본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 발현벡터로 형질전환된 동물세포에, 하기 a) 내지 d)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 과발현시켜, 발현하는 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:
d) 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8의 위치화 도메인 단편.
본 발명은 당쇄 공학을 이용하여 항체의 Fc 영역인 297번 아스파라긴의 N-아세틸글루코사민(N-acethyl glucosamine) 당쇄구조의 중심(core)에 결합하는 알파-1,6-푸코스(fucose)를 해리시키는 푸코시데이즈(fucosidase) 및/또는 알파-1,6-푸코스 합성에 관련된 효소인 푸코실트랜스퍼레이즈(alpha-1,6-fucosyltransferase)의 골지로의 이동 및 유지에 관련된 부분을 이용하여 항체 생산용 동물세포를 변형시키거나 기존의 항체생산 동물세포주를 변형시키고, 이 세포주들을 이용하여 생산된 치료용 항체의 푸코스 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 "발현벡터"는 상기 동물세포에서 a) 내지 d)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 과발현시킨 이후에 동물세포로 도입될 수 있다.
본 발명에서 "재조합 단백질"이라 함은 알파-1,6-푸코스를 가지는 당단백질인 것이 바람직하고, 상기 알파-1,6-푸코스는 당단백질의 탄수화물의 N-아세틸글루코사민 환원당 말단에 존재하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 재조합 단백질은 항체를 포함할 수 있으며, 상기 항체는 인간 IgG로 인간의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이고, 키메라(chimeric), 인간화(humanized) 또는 인간(human) 항체일 수 있다.
본 발명에서 "동물세포"는 이에 제한되는 것은 아니나, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 랫트 골수종 세포(rat myeloma cell), BHK(Baby hamster kidney) 세포, 하이브리도마 세포(hybridoma cell), Namalwa 세포, 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 수정란 세포(fertilized egg cell)가 사용될 수 있으며, 기타 항체를 포함한 당단백질의 생산이 가능한 동물세포주가 사용될 수 있다.
본 발명에서 "FUCA1" 및 "FUCA2"는 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 말한다.
본 발명에서 "FUCA1 변이체"라 함은 서열번호: 6의 아미노산 서열로 표시되는 FUCA1의 263번째 아스파라긴을 발린을 포함한 다른 아미노산으로 치환시킨 것을 의미한다.
본 발명에서 "FUT8의 위치화 도메인 단편"은, 세포주 내에 있는 본래의 FUT8 유전자에서 활성 도메인(catalytic domain) 부분을 잘라낸 후 이를 과발현시켜 FUT8이 골지체에서 유지되는 것을 방해하거나 혹은 부적합한 이합체를 유도하여 FUT8의 활성을 억제하여 재조합 단백질로 항체를 발현시키는 경우 항체 Fc 영역의 당쇄에 결합하는 푸코스 함량을 감소시킬 수 있다. FUT8의 위치화 도메인 단편은 FUT8의 골지체로의 위치(localization) 및 보존(retention)에 관여하는 부위인 세포질꼬리(cytoplasmic tail; CT), 막통과 도메인(transmembrane domain; TM) 또는 줄기부위(stem region; stem)가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 FUT8 위치화 도메인 단편은, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8에서 1 내지 n번째 아미노산 서열로 이루어진 단편으로서 상기 n은 30 내지 200의 정수이다. 바람직하게는, FUT8 위치화 도메인 단편으로 상기 n이 30인 서열번호: 2의 단편(FUT8에서 CT 및 TM 포함), n이 101인 서열번호: 3의 단편(FUT8에서 CT, TM 및 Stem 일부 포함) n이 125인 서열번호: 4의 단편(FUT8에서 CT, TM 및 Stem 일부 포함) 및 n이 200인 서열번호: 5의 단편(FUT8에서 CT, TM 및 Stem 일부 포함)이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 발현벡터로 형질전환된 동물세포에, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼레이즈(FUT8)의 위치화 도메인 단편과 하기 a) 내지 c)로 기재되는 단백질 중 어느 하나의 단백질을 융합시킨 융합 단백질을 과발현시켜, 발현되는 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:
c) 상기 FUCA1 단편의 아미노산 서열 중 아스파라긴을 다른 아미노산으로 치환시킨 FUCA1 단편 변이체.
