KR101385223B1 - 동물세포 발현벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 증가된 유전자 발현능을 가지는 동물세포 발현벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 프로모터의 5' 말단, 전사 종결 인자의 3' 말단, 또는 상기 프로모터의 5' 말단과 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 양측에 유전자 발현 증가 인자인 MAR 인자 및 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 동물세포 발현벡터는 종래 동물세포 발현벡터에 비하여, 매우 우수한 유전자 발현 증가능을 보임으로써, 상기 동물세포 발현벡터를 이용하여 외래 유전자의 단백질 발현을 현저하게 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 동물세포 발현벡터는 MTX 증폭 없이도 고발현 세포주 확보가 가능하게 하는 바 매우 유용하다.

Description

동물세포 발현벡터{Expression vector for Animal Cell}
본 발명은 증가된 유전자 발현능을 가지는 동물세포 발현벡터에 관한 것이다.
목적 단백질을 대량으로 발현, 수득하여 의약, 산업 등의 용도로 이용하기 위하여 미생물, 식물, 효모, 곤충세포, 동물세포 등의 다양한 발현 시스템이 사용되고 있다. 이 가운데 미생물은 가장 이용하기 쉬운 시스템으로서, 다양한 응용에 적합한 발현 시스템들로 개발되어 상용화되어 있다.
하지만 미생물 발현 시스템은 몇 가지 제한 요인을 가지고 있다. 가장 큰 제한요인은 미생물의 단백질 발현 및 변형기작 (당쇄화, 인산화, 아마이드화)이 동물세포와 상이하여 동일 유전자를 미생물 시스템에서 발현시키더라도 발현되는 단백질의 구조나 특성이 본래 단백질과 완전히 동일하지 않다는 것이다. 그로 인하여 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 단백질 생성은 합성 후 변형이 거의 일어나지 않아 불활성화 되거나 기능상의 현저한 차이는 없더라도 변형이나 구조에서 부분적인 차이를 가지는 단백질을 발현할 경우가 매우 많은 실정이다. 또한 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 단백질의 생산과정은 미생물의 오염, 미생물의 내독소 오염 등으로 인하여 부차적인 오염물 제거를 수반하여야 하는 번거러움이 따른다.
그에 비해 동물세포 발현시스템은 동물 단백질을 발현시키기에 가장 적합한 시스템임에도 불구하고 미생물 발현시스템에 비해 재조합 단백질의 발현효율이 낮아 생산단가가 높고, 동물세포의 조작 과정이 까다로워 쉽게 산업화되지 못하고 있다. 현재 사용되는 산업용 동물세포주로는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), 골수종(myeloma) 등이 있으며, 해당 유전자를 포함하는 발현벡터를 이들 동물세포주에 형질도입하여 목적하는 외래 단백질을 발현시킨다.
동물세포는 당쇄화를 비롯한 다양한 단백질 변형 기작이 유지되고, 배양배지로 단백질을 분비하는 경우 단백질의 수득과 정제 과정이 보다 용이하다. 대부분의 동물세포가 배양 과정에서 혈청 단백질 등의 복합적 첨가물을 반드시 필요로 하는 데 반하여, CHO 세포는 혈청 및 단백질이 첨가되지 않은 배지에서 배양 가능하므로, 재조합 단백질 발현에 가장 적합한 숙주로 활용된다. 또한 CHO 세포는 많은 연구가 선행되어 그 특성이 잘 알려져 있으며, 성장 속도가 빠르고 대량 배양을 위한 현탁 배양(suspension culture)이 가능하다는 이점을 지니고 있다.
일반적으로 동물세포에서 외래 유전자를 발현하고자 할 때 외래 유전자와 선별마크(marker)를 지닌 벡터를 동시에 형질 도입(transfection)시키고, 형질전환된 세포는 선택배지에서 배양하여 선별한다. 하지만 이들의 발현 빈도는 대부분의 경우 매우 낮다. 그 이유 중 하나는 미생물 시스템과 달리 동물세포에서는 이들 외래 유전자가 숙주 세포내 염색체에 삽입되어야 한다는 점이다. 또한 외래유전자가 숙주세포의 염색체에 안정적으로 삽입되어 있는 형질전환체(stable transfectants)를 선별하더라도 그 발현량은 예측하기 어렵다. 이는 각 세포마다 유전자의 삽입 위치가 다르고, 삽입위치에 따라 발현양상이 다르기 때문이다. 따라서 동물세포내 삽입된 외래 유전자의 수와 유전자 발현량은 명확한 상관관계를 가지지 않는다.(Grindley et al., 1987, Trends Genet. 3, 16-22 ; Kucherlapati et al., 1984, Crit. Rev. Biochem. 16,349-381 ; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev. Genet. 20, 465-499) 대부분의 경우 동물세포에서의 유전자 발현은 삽입된 주변의 핵산염기에 의하여 억제되어, 안정하게 삽입된 외래 유전자(stably integrated transgenes)라 할지라도 종종 매우 낮은 수준으로 발현된다(Eissenberg et al., 1991, Trends Genet. 7, 335-340; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev.Genet . 20, 465-499).
이러한 유전자 위치 특이적 효과로부터 외래유전자의 발현을 보호하기 위한 핵산인자의 이용 가능성이 여러 시스템에서 보고되어 왔다. 상기한 핵산인자로는 완충부위(insulator) 인자 및 핵 격자 구조체 결합 염기 (Nuclear Matrix Attachment Region : 이하 "MAR"라 함) 또는 지지체 접촉부위 (Scaffold Attachment Region : 이하 "SAR"라 함) 등이 활용될 수 있다. 이들의 작용기작은 규명되지 않았지만, 트랜스진(transgene) 구조체에 포함되어 있을 때 삽입 위치와는 무관하게 유전자 발현을 유도하여 그 발현량이 유전자의 카피 수에 따라 결정되는 양상이 나타난다(McKnight, R.A. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. USA. 89, 6943 - 6947). 칼로스 등은 인체 아포리포프로테인(apolipoprotein) B 유전자의 MAR 인자를 최소 프로모터 트랜스진 구조체(minimal promoter transgene construct)에 조합하고, 동물세포에서 유전자 발현을 유도하여 그 전사체의 발현을 약 200배 증가시킨 바 있다(Kalos et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 198-207). 이와 유사하게 척추동물세포에서 닭 라이조자임(chicken lysozyme) A 유전자의 MAR 인자와 사람의 인터페론 베타(interferon β) 유전자의 SAR 인자 등도 숙주세포 염색체 내의 삽입 위치에 무관하게 외래 유전자 발현을 증가시키는 성질을 가진 것으로 보고 되었다(Eissenberg et al., 1991, Trends Genet . 7, 335-340 ; Klehr et al., 1991, Biochemistry 30, 1264-1270). 그러나, 이러한 특정 베타 글로빈 MAR인자, 특정 CSP-B SAR인자 또는 특정 인터페론 베타 SAR인자의 조합을 이용하여, 세포주에서 실질적으로 단백질 생산을 증가시키려는 시도나 산업적 채산성이 검증된 사례는 아직 보고된 바 없다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및/또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 1 카피 이상의 MAR인자 또는 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 동물세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물세포 발현벡터를 이용한 목적 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및/또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 1 카피 이상의 MAR인자 또는 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및/또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 1 카피 이상의 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자 및 인터페론 베타 SAR인자로 구성된 군에서 선택되는 유전자 발현 증가 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및/또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 유전자 발현 증가 인자인 MAR 인자 및 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및/또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 유전자 발현 증가 인자인 베타글로빈 MAR 인자 및 CSP-B SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터 (이때, 상기 프로모터는 마우스 EF1α 프로모터 변이체인 것을 특징으로 함)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 동물세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 동물세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시킨 다음, 회수하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 EF1α 프로모터 변이체를 제공한다.
