CN102660552B

CN102660552B - 一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法

Info

Publication number: CN102660552B
Application number: CN201110458380.XA
Authority: CN
Inventors: 王华岩; 魏育蕾; 张军林; 程祥
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN102660552A

Abstract

一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及方法，将该基因在牛基因组中定位，并初步验证功能；用人的IL32基因序列在在NCBI及牛基因组数据库中进行序列比对，找出牛IL-32γ的构型，并在牛脾脏组织中进行分子克隆，该克隆出的基因序列已被NCBI收录(GenBank序列号为JQ327711，未经公布)；然后构建一种包含该牛IL-32γ的表达载体pIRES-IL32γ-GFP，以及一种基于该载体的包含牛IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞系RAW264.7，验证牛IL-32γ具有诱导IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子的功能。

Description

一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法

技术领域

本发明属于基因克隆领域，涉及一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法。

背景技术

白细胞介素32，原命名为细胞杀伤因子4型变体(NK4)。是Kim等在用基因芯片研究IL18高诱导表达因子时，发现有一种高表达细胞因子样基因，编码炎症性细胞因子，因此命名为白细胞介素32。

目前研究发现，人类IL-32基因定位于人染色体16p13.3上，含有8个外显子，通过不同的可变剪切成6种构型，分别为α、β、γ、δ、ε和ζ，其中γ型在其N端有一个疏水信号肽，可介导该蛋白跨膜表达。IL-32的6种构型都具有生物活性，其中以γ构型[Ji-Da Choi，Su-Young Bae，et al.Identificationof the most active interleukin-32 isoform[J].Inmmunology，2008，126：535-542]的生物活性最强，可能与其N端信号肽有一定关系。

研究表明IL-32的主要作用是通过NF-κB[Kim SH，Han S Y，et al.Interleukin-32：A Cytokine and Inducer of TNF α[J].Immunity，2005，22：131-142]和P38-MAPK磷酸化途径诱导TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子的产生。因为IL-32主要由IFN-γ诱导产生，且IL-32mRNA在免疫组织中的表达高于其它组织中的表达，这表明IL-32在固有性免疫中发挥作用[李莉，宝福凯.白介素-32及其与炎症性疾病的关系研究进展[J].中国热带医学，2010，10(6)]。固有性免疫是依赖于非特异性免疫细胞的病原体识别受体的免疫，具有代表性的病原体识别受体是Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)和核苷酸结合的寡聚化结构域蛋白(Nucleotide binding oligomerization domainprotein，NOD)，通过对病原体相关分子模式(Pathogen-associated moleculepatterns，PAMP，病原体表面的保守分子)的识别而发挥作用。IL-32协同NOD1和NOD2配体，通过胱天蛋白酶-1依赖的信号通路激活IL-1β和IL-6。同时，由于IL-32诱导多种细胞因子的产生且与多种炎症性疾病密切相关，揭示了IL-32在适应性免疫应答中也发挥作用，是一种前炎症反应细胞因子，它与疾病的严重性程度有关，尤其是自身免疫性炎症性疾病。

自从2005年白细胞介素32基因被命名以来，对于其研究主要集中于人上。直至2010年10月，才有人克隆出了牛白介素32的beta构型[Jun Jaekal，Hyunjhung Jhun，et al.Cloning and characterization of bovineinterleukin-32 beta isform[J].Veterinary Immunology andImmunopathology，2010，137：166-171]并且有研究猜测，小鼠中无此基因的存在。本发明通过分子克隆研究，克隆出牛白细胞介素32基因gamma亚型，并对其功能进行验证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法，牛IL-32γ基因(GenBank序列号为JQ327711，未经公布)的表达可以提高动物机体内其他相关免疫因子的表达，并进一步提高动物免疫系统的免疫作用，且有文章报道该基因对抵抗结核杆菌有一定的效用，因此，该基因的克隆及其基本功能验证，将为解决牛结核杆菌病的转基因克隆牛提供可靠的基因选择。

