ES2333774T3 - Uso de un vector de expresion para una celula animal. - Google Patents

Uso de un vector de expresion para una celula animal. Download PDF

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Abstract

Un vector de expresión para una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del CMV, y el complemento de un elemento MAR de ß-globina que está ubicado en el extremo 5''-terminal del promotor.

Description

Uso de un vector de expresión para una célula animal.
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Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención
La presente invención se refiere a un vector de expresión para una célula animal, y más particularmente, a un vector de expresión que incluye el elemento de la región de unión a la matriz nuclear (denominado a continuación en el presente documento "elemento MAR") y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina.
(b) Descripción de la técnica relacionada
Muchos tipos de sistemas de expresión, tales como microorganismos, plantas, levaduras, células de insectos y células animales están actualmente en uso para el tratamiento médico mediante la expresión de las proteínas deseadas en una gran cantidad. Entre los muchos tipos de sistemas de expresión, los microorganismos son los más fácilmente usados como sistema de expresión, y muchos tipos de sistemas de microorganismos se estudian y se utilizan como sistema de expresión.
Sin embargo, el uso del sistema de expresión de microorganismos está limitado en algún sentido. En primer lugar, aunque los genes se expresan en un microorganismo, la estructura y caracteres de la proteína expresada son distintos de los de la proteína animal, porque el microorganismo tiene un mecanismo diferente para expresar proteínas y un mecanismo de modificación de proteína tal como glicosilación, fosforilación y amidación. Por tanto, una proteína recombinante producida a partir de microorganismos casi no tiene modificación, o está limitada en la producción de proteínas de las que la función no se ve muy afectada por la diferencia de la modificación y la estructura de las proteínas. Además, cuando se usan las proteínas recombinantes que se expresan por microorganismos, se necesita un proceso de limpieza por la contaminación del microorganismo o toxina.
Aunque las células animales son adecuadas para una expresión de proteínas en animales, el sistema de expresión que usa células animales no se usa comúnmente, porque el sistema de expresión que usa células animales crea costes de producción superiores debido a una eficacia de expresión inferior de la proteína recombinante en comparación con la de microorganismos y células animales.
Una célula animal para la industria, que se usa actualmente para un sistema de expresión incluye CHO (ovario de hámster chino), BHK (riñón de cría de hámster) y mieloma, y se introduce el vector de expresión en la célula animal y se produce una proteína foránea deseada, como en microorganismos.
Por tanto, los sistemas de expresión génica se modifican mediante diversos procedimientos, porque en general se expresa una pequeña cantidad de los genes foráneos. Por ejemplo, se cultiva una cepa de células de CHO en medio que contiene metotrexato (denominado a continuación en el presente documento "MTX") que es un inhibidor de la DHFR (dihidrofolato reductasa), con el fin de obtener la cepa CHO que está viva dependiendo de la concentración de MTX, y expresa altamente la proteína debido al aumento en el número de copias de genes.
Generalmente, cuando se expresan los genes foráneos en una célula animal, el gen foráneo se cotransfecta con el vector que tiene un marcador selectivo y se seleccionan células transformadas a través del cultivo en el medio selectivo durante muchas horas. Sin embargo, la frecuencia para lograr un clon de células que expresan altamente es baja. La baja frecuencia de la expresión del gen foráneo se debe a la inserción cromosómica del gen foráneo en un sistema animal, a diferencia de un microorganismo. Además, aunque el proceso de inserción del gen foráneo sea satisfactorio, no puede esperarse la expresión de los genes foráneos, puesto que el sitio insertado de cada gen difiere y la expresión del gen depende del sitio insertado (Grindley et al., 1987. Trends Genet. 3, 16-22; Kucherlapati et al., 1984. Crit. Rev. Biochem. 16, 349-381; Palmiter et al., 1986. Annu. Rev. Genet. 20, 465-499). Por tanto, aunque los genes foráneos están integrados de manera estable, pueden expresarse en una pequeña cantidad, porque la mayor parte de la expresión génica en células animales está inhibida por el ácido nucleico adyacente (Eissenberg et al., 1991. Trends Genet. 7, 335-340; Palmiter et al., 1986. Annu Rev. Genet. 20, 465-499).
Con el fin de proteger la expresión del gen foráneo de los efectos de posición, se ha informado de la posibilidad de usar elementos de matriz nuclear en varios sistemas. El elemento nuclear a modo de ejemplo incluye un elemento aislante, una región de unión a la matriz nuclear (denominada a continuación en el presente documento "MAR") y una región de unión al armazón proteínico (denominada a continuación en el presente documento "SAR").
Kalos (Kalos et al., 1995 Mol. Cell. Biol. 15, 198-207) sugirió que cuando la MAR de apolipoproteína B estaba combinada con el constructo transgénico del promotor mínimo, el gen foráneo se introducía de manera estable en el cromosoma huésped, de modo que la cantidad expresada del transcrito aumentaba en aproximadamente 200 veces. De manera similar al procedimiento mencionado anteriormente, se informó de que la MAR de lisozima A de pollo y la SAR de \beta-interferón pueden aumentar el nivel de expresión del gen foráneo en una célula de vertebrado independientemente del sitio de inserción cromosómica (Eissenberg et al., 1991. Trends Genet. 7, 335-340; Klehr et al, 1991. Biochemistry 30, 1264-1270). Sin embargo, no se ha verificado que la MAR y la SAR puedan aumentar la producción de proteínas en una cepa de células CHO, o que la MAR y la SAR sean adecuadas para su uso común.
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Cuando se expresa un gen de célula animal; la síntesis de ARNmr se produce a partir del promotor y finaliza en el sitio de terminación. Los niveles de las proteínas expresadas están influenciados con frecuencia por la eficacia de la terminación de la transcripción así como la estabilidad del ARNm sintetizado.
El sitio de terminación transcripcional que se incluye en un vector de expresión controla la poliadenilación y tiene una influencia en la estabilidad del ARNm. El sitio de terminación incluye una señal de poli-A, un sitio de rotura, un sitio de terminación, y la señal de poliadenilación es AATAAA y está bien estudiada. Sin embargo, no se conocen bien el sitio de rotura en el que se produce la poliadenilación, ni el sitio de terminación en el que se completa la transcripción génica por la enzima II de polimerización de ARN. Además, aunque se informa de que la región rica en GU/U excepto los tres tipos de región crítica controla la poliadenilación del ARNm, no se conoce el mecanismo detallado.
Los vectores de expresión que se usan comúnmente en células animales contienen una señal de poli-A del virus SV40 y BGH (hormona de crecimiento bovina), y no se ha sugerido que el terminador específico, que mejora la estabilidad de ARNm y el nivel de expresión, se desarrolla con el fin de usar el vector de expresión de células animales.
Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un vector de expresión que tenga un aumento de la eficacia de la expresión y los niveles para genes foráneos en la expresión de proteínas foráneas usadas en un sistema de célula animal.
Con el fin de lograr estos objetivos, la descripción presente proporciona un vector de expresión que comprende el elemento MAR (región de unión a la matriz nuclear) o su secuencia complementaria en el extremo 5'-terminal de un promotor.
Además, la descripción presente proporciona un vector de expresión para células animales que comprende un constructo constituido por la señal de poli-A (poliadenilación) del virus SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina, en el que el constructo tiene una secuencia de SEC ID NO. 3.
