KR20130133625A

KR20130133625A - 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법

Info

Publication number: KR20130133625A
Application number: KR1020120057027A
Authority: KR
Inventors: 김선규; 이동헌; 장현숙; 정선기; 윤지용; 김원겸; 문경덕; 안용호; 박상경
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-12-09
Also published as: WO2013180473A1; KR101411740B1

Abstract

본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.

Description

항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법{Bicistronic expression vector for expressing antibody and method for producing antibody using the same}

본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포 및 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 다양한 인간유래 단백질들이 발현되고 있으나, 진핵세포 특유의 당화, 인산화 등과 같은 일련의 과정으로 인하여 포유동물세포를 이용할 경우에만 정상적으로 생물학적 활성을 갖는 단백질이 합성되는 경우가 많다. 치료용 항체로 많이 사용되는 면역글로불린G (IgG) 유전자는 중쇄(heavy chain) 유전자와 경쇄(light chain) 유전자로 구성되어 있다. 각각의 유전자로부터 만들어지는 중쇄와 경쇄 단백질은 세포내에서 접힘(folding) 과정에서 서로 결합하여 세포 밖으로 분비된다. 유전자 재조합 항체 단백질을 생산하기 위하여 주로 포유동물세포의 하나인 CHO 세포(Chinese hamster ovary 세포, 중국 햄스터 난소 세포)를 많이 이용한다(Kaufman 등, Mol. Cell. Biol. (1985) 5, 1750).

포유동물 세포에서 보다 강력하고 안정된 유전자 발현을 유도할 수 있는 재조합 발현벡터를 제조하기 위해 사용되고 있는 여러 가지 전략들 중에서 대표적인 방법은 강력한 프로모터를 선별하여 유전자 발현률을 증대시키는 방법이다. 프로모터는 여러가지 전사 인자(transcription factor)의 결합 위치와 TATA box가 존재하여, RNA 중합효소가 결합하여 mRNA 합성이 시작되는 DNA 상의 요소로서 프로모터의 성능에 따라 유전자 발현량이 크게 좌우된다. 높은 항체 발현을 위해서는 항상 높은 발현을 갖는 것이 적합한데, 대표적인 강력한 프로모터로 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터와 인간 EF1-α(Elongation factor1-α) 프로모터 등이 있다.

강력한 프로모터의 사용을 통한 벡터 자체의 mRNA 합성능력을 높이는 방법 외에 치료용 단백질의 생산성을 높이기 위해 널리 사용되는 방법으로 유전자 증폭방법이 있다. 그 방법을 간단히 요약하면, 세포에 외부 유전자를 형질전환 시킨 후 화학 약품을 이용하여 외부 유전자가 염색체에 재조합된 세포만 성장이 가능하도록 선택 배양하여 세포를 분리한 후, 더욱 많은 단백질을 발현하도록 하기 위해서 증가된 양의 화학 약품을 배지에 첨가하여 염색체에 재조합된 외부 유전자의 증폭을 유도하는 것이다. 유전자 증폭에 사용되는 대표적인 유전자로는 DHFR (dehydrofolate reductase, 이하 'DHFR'이라 칭한다)과 GS(glutamine synthetase, 이하 'GS'라 칭한다)가 있다. 이들 증폭 유전자들의 증폭에 사용되는 약품으로는 DHFR에 대하여는 메토트렉세이트(methotroxate, 이하 'MTX'라 한다)가 사용되고 GS에 대하여는 메티오닌 설폭시민(Methioine sulfoximine, 이하 'MSX'라 한다)이 사용된다. 이러한 유전자 증폭과정을 거쳐 1000개 이상의 증폭된 외부유전자를 갖는 세포주의 제조가 가능하게 된다.

통상적으로 항체 유전자를 계속적으로 발현하는 세포주를 제조하기 위해서는 발현하고자 하는 중쇄와 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 DNA와 증폭 유전자를 갖는 벡터 DNA를 함께 세포에 동시 형질전환시킨 후 두개의 DNA가 동시에 염색체에 삽입된 세포주를 분리하거나(Kaufman, Methods in Enz.(1990) 185, 487), 하나의 벡터 내에 SV40 프로모터에 의해 증폭유전자가 발현되도록 하여 그 벡터가 염색체에 삽입된 세포주를 분리하는 방법이 사용된다.

