JP4138479B2 - 動物細胞に使用する発現ベクター - Google Patents
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Description
(発明の背景)
(a)発明の分野
本発明は動物細胞用発現ベクター、より具体的には核マトリックス結合領域因子(本明細書では「MAR因子」と称する)及びガストリン遺伝子の転写終止部位を含む発現ベクターに関する。
【0002】
(b)関連技術の記載
多くの種類の発現ベクター、例えば微生物、植物、酵母、昆虫細胞、及び動物細胞が、現在、大量の望ましいタンパク質の発現による医学的処置に使用されている。多くの種類の発現系の中で、微生物は発現系として最も容易に使用され、多くの種類の微生物系が研究され、発現系として利用されている。
【0003】
しかしながら、微生物発現系の使用はいくつかの点において限定的である。まず、遺伝子は微生物において発現されるが、微生物はタンパク質発現や、例えばグリコシル化、リン酸化及びアミジル化のようなタンパク質の修飾機序に関して、異なる機序を有するので、発現されたタンパク質の構造及び特性は動物タンパク質の構造及び特性とは類似していない。従って、微生物から製造した組換えタンパク質はほとんど修飾されないか、または機能がタンパク質の修飾及び構造の差異にそれほど影響されないタンパク質の生成に限定される。加えて、微生物により発現される組換えタンパク質を用いる場合、微生物または毒素の夾雑を排除する方法が必要とされる。
【0004】
動物のタンパク質発現には動物細胞が適しているが、動物細胞を用いる発現系は、微生物及び動物細胞の組換えタンパク質の発現効率と比較して効率が低いために生産コストがより高くなり、動物細胞を用いる発現系は一般に使用されない。
【0005】
現在発現系に用いられている工業用の動物細胞にはCHO(チャイニーズハムスター卵巣)、BHK(ベビーハムスター腎臓)及び骨髄腫などがあり、発現ベクターは動物細胞に導入され、微生物の場合と同様望ましい外来性タンパク質を生成する。
【0006】
従って、一般に少量の外来性遺伝子が発現されるので、遺伝子発現系は種々の方法により修飾される。例えば、DHFR(ジヒドロ葉酸リダクターゼ)に対する阻害剤であるメトトレキセート(本明細書では以後「MTX」と称する)を含有する培地でCHOの細胞株を培養し、MTX濃度に依存して生存し、遺伝子のコピー数の増加によりタンパク質を高度に発現するCHO株を得る。
【0007】
一般に、外来性遺伝子が動物細胞で発現される場合、外来性遺伝子は選抜マーカーを有するベクターと同時トランスフェクトされ、形質転換された細胞は長時間選択培地で培養することにより選別する。しかしながら高度に発現する細胞クローンの達成頻度は低い。外来性遺伝子発現の低頻度は、微生物とは異なり、動物系における外来遺伝子の染色体挿入による。加えて、外来遺伝子の挿入方法は成功するが、各遺伝子の挿入部位は異なり、遺伝子の発現は挿入部位に依存するので、外来遺伝子の発現が予測できない(Grindleyら、Trends Genet.3:16−22(1987);Kucherlapatiら、Crit.Rev.Biochem.16:349−381(1984);Palmiterら、Annu.Rev.Genet.20:465−499(1986))。従って、外来性遺伝子は安定して挿入されるが、動物細胞におけるたいていの遺伝子発現は近隣の核酸により阻止されるので、少量しか発現できない(Eissenbergら、Trends Genet.7:335−340(1991);Palmiterら、Annu.Rev.Genet.20:465−499(1986))。
【0008】
位置効果から外来性遺伝子の発現を保護するために、いくつかの系で核マトリックス因子を使用する可能性が報告されている。核因子の実例としては絶縁体因子、核マトリックス結合領域(本明細書では「MAR」と称する)及び骨格結合領域(本明細書では「SAR」と称する)などがある。
【0009】
Kalos(Kalosら、Mol.Cell.Biol.15:198−207(1995))は、アポリポタンパク質B MARを最小プロモーター導入遺伝子構築物と組み合わせた場合、外来性遺伝子が宿主染色体に安定して導入され、発現された転写体の量が約200倍増加することを示唆した。前記の方法に類似して、ニワトリリゾチームA MAR及びβインターフェロンSARが染色体挿入部位にかかわらず、脊椎動物細胞における外来性遺伝子の発現レベルを増加させることができることが報告された(Eissenbergら、Trend Genet.7:335−340(1991);Klehrら、Biochemistry 30:1264−1270(1991))。しかしながら、MAR及びSARがCHO細胞株においてタンパク質生成を増加させることができること、またはMAR及びSARが一般的な使用に適することは証明されていない。
【0010】
動物細胞遺伝子が発現される場合、mRNA合成はプロモーターから生じ、終止部位で停止する。発現されたタンパク質のレベルはしばしば、合成されたmRNAの安定性によってのみならず、転写終止の効率によっても影響を受ける。
【0011】
発現ベクターに含まれる転写終止部位はポリアデニル化を調節し、mRNA安定性に影響を有する。終止部位はポリAシグナル、切断部位、終止部位を含み、ポリアデニル化シグナルはAATAAAであり、十分に研究されている。しかしながらポリアデニル化を生じる切断部位、及びRNA重合化酵素IIにより遺伝子転写が完了される終止部位についてはよく解っていない。加えて、3種の重要な領域以外のGU/Uに富む領域がmRNAのポリアデニル化を調節することが報告されているが、詳細な機序は解っていない。
【0012】
動物細胞において一般に使用される発現ベクターはSV40ウイルス及びBGH(ウシ成長ホルモン)のポリAシグナルを含有し、動物細胞の発現ベクターを使用するためにmRNAの安定性及び発現レベルを改善する特異的転写終結区は示唆されていない。
【0013】
(発明の要約)
本発明の目的は、動物細胞株において用いられる外来性タンパク質の発現において外来性遺伝子の発現効率及びレベルが上昇されている発現ベクターを提供することである。
【0014】
これらの目的を達成するために、本発明はMAR(核マトリックス結合領域)因子またはその相補性配列をプロモーターの5’末端に含んでなる発現ベクターを提供する。
【0015】
また本発明は、配列番号3の配列を有する、SV40ウイルスポリA(ポリアデニル化)シグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなる動物細胞のため発現ベクターを提供する。
