CN108362875A

CN108362875A - 一种鉴别新城疫感染与免疫的间接elisa方法

Info

Publication number: CN108362875A
Application number: CN201810022726.3A
Authority: CN
Inventors: 任涛; 于得水; 徐成刚; 谢鹏; 梁健鹏; 林秋燕; 廖明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明属于生物技术领域的免疫学检测方法，具体涉及新城疫病毒的非结构蛋白V的特有羧基端结构域在鉴别新城疫病毒感染与免疫中的应用。更具体地，本发明提供了一种能够鉴别诊断新城疫灭活疫苗免疫与野毒感染的方法，其通过大肠杆菌原核表达系统表达V蛋白特有羧基端结构域的重组蛋白，并将该重组蛋白作为抗原，通过间接ELISA检测方法，鉴别新城疫灭活疫苗免疫与野毒感染。本发明的方法具有高特异性，能够快速和有效区分新城疫野毒感染与灭活疫苗免疫，进而有效控制病新城疫病毒的快速传播。

Description

一种鉴别新城疫感染与免疫的间接ELISA方法

技术领域

本发明属于生物技术领域的免疫学检测方法，具体涉及新城疫病毒非结构蛋白V特有羧基端结构域的原核表达，以及利用该原核表达产物鉴别诊断新城疫病毒感染与灭活疫苗免疫的间接ELISA方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的鸡和多种禽类发病的急性、高度接触性传染病，广泛分布于世界各地，给养禽业造成了巨大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将ND列为法定报告疫病，在我国ND被定为一类动物疾病，《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020)》将ND列为优先防治的5种一类动物疫病之一。

在病毒分类学方面，NDV属于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属，其基因组为一条单股、负链、不分节段的RNA，可分为6个基因片段，包括NP、P、M、F、HN和L，其中编码磷酸化蛋白(P)的P基因在能在转录过程通过一种特殊的RNA编辑机制使其mRNA编码框发生移码，从而翻译出另外两种非结构蛋白V和W。研究表明病毒复制过程由P基因产生的3种mRNA及相应蛋白均能被检测到，且3者的含量具有一定的比例关系，编码P蛋白、V蛋白和W蛋白的mRNA分别约占69％、29％和2％。

区分动物的免疫与感染正是当前倡导的实现安全控制病毒性疾病的一种手段，但目前常用的NDV血清学诊断方法并不能区分疫苗免疫与野毒感染。因此，建立一种能够准确、快速区分免疫灭活疫苗和感染活病毒动物的诊断方法在检测和预防新城疫的发生以及活禽检疫等方面都是十分必要的。

非结构蛋白V产生于NDV的复制过程中，主要存在于感染病毒的宿主细胞内，但并不参与病毒粒子的装配(全病毒粒子内可能会有极少量V蛋白残留)。由于灭活病毒无法在动物体内复制，不产生新的V蛋白，而野毒感染后的复制过程中会产生一定量的V蛋白，因此，可以根据不同的V蛋白抗体应答水平来区分灭活疫苗免疫与野毒感染。

目前，国内外已报道过利用口蹄疫、繁殖与呼吸综合征、禽流感、鸡传染性支气管炎等病毒的非结构蛋白建立的ELISA鉴别诊断方法，但尚未报道有利用NDV非结构蛋白作为检测抗原的血清学检测方法。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明旨在通过新城疫病毒(NDV)V蛋白的特有的羧基端结构域鉴别新城疫灭活疫苗免疫与野毒感染。更具体地，通过大肠杆菌原核表达系统表达V蛋白特有羧基端结构域(简称Vc)的重组蛋白，并在利用该表达产物建立一种能够鉴别诊断新城疫灭活疫苗免疫与野毒感染的ELISA检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了新城疫病毒V蛋白的羧基端结构域(简称Vc)在制备鉴别新城疫病毒感染与灭活疫苗免疫的试剂盒中应用。

所述的Vc的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

新城疫病毒复制过程中，其P基因可产生3种蛋白，即P蛋白、V蛋白和W蛋白。其中P蛋白是新城疫病毒的结构蛋白，V和W是非结构蛋白。结构蛋白是病毒粒子的组成成分，而非结构蛋白是病毒在细胞内复制时产生的一些辅助性蛋白，并不参与病毒粒子的装配，理论上讲成熟的病毒粒子中不含非结构蛋白(实际情况中全病毒粒子中可能会残留极少量非结构蛋白)；灭活疫苗是失去感染能力的病毒粒子，仅能刺激机体产生免疫应答，而无法在动物机体内进行复制。因此，非结构蛋白V和W均可以作为灭活疫苗免疫和野毒感染的区分蛋白，然而，NDV复制过程中产生的非结构蛋白W的量极少，一般不容易被检测到，而V蛋白含量相对较多，便于检测，其为更优选择。

