BR112013025099B1

BR112013025099B1 - Vetor de expressão para células animais

Info

Publication number: BR112013025099B1
Application number: BR112013025099-2A
Authority: BR
Inventors: Yoon Jaeseung; Baek Kwanghee; Byun Taeho; Park Jeong Soo
Original assignee: Pangen Biotech Inc.
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2021-08-10
Also published as: WO2012134215A3; KR20120112254A; CN103492577B; EP2692867A2; WO2012134215A2; BR112013025099A2; US20140038233A1; JP5931174B2; EP2692867A4; CN103492577A; EP2692867B1; KR101385223B1; ES2617217T3; US9062326B2; MY171316A; JP2014510534A

Abstract

vetor de expressão para células animais é provido um vetor de expressão para célula animal contendo uma eficiência aumentada de expressão de gene, e, particularmente, um vetor de expressão para células animais incluindo um elemento mar e um elemento sar, que são fatores que aumentam a expressão do gene, em uma extremidade 5' de um promotor, uma extremidade 3' de um sítio de terminação de transcrição, ou em ambas extremidade 5' do promotor e a extremidade 3' do sítio de terminação de transcrição. 0 vetor de expressão para células animais, de acordo com a presente invenção, apresenta eficiência de expressão de gene notavelmente aumentada em comparação aos vetores de expressão convencionais para células animais, de modo que a expressão de proteína de genes estranhos pode ser significativamente aumentada usando este vetor de expressão para as células animais. particularmente, o vetor de expressão para as células animais, de acordo com a presente invenção, pode ser útil de modo que uma linhagem de célula com alta expressão pode ser garantida mesmo sem a amplificação mtx.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um vetor de expressão para células animais contendo uma eficiência aumentada de expressão de gene.

Estado da Técnica

[002] Para obter uma proteína alvo sobre-expressa para usar a proteína alvo obtida para medicamento, uma indústria, ou semelhante, vários sistemas de expressão tais como um sistema de expressão em micro-organismo, um sistema de expressão em planta, um sistema de expressão em levedura, um sistema de expressão em inseto, um sistema de expressão em célula animal, e semelhantes, foram usados. Dentre estes, o sistema de expressão de microorganismo, que é o sistema mais facilmente usado, foi desenvolvido como sistemas de expressão apropriados para várias aplicações e comercializados.

[003] No entanto, o sistema de expressão de micro-organismo tem vários fatores limitantes. O principal fator limitante é que uma vez que a proteína de expressão e o mecanismo de modificação (glicosilação, fosforilação, amidização) do micro-organismo são diferentes daqueles de uma célula animal, embora o mesmo gene seja expresso no sistema de expressão micro-organismo, uma estrutura ou característica da proteína expressa não é completamente a mesma que a da proteína original. Portanto, no caso de produção de proteína recombinante usando o sistema de expressão de micro-organismo, uma vez que a modificação após a síntese foi dificilmente gerado, a inativação da proteína produzida ou uma diferença significativa em funções não é gerada, mas a proteína modificada ou proteína contendo uma diferença parcial na estrutura é frequentemente expressa. Além disso, um processo de produção da proteína recombinante usando o sistema de expressão de micro-organismos tem dificuldades pelo fato de que um segundo processo de remoção de contaminante secundário deve ser realizado devido à contaminação do microorganismo,contaminação por endotoxina do micro-organismo, ou semelhante.

[004] Por outro lado, embora o sistema de expressão de célula animal seja o sistema mais apropriado para expressão de proteína animal, o sistema de expressão de célula animal tem alto custo de produção devido à baixa eficiência de expressão da proteína recombinante, e um processo de operação da célula animal é difícil, em comparação ao sistema de expressão de microorganismo, de modo que não é fácil industrializar a expressão de célula animal. Como uma linhagem de célula animal industrial atualmente usada, há as células de ovário de hamster chinês (CHO), células renais de hamster recém-nascido (BHK), células de mieloma, ou semelhantes. A proteína estrangeira alvo pode ser expressa pela transfecção de um vetor de expressão incluindo o gene correspondente nestas linhagens de células animais.

[005] No caso em que vários mecanismos de modificação de proteína incluindo glicosilação são mantidos na célula animal e a proteína é secretada em um meio de cultura, processos de obtenção e purificação da proteína podem ser facilmente realizados. A maioria das células animais necessariamente requer um composto aditivo como proteína sérica, ou semelhantes durante um processo de cultura, mas uma vez que as célula CHO podem ser cultivadas em um meio ao qual soro e proteína não são adicionados, a célula CHO pode ser usada como a célula mais apropriada para expressão de proteína recombinante. Além disso, a célula CHO tem vantagens em que várias pesquisas nas células CHO foram conduzidas, de modo que as características das mesmas são bem conhecidas, uma taxa de crescimento é rápida, e cultura de suspensão para cultura de massa pode ser realizada.

[006] Geralmente, no caso de permitir um transgene a ser expresso nas células animais, o transgene e um vetor contendo um marcador são simultaneamente transfectados, e as células transfectadas são cultivadas em meio seletivo e selecionadas. No entanto, na maioria dos casos, uma frequência de expressão da mesma é significativamente baixa. Uma das razões é que estes transgenes não devem ser integrados em um cromossomo da célula hospedeira na célula animal diferente do sistema de microorganismo. Ainda, embora transfectantes estáveis em que o transgene é estavelmente integrado no cromossomo da célula hospedeira são selecionados, é difícil prever uma quantidade de expressão dos mesmos. O motivo é que uma posição de integração do gene é diferente em cada célula, e um padrão de expressão é diferente de acordo com a posição da integração. Portanto, o número de transgenes e a quantidade de expressão do transgene integrado na célula animal não tem uma correlação clara entre estes (Grindley et al., 1987, Trends Genet. 3, 16-22; Kucherlapati et al., 1984, Crit. Rev. Biochem. 16,349-381; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev. Genet. 20, 465-499). Na maioria dos casos, a expressão do gene na célula animal é suprimida por bases de DNA ao redor da posição de integração, de modo que embora no caso de transgenes estavelmente integrados, a expressão é geralmente expressa em um nível significativamente baixo (Eissenberg et al., 1991, Trends Genet. 7, 335-340; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev.Genet. 20, 465-499).

[007] A disponibilidade de um fator de DNA para proteger a expressão do transgene do efeito específico da posição do gene como descrito acima foi reportada em vários sistemas. Como o fator de DNA mencionado acima, um fator isolador, uma região de ligação à matriz nuclear (doravante referenciado como “MAR”), uma região de ligação estrutural (doravante referenciado como “SAR”), ou semelhantes, podem ser usados. Embora os mecanismos de operação dos mesmos não tenham sido esclarecidos, quando os fatores de DNA são incluídos nos construtos transgene, estes induzem expressão do gene independentemente da posição de integração, e a quantidade de expressão é determinada pelo número de cópias do gene (McKnight, R. A. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. US. 89, 6943-6947). Kalos et al. combinaram o elemento MAR do gene humano de apolipoproteína B como um construto transgene promotor mínimo e a expressão de gene induzida em células animais para aumentar a expressão do transcrito em cerca de 200 vezes (Kalos et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 198-207). De modo semelhante, foi reportado que o elemento MAR do gene de lisozima A de galinha, o elemento SAR do interferon β humano, e semelhantes conferem expressão transgene em vertebrados independentemente de uma posição de integração no cromossomo de células hospedeiras (Eissenberg et al., 1991, Trends Genet. 7, 335-340; Klehr et al., 1991, Biochemistry 30, 1264-1270). No entanto, uma tentativa de substancialmente aumentar a produção de proteína em linhagens de células usando uma combinação de elemento MAR de globina β específico, o elemento MAR/SAR específico, ou o elemento SAR de interferon β específico, como descrito acima ou o caso em que um lucro industrial foi identificado ainda não foi reportado.

[008] Dentre os documentos do estado da técnica relacionados com esse assunto pode-se citar os seguintes: - WO0214525A2 - Expression Vector Using for Animal Cell; - WO2006093397A1 - Expression vector for animal cell comprising at least one copy of MAR DNA sequences at the 3’ terminal of transcription termination region of a gene and method for the expression of foreign gene using the vector; - WO9746687A1 - Vector comprising SAR elements; - US2004072352A1 - Expression vector for animal cell containing nuclear matrix attachment region of interferon beta; - KR20020010327A - Expression vector capable of expressing foreign proteins in animal cells; - WO2011015916A2 - Vectors and Compounds for Expression of Recombinant Infliximab; - US20080124792A1 - Hybrid Promoters; - US2008102523A1 - Expression vector for animal cell comprising at least one copy of MAR DNA sequences at the 3’ terminal of transcription region of a gene and method for the expression of foreign gene using the vector; - KIM JONG-MOOK et al. - "Improved recombinant gene expression in CHO cells using matrix attachment regions", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY (2004), vol. 107, 95- 105; - PAMELA L. STRISSEL et al. - "Scaffold-Associated Regions in the Human Type I Interferon Gene Cluster on the Short Arm of Chromosome 9", GENOMICS (1998), vol. 47, no. 2, 217 - 229.

