CN101603076A - 检测i型干扰素生物学活性的细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法。更具体地，本发明涉及一种基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物如鸡、牛和猪的I型干扰素生物学活性的方法。与所有已报道的基于Mx启动子-报告基因检测方法中相比，该检测方法所需时间最短，可大幅度节约检测时间；与传统抗病毒定量检测方法相比，具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等显著优势，在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。

Description

检测I型干扰素生物学活性的细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法。更具体地，本发明涉及一种基于鸡Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物的I型干扰素生物学活性的方法。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是重要的抗病毒活性物质，是机体非特异免疫系统的重要组成部分，在动物和人类抗感染和肿瘤临床治疗上有着广泛的应用。但长期以来，一直缺乏理想的IFN活性标准定量检测方法。传统的IFN活性定量手段主要包括：1、抗病毒活性检测法(antiviral assays，AVA)，常用病毒为水疱性口炎病毒(Vesticularstomatitis virus，VSV)和脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV^[1]。AVA有其局限性，敏感性和准确性低，并具有一定生物安全危险性，因此研究者不断探索新的方法来替代AVA。2、ELISA^[1，2]方法，检测IFN的活性尽管方便快捷，但只能检测IFN的抗原性，一些无生物学活性的类IFN蛋白会影响检测结果，所以并不可靠，而且不同种的IFN需要不同的单抗，因此也影响其通用性。3、依据IFN具有的细胞增殖抑制、细胞活性功能调节、细胞分化和免疫调节等特性建立的其它生物学方法，均具有不同程度的局限性，或方法比较繁琐，或适用范围较窄。探索一种适用范围广且准确敏感的方法对IFN的基础和应用研究具有重要现实意义^[3-8]。

在哺乳动物、禽类和鱼类中，I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经由JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter，Mxp)，表达的Mx蛋白(Mxprotein)能够抑制负链RNA病毒复制^[6，9-11]；Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等其它细胞因子启动^[12，13]。

在已有的报告基因系统中，荧光素酶(luciferase，Luc)检测系统比氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(Lac Z)等其它报告基因检测系统系统更具快捷敏感的显著优势。采用Luc系统检测96个样品只需要几分钟即可完成，便于大通量检测；荧光素酶的检测量能低至10^-20mol，比CAT灵敏100倍，具有极高的敏感性，却安全无放射性；检测线性范围宽，0.0002-200pg，可检测最小稀释度的样品。Luc报告基因检测系统在受体活性、细胞内信号传导、mRNA加工、蛋白质折叠及蛋白-蛋白相互作用等研究中广泛应用^[14]。

本文构建了基于鸡Mxp和luc报告基因的IFN质粒检测系统，就其应用于检测禽类如鸡、或哺乳动物如猪或牛的I型干扰素生物活性的敏感性与传统抗病毒活性检测方法进行了比较研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物的I型干扰素生物学活性的方法。

具体地，本发明涉及如下各项：

1.一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建表达荧光素酶的重组质粒，该质粒包含Mx启动子和与该启动子可操作地连接的编码荧光素酶的基因；

2)将步骤1)中构建的重组质粒转染所述动物细胞；

3)用待测的动物I型干扰素样品处理在步骤2)中获得的转染细胞，比较在处理前后所述细胞的荧光素酶基因的表达水平。

2.根据以上1所述的方法，其中所述Mx启动子是鸡Mx启动子。

3.根据以上1或2所述的方法，其中所述动物是禽类如鸡、或哺乳动物如猪或牛。

4.根据以上1或2所述的方法，其中所述I型干扰素是α或β干扰素。

5.根据以上1或2所述的方法，其中在步骤1)中的鸡Mx启动子的序列如SEQ IDNO：1所示。

6.根据以上5所述的方法，其中在步骤1)中的重组质粒为pMxp-luc，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.根据以上1或2所述的方法，其中在步骤2)中的所述转染是稳定转染或瞬时转染。

8.根据以上1或2所述的方法，其中在步骤3)中的动物I型干扰素样品是重组表达所述动物I型干扰素的细胞系的培养上清液或相应I型干扰素重组质粒转染哺乳动物细胞的培养上清液。

9.根据以上8的方法，其中所述细胞系是BHK-21细胞或CHO细胞。

10.根据以上1或2所述的方法，其中在步骤2)中获得的动物细胞是MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC2416。

与所有已报道的基于Mx启动子-报告基因检测方法中相比，该检测方法所需时间最短，可大幅度节约检测时间；与传统抗病毒定量检测方法相比，本发明的检测方法具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等显著优势，在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。

发明详述

干扰素是一种重要的抗病毒物质，对其生物学活性的定量检测具有重要的基础研究和生产应用意义。Mx启动子是干扰素主要效应转录启动子之一，受I型IFN作用表达Mx蛋白。

在一个实施方案中，本发明克隆了鸡Mx启动子(Mxp)，其序列与已报道的都不同，有6个碱基的差异。在其下游连接荧光素酶(luciferase，luc)报告基因，构建成鸡I型干扰素活性检测质粒pMxp-luc。以pMxp-luc瞬时转染DF-1鸡胚成纤维细胞系，24小时后用鸡IFN-α/β处理细胞，结果萤光素酶基因在Mx启动子作用下获得转录表达；萤光素酶的表达量与干扰素的抗病毒活性有着良好的线性相关性，并在干扰素处理细胞6个小时后就可以检测；对鸡IFN-α和IFN-β检测的敏感性是分别是抗病毒活性定量检测方法的10和100倍；检测的线性范围约为0.3～30AU/ml。

