CN105759058A - 一种检测猪o型口蹄疫病毒抗体的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

一种检测猪o型口蹄疫病毒抗体的方法及其专用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猪O型口蹄疫病毒抗体的方法及其专用试剂盒。本发明提供了一种检测或辅助检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒的化学发光酶联免疫试剂盒，包括抗原蛋白，所述抗原蛋白为如下a或b或c：a)序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的实验证明，建立的猪O型口蹄疫病毒抗体CLEIA检测方法较目前应用最为广泛的ELISA方法灵敏度大幅提升，从而降低了漏检率，而且精密度也更高，因此该检测方法明显优于ELISA方法。

Description

一种检测猪O型口蹄疫病毒抗体的方法及其专用试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪O型口蹄疫病毒抗体的方法及其专用试剂盒。
背景技术
口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)可引偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病，即通常所说的口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)。该病毒引起的病害具有传播迅速、感染率高的特点，主要通过呼吸道和消化道传播，仅数个感染性病毒粒子便可引起易感动物发病，甚至造成世界性的大流行，给畜牧业带来及其严重的经济损失，因此FMDV是世界各国检疫和防疫的重点对象。FMDV为单股正链RNA病毒，基因组全长约8.5kb，编码组成病毒衣壳的蛋白为4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4以及10种成熟的非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D及3AB和3ABC复合体)。在FMDV的4种结构蛋白中，VP1携带引发宿主细胞对FMDV免疫反应的关键性抗原表位，暴露于病毒粒子表面，单独的VP1蛋白即可刺激机体产生中和抗体，是ELISA中有效的目标抗原。
目前7个血清型中的O型、A型和Asia1型在中国交替流行，涉及面广、疫情复杂、破坏性强，造成很大危害。当前我国预防和控制口蹄疫主要以疫苗免疫为主，但FMDV的血清型众多，不同亚型的疫苗之间无交叉保护作用，且国内外口蹄疫疫苗质量参差不齐，因此建立一种简便、快速、灵敏度高的FMDV感染和/或免疫后抗体检测方法对预防和控制口蹄疫的发生和流行具有十分重要的意义。
FMDV的检测方法分为三类，包括血清学诊断技术、生物学试验和分子生物学诊断技术。在血清学诊断技术中，OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法为中和试验，但中和试验需要使用活病毒，在普通实验室难以完成，且操作费时。酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)与中和试验相比，具有灵敏、快速、操作简便等优点。化学发光酶联免疫检测(Chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLEIA)是将化学发光体系与ELISA技术相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术，利用标记酶促进发光底物发光，放大信号，具有灵敏度高、分析方法简单快捷、检测时间短、诊断范围宽、特异性好的优点，继承了ELISA的优点，同时灵敏度是ELISA的10倍以上，精密度明显高于ELISA，不需要特殊、大型、昂贵设备。
发明内容
本发明一个目的是提供一种检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括抗原蛋白或抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白为如下a或b或c：
a)序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
上述试剂盒中，所述抗原蛋白溶液的浓度为20μg/mL。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包括包被液、酶标二抗、化学发光物质、化学发光检测仪和可读性载体；
所述可读性载体上记载了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶标二抗检测的CLEIA方法。
上述试剂盒中，所述CLEIA检测方法包括如下步骤：
1)将所述抗原蛋白溶液包被孔板；
2)依次将待测样本、所述酶标二抗和所述化学发光物质加入1)处理后的孔板，反应，用所述化学发光检测仪检测化学发光值，得到待测样本化学发光值；