[009] A análise desses documentos revela que nenhum deles descreve um vetor de expressão para células animais compreendendo um elemento MAR e um elemento SAR na terminação 5’ de um promotor e na terminação 3’ de um sítio de transcrição.

[010] Tais documentos se referem a um promotor humano EF1α integrado a um vetor e a um promotor (CHO) EF1α do ovário de hamster chinês, onde a produtividade se revelou insuficiente para finalidades industriais. Nenhum desses documentos aborda o uso do promotor EF1α de rato incluindo SEQ ID No. 34.

[011] Outrossim, um vetor compreendendo dois elementos MAR, como descrito em alguns desses documentos, fornece resultados pouco vantajosos quando comparado com o caso em que são combinados um elemento MAR e um elemento SAR, que proporciona a produção de proteína com taxas industrialmente compensadoras.

[012] Tais informações aqui reveladas como fundamento da técnica são somente para melhorar o entendimento do fundamento da presente invenção. Portanto, informações da técnica anterior que já são conhecidas pelos especialistas na técnica à qual a presente invenção pertence, podem não ser incluídas.

Descrição Sumária da Invenção

[013] Um objetivo da presente invenção é fornecer um vetor de expressão para as células animais compreendendo pelo menos uma cópia do elemento MAR e elemento SAR em uma extremidade 5’ de um promotor e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[014] Outro objeto da presente invenção é fornecer uma célula animal recombinante transfectada com o vetor de expressão para as células animais.

[015] Ainda outro objeto da presente invenção é fornecer um método de produção de uma proteína alvo usando o vetor de expressão para as células animais.

[016] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão para as células animais compreendendo pelo menos uma cópia do elemento MAR ou elemento SAR em uma extremidade 5’ de um promotor e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[017] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão para as células animais compreendendo um fator que aumenta a expressão do gene selecionado de um grupo que consiste em pelo menos uma cópia de um elemento MAR de globina β, um elemento SAR de CSP-B, e um elemento SAR de interferon β em uma extremidade 5’ de um promotor e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[018] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão para as células animais compreendendo um elemento MAR e um elemento SAR , que são fator que aumenta a expressão do genes, em uma extremidade 5’ de um promotor e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[019] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão para as células animais compreendendo um elemento MAR de globina β e um elemento SAR de CSP-B, que são fator que aumenta a expressão do genes, em uma extremidade 5’ de um promotor (aqui, o promotor é um mutante de promotor EF1α de camundongo) e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[020] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um micro-organismo recombinante transformado com o vetor de expressão para as células animais.

[021] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula animal recombinante transfectada com o vetor de expressão para as células animais.

[022] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produção de uma proteína alvo caracterizada pelo cultivo de célula animal recombinante para expressar a proteína alvo e então recuperar a proteína alvo expressa.

[023] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um mutante de promotor EF1α de camundongo contendo uma sequência de SEQ ID NO. 34.

[024] Outras características e modalidades da presente invenção ficarão claras a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações que acompanham.

Breve Descrição das Figuras

[025] A FIG. 1 é um diagrama de configuração que esquematicamente mostra combinações de vários elementos MAR e elementos SAR incluídos em cada vetor.

[026] A FIG. 2 é um mapa de um vetor de expressão pC(F)mEGM(R).

[027] A FIG. 3 é um mapa de vetor de expressão pM(R)mEGC(F).

[028] A FIG. 4 é um mapa de vetor de expressão pM(R)M(R)mEG.

[029] A FIG. 5 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão de fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) usando um método de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) após transfecção dos vetores de expressão pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), e pSGM(R) em linhagens de células hospedeiras cultivadas aderentes.

[030] A FIG. 6 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão do VEGF usando o método ELISA após transfecção dos vetores pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), e pSGM(R) em linhagens de células hospedeiras cultivadas em suspensão.

[031] A FIG. 7 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão de VEGF usando o método ELISA com relação aos vetores pI(F)SGM(F), pI(R)SGM(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGI(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGC(R), pC(F)SGM(F), pC(F)SGM(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGI(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGC(R), pC(F)C(F)SG, pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), pM(R)SGI(R), pM(R)SGM(R), e pM(R)M(R)SG.

[032] A FIG. 8 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão do VEGF usando o método ELISA com relação a pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), e pM(R)M(R)SG.

[033] A FIG. 9 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão de VEGF usando o método ELISA após substituição de um promotor SV40 dos vetores da FIG. 8 com um mutante do promotor mEF1α. Aqui, um promotor* pmEF1α indica o mutante do promotor mEF1α.

[034] A FIG. 10 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão de uma proteína de anticorpo recombinante após substituição de uma proteína alvo dos vetores da FIG. 9 com a proteína de anticorpo recombinante. Aqui, o promotor pmEF1α indica o mutante do promotor mEF1α.

[035] A FIG. 11 mostra os resultados obtidos pela medição da taxa de expressão de uma proteína de anticorpo recombinante de pM(R)SG, pMhEG, pMcEG, pMmEG, e pMmEG(TA).

Descrição Detalhada das Realizações

[036] Salvo se definido de outra forma aqui, os termos técnicos e científicos usados na presente especificação têm os mesmos significados como aqueles entendidos pelos especialistas na técnica a que esta presente invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura usada na presente especificação é bem conhecida e comumente usada na técnica.

[037] A presente invenção refere-se a um vetor de expressão para as células animais contendo uma eficiência de expressão de gene aumentada, e particularmente a um vetor de expressão para as células animais compreendendo um elemento MAR e um elemento SAR, que são fator que aumenta a expressão do genes, em uma extremidade 5’ de um promotor e/ou uma extremidade 3’ de um sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[038] Para significativamente aumentar uma quantidade de expressão de genes no momento da expressão de genes estranhos, os presentes inventores inventaram um fator de expressão de proteção de genes estranhos a partir de um efeito inibitório específico da posição de um cromossomo de célula hospedeira e aumentar a expressão dos genes estranhos em células de ovário de hamster chinês (CHO), células renais de hamster recém-nascido (BHK), ou semelhantes, que são conhecidas como células animais.

[039] Em detalhes, um vetor foi construído usando uma região de ligação à matriz nuclear (doravante referenciado como “MAR”) e uma região de ligação estrutural (doravante referenciado como “SAR”) de modo que pelo menos uma ou duas cópias do elemento MAR ou elemento SAR são incluídos na extremidade 5’ do promotor ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, e capacidades do vetor de expressão foram comparadas e analisadas.

[040] Primeiro, para garantir uma sequência do elemento MAR ou o elemento SAR, os DNAs genômicos correspondentes foram separados das células correspondentes e então clonados em um vetor de Escherichia coli usando um método de reação de cadeia de polimerização (PCR) do DNA genômico correspondente e método de subclonagem, assim, garantindo vários elementos MAR e elementos SAR. Preferencialmente, o elemento MAR e elemento SAR podem ser selecionados de um grupo que consiste em MAR de globina beta humana (Yu, J., Bock, J. H., Slightom, J. L. and Villeponteau, B., Gene 139(2), 139-145 (1994), gene bank #: L22754), SAR de flanqueamento de gene CSP-B humano (Hanson, R. D. and Ley, T. J., Genbank No. de acessão: M62716), e SAR de flanqueamento de gene de interferon beta humano (Mielke, C., Kohwi, Y., Kohwi- Shigematsu, T. and Bode, J., Biochemistry 29, 7475-7485 (1990), Genbank Accession No.: M83137).

[041] Na presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor de expressão para as células animais compreendendo pelo menos uma cópia do fator que aumenta a expressão do gene selecionado do grupo que consiste em elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, e o elemento SAR de interferon beta em cada um de extremidade 5’ do promotor e a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[042] Ainda, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor de expressão para as células animais compreendendo pelo menos uma cópia do fator que aumenta a expressão do gene selecionado do grupo que consiste em o elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, e o elemento SAR de interferon beta na extremidade 5’ do promotor ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, todos os quais são operacionalmente ligados a cada outro dentro do vetor de expressão.