在另一个实施方案中，本发明克隆了鸡Mx启动子(Mxp)，在其下游连上了萤光素酶(luciferase，Luc)报告基因。稳定转染pMxp-Luc至MDBK细胞中，筛选出同时可用于检测牛、猪等动物的I型干扰素生物学活性的细胞克隆MDBK-Mxp-Luc。MDBK-Mxp-Luc对不同来源(转染、CHO)的牛、猪IFN-α/β检测范围约为0.5-100AU/ml；并且重复性良好，批次内、批次间的变异系数分别不大于5.6％和9.2％，与已报道的重复性最高报告基因检测方法相近；IFN处理后5～6h萤光素酶表达水平最高，12h降到1/5；整个检测过程可在14h内完成，是所有检测方法中最快的；操作安全，整个过程没有用到病毒；检测简单准确，适用于高通量检测。MDBK-Mxp-Luc细胞还可以作为研究病毒感染与牛I型IFN系统相互作用的分子机制的有力工具。

附图简述

图1.鸡Mxp PCR和ChIFN-α和ChIFN-β的ORF RT-PCR产物电泳图

M，DL2000标记(marker)；1，鸡Mxp；2，鸡IFN-α；3，鸡IFN-β；

图2.使用VSV*GFP的pCA-ChIFN-α，pCA-ChIFN-β和pCAGGS转染上清的抗病毒活性检测。表达pCA-ChIFN-α，pCA-ChIFN-β和pCAGGS的转染BHK-21的上清被分别命名为ChIFN-α，ChIFN-β和mock。病毒对照(VC)是不含IFN样品、但是也加入VSV*GFP的孔。ChIFN-α和ChIFN-β的抗病毒活性分别约为10^2.50和10^4.45AU/ml，在pCAGGS的10倍稀释上清中未检测到抗病毒活性。*()中的数字是IFN样品的稀释倍数；

图3.Mxp启动萤光素酶转录表达质粒pMxp-luc的构建；

图4.以Mxp和萤光素酶报告基因系统检测鸡IFN-α/β的生物学活性；

空白-对照(BC)：不含IFN但是以同样方式转染。(A)所有样品稀释100倍；(B)所有样品作10倍系列稀释；

图5.牛、猪IFN-α/β的抗病毒活性滴定。病毒对照(VC)是不含IFN样品、但是也加入VSV*GFP的孔。*()中的数字是IFN样品的稀释倍数；

图6.瞬时转染验证IFN对Mxp的激活反应。基于瞬时转染验证IFN对Mxp的激活反应。MDBK细胞于24孔细胞培养板中过夜生长至密度为70％，参照说明书以Fugene6进行pMxp-Luc和pRL-tk共转染。转染后24小时，细胞用100倍稀释的BoIFN-β(A)和PoIFN-β(B)处理，于37℃及5％CO₂中培养6小时。然后，两种质粒表达的荧光素酶用双荧光素酶检测系统(Dual-Luciferase assay system)检测。其中，pRL-tk表达的海肾荧光素酶作为转染效率的内参。

图7.IFN处理MDBK-Mxp-Luc细胞后萤光素酶表达量的时间曲线。MDBK-Mxp-Luc细胞在24孔板中过夜生长至单层汇合后，分别用100倍稀释的BoIFN-α(A)、BoIFN-β_CHO(B)、PoIFN-α(C)和PoIFN-β_CHO(D)处理，于37℃及5％CO₂中培养，分别于2、4、5、6、8、10和12小时用高亮荧光素酶检测系统(Bright-GloLuciferase Assay System)检测荧光素酶的表达。设不加干扰素的空白对照孔(blankcontrol，BC)。

图8.MDBK-Mxp-Luc检测猪、牛IFN-α和IFN-β的生物学活性。基于MDBK-Mxp-Luc细胞分析BoIFN-α(A)、BoIFN-β_CHO(B)、PoIFN-α(C)和PoIFN-β_CHO(D)的生物学活性。MDBK-Mxp-Luc细胞在24孔板中过夜生长至单层汇合后，用10倍梯度稀释的干扰素样品处理，于37℃及5％CO₂中培养5小时后，用高亮荧光素酶检测系统(Bright-Glo Luciferase Assay System)检测荧光素酶的表达。设不加干扰素的空白对照孔(blank control，BC)。图中曲线旁的数字表示此稀释度干扰素的抗病毒活性单位(AU/ml)。

具体实施方式

下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1.基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测鸡I型干扰素生物学活性的研究

1材料与方法

1.1质粒、细胞株和病毒毒株

鸡胚成纤维传代细胞系(DF-1)(ATCC No.CRL-12203)为本实验室保存，含有荧光素酶基因的质粒pGL3-Basic购自Promega公司。

稳定真核表达载体pCI-neo(pCN)购自Promega公司，neo在SV40早期启动子的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC(ATCC No.CCL-61)，CHO-K1细胞于含10％FBS的DMEM-Ham’s F12(DF12)培养基(invitrogen)中培养。

pMD18-T载体购自TaKaRa公司；克隆质粒pBluescript II KS(+)购自invitrogen公司；原核表达质粒pET-32a(+)(Novagen公司)、传代牛肾细胞系(MDBK)(ATCC No.CCL-22)和BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)均由本实验室保存；原代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts，CEFs)采用10日龄的SPF鸡胚常规方法^[15]制备；表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)商购自中国农业部哈尔冰兽医研究所，或者可以按照参考文献^[15]通过反向遗传技术构建，MDBK细胞系滴定PFU(plaque forming unit)后-70℃保存；新城疫LaSota株病毒(CCVC NO.AV1615)商购自中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统(CCCCM)下属的兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC，北京)，由本实验室保存，CEFs滴定PFU后-70℃保存备用。

