ES2333774T3 - Uso de un vector de expresion para una celula animal. - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresión para una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del CMV, y el complemento de un elemento MAR de ß-globina que está ubicado en el extremo 5''-terminal del promotor.
Description
Uso de un vector de expresión para una célula
animal.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a un vector de
expresión para una célula animal, y más particularmente, a un vector
de expresión que incluye el elemento de la región de unión a la
matriz nuclear (denominado a continuación en el presente documento
"elemento MAR") y el sitio de terminación de la transcripción
del gen de la gastrina.
Muchos tipos de sistemas de expresión, tales
como microorganismos, plantas, levaduras, células de insectos y
células animales están actualmente en uso para el tratamiento médico
mediante la expresión de las proteínas deseadas en una gran
cantidad. Entre los muchos tipos de sistemas de expresión, los
microorganismos son los más fácilmente usados como sistema de
expresión, y muchos tipos de sistemas de microorganismos se estudian
y se utilizan como sistema de expresión.
Sin embargo, el uso del sistema de expresión de
microorganismos está limitado en algún sentido. En primer lugar,
aunque los genes se expresan en un microorganismo, la estructura y
caracteres de la proteína expresada son distintos de los de la
proteína animal, porque el microorganismo tiene un mecanismo
diferente para expresar proteínas y un mecanismo de modificación de
proteína tal como glicosilación, fosforilación y amidación. Por
tanto, una proteína recombinante producida a partir de
microorganismos casi no tiene modificación, o está limitada en la
producción de proteínas de las que la función no se ve muy afectada
por la diferencia de la modificación y la estructura de las
proteínas. Además, cuando se usan las proteínas recombinantes que se
expresan por microorganismos, se necesita un proceso de limpieza por
la contaminación del microorganismo o toxina.
Aunque las células animales son adecuadas para
una expresión de proteínas en animales, el sistema de expresión que
usa células animales no se usa comúnmente, porque el sistema de
expresión que usa células animales crea costes de producción
superiores debido a una eficacia de expresión inferior de la
proteína recombinante en comparación con la de microorganismos y
células animales.
Una célula animal para la industria, que se usa
actualmente para un sistema de expresión incluye CHO (ovario de
hámster chino), BHK (riñón de cría de hámster) y mieloma, y se
introduce el vector de expresión en la célula animal y se produce
una proteína foránea deseada, como en microorganismos.
Por tanto, los sistemas de expresión génica se
modifican mediante diversos procedimientos, porque en general se
expresa una pequeña cantidad de los genes foráneos. Por ejemplo, se
cultiva una cepa de células de CHO en medio que contiene
metotrexato (denominado a continuación en el presente documento
"MTX") que es un inhibidor de la DHFR (dihidrofolato
reductasa), con el fin de obtener la cepa CHO que está viva
dependiendo de la concentración de MTX, y expresa altamente la
proteína debido al aumento en el número de copias de genes.
Generalmente, cuando se expresan los genes
foráneos en una célula animal, el gen foráneo se cotransfecta con
el vector que tiene un marcador selectivo y se seleccionan células
transformadas a través del cultivo en el medio selectivo durante
muchas horas. Sin embargo, la frecuencia para lograr un clon de
células que expresan altamente es baja. La baja frecuencia de la
expresión del gen foráneo se debe a la inserción cromosómica del
gen foráneo en un sistema animal, a diferencia de un microorganismo.
Además, aunque el proceso de inserción del gen foráneo sea
satisfactorio, no puede esperarse la expresión de los genes
foráneos, puesto que el sitio insertado de cada gen difiere y la
expresión del gen depende del sitio insertado (Grindley et
al., 1987. Trends Genet. 3, 16-22; Kucherlapati
et al., 1984. Crit. Rev. Biochem. 16,
349-381; Palmiter et al., 1986. Annu. Rev.
Genet. 20, 465-499). Por tanto, aunque los genes
foráneos están integrados de manera estable, pueden expresarse en
una pequeña cantidad, porque la mayor parte de la expresión génica
en células animales está inhibida por el ácido nucleico adyacente
(Eissenberg et al., 1991. Trends Genet. 7,
335-340; Palmiter et al., 1986. Annu Rev.
Genet. 20, 465-499).
Con el fin de proteger la expresión del gen
foráneo de los efectos de posición, se ha informado de la
posibilidad de usar elementos de matriz nuclear en varios sistemas.
El elemento nuclear a modo de ejemplo incluye un elemento aislante,
una región de unión a la matriz nuclear (denominada a continuación
en el presente documento "MAR") y una región de unión al
armazón proteínico (denominada a continuación en el presente
documento "SAR").
Kalos (Kalos et al., 1995 Mol. Cell.
Biol. 15, 198-207) sugirió que cuando la MAR de
apolipoproteína B estaba combinada con el constructo transgénico
del promotor mínimo, el gen foráneo se introducía de manera estable
en el cromosoma huésped, de modo que la cantidad expresada del
transcrito aumentaba en aproximadamente 200 veces. De manera
similar al procedimiento mencionado anteriormente, se informó de que
la MAR de lisozima A de pollo y la SAR de
\beta-interferón pueden aumentar el nivel de
expresión del gen foráneo en una célula de vertebrado
independientemente del sitio de inserción cromosómica (Eissenberg
et al., 1991. Trends Genet. 7, 335-340;
Klehr et al, 1991. Biochemistry 30,
1264-1270). Sin embargo, no se ha verificado que la
MAR y la SAR puedan aumentar la producción de proteínas en una cepa
de células CHO, o que la MAR y la SAR sean adecuadas para su uso
común.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando se expresa un gen de célula animal; la
síntesis de ARNmr se produce a partir del promotor y finaliza en el
sitio de terminación. Los niveles de las proteínas expresadas están
influenciados con frecuencia por la eficacia de la terminación de
la transcripción así como la estabilidad del ARNm sintetizado.
El sitio de terminación transcripcional que se
incluye en un vector de expresión controla la poliadenilación y
tiene una influencia en la estabilidad del ARNm. El sitio de
terminación incluye una señal de poli-A, un sitio
de rotura, un sitio de terminación, y la señal de poliadenilación es
AATAAA y está bien estudiada. Sin embargo, no se conocen bien el
sitio de rotura en el que se produce la poliadenilación, ni el sitio
de terminación en el que se completa la transcripción génica por la
enzima II de polimerización de ARN. Además, aunque se informa de
que la región rica en GU/U excepto los tres tipos de región crítica
controla la poliadenilación del ARNm, no se conoce el mecanismo
detallado.
Los vectores de expresión que se usan comúnmente
en células animales contienen una señal de poli-A
del virus SV40 y BGH (hormona de crecimiento bovina), y no se ha
sugerido que el terminador específico, que mejora la estabilidad de
ARNm y el nivel de expresión, se desarrolla con el fin de usar el
vector de expresión de células animales.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un vector de expresión que tenga un aumento de la
eficacia de la expresión y los niveles para genes foráneos en la
expresión de proteínas foráneas usadas en un sistema de célula
animal.
Con el fin de lograr estos objetivos, la
descripción presente proporciona un vector de expresión que
comprende el elemento MAR (región de unión a la matriz nuclear) o su
secuencia complementaria en el extremo 5'-terminal
de un promotor.
Además, la descripción presente proporciona un
vector de expresión para células animales que comprende un
constructo constituido por la señal de poli-A
(poliadenilación) del virus SV 40 y el sitio de terminación de la
transcripción del gen de la gastrina, en el que el constructo tiene
una secuencia de SEC ID NO. 3.