[043] Particularmente, o vetor de expressão para as células animais pode compreender pelo menos duas cópias do fator que aumenta a expressão do gene. Ou seja, o vetor de expressão para as células animais compreende pelo menos duas cópias do fator que aumenta a expressão do gene na extremidade 5’ do promotor ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição. Alternativamente, um aumento na expressão do gene estranho pode ser induzido contendo pelo menos uma cópia do fator que aumenta a expressão do gene na extremidade 5’ do promotor ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, respectivamente.

[044] Além disso, mais preferencialmente, o vetor de expressão para as células animais pode incluir ambos elemento MAR e o elemento SAR, que são o fator que aumenta a expressão do gene, na extremidade 5’ do promotor, a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, ou ambos de extremidade 5’ do promotor e a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[045] Na presente invenção, o termo “promotor” significa uma sequência de DNA de uma região não traduzida à montante de uma região não codificada, incluindo um sítio de ligação a polimerase e contendo uma atividade de início de transcrição de genes do promotor à jusante em mRNA. Mais especificamente, o “promoter” inclui um box TATA posicionado 20 a 30 bases à montante de um sítio de início de transcrição (+1) e servindo para permitir que a RNA polimerase inicie a transcrição de uma posição precisa ou uma região semelhante ao box TATA, mas não é limitada à montante e à jusante destas regiões. Além destas regiões, o promotor pode incluir uma região requerida para reunir uma proteína para regular a expressão exceto para a RNA polimerase. Na presente invenção, o promotor pode ser um promotor SV ou um promotor derivado de CMV e inclui um promotor EF-1α. Além disso, mutantes destes promotores podem ainda ser incluídos nestes. Como usado aqui, o termo “mutante” significa um mutante obtido por adição, deleção ou substituição de uma parte da sequência do promotor para aumentar a expressão do gene.

[046] Ainda, o promotor é operacionalmente ligado de modo a induzir a expressão do gene alvo, que é um gene estranho. Aqui, o termo “operacionalmente ligado” significa que uma sequência de regulação de expressão do DNA e uma sequência de DNA que codifica a proteína alvo são funcionalmente ligadas a cada outra de modo a realizar as funções gerais. A ligação operacional com um vetor recombinante pode ser realizada usando uma tecnologia de recombinação de gene bem conhecida na técnica e no momento da clivagem e ligação de DNA específico de sítio, as enzimas geralmente conhecidas na técnica, ou semelhantes, podem ser usadas.

[047] Na presente invenção, o gene alvo, que é um gene que codifica um produto estanho a ser expresso, é um gene que codifica todos os tipos de proteínas capazes de serem expressas como proteínas recombinantes. Como um exemplo representativo da proteína, como descrito aqui, há insulina, citocina (interleucina, um fator de necrose tumoral, interferon, um fator estimulante de colônia, quimiocina, e semelhantes), eritropoietina, e semelhantes. O gene alvo inclui um “sítio de clonagem”, que é uma sequência de DNA incluindo um sítio de reconhecimento ou clivagem de uma enzima de restrição introduzido neste de modo a ser integrado no vetor.

[048] Na presente invenção, o fator que aumenta a expressão do gene pode ser o elemento de região de ligação à matriz beta globina (MAR), o elemento CSP-B SAR, ou o elemento SAR de interferons beta, em que o termo “região de ligação à matriz (MAR)” indica uma sequência de DNA temporariamente ligando um domínio em alça do DNA que liga temporariamente uma sequência de DNA a uma rede de proteínas conhecidas como uma matriz nuclear (Pienta et al. (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres. 1:355385). Vários exemplos da sequência MAR são conhecidas na técnica.

[049] Na presente invenção, um exemplo do sítio de terminação de transcrição pode incluir qualquer sítio de terminação de transcrição conhecido na técnica relacionada. Preferencialmente, o sítio de terminação de transcrição pode ser um sítio de terminação de transcrição de gastrina, e polyA pode se ligado a este. Por exemplo, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (polyA), um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (polyA), ou um sinal de poliadenilação do vírus SV40 (polyA) pode ser incluído.

[050] Os presentes inventores selecionaram e construíram um terminador de gene de gastrina humano do qual um sinal de polyA essencial à terminação da transcrição, um sítio de clivagem e um sítio de terminação são precisamente conhecidos para aplicar o terminador do gene de gastrina construído ao vetor de expressão da presente invenção para melhorar a eficiência do vetor de expressão aumentando a estabilidade de mRNA. A gastrina é composta de um fragmento de 603 bp em que o sinal poly-A, o sítio de clivagem, e o terminador são incluídos em um mapa de enzima de restrição HindIII, em que o sinal poly-A e o sítio de clivagem são espaçados um de cada outro por 15 bp, e o terminador é espaçado do sinal poly-A em cerca de 220 bp. A transcrição é terminada no sítio de terminação de transcrição da gastrina posicionada como descrito acima, e a clivagem do mRNA e poliadenilação (poly-Asao gerados no sítio de clivagem.

[051] Na presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor incluindo uma cópia do elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, ou o elemento SAR de interferon beta na extremidade 5’ do promotor ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[052] Na presente invenção, a combinação do fator que aumenta a expressão do genes pode ser as configurações conhecidas na FIG. 1. A FIG. 1 esquematicamente mostra uma sequência de ligação do fator que aumenta a expressão do gene, o promotor, o polyA, e o terminador no vetor de expressão para as células animais. Aqui, o promotor é o promotor SV40, o promotor mEF1α, ou o promotor mutante mEF1α, e MAR/SAR é o elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, ou o elemento SAR interferon beta.

[053] Na presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor compreendendo o elemento MAR e o elemento SAR na extremidade 5’ do promotor e/ou a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição. Neste caso, o elemento MAR e o elemento SAR podem ser adjacentes a cada outro ou separados de cada outro por uma sequência de codificação ou não codificação.

[054] Como um exemplo específico da presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor compreendendo uma cópia do elemento MAR de beta globina na extremidade 5’ do promotor e uma cópia do elemento SAR CSP-B na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[055] Como um exemplo específico da presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor compreendendo uma cópia do elemento MAR de beta globina na extremidade 5’ do promotor e uma cópia do elemento SAR de interferon beta na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[056] Como um exemplo específico da presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor compreendendo uma cópia do elemento SAR CSP-B na extremidade 5’ do promotor e uma cópia do elemento MAR de beta globina na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[057] Como um exemplo específico da presente invenção, o vetor de expressão para as células animais pode ser um vetor compreendendo uma cópia do elemento SAR de interferon beta na extremidade 5’ do promotor e uma cópia do elemento MAR de beta globina na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição.

[058] Na presente invenção, quando duas cópias do elemento MAR de beta globinas, os elementos SAR CSP-B, ou os elementos SAR de interferon beta SAR são incluídos, é preferencial que as duas cópias dos elementos MAR ou SAR podem ser continuamente posicionados de modo que seja adjacentes a cada outro ou ser espaçados de cada outro por uma região espaçadora curta relativa.

[059] Na presente invenção, o vetor pode incluir fator que aumenta a expressão do genes incluindo o elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, e o elemento SAR de interferon beta como orientação direta ou reversa. Aqui, a orientação de cada um dos fatores que aumentam a expressão dos genes pode ser diferente de acordo com a combinação específica destes fatores.

[060] No Exemplo da presente invenção, foi confirmado que no caso de usar um mutante do promotor mEF1α contendo uma sequência de SEQ ID NO. 34, a produtividade do anticorpo foi aumentada em 5 vezes ou mais em todos os vetores contendo os elementos MAR e SAR em comparação ao caso de um promotor SV40, e particularmente, a produtividade de um vetor pC(F)mEGM(R) foi aumentado em 10 vezes ou mais. Uma vez que a produtividade medida após a substituição do promotor SV40 com o promotor mEF1α e sendo adaptado a uma concentração de MTX de 0nM foi analisada como sendo maior do que cerca de 2 vezes em comparação à produtividade assegurada após amplificação de MTX no caso de uso do promotor SV40, o resultado, como descrito acima, indica que as linhagens de células de alta expressão podem ser garantidas sem realização da amplificação de MTX. Portanto, a presente invenção é caracterizada usando o promotor mutante mEF1α. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um mutante de promotor EF1α de camundongo contendo uma sequência de SEQ ID NO. 34.

[061] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se às células recombinantes ou animais transformadas com o vetor de expressão para as células animais.