【0016】
また、本発明はヒトβグロビン5’MAR(核マトリックス結合領域)の相補性配列、並びにSV40ウイルスポリAシグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなる、配列番号8のpMSG KCCM 10202ベクターを提供する。
【0017】
また、本発明はβグロビンMAR因子、またはβグロビンMAR相補性配列をプロモーター5’末端で含んでなる動物細胞用発現ベクター、配列番号3のSV40ウイルスポリA(ポリアデニル化)シグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位を含んでなるベクター、並びにpMSGベクターを使用することによる、生理活性物質の調製方法を提供する。
【0018】
(発明の詳細な説明)
本明細書では以後、本発明を詳細に説明する。
【0019】
本願発明者は、外来性遺伝子を動物細胞株で発現させる場合に位置特異的効果から生じる問題を打破し、遺伝子の発現量を増加させる最適な発現ベクターを設計した。
【0020】
本発明の動物細胞用発現ベクターは、慣用される発現ベクターにさらに加えられる適当な塩基配列を含んでなる。適当な塩基配列は核酸マトリックス結合領域(本明細書以後「MAR」と称する)及び骨格結合領域(本明細書以後「SAR」と称する)を含み、これらは挿入部位の位置効果から宿主例えばCHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞)及びBHK(ベビーハムスター腎臓)の外来性遺伝子発現を刺激し、外来性遺伝子の発現量を増加させる。
【0021】
プロモーター5’末端にMARまたはSAR因子を加えて本明細書の発現ベクターの効率を分析する。染色体DNAを細胞から単離し、次いで染色体DNAをPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)及びサブクローニングによりE.coliにクローン化し、MAR及びSAR因子のDNAが得られるようにする。
【0022】
好ましくは、MARまたはSAR因子をニワトリリゾチーム5’MAR(Phi−Van,L.及びStratling,W.H.、Biochemistry 35:10735−10742(1996)、ジーンバンク番号:X98408)、ニワトリpiαグロビン5’MAR(Krevskii,V.A.、Mikhailov,V.S.及びRazin,S.V.、Mol.Biol.26:672−678(1992)、ジーンバンク番号:X64113)、ヒトβグロビン5’MAR(Yu,J.、Bock,J.H.、Slightom,J.L.及びVilleponteau,B.、Gene 139(2):139−145(1994)、ジーンバンク番号:L22754)、CHO DHFRイントロンMAR(Kas,E.及びChasin,L.A.、J.Mol.Biol.198(4):677−692(1987)、ジーンバンク番号:X06654)、ヒトHPRTイントロンMAR(Sykes,R.C.、Lin,D.、Hwang,S.J.、Framson,P.E.及びChinault,A.C.Mol.Gen.Genet.212:301−309(1988)、ジーンバンク番号:X07690)、ヒトCSP−B遺伝子隣接SAR(Handson,R.D.及びLey,T.J.、ジーンバンク番号:M62716)、及びヒトインターフェロンβ遺伝子隣接SAR(Mielke,C.、Kohwi,Y.、Kohwi−Shigematsu,T.及びGode,J.、Biochemistry 29:7475−7485(1990)、ジーンバンク番号:M83137)からなる群から選択する。
【0023】
MAR及びSARを動物細胞用発現ベクターに組み込み、MAR/SAR及び発現力価の間の関係を確認するためにベクターのβ−Gal発現を誘導した。
【0024】
インビトロPCR変異誘発によりpSV−β−galプロモーターの5’末端をマルチクローニング部位(本明細書では以後「MCS」と称する)に連結させ、次いで図1に示す組換えベクター(バージョンI及びバージョンIIベクター)を得た。MARまたはSARを組換えベクターpSV−β−galバージョンIまたはIIのSVプロモーターの5’末端の前に挿入し、被験ベクターを調製し、被験ベクターをCHO DG44に形質転換した。形質転換されたCHO DG 44をG418(ネオマイシン)含有培地で選別し、β−Gal染色することにより(IPTG及びX−Galでの青色染色)発現力価を測定した。発現力価を測定するために、発現頻度、発現細胞数、及びβ−Gal発現の量を測定した。
【0025】
図2は本発明で使用される種々MAR及びSAR因子により誘導されたβ−Galの発現頻度を示す。pSV−β−galベクターは約20から30%のβ−Gal発現頻度を示したが、βグロビンMAR、CSP−B SARまたはインターフェロンβSARを含んでなる被験ベクターは陽性細胞株において発現頻度を増加させ、さらに具体的にはβグロビンMARを含んでなる被験ベクターは約70から80%のβ−Gal発現頻度を示した。
【0026】
加えて、種々のMAR因子及びSV40プロモーターの組み合わせに従って構築物を調製し、組換えタンパク質発現の頻度をSV40ウイルスプロモーターと比較した。β−Gal生成の量を比較するために、β−Gal染色法及びβ−Gal酵素の測定法を運用し、発現頻度は各MAR因子によって異なるので、同一数の陽性細胞株においてβ−Galの活性を分析した。
【0027】
図3は、βグロビンMAR、CSP−B、SAR、及びインターフェロンβ−SAR因子を使用し、pSV−β−galと比較した場合の種々MAR及びSAR因子の影響によって発現されたβ−Galの活性、及び陽性細胞あたりのβ−Gal量または増加したβ−Gal活性を示す。βグロビンMAR因子を含んでなるベクターの発現量が7倍またはそれ以上に増加したことが観察される。
【0028】
従って、MAR因子の中でβグロビンMAR因子が本発明ではより好ましい。
【0029】
βグロビンMAR因子の効果及び効率を調べるためにMAR因子のDNA配列を分析した。
【0030】
βグロビンMAR因子は2999個の塩基を含有し、その機能は詳細には解っていない。βグロビンMAR因子は一致配列及び800bp領域の3’に位置する244bpのalu因子を含んで成り、ここにはA+T(アデニン、チミジン)に富む配列が存在する。alu部位は300bpの2つの直接反復単量体ユニットを含んで成り、真核生物の染色体には数千の相同性部位が存在するので、この部位でその組換えがしばしば生じる(Jagadeeswaranら、Nature 296:469−470(1982);Rogers、Int.Rev.Cytol.93:187−279(1985))。βグロビンMARのaluはSV40プロモーターの上流に位置し、細胞が長時間培養される場合、組換えを生じ得る。