3)根据所述待测样本化学发光值判断待测样本是否感染感染猪O型口蹄疫病毒。
上述试剂盒中，所述根据化学发光值判断待测样本是否感染感染猪O型口蹄疫病毒为若待测样本化学发光值大于等于31141，则待测样本感染或候选感染猪O型口蹄疫病毒；若待测样本化学发光值小于31141，则待测样本未感染或候选未感染猪O型口蹄疫病毒。
上述试剂盒中，所述可读性载体为试剂盒说明书。
本发明另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒或待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体的方法。
本发明提供的方法，为上述试剂盒中的所述CLEIA方法。
本发明第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
A)为上述CLEIA方法的步骤1)-2)，所述待测样本为经待测猪O型口蹄疫疫苗免疫后血清，得到待测免疫后血清的化学发光值；
B)若待测免疫后血清的化学发光值大于等于127388，则所述待测猪O型口蹄疫疫苗免疫合格或候选免疫合格；
若待测免疫后血清的化学发光值小于127388，则所述待测猪O型口蹄疫疫苗免疫不合格或候选免疫不合格。
上述试剂盒在制备检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述试剂盒在制备检测待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述试剂盒在制备检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述抗原蛋白在制备检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述抗原蛋白在制备检测待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述抗原蛋白在制备检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，建立的猪O型口蹄疫病毒抗体CLEIA检测方法较目前应用最为广泛的ELISA方法灵敏度大幅提升，从而降低了漏检率，而且精密度也更高，因此该检测方法明显优于ELISA方法。
附图说明
图1为经诱导后上清和沉淀中VP1蛋白的表达情况。
图2为纯化后蛋白的纯度检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
酶标板为无锡国盛生物工程有限公司产品，货号为LotF8T3H150914A2；HRP标记山羊抗猪lgG抗体为Earthox公司产品，产品目录号为Lot#nn0401；化学发光检测仪为MP180型化学发光分析仪，北京泰格有限公司产品，编号MP1802015010502；质粒pET-28a为Novagen公司产品，产品目录号为CatNo.69015-3；OneBL21(DE3)化学感受态E.coli为赛默飞世尔科技(ThermoFisher(中国))有限公司产品，产品编号为C6000-03；牛血清蛋白为北京元亨金马生物科技技术开发有限公司公司产品，产品批号060309；猪伪狂犬病毒阳性血清为武汉科前生物股份有限公司的“猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒”中的组件，在该试剂盒中的名称为阳性对照；猪瘟病毒阳性血清为武汉科前生物股份有限公司的“猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒”中的组件，在该试剂盒中的名称为阳性对照；猪细小病毒阳性血清为武汉科前生物股份有限公司的“猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒”中的组件，在该试剂盒中的名称为阳性对照；猪圆环病毒阳性血清为武汉科前生物股份有限公司的“猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒”中的组件，在该试剂盒中的名称为阳性对照；猪O型口蹄疫ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；O型口蹄疫间接血凝抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；其他常规试剂均为国产分析纯；200份临床猪血清采集自山东40家猪场。
LB液体培养基：向蒸馏水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后定容至1L。
发光液由化学发光A液和化学发光B液等体积混合组成，其中化学发光A液为用超纯水将增强型化学发光微量级卢米诺底物稀释16倍得到的溶液，化学发光B液为用超纯水将微量级稳定氧化物溶液稀释16倍得到的溶液；所述增强型化学发光微量级卢米诺底物和微量级稳定氧化物溶液均为赛默飞世尔科技(ThermoFisher(中国))有限公司产品货号为37075的“SuperSignalTMELISAFemtoSubstrate”中的组件。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