[062] Aqui, as células animais podem ser células CHO, células Hela, células BHK, células NIH/3T3, células COS-1, células COS- 7, células CHO-K1, células HEK293, ou semelhantes, que são linhagens de células animais geralmente conhecidas. Além disso, as células animais podem ser células SP2/0, células NSO, células PER.C6, ou semelhantes.

[063] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma proteína alvo usando um vetor de expressão para as células animais e caracterizado pelo cultivo de uma célula animal recombinante para expressar a proteína alvo e recuperar a proteína alvo.

[064] Na presente invenção, o método de produção pode incluir: (a) integrar um gene alvo no vetor de expressão para as células animais de modo que a expressão é regulada pelo promotor; (b) transfectar células animais com o vetor de expressão para as células animais nas quais o gene alvo gene é integrado; e (c) cultivar a célula animal recombinante transfectada para expressar a proteína alvo e recuperar a proteína alvo.

[065] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhe através dos Exemplos. No entanto, estes Exemplos são somente para ilustrar a presente invenção e os especialistas na técnica apreciarão que estes Exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção.

Exemplo 1 Clonagem de elementos MAR e SAR

[066] DNA MAR/SAR foi garantido por um método de PCR após separação do DNA genômico usando um kit de separação de DNA de linhagens de células Hep G-2 (kit de purificação de DNA genômico Wizard, Promega, US).

[067] 200ng do DNA genômico separado foi usado como um molde, e 25pmole de cada primer, dNTP (0,5mM), e ExTaq DNA polimerase (Takara Shuzo Co., Japão) foram adicionados, assim, realizando uma reação em cadeia da polimerase (PCR). As sequências dos primers usados para cada um dos elementos MAR/SAR e tamanhos de fragmentos de DNA obtidos pelo PCR foram mostrados na seguinte Tabela 1. A reação em cadeia da polimerase foi realizada usando um sistema de GeneAmp PCR 9600(Perkin - Elmer Corp., US) e condições de PCR foram mostrados na seguinte Tabela 2. [Tabela 1]

[Tabela 2]

[068] Os produtos de PCR obtidos do MAR de beta globina humana, o SAR CSP-B, e SAR interferon-beta foram sub-clonados em um vetor pT7blue (R) (Novagene, US) ou pCR 2.1 (Invitrogen, US). O MAR de globina beta humana foi sub-clonado no vetor pT7blue (R), e o SAR CSP-B e o SAR interferon-beta foram sub-clonados no vetor pCR 2.1.

Exemplo 2: Construção do vetor de expressão para as células animais 2-1: Construção de vetores pSV—e—gal/versão I e versão II

[069] Para eficientemente clonar os elementos MAR e SAR sub- clonados no vetor pT7blue (R) e o vetor pCR 2.1, na frente de um promotor de um vetor pSV-β-gal, os vetores recombinantes pSV-β- gal versão I e versão II foram construídos.

[070] Primeiro, após construir um primer (SEQ ID NO. 7) incluindo um sítio de enzima de restrição de Spe I-Sma I-Apa I- EcoR I e um primer (SEQ ID NO. 8) incluindo Hind III em uma extremidade 3’ e realizar um PCR para um promotor SV40 de um vetor pSV-β-gal (Promega Co., US), um fragmento tratado com 443bp Spe I-Hind III incluindo o promotor SV40 foi separado, purificado, e recuperado de gel agarose usando um kit gene clean III (BIO 101 Co.). Em seguida, este fragmento foi integrado em e ligado a um pBluescript SK(+)linearizado (Stratagene Co., US) tratado com Spe I/Hind III, que foram as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo um vetor promotor pBluescript/SV40 I. Em seguida, o vetor de promotor pBluescript/SV40 I construído foi tratado com as enzimas de restrição Sca I e Hind III, de modo que um fragmento incluindo o promotor SV40 foi purificado, separado e recuperado do gel de agarose pelo método acima mencionado. Depois disso, o fragmento foi integrado em e ligado ao vetor linearizado pSV-β-gal com as mesmas enzimas de restrição, assim, concluindo o vetor versão I (pSV-e-gal/versão I). SEQ ID NO. 7: primer senso para construir vetor pSV-beta- gal/ver1 5'-GCACTAGTCC CGGGCCCATG ATTACGAATT CGCGCAGCACCAT-3' SEQ ID NO. 8: primer antissenso para construir vetor pSV- beta-gal/ver1 5'-GCAAGCTTTT TGCAAAAGCC TAGGCCTCC-3'

[071] Para construir um vetor recombinante pSV-β-gal versão II, em seguida o vetor pSV-β-gal foi tratado com EcoR I e Hind III, de modo que um fragmento de 420bp de EcoR I/Hind III incluindo promotor SV40 foi purificado, separado, e recuperado do gel agarose pelo método acima mencionado. Em seguida, este fragmento foi integrado em e ligado a um vetor linearizado pBluescript SK(+) tratado com EcoR I e Hind III, que foram as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo um vetor do promotor pBluescript/SV 40 II. Depois, o vetor pBluescript/Promotor SV40 II construído foi tratado com as enzimas de restrição Sca I e Hind III, de modo que um fragmento incluindo o promotor SV40 foi separado, purificado e recuperado do gel agarose pelo método acima mencionado. Depois disso, o fragmento foi integrado em e ligado ao vetor linearizado pSV-β-gal tratado com as mesmas enzimas de restrição, assim, concluindo o vetor versão II (pSV- e-gal/versão II).

2-2:ConstruçãodevetorincluindoelementosMAR/SARegeneβ- gal

[072] O vetor MAR de pT7blue/beta globina construído no Exemplo 1 foi tratado com enzimas de restrição Spe I e Sma I, de modo que um fragmento de DNA 3kb incluindo o elemento MAR de beta globina foi separado, purificado, e recuperado do agarose gel. Então, este fragmento foi integrado em e ligado com o vetor linearizado recombinante pSV-β-gal versão I tratado com Spe I e Sma I, que foram as mesmas enzimas de restrição, assim concluindo a clonagem de elemento MAR de beta globina (pMS-β- gal). Para confirmar a orientação do elemento MAR de beta globina integrado, o tratamento usando uma enzima de restrição Hind III que estava presente no elemento MAR de beta globina e o vetor recombinante pSV-β-gal versão I foi realizado, assim confirmando que a orientação do elemento MAR de beta globina foi uma reversa.

[073] Os elementos SAR foram separados do SAR pCR 2.1/interferon beta e pCR 2.1/SAR CSP-B e clonados em pSV/I ou pSV/II como descrito acima. O SAR de interferon beta foi sub- clonado em pSV-e-gal/versão I usando Apal/Spel, assim, construindo SAR pSV-β-gal/interferon beta (F) (pIS-β-gal). Após realizar um PCR usando os primers e pCR 2.1/SAR CSP-B como um molde (SEQ ID NO. 9 e 10) incluindo enzima de restrição Spe I e Sma I, o SAR CSP-B foi tratado com as enzimas de restrição Spe I/Sma I separadas e sub-clonadas em pSV-β-gal/verII tratado pelas mesmas enzimas de restrição, assim, construindo pSV-β- gal/SAR CSP-B (pCS-β-gal). SEQ ID NO. 9: SAR CSP-B Senso GGA TCC CAT TCT CCT TGA-3' SEQ ID NO. 10: SAR CSP-B Antissenso 5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3' (30mer)

2-3:Garantiadosítiodeterminaçãodetranscriçãodegenede gastrina e construção de vetor pSG-β-gal

[074] Após uma fita senso do sítio de terminação de transcrição (GTF) do gene gastrina ter sido sintetizado usando um primer (SEQ ID NO. 11) e uma finta antissenso do mesmo foi sintetizada usando um primer (SEQ ID NO. 12), duas fitas foram aneladas. O produto de reação de anelação, que foi tratado com BamH I e Pst I, foi integrado em e ligado a um vetor linearizado pSV-β-gal (Promega Co., US) tratado com as mesmas enzimas de restrição antecipadamente, assim, concluindo um vetor pSG-β-gal. SEQ ID NO. 11: Sequência senso de sítio de terminação de gastrina 5'-AGCGGATCCA GGATAATATA TGGTAGGGTT CATAGCCAGA GTAACCTTTT TTTTTAATTT TTATTTTATT TTATTTTGAG CTGCAG-3' SEQ ID NO. 12: sequência antissenso de sítio de terminação de gastrina usando em vetor pSG 5'-CTGCAGCTCA AAATAAAATA AAATAAAAAT TAAAAAAAAA GGTTACTCTG GCTATGAACCCTACCATATA TTATCCTGGA TCCGCT-3'

2-4: Construção de vetor pM(R)SG

[075] Um vetor ao qual MAR beta globina (orientação reversa) e SPA-GTF foram simultaneamente aplicados foi construído por um método de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para construir ou vetor pM(R)SG, a reação em cadeia da polimerase foi realizada usando pMS-β-gal de Exemplo 2-2 e pSG-β-gal do Exemplo 2-3 como moldes, e então o produto de reação foi tratado com uma enzima específica de restrição a ser ligada, assim, concluindo o vetor pM(R)SG.