본 발명에 따른 동물세포 발현벡터는 종래 동물세포 발현벡터에 비하여, 매우 우수한 유전자 발현 증가능을 보임으로써, 상기 동물세포 발현벡터를 이용하여 외래 유전자의 단백질 발현을 현저하게 증가시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 동물세포 발현벡터는 MTX 증폭 없이도 고발현 세포주 확보가 가능하게 하는 바 매우 유용하다.
도 1은 각 벡터별로 함유된 다양한 MAR인자 및 SAR인자의 조합을 개략적으로 나타낸 일 구성도이다.
도 2는 pC(F)mEGM(R) 발현벡터의개열지도이다.
도 3은 pM(R)mEGC(F) 발현벡터의개열지도이다.
도 4는 pM(R)M(R)mEG 발현벡터의 개열지도이다.
도 5는 pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), pSGM(R) 벡터들을 부착배양 숙주세포주에 트랜스팩션 시킨 후, VEGF 생산량을 ELISA법으로 측정한 결과이다.
도 6은 pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), pSGM(R) 벡터들을 부유배양 숙주세포주에 트랜스팩션 시킨 후, VEGF 생산량을 ELISA법으로 측정한 결과이다.
도 7은 pI(F)SGM(F), pI(R)SGM(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGI(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGC(R), pC(F)SGM(F), pC(F)SGM(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGI(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGC(R), pC(F)C(F)SG, pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), pM(R)SGI(R), pM(R)SGM(R), 및 pM(R)M(R)SG 벡터에 대한 VEGF 생산량을 ELISA법으로 측정한 결과이다.
도 8은 pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), 및 pM(R)M(R)SG에 대하여 VEGF 생산량을 ELISA법으로 측정한 결과이다.
도 9은 도 8의 벡터들의 SV40 프로모터를 mEF1α 프로모터 변이체를 치환한 후 VEGF 생산량을 ELISA법으로 측정한 결과이다. 이때, pmEF1a promoter*는 mEF1α 프로모터 변이체를 나타낸다.
도 10은 도 9의 벡터들의 목적단백질을 재조합 항체 단백질로 치환한 후, 재조합 항체 단백질의 생산량을 측정한 결과이다. 이때, pmEF1a promoter*는 mEF1α 프로모터 변이체를 나타낸다.
도 11은 pM(R)SG, pMhEG, pMcEG, pMmEG 및 pMmEG(TA)의 재조합 항체 단백질 생산량을 측정한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 유전자 발현능이 증가된 동물세포 발현벡터에 관한 것으로, 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단, 상기 전사 종결 인자의 3' 말단, 또는 상기 프로모터의 5' 말단과 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 양측에 유전자 발현 증가 인자인 MAR 인자 및 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명자들은 외래 유전자 발현시 유전자 발현양의 현저한 증가를 위하여, 동물세포로 알려져있는 CHO (Chinese hamster ovary)세포 또는 BHK(Baby hamster kidney) 세포 등에서 숙주세포 염색체의 위치 특이적 저해 효과로부터 외부 유전자의 발현을 보호하고, 외부 유전자의 발현을 증가시키는 인자를 고안하였다.
구체적으로, 핵 격자 구조체 결합염기(nuclear matrix attachment region: 이하 MAR)와 SAR(scaffold attachment region)를 사용하여, 상기 MAR 인자 또는 SAR 인자를 프로모터의 5' 말단부위 또는 전사종결인자의 3' 말단에 1카피 이상, 또는 2카피 이상이 포함되도록 벡터를 제작하고, 발현벡터의 성능을 비교 분석하였다.
우선, 상기 MAR 인자 또는 SAR 인자의 염기서열을 확보하기 위하여 해당 세포로부터 게놈 핵산을 순수 분리한 후, 게놈 핵산 대상 PCR 방법 및 서브클로닝방법으로 대장균세포 벡터에 클로닝하여 여러 가지의 MAR 인자 및 SAR 인자를 확보하였다. 상기 MAR 인자 및 SAR 인자는 인간 베타 글로빈 MAR(Yu, J., Bock, J. H., Slightom, J. L. and Villeponteau, B., Gene 139(2), 139 - 145(1994), gene bank #: L22754), 인간 CSP-B 유전자 플랜킹(flanking) SAR(Hanson, R. D. and Ley, T. J., gene bank #: M62716), 및 인간 인터페론 베타 유전자 플랜킹 SAR(Mielke, C., Kohwi, Y., Kohwi-Shigematsu, T. and Bode, J., Biochemistry 29, 7475-7485 (1990), gene bank #: M83137)로 이루어지는 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는, 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 및 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 각각에 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자 및 인터페론 베타 SAR인자로 구성된 군에서 선택되는 유전자 발현 증가 인자를 1 카피 이상 포함하는 동물세포 발현벡터일 수 있다.
또는, 상기 동물세포 발현벡터는 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단 또는 상기 전사 종결 인자의 3' 말단에 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자 및 인터페론 베타 SAR인자로 구성된 군에서 선택되는 유전자 발현 증가 인자를 1 카피 이상 포함하는 동물세포 발현벡터일 수 있다.
특히, 상기 유전자 발현 증가 인자는 2카피 이상을 포함할 수 있으며, 프로모터의 5' 말단에 2카피 이상의 상기 유전자 발현 증가 인자를 함유하거나, 전사 종결인자의 3'말단에 2카피 이상의 유전자 발현 증가 인자를 함유할 수 있다. 또는, 프로모터의 5' 말단 또는 전사 종결인자의 3'말단에 각각 1카피 이상의 유전자 발현 증가 인자를 함유시킴으로써, 현격한 외래 유전자 발현 증가를 유도할 수 있다.
아울러, 더욱 바람직하게는 상기 프로모터의 5' 말단, 상기 전사 종결 인자의 3' 말단, 또는 상기 프로모터의 5' 말단과 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 양측에 유전자 발현 증가 인자인 MAR 인자 및 SAR 인자를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명에서 "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로, "프로모터"란, 전사개시점 (+1) 부터 20~30 염기에 대해 상류에 있고, 정확한 위치로부터 RNA 폴리머라아제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만, 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에, 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함해도 된다. 본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 SV40 프로모터 또는 CMV 유래 프로모터 일 수 있으며, EF-1α 프로모터를 포함할 수 있으며, 이들 프로모터의 변이체 또한 본 발명에 포함될 수 있다. 여기서의 변이체는, 유전자 발현 증가를 위해, 프로모터 서열의 일부를 부가, 결실, 또는 치환한 변이체를 의미한다.
아울러, 상기 프로모터는 외래 유전자인 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 여기서, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 발현하고자 하는 외래 산물을 코딩하는 유전자로써, 재조합 단백질로 발현가능한 모든 종류의 단백질을 암호화하는 유전자이다. 대표적으로, 인슐린, 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등등), 에리트로포이에틴 등이 있으며, 이러한 목적 유전자는 상기 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 “클로닝 부위”를 포함한다.
본 발명에 있어서, 유전자 증가 발현 인자로써, 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR 인자, 인터페론-베타 SAR인자 일 수 있으며, 여기서, “MAR (matrix attachment region)"란 전사적으로 활성인 DNA 루프 도메인을 핵 마트릭스(nuclear matrix)로 알려진 사상의 단백질 네트워크에 일시적으로 부착시키는 DNA 서열을 의도한 것이다. (Pienta et al. (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres. 1:355-385). MAR 서열의 예는 당업계 많이 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전사 종결 인자는 종래 알려진 임의의 전사 종결인자가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 가스트린 전사 종결 인자 일 수 있으며, 여기에 polyA가 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호(polyA), 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호 또는 SV40 바이러스 폴리아데닐레이션 신호가 포함될 수 있다.
