CN101781679B - 人baff-r基因启动子活性的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，包括引物设计、BAFF-R基因5’侧翼区的克隆、BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建、细胞培养、重组报告基因质粒瞬时转染细胞、荧光素酶活性检测等步骤。本发明易操作、准确，测定了BAFF-R基因5’上游序列在不同细胞中转录活性的差异及其不同区域转录活性的差异，确定了BAFF-R基因的核心启动子所在区域，对于研究BAFF-R基因转录调控元件的作用，及阐明该基因的表达调控机制奠定了基础。
Description
技术领域：
本发明涉及一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法。
背景技术：
BAFF-R是肿瘤坏死因子受体家族中的一员，是B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS)，也称为(B cell activating factorsbelonging to the TNF family，BAFF)的特异性受体。BLyS通过与三个受体：穿膜蛋白活化物(TACI)、B细胞成熟抗原(BCMA)和BAFF受体(BAFF-R)结合，参与B、T淋巴细胞的增殖和功能的调节。BLyS表达过度会使B淋巴细胞不断增殖并分泌自身抗体增多，导致一系列自身免疫病的发生，还会使淋巴细胞增殖失控从而引起B细胞恶性肿瘤的发生。BLyS的三个受体中BAFF-R是其特异性受体能与其特异性结合，BAFF-R对于BLyS介导的B细胞的存活和成熟是必要的[7]。目前对BAFF-R的表达水平与疾病的发生、发展的研究较多，而对BAFF-R基因转录调控方面的研究尚未见相关报导。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种易操作、准确的人BAFF-R基因启动子活性的测定方法。
本发明的技术解决方案是：
一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)引物设计：
用引物设计软件按叠瓦方式在BAFF-R基因5’侧翼序列设计八个片段的引物，八对引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性内切酶HindIII位点，5’端加限制性内切酶Mlu I位点，同时在两端分别添加6个保护碱基，便于酶切插入到载体的多克隆位点；八个片段的引物序列及下游引物序列为：
其中1-8为八个不同长度片段的上游引物序列，9为八个片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作为扩增相应产物B1(549bp)、B2(691bp)，B3(878bp)、B4(973bp)、B5(1129bp)、B6(1538bp)、B7(1681bp)、B8(1823bp)(即B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8)的引物，B1～B8分别与上述引物1～8对应；
(2)BAFF-R基因5’侧翼区的克隆：
从人全血中提取基因组DNA作为模板，应用LATaq酶PCR扩增目的片度B8(1823bp)；
用限制性内切酶Mlu I、Hind III酶切胶回收纯化后的PCR扩增产物B8及pGL3-Basic载体，酶切产物经T4连接酶连接，连接混合产物转化大肠埃希菌DH5α，酶切测序鉴定阳性克隆，得到阳性重组质粒，命名为pGL3-B8，即pGL3-B8(-1562～+261)；
(3)BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建：
以重组质粒pGL3-B8为模板，PCR扩增目的片段B1-B7，同构建重组质粒pGL3-B8的方法一样，得到7个重组体，分别命名为pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7；
(4)细胞培养：
Raji、KM3细胞悬浮生长于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于5％CO2，37℃恒温培养，1～2d传代一次；
(5)重组报告基因质粒瞬时转染细胞：
Raji、KM3两种细胞各分为11组：(1)pGL3-B1组；(2)pGL3-B2组；(3)pGL3-B3组；(4)pGL3-B4组；(5)pGL3-B5组；(6)pGL3-B6组；(7)pGL3-B7组；(8)pGL3-B8组；(9)pGL3-Control组；(10)pGL3-Basic组；(11)无质粒空白对照组，各组均以psv-β-gal质粒作为内参照，将构建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八种重组质粒以及阴性对照pGL3-Basic，阳性对照pGL3-Control，分别转染Raji、KM3细胞，同时共转染psv-β-gal内参质粒，空白对照组不转染任何质粒；
(6)荧光素酶活性检测：
对步骤(5)中的各组，在转染48h后分别收集并裂解细胞，进行荧光素酶活性检测：1×PBS洗涤细胞2次，加入200μl 1×裂解液，冻融一次后移入1.5mlEppendorf管中，12000g/min，4℃离心2min，取20μl裂解上清液，用化学发光仪检测荧光素酶活性；取50μl裂解上清液，加入50μl β-半乳糖苷酶检测试剂，酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活性；荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值为荧光素酶的相对活性。
引物设计软件为Primer premier5.0。
步骤(2)中PCR反应条件为94℃，1.5min；94℃，39S；56℃，45S，72℃，1min，35个循环；最后72℃延伸5min；PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相予以鉴定。
步骤(5)中脂质体转染试剂和质粒之间的比例为3μl∶4μg，待测质粒和内参照质粒的比例为4∶1。
本发明易操作、准确，测定了BAFF-R基因5’上游序列在不同细胞中转录活性的差异及其不同区域转录活性的差异，确定了BAFF-R基因的核心启动子所在区域，对于研究BAFF-R基因转录调控元件的作用，及阐明该基因的表达调控机制奠定了基础。
附图说明：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1是PCR扩增BAFF-R基因5’上游序列片段B8的示图。
图2是pGL3-B8的酶切鉴定结果示图。
图3是PCR扩增BAFF-R基因5’上游序列片段B1～B7结果示图。
图4是重组质粒pGL3-B1～B8的酶切鉴定结果示图。
图5是不同重组质粒转染不同细胞(Raji、KM3细胞)后荧光素酶的相对活性示图。