1.2试剂与仪器

双萤光素酶检测试剂(Dual-Luciferase assay system，Promega)购自Promega公司。T4DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维素膜购自Pierce公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自Sigma公司；高亮萤光素酶检测试剂(Bright-Glo Luciferase assay system)购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司；转染试剂Fugene6购自Roche公司；96孔白色板(96well whiteplate)购自Corning公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；Microplate FluorescenceReader(FLx800)为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光；CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。Grace’s培养基、DMEM培养基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。DAB显色试剂盒购自博士德公司。

1.3Mxp基因克隆及其启动luc报告基因转录表达质粒的构建

根据GenBank鸡Mxp序列(GenBank Accession No.Z23167)，设计引物，上游引物为：5′-ccc gaa ttc tcg gtg tca cat cca cac ggt，引入了EcoR I酶切位点；下游引物为：5′-ccc ctc gag ctg cca gag tca cac agc aag，引入Xho I酶切位点。常规方法提取CEFs基因组，采用Ex-Taq酶进行PCR，PCR产物胶回收后EcoR I和Xho I双酶切克隆到EcoRI和Xho I双酶切的pBluescript II KS(+)中得到pBlue-Mxp，CEQ8000自动测序仪测序。pIRES2-eGFP(购自Clontech)以Vsp I单酶切后，用T4DNA聚合酶平端化，再以Xho I酶切，切掉CMV启动子，胶回收载体片段；pBlue-Mxp以Sma I和Xho I双酶切下的Mxp片段，与如前述处理的pIRES2-eGFP载体片段连接，以Mxp替换pIRES2-eGFP载体的CMV启动子，获得质粒pMxp-IRES-eGFP，pGL3-Basic以Xho I和Xba I双酶切下Luc，克隆至同样Xho I和Xba I双酶切的pMxp-IRES-eGFP，构建成luc报告基因转录质粒pMxp-luc(质粒pMxp-luc的DNA全序列如SEQ ID NO：2所示)。pMxp-luc采用中量制备试剂盒制备用于转染。

1.4IFN表达质粒的构建

从GenBank获取鸡IFN-α(ChIFN-α)或IFN-β(ChIFN-β)的ORF序列(ChIFN-αGenBank Accession No.U07868；ChIFN-βGenBank Accession No.AY974089)，设计引物。ChIFN-α的上游引物为：5′-TGC CAC CAT GGC TGT GCC TGC AAG-3’；下游引物为：5′-TGG GAG GTG CGT TTG GGG CTAAGT-3’。ChIFN-β的上游引物为：5′-TGCCAC CAT GAC TGC AAA CCA TCA G-3’；下游引物为：5′-ACT CAC TGG GTG TTGAGA CGT T-3’。两种上游引物均在起始密码子ATG前加入了利于表达的Kozak序列。

CEFs待生长至100％左右时，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒。感染后8个小时收细胞，用Trizol(invitrogen)提取总RNA，进行RT-PCR。扩增的ChIFN-α/βPCR产物克隆到pMD18-T载体，获得质粒pMD18-ChIFN-α和pMD18-ChIFN-β，并测序鉴定。

把pMD18-ChIFN-α和pMD18-ChIFN-β分别以Sal I/Xba I和EcoR I/Sal I双酶切下ChIFN-α和ChIFN-β的ORF片断分别亚克隆至以Xho I/Nhe I和EcoR I/Xho I双酶切的质粒pCAGGS^[16，17]，获得真核表达质粒pCA-ChIFN-α和pCA-ChIFN-β。

1.5瞬时转染

分别以pCA-ChIFN-α、pCA-ChIFN-β和pCAGGS，按照Fugene 6按操作说明书转染至BHK-21细胞，于转染后48小时收获细胞培养上清，分别命名为ChIFN-α、ChIFN-β和mock，分装并于-70℃保存备用。

1.6抗病毒活性滴定

IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献^[15]，具体如下：DF-1细胞于96孔细胞板中生长至密度为90％，弃上清，每孔加10倍梯度稀释IFN样品100μl，每个稀释倍数设3个平行对照孔，37℃及5％CO₂培养条件下处理24h后，弃上清，用含2％FBS的DMEM稀释VSV*GFP，按每孔300PFU(100μl)加入病毒稀释液，同时设未经转染上清处理，只加病毒液的病毒对照(Virus Control，VC)孔。不加干扰素和病毒的孔，作为空白孔(Blank Control，BC)。接毒后至VC孔的CPE(cytopathic effect)约为100％时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最后所有孔每孔加入50μl细胞裂解液(cell lysis buffer，CLB)[0.15mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1.5％TritonX-100]，于摇床上裂解15min释放细胞内的GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性设置为70，激发光485nm，吸收光528nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达水平。判定：以BC孔校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为VC孔50％的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit，AU)，计算具体如下。

基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法如下：若绿色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units，RFU)用F表示，以BC孔校0，则50％病毒复制抑制的荧光值(F50)＝F(VC)/2，按下面公式计算IFN的抗病毒活性单位：log₁₀[每mL中IFN抗病毒活性单位(AU)]＝[F50-F(小于F50孔)]/[F(高于F50孔)-F(小于F50孔)]+log₁₀[小于F50孔的稀释倍数]。

