KR101913440B1 - 개변 항체 조성물 - Google Patents

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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, 297번째의 Asn에 결합하는 당쇄는 항체의 활성이나 혈중 안정성에 관여하고 있지만, 297번째 이외의 여분의 당쇄는 항체 정상 영역을 통한 활성에 영향을 미칠 가능성이나 항체 의약품으로서의 균일성에 문제를 일으킬 가능성이 있다. 따라서, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 여분의 당쇄를 제어하는 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는, 적어도 하나의 아미노산 개변이 행해진 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편을 제공한다.

Description

개변 항체 조성물{MODIFIED ANTIBODY COMPOSITION}
본 발명은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 조성물, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 여분의 당쇄가 감소 또는 결손되고 또한 항체의 이펙터 활성이 유지된 개변 항체 조성물, 이 개변 항체 분자를 코드하는 DNA, 상기 개변 항체 조성물을 생산하는 세포, 상기 개변 항체 조성물을 제조하는 방법 및 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 여분의 당쇄를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
항체는 높은 결합 활성, 결합 특이성 및 혈중에서의 높은 안정성을 지니므로, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료약으로서의 응용이 시도되어 왔다(비특허문헌 1). 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 비인간 동물 항체로부터 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체가 제작되었다(비특허문헌 2∼5).
인간형 키메라 항체는, 항체 가변 영역이 인간 이외의 동물의 항체, 정상 영역이 인간 항체로 구성된다. 인간화 항체란, 인간 이외의 동물 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR, 이하 CDR이라 표기함)이 인간 항체의 CDR로 치환된 항체이다.
인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 높은 면역원성, 낮은 이펙터 기능, 짧은 혈중 반감기 등의 마우스 항체 등이 갖는 문제를 해결하여, 모노클로널 항체의 의약품으로서의 응용을 가능하게 했다(비특허문헌 6∼9). 이미 미국에서는 예컨대 암 치료용 항체로서 복수의 인간화 항체가 인가를 받아, 판매되고 있다(비특허문헌 10).
이들 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는 실제로 임상에 있어서 어느 정도의 효과를 보이고 있지만, 보다 효과가 높은 항체 의약이 요구되고 있는 것도 사실이다.
예컨대, CD20에 대한 인간형 키메라 항체인 Rituxan(등록상표)(비특허문헌 11)(IDEC사/Roche사/Genentech사)의 단독 투여에서는, 재발성 저악성도의 비호지킨림프종 환자에 대한 제III상 임상 시험에 있어서의 주효율(奏效率)은 48%(완전 관해 6%, 부분 관해 42%)에 지나지 않고, 또한, 평균적인 효과 지속 기간은 12개월이라고 보고되어 있다(비특허문헌 12).
또한, Rituxan(등록상표)과 화학 요법(CHOP : Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine)과의 병용에서는, 재발성 저악성도 및 여포성의 비호지킨림프종 환자에 대한 제II상 임상 시험에 있어서, 주효율은 95%(완전 관해 55%, 부분 관해 45%)로 보고되어 있지만, CHOP에 기인하는 부작용이 인정되고 있다(비특허문헌 13).
HER2에 대한 인간화 항체인 Herceptin(등록상표)(Genentech사)은, 단독 투여에서는, 전이성 유방암 환자에 대한 제III상 임상 시험에 있어서의 주효율은 불과 15%이며, 평균적인 효과 지속 기간은 9.1개월이라고 보고되어 있다(비특허문헌 14).
인간 항체 분자는 이뮤노글로불린(이하 Ig)이라고도 부르며, 그 분자 구조로 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 각 클래스로 분류된다.
항체 의약으로서 주로 이용되는 인간 IgG(이하 IgG라 부름)형의 항체 분자는 2 가닥씩의 중쇄(heavy chain, 이하 H쇄라 부름)와 경쇄(light chain, 이하 L쇄라 부름)라 불리는 폴리펩티드에 의해서 형성된다.