图5中：A：pGL3-B1(-288～+261)；B：pGL3-B2(-430～+261)；C：pGL3-B3(-617～+261)；D：pGL3-B4(-712～+261)；E：pGL3-B5(-868～+261)；F：pGL3-B6(-1277～+261)；G：pGL3-B7(-1420～+261)；H：pGL3-B8(-1562～+261)；I：pGL3-Basic(ap＜0.05)。
具体实施方式：
一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：包括下列步骤：
材料：
菌株DH5α为本单位保存菌种，人Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji由南通大学免疫学实验室馈赠，多发性骨髓瘤细胞株KM3由上海第二军医大学赠送。哺乳动物基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒(碧云天)；PCR试剂、DNA Marker(大连宝生物Takara公司)；pGL3-Basic载体，pGL3-Control质粒，内参照质粒psv-β-gal质粒，荧光素酶报告基因检测试剂盒，T4连接酶，限制性内切酶Mlu I、HindIII、质粒抽提试剂盒，购自Promega公司；胎牛血清，RPMI1640培养基购自Gibco公司。脂质体转染试剂为美国Invitrogen公司的产品；
(1)引物设计：
用引物设计软件Primer premier5.0按叠瓦方式在BAFF-R基因5’侧翼序列设计八个片段的引物，八对引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性内切酶HindIII位点，5’端加限制性内切酶Mlu I位点，同时在两端分别添加6个保护碱基，便于酶切插入到载体的多克隆位点；八个片段的引物序列及下游引物序列为：
其中1-8为八个不同长度片段的上游引物序列，9为八个片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作为扩增相应产物B1(549bp)、B2(691bp)，B3(878bp)、B4(973bp)、B5(1129bp)、B6(1538bp)、B7(1681bp)、B8(1823bp)(即B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8)的引物，B1～B8分别与上述引物1～8对应；
(2)BAFF-R基因5’侧翼区的克隆：
从人全血中提取基因组DNA作为模板，应用上述引物，LATaq酶PCR扩增目的片度B8；PCR反应条件为94℃，1.5min；94℃，39S；56℃，45S，72℃，1min，35个循环；最后72℃延伸5min；PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相予以鉴定。
用限制性内切酶Mlu I、Hind III酶切胶回收纯化后的PCR扩增产物B8及pGL3-Basic载体，酶切产物经T4连接酶连接，连接混合产物转化大肠埃希菌DH5α，酶切测序鉴定阳性克隆，得到阳性重组质粒，命名为pGL3-B8，即pGL3-B8(-1562～+261)；
(3)BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建：
以重组质粒pGL3-B8为模板，PCR扩增目的片段B1-B7，同构建重组质粒pGL3-B8的方法一样，得到7个重组质粒，分别命名为pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7[即pGL3-B1(-288～+261)、pGL3-B2(-430～+261)、pGL3-B3(-617～+261)、pGL3-B4(-712～+261)、pGL3-B5(-868～+261)、pGL3-B6(-1277～+261)、pGL3-B7(-1420～+261)]；
(4)细胞培养：
Raji、KM3细胞悬浮生长于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于5％CO2，37℃恒温培养，1～2d传代一次；
(5)重组报告基因质粒瞬时转染细胞：
Raji、KM3两种细胞各分为11组：(1)pGL3-B1组；(2)pGL3-B2组；(3)pGL3-B3组；(4)pGL3-B4组；(5)pGL3-B5组；(6)pGL3-B6组；(7)pGL3-B7组；(8)pGL3-B8组；(9)pGL3-Control组；(10)pGL3-Basic组；(11)无质粒空白对照组，各组均以psv-β-gal质粒作为内参照，将构建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B、pGL3-B4、pGL3-B、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八种重组质粒以及阴性对照pGL3-Basic，阳性对照pGL3-Control，分别转染Raji、KM3细胞，同时共转染psv-β-gal内参质粒，空白对照组不转染任何质粒；脂质体转染试剂和质粒之间的比例为3μl∶4μg，待测质粒和内参照质粒的比例为4∶1。
(6)荧光素酶活性检测：
对步骤(5)中的各组，在转染48h后分别收集并裂解细胞，进行荧光素酶活性检测：1×PBS洗涤细胞2次，加入200μl 1×裂解液，冻融一次后移入1.5mlEppendorf管中，12000g/min，4℃离心2min，取20μl裂解上清液，用化学发光仪检测荧光素酶活性；取50μl裂解上清液，加入50μl β-半乳糖苷酶检测试剂，酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活性；荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值为荧光素酶的相对活性。
然后将得到的荧光素酶活性检测数据用统计学处理：
数据采用SPSS11.5统计软件分析。荧光素酶相对活性用x±s表示，组间差异采用t检验进行比较。结果表明：8种重组质粒在两种细胞中启动子活性水平差异程度相似，其中①pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6荧光素酶活性较低，并且它们之间没有明显的差异(t值P＞0.05)；②pGL3-B1与pGL3-B2相比，荧光素酶的相对活性显著增强(t值P＜0.05)；③pGL3-B4与pGL3-B1相比，荧光素酶的相对活性显著增强(t值P＜0.05)；④pGL3-B7与pGL3-B4相比，荧光素酶的相对活性显著增强(t值P＜0.05)；⑤pGL3-B8与pGL3-B7相比，荧光素酶的相对活性明显降低(t值P＜0.05)。
Claims (5)
1.一种人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：包括下列步骤：
(1)引物设计：
