ES2384391T3

ES2384391T3 - Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles

Info

Publication number: ES2384391T3
Application number: ES05810935T
Authority: ES
Inventors: Arie Pieter Otte; Henricus Johannes Maria Van Blokland; Theodorus Hendrikus Jacobus Kwaks; Richard George Antonius Bernardus Sewalt
Original assignee: Chromagenics BV
Current assignee: Chromagenics BV
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2005-11-07
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2025-11-07
Also published as: US8771984B2; NZ553700A; ATE550432T1; US20140186890A1; CN101090968B; US20110014655A1; ZA200702046B; SI1809750T1; CN101090968A; US20060172382A1; DK1809750T3

Abstract

Una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptidomarcador seleccionable capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, y ii) un polipéptido deinterés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptidomarcador seleccionable,en la quela secuencia codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3' de la secuencia codificante parael marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, yla secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia ATG en lahebra codificante tras el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio delpolipéptido de interés, y en la que la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para elpolipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en lasposiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en laque el A del codón de inicio ATG es nt +1);b) un codón de inicio GTG;c) un codón de inicio TTG;d) un codón de inicio CTG;e) un codón de inicio ATT; yf) un codón de inicio ACG.

Description

Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles

La invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a medios y métodos para mejorar la selección de células hospedantes que expresan proteínas a altos niveles.

Las proteínas pueden producirse en diversas células hospedantes para un amplio intervalo de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como productos biofarmacéuticos. Se prefieren para este fin células hospedantes eucariotas, y particularmente de mamífero, para la expresión de muchas proteínas, por ejemplo cuando dichas proteínas tienen ciertas modificaciones postraduccionales tales como glucosilación. Los métodos para dicha producción están bien establecidos, y suponen generalmente la expresión en una célula hospedante de un ácido nucleico (también denominado como “transgén”) que codifica la proteína de interés. En general, el transgén, junto con un gen marcador seleccionable, se introduce en una célula precursora, se seleccionan células para la expresión del gen marcador seleccionable, y se identifican uno o más clones que expresan la proteína de interés a altos niveles, y se usan para la expresión de la proteína de interés.

Un problema asociado a la expresión de transgenes es que es impredecible, partiendo de la alta probabilidad de que el transgén se haga inactivo debido al silenciamiento génico (McBurney et al., 2002), y por lo tanto muchos clones de células hospedantes tiene que ensayarse en busca de la expresión elevada del transgén.

Se conocen métodos para seleccionar células hospedantes recombinantes que expresan niveles relativamente elevados de proteínas deseadas.

Un método describe el uso de proteínas marcadoras seleccionables con mutaciones en su secuencia codificante que disminuyen pero no destruyen la función del marcador (por ejemplo, documento WO 01/32901). La razón fundamental es que se requieren mayores niveles de la expresión del marcador mutante cuando se emplean condiciones de selección y por lo tanto se logra la selección para la expresión elevada del marcador, seleccionando concomitantemente con eso células hospedantes que también expresan el gen de interés en niveles elevados.

Otro método hace uso de un gen marcador de selección bajo el control de una secuencia promotora que se ha mutado, de manera que el promotor tiene un nivel de actividad sustancialmente inferior a aquel de su tipo salvaje correspondiente (patente U.S. 5.627.033).

Otro método describe el uso de una secuencia marcadora seleccionable dominante alterada, tal como neomicina fosfotransferasa con una secuencia Kozak de consenso alterada, para reducir el número de colonias a identificar e incrementar los niveles de expresión de un gen de interés que está coligado al marcador seleccionable dominante (patentes US 5.648.267 y 5.733.779). En realizaciones preferidas allí, el gen de interés se coloca en un intrón (artificial) en el marcador seleccionable dominante. El gen de interés y el marcador seleccionable dominante están en casetes transcripcionales diferentes, y cada uno contiene su propio promotor eucariota en este método (patentes US 5.648.267 y 5.733.779).

Otro método describe el uso de una unidad de transcripción monocistrónica que comprende un sitio de comienzo traduccional (Kozak) no óptimo unido a un marcador seleccionable para alterar la traducción del marcador seleccionable mediante el comienzo traduccional no óptimo para identificar secuencias génicas celulares que podrían superar tal alteración permitiendo la sobreproducción del marcador seleccionable (patente US 6.107.477).

Otro método usa el principio de un gen marcador seleccionable que contienen un intrón que no se produce naturalmente en el gen seleccionable, en el que el intrón es capaz de ser empalmado en una célula hospedante para proporcionar ARNm que codifica una proteína seleccionable, y en el que el intrón en el gen seleccionable reduce el nivel de proteína seleccionable producida a partir del gen seleccionable en la célula hospedante (Patente Europea 0724639 B1).

En todavía otro método, se usan constructos de ADN que comprenden un gen seleccionable situado en un intrón definido por un sitio dador de empalme 5’ que comprende una secuencia dadora de empalme eficiente de manera que la eficiencia de empalmar un ARNm que tiene dicho sitio dador de empalme está entre alrededor de 80-99%, y un sitio aceptor de empalme 3’, y un producto génico que codifica un producto de interés en dirección 3’ del sitio afector de empalme 3’, estando el gen seleccionable y el producto génico controlados por la misma región reguladora transcripcional (patente US 5.561.053).

En ciertos métodos, se hace uso de constructos de vectores de expresión policistrónicos. Un documento previo del uso de este principio describe un vector de expresión policistrónico que contiene secuencias que codifican tanto la proteína deseada como una proteína seleccionable, secuencias codificantes las cuales están gobernadas por el mismo promotor y separadas por codones de señales de inicio y de parada traduccionales (patente US 4.965.196). En realizaciones preferidas en el documento US 4.965.196, el marcador seleccionable es el gen DHFR amplificable. En una realización particularmente preferida del sistema descrito en el documento US 4.965.196, la secuencia que codifica el marcador seleccionable está en dirección 3’ de aquella que codifica el polipéptido deseado, de manera

que los procedimientos diseñados para seleccionar las células transformadas por el marcador seleccionable también seleccionarán la producción particularmente mejorada de la proteína deseada.

En mejoras adicionales basadas en el concepto de vectores de expresión multicistrónicos, se han descrito vectores bicistrónicos para la creación rápida y eficiente de estirpes celulares de mamíferos estables que expresan proteína recombinante. Estos vectores contienen un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) entre la secuencia codificante en dirección 5’ para la proteína de interés y la secuencia codificante en dirección 3’ del marcador de selección (Rees et al, 1996). Tales vectores están comercialmente disponibles, por ejemplo el vector pIRES1 de Clontech (CLONTECHniques, octubre 1996). Usando tales vectores para la introducción en células hospedantes, la selección de suficiente expresión de la proteína marcadora en dirección 3’ selecciona entonces automáticamente niveles de transcripción elevados del ARNm multicistrónico, y por tanto se prevé una probabilidad fuertemente incrementada de expresión elevada de la proteína de interés usando tales vectores.

Preferiblemente en tales métodos, el IRES usado es un IRES que da un nivel relativamente bajo de traducción del gen marcador de selección, para mejorar además las ocasiones de seleccionar células hospedantes con un nivel de expresión elevado de la proteína de interés seleccionando la expresión de la proteína marcadora de selección (véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 03/106684).

La presente invención tiene como meta proporcionar medios y métodos mejorados para la selección de células hospedantes que expresan niveles elevados de proteínas de interés.

Sumario de la invención

La presente invención usa un concepto nuevo y único para seleccionar células hospedantes que expresan niveles elevados de polipéptidos de interés, refiriéndose el concepto aquí como “reducción interdependiente recíproca”. Es único con respecto a los enfoques de la técnica anterior por cuanto se usa un nivel extra de regulación para ajustar finamente la cantidad de productos de traducción procedentes de un transcrito multicistrónico, con lo que se reduce el nivel de traducción de un polipéptido marcador seleccionable, incrementando de ese modo el nivel de traducción del polipéptido de interés codificado en la misma unidad de transcripción multicistrónica, es decir, el nivel de expresión del polipéptido de interés depende directamente y más o menos recíprocamente del nivel de expresión del polipéptido marcador seleccionable (véase la Fig. 13 para una vista esquemática). Por el contrario, los enfoques que usan un IRES entre las secuencias codificantes para el polipéptido de interés y el polipéptido marcador seleccionable (por ejemplo Rees et al, 1996) implican la traducción independiente de ambos polipéptidos, de forma que en esos enfoques no hay un efecto directo de la eficiencia de traducción del polipéptido marcador seleccionable sobre aquella de la secuencia que codifica el polipéptido de interés.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptido marcador seleccionable capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, y ii) un polipéptido de interés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción (y un codón de inicio) separada de la del polipéptido marcador seleccionable, caracterizada porque la secuencia codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3’ de la secuencia codificante para el marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, y la secuencia que codifica el marcador seleccionable no tiene ATG en la hebra codificante después del codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio del polipéptido de interés, y caracterizada porque la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que la A del codón de inicio ATG es nt +1);

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

f) un codón de inicio ACG.

Preferiblemente, la eficiencia de la iniciación de la traducción del marcador seleccionable está disminuida.

Según la invención, la eficiencia disminuida de la iniciación de la traducción está provocada por tener una secuencia de inicio de la traducción no óptima del polipéptido marcador seleccionable.

En realizaciones preferidas de la misma, la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable comprende una secuencia ATG que define un codón de inicio, estando dicha secuencia ATG en un contexto no óptimo para el inicio de la traducción. Esto da como resultado un uso reducido de esta ATG como codón de inicio, cuando se compara con un codón de inicio ATG en el contexto óptimo.

En una realización más preferida, la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante del polipéptido marcador seleccionable comprende un codón de inicio diferente del codón de inicio ATG, tal como una de las secuencias GTG, TTG, CTG, ATT o ACG, siendo las dos primeras de éstas las más preferidas. Dichos codones de inicio no ATG están flanqueados preferiblemente por secuencias que proporcionan un reconocimiento relativamente bueno de las secuencias no ATG como codones de inicio, de manera que al menos la traducción de inicio de algunos ribosomas a partir de estos codones de inicio, es decir, la secuencia de inicio de la traducción, comprende preferiblemente la secuencia ACC[codón de inicio no ATG]G o GCC[codón de inicio no ATG]G.

Según la invención, la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia ATG en la hebra codificante tras la secuencia que codifica el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta la secuencia que codifica su codón de parada, y ninguna en ninguna de las secuencias en la misma hebra entre dicho codón de parada y el codón de inicio del polipéptido de interés (codón de inicio que se define preferiblemente por una ATG en la misma hebra codificante).

En ciertas realizaciones de la misma, cualquier secuencia ATG presente en el marco y que codifica metionina en la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable de tipo salvaje se ha mutado para que codifique valina, treonina, isoleucina o leucina.

En realizaciones preferidas, la proteína marcadora seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos letales y/o inhibidores del crecimiento de un agente de selección, tal como un antibiótico.

Preferiblemente, la secuencia codificante del polipéptido de interés comprende una secuencia de inicio de la traducción óptima.

La invención proporciona adicionalmente casetes de expresión que comprenden una molécula de ADN según la invención, casetes de expresión los cuales comprenden además un promotor en dirección 5’ de la unidad de expresión multicistrónica y siendo funcionales en una célula hospedante eucariota para el inicio de la transcripción de la unidad de expresión multicistrónica, y comprendiendo adicionalmente dichos casetes de expresión una secuencia de terminación de la transcripción en dirección 3’ de la unidad de expresión multicistrónica.

En realizaciones preferidas de los mismos, dichos casetes de expresión comprenden adicionalmente al menos un elemento de control de cromatina elegido del grupo que consiste en una región de unión a matriz o armazón (MAR/SAR), una secuencia aislante, un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) y una secuencia antirrepresora. Las más preferidas en este aspecto son secuencias antirrepresoras, y en realizaciones preferidas dichas secuencias antirrepresoras se eligen del grupo que consiste en: a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en las que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora; c) secuencias que son al menos 70% idénticas en la secuencia nucleotídica a a) o a b), en las que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora; y d) el complemento de una cualquiera de a) a c). En ciertas realizaciones preferidas, las secuencias antirrepresoras se eligen del grupo que consiste en STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), y fragmentos o derivados funcionales de estas secuencias STAR. En ciertas realizaciones, el casete de expresión comprende STAR67, o un fragmento o derivado funcional de la misma, colocada en dirección 5’ del promotor que dirige la expresión del gen multicistrónico. En ciertas realizaciones, el gen multicistrónico está flanqueado por ambos lados por al menos una secuencia antirrepresora. En ciertas realizaciones preferidas, se proporcionan casetes de expresión según la invención que comprenden en orden 5’ a 3’: secuencia antirrepresora A -secuencia antirrepresora B - [promotor - unidad de transcripción multicistrónica según la invención (que codifica la proteína marcadora seleccionable funcional y, en dirección 3’ de la misma, el polipéptido de interés) -secuencia de terminación de la transcripción] - secuencia antirrepresora C, en los que A, B y C pueden ser iguales o diferentes.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de interés es una parte de una proteína multimérica, por ejemplo una cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina.

La invención también proporciona moléculas de ADN que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido marcador seleccionable funcional, capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, caracterizado porque dicha molécula de ADN:

i) tiene una secuencia de inicio de la traducción escogida del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que la A de la secuencia de inicio ATG es nt +1);

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

f) un codón de inicio ACG, seguido de una secuencia codificante marcadora seleccionable de otro modo funcional, y

5 ii) porque la hebra codificante de la secuencia que define el polipéptido marcador seleccionable en dirección 3’ del codón de inicio no óptimo y hasta el codón de parada está desprovista de secuencias ATG.

La invención proporciona también células hospedantes que comprenden moléculas de ADN según la invención.

La invención proporciona adicionalmente métodos para generar células hospedantes que expresan un polipéptido de interés, comprendiendo el método las etapas de: introducir en una pluralidad de células hospedantes precursoras un

10 casete de expresión según la invención, cultivar las células en condiciones que seleccionan la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y seleccionar al menos una célula hospedante productora del polipéptido de interés.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para la producción de un polipéptido de interés, comprendiendo los métodos cultivar una célula hospedante, comprendiendo dicha célula hospedante un casete de

15 expresión según la invención, y expresar el polipéptido de interés a partir del casete de expresión. En realizaciones preferidas de la misma, el polipéptido de interés se aísla adicionalmente a partir de las células hospedantes y/o del medio de cultivo de células hospedantes.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción

20 multicistrónica que codifica i) un polipéptido marcador seleccionable, capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, y ii) un polipéptido de interés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido marcador seleccionable, caracterizado porque la secuencia de codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3’ de la secuencia codificante para el marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, y la secuencia que codifica el marcador seleccionable

25 no tiene ATG en la hebra codificante tras el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio del polipéptido de interés, y en la que la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que la A

30 de la secuencia de inicio ATG es nt +1);

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

35 f) un codón de inicio ACG.

Dicha molécula de ADN puede usarse según la invención para obtener células hospedantes eucariotas que expresan niveles elevados del polipéptido de interés seleccionando la expresión del polipéptido marcador seleccionable. Subsiguientemente o de forma simultánea, pueden identificarse una o más células hospedantes que expresan el polipéptido de interés, y usarse adicionalmente para la expresión de niveles elevados del polipéptido de

40 interés.

La expresión “gen monocistrónico” se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica un polipéptido. Una “unidad de transcripción multicistrónica”, también denominada como un gen multicistrónico, se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica al menos dos polipéptidos. La expresión “gen bicistrónico” se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica dos 45 polipéptidos. Por lo tanto, un gen bicistrónico está comprendido dentro de la definición de un gen multicistrónico. Un “polipéptido”, como se usa en la presente memoria, comprende al menos cinco aminoácidos ligados por enlaces peptídicos, y puede ser, por ejemplo, una proteína o una parte, tal como una subunidad, de la misma. La mayoría de veces, los términos polipéptido y proteína se usan intercambiablemente en la presente memoria. Un “gen” o una “unidad transcripcional”, como se usa en la presente invención, puede comprender ADN cromosómico, ADNc, ADN 50 artificial, combinaciones de los mismos, y similares. Las unidades de transcripción que comprenden varios cistrones se transcriben como un ARNm individual. En contraste con los enfoques usados en la técnica anterior, en las unidades de transcripción multicistrónicas de la invención, la traducción de la segunda región codificante (es decir, aquella para la proteína de interés) presente en ese ARN no depende del uso de los sitios de reinicio de la

traducción o sitios de entrada del ribosoma internos para el inicio de la traducción de la segunda región codificante, sino más bien depende de la eficiencia de la traducción de la primera región codificante (es decir, aquella para la proteína marcadora seleccionable) de una manera más o menos recíproca: cuanto mayor es el nivel de traducción del marcador seleccionable, menor es el nivel de traducción de la proteína de interés, y viceversa.

Una unidad de transcripción multicistrónica según la invención es preferiblemente una unidad de transcripción bicistrónica que codifica desde 5’ hasta 3’ un polipéptido marcador seleccionable y un polipéptido de interés. Por tanto, el polipéptido de interés está codificado en dirección 3’ desde la secuencia codificante para el polipéptido marcador seleccionable.

También es posible incluir más secuencias codificantes en la misma unidad de transcripción, en dirección 3’ del (primer) polipéptido de interés, por ejemplo que codifica un segundo polipéptido marcador seleccionable o un segundo polipéptido de interés. Tal secuencia codificante extra en dirección 3’ de la secuencia codificante para el primer polipéptido de interés está precedida entonces preferiblemente por una secuencia que codifica un sitio de reinicio de la traducción o sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), de manera que también el segundo polipéptido de interés o el segundo polipéptido marcador seleccionable es traducido, en este caso independientemente de las dos secuencias codificantes anteriores. En tal realización, es posible por ejemplo que las secuencias codificantes para subunidades de una proteína multimérica, por ejemplo una cadena pesada y una ligera de un anticuerpo, sean codificadas como un primer y segundo polipéptido de interés (en cualquier orden), para codificar subunidades de una proteína multimérica en una única unidad de expresión multicistrónica. Sin embargo, se prefiere usar unidades de transcripción separadas para la expresión de diferentes polipéptidos de interés, también cuando estos forman parte de una proteína multimérica (véase, por ejemplo, el ejemplo 13: la cadena pesada y ligera de un anticuerpo están codificadas cada una por una unidad de transcripción separada, siendo cada una de estas unidades de expresión una unidad de expresión bicistrónica según la invención).

Las moléculas de ADN de la invención pueden estar presentes en forma de ADN bicatenario, que tiene con respecto al polipéptido marcador seleccionable y el polipéptido de interés una hebra codificante y una hebra no codificante, siendo la hebra codificante la hebra con la misma secuencia que el ARN traducido, excepto por la presencia de T en lugar de U. Por tanto, un codón de inicio AUG está codificado en la hebra codificante por una secuencia ATG, y la hebra que contiene esta secuencia ATG correspondiente al codón de inicio AUG en el ARN se designa como la hebra codificante del ADN. Resultará evidente que los codones de inicio o secuencias de iniciación de la traducción están de hecho presentes en una molécula de ARN, pero que estos pueden considerarse igualmente materializados en una molécula de ADN que codifica dicha molécula de ARN; por tanto, siempre que la presente invención se refiera a un codón de inicio o secuencia de iniciación de la traducción, se pretende incluir la molécula de ADN correspondiente que tiene la misma secuencia que la molécula de ARN excepto por la presencia de una T en lugar de una U en la hebra codificante de dicha molécula de ADN, y viceversa, excepto cuando se especifique explícitamente otra cosa. En otras palabras, un codón de inicio es por ejemplo una secuencia AUG en ARN, pero la secuencia ATG correspondiente en la hebra codificante de ADN se designa igualmente como codón de inicio en la presente invención. Se usa lo mismo para la referencia de secuencias codificantes “en marco”, lo que significa tripletes (3 bases) en la molécula de ARN que se traducen a un aminoácido, pero también han de interpretarse como las secuencias trinucleotídicas correspondientes en la hebra codificante de la molécula de ADN.

El polipéptido marcador seleccionable y el polipéptido de interés codificados por el gen multicistrónico tienen cada uno su propia secuencia de iniciación de la traducción, y por lo tanto tienen cada uno su propio codón de inicio (así como codón de parada), es decir, están codificados por marcos de lectura abiertos separados.

La expresión “marcador de selección” o “marcador seleccionable” se usa típicamente para referirse a un gen y/o proteína cuya presencia puede detectarse directa o indirectamente en una célula, por ejemplo un polipéptido que inactiva un agente de selección y protege a la célula hospedante de los efectos letales o inhibidores del crecimiento del agente (por ejemplo, un gen y/o proteína de resistencia a antibiótico). Otra posibilidad es que dicho marcador de selección induzca fluorescencia o un depósito de color (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) y derivados (por ejemplo, d2EGFP), luciferasa, lacZ, fosfatasa alcalina, etc.), que puede usarse para seleccionar células que expresan el polipéptido inductor del depósito de color, por ejemplo usando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) para seleccionar células que expresan GFP. Preferiblemente, el polipéptido marcador seleccionable según la invención proporciona resistencia frente a los efectos letales y/o inhibidores del crecimiento de un agente de selección. El polipéptido marcador seleccionable está codificado por el ADN de la invención. El polipéptido marcador seleccionable según la invención debe ser funcional en una célula hospedante eucariota, y por tanto poder seleccionarse en células hospedantes eucariotas. En principio, según la presente invención, puede usarse cualquier polipéptido marcador seleccionable que cumpla este criterio. Dichos polipéptidos marcadores seleccionables son bien conocidos en la técnica y se usan rutinariamente cuando han de obtenerse clones de células hospedantes eucariotas, y se proporcionan varios ejemplos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, un marcador de selección usado para la invención es zeocina. En otras realizaciones, se usa blasticidina. El especialista en la técnica sabrá que existen y pueden usarse otros marcadores de selección, por ejemplo neomicina, puromicina, bleomicina, higromicina, etc. En otras realizaciones, se usa kanamicina. En aún otras realizaciones, se usa el gen DHFR como marcador seleccionable, que puede seleccionarse mediante metotrexato, especialmente aumentando la concentración de metotrexato pueden seleccionarse células para números aumentados de copias del gen DHFR. De forma similar, puede usarse el gen de glutamina sintetasa (GS), para el que es posible la selección

en células que tienen insuficiente GS (por ejemplo, células NS-0) cultivando en medio sin glutamina o, como alternativa, en células que tienen suficiente GS (por ejemplo, células CHO) añadiendo un inhibidor de GS, la metionina sulfoximina (MSX). En la tabla 1 de la patente de U.S. 5.561.053 se describen, por ejemplo, otros genes marcadores seleccionables que podrían usarse, y sus agentes de selección; véase también Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990), para una revisión de estos.

Cuando han de seleccionarse dos unidades de transcripción multicistrónicas según la invención en una sola célula hospedante, cada una contiene preferiblemente la secuencia codificante de un marcador seleccionable diferente, para permitir la selección de ambas unidades de transcripción multicistrónicas. Por supuesto, ambas unidades de transcripción multicistrónicas pueden estar presentes en una sola molécula de ácido nucleico o, como alternativa, cada una puede estar presente en una molécula de ácido nucleico separada.

El término “selección” se define típicamente como el proceso de usar un marcador de selección/marcador seleccionable y un agente de selección para identificar células hospedantes con propiedades genéticas específicas (por ejemplo, que la célula hospedante contenga un transgén integrado en su genoma). Resulta evidente para un especialista en la técnica que son posibles numerosas combinaciones de marcadores de selección. Un antibiótico que es particularmente ventajoso es zeocina, porque la proteína de resistencia a zeocina (zeocina-R) actúa uniéndose al fármaco y volviéndolo inofensivo. Por lo tanto, es fácil valorar la cantidad de fármaco que extermina las células con bajos niveles de expresión de zeocina-R, mientras que permite sobrevivir a las de alta expresión. Todas las demás proteínas de resistencia a antibiótico de uso común son enzimas, y de este modo actúan catalíticamente (no 1:1 con el fármaco). Por tanto, el antibiótico zeocina es un marcador de selección preferido. Sin embargo, la invención funciona también con otros marcadores de selección.

Un polipéptido marcador seleccionable según la invención es la proteína que es codificada por el ácido nucleico de la invención, polipéptido el cual puede detectarse, por ejemplo debido a que proporciona resistencia a un agente de selección tal como un antibiótico. Por tanto, cuando se usa un antibiótico como agente de selección, el ADN codifica un polipéptido que confiere resistencia al agente de selección, polipéptido el cual es el polipéptido marcador seleccionable. Se conocen las secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos marcadores seleccionables, y en la presente memoria se proporcionan varios ejemplos de secuencias de tipo salvaje de ADN que codifica proteínas marcadoras seleccionables (Fig. 26-32). Resultará evidente que los mutantes o derivados de los marcadores seleccionables pueden usarse también adecuadamente según la invención, y están por lo tanto incluidos dentro del alcance de la expresión “polipéptido marcador seleccionable”, a condición de que la proteína marcadora seleccionable todavía sea funcional. Por conveniencia, y como se acepta generalmente por los expertos, en muchas publicaciones así como en la presente memoria, a menudo el gen y la proteína que codifica resistencia a un agente de selección se designan como el “gen (de resistencia) del agente seleccionable” o la “proteína (de resistencia) del agente de selección”, respectivamente, aunque los nombres oficiales pueden ser diferentes, por ejemplo el gen que codifica la proteína que confiere resistencia a neomicina (así como a G418 y kanamicina) se designa a menudo como gen (de resistencia) de neomicina (o neor), mientras que el nombre oficial es gen de aminoglucósido 3’-fosfotransferasa.

Para la presente invención, es beneficioso tener bajos niveles de expresión del polipéptido marcador seleccionable, de modo que sea posible una selección restrictiva. En la presente invención, esto se produce usando una secuencia codificante marcadora seleccionable con una eficiencia de traducción no óptima. Tras la selección, se seleccionarán solo las células que tengan no obstante niveles suficientes de polipéptido marcador seleccionable, lo que significa que dichas células deben tener suficiente transcripción de la unidad de transcripción multicistrónica y suficiente traducción del polipéptido marcador seleccionable, lo que proporciona una selección de células en las que la unidad de transcripción multicistrónica se ha integrado o está presente de otro modo en las células hospedantes en un lugar en el que los niveles de expresión de esta unidad de transcripción son elevados. Según la invención, la naturaleza (más o menos) recíprocamente interdependiente de la traducción del polipéptido de interés de aquella de la eficiencia de la traducción del marcador asegura niveles de traducción elevados del polipéptido de interés. Este nivel elevado de traducción se superpone sobre los niveles elevados de transcripción seleccionados por las condiciones de selección restrictivas (y que resultan del uso de un fuerte promotor en las células hospedantes para conducir la transcripción de la unidad de transcripción multicistrónica).

Las moléculas de ADN según la invención tienen la secuencia codificante para el polipéptido marcador seleccionable en dirección 5’ de la secuencia codificante para el polipéptido de interés, para proporcionar un transcrito multicistrónico con traducción recíprocamente interdependiente del polipéptido de interés y el polipéptido marcador seleccionable. Por tanto, la unidad de transcripción multicistrónica comprende, en la dirección 5’ a 3’ (tanto en la hebra transcrita del ADN como en el ARN transcrito resultante) la secuencia codificante para el polipéptido marcador seleccionable y la secuencia codificante para el polipéptido de interés.