【0031】
従って、本願発明者は前記の悪影響を有さないβグロビンMAR変異体を設計した。
【0032】
図4はMAR相補性配列b、欠失変異体c、d、e、f、g及びiを調製し、これをpSV−β−galバージョンIに組み込むことにより生成したβグロビンMAR変異体を示す。
【0033】
βグロビンMAR変異体を含んでなるベクターをCHO細胞に導入した後、β−Gal発現細胞数及びβ−Gal量を測定し、その結果を図5に表す。たいていのβグロビンMAR変異体のβ−Gal発現力価は低下した;対照的にβグロビンMAR相補性配列を含んでなるpMS−β−galベクターで形質転換された細胞株の力価は高かった。図6及び図7は、組換えタンパク質の発現量及び組み込まれた遺伝子のコピー数、並びにpSV−β−Galの発現量の間の関係は組み込まれた遺伝子のコピー数に依存せず、pMS−β−Galで形質転換されたベクターの発現量は組み込まれた遺伝子のコピー数に比例することを示している。βグロビンMAR相補性配列によりaluがプロモーターの別の側に存在できるので、ベクターの組換えの可能性が低減し、挿入位置特異的効果の防御により発現量が増加する。従ってβグロビンMAR相補性配列は本発明において好ましい。
【0034】
MARまたはSAR因子が慣用される発現ベクタープロモーターの5’部位に位置し、MARもしくはSAR変異体または相補性配列が慣用される発現ベクターに組み込まれ、そのため外来性タンパク質の発現力価が増加することが証明される。従って、本発明はMARまたはSAR因子を含む発現ベクターを提供し、その発現ベクターにはMARもしくはSAR変異体、またはその相補性配列が含まれる。MARまたはSARはpi−a MAR(ニワトリpi αグロビン5’MAR)、βグロビンMAR(ヒトβグロビン5’MAR)、DHFR MAR(CHO DHFRイントロンMAR)、HPRT MAR(ヒトHPRTイントロンMAR)、CSP−B SAR(ヒトCSP−B遺伝子隣接SAR因子)、インターフェロンβSAR因子(ヒトインターフェロン−β遺伝子隣接SAR因子)、及びリゾMAR(ニワトリリゾチーム5’MAR)からなる群からから選択されるのが好ましい。
【0035】
これらの中で本発明のpMSベクター(KCCM10203)はSV40ウイルスプロモーターの5’末端でヒトβグロビンMAR相補性配列を含んでなる6287bp及びマルチクローニング部位からなり、マルチクローニング部位に遺伝子を組み込むことにより組換えタンパク質を発現できる。pMS塩基配列をシークエンス・リスティング・ソフトウェアで配列番号1として編成した。
【0036】
βグロビンMAR相補性配列を用いる場合、外来性遺伝子の発現頻度及び発現量は、SV40プロモーターのみを用いる場合の外来性遺伝子のそれと比較して各々3から4倍、及び7から10倍増加する。加えて、pMS−β−galベクターを図8に示す種々の動物細胞に適用でき、pMS−β−galベクター系が好ましくBHK、CHO、NIH3T3及びHEK293に適用できる。図9は外来性遺伝子がpMS−β−galベクター系において発現される場合、MTX(メトトレキセート)を添加することにより発現力価が上昇することを示している。
【0037】
MARまたはSARによる外来性タンパク質の発現力価を測定するために、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーターを使用する。外来性遺伝子の発現力価はプロモーターの種類及び種々の細胞株に依存して変化するので、CMVプロモーターをも試験する。CMVプロモーターの機能に及ぼすβグロビンMAR相補性配列を確認するために、pMS調製に類似の手順によりpMCベクターを調製し、Scu−PA遺伝子をpMS、pMC及び調節ベクターに組み込む。
【0038】
図10は、scu−PAのpMS、pMC、pSV及びpCMVへの組み込みにより調製されるpMSPUK、pMCPUK、pSPUK及びpMCPUKベクターで形質転換したCHOにおけるscu−PAの発現力価、並びにpMS及びpMCの遺伝子発現はpSV及びpCMVの発現の4倍増加することを示す。従って、本発明のβグロビンMAR相補性配列を望ましいプロモーターとの適当な組み合わせにより動物細胞のタンパク質発現に使用することができる。
【0039】
βグロビンMAR相補性配列などの本発明のベクターは宿主細胞である外来性の遺伝子に組み込まれるので、慣用される方法で動物細胞株から有用なタンパク質を得ることができる。
【0040】
本発明ではヒトガストリン遺伝子転写ポリAシグナル、切断部位及びヒトガストリン終止部位を調製し、mRNA安定性を増し、それにより発現ベクターの効率を増すためにこれらを本発明の発現ベクターに適用した。
【0041】
ヒトガストリン遺伝子3’転写制御領域はポリAシグナル、切断部位、終止部位を含む605bpを含んで成り、ヒトガストリン遺伝子3’転写制御領域に塩基配列を配列番号2として提示する。切断部位はポリAシグナルの下流15bpに位置し、終止部位はポリAシグナルの下流220bpに位置する。ガストリンの転写は終止部位で完了し、mRNAの切断及びポリアデニル化は切断部位で生じる。
【0042】
本発明者が設計した、遺伝子の発現力価を増加させることができるSV40ポリA及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を、図11に示す。
【0043】
図11はガストリン遺伝子の転写終止部位及びSV40ポリAからなる構築物を示し、構築物は好ましくは「a」のpSV−SPA(SPA;SV40ポリアデニル化のシグナル)、「b」のpSV−SPA−GTF(GTF;ガストリン遺伝子の転写終止部位)、「c」のpSV−SPA−GTR(GTR;GTF相補性配列)、「d」のpSV−GPA(GPA;ガストリンポリアデニル化シグナル)、「e」のpSV−GPA−GTF、「f」のpSV−GPA−GTR、「g」のpSV−GMPA(GMPA;GPA変異体)、「h」のpSV−GMPA―GTF、「i」のpSV−GMPA―GTRから選択される。SPA−GTF、SPA−GTR、SPA−GPA、SPA−GPMAの塩基配列は各々配列番号3、4、5及び6に列挙する。全ての構築物はおのおのpSV−β−galに組み込まれ、β−Galの発現力価を測定するためにCOS−7細胞株にさらに導入した。発現力価はβ−Galの発現量であり、これを図12に示す。SV40ポリAからなる構築物及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなるpSGベクターはタンパク質の発現量を4倍に増加させる効果を有する。従って発現力価を上昇させるために終止部位はSPA−GTF(SV40ポリAシグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位)であるのが好ましい。本発明では、慣用される発現ベクターの終止部位として構築物を用い、そして外来性タンパク質の発現量を増加させる。本発明の発現ベクターの例としてはpSGなどがある。