본 발명의 방법에서 "발현벡터"는 상기 동물세포에서 a) 내지 c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 과발현시킨 이후에 동물세포로 도입될 수 있다.
본 발명에서 "FUCA1 단편" 및 "FUCA2 단편"이라 함은, 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 7로 표시되는 FUCA1과 FUCA2에서 시그날 시퀀스(signal sequence)에 해당하는 부분을 제거한 단편을 의미한다.
본 발명에서 "FUCA1 단편 변이체"라 함은 FUCA1 단편에서 아미노산 서열 중 아스파라긴을 발린을 포함한 다른 아미노산으로 치환시킨 FUCA1 단편을 의미한다. 본 발명의 한 실시양태에서 FUCA1 단편 변이체는 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 263번째 아스파라긴이 발린으로 치환되고, 1 내지 26번째 아미노산 서열이 제거된 것으로서, 이는 푸코시데이즈가 리소좀(lysosome)으로 타겟팅되는 것을 억제하여 골지체 등 다른 세포 내 부위로 이동하게 할 것으로 예상한다.
본 발명에서 융합 단백질은 구체적으로, FUCA1, FUCA2 또는 FUCA1 변이체에서 각각 그의 시그날 시퀀스를 제외한 나머지 푸코시데이즈 효소활성을 갖는 활성 도메인들과 앞서 설명한 FUT8 위치화 도메인 단편을 융합시킨 단백질이다. 구체적인 예로서, 서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편과 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 1 내지 26번째 아미노산 서열이 제거된 FUCA1 단편의 융합 단백질, 서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편과 서열번호: 7에서 1 내지 28번째 아미노산 서열이 제거된 FUCA2 단편의 융합 단백질, 서열번호: 2의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편과 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 263번째 아스파라긴이 발린으로 치환되고, 1 내지 26번째 아미노산 서열이 제거된 FUCA1 단편 변이체의 융합 단백질 및 서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편과 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 263번째 아스파라긴이 발린으로 치환되고, 1 내지 26번째 아미노산 서열이 제거된 FUCA1 단편 변이체의 융합 단백질이 바람직하다.
상기 재조합 단백질, 동물세포 및 FUT8 위치화 도메인 단편은, 앞서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 방법은 상기 재조합 단백질을 발현하는 발현벡터로 형질전환된 동물세포에서의 융합 단백질의 발현이, 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 상기 동물세포에 도입함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에서 당쇄 변형을 위해 사용한 FUT8 및 FUT8 위치화 도메인 단편; FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체; 및 본 발명의 융합 단백질의 유전자 구조를 도 1에 나타내었다.
본 발명에서 "재조합 단백질"은 알파-1,6-푸코스를 가지는 당단백질인 것이 바람직하고, 대표적으로 항체인 것이 바람직하다. 상기 알파-1,6-푸코스는 당단백질의 탄수화물의 N-아세틸글루코사민 환원당 말단에 존재하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따라 재조합 단백질로 항체를 발현시키는 경우 항체 불변영역(Fc region)의 푸코스 함량을 감소시킬 수 있어 항체의 치료 효능을 증진시킬 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체 제작
FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체를 제작하기 위하여 인간 간의 전체 RNA(Clontech, cat.636531, lot.5070344)를 이용하여 RT-PCR 방법을 통해 제작하여 NheI(NEB,131L)/XhoI(NEB,146L) 제한효소 부위를 이용하여 pcDNA3.1 B(-)Myc-His (Invitrogen, INV-V855-20, 미국; 이하 pcDNA라고 함) 벡터에 클로닝하였다.
구체적으로는 인간 간의 전체 RNA로부터 superscript first-strand synthesis kit(Invitrogen, 11904-018)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 프라이머를 이용하여 FUCA1의 전체서열을 얻었고, 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 프라이머을 이용하여 FUCA2의 전체서열을 얻었다. pcDNA와 FUCA1 및 FUCA2 전체서열에 NheI/XhoI 제한효소를 처리하고, DNA 접합 키트(TAKARA, 6023)를 이용하여 pcDNA (Invitrogen)와 FUCA1 및 FUCA2를 결합한 후, 대장균(DH5a) 세포주를 이용하여 형질전환(transformation)을 시키고 FUCA1 및 FUCA2 서열을 확인하여 pcDNA-FUCA1 및 pcDNA-FUCA2를 얻었다.