本发明的技术解决方案是：

一种克隆牛IL-32γ基因的方法，其特殊之处在于：通过将人IL-32与牛的基因比对，分子克隆了牛IL-32γ基因。

一种整合牛IL-32γ基因的真核表达载体，其特殊之处在于：包含目的基因牛IL-32γ及通过IRES序列与其相连的GFP序列；包括抗性筛选基因neo基因。

上述的整合牛IL-32γ真核表达载体，其特征在于：该载体通过用BamHI和SalI酶切将牛IL-32γ基因克隆到表达载体pIRES2-EGFP载体上。

上述载体的小鼠巨噬细胞，其特征在于：其宿主细胞是小鼠巨噬细胞系RAW264.7，通过脂质体转染的方法将目的基因牛IL-32γ整合到小鼠巨噬细胞的基因组中。

上述小鼠巨噬细胞用于检测牛IL-32γ的功能，判断其是否具有调节IL-1β、IL-6、MIP2以及TNFα细胞因子的产生或表达。

一种整合牛IL-32γ基因的真核表达载体的构建方法，其特殊之处在于，该方法包括：

1)牛IL-32γ基因克隆

1.1)根据牛IL-32γ与牛IL-32β序列的开放阅读框比较可知，牛IL-32γ比牛IL-32β多了一段序列，据此可将牛IL-32γ基因根据特殊设计引物分为3段克隆：

i、用牛IL-32βcDNA片段扩增r1；

ii、用牛基因组扩增牛IL-32γ特有片段r2；

iii、用牛IL-32βcDNA片段扩增r3；然后将3片段用PCR方法拼接，产生一段完整序列的牛IL-32γ基因；

其中首尾两端设计分别含有BamHI和SalI酶切位点，其引物如下：

正向引物1F：5’-cgGGATCC ATGTGCTTCGCTAAGAGAGACC-3’；

反向引物1R：5’-GAGCTTCTTAC CGATAACACCCTGAAAGAAGC-3’；

正向引物2F：5’-GGGTGTTATCG GTAAGAAGCTCATTTCCACGTATAG-3’；

反向引物2R：5’-CAAGGTTGTG CTGTGAACAGAGATGGACTTGAG-3’；

正向引物3F：5’-CTCTGTTCACAG CACAACCTTGTAGATGAATTTTTCG-3’；

反向引物3R：5’-tataGTCGAC TTAGACCTGGATGAGGCTTCTG-3’；

1.2)取成体秦川黄牛脾脏中约10mg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA；

1.3)以cDNA为模板，用引物对1F和3R，用Taq system PCR扩增牛IL-32基因，得到牛IL-32β；反应条件是94℃3min；94℃30sec；58℃30sec；72℃45sec；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

1.4)取成体秦川黄牛脾脏中约10mg组织，用BIOTAC提取基因组试剂盒提取牛基因组；

1.5)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与pGEM-T Easy载体连接并转化到DH5α细菌，经蓝白斑筛选挑选重组子，用EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-IL32并用生物学软件进行序列分析；

1.6)用PFU system PCR扩增r1、r2、r3片段，其中r1、r3以cDNA为模板，分别用引物对1F和1R、3F和3R，r2以牛基因组为模板，用引物2F和2R，反应条件均为94℃2min；94℃30sec；58℃30sec；72℃80sec；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；得到片段r1、r2、r3；然后以上述r1、r2为模板，用引物1F和2R，上述反应条件进行扩增，得到r1-2片段；再以上述r1-2、r3为模板，用引物1F和3R，上述反应条件进行扩增，得到r1-2-3片段；即为牛IL-32γ基因；

1.7)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用BamHI和SalI酶切，与pET-41a连接并转化到DH5α细菌，用BamHI和SalI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pET-41a-IL32γ并用生物学软件进行序列分析；

2)牛IL-32γ真核表达载体构建

2.1)以pIRES2-EGFP载体为骨架，将pET-41a-IL32γ、pIRES2-EGFP分别用BamHI、BglII酶切并用Klenow酶补平，再分别用SalI酶切，回收IL32γ基因片段和pIRES2-EGFP载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5α细菌，用NheI和BamHI酶切筛选阳性克隆；得表达载体pIRES-IL32γ-GFP；

2.2)pIRES-IL32γ-GFP载体的验证

小鼠巨噬细胞RAW264.7用含有体积百分比为10％FBS的高糖DMEM培养液，在37℃的CO₂孵箱中常规培养；将巨噬细胞接种于24孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pIRES-IL32γ-GFP，转染6h后弃去培养液，PBS冲洗3遍，48h后用荧光显微镜观察GFP的表达。