Además, la descripción presente proporciona un vector pMSG KCCM 10202 de la SEC ID NO. 8, que comprende una secuencia complementaria de la MAR (región de unión a la matriz nuclear) en 5' de \beta-globina humana, y el constructo constituido por la señal de poli-A del virus SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina.
Además, la descripción presente un procedimiento de preparación de materiales bioactivos usando un vector de expresión para células animales que comprende un elemento MAR de \beta-globina, o la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina en el extremo 5'-terminal del promotor, un vector que comprende la señal de poli-A (poliadenilación) del virus SV40 de la SEC ID NO. 3 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina, y un vector pMSG.
La presente invención se refiere al objeto de las reivindicaciones 1-12.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una estructura de un vector de expresión, que se prepara combinando el promotor de SV40 y el gen de \beta-gaul como indicador de la expresión génica;
la figura 2 muestra una frecuencia de expresión de \beta-Gal inducida por diversos elementos MAR y SAR que se usan en la presente descripción;
la figura 3 muestra una actividad de \beta-Gal expresada, que indica una influencia de los elementos MAR y SAR de la presente invención sobre la expresión de \beta-Gal;
la figura 4 muestra diversos constructos mutantes a partir del elemento MAR basándose en la secuencia de ADN de la MAR de \beta-globina;
la figura 5 muestra la frecuencia de expresión y la cantidad de expresión de proteínas \beta-Gal, tras la transfección de un vector introducido con elementos MAR en células CHO;
la figura 6 muestra la transferencia de tipo Southern y tipo Northern para confirmar el número de copias de genes de \beta-Gal (a: un grupo control, b: la presente invención), el número de ARN (c: un grupo control, d: la presente invención) y el número de copias de gen neo como marcador selectivo (e: un grupo control, f: la presente invención) en células animales transformadas con vector pMS-\beta-gal o pSV-\beta-gal como control;
la figura 7 es un gráfico que muestra la relación entre el número de copias del gen de \beta-Gal y el rendimiento de expresión de \beta-Gal en células animales transformadas con el vector pMS-\beta-gal o pSV-\beta-gal como grupo control;
la figura 8 muestra un título de expresión del vector pMS-\beta-gal en diversas líneas celulares;
la figura 9 muestra una cantidad de expresión de la proteína foránea dependiendo de la concentración de MTX en una célula transformada con el vector pMS-\beta-gal o un vector control;
la figura 10 muestra un título de expresión de scu-PA, tras insertar scu-PA (prouroquinasa de cadena simple) en el vector pMS y el vector pMC, en comparación con el del control;
la figura 11 muestra un constructo que incluye el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y la señal de poli-A del SV40;
la figura12 muestra una cantidad de expresión de \beta-Gal en el vector de expresión que comprende un constructo que incluye el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y la señal de poli-A del SV40;
la figura 13 muestra la estructura de pMSG;
la figura 14 muestra una expresión de TGF-\beta SRII en el vector pMSG confirmada por una reacción antígeno-anticuerpo; y
la figura 15 muestra una cantidad de expresión de TGF-\beta SRII que se produce clonando el gen de TGF-\beta SRII en el vector pMSG, transfectándolo en una célula CHO y cultivando en condición de añadir MTX.
Descripción detallada de la presente invención
Los inventores superaron los problemas que surgían del efecto específico del sitio cuando se expresan genes foráneos en sistemas de célula animal, y diseñaron un vector de expresión óptimo que aumenta la cantidad de expresión de los genes.
Un vector de expresión para células animales de la presente descripción comprende secuencias de bases adecuadas, que se añaden adicionalmente a los vectores de expresión convencionales. Las secuencias de bases adecuadas incluyen una región de unión a la matriz nuclear (denominada a continuación en el presente documento "MAR") y una región de unión al armazón proteínico (denominado a continuación en el presente documento "SAR"), que estimulan la expresión de genes foráneos de un huésped tal como CHO (ovario de hámster chino) y BHK (riñón de cría de hámster) a partir de los efectos de posición del sitio de inserción, y aumentan la cantidad de expresión de los genes foráneos.
El elemento MAR o SAR se añade al extremo 5'-terminal del promotor y se analiza la eficacia del vector de expresión. El ADN cromosómico se aísla de la célula, y entonces se clona el ADN cromosómico en E. coli a través de una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y subclonación, de modo que se obtiene el ADN de los elementos MAR y SAR.
Preferiblemente, el elemento MAR o SAR se selecciona del grupo constituido por MAR en 5' de lisozima de pollo (Phi-Van, L. y Stratling, W. H., Biochemistry 35, 10735-10742 (1996), banco de genes n.º: X98408), MAR en 5' de pi \alpha globina de pollo (Krevskii, V. A., Mikhailov, V. S. y. Razin, S. V., Mol. Biol. 26, 672-678 (1992), banco de genes n.º: X64113), MAR en 5' de \beta-globina humana (Yu, J., Bock, J. H., Slightom, J. L. y Villeponteau, B., Gene 139(2), 139-145 (1994), banco de genes n.º: L22754), MAR de intrón de DHFR de CHO (Kas, E. y Chasin, L.A., J. Mol. Biol. 198(4), 677-692 (1987), banco de genes n.º: X06654), MAR de intrón de HPRT humana (Sykes, R. C., Lin, D., Hwang, S. J., Framson, P E. y Chinault, A. C., Mol. Gen. Genet. 212. 301-309 (1988), banco de genes n.º: X07690), SAR que flanquea al gen CSP-B humano (Handson, R. D. y Ley, TJ., banco de genes n.º: M62716) y SAR que flanquea al gen interferón-\beta humano (Mielke, C., Kohwi, Y, Kohwi-Shigematsu, T. y Gode, J., Biochemistry 29, 7475-7485 (1990), banco de genes n.º: M83137).
La MAR y la SAR estaban integradas en un vector de expresión para células animales y se indujo la expresión de \beta-Gal del vector con el fin de confirmar la relación entre MAR/SAR y el título de expresión.
El extremo 5'-terminal del promotor pSV-\beta-gal se conectó al sitio de multiclonación (denominado a continuación en el presente documento "MCS") mediante mutagénesis por PCR in vitro y entonces se obtuvo un vector de recombinación (vector de versión 1 y versión II), tal como se muestra en la figura 1. Se insertó una MAR o una SAR enfrente del extremo 5'-terminal del promotor de SV40 del vector de recombinación pSV-\beta-gal versión I ó II, se preparó un vector de prueba y se transformó el vector de prueba en CHO DG44. Se seleccionó la CHO DG 44 transformada en medios que contenían G418 (neomicina) y se midió el título de expresión mediante tinción de \beta-Gal (tinción de azul con IPTG y X-Gal). Para medir el título de expresión, se midieron la frecuencia de expresión, varias células de expresión y la cantidad de expresión de \beta-Gal.
La figura 2 muestra una frecuencia de expresión de \beta-Gal inducida por diversos elementos MAR y SAR. El vector pSV-\beta-gal mostró aproximadamente del 20% al 30% de la frecuencia de expresión de \beta-Gal, mientras que el vector de prueba que comprende una MAR de \beta-globina, SAR de CSP-B o SAR de interferón-\beta aumentaba la frecuencia de expresión en la línea celular positiva y, más particularmente, el vector de prueba que comprende una MAR de \beta-globina mostró aproximadamente del 70% al 80% de la frecuencia de expresión de \beta-gal.
