CN104975018A - 一种新型增强子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人工合成的DNA增强子及其应用。本发明增强子可添加于哺乳动物细胞的重组蛋白表达载体，用于增强启动子转录活性强度，从而增强哺乳动物或者其他来源蛋白质的分泌表达，将其在动物细胞中的外源蛋白表达量大幅度提高。

Description

一种新型增强子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于增强启动子转录活性，促进哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的增强子及其应用。

技术背景

外源基因在宿主细胞中的高效表达是蛋白质的结构和功能分析、蛋白质或多肽类药物研究开发的先决条件。哺乳动物细胞表达外源蛋白质如抗体，最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导，产生的抗体具有相应的结合能力和效应功能，但表达量很低。常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生产，是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞。CHO细胞已用于多种动物来源蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平，但大肠杆菌表达的动物蛋白能进行正确的翻译后加工如糖基化和三维结构的形成，不具有与天然抗体相似的功能活性，且在人体内易于清除。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如细胞表面的受体或细胞外的激素和酶，则不能在原核细胞中表达。而哺乳动物细胞表达的蛋白则具有天然蛋白的生物学活性。为提高哺乳动物细胞的蛋白表达量，需要选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子。

影响外源蛋白质在哺乳动物细胞中的因素很多，如增强子、转录和翻译控制因子、RNA加工(RNA Processing)、基因拷贝的数目、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性(genetic properties)等。在调控基因表达的因素中，增强子的选择也起到了举足轻重的作用。

增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。例如，人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子作用下可提高600～1000倍。增强子的作用同增强子的取向(5’一3’或3’一5’)无关，甚至远离靶基因达几千kb也仍有增强作用。增强子具有如下特点：

①具有远距离效应。

②无方向性。

③顺式调节。

④无物种和基因的特异性。

⑤具有组织特异性。

⑥有相位性。

⑦有的增强子可以对外部信号产生反应。

增强子有别于启动子处有两点:[1]增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动;[2]它能在两个方向产生相互作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。首先被发现的增强子是SV40增强子。两个增强子位于基因组的两个串连的72bp重复中，约在转录起始点上游200bp处，每个72bp重复中有一个。缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，而如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将β珠蛋白基因放在含有72bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72bp顺序位于离转录起点上游1400bp或下游3000bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(core sequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG。增强子能大大增强启动子的活性。

目前，用于表达重组蛋白尤其是重组抗体蛋白的哺乳动物宿主细胞主要是CHO细胞，而CHO细胞中常用的增强子是CMV增强子和SV40增强子。其中，CMV增强子广泛用于重组蛋白表达载体的构建，以提高重组蛋白的表达量。但多数重组蛋白的表达水平很难达到工业生产的要求，通过改造表达载体和宿主改造提高重组蛋白表达水平，成为重组蛋白尤其是重组抗体蛋白表达的重点工作。

发明内容

本发明目的是提供一种可以增强启动子转录活性，提高外源基因表达的增强子，以改善哺乳动物细胞表达外源蛋白产量低的现状，从而降低哺乳动物来源蛋白（尤其是抗体）的生产成本。

首先，本发明提供了一种人工合成的用于增强启动子转录活性，促进哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的增强子，所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

所述的哺乳动物细胞可以是CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。

本发明的增强子可用于在哺乳动物宿主细胞中促进哺乳动物来源蛋白的分泌表达。

本发明的增强子可通过常规的合成方法制备。

本发明的增强子可添加于哺乳动物细胞表达载体,用于增强启动子转录活性，促进哺乳动物来源蛋白的分泌表达。

利用本发明的增强子在动物细胞中分泌表达哺乳动物来源蛋白的方法为：将编码本发明增强子的DNA序列插入装有哺乳动物来源蛋白质DNA序列的哺乳动物细胞表达载体启动子的5’端或者3’端，而后将该哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物细胞后表达目的蛋白。构建哺乳动物细胞表达载体时，先插入本发明增强子DNA序列，而后加入哺乳动物来源蛋白质DNA序列的过程，对于转染后哺乳动物细胞表达目的蛋白具有同样的效果。

本发明还提供了一种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有前述编码本发明增强子的DNA序列及编码哺乳动物来源蛋白质的DNA序列。

所述表达载体中，编码本发明增强子的DNA序列在所述表达载体启动子的5’端或3’端。

所述表达载体的启动子可以是hEF-1α启动子（human elongation factor-1alpha promoter）、hCMV启动子（human cytomegalovirus promoter）、SV40（Simianvacuolating virus40）早期启动子等。

如本发明实施例列举的，所述表达载体为pIRESneo3（购自Clontech）和经过改造的pIRESneo3，所述经过改造的pIRESneo3中，人EF-1α启动子序列或人SV40启动子序列替换了pIRESneo3质粒中的hCMV主要立即早期启动子序列。