一种利用上述pIRES-IL32γ-GFP载体稳定转染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的方法，其特殊之处在于，该方法包括：

1)小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的培养

1.1)在37℃解冻一管小鼠巨噬细胞RAW264.7成系细胞，离心；

1.2)弃去培养液，加入1ml培养液重悬细胞，所述培养液为含体积百分比10％FBS的高糖DMEM；转移至含有4ml培养液60mm培养皿，在CO₂孵箱中37℃培养；

1.3)待小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞密度达到70％-80％时，弃去培养液，加入2ml PBS洗涤细胞，所述PBS无Ca²⁺/Mg²⁺，弃去PBS加入质量百分比0.25％的胰酶消化细胞，待大多数细胞变圆、飘起时，用含有体积百分比10％FBS的DMEM培养液终止消化，使用移液器吹打混匀转移到离心管中，1000转离心5分钟后，弃去培养液并悬浮，按照1∶3的比例传代，置于CO₂孵箱中37℃培养；

1.4)以此小鼠RAW264.7巨噬细胞作为转染并G418药物筛选的宿主细胞；

2)pIRES-IL32γ-GFP载体稳定转染小鼠巨噬细胞

2.1)转染前1天，将小鼠巨噬细胞RAW264.7接种至60mm培养皿；培养液为含体积白饭比10％FBS、不含青霉素、链霉素的高糖DMEM；

2.2)当细胞汇合达到全皿的10％-15％时，按照脂质体2000说明书陈述的方法将重组质粒pIRES-IL32γ-GFP转染小鼠巨噬细胞，以pIRES-EGF载体作为阳性对照；

2.3)在转染前1h，将培养液换为无血清、无双抗的DMEM；将6μgDNA和15μL脂质体分别用50μL Opti-MEM^RI Reduced Serum Medium进行稀释，室温孵育5min，将二者混合，再在室温下孵育20min；

2.4)最后将DNA/脂质体混合物逐滴加至培养孔内，在体积白饭比5％CO₂和饱和湿度下37℃培养；

2.5)转染6h后换为含体积百分比10％FBS的高糖DMEM；转染24h后，更换含有终浓度为700μg/mL G418的细胞培养液进行筛选；同时，以未转染的小鼠巨噬细胞RAW264.7作为阴性对照；

2.6)每隔3-4天换液，筛选3-4周，直至长出阳性细胞克隆，在皿底标记克隆位置；

2.7)挑取克隆并逐个将阳性克隆传至48孔培养板，一个孔接一个克隆；培养液中G418含量减半；待细胞汇合达到70～80％，胰酶消化后传至六孔培养板；以同样的方法，将六孔培养板中的细胞传至60mm培养皿扩增；最后将60mm培养皿中的细胞消化后冻存。

3)pIRES-IL32γ-GFP载体稳定表达小鼠巨噬细胞RAW264.7的鉴定

3.1)扩大培养pIRES-IL32γ-GFP阳性小鼠巨噬细胞，提取mRNA，反转录后并以cDNA为模板，PCR鉴定IL32γ基因是否整合到小鼠巨噬细胞中并稳定表达IL32mRNA；

3.2)取未转染的正常小鼠巨噬细胞为阴性对照，取质粒pIRES-IL32γ-GFP为阳性对照；根据引物1F和2R进行PCR扩增；

3.3)PCR反应条件是94℃3min；94℃30sec；58℃30sec；72℃1min；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

3.4)PCR产物经质量百分比1％琼脂糖凝胶电泳检测。

上述以G418药物筛选是：

1)以G418药物筛选小鼠巨噬细胞，pIRES-IL32γ-GFP载体上含有neo基因，整合有该载体并表达neo基因的小鼠巨噬细胞能够在一定浓度的G418筛选时存活，未整合该载体的小鼠巨噬细胞在该浓度下死亡；需要筛选小鼠巨噬细胞的G418最小致死浓度；

2)小鼠巨噬细胞G418最小致死浓度的测定：

将小鼠巨噬细胞接种12孔板的6个孔，次日换液，每孔分别加入以终浓度100，300，500，700，900，和1100μg/mL G418进行培养，其间每隔3天换液一次，培养至3周；当细胞培养液中的G418浓度等于或大于700μg/mL时，所有小鼠巨噬细胞都死亡，就G418对小鼠巨噬细胞胞的最小致死量是700μg/mL。一种用上述稳定转染pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞检测细胞因子IL-1β、IL-6、MIP2以及TNF α表达情况的方法，其特殊之处在于，该方法包括：