또 다른 증폭 유전자 발현 방법으로 바이시스트로닉 벡터를 제조하는 방법이 있다. 진핵생물은 원핵생물과 달리 원칙적으로 하나의 프로모터에서 하나의 mRNA가 만들어지고 그 유전자만 해독되어 단백질이 합성된다. 그런데 일부 바이러스의 경우 mRNA 중간에 리보좀이 결합할 수 있는 서열이 있어 하나의 mRNA에서 여러 단백질을 합성할 수 있게 해 준다. 항체 유전자와 증폭 유전자가 서로 다른 프로모터에 의하여 발현될 경우, 유전자 증폭시 증폭 유전자 부분만 증폭되고 항체 유전자의 증폭은 이루어 지지 않을 수 있는데, IRES(internal ribosome entry site)를 사용하면 동일한 프로모터로부터 발현되므로 이러한 문제를 피할 수 있다.

한편, 트라스트주맙(trastuzumab, herceptin이라고도 함)은 미국 Genentech사에서 개발한 HER2에 대한 인간화 항체로서, HER2/neu를 과발현시키는 유방암의 치료를 주 적응증으로 하는 항체치료제이다. 트라스투주맙은 HER2에 결합하여 암세포가 증식하는 과정을 억제하며 ADCC를 통하여 암세포 사멸을 유도한다. 트라스투주맙은 그 효능이 우수하며 탈모나 오심, 구토 및 골수에 대한 부작용을 일으키지 않아 환자의 삶의 질 개선에도 효과적인 것으로 알려져 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 발현벡터에 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터를 제작하면 증폭 유전자와 함께 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 동시에 고발현시킬 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 '프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 다양한 포유동물세포에서 강력하고 안정적으로 유전자 발현을 유도할 수 있도록 인트론을 포함하여 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자와 증폭 유전자가 하나의 유전자처럼 발현되도록 설계된 바이시스트로닉 발현벡터를 제공할 수 있는 것에 그 특징이 있다.

본 발명에서 용어, "바이시스트로닉(bicistronic)"이란, 진핵세포 내에서 mRNA의 내부에서도 리보좀이 폴리펩티드를 합성할 수 있게 되어 하나의 mRNA로부터 여러 단백질이 합성 가능하게 된 시스템을 의미하며, 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 벡터를 디자인하였다.

일반적으로, 대장균과 같은 원핵세포가 하나의 mRNA의 여러 위치에 리보좀이 결합하여 한번에 여러 단백질을 합성할 수 있는 폴리시스트로닉(polycistronic) 시스템을 가진 것과는 달리, 진핵세포에서는 mRNA로부터 단백질을 해독(translation)할 때, 리보좀이 mRNA의 5' 끝에 부착된 후 스캐닝(scanning) 방법을 통해서 개시 코돈인 AUG를 찾게 되고, 이 AUG 코돈으로부터 단백질의 합성이 시작됨에 따라 하나의 mRNA로부터 반드시 하나의 폴리펩티드가 형성되는 모노시스트로닉(monocistronic) 시스템을 갖게 되며, ATG의 인식 및 단백질 합성의 시작에 코작 서열(Kozac sequence)이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 EMC 바이러스(Encephalomyocarditis virus, 이하 'EMCV'라 한다)의 경우는, 내부 인트론 진입부분(Internal Ribosome Entry Site, IRES, 이하 'IRES'라 칭한다)이라 불리는 특별한 구조로 되어있는 RNA 서열을 갖고 있어, 진핵세포 내에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하다(Jang 등, J. Virol.(1989) 63, 1651). 본 발명에서는 항체 유전자와 증폭 유전자가 동시에 발현될 수 있도록 하기 위하여, 항체의 중쇄 유전자 뒤에 IRES가 오도록 한 후 그 뒤에 증폭 유전자가 오도록 벡터를 디자인하였다.