本发明还提供了一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为前述表达载体所转染。所述的哺乳动物细胞可选自CHO、BHK、SP2/0、C127、HEK293等。

本发明还进一步提供了一种哺乳动物来源蛋白质的生产方法，为在适合表达所述哺乳动物来源的蛋白质的条件下，培养前述含有本发明增强子的表达载体所转染的哺乳动物宿主细胞。所述哺乳动物来源的蛋白质可以为任意分子量的蛋白质，如抗体轻链或者重链等。

更具体的，本发明还提供了一种哺乳动物来源蛋白质的表达方法，其步骤包括，

1、将本发明所述的增强子序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子的5’端或者3’端，

2、在增强子序列插入之前或者之后加入哺乳动物来源蛋白质的核苷酸序列，

3、哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物宿主细胞，

4、培养哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。

本发明提供了本发明所述增强子在提高哺乳动物来源蛋白表达量的应用。本发明将本发明增强子与现有hCMV增强子进行比较，外源蛋白表达量的测定结果表明，本发明的增强子特别适用于CHO细胞，与现有hCMV增强子相比，在动物细胞中的外源蛋白表达量获得大幅提升，表达水平提高了约2～3倍，其应用有利于筛选到高表达单克隆细胞株，具有降低生产成本、缩短研发时间等优势。

附图说明

图1显示本发明增强子与hCMV增强子的比较（pCV载体）

图2显示本发明增强子与hCMV增强子的比较（pEF载体）

图3显示本发明增强子与hCMV增强子的比较（pSV载体）

具体实施方式

下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。

本发明实施例所列举的表达载体，是pIRESneo3（购自Clontech）和经过改造的pIRESneo3。经过改造的pIRESneo3表达载体中，hEF-1α启动子,SV40早期启动子分别替换了原质粒中的hCMV主要立即早期启动子(Humancytomegalovirus major immediate early promoter)序列。

实施例1本发明增强子的合成

PCR法合成增强子，5′与3′端添加NruI（TCGCGA）酶切位点，以便于插入表达载体启动子5’端（无方向性）。

增强子1：

CATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACTTCCCATAGTAACCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGCGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCGGTGTGGAAAGCCCATTGACGTCAATGGGA（SEQ ID NO：1）

增强子2：

TGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGTACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTGGTGTGGAAAGCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAA（SEQ ID NO：2）

增强子3：

CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGACAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGA（SEQ ID NO：3）

增强子4：

TAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG（SEQ ID NO：4）

增强子5：

TACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGG（SEQ ID NO：5）

实施例2hCMV增强子的扩增

以质粒pIRESneo3（购自Clontech公司）为模版，hCMV增强子序列为参考，设计引物（5′与3′端添加NruI（TCGCGA）酶切位点）进行聚合酶链式反应，扩增出hCMV增强子序列，反应条件如表1。

所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57（购自Fermentas公司）连接，并进行测序鉴定以获得正确的目的序列。

表1 PCR反应条件

实施例3人EF-1α启动子的扩增

以质粒pEF6/V5-HisA（购自Invitrogen公司）为模版，人EF-1α启动子序列为参考，设计引物,进行聚合酶链式反应，扩增出人EF-1α启动子序列，反应条件如表1。

所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57（购自Fermentas公司）连接，并进行测序鉴定以获得正确的目的序列。

实施例4SV40早期启动子的扩增

以质粒pEF6/V5-HisA（购自Invitrogen公司）为模版，SV40早期启动子序列为参考，设计引物,进行聚合酶链式反应，扩增出SV40早期启动子序列，

反应条件如表1。

所得PCR产物与经过SmaI处理的pUC57（购自Fermentas公司）连接，并进行测序鉴定以获得正确的目的序列。

实施例5重组pCV表达载体的构建

将人IgG1重链恒定区（genebank ID:3500，5′端添加了Kozak序列）经NheI/BamHI双酶切处理后，连接至NheI/BamHI双酶切后的质粒pIRESneo3(pCV)，所获得的重组质粒命名为pCV-CHh。

将增强子1，增强子2，增强子3，增强子4，增强子5分别替换pCV-CHh载体中的hCMV增强子。所获得的重组质粒分别命名为pCV-CH1,pCV-CH2,pCV-CH3,pCV-CH4,pCV-CH5。

实施例6重组pCV表达载体瞬时转染表达研究

采用脂质体法（freestyle MAX，invitrogen）将质粒pCV-CHh，pCV-CH1,pCV-CH2,pCV-CH3,pCV-CH4,pCV-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。