Además, se prepararon constructos según una combinación de diversos elementos MAR y promotor de SV40 y se comparó la influencia de la expresión de proteínas de recombinación con el promotor del virus SV40. Con el fin de comparar la cantidad de producción de \beta-Gal, se realizaron un procedimiento de tinción de \beta-Gal y un procedimiento de medición de la enzima \beta-gal y se analizó la actividad de \beta-Gal en el mismo número de líneas celulares positivas, puesto que la frecuencia de expresión difiere según cada elemento MAR.
La figura 3 muestra la actividad de \beta-Gal expresada según la influencia de diversos elementos MAR y SAR, y la cantidad de \beta-Gal por célula positiva o la actividad de \beta-Gal aumentó cuando se usaron los elementos MAR de \beta-globina, SAR de CSP-B y say de interferón-\beta, en comparación con la de pSV-\beta-gal. Se observó que la cantidad de expresión del vector que comprende el elemento MAR de \beta-globina aumentó en 7 veces o más.
Por consiguiente, entre los elementos MAR, el elemento MAR de \beta-globina es más preferible actualmente.
Se analizó la secuencia de ADN del elemento MAR con el fin de investigar el efecto y la eficacia del elemento MAR de \beta-globina.
El elemento MAR de \beta-globina incluye 2.999 bases y su función no se ha encontrado en detalle. El elemento MAR de \beta-globina comprende una secuencia consenso y 244 pb del elemento alu que está ubicado en el extremo 3' de la región de 800 pb y en la que existen secuencias ricas en A+T (adenina, timidina). Se informa de que el sitio alu comprende 300 pb de dos unidades monoméricas de repetición directa, y su recombinación se produce con frecuencia en este sitio, puesto que existen miles de sitios homólogos en el cromosoma de un eucariota (Jagadeeswaran et al., 1982. Nature 296, 469-470; Rogers. 1985. Int. Rev. Cytol. 93, 187-279). Cuando existe el alu de la MAR de \beta-globina en el sentido de 5' del promotor de SV 40, y se cultiva la célula durante un tiempo prolongado, puede producirse la recombinación.
Por tanto, los inventores diseñaron los mutantes de la MAR de \beta-globina que no tenían el mal efecto mencionado anteriormente.
La figura 4 muestra los mutantes de la MAR de \beta-globina, que se producen preparando la secuencia complementaria de la MAR b, el mutante de deleción c, d, e, f, g e i, e integrándolos en pSV-\beta-gal versión I.
Tras introducir el vector que comprende el mutante de la MAR de \beta-globina en la célula CHO, se midieron el número de células de expresión de \beta-Gal y la cantidad de \beta-Gal, y se representaron los resultados en la figura 5. El título de expresión de \beta-gal de la mayor parte de los mutantes de la MAR de \beta-globina disminuyó; por el contrario, el de la línea celular transformada con el vector pMS-\beta-gal que comprendía una secuencia complementaria de la MAR \beta-globina era alto. Las figuras 6 y 7 muestran la relación entre la cantidad de expresión de la proteína recombinante y el número de copias de los genes integrados, y la cantidad de expresión del pSV-\beta-Gal es independiente del número de copias de los genes integrados, y la cantidad de expresión del vector transformado con el pMS-\beta-Gal es proporcional al número de copias de los genes integrados. Puesto que la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina permite que alu salga al otro lado del promotor, disminuye la posibilidad de recombinación del vector, y aumenta la cantidad de expresión evitando el efecto específico del sitio de inserción. Por tanto, la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina es preferible en la presente invención.
Se verifica que el elemento MAR o SAR está ubicado en el sitio en 5' del promotor del vector de expresión convencional, y que los mutantes de la MAR o SAR, o la secuencia complementaria están integrados en el vector de expresión convencional, de modo que aumenta el título de expresión de las proteínas foráneas. Por tanto, la presente descripción proporciona un vector de expresión que incluye el elemento MAR o SAR, y los vectores de expresión que incluyen mutantes de la MAR o SAR, o su secuencia complementaria. La MAR o la SAR se selecciona preferiblemente del grupo constituido por MAR de pi-a (MAR en 5' de pi \alpha-globina de pollo), MAR de \beta-globina (MAR en 5' de \beta-globina humana), MAR de DHFR (MAR de intrón de DHFR de CHO), MAR de HPRT (MAR de intrón de HPRT humana), SAR de CSP-B (elemento SAR que flanquea el gen CSP-B humano), elemento SAR de interferón-\beta (elemento SAR que flanquea el gen de interferón-\beta humano) y MAR de liso (MAR en 5' de lisozima de pollo).
Entre ellos, el vector pMS (KCCM 10203) estaba constituido por 6287 pb que comprendían la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina humana en el extremo 5'-terminal de un promotor del virus SV 40 y sitios de multiclonación, y pueden expresar la proteína recombinante mediante la integración de genes en los sitios de multiclonación. La secuencia de bases de pMS se compila como SEC ID NO.1 con el software para el listado de secuencias.
Cuando se usa la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina, la frecuencia de expresión y la cantidad de expresión de los genes foráneos aumentan en de 3 a 4 veces, y en de 7 a 10 veces, respectivamente, en comparación con las de los genes foráneos cuando se usa el único promotor de SV40. Además, el vector pMS-\beta-gal puede aplicarse a diversos tipos de célula animal, lo que está representado en la figura 8, y el sistema de vector pMS-\beta-gal puede aplicarse preferiblemente a BHK, CHO, NIH3T3 y HEK 293. La figura 9 muestra los incrementos del título de expresión añadiendo MTX (metotrexato) cuando se expresan las proteínas foráneas en el sistema de vector pMS-\beta-gal.
Para medir el título de expresión de proteínas foráneas según la MAR o la SAR, se usa el promotor del CMV (citomegalovirus). Puesto que el título de expresión de los genes foráneos difiere ya que depende del tipo de promotor y las diversas cepas celulares, también se somete a prueba el promotor del CMV. Con el fin de verificar el efecto de la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina sobre la función del promotor del CMV, se prepara el vector pMC mediante un procedimiento similar a la preparación de pMS, y se integran genes de scu-PA en el vector pMS, pMC y control.
La figura 10 muestra que el título de expresión de scu-PA en una CHO transformada con vectores pMSPUK, pMCPUK, pSPUK y pMCPUK que se prepara integrando la scu-PA en pMS, pMC, pSV y pCMV, y que la expresión génica de pMS y pMC aumentaban en 4 veces la de pSV y pCMV. Por tanto, puede usarse la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina para la expresión de proteínas de células animales mediante combinación adecuada con los promotores deseados.
Puesto que el vector que incluye la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina tiene integrado genes foráneos como célula huésped, pueden obtenerse proteínas útiles a partir de una cepa de células animales en el procedimiento convencional.
Se prepararon una señal de poli-A de transcripción del gen de la gastrina humano, un sitio de rotura y un sitio de terminación de la gastrina humana, y se aplicaron al vector de expresión de la presente descripción con el fin de aumentar la estabilidad del ARNm, aumentando de ese modo la eficacia del vector de expresión.
La región reguladora transcripcional en 3' del gen de la gastrina humano comprende 605 pb incluyendo la señal de poli-A, los sitios de rotura, un sitio de terminación y la secuencia de bases de la región reguladora transcripcional en 3' del gen de la gastrina humano se presenta como SEC ID NO. 2. El sitio de rotura está ubicado 15 pb en el sentido de 3' desde la señal de poli-A, y el sitio de terminación está ubicado 220 pb en el sentido de 3' desde la señal de poli-A. La transcripción de la gastrina se completa en el sitio de terminación y se producen la rotura y poliadenilación de ARNm en el sitio de rotura.