【0044】
pSGベクターはその終止部位でSPA−GTFに組み込まれ、3309bpである。pSGベクターの塩基配列を配列番号7に列挙する。pSGベクターを、その発現力価を測定するためにβ−Galに挿入し、pSGの発現力価はpSVベクターよりも4倍多くなり、これはガストリン遺伝子の転写終止部位及びSV40ウイルスポリAシグナルからなる構築物によりmRNAが安定化された結果である。
【0045】
従って、SPA−GRFからなるベクターは従来の方法で動物宿主において外来性遺伝子を発現でき、有用なタンパク質、例えば生理活性物質を得ることができる。
【0046】
加えて、本発明は外来性遺伝子の発現力価を増加させることができる2つの部位を含む発現ベクターを提供する。2つの部位は、SV40ポリAを伴うガストリン遺伝子の転写終止部位と連結した転写終止部位、及びβグロビンMAR相補性配列である。
【0047】
図13は本発明のpMSG構造を示し、全塩基配列の6347bpを配列番号8として列挙し、pMSGを韓国微生物培養センターにKCCM10202の下に寄託した。以下の表はpMSGの詳細なマップを示す。
【0048】
【表1】
【0049】
TGF−β SRII遺伝子のタンパク質は、活性なヒトタンパク質であるTGF−βとの選択的結合によりTGF−βの副作用を防御できる。本発明のpMSGの効果及び効率を分析するためにTGF−β SRIIを発現させた。結果は図14に示すように、TGF−β SRIIタンパク質はグリコシル化構造を有するので、タンパク質は典型的な動物細胞が有するような元来のタンパク質の分子量よりも大きな分子量を有する。TGF−β SRIIの最初の発現量は約100ng/106細胞/日であり、たいていの細胞は同等に発現する。加えて、図15に示すように、MTX 1μMをTGF−β SRII細胞に添加した場合、最大10μg/106細胞/日が得られた。TGF−βはヒト体内で種々の機能を有し、とりわけ、例えば腎臓の糸球体硬化体、肝硬変、表皮細胞の角質化、及び軟骨咬合のごとき炎症に至る因子として見出され、TGF−β SRIIはTGF−β過剰発現された疾患の処置に用いることができる。
【0050】
本発明のpMSGベクターは、一般的な問題、すなわち発現収量が低く及び形質転換体の入手が困難であるという問題を打破しており、種々の組換えタンパク質、例えば生理活性物質の大量生産が可能である。
【0051】
加えて、pMSベクター(KCCM−10203)が開発され、これは挿入部位の近隣塩基によるその発現が阻止されず、pMSは慣用されるSV40プロモーターよりも約8倍の組換えタンパク質を生成する。
【0052】
また、転写体の特定の部位で転写終止を誘導することができる転写終止部位を含んでなるpSGベクターを調製し、慣用されるポリA部位の3倍まで増加した。
【0053】
機能的DNAフラグメント及び外来性遺伝子に適用できるマルチクローニング部位を連結することにより本発明のpMSGベクター(KCCM−10202)を調製し、動物細胞においてTGF−βを発現させる場合、その発現量は10μg/106細胞/日である。従って、本発明の発現ベクターは組換えタンパク質の発現に適し、本発明によれば、原核細胞において発現される、真核細胞に由来するタンパク質を、野生型タンパク質に比較して同一の構造及び機能を有する組換えタンパク質として動物細胞において生成することができる。
【0054】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、その範囲を限定することを意図するものではない。
【0055】
実施例1:pMS−β−galベクターの調製
(1)pMS−β−galベクターの調製
pMS−β−galベクターを以下のように調製した
1) ヒトβグロビンMBRの塩基配列を得るための、G−2細胞からのゲノムDNA単離
ウィザード・ゲノミックDNA精製キット(プロメガ(Promega)社による製品)を使用してヒト宿主においてG−2細胞からゲノムDNAを単離し、精製手順は製造会社により供給された実験手順に従った。
【0056】
2) ゲノムPCR及びサブクローニングの実施
ヒトβグロビン5’MARのフラグメントを得るために、鋳型として精製されたゲノムDNAを用い、ゲノムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてβグロビンMARのセンスプライマーBML1及びアンチセンスプライマーBMR1を使用した。BML1及びBMR1は各々配列番号9及び配列番号10として列挙した。PCRは32サイクルで実施した。表2はサイクル数を示す。
【0057】
【表2】
【0058】
PCRの後、PCR産物をノヴァゲン(Novagen)社のpT7blueベクターに挿入し、pT7blue/βグロビンMARベクターを調製した。pT7blueベクターはPCR産物を直接クローニングできるTAクローニングベクターである。
【0059】
3) 組換えベクターpSV−β−galバージョンI及びバージョンIIマルチクローニング部位(MCS)の調製
pT7blueベクターのβグロビンMARをpSV−β−galベクターのプロモーターの上流に挿入するために、pSV−β−galバージョンIとpSV−β−galバージョンIIを調製した。
【0060】
まずpSV−β−galバージョンIを調製するために、pSV−β−galをSpe I及びHind IIIで処理した後、SV40プロモーターを含むSpe I/Hind IIIフラグメントの443bpをBIO 101社のジーン・クリーンIIIキットでアガロースゲルから精製した。フラグメントをSpe I/Hind III消化により直線化したストラタジーン(Stratagene)社のpBluescript SK(+)にライゲートし、pBluescript/SV40 Iプロモーターベクターを調製した。
【0061】
次いで、pBluescript/SV40 IプロモーターベクターをSca I及びHind IIIと反応させ、前記と同一の方法でSV40プロモーターを含むフラグメントをアガロースゲルから精製し、フラグメントをSca I及びHind III消化により直線化したpSV−β−galベクターと共にライゲートし、バージョンIベクターを調製した。