FUCA1 변이체는 263번 아미노산인 아스파라긴이 발린으로 치환된 것으로, 서열번호: 8과 서열번호: 12의 프라이머를 이용하여 앞조각(5' fragment)을 얻고, 서열번호: 9와 서열번호: 13의 프라이머를 이용하여 뒷조각(3' fragment)을 얻은 후, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 프라이머를 이용한 오버랩 중합반응(overlap PCR)하여 FUCA1 변이체를 제작하고, pcDNA-FUCA1의 제조방법과 같이 NheI/XhoI 제한효소를 이용하여 pcDNA 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 pcDNA-FUCA1NV를 제작하였다.
상기에서 얻어진 pcDNA-FUCA1, pcDNA-FUCA2 및 pcDNA-FUCA1NV는 Endofree plasmid maxi kit(Quigen,12362)를 이용하여 플라스미드 DNA를 확보하였다.
실시예 2: FUT8 위치화 도메인 단편의 제작
FUT8은 인간 간의 전체 RNA로부터 RT-PCR 방법을 통해 제작하여 NheI/XhoI 제한효소 site를 이용하여 pcDNA 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다.
구체적으로는 인간 간의 전체 RNA로부터 superscript first-strand synthesis system을 이용하여 cDNA를 합성하였고, 이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여 서열번호: 14 및 서열번호: 15의 프라이머를 이용하여 FUT8 전체 서열을 얻었다. pcDNA와 FUT8 전체서열에 NheI/XhoI을 처리하고, DNA ligation kit를 이용하여 pcDNA와 FUT8을 결합한 후, 대장균(DH5a) 세포주를 이용하여 형질전환시키고 FUT8 서열을 확인하여 pcDNA-FUT8을 얻었고, Endofree plasmid maxi kit를 이용하여 플라스미드 DNA를 확보하였다.
FUT8의 위치화 도메인 단편은 상기에서 얻어진 pcDNA-FUT8 벡터를 주형으로 하고, FUT8의 1 내지 30의 아미노산 서열을 갖는 단편(CT/TM; 서열번호: 2), FUT8의 1 내지 125의 아미노산 서열을 갖는 단편(stem1; 서열번호: 4) 및 FUT8의 1 내지 200의 아미노산 서열을 갖는 단편(stem2; 서열번호: 5)가 되도록 각각 서열번호: 14, 서열번호: 16, 서열번호: 17 및 서열번호: 18의 프라이머를 이용하여 얻었다. 그리고 상기와 같은 방법으로 pcDNA 벡터에 클로닝하여 pcDNA-FUT8-CT/TM, pcDNA-FUT8-stem1 및 pcDNA-FUT8-stem2를 얻었다.
실시예 3: FUT8의 위치화 도메인 단편과 FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체의 활성 도메인을 각각 결합한 형태의 융합 단백질 제작
FUT8의 위치화 도메인과 FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체의 활성 도메인(시그날 시퀀스가 제거된 FUCA1 및 FUCA2)을 각각 결합시킨 형태의 융합 단백질 제작은 FUT8의 위치화 도메인 단편과 FUCA1 단편, FUCA2 단편 및 FUCA1 단편 변이체를 오버랩 중합반응하여 제작하였다.
구체적으로는, 서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편(FUT8 서열에서 1-101 아미노산으로 이루어진 단편)과 FUCA1 단편(FUCA1의 아미노산 서열에서 1-26의 시그날 시퀀스가 제거된 27-461 아미노산으로 이루어진 단편)의 융합 단백질(이하 FLD-FUCA1)은 pcDNA-FUT8 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 14와 서열번호: 19의 프라이머를 이용하여 앞조각을 얻었고, pcDNA-FUCA1 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 9와 서열번호: 20의 프라이머를 이용하여 뒷조각을 얻었고, 서열번호: 14와 서열번호: 9의 프라이머를 이용한 오버랩 중합반응으로 FLD-FUCA1을 얻었고, NheI/XhoI 제한효소를 이용하여 pcDNA 벡터에 클로닝하여 pcDNA-FLD-FUCA1을 얻었다.