Además, la descripción presente proporciona un
vector pMSG KCCM 10202 de la SEC ID NO. 8, que comprende una
secuencia complementaria de la MAR (región de unión a la matriz
nuclear) en 5' de \beta-globina humana, y el
constructo constituido por la señal de poli-A del
virus SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de
la gastrina.
Además, la descripción presente un procedimiento
de preparación de materiales bioactivos usando un vector de
expresión para células animales que comprende un elemento MAR de
\beta-globina, o la secuencia complementaria de
la MAR de \beta-globina en el extremo
5'-terminal del promotor, un vector que comprende la
señal de poli-A (poliadenilación) del virus SV40 de
la SEC ID NO. 3 y el sitio de terminación de la transcripción del
gen de la gastrina, y un vector pMSG.
La presente invención se refiere al objeto de
las reivindicaciones 1-12.
La figura 1 muestra una estructura de un vector
de expresión, que se prepara combinando el promotor de SV40 y el gen
de \beta-gaul como indicador de la expresión
génica;
la figura 2 muestra una frecuencia de expresión
de \beta-Gal inducida por diversos elementos MAR y
SAR que se usan en la presente descripción;
la figura 3 muestra una actividad de
\beta-Gal expresada, que indica una influencia de
los elementos MAR y SAR de la presente invención sobre la expresión
de \beta-Gal;
la figura 4 muestra diversos constructos
mutantes a partir del elemento MAR basándose en la secuencia de ADN
de la MAR de \beta-globina;
la figura 5 muestra la frecuencia de expresión y
la cantidad de expresión de proteínas \beta-Gal,
tras la transfección de un vector introducido con elementos MAR en
células CHO;
la figura 6 muestra la transferencia de tipo
Southern y tipo Northern para confirmar el número de copias de genes
de \beta-Gal (a: un grupo control, b: la presente
invención), el número de ARN (c: un grupo control, d: la presente
invención) y el número de copias de gen neo como marcador selectivo
(e: un grupo control, f: la presente invención) en células animales
transformadas con vector
pMS-\beta-gal o
pSV-\beta-gal como control;
la figura 7 es un gráfico que muestra la
relación entre el número de copias del gen de
\beta-Gal y el rendimiento de expresión de
\beta-Gal en células animales transformadas con el
vector pMS-\beta-gal o
pSV-\beta-gal como grupo
control;
la figura 8 muestra un título de expresión del
vector pMS-\beta-gal en diversas
líneas celulares;
la figura 9 muestra una cantidad de expresión de
la proteína foránea dependiendo de la concentración de MTX en una
célula transformada con el vector
pMS-\beta-gal o un vector
control;
la figura 10 muestra un título de expresión de
scu-PA, tras insertar scu-PA
(prouroquinasa de cadena simple) en el vector pMS y el vector pMC,
en comparación con el del control;
la figura 11 muestra un constructo que incluye
el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y
la señal de poli-A del SV40;
la figura12 muestra una cantidad de expresión de
\beta-Gal en el vector de expresión que comprende
un constructo que incluye el sitio de terminación de la
transcripción del gen de la gastrina y la señal de
poli-A del SV40;
la figura 13 muestra la estructura de pMSG;
la figura 14 muestra una expresión de
TGF-\beta SRII en el vector pMSG confirmada por
una reacción antígeno-anticuerpo; y
la figura 15 muestra una cantidad de expresión
de TGF-\beta SRII que se produce clonando el gen
de TGF-\beta SRII en el vector pMSG,
transfectándolo en una célula CHO y cultivando en condición de
añadir MTX.
Los inventores superaron los problemas que
surgían del efecto específico del sitio cuando se expresan genes
foráneos en sistemas de célula animal, y diseñaron un vector de
expresión óptimo que aumenta la cantidad de expresión de los
genes.
Un vector de expresión para células animales de
la presente descripción comprende secuencias de bases adecuadas,
que se añaden adicionalmente a los vectores de expresión
convencionales. Las secuencias de bases adecuadas incluyen una
región de unión a la matriz nuclear (denominada a continuación en el
presente documento "MAR") y una región de unión al armazón
proteínico (denominado a continuación en el presente documento
"SAR"), que estimulan la expresión de genes foráneos de un
huésped tal como CHO (ovario de hámster chino) y BHK (riñón de cría
de hámster) a partir de los efectos de posición del sitio de
inserción, y aumentan la cantidad de expresión de los genes
foráneos.
El elemento MAR o SAR se añade al extremo
5'-terminal del promotor y se analiza la eficacia
del vector de expresión. El ADN cromosómico se aísla de la célula,
y entonces se clona el ADN cromosómico en E. coli a través
de una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y subclonación, de
modo que se obtiene el ADN de los elementos MAR y SAR.
Preferiblemente, el elemento MAR o SAR se
selecciona del grupo constituido por MAR en 5' de lisozima de pollo
(Phi-Van, L. y Stratling, W. H., Biochemistry 35,
10735-10742 (1996), banco de genes n.º: X98408), MAR
en 5' de pi \alpha globina de pollo (Krevskii, V. A., Mikhailov,
V. S. y. Razin, S. V., Mol. Biol. 26, 672-678
(1992), banco de genes n.º: X64113), MAR en 5' de
\beta-globina humana (Yu, J., Bock, J. H.,
Slightom, J. L. y Villeponteau, B., Gene 139(2),
139-145 (1994), banco de genes n.º: L22754), MAR de
intrón de DHFR de CHO (Kas, E. y Chasin, L.A., J. Mol. Biol.
198(4), 677-692 (1987), banco de genes n.º:
X06654), MAR de intrón de HPRT humana (Sykes, R. C., Lin, D.,
Hwang, S. J., Framson, P E. y Chinault, A. C., Mol. Gen. Genet. 212.
301-309 (1988), banco de genes n.º: X07690), SAR
que flanquea al gen CSP-B humano (Handson, R. D. y
Ley, TJ., banco de genes n.º: M62716) y SAR que flanquea al gen
interferón-\beta humano (Mielke, C., Kohwi, Y,
Kohwi-Shigematsu, T. y Gode, J., Biochemistry 29,
7475-7485 (1990), banco de genes n.º: M83137).
La MAR y la SAR estaban integradas en un vector
de expresión para células animales y se indujo la expresión de
\beta-Gal del vector con el fin de confirmar la
relación entre MAR/SAR y el título de expresión.
El extremo 5'-terminal del
promotor pSV-\beta-gal se conectó
al sitio de multiclonación (denominado a continuación en el
presente documento "MCS") mediante mutagénesis por PCR in
vitro y entonces se obtuvo un vector de recombinación (vector
de versión 1 y versión II), tal como se muestra en la figura 1. Se
insertó una MAR o una SAR enfrente del extremo
5'-terminal del promotor de SV40 del vector de
recombinación pSV-\beta-gal
versión I ó II, se preparó un vector de prueba y se transformó el
vector de prueba en CHO DG44. Se seleccionó la CHO DG 44
transformada en medios que contenían G418 (neomicina) y se midió el
título de expresión mediante tinción de \beta-Gal
(tinción de azul con IPTG y X-Gal). Para medir el
título de expresión, se midieron la frecuencia de expresión, varias
células de expresión y la cantidad de expresión de
\beta-Gal.