El presente inventor diseñó el constructo que estaba constituido por poli-A de SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina, que puede aumentar el título de expresión de los genes, lo que se muestra en la figura 11.
La figura 11 muestra los constructos constituidos por el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y poli-A de SV 40, y los constructos se seleccionan preferiblemente de pSV-SPA (SPA; la señal de poliadenilación de SV 40) en "a", pSV-SPA-GTF (GTF; sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina) en "b", pSV-SPA-GTR (GTR; secuencia complementaria a GTF) en "c", pSV-GPA (GPA; señal de poliadenilación de la gastrina) en "d", pSV-GPA-GTF en "e", pSV-GPA-GTR en "f", pSV-GMPA (GMPA; mutante de GPA) en "g", pSV-GMPA-GTF en "h", pSV-GMPA-GTR en "i". Las secuencias de bases de SPA-GTF, SPA-GTR, SPA-GPA, SPA-GPMA se enumeran como SEC ID NO. 3, NO. 4, NO. 5 y NO. 6, respectivamente. Todos los constructos se integraron respectivamente en pSV-\beta-gal y se introdujeron adicionalmente en una cepa de células COS-7 con el fin de medir el título de expresión de \beta-Gal. El título de expresión es la cantidad de expresión de \beta-Gal, y está representado en la figura 12. El vector pSG que comprende el constructo constituido por la señal de poli-A de SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina tiene un efecto para aumentar la cantidad de expresión de la proteína 4 veces. Por tanto, el sitio de terminación es preferiblemente SPA-GTF (la señal de poli-A de SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina) para aumentar el título de expresión.
Los constructos se usan como sitio de terminación de los vectores de expresión convencionales, de modo que aumenta la cantidad de expresión de las proteínas foráneas. El vector de expresión a modo de ejemplo de la presente descripción incluye pSG.
El vector pSG es un vector que tiene integrado SPA-GTF en su sitio de terminación, y 3309 pb. La secuencia de bases del vector pSG se enumera como SEC ID NO. 7. \beta-Gal se insertó en el vector pSG con el fin de medir su título de expresión, y el título de expresión del pSG es 4 veces mayor que el del vector pSV, lo que resulta de estabilizar el ARNm mediante un constructo constituido por el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y la señal de poli-A del virus SV 40.
Por tanto, el vector que comprende SPA-GRF puede expresar los genes foráneos en un huésped animal de manera convencional, y pueden obtenerse proteínas útiles tales como un material bioactivo.
Además, la presente descripción proporciona un vector de expresión que incluye los dos sitios que pueden aumentar el título de expresión de los genes foráneos. Los dos sitios son el sitio de terminación transcripcional de atracción del sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina con la poli-A de SV 40 y la secuencia complementaria de la MAR de \beta-globina.
La figura 13 muestra la estructura de pMSG, los 6347 pb de las secuencias de bases totales se enumeran como SEC ID NO. 8, y pMSG se depositó como KCCM 10202 en el Centro de Cultivos de Microorganismos de Corea. La siguiente tabla 1 muestra el mapa del pMSG en detalle.
TABLA 1
1
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La proteína para un gen TGF-\beta SRII puede evitar los efectos secundarios del TGF-\beta mediante la unión selectiva con el TGF-\beta que es una proteína humana activa. El TGF-\beta SRII se expresó con el fin de analizar el efecto y la eficacia del pMSG de la presente descripción. Como resultado, en la figura 14, puesto que la proteína TGF-\beta SRII tiene una estructura de glicosilación, la proteína tiene un mayor peso molecular que el de la proteína original, tal como lo tienen las células animales típicas. La cantidad de expresión inicial de TGF-\beta SRII es de aproximadamente 100 ng/10^{6} células/día, y la mayor parte de las células se expresan igualmente. Además, como en la figura 15, se obtuvieron 10 \mug/10^{6} células/día como máximo, cuando se añadió MTX 1 \muM a las células con TGF-\beta SRII. El TGF-\beta tiene diversas funciones en el cuerpo humano, en particular, se encuentra como factor que da como resultado la inflamación tal como cuerpos glomerulares, esclerosis del riñón, cirrosis hepática, cornificación de células epidérmicas y un cartílago oclusal, el TGF-\beta SRII puede usarse para el tratamiento de enfermedad que sobreexpresa TGF-\beta.
El vector pMSG ha superado un problema general, que es el bajo rendimiento de expresión y la dificultad para obtener transformantes, y puede producir en masa distintos tipos de proteínas recombinantes tales como materiales bioactivos.
Además, se desarrolló el vector pMS (KCCM-10203), cuya expresión no se inhibe por la base adyacente del sitio de inserción, y pMS produjo proteína recombinante en aproximadamente 8 veces más que la del promotor de SV 40 convencional.
Además, se preparó el vector pSG, que comprende un sitio de terminación transcripcional que puede inducir la terminación transcripcional en un sitio específico de transcritos y que aumenta en 3 veces la del sitio de poli-A convencional.
El vector pMSG (KCCM-10202) se prepara mediante la conexión de los fragmentos de ADN funcionales y el sitio de multiclonación que puede aplicarse a genes foráneos, y su cantidad de expresión es de 10 ug/10^{6} células/día, cuando se expresa TGF-\beta en células animales. Por consiguiente, el vector de expresión es adecuado para la expresión de las proteínas recombinantes, y puede producirse en células animales una proteína derivada de un eucariota que se expresa en un procariota como una proteína recombinante que tiene la misma estructura y función en comparación con la proteína de tipo natural.
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Ejemplo 1 La preparación del vector pMS-\beta-gal (1) Preparación del vector pMS-\beta-gal
Se preparó un vector pMS-\beta-gal tal como sigue.
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\ding{192} Aislamiento de ADN genómico de una célula G-2 con el fin de obtener una secuencia de bases de la MAR de \beta-globina humana
Se aísla un ADN genómico de una célula G-2 en un huésped humano usando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (un producto de Promega Co.) y el procedimiento de purificación seguido por el procedimiento experimental suministrado por la empresa de producción.
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\ding{193} Realización de PCR genómica y subclonación
Con el fin de obtener un fragmento de la MAR en 5' de \beta-globina humana, se usó el ADN genómico purificado como molde, y se usaron el cebador sentido BML1 y el cebador antisentido BMR 1 para la MAR de \beta-globina en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) genómica. El BML1 y BMR1 se enumeraron como SEC ID NO. 9 y SEC ID NO.10, respectivamente. Se realizó la PCR con 32 ciclos. La tabla 2 muestra los números de ciclo.
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TABLA 2
3
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Tras la PCR, se insertó el producto de PCR en el vector pT7blue (Novagen Co.), y se preparó el vector
pT7blue/MAR de \beta-globina. El vector pT7blue es un vector de clonación TA que puede clonar un producto de PCR directamente.
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\ding{194} Preparación de vector recombinante pSV-\beta-gal versión I y versión II que contiene el sitio de multiclonación (MCS)
Con el fin de insertar la MAR de \beta-globina del vector pT7blue en el sentido de 5' del promotor del vector pSV-\beta-gal, se prepararon pSV-\beta-gal versión I y pSV-\beta-gal versión II.