1)将上述稳定转染pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞采用Trizol方法提取细胞中的总RNA，并用DNA酶去除污染DNA，再用反转录试剂盒反转录成第一链cDNA；

2)Real-Time PCR

以cDNA为模板，用下列引物，RealTime PCR检测小鼠IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子的表达情况；反应条件是94℃3min；94℃20sec；60℃30sec；40个循环；4℃保存；

引物序列如下：

人工合成的小鼠IL1β引物F：5’-CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3’

人工合成的小鼠IL1β引物R：5’-CCAGGTCAAAGGTTTGGAAGC-3’

人工合成的小鼠TNFα引物F：5’-CGGCATGGATCTCAAAGACAAC-3’

人工合成的小鼠TNFα引物R：5’-CGGCAGAGAGGAGGTTGACTTT-3’

人工合成的小鼠IL6引物F：5’-GCCTTCTTGGGACTGATGCTG-3’

人工合成的小鼠IL6引物R：5’-CTCATTTCCACGATTTCCCAG-3’A

人工合成的小鼠MIP2引物F：5’-GTCAATGCCTGAAGACCCTGC-3’

人工合成的小鼠MIP2引物R：5’-GGCTTCAGGGTCAAGGCAAA-3’

本发明具有以下特点：

1、本发明通过人与牛的DNA序列比对，分子克隆了牛IL-32γ基因(GenBank序列号为JQ327711，未经公布)。并构建了真核表达载体，该载体含有启动子CMV，能够实现目的基因在小鼠巨噬细胞中高效表达。

2、本发明将牛IL-32γ真核表达载体转染到小鼠巨噬细胞中，构建转基因的小鼠巨噬细胞系；经过G418筛选获得阳性细胞，并通过PCR验证目的基因IL-32γ整合到小鼠巨噬细胞的基因组中，建立了5株稳转细胞系。

3、用稳转牛IL-32γ的小鼠巨噬细胞系进行细胞水平验证，检测IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子的表达变化。

附图说明

图1A是PCR扩增牛IL-32β的结果图；

图1B是EcoRI单酶切检测pGEM-T-IL32β的结果图；

图2A是PCR扩增牛IL-32γ片段γ1、γ2、γ3、γ1-2、γ1-2-3的结果图；

图2B是BamHI和SalI双酶切鉴定pET41-IL32γ

图3A是IL-32γ真核细胞表达载体pIRES-IL32γ-GFP的载体图谱；

图3B是NheI和BamHI双酶切鉴定pIRES-IL32γ-GFP载体的结果图；

图4是pIRES-IL32γ-GFP载体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后筛选稳定克隆免疫荧光图；

图5是pIRES-IL32γ-GFP载体稳定转染小鼠巨噬细胞PCR鉴定的结果图；

图6是Real-Time PCR检测IL-1β、IL-6、MIP2、TNF α等细胞因子的表达。

具体实施方式

本发明首先克隆牛IL-32γ基因，然后构建牛IL-32γ表达载体pIRES-IL32γ-GFP，通过脂质体法将外源表达载体pIRES-IL32γ-GFP转染入小鼠巨噬细胞。经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定证实目的基因牛IL-32γ基因整合到小鼠巨噬细胞的基因组中并稳定表达该mRNA。将转染牛IL-32γ的巨噬细胞进行功能验证，检测IL-1β、IL-6、MIP2、TNF α等细胞因子的表达情况。

具体所涉及的试剂和材料如下：

G418，高糖DMEM，Trizol，细胞转染试剂Lipofectamine 2000和Opti-MEM^RIReduced Serum Medium购自美国Invitrogen公司；EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司；FBS购自Hyclone公司；细胞培养板和培养皿购自Corning公司；DNA maker购自天根公司；pGEM-T Easy载体和质粒提取试剂盒购自Promega公司；限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、PFU DNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、Klenow酶、和反转录试剂盒由Fermentas公司提供；基因组提取试剂盒购自Axygene；小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中南大学湘雅中心实验室。