서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편(FUT8 서열에서 1-101 아미노산으로 이루어진 단편)과 FUCA2 단편(FUCA2의 아미노산 서열에서 1-28의 시그날 시퀀스가 제거된 29-467 아미노산으로 이루어진 단편)의 융합 단백질(이하 FLD-FUCA2)은 pcDNA-FUT8 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 14와 서열번호: 21의 프라이머를 이용하여 앞조각을 얻었고, pcDNA-FUCA2 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 11과 서열번호: 22의 프라이머를 이용하여 뒷조각을 얻었고, 서열번호: 14와 서열번호: 11을 이용한 오버랩 중합반응으로 FLD-FUCA2을 얻었고, NheI/XhoI 제한효소를 이용하여 pcDNA 벡터에 클로닝하여 pcDNA-FLD-FUCA2을 얻었다.
서열번호: 2의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편(FUT8 서열에서 1-30 아미노산으로 이루어진 단편) 및 서열번호: 3의 아미노산 서열로 표시되는 FUT8 위치화 도메인 단편(FUT8 서열에서 1-101 아미노산으로 이루어진 단편);과 FUCA1 단편 변이체(FUCA1의 아미노산 서열에서 1-26의 시그날 시퀀스가 제거된 27-461 아미노산으로 이루어진 단편)와의 각각의 융합 단백질(이하 FLD1-FUCA1NV 및 FLD2-FUCA1NV)은 pcDNA-FUT8 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 14와 서열번호: 23 및 서열번호: 19의 프라이머를 이용하여 앞조각을 얻었고, pcDNA-FUCA1NV 벡터를 주형으로 하여, 서열번호: 9과 서열번호: 24 및 서열번호: 20의 프라이머를 이용하여 뒷조각을 얻었고, 서열번호: 14와 서열번호: 9를 이용한 오버랩 중합반응을 이용하여, FLD1-FUCA1NV 및 FLD2-FUCA1NV를 얻었고, NheI/XhoI 제한효소를 이용하여 pcDNA 벡터에 클로닝하여 pcDNA-FLD1-FUCA1NV, pcDNA-FLD2-FUCA1NV을 얻었다.
상기에서 얻어진 pcDNA-FLD-FUCA1, pcDNA-FLD-FUCA2, pcDNA-FLD1-FUCA1NV 및 pcDNA-FLD2-FUCA1NV의 플라스미드 DNA는 Endofree plasmid maxi kit(Quigen,12362)를 이용하여 얻었다.
실시예 4: siRNA를 이용한 대조항체 발현 세포주 제작
치료용 항체를 발현하고 있는 세포주에 FUT8에 대한 siRNA를 이용하여 항체 Fc 영역 당쇄의 푸코스 함량이 감소된 대조항체를 발현하는 세포주를 제작하였다.
구체적으로는 먼저 pMSG 벡터 (대한민국 특허등록 제 408844호; KCCM 10202)에 대조항체로서 항 CD20 항체치료제인 리툭산(Rituxan)을 발현하는 유전자(미국특허 제 5736137호 참고)를 클로닝하고, 유전자의 증폭을 위하여 다이하이드로폴레이트 리덕테이즈(dihydrofolate reductase; DHFR)를 발현하는 pDCH1P 플라스미드(Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, New York, USA)와 함께, CHO-DG44(dhfr-)(Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, New York, USA), 세포에 형질전환하고 콜로니들을 얻은 후 DHFR 효소의 기질로 이용되는 폴레이트(folate)의 유사체(analog)인 메소트리제이트(methotrexate; MTX)를 1 uM 농도까지 점진적으로 늘려가면서 세포주를 적응시켜 항체유전자를 증폭시킴으로써 리툭산을 고발현하는 CHO-Rituxan 세포주를 제작하였다.
항체 Fc 영역의 당쇄구조에 푸코스가 감소된 대조항체 발현세포주 제작에 사 용된 siRNA는 기존에 알려진 두 가지의 siRNA 염기서열(Mori, K. et al., Biotechnology and Bioengineering, 88(7), 901-908, 2004)을 이용하였으며 그 방법은 다음과 같다. FUT8의 전체 염기서열 중 서열번호: 25의 염기서열로 표시되는 부분을 저해하는 B form(FUT8 siB)을 제작하기 위하여 서열번호: 26과 서열번호: 27의 프라이머를 이용하였고, FUT8의 전체 염기서열 중 서열번호: 28의 염기서열로 표시되는 부분을 저해하는 R form(FUT8 siR)을 제작하기 위하여 서열번호: 29과 서열번호: 30의 프라이머를 이용하였다. 각각 B form과 R form 제작용으로 만들어진 프라이머를 접합시키고, pSilencer 2.1-U6 hygro(Ambion, 5760) 벡터에 클로닝하고, 상기와 같은 방법으로 CHO-Rituxan 세포주에 형질전환하고, 하이그로마이신(hygromycin)을 선택표지로 하여 CHO-R-siB 및 CHO-R-siR의 세포주를 일차 선별하였고, LCA(biotilated-lens culinaris agglutinin; Vector Lab, B-1045(S0925))와 피코에리스린(Phycoerythrin; PE) 스트렙타비딘(Vector Lab, SA-5007(R1209))을 이용한 FACS(Fluorescence activated cell sorting) 분석을 실시하여 최종 세포주를 선별하였다.