Según la invención, las regiones codificantes para el gen multicistrónico se traducen preferiblemente a partir del ORF dependiente de caperuza, y por lo tanto el polipéptido marcador seleccionable en principio también se produciría en abundancia. Para prevenir tal traducción elevada del cistrón marcador seleccionable, según la invención la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido marcador seleccionable comprende una mutación (en el marco de lectura abierto (ORF) o en las secuencias de iniciación de la traducción que preceden al ORF, o en ambos) que reduce la eficiencia de la traducción del polipéptido marcador seleccionable en una célula

hospedante eucariota. La eficiencia de traducción debería ser menor que la de la secuencia de tipo salvaje correspondiente en la misma célula, es decir, la mutación debería dar como resultado menos polipéptido por célula por unidad de tiempo, y por tanto menos polipéptido marcador seleccionable. Este se puede detectar usando métodos habituales conocidos por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, en el caso de selección con antibióticos, la mutación dará como resultado menor resistencia que la obtenida con la secuencia que no tiene tal mutación y por tanto eficiencia de traducción normal, diferencia la cual se puede detectar fácilmente determinando el número de colonias supervivientes tras un periodo de selección normal, que será menor cuando está presente una mutación que disminuye la eficiencia de la traducción. Como es bien conocido por la persona experta en la técnica, hay un número de parámetros que indican el nivel de expresión del polipéptido marcador, tales como la concentración máxima de agente de selección al que todavía son resistentes las células, el número de colonias supervivientes a una concentración dada, la velocidad de crecimiento (tiempo de doblaje) de las células en presencia de agente de selección, combinaciones de los anteriores, y similares.

Según la invención, la mutación que disminuye la eficiencia de la traducción es una mutación que disminuye la eficiencia de iniciación de la traducción. Esta se puede establecer, por ejemplo, según la presente invención, proporcionando la secuencia codificante del polipéptido marcador seleccionable con una secuencia de inicio de la traducción no óptima.

Según la invención, la eficiencia de iniciación de la traducción del gen marcador seleccionable en células eucariotas se puede disminuir adecuadamente según la invención mutando el codón de inicio y/o los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y +4 (en las que la A del codón de inicio ATG es nt +1), por ejemplo en la hebra codificante de la secuencia de ADN correspondiente, para proporcionar una secuencia de inicio de la traducción no óptima. Una secuencia de inicio de la traducción se designa a menudo en el campo como una “secuencia Kozak”, y una secuencia Kozak óptima es RCCATGG, con el codón de inicio subrayado, siendo R una purina, es decir, A o G (véanse Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002). Por tanto, además del propio codón de inicio, es relevante el contexto del mismo, en particular los nucleótidos -3 a -1 y +4, y una secuencia de inicio de la traducción óptima comprende un codón de inicio óptimo (es decir, ATG) en un contexto óptimo (es decir, el ATG precedido directamente por RCC y seguido directamente por G). Una secuencia de inicio de la traducción no óptima se define aquí como cualquier secuencia que da al menos alguna traducción detectable en una célula eucariota (detectable debido a que el polipéptido marcador de selección es detectable), y que no tiene la secuencia de consenso RCCATGG (codón de inicio subrayado). La traducción por los ribosomas comienza preferiblemente en el primer codón de inicio que encuentra cuando escanea la caperuza de 5’ del ARNm (mecanismo de escaneado), y es lo más eficaz cuando está presente una secuencia Kozak óptima (véanse Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002). Sin embargo, en un pequeño porcentaje de sucesos, se reconocen secuencias de iniciación de la traducción no óptimas y son usadas por el ribosoma para iniciar la traducción. La presente invención hace uso de este principio, y permite reducir e incluso ajustar finamente la cantidad de traducción y por tanto de la expresión del polipéptido marcador seleccionable, que puede usarse por lo tanto para aumentar la restricción del sistema de selección.

En una primera realización de la invención, el codón de inicio ATG del polipéptido marcador seleccionable (en la hebra codificante del ADN, que codifica el codón de inicio AUG correspondiente en el producto de transcripción de ARN) se deja intacto, pero las posiciones en -3 a -1 y +4 están mutadas de manera que ya no cumplen la secuencia Kozak óptima, por ejemplo proporcionando la secuencia TTTATGT como el sitio de inicio de la traducción (codón de inicio ATG subrayado). Está claro que se podrían usar otras mutaciones alrededor del codón de inicio en las posiciones -3 a -1 y/o +4 con resultados similares usando las enseñanzas de la presente invención, como se puede evaluar normal y fácilmente por la persona experta en la técnica. La idea de esta primera realización es que el codón de inicio ATG se coloca en un contexto “no óptimo” para el inicio de la traducción.

En una realización segunda y preferida, el propio codón de inicio ATG del polipéptido marcador seleccionable está mutado. Esto conducirá en general a niveles incluso menores de iniciación de la traducción que la primera realización. El codón de inicio ATG en esta segunda realización se muta a otro codón, lo que se ha informado que proporciona cierta iniciación de la traducción, por ejemplo a GTG, TTG, CTG, ATT o ACG (designados colectivamente en la presente memoria como “codones de inicio no óptimos”). En realizaciones preferidas, el codón de inicio ATG se muta a un codón de inicio GTG. Esto proporciona niveles de expresión aún menores (menor traducción) que con el codón de inicio ATG intacto, pero en un contexto no óptimo. Más preferiblemente, el codón de inicio ATG se muta a un codón de inicio TTG, que proporciona niveles de expresión aún menores del polipéptido marcador seleccionable que con el codón de inicio GTG (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002; véanse también los ejemplos 9-13 aquí).

Para la segunda realización, es decir, cuando se usa un codón de inicio no ATG, es muy preferido proporcionar un contexto óptimo para dicho codón de inicio, es decir, los codones de inicio no óptimos preferiblemente están precedidos directamente por los nucleótidos RCC en posiciones -3 a -1 y están seguidos directamente por un nucleótido G (posición +4). Sin embargo, se ha informado que usando la secuencia TTTGTGG (codón de inicio subrayado), se observa cierta iniciación al menos in vitro, así que, aunque muy preferido, puede no ser absolutamente necesario proporcionar un contexto óptimo para los codones de inicio no óptimos.

Las secuencias de ATG en la secuencia codificante para un polipéptido, pero que excluyen el codón de inicio ATG, se designan como “ATG internos”, y si estas están en marco con el ORF y codifican por lo tanto metionina, la

metionina resultante en el polipéptido se designa como “metionina interna”. Según la invención, la región codificante (después del codón de inicio, no incluyendo necesariamente el codón de inicio) que codifica el polipéptido marcador seleccionable está desprovista preferiblemente de cualquier secuencia ATG en la hebra codificante del ADN, hasta (pero sin incluir) el codón de inicio del polipéptido de interés (obviamente, el codón de inicio del polipéptido de interés puede ser, y de hecho es preferiblemente, un codón de inicio ATG). Esto se puede establecer mutando cualquiera de tal secuencia ATG en la secuencia codificante del polipéptido marcador seleccionable, tras su codón de inicio (como está claro a partir de las enseñanzas anteriores, el codón de inicio del propio polipéptido marcador seleccionable puede ser una secuencia ATG, aunque no es necesariamente así). Para este fin, preferiblemente se usa la degeneración del código genético para evitar mutar siempre que sea posible aminoácidos en el polipéptido marcador seleccionable. Por tanto, siempre que esté presente una ATG en la hebra codificante de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido marcador seleccionable, ATG la cual no está en marco con el ORF del polipéptido marcador seleccionable, y por lo tanto no codifica una metionina interna en el polipéptido marcador seleccionable, la ATG se puede mutar de manera que el polipéptido resultante no tenga mutaciones en su secuencia de aminoácidos interna. Cuando la ATG es un codón en marco que codifica una metionina interna, el codón se puede mutar, y el polipéptido mutado resultante se puede comprobar normalmente para determinar la actividad del polipéptido marcador seleccionable. De esta manera, se puede escoger una mutación que conduzca a un polipéptido marcador seleccionable mutado que todavía es activo como tal (pueden existir diferencias cuantitativas, pero aquellas son menos relevantes, y de hecho incluso podría ser beneficioso tener menos variantes activas para los fines de la presente invención; el requisito mínimo es que el polipéptido marcador seleccionable todavía pueda ser seleccionado en células eucariotas). Los aminoácidos valina, treonina, isoleucina y leucina son estructuralmente similares a metionina, y por lo tanto los codones que codifican uno de estos aminoácidos son buenos candidatos de partida para ser ensayados en lugar de metionina en la secuencia codificante después del codón de inicio. Por supuesto, usando las enseñanzas de la presente invención, el experto en la técnica puede ensayar igualmente otros aminoácidos en lugar de metioninas internas, usando técnicas de biología molecular habituales para mutar el ADN codificante, y ensayos habituales para determinar la funcionalidad del polipéptido marcador seleccionable. Además de técnicas de biología molecular habituales para mutar el ADN, actualmente también es posible sintetizar a voluntad (si se requiere usando etapas de subclonación) secuencias de ADN que tienen una longitud suficiente para un ORF de un polipéptido marcador seleccionable, y tales secuencias de ADN sintéticas en la actualidad pueden pedirse comercialmente de diversas compañías. Por tanto, usando las enseñanzas de la presente invención, el experto en la técnica puede diseñar secuencias apropiadas según la invención que codifican un polipéptido marcador seleccionable (con una mutación que disminuye el inicio de la traducción, y preferiblemente que no tienen secuencias ATG internas), hacer que se sintetice esta secuencia, y someter a ensayo la molécula de ADN para determinar la funcionalidad del marcador seleccionable codificado introduciendo la molécula de ADN en células hospedantes eucariotas y someter a ensayo para determinar la expresión del polipéptido marcador seleccionable funcional. La disponibilidad comercial de tales secuencias también hace factible proporcionar sin demasiado problema secuencias codificantes marcadoras de selección que carecen de secuencias ATG internas, en las que la secuencia codificante de tipo salvaje del polipéptido marcador de selección comprende varias secuencias ATG internas de este tipo.

Proporcionando una secuencia codificante para un polipéptido marcador seleccionable que carece de cualquier secuencia ATG interna, se reducen las ocasiones del inicio inadvertido de la traducción por ribosomas que pasan la (primera) secuencia (no óptima) de inicio de la traducción del polipéptido marcador seleccionable en un trinucleótido ATG interno, de manera que los ribosomas continuarán barriendo la primera secuencia de inicio de la traducción óptima, es decir, la del polipéptido de interés.

Estará claro que no se requiere necesariamente de forma estricta eliminar todas las secuencias ATG internas de la secuencia codificante del marcador seleccionable, en tanto que la inmensa mayoría de ribosomas no usarán tales secuencias ATG internas como un sitio de inicio de la traducción, por ejemplo debido a que tales ATG internas habitualmente no están en un contexto óptimo para el inicio de la traducción. Sin embargo, también a la vista del hecho de que incluso una secuencia ATG en un contexto no óptimo da lugar a sucesos de inicio de la traducción significativos (en general mucho mayores que a partir de un codón de inicio no ATG en un contexto óptimo), también está claro que si están presentes varias secuencias ATG internas en la región codificante del marcador seleccionable, cada una de éstas puede sustraer una fracción de ribosomas que comienzan la traducción de esas ATG, evitando que alcance la unidad de traducción en dirección 3’ que codifica el polipéptido de interés, y por tanto da como resultado menor expresión del polipéptido de interés. Esta es la razón por la que se prefiere tener una secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable, secuencia la cual está libre de secuencias ATG internas. Posiblemente, si se desea, la relación de ribosomas que traducen el polipéptido de interés puede incluso potenciarse adicionalmente mutando cualesquiera sitios de inicio de la traducción potenciales no óptimos en la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable.

Claramente, cualquier secuencia presente en la hebra codificante entre el codón de parada del marcador seleccionable y el codón de inicio del polipéptido de interés se puede diseñar de manera que no comprenda secuencias ATG, u otros codones de inicio de la traducción potenciales no óptimos.

Claramente, se prefiere enormemente según la presente invención que la secuencia de inicio de la traducción del polipéptido de interés comprenda una secuencia de inicio de la traducción óptima, es decir, que tenga la secuencia

de consenso RCCATGG (codón de inicio subrayado). Esto dará como resultado una traducción muy eficiente del polipéptido de interés.

Como consecuencia de estas medidas, se proporciona el mecanismo de traducción recíprocamente interdependiente de la invención: los ribosomas barren desde la caperuza del ARNm que contiene la unidad de 5 transcripción multicistrónica, y un pequeño porcentaje de ribosomas traducirá el primer marco de lectura abierto, es decir, la proteína marcadora seleccionable, debido a que se proporciona con una mutación que disminuye la eficiencia de la traducción, mientras que la inmensa mayoría de los ribosomas pasarán este marco de lectura abierto y comenzarán la traducción en el sitio de inicio de la traducción óptimo del polipéptido de interés, dando como resultado niveles bajos de proteína marcadora seleccionable y niveles elevados de polipéptido de interés. 10 Proporcionando la secuencia codificante del marcador con diferentes mutaciones que conducen a varios niveles de eficiencia reducida de la traducción, se incrementa la restricción de la selección y aumentan recíprocamente los niveles de expresión del polipéptido de interés, de manera que es posible el ajuste fino: por ejemplo usando un codón de inicio TTG para el polipéptido marcador de selección, sólo muy pocos ribosomas traducirán a partir de este codón de inicio, dando como resultado niveles muy bajos de proteína marcadora seleccionable, y por tanto una

15 elevada restricción de selección, y al mismo tiempo casi todos los ribosomas traducirán el polipéptido de interés.

Se demuestra aquí que esto se puede usar en un sistema de selección muy robusto, conduciendo a un porcentaje muy grande de clones que expresan el polipéptido de interés a niveles elevados, según se desee. Además, los niveles de expresión obtenidos para el polipéptido de interés parecen ser significativamente mayores que los obtenidos cuando se criba un número aún mayor de colonias usando los sistemas de selección conocidos hasta

20 ahora.

Además de una eficiencia reducida de la iniciación de la traducción, podría ser beneficioso proporcionar también una eficiencia reducida del alargamiento de la traducción del polipéptido marcador seleccionable, por ejemplo mutando la secuencia codificante del mismo de modo que comprenda varios codones no preferidos de la célula hospedante, para reducir adicionalmente los niveles de traducción del polipéptido marcador y permitir condiciones de selección 25 aún más rigurosas, si se desea. En ciertas realizaciones, además de la mutación o mutaciones que reducen la eficiencia de la traducción según la invención, el polipéptido marcador seleccionable comprende adicionalmente una mutación que reduce la actividad del polipéptido marcador seleccionable en comparación con su contrapartida de tipo salvaje. Estoo puede usarse para aumentar la restricción de la selección más aún. Como ejemplos no limitantes, puede mutarse la prolina en posición 9 en el polipéptido de resistencia a zeocina, por ejemplo, a Thr o Phe, y para el

30 polipéptido de resistencia a neomicina, pueden mutarse adicionalmente el resto de aminoácido 182 ó 261 o ambos (véase, por ejemplo, el documento WO 01/32901).

En algunas realizaciones de la invención, se coloca una secuencia denominada espaciadora en dirección 3’ de la secuencia que codifica el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable, secuencia espaciadora la cual es preferiblemente una secuencia en marco con el codón de inicio y que codifica unos pocos aminoácidos, y que no

35 contiene una estructura secundaria (Kozak, 1990), y no contiene la secuencia ATG. Dicha secuencia espaciadora puede usarse para reducir adicionalmente la frecuencia de iniciación de la traducción si está presente una estructura secundaria en el ARN (Kozak, 1990) del polipéptido marcador seleccionable (por ejemplo, para zeocina, posiblemente de blasticidina), y por tanto aumentar el rigor del sistema de selección según la invención.

La invención también proporciona una molécula de ADN que comprende la secuencia que codifica una proteína 40 marcadora seleccionable funcional según la invención, molécula de ADN la cual:

45 b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

f) un codón de inicio ACG, seguido de una secuencia codificante marcadora seleccionable de otro 50 modo funcional, y

ii) porque la hebra codificante de la secuencia que define el polipéptido marcador seleccionable en dirección 3’ del codón de inicio no óptimo y hasta el codón de parada está desprovista de secuencias ATG. Tales moléculas de ADN engloban un producto intermedio útil según la invención. Estas moléculas se pueden preparar primero, se pueden introducir en células hospedantes eucariotas y se pueden ensayar para 55 determinar la funcionalidad (para algunos marcadores esto es posible incluso en células hospedantes

procariotas), si se desea de manera (semi)cuantitativa, del polipéptido marcador seleccionable. Entonces pueden usarse adicionalmente para preparar una molécula de ADN según la invención, que comprende la unidad de transcripción multicistrónica.

Es un aspecto preferido de la invención proporcionar un casete de expresión que comprende la molécula de ADN según la invención, que tiene la unidad de transcripción multicistrónica. Dicho casete de expresión es útil para expresar secuencias de interés, por ejemplo en células hospedantes. Un “casete de expresión”, como se usa en la presente memoria, es una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un promotor ligado funcionalmente a una secuencia de la que se desea la expresión. Preferiblemente, un casete de expresión contiene adicionalmente secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Pueden incluirse también otras secuencias reguladoras tales como potenciadores. Por tanto, la invención proporciona un casete de expresión que comprende en el siguiente orden: 5’- promotor - unidad de transcripción multicistrónica según la invención, que codifica un polipéptido marcador seleccionable y en dirección 3’ de la misma un polipéptido de interés - secuencia de terminación de la transcripción - 3’. El promotor debe ser capaz de funcionar en una célula hospedante eucariota, es decir, debe ser capaz de dirigir la transcripción de la unidad de transcripción multicistrónica. El casete de expresión puede contener opcionalmente otros elementos conocidos en la técnica, por ejemplo sitios de corte y empalme para comprender intrones, y similares. En algunas realizaciones, está presente un intrón detrás del promotor y antes de la secuencia que codifica el polipéptido de interés.

Para obtener la expresión de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteína, es bien conocido por los expertos en la técnica que las secuencias capaces de dirigir dicha expresión pueden estar ligadas funcionalmente con las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína, dando como resultado moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que codifican una proteína en formato expresable. En la presente invención, el casete de expresión comprende una unidad de transcripción multicistrónica. En general, la secuencia promotora se coloca en dirección 5’ de las secuencias que deberían expresarse. Están disponibles en la técnica vectores de expresión muy usados, por ejemplo, la serie de vectores pcDNA y pEF de Invitrogen, pMSCV y pTK-Hyg de BD Sciences, pCMV-Script de Stratagene, etc., que pueden usarse para obtener secuencias promotoras y/o terminadoras de la transcripción adecuadas, secuencias de poliA, y similares.

Cuando la secuencia que codifica el polipéptido de interés se inserta apropiadamente con referencia a las secuencias que gobiernan la transcripción y traducción del polipéptido codificado, el casete de expresión resultante es útil para producir el polipéptido de interés, designado como expresión. Las secuencias que dirigen la expresión pueden incluir promotores, potenciadores y similares, y combinaciones de los mismos. Estos deberían ser capaces de funcionar en la célula hospedante, dirigiendo de ese modo la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos que están ligadas funcionalmente a ellos. La persona experta en la técnica es consciente de que pueden usarse diversos promotores para obtener la expresión de un gen en células hospedantes. Los promotores pueden ser constitutivos o regulados, y pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo virus, fuentes procariotas o eucariotas, o pueden diseñarse artificialmente. La expresión de los ácidos nucleicos de interés puede ser a partir del promotor natural o un derivado del mismo, o a partir de un promotor enteramente heterólogo (Kaufman, 2000). Algunos promotores bien conocidos y muy usados para la expresión en células eucariotas comprenden promotores derivados de virus, tales como adenovirus, por ejemplo el promotor E1A, promotores derivados de citomegalovirus (CMV), tales como el promotor inmediato temprano (IE) de CMV (designado en la presente memoria como el promotor de CMV) (obtenible, por ejemplo, a partir de pcDNA, Invitrogen), promotores derivados del Virus del Simio 40 (SV40) (Das et al, 1985), y similares. Los promotores adecuados también se pueden derivar de células eucariotas, tales como promotores de metalotioneína (MT), el promotor del factor 1! de alargamiento (EF-1!) (Gill et al., 2001), el promotor de ubiquitina C o UB6 (Gill et al., 2001; Schorpp et al, 1996), el promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, promotores del choque término, y similares. Algunos promotores preferidos para obtener la expresión en células eucariotas, que son promotores adecuados en la presente invención, son el promotor de CMV, un promotor de EF1-alfa de mamífero, un promotor de ubiquitina de mamífero tal como un promotor de ubiquitina C, o un promotor de SV40 (por ejemplo, obtenible de pIRES, nº de cat. 631605, BD Sciences). El ensayo de la función del promotor y la fortaleza de un promotor es una cuestión de rutina para una persona experta en la técnica, y en general puede comprender, por ejemplo, clonar un gen de ensayo, tal como lacZ, luciferasa, GFP, etc., detrás de la secuencia promotora, y ensayar la expresión del gen de ensayo. Por supuesto, los promotores se pueden alterar por supresión, adición, mutación de las secuencias allí, y se pueden ensayar para determinar la funcionalidad, para encontrar secuencias promotoras nuevas, atenuadas, o mejoradas. Según la presente invención, se prefieren promotores fuertes que dan niveles elevados de transcripción en las células eucariotas de elección.

En ciertas realizaciones, una molécula de ADN según la invención es parte de un vector, por ejemplo un plásmido. Dichos vectores pueden manipularse fácilmente mediante métodos bien conocidos por la persona experta en la técnica, y pueden diseñarse, por ejemplo, para que sean capaces de replicarse en células procariotas y/o eucariotas. Además, muchos vectores pueden usarse directamente o en forma de un fragmento deseado aislado a partir del mismo para la transformación de células eucariotas, y se integrarán en todo o en parte en el genoma de dichas células, dando como resultado células hospedantes estables que comprenden el ácido nucleico deseado en su genoma.

Los sistemas de expresión convencionales son moléculas de ADN en forma de un plásmido recombinante o un genoma vírico recombinante. El plásmido o el genoma vírico se introduce en células (hospedantes eucariotas) y preferiblemente se integra en sus genomas mediante métodos conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, la presente invención también usa estos tipos de moléculas de ADN para suministrar su sistema de expresión transgénico mejorado. Una realización preferida de la invención es el uso de ADN plasmídico para suministrar el sistema de expresión. Un plásmido contiene un número de componentes: los componentes convencionales, conocidos en la técnica, son un origen de replicación y un marcador seleccionable para la propagación del plásmido en células bacterianas; un marcador seleccionable que funciona en células eucariotas para identificar y aislar células hospedantes que poseen un sistema de expresión transgénico integrado; la proteína de interés, cuya transcripción a alto nivel es provocada por un promotor que es funcional en células eucariotas (por ejemplo el promotor/potenciador temprano inmediato principal de citomegalovirus humano, pCMV (Boshart et al., 1985); y terminadores transcripcionales víricos (por ejemplo el sitio de poliadenilación de SV40 (Kaufman y Sharp, 1982) para el transgén de interés y el marcador seleccionable.

El vector usado puede ser cualquier vector que sea adecuado para clonar ADN y que puede usarse para la transcripción de un ácido nucleico de interés. Cuando se usan células hospedantes, se prefiere que el vector sea un vector de integración. Alternativamente, el vector puede ser un vector que se replica episómicamente.

Es ampliamente apreciado que la estructura de cromatina y otros mecanismos de control epigenéticos pueden influir en la expresión de transgenes en células eucariotas (por ejemplo, Whitelaw et al., 2001). Las unidades de expresión muticistrónicas según la invención forman parte de un sistema de selección con un régimen de selección más bien riguroso. Esto requiere generalmente niveles elevados de transcripción en las células hospedantes de elección. Para aumentar la oportunidad de encontrar clones de células hospedantes que sobrevivan al régimen de selección riguroso, y posiblemente para aumentar la estabilidad de la expresión en los clones obtenidos, será preferible generalmente aumentar la predecibilidad de la transcripción. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, un casete de expresión según la invención comprende adicionalmente al menos un elemento de control de cromatina. Un “elemento de control de cromatina”, como se usa en la presente memoria, es un término colectivo para secuencias de ADN que pueden tener de algún modo un efecto sobre la estructura de cromatina y con ello sobre el nivel de expresión y/o estabilidad de la expresión de los transgenes en su vecindad (funcionan “en cis”, y por tanto se colocan preferiblemente a 5 kb, más preferiblemente a 2 kb, aún más preferiblemente a 1 kb del transgén) en células eucariotas. Dichos elementos se han usado algunas veces para aumentar el número de clones que tienen los niveles deseados de expresión transgénica. Los mecanismos mediante los cuales estos elementos funcionan pueden diferir para e incluso en diferentes clases de tales elementos, y no son completamente conocidos para todos los tipos de dichos elementos. Sin embargo, tales elementos se han descrito, y para los fines de la presente invención se eligen elementos de control de cromatina del grupo que consiste en regiones de unión a matriz o armazón (MARs/SARs) (por ejemplo, Phi-Van et al, 1990; documentos WO 02/074969, WO 2005/040377), aislantes (West et al, 2002), tales como el elemento aislante de beta-globina (5’ HS4 del locus de beta-globina de pollo), scs, scs’ y similares (por ejemplo, Chung et al, 1993, 1997; Kellum y Schedl, 1991; documentos WO 94/23046, WO 96/04390, WO 01/02553, WO 2004/027072), un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) (documentos WO 00/05393, WO 02/24930, WO 02/099089, WO 02/099070), y secuencias antirrepresoras (también designadas como secuencias “STAR”) (Kwaks et al, 2003; documento WO 03/004704). Los ejemplos no limitantes de secuencias MAR/SAR que se podrían usar en la actual invención son 5’ MAR de lisozima de pollo (Phi-Van et al, 1990) o sus fragmentos, por ejemplo las regiones B, K, y F, como se describe en el documento WO 02/074969); secuencias de ADN que comprenden al menos un elemento de ADN doblado y al menos un sitio de unión para una proteína de unión a ADN, preferiblemente que contiene al menos 10% de dinucleótido TA, y/o al menos 12% de dinucleótido AT en un tramo de 100 pares de bases contiguas, tal como una secuencia seleccionada del grupo que comprende las secuencias SEQ ID Nos 1 a 27 en el documento WO 2005/040377, teniendo los fragmentos de una cualquiera de las SEQ ID Nos 1 a 27 en el documento WO 2005/040377 una longitud de al menos 100 nucleótidos y que tienen actividad MAR, secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a una cualquiera de SEQ ID Nos 1 a 27 en el documento WO 2005/040377 o sus fragmentos y que tienen actividad MAR, en el que la actividad MAR se define como siendo capaz de unirse a matrices/armazones nucleares in vitro y/o de alterar la expresión de secuencias codificantes ligadas operablemente a un promotor; secuencias escogidas de una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 5 en el documento WO 02/074969, fragmentos de una cualquiera de una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 5 en el documento WO 02/074969 y que tienen actividad MAR, secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 5 en el documento WO 02/074969 o sus fragmentos y que tienen actividad MAR; secuencias escogidas de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2004/027072, sus fragmentos funcionales y secuencias que son al menos 70% idénticas a ellas. Un ejemplo no limitante de secuencias aislantes que se podrían usar en la presente invención es una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1 del documento WO 01/02553. Los ejemplos no limitantes de UCOEs que se podrían usar en la presente invención son secuencias representadas en las Figuras 2 y 7 del documento WO 02/24930, sus fragmentos funcionales y secuencias que son al menos 70% idénticas a ellas mientras que todavía retienen actividad, secuencias que comprenden SEQ ID NO: 28 del documento US 2005/181428, sus fragmentos funcionales y secuencias que son al menos 70% idénticas a ellas mientras todavía retienen actividad.

Preferiblemente, dicho elemento de control de cromatina es una secuencia antirrepresora, preferiblemente elegida del grupo que consiste en: a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera

de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en el que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora (“fragmentos funcionales”); c) secuencias que son al menos 70% idénticas en la secuencia nucleotídica a a) o a b), en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora (“derivados funcionales”); y d) el complemento de una cualquiera de a) a c). Preferiblemente, dicho elemento de control de cromatina se elige del grupo que consiste en STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR 17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), o un fragmento funcional o derivado de dichas secuencias STAR. En una realización particularmente preferida, dicha secuencia STAR es STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), o un fragmento funcional o derivado de la misma. En ciertas realizaciones preferidas, STAR67 o un fragmento funcional o derivado de la misma está situado en dirección 5’ de un promotor que dirige la expresión de la unidad de transcripción multicistrónica. En otras realizaciones preferidas, los casetes de expresión según la invención están flanqueados en ambos lados por al menos una secuencia antirrepresora.