下面结合附图和实验作进一步详细说明。

1、牛IL-32γ基因克隆

根据牛IL-32γ与牛IL-32β序列的开放阅读框比较可知，牛IL-32γ比牛IL-32β多了一段序列，所以可以据此将牛IL-32γ基因根据特殊设计引物分为3段克隆：(1)、用牛IL-32βcDNA片段扩增r1；(2)、用牛基因组扩增牛IL-32γ特有片段r2；(3)、用牛IL-32βcDNA片段扩增r3；然后将3片段用PCR方法拼接，产生一段完整序列的牛IL-32γ基因。其中首尾两端设计分别含有BamHI和SalI酶切位点。其引物如下：，

正向引物1F：5’-c gGGATCC ATGTGCTTCGCTAAGAGAGACC-3’；

反向引物1R：5’-CGATAACACCCTGAAAGAAGC-3’；

正向引物2F：5’-

GTAAGAAGCTCATTTCCACGTATAG-3’；

反向引物2R：5’-

CTGTGAACAGAGATGGACTTGAG-3’；

正向引物3F：5’-CACAACCTTGTAGATGAATTTTTCG-3’；

反向引物3R：5’-tataGTCGAC TTAGACCTGGATGAGGCTTCTG-3’；

下划线为酶切位点BamHI和SalI，粗体为拼接序列小写字体为保护序列。引物有北京奥科公司合成。

1.1牛IL-32β基因的合成

取成体秦川黄牛脾脏中约10mg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA。以cDNA为模板，用引物对1F和3R，用Taq酶扩增牛IL-32基因，得到牛IL-32β；反应条件是94℃3min；94℃30sec；58℃30sec；72℃45sec；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与pGEM-T Easy载体连接并转化到DH5α细菌，经蓝白斑筛选挑选重组子，对EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-IL32β并用生物学软件进行序列分析。PCR结果如图1A所示，酶切检测如图1B所示，泳道1是重组质粒pGEM-T-IL32β经EcoRI酶切后产生516bp特异性条带，电泳结果与预期结果一致。测序结果通过Blast比对分析表明，扩增的秦川黄牛IL-32β的序列与Genebank中NW_001494274.1(Bos taurus breed Hereford chromosome 25genomic scaffold)比对得到IL32序列有七个碱基不同。有5个氨基酸不同，经氨基酸二级结构比较可知其变化对二级结构没有影响。IL32β基因虽然较为保守，但在不同品种间存在多态性，造成这种突变可能是种属间差异产生的一种多态现象。

1.2牛IL-32γ基因的合成

用PFU system PCR扩增r1、r2、r3片段，其中r1、r3以cDNA为模板，分别用引物对1F和1R、3F和3R，r2以牛基因组为模板，用引物2F和2R，反应条件均为94℃，2min；94℃30sec；58℃30sec；72℃80sec；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；得到片段r1、r2、r3；然后以上述r1、r2为模板，用引物1F和2R，上述反应条件进行扩增，得到r1-2片段；再以上述r1-2、r3为模板，用引物1F和3R，上述反应条件进行扩增，得到r1-2-3片段；即为牛IL-32γ基因；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用BamHI和Sal I酶切，与pET-41a连接并转化到DH5α细菌，用BamHI和SalI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pET-41a-IL32γ并用生物学软件进行序列分析；

PCR结果如图3、4、5所示，pET-41a-IL32γ酶切检测如图6所示，泳道1是重组质粒pET-41a-IL32γ经酶切后产生657bp特异性条带，电泳结果与预期结果一致。

2、牛IL-32γ真核表达载体的结构及其构建

2.1pIRES-IL32γ-GFP的构建

含有IL-32γ基因和启动子(CMV)以及抗性筛选基因(Neo)的pIRES2-EGFP载体。筛选基因(Neo)用来筛选含有该载体的重组细胞，进而检测细胞因子诱导效率。

以pIRES2-EGFP载体为骨架，将pET-41a-IL32γ、pIRES2-EGFP分别用BamHI、BglII酶切并用Klenow酶补平，再分别用SalI酶切，回收IL32γ基因片段和pIRES2-EGFP载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5α细菌，用NheI和BamHI酶切鉴定阳性克隆；得表达载体pIRES-IL32γ-GFP(如图6)。

2.2pIRES-IL32γ-GFP载体的验证

小鼠巨噬细胞RAW264.7用含有10％FBS的高糖DMEM培养液，在37℃的CO₂孵箱中常规培养。将巨噬细胞接种于24孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pIRES-IL32γ-GFP(具体方法按脂质体-2000说明书进行)，转染48h后照相，pIRES-IL32γ-GFP转染小鼠巨噬细胞有效。