按照freestyle MAX操作说明书，将5μg pCV-CHh，pCV-CH1,pCV-CH2,pCV-CH3,pCV-CH4,pCV-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/well）的CHO-S细胞（约3×10⁶个细胞）。转染细胞在8%CO₂，37℃的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用ELISA法检测人IgG重链（CH）表达量。pCV-CHh，pCV-CH1,pCV-CH2,pCV-CH3,pCV-CH4,pCV-CH5的表达量分别是390ng/ml,921ng/ml,428ng/ml,460ng/ml,500ng/ml,403ng/ml。结果显示，本发明增强子相对于hCMV增强子，在相同条件下，将CH表达量提高了2倍多，见图1。

实施例7重组pEF表达载体的构建

将实施例3中的产物与pIRESneo3质粒进行SpeI/NheI双酶切连接，获得质粒pEF。

将人IgG1重链恒定区（genebank ID:3500，5′端添加了Kozak序列）经NheI/BamHI双酶切处理后，连接至NheI/BamHI双酶切后的质粒pEF，所获得的重组质粒命名为pEF-CH。

将hCMV增强子，增强子1，增强子2，增强子3，增强子4，增强子5分别用NruI酶处理，pEF载体用NruI酶处理。将上述增强子酶切产物分别与pEF酶切产物连接，所获得的重组质粒分别命名为pEF-CHh，pEF-CH1,pEF-CH2,pEF-CH3,pEF-CH4,pEF-CH5。

实施例8重组pEF表达载体瞬时转染表达研究

采用脂质体法（freestyle MAX，invitrogen）将质粒pEF-CHh，pEF-CH1,pEF-CH2,pEF-CH3,pEF-CH4,pEF-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。

按照freestyle MAX操作说明书，将5μg pEF-CHh，pEF-CH1,pEF-CH2,pEF-CH3,pEF-CH4,pEF-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/well）的CHO-S细胞（约3×10⁶个细胞）。转染细胞在8%CO₂，37℃的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用Elisa法检测人IgG重链恒定区表达量。pEF-CHh，pEF-CH1,pEF-CH2,pEF-CH3,pEF-CH4,pEF-CH5的CH表达量分别是460ng/ml,1260ng/ml,603ng/ml,530ng/ml,820ng/ml,469ng/ml。结果显示，本发明增强子相对于hCMV增强子，在相同条件下，CH表达量提高了近3倍，见图2。

实施例9重组pSV表达载体的构建

将实施例4中的产物与pIRESneo3质粒进行SpeI/NheI双酶切连接，获得质粒pSV。

将人IgG1重链恒定区（genebank ID:3500，5′端添加了Kozak序列）经NheI/BamHI双酶切处理后，连接至NheI/BamHI双酶切后的质粒pSV，所获得的重组质粒命名为pSV-CH。

将hCMV增强子，增强子1，增强子2，增强子3，增强子4，增强子5分别用NruI酶处理，pSV载体用NruI酶处理。将上述增强子酶切产物分别与pSV酶切产物连接。所获得的重组质粒分别命名为pSV-CHh,pSV-CH1,pSV-CH2,pSV-CH3,pSV-CH4,pSV-CH5。

实施例10重组pSV表达载体瞬时转染表达研究

采用脂质体法（freestyle MAX，invitrogen）将质粒pSV-CHh，pSV-CH1,pSV-CH2,pSV-CH3,pSV-CH4,pSV-CH5分别转染CHO-S细胞，检测CH瞬时表达水平。

按照freestyle MAX操作说明书，将5μg pSV-CHh，pSV-CH1,pSV-CH2,pSV-CH3,pSV-CH4,pSV-CH5质粒分别转染培养于6孔板（3ml/well）的CHO-S细胞（约3×10⁶个细胞）。转染细胞在8%CO₂，37℃的Infors中摇动培养48小时后，收集培养液上清，使用ELISA法检测CH表达量。pSV-CHh，pSV-CH1,pSV-CH2,pSV-CH3,pSV-CH4,pSV-CH5的表达量分别是230ng/ml,505ng/ml,200ng/ml,191ng/ml,303ng/ml,231ng/ml。结果显示，本发明增强子相对于hCMV增强子，在相同条件下，CH表达量提高了2倍，见图3。

Claims (9)

1.一种人工合成的增强子，其特征在于所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述核苷酸序列位于表达载体启动子的5’端或者3’端。

4.根据权利要求3所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于所述表达载体启动子选自hEF-1α启动子、hCMV启动子或者SV40早期启动子。

5.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为权利要求2-4任一所述表达载体所转染。

6.根据权利要求5所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为CHO、BHK、SP2/0、HEK293或者C127。

7.根据权利要求6所述的哺乳动物宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为CHO细胞。

8.一种哺乳动物来源蛋白质的表达方法，其步骤包括，

a，将权利要求1所述的增强子序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子的5’端或者3’端，

b，在增强子序列插入之前或者之后加入哺乳动物来源蛋白质的核苷酸序列，

c，哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物宿主细胞，

d，培养哺乳动物宿主细胞，表达目的蛋白。

9.一种如权利要求1所述的增强子在提高哺乳动物来源蛋白质表达量的应用。