La figura 2 muestra una frecuencia de expresión
de \beta-Gal inducida por diversos elementos MAR y
SAR. El vector pSV-\beta-gal
mostró aproximadamente del 20% al 30% de la frecuencia de expresión
de \beta-Gal, mientras que el vector de prueba
que comprende una MAR de \beta-globina, SAR de
CSP-B o SAR de interferón-\beta
aumentaba la frecuencia de expresión en la línea celular positiva y,
más particularmente, el vector de prueba que comprende una MAR de
\beta-globina mostró aproximadamente del 70% al
80% de la frecuencia de expresión de
\beta-gal.
Además, se prepararon constructos según una
combinación de diversos elementos MAR y promotor de SV40 y se
comparó la influencia de la expresión de proteínas de recombinación
con el promotor del virus SV40. Con el fin de comparar la cantidad
de producción de \beta-Gal, se realizaron un
procedimiento de tinción de \beta-Gal y un
procedimiento de medición de la enzima \beta-gal y
se analizó la actividad de \beta-Gal en el mismo
número de líneas celulares positivas, puesto que la frecuencia de
expresión difiere según cada elemento MAR.
La figura 3 muestra la actividad de
\beta-Gal expresada según la influencia de
diversos elementos MAR y SAR, y la cantidad de
\beta-Gal por célula positiva o la actividad de
\beta-Gal aumentó cuando se usaron los elementos
MAR de \beta-globina, SAR de CSP-B
y say de interferón-\beta, en comparación con la
de pSV-\beta-gal. Se observó que
la cantidad de expresión del vector que comprende el elemento MAR de
\beta-globina aumentó en 7 veces o más.
Por consiguiente, entre los elementos MAR, el
elemento MAR de \beta-globina es más preferible
actualmente.
Se analizó la secuencia de ADN del elemento MAR
con el fin de investigar el efecto y la eficacia del elemento MAR de
\beta-globina.
El elemento MAR de
\beta-globina incluye 2.999 bases y su función no
se ha encontrado en detalle. El elemento MAR de
\beta-globina comprende una secuencia consenso y
244 pb del elemento alu que está ubicado en el extremo 3' de la
región de 800 pb y en la que existen secuencias ricas en A+T
(adenina, timidina). Se informa de que el sitio alu comprende 300
pb de dos unidades monoméricas de repetición directa, y su
recombinación se produce con frecuencia en este sitio, puesto que
existen miles de sitios homólogos en el cromosoma de un eucariota
(Jagadeeswaran et al., 1982. Nature 296,
469-470; Rogers. 1985. Int. Rev. Cytol. 93,
187-279). Cuando existe el alu de la MAR de
\beta-globina en el sentido de 5' del promotor de
SV 40, y se cultiva la célula durante un tiempo prolongado, puede
producirse la recombinación.
Por tanto, los inventores diseñaron los mutantes
de la MAR de \beta-globina que no tenían el mal
efecto mencionado anteriormente.
La figura 4 muestra los mutantes de la MAR de
\beta-globina, que se producen preparando la
secuencia complementaria de la MAR b, el mutante de deleción c, d,
e, f, g e i, e integrándolos en
pSV-\beta-gal versión I.
Tras introducir el vector que comprende el
mutante de la MAR de \beta-globina en la célula
CHO, se midieron el número de células de expresión de
\beta-Gal y la cantidad de
\beta-Gal, y se representaron los resultados en
la figura 5. El título de expresión de \beta-gal
de la mayor parte de los mutantes de la MAR de
\beta-globina disminuyó; por el contrario, el de
la línea celular transformada con el vector
pMS-\beta-gal que comprendía una
secuencia complementaria de la MAR \beta-globina
era alto. Las figuras 6 y 7 muestran la relación entre la cantidad
de expresión de la proteína recombinante y el número de copias de
los genes integrados, y la cantidad de expresión del
pSV-\beta-Gal es independiente del
número de copias de los genes integrados, y la cantidad de
expresión del vector transformado con el
pMS-\beta-Gal es proporcional al
número de copias de los genes integrados. Puesto que la secuencia
complementaria de la MAR de \beta-globina permite
que alu salga al otro lado del promotor, disminuye la posibilidad
de recombinación del vector, y aumenta la cantidad de expresión
evitando el efecto específico del sitio de inserción. Por tanto, la
secuencia complementaria de la MAR de
\beta-globina es preferible en la presente
invención.
Se verifica que el elemento MAR o SAR está
ubicado en el sitio en 5' del promotor del vector de expresión
convencional, y que los mutantes de la MAR o SAR, o la secuencia
complementaria están integrados en el vector de expresión
convencional, de modo que aumenta el título de expresión de las
proteínas foráneas. Por tanto, la presente descripción proporciona
un vector de expresión que incluye el elemento MAR o SAR, y los
vectores de expresión que incluyen mutantes de la MAR o SAR, o su
secuencia complementaria. La MAR o la SAR se selecciona
preferiblemente del grupo constituido por MAR de
pi-a (MAR en 5' de pi
\alpha-globina de pollo), MAR de
\beta-globina (MAR en 5' de
\beta-globina humana), MAR de DHFR (MAR de intrón
de DHFR de CHO), MAR de HPRT (MAR de intrón de HPRT humana), SAR de
CSP-B (elemento SAR que flanquea el gen
CSP-B humano), elemento SAR de
interferón-\beta (elemento SAR que flanquea el gen
de interferón-\beta humano) y MAR de liso (MAR en
5' de lisozima de pollo).
Entre ellos, el vector pMS (KCCM 10203) estaba
constituido por 6287 pb que comprendían la secuencia complementaria
de la MAR de \beta-globina humana en el extremo
5'-terminal de un promotor del virus SV 40 y sitios
de multiclonación, y pueden expresar la proteína recombinante
mediante la integración de genes en los sitios de multiclonación. La
secuencia de bases de pMS se compila como SEC ID NO.1 con el
software para el listado de secuencias.
Cuando se usa la secuencia complementaria de la
MAR de \beta-globina, la frecuencia de expresión y
la cantidad de expresión de los genes foráneos aumentan en de 3 a 4
veces, y en de 7 a 10 veces, respectivamente, en comparación con
las de los genes foráneos cuando se usa el único promotor de SV40.
Además, el vector pMS-\beta-gal
puede aplicarse a diversos tipos de célula animal, lo que está
representado en la figura 8, y el sistema de vector
pMS-\beta-gal puede aplicarse
preferiblemente a BHK, CHO, NIH3T3 y HEK 293. La figura 9 muestra
los incrementos del título de expresión añadiendo MTX (metotrexato)
cuando se expresan las proteínas foráneas en el sistema de vector
pMS-\beta-gal.
Para medir el título de expresión de proteínas
foráneas según la MAR o la SAR, se usa el promotor del CMV
(citomegalovirus). Puesto que el título de expresión de los genes
foráneos difiere ya que depende del tipo de promotor y las diversas
cepas celulares, también se somete a prueba el promotor del CMV. Con
el fin de verificar el efecto de la secuencia complementaria de la
MAR de \beta-globina sobre la función del promotor
del CMV, se prepara el vector pMC mediante un procedimiento similar
a la preparación de pMS, y se integran genes de
scu-PA en el vector pMS, pMC y control.
La figura 10 muestra que el título de expresión
de scu-PA en una CHO transformada con vectores
pMSPUK, pMCPUK, pSPUK y pMCPUK que se prepara integrando la
scu-PA en pMS, pMC, pSV y pCMV, y que la expresión
génica de pMS y pMC aumentaban en 4 veces la de pSV y pCMV. Por
tanto, puede usarse la secuencia complementaria de la MAR de
\beta-globina para la expresión de proteínas de
células animales mediante combinación adecuada con los promotores
deseados.