본 발명에서 용어, "벡터(vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 본 발명의 목적상 바람직하게는 항체를 발현하기 위한 벡터를 의미하며, 바이시스트로닉 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "인트론(intron)"은 진핵세포에서 발견되는 특징적인 서열로 유전정보를 가지고 있지 않아서 단백질을 만들지 못하는 DNA 영역을 의미하며, 핵에서 RNA 중합효소에 의하여 mRNA가 합성될 때 전사되지만 핵 밖으로 빠져나가는 과정에서 스플라이싱(splicing) 과정을 통해 제거되는 부분이다. 이러한 인트론과 비해독 엑손(untranslated exon)을 포함하는 플라스미드의 유전자 발현량이 인트론을 포함하지 않는 경우에 비하여 더 높다는 연구 결과들이 축적됨에 따라, 재조합 발현벡터에 이종 인트론을 도입함으로써 보다 안정하고 지속적인 유전자 발현이 가능하도록 개선된 벡터들이 개발되어 사용되고 있다. 그러나 기존의 인트론 삽입 벡터의 경우에는 모노시스트로닉 벡터에 사용되어 단지 하나의 유전자만을 발현시키는 단점이 있었다. 이에 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하기 위하여 바이시스트로닉 벡터 시스템에서 외부 인트론 유전자를 프로모터 뒤에 삽입할 경우 고효율의 유전자 발현을 시킬 수 있음을 고안하였다.

본 발명의 인트론은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 1의 AI 인트론일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 보다 효과적이고 짧은 서열의 인트론을 제작하기 위하여 인간 IGLV1-1L1 인트론을 기반으로 하여 인트론이 제거되는 과정인 스플라이싱에 관여하는 U1 및 U2 RNA의 서열 및 인트론의 보존적 서열(consensus sequence)을 적용하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 돌연변이 AI 인트론 서열을 고안하였으며, 이를 프로모터와 항체 경쇄 및 중쇄 유전자 사이에 각각 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.

본 발명에서 용어, "증폭 유전자"는 본 발명에서 안정적으로 고발현하고자 하는 항체 유전자와 함께 발현시키도록 유도하기 위하여 증폭되는 유전자를 의미하며, 세포 내 염색체로 상기 증폭 유전자 및 항체 유전자가 재조합된 세포만이 성장이 가능하도록, 증폭 유전자가 삽입되지 않은 세포는 처리된 화학약품의 존재 하에서는 성장하지 않는 원리를 이용하여, 화학 약품을 사용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면 상기 증폭 유전자와 항체 유전자가 하나의 유전자처럼 함께 발현되도록 유도되어 궁극적으로 목적하는 항체 유전자를 고발현시킬 수 있다.

상기 증폭 유전자는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 증폭 유전자로 GS를 사용한 pCALHIG 발현벡터 및 증폭 유전자로 DHFR을 사용한 pCALHID 발현벡터를 제작하고(도 4 및 5), 상기 발현벡터가 항체 유전자를 고발현시키는데 유용함을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "프로모터"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 프로모터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터 또는 인간 연장인자1-α(EF-α) 프로모터일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사이토메갈로 바이러스일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 높은 항체 발현을 유도하기 위하여 지금까지 알려진 가장 강력한 동물세포용 프로모터 중의 하나인 사이토메갈로 바이러스(Bohart 등, Cell (1985) 41, 521; Thomen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81, 659)의 초기 프로모터를 이용하여 발현벡터를 제작하였다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 계속적으로 고발현되기 위한 목적이 되는 것으로서, 본 발명의 발현벡터를 이용하여 상기 항체 유전자를 강력하고 안정적으로 발현하도록 유도할 수 있으며, 상기 발현벡터를 형질전환시킨 동물세포를 이용하여 항체를 효율적으로 생산할 수 있다.

상기 항체는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 경쇄 2개와 중쇄 2개가 이황화결합을 통하여 Y자형의 단백질로 형성된다. 본 발명의 일실시예에서는 인트론을 포함하는 항체의 경쇄 발현벡터 및 중쇄 발현벡터를 각각 제작하여 최종적으로 경쇄/중쇄 발현벡터를 제작함으로써, 경쇄 및 중쇄를 모두 갖는 항체를 생산할 수 있는 발현벡터를 제작하였다.