1.7萤光素酶活性检测

DF-1细胞于24孔细胞培养板培养过夜至密度约为60％，用Fugene6共转染转染pMxp-luc和pRL-TK(商购自Promega公司)，二者的比例为1μg∶1μg，其中pRL-TK质粒表达海肾萤光素酶，作为转染效率的内参。转染后24小时用10倍梯度稀释的上述转染细胞上清ChIFN-α、ChIFN-β和mock处理DF-1，每稀释梯度设3个平行孔，同时设未经转染上清处理但同样转染的空白对照(Blank Control，BC)。6小时后参照双萤光素酶检测试剂说明书检测DF-1内两种萤光素酶的表达水平。

2结果

2.1ChIFN-α/β的克隆及其表达产物抗病毒活性检测

以ChIFN-α和ChIFN-β的ORF特异引物进行RT-PCR，分别从CEFs扩增出588bp和612bp的产物(图1的B和C)与预期结果相符，经测序鉴定证实获得了ChIFN-α和ChIFN-β完整基因。再分别将ChIFN-α和ChIFN-β完整ORF克隆至高效真核表达质粒pCAGGS^[16，17]中，构建成pCA-ChIFN-α、pCA-ChIFN-β。分别以pCA-ChIFN-α、pCA-ChIFN-β或pCAGGS转染BHK-21细胞，于转染后4h后换液，再48小时收获细胞培养上清，分别命名为ChIFN-α、ChIFN-β和mock，其抗病毒活性采用VSV*GFP于DF-1细胞进行抗病毒活性滴定(图2)。结果，细胞转染收获上清ChIFN-α和ChIFN-β的抗病毒活性分别约为10^2.50(316)、10^4.45(2.8×10⁴)AU/ml，mock的10倍稀释度未检测到抗病毒活性；VSV*GFP系统对ChIFN-α和ChIFN-β检测下限分别为10³(0.32AU/ml)和10⁵(0.28AU/ml)稀释倍数。

2.2Mxp启动luc转录表达质粒pMxp-luc的构建及其对ChIFN-α/β刺激的激活反应

从CEFs基因组扩增的鸡Mxp启动子PCR产物片段约470bp(图1的A)，与预期结果相符，序列测定结果与已报导的序列^[13]有6个碱基的差异，但其中IFN应答的关键基因序列(ISRE)为5’-AGT TTC GTT TCT，完全一致。进一步先以Mxp替换pIRES2-eGFP的CMV启动子，再用萤光素酶报告基因替换IRES-eGFP，构建成pMxp-luc，使萤光素酶在Mxp的控制下表达(图3)。

pMxp-luc转染CEFs细胞中，经ChIFN-α和ChIFN-β处理后，Mxp被有效激活，luc获得表达(图4的A)；ChIFN-α检测下限为10⁴倍(3.6×10^-2AU/ml)稀释，ChIFN-β的检测下限高达10⁷倍(2.8×10^-3AU/ml)稀释度，分别是上述VSV*GFP检测下限的10倍和100倍，检测的敏感性与抗病毒定量检测相比显著提高(图4的B)。从图7(B)还可以估计ChIFN-α的检测线性范围为0.32～30AU/ml，ChIFN-β检测的线性范围约为0.28～28AU/ml。

3讨论和结论

IFN-α/β主要作用于I型IFN受体，激活JAK1和TYK2，促使STAT蛋白的酪氨酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9复合物，即IFN刺激基因因子3(IFN-stimulatedgene factor 3，ISGF3)，ISGF3转运到核内结合到ISRE，转录表达各种抗病毒蛋白^[18]。因此ISRE是I型IFN发挥生物学功能的关键。本研究中ChIFN-α和ChIFN-β作用于pMxp-luc的ISRE转录表达萤光素酶，萤光素酶的表达量与IFN的抗病毒活性成良好的线性相关。

病毒复制抑制试验是目前检测干扰素的生物学活性的传统方法。传统方法抗病毒活性的判定标准主要有三种方法，病毒复制抑制(Virus yield-ReductionAssay，VYRA)、噬斑减少分析(Plaque Reduction Assay，PRA)、细胞病变抑制(Cytopathic EffectReduction Assay，CPERA)等方法。但三种方法都存在误差较大、重复性差、精确度低和、耗时长和安全性差等缺点^[5，19]。

本研究建立的Mxp-luc检测系统显示出诸多方面的优越性点，整个过程完全避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；检测程序简化，时间大大缩短，在IFN处理细胞后约6个小时即可完成检测，因此检测速度快；萤光素酶的表达可以通过仪器检测精确量化，不仅提高了IFN定量的准确性，而且便于大量样品的高通量操作；比ELISA方法相比，Mxp-luc系统检测的是IFN的激活Mxp的能力，不存在假阳性；本实验中Mxp-luc检测ChIFN-α和ChIFN-β的敏感性分别为VSV*GFP检测敏感性的10倍和100倍，显示了其在检测敏感性上的优越性；Mxp-luc检测系统具有IFN刺激反应专一性，其它细胞因子如白细胞介素(interleukin)，肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor)、白细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor)等均对其不产生干扰^[11，12]。

由于本研究是基于转染的方法，因此步骤繁琐，背景也较高，但是如果把Mxp-luc框架稳定转染至细胞中，建立稳定检测细胞系，那么将显著减少操作步骤，从准备细胞到完成检测只需要15小时左右，相比较于抗病毒检测的40-48小时，大大节约了检测时间；同时检测结果会更稳定可靠。

结论，本研究克隆了鸡Mxp启动子，建立了基于Mxp启动荧光素酶基因转录表达质粒pMxp-luc的IFN生物活性检测系统，用于检测包括鸡在内的动物的I型干扰素的生物学活性。