【0062】
加えて、pSV−β−galをEcoR I及びHind IIIと反応させた後、pSV−β−galバージョンIIベクターを生成するために、前記と同一の方法でSV40プロモーターを含むEcoR I/Hind IIIフラグメントの420bpをアガロースゲルから精製し、EcoR I及びHind III消化により直線化したpBluescript SK(+)と共にフラグメントをライゲートして、pBluescript/SV40 IIプロモーターベクターを生成した。
【0063】
前記と同一の方法でSV40を含むフラグメントをアガロースゲルから精製するために、pBluescript/SV40 IIプロモーターベクターをSca I及びHind IIIで処理し、フラグメントをSce I及びHind III消化により直線化したpSV−β−galベクターと共にライゲートし、pSV−β−galバージョンIIベクターを調製した。
【0064】
4) pMS−β−galベクターの調製
pT7blue/βグロビンMARベクターをSpe I及びSma Iで処理して、βグロビンMARを含む3kbの大きさのDNAフラグメントをアガロースゲルから精製し、フラグメントをSpe I及びSma Iにより直線化した組換えpSV−β−galバージョンIとライゲートし、βグロビンMARをクローン化した。βグロビンMARの配向を確認するために、pSV−β−galバージョンIに存在する制限酵素Hind III及びβグロビンMARを反応させ、βグロビンMARがpSV−β−galバージョンIベクターに対して逆の配向でクローン化されたことを確認した。
【0065】
(2)pMS−β−galベクターの発現力価
pMS−β−galベクターを含む被験ベクター2μgをDOSPER(ロッシュ(Roche)による製品)を用いてpSV2neoベクターでCHO DG44に同時トランスフェクトし、対照ベクターとしてpSV−β−galベクターを同一の方法で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされたCHO DG44細胞をヌクレオシド補充した10%加熱不活性化したFBS及び850μg/ml G418硫酸塩(カルビオケム(Calbiochem)社による製品)を含むMEM−α培地である選択培地中で培養した。約2週後、安定してトランスフェクトされたG418抵抗性トランスフェクト体を生じ、G418抵抗性トランスフェクト体において対照ベクター及びpMS−β−galベクターに関してβ−Galを発現する20個の安定したクローンを単離した。β−Gal及びneo遺伝子のコピー数及びpSV−β−gal及びpMS−β−galからの転写されるβ−Gal RNAの量を測定するために、40個の陽性クローンをサザン及びノザンブロッティングにより分析した。
【0066】
図6はpSV−β−galまたはpMS−β−galベクターに関する、β−Gal遺伝子コピー数(a:対照群、b:本発明)、RNA数(c:対照群、d:本発明)、及びβ−Galを発現する陽性クローン(本明細書において以後「陽性クローン」と称する)における選抜マーカーとしてのneo遺伝子のコピー数(e:対照群、f:本発明)を確認するためのサザン及びノザンブロットを示し、図7はpSV−β−galまたはpMS−β−galベクターに関する、陽性クローンにおけるβ−Gal遺伝子のコピー数及びβ−Galの発現収量間の関係を示すグラフである。各陽性クローン中のβ−Gal遺伝子のコピー数は図6a及び6bで示されるように変化するので、各陽性クローンを2群に分類し、ここで一方はβ−Gal遺伝子の高コピー数を有し、他方はβ−Gal遺伝子の比較的低コピー数を有し、互いの群を分析した。β−Gal遺伝子の高コピー数を有する群では、「a」で示すように対照群はβ−Gal遺伝子の高コピー数を有するが、これらのクローンにおけるβ−Gal遺伝子のRNA量は「c」で示すようにDNAコピー数に相対して低かった。しかしながら、「d」で示す、本発明のpMS−β−galの陽性クローンにおけるRNA量は高かった。加えて、図6で示すように、β−Gal遺伝子の低コピー数を有する群では、pMS−β−galベクターに関する陽性クローンにおけるβ−Galのコピー数及びRNA量は対照ベクターに関する陽性クローンよりも非常に高かった。図7は遺伝子のコピー数及び発現量間の関係を示す。図7ではpMS−β−galベクタークローンにおけるβ−Gal遺伝子の平均コピー数及び発現レベル(●)は対照ベクタークローン(○)の約10倍に相当する。加えて、β−Gal遺伝子の高コピー群の場合、対照ベクタークローンにおけるβ−gal遺伝子の発現は遺伝子のコピー数に依存せず、pMS−β−galの場合を図7に示す。
【0067】
(3)種々細胞株におけるpMS−β−galベクターの発現パターン
動物細胞における外来性遺伝子の発現では、種々の細胞及びCHOもまた用いられ、外来性遺伝子の発現量は種々の細胞で多様であった。本発明では、CHO細胞宿主でpMS−β−galベクターを用いる場合、トランスフェクトされたCHOにおける外来性遺伝子の発現力価及び発現頻度が増加した事が明らかにされた。従って、本発明のベクターを、起源及び形態がCHO細胞とは類似しない動物細胞に適用できるかどうかを試験した。
【0068】
pSV−β−galベクター及びpMS−β−galベクターを各々ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウス繊維芽細胞(NIH3T3)、及びヒト胚腎細胞(HEK293)にpSV2neoベクターと同時トランスフェクトした後、G418を含む培地中で14日間培養し、各ベクターに関して安定したトランスフェクト体においてβ−Galを発現する陽性細胞の頻度及び発現力価を(2)と同一の方法で測定した。
【0069】
図8は種々細胞株におけるpMS−β−galの発現力価を示す。宿主細胞株にBHKを用いる場合、遺伝子発現はCHO細胞株の場合に類似する。宿主細胞株にNIH3T3を用いる場合、発現量の増加に及ぼす影響は低かった。宿主細胞株にHEK293を用いる場合、効果及び発現量は対照に類似した。陽性クローンの頻度は前記に類似した。従って、本発明の発現ベクターの効果は細胞の種類で異なり、とりわけ動物細胞の発現において一般的に用いられるCHO、BHK、及びNIH3T3細胞に関して有用である。
【0070】
(4)pMS−β−galベクターの発現系の確立
慣用される発現ベクター系では、プールされた1次トランスフェクト体のできるだけ多くを単離し、外来性遺伝子の発現レベルを高めるために長時間これらのクローンを培養する冗長な方法で高度に発現するクローンを選別しなければならない。これらの問題を打破し、外来性遺伝子の発現レベルを最大にするために、CHO DG44細胞株を用いるDHFR/MTX増幅系を発現系において確立した。