H쇄는 N 말단 측에서부터 H쇄 가변 영역(이하 VH라 표기함), CH1, 힌지(Hinge), CH2 및 CH3이라고 불리는 각 도메인 구조에 의해서 형성된다. CH1, 힌지, CH2 및 CH3은 합하여 중쇄 정상 영역(이하, CH라 표기함)이라고도 불리며, CH2 및 CH3은 합하여 Fc 영역이라고 불린다.
L쇄는 N 말단 측에서부터 L쇄 가변 영역(이하 VL이라 표기함), L쇄 정상 영역(이하 CL이라 표기함)이라고 불리는 각 도메인 구조에 의해서 형성된다.
IgG형 항체의 H쇄에는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4개의 서브클래스가 존재한다. 각 IgG 서브클래스의 H쇄는 서로 가변성이 풍부한 힌지를 제외한 정상 영역에 대해서 95% 정도의 아미노산 서열의 상동성을 갖는다.
각 IgG 서브클래스는 아미노산 서열의 상동성이 높음에도 불구하고, 이들이 갖는 생물 활성의 강약은 다르다(비특허문헌 15). 생물 활성으로서는, 보체 의존성 세포 상해 활성(complement-dependent cytotoxicity; CDC, 이하 CDC 활성이라 약기함), 항체 의존성 세포 상해 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC, 이하 ADCC 활성이라 약기함), 탐식 활성 등의 이펙터 기능을 들 수 있으며, 이들은 생체 내에서 이물이나 병원체 배제에 중요한 역할을 한다.
자연 살해 세포(이하 NK 세포라 표기함), 단구, 대식세포, 과립구 등의 여러 가지 백혈구의 표면에는 Fcγ 수용체(이하 FcγR이라 표기함)의 패밀리가 발현된다.
FcγR에는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 FcγR과, FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다. IgG 항체, 특히 인간에게 있어서는 IgG1과 IgG3은 이들 수용체에 강하게 결합하여, 그 결과 백혈구에 의한 ADCC 활성이나 탐식 활성을 유도한다.
ADCC 활성이란, 항원에 결합한 항체가 Fc 부분을 통해 주로 NK 세포 표면의 FcγRIIIa에 결합하여, 그 결과, NK 세포로부터 방출되는 퍼포린이나 그란자임 등의 세포 상해성 분자에 의해서 생기는 세포 융해 반응이다(비특허문헌 16, 17). ADCC 활성은 일반적으로는 IgG1>IgG3>>IgG4≥IgG2의 서열을 보인다(비특허문헌 18, 19). Fc 상의 FcγRIIIa의 결합 부위는 CH2 도메인에 존재하며, 2개의 CH2 도메인 사이에 FcγRIIIa가 1 분자 결합하는 것이 결정 구조 해석에서 드러나 있다(비특허문헌 20).
CDC 활성이란, 항원에 결합한 항체가, 혈청 중의 보체계라고 불리는 일군의 혈청 단백질의 반응 캐스케이드를 활성화하여, 최종적으로 표적 세포를 융해하는 반응이다. CDC 활성은 인간 IgG1 및 IgG3에 있어서 높으며, 일반적으로 IgG3≥IgG1>>IgG2≒IgG4의 서열을 보인다. 보체계는 C1∼C9의 각 성분으로 분류되며, 그 대부분이 부분 분해를 받아 효소 활성을 발현하는 효소 전구체이다.
CDC 활성은 맨 처음에 C1의 한 성분인 C1q의 표적 세포 상의 항체의 Fc 영역에의 결합에서 시작되어, 각 성분이 앞 단계의 성분에 의해서 부분 분해를 받음으로써 활성화의 캐스케이드가 진행되어, 최종적으로는 C5∼C9가 막침습 복합체라고 불리는 구멍 형성 중합체가 표적 세포의 세포막 상에서 형성되어, 세포의 용해 반응을 야기한다(비특허문헌 16, 17). Fc 영역 상의 C1q의 결합 부위는 CH2 도메인에 존재하는 것이 Fc 영역의 아미노산 치환 연구에 의해 시사되어 있다(비특허문헌 21).