还需要说明的是，本发明特意选择了新城疫病毒V蛋白的特有羧基端结构域(Vc)，由于NDV的V蛋白与P蛋白氨基端区域序列相同，故本发明在利用大肠杆菌进行原核表达时仅表达了V蛋白特有羧基端结构域(简称Vc)的重组蛋白，以保证该抗原的特异性。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其含有SEQ ID NO.1所示新城疫病毒V蛋白的特有羧基端结构域(Vc)。

所述的试剂盒用于鉴别新城疫病毒感染与灭活疫苗免疫的应用。在本发明示范性的实施例中，所述的试剂盒为ELISA检测试剂盒。

作为优选的实施方式，所述的ELISA检测试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、封闭液、显色液、洗涤液。更具体地，所述的阴性对照为未感染新城疫病毒也未接种新城疫疫苗的阴性血清；阳性对照为新城疫病毒感染的阳性血清；所述封闭液为7.5％脱脂奶粉；所述的显色液为TMB；所述洗涤液为PBST缓冲液。

另一方面，本发明还提供了一种鉴别新城疫病毒感染与免疫的间接ELISH方法，该方法包括以下步骤：

S1.新城疫病毒V蛋白特有羧基端结构域(Vc)的表达及纯化；

S2.间接ELISA检测；

作为本发明一种优选的实施方式，步骤S1中，Vc的表达采用原核细胞表达；作为更优选的实施方式，所述的原核细胞为大肠杆菌。作为一种示范性的实施方式，所述的原核细胞为大肠杆菌BL21。当然，本发明不限于此种大肠杆菌，只要是现有技术中能够实现Vc表达的表达系统均可以。

作为本发明一种优选的实施方式，Vc的表达所用的载体为质粒，作为本发明一个示范性是实施方式，所述的载体为pET-32a，其构建好的表达载体命名为pET-32a-Vc。

作为本发明一个优选的实施方式，Vc表达后，采用镍离子亲和层析柱进对表达产物进行纯化。

其中，步骤S2中，间接ELISA检测具体包含以下步骤：

(1)抗原包被；

(2)封闭；

(3)孵育一抗；

(4)孵育酶标二抗；

(5)显色；

(6)终显色；

(7)测OD₄₅₀nm处吸光值；

(8)结果判定；

其中，步骤(1)中，抗原包被的浓度为0.4～1.6μg/mL；优选为0.8μg/mL。作为优选的实施方式，抗原包被方式为4℃过夜，此时阳性对照血清OD450nm均值在1.0左右，且P/N值(阳性对照OD₄₅₀nm均值/阴性对照OD₄₅₀nm均值)最大。

其中，步骤(2)中，封闭液采用脱脂奶或BSA；作为更优选的实施方式，封闭液采用脱脂奶粉，更为优选7.5％的脱脂奶粉。此时P/N值最大。作为优选的实施方式，封闭时间为1～3h；更优选为2h，此时P/N值最大。

其中，步骤(3)中，孵育一抗时，加入稀释好的待检血清以及阴、阳性对照血清，35～39℃孵育45～90min，使用PBST洗板5次后甩净拍干。作为优选的实施方式，血清的稀释浓度为1:25～1:100；更优选为1:50。优选地，孵育时间为60min，此时P/N值最大。其中，所述的阴性对照为未感染新城疫病毒也未接种新城疫疫苗的阴性血清；阳性对照为新城疫病毒感染的阳性血清。

其中，步骤(4)中，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG，35～39℃孵育30～90min，使用PBST洗板5次后甩净拍干。作为优选的实施方式，二抗的孵育时间为60min，此时P/N值最大。作为优选的实施方式，酶标二抗稀释倍数为1:6000～1:10000时，更优选1:8000，此时P/N值最大。