[076] 1. Reação em cadeia da polimerase (PCR) para elemento MAR de beta globina

[077] O PCR foi realizado usando pMS-β-gal como um molde, um primer senso ML1 (SEQ ID NO. 13), e um primer antissenso MR1 (SEQ ID NO. 14). O produto de reação obtido foi tratado com enzimas de restrição Sac II e Cla I a ser clivado e então integrado em e ligado a um vetor linearizado pMS-β-gal tratado pelas mesmas enzimas de restrição adiantado para completar uma primeira etapa de sub-clonagem, assim, construindo um vetor pMS- β-gal/sc, que foi um produto de vetor intermediário. SEQ ID NO. 13: primer ML1 para amplificar elemento MAR de globina beta humana no vetor pMS 5'-TCCCCGCGGC CCGGGCCTCC TGAGTAGCTG GGGACT-3' SEQ ID NO. 14: primer MR1 para amplificar elemento MAR de globina beta humana no vetor pMS 5'-TTGGGGCCCA TCGATTTTTC CTCTTTAGGT TCTC-3'

[078] 2. Reação em cadeia da polimerase (PCR) incluindo sítio de multiclonagem e sítio de terminação de transcrição

[079] O PCR para o sítio de terminação de transcrição do gene de gastrina no vetor pSG-β-gal foi realizado usando um primer senso TL1 (SEQ ID NO. 15) e um primer antissenso TR1 (SEQ ID NO. 16). O produto do PCR foi sub-clonado em um vetor pGEM-T (Promega Co., US), que é um tipo de vetor de clonagem TA construído de modo a diretamente clonar um produto PCR sem tratamento com enzima de restrição, assim, construindo um vetor pGEM-T/MCSp(A), que foi um produto intermediário para construir um vetor. SEQ ID NO. 15: primer TL1 de sítio de terminação de gastrina no vetor pSG 5'-GAAGATCTGT TAACTCGAGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTA 3' SEQ ID NO. 16: primer TR1 do sítio de terminação de gastrina no vetor pSG 5'-GTGCCAGCTT GCATGCCTGC-3'

[080] 3. Reação em cadeia da polimerase (PCR) para o promotor SV40 e sítios de multiclonagem

[081] O PCR para o promotor SV40 e o sítio de multiclonagem foi realizado usando um primer senso PL1 (SEQ ID NO. 17) e um primer antissenso PR1 (SEQ ID NO. 18). O produto de reação foi tratado com enzimas de restrição Apa I e Bgl II e então ligado a um vetor linearizado pGEM-T/MCSp(A) construído antecipado ao ser tratado com as mesmas enzimas de restrição como descrito acima, assim, construindo um vetor pGEM-T/SVMCSp(A) como um produto intermediário. SEQ ID NO. 17: primer PL1 para fundir promotor vírus SV40 e sítio de multiclonagem 5'-CCGGGCCCAT CGATAAGCTT GATCCCGCGC AGCACCATGG CCTGAA-3' SEQ ID NO. 18: primer PR1 para fundir promotor vírus SV40 e sítio de multiclonagem 5'-GAAGATCTGC GGCCGCTAGC AAGCTTTTTG CAAAAGCCTA-3'

[082] 4. Construção de vetor pMS e vetor pMSG

[083] O vetor pGEM-T/SVMCSp(A) construído no Exemplo @ foi tratado com enzimas de restrição Cla I e BamH I, de modo que um fragmento de DNA composto do promotor SV40, o sítio de multiclonagem, e um SV40 sítio de terminação de transcrição foi separado e purificado. Em seguida, o fragmento de DNA purificado foi integrado no vetor linearizado pMS-β-gal/sc construído no Exemplo @ ao ser tratado com as mesmas enzimas de restrição em avanço, assim, concluindo o vetor pMS. Para construir o vetor pM(R)SG, então o vetor pSG-β-gal construído acima foi tratado com enzimas de restrição BamH I e Sca I para separar e purificar um fragmento de DNA de 950bp contendo uma sequência GTF de gene de gastrina, o fragmento de DNA purificado foi integrado em e ligado ao vetor linearizado pMS tratado em avanço com as mesmas enzimas de restrição, assim, concluindo um vetor pM(R)SG.

2-5: Construção de vetor pSG

[084] Para integrar o elemento MAR/SAR em uma extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, o vetor pSG foi construído. Após o vetor de expressão pM(R)SG ter sido tratado com Sma I e Cla I para remover MAR destes, o resultante foi tratado com Klenow para preparar extremidades cegas e então auto-ligadas, assim, construindo o vetor pSG.

2-6: Construção de vetores pMSG e pSGM

[085] Após o vetor de expressão pM(R)SG ter sido tratado com Sac II e Cla I para separar MAR (R) dos mesmos, para garantir MAR (F) (MAR como orientação direta), primers (SEQ ID NO. 19 e 20) foram construídos de modo que Sac II/Cla I foi incluído neste, assim, realizando o PCR. O produto PCR foi separado de um gel agarose e integrado no vetor pM(R)SG tratado com as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo o vetor pM(F)SG. SEQ ID NO. 19: 5'-TTTTCCGCGGTTTTCCTCTTTAG-3' SEQ ID NO. 20: 5'-TTTTATCGATCCTCCTGAGTAG-3'

[086] Entretanto, o vetor pSGM, que é um vetor de expressão para as células animais contendo o elemento MAR de beta globina na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, foi construído através dos processos como descrito abaixo.

[087] Para construir o vetor pSGM, primers (SEQ ID NO. 21 e 22) foram construídos de modo a incluir a enzima de restrição Nar I em ambas as extremidades de MAR, e um PCR foi realizado usando o pM(R)SG como um molde. O produto de PCR foi tratado com a enzima de restrição Nar I e integrado no vetor pSG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo os vetores pSGM(R) e pSGM(F). SEQ ID NO. 21: MAR β-globina senso Nar I 5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mer) SEQ ID NO. 22: MAR β-globina antissenso Nar I 5'-AAA AGG CGC CTT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mer)

2-7: Construção de vetores pISG e pSGI

[088] Um vetor pISG, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo o elemento SAR de interferon beta na extremidade 5’ do promotor, e um vetor pSGI, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo o elemento SAR de interferon beta na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição foram construídos através dos processos como descrito abaixo.

[089] Um gene β-gal foi removido do vetor SAR pSV-β- gal/interferon beta (F) (pI(F)S-β-gal), e o sítio de multiclonagem (MCS), o sítio de terminação de transcrição SV40, e o GTF de gastrina foram integrados, assim, construindo o vetor pI(F)SG.

[090] Um fragmento Hind III/Pst I incluindo o sítio do gene β- gal do vetor pI(F)S-β-gal foi removido, e o fragmento Hind III/Pst I foi separado do pM(R)SG tratado com a mesma enzima de restrição e integrado, assim, construindo o vetor pI(F)SG.

[091] O vetor pI(F)SG foi tratado com a enzima de restrição EcoR I, o elemento SAR de interferon beta foi separado do gel agarose e integrado novamente no vetor pI(F)SG tratado com a mesma enzima de restrição ao construto pI(R)SG. Em seguida, o vetor pI(R)SG foi confirmado por mapeamento de enzima de restrição. Para construir o vetor pSGI, um ligante (SEQ ID NO. 23) incluindo um sítio de enzima de restrição Nar I foi integrado em um vetor pGEM-T Easy, e o elemento SAR foi tratado com a enzima de restrição EcoR I do vetor pISG para separar um fragmento de DNA. Então, o fragmento de DNA separado foi integrado em um vetor T modificado. Novamente, o resultante foi clivado pela enzima de restrição Nar I e então integrado no vetor pSG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo os vetores pSGI(F) e pSG(R). SEQ ID NO. 23: Ligante 5'-GGC CGG CGC CGA ATT CGG CGC C-3'

2-8: Construção de vetores pCSG e pSGC

[092] Um vetor pCSG, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo o elemento SAR CSP-B na extremidade 5’ do promotor, e um vetor pSGC, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo o elemento SAR CSP-B na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição foram construídos pelos processos como descrito abaixo.