Puesto que el vector que incluye la secuencia
complementaria de la MAR de \beta-globina tiene
integrado genes foráneos como célula huésped, pueden obtenerse
proteínas útiles a partir de una cepa de células animales en el
procedimiento convencional.
Se prepararon una señal de
poli-A de transcripción del gen de la gastrina
humano, un sitio de rotura y un sitio de terminación de la gastrina
humana, y se aplicaron al vector de expresión de la presente
descripción con el fin de aumentar la estabilidad del ARNm,
aumentando de ese modo la eficacia del vector de expresión.
La región reguladora transcripcional en 3' del
gen de la gastrina humano comprende 605 pb incluyendo la señal de
poli-A, los sitios de rotura, un sitio de
terminación y la secuencia de bases de la región reguladora
transcripcional en 3' del gen de la gastrina humano se presenta
como SEC ID NO. 2. El sitio de rotura está ubicado 15 pb en el
sentido de 3' desde la señal de poli-A, y el sitio
de terminación está ubicado 220 pb en el sentido de 3' desde la
señal de poli-A. La transcripción de la gastrina se
completa en el sitio de terminación y se producen la rotura y
poliadenilación de ARNm en el sitio de rotura.
El presente inventor diseñó el constructo que
estaba constituido por poli-A de SV 40 y el sitio de
terminación de la transcripción del gen de la gastrina, que puede
aumentar el título de expresión de los genes, lo que se muestra en
la figura 11.
La figura 11 muestra los constructos
constituidos por el sitio de terminación de la transcripción del gen
de la gastrina y poli-A de SV 40, y los constructos
se seleccionan preferiblemente de pSV-SPA (SPA; la
señal de poliadenilación de SV 40) en "a",
pSV-SPA-GTF (GTF; sitio de
terminación de la transcripción del gen de la gastrina) en
"b", pSV-SPA-GTR (GTR;
secuencia complementaria a GTF) en "c", pSV-GPA
(GPA; señal de poliadenilación de la gastrina) en "d",
pSV-GPA-GTF en "e",
pSV-GPA-GTR en "f",
pSV-GMPA (GMPA; mutante de GPA) en "g",
pSV-GMPA-GTF en "h",
pSV-GMPA-GTR en "i". Las
secuencias de bases de SPA-GTF,
SPA-GTR, SPA-GPA,
SPA-GPMA se enumeran como SEC ID NO. 3, NO. 4, NO.
5 y NO. 6, respectivamente. Todos los constructos se integraron
respectivamente en pSV-\beta-gal
y se introdujeron adicionalmente en una cepa de células
COS-7 con el fin de medir el título de expresión de
\beta-Gal. El título de expresión es la cantidad
de expresión de \beta-Gal, y está representado en
la figura 12. El vector pSG que comprende el constructo constituido
por la señal de poli-A de SV 40 y el sitio de
terminación de la transcripción del gen de la gastrina tiene un
efecto para aumentar la cantidad de expresión de la proteína 4
veces. Por tanto, el sitio de terminación es preferiblemente
SPA-GTF (la señal de poli-A de SV
40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la
gastrina) para aumentar el título de expresión.
Los constructos se usan como sitio de
terminación de los vectores de expresión convencionales, de modo que
aumenta la cantidad de expresión de las proteínas foráneas. El
vector de expresión a modo de ejemplo de la presente descripción
incluye pSG.
El vector pSG es un vector que tiene integrado
SPA-GTF en su sitio de terminación, y 3309 pb. La
secuencia de bases del vector pSG se enumera como SEC ID NO. 7.
\beta-Gal se insertó en el vector pSG con el fin
de medir su título de expresión, y el título de expresión del pSG
es 4 veces mayor que el del vector pSV, lo que resulta de
estabilizar el ARNm mediante un constructo constituido por el sitio
de terminación de la transcripción del gen de la gastrina y la señal
de poli-A del virus SV 40.
Por tanto, el vector que comprende
SPA-GRF puede expresar los genes foráneos en un
huésped animal de manera convencional, y pueden obtenerse proteínas
útiles tales como un material bioactivo.
Además, la presente descripción proporciona un
vector de expresión que incluye los dos sitios que pueden aumentar
el título de expresión de los genes foráneos. Los dos sitios son el
sitio de terminación transcripcional de atracción del sitio de
terminación de la transcripción del gen de la gastrina con la
poli-A de SV 40 y la secuencia complementaria de la
MAR de \beta-globina.
La figura 13 muestra la estructura de pMSG, los
6347 pb de las secuencias de bases totales se enumeran como SEC ID
NO. 8, y pMSG se depositó como KCCM 10202 en el Centro de Cultivos
de Microorganismos de Corea. La siguiente tabla 1 muestra el mapa
del pMSG en detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína para un gen
TGF-\beta SRII puede evitar los efectos
secundarios del TGF-\beta mediante la unión
selectiva con el TGF-\beta que es una proteína
humana activa. El TGF-\beta SRII se expresó con el
fin de analizar el efecto y la eficacia del pMSG de la presente
descripción. Como resultado, en la figura 14, puesto que la
proteína TGF-\beta SRII tiene una estructura de
glicosilación, la proteína tiene un mayor peso molecular que el de
la proteína original, tal como lo tienen las células animales
típicas. La cantidad de expresión inicial de
TGF-\beta SRII es de aproximadamente 100
ng/10^{6} células/día, y la mayor parte de las células se
expresan igualmente. Además, como en la figura 15, se obtuvieron 10
\mug/10^{6} células/día como máximo, cuando se añadió MTX 1
\muM a las células con TGF-\beta SRII. El
TGF-\beta tiene diversas funciones en el cuerpo
humano, en particular, se encuentra como factor que da como
resultado la inflamación tal como cuerpos glomerulares, esclerosis
del riñón, cirrosis hepática, cornificación de células epidérmicas
y un cartílago oclusal, el TGF-\beta SRII puede
usarse para el tratamiento de enfermedad que sobreexpresa
TGF-\beta.
El vector pMSG ha superado un problema general,
que es el bajo rendimiento de expresión y la dificultad para obtener
transformantes, y puede producir en masa distintos tipos de
proteínas recombinantes tales como materiales bioactivos.
Además, se desarrolló el vector pMS
(KCCM-10203), cuya expresión no se inhibe por la
base adyacente del sitio de inserción, y pMS produjo proteína
recombinante en aproximadamente 8 veces más que la del promotor de
SV 40 convencional.
Además, se preparó el vector pSG, que comprende
un sitio de terminación transcripcional que puede inducir la
terminación transcripcional en un sitio específico de transcritos y
que aumenta en 3 veces la del sitio de poli-A
convencional.
El vector pMSG (KCCM-10202) se
prepara mediante la conexión de los fragmentos de ADN funcionales y
el sitio de multiclonación que puede aplicarse a genes foráneos, y
su cantidad de expresión es de 10 ug/10^{6} células/día, cuando
se expresa TGF-\beta en células animales. Por
consiguiente, el vector de expresión es adecuado para la expresión
de las proteínas recombinantes, y puede producirse en células
animales una proteína derivada de un eucariota que se expresa en un
procariota como una proteína recombinante que tiene la misma
estructura y función en comparación con la proteína de tipo
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un vector
pMS-\beta-gal tal como sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aísla un ADN genómico de una célula
G-2 en un huésped humano usando el kit de
purificación de ADN genómico Wizard (un producto de Promega Co.) y
el procedimiento de purificación seguido por el procedimiento
experimental suministrado por la empresa de producción.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de obtener un fragmento de la MAR en
5' de \beta-globina humana, se usó el ADN genómico
purificado como molde, y se usaron el cebador sentido BML1 y el
cebador antisentido BMR 1 para la MAR de
\beta-globina en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) genómica. El BML1 y BMR1 se enumeraron como SEC ID
NO. 9 y SEC ID NO.10, respectivamente. Se realizó la PCR con 32
ciclos. La tabla 2 muestra los números de ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la PCR, se insertó el producto de PCR en el
vector pT7blue (Novagen Co.), y se preparó el vector
pT7blue/MAR de \beta-globina. El vector pT7blue es un vector de clonación TA que puede clonar un producto de PCR directamente.
pT7blue/MAR de \beta-globina. El vector pT7blue es un vector de clonación TA que puede clonar un producto de PCR directamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de insertar la MAR de
\beta-globina del vector pT7blue en el sentido de
5' del promotor del vector
pSV-\beta-gal, se prepararon
pSV-\beta-gal versión I y
pSV-\beta-gal versión II.