본 발명자들은, mRNA 안정성 증가를 통하여 발현벡터의 효율을 증진하기 위하여, 유전자의 전사 종결에 있어 필수적인 poly-A 신호, 절단부위, 종결부위가 정확히 알려져 있는 인체의 가스트린(gastrin) 유전자 전사종결부위 (terminator)를 선별, 제작하여 본 발명의 발현벡터에 적용하였다. 상기 가스트린은 HindIII 제한효소 맵(map)상에서 poly-A 신호, 절단부위, 종결부위가 포함되는 603 bp의 절편으로 이루어져 있으며, poly-A 신호와 절단부위는 15 bp 떨어져 있으며, 종결부위는 poly-A 신호로부터 약 220 bp 떨어져 위치한다. 상기한 거리로 위치한 가스트린의 전사종결부위는 종결부위에서 전사가 종결되고 절단부위에서 mRNA의 절단 및 poly-A가 일어난다.
본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단 또는 상기 전사 종결인자의 3'말단에 1카피의 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자 또는 인터페론 베타 SAR인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 발현 증가 인자들의 조합은 예컨대, 도 1에 개시된 구성들일 수 있으며, 도 1은 동물세포 발현벡터 중, 유전자 발현 증가 인자, 프로모터, PolyA, terminator의 결합 순서를 개략적으로 도시한 것으로, 여기서, 프로모터는 SV40, EF1-alpha 프로모터, EF1-alpha 프로모터 변이체이고, MAR/SAR는 베타글로빈 MAR 인자, CSP-B SAR인자 또는 인터페론 베타 SAR인자이다.
본 발명에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단 또는 상기 전사 종결인자의 3'말단에, 또는 프로모터의 5'말단 및 전사 종결인자의 3' 말단에 MAR 인자 및 SAR 인자를 포함하는 벡터일 수 있다. 이때, 상기 MAR 인자와 상기 SAR 인자는 서로 인접하거나 서로 코딩 서열 또는 비코딩 서열에 의하여 분리되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로써, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단에 1카피의 베타글로빈 MAR인자를 포함하고, 상기 전사 종결인자의 3'말단에 1카피의 CSP-B SAR인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로써, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단에 1카피의 베타글로빈 MAR인자를 포함하고, 상기 전사 종결인자의 3'말단에 1카피의 인터페론 베타 SAR인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로써, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단에 1카피의 CSP-B SAR인자를 포함하고, 상기 전사 종결인자의 3'말단에 1카피의 베타글로빈 MAR인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로써, 상기 동물세포 발현벡터는 프로모터의 5'말단에 1카피의 인터페론-베타 SAR인자를 포함하고, 상기 전사 종결인자의 3'말단에 1카피의 베타글로빈 MAR인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 2카피의 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자, 인터페론 베타 SAR인자가 포함되는 경우, 상기 2카피의 MAR인자 또는 SAR 인자는 바람직하게는 서로 이웃하게 연속되어 있거나 비교적 짧은 스페이서 영역에 의하여 이격되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터는, 베타글로빈 MAR인자, CSP-B SAR인자, 인터페론 베타 SAR인자를 비롯한 유전자 발현 증가인자의 정방향체 또는 역방향체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 각각의 유전자 발현 증가인자의 방향성은 이들 인자들의 특정 조합의 경우마다 바람직한 방향체가 다르다.
본 발명의 일 실시예에서는 SV40 프로모터에 비하여 서열번호 34의 염기서열을 가지는 mEF1 프로모터 변이체를 사용한 경우, MAR 인자 및 SAR 인자를 가지는 벡터들에서 모두 5배 이상 항체 생산성이 증가하였고, 특히 pC(F)mEGM(R) 벡터의 생산성은 10배 이상 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 SV40 프모모터 결과에서 MTX 증폭 후 확보된 생산성보다 mEF1 프로모터로 치환하여 0nM 적응 후 측정된 생산성이 약 2배 높게 분석되었으므로, MTX 증폭 없이 고발현 세포주 확보가 가능하여 졌음을 나타낸다. 이에 본 발명은 mEF1 프로모터 변이체를 사용하는 것을 일 특징으로 한다. 이에 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 EF1α 프로모터 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 또는 재조합 동물세포에 관한 것이다.
여기서, 동물세포는 일반적으로 알려져 있는 동물세포주인 CHO 세포, Hela 세포, BHK 세포, NIH/3T3 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, CHO-K1 세포, 및 HEK293 세포 등 일 수 있으며, 이 이외에도, SP2/0, NSO, PER.C6 일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 동물세포 발현벡터를 이용한 목적 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 상기 재조합 동물세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명에 있어서, 상기 생산방법은 (a) 상기 동물세포 발현벡터에 상기 프로모터에 의하여 발현이 조절되도록 목적 유전자를 삽입하는 단계; (b) 상기 목적 유전자가 삽입된 동물세포 발현벡터를 동물세포에 형질전환시키는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 재조합 동물세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
MAR 및 SAR 인자의 클로닝
MAR/SAR DNA는 Hep G-2 세포주로부터 DNA 분리키트(Wizard Genomic DNA purification kit, Promega 미국)를 사용하여 게놈 핵산 (genomic DNA)을 분리한 후 PCR 방법에 의해 확보하였다.
상기에서 분리한 게놈 핵산 200 ng을 주형(template)으로 사용하고, 25 pmole의 각 프라이머, 0.5 mM의 dNTP, ExTaq DNA 중합효소(Takara Shuzo Co., Japan)를 첨가하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각각의 MAR/SAR인자에 대하여 사용된 프라이머의 염기서열과 PCR로 얻어진 DNA 절편의 크기는 하기 표 1과 같다. 중합효소연쇄반응은 GeneAmp PCR system 9600(Perkin - Elmer Corp, 미국)을 이용하여 실시하였고, PCR 조건은 하기 표 2에 나타내었다.
MAR/SAR 인자 DNA 크기 프라이머 서열번호
인간 베타글로빈 MAR 2969bp 5'- TTT TTC CTC TTT AGG TTC TC -3' 서열번호 1
5'- CCT CCT GAG TAG CTG GGG AC -3' 서열번호 2
CSP-B SAR 1233bp
 5'- GGA TCC CAT TCT CCT TGA TG -3' 서열번호 3
5'- GAA TTC AAA CAA CTC AAT AG -3' 서열번호 4
인터페론-베타 SAR 2168bp 5'- GAA TTC AGC AAG GTC GCC AC -3' 서열번호 5
5'- TTG TAT CAA CTT TCT ACA AT -3' 서열번호 6
단계 조 건 주기 수
1 94℃, 2분 1
2 94℃, 40초; 65℃, 40초; 72℃, 40초 2-31
3 72℃, 10분 32
이렇게 얻어진 인간 베타글로빈 MAR, CSP-B SAR와 인터페론-베타 SAR의 PCR 산물은 pT7blue (R) (Novagene, 미국) 또는 pCR 2.1 (Invitrogen, 미국) 벡터에 서브클로닝하였다. 인간 베타글로빈 MAR는 pT7blue(R) 벡터에 서브클로닝하였으며, CSP-B MAR 및 인터페론-베타 SAR는 pCR 2.1에 서브클로닝하였다.
동물세포 발현벡터의 제조
2-1: pSV-β-gal/version I과 version II 벡터 제조
상기에서 pT7blue, pCR 2.1 벡터에 서브클로닝된 MAR, SAR 인자를 pSV-β-gal 벡터의 프로모터 앞부분에 효율적으로 클로닝하기 위해 재조합 pSV-β-gal 버전 I(version I)과 버전 II(version II) 벡터를 제작하였다.
pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국)의 SV40 프로모터를 제한효소 Spe I-Sma I-Apa I-EcoR I을 포함하는 프라이머 (서열번호 7)와 3'말단에 Hind III를 포함하는 프라이머 (서열번호 8)를 제작하여 PCR을 수행한 후 SV40 프로모터를 포함하는 443bp의 Spe I--Hind III 단편을 아가로스 갤(agarose gel)로부터 BIO 101사의 gene clean III kit로 분리 정제하여 회수한 후, 이 단편을 같은 제한효소인 Spe I과 Hind III를 처리하여 개환된 pBluescript SK(+) (미국의 Stratagene사) 벡터에 삽입 연결하여 먼저 pBluescript /SV40 I 프로모터 벡터를 제작하였다. 다음으로 상기에서 제작한 pBluescript/SV40 I 프로모터 벡터에 제한효소 Sca I과 Hind III를 처리하여 SV40 프로모터를 포함하는 단편을 위와 같은 방법으로 아가로스 겔에서 분리 정제하여 회수한 다음, 같은 제한효소를 처리하여 개환된 pSV-β-gal 벡터에 삽입 연결함으로써 버전 I 벡터를 완성하였다 (pSV-β-gal/version I).