[093] Um PCR foi realizado usando pSV-β-gal/SAR CSP-B (F) (pCS- β-gal) como um molde e primers (SEQ ID NO. 24 e 10) incluindo enzimas de restrição Cla I e Sma I, seguido por tratamento com enzimas de restrição Cla I e Sma I, obtendo um fragmento de DNA SAR CSP-B. O vetor pM(R)SG foi tratado com enzimas de restrição Cla I e Sma I para remover MAR, seguido por integração do CSP-B tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo o vetor pC(R)SG. SEQ ID NO. 24: SAR CSP-B Senso Cla I 5'-AAA AAT CGA TAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mer) SEQ ID NO. 10: SAR CSP-B Antissenso Sma I 5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3' (30mer)

[094] O elemento SAR CSP-B tratado com a enzima de restrição Sac II do vetor pC(R)SG foi integrado no vetor pSG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo o vetor pC(F)SG.

[095] Para construir o vetor pSGC vetor, primers (SEQ ID NO. 25 e 26) foram construídos de modo a incluírem a enzima de restrição Nar I em ambas as extremidades de SAR CSP-B, e um PCR foi realizado usando o pC(F)SG como um molde. O produto de PCR foi tratado com a enzima de restrição Nar I e integrado no vetor pSG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo os vetores pSGC(F) e pSGC(R). SEQ ID NO. 25: SAR CSP-B Senso Nar I 5'-AAA AGG CGC CGA ATT CAA ACA ACT CAA TAG C-3' (31mer) SEQ ID NO. 26: SAR CSP-B Antissenso Nar I 5'-AAA AGG CGC CAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mer)

2-9: Construção de vetores pMMSG, pMSGM, pMSGC, e pMSGI

[096] Um vetor pMMSG, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo 2 cópias do elemento MAR de beta globinas na extremidade 5’ do promotor, e um vetor pMSGM vetor, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo o elemento MAR de beta globinas na extremidade 5’ do promotor e a extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição, respectivamente foram construídos através dos processos como descrito abaixo.

[097] Um PCR foi realizado usando o vetor pM(R)SG como um molde e primers (SEQ ID NO. 21 e 27) incluindo enzimas de restrição Nar I e Cla I em ambas as extremidades do MAR. Então, o produto PCR foi tratado com as enzimas de restrição Nar I e Cla I e integrado no vetor pM(R)SG tratado com a enzima de restrição Cla I, assim, construindo o vetor pM(R)M(R)SG. SEQ ID NO. 21: β-globina MAR Senso Nar I 5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mer) SEQ ID NO. 27: β-globina MAR Cla I 5'-AAA ATC GAT TT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mer)

[098] Para construir os vetores pM(R)SGM, pM(R)SGC, e pM(R)SGI, os vetores pSGM(F), pSGC(F), e pSGI(F) foram tratados com a enzima de restrição Nar I para individualmente separar o MAR de beta globina, o elemento SAR CSP-B, ou elemento SAR de interferon beta e integrado no vetor pM(R)SG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo vetores pM(R)SGM(R), pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), e pM(R)SGI(R).

2-10: Construção de vetores pI(R)SGI, pI(R)SGC, e pI(R)SGM

[099] Um vetor de expressão para as células animais incluindo uma cópia do elemento SAR de interferon beta na extremidade 5’ do promotor e uma cópia do elemento MAR de beta globina, o elemento CSP-B SAR, e o elemento SAR de interferon beta na extremidade 3’ do sítio de terminação de transcrição foi construído através dos processos descritos abaixo.

[0100] Para construir vetores pI(R)SGI, pI(R)SGC, e pI(R)SGM, os elementos MAR/SAR foram separados de vetores pSGI(F), pSGC(F), e pSGM(F) por tratamento com enzima de restrição Nar I, respectivamente. Os elementos MAR/SAR separados e purificados foram integrados em um vetor pI(R)SG tratado com a enzima de restrição Nar I, assim, construindo vetores pI(R)SGI(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGC(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGM(R), e pI(R)SGM(F).

2-11: Construção de vetores pCCSG, pCSGI, pCSGC, e pCSGM

[0101] Um vetor pCCSG, que é um vetor de expressão para as células animais incluindo 2 cópias do elemento SAR CSP-B na extremidade 5’ do promotor, foi construído através dos processos como descrito abaixo.

[0102] O vetor pC(F)SG incluindo o elemento SAR CSP-B foi tratado com Enzima de restrição Hind III a ser separado, e então auto-ligação foi realizada. Novamente, o resultante foi tratado com as enzimas de restrição Nhe I e Spe I para separar e purificar o elemento SAR CSP-B e então integrado no vetor pC(F)SG tratado com a enzima de restrição Spe I, assim, construindo um vetor pC(F)C(F)SG.

[0103] Para construir vetores pC(F)SGI, pC(F)SGC, e pC(F)SGM, os elementos MAR/SAR foram separados dos vetores pSGI(F), pSGC(F), e pSGM(F) por tratamento com enzima de restrição Nar I, respectivamente. Os elementos MAR/SAR separados e purificados foram integrados em um vetor pC(F)SG tratados com a enzima de restrição Nar I, assim, construindo vetores pC(F)SGI(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGC(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGM(R), e pC(F)SGM(F).

2-12:Construçãodevetordeexpressãoincluindomousepromotor EF1α de camundongo e mutante do mesmo

[0104] Um promotor EF1α de camundongo foi separado de DNA genômico garantido de tecido de saco vitelino de camundongo usando um kit de isolamento de DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN).

[0105] 200ng do DNA genômico, 10 pmol de cada primer (SEQ ID NO. 28 e 29), e água foram adicionais a Maxime PCR Premix (i-pfu) (Intron biotechnology) de modo que tenha um volume total de 20 ^ para realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR). As condições de reação foram como a seguir. Após um processo de sequencialmente realizar uma reação a 94°C por 5 minutos, 94°C por 30 segundos, 56°C por 1 minuto, e 72°C por 3 minutos foi conduzido em um ciclador térmico por 25 ciclos, a reação final foi conduzida a 72°C por 5 minutos, seguido por separação e purificação usando um kit de separação (GeneAllR ExpinTM PCR SV, Geneall). SEQ ID NO. 28: mEF1α-F 5'-TTT TAT CGA TAG CGG AGT AAG GAA GAG TAG-3 SEQ ID NO. 29: mEF1α-R 5’-TTT TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3’

[0106] Após o promotor SV40 ser removido do vetor de expressão pM(R)SG usando Cla I e Nhe I, um promotor EF1α de camundongo tratado com as mesmas enzimas de restrição foram integrados, assim, construindo um vetor de expressão pMmEG.

[0107] Para substituir timina posicionada em uma quinta posição de TATATAA, que é uma sequência box TATA de promotor EF1α de camundongo, com adenina, um primer PCR incluindo uma sequência substituída como descrito abaixo foi construído, assim, induzir uma mutação de par de base (Jaeger E., 1997).

[0108] Após um PCR primário foi realizado pela mistura de primer 1 e 3 (SEQ ID NO. 30 e 32) em um tubo 1 e primer 2 e 4 (SEQ ID NO. 31 e 33) em um tubo 2, respectivamente usando o vetor de expressão pMmEG como um molde, cada um dos produtos obtidos em dois tubos foi purificado, e os produtos purificados foram misturados com cada outro. Então, um PCR secundário foi realizado nas mesmas condições usando o produto de PCR misturado como um molde e o iniciador 1 e 4. O produto de PCR foi tratado com Kpn I e Spe I, e então um mutante de promotor EF1α de camundongo (mEF1α(TA)) foi garantido usando um kit de separação. Em seguida, o vetor de expressão pMmEG foi tratado com Kpn I e Spe I para remover o promotor EF1α de camundongo, um mutante de promotor EF1α de camundongo (mEF1α(TA), SEQ ID NO. 34) tratado

2-13: Construção de vetor de expressão pmEG

[0109] Após o vetor pC(R)SG ter sido tratado com a enzima de restrição Sac I para remover SAR CSP-B e então auto-ligado, o resultante foi tratado com as enzimas de restrição Cla I e Nhe I, assim, construindo pG. O vetor pMmEG (TA) foi tratado com as enzimas de restrição Cla I e Nhe I para separar o mutante EF1α de camundongo e então integrado no pG tratado com as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo um vetor pmEG.

2-14: Construção de vetor de expressão pC(F)mEGM(R)/ pM(R)mEGC(F)/ pM(R)M(R)mEG

[0110] O mutante de promotor EF1α de camundongo foi integrado em um vetor de expressão incluindo 2 cópias de MAR/SAR contendo alta eficiência de expressão, assim, construindo um vetor de expressão como descrito abaixo.