Las secuencias que tienen actividad antirrepresora como se usa aquí son secuencias que son capaces de contrarrestar al menos en parte el efecto represor de proteínas HP1 o HPC2 cuando estas proteínas se unen a ADN. Las secuencias que tienen actividad antirrepresora (algunas veces también denominadas como secuencias antirrepresoras o elementos antirrepresores aquí) adecuadas para la presente invención se han descrito en el documento WO 03/004704, y se acuñaron allí como secuencias “STAR” (siempre que una secuencia se cite como una secuencia STAR aquí, esta secuencia tiene actividad antirrepresora según la invención). Como ejemplo no limitante, las secuencias de 66 elementos antirrepresores, denominadas STAR1-65 (véase el documento WO 03/004704) y STAR 67, se presentan aquí como SEQ. ID. NOs. 1-65 y 66, respectivamente.

Según la invención, un fragmento funcional o derivado de un elemento antirrepresor dado se considera equivalente a dicho elemento antirrepresor cuando todavía tiene actividad antirrepresora. La presencia de tal actividad antirrepresora se puede comprobar fácilmente por la persona experta en la técnica, por ejemplo mediante el ensayo descrito más abajo. Los fragmentos funcionales o derivados se pueden obtener fácilmente por una persona experta en la técnica de biología molecular partiendo de una secuencia antirrepresora dada, y realizando supresiones, adiciones, sustituciones, inversiones y similares (véase, por ejemplo, el documento WO 03/004704). Un fragmento funcional o derivado también comprende ortólogos de otras especies, que se pueden encontrar usando las secuencias antirrepresoras conocidas mediante métodos conocidos por la persona experta en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 03/004704). Por tanto, la presente invención engloba fragmentos de las secuencias antirrepresoras, en el que dichos fragmentos todavía tienen actividad antirrepresora. La invención también engloba secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a dichas secuencias que tienen actividad antirrepresora, o a fragmentos funcionales de las mismas que tienen actividad antirrepresora, en tanto que estas secuencias que son al menos 70% idénticas tengan todavía la actividad antirrepresora según la invención. Preferiblemente, dichas secuencias son al menos 80% idénticas, más preferiblemente al menos 90% idénticas, y todavía más preferiblemente al menos 95% idénticas a la secuencia nativa de referencia o su fragmento funcional. Para fragmentos de una secuencia dada, el porcentaje de identidad se refiere a aquella porción de la secuencia nativa de referencia que se encuentra en el fragmento.

Las secuencias que tienen actividad antirrepresora según la invención se pueden obtener por diversos métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, la clonación a partir del genoma humano o a partir del genoma de otro organismo, o, por ejemplo, amplificando secuencias antirrepresoras conocidas directamente a partir de tal genoma usando el conocimiento de las secuencias, por ejemplo mediante PCR, o se pueden sintetizar químicamente en parte o completamente.

Las secuencias que tienen actividad antirrepresora, y sus fragmentos funcionales o derivados, se definen estructuralmente aquí por su secuencia, y además se definen funcionalmente como secuencias que tienen actividad antirrepresora, que se puede determinar con el ensayo descrito más abajo.

Cualquier secuencia que tenga actividad antirrepresora según la presente invención debería ser al menos capaz de sobrevivir al siguiente ensayo funcional (véase el documento WO 03/004704, ejemplo 1).

Células U-2 OS humanas (ATCC HTB-96) se transfectan de forma estable con el plásmido pTet-Off (Clontech K1620-A) y con ácido nucleico que codifica una proteína de fusión LexA-represor que contiene el dominio de unión a ADN LexA y la región codificante de HP1 o HPC2 (proteínas del grupo Polycomb de Drosophila que reprimen la expresión génica cuando se unen a ADN; el ensayo funciona con cualquier proteína de fusión) bajo el control del sistema regulador transcripconal Tet-Off (Gossen y Bujard, 1992). Estas células se denominan más abajo como las células informadoras para el ensayo de actividad antirrepresora. Un plásmido informador, que proporciona resistencia a higromicina, contiene una secuencia poliligadora situada entre cuatro sitios del operador LexA y el promotor de SV40 que controla el gen de resistencia a zeocina. La secuencia a ensayar en busca de la actividad antirrepresora se puede clonar en dicho poliligador. La construcción de un plásmido informador adecuado, tal como pSelect, se describe en el ejemplo 1 y en la Fig. 1 del documento WO 00/004704. El plásmido informador se transfecta en las células informadoras, y las células se cultivan bajo selección con higromicina (25 ∀g/ml; selección en busca de la presencia del plásmido informador) y represión con tetraciclina (doxiciclina, 10 ∀g/ml; evita la expresión de la proteína de fusión LexA-represor). Después de 1 semana de crecimiento en estas condiciones, la concentración de doxiciclina se reduce hasta 0,1 ng/ml para inducir el gen de LexA, y después de 2 días se añade

zeocina hasta 250 ∀g/ml. Las células se cultivan durante 5 semanas, hasta que los cultivos de control (transfectados con plásmido informador vacío, es decir, que carece de una secuencia antirrepresora clonada en el poliligador) son exterminados por la zeocina (en este plásmido de control, el promotor de SV40 está representado por la proteína de fusión LexA-represor que está unida a los sitios de operación de LexA, dando como resultado una expresión insuficiente de zeocina en tales células para sobrevivir a la selección con zeocina). Una secuencia tiene actividad antirrepresora según la presente invención si, cuando dicha secuencia es clonada en el poliligador del plásmido informador, las células informadoras sobreviven la selección de 5 semanas bajo zeocina. Las células procedentes de tales colonias todavía se pueden propagar sobre nuevo medio que contiene zeocina después de la selección con zeocina durante 5 semanas, mientras que las células transfectadas con plásmidos informadores que carecen de secuencias antirrepresoras no se pueden propagar sobre nuevo medio que contiene zeocina. Cualquier secuencia no capaz de conferir tal crecimiento después de 5 semanas en zeocina en este ensayo no sirve como secuencia que tiene actividad antirrepresora, o fragmento funcional o derivado funcional de la misma según la presente invención. Como ejemplo, otros elementos de control de cromatina conocidos, tales como los ensayados por Van der Vlag et al (2000), incluyendo scs de Drosophila (Kellum y Schedl, 1991), 5’-HS4 del locus de #-globina de pollo (Chung et al, 1993, 1997) o Regiones de Adhesión de la Matriz (MARs) (Phi-Van et al.1990), no sobreviven a este ensayo.

Además, se prefiere que la secuencia antirrepresora o su fragmento funcional o derivado confiera una mayor proporción de clones que sobreexpresan el informador cuando flanquea a un gen informador (por ejemplo luciferasa, GFP) que se integra en el genoma de células U-2 OS o CHO, en comparación a cuando dicho gen informador no está flanqueado por secuencias antirrepresoras, o flanqueado por secuencias que bloquean la represión más débiles, tales como scs de Drosophila. Esto se puede verificar usando, por ejemplo, el vector pSDH, o vectores similares, como se describe en el ejemplo 1 y en la Fig. 2 del documento WO 03/004704. Los elementos antirrepresores pueden tener al menos una de tres consecuencias para la producción de proteína: (1) incrementan la predicibilidad de identificar líneas de células hospedantes que expresan una proteína a niveles industrialmente aceptables (proporciona la capacidad de hematocromatina adyacente para silenciar el transgén, de manera que la posición de integración tiene un efecto menos pronunciado sobre la expresión); (2) dan como resultado líneas de células hospedantes con mayores rendimientos proteicos; y/o (3) dan como resultado líneas de células hospedantes que presentan una producción proteica más estable durante un cultivo prolongado.

Cualquier secuencia STAR se puede usar en los casetes de expresión según la presente invención, pero las siguientes secuencias STAR son particularmente útiles: STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR 17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), o fragmentos funcionales o derivados de estas secuencias STAR.

En ciertas realizaciones, dicha secuencia antirrepresora, preferiblemente STAR67, se coloca en dirección 5’ de dicho promotor, preferiblemente de manera que hay menos de 2kb entre el extremo 3’ de la secuencia antirrepresora y el inicio de la secuencia promotora. En realizaciones preferidas, hay menos de 1kb, más preferiblemente menos de 500 nucleótidos (nt), todavía más preferiblemente menos de alrededor de 200, 100, 50, o 30 nt, entre el extremo 3’ de la secuencia antirrepresora y el inicio de la secuencia promotora. En ciertas realizaciones preferidas, la secuencia antirrepresora se clona directamente en dirección 5’ del promotor, dando como resultado sólo alrededor de 0-20 nt entre el extremo 3’ de la secuencia antirrepresora y el inicio de la secuencia promotora.

Para la producción de proteínas multiméricas, pueden usarse dos o más casetes de expresión. Preferiblemente, ambos casetes de expresión son casetes de expresión multicistrónicos según la invención, codificando cada uno una proteína marcadora seleccionable diferente, de modo que es posible la selección de ambos casetes de expresión. Esta realización ha demostrado dar buenos resultados, por ejemplo para la expresión de la cadena pesada y ligera de anticuerpos. Resultará evidente que ambos casetes de expresión pueden colocarse en una molécula de ácido nucleico, o los dos pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico separada, antes de introducirlos en células hospedantes. Una ventaja de colocarlos en una molécula de ácido nucleico es que los dos casetes de expresión están presentes a una relación predeterminada única (por ejemplo, 1:1) cuando se introducen en células hospedantes. Por otro lado, cuando están presentes en dos moléculas de ácido nucleico diferentes, esto permite la posibilidad de variar la relación molar de los dos casetes de expresión cuando se introducen en células hospedantes, lo que puede ser una ventaja si la relación molar preferida es diferente de 1:1 o cuando es desconocido previamente cuál es la relación molar preferida, de modo que pueda efectuarse fácilmente por el experto en la técnica la variación de la misma y encontrar empíricamente la óptima. Según la invención, preferiblemente al menos uno de los casetes de expresión, pero más preferiblemente cada uno de ellos, comprende un elemento de control de cromatina, más preferiblemente una secuencia antirrepresora.

En otra realización, las diferentes subunidades o partes de una proteína multimérica están presentes en un solo casete de expresión.

En lugar de o además de la presencia de una secuencia STAR colocada en dirección 5’ de un promotor en un casete de expresión, se ha demostrado muy beneficioso proporcionar una secuencia STAR en ambos lados de un casete de expresión, de manera que el casete de expresión que comprende el transgén esté flanqueado por dos secuencias STAR, que en ciertas realizaciones son esencialmente idénticas entre sí.

Se muestra aquí que la combinación del primer elemento antirrepresor en dirección 5’ de un promotor y que flanquea el casete de expresión por otras dos secuencias antirrepresoras proporciona resultados superiores.

Ya que al menos algunas secuencias antirrepresoras pueden ser direccionales (documento WO 00/004704), las secuencias antirrepresoras que flanquean el casete de expresión (antirrepresor A y B) se pueden colocar beneficiosamente en dirección opuesta una con respecto a la otra, de manera que el extremo 3’ de cada una de estas secuencias antirrepresoras mira hacia el casete de expresión (y entre sí). Por tanto, en realizaciones preferidas, el lado 5’ de un elemento antirrepresor encara el ADN/cromatina del cual se ha de disminuir la influencia sobre el transgén por dicho elemento antirrepresor. Para una secuencia antirrepresora en dirección 5’ de un promotor en un casete de expresión, el extremo 3’ mira hacia el promotor. Las secuencias de los elementos antirrepresores en el listado de secuencias (SEQ. ID. NOs. 1-66) se dan en la dirección 5’ a 3’, excepto que se indique de otro modo.

En ciertas realizaciones, se proporcionan unidades de transcripción o casetes de expresión según la invención, que comprenden además: a) una secuencia de pausa de la transcripción (TRAP) en dirección 5’ del promotor que dirige la transcripción de la unidad de transcripción multicistrónica, estando dicha TRAP en una dirección 5’ a 3’; o b) una secuencia TRAP en dirección 3’ de dicho marco de lectura abierto del polipéptido de interés y preferiblemente en dirección 3’ de la secuencia de terminación de la transcripción de dicha unidad de transcripción multicistrónica, estando dicha TRAP en una dirección 3’ a 5’; o c) tanto a) como b); en el que una secuencia TRAP se define funcionalmente como una secuencia que, cuando se coloca en una unidad de transcripción, da como resultado un nivel reducido de transcripción en el ácido nucleico presente en el lado 3’ de la TRAP cuando se compara con el nivel de transcripción observado en el ácido nucleico en el lado 5’ de la TRAP. Los ejemplos no limitantes de secuencias TRAP son señales de terminación de la transcripción y/o de poliadenilación. En la SEQ. ID. NO. 142 se da un ejemplo no limitante de una secuencia TRAP. Los ejemplos de otras secuencias TRAP, los métodos para encontrarlas, y sus usos se han descrito en el documento WO 2004/055215.

Las moléculas de ADN que comprenden unidades de transcripción muticistrónicas y/o casetes de expresión según la presente invención pueden usarse para mejorar la expresión de ácidos nucleicos, preferiblemente en células hospedantes. Los términos “célula”/“célula hospedante” y “línea celular”/“línea celular hospedante” típicamente se definen respectivamente como una célula y poblaciones homogéneas de la misma que pueden mantenerse en cultivo celular mediante métodos conocidos en la técnica, y que tienen la capacidad de expresar proteínas heterólogas u homólogas.

Las células hospedantes procariotas pueden usarse para propagar y/o realizar ingeniería genética con las moléculas de ADN de la invención, especialmente cuando están presentes en plásmidos que pueden replicarse en células hospedantes procariotas tales como bacterias.

Una célula hospedante según la presente invención es preferiblemente una células eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero, tal como una célula de roedor o una célula humana, o una fusión entre diferentes células. En ciertas realizaciones no limitantes, dicha célula hospedante es una célula de osteosarcoma U-2 OS, célula CHO (ovario de hámster chino), célula HEK 293, célula de mieloma HuNS-1, célula de retinoblastoma WERI-Rb-1, célula BHK, célula Vero, célula de mieloma de ratón no secretor Sp2/0-Ag 14, célula de mieloma de ratón no secretor NS0, célula de carcinoma de glándula suprarrenal NCI-H295R o una célula PER.C6®. En ciertas realizaciones de la invención, una célula hospedante es una célula que expresa al menos E1A, y preferiblemente también E1B, de un adenovirus. Como ejemplos no limitantes, tal célula puede derivar de, por ejemplo, células humanas, por ejemplo de un riñón (ejemplo: células HEK 293; véase Graham et al, 1977), pulmón (por ejemplo A549; véase por ejemplo el documento WO 98/39411) o retina (ejemplo: células HER comercializadas con la marca PER.C6®; véase la patente US 5.994.128), o de amniocitos (por ejemplo N52.E6, descritos en la patente US 6.558.948), y similarmente de otras células. Los métodos para obtener tales células se describen por ejemplo en las patentes US 5.994.128 y US

6.558.948. Las células PER.C6, para los fines de la presente invención, significan células procedentes de una pasada en dirección 5’ o en dirección 3’ de células tal como se depositaron con el nº ECACC 96022940, es decir, que tienen las características de esas células. Previamente se ha mostrado que tales células son capaces de expresar proteínas en niveles elevados (por ejemplo el documento WO 00/63403, y Jones et al, 2003). En otras realizaciones preferidas, las células hospedantes son células CHO, por ejemplo CHO-K1, CHO-S, CHO-DG44, CHO-DUKXB11, y similares. En ciertas realizaciones, dichas células CHO tienen un fenotipo dhfr-. Tales células hospedantes eucariotas pueden expresar polipéptidos deseados, y a menudo se usan para ese fin. Pueden obtenerse mediante la introducción de una molécula de ADN de la invención, preferiblemente en forma de un casete de expresión, en las células. Preferiblemente, el casete de expresión se integra en el genoma de las células hospedantes, que puede estar en diferentes posiciones en diversas células hospedantes, y la selección proporcionará un clon en el que el transgén está integrado en una posición adecuada, lo que conduce a un clon de célula hospedante con las propiedades deseadas en términos de niveles de expresión, estabilidad, características de crecimiento, y similares. Alternativamente, la unidad de transcripción multicistrónica puede seleccionarse como diana o seleccionarse al azar para su integración en una región cromosómica que es activa de manera transcripcional, por ejemplo detrás de un promotor presente en el genoma. La selección de células que contienen el ADN de la invención puede efectuarse seleccionando el polipéptido marcador seleccionable, usando métodos habituales conocidos por la persona experta en la técnica. Cuando dicha unidad de transcripción multicistrónica se

integra detrás de un promotor en el genoma, puede generarse in situ un casete de expresión según la invención, es decir, en el genoma de las células hospedantes.

Preferiblemente, las células hospedantes provienen de un clon estable que puede seleccionarse y propagarse según procedimientos convencionales conocidos por el experto en la técnica. Un cultivo de un clon de este tipo es capaz de producir el polipéptido de interés, si las células comprenden la unidad de transcripción multicistrónica de la invención. Las células según la invención son capaces de crecer preferiblemente en cultivo en suspensión en medio libre de suero.

En realizaciones preferidas, la molécula de ADN que comprende la unidad de transcripción multicistrónica de la invención, preferiblemente en forma de un casete de expresión, se integra en el genoma de la célula hospedante eucariota según la invención. Esto proporcionará una herencia estable de la unidad de transcripción multicistrónica.

La selección de la presencia del polipéptido marcador seleccionable, y por tanto de la expresión, puede efectuarse durante la obtención inicial de las células, y podría reducirse o detenerse del todo después de que se han obtenido clones estables. Sin embargo, también es posible aplicar el agente de selección durante etapas posteriores continuamente, o sólo ocasionalmente, posiblemente a menores niveles que durante la selección inicial de las células hospedantes.

Un polipéptido de interés según la invención puede ser cualquier proteína, y puede ser una proteína monomérica o una (parte de una) proteína multimérica. Una proteína multimérica comprende al menos dos cadenas polipeptídicas. Los ejemplos no limitantes de una proteína de interés según la invención son enzimas, hormonas, cadenas de inmunoglobulina, proteínas terapéuticas como proteínas anticancerosas, proteínas de coagulación sanguínea tales como Factor VIII, proteínas multifuncionales tales como eritropoyetina, proteínas de diagnóstico, o proteínas o fragmentos de las mismas útiles con fines de vacunación, todas conocidas por el experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, un casete de expresión de la invención codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o una parte de unión a antígeno, derivado y/o análogo de la misma. En una realización preferida, se proporciona una unidad de expresión de proteína según la invención, en la que dicha proteína de interés es una cadena pesada de inmunoglobulina. En aún otra realización preferida, se proporciona una unidad de expresión de proteína según la invención, en la que dicha proteína de interés es una cadena ligera de inmunoglobulina. Cuando estas dos unidades de expresión de proteína están presentes en la misma célula (hospedante), se ensambla una proteína multimérica, y más específicamente una inmunoglobulina. Por tanto, en ciertas realizaciones, la proteína de interés es una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, que es una proteína multimérica. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado. En ciertas realizaciones del mismo, es un anticuerpo de IgG, IgA o IgM. Una inmunoglobulina puede estar codificada por las cadenas pesada y ligera en casetes de expresión diferentes, o en un único casete de expresión. Preferiblemente, la cadena pesada y ligera están presentes cada una en un casete de expresión separado, teniendo cada uno su propio promotor (que puede ser el mismo o diferente para los dos casetes de expresión), comprendiendo cada uno una unidad de transcripción multicistrónica según la invención, siendo la cadena pesada y ligera el polipéptido de interés, y codificando preferiblemente cada uno una proteína marcadora seleccionable diferente, de modo que puede efectuarse la selección del casete de expresión de ambas cadenas pesada y ligera cuando los casetes de expresión se introducen y/o están presentes en una célula hospedante eucariota.

El polipéptido de interés puede ser de cualquier fuente, y en ciertas realizaciones es una proteína de mamífero, una proteína artificial (por ejemplo, una proteína de fusión o proteína mutada), y preferiblemente es una proteína humana.

Obviamente, las configuraciones de los casetes de expresión de la presente invención pueden usarse también cuando el objetivo último no es la producción de un polipéptido de interés, sino el ARN mismo, por ejemplo para la producción de cantidades aumentadas de ARN a partir de un casete de expresión, que puede usarse con fines de regular otros genes (por ejemplo, ARNi, ARN anticodificante), terapia génica, producción de proteína in vivo, etc.

En un aspecto, la invención proporciona un método para generar una célula hospedante que expresa un polipéptido de interés, comprendiendo el método las etapas de: a) introducir en una pluralidad de células precursoras un casete de expresión según la invención, y b) cultivar las células generadas en condiciones que seleccionan la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y c) seleccionar al menos una célula hospedante que produce el polipéptido de interés. Este nuevo método proporciona un resultado muy bueno en términos de la relación de clones obtenidos frente a clones con expresión elevada del polipéptido deseado. Usando las condiciones más rigurosas, es decir, la eficiencia de la traducción más débil para el polipéptido marcador seleccionable (usando la secuencia de inicio de la traducción más débil), se obtienen muchas menos colonias usando la misma concentración de agente de selección que con sistemas de selección conocidos, y un porcentaje relativamente elevado de los clones obtenidos produce el polipéptido de interés en niveles elevados. Además, los niveles obtenidos de expresión parecen mayores que los obtenidos cuando se usa un número incluso mayor de clones usando los sistemas de selección conocidos.

Es una ventaja adicional que el sistema de selección sea veloz, debido a que no requiere la amplificación del número de copias del transgén. Por tanto, las células con números de copia bajos de las unidades de transcripción

multicistrónicas ya proporcionan niveles de expresión elevados. Números elevados de copias del transgén pueden tender a la inestabilidad genética y al silenciamiento inducido por la repetición (por ejemplo Kim et al, 1998; McBurney et al, 2002). Por lo tanto, una ventaja adicional de las realizaciones de la invención con números relativamente bajos de copias del transgén es que se anticipa que menores números de copias tienen menos tendencia a la recombinación y al silenciamiento inducido por repetición, y por lo tanto se anticipan menos problemas a este respecto cuando se usan células hospedantes con un número limitado de copias del transgén en comparación con las células hospedantes obtenidas usando un sistema de amplificación en el que puede haber en el genoma de la célula cientos o incluso miles de copias de las secuencias codificantes del marcador seleccionable y de la proteína de interés. La presente invención proporciona ejemplos de niveles de expresión elevados, que usan el sistema de selección de unidad de transcripción multicistrónica, mientras que el número de copias del transgén es relativamente bajo, es decir, menor que 30 copias por célula, o incluso menor que 20 copias por célula. Por tanto, la presente invención permite la generación de células hospedantes según la invención que comprenden menos de 30 copias de la unidad de transcripción multicistrónica en el genoma de las células hospedantes, preferiblemente menos de 25, más preferiblemente menos de 20 copias, mientras que al mismo tiempo proporcionan suficientes niveles de expresión del polipéptido de interés para fines comerciales, por ejemplo más de 15, preferiblemente más de 20 pg/célula/día de un anticuerpo.

Aunque pueden obtenerse clones que tienen números de copias relativamente bajos de las unidades de transcripción multicistrónicas y niveles elevados de expresión, el sistema de selección de la invención puede combinarse no obstante con métodos de amplificación para mejorar aún más los niveles de expresión. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la amplificación de un gen dhfr cointegrado usando metotrexato, por ejemplo colocando dhfr en la misma molécula de ácido nucleico que la unidad de transcripción multicistrónica de la invención, o mediante cotransfección cuando dhfr está en una molécula de ADN separada.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un polipéptido de interés, comprendiendo el método cultivar una célula hospedante, comprendiendo dicha célula hospedante una molécula de ADN que comprende una unidad de expresión multicistrónica o un casete de expresión según la invención, y expresar el polipéptido de interés a partir de la secuencia codificante para el polipéptido de interés.

La célula hospedante para este aspecto es una célula hospedante eucariota, preferiblemente una célula de mamífero, tal como una célula CHO, adicionalmente como se describe anteriormente.

La introducción de ácido nucleico que se va a expresar en una célula puede hacerse mediante uno de varios métodos, que son conocidos como tales por el experto en la técnica, dependiendo también del formato del ácido nucleico a introducir. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, transfección, infección, inyección, transformación, y similares. Las células hospedantes adecuadas que expresan el polipéptido de interés pueden obtenerse mediante selección como se describe anteriormente.

En ciertas realizaciones, el agente de selección está presente en el medio de cultivo al menos parte del tiempo durante el cultivo, ya sea en concentraciones suficientes para seleccionar células que expresan el polipéptido marcador seleccionable o en concentraciones menores. En realizaciones preferidas, el agente de selección ya no está presente en el medio de cultivo durante la fase de producción cuando se expresa el polipéptido.

El cultivo de una célula se realiza para posibilitar que metabolice y/o crezca y/o se divida y/o produzca proteínas recombinantes de interés. Esto puede lograrse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluye, pero sin limitarse a, proporcionar nutrientes para la célula. Los métodos comprenden crecimiento adherente a superficies, crecimiento en suspensión, o combinaciones de los mismos. El cultivo puede realizarse por ejemplo en platos, matraces giratorios o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, semicontinuos, continuos tales como sistemas de perfusión y similares. Para conseguir la producción a gran escala (continua) de proteínas recombinantes mediante el cultivo celular, se prefiere en la técnica tener células capaces de crecer en suspensión, y se prefiere tener células aptas para ser cultivadas en ausencia del suero derivado de animal o ser humano o de componentes séricos derivados de animal o ser humano.

Las condiciones para hacer crecer o multiplicar células (véase, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editores (1973)) y las condiciones para la expresión del producto recombinante son conocidas para el experto en la técnica. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos de células de mamífero pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991).

En una realización preferida, la proteína expresada se recoge (aísla) a partir de células o del medio de cultivo, o de ambos. Entonces puede purificarse adicionalmente usando métodos conocidos, por ejemplo filtración, cromatografía en columna, etc., por métodos generalmente conocidos por el experto en la técnica.

El método de selección según la presente invención funciona en ausencia de elementos de control de cromatina, pero se obtienen resultados mejorados cuando las unidades de expresión multicistrónicas se proporcionan con dichos elementos. El método de selección según la presente invención funciona particularmente bien cuando se usa un casete de expresión según la invención, que comprende al menos una secuencia antirrepresora. Dependiendo

del agente y condiciones de selección, la selección puede hacerse en ciertos casos tan rigurosa que sólo unas pocas o incluso ninguna célula hospedante sobrevive a la selección, a menos que estén presentes secuencias antirrepresoras. Por tanto, la combinación del nuevo método de selección y las secuencias antirrepresoras proporciona un método muy atractivo para obtener sólo números limitados de colonias con una oportunidad enormemente mejorada de expresión elevada del polipéptido de interés en las mismas, mientras que al mismo tiempo los clones obtenidos que comprenden los casetes de expresión con secuencias antirrepresoras proporcionan la expresión estable del polipéptido de interés, es decir, tienden menos al silenciamiento u otros mecanismos de reducción de la expresión que los casetes de expresión convencionales.

En ciertas realizaciones, casi no se obtienen clones cuando está presente una secuencia no antirrepresora en el casete de expresión según la invención, que proporciona una selección muy rigurosa. El nuevo sistema de selección descrito aquí también proporciona por lo tanto la posibilidad de ensayar partes de elementos antirrepresores en busca de funcionalidad, analizando los efectos de tales secuencias cuando están presentes en casetes de expresión de la invención en condiciones de selección. Este cribado fácil, que proporciona en muchos casos una diferencia de blanco y negro casi completa o incluso completa, puede contribuir por lo tanto a identificar partes funcionales o derivados procedentes de secuencias antirrepresoras. Cuando se ensayan secuencias antirrepresoras conocidas, este ensayo se puede usar para caracterizarlas adicionalmente. Cuando se ensayan fragmentos de secuencias antirrepresoras conocidas, el ensayo proporcionará fragmentos funcionales de tales secuencias antirrepresoras conocidas.