En primer lugar, con el fin de preparar pSV-\beta-gal versión I, después de tratar pSV-\beta-gal con SpeI y HindIII, se purificaron 443 pb del fragmento SpeI/HindIII que incluía el promotor de SV 40 en gel de agarosa con un kit gene clean III (BIO 101 Co.). Se ligó el fragmento al pBluescript SK(+) (Stratagene Co.) linealizado mediante la digestión con SpeI/HindIII, y se preparó el vector pBluescript/promotor I de SV40.
Entonces se trató el vector pBluescript/promotor I de SV 40 con ScaI y HindIII, se purificó un fragmento que incluía el promotor de SV 40 en gel de agarosa de la misma manera mencionada anteriormente y se ligó el fragmento con el vector pSV-\beta-gal linealizado mediante la digestión con ScaI y HindIII, de modo que se preparó el vector de versión I.
Además, con el fin de producir el vector pSV-\beta-gal versión II, después de tratar pSV-\beta-gal con EcoRI y HindIII, se purificaron los 420 pb del fragmento EcoRI/HindIII que incluía el promotor de SV 40 en el gel de agarosa de la misma manera mencionada anteriormente y se ligó el fragmento con el pBluescript SK(+) linealizado mediante la digestión con EcoRI y HindIII, de modo que se produjo el vector pBluescript/promotor II de SV 40.
Se trató el vector pBluescript/promotor II de SV 40 con ScaI y HindIII con el fin de purificar el fragmento que incluía el promotor de SV 40 en el gel de agarosa de la misma manera mencionada anteriormente y se ligó el fragmento con el vector pSV-\beta-gal linealizado mediante la digestión con SceI y HindIII, de modo que se preparó el vector pSV-\beta-gal versión II.
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\ding{195} Preparación de un vector pMS-\beta-gal
Se trató el vector pT7blue/MAR de \beta-globina con SpeI y SmaI y se purificó el fragmento de ADN con un tamaño de 3 kb que incluía la MAR de \beta-globina en un gel de agarosa y se ligó el fragmento con pSV-\beta-gal versión I recombinante linealizado mediante SpeI y SmaI, de modo que se clonó la MAR de \beta-globina. Con el fin de confirmar la orientación de la MAR de \beta-globina, se trató la enzima de restricción HindIII que existe en pSV-\beta-gal versión I y la MAR de \beta-globina, y se confirmó que se clonó la MAR de \beta-globina en la orientación inversa al vector pSV-\beta-gal versión I.
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(2) Título de expresión del vector pMS-\beta-gal
Se cotransfectaron 2 \mug de los vectores de prueba que incluían el vector pMS-\beta-gal en CHO DG44 con el vector pSV2neo usando DOSPER (un producto de Roche) y se cotransfectó el vector pSV-\beta-gal como vector control de la misma manera. Se cultivó la célula CHO DG44 transfectada en un medio selectivo que era medio MEM-a que incluía nucleósidos complementado con FBS al 10% inactivado por calor y G418 sulface 850 \mug/ml (un producto de Calbiochem Co.). Se generaron transfectantes resistentes a G418 transfectados de manera estable después de aproximadamente 2 semanas, y se aislaron veinte clones estables que expresaban \beta-Gal para el vector control y el vector pMS-\beta-gal en transfectantes resistentes a G418. Se analizaron 40 clones positivos mediante transferencia de tipo Southern y tipo Northern con el fin de medir el número de copias de la \beta-Gal y el gen neo y la cantidad del ARN de \beta-Gal que se transcribe de pSV-\beta-gal y pMS-\beta-gal.
La figura 6 muestra la transferencia de tipo Southern y tipo Northern para confirmar el número de copias del gen de \beta-Gal (a: un grupo control, b: la presente descripción), el número de ARN (c: un grupo control, d: la presente invención) y el número de copias del gen neo como marcador selectivo (e: un grupo control, f: la presente descripción) en clones positivos que expresan \beta-Gal (denominado a continuación en el presente documento "clones positivos") para el vector pSV-\beta-gal o pMS-\beta-gal, y la figura 7 es un gráfico que muestra la relación entre el número de copias del gen de \beta-Gal y el rendimiento de expresión de \beta-gal en clones positivos para el vector pSV-\beta-gal o pMS-\beta-gal. Puesto que se varió el número de copias del gen de \beta-Gal en cada clon positivo tal como se muestra en las figuras 6a y 6b, se clasificó cada clon positivo en dos grupos, en los que uno tiene un alto número de copias del gen de \beta-Gal, y el otro tiene un bajo número de copias del gen de \beta-Gal, relativamente, y se analizaron los grupos entre sí. En el grupo que tiene un alto número de copias del gen de \beta-gal, aunque el grupo control tenía un alto número de copias del gen de \beta-Gal tal como se muestra en "a", la cantidad de ARN del gen de \beta-Gal en estos clones era baja con respecto a un número de copias de ADN tal como se muestra en "c". Sin embargo era alta la cantidad de ARN en clones positivos para el pMS-\beta-gal de la presente invención representada en "d". Además, en el grupo que tiene un bajo número de copias del gen de \beta-Gal, el número de copias de \beta-gal y la cantidad de ARN en clones positivos para el vector pMS-\beta-gal eran muy superiores que los de en clones positivos para el vector control, tal como se muestra en la figura 6. La figura 7 muestra la relación entre el número de copias y la cantidad de expresión de genes. En la figura 7, el número de copias medio y el nivel de expresión del gen de \beta-gal en clones de vector pMS-\beta-gal (\bullet) corresponden a aproximadamente 10 veces en comparación con los de clones de vector control (\circ). Además, en caso de un grupo de alto número de copias del gen de \beta-Gal, la expresión del gen de \beta-gal en clones de vector control es independiente del número de copias del gen y el pMS-\beta-gal tal como se muestra en la figura 7.
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(3) Patrón de expresión del vector pMS-\beta-gal en diversas líneas celulares
En la expresión de los genes foráneos en células animales, también se usan diversos tipos de células así como las CHO, y la cantidad de expresión de los genes foráneos variaba en los diversos tipos de células. En la presente descripción, se aclara que el título de expresión y la frecuencia de expresión del gen foráneo en la célula CHO transfectada aumentaban cuando se usa el vector pMS-\beta-gal en un huésped de célula CHO. Por tanto, se sometió a prueba si el vector de la presente descripción puede aplicarse a células animales cuyo origen y morfología son distintos de los de las células CHO.
Después de cotransfectar respectivamente el vector pSV-\beta-gal y el vector pMS-\beta-gal en una célula de riñón de cría de hámster (BHK), una célula de fibroblasto de ratón (NIH3T3) y una célula de riñón embrionario humano (KEK293) con un vector pSV2neo, y de cultivarlos en medios que incluían G418 durante aproximadamente 14 días, se midieron la frecuencia de la célula positiva que expresaba \beta-Gal y el título de expresión en transfectantes estables para cada vector de la misma manera que en (2).
La figura 8 muestra el título de expresión del pMS-\beta-gal en diversas líneas celulares. Cuando se usa BHK para una línea de células huésped, la expresión génica es similar a la de en una línea de células CHO. Cuando se usa NIH 3T3 para una línea de células huésped, el efecto sobre el aumento de la cantidad de expresión era bajo. Cuando se usa HEK 293 para una célula huésped, el efecto y la cantidad de expresión eran similares a los del control. La frecuencia de los clones positivos era similar a la mencionada anteriormente. Por tanto, los efectos de los vectores de expresión de la presente descripción varían con el tipo de células, y en particular, son útiles para células CHO, BHK y NIH 3T3 que se usan generalmente en la expresión de células animales.