실시예 5: 당쇄 변형 치료용 항체 발현세포주 제작
대조항체인 리툭산을 발현하는 CHO-Rituxan 세포주에 상기 실시예 1 내지 3에서 얻어진 당쇄 변형 유전자인 pcDNA-FUT8, pcDNA-FUT8-CT/TM, pcDNA-FUT8-stem1, pcDNA-FUT8-stem2, pcDNA-FUCA1, pcDNA-FUCA2, pcDNA-FUCA1NV, pcDNA-FLD-FUCA1, pcDNA-FLD-FUCA2, pcDNA-FLD1-FUCA1NV 및 pcDNA-FLD2-FUCA1NV를 지질인 리 포펙타민 2000(Invitrogen, 11668-019(1369361))을 이용하여 형질전환하고 네오마이신(neomycin)을 선택표지로 이용하여 재조합 세포주를 선별 및 제조하였으며, 제작된 세포주를 각각 CHO-R-FUT8, CHO-R-FUT8-CT/TM, CHO-R-FUT8-stem1, CHO-R-FUT8-stem2, CHO-R-FUCA1, CHO-R-FUCA2, CHO-R-FUCA1NV, CHO-R-FLD-FUCA1, CHO-R-FLD-FUCA2, CHO-R-FLD1-FUCA1NV 및 CHO-R-FLD2-FUCA1NV라고 명명하였다.
상기에서 제작된 당쇄 변형 세포주는 래빗 항-히스 항체(SantaCruz, His-probe(G-18) rabbit polyclonal, sc804(H3006)), 항-래빗 항체(KPL, Goat anti-rabbit IgG(H+L)-HRP, 074-1506)를 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)한 결과를 도 2a에 나타내고, RT-PCR한 결과를 도 2b에 나타내었다. 또한, LCA(Vector Lab, B-1045(S0925))와 피코에리스린 스트렙타비딘(Vector Lab, SA-5007(R1209))을 이용한 FACS 분석을 통하여 후보 세포주들로부터 선별하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이, CHO-Rituxan 세포주에 비해서 후보 세포주들은 LCA에 대한 친화력이 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 후보 세포주와 CHO-Rituxan 세포주의 FACS 평균값(mean value)을 비교한 결과 그 값이 CHO-R-siRNA:0.17, CHO-R-FUCA1:0.93, CHO-R-FUCA2:0.79, CHO-R-FUT8:0.87, CHO-R-FUCA1NV:0.65, CHO-R-FLD-FUCA2:0.74, CHO-R-FLD1FUCA1NV:0.79, CHO-R-FLD2-FUCA1NV:0.80, CHO-R-FUT8-CT/TM:0.80, CHO-R-FUT8-stem1:0.79 및 CHO-R-stem2:0.73으로, 10~35% 가량 감소되었음을 알 수 있었다.
상기의 결과를 통하여 FUT8의 위치화 도메인, FUCA1, FUCA2 및 FUCA1 변이체가 세포주의 당쇄 구조 중 푸코스 함량을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, FUT8의 위치화 도메인 단편과; FUCA1 단편, FUCA2 단편 또는 FUCA1 단편 변이체와의 융합 단백질이 세포주의 당쇄 구조 중 푸코스 함량을 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 당쇄 변형 치료용 항체의 당쇄 분석
당쇄 변형 치료용 항체 생산세포주에서 생산된 항체를 정제하여, BIO-LC system(DC ICS 3000 system, DIONEX, 06110276)를 이용한 단당 분석을 이용하여 항체 Fc 영역의 당쇄를 분석하였다.