La práctica de esta invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están dentro de las habilidades de la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., eds., 1987; la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds., 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, ed., 1988.

La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención en modo alguno. Sirven simplemente para aclarar la invención.

Ejemplos

Los Ejemplos 1-7 describen el ensayo de STAR67 y otras secuencias STAR en diversas configuraciones y en diversas circunstancias. Los Ejemplos 8 y posteriores describen el nuevo sistema de selección de la invención.

Ejemplo 1: Construcción de vectores STAR 67

Se aisló una nueva secuencia antirrepresora (STAR) usando un cribado genético como se describe en el documento WO 03/004704, y esta nueva secuencia se denominó STAR67. Se ensayaron los efectos de STAR67 sobre la expresión de transgenes en líneas de células de mamífero. Se describe aquí la construcción de los diversos constructos.

Materiales y métodos

Se crearon tres plásmidos (Fig.1):

A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (Control de CMV), B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67), C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

A continuación se describe la construcción del constructo A. El plásmido pd2EGFP (Clontech 6010-1) se modificó mediante inserción de un ligador en el sitio BsiWI para producir pd2EGFP-link. El ligador, obtenido mediante la hibridación de oligonucleótidos GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) y GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68), introdujo sitios para las endonucleasas de restricción Pacl, BglII, y EcoRV. Esto creó el sitio de clonación múltiple MCSII para la inserción de elementos STAR. Después, los cebadores GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACG G (SEQ. ID. NO. 69) y (AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG (SEQ. ID. NO. 70) se usaron para amplificar una región de 0,37 kb procedente de pd2EGFP, que se insertó en el sitio BglII de pIRES (Clontech 6028-1) para producir pIRES-stuf. Esto introdujo sitios para las endonucleasas de restricción AscI y SwaI en MCSI, y actúa como un “fragmento rellenador” para evitar la interferencia potencial entre elementos STAR y promotores adyacentes. pIRESstuf se digirió con BglII y FspI para liberar un fragmento de ADN compuesto del fragmento rellenador, el promotor de CMV, el elemento IRES (flanqueado por sitios de clonación múltiples MCS A y MCS B), y la señal de poliadenilación de SV40. Este fragmento se ligó con el vector de cadena principal de pd2EGFP-link, producido mediante digestión con BamHI y StuI, para producir pIRES-link.

El marco de lectura abierto del gen de resistencia a zeocina se insertó en los sitios BamHI/NotI en dirección 3’ del pIRES según lo siguiente: el ORF de resistencia a zeocina se amplificó mediante PCR con los cebadores GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ. ID. NO. 71) y

AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72) del plásmido pCMV/zeo (Invitrogen, número de catálogo V50120), se dirigió con BamHl y NotI, y se ligó con pIRES-link digerido con BamHl/NotI para producir pIRES-link-zeo. El ORF informador de d2EGFP se introdujo en pIRES-link-zeo mediante amplificación de pd2EGFP (Clontech 6010-1) con los cebadores GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG (SEQ. ID. NO. 73) y AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCA GG (SEQ. ID. NO. 74), y la inserción del casete de d2EGFP digerido con EcoRI en el sitio EcoRI en el plásmido pIRES-link-zeo. Esto creó el constructo A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (Control de CMV).

STAR 67 se clonó en dirección 5’ del promotor de CMV, en el sitio AscI (quedando alrededor de 15 nt entre STAR67 y el promotor). Esto creó el constructo B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

STAR67 también se ensayó en el contexto de un casete que contiene también STAR7, clonado direccionalmente en los sitios 5’ SaII y XbaI y los sitios 3’ BgIII y PacI para flanquear el casete completo con STAR7. Este es el constructo C (CMV-STAR67 7/7).

Ejemplo 2: STAR67 potencia el nivel de expresión de los promotores de CMV, EFI y UB6 en células CHO transfectadas establemente.

Se ensayó si la presencia de STAR67 adyacente a los promotores de CMV, EFI! y UB6 influye en el nivel de expresión de estos promotores en células CHO. Para este fin se usan los constructos A y B (Fig. 1) descritos en el Ejemplo 1, modificados para los promotores respectivos:

1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (Control de CMV)

2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

3 EFI!-d2EGFP-ires-Zeo (Control de EFI!)

4 STAR67-EFI!-d2EGFP-ires-Zeo (EFI!-STAR67)

5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (Control de UB6)

6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

Materiales y métodos

Los promotores de UB6 y EFI! se intercambiaron por el promotor de CMV en los plásmidos descritos en la Fig. 1. El promotor de UB6 se clonó según lo siguiente. Se amplificó mediante PCR un rellenador de 0,37 kb de ADN procedente del plásmido pd2EGFP como se describe en el ejemplo 1, usando cebadores identificados mediante SEQ. ID. NOs. 69 y 70. El rellenador de ADN resultante se clonó en el sitio BgIII de pUB6/V5-His [Invitrogen V25020], creando pUB6-stuf. A partir de pUB6-stuf, se clonó un fragmento AscI-SacI en CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir del que se eliminó el promotor de CMV.

El promotor de EFI! se amplificó mediante PCR con pEFl!/V5-His [Invitrogen V920-20] como molde, usando los cebadores GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ. ID. NO. 79) y AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ. ID. NO. 80). El fragmento de PCR se clonó en los sitios AscI y PpuMI de CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir del que se eliminó el promotor de CMV.

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se cultivó en medio HAMS-F12 + 10% de suero fetal de ternera que contiene 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 37°C/5% de CO2. Las células se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante. De forma breve, las células se sembraron en vasos de cultivo y se hicieron crecer toda la noche hasta 70-90% de confluencia. El reactivo Lipofectamine se combinó con ADN plasmídico a una relación de 6 microlitros por microgramo (por ejemplo, para una cápsula de Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de Lipofectamine), y se añadieron a las células. Después de la incubación durante toda la noche, la mezcla de transfección se sustituyó por medio reciente, y las células transfectadas se incubaron adicionalmente. Después del cultivo durante toda la noche, las células se tripsinizaron y se sembraron en vasijas de cultivo recientes con medio reciente. Después de otra incubación durante toda la noche, se añadió zeocina hasta una concentración de 50 ∀g/ml, y las células se cultivaron adicionalmente. Después de otros tres días, el medio se sustituyó por medio reciente que contiene zeocina (100 ∀g/ml) y se cultivó adicionalmente. Cuando las colonias individuales se hicieron visibles (aproximadamente diez días después de la transfección), el medio se retiró y se sustituyó por medio reciente sin zeocina. Los clones individuales se aislaron y se transfirieron a placas de 24 pocillos en medio sin zeocina. Un día después del aislamiento de las colonias, se añadió zeocina al medio. La expresión del gen informador d2EGFP se evaluó aproximadamente tres semanas después de la transfección. Los niveles de expresión de d2EGFP en las colonias se midieron después de períodos de dos semanas. Después de las dos semanas iniciales después de la transfección cuando se llevaron a cabo las primeras medidas de d2EGFP, las colonias se cultivaron en medio sin zeocina u otros antibióticos. Esto continuó durante el resto del experimento.

Resultados

La Fig. 2 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de CMV dio como resultado un número de colonias de CHO que expresan niveles significativamente mayores de

proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de CMV. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de Control de CMV fue 34, cuando se mide 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias se redujo a 13, indicando que la expresión no es estable a lo largo del tiempo. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido STAR67-CMV fue 42 cuando se mide después de 25 días, y 32 medida 60 días después de la transfección. Por tanto, 60 días después de la transfección, un constructo de CMV que engloba STAR67 comunicó un factor 2,5 mayor de nivel de expresión conducido por el promotor de CMV de la proteína informadora en clones establemente transfectados. De forma importante, 25 días después de la transfección, tras la primera medida, la presión de selección se retiró cultivando las colonias en medio sin zeocina. Por tanto, las colonias que contienen el constructo STAR67 son más estables a lo largo del tiempo en ausencia de presión de selección que las colonias que no contienen un constructo STAR67.

La Fig. 3 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado en dirección 5’ del promotor de EFI! dio como resultado un número de colonias de CHO que expresan niveles significativamente mayores de proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de EFI!. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de Control de EFI! fue 31 cuando se mide 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias fue 26. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido EFI!-STAR67 fue 60 cuando se midió después de 25 días, y 76 cuando se midió 60 días después de la transfección. Por tanto, tanto después de 25 como de 60 días después de la transfección, un constructo de EFI! que engloba STAR67 comunicó un factor 2,9 mayor de nivel de expresión conducida por el promotor de EFI! de la proteína informadora en clones establemente transfectados.

La Fig. 4 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado en dirección 5’ del promotor de UB6 dio como resultado un número de colonias de CHO que expresan niveles significativamente mayores de proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de UB6. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control de UB6 fue 51 cuando se mide 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias fue 29, indicando que la expresión no fue estable a lo largo del tiempo. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido UB6-STAR67 fue 218 cuando se mide después de 25 días, y 224 cuando se mide 60 días después de la transfección. Por tanto, 25 días después de la transfección, un constructo de UB6 que engloba STAR67 comunicó un factor 4,3 mayor de nivel de expresión conducida por el promotor de UB6 de la proteína informadora en clones establemente transfectados. Después de 60 días, este factor fue 7,7, debido a la inestabilidad de la expresión en las colonias del control y a la estabilidad en las colonias de UB6-STAR67. De forma importante, 25 días después de la transfección, tras la primera medida, se retiró la presión de selección cultivando las colonias en medio sin zeocina. Por tanto, las colonias que contienen el constructo de STAR67 son más estables a lo largo del tiempo en ausencia de presión de selección de las colonias que no contienen un constructo de STAR67.

En conclusión, STAR67 incrementa la expresión de tres promotores diferentes, no relacionados.

Ejemplo 3: STAR67 potencia el nivel de expresión a partir de promotores de CMV, EFI y UB6 en células PER.C6 establemente transfectadas.

Se ensayó si la presencia de STAR67 adyacente a los promotores de CMV, EFI! y UB6 influye en el nivel de expresión de estos promotores en otro tipo celular distinto de células CHO, a saber, células PER.C6 humanas. Se usaron los mismos constructos como en el ejemplo 1.

Materiales y métodos

Transfección, cultivo y análisis de células PER.C6

Se cultivaron células PER.C6® en medio DMEM + piridoxina + 9% de suero fetal bovino (no inactivado con calor), 8,9 mM de MgCl2, 100 U/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 37ºC/10% de CO2. Las células se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante. De forma breve, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se hicieron crecer toda la noche hasta 70-90% de confluencia. El reactivo de LIpofectamine se combinó con ADN plasmídico a una relación de 15 microlitros por 3 microgramos (por ejemplo para una cápsula de Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de Lipofectamine) y se añadió después de 30 minutos de incubación a 25ºC a las células. Después de la incubación durante 6 horas, la mezcla de transfección se sustituyó por medio reciente, y las células transfectadas se incubaron adicionalmente. Después del cultivo durante toda la noche, las células se tripsinizaron y se sembraron (diluciones 1:15, 1:30, 1:60, 1:120) en cápsulas de Petri recientes (90 mm) con medio reciente con zeocina añadida hasta una concentración de 100 ∀g/ml, y las células se cultivaron adicionalmente. Cuando las colonias se hicieron visibles, los clones individuales se aislaron raspando y se transfirieron a placas de 24 pocillos en medio con zeocina. Cuando se hicieron crecer hasta ~70% de confluencia, las células se transfirieron a placas de 6 pocillos. Las colonias estables se expandieron durante dos semanas en placas de 6 pocillos antes de que se determinase la señal de d2EGFP en un citómetro de flujo XL-MCL Beckman Coulter. La media de la señal de d2EGFP se tomó como medida para el

nivel de expresión de d2EGFP. Las colonias se midieron durante una segunda vez después de dos semanas. Después, las colonias se cultivaron adicionalmente en ausencia de zeocina.

Resultados

La Fig. 5 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de CMV dio como resultado un número de colonias de PER.C6 que expresan niveles significativamente mayores de proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de CMV. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de Control de CMV fue 37 cuando se midió 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias se redujo a 14, indicando que la expresión no fue estable a lo largo del tiempo. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido STAR67-CMV fue 101 cuando se midió después de 30 días, y 45 cuando se midió 60 días después de la transfección. Por tanto, 60 días después de la transfección, un constructo de CMV que engloba STAR67 comunicó un factor de 3,2 mayor de nivel de expresión conducida por el promotor de CMV de la proteína informadora en clones establemente transfectados.

La Fig. 6 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de EF1! dio como resultado un número de colonias de PER.C6 que expresan niveles significativamente mayores de proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de EF1!. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de Control de EF1! fue 5 cuando se midió 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias fue 6. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido EF1!-STAR67 fue 25 cuando se midió después de 30 días, y 20 cuando se midió 60 días después de la transfección. Por tanto, tanto después de 30 días como de 60 días después de la transfección, un constructo de EF1! que engloba STAR67 comunicó un factor de 4 mayor de nivel de expresión conducida por el promotor de EF1! de la proteína informadora en clones establemente transfectados.

La Fig. 7 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de UB6 dio como resultado un número de colonias de PER.C6 que expresan niveles significativamente mayores de proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin STAR67, Control de UB6. La media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de Control de UB6 fue 4 cuando se midió 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, la media de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias fue 2. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido UB6-STAR67 fue 27 cuando se midió después de 30 días, y 18 cuando se midió 60 días después de la transfección. Por tanto, tanto después de 30 días como de 60 días después de la transfección, un constructo de UB6 que engloba STAR67 comunicó un factor 7 a 9 veces mayor de nivel de expresión conducida por el promotor de UB6 de la proteína informadora en clones establemente transfectados.

Por tanto, la colocación de STAR67 en dirección 5’ del promotor dio como resultado niveles de expresión proteica significativamente mayores en comparación con constructos sin STAR67, también en células PER.C6. Por tanto, STAR 67 funciona en tipos celulares diferentes, no relacionados.

Ejemplo 4: Nueva configuración de STAR67 combinada con otros elementos de STAR para potenciar el promotor de SV40 en células CHO.

Se ensayó si la presencia de STAR67 adyacente al promotor de SV40 influye en el nivel de expresión de este promotor, ya sea sola o en combinación con otro elemento STAR, en este ejemplo STAR7. Los constructos que se usaron para este fin (véase la Fig. 8) son:

1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (Control de SV40) 2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67) 3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7) 4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)

Materiales y métodos

El promotor de SV40 se amplificó mediante PCR con pIRES como molde usando los cebadores TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAG G (SEQ. ID. NO. 81) y TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCC TCCTC (SEQ. ID. NO. 82).

El fragmento de PCR se clonó en los sitios AscI y SacI de CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir del cual se retiró el promotor de CMV.

Las células CHO se transfectaron, las colonias se aislaron y se propagaron, y se analizaron como en el Ejemplo 2.

Resultados

La Fig. 8 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de SV40 (SV40-STAR67), o STAR7 clonada para flanquear todo el constructo (SV40-STAR 7/7), no dio como resultado colonias de CHO que expresan niveles significativamente mayores de la proteína d2EGFP, en comparación con el control “vacío” sin los STARs (Control de SV40). La media de la señal de d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido de Control de SV40 fue 86, cuando se midió 40 días después de la transfección. En comparación, la media de la señal de d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR67 fue 82 cuando se midió después de 40 días, y la media de la señal de d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR 7/7 fue 91 cuando se midió después de 40 días. Por tanto, no se observó ningún efecto significativo de estos elementos de STAR sobre el promotor de SV40 en células CHO.

Parece que los niveles de expresión a partir del promotor de SV40 en estas células ya son bastante elevados, e incluso mucho mayores que los observados con el promotor de CMV, que se considera que es un promotor muy potente. Esta expresión de fondo elevada en ausencia de un elemento STAR usando el promotor de SV40 en células CHO puede explicar por qué no se observó ningún efecto significativo de STAR67 sola, o STAR7 que flanquea el transgén.

Sin embargo, la media de la señal de d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR67 7/7 fue 209 cuando se midió después de 40 días, que es un factor 2,4 veces mayor que la media de las 18 colonias de control (86). Por tanto, cuando se usa el elemento STAR67 en combinación con otro elemento STAR, esto da como resultado un número de colonias de CHO establemente transfectadas que muestran niveles de expresión de d2EGFP significativamente mayores.

Por lo tanto, en esta nueva configuración (5’-secuencia STAR A - secuencia STAR C - promotor -ácido nucleico que codifica una proteína de interés -secuencia STAR B - 3’, en la que, en el presente ejemplo, las secuencias STAR A y B son STAR7, y la secuencia STAR C es STAR67), parece que los elementos STAR funcionan incluso mejor que en las configuraciones descritas hasta ahora.

Se han realizado experimentos en los que los elementos STAR7 flanqueantes se sustituyeron flanqueando elementos STAR6 o flanqueando elementos STAR4, en combinación con STAR67 en dirección 5’ del promotor de SV40 (SV40-STAR67 6/6 y SV40-STAR67 4/4, respectivamente, usando la misma nomenclatura como antes), y se observó expresión mejorada también con estas combinaciones. Esto demuestra que los elementos STAR7 flanqueantes pueden de hecho intercambiarse por otras secuencias STAR, y todavía se observa la mejora de la nueva configuración del casete de expresión con las secuencias STAR.

Ejemplo 5: Una combinación de STAR67 y STAR7 potencia los niveles de expresión de anticuerpo conducidapor UB6 en células CHO establemente transfectadas.

En el ejemplo 4 se demostró que la combinación de STAR67 y STAR7 potenció los niveles de expresión de la proteína d2EGFP en células CHO. Aquí se ensayó si la combinación de STAR67 y STAR7 se podría usar para la producción de un anticuerpo. Se escogió un anticuerpo frente a la molécula EpCAM (Huls et al, 1999) como proteína de ensayo, y se usó el promotor de UB6.

Materiales y métodos

Plásmidos

El ADNc de cadena pesada (HC-EpCAM) se clonó en un constructo que engloba el promotor de UB6. El HC-EpCAM se acopló al gen de resistencia a zeocina mediante una secuencia IRES. El ADNc de cadena ligera (LC-EpCAM) también se clonó en un constructo que engloba el promotor de UB6. El LC-EpCAM se acopló al gen de resistencia a puromicina mediante una secuencia IRES. Juntos, estos dos plásmidos representan el Control de UB6 (HC+LC) (Fig. 9).

Para ensayar los efectos de STAR67 y STAR7, se clonó STAR67 en ambos constructos HC+LC, en dirección 5’ de los promotores de UB6. STAR7 se clonó para flanquear todos los casetes, tanto en el extremo 5’ como 3’ (Fig. 9). Estos dos plásmidos representan STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7.

Transfección y cultivo de células CHO

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfectó y cultivo como en el ejemplo 2, usando zeocina (100 ∀g/ml) y puromicina (2,5 ∀g/ml) para la selección. Un día después de la transfección, se añadió zeocina al medio de cultivo. Cuando las primeras colonias se hicieron visible (aproximadamente 7 días después de la adición de zeocina), se retiró el medio de cultivo y se sustituyó por medio de cultivo que contiene puromicina. Después de aproximadamente 7 días, las colonias se aislaron y se transfirieron a placas de 24 pocillos, en medio de cultivo que contiene zeocina solamente.

Resultados

La Fig. 9 muestra que la transfección de constructos de anticuerpo que contienen STAR67 clonada en dirección 5’ del promotor de UB6 y dos elementos STAR7 clonados para flanquear los casetes completos dio como resultado un número de colonias de CHO que expresan niveles significativamente mayores de anticuerpo EpCAM (medido mediante ELISA usando un anticuerpo anti-IgG humana) en comparación con el control “vacío” sin STAR67 y STAR7, Control de UB6 (HC+LC). La media de la producción de EpCAM en las 18 colonias transfectadas con el plásmido de Control de UB6 (HC+LC) fue 2,7 pg/célula/día, cuando se mide 25 días después de la transfección. Los agentes de selección zeocina y puromicina se retiraron después de 25 días. 45 días después de la transfección, la media de la producción de EpCAM en estas 18 colonias fue 2,7 pg/célula/día. En comparación, la media de la señal de producción de EpCAM en las 18 colonias transfectadas con el plásmido STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 fue 6,7 cuando se midió después de 25 días, y 7,7 pg/célula/día cuando se midió 45 días después de la transfección. Por tanto, tanto después de 30 como de 45 días después de la transfección, un constructo de UB6 que engloba STAR67/STAR7 comunicó un factor de 2,5 a 2,9 veces mayor de nivel de expresión de EpCAM conducida por el promotor de UB6 en clones de CHO establemente transfectados.

Por tanto, la colocación de STAR67 en dirección 5’ del promotor y dos elementos STAR7 para flanquear los casetes dio como resultado niveles de expresión del anticuerpo EpCAM significativamente mayores en CHO, en comparación con constructos sin STAR67/STAR7.

Ejemplo 6: STAR67 no es un bloqueador del potenciador, mientras que STAR6 y STAR7 sí lo son.

Todos los elementos STAR conocidos hasta ahora que se ensayaron para determinar esa propiedad, incluyendo STAR6 y STAR7, son bloqueadores del potenciador (documento WO 03/004704, Kwaks et al, 2003). La actividad bloqueante del potenciador se ensaya colocando un elemento STAR entre un potenciador fuerte y un promotor. Aquí, se ensayó si también STAR67 es un bloqueador del potenciador.

Materiales y métodos

El gen d2EGFP se amplificó mediante PCR usando los cebadores TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC (SEQ.ID.NO. 75) y ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC (SEQ.ID.NO. 76), y se clonó en el plásmido pGL3-promoter (Promega) usando los sitios de restricción NcoI y XbaI para sustituir el gen de luciferasa para crear el plásmido pGL3-promoter-GFP. Un ligador, creado hibridando los oligo CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ. ID. NO. 77) y GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT (SEQ. ID. NO. 78), se clonó en los sitios SacI y BgIII para crear múltiples sitios de clonación. El sitio BgIII original se destruyó con la ligación del ligador, creando un nuevo sitio BgIII único en el ADN ligador. El potenciador de SV40 se cortó del plásmido pGL3-basic (Promega) usando BsaBI y BamHI, y se clonó en el pGL3-ligador-promotor-GFP usando los sitios EcoRV y BgIII creando el plásmido pGL3-potenciador-promotor-GFP. El elemento STAR40 se colocó en dirección 5’ del potenciador de SV40 usando los sitios KpnI y SacI para evitar la acción del potenciador en las secuencias en dirección 5’. Finalmente, los elementos STAR 6, 7 y 67 se colocaron entre el potenciador de SV40 y el promotor mínimo de SV40 usando los sitios de restricción SpeI y AscI.

Transfección y cultivo de células CHO

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfectó como en el ejemplo 2. Un día después de la transfección, los niveles de d2EGFP se midieron en el citómetro de flujo Epics XL (Beckman Coulter).

Resultados

La Fig. 10 muestra que STAR67 no es un bloqueador del potenciador, mientras que STAR6 y STAR7 actúan como bloqueadores del potenciador en el mismo ensayo. STAR6, STAR7 y STAR67 se clonaron entre el potenciador de SV40 y un promotor de SV40 mínimo en dirección 5’ del gen de d2EGFP. Cuando no se clonó ningún elemento STAR entre el potenciador y el promotor, se produjo una fuerza activación transcripcional (arbitrariamente establecida a 100%). Cuando STAR6 o STAR7 se colocaron entre el potenciador y el promotor, la transcripción cayó hasta los niveles de valores iniciales, indicando que STAR6 y STAR7 son potentes bloqueadores del potenciador. Por el contrario, cuando STAR67 se clonó entre el potenciador y el promotor, los niveles de transcripción relativos todavía fueron 80% del control, indicando que STAR67 no es un buen bloqueador del potenciador, estando esto en contraste con STAR6 y STAR7, así como otros elementos STAR, como se describe previamente (documento WO 03/004704, Kwaks et al, 2003).

Ejemplo 7: STAR67 potencia los niveles de expresión de anticuerpo dirigida por UB6 y CMV en células CHO establemente transfectadas

En el ejemplo 5 se demostró que la combinación de STAR67 y STAR7 potenció los niveles de expresión del anticuerpo EpCAM en células CHO, en el contexto de dos plásmidos distintos, que contenían las cadenas pesada y ligera. En este ejemplo se ensayó si se podría usar STAR67 para la producción de anticuerpo EpCAM cuando las cadenas tanto pesada como ligera se colocan en un plásmido. Para cada marcador seleccionable se usó selección simultánea.

Materiales y métodos

Plásmidos

El ADNc de cadena pesada (HC-EpCAM) se coloca bajo el control del promotor de UB6 y se acopla al gen de resistencia a zeocina mediante una secuencia IRES. El ADNc de cadena ligera (LC-EpCAM) se coloca bajo el control del promotor de CMV y se acopla al gen de resistencia a puromicina mediante una secuencia IRES. Básicamente, estos son los constructos usados en el ejemplo 5. Estos dos casetes de expresión se colocaron en un plásmido, de una manera tal que la transcripción de las dos unidades de expresión tuvo direcciones opuestas. En el plásmido de control, los promotores de UB6 y CMV se separaron mediante un rellenador de 500 pb (control de EpCAM) (Fig. 10). En otro plásmido, STAR67 se colocó entre el promotor de UB6 y CMV (EpCAM STAR67) (Fig. 10).

Transfección y cultivo de células CHO

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfectó y cultivó como en el ejemplo 2, usando zeocina (100 ∀g/ml) y puromicina (2,5 ∀g/ml) para la selección. En el ejemplo 5 se usó selección consecutiva para ambos marcadores de selección. Por el contrario, aquí estaban presentes simultáneamente ambos agentes de selección en el medio de cultivo. Un día después de la transfección, se añadió zeocina y puromicina al medio de cultivo. El medio de selección estaba presente hasta que se aislaron colonias (aproximadamente 14 días después de la transfección). Después de que las colonias se aislaron y se transfirieron a placas de 24 pocillos, las células se cultivaron en presencia de zeocina y puromicina.

Resultados

La Fig. 11 muestra que la transfección del constructo de anticuerpo que contiene STAR67 clonada entre los promotores de UB6 y CMV dio como resultado un número de colonias de CHO que expresan anticuerpo EpCAM (medido mediante ELISA usando un anticuerpo anti-IgG humana). La media de la producción de EpCAM en las 19 colonias transfectadas con el plásmido EpCAM STAR67 fue 9,8 pg/célula/día, cuando se midió 25 días después de la transfección.

Por el contrario, sorprendentemente no sobrevivieron colonias de la transfección con el plásmido de Control de EpCAM. Cuando se llevó a cabo la selección con zeocina o puromicina sola, las colonias de Control de EpCAM sobrevivieron. Sin embargo, cuando la presión de selección se incrementó poniendo presión de selección tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera, estas condiciones sólo permitieron que sobreviviesen colonias que tienen una STAR67 presente en el plásmido transfectado.

Los resultados muestran también que la incorporación de STAR67 tiene un efecto beneficioso sobre dos promotores, los promotores de UB6 y CMV, que se colocan en dirección 5’ y en dirección 3’ de un elemento STAR67. Esto indica que STAR67 puede operar de manera bidireccional.

La diferencia entre el plásmido de Control de EpCAM y el plásmido de EpCAM STAR67 es blanco-negro, en el sentido de que solamente la transfección de EpCAM STAR67 da como resultado el establecimiento de colonias, cuando la presión de selección es elevada. Esto abre una oportunidad para usar esta configuración plasmídica para identificar la región en STAR67 que es responsable de mediar este efecto. Se colocan porciones más pequeñas, solapantes, de STAR67 entre los promotores de UB6 y CMV, que dirigen la molécula de EpCAM. Cuando una porción de STAR67 es funcional, las colonias sobrevivirán cuando se usan simultáneamente tanto zeocina como puromicina como agente de selección. Cuando una porción de STAR67 no es funcional, ninguna colonia sobrevivirá en condiciones de selección idénticas.