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(4) Establecimiento del sistema de expresión del vector pMS-\beta-gal
En el sistema de vector de expresión convencional, los clones de alta expresión deben seleccionarse a través de procesos tediosos para aislar tantos como sean posibles en transfectantes primarios combinados, y para cultivar estos clones durante un tiempo prolongado para aumentar el nivel de expresión de los genes foráneos. Con el fin de superar estos problemas y maximizar el nivel de expresión de los genes foráneos, se estableció el sistema de amplificación DHFR/MTX sobre el sistema de expresión que usa la línea de células CHO DG44.
El vector pMS-\beta-gal se transfectó en la línea celular DHFR-CHO DG44 (denominada a continuación en el presente documento "CHO DG44"), se adaptaron los transfectantes del vector pMS-\beta-gal a MTX y entonces se midió la cantidad de expresión de las proteínas. El vector pMS-\beta-gal y el control (el vector pSV-\beta-gal) se cotransfectaron respectivamente en CHO DG44 que tenía carencia de genes DHFR con el vector pDCH1 P que tenía los genes DHFR. Se cultivaron las cepas celulares transfectadas con DHFR en medios selectivos, medio MEM-a que carece de nucleósidos complementado con FBS al 10% dializado inactivado con calor. Se generaron transfectantes de DHFR^{+} estables tras aproximadamente 2 semanas y se aislaron los clones positivos que expresan \beta-Gal en transfectantes de DHFR^{+} estables mediante tinción con \beta-Gal. Para la tinción con \beta-Gal para seleccionar clones positivos que expresan \beta-Gal en transfectantes de DHFR^{+}, se fijaron las células mediante incubación en PBS que contenía formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% a 4ºC durante 10 minutos, se lavaron dos veces con PBS y se trataron con X-Gal. Cuando se expresa la \beta-Gal, las células aparecen azules puesto que se generan productos azules debido a la descomposición de X-Gal por la proteína \beta-Gal. Se trataron los clones seleccionados en múltiples incrementos graduales de concentración de MTX tal como 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100 nM, 400 nM y 1 \muM. Les llevó a los clones aproximadamente de 2 a 3 semanas adaptarse a cada concentración de MTX cultivada. Se analizó la cantidad de expresión de b-Gal durante la amplificación génica mediante la adaptación de MTX con el ELISA convencional.
La figura 9 muestra la cantidad de expresión de las proteínas recombinantes en células transfectadas con pMS-b-gal y el control, respectivamente, y adaptadas a una concentración de MTX de 1 \muM. Se ha informado de que cuando se amplificó la expresión de las proteínas recombinantes mediante el sistema de amplificación DHFR.MTX en la línea de células CHO, el nivel de expresión era de hasta aproximadamente 10 \mug/10^{6} células/día que corresponde al 2,5% de las proteínas totales (Kaufman, 1997, Methods Mol Biol 62, 287-300). Se observa que se amplifican aproximadamente de 100 a 1000 números de copias mediante el aumento gradual de la cantidad de MTX. Se midió la cantidad de expresión de b-Gal en clones del vector pMS-b-gal de control. La cantidad de expresión de b-Gal en clones control varía con cada clon. Si se considera que 20 \mug/10^{6} células es industrialmente valioso en la producción de proteínas recombinantes en células animales, el 25% de los clones de vector control pertenecen a este valor, y el 88% de clones del vector pMS-b-gal de la presente invención produjeron la proteína recombinante por encima de 20 \mug/10^{6} células. En comparación con las cepas celulares que tienen una cantidad de expresión máxima, el pMS-b-gal de la presente invención tiene una gran cantidad de proteína de expresión, y pueden producirse grandes cantidades de proteínas insertando un gen foráneo en pMS (KCCM-10203). Por tanto, cuando se usa el vector de expresión de la presente descripción para la expresión de genes foráneos, da como resultado un alto rendimiento de expresión y eficacia.
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Ejemplo 2 Preparación de pSPUK, pMSPUK, pCPUK y pMCPUK (1) Preparación del vector pCMV
Se preparó un vector pCMV con el fin de hacer fácil la clonación de un promotor del CMV y un promotor de SV40 en genes de scu-PA. Se realizó la PCR para obtener el promotor del CMV, el sitio MCS y un sitio de terminación transcripcional de pcCDNA 3.1 (+) (un producto de Invitrogen Co.). Un cebador sentido para PCR es CMVL1 (SEC ID NO. 11) y un cebador antisentido es PAR1 (SEC ID NO. 12). El cebador CMVL1 tiene sitios SacII, ClaI, NruI, y el cebador PAR1 tiene el sitio BsmI. Después de digerir un producto de 1,4 kb de PCR con SacII y BsmI, se ligó con pSV-b-gal versión I recombinante linealizado con el fin de preparar pCMV.
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(2) Preparación de pSPUK, pMSPUK, pCPUK y pMCPUK
Con el fin de preparar un vector de expresión recombinante para la expresión de scu-PA en una célula animal, se obtienen genes de scu-PA mediante PCR del ADN genómico separado de una cepa de células CHO que tiene genes de scu-PA que se originan a partir de una cepa de células TCL-598 humanas como molde. Un cebador sentido PKL1 se presenta como SEC ID NO. 13, y un cebador antisentido PKR1 se presenta como SEC ID NO. 14. El cebador PKL1 tiene el sitio de restricción HindIII y el cebador PKR1 tiene el sitio de restricción SmaI.
Aproximadamente 1,3 kb de producto de PCR de scu-PA producido a partir de los cebadores (un fragmento de ADN que tiene de una base n.º 6 a una base n.º 1293 de una scu-PA humana) se cortaron mediante SmaI y HindIII, y se insertaron en un plásmido, pCMV que se corta mediante HindIII y EcoRV con el fin de preparar un vector de expresión pCPUK.
Además, se trató el vector pSV-b-gal versión I recombinante con SmaI y HindII con el fin de separar un fragmento que tiene el promotor de SV40 del mismo. Este fragmento se insertó en y se unió con un pCPUK de control que se linealizó mediante NruI y HindIII con el fin de preparar un vector de expresión pSPUK.
Se trató pCPUK con SacII y NruI con el fin de insertar el elemento MAR en el mismo. El pCPUK linealizado se insertó en y se unió con un elemento MAR de \beta-globina que se preparó tratando el vector pMS-\beta-gal con SmaI y SacII, con el fin de preparar un vector pMCPUK.
Se trató el vector pSPUK con StuI y SacII con el fin de insertar un elemento MAR de \beta-globina en el mismo. Se insertó un elemento MAR de \beta-globina, que se produjo tratando el vector pMS-\beta-gal con SuI y SacII, en el vector pSPUK y se preparó el vector pMSPUK.
En resumen, el constructo del vector pSPUK era la forma producida insertando el gen de scu-PA en el vector recombinante, pSV-\beta-gal versión I del cual se retiró el gen de \beta-Gal, y se insertó la secuencia complementaria de MAR de \beta-globina en el vector pSPUK con el fin de preparar el vector pMSPUK. Un constructo del vector pCPUK era la forma producida insertando scu-PA en el vector pCMV, y se insertó la secuencia complementaria de MAR de \beta-globina en el pCPUK con el fin de preparar un vector pMCPUK.