본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 HER-2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 퍼투주맙(pertuzumab)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 트라스투주맙(trastuzumab)일 수 있다. 상기 트라스투주맙은 허셉틴(Herceptin)이라고도 하며, 유방암 세포에서 주로 발현되는 HER2/neu에 대한 항체치료제로 알려져 있는 미국 Genentech사에서 개발한 HER2에 대한 인간화 항체이다.

본 발명에서 용어, "IRES(internal ribosome entry site, 내부리보좀유입점)"는 진핵세포에서 하나의 mRNA로부터 여러 단백질 합성이 가능하도록 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역을 의미하며, 본 발명의 발현벡터가 바이시스트로닉 발현벡터가 될 수 있도록 하는 역할을 한다.

진핵세포에서 mRNA의 해독은 일반적으로 mRNA의 5'끝에 부착된 캡(cap) 구조 의존적이지만, 이러한 캡 구조 비의존성 번역을 하는 경우 리보좀이 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역에 직접 결합하여 번역을 시작하는 경우가 있어 이것을 내부개시기구라 한다. 상기 내부개시기구에서 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 상의 부위를 IRES라 하는데, 폴리오바이러스, EMC 바이러스 등의 바이러스 mRNA 외에 면역글로불린 중쇄 결합단백질(BiP) mRNA, 초파리의 안테나유전자(Antp) mRNA 등의 세포 mRNA에서도 발견된다.

본 발명에서 용어, "polyA"는 폴리아데닐산 또는 폴리아데닐산 절편이라고 불리며, 진핵생물의 mRNA 3' 말단에 보편적으로 존재하는 아데닐산의 연속한 배열을 의미한다. 그 길이는 10 내지 200 뉴클레오티드 정도이며, mRNA의 안정화, 해독, 핵에서 세포질로의 수송 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 항체 생산용 바이시스트로닉 발현벡터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 도 4에 도시된 pCALHIG 또는 도 5에 도시된 pCALHID일 수 있다. 상기 pCALHIG 발현벡터는 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-트라스투주맙 중쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이며, pCALHID 발현벡터는 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 'CMV 프로모터-AI 인트론-트라스투주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-트라스투주맙 중쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는 발현벡터이다. 본 발명의 일실시예서는 경쇄 발현벡터 pCALSN 및 중쇄 발현벡터 pCAHIG를 이용하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG를 제작하였으며, 상기 pCALHIG 발현벡터에서 증폭 유전자로서 GS 대신 DHFR을 포함하는 pCALHID 발현벡터를 제작하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 제공한다.

본 발명에서 동물세포에 형질전환된 발현벡터는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터이며, 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "형질전환(transfection)"은 배양동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법으로서, 일반적으로 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 방법을 사용한다. 상기 형질전환은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 그 예로 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법, 전기천공법, 재분포법 등이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 리포펙타민을 이용하여 경쇄/중쇄 발현벡터를 세포 내로 형질전환시켰다.

상기 동물세포는 항체를 생산할 수 있는 한 당 분야에서 사용하는 동물세포를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 사용할 수 있다.

상기 동물세포는 상기에서 설명한 본원발명의 경쇄/중쇄 발현벡터가 형질전환된 것을 모두 포함하나, 바람직하게는 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG가 형질전환된 기탁번호 KCTC 12164BP의 세포주일 수 있다. 본 발명자들은 상기 pCALHIG가 형질전환된 세포주를 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 12164BP를 부여받았다.