3.pIRES-IL32γ-GFP稳定转染小鼠巨噬细胞RAW264.7

3.1小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养

在37℃解冻一管小鼠巨噬细胞RAW264.7成系细胞，离心。弃去培养液，加入1ml培养液(含10％FBS的高糖DMEM)重悬细胞，转移至含有4ml培养液60mm培养皿，在CO₂孵箱中37℃培养。待牛成纤维细胞密度达到70％-80％时，弃去培养液，加入2ml PBS无Ca²⁺/Mg²⁺洗涤细胞，弃去PBS，加入0.25％的胰酶消化细胞，待大多数细胞变圆、飘起时，用含有10％FBS的DMEM培养液终止消化，使用移液器吹打混匀转移到离心管中，1000转离心5分钟后，弃去培养液并悬浮，按照1∶3的比例传代，置于CO₂孵箱中37℃培养。取传代2-3次的巨噬细胞作为转染的宿主细胞。

本发明以G418药物筛选巨噬细胞，由于pIRES-IL32γ-GFP载体上含有neo基因，因此整合有该载体并表达neo基因的巨噬细胞能够在一定浓度的G418筛选时存活，而未整合该载体的巨噬细胞在该浓度下死亡。因此需要筛选正常巨噬细胞的G418最小致死浓度。

小鼠巨噬细胞G418最小致死浓度的测定：将小鼠巨噬细胞接种12孔板的6个孔，次日换液，每孔分别加入以终浓度100，300，500，700，900和1100μg/mL G418进行培养，其间每隔3天换液一次，培养至3周。当细胞培养液中的G418浓度等于或大于700μg/mL时，所有巨噬细胞都死亡，就G418对牛皮肤成纤维细胞的最小致死量是700μg/mL。

3.2pIRES-IL32γ-GFP载体稳定转染小鼠巨噬细胞

转染前1天，将小鼠巨噬细胞接种至60mm培养皿。培养液为含10％FBS、不含青霉素、链霉素的高糖DMEM。当细胞汇合达到全皿的10％-15％时，按照脂质体2000说明书陈述的方法将重组质粒pIRES-IL32γ-GFP转染小鼠巨噬细胞，以pIRES-EGFP载体作为阳性对照。在转染前1h，将培养液换为无血清、无双抗的DMEM。将6μgDNA和15μL脂质体分别用500μL Opti-MEM^RI Reduced SerumMedium进行稀释，室温孵育5min，将二者混合，再在室温下孵育20min。最后将DNA/脂质体混合物逐滴加至培养孔内，在5％CO₂和饱和湿度下37℃培养。转染6h后换为含10％FBS的高糖DMEM。转染24h后，更换含有终浓度为700μg/mL G418的细胞培养液进行筛选；同时，以未转染的小鼠巨噬细胞作为阴性对照。每隔3-4天换液，筛选3-4周，直至长出阳性细胞克隆，用记号笔在皿底标记克隆位置。挑取克隆并逐个将阳性克隆传至48孔培养板，一个孔接一个克隆。此后培养液中G418含量减半(400μg/mL)。待细胞达到70～80％汇合时，胰酶消化后传至六孔培养板。以同样的方法，将六孔培养板中的细胞传至60mm培养皿扩增。最后将60mm培养皿中的细胞消化后冻存。

本发明筛选的阳性细胞都是稳定转染pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞。载体整合到细胞的基因组上，随着细胞DNA的复制而复制。在稳定转染的过程中，pIRES-IL32γ-GFP载体携带的CMV启动子，IL32γ基因和neo基因等元件会整合到宿主细胞的基因组中，通过G418筛选3周后达到稳定转染的目的，表现为筛选的细胞呈G418抗性。

以上通过稳定转染筛选整合有pIRES-IL32γ-GFP载体细胞，得到含有IL32-γ基因的小鼠巨噬细胞。

3.3pIRES-IL32γ-GFP载体稳定转染小鼠巨噬细胞表达基因情况的鉴定扩大培养pIRES-IL32γ-GFP阳性小鼠巨噬细胞，提取RNA并进行反转录，以此cDNA为模板，PCR鉴定IL32γ基因是否在小鼠巨噬细胞中表达；取未转染质粒的正常小鼠巨噬细胞为阴性对照，取质粒pIRES-IL32γ-GFP为阳性对照。PCR扩增引物对为1F和2R。