【0071】
pMS−β−galベクターをDHFR−CHO DG44(本明細書では以後「CHO DG44」と称する)細胞株にトランスフェクトし、pMS−β−galベクターをMTXに適合させ、次いでタンパク質の発現量を測定した。pMS−β−galベクター及び対照(pSV−β−galベクター)を、各々DHFR遺伝子を欠いているCHO DG44に、DHFR遺伝子を有しているpDCH1Pベクターと共に同時トランスフェクトした。DHFRトランスフェクトされた細胞株を選択培地、ヌクレオシド補充した10%加熱不活性化透析FBSを欠いたMEM−α培地で培養した。2週後に安定したDHFR+トランスフェクト体を生じ、安定したDHFR+トランスフェクト体においてβ−Galを発現する陽性クローンをβ−Gal染色により単離した。DHFR+トランスフェクト体においてβ−Galを発現する陽性クローンをスクリーニングするためのβ−Gal染色に関しては、細胞を2%ホルムアルデヒド、及び0.2%グルタルアルデヒドを含有するPBS中4℃で10分間インキュベートすることにより固定し、PBSで二回洗浄し、X−Galで処理した。β−Galを発現する場合、β−Galタンパク質によるX−Galの分解のため、青色生成物が作製されるので、細胞は青色に見える。選択されたクローンを、MTX濃度を多段階的に増加させて、例えば10nM、20nM、50nM、100nM、400nM、及び1μMで処理した。クローンを各々のMTX濃度の培養に適合させるのに約2から3週間かかった。MTX適合による遺伝子増幅の間のβ−Galの発現量を、慣用されるELISAで分析した。
【0072】
図9は、1μM MTX濃度に適合させた、pMS−β−gal及び対照各々でトランスフェクトした細胞における組換えタンパク質の発現量を示す。組換えタンパク質の発現がCHO細胞株においてDHFR.MTX増幅系により増幅された場合、発現レベルは約10μg/106細胞/日までになり、これは全タンパク質の2.5%に相当する(Kaufman、Methods Mol.Biol.62:287−300(1997))。本発明では漸増量のMTXにより約100から1000までのコピー数が増幅されることが観察される。対照のpMS−β−galベクターのクローンにおけるβ−Galの発現量が測定された。対照クローンにおけるβ−Galの発現量は各クローンで変化する。動物細胞における組換えタンパク質生成では、20μg/106細胞は工業的に貴重であることを鑑みて、対照ベクターの25%がそれに属し、本発明のpMS−β−galベクタークローンの88%が20μg/106細胞以上の組換えタンパク質を生成した。最大発現量を有する細胞株に比較した、本発明のpMS−β−galベクターは多量の発現タンパク質を有し、外来性遺伝子をpMS(KCCM−10203)に挿入することにより多量のタンパク質を生成できる。従って、本発明の発現ベクターを外来性遺伝子の発現に使用する場合、高度な発現収量及び効率に至る。
【0073】
実施例2:pSPUK、pMSPUK、pCPUK、及びpMCPUKの調製
(1)pCMVベクターの調製
CMVプロモーター及びSV40プロモーターのscu−PA遺伝子へのクローニングを容易にするために、pCMVベクターを調製した。CMVプロモーター、MCS部位、及びpcCDNA3.1(+)(インビトロゲン(Invitrogen)社による製品)の転写終止部位を得るためのPCRを実施した。PCRセンスプライマーはCMVL1(配列番号11)であり、アンチセンスプライマーはPAR1(配列番号12)である。CMVL1プライマーはSac II、Cla I、Nru I部位を有し、PAR1プライマーはBsml部位を有する。1.4kbのPCR産物をSac II及びBsm Iで消化した後、pCMVを調製するためにこれを直線化した組換えpSV−β−galバージョンIでライゲートした。
【0074】
(2)pSPUK、pMSPUK、pCPUK、及びpMCPUKの調製
動物細胞におけるscu−PA発現のための組換え発現ベクターを調製するために、鋳型としてヒトTCL−598細胞株に由来するscu−PA遺伝子を有するCHO細胞株から分離したゲノムDNAに関するPCRにより、scu−PA遺伝子を得た。センスプライマーPKL1は配列番号13として提示し、アンチセンスプライマーPKR1は配列番号14として提示する。PKL1プライマーはHind III制限部位を有し、PKR1プライマーはSma I制限部位を有する。
【0075】
プライマーから生成した約1.3kbのscu−PA PCR産物(ヒトscu−PAの第6から第1293塩基を有するDNAフラグメント)をSma I及びHind IIIにより切断し、pCPUK発現ベクターの調製のため、Hind III及びEcoR Vにより切断したプラスミド、pCMVに挿入した。
【0076】
加えて、組換えpSV−β−galバージョンIベクターをSma I及びHind IIIで処理し、そこからSV40プロモーターを有するフラグメントを分離する。このフラグメントをNru I及びHind IIIにより直線化した対照のpCPUKに挿入し、結合させ、pSPUK発現ベクターを調製した。
【0077】
pCPUKをSac II及びNru Iで処理して、MAR因子をそこに挿入した。直線化したpCPUKを、pMS−β−galベクターをSma I及びSac IIで処理することにより調製したβグロビンMAR因子に挿入し結合させ、pMCPUKベクターを調製した。
【0078】
pSPUKベクターをStu I及びSac IIで処理して、そこにβグロビンMAR因子を挿入した。pMS−β−galベクターをSu I及びSac IIで処理することにより生成したβグロビンMAR因子を、pSPUKベクターに挿入し、pMSPUKベクターを調製した。
【0079】
簡単には、pSPUKベクター構築物はscu−PA遺伝子を組換えベクターである、β−Gal遺伝子を除去したpSV−β−galバージョンIに挿入することにより生成された形態であり、βグロビンMAR相補性配列をpSPUKベクターに挿入してpMSPUKベクターを調製した。pCPUKベクター構築物はscu−PAをpCMVベクターに挿入することにより生成された形態であり、βグロビンMAR相補性配列をpCPUKに挿入してpMCPUKベクターを調製した。
【0080】
(3)pSPUK、pMSPUK、pCPUK及びpMCPUKベクターの効率の試験
1) 組換えscu−PA遺伝子の細胞へのトランスフェクション、形質転換体の選別及び遺伝子の増幅