본 발명에서 상기 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포는 항체를 안정적으로 고발현할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 100μM MSX 농도에서 인트론을 갖는 발현벡터(pCALHIG)가 형질전환된 동물세포주가 인트론이 없는 발현벡터(pCLHIG)가 형질전환된 세포주에 비하여 약 2.5배 수준의 항체 발현량을 보임을 확인하였으며, 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포주가 모노시스트로닉 발현벡터(pCALHSG)가 형질전환된 동물세포주에 비하여 약 17배 수준의 생산성을 보임을 확인하였다(도 6).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 동물세포는 본 발명에 따른 인트론을 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터가 형질전환된 동물세포로서, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 항체 생산 방법은 상기 동물세포를 배양함으로써, 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게는 (a) 상기 동물세포를 배지에 접종하는 단계; (b) 상기 배지를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 배지에서 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 생산될 수 있는 상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나, 트라스투주맙일 수 있다.

본 발명에 따른 인트론을 포함하는 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터를 이용하면, 원하는 항체를 고효율로 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작할 수 있으며, 상기 발현벡터가 형질전환된 동물세포를 배양하여 항체를 안정적이고 고효율로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 경쇄 발현벡터 pCLSN 및 pCALSN의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 중쇄 발현벡터 pCHIG 및 PCAHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID의 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 6은 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG, pCALHIG 및 모노시스트로닉 발현벡터 pCALHSG를 형질전환시킨 세포주의 상대적 항체 발현량을 비교한 결과이다.
도 7은 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG 및 pCALHID를 형질전환시킨 세포주의 상대적 항체 발현량을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> AI 인트론의 제작

인간 IGLV1-1L1 인트론(Genbank Accession No. X59707)을 기반으로 하여 인트론이 제거되는 과정인 스플라이싱(splicing)에 관여하는 U1 및 U2 RNA의 서열 및 인트론의 보존적 서열(consensus sequence)을 적용하여 서열번호 1의 염기서열을 갖는 돌연변이 AI 인트론 서열을 고안하였다. 고안된 AI 인트론 서열을 바탕으로 중간 부분의 서열이 겹치도록 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 PCR을 통하여 어닐링(annealing) 및 필-인(fill-in)하여 DNA를 확보하였다. 올리고뉴클레오티드의 고안 시 제한효소 NheI과 ApaI 인식부위를 각각 첨가하여 이후의 클로닝 과정에 사용되도록 하였다.

PCR 반응은 주형 없이 서로 상보적 서열을 포함하는 서열번호 2 및 3의 염기서열을 갖는 AIF 프라이머와 AIR 프라이머를 사용하여 어닐링(annealing)과 필-인(fill-in) 과정을 통해 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 5회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 2 및 3의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. PCR로 증폭된 AI 인트론 절편을 제조사의 지침에 따라 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다.

AI 인트론을 클로닝이 용이한 CMV 프로모터-AI 인트론 형태로 제작하기 위하여, 상기 AI 인트론이 삽입된 pCR2.1-TOPO 벡터를 제한효소 NheI과 ApaI으로 절단하여 얻은 AI 인트론 절편을 동일한 제한효소로 처리된 pcDNA3 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. 이어서 상기 AI 인트론이 삽입된 pcDNA3 벡터로부터 CMV 프로모터로부터 AI 인트론을 포함하는 절편을 PCR을 통해 증폭하였다. PCR 반응은 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 CAF 프라이머와 CAR 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 4 및 5의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다.

이로부터 증폭된 CMV 프로모터 하부에 AI 인트론 절편을 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen사)에 클로닝하여 pCR-CMV-AI 벡터를 제작하였다.

본 실시예에서 AI 인트론의 제조에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

프라이머	염기서열	서열번호
AIF	GCT AGC CAG GTA AGT GCA TGG GGA CCA AGA AAG GCG CCC TGG GAA GCC CAT GGC GCC CTG CTT TCT CCT CTT GTC TCC TTT TGT CTC TTG	2
AIR	GGG CCC AGG TCA CCT GGA AGT GAG AGA GAC ACA GAC AGT TAG TAG TAC AAG AGA CAA AAG GAG ACA AGA GGA GAA AGC AGG GCG CCA TGG	3
CAF	ACA TGT GGC GCG CCG CGG CGA CGC GTT GAC	4
CAR	GGA TCC TCT AGA AGG TCA CCT GGA AGT GAG	5