Por tanto, la colocación de STAR67 en dirección 5’ del promotor dio como resultado niveles de expresión del anticuerpo EpCAM significativamente mayores en CHO, en comparación con constructos sin STAR.

Ejemplo 8: Construcción y ensayo de un producto génico de resistencia a zeocina sin metionina interna

La idea básica detrás del desarrollo de un nuevo sistema de selección es colocar el gen que codifica el gen de resistencia en dirección 5’ de un gen de interés, y que un promotor dirija la expresión de este ARNm bicistrónico. La traducción del ARNm bicistrónico es tal que sólo en un pequeño porcentaje de sucesos de traducción el gen de resistencia se traducirá en proteína, y la mayoría del tiempo el gen de interés en dirección 3’ se traducirá en proteína. Por tanto, la eficacia de la traducción del gen de resistencia en dirección 5’ se debe impedir de forma importante en comparación con la eficacia de la traducción del gen de interés en dirección 3’. Para lograr esto, se pueden realizar tres etapas según la invención:

1) en el gen de resistencia en el ARNm, el ribosoma de búsqueda no debería encontrar preferiblemente otro AUG, puesto que cualquier AUG en dirección 3’ puede servir como codón de inicio de la traducción, dando como resultado una menor eficacia de la traducción del segundo gen de interés en dirección 3’. Por tanto, preferiblemente cualquier AUG en el ARNm del gen de resistencia tendrá que ser sustituido. En el caso en

el que este AUG sea un codón funcional que codifique una metionina, este aminoácido tendrá que ser sustituido por un aminoácido diferente, por ejemplo por una leucina (Fig. 12A y B);

2) el codón de inicio del gen de resistencia debe tener un mal contexto (ser parte de una secuencia de inicio de la traducción no óptima); es decir, los ribosomas deben comenzar la traducción en este codón de inicio sólo en un número limitado de sucesos, y por tanto en la mayoría de los sucesos deben continuar buscando un codón de inicio mejor, más óptimo (Fig. 12C-E). Se pueden distinguir tres restricciones diferentes: a) el codón de inicio ATG normal, pero colocado en un mal contexto (TTTATGT (denominado ATGmut) (Fig. 12C), b) preferiblemente cuando se coloca en un contexto óptimo, GTG puede servir como codón de inicio (ACCGTGG) (Fig. 12D), y c) preferiblemente cuando se coloca en un contexto óptimo, TTG puede servir como un codón de inicio (ACCTTGG) (Fig. 12E). La condición de traducción más rigurosa es el codón TTG, seguido del codón GTG (Fig. 12). Se espera que el ARNm de Zeo con un TTG como codón de inicio produzca la proteína menos resistente a zeocina, y por tanto comunicará la resistencia a zeocina funcional más baja a las células (Figs. 12, 13).

3) preferiblemente, el codón de inicio normal (ATG) del gen de interés en dirección 3’ debería tener un contexto de traducción óptimo (por ejemplo ACCATGG) (Fig. 13A-D). Esto garantiza que, después de que se han llevado a cabo las etapas 1 y 2, en la mayoría de los sucesos el codón de inicio del gen de interés funcionará como codón de inicio del ARNm bicistrónico.

En el ejemplo 8, se lleva a cabo la etapa 1, esto es, en el gen de resistencia a zeocina, una metionina interna existente se sustituye por otro aminoácido (Fig. 12B-E). Es importante que después de tal cambio la proteína Zeo todavía confiera resistencia a Zeocina a las células transfectadas. Puesto que no se sabe de antemano qué aminoácido cumplirá este criterio, se han intentado tres aminoácidos diferentes: leucina, treonina y valina. Los diferentes constructos con aminoácidos distintos se han ensayado entonces para determinar su capacidad para conferir todavía resistencia a zeocina a las células transfectadas.

Materiales y métodos

Construcción de los plásmidos

El marco de lectura abierto de Zeo original tiene la siguiente secuencia alrededor del codón de inicio: AAACCATGGCC (codón de inicio en negrita; SEQ. ID. NO. 83). Este es un codón de inicio con un contexto traduccional óptimo (Fig. 12A). En primer lugar, el contexto óptimo del codón de inicio del marco de lectura abierto de Zeo se cambió mediante amplificación a partir del plásmido pCMV-zeo [Invitrogen V50120], con el par de cebadores ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84): GATCTCGCGATACAGGATTTATGTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG y ZEO-WTreverse (WT=tipo salvaje; SEQ. ID. NO. 85): AGGCGAATTCAGTCCTGCTCCTCGGC, usando como molde pCMV-ZEO (Invitrogen; V50120). El producto amplificado se cortó con NruI-EcoRI, y se ligó en pcDNA3, dando como resultado pZEOATGmut.

El marco de lectura abierto de Zeo original contiene ATG en el marco, que codifica metionina en la posición 94 de los aminoácidos (de 124). Este ATG interno, que codifica la metionina en la posición 94, se cambió de tal manera que la metionina se cambió en leucina, treonina o valina, respectivamente:

1) Para sustituir el codón interno para metionina en el marco de lectura abierto de Zeo por el codón para leucina (Fig. 12B), se amplificó parte del marco de lectura abierto de Zeo usando el par de cebadores ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) y ZEO-LEUreverse (SEQ. ID. NO. 86): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCAAGGCCGGC. El producto de PCR se cortó con BamHI-Bgll y se ligó en pZEOATGmut. Esto dio como resultado pZEO(leu).

Para sustituir el codón interno para metionina en el marco de lectura abierto de Zeo por el codón para treonina (no mostrado, pero como en Fig. 12B), se amplificó parte del marco de lectura abierto de Zeo usando el par de cebadores ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) y ZEO-THRreverse (SEQ. ID. NO. 87): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTGGTGGCCGGC. El producto de PCR se cortó con BamHI-Bgll y se ligó en pZEOATGmut. Esto dio como resultado pZEO(thr).

Para sustituir el codón interno para metionina en el marco de lectura abierto de Zeo por el codón para valina (no mostrado, pero como en la Fig. 12B) (GTG), se amplificó parte del marco de lectura abierto de Zeo usando el par de cebadores ZEOforwardMUT (SEQ. ID. NO. 84) y ZEO-VALreverse (SEQ. ID. NO. 88): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCCACGCCGG. El producto de PCR se cortó con BamHI-Bgll y se ligó en pZEOATGmut. Esto dio como resultado pZEO(val).

Transfección y cultivo de células

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se cultivó en medio HAMS-F12 + 10% de suero fetal de ternera que contiene 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 37°C/5% CO2. Las células se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante. De forma breve, las células se sembraron en vasijas de cultivo y se hicieron crecer toda la

noche hasta 70-90% de confluencia. El reactivo de Lipofectamine se combinó con ADN plasmídico a una relación de 6 microlitros por microgramo (por ejemplo para una cápsula de Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de Lipofectamine), y se añadió a las células. Después de la incubación durante toda la noche, la mezcla de transfección se sustituyó por medio reciente, y las células transfectadas se incubaron adicionalmente. Tras el

5 cultivo durante toda la noche, las células se tripsinizaron y se sembraron en vasijas de cultivo recientes con medio reciente que contiene zeocina (100 ∀g/ml). Cuando las colonias individuales se hicieron visibles (aproximadamente diez días después de la transfección), las colonias se contaron.

Resultados

Se transfectaron cuatro plásmidos en células CHO-K1, 1) pZEO(WT), 2) pZEO(leu), 3) pZEO(thr), y 4) pZEO(val).

10 Las células se seleccionaron en 100 ∀g/ml de zeocina. La transfección de pZEO(leu) dio como resultado un número igual de colonias resistentes a zeocina en comparación con el control pZEO (WT). pZEO(thr) y pZEO(val) dieron menos colonias, pero las diferencias no fueron del orden de una magnitud. Por tanto, se concluyó que los cambios de la metionina interna en leucina, treonina o valina dieron todos como resultado una proteína de resistencia a zeocina que todavía es capaz de conferir resistencia a zeocina a las células transfectadas. De forma más bien

15 arbitraria, se escogió pZEO(leu) como punto de partida para crear diferentes codones de inicio en el marco de lectura abierto de Zeo. Por tanto, en los ejemplos a continuación, las metioninas de inicio así como internas se sustituyen siempre por leucina, para zeocina, pero también para otros genes marcadores seleccionables, como será claro a partir de ejemplos posteriores.

Ejemplo 9: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos de zeocina-d2EGFP con diferentes eficacias de 20 traducción.

Para crear un ARNm bicistrónico que engloba un ARNm de resistencia a zeocina mutado con menos eficacia traduccional, y el gen de d2EGFP como gen de interés en dirección 3’, se optimizó en primer lugar el codón de inicio del gen de d2EGFP (etapa 3 en el ejemplo 8). Después de eso, se crearon las diferentes versiones del gen de resistencia a zeocina. Las diferencias entre estas versiones son que tienen diferentes codones de inicio, con distinta

25 eficacia traduccional (etapa 2 en el Ejemplo 9, Figura 12C-E). Estas diferentes versiones del gen de resistencia a zeocina se clonaron en dirección 5’ del gen de d2EGFP modificado (Fig. 13).

Materiales y métodos

Creación de plásmidos

El ORF informador de d2EGFP se introdujo en pcDNA3. La secuencia alrededor del codón de inicio de este ADNc

30 de d2EGFP es GAATTCATGGG (codón de inicio en negrita; SEQ. ID. NO. 89), que no es óptima. Como una primera etapa, se amplificó d2EGFP a partir de pd2EGFP (Clontech 6010-1) con los cebadores d2EGFPforwardBamHI (SEQ. ID. NO. 90): GATCGGATCCTATGAGGAATTCGCCACCA TGGTGAGCAAGGGCGAGGAG y d2EGFPreverseNotI (SEQ. ID. NO. 91): AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACACATTGATCCTAGCAGAAG. Este producto contiene ahora un codón de inicio con un contexto traduccional óptimo (ACCATGG). Esto creó pd2EGFP, y

35 subsiguientemente el marco de lectura abierto de Zeo se ligó en pd2EGFP, dando como resultado pZEO-d2EGFP. Se señala aquí que la optimización de la secuencia de inicio traduccional del gen de interés (aquí: EGFP como un gen modelo) no es esencial pero sí preferida a fin de inclinar todavía más la frecuencia de iniciación de la traducción hacia el gen de interés.

Ahora se obtuvieron tres clases de constructos:

40 1) ATG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, pero en un mal contexto (TTTATGT) (no mostrado, pero como en la Fig. 13B) y seguido de secuencia espaciadora, en lugar del ATG óptimo (Fig. 13 A).

La secuencia espaciadora se coloca en dirección 3’ de la secuencia de ATG. En el ARN de zeocina (y posiblemente en la blasticidina), está presente una estructura secundaria, que provoca que se retrase 45 temporalmente el ribosoma. Debido a esto, en algunos casos el ribosoma puede usar un codón de inicio pobre, a pesar de ser un codón de inicio malo o estar en un contexto no óptimo para la iniciación de la traducción. Esto provoca que aumente la oportunidad de la traducción, y, en el caso de la actual invención, hace por lo tanto más baja la rigurosidad para la selección. Para disminuir este efecto, y por tanto disminuir adicionalmente la eficacia de la iniciación de la traducción, se introduce una secuencia espaciadora que no 50 contiene una estructura secundaria (Kozak, 1990). Por tanto, se introduce el término “espacio”, y se usa en los nombres del plásmido y de los cebadores para indicar la presencia de tal secuencia espaciadora. El espaciador elimina la “secuencia que retrasa el ribosoma” de la vecindad del codón de iniciación, provocando con ello que el ribosoma comience a traducir menos frecuentemente, y por tanto aumentando la rigurosidad de la selección según la invención. El espaciador introduce algunos aminoácidos extra en la 55 secuencia codificante. Esto se ha hecho en algunos casos tanto para zeocina como para blasticidina, como será manifiesto a partir de los ejemplos. La nomenclatura de los plásmidos y cebadores en general en lo siguiente sigue estas líneas: el nombre del polipéptido marcador seleccionable se cita mediante abreviatura (por ejemplo Zeo, Blas, etc); se menciona el codón de inicio (por ejemplo ATG, GTG, TTG); cuando este

codón de inicio se coloca en un contexto no óptimo para la iniciación de la traducción, se usa la adición “mut” (esto sólo se hace habitualmente para codones de inicio ATG, puesto que la combinación de un contexto no óptimo con un codón de inicio no ATG habitualmente no da como resultado una iniciación suficiente de la traducción para permitir la selección), y cuando se usa una secuencia espaciadora detrás del codón de inicio se usa la adición “space” (esto se hace habitualmente para codones de inicio “ATGmut” para los marcadores seleccionables Zeo o Blas).

El marco de lectura abierto de Zeo se amplificó con el par de cebadores ZEOforwardBamHI-ATGmut/space (SEQ. ID. NO. 93):

GATCGGATCCTTGGTTTATGTCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGA

GATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGTTGACCAGTGAAGTTC

(en el que la secuencia tras la secuencia subrayada comprende la secuencia espaciadora), y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGF, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-ATGmut/space-d2EGFP.

2) GTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, en lugar de ATG (Fig. 13C).

El marco de lectura abierto de Zeo se amplificó con el par de cebadores ZEOforwardBamHI-GTG (SEQ. ID. NO. 94): GATCGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-GTG-d2EGFP.

3) TTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, en lugar de ATG (Fig. 13D). El marco de lectura abierto de Zeo se amplificó con el par de cebadores ZEOforwardBamHI-TTG: GATCGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC (SEQ. ID. NO. 95) y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-TTG-d2EGFP.

Transfección, cultivo y análisis de células CHO

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se cultivó en medio HAMS-F12 + 10% de suero fetal de ternera que contiene 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina a 37ºC/5% CO2. Las células se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante. De forma breve, las células se sembraron en vasijas de cultivo y se hicieron crecer toda la noche hasta 70-90% de confluencia. El reactivo de Lipofectamine se combinó con ADN plasmídico a una relación de 15 microlitros por 3 microgramos (por ejemplo para una cápsula de Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de Lipofectamine), y se añadió después de 30 minutos de incubación a 25ºC a las células. Después de la incubación durante toda la noche, la mezcla de transfección se sustituyó por medio reciente, y las células transfectadas se incubaron adicionalmente. Después del cultivo durante toda la noche, las células se tripsinizaron y se sembraron en vasijas de cultivo recientes con medio reciente. Después de otra incubación durante toda la noche, se añadió zeocina a una concentración de 50 ∀g/ml, y las células se cultivaron adicionalmente. Después de otros tres días, el medio se sustituyó por medio reciente que contiene zeocina (100 ∀g/ml) y se cultivó adicionalmente. Cuando las colonias individuales se hicieron visibles (aproximadamente diez días después de la transfección), el medio se eliminó y se sustituyó por medio reciente sin zeocina. Los clones individuales se aislaron y se transfirieron a placas de 24 pocillos en medio sin zeocina. Un día después de aislar las colonias, se añadió zeocina al medio. La expresión del gen informador d2EGFP se evaluó aproximadamente 3 semanas después de la transfección. Los niveles de expresión de d2EGFP en las colonias se midió después de períodos de dos semanas.

Resultados

Células CHO-K1 se transfectaron con constructos que contienen los genes ATGmut/space Zeo (Fig. 13B), GTG Zeo (Fig. 13C) y TTG Zeo (Fig. 13D) como genes de selección, clonándose todos ellos en dirección 5’ del gen informador d2EGFP. Estos tres constructos carecían de elementos STAR (Control) o tenían elementos STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor de CMV, y STAR 7 en dirección 3’ del gen de d2EGFP (Fig. 14). La Fig. 14 muestra que ambos constructos de control (sin elementos STAR) con ATGmut/space Zeo (A) y GTG Zeo (B) dieron colonias que expresaron la proteína d2EGFP. El nivel medio de expresión de d2EGFP de 24 colonias ATGmut/space Zeo fue 46, y de colonias GTG Zeo fue 75. Este mayor nivel medio de expresión en colonias GTG Zeo puede reflejar la mayor rigurosidad de GTG, en comparación con ATGmut/space (ejemplo 8). La adición de elementos STAR 7 y 67 a dos constructos dio como resultado colonias que tuvieron mayores niveles medios de expresión de d2EGFP. La transfección del constructo ATGmut/space Zeo STAR 7/67/7 dio como resultado colonias con un nivel medio de expresión de d2EGFP de 118, que es un factor 2,6 veces mayor que la media en las células de control (46). La adición de los elementos STAR al constructo GTG Zeo dio como resultado un nivel medio de expresión de d2EGFP de 99, que es un factor 1,3 veces mayor que la media en las células de control (75).

De forma importante, no se establecieron colonias cuando se transfectó el constructo TTG Zeo. Sin embargo, el constructo con TTG Zeo, flanqueado con STARs 7 y 67, dio como resultado el establecimiento de 6 colonias, con un nivel medio de expresión de d2EGFP de 576 (Fig. 14C). De este modo, la rigurosidad de la traducción más elevada, provocada por el codón de inicio TTG (Fig. 12), conduce a los niveles de expresión de d2EGFP más elevados, como se predice en Fig. 13. Los resultados también indican que la rigurosidad del TTG Zeo solo (sin elementos STAR) es al menos, en algunos experimentos, demasiado elevada para que las colonias sobrevivan. Sin embargo, en experimentos independientes posteriores (véase más abajo), se encontraron algunas colonias con este constructo sin elementos STAR, indicando que la rigurosidad del sistema de selección con el codón de inicio TTG en el marcador de selección de zeocina no excluye necesariamente el hallazgo de colonias cuando no están presentes elementos STAR, y que el número de colonias obtenidas puede variar entre experimentos.

Se concluye que el uso de elementos STAR en combinación con el sistema de selección riguroso según la invención permite identificar fácilmente productores elevados del gen de interés.

Ejemplo 10: Establecimiento de un mayor número de colonias TTG Zeo STAR en comparación con un constructo IRES-Zeo.

Los resultados en el ejemplo 9 indican que el TTG Zeo tiene una eficacia de la traducción extremadamente rigurosa, que puede ser demasiado elevada para conferir resistencia a zeocina a las células. La transfección se aumentó de escala para ensayar si habría algunas colonias que tienen tales niveles elevados de expresión de manera que sobrevivieran. El aumento de escala del experimento podría resolver también la cuestión de si la media elevada de TTG Zeo STAR 7/67/7 sería mayor cuando se analizasen más colonias.

Materiales y métodos

Se transfectaron células CHO-K1 con los constructos que tienen el gen TTG Zeo como marcador de selección, con y sin elementos STAR 7 y 67 (Fig. 15). Las transfecciones, la selección, el cultivo, etc., fueron como en el ejemplo 9, excepto que se usaron 6 veces más células, ADN y Lipofectamine 2000. Las transfecciones y la selección se realizaron en cápsulas de Petri.

Resultados

La Fig. 15A muestra que la transfección con el constructo TTG Zeo STAR 7/67/7 dio como resultado la generación de muchas colonias con una señal media de d2EGFP de 560. Esto es tan elevado como en el ejemplo 9, excepto que ahora se analizaron 58 colonias. Cuando se compara con un constructo con el gen de resistencia a zeocina colocado detrás de una secuencia IRES (Fig. 15B), el nivel medio de expresión de d2EGFP fue 61, y cuando los elementos STAR 7 y 67 se añadieron a tal constructo, el nivel medio de expresión de d2EGFP fue 125, un factor de 2 por encima del control (Fig. 15B). La media de las colonias de TTG Zeo STAR 7/67/7 fue por lo tanto un factor 9,2 veces mayor que las colonias de IRES-Zeo sin STAR, y un factor de 4,5 veces mayor que las colonias de STAR7/67/7 IRES Zeo.

Una observación es que la forma de la curva de todas las colonias que se expresan difiere entre TTG Zeo STAR7/67/7 e IRES-Zeo STAR 7/67/7. En el primer caso (TTG Zeo), la curva se estabiliza, mientras que en el segundo caso (IRES-Zeo) la curva tiene una forma más “exponencial”. La meseta en la curva de TTG Zeo podría indicar que las células han alcanzado un nivel máximo de expresión de d2EGFP, por encima del cual los niveles de expresión de d2EGFP se hacen tóxicos y las células mueren. Sin embargo, parece más tarde que los valores elevados estuvieron próximos al valor máximo que se puedo detectar con los ajustes del detector del analizador de FACS. En experimentos posteriores, los ajustes del analizador de FACS se cambiaron para permitir la detección de valores mayores, y en algunos casos se midieron de hecho, en experimentos independientes posteriores, valores mayores que los obtenidos aquí (véase más abajo).

Debido al aumento de escala de las transfecciones, se pudieron escoger tres colonias con el constructo TTG Zeo sin STAR. Los niveles de expresión de d2EGFP de estas colonias fueron 475, 158 y 43. La última colonia murió pronto después de la primera medición. Este resultado indica que el constructo TTG Zeo puede conferir resistencia a zeocina, dando como resultado colonias que también pueden dar en algunos casos niveles elevados de expresión. Por tanto, el nuevo método de selección según la invención se puede aplicar con casetes de expresión que no contienen elementos de control de cromatina, aunque se prefiere claramente usar casetes de expresión que comprenden al menos uno de tales elementos, preferiblemente un elemento STAR.

Los resultados indican que los elementos STAR permiten un sistema de selección más riguroso según la invención, tal como se ejemplifica en este ejemplo, dando como resultado la recogida de colonias que tienen un nivel medio de expresión proteica muy elevado.

Ejemplo 11: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos Blasticidina-d2EGFP con eficacias de traducción diferenciales.

Hay cuatro ATG internos en el gen de resistencia a blasticidina, ninguno de los cuales codifica una metionina (Fig. 25A). Estos ATG se han de eliminar sin embargo (Fig. 25B), puesto que servirán como codón de inicio cuando se

haya modificado el codón de inicio ATG (o su contexto), y esto dará como resultado péptidos que no se asemejan a la proteína de resistencia a blasticidina. De forma más importante, estos ATGs evitarán la traducción eficaz del gen de interés, como se representa mediante d2EGFP en este ejemplo con fines ilustrativos. Para eliminar los ATGs internos, se amplificó en primer lugar el marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a blasticidina con

5 cuatro pares de cebadores, generando 4 fragmentos de proteína de resistencia a blasticidina. Los pares de cebadores fueron:

A) BSDBamHIforward (SEQ. ID. NO. 96):

10 GATCGGATCCACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG

BSD 150reverse (SEQ. ID. NO. 97):

GTAAAATGATATACGTTGACACCAG

15 B) BSD 150forward (SEQ. ID. NO. 98): CTGGTGTCAACGTATATCATTTTAC BSD250reverse (SEQ. ID. NO. 99): GCCCTGTTCTCGTTTCCGATCGCG C) BSD250forward (SEQ. ID. NO. 100):

CGCGATCGGAAACGAGAACAGGGC

20 BSD350reverse (SEQ. ID. NO. 101): GCCGTCGGCTGTCCGTCACTGTCC D) BSD350forward (SEQ. ID. NO. 102): GGACAGTGACGGACAGCCGACGGC

BSD399reverse (SEQ. ID. NO. 103):

25 GATCGAATTCTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC

Los fragmentos A a D se aislaron de un gel de agarosa y se mezclaron juntos. Seguidamente, sólo se usaron los cebadores BSDBamHIforward y BSD399reverse para crear el ADNc de la proteína de resistencia a blasticidina de longitud completa, pero sustituyendo todos los ATG internos. La blasticidina reconstituida se cortó entonces con

30 EcoRI-BamHI, y se clonó en pZEO-GTG-d2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI (que libera Zeo), dando como resultado pBSDmut-d2EGFP. Todo el marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a blasticidina se secuenció para verificar que se habían sustituido todos los ATGs.

Con este gen mutado que codifica proteína de resistencia a blasticidina (Blas), se obtuvieron tres clases de constructos (Fig. 25C-E):

35 1) ATG como codón de inicio, pero en un mal contexto y seguido de secuencia espaciadora. El marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a blasticidina mutado en pBSD-d2EGFP se amplificó usando los cebadores BSDforwardBamHIAvrll-ATGmut/space (SEQ. ID. NO. 104):

y BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105):

40 GATCGAATTCCCTAGGTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC,

el producto de la PCR se cortó con BamHI-EcoRI, y se ligó en pZEO-GTG-d2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI. Esto da como resultado pBSD-ATGmut/space-d2EGFP.

2) GTG como codón de inicio en lugar de ATG. El marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a blasticidina mutado en pBSDd2EGFP se amplificó usando los cebadores BSDforwardBamHIAvrII-GTG

45 (SEQ. ID. NO. 106): GATCGGATCCTAGGACCGTGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG y BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105), el producto de la PCR se cortó con BamHI-EcoRI, y se ligó en pZEO-GTG-d2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI. Esto da como resultado pBSD-GTG-d2EGFP.

3) TTG como codón de inicio en lugar de ATG. El marco de lectura abierto de blasticidina mutado en pBSDd2EGFP se amplificó usando los cebadores BSDforwardBamHIAvrII-TTG (SEQ. ID. NO. 107):

50 GATCGGATCCTAGGACCTTGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG y BSD399reverseEcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105), el producto de la PCR se cortó con BamHI-EcoRI, y se ligó en pZEO-GTG-d2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI. Esto da como resultado pBSD-TTG-d2EGFP.

Resultados

Se transfectaron células CHO-K1 con constructos que contienen los genes GTG Blas (Fig. 16A) y TTG Blas (Fig. 16B) como gen de selección, clonándose todos en dirección 5’ del gen informador d2EGFP. La selección tuvo lugar en presencia de 20 ∀g/ml de blasticidina. Los dos constructos carecían de elementos STAR (Control), o tenían elementos STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor de CMV, y STAR7 en dirección 3’ del gen d2EGFP (Fig. 16). La Fig. 16 muestra que ambos constructos de control (sin elementos STAR) con GTG Blas (A) y TTG Blas (B) dieron colonias que expresaron la proteína d2EGFP. La señal media de d2EGFP de 24 colonias GTG Blas fue 14,0 (Fig. 16A), y la de las colonias TTG Blas fue 81 (Fig. 16B). Este mayor nivel medio de expresión en colonias TTG Blas puede reflejar la mayor rigurosidad de TTG, en comparación con GTG (véase también el ejemplo 9). Sin embargo, sólo sobrevivieron 8 colonias bajo las condiciones TTG más restrictivas.

La adición de elementos STAR 7 y 67 a los constructos dio como resultado colonias que tuvieron mayores niveles medios de expresión de d2EGFP. La transfección del constructo GTG Blas STAR 7/67/7 dio como resultado colonias con un nivel medio de expresión de d2EGFP de 97,2 (Fig. 16A), que es un factor 6,9 veces mayor que la media en las células de control (14,0). La adición de elementos STAR al constructo TTG Blas dio como resultado una señal media de d2EGFP de 234,2 (Fig. 16B), que es un factor 2,9 mayor que la media en las células de control (81). Sin embargo, obsérvese nuevamente que sólo sobrevivieron 8 colonias a las condiciones duras de selección de TTG Blas, mientras que sobrevivieron 48 colonias con TTG Blas STAR 7/67/7. Cuando se comparan solamente los cinco valores más elevados, la media de los cinco TTG Blas más elevados fue 109,1, y la media de los cinco TTG Blas STAR 7/67/7 más elevados fue 561,2, que es un factor 5,1 veces mayor.

Los resultados indican que los elementos STAR permiten un sistema de selección más riguroso, dando como resultado la recogida de colonias que tienen un nivel medio de expresión proteica muy elevado. También muestran que esta selección no está restringida a la proteína de resistencia a zeocina sola, sino que también se pueden usar otros polipéptidos marcadores de selección, en este caso la proteína de resistencia a blasticidina.

Ejemplo 12: Estabilidad de la expresión de d2EGFP en el nuevo sistema de selección.

Las colonias descritas en el ejemplo 10 se cultivaron adicionalmente en varias condiciones para evaluar la estabilidad de la expresión de d2EGFP a lo largo de un período de tiempo prolongado.