包被液：1.6g无水碳酸钠，2.96g碳酸氢钠，用纯水定容至1L。
封闭液：向包被液中加入牛血清蛋白(BSA)和蔗糖，至牛血清蛋白含量为1％(质量百分比)，蔗糖含量为5％(质量百分比)。
100×洗涤液：取KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8g，KCl0.2g，Tween-2050ml，用纯水定容至1L，调pH至7.4。
洗涤液：用蒸馏水将100×洗涤液稀释至100倍体积。
样品稀释液：含有2.1％(质量百分比)NaCl和4％(质量百分比)PEG6000的洗涤液。
实施例1、抗原蛋白VP1的制备
一、表达抗原蛋白VP1的重组载体构建
将猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白编码基因进行密码子优化，以便于在大肠杆菌中表达，优化后序列见序列1，序列1所示的DNA分子为优化后VP1蛋白编码基因；其编码的蛋白为优化后VP1蛋白，优化后VP1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
将序列1所示优化后VP1蛋白编码基因用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ克隆入原核表达质粒pET-28a(默克密理博公司，货号：69864-3CN)，得到重组质粒pET-28a-VP1，优化后VP1蛋白编码基因与pET-28a载体上的His标签融合表达，得到N端融合His标签的抗原蛋白VP1，命名为重组蛋白VP1。
N端融合His标签的抗原蛋白VP1(重组蛋白VP1)的氨基酸序列为序列2的N端添加6个his得到的序列。
N端融合His标签的抗原蛋白VP1(重组蛋白VP1)的编码基因的核苷酸序列为序列1的5端添加6个his的密码子得到的序列。
二、抗原蛋白VP1的表达及纯化
1、将重组质粒pET-28a-VP1导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到含有重组质粒pET-28a-VP1的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET-28a-VP1。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞即OneBL21(DE3)化学感受态E.coli。
2、将BL21(DE3)/pET-28a-VP1接种于LB液体培养基(含50μg/ml硫酸卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养16小时，得到培养菌液1。
3、将培养菌液1以1:100(体积比)接种到LB液体培养基(含50μg/ml硫酸卡那霉素)中，37℃、220rpm振荡培养至OD600值为0.6，得到培养菌液2。
4、向培养菌液2中加入IPTG并使其浓度为0.5mM，28℃、220rpm振荡培养3h，离心收集菌体。
5、取步骤4得到的菌体，用BindingBuffer(pH8.0、20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mMimidazole)悬浮并超声破碎30min，然后12000rpm离心15min，收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE，结果如图1，M:蛋白分子量标准，1:诱导前全菌，2:诱导后全菌超声破碎沉淀，3:诱导后全菌超声破碎上清，可以看出，得到27ku重组蛋白VP1，且以包涵体的形式。
6、将步骤5得到沉淀溶解于BindingBuffer(pH8.0、20mMTris-HCl，500mMNaCl，8MUrea，50mMimidazole)，以1ml/min流速上样于5mLHisTrapFF预装柱(GE公司产品，产品目录号为Lot17-5255-01)，再用BindingBuffer以2ml/min流速冲洗5个柱体积，收集穿透液，然后用ElutionBuffer(pH8.0、20mMTris-HCl，500mMNaCl，8MUrea，500mMimidazole)以2ml/min流速洗脱5个柱体积，在UV280nm达到50mAU开始收集蛋白，当UV降至同一值结束收集，所收集的蛋白溶液即为纯化的重组蛋白VP1。
将纯化的重组蛋白VP1进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，M:蛋白分子量标准1:穿透液，2-8:洗脱目的蛋白，得到分子量在27ku左右的高纯度重组蛋白VP1。
用Bradford法测纯化的重组蛋白VP1浓度为0.8mg/mL，分装为500μL/管，-20℃保存备用。
实施例2、检测待测血清中的O型口蹄疫病毒的方法确立
下面是在化学发光酶联免疫法的基础上进行优化，命名为VP1-CLEIA方法。
一、VP1-CLEIA方法中检测标准的确立