<실시예 2> 경쇄 발현벡터 pCLSN과 pCALSN의 제작

항체의 경쇄를 발현하는 벡터를 제작하기 위하여, CMV 프로모터와 GFP 유전자를 포함하는 pAcGFP-N2 벡터(Clonetech사)를 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 GFP 절편을 제거한 후, 그 자리에 트라스트주맙(trastuzumab) 유전자(미국특허 US6,870,034 B2의 아미노산 서열을 바탕으로 Geneart 사로부터 유전자 합성을 통해 얻음)을 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 얻은 경쇄 유전자 절편을 삽입하여 pCLSN 벡터를 제작하였다(도 1). pCLSN 벡터는 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

pCLSN 벡터의 CMV 프로모터와 트라스트주맙 경쇄 유전자의 사이에 AI 인트론을 삽입하기 위하여, pCLSN 벡터를 제한효소 NdeI(CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI(CMV 프로모터와 트라스트주맙 경쇄 유전자 사이에 위치)으로 절단한 후, 그 자리에 실시예 1에서 제작한 pCR-CMV-AI 벡터를 제한효소 NdeI과 XbaI으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 인트론 절편을 삽입하여 경쇄 발현벡터 pCALSN을 제작하였다(도 1). 경쇄 발현벡터 pCALSN는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

<실시예 3> 중쇄 발현벡터 pCHIG와 pCAHIG의 제작

CMV 프로모터와 엔브렐(Enbrel; Etanercept) 유전자를 포함하는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS(대한민국 특허출원 제10-2012-0025197호)의 엔브렐 유전자를 제한효소 NheI과 NotI으로 절단한 후, 그 자리에 트라스트주맙을 제한효소 NheI과 NotI으로 절단하여 얻은 중쇄 유전자 절편을 pCHIG 벡터를 제작하였다(도 2). pCHIG 벡터는 CMV 프로모터-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES(internal ribosomal entry site)-GS(glutathione synthetase)-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

pCHIG 벡터의 CMV 프로모터와 트라스트주맙 중쇄 유전자 사이에 AI 인트론을 삽입하기 위하여, pCHIG 벡터를 제한효소 NdeI(CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI(CMV 프로모터와 트라스트주맙 중쇄 유전자 사이에 위치)으로 절단한 후, 그 자리에 실시예 1에서 제작한 pCR-CMV-AI 벡터를 제한효소 NdeI과 XbaI으로 절단하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 인트론 절편을 삽입하여 중쇄 발현벡터 pCAHIG를 제작하였다(도 2). 중쇄 발현벡터 pCAHIG는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

<실시예 4> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG의 제작

실시예 2에서 제작된 pCLSN 벡터로부터 PCR을 통하여 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 증폭한 후 이를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단하였다. 이때 PCR 반응은 pCLSN 벡터를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 CMV_Ac 정방향 프라이머와 AflII_Ac 역방항 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 6 및 7의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다.

실시예 3에서 제작된 pCHIG 벡터를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단한 후 그 자리에 상기에서 준비된 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG를 제작하였다(도 3). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG는 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-트라스트주맙 중쇄 유전자-폴리A 절편-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

상기에서 CMV 프로모터-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편의 증폭에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

프라이머	염기서열	서열번호
CMV_Ac	ACA TGT CCG CGG ACT GGC GCG CCC GCC ATG CAT TAG TTA TTA A	6
AflII_Ac	GGA TCC ACG CGT CGC CTT AAG ATA CAT TGA TG	7

실시예 2에서 제작된 pCALSN 벡터로부터 PCR을 통하여 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 증폭한 후 이를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단하였다. 이때 PCR 반응은 pCALSN 벡터를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 CMV_Ac 정방향 프라이머와 AflII_Ac 역방항 프라이머를 사용하여 수행되었다). PCR 반응은 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분 및 72℃에서 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 증폭시켰다. PCR 반응용액은 Premix Taq (Ex Taq version) (TAKARA사) 25 ㎕, 서열번호 6 및 7의 프라이머(10 pmole/㎕) 각 2 ㎕와 DNA 주형 1 ㎕를 포함하고, 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다.