Resultados

Las colonias que contienen TTG Zeo STAR 7/67/7 en la Fig. 15A se cultivaron durante 70 días adicionales en presencia de 100 ∀g/ml de zeocina. Como se muestra en la Fig. 17, la señal media de d2EGFP aumentó desde 560,2 después de 35 días hasta 677,2 después de 105 días. Excepto por algunas colonias raras, todas las colonias tuvieron un mayor nivel de expresión de d2EGFP.

Cuando el nivel de zeocina se redujo hasta 20 ∀g/ml de zeocina, todavía hubo un incremento en el nivel medio de expresión de d2EGFP, desde 560,2 después de 35 días hasta 604,5 después de 105 días (Fig. 18).

Cuando no había presión de selección en absoluto debido a la eliminación de la zeocina del medio de cultivo, aproximadamente 50% de las colonias se convirtieron en un mosaico, esto es, dentro de una colonia se manifestaron células que no expresan d2EGFP. Esto dio como resultado una reducción de los niveles de expresión de d2EGFP a menos de 50% de los niveles originales. Si la señal se hizo menor que 67% (disminución de al menos un tercio) desde la señal original, la colonia se consideró que era inestable con respecto a la expresión de d2EGFP. De las 57 colonias originales, 27 colonias permanecieron estables según este criterio; la señal media de d2EGFP de estas colonias después de 35 días (mientras todavía estaban bajo presión de selección) fue 425,6, mientras que la señal media de d2EGFP sin presión de selección después de 65 días fue 290,0. Cuando se midió después de 105 días, la señal media en las 27 colonias fue 300,9. Por tanto, después de una disminución inicial, los niveles de expresión en las 27 colonias permanecieron estables según este criterio (Fig. 19).

Seis de las colonias se sometieron a una ronda de subclonación. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de tal manera que cada pocillo contuvo aproximadamente 0,3 células. No había zeocina en el medio, de manera que, desde el comienzo, los subclones crecieron sin presión de selección. De cada colonia original, se aislaron al azar seis subclones y se hicieron crecer en placas de 6 pocillos hasta el análisis. En la Fig. 23 se comparan los valores originales de los clones originales, como ya se mostraron en la Fig. 15 A, con uno de los subclones. En uno de los seis clones (clon 25), no había ningún subclón con señal de d2EGFP en el intervalo del clon original. Sin embargo, en cinco de seis casos, al menos uno de los sbuclones tuvo niveles de expresión de d2EGFP iguales al clon progenitor. Estos niveles de expresión se determinaron después de 50 días sin presión de selección. Se concluye que una ronda de subclonación es suficiente para obtener un número elevado de colonias que permanecen estables para la expresión elevada en ausencia de presión de selección. Esto se ha confirmado en un experimento similar (no mostrado).

Se comparó el número de copias que se integraron en las colonias TTG Zeo STAR 7/67/7. Se aisló ADN cuando las colonias estuvieron 105 días bajo presión de selección de zeocina (véase la Fig. 17). Como se muestra en la Fig. 24, se pudieron distinguir dos subpoblaciones. En la Fig. 24, el corte se realizó a 20 copias, y se calculó el valor R2 y se

muestra. También se muestra el valor R2 a partir de datos con copias mayores de 20. En el intervalo de la señal de d2EGFP de 100 a 800, hubo un grado elevado de dependencia del número de copias, como se denota mediante un R2 relativamente elevado de 0,5685 (Fig. 24). Sin embargo, la población de colonias que fluctúa alrededor de una señal de d2EGFP de 800, se observó una variación elevada en el número de copias (Fig. 24), como se denota con R2 bajo de 0,0328. Juntos, los datos muestran que, en el nuevo sistema de selección, en colonias que contienen constructos TTG Zeo STAR 7/67/7, hay una expresión de d2EGFP dependiente del número de copias hasta ∃20 copias. También, aunque la dependencia del número de copias se pierde cuando hay >20 copias, todavía una proporción sustancial de las colonias con una señal de d2EGFP elevada (>800) tienen no más de 30 copias (Fig. 24). Esta combinación entre expresión elevada de d2EGFP y un número relativamente bajo de copias (entre 10 y 30) puede ser importante para identificar colonias que siguen siendo relativamente estables sin presión de selección. Es una ventaja tener clones con números relativamente bajos de copias (menos de alrededor de 30, más preferiblemente menos de alrededor de 20) que dan niveles elevados de expresión, debido a que se cree que tales clones son menos susceptibles a la inestabilidad genética. El presente sistema de selección permite generar tales clones, incluyendo a partir de células CHO.

Ejemplo 13: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos zeocina-blasticidina-EpCAM con eficacias de traducción diferenciales.

Para ensayar el sistema de selección en la producción de un anticuerpo, se tomó como ejemplo el anticuerpo anti-EpCAM (véase también el ejemplo 5).

Resultados

Se creó un plásmido en el que tanto la cadena pesada (HC) como la cadena ligera (LC) se colocaron cada una en una unidad de transcripción separada (Fig. 20-22). La expresión de ambas cadenas fue conducida por el promotor de CMV. En dirección 5’ de la cadena pesada de EpCAM, se colocó el gen de resistencia a zeocina, ya sea con el ATGmut/space (Fig. 20), GTG (Fig. 21) o TTG (Fig. 22) como codón de inicio (véase el ejemplo 9). En dirección 5’ de la cadena ligera de EpCAM, se colocó el gen de resistencia a blasticidina, ya sea con el ATGmut/space (Fig. 20), GTG (Fig. 21) o TTG (Fig. 22) como codón de inicio (véase el ejemplo 11). Se obtuvieron dos tipos de constructos, un constructo sin elementos STAR (Control) y un constructo con una combinación de elementos STAR 7 y 67. Los elementos STAR se colocaron según lo siguiente: en dirección 5’ de cada promotor de CMV (es decir, uno para la unidad de transcripción que comprende HC, y uno para la unidad de transcripción que comprende LC) se colocó STAR 67, y el constructo resultante se flanqueó con un elemento STAR 7 5’ y 3’ (Figs. 20-22). Todos los constructos se transfectaron a células CHO-K1, y se seleccionaron en 100 ∀g/ml de zeocina y 20 ∀g/ml de blasticidina (al mismo tiempo). Después de la selección, se aislaron colonias independientes y se propagaron bajo presión de selección continua (usando 100 ∀g/ml de zeocina y 20 ∀g/ml de blasticidina). La Fig. 20 muestra que la combinación STAR 7/67/7 tuvo un efecto beneficioso sobre la producción de EpCAM. El ATGmut/space Zeo y ATGmut/space Blas no tuvieron efectos sobre el número de colonias que se formaron con plásmidos que contienen o no elementos STAR. Sin embargo, los niveles medios de expresión de EpCAM de 24 colonias de control frente a colonias STAR 7/67/7 osciló desde 0,61 pg/célula/día en el control hasta 3,44 pg/célula/día en el constructo STAR7/67/7 (Fig. 20). Esto es un factor de 5,6 de incremento. Puesto que hubo muchas colonias en el control ATGmut/space con 0 pg/célula/día, también se comparó la producción media de EpCAM en las cinco colonias más elevadas. En el ATGmut/space de control, esta fue de 3,0 pg/célula/día, frente a 7,8 pg/célula/día con el constructo ATGmut/space STAR 7/67/7, un incremento de un factor de 2,6.

La Fig. 21 también muestra que la combinación STAR 7/67/7 tuvo un efecto beneficioso sobre la producción de EpCAM, usando el codón de inicio GTG para los marcadores. Con el constructo GTG Zeo y GTG Blas STAR 7/67/7, se formaron aproximadamente 2 veces más colonias. También, los niveles medios de expresión de EpCAM de 24 colonias de control frente a colonias STAR 7/67/7 osciló desde 2,44 pg/célula/día en el control hasta 6,51 pg/célula/día en el constructo STAR7/67/7 (Fig. 21). Este es un factor de 2,7 de incremento. También se comparó la producción media de EpCAM en las cinco colonias más elevadas. En el GTG de control, esta fue 5,7 pg/célula/día, frente a 13,0 pg/célula/día con el constructo GTG STAR 7/67/7, un incremento de un factor de 2,3. También obsérvese que la producción media de EpCAM mediada por el codón de inicio GTG para los marcadores de selección fue significativamente mayor que con el codón de inicio ATGmut/space.

La Fig. 22 muestra que con el constructo de control TTG Zeo y TTG Blas no se formaron colonias, de manera similar como en el ejemplo 9. Con el constructo STAR 7/67/7 TTG se formaron colonias. Los niveles medios de expresión de EpCAM de las colonias STAR 7/67/7 TTG fue 10,4 pg/célula/día (Fig. 22). Esto es nuevamente mayor que con el ATGmut/space y GTG como codón de inicio (véanse las Figs. 20, 21 para comparación). La producción media de EpCAM en las cinco colonias TTG STAR 7/67/7 más elevadas fue 22,5 pg/célula/día.

Los resultados muestran que el sistema de selección también se puede aplicar a dos polipéptidos producidos simultáneamente, en este caso dos polipéptidos de una proteína multimérica, según sea el caso, un anticuerpo. La producción de EpCAM sigue estrechamente los resultados obtenidos con d2EGFP. El TTG como codón de inicio es más restrictivo que el codón de inicio GTG, que a su vez es más restrictivo que el ATGmut/space (Figs. 12 y 13). Una mayor rigurosidad da como resultado un número decreciente de colonias, sin colonias en el caso del control de

TTG, que no tiene elementos STAR, y una mayor restricción del marcador de selección está acoplado a una mayor expresión de la proteína de interés.

Ejemplo 14: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos GTG zeocina-d2EGFP adicionales con eficacias de traducción diferenciales.

En el Ejemplo 8 se describieron diferentes versiones del gen de resistencia a zeocina con codones de inicio mutados. Además de los codones GTG descritos (Ejemplo 8, Fig. 33A), son posibles codones de inicio modificados adicionales con eficacia traduccional distinta. Estas versiones diferentes del gen de resistencia a zeocina se crearon (Fig. 33) y se clonaron en dirección 5’ del gen de d2EGFP modificado, como en el Ejemplo 9.

Materiales y métodos

Creación de plásmidos

Se obtuvieron cuatro constructos GTG adicionales:

1) GTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo (Fig. 33A), pero seguido de una secuencia espaciadora (Fig. 33B). El marco de lectura abierto de mutspace-Zeo se amplificó con el par de cebadores GTGspaceBamHIF (SEQ. ID. NO. 122):

GAATTCGGATCCACCGTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG y

(en el que la secuencia que sigue a la secuencia subrayada comprende la secuencia espaciadora), y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-GTGspace-d2EGFP.

2) GTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, pero en un mal contexto (TTTGTG) (Fig. 33C). El marco de lectura abierto de Zeo se amplificó con el par de cebadores ZEOTTTGTGBamHIF (SEQ. ID. NO. 123):

GAATTCGGATCCTTTGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG y

ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO(leu)-TTTGTG-d2EGFP.

3) GTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, en lugar de ATG (Fig. 33A), pero con una mutación adicional en el marco de lectura abierto de Zeo en Pro9, que se sustituyó por treonina (Thr) (Fig. 33D). La mutación Thr9 se introdujo amplificando el marco de lectura abierto de Zeo con el par de cebadores ZEOForwardGTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 124):

AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTACCGTGCTC

y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-GTG-Thr9-d2EGFP.

4) GTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, en lugar de ATG (Fig. 33A), pero con una mutación adicional en el marco de lectura abierto de Zeo en Pro9, que se sustituyó por fenilalanina (Phe) (Fig. 33E). La mutación Phe9 se introdujo amplificando el marco de lectura abierto de Zeo con el par de cebadores ZEOForward GTG-Phe9 (SEQ. ID. NO. 125):

AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTTTCGTGCTC

y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de la PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-GTG-Phe9-d2EGFP.

Transfección, cultivo y análisis de células CHO

La transfección, el cultivo y el análisis de células CHO-K1 se realizó como en el Ejemplo 8.

Resultados.

Células CHO-K1 se transfectaron con constructos que contienen los genes de GTG Zeo (Fig. 33A), GTG space Zeo (Fig. 33B), TTT GTG Zeo (también denominado: GTGmut Zeo) (Fig. 33C), GTG Thr9 Zeo(leu) (Fig. 33D) y GTG Phe9 Zeo(leu) (Fig. 33D) como gen de selección, clonándose todos ellos en dirección 5’ del gen informador de d2EGFP. Estos cinco constructos carecían de elementos STAR (Control) o tenían elementos STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor de CMV, y STAR 7 en dirección 3’ del gen de d2EGFP (Fig. 33). La Fig. 34 muestra que, de los constructos de control sin elementos STAR, solamente el constructo GTG Zeo sin elementos STAR dio colonias que expresaron la proteína d2EGFP. Por el contrario, todos los constructos que contienen elementos STAR dieron colonias que expresaron proteína d2EGFP. La señal media de fluorescencia de d2EGFP de 11 colonias de

Control de GTG Zeo fue 20,3, de 13 colonias GTG Zeo con los STAR 7/67/7 104,9, de 24 colonias GTG space Zeo 7/67/7 201,5, de 6 colonias TTT GTG Zeo 7/67/7 310,5, de 22 colonias GTG Thr9 Zeo 7/67/7 423, y de 16 colonias GTG Phe9 Zeo 550,2 (Fig. 34).

Las mayores restricciones de las nuevas mutaciones GTG se correlacionan con mayores señales medias de

5 fluorescencia (Fig. 34). Sin embargo, el TTT GTG Zeo 7/67/7 dio solamente dos colonias con nivel elevado de expresión, y unas pocas colonias con un nivel bajo de expresión. Esto puede indicar que esta mutación está al borde de la restricción que estas células pueden soportar con una concentración fija de zeocina añadida al medio de cultivo.

Las mutaciones Thr9 y Phe9 no influyen en la eficacia de la traducción de los mutantes de Zeo. En su lugar, reducen

10 la funcionalidad de la proteína de resistencia a zeocina, evitando una interacción óptima entre las dos mitades de la proteína de resistencia a zeocina (Dumas et al, 1994). Esto implica que se ha de producir más proteína para lograr resistencia frente a la zeocina en el medio de cultivo. Como consecuencia, todo el casete se ha de transcribir a un mayor nivel, dando como resultado eventualmente un mayor nivel de expresión de d2EGFP.

Se concluye que el uso de las eficacias de traducción descritas del ARNm de resistencia a zeocina da como 15 resultado mayores niveles de expresión de la proteína d2EGFP, esto en combinación con elementos STAR.

Este ejemplo demuestra además la posibilidad de proporcionar un ajuste fino de la restricción del sistema de selección de la invención para lograr niveles óptimos de expresión de una proteína de interés. Claramente, la persona experta en la técnica será capaz de combinar estas y otras posibilidades dentro de los conceptos descritos aquí (por ejemplo mutar la zeocina en la posición 9 a otros aminoácidos, o mutarla en otras posiciones; usar un GTG 20 u otro codón de inicio en un contexto de iniciación de la traducción no óptimo para zeocina u otros marcadores de selección; o mutar otros marcadores de selección para reducir su funcionalidad, por ejemplo usar una secuencia que codifica un gen de resistencia a neomicina que tiene una mutación en el resto de aminoácidos 182 o 261, o ambos, véase por ejemplo el documento WO 01/32901), y similar, para proporcionar tal ajuste fino, y, simplemente ensayando, determinar una combinación adecuada de rasgos para el marcador de selección, conduciendo a una

25 expresión mejorada del polipéptido de interés.

Ejemplo 15: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos TTG Zeocina-d2EGFP adicionales con eficacias de traducción diferenciales.

En el Ejemplo 8 se describieron diferentes versiones del gen de resistencia a zeocina con codones de inicio mutados. Además de los codones TTG descritos (Fig. 35A), son posibles codones de inicio modificados adicionales,

30 con distinta eficacia traduccional. Estas diferentes versiones del gen de resistencia a zeocina se crearon y se clonaron en dirección 5’ del gen de d2EGFP modificado (Fig. 35).

Materiales y métodos

Creación de plásmidos

Se obtuvieron tres constructos TTG adicionales:

35 1) TTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo (Fig. 35A), pero seguido de una secuencia espaciadora (Fig. 35B). El marco de lectura abierto de Zeo (con la secuencia espaciadora) se amplificó con el par de cebadores TTGspaceBamHIF (SEQ. ID. NO. 126):

GAATTCGGATCCACCTTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG y

ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de la PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en 40 pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-TTGspace-d2EGFP.

2) TTG como codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo en lugar de ATG (Fig. 35A), pero con una mutación adicional en el marco de lectura abierto de Zeo en Pro9, que se sustituyó por treonina (Thr) (Fig. 35C). La mutación Thr9 se introdujo amplificando el marco de lectura abierto de Zeo con el par de cebadores ZEOForwardTTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 127):

45 AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTACCGTGCTC

y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de la PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-TTG-Thr9-d2EGFP.

3) TTG como un codón de inicio en el gen de resistencia a Zeo, en lugar de ATG (Fig. 35A), pero con una mutación adicional en el marco de lectura abierto de Zeo en Pro9, que se sustituyó por fenilalanina (Phe)

50 (Fig. 35D). La mutación Phe9 se introdujo amplificando el marco de lectura abierto de Zeo con el par de cebadores ZEOForwardTTG-Phe9 (SEQ. ID. NO. 128):

AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTTTCGTGCTC 5

y ZEOWTreverse (SEQ. ID. NO. 85), el producto de la PCR se cortó con EcoRI-BamHI, y se ligó en pd2EGFP, cortado con EcoRI-BamHI, creando pZEO-TTG-Phe9-d2EGFP.

Resultados

Se transfectaron células CHO-K1 con constructos que contienen los genes TTG Zeo (Fig. 35A), TTGspace Zeo (Fig. 35B), TTG Thr9 Zeo (Fig. 35C) y TTG Phe9 Zeo (Fig. 35D) como gen de selección, clonándose todos ellos en dirección 5’ del gen informador de d2EGFP. Estos cuatro constructos carecían de elementos STAR (Control), o tenían elementos STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor de CMV, y STAR 7 en dirección 3’ del gen de d2EGFP (Fig. 35). La Fig. 36 muestra que, de los constructos de control sin elementos STAR, solamente el constructo TTG Zeo sin elementos STAR dio colonias que expresaron la proteína d2EGFP. Por el contrario, todos los constructos que contienen elementos STAR dieron colonias que expresaron la proteína d2EGFP. La señal media de fluorescencia de d2EGFP de 3 colonias de Control de TTG Zeo fue 26,8, de 24 colonias TTG Zeo con los STARs 7/67/7 426,8, de 24 colonias TTGspace Zeo 7/67/7 595,7, de 2 colonias TTG Thr9 Zeo 7/67/7 712,1, y de 3 colonias TTG Phe9 Zeo 677,1 (Fig. 36).

Las mayores restricciones de las nuevas mutaciones TTG se correlacionan con mayores señales medias de fluorescencia (Fig. 36). Sin embargo, los constructos TTG Thr9 Zeo 7/67/7 y TTG Phe9 Zeo 7/67/7 solamente dieron dos colonias de expresión elevada cada una, y unas pocas colonias de baja expresión. Esto puede indicar que estas mutaciones están en el borde de la restricción que las células pueden soportar con una concentración fija de zeocina añadida al medio de cultivo.

Se concluye que el uso de las eficacias de traducción descritas del ARNm de resistencia a zeocina da como resultado mayores niveles de expresión de la proteína d2EGFP, esto en combinación con elementos STAR.

Ejemplo 16: Creación y ensayo de constructos bicistrónicos de puromicina-d2EGFP con eficacias de traducción diferenciales.

Hay tres ATGs internos en el gen de resistencia a puromicina, cada uno de los cuales codifica una metionina (Fig. 28, Fig. 37A). Estos ATGs se han de eliminar (Fig. 37B, C), puesto que servirán como codón de inicio cuando se ha modificado el codón de inicio ATG (o su contexto), y esto dará como resultado péptidos que no se asemejan a la proteína de resistencia a puromicina. De forma más importante, estos ATGs evitarán la traducción eficiente del gen de interés, como se representa mediante d2EGFP en este ejemplo con fines ilustrativos. Las metioninas se cambiaron por leucina, como en la proteína de resistencia a zeocina (ejemplo 8). Sin embargo, en lugar de usar el codón TTG para leucina (por ejemplo en zeocina en el ejemplo 8), ahora se escogió el codón CTG para leucina (en seres humanos, para leucina, el codón CTG se usó más a menudo que el codón TTG). Para eliminar los ATGs internos, se amplificó en primer lugar el marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a puromicina con 4 pares de cebadores, generando 4 fragmentos de proteína de resistencia a puromicina. Los pares de cebadores fueron:

PURO BamHI F (SEQ. ID. NO. 129):

GATCGGATCCATGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGT,

PURO300 R LEU (SEQ. ID. NO. 130):

CAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCAGGCGCGGGC; y

PURO300FLEU (SEQ. ID. NO. 131):

CGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGCTGGAAGGCCTC,

PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132):

AAGCTTGAATTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCAGGCACCAGGTC.

Esto genera dos productos de PCR, que corresponden a la parte 5’ y 3’ del gen de resistencia a puromicina. Los dos productos se añadieron juntos y se amplificaron con PURO BamHI F (SEQ. ID. NO. 129) -PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132). El producto de PCR resultante se cortó con BamHI-EcoRI y se ligó, creando pCMV-ATGPURO (leu). La secuenciación de este clon verificó que se habían convertido los tres ATGs internos. Todo el marco de lectura abierto de puromicina se amplificó entonces con PUROBamHl TTG IF (SEQ. ID. NO. 133):

GAATTCGGATCCACCTTGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGTG y

PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132). Este cebador introduce un codón extra (GTT) directamente después del codón de inicio TTG, debido a que se introduce el “G” en el nucleótido +4 para un contexto óptimo, y por tanto se introducen dos nucleótidos más para conservar el marco de lectura.

Resultados

Se transfectaron células CHO-K1 con el constructo que contiene el gen TTG Puro (Fig. 38) como gen de selección, clonado en dirección 5’ del gen informador d2EGFP. La selección se realizó en 10 ∀g/ml de puromicina. El constructo carecía de elementos STAR (Control), o poseía elementos STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor de CMV, y STAR 7 en dirección 3’ del gen de d2EGFP (Fig. 38). La Fig. 38 muestra que la señal media de fluorescencia de d2EGFP de 24 colonias de control de TTG Puro fue 37,9, de 24 colonias TTG Puro con STARs 7/67/7 75,5. Además, cuando se toma la media de los cinco valores más elevados, la señal de fluorescencia de d2EGFP de colonias de Control de TTG Puro fue 69,5, y de colonias TTG Puro con STARs 7/67/7 186,1, un incremento de casi tres veces en la señal de fluorescencia de d2EGFP. Esto muestra que la eficacia de traducción modificada, descrita, del ARNm de resistencia a puromicina da como resultado mayores niveles de expresión de la proteína d2EGFP, esto en combinación con elementos STAR.

Este experimento demuestra que el gen de resistencia a puromicina se puede mutar para eliminar las secuencias ATG de él, a la vez que sigue siendo funcional. Además, se concluye que el método de selección de la invención también funciona con todavía otro marcador de selección, puromicina.

Ejemplo 17: Creación y ensayo de constructos de neomicina con eficacias de traducción diferenciales.

Hay dieciséis ATGs internos en el gen de resistencia a neomicina, cinco de los cuales codifican una metionina en el marco de lectura abierto de neomicina (Fig. 31, Fig. 39A). Estos dieciséis ATGs se han de eliminar (Fig. 39B, C), puesto que servirán como codón de inicio cuando se ha modificado el codón de inicio ATG (o su contexto), y esto dará como resultado péptidos que no se asemejan a la proteína de resistencia a neomicina, y esto disminuirá la traducción desde el marco de lectura abierto en dirección 3’ que codifica el péptido de interés en las unidades de transcripción de la invención. Para eliminar los ATGs internos, el marco de lectura abierto de la proteína de resistencia a neomicina se sintetizó completamente por un proveedor comercial (GeneArt, Alemania), en el que todos los ATGs codificantes internos (para Met) se sustituyeron por CTGs (que codifican Leu), y los ATGs no codificantes se sustituyeron de manera que se usó un codón degenerado y por tanto no se produjeron mutaciones en la secuencia proteica; la secuencia sintetizada de la neomicina se da en SEQ. ID. NO. 134. A fin de sustituir el codón de inicio ATG por GTG (Fig. 39B) o TTG (Fig. 39C), se amplificó el gen de neomicina sintetizado con pares de cebadores NEO-F-Hindlll (SEQ. ID. NO. 136):

GATCAAGCTTTTGGATCGGCCATTGAAACAAGACGGATTG y

NEO EcoRI 800R (SEQ. ID. NO. 137): AAGCTTGAATTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG.

Resultados

Se usaron bacterias de E. coli para ensayar la funcionalidad de la proteína de resistencia a neomicina de la que se eliminaron todos los ATGs. Las bacterias de E. coli se transformaron con los constructos que contienen el gen GTG Neo (Fig. 39B) o TTG Neo (Fig. 39C) como gen de selección. La selección tuvo lugar haciendo crecer las bacterias en kanamicina. Sólo un gen de resistencia a neomicina funcional puede dar resistencia frente a kanamicina. La transformación con cualquier gen Neo modificado dio como resultado la formación de colonias de E. coli, a partir de las cuales se pudo aislar el plásmido que contiene el gen. Esto muestra que las eficacias de traducción modificadas, descritas, de los ARNm de resistencia a Neomicina, así como la eliminación de todos los ATGs del marco de lectura abierto de Neo, da como resultado la producción de proteína de resistencia a neomicina funcional.

Los genes de resistencia a neomicina mutados se incorporan en una unidad de transcripción multicistrónica de la invención, y se usan para la selección con G418 o neomicina en células hospedantes eucariotas.

Ejemplo 18: Creación y ensayo de constructos de dhfr con eficacias de traducción diferenciales.

Hay ocho ATGs internos en el gen de dhfr, seis de los cuales codifican una metionina en el marco de lectura abierto de dhfr (Fig. 29, Fig. 40A). Todos estos ATGs se han de eliminar (Fig. 40B, C), puesto que servirán como codón de inicio cuando se ha modificado el codón de inicio ATG (o su contexto), y esto dará como resultado péptidos que no se asemejan a la proteína dhfr, y disminuirá la traducción a partir del marco de lectura abierto en dirección 3’ que codifica el polipéptido de interés en las unidades de transcripción de la invención. Para eliminar los ATGs internos, se sintetizó completamente el marco de lectura abierto de la proteína dhfr (SEQ. ID. NO. 138), como se describe anteriormente para neomicina. A fin de sustituir el codón de inicio ATG por GTG (Fig. 40B) o TTG (Fig. 40C), se

amplificó el gen de DHFR sintetizado con GATCAAGCTTTTGTTCGACCATTGAACTGCATCGTC AGCTTGAATTCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTTC.: los y cebadores DHFR-E DHFR-F-Hindlll coRI-600-R (SEQ. (SEQ. ID. ID. NO. NO. 140): 141):

Resultados

Se usaron bacterias de E. coli para ensayar la funcionalidad de la proteína dhfr, de la que se eliminaron todos los ATGs. E. coli se transformó con los constructos que contienen el gen GTG dhfr (Fig. 40B) o TTG dhfr (Fig. 40C). La selección tuvo lugar haciendo crecer las bacterias en trimetoprima (Sigma T7883-56). Sólo un gen de dhfr funcional puede dar resistencia frente a trimetoprima. La transformación con cualquier gen de dhfr modificado dio como resultado la formación de colonias de E. coli, a partir de las cuales se pudo aislar el plásmido que contiene el gen.

Esto muestra que las eficacias de traducción modificadas, descritas, de los ARNm de dhfr, así como la eliminación de todos los ATGs del marco de lectura abierto de dhfr, dan como resultado la producción de proteína dhfr funcional.