用引物设计软件按叠瓦方式在BAFF-R基因5’侧翼序列设计八个片段的引物，八对引物具有相同的下游引物，引物的3’端加限制性内切酶HindIII位点，5’端加限制性内切酶Mlu I位点，同时在两端分别添加6个保护碱基，便于酶切插入到载体的多克隆位点；八个片段的引物序列及下游引物序列为：
其中1-8为八个不同长度片段的上游引物序列，9为八个片段3’端共同的下游引物序列；上述引物作为扩增相应产物B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8的引物，B1～B8分别与上述引物1～8对应；
(2)BAFF-R基因5’侧翼区的克隆：
从人全血中提取基因组DNA作为模板，应用LATaq酶PCR扩增目的片段B8；
用限制性内切酶Mlu I、Hind III酶切胶回收纯化后的PCR扩增产物B8及pGL3-Basic载体，酶切产物经T4连接酶连接，连接混合产物转化大肠埃希菌DH5α，酶切测序鉴定阳性克隆，得到阳性重组质粒，命名为pGL3-B8；
(3)BAFF-R基因5’侧翼区序列缺失质粒的构建：
以重组质粒pGL3-B8为模板，PCR扩增目的片段B1-B7，同构建重组质粒pGL3-B8的方法一样，得到7个重组质粒，分别命名为pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7；
(4)细胞培养：
Raji、KM3细胞悬浮生长于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养基中含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于5％CO2，37℃恒温培养，1～2d传代一次；
(5)重组报告基因质粒瞬时转染细胞：
Raji、KM3两种细胞各分为11组：(1)pGL3-B1组；(2)pGL3-B2组；(3)pGL3-B3组；(4)pGL3-B4组；(5)pGL3-B5组；(6)pGL3-B6组；(7)pGL3-B7组；(8)pGL3-B8组；(9)pGL3-Control组；(10)pGL3-Basic组；(11)无质粒空白对照组，各组均以psv-β-gal质粒作为内参照，将构建的pGL3-B1、pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B4、pGL3-B5、pGL3-B6、pGL3-B7、pGL3-B8八种重组质粒以及阴性对照pGL3-Basic，阳性对照pGL3-Control，分别转染Raji、KM3细胞，同时共转染psv-β-gal内参质粒，空白对照组不转染任何质粒；在转染48h后对各组分别收集并裂解细胞，进行荧光素酶活性检测。
2.根据权利要求1所述的人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：步骤(5)中裂解细胞、进行荧光素酶活性检测的具体方法是：1×PBS洗涤细胞2次，加入200μl 1×裂解液，冻融一次后移入1.5mlEppendorf管中，12000g/min，4℃离心2min，取20μl裂解上清液，用化学发光仪检测荧光素酶活性；取50μl裂解上清液，加入50μl β-半乳糖苷酶检测试剂，酶标仪测定β-半乳糖苷酶的活性；荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值为荧光素酶的相对活性。
3.根据权利要求1或2所述的人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：引物设计软件为Primer premier5.0。
4.根据权利要求1或2所述的人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：步骤(2)中PCR反应条件为94℃，1.5min；94℃，39S；56℃，45S，72℃，1min，35个循环；最后72℃延伸5min；PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相予以鉴定。
5.根据权利要求1或2所述的人BAFF-R基因启动子活性的测定方法，其特征是：步骤(5)中脂质体转染试剂和质粒之间的比例为3μl∶4μg，待测质粒和内参照质粒的比例为4∶1。
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Families Citing this family (6)
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001012812A2 (en) * | 1999-08-17 | 2001-02-22 | Biogen, Inc. | Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent |
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| CN101781680A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-07-21 | 南通大学附属医院 | 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001012812A2 (en) * | 1999-08-17 | 2001-02-22 | Biogen, Inc. | Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent |
| CN1844400A (zh) * | 2006-04-14 | 2006-10-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | 含不同长度b细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途 |
| CN101271113A (zh) * | 2008-04-25 | 2008-09-24 | 南京师范大学 | 检测人b淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法 |
| CN101781680A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-07-21 | 南通大学附属医院 | 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| 袁宏香等.NF-[kappa]B抑制剂和IFN-[alpha]对BAFF-R基因启动子活性的影响.《细胞与分子免疫学杂志》.2010,第26卷(第2期),第111-114页. * |
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Granted publication date: 20120523 Termination date: 20131019 |