구체적으로 당쇄 변형 치료용 항체 생산세포주의 배양액을 Protein G Sepharose(Amersham, 17-0618-01) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 20mM 나트륨 인산 버퍼(pH 7.0)를 결합 완충액으로 사용하였고, 0.5M 글라이신(pH 2.7)을 희석 완충액으로 사용하였으며, 1M Tris-HCl pH 9.0을 중화 완충액으로 사용하였고, 정제된 항체는 은염색(silver staining)을 이용하여 순도를 확인하였다.
정제된 항체는 우선 4M TFA(Trifluoroacetic acid)를 이용하여 100℃에서 4시간동안 가열하여 단당을 분리하였고, 진공건조기(vacuum dryer)를 이용하여 여액을 제거한 후 증류수(Deionized water)에 녹여서 BIO-LC system을 이용하여 측정하였다. 측정시에는 ED detector(DIONEX, 06110046)를 이용하였고, 보호 컬럼(guard column)은 아미노 트랩 컬럼(DIONEX, 046122)을 사용하였고, 분석 컬럼은 CarboPac PA 10 column(DIONEX, 046110)을 이용하였다.
각각의 샘플은 25ul씩 분석에 사용을 하였으며, 용출액(eluent)은 탈이온 수(DI water)와 200mM NaOH(Fisher, SS254-1)를 이용하였다. 기본적인 분석 조건 및 시간에 따른 용출액의 농도 변화를 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
분석 조건 |
샘플량 |
25ul |
분석컬럼 |
CarboPac PA 10 (4x250mm) |
보호컬럼 |
아미노-트랩 컬럼(4x50mm) or PA 10 |
ED detector |
적량 |
용출액 A |
탈이온수(DI water) |
용출액 B |
200mM NaOH |
시간에 따른 용출액의 농도 변화
시간(분) |
용출액 A의 농도(%) |
용출액 B의 농도(%) |
조건 |
0 |
91 |
9 |
18mM NaOH |
20 |
91 |
9 |
18mM NaOH |
20.1 |
0 |
100 |
세척 조건 |
25 |
0 |
100 |
세척 조건 |
25.1 |
91 |
9 |
최초 조건 |
30 |
91 |
9 |
최초 조건 |
분석은 당쇄의 뼈대구조인 4개의 N-아세틸글루코사민과 푸코스의 비율을 계산하는 방법으로 진행하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 후보 세포주(당쇄 변형 세포주)와 CHO-Rituxan 세포주의 푸코스/N-아세틸글루코사민의 값은 각각 CHO-Rituxan: 1.01, CHO-R-siRNA: 0.10, CHO-R-FUCA1: 0.88, CHO-R-FUCA2: 0.90, CHO-R-FUT8: 1.03, CHO-R-FUCA1NV: 0.75, CHO-R-FLD-FUCA1: 0.90, CHO-R-FLD-FUCA2: 0.82, CHO-R-FLD1-FUCA1NV: 0.79, CHO-R-FLD2-FUCA1NV: 0.75, CHO-R-CT/TM: 0.78, CHO-R-FUT8-stem1: 0.84 및 CHO-R-FUT8-stem2: 0.76으로, 약 10-25% 정도 푸코스 함량이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이 FUT8의 위치화 도메인 단편은 대략 15~25% 가량 Fc 영역의 당쇄의 푸코스 함량을 감소시키는 것을 보였다. 또한 FUCA1과 FUCA2의 경우에도 10% 내외의 푸코스 함량을 감소시키는 것을 보였지만, FUCA1의 위치관여 부위에 변형을 준 FUCA1NV의 경우 25% 정도로 푸코스 함량을 감소시킴으로써 그 효과가 증대되는 것을 보였다. 뿐만 아니라 FUT8의 위치화 도메인 단편과 FUCA1, FUCA2 또는 FUCA1 변이체의 활성 도메인과의 융합 단백질의 경우도 10~25% 정도로 푸코스 함량을 감소시키는 것을 보였다.
위의 결과를 통해 FUT8의 위치화 도메인 단편, FUCA1, FUCA2, FUCA1 변이체, 및 FUT8의 위치화 도메인 단편과 FUCA1, FUCA2 또는 FUCA1 변이체의 활성 도메인과의 융합 단백질을 과발현하는 항체 발현세포주를 이용함으로써 이 세포주들에서 얻어진 항체 Fc 영역의 당쇄 구조에서 푸코스 함량을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7: 당쇄 변형 치료용 항체 효능 분석
당쇄 변형 치료용 항체의 효능 분석은 보체 의존성 독성 (complement-dependent cytotoxicity, CDC)과 항체 Fc 영역 수용체와의 결합력 및 항체의존성 세포독성법(ADCC)을 이용하여 측정하였다.