실시예 3에서 제작된 pCAHIG 벡터를 제한효소 SacII와 MluI으로 절단한 후 그 자리에 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG를 제작하였다(도 4). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-폴리A 절편-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

상기에서 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편의 증폭에 사용된 프라이머 및 그의 염기서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.

<실시예 5> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID의 제작

실시예 4에서 제작된 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 동일한 구조를 갖지만 증폭 유전자 GS 대신에 DHFR(dihydrofolate reductase)을 포함하는 발현벡터를 제작하기 위하여, 발현벡터 pCALHIG를 제한효소 SalI과 SfiI으로 절단하여 GS 유전자 절편을 제거하였다. pcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-DHFR(대한민국 특허출원 제10-2012-0025197호)를 제한효소 SalI과 SfiI으로 절단하여 얻은 DHFR 유전자 절편을 상기 발현벡터 pCALHIG에 삽입하여 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID를 제작하였다(도 5). 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHID는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하고, CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES-DHFR-폴리A 절편을 포함하는 벡터이다.

<실시예 6> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG로부터 항체의 발현율 검사

<6-1> 형질전환

항체 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위해, 우선 DHFR 결핍 CHO-K1 세포(ATCC CCL-61)를 형질전환 실험 전날 6-웰 플레이트에 웰당 4×10⁵ 세포의 농도로 분양한 후 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 70 내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen사)을 이용해 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각을 세포 내로 형질전환시켰다. 이때 형질전환은 Opti-MEM-1(Invitrgen 사)에 상기 발현벡터 DNA 각 4 ㎍과 리포펙타민 10 ㎕를 첨가한 배지를 사용하여 수행되었다. 이로부터 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각이 형질전환된 CHO-K1 세포를 선발하였다.

한편, 상기 방법으로 형질전환된 CHO-K1 세포 중에서 pCALHIG가 형질전환된 세포를 선발하여 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 12164BP를 부여받았다.

<6-2> 항체 유전자 증폭

실시예 6-1에서 경쇄/중쇄 발현벡터 pCLHIG와 pCALHIG 각각이 형질전환된 CHO-K1 세포주에 MSX(Methioine sulfoximine)의 초기 농도로 25μM을 처리한 후 세포 생장이 정상적으로 회복될 때까지 생장의 추이를 관찰하였다. 이 때, MSX의 작동 여부를 알기 위해 GS가 삽입되지 않은 CHO-K1 세포주를 대조군으로 사용하여 생장 여부를 비교하였다. MSX 25μM을 처리하고 3일 이후에 세포 수가 약 40% 감소하였으며, 이는 계대 이후 생장이 회복되는 추세를 보였다. 7일 이후의 계대에서는 MSX의 농도를 초기 농도의 2배인 50μM로 증가시켰으며, 마찬가지 방법으로 MSX에 의한 외부압력에 대해 생장이 회복되는 계대 시점에서 MSX의 농도를 증가시켜 최종적으로 100μM까지 증가시켰다. 100μM의 MSX의 농도에서 제조된 세포주 풀(pool)의 발현량을 측정하여 벡터간 발현량을 비교하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하여 이들 값의 상대적인 발현량을 비교하였다. 그 결과 100μM의 MSX 농도에서, 인트론을 갖는 pCALHIG 벡터를 형질전환시킨 세포주가 인트론이 없는 pCLHIG 벡터를 형질전환시킨 세포주에 비하여 약 2.5배 수준의 발현량을 보임을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 본 발명의 바이시스트로닉 벡터는 인트론을 삽입함으로써, 인트론이 없는 벡터보다 상기 항체 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.

추가적으로, 본 발명의 바이시스트로닉 발현벡터가 모노시스트로닉 발현벡터에 비하여 항체 유전자의 생산성이 높음을 확인하기 위하여, 모노시스트로닉 발현벡터인 pCALHSG를 제작하여 동일한 조건에서 비교하였다. 그 결과, 본원발명의 바이시스트로닉 발현벡터가 모노시스트로닉 발현벡터에 비하여 약 17배 수준의 항체 발현량을 보임을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 모노시스트로닉 벡터에 비하여 본원발명의 바이시스트로닉 벡터가 항체 생산성이 높음을 의미한다.