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(3) Prueba para determinar la eficacia de los vectores pSPUK, pMSPUK, pCPUK y pMCPUK \ding{192} Transfección de un gen de scu-PA recombinante en una célula, selección de transformantes y amplificación del gen
Se introdujeron respectivamente cuatro tipos de plásmido de expresión recombinante, es decir pSPUK, pMSPUK, pCPUK y pMCPUK, en la célula DHFR-CHO (CHO DG44) con el fin de obtener una línea celular lo suficientemente estable para expresar scu-PA. Se colocaron en una placa de 6 pocillos 2 x 10^{5} células CHO y se incubaron en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas. Se mezclaron respectivamente 1 \mug de los plásmidos de pSPUK, pMSPUK, pCPUK y pMCPUK y 10 ng de minigén de DHFR en una proporción de 100:1, y se transfectó la mezcla en la célula CHO en el procedimiento de lipofectamina, (GiboBRL) o DOSPER (Loche). Tras 6 horas, se sustituyó el medio con medio de cultivo fresco y se incubaron adicionalmente las células durante 48 horas. Se subcultivaron las células en el medio con respecto a medio selectivo en una proporción de 10:1 durante aproximadamente 2 semanas o más y se cambió el medio cada aproximadamente cuatro o cinco días con el fin de formar una colonia celular. Se cultivó la colonia celular junta o por separado.
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\ding{193} Medición de la actividad de scu-PA secretada a la disolución de cultivo de células
La actividad amidolítica del medio de cultivo de células, que se midió mediante el uso de S-2444 como sustrato, y su resultado se compararon con la actividad uroquinasa de referencia. Se colocaron en una placa de 6 pocillos 1 x10^{6} células con 2 ml de la disolución de cultivo y se cultivaron en una incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 17 horas. Con el fin de medir la actividad del sobrenadante, se colocaron en una placa de 96 pocillos 50 \mul del sobrenadante diluido en serie y se mezclaron con 30 \mul de disolución tampón (Tris/HCl 50 mM (pH 8,8), NaCl 80 mM, Twin 80 al 0,02%). Se mezclaron adicionalmente 10 \mul de plasmina (0,5 U/ml) a la mezcla y se hizo reaccionar la mezcla a 37ºC durante 20 minutos con el fin de activar la scu-PA recombinante. Se añadieron 10 \mul de aprotinina (100 KIU/ml) a la mezcla con el fin de inhibir la actividad de plasmina y se añadieron adicionalmente 100 \mul de disolución de sustrato cromogénico (una mezcla de la disolución tampón y S-2444 6 mM) a la mezcla y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Se midieron la actividad y la concentración de scu-PA en el medio de cultivo mediante la medición de absorbancia (densidad óptica) a 405 nm de la disolución resultante con un lector de microplacas y se compararon los resultados con los de uroquinasa como referencia.
La figura 10 muestra el título de expresión de scu-PA según la transfección de pMSPUK, pMCPUK, pSPUK y pCPUK en la célula CHO. El nivel de expresión de los vectores pMS y pMC aumenta en 4 veces más que el de pSV y pCMV como control.
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Ejemplo 3 Preparación del vector pSG-\beta-gal (1) Preparación del sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y el vector pSG-\beta-gal
Tras sintetizar la cadena sentido del sitio de terminación de la transcripción de genes de la gastrina de SEC ID NO. 15 y sintetizar la cadena antisentido de SEC ID NO. 16, se hibridaron las dos. Se trató el fragmento de hibridación con BamHI y PstI, y se integraron en y se unieron con el vector pSV-\beta-gal linealizado (un vector producido por Promega Co.) mediante la digestión con BamHI y PstI en el extremo 3' del terminador de SV40 p(A), de modo que se preparó pSG-\beta-gal.
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(2) Medición de la eficacia del vector pSG
Se contransfectó el vector pSG-\beta-gal en una célula Cos-7 con el vector pSV2neo mediante el uso de DOSPER (Roche), con el fin de medir el título de expresión de \beta-Gal.
La figura 12 muestra el título de expresión de \beta-Gal en el vector pSG-\beta-gal, y el vector pSG-\beta-gal que comprende el constructo constituido por la poli-A de SV40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina produce \beta-Gal en 4 veces más que la del vector convencional que comprende poli-A de SV40. Por tanto, puede producirse una gran cantidad de proteínas recombinantes mediante la transfección de los genes foráneos clonados en el vector pSG.
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Ejemplo 4 (1) Preparación del vector pMSG
Tal como se muestra en la figura 13, se preparó un vector que contenía la secuencia complementaria de MAR de \beta-globina y SPA-GTF mediante la PCR. Con el fin de preparar el vector pMSG, se usaron pMS-\beta-gal y pSG-\beta-gal como moldes, se realizó la PCR tres veces y se trataron los productos de PCR con una enzima de restricción específica y se unieron entre sí.
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\ding{192} PCR del elemento MAR de \beta-globina
Se usaron un cebador sentido ML1 (secuencia número 17) y un cebador antisentido MR1 (secuencia número 18) para la PCR. Tras tratar el producto de PCR con SacII y ClaI, se integró con el vector pMS-\beta-gal linealizado mediante la digestión con SacII y ClaI y se preparó el vector pMS-\beta-gal/sc.
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\ding{193} PCR para obtener sitios de multiclonación y sitios de terminación transcripcional
Se usaron un cebador sentido TL1 (secuencia número 19) y un cebador antisentido TR1 (secuencia número 20) en la PCR para obtener el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina del vector pSG. Se subclonó el producto de PCR con pGEM-T (un producto de Promega Co.), que es una clase de vector de clonación TA que puede clonar un producto de PCR directamente, de modo que se preparó pGEM-T/MCSp(A).
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\ding{194} PCR para obtener el promotor de SV40 y el sitio de multiclonación
Se usaron un cebador sentido PL1 (secuencia número 21) y un cebador antisentido PR1 (secuencia número 22) en la PCR para obtener el promotor de SV 40 y el sitio de multiclonación del vector de versión 1 de la figura 1. Se trató el producto de PCR con ApaI y BgIII y entonces se integró con el vector pGEM-T/MCSp(A) linealizado mediante la digestión con ApaI y BgIII, de modo que se preparó el vector pGEM-T/SVMCSp(A).
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\ding{195} Preparación del vector pMS y el vector pMSG
Se trató PGEM-T/SVMCSp(A) del ejemplo 4 con ApaI y BamHI con el fin de purificar un fragmento de ADN constituido por el promotor de SV40, sitios de multiclonación y un sitio de terminación de SV40, y se integró el fragmento purificado en el vector pMS-\beta-gal/sc linealizado mediante la digestión con ApaI y BamHI de \ding{192} en el ejemplo 4, de modo que se preparó el vector pMS. Se trató el vector pSG con BamHI y ScaI con el fin de separar 950 pb del fragmento de ADN que tiene una secuencia de bases GTF, y se unió con el vector pMS linealizado mediante la digestión con BamHI y ScaI, de modo que se preparó un vector pMSG.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Medición del título de expresión en el vector pMSG
Se realizó la PCR para el gen de TFG-\beta SRII (receptor II soluble de TGF-\beta, proteína de glicosilación) con un cebador sentido TRI (SEC ID NO. 23) y un cebador antisentido TRR1 (SEC ID NO. 24) con el fin de verificar la eficacia de expresión del vector pMSG en una línea de células huésped CHO y la aplicación industrial del vector pMSG. Se insertó el producto de PCR, TGF-\beta SRII amplificado, en vectores pMSG y pSV en el sitio NheI y XhoI, y cada vector resultante se cotransfectó en células CHO DG44 con pDCH1P que tenía genes de DHFR. Se cultivaron en medios selectivos, en los que sólo se pudo hacer crecer la cepa celular que tenía genes de DHFR. Se generaron transfectantes de DHFR^{+} estables tras aproximadamente 2 semanas, se aislaron veinte clones de DHFR^{+} y se analizaron estos clones mediante inmunotransferencia de tipo Western con el fin de medir la cantidad de TGF-\beta SRII y encontrar sus características.