1、检测待测血清是否感染O型口蹄疫病毒的判断标准
取10份猪O型FMDV阴性血清分别进行CLEIA检测，每份血清重复两孔取其平均值，操作过程如下：
1)、取酶标板，用实施例1制备的纯化的重组蛋白VP1进行包被；
2)、加入O型口蹄疫病毒阴性血清，孵育；
3)、加入HRP标记山羊抗猪lgG抗体，孵育；
4)、加入发光液，孵育；
5)、用化学发光检测仪检测。
计算10份标准阴性血清的OD450nm平均值(x1)和标准差(s1)，根据统计学原则，待检血清的OD450nm值≥x1+2s1时，则可以在99.9％的水平上判为阳性。因此将x1+2s1所得的值定为阴阳性血清的界限。10份血清化学发光值的平均值(x1)和标准差(s1)分别为28033.25和1553.87。因此初步确定VP1-CLEIA阴阳血清临界值为x1+2s1，即31141。
若待测血清的化学发光值≥31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒；
若待测血清的化学发光值＜31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒。
2、检测O型FMDV疫苗是否免疫合格的判断标准确立
根据《2015年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的规定，猪经O型FMDV灭活疫苗免疫后28天，使用正向间接血凝试验检测血清中的抗体效价≥32，即可判定为免疫合格。本次建立的CLEIA检测方法中，同时确定免疫合格的判定标准。
对10份经正向间接血凝试验判定抗体效价为1:32的猪O型FMDV标准血清按以上确定进行VP1-CLEIA检测(方法同上述1)，每份血清重复两孔。10份血清化学发光值的平均值(x2)和标准差(s2)分别为108322.80和9532.36。因此初步确定是否免疫合格的临界值为x2+2s2，即127388。
若免疫后血清的化学发光值≥127388，则猪接种O型FMDV疫苗免疫合格或候选免疫合格；
若免疫后血清的化学发光值＜127388，则猪接种O型FMDV疫苗判定为免疫不合格或候选免疫不合格。
二、VP1-CLEIA方法中抗原蛋白包被浓度的确定
VP1-CLEIA方法的步骤如下：
1、包被抗原：取酶标板，用包被液稀释实施例1制备的浓度为0.8mg/ml纯化重组抗原蛋白VP1，分别按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160进行稀释倍数进行；每孔加入100μl，用封口膜封好，4℃包被20h，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤4次，每次加入200μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；向酶标板每孔加入300μl封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
2、向1处理后的酶标板每孔分别加入100μl的O型口蹄疫病毒阴性血清稀释液(用样品稀释液稀释O型口蹄疫病毒阴性血清40倍)和O型口蹄疫病毒标准阳性血清稀释液(用样品稀释液稀释O型口蹄疫病毒标准阳性血清40倍)，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
3、向2)处理后的酶标板每孔加入100μlHRP标记山羊抗猪lgG抗体(用样品稀释液稀释20000倍)，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
4、向3)处理后的酶标板每孔加入发光液100μl，计时5min孵育；
5、用化学发光检测仪检测吸光值。
综合考虑抗原蛋白使用量较少且吸光值的P/N(P：阳性血清，N：阴性血清)比值作为最佳抗原包被浓度，随着重组VP1蛋白包被量的减少，测得FMDV阴性血清及阳性血清的化学发光值均不断降低，当包被抗原为1:40(20μg/mL)稀释时，P/N值较大，且阴性血清的化学发光值较小，结果见表1。因此可以确定在VP1-CLEIA方法中重组VP1蛋白的最佳包被浓度为20μg/mL。
表1VP1-CLEIA中重组VP1蛋白最佳包被浓度的选择
三、VP1-CLEIA方法中二抗稀释倍数的确定
确定二抗最佳稀释倍数的步骤如下：
1、用步骤二中已确定的实施例1制备的重组蛋白VP1的包被浓度为20μg/mL，每孔加入100μl，用封口膜封好，4℃包被20h，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤4次，每次加入200μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；向酶标板每孔加入300μl封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
2、同步骤二中2；
3、HRP-羊抗猪IgG酶标二抗用封闭液稀释为1:5000、1:10000、1:20000和1:40000四个梯度，向2处理后的酶标板每孔加入100μl，用封口膜封好，37℃孵育30min，然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、向3处理后的酶标板每孔加入发光液100μl，计时5min孵育；