Los genes de dhfr mutados se incorporan en una unidad de transcripción multicistrónica de la invención, y se usan para la selección con metotrexato en células hospedantes eucariotas.

Ejemplo 20: Ensayo de constructos de zeocina y blasticidina con eficacias de traducción diferenciales en células PER.C6.

Se ensayaron en la línea celular PER.C6 diversos gentes de zeocina y de blasticidina con codones de inicio mutados, todos clonados en dirección 5’ del gen de d2EGFP.

Resultados

Las modificaciones del gen de resistencia GTG Zeocina y GTGspace Zeocina (véase también el Ejemplo 14; Fig. 41) y las modificaciones del gen de resistencia GTG Blasticidina y TTG Blasticidina (véase también el Ejemplo 11; Fig. 42), todos clonados en dirección 5’ del gen d2EGFP, se transfectaron a células PER.C6. Como se muestra en la Fig. 41, la transfección con el gen tanto de GTG Zeocina como de GTGspace Zeocina dio como resultado colonias que expresaron d2EGFP. La señal media de fluorescencia de d2EGFP de 20 colonias GTG Zeo fue 63,8, mientras que la señal media de d2EGFP de 20 colonias GTGspace Zeo fue 185, demostrando que también en células PER.C6 el GTGspace Zeo tiene una restricción de traducción mayor que el ARNm de GTG Zeo.

Como se muestra en la Fig. 42, la transfección con el gen tanto GTG Blasticidina como TTG Blasticidina dio como resultado colonias que expresaron d2EGFP. La señal media de fluorescencia de d2EGFP de 20 colonias GTG Blasticidina fue 71,4, mientras que la señal media de d2EGFP de 20 colonias TTG Blasticidina fue 135, demostrando que también en células PER.C6 el TTG Blasticidina tiene una restricción de traducción mayor que el ARNm de GTG Blasticidina.

Este ejemplo demuestra que el sistema de selección de la invención también se puede usar en otras células distintas de las células CHO.

Ejemplo 21: Ensayo de la adición de una señal de pausa transcripcional a un constructo TTG Zeocinad2EGFP.

Se piensa que una secuencia de Pausa de la TRAnscripción (TRAP) evita, al menos en parte, la formación de ARN antisentido, o, al menos en parte, evita que entre la transcripción en dicha unidad de expresión proteica (véase el documento WO 2004/055215). Una secuencia TRAP se define funcionalmente como una secuencia que, cuando se coloca en una unidad de transcripción, da como resultado un nivel reducido de transcripción del ácido nucleico presente en el lado 3’ de la TRAP, cuando se compara con el nivel de transcripción observado en el ácido nucleico en el lado 5’ de la TRAP, y los ejemplos no limitantes de secuencias TRAP son las señales de terminación de la transcripción. A fin de que funcione para evitar o disminuir que la transcripción entre en la unidad de transcripción, la TRAP se ha de colocar en dirección 5’ de un promotor que dirige la expresión de la unidad de transcripción, y la TRAP debería estar en una dirección 5’ a 3’. A fin de evitar al menos en parte la formación de ARN antisentido, la TRAP debería estar localizada en dirección 3’ del marco de lectura abierto en una unidad de transcripción, y presente en una dirección 3’ a 5’ (esto es, en una orientación opuesta a la de la orientación normal de una secuencia de terminación de la transcripción que está presente habitualmente detrás del marco de lectura abierto en una unidad de transcripción). Se prefiere una combinación de una TRAP en dirección 5’ del promotor en una orientación 5’ a 3’ y una TRAP en dirección 3’ del marco de lectura abierto en una orientación 3’ a 5’. La adición de una secuencia TRAP a un elemento STAR mejora los efectos de los elementos STAR sobre la expresión transgénica (véase el documento WO 2004/055215). Aquí, se ensayaron los efectos de la secuencia TRAP en el contexto del gen de resistencia a TTG Zeo.

Resultados

El casete TTG Zeocina-d2EGFP, que estaba flanqueado con elementos STAR7 (Fig. 43), se modificó mediante adición de la secuencia TRAP SPA/pause (véase el documento WO 2004/055215); SEQ. ID. NO. 142), ambos en dirección 5’ del 5’ STAR7 (en dirección 5’ a 3’) y en dirección 3’ del 3’ STAR 7 (en dirección 3’ a 5’) (Fig. 43). Los vectores que contienen tanto STAR 7/7 como TRAP-STAR 7/7-TRAP se transfectaron a CHO-K.1. Se aislaron colonias estables, y se midieron las intensidades de fluorescencia de d2EGFP. Como se muestra en la Fig. 43, la señal media de fluorescencia de d2EGFP de 23 colonias TTG Zeo STAR 7/7 fue 455,1, mientras que la señal media de fluorescencia de d2EGFP de 23 colonias TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP fue 642,3. La señal media de fluorescencia de d2EGFP en las 5 colonias TTG Zeo STAR 7/7 más elevadas fue 705,1, mientras que la señal media de fluorescencia de d2EGFP de 5 colonias TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP fue 784,7.

Este resultado indica que la adición de las TRAPs no potencia la señal de fluorescencia de d2EGFP en las colonias más elevadas, sino que hay una elevación significativa en el número de colonias de expresión elevada. Mientras que sólo 5 colonias TTG Zeo STAR 7/7 tuvieron una señal de d2EGFP por encima de 600, 17 colonias TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP tuvieron una señal de fluorescencia de d2EGFP por encima de 600.

En el experimento, se transfectaron 3 ∀g de ADN de cada plásmido. Sin embargo, mientras que la eficacia de la transfección fue similar, el número total de colonias con el plásmido TTG Zeo STAR 7/7 fue 62, mientras que el número total de colonias con el plásmido TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP fue 116, casi el doble.

Se concluye que la adición de elementos TRAP a los plásmidos que contienen STAR con codones de traducción del gen de resistencia a zeocina modificado da como resultado un número global de colonias significativamente mayor, y que hay más colonias con los niveles de expresión más elevados.

Ejemplo 22: Dependencia de la expresión con el número de copias.

Se analizaron los niveles de expresión del anticuerpo EpCAM con relación al número de copias de ADN de EpCAM integrado.

Resultados

El constructo que se ensayó fue TTG-Zeo-Cadena Ligera (LC)-TTG-Blas-Cadena Pesada (HC), estando ambas unidades de expresión bajo el control de promotor de CMV (véase la Fig. 44). Este constructo contenía STAR 7 y 67 (véase la Fig. 44). Las condiciones de selección fueron tales que con 200 ∀g/ml de zeocina y 20 ∀g/ml de blasticidina en el medio de cultivo no sobrevivieron colonias de control (no STARs), y sólo sobrevivieron colonias STAR 7/67/7.

Se aisló ADN cuando las colonias tuvieron 60 días bajo presión de selección con zeocina y blasticidina (véase la Fig. 44). Se calculó el valor de R2, y se mostró. En todo el intervalo de 5 a 40 pg/célula/día de EpCAM, hubo un grado elevado de dependencia del número de copias, como se señala mediante un R2 relativamente elevado de 0,5978 (Fig. 44). Los datos muestran que, en el nuevo sistema de selección, en colonias que contienen constructos TTG Zeo-TTG Blas EpCAM STAR 7/67/7, hay una expresión de EpCAM dependiente del número de copias.

Ejemplo 23: Inducción de una mayor expresión de EpCAM debido a metotrexato

Se analizaron los niveles de expresión del anticuerpo EpCAM tras incubar los clones con metotrexato (MTX). El objetivo de este experimento fue determinar si la amplificación de un constructo que contiene STAR daría como resultado una mayor expresión de EpCAM. MTX actúa mediante la inhibición del producto génico de dhfr. Aunque se han descrito algunas cepas de CHO que son deficientes en dhfr, CHO-K1 es dhfr+. Por lo tanto, deben existir concentraciones relativamente elevadas de MTX en el medio de cultivo para seleccionar la amplificación mediante concentraciones aumentadas de MTX en células CHO-K1.

Resultados

El constructo que se ensayó fue TTG-Zeo-Cadena Pesada (HC)-TTG-Blas-Cadena Ligera (LC), estando ambas unidades de expresión bajo el control del promotor de CMV. En dirección 5’ de cada promotor de CMV, se colocó STAR67, y se usó STAR7 para flanquear todo el casete (véase también el Ejemplo 13, Fig. 22 para tal constructo). Este constructo se modificó adicionalmente colocando un casete SV40-dhfr (un gen de dhfr de ratón bajo el control de un promotor de SV40) entre los casetes HC y LC, en dirección 5’ del segundo STAR67 (Fig. 45). Se transfectaron células CHO-K1. La selección se realizó con 100 ∀g/ml de zeocina y 10 ∀g/ml de blasticidina en el medio de cultivo. Ninguna de las colonias de control (sin elementos STAR) sobrevivieron, y sólo sobrevivieron las colonias con constructos que contienen los STAR. Las colonias se aislaron y se propagaron antes de medir los niveles de expresión de EpCAM. Seis colonias que produjeron entre 20 y 35 pg/célula/día se transfirieron a medio que contiene 100 nM de MTX. Esta concentración se elevó hasta 500 nM, 1000 nM y finalmente hasta 2000 nM, con períodos de dos semanas entre cada etapa. Después de dos semanas en 2000 nM de MTX, se midieron las concentraciones de EpCAM. Como se muestra en la Fig. 45, cuatro colonias mostraron una producción aumentada de EpCAM. Colonia

13: de 22 a 30; colonia 14: de 28 a 42; colonia 17: de 20 a 67; y colonia 19: de 37 a 67 pg/célula/día. Las colonias 4 y 16 no mostraron expresión potenciada de EpCAM. Se concluye que la adición de metotrexato al medio de cultivo de colonias CHO-K1 creadas con el sistema de selección de la invención puede dar como resultado una expresión potenciada de la proteína. Por tanto, los elementos STAR y el método de selección de la invención se pueden combinar con y son compatibles con la potenciación de los niveles de expresión proteica inducida por MTX.

Ejemplo 24: La selección TTG-Zeo opera en el contexto de diferentes promotores

Se analizaron los niveles de expresión de d2EGFP en el contexto del marcador de selección TTG Zeo y diferentes promotores. Se comparó la acción de elementos STAR en el contexto del potenciador/promotor de CMV, el potenciador/promotor de SV40 y el potenciador de CMV/promotor de #-actina.

Resultados

En la Fig. 46 se indican los promotores que se ensayaron en el contexto del marcador de selección TTG-Zeo. Los plásmidos ensayados consistieron en los constructos de control indicados con tres promotores diferentes y los constructos STAR que estuvieron flanqueados con STAR 7 y STAR 67 en el extremo 5’ y STAR 7 en el extremo 3’. Los constructos se transfectaron a célula CHO-K1, y la selección se llevó a cabo con 200 ∀g/ml en el medio de cultivo. Se aislaron y propagaron hasta 23 colonias independientes antes del análisis de los niveles de expresión de

d2EGFP. Como se muestra en la Fig. 46, la incorporación de elementos STAR en constructos con el potenciador/promotor de CMV, el potenciador/promotor de SV40 o el potenciador de CMV/promotor de #-actina dio como resultado en todos ellos la formación de colonias con niveles de expresión de d2EGFP mayores que con los constructos de control correspondientes. Esto muestra que el sistema de selección de la invención, en combinación con elementos STAR, opera bien en el contexto de diferentes promotores. Un análisis posterior demostró que la media de los valores de d2EGFP dirigida por CMV fue significativamente mayor que la media de los valores de d2EGFP dirigida por SV40 (p<0,05). Por el contrario, la media de los valores de d2EGFP dirigida por CMV no fue significativamente diferente de los valores de d2EGFP dirigida por CMV/#-actina (p=0,2).

Ejemplo 25: Comparación de diferentes elementos STAR en el sistema de selección TTG-Zeo.

Se analizaron los niveles de expresión de d2EGFP en el contexto del marcador de selección TTG Zeo con el promotor de CMV y 53 elementos STAR diferentes, para obtener una comprensión más profunda de qué elementos STAR dan los mejores resultados en este contexto.

Resultados

Se clonaron 53 elementos STAR en dirección 5’ y en dirección 3’ del casete promotor de CMV-TTG Zeo-d2EGFP. Los siguientes elementos STAR se ensayaron en tales constructos: STAR2-12, 14, 15, 17-20, 26-34, 36, 37, 39, 40,42-49, 51, 52, 54, 55, 57-62, 64, 65, 67. Los constructos se transfectaron a células CHO-K1, y la selección se llevó a cabo con 200 ∀g/ml de zeocina en el medio de cultivo. Se aislaron y se propagaron hasta 24 colonias independientes antes del análisis de los niveles de expresión de d2EGFP. La incorporación de elementos STAR en los constructos dio como resultado diferentes grados de expresión potenciada de d2EGFP, en comparación con el control. La incorporación de elementos STAR 14, 18 y 55 en este experimento no dio como resultado un incremento de la expresión media de d2EGFP con respecto al control (sin elemento STAR). Aunque algunos constructos (con elementos STAR 2, 3, 10, 42, 48 y 49) en este experimento dieron lugar a solamente unas pocas colonias, todos los elementos STAR ensayados, excepto 14, 18 y 55, dieron como resultado niveles medios de expresión de d2EGFP mayores que para el control. Se debería señalar que algunos elementos STAR pueden actuar de una manera más específica del tipo celular, y que es muy posible que STAR 14, 18 y 55 funcionen mejor en otros tipos celulares, con otros promotores, otros marcadores de selección, o en diferente contexto o configuración que en el conjunto particular de condiciones ensayadas aquí. La adición de 10 elementos STAR, a saber, elementos STAR 7, 9, 17, 27, 29, 43, 44, 45, 47 y 61, indujo niveles medios de expresión de d2EGFP mayores de 5 veces el nivel medio de expresión de d2EGFP del control. Se retransformó el control y los 7 constructos con elementos STAR, y se repitió el experimento. Los resultados se muestran en la Fig. 47. La incorporación de elementos STAR en los constructos dio como resultado diferentes grados de expresión potenciada de d2EGFP, según se compara con el control (Fig. 47). El nivel medio de expresión de d2EGFP en colonias transfectadas con el constructo de control fue 29. Las medias de los niveles de expresión de d2EGFP en colonias con los 7 constructos STAR diferentes osciló entre 151 (STAR 67) y 297 (STAR 29). Esto es un factor de 5 a 10 veces mayor que la media en las colonias de control.

Se concluye que a) la inmensa mayoría de elementos STAR tiene un efecto positivo sobre los niveles de expresión génica, b) hay una variación en el grado de efectos positivos inducidos por los diferentes elementos STAR, y c) 10 de 53 elementos STAR ensayados indujeron niveles medios de expresión de d2EGFP de más de 5 veces, en comparación con el control, y que los elementos STAR pueden inducir un nivel medio de expresión de d2EGFP de 10 veces mayor, en comparación con el control.

Ejemplo 26: Otros elementos de control de cromatina en el contexto de un sistema de selección de la invención

Se ha dado a conocer que los elementos de ADN tales como el sitio hipersensible HS4 en la región de control del locus del locus de #-globina de pollo (Chung et al, 1997), las regiones de unión de la matriz (MAR) (Stief et al, 1989) y un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) (Williams et al, 2005) tienen efectos beneficiosos sobre la expresión génica cuando se incorporan en un vector estos elementos de ADN. Se combinaron estos elementos de ADN con el sistema de selección de la invención.

Resultados

El elemento HS4 de 1,25 kb se clonó en el casete que engloba el promotor de CMV, TTG Zeo y d2EGFP mediante una etapa de ligación de tres vías, para obtener un constructo con un tándem de 2 elementos HS4 (Chung et al, 1997). Esta etapa se realizó tanto para el 5’ como para el 3’ del casete que engloba el promotor de CMV, TTG Zeo y d2EGFP. La MAR de lisozima de pollo de una longitud de 2959 pb (Stief et al, 1989) se clonó 5’ y 3’ del casete que engloba el promotor de CMV, TTG Zeo y d2EGFP.

El UCOE de 2614 pb de longitud (Williams et al, 2005) fue un fragmento Notl-Kpnl, cortado de un clon de BAC humano (RP11-93D5), que corresponde al nucleótido 29449 a 32063. Este fragmento se clonó 5’ del promotor de CMV.

El constructo STAR contenía STAR7 y STAR67 5’ del promotor de CMV, y STAR7 3’ del casete. Estos cuatro constructos, así como el constructo de control sin elementos de ADN de control de cromatina flanqueantes, se

transfectaron a células CHO-K1. La selección se llevó a cabo mediante 200 ∀g/ml de zeocina en el medio de cultivo. Las colonias se aislaron, se propagaron, y se midieron los niveles de expresión de d2EGFP. Como se muestra en la Fig. 48, los constructos con todos los elementos de ADN dieron como resultado la formación de colonias que expresan d2EGFP. Sin embargo, la incorporación de 2x elementos HS4 y el UCOE no dio como resultado la formación de colonias que presentaron mayores niveles de expresión de d2EGFP, en comparación con las colonias de control. Por el contrario, la incorporación de la MAR de lisozima dio como resultado la formación de colonias que expresaron d2EGFP de forma significativamente mayor. El nivel medio de expresión inducido por constructos que contienen MAR fue cuatro veces mayor que en las colonias de control. Sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron incorporando STAR 7 y 67 en el constructo. Se observó un incremento de casi diez veces en el nivel medio de expresión de d2EGFP, en comparación con las colonias de control. Se concluye que se pueden usar otros elementos de ADN de control de cromatina, tales como MARs en el contexto del sistema de selección de la invención. Sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron cuando se usaron elementos STAR como elementos de control de cromatina.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Diagrama esquemático de unidades de transcripción sin y con elementos STAR.

A) Gen bicistrónico que contiene (de 5’ a 3’) un transgén (que codifica por ejemplo el gen de d2EGFP), un IRES, un marcador seleccionable (zeo, que confiere resistencia a zeocina) bajo el control del promotor de CMV. La unidad de expresión tiene el terminador transcripcional de SV40 en su extremo 3’ (t). El nombre de constructo es CMV-d2EGFP-ires-Zeo (Control de CMV).

B) Constructo como en A, pero ahora STAR 67 se clonó en dirección 5’ del promotor de CMV. El nombre del constructo es STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

C) Constructo como en B, pero los elementos STAR7 en dirección 5’ y en dirección 3’ se clonan para flanquear todo el constructo. El nombre de constructo es STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7).

Fig. 2. STAR67 mejora en la expresión de d2EGFP dirigida por CMV en células CHO. La media de la señal de d2EGFP para 10 colonias estables independientes se representa gráficamente para los constructos indicados en células CHO. A) Control de CMV; B) STAR67-CMV. X(10): niveles medios de expresión de d2EGFP de las 10 colonias. Véase el ejemplo 2 para detalles.

Fig. 3. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por EF1! en células CHO. Igual que Fig. 2. pero ahora con el promotor de EF1!. A) Control de EF1!; B) STAR67-EF1!.

Fig. 4. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por UB6 en células CHO. Igual que Figs. 2 y 3, pero ahora con el promotor de UB6. A) Control de UB6; B) STAR67-UB6.

Fig. 5. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por CMV en células PER.C6. Igual que Fig. 2, pero ahora en células PER.C6. A) Control de CMV; B) STAR67-CMV.

Fig. 6. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por EF1! en células PER.C6. Igual que Fig. 3, pero ahora en células PER.C6. A) Control de EF1!; B) STAR67-EF1!.

Fig. 7. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por UB6 en células PER.C6. Igual que Fig. 4, pero ahora en células PER.C6. A) Control de UB6; B) STAR67-UB6.

Fig. 8. STAR67 mejora la expresión de d2EGFP dirigida por SV40 en células CHO-K1 en combinación con otro elemento STAR. Similar a Fig. 2, pero usando ahora el promotor de SV40 en células CHO, y los constructos indicados. La media de la señal de d2EGFP se representa gráficamente para 18-20 colonias estables e independientes, 60 días después de la transfección. A) Control de SV40, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) Control de SV40 y SV40-STAR67 7/7. Véase el ejemplo 4 para detalles.

Fig. 9. STAR67 mejora los niveles de expresión dirigida por UB6 del anticuerpo EpCAM en células CHO-K1. Véase el ejemplo 5 para detalles. A) constructos con elementos STAR; B) constructos con STAR67 en dirección 5’ del promotor y elementos STAR7 flanqueantes. La concentración de anticuerpo anti-EpCAM se presenta como pg/célula/día. X(18): nivel de producción medio de las 18 colonias.

Fig. 10. STAR67 no es un bloqueador del potenciador, mientras que STAR 6 y 7 sí lo son. Véase el ejemplo 6 para detalles.

Fig. 11. STAR67 potencia los niveles de expresión de anticuerpo dirigida por UB6 y CMV en células CHO establemente transfectadas. Véase el ejemplo 7 para detalles. A) molécula de ADN individual que contiene la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) anti-EpCAM, cada una detrás de un promotor, y cada una ligada a un gen marcador seleccionable diferente (se usó selección simultánea para ambos marcadores): constructo

sin elementos STAR. No se encontraron colonias; B) el mismo constructo con STAR67 entre los dos promotores. La concentración de anticuerpo anti-EpCAM se presenta como pg/célula/día. X(19): nivel de producción medio de las 19 colonias.

Fig. 12. Representación esquemática del uso de un gen marcador de selección (gen de resistencia a zeocina) según la invención. A. gen de resistencia a zeocina de tipo salvaje, que tiene su sitio de iniciación de la traducción normal (codón de inicio ATG) y un codón ATG interno, que codifica metionina. B. gen de resistencia a zeocina mutante, en el que el ATG interno se ha mutado en un codón para leucina; este mutante es un gen de resistencia a zeocina funcional. C. igual que B, pero que comprende un sitio de iniciación de la traducción mutado, en el que el contexto del codón de inicio ATG se ha mutado para disminuir la iniciación de la traducción. D. igual que B, pero que comprende un codón de inicio mutado (GTG). E. igual que B, pero con un codón de inicio TTG. Los números en las figuras C-E indican esquemáticamente una cantidad relativa de frecuencia de iniciación (bajo el codón de inicio) y la frecuencia “mediante barrido” (bajo la secuencia codificante) mediante los ribosomas, pero sólo de una manera semicuantitativa, es decir, indican la eficiencia de la iniciación de la traducción comparada entre sí, pero los números cualitativos pueden diferir completamente: los números sólo sirven para explicar la invención. Véase el ejemplo 8 para detalles.

Fig. 13. Representación esquemática de una unidad de transcripción multicistrónica según la invención, con eficacia de la traducción interdependiente más o menos recíproca. La explicación es igual que para la Fig. 12, pero ahora se ha colocado un gen de dEGFP (que ejemplifica aquí un gen de interés) en dirección 3’ de la secuencia codificante del polipéptido marcador seleccionable. El gen de resistencia a zeocina comprende la mutación interna Met->Leu (véase Fig. 12B). Véase el ejemplo 9 para detalles.

Fig. 14. Resultados de sistemas de selección según la invención, con y sin elementos STAR. A. gen de resistencia a zeocina con codón de inicio ATG en mal contexto (denominado “ATGmut” en el dibujo, pero que incluye una secuencia espaciadora detrás del ATG en el mal contexto, denominado generalmente así en el texto como “ATGmut/space”). B. gen de resistencia a zeocina con codón de inicio GTG. C. gen de resistencia a zeocina con codón de inicio TTG. La señal de d2EGFP para colonias independientes se muestra en el eje vertical. Véase el ejemplo 9 para detalles.

Fig. 15. Resultados del sistema de selección según la invención en experimento aumentado de escala (A), y comparación con el sistema de selección según la técnica anterior usando un IRES (B). La señal de d2EGFP para colonias independientes se muestra en el eje vertical. Véase el ejemplo 10 para detalles.

Fig. 16. Resultados del sistema de selección con unidad de transcripción multicistrónica según la invención, usando como marcador seleccionable blasticidina. A. gen de resistencia a blasticidina mutado para comprender un codón de inicio GTG. B. gen de resistencia a blasticidina mutado para comprender un codón de inicio TTG. El gen de resistencia a blasticidina se había mutado adicionalmente para eliminar todas las secuencias ATG internas. La señal de d2EGFP para colonias independientes se muestra en el eje vertical. Véase el ejemplo 11 para detalles.

Fig. 17. Estabilidad de la expresión de varios clones con una unidad de transcripción multicistrónica según la invención (incluye una zeocina con codón de inicio TTG). Había presión de selección (100 ∀g/ml de zeocina) durante todo el experimento. La señal de d2EGFP para colonias independientes se muestra en el eje vertical. Véase el ejemplo 12 para detalles.

Fig. 18. Igual que Fig. 17, pero la concentración de zeocina se redujo hasta 20 ∀g/ml después del establecimiento de los clones.

Fig. 19. Igual que Fig. 17, pero la zeocina estaba ausente del medio de cultivo después del establecimiento de los clones.

Fig. 20. Expresión de un anticuerpo (anti-EpCAM) usando el sistema de selección sin la unidad de transcripción multicistrónica según la invención. La cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) son en este ejemplo el polipéptido de interés. Cada una de estas está presente en una unidad de transcripción separada, que están ambas en una única molécula de ácido nucleico en este ejemplo. La HC está precedida por el gen de resistencia a zeocina que codifica un polipéptido marcador seleccionable, mientras que la LC está precedida por el gen de resistencia a blasticidina que codifica un polipéptido marcador seleccionable. Ambos genes de resistencia se han mutado para comprender un codón de inicio ATG en un contexto no óptimo (“mutATG” en la Figura, pero incluyendo una secuencia espaciadora, y por tanto referido generalmente en el texto como “ATGmut/space”). Cada una de las unidades de transcripción multicistrónicas está bajo el control de un promotor de CMV. Los constructos con secuencias STAR como se indican, se compararon con los constructos sin secuencias STAR. Los niveles de anticuerpo obtenidos cuando estos constructos se introdujeron en células hospedantes se dan en el eje vertical en pg/célula/día para diversos clones independientes. Véase el ejemplo 13 para detalles.

Fig. 21. Igual que Fig. 20, pero ambos genes marcadores de selección se han proporcionado con un codón de inicio GTG. Véase el ejemplo 13 para detalles.

Fig. 22. Igual que Fig. 20, pero ambos genes marcadores de selección se han proporcionado con un codón de inicio TTG. Véase el ejemplo 13 para detalles.

Fig. 23. Estabilidad de la expresión en subclones en ausencia de presión de selección (después de establecer colonias bajo presión de selección, algunas colonias se subclonaron en medio que no contiene zeocina). Véase el ejemplo 12 para detalles.

Fig. 24. Dependencia de los niveles de expresión con el número de copias de una realización de la invención. Véase el ejemplo 12 para detalles.

Fig. 25. Igual que Fig. 12, pero para el gen de resistencia a blasticidina. Ninguno de los 4 ATG internos en este gen están en marco que codifica una metionina, y por lo tanto se usó la redundancia del código genético para mutar estos ATG sin mutar la secuencia de aminoácidos interna de la proteína codificada.

Fig. 26. Secuencia codificante del gen de resistencia a zeocina de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 108). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG en negrita es el codón de inicio.

Fig. 27. Secuencia codificante del gen de resistencia a blasticidina de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 110). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG es el codón de inicio. Se subrayan otros ATG en la secuencia: estos ATG internos no codifican metionina, debido a que no están en el marco.

Fig. 28. Secuencia codificante del gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 112). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG en negrita es el codón de inicio.

Fig. 29. Secuencia codificante del gen de DHFR de ratón de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 114). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG en negrita es el codón de inicio. Se subrayan otros ATG en la secuencia: estos ATG internos no codifican metionina, debido a que no están en marco.

Fig. 30. Secuencia codificante del gen de resistencia a higromicina de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 116). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG es el codón de inicio. Se subrayan otros ATG en la secuencia: estos ATG internos no codifican metionina, debido a que no están en el marco.

Fig. 31. Secuencia codificante del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 118). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG es el codón de inicio. Se subrayan otros ATG en la secuencia: estos ATG internos no codifican metionina, debido a que no están en el marco.