[0111] Após o vetor de pMmEG(TA) ter sido tratado com as enzimas de restrição Cla I e Nhe I para separar o mutante de promotor EF1α de camundongo, os vetores de expressão pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), e pM(R)M(R)SG foram tratados com as mesmas enzimas de restrição para remover o promotor SV40, e o mutante de promotor EF1α de camundongo separado foi integrado a este, assim, construindo um mapa de vetor de expressão pC(F)mEGM(R) da FIG. 2, um mapa de vetor de expressão pM(R)mEGC(F) de FIG. 3, e um mapa de vetor de expressão pM(R)M(R)mEG da FIG. 4.

[0112] Neste caso, as informações no vetor construído pC(F)mEGM(R) (SEQ ID NO. 35) foi como a seguir. [Tabela 3]

Exemplo 3: Desenvolvimento de linhagem de célula transfectada 3-1:Transfecçãousandolinhagemdecélulahospedeiraaderente

[0113] Uma linhagem de célula CHO DG44 deficiente de gene DHFR (Dr. Chasin, Columbia University) foi cultivada em um meio MEM (Meio Essencial Mínimo, Gibco BRL) com soro bovino fetal 10%. 2x105 células foram inoculadas em uma placa de 6 poços contendo 2mL de meio e cultivadas durante a noite a 37°C em incubadora 5% CO2 até a transfecção ocorrer.

[0114] Transfecção foi realizada por um método mediado por lipossoma. Um vetor pDCH1P incluindo um gene DHFR em um vetor pSP72, que é um vetor comercializado, foi co-transfectado com cada vetor de teste em uma proporção molar de 100:1. 2 ug de cada vetor foi misturado com GeneJuice (MERCK, Alemanha), que é um tipo de surfactante de gordura e um meio MEM isento de soro para reagir com cada outro em temperatura ambiente por 45 minutos e então adicionado à célula lavada junto com o meio. Então, as células transfectadas foram cultivadas por 6 horas e um meio de cultura foi removido. Para selecionar a linhagem de célula transfectada, as células foram incubadas no meio MEM sem nucleosídeo. Após 2 semanas as células inicialmente adaptadas foram obtidas e as células foram continuamente adaptadas a 10 nM e 100 nM MTX, assim, garantindo linhagens de células estáveis, respectivamente.

3-2: Transfecção usando linhagem de célula de hospedeiro cultivada em suspensão

[0115] Uma linhagem de célula hospedeira CHO DG44 adaptada para cultura em suspensão foi sub-cultivada em um meio comercial isento de soro. Antes 1 dia da transfecção, a sub-cultura foi realizada, e o vetor pDCH1P e cada vetor teste foi transfectado com eletroporação. Para selecionar a linhagem de célula transfectada, as células foram incubadas no meio sem soro comercial sem nucleosídeo. Após 2 semanas as células inicialmente adaptadas foram obtidas e as células foram continuamente adaptadas a 10 nM e 100 nM MTX, assim, garantindo linhagens de células estáveis, respectivamente.

Exemplo 4: Exemplo Experimental: experimento para confirmar a potência de expressão 4-1:Construçãodevetordeexpressãoparaexpressarproteína VEGF recombinante

[0116] Após obter genes de proteína recombinante sub-clonadas nos vetores pT7blue e pCR 2.1, este foi cortado por enzimas de restrição. Cada vetor construído no Exemplo 2 foi cortado pelas mesmas enzimas de restrição como aquela no gene de proteína recombinante e integrado em cada vetor, assim, construindo um vetor de expressão.

[0117] Para verificar a efetividade dos vetores construídos no Exemplo 2 na expressão do gene, o gene de fator de crescimento endotelial Vascular humano (VEGF) foi amplificado por PCR usando um primer senso (SEQ ID NO. 36) e um primer antissenso (SEQ ID NO. 37). Após o produto PCR ter sido tratado com as enzimas de restrição Nhe I e Xho I para garantir o gene VEGF, os vetores construídos nos Exemplos foram clivados pela mesma enzima de restrição, e o gene VEGR assegurado foi integrado nestes vetores, assim, construindo vetores de expressão. SEQ ID NO. 36: vegf-5 5'-CTA GCTAGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-3' SEQ ID NO. 37: vegf-3 5'-GAAGATCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3'

4-2:Construçãodevetordeexpressãoparaexpressarproteínade anticorpo recombinante

[0118] Para verificar a efetividade dos vetores construídos nos Exemplos na expressão de gene, um vetor de expressão para expressar gene de anticorpo anti-CD20 recombinante foi construído.

[0119] Após um gene de cadeia pesada do anticorpo recombinante foi tratado com enzimas de restrição Bgl II e Xho I, e uma cadeia leve foi tratada com as enzimas de restrição Nhe I e Xho I, respectivamente, os genes tratados foram integrados nos vetores dos Exemplos tratados com as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo vetores de expressão.

4-3:Estabelecimentodelinhagemdecélulaaderentetransfectada

[0120] Estes vetores de expressão foram introduzidos na linhagem de célula hospedeira CHO DG44. Em seguida, 2x105 células foram inoculadas em uma placa de 6 poços e cultivadas a 37°C por 24 horas no incubador 5% CO2, estes vetores de expressão (2 μg) e um minigene DHFR foram misturados em uma proporção de 100:1 e introduzido nas células CHO junto com outras por transfecção mediada por lipossoma, como lipofectamina, Dosper, ou semelhantes. Após 6 horas de introdução, o meio de cultura foi alterado em um meio de crescimento, e então a cultura de célula foi mantida por 48 horas.

[0121] A linhagem de célula transfectada foi cultivada em metotrexato sequencialmente aumentando (MTX) em uma concentração de 0nM, 10nM, e 100nM em um meio seletivo (meio MEM-α com 10% de FBS dialisado inativado por calor e sem nucleosídeo). A linhagem de célula transfectada foi inoculada em 2x105 células/poço (2 mL) em cada concentração MTX e cultivada por 4 dias, e então, o fluido de cultura foi coletado, seguido por análise de absorbância usando um kit ELISA (R&D Systems, DY293).

[0122] Os resultados obtidos por medição da taxa de expressão do VEGF usando a absorbância aos vetores pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), e pSGM(R) foram mostrados na FIG. 5.

4-4: Estabelecimento de linhagem de célula cultivada em suspensão transfectada e medição da produtividade VEGF

[0123] Estes vetores de expressão foram introduzidos na linhagem de célula hospedeira CHO DG44 adaptada para cultura em suspensão. Após as células terem sido adicionadas em um frasco em uma concentração de 5x105 células/mL e incubadas a 37°C com agitação para 24 horas na incubadora 5% CO2, os vetores de expressão VEGF e o vetor pDCH1P foram misturados com cada outro em uma proporção molar de 100:1 e introduzidos junto às células CHO por eletroporação. Após cerca de 3 dias de transfecção, o meio de cultura foi alterado em um meio seletivo, e então a cultura foi realizada novamente por 2 a 3 semanas.

[0124] A linhagem de célula transfectada foi cultivada em meio adicionado com metotrexato (MTX), e as células adaptadas em cada etapa MTX foram inoculadas em uma placa de 6 poços em 2x105 células/poço (2 mL) e cultivadas por 4 dias. Em seguida, o fluido de cultura foi coletado e analisado por absorbância usando um kit ELISA (R&D Systems, DY293).

[0125] Primeiro, a taxa de expressão do VEGF foi medida (FIG. 6) usando a absorbância com relação aos vetores pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F), e pSGM(R), e os resultados obtidos foram comparados com aqueles do Exemplo 4-3 mostrados na FIG. 5. A partir do resultado, pelo menos duas cópias de combinações MAR/SAR foram selecionadas. Uma combinação foi conduzida de modo que I(R), C(F), e M(R) foram selecionados em um promotor à montante e os elementos MAR e SAR como orientação direta e reversa foram selecionados em um sítio de terminação de transcrição à jusante.