5、用化学发光检测仪检测化学发光值。
P/N(P：阳性血清，N：阴性血清)比值越大，表明二抗稀释倍数最佳。
结果见表2所示，当HRP-羊抗猪IgG酶标二抗稀释度为1:40000时，P/N值最大，因此将该稀释度作为酶标二抗的最佳稀释度。
表2VP1-CLEIAHRP-羊抗猪IgG酶标二抗最佳稀释度的确定
实施例3、VP1-CLEIA法检测待测血清中的O型口蹄疫病毒
一、灵敏度检测
VP1-CLEIA法步骤如下：
1、制备猪O型FMDV阳性血清：对2月龄仔猪肌肉免疫1毫升猪口蹄疫O型灭活疫苗(中农威特生物科技股份有限公司)，1个月后加强免疫1次，加强免疫后2周静脉采血，分离血清，用O型口蹄疫间接血凝抗体检测试剂盒将血清抗体效价标定为1:512。
2、以实施例1制备的纯化重组VP1蛋白的包被浓度为20μg/mL加入酶标板各孔中，每孔加入100μl，用封口膜封好，4℃包被20h，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤4次，每次加入200μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；向酶标板每孔加入300μl封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；将已标定抗体效价为1:512的猪O型FMDV阳性标准血清用封闭液从1:32开始做倍比稀释，分别是1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1：2048、1:4096八个稀释度，向1处理后的酶标板每孔中加入100μl，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
3、向2处理后的酶标板每孔加入100μl稀释度为1:40000的HRP-羊抗猪IgG酶标二抗，用封口膜封好，37℃孵育30min，然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、向3处理后的酶标板每孔加入发光液100μl，计时5min孵育；
5、用化学发光检测仪检测化学发光值。
若待测血清的化学发光值≥31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒；
若待测血清的化学发光值＜31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒。
结果如表3所示，VP1-CLEIA方法检测血清样本在1:2048稀释时仍可判为阳性。
表3VP1-CLEIA灵敏度试验
二、特异性检测
用建立好的VP1-CLEIA法分别检测如下待测血清：猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清，猪圆环病毒(PVC)阳性血清，同时设猪O型FMDV阳性、阴性血清对照，观察CLEIA方法的特异性。
VP1-CLEIA法步骤如下：
1、以实施例1制备的纯化重组VP1蛋白的包被浓度为20μg/mL加入酶标板各孔中，每孔加入100μl，用封口膜封好，4℃包被20h，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤4次，每次加入200μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；向酶标板每孔加入300μl封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
2、向1处理后的酶标板每孔中加入100μl待测血清稀释液(用样品稀释液稀释待测血清60倍)，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
3、向2处理后的酶标板每孔加入100μl稀释度为1:40000的HRP-羊抗猪IgG酶标二抗，用封口膜封好，37℃孵育30min，然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、向3处理后的酶标板每孔加入发光液100μl，计时5min孵育；
5、用化学发光检测仪检测吸光值。
若待测血清的化学发光值≥31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒；
若待测血清的化学发光值＜31141，则待测血清感染或候选感染O型口蹄疫病毒。
上述待测血清为分别为猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清，猪圆环病毒(PVC)阳性血清、猪O型FMDV阳性或O型口蹄疫病毒阴性血清。
结果见表4，可以看出，本发明方法能特异性检测O型口蹄疫病毒抗体。
表4.检测待检血清中O型口蹄疫病毒抗体方法的特异性结果
注：“-”表示阴性“+”表示为阳性。
三、方法的重复性