En primer lugar, con el fin de preparar
pSV-\beta-gal versión I, después
de tratar pSV-\beta-gal con SpeI y
HindIII, se purificaron 443 pb del fragmento SpeI/HindIII que
incluía el promotor de SV 40 en gel de agarosa con un kit gene
clean III (BIO 101 Co.). Se ligó el fragmento al pBluescript SK(+)
(Stratagene Co.) linealizado mediante la digestión con
SpeI/HindIII, y se preparó el vector pBluescript/promotor I de
SV40.
Entonces se trató el vector pBluescript/promotor
I de SV 40 con ScaI y HindIII, se purificó un fragmento que incluía
el promotor de SV 40 en gel de agarosa de la misma manera mencionada
anteriormente y se ligó el fragmento con el vector
pSV-\beta-gal linealizado mediante
la digestión con ScaI y HindIII, de modo que se preparó el vector de
versión I.
Además, con el fin de producir el vector
pSV-\beta-gal versión II, después
de tratar pSV-\beta-gal con EcoRI
y HindIII, se purificaron los 420 pb del fragmento EcoRI/HindIII que
incluía el promotor de SV 40 en el gel de agarosa de la misma
manera mencionada anteriormente y se ligó el fragmento con el
pBluescript SK(+) linealizado mediante la digestión con EcoRI y
HindIII, de modo que se produjo el vector pBluescript/promotor II de
SV 40.
Se trató el vector pBluescript/promotor II de SV
40 con ScaI y HindIII con el fin de purificar el fragmento que
incluía el promotor de SV 40 en el gel de agarosa de la misma manera
mencionada anteriormente y se ligó el fragmento con el vector
pSV-\beta-gal linealizado mediante
la digestión con SceI y HindIII, de modo que se preparó el vector
pSV-\beta-gal versión II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató el vector pT7blue/MAR de
\beta-globina con SpeI y SmaI y se purificó el
fragmento de ADN con un tamaño de 3 kb que incluía la MAR de
\beta-globina en un gel de agarosa y se ligó el
fragmento con pSV-\beta-gal
versión I recombinante linealizado mediante SpeI y SmaI, de modo que
se clonó la MAR de \beta-globina. Con el fin de
confirmar la orientación de la MAR de
\beta-globina, se trató la enzima de restricción
HindIII que existe en
pSV-\beta-gal versión I y la MAR
de \beta-globina, y se confirmó que se clonó la
MAR de \beta-globina en la orientación inversa al
vector pSV-\beta-gal versión
I.
\newpage
Se cotransfectaron 2 \mug de los vectores de
prueba que incluían el vector
pMS-\beta-gal en CHO DG44 con el
vector pSV2neo usando DOSPER (un producto de Roche) y se
cotransfectó el vector
pSV-\beta-gal como vector control
de la misma manera. Se cultivó la célula CHO DG44 transfectada en un
medio selectivo que era medio MEM-a que incluía
nucleósidos complementado con FBS al 10% inactivado por calor y G418
sulface 850 \mug/ml (un producto de Calbiochem Co.). Se generaron
transfectantes resistentes a G418 transfectados de manera estable
después de aproximadamente 2 semanas, y se aislaron veinte clones
estables que expresaban \beta-Gal para el vector
control y el vector pMS-\beta-gal
en transfectantes resistentes a G418. Se analizaron 40 clones
positivos mediante transferencia de tipo Southern y tipo Northern
con el fin de medir el número de copias de la
\beta-Gal y el gen neo y la cantidad del ARN de
\beta-Gal que se transcribe de
pSV-\beta-gal y
pMS-\beta-gal.
La figura 6 muestra la transferencia de tipo
Southern y tipo Northern para confirmar el número de copias del gen
de \beta-Gal (a: un grupo control, b: la presente
descripción), el número de ARN (c: un grupo control, d: la presente
invención) y el número de copias del gen neo como marcador selectivo
(e: un grupo control, f: la presente descripción) en clones
positivos que expresan \beta-Gal (denominado a
continuación en el presente documento "clones positivos") para
el vector pSV-\beta-gal o
pMS-\beta-gal, y la figura 7 es
un gráfico que muestra la relación entre el número de copias del gen
de \beta-Gal y el rendimiento de expresión de
\beta-gal en clones positivos para el vector
pSV-\beta-gal o
pMS-\beta-gal. Puesto que se varió
el número de copias del gen de \beta-Gal en cada
clon positivo tal como se muestra en las figuras 6a y 6b, se
clasificó cada clon positivo en dos grupos, en los que uno tiene un
alto número de copias del gen de \beta-Gal, y el
otro tiene un bajo número de copias del gen de
\beta-Gal, relativamente, y se analizaron los
grupos entre sí. En el grupo que tiene un alto número de copias del
gen de \beta-gal, aunque el grupo control tenía
un alto número de copias del gen de \beta-Gal tal
como se muestra en "a", la cantidad de ARN del gen de
\beta-Gal en estos clones era baja con respecto a
un número de copias de ADN tal como se muestra en "c". Sin
embargo era alta la cantidad de ARN en clones positivos para el
pMS-\beta-gal de la presente
invención representada en "d". Además, en el grupo que tiene
un bajo número de copias del gen de \beta-Gal, el
número de copias de \beta-gal y la cantidad de
ARN en clones positivos para el vector
pMS-\beta-gal eran muy superiores
que los de en clones positivos para el vector control, tal como se
muestra en la figura 6. La figura 7 muestra la relación entre el
número de copias y la cantidad de expresión de genes. En la figura
7, el número de copias medio y el nivel de expresión del gen de
\beta-gal en clones de vector
pMS-\beta-gal (\bullet)
corresponden a aproximadamente 10 veces en comparación con los de
clones de vector control (\circ). Además, en caso de un grupo de
alto número de copias del gen de \beta-Gal, la
expresión del gen de \beta-gal en clones de
vector control es independiente del número de copias del gen y el
pMS-\beta-gal tal como se muestra
en la figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
En la expresión de los genes foráneos en células
animales, también se usan diversos tipos de células así como las
CHO, y la cantidad de expresión de los genes foráneos variaba en los
diversos tipos de células. En la presente descripción, se aclara
que el título de expresión y la frecuencia de expresión del gen
foráneo en la célula CHO transfectada aumentaban cuando se usa el
vector pMS-\beta-gal en un huésped
de célula CHO. Por tanto, se sometió a prueba si el vector de la
presente descripción puede aplicarse a células animales cuyo origen
y morfología son distintos de los de las células CHO.