임상에 이용되는 항체 의약의 약효 메카니즘에 있어서도, 상술한 이펙터 기능의 중요성이 인식되고 있다. 상기한 Rituxan(등록상표)은 IgG1 서브클래스의 인간형 키메라 항체이며, 인비트로에서 ADCC 활성 및 CDC 활성을 보인다(비특허문헌 22).
또한, Rituxan(등록상표)은, 임상 효과에 있어서도, ADCC 활성이 강한 FcγRIIIa 유전자형을 보이는 환자에게 있어서 치료 효과가 높다는 것(비특허문헌 23), 투여 후에 신속하게 혈중에서 보체 성분이 소비되는 것(비특허문헌 24), 투여 후에 재발한 환자의 암 세포에서는 CDC 활성을 억제하는 인자인 CD59의 발현이 상승하고 있는 것(비특허문헌 25) 등으로부터, Rituxan(등록상표)이 실제로 환자 체내에서 이펙터 기능을 발휘하고 있음이 시사되어 있다.
Herceptin(등록상표)도 IgG1 서브클래스의 인간화 항체이며, ADCC 활성이 강한 FcγRIIIa 유전자형을 보이는 환자에게 있어서 치료 효과가 높다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 26).
또한, 인간 IgG는 혈관 내피 세포 등에 발현하는 태아성 Fc 수용체(neonatal Fc receptor for IgG; FcRn, 이하 FcRn이라고 기재함)와 엔도좀 내의 낮은 pH 조건에서 결합함으로써 리소좀에 의한 분해를 벗어나고, 그 결과 7일(IgG3)∼21일(IgG1, 2, 4)로 긴 혈중 반감기를 갖는다. 항체의 Fc와 FcRn과의 결합 부위는 CH2 도메인과 CH3 도메인의 계면에 존재한다는 것이 Fc의 아미노산 잔기 개변의 연구로부터 시사되어 있다(비특허문헌 27).
이상의 점에서, 인간 IgG1 항체는 다른 서브클래스와 비교하여, 강한 ADCC 활성 및 CDC 활성을 지니고, 또한 인간 혈중에서의 반감기가 길다는 점 등에서 항체 의약으로서 최적이다.
C1q는 항체 분자의 Fc 영역에 결합한다는 것이 알려졌다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 단량체에 대한 C1q의 결합 상수(Ka)는 각각 1.2×104, 0.64×104, 2.9×104, 0.44×104 M-1이다(비특허문헌 28). 상술한 것과 같이, Fc 영역 중에서도 특히 CH2 도메인이 중요하다(비특허문헌 29).
더욱 상세하게는, 인간 IgG1에서는 EU 인덱스(비특허문헌 30)에 있어서, CH2 중의 Leu235(비특허문헌 31), Asp270, Lys322, Pro329, Pro331(비특허문헌 32), 인간 IgG3에서는 Glu233, Leu234, Leu235, Gly236(비특허문헌 33), Lys322(비특허문헌 34) 등이 중요하다는 것이 알려져 있다.
인간 IgG 중쇄 정상 영역 중에 아미노산 개변을 도입함으로써 IgG의 개변체를 제작하여, C1q와의 결합 활성을 상승시켜, CDC 활성을 증강시키는 시도가 이루어져 왔다.
Idusogie 등은, 인간 IgG1형의 정상 영역 및 마우스 유래의 가변 영역을 갖는 항CD20 키메라 항체 Rituxan(등록상표)의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인 중의 EU 인덱스 326번째의 Lys 또는 333번째의 Glu를 다른 아미노산으로 치환하면, 최대 2배 정도 CDC 활성이 증강되는 것을 보고했다(비특허문헌 35, 특허문헌 2).