其中，步骤(5)中，显色采用的显色剂为TMB。显色方式为室温避光显色5～15min；优选为10min，此时，P/N值最大。

其中，步骤(6)中，终显色加入终止液终止显色。作为优选的实施方式，所述的终止液为H₂SO₄；更优选地，为1M H₂SO₄。

其中，步骤(7)中，采用酶标仪测OD₄₅₀nm处吸光值。

其中，步骤(8)中，先读取OD₄₅₀nm值，再通过S/P值校正后进行结果判定。S/P值＝(待测样本OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)/(阳性对照孔OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)，将S/P值与最终确定的阴、阳性临界值对比，判定结果。

经过本发明多次优化Vc-ELISA反应条件后，作为一种优选的实施方式：抗原包被浓度为0.8μg/mL，血清稀释倍数为1:50，抗原包被方式为4℃过夜，封闭液为7.5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，血清作用时间为60min，酶标二抗稀释倍数为1:8000，酶标二抗作用时间为60min，TMB底物反应时间为10min。

此外，本发明还通过多次重复实验，确定了ELISA的临界值，具体地，使用S/P值校正样品OD₄₅₀nm值，当S/P值≥0.29时判定为阳性，当S/P值≤0.24时判定为阴性，当S/P值介于两者之间时为可疑值，需做进一步验证。

经试验证实，本发明的Vc-ELISA方法具有良好的特异性，可用于判断新城疫病毒感染和灭活疫苗免疫。

本发明的有益效果：

区分动物的免疫与感染(DIVA)正是当前倡导的实现完全控制病毒性疾病的一种手段，但目前所使用的新城疫病毒血清学诊断方法，如血凝抑制(HI)试验、包被全病毒粒子的ELISA方法以及胶体金检测等，并不能鉴别诊断NDV灭活疫苗免疫与野毒感染。本Vc-ELISA检测方法正是一种可以区分NDV野毒感染与灭活疫苗免疫的方法。本发明在将来净化新城疫病毒时，可快速确诊新城疫病毒感染，进而有效控制病新城疫病毒的快速传播，以减少不必要的经济损失。

附图说明

图1为重组蛋白Vc纯化的SDS-PAGE结果；Maker：低分子量蛋白标准；1：重组蛋白Vc原核表达后(未纯化)；2：样品滤过液；3：平衡液冲洗杂蛋白；4：低浓度咪唑洗涤液冲洗杂蛋白；5～7：高浓度咪唑洗脱液冲洗目的蛋白(即纯化后的重组蛋白Vc)。

图2为4批重组蛋白Vc纯化后Western Blot结果；Maker：低分子量蛋白标准；1～4：4批纯化后的重组蛋白Vc。

图3为NVD灭活苗免疫后HI滴度变化情况。

图4为免疫三周后再攻强毒后HI滴度变化情况。

图5为动物实验Vc-ELISA结果。

具体实施方式

以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、替代、简化、组合、修饰，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1.重组蛋白Vc的原核表达及纯化

首先，本ELISA检测方法中所用包被抗原为新城疫病毒重组蛋白Vc，该蛋白是使用本实验室已经构建好的原核表达载体质粒pET-32a-Vc经大肠杆菌原核表达系统大量表达，再通过镍离子亲和层析柱纯化后得到的。具体操作如下：

取本实验室以构建好的原核表达载体pET-32a-Vc转化大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃培养12～14h后挑取单个阳性菌落进行扩大培养，然后加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG诱导融合有His标签的重组蛋白Vc大量表达。

原核表达后收集表达菌的菌体沉淀，经PBS洗涤一次后再加入适量PBS震荡混匀，经超声裂解后使上清液和沉淀分离，再利用SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定重组蛋白Vc的表达情况。

最后，利用镍离子亲和层析柱对该原核表达后的重组蛋白Vc进行纯化，并使用SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定纯化效果(见图1和图2)，纯化后的NDV Vc重组蛋白保存于-80℃备用。

附:

(1)NDV Vc基因编码的氨基酸序列：

SEQ ID NO.1

MVGSPRRASPTSGPTTREPTELWKQPGKTAAPGQGRPWKPGHRREHSISWTMEGVTTISWCNPSCAPVRAEPRQYSCTCGSCPATCRLCAGDDVYDGGIITEGK

(2)NDV Vc基因的核苷酸序列：

SEQ ID NO.2

ATGGTCGGGTCCCCAAGAAGGGCATCACCAACCTCCGGCCCAACAACACGGGAACCAACCGAGCTATGGAAGCAGCCAGGGAAGACCGCAGCACCAGGCCAAGGCCGTCCCTGGAAACCGGGGCATAGACGAGAACACAGCATATCATGGACAATGGAAGGAGTCACAACCATCAGCTGGTGCAACCCCTCATGCGCCCCAGTCAGGGCAGAGCCAAGACAATACTCCTGTACCTGTGGATCGTGTCCAGCTACCTGCCGACTTTGCGCAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGCATTATCACAGAAGGTAAGTAA

实施例2.Vc-ELISA检测方法的建立

2.1ELISA的基本程序

(1)抗原包被：使用抗原包被液(即pH9.6的碳酸盐缓冲液)将抗原(即重组蛋白Vc)稀释至工作浓度，按100μL/孔包被酶标板，4℃静置过夜，使用PBST(即含0.05％Tween-20的PBS)洗板5次后甩净拍干。

(2)封闭：以200μL/孔的量加入封闭液，37℃恒温箱静置封闭2h，使用PBST洗板5次后甩净拍干。

(3)孵育一抗：以100μL/孔的量加入稀释好的待检血清以及阴、阳性对照血清(阴、阳性血清均做两个重复)，37℃恒温箱静置孵育1h，使用PBST洗板5次后甩净拍干。

(4)孵育酶标二抗：以100μL/孔的量加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG，37℃恒温箱中静置孵育1h，使用PBST洗板5次后甩净拍干。

(5)显色(该步骤需避光)：以100μL/孔的量加入TMB单组份显色液，室温(25℃左右)避光显色10min。

(6)终止显色：以100μL/孔的量加入终止液(即1M H₂SO₄)终止显色；

(7)读数：使用酶标仪测定各孔在OD₄₅₀nm处吸光值。

(8)结果判定：先读取OD₄₅₀nm值，再计算S/P值，公式为S/P值＝(待测样本OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)/(阳性对照孔OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)，将S/P值与最终确定的阴、阳性临界值对比，判定结果。

2.2ELISA条件优化

以上述的ELISA基本程序为基础，对Vc-ELISA的反应条件进行优化。

(1)抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定

分别使用抗原包被液和PBS将抗原和血清梯度稀释，然后作方阵滴定试验来确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。

具体操作为取96孔酶标板(8×12)，横排抗原包被浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg/mL，竖排阴、阳性血清按1:25、1:50、1:100、1:200稀释，每个稀释度做两个重复。ELISA反应后以阳性血清OD450nm均值在1.0左右，且P/N值(阳性血清OD₄₅₀nm均值/阴性血清OD₄₅₀nm均值)最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度。经分析，最佳抗原包被浓度为0.4～1.6μg/mL；优选为0.8μg/mL，最佳血清稀释倍数为1:25～1:100；更优选为1:50。

(2)抗原包被方式的选择

将抗原按最佳包被浓度进行包被后，分别于37℃2h、37℃2h+4℃过夜和直接4℃过夜(即12～16h)包被酶标板，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当抗原包被方式为4℃过夜时，P/N值最大，即为最佳抗原包被方式。

(3)封闭液的选择

使用PBS分别配制1％BSA、3％BSA、5％脱脂奶粉、7.5％脱脂奶粉作为封闭液，对包被好的酶标板进行封闭，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当封闭液为7.5％脱脂奶粉时，P/N值最大，即为最佳封闭液。

(4)封闭时间的选择

确定最佳封闭剂后，再在37℃条件下分别对包被好的酶标板封闭1h、2h和3h，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明封闭时间为1～3h均可行，当封闭时间为2h时，P/N值最大，即为最佳封闭时间。

(5)血清最佳作用时间的确定

将阴、阳性血清按最佳稀释度进行稀释后，置于37℃条件下分别作用30min、45min、60min和90min，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当血清作用时间为30～90min时，P/N值均较高，在60min时，P/N值最大，即为最佳血清作用时间。

(6)酶标二抗最佳工作浓度的确定

将酶标二抗分别按1:4000、1:6000、1:8000、1:10000稀释，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当酶标二抗稀释倍数为1:8000时，P/N值最大，即为最佳酶标二抗工作浓度。

(7)酶标二抗最佳作用时间的确定

将酶标二抗按最佳稀释度进行稀释后，置于37℃条件下分别作用15min、30min、60min和90min，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当酶标二抗作用时间为30～90min时，P/N值均较高，尤其是60min时，P/N值最大，即为最佳酶标二抗工作时间。