구체적으로는 보체의존성 독성 실험은 CD20을 발현하고 있는 다우리(ATCC/CCL-213) 세포에 CHO-Rituxan, CHO-R-siRNA, CHO-R-FUT8-LD (CHO-R-FUT8-CT/TM 및 CHO-R-FUT8-stem1) 및 CHO-R-FUCA1NV 세포주로부터 정제한 항체와 인간혈청(Standard human plasma, DADE Behring)을 처리하고, WST-1 시약(Roche)을 처리한 후 450nm와 690nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 실시하였다(Hodoniczky J. et al., Biotechnology Progress, 21(6), 1644-1652, 2005). 도 5a에 나타난 바와 같이, 상기 5가지 세포주들 사이에는 보체의존성 독성에는 크게 차이가 없었다.
항체 Fc 영역 수용체와 항체와의 결합력 측정하기 위해서, 항체 Fc 영역 수용체(FcrRIIIa)는 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)로부터 RT-PCR을 이용하여 제작하였다(Clemenceau, B. et. al., Blood, 107(12), 4669-4677, 2006). 구체적으로 수용성 항체 Fc 영역 수용체(FcrRIIIa) 유전자(GenBank, X52645)를 클로닝하기 위하여 인간 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)로부터 전체 RNA를 분리하고 cDNA 합성 키트(Invitrogen, 18080-051)를 사용하여 RT-PCR하여 얻은 cDNA를 제조하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하여 서열번호: 31 및 서열번호: 32의 프라이머를 이용하여 PCR하여, 세포질 꼬리 부위(cytoplasmic tail domain)와 세포막 통과부위(Transmembrane domain)는 제거하고 5'쪽의 시그널 시퀀스와 세포외부위(Extracellular domain)에 6개의 히스티딘(His)을 덧붙인 FcrRIIIa-His을 얻고 이를 pMSG 벡터에 클로닝하고 pMSG-FcrRIIIa-his라고 명명하였다. 제작된 pMSG-FcrRIIIa-his 플라스미드를 리포펙타민 2000 (Invitrogen, 11668-019)을 이용하여 CHO 세포에 형질전환한 후, MTX 시스템을 통해 FcrRIIIa의 발현을 증폭하였고, 최종 선별된 CHO-FcrRIIIa-his 세포주를 200ml 배양해서 His column(Novagen)을 이용하여 항체 Fc 영역 수용체 단백질을 정제하였다. 항체 Fc 영역 수용체와 항체와의 결합력은 항-히스 모노클로날 항체(QIAGEN, anti-4X his antibody) 및 항-human F(ab)2-HRP(Jackson Lab, 309-036-006)를 이용한 ELISA법을 이용하여 측정하였다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 상기 5가지 세포주들 사이에서 항체농도 의존적으로 흡광도 값이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 당쇄 변형된 리툭산 항체가 리툭산 항체에 비하여 FcrRIIIa-His에 대한 결합력이 약 4배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
항체의존성 세포독성은 CD20를 발현하고 있는 Daudi(ATCC/CCL-213) 세포(1×10^4 cells/well)를 Cr-51을 처리하여 세포내부로 Cr-51이 들어가게 한 후, CHO-Rituxan, CHO-R-siRNA, CHO-R-FUT8-CT/TM, CHO-R-FUT8-stem1 및 CHO-R-FUCA1NV 세포주로부터 정제한 항체와 건강한 지원자들의 혈액으로부터 분리한 PBMC(4×105 cells)를 처리한 후, 사멸된 세포에서 나오는 Cr-51의 양을 감마 카운터에서 측정하였고, 하기 수학식을 이용하여 항체 의존성 세포독성을 정량하였다(Shinkawa, T. et al., Journal of Biological Chemistry, 278(5), 3466-3473, 2003).
도 5c에 나타난 바와 같이, 그 결과 당쇄 변형 세포주에서 생산된 항체는 당쇄 변형되지 않은 항체에 비해 2 내지 5배 정도 증가된 항체의존성 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.