4種の組換え発現プラスミド、すなわちpSPUK、pMSPUK、pCPUK及びpMCPUKを各々DHFR−CHO細胞(CHO DG44)に導入してscu−PAを発現するのに十分安定な細胞株を得た。CHO細胞2x105を6ウェルプレートに載せ、5%CO2インキュベーター中37℃で24時間インキュベートした。pSPUK、pMSPUK、pCPUK及びpMCPUKのプラスミド1μg及びDHFRミニ遺伝子10ngを各々100:1の比率で混合し、リポフェクトアミン(GiboBRL)またはロッシュ(Loche)によるDOSPERの方法で混合物をCHO細胞にトランスフェクトした。6時間後、培地を新鮮培養培地で置換し、細胞をさらに48時間インキュベートした。細胞を培地上で選択培地に10:1の比率で約2週またはそれ以上継代培養し、培地を約4または5日毎に交換して細胞コロニーを形成させた。細胞コロニーを別個にまたは一緒に培養した。
【0081】
2) 細胞の培養溶液に分泌されたscu−PAの活性測定
細胞の培養培地のアミド溶解活性は基質としてS−2444を用いて測定し、その結果を標準ウロキナーゼ活性と比較した。1×106細胞を培養溶液2mlと一緒の6ウェルプレートに載せ、5%CO2インキュベーター中37℃で17時間インキュベートした。上澄の活性を測定するために、連続希釈した上澄50μlを96ウェルプレートに載せ、バッファー溶液(50mMトリス/Hcl(pH8.8)、80mM NaCl、0.02%トゥイン80)30μlと混合した。プラスミン(0.5U/ml)10μlをさらに混合物に混合し、混合物を37℃で20分間反応させて組換えscu−PAを活性化させた。アプロチニン(100KIU/ml)10μlを混合物に加えてプラスミン活性を阻止し、色素基質溶液(バッファー溶液及び6mM S−2444の混合物)100μlをさらに混合物に加え、37℃で1時間反応させた。マイクロプレートリーダーで得られた溶液の405nmでの吸収(光学密度)を測定することにより、培養培地中のscu−PAの活性及び濃度を測定し、結果を標準であるウロキナーゼと比較した。
【0082】
図10はpMSPUK、pMCPUK、pSPUK及びpCPUKのCHO細胞へのトランスフェクションによるscu−PAの発現力価を示す。pMS及びpMCベクターからの発現レベルは対照であるpSV及びpCMVからの発現レベルよりも4倍増加する。
【0083】
実施例3:pSG−β−galベクターの調製
(1)ガストリン遺伝子の転写終止部位及びpSG−β−galベクターの調製
配列番号15のガストリン遺伝子の転写終止部位のセンス鎖を合成した後、配列番号16のアンチセンス鎖を合成し、2つをアニーリングさせた。アニーリングフラグメントをBamH I及びPst Iで処理して、SV40p(A)転写週末区の3’でBamH I及びPst I消化により直線化されたpSV−β−galベクター(プロメガ(Promega)社により製造されたベクター)に組み込んで結合させ、pSG−β−galを調製した。
【0084】
(2)pSGベクター効率の測定
ロッシュ(Roche)によるDOSPERを用いて、pSG−β−galベクターをCos−7細胞にpSV2neoベクターと共に同時トランスフェクトし、β−Galの発現力価を測定した。
【0085】
図12はpSG−β−galベクター中のβ−Galの発現力価を示し、SV40ポリA及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなるpSG−β−galベクターは、SV40ポリAを含んでなる慣用されるベクターよりも4倍多いβ−Galを生成した。従って、pSGベクターにクローン化された外来性遺伝子のトランスフェクションにより大量の組換えタンパク質を生成することができる。
【0086】
実施例4
(1)pMSGベクターの調製
図13に示すように、βグロビンMAR相補性配列及びSPA−GTFを含有するベクターをPCRにより調製した。pMSGベクターを調製するために、pMS−β−gal及びpSG−β−galを鋳型として用い、PCRを3回実施し、PCRプロデューサーを特異的制限酵素と反応させ、一緒に結合させた。
【0087】
1) βグロビンMAR因子のPCR
センスプライマーML1(配列番号17)及びアンチセンスプライマーMR1(配列番号18)をPCRに用いた。PCR産物をSac II及びCla Iで処理した後、Sac II及びCla I消化により直線化されたpMS−β−galベクターに組み込み、pMS−β−gal/scベクターを調製した。
【0088】
2) マルチクローニング部位及び転写終止部位を得るためのPCR
センスプライマーTL1(配列番号19)及びアンチセンスプライマーTR1(配列番号20)をpSGベクターのガストリン遺伝子の転写終止部位のPCRに用いた。PCR産物を直接クローニングできる一種のTAクローニングベクターであるpGEM−T(プロメガ(Promega)社による製品)でPCR産物をサブクローニングし、pGEM−T/MCSp(A)を調製した。
【0089】
3) SV40プロモーター及びマルチクローニング部位を得るためのPCR
センスプライマーPL1(配列番号21)及びアンチセンスプライマーPR1(配列番号22)をSV40プロモーター及び図1のバージョン1のマルチクローニング部位に関するPCRに用いた。PCR生成物をApa I及びBgl IIで処理し、次いでApa I及びBgl II消化により直線化されたpGEM−T/MCSp(A)ベクターにこれを組み込み、pGEM−T/SVMCSp(A)ベクターを調製した。
【0090】
4) pMSベクター及びpMSGベクターの調製
実施例4のpGEM−T/SVMCSp(A)をApa I及びBamH Iで処理し、SV40プロモーター、マルチクローニング部位及びSV40終止部位からなるDNAフラグメントを精製し、精製したフラグメントを実施例4の1)のApa I及びBamH I消化により直線化されたpMS−β−gal/scベクターに組み込み、pMSベクターを調製した。pSGベクターをBamH I及びSca Iで処理して、GTF塩基配列を有する950bpのDNAフラグメントを分離し、BamH I及びSca I消化により直線化したpMSベクターと結合させ、pMSGベクターを調製した。
【0091】
(2)pMSGベクターにおける発現力価の測定