Después de cotransfectar respectivamente el
vector pSV-\beta-gal y el vector
pMS-\beta-gal en una célula de
riñón de cría de hámster (BHK), una célula de fibroblasto de ratón
(NIH3T3) y una célula de riñón embrionario humano (KEK293) con un
vector pSV2neo, y de cultivarlos en medios que incluían G418 durante
aproximadamente 14 días, se midieron la frecuencia de la célula
positiva que expresaba \beta-Gal y el título de
expresión en transfectantes estables para cada vector de la misma
manera que en (2).
La figura 8 muestra el título de expresión del
pMS-\beta-gal en diversas líneas
celulares. Cuando se usa BHK para una línea de células huésped, la
expresión génica es similar a la de en una línea de células CHO.
Cuando se usa NIH 3T3 para una línea de células huésped, el efecto
sobre el aumento de la cantidad de expresión era bajo. Cuando se
usa HEK 293 para una célula huésped, el efecto y la cantidad de
expresión eran similares a los del control. La frecuencia de los
clones positivos era similar a la mencionada anteriormente. Por
tanto, los efectos de los vectores de expresión de la presente
descripción varían con el tipo de células, y en particular, son
útiles para células CHO, BHK y NIH 3T3 que se usan generalmente en
la expresión de células animales.
\vskip1.000000\baselineskip
En el sistema de vector de expresión
convencional, los clones de alta expresión deben seleccionarse a
través de procesos tediosos para aislar tantos como sean posibles
en transfectantes primarios combinados, y para cultivar estos
clones durante un tiempo prolongado para aumentar el nivel de
expresión de los genes foráneos. Con el fin de superar estos
problemas y maximizar el nivel de expresión de los genes foráneos,
se estableció el sistema de amplificación DHFR/MTX sobre el sistema
de expresión que usa la línea de células CHO DG44.
El vector
pMS-\beta-gal se transfectó en la
línea celular DHFR-CHO DG44 (denominada a
continuación en el presente documento "CHO DG44"), se
adaptaron los transfectantes del vector
pMS-\beta-gal a MTX y entonces se
midió la cantidad de expresión de las proteínas. El vector
pMS-\beta-gal y el control (el
vector pSV-\beta-gal) se
cotransfectaron respectivamente en CHO DG44 que tenía carencia de
genes DHFR con el vector pDCH1 P que tenía los genes DHFR. Se
cultivaron las cepas celulares transfectadas con DHFR en medios
selectivos, medio MEM-a que carece de nucleósidos
complementado con FBS al 10% dializado inactivado con calor. Se
generaron transfectantes de DHFR^{+} estables tras
aproximadamente 2 semanas y se aislaron los clones positivos que
expresan \beta-Gal en transfectantes de DHFR^{+}
estables mediante tinción con \beta-Gal. Para la
tinción con \beta-Gal para seleccionar clones
positivos que expresan \beta-Gal en transfectantes
de DHFR^{+}, se fijaron las células mediante incubación en PBS
que contenía formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% a 4ºC
durante 10 minutos, se lavaron dos veces con PBS y se trataron con
X-Gal. Cuando se expresa la
\beta-Gal, las células aparecen azules puesto que
se generan productos azules debido a la descomposición de
X-Gal por la proteína \beta-Gal.
Se trataron los clones seleccionados en múltiples incrementos
graduales de concentración de MTX tal como 10 nM, 20 nM, 50 nM, 100
nM, 400 nM y 1 \muM. Les llevó a los clones aproximadamente de 2
a 3 semanas adaptarse a cada concentración de MTX cultivada. Se
analizó la cantidad de expresión de b-Gal durante la
amplificación génica mediante la adaptación de MTX con el ELISA
convencional.
La figura 9 muestra la cantidad de expresión de
las proteínas recombinantes en células transfectadas con
pMS-b-gal y el control,
respectivamente, y adaptadas a una concentración de MTX de 1 \muM.
Se ha informado de que cuando se amplificó la expresión de las
proteínas recombinantes mediante el sistema de amplificación
DHFR.MTX en la línea de células CHO, el nivel de expresión era de
hasta aproximadamente 10 \mug/10^{6} células/día que
corresponde al 2,5% de las proteínas totales (Kaufman, 1997, Methods
Mol Biol 62, 287-300). Se observa que se amplifican
aproximadamente de 100 a 1000 números de copias mediante el aumento
gradual de la cantidad de MTX. Se midió la cantidad de expresión de
b-Gal en clones del vector
pMS-b-gal de control. La cantidad
de expresión de b-Gal en clones control varía con
cada clon. Si se considera que 20 \mug/10^{6} células es
industrialmente valioso en la producción de proteínas recombinantes
en células animales, el 25% de los clones de vector control
pertenecen a este valor, y el 88% de clones del vector
pMS-b-gal de la presente invención
produjeron la proteína recombinante por encima de 20 \mug/10^{6}
células. En comparación con las cepas celulares que tienen una
cantidad de expresión máxima, el
pMS-b-gal de la presente invención
tiene una gran cantidad de proteína de expresión, y pueden
producirse grandes cantidades de proteínas insertando un gen foráneo
en pMS (KCCM-10203). Por tanto, cuando se usa el
vector de expresión de la presente descripción para la expresión de
genes foráneos, da como resultado un alto rendimiento de expresión y
eficacia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó un vector pCMV con el fin de hacer
fácil la clonación de un promotor del CMV y un promotor de SV40 en
genes de scu-PA. Se realizó la PCR para obtener el
promotor del CMV, el sitio MCS y un sitio de terminación
transcripcional de pcCDNA 3.1 (+) (un producto de Invitrogen Co.).
Un cebador sentido para PCR es CMVL1 (SEC ID NO. 11) y un cebador
antisentido es PAR1 (SEC ID NO. 12). El cebador CMVL1 tiene sitios
SacII, ClaI, NruI, y el cebador PAR1 tiene el sitio BsmI. Después
de digerir un producto de 1,4 kb de PCR con SacII y BsmI, se ligó
con pSV-b-gal versión I recombinante
linealizado con el fin de preparar pCMV.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de preparar un vector de expresión
recombinante para la expresión de scu-PA en una
célula animal, se obtienen genes de scu-PA mediante
PCR del ADN genómico separado de una cepa de células CHO que tiene
genes de scu-PA que se originan a partir de una
cepa de células TCL-598 humanas como molde. Un
cebador sentido PKL1 se presenta como SEC ID NO. 13, y un cebador
antisentido PKR1 se presenta como SEC ID NO. 14. El cebador PKL1
tiene el sitio de restricción HindIII y el cebador PKR1 tiene el
sitio de restricción SmaI.
Aproximadamente 1,3 kb de producto de PCR de
scu-PA producido a partir de los cebadores (un
fragmento de ADN que tiene de una base n.º 6 a una base n.º 1293 de
una scu-PA humana) se cortaron mediante SmaI y
HindIII, y se insertaron en un plásmido, pCMV que se corta mediante
HindIII y EcoRV con el fin de preparar un vector de expresión
pCPUK.
Además, se trató el vector
pSV-b-gal versión I recombinante con
SmaI y HindII con el fin de separar un fragmento que tiene el
promotor de SV40 del mismo. Este fragmento se insertó en y se unió
con un pCPUK de control que se linealizó mediante NruI y HindIII con
el fin de preparar un vector de expresión pSPUK.
Se trató pCPUK con SacII y NruI con el fin de
insertar el elemento MAR en el mismo. El pCPUK linealizado se
insertó en y se unió con un elemento MAR de
\beta-globina que se preparó tratando el vector
pMS-\beta-gal con SmaI y SacII,
con el fin de preparar un vector pMCPUK.