Idusogie 등은, 또한, IgG1의 수백분의 일 정도의 CDC 활성이었던 IgG2의 CDC 활성이, 인간 IgG2형 항체의 EU 인덱스 326번째의 Lys 또는 333번째의 Glu를 다른 아미노산으로 치환함으로써, IgG1의 CDC 활성의 1/25 정도까지 상승하는 것을 개시했다(특허문헌 3∼5).
또한 Dall' Acqua 등은, 인간 IgG1형의 항EphA2 항체의 힌지 영역에 여러 가지 아미노산 개변을 실시한 결과, 복수의 개변체에 있어서, 개변 전의 항체보다도 C1q 결합 활성 및 CDC 활성이 상승하는 것을 보고했다(비특허문헌 35).
아미노산 개변을 도입하는 수법과는 달리, 천연에 존재하는 서열의 조합에 의해서 CDC 활성을 증강시키는 예도 알려져 있다. Shitara 등은, 인간 IgG1의 CH2 도메인 전체 및 CH3 도메인의 전체 또는 N 말단 측의 일부를 인간 IgG3의 서열로 치환하면, IgG1 및 IgG3의 어느 것보다도 C1q 결합 활성 및 CDC 활성이 크게 상승하는 것을 알아냈다(특허문헌 6, 비특허문헌 36).
단백질에 부가하는 당쇄에는 N-글리코시드 결합형 당쇄와 O-글리코시드 결합형 당쇄의 2가지 타입이 존재한다. Asn 측쇄의 아미드의 N 원자에 결합하는 당쇄는 N-글리코시드 결합형 당쇄, Ser와 Thr 측쇄의 히드록시기의 O 원자에 결합하는 당쇄는 O-글리코시드 결합형 당쇄이다.
N-글리코시드 결합형 당쇄에는, 고(高)만노오스형 당쇄, 복합형 당쇄(콤플렉스형 당쇄) 및 혼성형 당쇄(하이브리드형 당쇄)의 3종의 타입이 있다.
N-글리코시드 결합형 당쇄의 생합성 과정은 조면 소포체에 있어서 만노오스(Man) 9 분자를 포함하는 돌리콜-피로인산-올리고당[(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2]이 N-글리코시드 결합형 당쇄의 콘센서스 서열 Asn-X-Ser/Thr(X는 프롤린 이외의 모든 아미노산)의 Asn 잔기에 부가하는 것에서 시작된다. 그 후, 여러 가지 효소에 의해서 Man8형, Man7형, Man6형 및 Man5형의 높은 만노오스형으로 변환되고, 나아가서는 만노오스 대신에 N-아세틸글루코사민, 갈락토오스, 시알산 및 푸코오스 등이 부가된 복합형 당쇄가 합성된다(비특허문헌 37).
단 N-글리코시드 결합형 당쇄는 단백질 중의 모든 Asn-X-Ser/Thr 서열에 부가하는 것은 아니고, 또한 주변의 아미노산 서열이나 입체 구조에 따라서는 부가하지 않는 것이 알려져 있다. 특히, Asn-X-Ser/Thr의 C 말단 측에 계속되는 아미노산이 Pro인 경우, Asn-X-Ser/Thr의 Asn 잔기에는 거의 당쇄 부가가 일어나지 않는 것이 알려져 있다(비특허문헌 38, 39).
인간 IgG의 정상 영역에는, 유일하게 CH2 도메인의 297번째의 Asn에 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합하는 것이 알려져 있고(비특허문헌 40), 그 밖의 부위에의 N-글리코시드 결합형 당쇄의 존재는 알려져 있지 않다. 유일하게 마우스 IgG3의 정상 영역 471번째의 Asn에 여분의 N-글리코시드 결합형 당쇄가 결합하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 41).
한편, 인간 IgG3형의 정상 영역 중의 CH3 도메인의 392∼394번째에는 Asn-Thr-Thr의 서열이 존재하지만, 395번째의 아미노산은 Pro이며(비특허문헌 42), 실제로 IgG3의 392위의 Asn에의 당쇄 부가는 알려져 있지 않다.