(8)TMB底物的最佳反应时间的确定

加入TMB单组份显色液后，室温条件下分别反应5min、10min、15min和30min，在其他条件相同的情况下进行ELISA检测。结果表明当TMB底物反应时间为5～15min时，P/N值均较高，尤其是10min时，P/N值最大，即为最佳TMB底物反应时间。

因此，Vc-ELISA反应条件的优化后，最终确定的最佳反应条件为：抗原包被浓度为0.8μg/mL，血清稀释倍数为1:50，抗原包被方式为4℃过夜，封闭液为7.5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，血清作用时间为60min，酶标二抗稀释倍数为1:8000，酶标二抗作用时间为60min，TMB底物反应时间为10min。

2.3临界值的确定

选择30份经血凝抑制(HI)试验确定为NDV阴性的SPF鸡血清，用上述优化好的ELISA反应条件进行检测(结果见表1)，经计算这30份血清OD₄₅₀nm值的平均值为0.127，标准差(SD)为0.037，根据统计学原理计算为0.287，计算为0.244。为了方便计算，确定当样品OD₄₅₀nm值≥0.29时判定为阳性，当样品OD₄₅₀nm值≤0.24时判定为阴性，当OD₄₅₀nm值介于两者之间时为可疑值，需做进一步验证。

另外，为了降低人为因素(如操作人员技术误差)、环境因素(环境温度)及每批试剂，尤其是每批抗原的差异对检测结果的影响，我们引入S/P值＝(待测样本OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)/(阳性对照孔OD₄₅₀nm均值–阴性对照OD₄₅₀nm均值)对该ELISA方法的结果进行校正。即通过设定阴性和阳性对照血清的OD₄₅₀nm均值，用S/P值作为判定标准，确定当样品S/P值≥0.29时判定为阳性，S/P值≤0.24时判定为阴性，当S/P值介于两者之间时为可疑值，需做进一步验证。

表1 30份SPF鸡NDV阴性血清Vc-ELISA结果

2.4Vc-ELISA方法特异性验证实验

使用上述建立好的Vc-ELISA方法，分别检测H7N9禽流感病毒(AIV H7N9)阳性血清、H9N2禽流感病毒(AIV H9N2)阳性血清、K亚群禽白血病(ALV-K)阳性血清、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)阳性血清、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)阳性血清和禽腺病毒4型(FADV-4)阳性血清各8份，同时设新城疫V蛋白阳性对照血清和SPF鸡阴性对照血清各2份。实验前以上AIV H7N9、AIV H9N2、ALV-K、IBV、IBDV和FADV-4阳性血清经血凝抑制(HI)试验检测确定均为新城疫阴性。

AIV H7N9、AIV H9N2、ALV-K、IBV、IBDV和FADV-4阳性血清的Vc-ELISA结果均小于0.24，均为阴性，阳性对照血清和阴性对照血清结果均正常。

实施例3.Vc-ELISA方法鉴别诊断NDV感染与免疫

3.1动物实验设计及HI结果

订购30只3周龄SPF鸡，分为3组，包括实验组、PBS阴性对照组和强毒对照组，每组10只，饲养于SPF鸡隔离器内。其中实验组的10只鸡免疫3周后再攻强毒，然后在继续观察3周，期间按计划采血并制备成血清(见表2)。

表2动物实验方案

血凝抑制(HI)试验结果(见图3和图4)表明试验动物免疫成功，免疫3周后HI抗体效价(即HI滴度)可达到10log₂左右，而免疫3周再攻NDV强毒后HI抗体效价稍有降低，但变化并不显著，所以无法通过HI试验区分NDV的免疫与感染；PBS阴性对照组结果正常，HI结果显示均为NDV阴性；强毒对照组在攻毒一周内全部死亡，这表明NDV强毒株可以感染并致死正常非免疫SPF鸡。

3.2通过Vc-ELISA方法鉴别NDV感染与免疫

使用上述建立好的Vc-ELISA方法，分别检测动物实验中免疫后7d、14d、21d血清样品和免疫3周再攻NDV强毒后7d、14d、21d血清样品。

Vc-ELISA结果显示免疫后7d、14d、21d血清样品S/P值校正后的OD_450nm结果基本为阴性(存在少数可疑或阳性值)，而免疫3周再攻NDV强毒后7d、14d、21d血清样品S/P值校正后的OD_450nm结果大部分为阳性(存在部分阴性值和可疑值)，表明该方法在群体检测中可以达到鉴别NDV野毒感染与灭活疫苗免疫的效果(结果见图5)。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴别新城疫感染与免疫的间接ELISA方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 1