PCR反应条件是94℃3min；94℃30sec；60℃30sec；72℃50sec；30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图5所示，其中泳道M为DNA marker，泳道1是阴性对照，泳道2-4为稳定转染pIRES-IL32γ-GFP的小鼠巨噬细胞，泳道5为阳性对照。结果表明，pIRES-IL32γ-GFP载体在宿主细胞小鼠巨噬细胞中稳定表达IL32mRNA。

4、以稳定转染pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞检测IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子的表达

以未转染的小鼠巨噬细胞为阴性对照组，以pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞为样品组，以稳定转染人pIRES-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞为阳性对照组，将此3组样品提取RNA并进行反转录，以此cDNA为模板，进行Real-TimePCR，检测IL-1β、IL-6、TNFα、MIP2等细胞因子的表达变化情况。结果表明，IL-1β、TNF α、MIP2的表达量较阴性对照上升，IL-6的表达下降，但其趋势均与阳性对照一致。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物1F

<400>1

cgggatccat gtgcttcgct aagagagacc 30

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物1R

<400>2

gagcttctta ccgataacac cctgaaagaa gc 32

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物2F

<400>3

gggtgttatc ggtaagaagc tcatttccac gtatag 36

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物2R

<400>4

caaggttgtg ctgtgaacag agatggactt gag 33

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物3F

<400>5

ctctgttcac agcacaacct tgtagatgaa tttttcg 37

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物2R

<400>6

tatagtcgac ttagacctgg atgaggcttc tg 32

<210>7

<211>657

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ基因

<400>7

atgtgcttcg ctaagagaga cccacgtgtc ctggcttctt tcagggtgtt atcggtaaga 60

agctcatttc cacgtatagc tggggttcag gaggcctggg ttctgctggg tgaagctgag 120

aacattctgg cccacttggg acccagcaga gagaagaacc gagattcttt tactcaagtc 180

catctctgtt cacagcacaa ccttgtagat gaatttttcg atacaatgga aaatgaacca 240

gaaggagcac aggtggaggc agtcctagca gagactaagg agaaattcat caaggacgcc 300

tttaaagtca tggataatca cattcaagag aacagtcccg aaaccctgaa ggagtccagt 360

cccttgcttc aggaagcaca gcaagaagta cgctgcagaa tccagagacg ctccgtcgcc 420

acctctctgg aggtccagaa tccggaagag agcatctggg ccagagccct gcggcagttc 480

ttgggcattc tgcagagttt cctgtccggg tgtcgggatg cgctcacctg gctgtgggag 540

aaggccgcgg cctgcctaca ggccgtctgc agtgcggtgg aggccctctg ggaagtgctc 600

acggatttct gctcctttgt tgggcagctc ttatgcagaa gcctcatcca ggtctaa 660

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL1β引物F

<400>8

cctgaactca actgtgaaat gcc

23

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL1β引物R

<400>9

ccaggtcaaa ggtttggaag c

21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL6引物F

<400>10

gccttcttgg gactgatgct g

21

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL6引物R

<400>11

ctcatttcca cgatttccca ga

22

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL6引物F

<400>12

cggcatggat ctcaaagaca ac

22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物2R

<400>13

cggcagagag gaggttgact tt

22

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成的小鼠IL6引物F

<400>14

gtcaatgcct gaagaccctg c

21

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成的牛IL32γ引物2R

<400>15

ggcttcaggg tcaaggcaaa

20

Claims

1.一种人工合成的牛IL-32γ基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.一种含有权利要求1所述基因的真核表达载体pIRES2-IL32γ-GFP，其特征在于：利用BamHI和SalI酶切将所述基因克隆到表达载体pIRES2-EGFP上。

3.一种含有权利要求2所述pIRES2-IL32γ-GFP载体的小鼠巨噬细胞，其特征在于：利用脂质体转染的方法将pIRES2-IL32γ-GFP载体转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7中。

4.根据权利要求3所述的小鼠巨噬细胞，其特征在于：该小鼠巨噬细胞用于检测所述牛IL-32γ基因是否可以调节IL-1β、IL-6、MIP2以及TNFα细胞因子的产生或表达。