<실시예 7> 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID의 발현율 검사

<7-1> 형질전환

증폭 유전자 GS 대신에 DHFR를 포함하는 pCALHID 발현벡터가 형질전환된 세포주의 발현량을 비교하기 위하여, 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 CHO-K1 세포와 CHO-DG44 세포(Invitrogen) 각각에 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID 각각을 세포 내로 형질전환시키고, 형질전환된 CHO-K1 및 CHO-DG44 세포를 선발하였다.

<7-2> 항체 유전자 증폭

실시예 7-1에서 경쇄/중쇄 발현벡터 pCALHIG와 pCALHID 각각이 형질전환된 CHO-K1과 CHO-DG44 세포주에 각각 MSX와 MTX(methotroxate)를 처리하여 유전자 증폭을 수행하였다. 실시예 6-2와 동일하게 세포 생장이 정상적으로 회복될 때 MSX와 MTX의 농도를 증가시키는 방법에 의하여 MSX와 MTX의 농도를 증가시키면서 발현량을 측정하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD(Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구하였다. 그 결과, pCALHIG벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 500μM의 MSX 농도에서, pCALHID 벡터를 형질전환시킨 세포주의 경우 5μM의 MTX 농도에서 최고 발현량을 보였으며, 이 때 상기 두 벡터를 형질전환시킨 세포주는 유사한 수준의 세포당 발현량을 보임을 확인하였다(도 7). 이러한 결과는, 증폭 유전자가 서로 다른 경우에도 인트론이 삽입된 발현벡터를 형질전환시킨 경우 유전자를 계속적으로 고발현할 수 있음을 의미한다.

한국생명공학연구원

KCTC12164BP

20120319

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Bicistronic expression vector for expressing antibody and method for producing antibody using the same <130> PA110546KR <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AI intron <400> 1 caggtaagtg catggggacc aagaaaggcg ccctgggaag cccatggcgc cctgctttct 60 cctcttgtct ccttttgtct cttgtactac taactgtctg tgtctctctc acttccaggt 120 gacct 125 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIF primer <400> 2 gctagccagg taagtgcatg gggaccaaga aaggcgccct gggaagccca tggcgccctg 60 ctttctcctc ttgtctcctt ttgtctcttg 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIR primer <400> 3 gggcccaggt cacctggaag tgagagagac acagacagtt agtagtacaa gagacaaaag 60 gagacaagag gagaaagcag ggcgccatgg 90 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAF primer <400> 4 acatgtggcg cgccgcggcg acgcgttgac 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR primer <400> 5 ggatcctcta gaaggtcacc tggaagtgag 30 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_Ac primer <400> 6 acatgtccgc ggactggcgc gcccgccatg cattagttat taa 43 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AflII_Ac primer <400> 7 ggatccacgc gtcgccttaa gatacattga tg 32

Claims

'프로모터-인트론-항체 경쇄 유전자-polyA'를 포함하는 제1발현 카세트 및 '프로모터-인트론-항체 중쇄 유전자-IRES(internal ribosome entry site)-증폭 유전자-polyA'를 포함하는 제2발현 카세트를 포함하는, 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 인트론은 서열번호 1인 것인 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 증폭 유전자는 GS(glutamine synthetase) 또는 DHFR(dehydrofolate reductase)인 것인 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터인 것인 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙(trastuzumab)인 것인 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 4에 기재된 pCALHIG의 개열지도를 갖는 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 5에 기재된 pCALHID의 개열지도를 갖는 발현벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현벡터가 형질전환된 동물세포.
제8항에 있어서, 상기 동물세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)인 것인 동물세포.
제8항에 있어서, 상기 동물세포는 기탁번호 KCTC 12164BP인 것인 동물세포.
제8항의 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
제11항에 있어서,
(a) 제8항의 동물세포를 배지에 접종하는 단계;
(b) 상기 배지를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 배지에서 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
제11항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙인 것인 방법.