서열번호 7: Sense primer for constructing pSV-beta-gal/ver1 vector
5'-GCACTAGTCC CGGGCCCATG ATTACGAATT CGCGCAGCACCAT-3'
서열번호 8: Antisense primer for constructing pSV-beta-gal/ver1 vector
5'-GCAAGCTTTT TGCAAAAGCC TAGGCCTCC-3'
또한 재조합 pSV-β-gal 버전 II 벡터 제작하기 위하여 pSV-β-gal 벡터에 EcoR I과 Hind III를 처리하여 SV40 프로모터를 포함하는 420 bp의 EcoR I/Hind III 단편을 상기와 같은 방법으로 분리 정제하여 회수한 후, 이 단편을 같은 제한효소인 EcoR I과 Hind III를 처리하여 개환된 pBluescript SK(+) 벡터에 삽입 연결함으로써 pBluescript/SV40 II 프로모터 벡터를 제작하였다. 다음으로 상기에서 제작한 pBluescript/SV40 II 프로모터 벡터에 제한효소 Sca I과 Hind III를 처리하여 SV40 프로모터를 포함하는 단편을 상기와 같은 방법으로 아가로스 겔에서 분리 정제하여 회수한 다음, 같은 제한효소를 처리하여 개환된 pSV-β-gal 벡터에 삽입 연결함으로써 버전 II 벡터를 완성하였다 (pSV-β-gal/version II).
2-2: MAR/SAR 인자 및 β-gal 유전자를 포함하는 벡터의 제조
실시예 1에서 제작된 pT7blue/베타글로빈 MAR 벡터에 제한효소 Spe I과 Sma I을 처리하여 베타글로빈 MAR 인자를 함유하는 3 kb 크기의 DNA 단편을 아가로스 겔에서 분리 정제하여 회수한 후, 같은 제한효소인 Spe I과 Sma I을 처리하여 개환된 재조합 pSV-β-gal 버전 I 벡터에 삽입 연결하여 베타글로빈 MAR 인자 클로닝을 완료하였다 (pMS-β-gal). 삽입된 베타글로빈 MAR 인자의 방향성을 알기 위해 제한효소 베타글로빈 MAR 인자에 존재하고 그리고 재조합 pSV-β-gal 버전 I 벡터에 존재하는 제한효소 Hind III를 처리하여 역방향체임을 확인하였다.
pCR 2.1/인터페론 베타 SAR 및 pCR 2.1/CSP-B MAR에서 MAR/SAR 인자를 분리하여 상기와 같은 방법으로 pSV/I 또는 pSV/II에 클로닝하였다. 인터페론 베타 SAR는 ApaI/SpeI를 이용하여 pSV-β-gal/version I에 서브클로닝하여 pSV-β-gal/인터페론 베타 SAR (F) (pIS-β-gal)를 각각 제조하였다. CSP-B SAR는 pCR 2.1/CSP-B SAR로부터 Spe I과 Sma I 제한효소를 포함하는 프라이머(서열번호 9, 서열번호 10)를 이용하여 PCR 수행 후 Spe I/Sma I 제한효소 처리하여 분리하고, 동일한 제한효소로 처리된 pSV-β-gal/verII에 서브클로닝하여 pSV-β-gal/CSP-B SAR (pCS-β-gal)을 제조하였다.
서열번호 9: CSP-B SAR Sense
5'-TTT ACT AGT GGA TCC CAT TCT CCT TGA-3'
서열번호 10: CSP-B SAR Antisense
5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3' (30mer) Sma I
2-3: 가스트린 유전자의 전사종결부위의 확보 및 pSG-β-gal 벡터제조
가스트린 유전자의 전사종결부위 (GTF) 중에서 센스 가닥(sense strand)를 서열번호 11로 합성하고, 안티센스 가닥(antisense strand)를 서열번호 12번으로 합성하여 서로 결합(annealing)시켰다. 결합 반응산물을 제한효소 BamH I과 Pst I을 처리한 후, 미리 같은 제한효소를 처리하여 개환한 pSV-β-gal 벡터 (Promega사, 미국)에 연결 삽입하여 pSG-β-gal 벡터를 완성하였다.
서열번호 11: Sense sequence of gastrin termination site
5'-AGCGGATCCA GGATAATATA TGGTAGGGTT CATAGCCAGA GTAACCTTTT TTTTTAATTT TTATTTTATT TTATTTTGAG CTGCAG-3'
서열번호 12: Antisense sequence of gastrin germination site used in pSG vector
5'-CTGCAGCTCA AAATAAAATA AAATAAAAAT TAAAAAAAAA GGTTACTCTG GCTATGAACCCTACCATATA TTATCCTGGA TCCGCT-3'
2-4: pM(R)SG 벡터의 제조
베타글로빈 MAR 역방향체와 SPA-GTF를 동시에 적용한 벡터를 중합효소 연쇄반응방법 (PCR)으로 제조하였다. pM(R)SG 벡터 제조를 위해서 실시예 2-2의 pMS-β-gal와 실시예 2-3의 pSG-β-gal을 주형으로 3세트의 중합효소연쇄반응을 실시한 다음, 반응산물에 특정제한효소를 처리하여 연결함으로 pM(R)SG 벡터를 완성하였다.
① 베타글로빈 MAR 인자의 중합효소연쇄반응
pMS-β-gal을 주형으로 하여 센스프라이머 ML1(서열번호 13)과 안티센스프라이머 MR1(서열번호 14)을 사용하여 PCR을 실시하였다. 얻어진 반응산물에 제한효소 Sac II와 Cla I을 처리하여 절단한 다음, 미리 같은 제한효소를 처리하여 개환된 pMS-β-gal 벡터에 연결 삽입하여 일 단계 서브클로닝을 완료하여 중간벡터 산물인 pMS-β-gal/sc 벡터를 제작하였다.
서열번호 13: ML1 primer for amplifying human beta globin MAR element in pMS vector
5'-TCCCCGCGGC CCGGGCCTCC TGAGTAGCTG GGGACT-3'
서열번호 14: MR1 primer for amplifying human beta globin MAR element in pMS vector
5'-TTGGGGCCCA TCGATTTTTC CTCTTTAGGT TCTC-3'
② 다수클로닝 사이트 및 전사종결부위를 포함하는 중합효소연쇄반응
센스프라이머 TL1(서열번호 15)와 안티센스프라이머 TR1(서열번호 16)을 사용하여 pSG-β-gal 벡터의 가스트린 전사종결부위를 PCR 하였다. 반응산물을 제한효소 처리하지 않고 직접 클로닝 할 수 있도록 제작된 TA 클로닝 벡터의 일종인 pGEM-T Easy 벡터(미국의 Promega사)에 서브클로닝을 실시하여 벡터제작중간 산물인 pGEM-T/MCSp(A) 벡터를 제작하였다.
서열번호 15: TL1 primer of gastrin termination site in pSG vector
5'-GAAGATCTGT TAACTCGAGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTA 3'
서열번호 16:TR1 primer of gastrin termination site in pSG vector
5'-GTGCCAGCTT GCATGCCTGC-3'
③ SV40 프로모터와 다수클로닝 사이트 부분의 중합효소연쇄반응
센스프라이머 PL1(서열번호 17)와 PR1(서열번호 18)를 사용하여 SV40 프로모터와 다수클로닝 사이트부분을 PCR 하였다. 반응산물을 제한효소 Apa I과 Bgl II을 처리한 후, 미리 같은 제한효소를 처리하여 개환된 상기에서 제작된 벡터 pGEM-T/MCSp(A) 벡터에 연결하여 pGEM-T/SVMCSp(A) 벡터를 중간산물로 제작하였다.