实施例2.报告基因分析定量检测猪、牛I型扰素生物学活性

1材料与方法

1.1质粒、细胞株和毒株

同实施例1

1.2试剂与仪器

同实施例1

1.3猪和牛IFN-α/β的基因克隆及真核表达质粒的构建

从GenBank获取猪和牛IFN-α的序列(猪IFN-α的GenbankAccession No.X57194；牛IFN-α的Genbank Accession No.Z46508)，设计引物。BoIFN-α(牛IFN-α)的上游引物为：5′-GGC CAC CAT GGC CCC AGC CTG GTC C；下游引物为：5′-CCA GGT GTGTGG TCA GTC CTT TC。PoIFN-α(猪IFN-α)的上游引物为：5′-CTG AAT TCG CCA CCATGG CCC CAA CCT C，引入EcoR I酶切位点；下游引物为：5′-GGC TCG AGT CACTCC TTC TTC CTG，引入Xho I酶切位点。上游引物中都在起始密码子ATG前引入了利于真核表达的Kozak序列。

PK15(ATCC No.CCL-33)和MDBK细胞密度为90％左右时，按MOI为1.0接种新城疫LaSota株病毒(CCVC NO.AV1615)，感染后8个小时，收细胞并提取总RNA做RT-PCR扩增BoIFN-α和PoIFN-αORF基因。PCR产物克隆到pMD18-T载体获得质粒pMD18-BoIFN-α和pMD18-PoIFN-α，并测序鉴定后，用双酶(对应于各个引物设计的酶切位点)切下IFN-α片断，并克隆到同样双酶切割的质粒pCAGGS上，分别获得真核表达质粒pCA-BoIFN-α和pCA-PoIFN-α。

从GenBank获取BoIFN-β(牛IFN-β)的ORF序列(GenBank Accession No.E00139)，设计引物。上游引物为5’-TGC CAC CAT GAC CTA CCG GTG CCT C，下游引物为5’-ACA GGT GGG AGA TGT TCA GTC AC，上游引物在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列。

传代牛肾细胞系(MDBK)(ATCC No.CCL-22)细胞生长至密度为90％左右时，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒(CCVCNO.AV1615)。8h后收细胞，用Trizol(Invitrogen公司)提取总RNA，进行RT-PCR。扩增的BoIFN-βPCR产物克隆到pMD18-T载体获得质粒pMD18-BoIFN-β，通过测序鉴定。

从质粒pMD18-BoIFN-β以Sal I/Xba I双酶切下BoIFN-β的ORF片断，克隆至以Xho I/Nhe I双酶切的质粒pCAGGS，获得瞬时真核表达质粒pCA-BoIFN-β。

从质粒pMD18-BoIFN-β以Sal I/Xba I双酶切下BoIFN-β的ORF片断，以T4DNA聚合酶平滑化末端后克隆至Sma I酶切的稳定真核表达质粒pCI-neo(在本文中也称为pCN)(Promega公司)，获得稳定真核表达质粒pCN-BoIFN-β。

从GenBank获取PoIFN-β(猪IFN-β)的ORF序列(Genbank Accession No.S41178)，设计引物。上游引物为5’-TGC CAC CAT GGC TAA CAA GTG CAT C，下游引物为5’-AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上游引物在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列。

PK15细胞生长至密度为90％左右时，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒。8h后收细胞，用Trizol提取总RNA，以上述引物进行RT-PCR。扩增的PoIFN-β PCR产物亚克隆到PMD18-T载体获得质粒pMD18-PoIFN-β，测序鉴定。

从质粒pMD18-BoIFN-β以EcoR I/Sal I双酶切下BoIFN-β的ORF片断，分别亚克隆至以Xho I/Nhe I双酶切的质粒pCAGGS，或亚克隆至以T4DNA聚合酶平滑化末端后克隆至Sma I酶切的质粒pCN，获得瞬时真核表达质粒pCA-PoIFN-β和稳定真核表达质粒pCN-PoIFN-β。

1.4重组IFN

瞬时转染：

以pCA-BoIFN-α、pCA-PoIFN-α和pCAGGS，按照Fugene 6按操作说明书转染至BHK-21细胞，于转染后16h换液，继续培养48h收获细胞培养上清，分别命名为BoIFN-α_pCA、PoIFN-α_pCA和mock_pCA。

稳定转染：

源自CHO细胞的BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO的制备：

参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-BoIFN-β或pCN-PoIFN-β至CHO-K1细胞。转染后24小时，按1∶8的比例进行细胞传代，用含有800μg/ml G418的压力筛选培养液筛选培养细胞，10～14天后，用克隆环圈住具有新霉素抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5×10⁶个细胞接种于6孔细胞培养板中生长至密度为100％后24小时，收取细胞培养上清，分别如上用VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克隆按限稀释法再进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常规方法冻存细胞，分别命名为CHO-BoIFN-β和CHO-PoIFN-β，含有重组BoIFN-β和重组PoIFN-β的细胞培养上清分别命名为BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO。本发明的阳性CHO细胞克隆(CHO-BoIFN-β)于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2415。本发明的阳性CHO细胞克隆(CHO-PoIFN-β)于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2412。