VP1-CLEIA法的步骤同上述二，不同的是待测血清为3份猪O型FMDV阳性血清(编号为1-3)和1份阴性血清(编号为4)。
每份血清重复4孔，进行板内重复性试验，对结果进行统计学分析，计算板内变异系数；包被4块化学发光板，使用相同的3份猪O型FMDV阳性血清和1份阴性血清进行板间重复性试验，计算板间变异系数。
结果如表5和表6所示，板内重复性试验的变异系数在1.1％-6.7％之间，板间重复性试验的变异系数在0.66％-4.8％之间，均小于7％。表明同一份血清样本在同一批次制备抗原包被的化学发光板内变异系数较小，具有良好的重复性。结果见表5、表6。
表5VP1-CLEIA板内重复试验
表6VP1-CLEIA板间重复试验
实施例4、VP1-CLEIA法检测O型FMDV疫苗是否免疫合格
VP1-CLEIA法的步骤同实施例2的二，不同的是待测血清为采集自山东猪场的血清样本200份(已免疫O型FMDV疫苗的猪的血清)。
若免疫后血清的化学发光值≥127388，则猪接种O型FMDV疫苗免疫合格或候选免疫合格，即为阳性数；
若免疫后血清的化学发光值＜127388，则猪接种O型FMDV疫苗判定为免疫不合格或候选免疫不合格，即为阴性数。
结果如表7所示。
采用武汉科前生物生产的猪O型口蹄疫ELISA抗体检测试剂盒检测同样的采集自山东猪场的血清样本200份，结果如表7所示。
从表7看出，两种方法检测结果符合率为93.50％，表明本发明的方法正确，可以用来检测待测血清中的O型口蹄疫病毒。
表7本发明检测方法与商品化试剂盒对比结果

Claims (10)

1.一种检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫试剂盒，包括抗原蛋白或抗原蛋白溶液，所述抗原蛋白为如下a或b或c：
a)序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原蛋白溶液的浓度为20μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括包被液、酶标二抗、化学发光物质、化学发光检测仪和可读性载体；
所述可读性载体上记载了利用所述抗原蛋白溶液和所述酶标二抗检测的CLEIA方法。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：
所述CLEIA检测方法包括如下步骤：
1)将所述抗原蛋白溶液包被孔板；
2)依次将待测样本、所述酶标二抗和所述化学发光物质加入1)处理后的孔板，反应，用所述化学发光检测仪检测化学发光值，得到待测样本化学发光值；
3)根据所述待测样本化学发光值判断待测样本是否感染感染猪O型口蹄疫病毒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
所述根据化学发光值判断待测样本是否感染感染猪O型口蹄疫病毒为若待测样本化学发光值大于等于31141，则待测样本感染或候选感染猪O型口蹄疫病毒；若待测样本化学发光值小于31141，则待测样本未感染或候选未感染猪O型口蹄疫病毒。
6.根据权利要求3-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述可读性载体为试剂盒说明书。
7.一种检测或辅助检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒或待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体的方法，为权利要求3-5中任一所述试剂盒中的所述CLEIA方法。
8.一种检测或辅助检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格的方法，包括如下步骤：
A)为权利要求3-4中的所述CLEIA方法的步骤1)-2)，所述待测样本为经待测猪O型口蹄疫疫苗免疫后血清，得到待测免疫后血清的化学发光值；
B)若待测免疫后血清的化学发光值大于等于127388，则所述待测猪O型口蹄疫疫苗免疫合格或候选免疫合格；
若待测免疫后血清的化学发光值小于127388，则所述待测猪O型口蹄疫疫苗免疫不合格或候选免疫不合格。
9.权利要求1-5中任一所述试剂盒在制备检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒产品中的应用；
或，权利要求1-5中任一所述试剂盒在制备检测待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体产品中的应用；
或，权利要求1-5中任一所述试剂盒在制备检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格产品中的应用。
10.权利要求1中的所述抗原蛋白在制备检测待测样本是否感染猪O型口蹄疫病毒产品中的应用；
或，权利要求1中的所述抗原蛋白在制备检测待测样本是否含有猪O型口蹄疫病毒抗体产品中的应用；
或，权利要求1中的所述抗原蛋白在制备检测待测猪O型口蹄疫疫苗是否免疫合格产品中的应用。
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