서열번호 17: PL1 primer for fusing SV40 virus promoter and multicloning site
5'-CCGGGCCCAT CGATAAGCTT GATCCCGCGC AGCACCATGG CCTGAA-3'
서열번호 18: PR1 primer for fusing SV40 virus promoter and multicloning site
5'-GAAGATCTGC GGCCGCTAGC AAGCTTTTTG CAAAAGCCTA-3'
④ pMS 벡터 및 pMSG 벡터의 제작
③에서 제작한 pGEM-T/SVMCSp(A) 벡터에 제한효소 Cla I과 BamH I을 처리하여 SV40 프로모터, 다수클로닝 사이트 그리고 SV40 전사종결부위로 구성된 DNA단편을 분리 정제한 후, 미리 같은 제한효소를 처리하여 개환된 ①에서 제작한 pMS-β-gal/sc 벡터에 삽입하여 pMS 벡터를 완성하였다. pM(R)SG 벡터를 제작하기 위하여 상기에서 제작한 pSG-β-gal 벡터에 제한효소 BamH I과 Sca I을 처리하여 가스트린의 GTF 염기서열을 가지는 950bp의 DNA 단편을 분리 정제한 후, 미리 같은 제한효소를 처리하여 개환시킨 pMS 벡터에 연결 삽입하여 pM(R)SG 벡터를 완성하였다.
2-5: pSG 벡터 제작
전사종결인자의 3' 말단에 MAR/SAR 인자를 삽입하기 위해서 pSG 벡터를 제작하였다. pM(R)SG 발현벡터로부터 Sma I과 Cla I을 처리하여 MAR를 제거한 후 Klenow 처리하여 blunt end로 만든 후 다시 접합시켜 pSG 벡터를 제조하였다.
2-6: pMSG와 pSGM 벡터 제작
pM(R)SG발현 벡터로부터 Sac II와 Cla I을 처리하여 MAR (R)를 분리한 후 MAR(F) (MAR의 정방향체)를 확보하기 위해서 Sac II/3Cla I이 포함되도록 프라이머 (서열번호 19, 서열번호 20)를 제작하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 아가로스젤로부터 분리한 후 동일한 제한효소로 처리된 pM(R)SG벡터에 삽입하여 pM(F)SG를 제작하였다.
서열번호 19: 5'-TTTTCCGCGGTTTTCCTCTTTAG-3'
서열번호 20: 5'-TTTTATCGATCCTCCTGAGTAG-3'
한편, 전사종결인자의 3'말단에 베타글로빈 MAR인자를 함유한 동물세포 발현벡터인 pSGM을 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
pSGM벡터를 제작하기 위해서 MAR의 양쪽 끝에 Nar I 제한효소을 포함하도록 프라이머 (서열번호 21, 서열번호 22)를 제작하여 pM(R)SG를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 Nar I 제한효소로 처리하고, 동일한 제한효소로 처리된 pSG 벡터에 삽입하여 pSGM(R) 및 pSGM(F) 벡터를 제조하였다.
서열번호 21: β-globin MAR sense Nar I
5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mer)
서열번호 22: β-globin MAR antisense Nar I
5'-AAA AGG CGC CTT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mer)
2-7: pISG와 pSGI 벡터제조
프로모터의 5'말단에 인터페론 베타 SAR인자를 함유한 동물세포 발현벡터인 pISG와, 전사종결인자의 3'말단에 인터페론 베타 SAR인자를 함유한 동물세포 발현벡터인 pSGI를 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
pSV-β-gal/인터페론 베타 SAR (F) (pI(F)S-β-gal)벡터에서 β-gal 유전자 부위를 제거하고, 다수 클로닝 부위(MCS), SV40 전사종결부위 그리고 가스트린의 GTF 를 도입하여 pI(F)SG 벡터를 제조하였다.
pI(F)S-β-gal 벡터의 β-gal 유전자 부위를 포함하는 Hind III Pst I 단편을 제거하고, 동일한 제한효소로 처리된 pM(R)SG로부터 Hind III Pst I 단편을 분리한 후 삽입하여 pI(F)SG를 제조하였다.
pI(F)SG 벡터는 EcoR I 제한 효소를 처리한 후 인터페론 베타 SAR 인자를 아가로스겔로부터 분리하였고, 동일한 제한효소로 처리된 pI(F)SG 벡터에 다시 삽입한 후 제한효소 지도 (Enzyme mapping)을 통해 pI(R)SG 벡터를 제조하였다. pSGI 벡터를 제조하기 위해서 Nar I 제한효소 서열을 포함하는 linker (서열번호 23)를 pGEM-T Easy에 삽입시키고, pISG 벡터로부터 SAR인자를 EcoR I 제한효소를 처리하여 DNA 단편을 분리한 후 변형된 T 벡터에 삽입하였다. 다시 Nar I 제한효소로 절단한 후 동일한 제한효소로 처리된 pSG 벡터에 삽입하여 pSGI(F)와 pSG(R) 벡터를 제작하였다.
서열번호 23: Linker
5'-GGC CGG CGC CGA ATT CGG CGC C-3'
2-8: pCSG와 pSGC 벡터제조
프로모터의 5'말단에 CSP-B SAR인자를 함유한 동물세포 발현벡터인 pCSG와, 전사종결인자의 3'말단에 CSP-B SAR인자를 함유한 동물세포 발현벡터인 pSGC을 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
pSV-β-gal/CSP-B SAR (F) (pCS-β-gal)를 주형으로하여 Cla I과 Sma I 제한효소를 포함하는 프라이머 (서열번호 24, 서열번호 10)를 이용하여 PCR을 수행한 후 Cla I, Sma I 제한효소를 처리하여 CSP-B SAR DNA 절편을 얻었다. pM(R)SG벡터를 Cla I, Sma I 제한효소 처리하여 MAR를 제거한 후 동일한 제한효소 처리하여 확보된 CSP-B SAR를 삽입하여 pC(R)SG vector를 제작하였다.
서열번호 24: CSP-B SAR Sense Cla I
5'-AAA AAT CGA TAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mer)
서열번호 10: CSP-B SAR Antisense Sma I
5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3' (30mer)
pC(R)SG벡터로부터 Sac II 제한효소 처리된 CSP-B SAR 인자는 동일한 제한효소 처리된 pSG 벡터에 다시 삽입하여 pC(F)SG 벡터를 제작하였다.
pSGC벡터를 제작하기 위해서 CSP-B SAR의 양쪽 끝에 NarI 제한효소을 포함하도록 프라이머 (서열번호 25, 서열번호 26)를 제작하여 pC(F)SG를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 Nar I 제한효소로 처리하고, 동일한 제한효소로 처리된 pSG 벡터에 삽입하여 pSGC(F)와 pSGC(R) 벡터를 제작하였다.
서열번호 25: CSP-B SAR Sense Nar I
5'-AAA AGG CGC CGA ATT CAA ACA ACT CAA TAG C-3' (31mer)
서열번호 26: CSP-B SAR Antisense Nar I
5'-AAA AGG CGC CAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mer)
2-9: pMMSG, pMSGM, pMSGC 및 pMSGI 벡터제조
프로모터의 5'말단에 베타글로빈 MAR인자를 2카피 함유한 동물세포 발현벡터인 pMMSG와, 프로모터의 5'말단 및 전사종결인자의 3'말단에 각각 베타글로빈 MAR인자를 1카피씩 함유한 동물세포 발현벡터인 pMSGM을 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
pM(R)SG 벡터를 주형으로 MAR의 양쪽 끝에 Nar I과 Cla I 제한효소를 포함하는 프라이머 (서열번호 21, 서열번호 27)를 이용하여 PCR을 수행하였고, PCR 산물은 Nar I과 Cla I 제한 효소로 처리하고, Cla I 제한효소로 처리된 pM(R)SG 벡터에 삽입하여 pM(R)M(R)SG 벡터를 제조하였다.