Met Val Gly Ser Pro Arg Arg Ala Ser Pro Thr Ser Gly Pro Thr Thr

1 5 10 15

Arg Glu Pro Thr Glu Leu Trp Lys Gln Pro Gly Lys Thr Ala Ala Pro

20 25 30

Gly Gln Gly Arg Pro Trp Lys Pro Gly His Arg Arg Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Trp Thr Met Glu Gly Val Thr Thr Ile Ser Trp Cys Asn Pro Ser

50 55 60

Cys Ala Pro Val Arg Ala Glu Pro Arg Gln Tyr Ser Cys Thr Cys Gly

65 70 75 80

Ser Cys Pro Ala Thr Cys Arg Leu Cys Ala Gly Asp Asp Val Tyr Asp

85 90 95

Gly Gly Ile Ile Thr Glu Gly Lys

100

<210> 2

<211> 315

<212> DNA

<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)

<400> 2

atggtcgggt ccccaagaag ggcatcacca acctccggcc caacaacacg ggaaccaacc 60

gagctatgga agcagccagg gaagaccgca gcaccaggcc aaggccgtcc ctggaaaccg 120

gggcatagac gagaacacag catatcatgg acaatggaag gagtcacaac catcagctgg 180

tgcaacccct catgcgcccc agtcagggca gagccaagac aatactcctg tacctgtgga 240

tcgtgtccag ctacctgccg actttgcgca ggcgatgatg tctatgatgg aggcattatc 300

acagaaggta agtaa 315

Claims

1.新城疫病毒V蛋白的羧基端结构域在制备鉴别新城疫病毒感染与免疫的试剂盒中应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的新城疫病毒V蛋白的羧基端结构域具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种试剂盒，其含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有阴性对照、阳性对照、封闭液、显色液、洗涤液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为未感染新城疫病毒也未接种新城疫疫苗的阴性血清；所述的阳性对照为新城疫病毒感染的阳性血清；

优选地，所述封闭液为脱脂奶粉；所述的显色液为TMB；所述洗涤液为PBST缓冲液。

7.一种鉴别新城疫病毒感染与免疫的间接ELISH方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1.SEQ ID NO.1所示的新城疫病毒V蛋白的羧基端结构域的表达及纯化；

S2.间接ELISA检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中，采用原核细胞表达；

优选采用大肠杆菌表达；

优选地，步骤S1，采用镍离子亲和层析柱进行纯化。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，间接ELISA检测具体包含以下步骤：

(1)抗原包被；

(2)封闭；

(3)孵育一抗；

(4)孵育酶标二抗；

(5)显色；

(6)终显色；

(7)测OD₄₅₀nm处吸光值；

(8)结果判定。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，抗原包被的浓度为0.4～1.6μg/mL，抗原包被为4℃过夜；优选地，抗原包被的浓度为0.8μg/mL；

优选地，步骤(2)中，封闭液为脱脂奶或BSA，封闭时间为1～3h；更优选地，封闭液为脱脂奶粉，封闭时间为2h；还更优选地，封闭液为7.5％的脱脂奶粉；

优选地，步骤(3)中，血清的稀释浓度为1:25～1:100，一抗在35～39℃孵育45～90min；

更优选地，血清的稀释浓度为1:50；一抗在37℃孵育60min；

优选地，步骤(4)中，酶标二抗稀释倍数为1:6000～1:10000，二抗在35～39℃孵育30～90min；

更优选地，酶标二抗稀释倍数为1:8000，二抗在37℃孵育60min；

优选地，步骤(5)中，显色剂为TMB，在室温避光显色5～15min；更优选显色10min；

优选地，步骤(6)中，终显色采用的终止液为H₂SO₄；更优选地，为1M H₂SO₄；

优选地，步骤(7)中，采用酶标仪测OD₄₅₀nm处吸光值；

优选地，步骤(8)中，判定标准为：对样品OD₄₅₀nm值进行S/P值校正，当S/P值≥0.29时判定为阳性，当S/P值≤0.24时判定为阴性，当S/P值介于两者之间时为可疑值，需做进一步验证。