인간 IgG의 ADCC 활성은 297번째의 Asn에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 구조(도 1에 전형적인 복합형 당쇄 모식도를 도시함)에 의해서 변화되는 것이 알려져 있다(특허문헌 7).
항체에 결합하는 당쇄의 갈락토오스 및 N-아세틸글루코사민의 함량에 의존하여, 항체의 ADCC 활성이 변화되는 보고가 있지만(비특허문헌 43∼46), 가장 ADCC 활성에 영향을 미치는 것은 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α1,6 결합하는 푸코오스(이하, 코어 푸코오스라고 기재하는 경우도 있음)이다.
코어 푸코오스가 없는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 IgG 항체는, 코어 푸코오스가 결합된 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 IgG 항체보다도 현저히 높은 ADCC 활성을 보인다(비특허문헌 47, 48, 특허문헌 7).
코어 푸코오스가 없는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 항체 조성물을 생산하는 세포로서는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자가 넉아웃된 세포가 알려져 있다(특허문헌 8, 9).
항체 의약의 치료 효과에는 ADCC 활성 및 탐식 활성 등의 FcγR 의존적인 활성, CDC 활성 및 FcRn 결합 활성의 어느 것이나 중요하다.
그러나, CDC 활성을 야기하는 초기 단계인 C1q 결합 및 ADCC 활성을 야기하는 초기 단계인 FcγR에의 결합, 긴 혈중 반감기에 기여하는 FcRn에의 결합은 어느 것이나 항체의 Fc 영역을 통하고 있기 때문에, Fc에 아미노산 개변을 도입한 경우, 이들 활성을 손상시켜 버릴 가능성도 있다.
Idusogie 등은, CDC 활성을 증강시키는 IgG1의 CH2 도메인에의 아미노산의 점 변이 도입체는 ADCC 활성이 크게 저하되어 버리는 것을 보고하고 있다(비특허문헌 49).
또한 Dall' Acqua 등은, FcRn에의 결합 활성을 상승시키는 IgG1의 CH2 도메인에의 아미노산 변이 도입은 동시에 ADCC 활성을 저하시키는 현상을 보고하고 있다(비특허문헌 50).
흥미깊게도 이들 보고는, Fc 중의 FcγRIIIa, C1q, FcRn에의 결합 부위는 각각 미묘하게 다른 부위에 위치함에도 불구하고, 각각의 결합성을 변화시키는 아미노산 개변은 다른 결합 부위에 예기하지 않는 영향을 미치는 것을 보이고 있다.
IgG 중쇄 정상 영역의 392번째의 아미노산은 항체 분자 중의 2개의 CH3 도메인의 계면에 위치하고 있다(비특허문헌 51). 이 계면에 위치하는 아미노산은 2개의 중쇄 분자의 회합에 큰 역할을 하고 있으며(비특허문헌 52), 예컨대 392번째의 아미노산을 개변한 경우, 항체 분자의 입체 구조 및 여러 가지 생물 활성에 예기치 못한 영향을 줄 가능성이 있다.
특허문헌 1 : 유럽 특허출원공개 제0327378호 명세서 특허문헌 2 : 미국 특허출원공개 제2003/0158389호 명세서 특허문헌 3 : 국제공개 제00/42072호 특허문헌 4 : 미국 특허출원공개 제2004/0132101호 명세서 특허문헌 5 : 미국 특허출원공개 제2005/0054832호 명세서 특허문헌 6 : 국제공개 제2007/011041호 특허문헌 7 : 국제공개 제00/61739호 특허문헌 8 : 국제공개 제02/31140호 특허문헌 9 : 국제공개 제03/85107호
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항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, 297번째의 Asn에 결합하는 당쇄는 항체의 활성이나 혈중 안정성에 관여하고 있지만, 297번째 이외의 아미노산 잔기에 결합한 여분의 당쇄는 항체 정상 영역을 통한 활성에 영향을 미치게 할 가능성이나, 항체 의약품으로서의 균일성의 문제를 야기할 가능성이 있다. 그 때문에, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 여분의 당쇄를 제어하는 방법이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 감안하여 검토한 결과, 본 발명자들은, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 개변이 이루어짐으로써, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 요지는 이하이다.
1. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 개변이 이루어진 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
2. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열 중의 Asn에 N-글리코시드 결합형 당쇄가 부가되어 있는 상기 항 1에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
3. EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열이, EU 인덱스 392∼394번째인 상기 항 1 또는 2에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
4. EU 인덱스의 392∼394번째 중 아미노산 잔기의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 이하의 아미노산 잔기로 개변된 상기 항 1∼3 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
EU 인덱스 392번째 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 또는 Trp
EU 인덱스 393번째 : Pro
EU 인덱스 394번째 : Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Tyr 또는 Trp
5. 인간 IgG 항체의 Fc 영역이 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 상기 항 1∼4 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
6. CH1 도메인 및 힌지 도메인을 포함하고, 상기 CH1 도메인 및 힌지 도메인이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는 상기 항 1∼5 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
7. EU 인덱스 339번째의 Thr이, Asn 또는 Tyr의 아미노산 잔기로 개변된 Fc 영역을 포함하는 상기 항 1∼6 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
8. EU 인덱스 397번째의 Met가, Gln, Asn, Asp 및 Phe에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 항체 Fc 영역을 포함하는 상기 항 1∼7 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편.
9. 상기 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편의 아미노산 서열을 코드하는 DNA.
10. 상기 항 9에 기재한 DNA를 함유하는 벡터.
11. 상기 항 10에 기재한 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
12. 상기 항 11에 기재한 형질전환체를 배지 내에서 배양하여, 배양액 중에 상기 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 또는 이 개변 항체 조성물 단편을 생성 축적시켜, 배양액으로부터 개변 항체 조성물 또는 이 개변 항체 조성물 단편을 정제하는 상기 항 1∼8 중 어느 한 항에 기재한 개변 항체 조성물 및 이개변 항체 조성물 단편을 제조하는 방법.
13. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 개변을 행하는, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn 잔기에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄를 감소시키는 방법.
14. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열의 Asn 잔기에 N-글리코시드 결합 당쇄가 부가되어 있는 상기 항 13에 기재한 방법.
15. EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열이 EU 인덱스 392∼394번째인 상기 항 13 또는 14에 기재한 방법.
16. EU 인덱스의 392∼394번째 중 아미노산 잔기의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 이하의 아미노산 잔기로 개변된 상기 항 13∼15 중 어느 한 항에 기재한 방법.
EU 인덱스 392번째 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 또는 Trp
EU 인덱스 393번째 : Pro
EU 인덱스 394번째 : Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Tyr 또는 Trp
17. 인간 IgG 항체의 Fc 영역이 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 상기 항 13∼16 중 어느 한 항에 기재한 방법.
18. 인간 IgG 항체가 CH1 도메인 및 힌지 도메인을 포함하고, 이 CH1 도메인 및 힌지 도메인이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는 상기 항 13∼17 중 어느 한 항에 기재한 방법.
본 발명의 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 조성물, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 여분의 당쇄가 감소 또는 결손되고, 또한 항체의 이펙터 활성이 유지된 개변 항체 조성물 및 개변 항체 조성물 단편이다.
본 발명의 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편은 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손되어 있기 때문에, 297번째 이외의 아미노산 잔기에 결합한 여분의 당쇄에 의한 항체 정상 영역을 통한 활성에 미치는 영향 및 항체 의약품으로서의 균일성의 문제 등을 야기하는 일이 없어, 매우 유용하다.
도 1의 (a) 및 (b)는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄(콤플렉스형 당쇄)의 전형적인 구조를 도시한다.