Se trató el vector pSPUK con StuI y SacII con el
fin de insertar un elemento MAR de \beta-globina
en el mismo. Se insertó un elemento MAR de
\beta-globina, que se produjo tratando el vector
pMS-\beta-gal con SuI y SacII, en
el vector pSPUK y se preparó el vector pMSPUK.
En resumen, el constructo del vector pSPUK era
la forma producida insertando el gen de scu-PA en el
vector recombinante, pSV-\beta-gal
versión I del cual se retiró el gen de \beta-Gal,
y se insertó la secuencia complementaria de MAR de
\beta-globina en el vector pSPUK con el fin de
preparar el vector pMSPUK. Un constructo del vector pCPUK era la
forma producida insertando scu-PA en el vector pCMV,
y se insertó la secuencia complementaria de MAR de
\beta-globina en el pCPUK con el fin de preparar
un vector pMCPUK.
\vskip1.000000\baselineskip
Se introdujeron respectivamente cuatro tipos de
plásmido de expresión recombinante, es decir pSPUK, pMSPUK, pCPUK y
pMCPUK, en la célula DHFR-CHO (CHO DG44) con el fin
de obtener una línea celular lo suficientemente estable para
expresar scu-PA. Se colocaron en una placa de 6
pocillos 2 x 10^{5} células CHO y se incubaron en una incubadora
con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas. Se mezclaron
respectivamente 1 \mug de los plásmidos de pSPUK, pMSPUK, pCPUK y
pMCPUK y 10 ng de minigén de DHFR en una proporción de 100:1, y se
transfectó la mezcla en la célula CHO en el procedimiento de
lipofectamina, (GiboBRL) o DOSPER (Loche). Tras 6 horas, se
sustituyó el medio con medio de cultivo fresco y se incubaron
adicionalmente las células durante 48 horas. Se subcultivaron las
células en el medio con respecto a medio selectivo en una proporción
de 10:1 durante aproximadamente 2 semanas o más y se cambió el
medio cada aproximadamente cuatro o cinco días con el fin de formar
una colonia celular. Se cultivó la colonia celular junta o por
separado.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad amidolítica del medio de cultivo de
células, que se midió mediante el uso de S-2444 como
sustrato, y su resultado se compararon con la actividad uroquinasa
de referencia. Se colocaron en una placa de 6 pocillos 1 x10^{6}
células con 2 ml de la disolución de cultivo y se cultivaron en una
incubadora con CO_{2} al 5% a 37ºC durante 17 horas. Con el fin
de medir la actividad del sobrenadante, se colocaron en una placa de
96 pocillos 50 \mul del sobrenadante diluido en serie y se
mezclaron con 30 \mul de disolución tampón (Tris/HCl 50 mM (pH
8,8), NaCl 80 mM, Twin 80 al 0,02%). Se mezclaron adicionalmente 10
\mul de plasmina (0,5 U/ml) a la mezcla y se hizo reaccionar la
mezcla a 37ºC durante 20 minutos con el fin de activar la
scu-PA recombinante. Se añadieron 10 \mul de
aprotinina (100 KIU/ml) a la mezcla con el fin de inhibir la
actividad de plasmina y se añadieron adicionalmente 100 \mul de
disolución de sustrato cromogénico (una mezcla de la disolución
tampón y S-2444 6 mM) a la mezcla y se hizo
reaccionar a 37ºC durante 1 hora. Se midieron la actividad y la
concentración de scu-PA en el medio de cultivo
mediante la medición de absorbancia (densidad óptica) a 405 nm de
la disolución resultante con un lector de microplacas y se
compararon los resultados con los de uroquinasa como referencia.
La figura 10 muestra el título de expresión de
scu-PA según la transfección de pMSPUK, pMCPUK,
pSPUK y pCPUK en la célula CHO. El nivel de expresión de los
vectores pMS y pMC aumenta en 4 veces más que el de pSV y pCMV como
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras sintetizar la cadena sentido del sitio de
terminación de la transcripción de genes de la gastrina de SEC ID
NO. 15 y sintetizar la cadena antisentido de SEC ID NO. 16, se
hibridaron las dos. Se trató el fragmento de hibridación con BamHI
y PstI, y se integraron en y se unieron con el vector
pSV-\beta-gal linealizado (un
vector producido por Promega Co.) mediante la digestión con BamHI y
PstI en el extremo 3' del terminador de SV40 p(A), de modo
que se preparó pSG-\beta-gal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se contransfectó el vector
pSG-\beta-gal en una célula
Cos-7 con el vector pSV2neo mediante el uso de
DOSPER (Roche), con el fin de medir el título de expresión de
\beta-Gal.
La figura 12 muestra el título de expresión de
\beta-Gal en el vector
pSG-\beta-gal, y el vector
pSG-\beta-gal que comprende el
constructo constituido por la poli-A de SV40 y el
sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina
produce \beta-Gal en 4 veces más que la del vector
convencional que comprende poli-A de SV40. Por
tanto, puede producirse una gran cantidad de proteínas recombinantes
mediante la transfección de los genes foráneos clonados en el vector
pSG.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la figura 13, se preparó
un vector que contenía la secuencia complementaria de MAR de
\beta-globina y SPA-GTF mediante
la PCR. Con el fin de preparar el vector pMSG, se usaron
pMS-\beta-gal y
pSG-\beta-gal como moldes, se
realizó la PCR tres veces y se trataron los productos de PCR con una
enzima de restricción específica y se unieron entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron un cebador sentido ML1 (secuencia
número 17) y un cebador antisentido MR1 (secuencia número 18) para
la PCR. Tras tratar el producto de PCR con SacII y ClaI, se integró
con el vector pMS-\beta-gal
linealizado mediante la digestión con SacII y ClaI y se preparó el
vector pMS-\beta-gal/sc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron un cebador sentido TL1 (secuencia
número 19) y un cebador antisentido TR1 (secuencia número 20) en la
PCR para obtener el sitio de terminación de la transcripción del gen
de la gastrina del vector pSG. Se subclonó el producto de PCR con
pGEM-T (un producto de Promega Co.), que es una
clase de vector de clonación TA que puede clonar un producto de PCR
directamente, de modo que se preparó
pGEM-T/MCSp(A).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron un cebador sentido PL1 (secuencia
número 21) y un cebador antisentido PR1 (secuencia número 22) en la
PCR para obtener el promotor de SV 40 y el sitio de multiclonación
del vector de versión 1 de la figura 1. Se trató el producto de PCR
con ApaI y BgIII y entonces se integró con el vector
pGEM-T/MCSp(A) linealizado mediante la
digestión con ApaI y BgIII, de modo que se preparó el vector
pGEM-T/SVMCSp(A).