以上收获的重组干扰素都分装后于-70℃保存。

1.5抗病毒活性滴定

IFN抗病毒活性滴定步骤基本同实施例1，不同的地方是：干扰素样品先稀释1000倍，然后再4倍梯度稀释。

1.6Mxp的克隆与检测质粒的构建

同实施例1。

1.7稳定转染整合Mxp-Luc的MDBK细胞系的建立

方法参考文献^[4]，主要步骤如下：参照转染试剂Fugene6操作说明书转染pMxp-Luc至MDBK细胞。转染后24小时，按1∶10的比例进行细胞传代，用含有600μg/ml G418的压力筛选培养液筛选具有新霉素抗性的细胞克隆。筛选出的细胞克隆扩增培养后，接种到24孔板中生长至密度为100％时，用含有5％FBS的DMEM100倍稀释的BoIFN-β_CHO处理6小时后，用高亮萤光素酶检测系统检测荧光素酶的表达，设未用IFN处理的对照孔，选择表达水平最高的克隆再进行一次单细胞克隆筛，并按上述步骤筛选诱导表达水平最高的克隆，扩增培养并冻存，作为检测I型干扰素的细胞系，命名为MDBK-Mxp-Luc。本发明的阳性MDBK细胞克隆(MDBK-Mxp-Luc)于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2416。

1.8Mxp-Luc分析方法

基于转染的方法：参照Fugene 6按操作说明书共转染pMxp-Luc和pRL-TK至24孔细胞板中的MDBK细胞，二者的比例为1∶1，转染后24小时，加入以含有5％FBS的DMEM100倍稀释的IFN样品，每个样品设3个平行孔，细胞于37℃及5％CO₂培养6小时后参照双萤光素酶检测系统说明书检测MDBK内两种萤光素酶的表达。

基于MDBK-Mxp-Luc细胞系的方法：使细胞于24孔板中过夜生长至密度约100％时，分别加入以含5％FBS的DMEM10倍梯度稀释的IFN样品400μl，于37℃及5％CO₂培养5小时后，参照高亮萤光素酶检测系统说明书检测细胞内萤光素酶的表达。每个稀释度都设2个平行孔，设未用IFN处理的空白孔(Blank Control，BC)。

2结果

2.1抗病毒活性滴定

转染收获的细胞上清BoIFN-α_pCA、PoIFN-α_pCA；CHO-BoIFN-β、CHO-PoIFN-β稳定细胞系的细胞培养上清BoIFN-β_CHO、PoIFN-β_CHO都先稀释1,000倍后，再4倍梯度稀释，采用VSV^*GFP于MDBK细胞进行抗病毒活性滴定。结果如图5，BoIFN-α_pCA、BoIFN-β_CHO、PoIFN-α_pCA、和PoIFN-β_CHO的抗病毒活性分别约为207,058、102,316、154,452、和366,745AU/ml。

2.2Mxp基因的克隆和检测质粒的构建

见实施例1。

2.3稳定整合Mxp-Luc的MDBK细胞克隆的筛选和鉴定

为了获得稳定整合Mxp-Luc的MDBK细胞克隆，在600μg/ml G418的压力筛选下共进行了两次单细胞克隆，确保整合的稳定性。同时对每次筛选出的克隆用BoIFN-β_CHO处理后，检测荧光素酶的表达，以从众多G418阳性克隆中选出一株敏感的细胞克隆，命名为MDBK-Mxp-Luc(CGMCC No.2416)，并用含有400μg/ml G418和5％FBS的DMEM培养传代。

2.4Mxp-Luc对猪、牛IFN-α/β生物学活性的检测

为了验证Mxp是否可以被猪、牛的IFN激活，把pMxp-Luc和pRL-TK共转染至MDBK细胞后24小时，分别加入100倍稀释的BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO处理细胞6个小时，参照双萤光素酶检测系统说明书检测MDBK内两种萤光素酶的表达，其中海参萤光素酶的表达作为转染效率的内参(图6)，结果表明Mxp能够分别被BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO激活，表达量是空白对照的20倍到25倍。同时虽然本实验中MDBK的转染效率不到1％(数据未显示)，但萤光素酶的微量表达仍然能够被检测到，显示了其极高的敏感性。

为了确定干扰素处理MDBK-Mxp-Luc细胞的时间，分别于加入100倍稀释的BoIFN-α_pCA、BoIFN-β_CHO、PoIFN-α_pCA和PoIFN-β_CHO样品后的2、4、5、6、8、10和12小时检测IFN刺激Mxp表达的萤光素酶，每个时间点都做3个平行孔，设未用IFN处理的空白孔(Blank Control，BC)。结果，BoIFN-α、BoIFN-β_CHO、PoIFN-α和PoIFN-β_CHO在刺激Mxp表达萤光素酶上都相似，于5-6小时左右达到峰值(图7)，因此选择5小时作为此后检测中IFN样品处理细胞的时间。

以MDBK-Mxp-Luc检测10倍梯度稀释的BoIFN-α_pCA、BoIFN-β_CHO、PoIFN-α_pCA、和PoIFN-β_CHO，于刺激5个小时后检测萤光素酶的表达，结果(图8)显示MDBK-Mxp-Luc对所有IFN样品的检测范围在约0.1和100AU/ml之间，并且在0.5和100AU/ml活性范围内，萤光素酶的表达量和IFN活性近似线性关系。MDBK-Mxp-Luc系统检测IFN活性的下限(表1)和AVA(VSV*GFP)比较，除了PoIFN-β_CHO，MDBK-Mxp-Luc检测方法要比抗病毒活性定量检测方法的敏感性要略高。10倍稀释的转染对照上清、阴性CHO培养液，几乎对Mxp没有激活，而10倍稀释的野生型杆装病毒感染的上清，对Mxp有较高激活，可能是由于杆装病毒一过性感染的结果，100倍稀释的就几乎没有激活。