TFG−β SRII(TGF−β可溶性レセプターII、グリコシル化タンパク質)遺伝子に関するPCRをセンスプライマーTRI(配列番号23)及びアンチセンスプライマーTRR1(配列番号24)で実施し、CHO宿主細胞株におけるpMSGベクターの発現効率及びpMSGベクターの工業用適用を確認した。PCR産物である増幅されたTGF−β SRIIをpMSG及びpSVベクターにNhe I及びXho I部位で挿入し、得られた各々のベクターを、DHFR遺伝子を有するpDCH1Pと共にCHO DG44細胞に同時トランスフェクトした。これらを、DHFR遺伝子を有する細胞株のみが成長できる選択培地で培養した。2週後、安定したDHFR+トランスフェクト体を生じ、20個のDHFR+クローンを単離し、これらのクローンをウェスタンブロットにより分析し、TGF−β SRIIの量を測定して、その特性を見出した。
【0092】
図14はTGF−β SRII発現を示すウェスタンブロットを示し、ここで「a」はpSVベクタークローンから発現されたTGF−β SRIIであり、「b」はpMSGベクタークローンから発現されたTGF−β SRIIである。対照ベクタークローンの場合、25個のクローン中1個のクローンでTGF−β SRII発現が検出された。27個のクローン中23個のクローンでTGF−β SRIIの発現が検出されたが、さらに多くのクローンでTGF−βが高レベルで発現された。加えて、TGF−β SRIIがpMSG発現ベクターにより発現された場合、これはグリコシル構造を有し、典型的な動物細胞の糖タンパク質のようにその分子量が増加した。pMSGベクターに関するこれらの1次クローンの平均発現レベルは約100ng/106細胞/日である。
【0093】
本発明のpMSG/TGF−β SRIIベクターに関する安定した1次クローンを、10nM、40nM、200nM及び1μMのような多段階で増加させたMTX量で処置することによりDHFR/MTX増幅系に適合させ、TGF−β SRIIの発現量を増加させた。
【0094】
図15はTGF−β SRIIをpMSGベクターにクローニングし、これらをCHO細胞にトランスフェクトし、そして1μM MTX濃度に適合させることにより生成される、TGF−β SRIIの発現量を示す。対照ベクタークローンでは、多くのクローンはMTX処理による遺伝子増幅過程中に各MTX濃度で適合しないが、pMSG/TGF−β SRIIベクタークローンは対照ベクタークローンに比較して良好に適合する。pMSG発現ベクターのMAR因子は、外来性遺伝子のみならずDHFR遺伝子も同様に発現量を増加すること考えられる。図15に示すように、1μM MTX濃度に適合させる場合、約10μg/106細胞/日でTGF−βを生成するMSGベクターに対する多くのクローンが得られた。
【0095】
細胞成長及び分化の強力なタンパク質レギュレーターであるTGF−βは損傷応答の中心であることが報告されている。多くの上皮では反復された、または延長された損傷が進行性繊維症及び最終的には望ましくない過剰な瘢痕の発達に至る。加えて、TFG−βは糸球体、腎硬化症、肝硬変、表皮細胞の角質化、及び炎症性軟骨のごとき疾患に至る。TFG−β SRIIはTFG−βのアンタゴニストとして機能する。従って、本発明のCHO細胞株から発現されるTGF−β SRIIは、例えばE.coliまたはPichia pastorisのような原核生物から発現されるタンパク質に比較して優れた処置効果を有し、外来性遺伝子の発現力価が改善されている本発明の発現ベクターを動物細胞において用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、SV40プロモーターと、遺伝子発現のレポーターのためのβ−gal遺伝子とを組み合わせることにより調製される、発現ベクターの構造を示す。
【図2】 図2は本発明で用いられる種々のMAR及びSAR因子により誘導される、β−Galの発現頻度を示す。
【図3】 図3は本発明のMAR及びSAR因子によるβ−Gal発現に及ぼす影響を示す、発現されたβ−Galの活性を示す。
【図4】 図4は本発明のβグロビンMAR DNA配列に基づく、MAR因子の種々の変異体構築物形態を示す。
【図5】 図5はMAR因子と共にCHO細胞に導入されたベクターのトランスフェクション後の、β−Galタンパク質の発現頻度及び発現量を示す。
【図6】 図6は、pMS−β−galまたは対照としてpSV−β−galベクターで形質転換された動物細胞における、β−Gal遺伝子コピー数(a:対照群、b:本発明)、RNA数(c:対照群、d:本発明)、及び選抜マーカーとしてのneo遺伝子のコピー数(e:対照群、f:本発明)を確認するための、サザン及びノザンブロットを示す。
【図7】 図7は、pMS−β−galまたは対照としてpSV−β−galベクターで形質転換された動物細胞における、β−Gal遺伝子のコピー数とβ−Galの発現収量との間の関係を示すグラフである。
【図8】 図8は種々の細胞株におけるpMS−β−galベクターの発現力価を示す。
【図9】 図9はpMS−β−galベクターまたは対照ベクターで形質転換された細胞における、MTX濃度に依存する外来性タンパク質の発現量を示す。
【図10】 図10はscu−PA(一本鎖プロウロキナーゼ)をpMSベクター及びpMSベクターに挿入した後のscu−PAの発現力価を、対照と比較して示す。
【図11】 図11はガストリン遺伝子の転写終止部位及びSV40ポリAシグナルを含む構築物を示す。
【図12】 図12はガストリン遺伝子の転写終止部位及びSV40ポリAシグナルを含む構築物を含んでなる発現ベクターにおけるβ−Galの発現量を示す。
【図13】 図13は本発明のpMSG構造を示す。
【図14】 図14は抗原抗体反応により確認されたpMSGベクターにおけるTGF−β SRIIの発現を示す。
【図15】 図15はTGF−β SRII遺伝子をpMSGベクターにクローニングし、これらをCHO細胞にトランスフェクトし、及びMTXの添加条件において培養することにより生成される、TGF−β SRIIの発現量を示す。
【配列表】
Claims (4)
- CHO、BHK、NIH3T3、及びCos−7細胞からなる群より選択される動物細胞用の発現ベクターであって、
前記ベクターが、pMS−β−galベクター(配列番号1;受託番号 KCCM 10203)およびpMSGベクター(配列番号8;受託番号 KCCM 10202)からなる群より選択される、
動物細胞用の発現ベクター。 - 配列番号3の配列をさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。
- 請求項1〜2のいずれかに記載の発現ベクターからなる群から選択される発現ベクターを用いて、動物細胞において生理活性物質を調製する方法。
- 生理活性物質がTGF−β SRIIである、請求項3に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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