서열번호 21: β-globin MAR sense Nar I
5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mer)
서열번호 27: β-globin MAR Cla I
5'-AAA ATC GAT TT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mer)
pM(R)SGM, pM(R)SGC 그리고 pM(R)SGI벡터를 제조하기 위해서 pSGM(F), pSGC(F), pSGI(F) 벡터를 Nar I 제한효소 처리하여 베타글로빈 MAR, CSP-B SAR인자 또는 인터페론 베타 SAR 인자를 각각 분리하고, 동일한 제한효소로 처리된 pM(R)SG에 삽입시켜 pM(R)SGM(R), pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F) 및 pM(R)SGI(R) 벡터를 제조하였다.
2-10: pI(R)SGI, pI(R)SGC, pI(R)SGM 벡터 제조
프로모터의 5' 말단에 인터페론 베타 SAR인자 1카피를, 전사종결인자의 3'말단에 베타글로빈 MAR, CSP-B SAR 그리고 인터페론 베타 SAR 인자 1카피를 함유한 동물세포 발현벡터는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
pI(R)SGI, pI(R)SGC, pI(R)SGM 벡터를 제조하기 위해 pSGI(F), pSGC(F) 그리고 pSGM(F)벡터로부터 Nar I 제한효소 처리하여 MAR/SAR 인자를 각각 분리하였다. 분리 정제된 MAR/SAR 인자는 Nar I 제한효소로 처리된 pI(R)SG벡터에 삽입하여 pI(R)SGI(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGC(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGM(R) 그리고 pI(R)SGM(F) 벡터를 제조하였다.
2-11: pCCSG와 pCSGI, pCSGC, pCSGM 벡터제조
프로모터의 5'말단에 CSP-B SAR인자를 2카피 함유한 동물세포 발현벡터인 pCCSG는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
CSP-B SAR 인자를 포함하고 있는 pC(F)SG벡터는 Hind III 제한 효소 처리하여 분리한 후 자가접합 (self ligation) 시켰다. 다시 Nhe I과 Spe I 제한 효소를 처리하여 CSP-B SAR인자를 분리 정제한 후 Spe I 제한 효소 처리된 pC(F)SG 벡터에 삽입하여 pC(F)C(F)SG 벡터를 제조하였다.
pC(F)SGI, pC(F)SGC, pC(F)SGM 벡터를 제조하기 위해 pSGI(F), pSGC(F) 그리고 pSGM(F)벡터로부터 Nar I 제한효소 처리하여 MAR/SAR 인자를 각각 분리하였다. 분리 정제된 MAR/SAR 인자는 Nar I 제한효소로 처리된 pC(F)SG벡터에 삽입하여 pC(F)SGI(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGC(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGM(R) 그리고 pC(F)SGM(F) 벡터를 제조하였다.
2-12: 마우스 EF1α 프로모터 및 그 변이체를 포함하는 발현벡터 제조
마우스 EF1α 프로모터는 DNA 분리키트 (DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN)을 사용하여 Mouse yolk sac tissue로부터 확보된 게놈 DNA (genomic DNA)로부터 분리하였다.
Maxime PCR Premix (i-pfu) (Intron biotechnology)에 200 ng의 게놈 DNA, 10 pmol의 각 프라이머 (서열번호 28, 서열번호 29)와 총 20㎕ 가 되도록 물을 첨가하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 반응 조건은 thermal cycler에서 94 ℃ 5분을 시작으로, 94℃ 30초, 56℃ 1분, 72℃ 3분간의 중합 반응으로 이어지는 과정을 25 cycle 진행하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 중합 반응을 분리 키트 (GeneAllR ExpinTM PCR SV, Geneall)를 이용하여 분리 정제하였다.
서열번호 28: mEF1α-F
5'-TTT TAT CGA TAG CGG AGT AAG GAA GAG TAG-3
서열번호 29: mEF1α-R
5’-TTT TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3’
pM(R)SG 발현벡터로부터 먼저 SV40 프로모터를 ClaI, NheI을 이용해 제거한 다음 동일한 제한효소로 처리된 마우스 EF1α 프로모터를 삽입하여 pMmEG발현벡터를 제조하였다
마우스 EF1 프로모터의 TATA box 염기서열인 TATATAA 중 5번째에 위치한 티민 (Thymine)을 아데닌 (Adenine)으로 치환하기 위해, 다음과 같은 치환된 염기 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 제작하여 single base pair mutation을 유도하였다 (Jaeger E., 1997).
pMmEG 발현벡터를 주형으로하여 1번 tube에 1, 3번 프라이머 (서열번호 30, 서열번호 32), 2번 tube에는 2, 4번 프라이머 (서열번호 31, 서열번호 33)를 각각 혼합하여 1차 PCR을 수행하고 두 tube로 부터 나온 각각의 산물을 정제한 후 다시 그 산물을 혼합하여 이를 주형으로 1,4번 프라이머를 이용하여 2차 PCR을 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 산물을 KpnI, SpeI 처리한 후 분리키트를 사용하여 마우스 EF1α 프로모터 변이체(mEF1α(TA))를 확보하였다. pMmEG 발현벡터는 KpnI, SpeI으로 처리하여 마우스 EF1α 프로모터를 제거한 후 동일한 제한효소로 처리된 마우스 EF1α 프로모터 변이체 (서열번호 34)를 삽입하여 pMmEG(TA)를 제작하였다.
서열번호 30: mEF-tata-1
5’-TCC CAG GGA CCG TCG CTA AAT TCT CAT AAC-3’
서열번호 31: mEF-tata-2
5’-GAA CGG TAT AAA AGT GCG GCA GTC GCC TTG-3’
서열번호 32: mEF-tata-3
5’-CAA GGC GAC TGC CGC ACT TTT ATA CCG TTC-3’
서열번호 33: mEF-tata-4
5’-GCT CCG CTC AAA ACT CAA GGG GAC AAA TTC-3’
2-13: pmEG 발현벡터제조
pC(R)SG 벡터를 Sac I 제한효소 처리하여 CSP-B SAR를 제거한 후 자가접합 (Self-ligation) 시킨 후 다시 Cla I과 Nhe I 제한효소를 처리하여 pG를 제조하였다. pMmEG 벡터를 Cla I과 Nhe I제한 효소로 처리하여 마우스 EF1α 변이체를 분리한 후 동일한 제한효소로 처리된 pG에 삽입시켜 pmEG 벡터를 제조하였다.
2-14: pC(F)mEGM(R)/pM(R)mEGC(F)/pM(R)M(R)mEG 발현벡터제조
발현효능이 높은 MAR/SAR 2 카피를 포함하는 발현벡터에 마우스 EF1α 프로모터 변이체를 삽입하여 다음과 같이 발현벡터를 제조하였다.
pMmEG(TA) 발현벡터를 Cla I과 Nhe I 제한효소로 처리하여 마우스 EF1α 프로모터 변이체를 분리하고, pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), pM(R)M(R)SG 발현벡터를 동일한 제한효소로 처리하여 SV40 프로모터를 제거한 후 분리된 마우스 EF1α 프로모터 변이체를 삽입하여 도 2의 개열지도를 갖는 pC(F)mEGM(R), 도 3의 개열지도를 갖는 pM(R)mEGC(F), 도 4의 개열지도를 갖는 pM(R)M(R)mEG 발현벡터를 제조하였다.