由于没有猪和牛IFN标准品(WHO)，所以为了检验MDBK-Mxp-Luc检测方法的重复性，本研究通过计算BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO比值的变异系数来实现。把BoIFN-β_CHO分别进行100倍(A)和100,000倍(B)稀释，把PoIFN-β_CHO进行1,000倍(C)和1000,000倍(D)稀释。其中样A和C的活性较高(60～100AU/ml)，为MDBK-Mxp-Luc检测线性范围的上限；样B和D的活性较低(0.6～1.0AU/ml)，为MDBK-Mxp-Luc检测线性范围的下限。分别以MDBK-Mxp-Luc在同一批次内和不同批次间检测样A、B、C和D各10次，检测并计算萤光素酶表达量比值(RLU_A/C和RLU_B/D)的变异系数，由表2可知，在同一批次，MDBK-Mxp-Luc检测高活性BoIFN-β_CHO和PoIFN-β_CHO的比值(RLU_A/C)为1.13±0.063，变异系数为0.056；检测低活性(RLU_B/D)为1.15±0.044，变异系数为0.038。对于不同批次间的检测，相应的RLU_A/C为1.10±0.100，变异系数为0.092；RLU_B/D为1.12±0.094，变异系数为0.084。

表1MDBK-Mxp-Luc和AVA检测敏感性的比较

分别用MDBK-Mxp-Luc和AVA(使用VSV*GFP)方法分析BoIFN-α，BoIFN-β_CHO，PoIFN-α和PoIFN-β_CHO的生物学活性。结果表明，前者比后者敏感性略高。图中数值表示干扰素样品的稀释倍数。

^a表示此稀释度干扰素的生物学活性“不能够”被检测出。

^b表示此稀释度干扰素的生物学活性“能够”被检测出。

表2MDBK-Mxp-Luc检测的重复性

BoIFN-β_CHO分别以10倍(A)和100,000倍(B)稀释，PoIFN-β_CHO分别以1,000倍(C)和1000,000倍(D)稀释。那么，A和C样的抗病毒活性较高(600～1020AU/ml)，B和D样的抗病毒活性较低(0.6～1.0AU/ml)。用MDBK-Mxp-Luc分别同一批次内和批次间对A、B、C和D样检测10次，计算A和C、B和D的比值，分别用RLU(相对荧光单位)A/C和RLU B/D表示，然后分别计算上述比值的平均值、标准差和变异系数。

3讨论

IFN-α/β主要作用于I型IFN受体，激活JAK1和TYK2，促使STAT蛋白的酪氨酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9复合物，即IFN刺激基因因子3(IFN-stimulatedgene factor3，ISGF3)，ISGF3转运到核内结合到含有ISRE的DNA调节序列，刺激超过100种IFN刺激基因(ISGs)的转录，诱导出“抗病毒状态”。因此ISRE是I型IFN诱导出抗病毒状态的关键。哺乳动物IFN-α/β效应基因内有序列为5’-A/GGTTTCN_(1-2)TTTCC/T-3’的ISRE基序，而鸡Mxp内的序列5’-AGTTTCGTTTCT-3’符合上述序列的特征。因此，鸡Mxp不但适用于鸡I型IFN的检测，也适用于哺乳动物I型IFN生物活性的检测，本文证实鸡Mxp能够用于牛、猪IFN-α/β的生物学活性检测。

本研究建立的MDBK-Mxp-Luc检测系统显示出诸多方面的优越性：整个过程完全避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；萤光素酶的表达可以通过仪器检测精确量化，不仅提高了IFN定量的准确性，而且便于高通量操作，变异系数小于10％，大大优于抗病毒检测的重复性(15％-59％)。此外，在约0.1～100AU/ml之间，干扰素活性与萤光素酶的表达成正相关，在约0.5～100AU/ml之间，成线性相关，在线性范围内只需要一个稀释度就能够得出检测结果，减少了工作量。

再与ELISA方法相比，MDBK-Mxp-Luc系统检测的是IFN激活Mxp的能力，不存在假阳性；本试验对不同来源的牛、猪IFN-α/β的检测表明，总体来讲MDBK-Mxp-Luc检测方法比抗病毒活性定量分析(VSV*GFP)的敏感性略高，具有一定优越性。

除以上优点外，与报道的报告基因检测系统相比较，I型干扰素刺激Mx启动子的时间与萤光素酶的表达量的关系明显不同。已有的报道使用人、鼠、鱼的Mx启动子和氯霉素乙酰转移酶(CAT)、Luc和人生长激素(hGH)等报告基因，在vero、MDBK或CHSE等细胞上检测人、鼠、鱼或牛的I型干扰素，干扰素处理后48h，报告基因的表达仍然在增加，一般选择24h或48h作为干扰素处理细胞的时间，整个检测所需时间最少22小时^{[3-7，20，21]}。对于MDBK-Mxp-Luc分析系统，干扰素刺激5～6h，萤光素酶的表达就已达到最高峰，并且在12h降低了5倍，这与以往所有的报道都不相同。整个检测可在14个小时内完成，是已报道的基于Mx启动子和报告基因检测方法中最快的，相比较于抗病毒活性检测方法的40-48小时，更是大大节约了检测时间。本方法中鸡Mx启动子和其它启动子刺激时间差异的根本原因是什么？可能是由于本研究克隆的鸡Mxp启动子碱基序列特殊性，或启动子结构上的不同，也可能是由于其它未知原因，但无论如何，对这些未知的探索将会增进我们对干扰系统进化及诱导机制的了解。

在一些病毒感染的过程中，病毒表达的某些蛋白(如牛呼吸道合胞病毒和流感的NS蛋白、尼帕病毒和新城疫病毒的V蛋白等)通过阻断I型IFN的信号转导通路来抵御宿主的进攻，而ISRE在I型IFN抑制病毒感染复制中是一个重要的枢纽，因此MDBK-Mxp-Luc细胞系还作为研究病毒感染与牛I型IFN系统相互作用的分子机制的有力工具。