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató PGEM-T/SVMCSp(A)
del ejemplo 4 con ApaI y BamHI con el fin de purificar un fragmento
de ADN constituido por el promotor de SV40, sitios de
multiclonación y un sitio de terminación de SV40, y se integró el
fragmento purificado en el vector
pMS-\beta-gal/sc linealizado
mediante la digestión con ApaI y BamHI de \ding{192} en el
ejemplo 4, de modo que se preparó el vector pMS. Se trató el vector
pSG con BamHI y ScaI con el fin de separar 950 pb del fragmento de
ADN que tiene una secuencia de bases GTF, y se unió con el vector
pMS linealizado mediante la digestión con BamHI y ScaI, de modo que
se preparó un vector pMSG.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la PCR para el gen de
TFG-\beta SRII (receptor II soluble de
TGF-\beta, proteína de glicosilación) con un
cebador sentido TRI (SEC ID NO. 23) y un cebador antisentido TRR1
(SEC ID NO. 24) con el fin de verificar la eficacia de expresión
del vector pMSG en una línea de células huésped CHO y la aplicación
industrial del vector pMSG. Se insertó el producto de PCR,
TGF-\beta SRII amplificado, en vectores pMSG y pSV
en el sitio NheI y XhoI, y cada vector resultante se cotransfectó
en células CHO DG44 con pDCH1P que tenía genes de DHFR. Se
cultivaron en medios selectivos, en los que sólo se pudo hacer
crecer la cepa celular que tenía genes de DHFR. Se generaron
transfectantes de DHFR^{+} estables tras aproximadamente 2
semanas, se aislaron veinte clones de DHFR^{+} y se analizaron
estos clones mediante inmunotransferencia de tipo Western con el fin
de medir la cantidad de TGF-\beta SRII y encontrar
sus características.
La figura 14 muestra la inmunotransferencia de
tipo Western que indica la expresión de TGF-\beta
SRII, en la que "a" es el TGF-\beta SRII
expresado a partir de clones del vector pSV y "b" es el
TGF-\beta SRII expresado a partir de clones del
vector pMSG. En el caso de clones del vector control, se detectó la
expresión de TGF-\beta SRII en un clon entre 25
clones. Mientras que en 23 clones entre 27 clones se detectó la
expresión de TGF-\beta SRII, además muchos más
clones expresaron TFG-\beta a altos niveles.
Además, cuando se expresó TGF-\beta SRII mediante
el vector de expresión pMSG, tenía una estructura de glicosilación,
de modo que aumentó su peso molecular como la glicoproteína de una
célula animal típica. El nivel de expresión promedio de estos
clones primarios del vector pMSG es de aproximadamente 100
ng/10^{6} células/día.
Se adaptaron los clones primarios estables del
vector pMSG/TGF-\beta SRII de la presente
invención a un sistema de amplificación de DHFR/MTX mediante el
tratamiento en múltiples incrementos graduales de cantidad de MTX
tal como 10 nM, 40 nM, 200 nM y 1 \muM, con el fin de aumentar la
cantidad de expresión de TGF-\beta SRII.
La figura 15 muestra una cantidad de expresión
de TGF-\beta SRII que se produce clonando
TGF-\beta SRII en el vector pMSG, transfectándolo
en una célula CHO y adaptándolo a una concentración de MTX de 1
\muM. En los clones del vector control, muchos clones no se
adaptan a cada concentración de MTX durante el proceso de
amplificación génica mediante el tratamiento con MTX, mientras que
los clones del vector pMSG/TGF-\beta SRII se
adaptan bien, en comparación con los clones del vector control. Se
supone que el elemento MAR del vector de expresión pMSG aumenta la
cantidad de expresión de los genes de DHFR así como los genes
foráneos. Tal como se muestra en la figura 15, cuando se adaptó una
concentración de MTX de 1 \muM, se obtuvieron muchos clones del
vector pMSG que producían TGF-\beta en
aproximadamente 10 \mug/10^{6} células/día.
Se ha informado de que
TGF-\beta, un potente regulador del crecimiento y
la diferenciación celular, es fundamental para la respuesta a
daños. En varios epitelios, el daño repetido o prolongado conduce a
fibrosis progresiva y en última instancia al desarrollo de la
cicatrización excesiva no deseada. Además,
TFG-\beta da como resultado a enfermedades tales
como cuerpos glomerulares, esclerosis del riñón, cirrosis hepática,
cornificación de células epidérmicas y un cartílago inflamatorio.
TFG-\beta SRII actúa como antagonista de
TFG-\beta. Por tanto, TGF-\beta
está prohibido mediante el tratamiento de
TGF-\beta SRII como tratamiento médico. El
TGF-\beta SRII expresado a partir de una línea de
células CHO tiene un efecto de tratamiento excelente en comparación
con las proteínas que se expresan a partir de un procariota tal como
E. coli, o Pichia pastoris, y el vector de expresión
de la presente descripción, que tiene un título de expresión de los
genes foráneos mejorado, puede usarse en células animales.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Mogam Biotechnology Research
Institute
\hskip1cmPan-Gen Biotech Laboratories Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vector de expresión para célula
animal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> opp010629kr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150>
KR10-2000-43996
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-7-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6287
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del vector pMS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ..(419)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Virus SV40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3305)..(6269)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Elemento MAR de
beta-globina humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gastrina que se digiere
con enzima de restricción HindIII, que contiene la señal de
poli-A, el código de terminación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (256)..(435)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del
virus SV 40 y sitio de terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(214)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del
virus SV40 e inversa de señal de poli-A de la
gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(137)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (138)..(221)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del
virus SV40 y señal de poli-A de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(217)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de poli-A del
virus SV40 y señal de poli-A de la gastrina
mínima
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poli-A
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(135)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(217)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(419)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del vector pMSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(419)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (449)..(656)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3365)..(6329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Elemento MAR de
beta-globina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1272)..(2132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
beta-galactosidasa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BML1 para el elemento de la
región de unión a la matriz nuclear de beta-globina
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador BMR1 para el elemento de la
región de unión a la matriz nuclear de beta-globina
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CMVL1 para el vector
pcCNA3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PAR1 para el vector
pcCDNA3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PKL1 para el gen de
scu-PA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PKR1 del gen de
asc-PA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia sentido del sitio de
terminación de la gastrina usada en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia sentido del sitio de
terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido del sitio de
germinación de la gastrina usada en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia antisentido del sitio de
terminación de la gastrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ML1 para amplificar el
elemento MAR de beta-globina humana en el vector
pMS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MR1 para amplificar el
elemento MAR de beta-globina humana en el vector
pMS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TL1 del sitio de terminación
de la gastrina en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TR1 del sitio de terminación
de la gastrina en el vector pSG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PL1 para fusionar el
promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PR1 para fusionar el
promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TRI del receptor II soluble
de TGF-beta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador TRRI del receptor II soluble
de TGF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (12)
1. Un vector de expresión para una célula animal
seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una
NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del
grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del
CMV, y el complemento de un elemento MAR de
\beta-globina que está ubicado en el extremo
5'-terminal del promotor.
2. El vector de expresión según la
reivindicación 1, en el que el vector de expresión es pMS de la SEC
ID NO.1.
3. El vector de expresión según la
reivindicación 1, que comprende el promotor del CMV y el complemento
del elemento MAR de \beta-globina ubicado en el
extremo 5'-terminal del promotor.
4. El vector de expresión según la
reivindicación 1, que comprende además la secuencia de SEC ID NO. 3
como terminador.
5. El vector de expresión según la
reivindicación 4, en el que el vector de expresión es el vector pMSG
de la SEC ID NO. 8.
6. Un procedimiento de preparación de materiales
bioactivos en una célula animal seleccionada del grupo constituido
por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, usando el vector de
expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el material bioactivo es TGF-\beta
SRII.
8. Un procedimiento para aumentar una expresión
génica en una célula animal seleccionada del grupo constituido por
una célula CHO, una BHK, una NIH3T3, usando el vector de expresión
según la reivindicación 1.
9. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el vector de expresión es pMS de la SEC ID NO. 1.
10. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el vector de expresión comprende el promotor del CMV y el
complemento del elemento MAR de \beta-globina
ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.
11. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el vector de expresión comprende además la secuencia de
SEC ID NO. 3 como terminador.
12. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el vector de expresión es el vector pMSG de la SEC ID NO.
8.
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