[0126] Em seguida, a taxa de expressão do VEGF foi medida pela absorbância com relação aos vetores pI(R)SGM(F), pI(R)SGM(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGI(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGC(R), pC(F)SGM(F), pC(F)SGM(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGI(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGC(R), pC(F)C(F)SG, pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), pM(R)SGI(R), pM(R)SGM(R), e pM(R)M(R)SG usando a combinação selecionada. Como mostrado na FIG. 7, os vetores pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), e pM(R)M(R)SG tinha produtividade significativamente alta em comparação a outros vetores. Ou seja, foi conformado que no caso a combinação do elemento MAR e o elemento SAR juntos, a proteína alvo foi altamente expressa. Particularmente, o pC(F)SGM(R) teve uma taxa de expressão significativamente alta em comparação ao vetor pM(R)M(R)SG contendo dois elementos MAR. Isto indica que uma combinação do elemento MAR e o elemento SAR é mais efetivo do que o caso de incluir dois elementos MAR e proteína pode ser produzida em um nível lucrável usando esta combinação.

[0127] Novamente, a taxa de expressão do VEGF foi medido pelo método ELISA com relação aos três vetores selecionados (pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F), e pM(R)M(R)SG)) (FIG. 8). Além disso, a taxa de expresso do VEGF foi medida usando absorbância (FIG. 9) com relação ao vetor de expressão pC(F)mEGM(R) (SEQ ID NO. 35) da FIG. 2 no Exemplo 2-14 em que o promotor SV40 do mesmo foi substituído com mutante de promotor mEF1α, o vetor de expressão pM(R)mEGC(F) de FIG. 3 no Exemplo 2-14, e o vetor de expressão pM(R)M(R)mEG contendo um mapa de clivagem da FIG. 4 no Exemplo 2-14. Como um resultado, como mostrado nas FIGS. 8 e 9, após substituir promotor SV40 com o promotor mutante mEF1α, nos casos dos três vetores, a produtividade de VEGF foi aumentada em 5 vezes ou mais. Particularmente, no caso do vetor pC(F)mEGM(R), a produtividade foi aumentada em 20 vezes ou mais.

[0128] O resultado experimental como descrito acima indica que um efeito sinérgico significativo foi obtido aplicando o promotor mutante mEF1α à combinação do elemento MAR e o elemento SAR.

4-5:Mediçãodeprodutividadedeproteínadeanticorpo recombinante

[0129] Entretanto, os vetores de expressão para proteína de anticorpo recombinante foram construídos pelo método no Exemplo 4-2 com relação aos três tipos de vetores, e as linhagens de células que produzem anticorpo foram transfectados com os métodos nos Exemplos 4-4 e cultivados em meio seletivo por 2 a 3 semanas. As linhagens de células transfectadas foram inoculadas em uma placa de 6 poços a 2x105 células/poço (2 mL) e cultivadas por 6 dias, e então um fluido de cultura foi coletado, seguido por análise de uma taxa de expressão de anticorpo usando um kit ELISA (PanGen Biotech., PGK1002).

[0130] Como um resultado, como mostrado na FIG. 10, no caso de uso do promotor mutante mEF1α, a produtividade de anticorpo foi aumentada em 3 vezes ou mais em todos os três vetores, em comparação ao caso de uso do promotor SV40. Particularmente, a produtividade do vetor pC(F)mEGM(R) foi aumentado em 10 vezes ou mais.

[0131] Uma vez a produtividade medida após substituição do promotor SV40 com o promotor mutante mEF1α e sendo adaptada à uma concentração MTX de 0nM foi analisada como sendo cerca de 2 vezes maior em comparação à produtividade analisada após amplificação MTX no caso de uso do promotor SV40, o resultado como descrito acima indica que as linhagens de células de expressão alta podem ser obtidas sem realização da amplificação de MTX. Ou seja, em comparação à técnica relacionada, foi conformada que a produtividade foi melhorada em um nível industrialmente rentável ao combinar o promotor mutante mEF1α com a combinação do elemento MAR e o elemento SAR de acordo com a presente invenção.

[0132] Entretanto, na produção do anticorpo recombinante, no caso de uso da combinação do elemento MAR e o elemento SAR com mutante de promotor EF1α de camundongo, a produtividade foi significativamente melhorada em comparação ao caso de uso de 2 cópias dos elementos MAR com mutante de promotor EF1α de camundongo. Pode ser sugerido a partir deste resultado experimental que o efeito sinergístico foi obtido aplicando o mutante de promotor EF1α de camundongo à combinação do elemento MAR e o elemento SAR.

4-6: Confirmação do efeito de mutante de promotor EF1α de camundongo

[0133] Para testar o efeito de mutante de promotor EF1α de camundongo construído no Exemplo 2-12, um pMhEG no qual um promotor EF1α humano foi integrado e um pMcEG no qual um promotor EF1α de ovário de hamster chinês (CHO) foi integrado foram construídos e comprados com o promotor EF1α de camundongo e os mutantes do Exemplo 2-12.

[0134] Primeiro, o vetor pMhEG foi construído como a seguir. Um PCR foi realizado direcionado a um sítio promotor EF1α humano do vetor pEF/myc/cyto(Invitrogen) usando primers de SEQ ID NO. 38 e 39. SEQ ID NO. 38: 5'-TCG ATC GAA TTC AAG TT CGT GAG G-3' SEQ ID NO. 39: 5'-GCT AGC GTG TTC ACG ACA CCT GAA ATG-3'

[0135] Depois, o produto PCR foi tratado com enzimas de restrição Cla I e Nhe I, seguido por separação e purificação de 1% gel agarose. Então, o produto PCR purificado foi integrado no vetor pM(R)SG tratado com a mesma enzima de restrição, assim, construindo o vetor pMhEG.

[0136] Além disso, o vetor pMcEG foi construído como a seguir. A sub-cultura de células CHO DG44 (1x106) foi colocada em um microtubo e centrifugado a 3.000 rpm por 1 minuto para proteger as células, e DNA genômico de CHO foi preparado usando um kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). Então, um PCR foi realizado usando primers de SEQ ID NO. 40 e 41, assim, obtendo um promotor CHO EF1α (Genbank número de acessão AY188393). SEQ ID NO. 40: chEF1A-F 5'-TAT CGA TAG TGG AGT CAG GAA GGG TAG-3' SEQ ID NO. 41: chEF1A-R 5'-TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3'

[0137] O produto PCR foi tratado com enzimas de restrição ClaI e NheI, seguido por separação e purificação de 1% gel agarose. Então, o produto PCR purificado foi integrado no vetor pM(R)SG tratado com as mesmas enzimas de restrição, assim, construindo o vetor pMcEG.

[0138] Em seguida, anticorpos recombinantes foram produzidos usando o pM(R)SG do Exemplo 2-4 e o pMmEG e pMmEG(TA) do Exemplo 2-12, e os vetores pMhEG e pMcEG obtidos como descrito acima pelo mesmo método no Exemplo 4-5.

[0139] Como um resultado, como mostrado na FIG. 11, foi confirmado que no caso de uso de promotor EF1α de camundongo, a produtividade foi maior do que no caso de uso do promotor EF1α humano ou o promotor EF1α de CHO, e no caso de mutante de promotor EF1α de camundongo da SEQ ID No. 34, a produtividade foi significativamente melhorada em comparação ao caso de uso do promotor SV40 ou o promotor EF1α de camundongo, ou semelhantes.

Claims

1. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS compreendendo um elemento da região de ligação à matriz (MAR) ou um elemento da região de ligação estrutural (SAR) em uma extremidade 5' de um promotor e/ou uma extremidade 3' de um sítio de terminação de transcrição, dos quais todos são operacionalmente ligados dentro do vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que o promotor é um mutante de promotor EF1α de camundongo e tem uma sequência de SEQ ID NO. 34.

2. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento MAR e o elemento SAR estão localizados mutuamente adjacentes ou separados entre si por uma sequência de codificação ou não codificação.

3. VETOR DE EXPRESSÃO PARA AS CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor inclui o elemento MAR ou o elemento SAR em orientação direta ou reversa.

4. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento MAR é o elemento MAR de beta globina.

5. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento SAR é um elemento SAR CSP-B ou o elemento SAR beta interferon MAR de beta globina tendo uma sequência de acesso Genbank n°. L22754.

6. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal de poliadenilação é ligado a uma extremidade 5’ de um sítio de terminação em transcrição.

7. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene alvo, cuja expressão é regulada pelo promotor, está integrado no vetor de expressão e onde dito gene alvo está operacionalmente ligado ao promotor.

8. VETOR DE EXPRESSÃO PARA CÉLULAS ANIMAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de expressão pC(F)mEGM(R) tendo a sequência de gene de SEQ ID NO. 35.

9. MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE, caracterizadopor ser transformado com o vetor de expressão para células animais de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA ALVO, caracterizado por compreender: (a) cultivar a célula animal recombinante conforme a reivindicação 1, para expressar a proteína alvo; e (b) recuperar a proteína alvo.