结论，本研究建立了敏感、准确、快速、简便和安全的猪、牛I型干扰素报告基因分析方法，可用来替代费时费力的传统AVA方法。

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序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>检测I型干扰素生物学活性的细胞系及其应用

<130>IB083070

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>460

<212>DNA

<213>鸡

<400>1

tcggtgtcac atccacacgg tccttgaaca ctcctagaga tgactccacc acctctctgg    60

gcagcctgtg ccactgcctc accactcttt cggggaataa atgtttcctg atatccaacc    120

tgaaaaggaa aggggctgtt gctcataagc agtattacct agcacctgtg ccatctgccc    180

tctgattcct ctgcaggaga aggagaaacc acaggacaag gagggtagta gtgcattgga    240

gtggttttgt tacagggttc tgcaaagaac tgggacgaaa attggctaat ggatgaggaa    300

tttgagtgaa acacacatca ggatactgtt ttcaataatg aaagcatttt agtttcgttt    360

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<210>2

<211>5505

<212>DNA

<213>鸡

<400>2

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ccacctctct gggcagcctg tgccactgcc tcaccactct ttcggggaat aaatgtttcc    120

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ttagtttcgt ttctccttgt ttatgtcatg taagtggagt cttgtgtata gaaaagcatt    420

cagagcggct gaatgtagtt aattgtttct ccttgctgtg tgactctggc agctcgagat    480

ctgcgatcta agtaagcttg gcattccggt actgttggta aagccaccat ggaagacgcc    540

aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatccgctgg aagatggaac cgctggagag    600

caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg gaacaattgc ttttacagat    660

gcacatatcg aggtggacat cacttacgct gagtacttcg aaatgtccgt tcggttggca    720

gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa tcgtcgtatg cagtgaaaac    780

tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta tcggagttgc agttgcgccc    840

gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta tgggcatttc gcagcctacc    900

gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga acgtgcaaaa aaagctccca    960

atcatccaaa aaattattat catggattct aaaacggatt accagggatt tcagtcgatg    1020

tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg aatacgattt tgtgccagag    1080

tccttcgata gggacaagac aattgcactg atcatgaact cctctggatc tactggtctg    1140

cctaaaggtg tcgctctgcc tcatagaact gcctgcgtga gattctcgca tgccagagat    1200

cctatttttg gcaatcaaat cattccggat actgcgattt taagtgttgt tccattccat    1260

cacggttttg gaatgtttac tacactcgga tatttgatat gtggatttcg agtcgtctta    1320

atgtatagat ttgaagaaga gctgtttctg aggagccttc aggattacaa gattcaaagt    1380

gcgctgctgg tgccaaccct attctccttc ttcgccaaaa gcactctgat tgacaaatac    1440

gatttatcta atttacacga aattgcttct ggtggcgctc ccctctctaa ggaagtcggg    1500

gaagcggttg ccaagaggtt ccatctgcca ggtatcaggc aaggatatgg gctcactgag    1560

actacatcag ctattctgat tacacccgag ggggatgata aaccgggcgc ggtcggtaaa    1620

gttgttccat tttttgaagc gaaggttgtg gatctggata ccgggaaaac gctgggcgtt    1680

aatcaaagag gcgaactgtg tgtgagaggt cctatgatta tgtccggtta tgtaaacaat    1740

ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc tacattctgg agacatagct    1800

tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc gttgaccgcc tgaagtctct gattaagtac    1860

aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg gaatccatct tgctccaaca ccccaacatc    1920

ttcgacgcag gtgtcgcagg tcttcccgac gatgacgccg gtgaacttcc cgccgccgtt    1980

gttgttttgg agcacggaaa gacgatgacg gaaaaagaga tcgtggatta cgtcgccagt    2040

caagtaacaa ccgcgaaaaa gttgcgcgga ggagttgtgt ttgtggacga agtaccgaaa    2100

ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa atcagagaga tcctcataaa ggccaagaag    2160

ggcggaaaga tcgccgtgta attctagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt    2220

ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca    2280

attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct  tataatggtt acaaataaag caatagcatc   2340

acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc    2400

atcaatgtat cttaaggcgt aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa    2460

tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa    2520

atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact    2580

attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc    2640

actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa    2700

tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc    2760

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Claims (10)

1.一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建表达荧光素酶的重组质粒，该质粒包含Mx启动子和与该启动子可操作地连接的编码荧光素酶的基因；

2)将步骤1)中构建的重组质粒转染所述动物细胞；

3)用待测的动物I型干扰素样品处理在步骤2)中获得的转染细胞，比较在处理前后所述细胞的荧光素酶基因的表达水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Mx启动子包含I型干扰素应答的关键基因序列(ISRE)5’-AGTTTCGTTTCT，优选是鸡Mx启动子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述动物是禽类如鸡、或哺乳动物如猪或牛。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述I型干扰素是α或β干扰素。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤1)中的鸡Mx启动子的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤1)中的重组质粒为pMxp-luc，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤2)中的所述转染是稳定转染或瞬时转染。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤3)中的动物I型干扰素样品是重组表达所述动物I型干扰素的细胞系的培养上清液或相应I型干扰素重组质粒转染哺乳动物细胞的培养上清液，优选处理转染细胞5至6小时，优选所述细胞系是BHK-21细胞或CHO细胞。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤2)中获得的动物细胞是MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC 2416。

10.MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC 2416。

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