Fig. 32. Secuencia codificante del gen de glutamina sintasa (GS) humano de tipo salvaje (SEQ. ID. NO. 120). Los ATG en negrita codifican metionina. El primer ATG es el codón de inicio. Se subrayan otros ATG en la secuencia: estos ATG internos no codifican metionina, debido a que no están en el marco.

Fig. 33. Representación esquemática de algunos genes marcadores de selección de resistencia a zeocina modificados con un codón GTG según la invención, que permiten el ajuste fino adicional de la restricción de selección. Véase el ejemplo 14 para detalles.

Fig. 34. Resultados con sistemas de expresión que contienen los genes marcadores de selección de resistencia a zeocina modificados. Véase el ejemplo 14 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados (véase también Fig. 33) se indican en el eje horizontal (la adición de 7/67/7 al final del nombre del constructo indica la presencia de secuencias STAR 7 y 67 en dirección 5’ del promotor y STAR7 en dirección 3’ del sitio de terminación de la transcripción), y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 35. Representación esquemática de algunos genes marcadores de selección de resistencia a zeocina modificados adicionales con un codón de inicio TTG según la invención, que permite el ajuste fino adicional de la restricción de la selección. Véase el ejemplo 15 para detalles.

Fig. 36. Resultados con sistemas de expresión que contienen los genes marcadores de selección de resistencia a zeocina modificados adicionales. Véase el ejemplo 15 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 37. Igual que Fig. 12, pero para el gen de resistencia a puromicina. Los tres ATG internos codifican metionina (panel A), y están sustituidos por secuencias CTG que codifican leucina (panel B). véase el ejemplo 16 para detalles.

Fig. 38. Resultados con constructos de expresión que contienen el gen de resistencia a puromicina con un codón de inicio TTG y codones ATG no internos. Véase el ejemplo 16 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se

indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 39. Igual que Fig. 12, pero para el gen de resistencia a neomicina. Véase el Ejemplo 17 para detalles. A. gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje; se indican las secuencias ATG; los ATG que codifican metionina se indican mediante Met encima del ATG. B. gen de resistencia a neomicina sin secuencias ATG, y con un codón de inicio GTG. C. gen de resistencia a neomicina sin secuencias ATG, y con un codón de inicio TTG.

Fig. 40. Igual que Fig. 12, pero para el gen dhfr. Véase el Ejemplo 18 para detalles. A. gen dhfr de tipo salvaje; se indican las secuencias ATG, los ATG que codifican metionina se indican mediante Met encima del ATG. B. gen dhfr sin secuencias ATG, y con un codón de inicio GTG. C. gen dhfr sin secuencias ATG, y con un codón de inicio TTG.

Fig. 41. Resultados con constructos de expresión (marcador seleccionable de zeocina) según la invención en células PER.C6. Véase el Ejemplo 20 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 42. Resultados con constructos de expresión (marcador seleccionable de blasticidina) según la invención en células PER.C6. Véase el Ejemplo 20 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 43. Resultados con constructos de expresión según la invención, que comprenden además una secuencia de pausa de la transcripción (TRAP). Véase el Ejemplo 21 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 44. Dependencia de la expresión de un anticuerpo con el número de copias usando unidades de transcripción según la invención. Véase el Ejemplo 22 para detalles.

Fig. 45. Expresión de anticuerpo a partir de colonias que contienen constructos de expresión según la invención, en las que el número de copias de los constructos de expresión está amplificado mediante metotrexato. Véase el Ejemplo 23 para detalles. Barras blancas: selección con zeocina y blasticidina; barras negras: selección con zeocina, blasticidina y metotrexato (MTX). Los números de colonias ensayadas se representan en el eje horizontal.

Fig. 46. Resultados con diferentes promotores. Véase el Ejemplo 24 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 47. Resultados con diferentes elementos STAR. Véase el ejemplo 25 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica; el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

Fig. 48. Resultados con otros elementos de control de cromatina. Véase el Ejemplo 26 para detalles. Los puntos indican puntos de datos individuales; las líneas indican los niveles medios de expresión; los constructos usados se indican en el eje horizontal, y se representan esquemáticamente encima de la gráfica (los triángulos en negro indican diferentes elementos de control de cromatina ensayados); el eje vertical indica la señal de d2EGFP.

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Whitelaw, E, Sutherland, H, Kearns, M, Morgan, H, Weaving, L, and Garrick, D. (2001) Epigenetic effects on transgene expression Methods Mol Biol 158, 351-68.

Williams S, Mustoe T, Mulcahy T, Griffiths M, Simpson D, Antoniou M, Ivine A, Mountain A, Crombie R (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol. 5:17.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ChromaGenics B.V. Otte, Arie P. Kwaks, Theodorus H.J. Sewalt, Richard G.A.B. van Blokland, Rik

<120> Selección de células hospedantes que expresan proteína en niveles elevados

<130> 0117 US P01 PRO

<160> 142

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1 <211>749

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR1

<400> 1

<210>2 <211>883

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR2

<400> 2

<210>3 <211>2126

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR3 <400>3

<210>4 <211>1625

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR4

<400> 4

<210>5

<211> 1571

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR5

<400> 5

<210>6

<211> 1173

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR6

<400> 6

<210>7

<211> 2101 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR7 15 <400> 7

<210>8

<211> 1821

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR8

<400> 8

<210>9 <211>1929

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR9

<400> 9

<210> 10

<211> 1167

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR10

<220> 10 <221> característica diversa

<222> (452)..(1143)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

<400> 10

<210> 11 5 <211> 1377

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa 10 <223> secuencia de STAR11

<400> 11

<210> 12

<211> 1051 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR12 10 <400> 12

<210> 13

<211> 1291

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR13

<400> 13

<210> 14

<211> 711

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR14

<400> 14

<210> 15

<211> 1876

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR15

<400> 15

<210> 16

<211> 1282

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR16

<400> 16

<210> 17 <211>793

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR17

<400> 17

<210> 18 <211>492

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR18

<400> 18

<210> 19

<211> 1840

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR19

<400> 19

<210> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR20

<400> 20

<210> 21

<211> 607 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR21 15 <400> 21

<210> 22

<211> 1380

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR22

<400> 22

<210> 23

<211> 1246 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR23 10 <400> 23

<210> 24

<211> 939

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR24

<400> 24

<210> 25

<211> 1067

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR25

<400> 25

<210> 26

<211> 540

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR26

<400> 26

<210> 27

<211> 1520

<212> ADN

<213>: Homo sapiens 15 <220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR27

<400> 27

<210> 28

<211> 961

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR28

<400> 28

<210> 29

<211> 2233

<212> ADN

<213>: Homo sapiens 10 <220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR29

<400> 29

<210> 30

<211> 1851

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR30

<400> 30

<210>31

<211> 1701

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa 5 <223> secuencia de STAR31

<220>

<221> característica diversa

<222> (159)..(1696)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones 10 <400> 31

<210> 32

<211> 771

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR32

<400> 32

<210> 33 5 <211> 1368

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa 10 <223> secuencia de STAR33

<400> 33 <210> 34

<211> 755 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR34 10 <400> 34

<210> 35

<211> 1193

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR35

<220> 10 <221> característica diversa

<222> (312)..(1191)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

<400> 35

<210> 36

<211> 1712

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR36

<400> 36

<210> 37

<211> 1321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR37

<400> 37

<210> 38

<211> 1445

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR38

<220>

<221> característica diversa

<222> (348)..(949)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

<400> 38

<210> 39

<211> 2331

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR39

<400> 39

<210> 40

<211> 1071

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR40

<400> 40

<210> 41

<211> 1135 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR41 10 <400> 41

<210> 42

<211> 735 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR42 10 <400> 42

<210> 43

<211> 1227

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR43

<400> 43

<210> 44

<211> 1586

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR44

<400> 44

<210> 45

<211> 1981

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR45

<400> 45

<210> 46

<211> 1859

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR46

<400> 46

<210> 47

<211> 1082

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR47

<400> 47

<210> 48 10 <211> 1242

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa 15 <223> secuencia de STAR48

<400> 48 <210> 49

<211> 1015 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR49 10 <400> 49

<210> 50

<211> 2355

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR50

<400> 50

<210>51

<211> 2289

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR51

<400> 51

<210> 52

<211> 1184

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR52

<400> 52

<210> 53

<211> 1431 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR53 10 <400> 53

<210> 54

<211> 975

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR54

<400> 54

<210> 55

<211> 501

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR55

<400> 55

<210> 56

<211> 741

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR56

<400> 56

<210> 57

<211> 1365

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15 <220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR57

<400> 57 <210> 58

<211> 1401 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR58 10 <400> 58

<210> 59

<211> 866 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR59 10 <400> 59

<210> 60

<211> 2067

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR60

<220> 10 <221> característica diversa

<222> (92)..(1777)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

<400> 60

<210>61

<211> 1470

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR61

<220> 10 <221> característica diversa

<222> (130)..(976)

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

<400> 61 <210> 62

<211> 1011 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR62 10 <400> 62

<210> 63

<211> 1410

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR63

<400> 63

<210> 64

<211> 1414

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR64

<400> 64

<210> 65

<211> 1310 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR65 10 <400> 65

<210> 66

<211> 1917 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica diversa

<223> secuencia de STAR67 10 <400> 66

<210> 67

<211> 26 <400> 71 <213> Artificial <210> 81 <223> cebador ZEO-WTreverse <212> ADN

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligo para obtener el ligador que contiene MCSII de pd2EGFP-link

<400> 67

gtacggatat cagatcttta attaag: 26

<210> 68

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligo para obtener el ligador que contiene MCSII de pd2EGFP-link

<400> 68

gtaccttaat taaagatctg atat: 24

<210> 69

<211> 52

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación de 0,37 kb de pd2EGFP

<400> 69

gatcagatct ggcgcgccat ttaaatcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac gg: 52

<210> 70

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación de 0,37 kb de pd2EGFP

<400> 70

aggcggatcc gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg g: 41

<210>71

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para amplificar el ORF del gen de resistencia a zeocina

gatcggatcc ttcgaaatgg ccaagttgac cagtgc: 36

<210> 72

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para amplificar el ORF del gen de resistencia a zeocina

<400> 72

aggcgcggcc gcaattctca gtcctgctcc tc: 32

<210> 73

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para amplificar el ORF de d2EGFP

<400> 73

gatcgaattc tcgcgaatgg tgagcaagca gatcctgaag: 40

<210> 74

<211> 52

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para amplificar el ORF de d2EGFP

<400> 74

aggcgaattc accggtgttt aaacttacac ccactcgtgc aggctgccca gg: 52

<210> 75

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para amplificar el gen de d2EGFP

<400> 75

ttggttggtc atgaatggtg agcaagggcg aggagctgtt c: 41

<210> 76

<211> 36

<212> ADN

<220>

<223> cebador para amplificar el gen de d2EGFP

<400> 76

attctctaga ctacacattg atcctagcag aagcac: 36

<210> 77

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligo para preparer el ligador para crear MCS en pGL3-promoter-GFP

<400> 77

cgatatcttg gagatctact agtggcgcgc cttgggctag ct: 42

<210> 78

<211> 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> oligo para preparer el ligador para crear MCS en pGL3-promoter-GFP

<400> 78

gatcagctag cccaaggcgc gccactagta gatctccaag atatcgagct: 50

<210> 79

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación del promotor de EF-1alfa

<400> 79

gatcggcgcg ccatttaaat ccgaaaagtg ccacctgacg: 40

<210> 80

<211> 34

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación del promotor de EF-1alfa

<400> 80

aggcgggacc ccctcacgac acctgaaatg gaag: 34

<211> 51

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación del promotor de SV40

<400> 81

ttggttgggg cgcgccgcag caccatggcc tgaaataacc tctgaaagag g: 51

<210> 82

<211> 55

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para la amplificación del promotor de SV40

<400> 82

ttggttggga gctcaagctt tttgcaaaag cctaggcctc caaaaaagcc tcctc: 55

<210> 83

<211> 11

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia alrededor del codón de inicio del gen de Resistencia a zeocina de tipo salvaje

<400> 83

aaaccatggc c: 11

<210> 84

<211> 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOforwardMUT

<400> 84

gatctcgcga tacaggattt atgttggcca agttgaccag tgccgttccg: 50

<210> 85

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<400> 85

aggcgaattc agtcctgctc ctcggc: 26

<210> 86

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEO-LEUreverse

<400> 86

aggccccgcc cccacggctg ctcgccgatc tcggtcaagg ccggc: 45

<210> 87

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEO-THRreverse

<400> 87

aggccccgcc cccacggctg ctcgccgatc tcggtggtgg ccggc: 45

<210> 88

<211> 44

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEO-VALreverse

<400> 88

aggccccgcc cccacggctg ctcgccgatc tcggtccacg ccgg: 44

<210> 89

<211> 11

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia alrededor del codón de inicio de d2EGFP de tipo salvaje

<400> 89

gaattcatgg g: 11

<210> 90

<211> 49

<213> Artificial

<220>

<223> cebador d2EGFPforwardBamHI

<400> 90

gatcggatcc tatgaggaat tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggag: 49

<210> 91

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador d2EGFPreverseNotI

<400> 91

aaggaaaaaa gcggccgcct acacattgat cctagcagaa g: 41

<210> 92

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia espaciadora

<400> 92

tcgatccaaa gactgccaaa tctagatccg agattttcag gagctaagga agctaaa: 57

<210> 93

<211> 99

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOforwardBamHI-ATGmut/space

<400> 93

<210> 94

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOforwardBamHI-GTG <212> ADN

<400> 94

gatcggatcc accgtggcca agttgaccag tgccgttc: 38

<210> 95

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOforwardBamHI-TTG

<400> 95

gatcggatcc accttggcca agttgaccag tgccgttc: 38

<210> 96

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSDBamHIforward

<400> 96

gatcggatcc accatggcca agcctttgtc tcaag: 35

<210> 97

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD150reverse

<400> 97

gtaaaatgat atacgttgac accag: 25

<210> 98

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD150forward

<400> 98

ctggtgtcaa cgtatatcat tttac: 25

<210> 99

<211> 24

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD250reverse

<400> 99

gccctgttct cgtttccgat cgcg: 24

<210> 100

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD250forward

<400> 100

cgcgatcgga aacgagaaca gggc: 24

<210> 101

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD350reverse

<400> 101

gccgtcggct gtccgtcact gtcc: 24

<210> 102

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD350forward

<400> 102

ggacagtgac ggacagccga cggc: 24

<210> 103

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD399reverse

<400> 103

gatcgaattc ttagccctcc cacacgtaac cagagggc

<210> 104

<211> 103

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSDforwardBamHIAvrll-ATGmut/space

<400> 104

<210> 105

<211> 44

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSD399reverseEcoRIAvrII

<400> 105

gatcgaattc cctaggttag ccctcccaca cgtaaccaga gggc: 44

<210> 106

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSDforwardBamHIAvrII-GTG

<400> 106

gatcggatcc taggaccgtg gccaagcctt tgtctcaaga ag: 42

<210> 107

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador BSDforwardBamHIAvrII-TTG

<400> 107

gatcggatcc taggaccttg gccaagcctt tgtctcaaga ag: 42

<210> 108

<211>375

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a zeocina de tipo salvaje

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(375)

<400> 108

10 <210> 109

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 15 <223> gen de resistencia a zeocina de tipo salvaje

<400> 109

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a blasticidina de tipo salvaje

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(399)

<400> 110

<210> 111

<211> 132

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a blasticidina de tipo salvaje

<400> 111

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(600)

<400> 112

<210> 113

<211> 199

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje

<400> 113

<210> 114

<211> 564 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> gen de DHFR de tipo salvaje (procedente de ratón)

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)..(564)

<400> 114

<210> 115

<211> 187

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de DHFR de tipo salvaje (procedente de ratón)

<400> 115 <210> 116

<211> 1143

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a higromicina de tipo salvaje

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1143)

<400> 116

<210> 117

<211> 380

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a higromicina de tipo salvaje

<400> 117

<210> 118

<211> 804

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(804)

<400> 118

<210> 119

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje

<400> 119 <210> 120

<211> 1121

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> gen de glutamina sintasa de tipo salvaje (humano)

<220> <221> CDS

<222> (1)..(1119)

<400> 120

<210> 121

<211> 373

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de glutamina sintasa de tipo salvaje (humano)

<400> 121

<210> 122

<211> 43

<212> ADN

5: <213> Artificial

<220>

<223> cebador GTGspaceBamHIF

<400> 122

gaattcggat ccaccgtggc gatccaaaga ctgccaaatc tag: 43

10: <210> 123

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

15: <223> cebador ZEOTTTGTGBamHIF

<400> 123

gaattcggat cctttgtggc caagttgacc agtgccgttc cg: 42

<210> 124

<211> 46

20: <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOForwardGTG-Thr9 <212> ADN

<400> 124

aattggatcc accgtggcca agttgaccag tgccgttacc gtgctc: 46

<210> 125

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOForward GTG-Phe9

<400> 125

aattggatcc accgtggcca agttgaccag tgccgttttc gtgctc: 46

<210> 126

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador TTGspaceBamHIF

<400> 126

gaattcggat ccaccttggc gatccaaaga ctgccaaatc tag: 43

<210> 127

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOForwardTTG-Thr9

<400> 127

aattggatcc accttggcca agttgaccag tgccgttacc gtgctc: 46

<210> 128

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador ZEOForwardTTG-Phe9

<400> 128

aattggatcc accttggcca agttgaccag tgccgttttc gtgctc: 46

<210> 129

<211> 37

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PURO BamHI F

<400> 129

gatcggatcc atggttaccg agtacaagcc cacggtg: 37

<210> 130

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PURO300 R LEU

<400> 130

cagccgggaa ccgctcaact cggccaggcg cgggc: 35

<210> 131

<211> 49

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PUR0300FLEU

<400> 131

cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagctg gaaggcctc: 49

<210> 132

<211> 44

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PURO600RLEU

<400> 132

aagcttgaat tcaggcaccg ggcttgcggg tcaggcacca ggtc: 44

<210> 133

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PUROBamHI TTG1F

<400> 133

gaattcggat ccaccttggt taccgagtac aagcccacgg tg: 42

<210> 134

<211> 804

<212> ADN

5: <213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina modificado que carece de secuencias ATG internas

<220>

<221> CDS

10: <222> (1)..(804)

<400> 134

<210> 135

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina modificado que carece de secuencias ATG internas

<400> 135

<210> 136

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador NEO-F-Hindlll

<400> 136

gatcaagctt ttggatcggc cattgaaaca agacggattg 40

<210> 137

<211> 36 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador NEO EcoRI 800R

<400> 137 10 aagcttgaat tctcagaaga actcgtcaag aaggcg 36

<210> 138

<211> 564

<212> ADN

<213> Artificial 15 <220>

<223> gen de dhfr modificado que carece de secuencias ATG internas

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(564) 20 <400> 138

<210> 139

<211> 187

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> gen de dhfr modificado que carece de secuencias ATG internas

<400> 139

<210> 140

<211> 36

<212> ADN

5: <213> Artificial

<220>

<223> cebador DHFR-F-HindIII

<400> 140

gatcaagctt ttgttcgacc attgaactgc atcgtc: 36

10: <210> 141

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

15: <223> cebador DHFR-EcoRI-600-R

<400> 141

aagcttgaat tcttagtctt tcttctcgta gacttc: 36

<210> 142

<211> 154

<212> ADN

<213> Artificial 5 <220>

<223> secuencia de poliadenilación sintética combinada y señal de pausa del gen de alfa2 globina humano

<220>

<221> secuencia de poliadenilación sintética

<222> (1)..(49) 10 <220>

<221> sitio de clonación

<222> (50)..(62)

<220>

<221> señal de pausa del gen de alfa2 globina humano 15 <222> (63)..(154)

<400> 142

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN que comprende una unidad de transcripción multicistrónica que codifica i) un polipéptido marcador seleccionable capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, y ii) un polipéptido de interés, teniendo el polipéptido de interés una secuencia de iniciación de la traducción separada de la del polipéptido marcador seleccionable,

en la que

la secuencia codificante para el polipéptido de interés está en dirección 3’ de la secuencia codificante para el marcador seleccionable en dicha unidad de transcripción multicistrónica, y

la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable no tiene ninguna secuencia ATG en la hebra codificante tras el codón de inicio del polipéptido marcador seleccionable hasta el codón de inicio del polipéptido de interés, y en la que la secuencia de inicio de la traducción en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable se elige del grupo que consiste en:

a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que el A del codón de inicio ATG es nt +1);

b) un codón de inicio GTG;

c) un codón de inicio TTG;

d) un codón de inicio CTG;

e) un codón de inicio ATT; y

f) un codón de inicio ACG.
2.

Una molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia de inicio de la traducción resultante en la hebra codificante para el polipéptido marcador seleccionable comprende un codón de inicio GTG o un codón de inicio TTG.
3.

Una molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en la que cualquier secuencia ATG cuando está presente en el marco y que codifica metionina en la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable de tipo salvaje está mutada para codificar valina, treonina, isoleucina o leucina.
4.

Una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido marcador seleccionable proporciona resistencia frente a los efectos letales o inhibidores del crecimiento de un agente de selección, por ejemplo un antibiótico.
5.

Una molécula de ADN según la reivindicación 4, en la que dicho agente de selección se elige del grupo que consiste en: zeocina, puromicina, blasticidina, higromicina, neomicina, metotrexato, metionina sulfoximina y kanamicina.
6.

Una molécula de ADN según la reivindicación 5, en la que el agente de selección es zeocina.
7.

Una molécula de ADN según la reivindicación 5, en la que el polipéptido marcador seleccionable está codificado por el gen de resistencia a neomicina.
8.

Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido marcador seleccionable comprende además una mutación que reduce la actividad del polipéptido marcador seleccionable comparada con su contraparte de tipo salvaje, por ejemplo en la que el polipéptido marcador seleccionable es un polipéptido de resistencia a zeocina en el que la prolina en la posición 9 está cambiada por un aminoácido diferente.
9.

Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia codificante del polipéptido de interés comprende una secuencia de inicio de la traducción óptima.
10.

Un casete de expresión que comprende una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además dicho casete de expresión un promotor en dirección 5’ de dicha unidad de expresión multicistrónica, y secuencias de terminación de la transcripción en dirección 3’ de la unidad de expresión multicistrónica.
11.

Un casete de expresión según la reivindicación 10, que comprende además al menos un elemento de control de cromatina, escogido del grupo que consiste en una región de unión de matriz o armazón (MAR/SAR), una secuencia aislante, un elemento de apertura de cromatina universal (UCOE), y una secuencia antirrepresora (STAR).
12.

Un casete de expresión según la reivindicación 11, en el que dicho elemento de control de cromatina es una secuencia antirrepresora elegida del grupo que consiste en:

a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66; b) fragmentos de una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ID. NO. 66, en el que dichos fragmentos tienen actividad antirrepresora;

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b), en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora; y d) el complemento a una cualquiera de a) a c).
13.

Un casete de expresión según la reivindicación 12, en el que dicho casete de expresión comprende uno de: a) SEQ. ID. NO. 66, b) un fragmento de a) que tiene actividad antirrepresora; c) una secuencia que es al menos 70% idéntica en secuencia nucleotídica a a) o b), en el que dicha

secuencia tiene actividad antirrepresora, en el que a), b) o c) está situado en dirección 5’ del promotor que dirige la transcripción del gen multicistrónico.
14.

Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que dicho gen multicistrónico está flanqueado en ambos lados por al menos una secuencia antirrepresora.
15.

Un casete de expresión según la reivindicación 14, que comprende: 5’ -secuencia antirrepresora A - secuencia antirrepresora B - promotor - gen multicistrónico que codifica la proteína marcadora seleccionable funcional y, en dirección 3’ de ella, el polipéptido de interés - secuencia de terminación de la transcripción - secuencia antirrepresora C -3’,

en el que las secuencias antirrepresoras A y C pueden ser iguales o diferentes y se eligen del grupo que consiste en:

a) una cualquiera de SEQ. ID. NO. 1 a SEQ. ED. NO. 65; b) fragmentos de una cualquiera de las secuencias de a), teniendo dichos fragmentos actividad antirrepresora;

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b), en el que dichas secuencias tienen actividad antirrepresora, y en el que la secuencia antirrepresora B se elige del grupo que consiste en i) SEQ. ID. NO. 66,

ii) un fragmento de i) que tiene actividad antirrepresora; y iii) una secuencia que es al menos 70% idéntica en secuencia nucleotídica a i) o ii), en el que dicha secuencia tiene actividad antirrepresora.
16. Un casete de expresión según la reivindicación 15, en el que las secuencias antirrepresoras A y C se eligen de:

a) un cualquiera de SEQ. ID. NO. 7, SEQ. ID. NO. 9, SEQ. ID. NO. 17, SEQ. ID. NO. 27, SEQ. ID. NO. 29, SEQ. ID. NO. 43, SEQ. ID. NO. 44, SEQ. ID. NO. 45, SEQ. ID. NO. 47, o SEQ. ID. NO. 61; b) fragmentos de una de las secuencias de a), teniendo dichos fragmentos actividad antirrepresora; y c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia nucleotídica a a) o b), en el que dichas

secuencias tienen actividad antirrepresora.
17.

Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que el polipéptido de interés es una parte de una proteína multimérica.
18.

Un casete de expresión según la reivindicación 17, en el que el polipéptido de interés es una cadena ligera de inmunoglobulina o una cadena pesada de inmunoglobulina.
19.

Un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, que comprende además:

a) una secuencia de pausa de la transcripción (TRAP) en dirección 5’ de dicho promotor y que está en una dirección 5’ a 3’; o

b) una secuencia TRAP en dirección 3’ de dicha secuencia de terminación de la transcripción y que está en una orientación 3’ a 5’; o

c) tanto a) como b);

en el que una secuencia TRAP es una secuencia que, cuando se coloca en una unidad de transcripción, da como resultado un nivel reducido de transcripción en el ácido nucleico presente en el lado 3’ de la TRAP, cuando se compara con el nivel de transcripción observado en el ácido nucleico en el lado 5’ de la TRAP,

por ejemplo, en el que dicha TRAP es SEQ. ID. NO. 142.
20. Una molécula de ADN que comprende una secuencia que codifica un polipéptido marcador seleccionable funcional capaz de ser seleccionado en una célula hospedante eucariota, caracterizada porque dicha molécula de ADN:

i) tiene una secuencia de inicio de la traducción elegida del grupo que consiste en: a) una secuencia de inicio de la traducción que comprende una mutación en los nucleótidos en las

posiciones -3 a -1 y/o +4 de la secuencia de consenso RCCATGG (en la que R es A o G, y en la que el A del codón de inicio ATG es nt +1); b) un codón de inicio GTG; c) un codón de inicio TTG; d) un codón de inicio CTG; e) un codón de inicio ATT; y f) un codón de inicio ACG, seguido de una secuencia codificante marcadora seleccionable de otro

modo funcional, y ii) porque la hebra codificante de la secuencia que define el polipéptido marcador seleccionable en dirección 3’ del codón de inicio no óptimo y hasta el codón de parada está desprovista de secuencias ATG.
21.

Una célula hospedante que comprende una molécula de ADN o un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
22.

Una célula hospedante según la reivindicación 21, que es una célula hospedante eucariota, preferiblemente una célula hospedante de mamífero.
23.

Una célula hospedante según la reivindicación 22, que es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
24.

Un método para generar una célula hospedante que expresa un polipéptido de interés, comprendiendo el método las etapas de:

a) introducir en una pluralidad de células precursoras una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y

b) cultivar las células generadas en condiciones que seleccionan la expresión del polipéptido marcador seleccionable, y

c) seleccionar al menos una célula hospedante que produce el polipéptido de interés.
25.

Un método para producir un polipéptido de interés, que comprende cultivar una célula hospedante, comprendiendo dicha célula hospedante un casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y expresar el polipéptido de interés a partir del casete de expresión.
26.

Un método según la reivindicación 25, que comprende además aislar el polipéptido de interés.