이때, 제조된 상기 pC(F)mEGM(R) 벡터 (서열번호 35)의 정보는 다음과 같다.
vector size (bp) 8664
start end Size (bp)
mEF1α(TA) 1 1416 1416
MCS 1417 1445 29
SV40 small antigen Poly A signal 1446 1580 135
terminator 1581 1652 72
Human β-globin MAR (R) 1834 4802 2969
Amp 5243 6103 861
ColE1 origin 6263 6877 615
CSP-B-SAR(F) 7352 8584 1233
형질전환된 세포주 제작
3-1: 부착배양 숙주 세포주를 이용한 트랜스펙션
DHFR 유전자가 결손된 CHO 세포주 DG44 (Dr. chasin, Columbia University)는 10% 혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 MEM-배지(-Minimum Essential Medium, Gibco BRL)에서 배양하였다. 2x105 개의 세포를 배지 2 mL과 함께 6 웰 플레이트에 접종하여 형질 도입 과정까지 하룻밤 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
형질도입은 리포좀 방법에 따라 수행하였다. 상용벡터인 pSP72 벡터에 DHFR 유전자를 도입한 pDCH1P 벡터를 각각의 시험용 벡터와 함께 100:1의 몰비로 동시 형질 도입하였다. 벡터 각 2 ug을 지방계면활성제의 일종인 GeneJuice (MERCK, 독일), 무혈청 MEM-배지와 혼합하여 상온에서 45분간 반응시킨 다음, 세척한 세포에 배지와 함께 첨가하여 6시간 배양하고 반응액을 제거하였다. DHFR 유전자를 이용한 형질전환 세포주 선별 시 뉴클레오사이드가 포함되지 않은 MEM-배지에서 2 주일간 배양하여 초기 적응세포를 확보한 후 연속적으로 10 nM과 100 nM MTX에 적응시켜 각각 안정적 발현 세포주 (stable cell line)를 확보하였다.
3-2: 부유배양 숙주 세포주를 이용한 트랜스펙션
부유배양에 적응된 CHO DG44 숙주 세포주는 상업용 무혈청 배지에서 계대배양하였다. 형질도입 하루 전날 계대배양을 수행하였고, pDCH1P 벡터와 각각의 시험용 벡터를 전기 천공법 (Electroporation)에 의해 형질도입 하였다. DHFR 유전자를 이용한 형질전환 세포주 선별은 뉴클레오사이드가 포함되지 않은 상업용 무혈청 배지에서 2 주일간 배양하여 초기 적응세포를 확보하였고, 연속적으로 MTX에 적응시켜 각각 안정적 발현 세포주 (stable cell line)를 확보하였다.
실험예:발현 역가 확인 실험
4-1: 재조합 VEGF 단백질를 발현하는 발현벡터의 제작
재조합 단백질 유전자를 확보한 후 상기 실시예 2에서 제작된 각각의 벡터는 재조합 단벡질 유전자와 동일한 제한 효소로 절단 후 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
실시예 2에서 제작된 벡터들의 유전자 발현에 대한 효용성을 검증하기 위해서 VEGF (human Vascular Endothelial Growth Factor)의 유전자를 센스프라이머 (서열번호 36)와 안티센스프라이머 (서열번호 37)를 이용하여 PCR 하였다. PCR 산물은 Nhe I과 Xho I 제한 효소로 처리하여 VEGF 유전자를 확보하여 실시예에서 제작된 벡터들을 동일한 제한효소로 절단 후 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
서열번호 36: vegf-5
5'-CTA GCTAGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-3'
서열번호 37: vegf-3
5'-GAAGATCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3'
4-2: 재조합 항체 단백질를 발현하는 발현벡터의 제작
실시예에서 제작된 벡터들의 유전자 발현에 대한 효용성을 검증하기 위해서 재조합 항 CD20 항체 유전자 발현 벡터를 제작하였다.
보유중인 재조합 항체의 중쇄 (Heavy chain)유전자는 Bgl II와 Xho I제한효소로 처리하고, 경쇄 (Light chain)는 Nhe I과 Xho I으로 각각 처리한 후 동일한 제한효소로 처리된 실시예의 벡터들에 삽입하여 발현벡터를 제작하였다.
4-3: 형질전환된 부착 세포주 확립
상기 발현벡터들로 CHO DG44에 도입하였다. 2×105 cell을 6웰 배양 용기에 넣고 24시간동안 37℃ 5% CO2에서 배양한 후, 상기 발현벡터들을 2㎍ 과 DHFR 미니젠을 100:1 비율로 섞은 후 리포펙타민 또는 Dosper 등의 지질을 이용한 방법으로 CHO세포에 함께 도입하였다. 도입 후 약 6시간 후에 배양액을 성장배지로 바꾸어주고, 다시 48시간 동안 배양하였다.
상기 형질전환된 세포주는 세포 선별제인 MTX(Methotrexate)를 세포배양 선별 배지에 (열처리와 투석된 FBS를 10% 포함하는 뉴클레오시드가 없는 MEM-α 배지) 0nM, 10nM, 100nM 순서로 순차적으로 증가시킨 선별배지로 배양함으로써, 각 MTX농도에 적응하여 건강하게 자랄수 있도록 각 농도 단계에서 2×105 cells/well (2 mL)로 접종하여 4일 배양한 후, 배양액을 수확하여 ELISA 키트 (R&D Systems, DY293)를 이용하여 흡광도 분석하였다.
pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), pSGM(R) 벡터들에 대하여 VEGF 생산량을 흡광도로 측정한 결과는 도 5와 같다.
4-4: 형질전환된 부유배양 세포주 확립 및 VEGF 생산성 측정
상기 발현벡터들로 부유배양에 적응된 CHO DG44에 도입하였다. 5×105 cells/mL의 농도로 플라스크 배양 용기에 넣고 24시간동안 37도 5% CO2에서 진탕배양한 후, 상기 VEGF 발현벡터들과 pDCH1P 발현벡터를 100:1 비율로 섞은 후 전기 천공법으로 CHO세포에 함께 도입하였다. 도입 후 약 3일 후에 배양액을 선별배지로 바꾸어주고, 다시 2 ~ 3주 동안 배양하였다.
상기 형질전환된 세포주는 세포 선별제인 MTX (Methotrexate)를 세포배양 선별 배지에 첨가하여 배양하였고, 각 단계에서 적응이 완료된 세포는 2×105 cells/well (2 mL)로 6 웰 플레이트에 접종하여 4일 배양한 후, 배양액을 수확하여 ELISA 키트 (R&D System, DY293)를 이용하여 흡광도 분석하였다.
먼저, pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), pSGM(R) 벡터들에 대하여 VEGF 생산량을 흡광도로 측정하여 (도 6), 실시예 4-3의 도 5의 결과와 비교하고, 2 카피 이상의 MAR/SAR 조합을 구성할 인자를 선별하였다. 이에 따라, 프로모터의 상단에는 I(R), C(F) 및 M(R)을 선별하였고, 전사종결인자 하단에는 MAR, SAR 인자의 정방향체와 역방향체를 모두 포함하도록 조합하였다.
그 다음, 상기 선별된 조합으로 pI(R)SGM(F), pI(R)SGM(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGI(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGC(R), pC(F)SGM(F), pC(F)SGM(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGI(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGC(R), pC(F)C(F)SG, pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), pM(R)SGI(R), pM(R)SGM(R), 및 pM(R)M(R)SG 벡터에 대한 VEGF 생산량을 흡광도로 측정한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), 및 pM(R)SGM(R)이 다른 벡터들에 비하여 현저한 정도로 높은 생산성을 나타내는 것으로 나타났다. 즉, MAR 인자와 SAR 인자를 함께 조합한 경우에 높은 목적 단백질 발현을 보임을 확인할 수 있었다. 특히, MAR 인자를 2개 가지는 pM(R)M(R)SG에 비하여 pC(F)SGM(R)이 훨씬 높은 발현량을 가지는 것으로 나타났다. 이는 2개의 MAR 인자를 포함하는 것보다는 MAR 인자 및 SAR 인자의 조합이 더 효과적임을 나타내며, 이러한 조합으로서 산업적 채산성을 가지는 수준으로 단백질 생산이 가능하여 졌음을 의미한다.