La figura 14 muestra la inmunotransferencia de tipo Western que indica la expresión de TGF-\beta SRII, en la que "a" es el TGF-\beta SRII expresado a partir de clones del vector pSV y "b" es el TGF-\beta SRII expresado a partir de clones del vector pMSG. En el caso de clones del vector control, se detectó la expresión de TGF-\beta SRII en un clon entre 25 clones. Mientras que en 23 clones entre 27 clones se detectó la expresión de TGF-\beta SRII, además muchos más clones expresaron TFG-\beta a altos niveles. Además, cuando se expresó TGF-\beta SRII mediante el vector de expresión pMSG, tenía una estructura de glicosilación, de modo que aumentó su peso molecular como la glicoproteína de una célula animal típica. El nivel de expresión promedio de estos clones primarios del vector pMSG es de aproximadamente 100 ng/10^{6} células/día.
Se adaptaron los clones primarios estables del vector pMSG/TGF-\beta SRII de la presente invención a un sistema de amplificación de DHFR/MTX mediante el tratamiento en múltiples incrementos graduales de cantidad de MTX tal como 10 nM, 40 nM, 200 nM y 1 \muM, con el fin de aumentar la cantidad de expresión de TGF-\beta SRII.
La figura 15 muestra una cantidad de expresión de TGF-\beta SRII que se produce clonando TGF-\beta SRII en el vector pMSG, transfectándolo en una célula CHO y adaptándolo a una concentración de MTX de 1 \muM. En los clones del vector control, muchos clones no se adaptan a cada concentración de MTX durante el proceso de amplificación génica mediante el tratamiento con MTX, mientras que los clones del vector pMSG/TGF-\beta SRII se adaptan bien, en comparación con los clones del vector control. Se supone que el elemento MAR del vector de expresión pMSG aumenta la cantidad de expresión de los genes de DHFR así como los genes foráneos. Tal como se muestra en la figura 15, cuando se adaptó una concentración de MTX de 1 \muM, se obtuvieron muchos clones del vector pMSG que producían TGF-\beta en aproximadamente 10 \mug/10^{6} células/día.
Se ha informado de que TGF-\beta, un potente regulador del crecimiento y la diferenciación celular, es fundamental para la respuesta a daños. En varios epitelios, el daño repetido o prolongado conduce a fibrosis progresiva y en última instancia al desarrollo de la cicatrización excesiva no deseada. Además, TFG-\beta da como resultado a enfermedades tales como cuerpos glomerulares, esclerosis del riñón, cirrosis hepática, cornificación de células epidérmicas y un cartílago inflamatorio. TFG-\beta SRII actúa como antagonista de TFG-\beta. Por tanto, TGF-\beta está prohibido mediante el tratamiento de TGF-\beta SRII como tratamiento médico. El TGF-\beta SRII expresado a partir de una línea de células CHO tiene un efecto de tratamiento excelente en comparación con las proteínas que se expresan a partir de un procariota tal como E. coli, o Pichia pastoris, y el vector de expresión de la presente descripción, que tiene un título de expresión de los genes foráneos mejorado, puede usarse en células animales.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Mogam Biotechnology Research Institute
\hskip1cm
Pan-Gen Biotech Laboratories Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Vector de expresión para célula animal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> opp010629kr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR10-2000-43996
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 29-7-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del vector pMS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ..(419)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Virus SV40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3305)..(6269)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Elemento MAR de beta-globina humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
4
5
6
7
8
9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gastrina que se digiere con enzima de restricción HindIII, que contiene la señal de poli-A, el código de terminación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (256)..(435)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del virus SV 40 y sitio de terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(214)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del virus SV40 e inversa de señal de poli-A de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(137)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (138)..(221)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del virus SV40 y señal de poli-A de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(217)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del virus SV40 y señal de poli-A de la gastrina mínima
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(217)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(419)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
16
17
18
19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del vector pMSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(419)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (449)..(656)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3365)..(6329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Elemento MAR de beta-globina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1272)..(2132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> beta-galactosidasa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
20
21
22
23
24
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BML1 para el elemento de la región de unión a la matriz nuclear de beta-globina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BMR1 para el elemento de la región de unión a la matriz nuclear de beta-globina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CMVL1 para el vector pcCNA3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PAR1 para el vector pcCDNA3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PKL1 para el gen de scu-PA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PKR1 del gen de asc-PA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia sentido del sitio de terminación de la gastrina usada en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia sentido del sitio de terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido del sitio de germinación de la gastrina usada en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido del sitio de terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador ML1 para amplificar el elemento MAR de beta-globina humana en el vector pMS
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<220>
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<221> cebador
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<222> (1)..(35)
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<223> cebador
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<400> 17
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34
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<210> 18
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador MR1 para amplificar el elemento MAR de beta-globina humana en el vector pMS
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<221> cebador
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<222> (1)..(35)
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<223> cebador
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<400> 18
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35
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<210> 19
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador TL1 del sitio de terminación de la gastrina en el vector pSG
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<221> cebador
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<222> (1)..(39)
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<223> cebador
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<400> 19
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36
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<210> 20
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador TR1 del sitio de terminación de la gastrina en el vector pSG
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<221> cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> cebador
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<400> 20
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37
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<210> 21
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador PL1 para fusionar el promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación
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<220>
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<221> primer
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<222> (1)..(34)
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<223> primer
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<400> 21
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38
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<210> 22
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador PR1 para fusionar el promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación
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<220>
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<221> cebador
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<222> (1)..(40)
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<223> cebador
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<400> 22
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43
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<210> 23
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador TRI del receptor II soluble de TGF-beta
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<220>
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<221> cebador
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<222> (1)..(29)
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<223> cebador
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<400> 23
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44
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<210> 24
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador TRRI del receptor II soluble de TGF
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<221> cebador
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<222> (1)..(29)
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<223> cebador
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<400> 24
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45

Claims (12)

1. Un vector de expresión para una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del CMV, y el complemento de un elemento MAR de \beta-globina que está ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.
2. El vector de expresión según la reivindicación 1, en el que el vector de expresión es pMS de la SEC ID NO.1.
3. El vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende el promotor del CMV y el complemento del elemento MAR de \beta-globina ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.
4. El vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además la secuencia de SEC ID NO. 3 como terminador.
5. El vector de expresión según la reivindicación 4, en el que el vector de expresión es el vector pMSG de la SEC ID NO. 8.
6. Un procedimiento de preparación de materiales bioactivos en una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, usando el vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el material bioactivo es TGF-\beta SRII.
8. Un procedimiento para aumentar una expresión génica en una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK, una NIH3T3, usando el vector de expresión según la reivindicación 1.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión es pMS de la SEC ID NO. 1.
10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión comprende el promotor del CMV y el complemento del elemento MAR de \beta-globina ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.
11. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión comprende además la secuencia de SEC ID NO. 3 como terminador.
12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el vector de expresión es el vector pMSG de la SEC ID NO. 8.
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