다시 상기 선별된 3종의 벡터 (pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), 및 pM(R)M(R)SG)에 대하여 VEGF 생산량을 ELISA 법으로 측정하고 (도 8), 이들의 SV40 프로모터를 mEF1α 프로모터 변이체로 치환한 실시예 2-14의 도 2의 개열지도를 갖는 pC(F)mEGM(R) (서열번호 35), 도 3의 개열지도를 갖는 pM(R)mEGC(F), 도 4의 개열지도를 갖는 pM(R)M(R)mEG 발현벡터에 대하여 VEGF 생산량을 흡광도로 측정한 결과(도 9), 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, mEF1 프로모터 변이체로 치환한 후 3종의 벡터 모두 5배 이상 VEGF 생산성이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 pC(F)mEGM(R) 벡터의 생산성은 20배 이상 증가하였다.
이러한 실험 결과는 MAR 인자 및 SAR 인자의 조합에 마우스 mEF1 프로모터 변이체를 적용시킴으로써 시너지 효과로서 극히 현저한 효과의 상승을 가져옴을 나타낸다.
4-5: 재조합 항체 단백질 생산성 측정
한편, 3종의 벡터에 대하여 실시예 4-2의 방법에 따라, 재조합 항체 단백질을 위한 발현 벡터를 제작한 후 실시예 4-3 및 4-4의 방법에 따라 항체 생산 세포주는 동일한 방법을 형질 전환 시킨 후 선별배지에서 2 ~ 3주 동안 배양하였다. 형질전환된 세포주는 2×105 cells/well (2 mL)로 6 웰 플레이트에 접종하여 6일 배양한 후, 배양액을 수확하여 ELISA 키트 (PanGen Biotech., PGK1002)를 이용하여 항체 발현률을 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, SV40 프로모터에 비하여 mEF1 프로모터 변이체를 사용한 경우, 3종 벡터 모두 3배 이상 항체 생산성이 증가하였고, 특히 pC(F)mEGM(R) 벡터의 생산성은 10배 이상 증가하였다.
이러한 결과는 SV40 프모모터 결과에서 MTX 증폭 후 확보된 생산성보다 mEF1 프모모터로 치환하여 0nM 적응 후 측정된 생산성이 약 2배 높게 분석되었으므로, MTX 증폭 없이 고발현 세포주 확보가 가능하여 졌음을 나타낸다. 즉, 종래 기술에 비하여 본 발명에 따른 MAR 인자 및 SAR 인자의 조합에 마우스 mEF1α 프로모터 변이체를 조합시킴으로서 산업적으로 채산성이 있는 수준으로 높은 생산성 향상을 확인할 수 있었다.
한편, 재조합 항체 생산에 있어서도 마우스 mEF1 프로모터 변이체를 적용시 2카피의 MAR 인자를 사용한 것에 비하여 MAR 인자와 SAR 인자를 조합한 경우 극히 현저한 생산성 향상이 나타나는바, 이러한 실험 결과는 MAR 인자 및 SAR 인자의 조합에 마우스 mEF1 프로모터 변이체를 적용시킴으로써 시너지 효과가 일어남을 제시한다.
4-6: 마우스 EF1α 프로모터 변이체의 효과 확인
실시예 2-12에서 제작한 마우스 EF1α 프로모터의 변이체의 효율을 테스트하기 위하여, 추가로 human EF1α프로모터를 삽입한 pMhEG 벡터 및 CHO (Chinese hamster ovary) EF1α프로모터를 삽입한 pMcEG 벡터를 제작한 다음, 마우스 EF1α 프로모터 및 상기 실시예 2-12의 변이체와 비교하였다.
먼저, pMhEG 벡터를 다음과 같이 제작하였다. pEF/myc/cyto(Invitrogen) vector의 Human EF1 promoter부위를 다음의 서열번호 38 및 39의 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 38: 5'-TCG ATC GAA TTC AAG TT CGT GAG G-3'
서열번호 39: 5'-GCT AGC GTG TTC ACG ACA CCT GAA ATG-3'
그 다음, PCR product를 ClaI, NheI 제한효소를 처리하여 1% agarose gel에서 분리 정제 한 후 동일한 제한효소로 처리된 pM(R)SG 벡터에 삽입하여 pMhEG를 제작하였다.
아울러, pMcEG 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 계대 배양 중인 CHO DG44 cell을 microtube에 1×106cell을 담아 3,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 세포를 확보하고 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)을 이용해 CHO genomic DNA를 준비한 후 다음의 서열번호 40 및 41의 primer를 이용해 PCR을 수행하여 CHO EF1 promoter를 획득하였다 (Genbank accession number AY188393).
서열번호 40: chEF1A-F
5'-TAT CGA TAG TGG AGT CAG GAA GGG TAG-3'
서열번호 41: chEF1A-R
5'-TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3'
PCR product를 ClaI, NheI 제한효소를 처리하여 1% agarose gel에서 분리 정제 한 후 동일한 제한효소로 처리된 pM(R)SG 벡터에 삽입하여 pMcEG를 제작하였다.
그 다음, 실시예 2-4의 pM(R)SG, 실시예 2-12의 pMmEG 및 pMmEG(TA)와 상기 pMhEG 벡터와 pMcEG 벡터를 실시예 4-5와 동일한 방법으로 재조합 항체를 생산하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 마우스 EF1α 프로모터를 사용한 경우 인간 EF1α 프로모터나 CHO EF1α 프로모터를 사용한 경우보다 높은 생산성을 보였으며, 서열번호 34의 마우스 EF1α 프로모터를 사용한 경우에는 SV40 프로모터를 사용한 경우 및 마우스 EF1α 프로모터를 사용한 경우 등에 비하여 매우 현저한 생산성의 향상을 가져옴을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음
서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

  1. 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단, 상기 전사 종결 인자의 3' 말단, 또는 상기 프로모터의 5' 말단과 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 양측에 유전자 발현 증가 인자인 MAR 인자 및 SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MAR 인자와 상기 SAR 인자는 서로 인접하거나 서로 코딩 서열 또는 비코딩 서열에 의하여 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MAR 인자 또는 상기 SAR 인자는 정방향체 또는 역방향체로 포함되는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 MAR 인자는 베타글로빈 MAR 인자인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 베타글로빈 MAR 인자는 젠뱅크 번호 L22754의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 SAR 인자는 CSP-B SAR인자 또는 인터페론 베타 SAR인자인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CSP-B SAR인자는 젠뱅크 번호 M62716로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 인터페론 베타 SAR인자는 젠뱅크 번호 M83137의 염기염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터 또는 EF1α 프로모터인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 EF1α 프로모터 변이체인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  11. 삭제
  12. 제1항 있어서, 상기 전사 종결인자의 5' 말단에 polyA가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현벡터.
  13. 제1항에 있어서, 상기 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
  14. 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사 종결 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터로서, 상기 프로모터의 5' 말단, 상기 전사 종결 인자의 3' 말단, 또는 상기 프로모터의 5' 말단과 상기 전사 종결 인자의 3' 말단 양측에 유전자 발현 증가 인자인 베타글로빈 MAR 인자 및 CSP-B SAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터,
    이때, 상기 프로모터는 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 EF1α 프로모터 변이체인 것을 특징으로 함.
  15. 제14항에 있어서, 서열번호 35의 염기서열을 가지는 pC(F)mEGM(R) 벡터인 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
  16. 제14항에 있어서, 상기 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
  17. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  18. 제13항 또는 제16항의 동물세포 발현벡터로 형질전환된 재조합 동물세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO 세포, Hela 세포, BHK 세포, NIH/3T3 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, CHO-K1 세포, 및 HEK293 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 동물세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 동물세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 동물세포.
  21. 제18항의 재조합 동물세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시킨 다음, 회수하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생산 방법.
  22. 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 EF1α 프로모터 변이체.
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