도 2의 (a)∼(c)는 고CDC 활성형의 IgG1/IgG3 도메인 교환 항체인 113F형 항체의 구성을 나타내고 있다.
도 3은 GM2-113F의 SDS-PAGE상을 도시하는 도면이다. 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 GM2-113F를 분석했다. 분자량 마커의 분자량은 도 3의 좌측단에 도시했다.
도 4는 IgG1 항체, IgG3 항체 및 113F형 항체의 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 비교이다. 굵은 글씨로 나타내어진 아미노산 잔기는 IgG1 항체와 IgG3 항체에서 다른 아미노산을 배치하는 부위이다. 별표는 본 연구 중에서 아미노산 치환을 행한 잔기를 나타낸다.
도 5는 발현 벡터의 제작 순서이다. 도 5 중에서 벡터의 일부분이 점선으로 그려져 있는 것은, PCR 후에 H쇄 정상 영역 이외의 염기 서열이 미확인임을 나타낸다.
도 6의 (a) 및 (b)는 CD20 트랜스펙턴트 KC1156에 대한 113F 항체, N392K, T394Y, T394F 및 리툭시맵(rituximab)의 각종 농도에 있어서의 CDC 활성 측정의 결과이다. 그래프의 종축은 세포 상해 활성(%)을, 횡축은 항체 농도를 나타낸다. 실험은 N=3으로 행했다.
도 7의 (a)∼(e)는 CD20 양성 종양 세포주인 Raji, Daudi, ST486, EHEB 및 MEC-1에 대한 113F 항체, N392K, T394Y, T394F, N392K/T339Y 및 리툭시맵의 각종 농도에 있어서의 CDC 활성 측정의 결과이다. 그래프의 종축은 세포 상해 활성(%)을, 횡축은 항체 농도를 나타낸다. 실험은 N=3으로 행했다.
도 8은 플로우 사이토미터를 이용한 113F 항체, N392K, T394Y 및 T394F의 C1q 결합 활성 측정의 결과이다. 실험에는 CD20 양성 종양 세포인 Daudi를 이용하여, 항체와 인간 혈청을 반응시킨 후, FITC 표지 항인간 C1q 항체에 의해 C1q의 결합을 검출했다. 그래프의 종축은 평균 형광 강도(MFI)를, 횡축은 항체 농도를 나타낸다. 실험은 N=3으로 행했다.
본 발명의 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편은, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 Kabat 등에 의한 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 개변이 이루어진 개변 항체 조성물 및 이 개변 항체 조성물 단편이다.
본 발명에 있어서, EU 인덱스란, 시퀀스 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 제5판(1991)을 나타낸다. 이하에 나타내는 아미노산 잔기의 위치는, 특별히 기재가 없는 경우는 전부 EU 인덱스에 기초하여 나타낸다.
Asn-X-Ser/Thr 서열은, Asn 잔기의 NH2기에 당쇄가 결합하기 쉬운 공통 서열(이하, N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열 또는 단순히 컨센서스 서열이라고 기재함)을 말한다.
본 발명에 있어서, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열로서는 392∼394번째의 Asn을 들 수 있다.
또한 본 발명의 개변 항체 조성물로서, 구체적으로는, 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 392∼394번째의 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 및 X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중 적어도 어느 하나의 아미노산 개변이 행해진 개변 항체 조성물을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물로서, 보다 구체적으로는, 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스의 392∼394번째의 아미노산 잔기에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 이하의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물 등을 들 수 있다.
EU 인덱스 392번째 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 또는 Trp
EU 인덱스 393번째 : Pro
EU 인덱스 394번째 : Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Tyr 또는 Trp
본 발명의 인간 IgG 항체의 Fc 영역으로서는, 적어도 Fc 영역의 EU 인덱스의 392번째∼394번째의 아미노산 서열이 Asn-Thr-Thr을 갖는 Fc 영역, 구체적으로는, EU 인덱스 231∼434번째까지가 인간 IgG1 또 435∼447번째까지가 인간 IgG3의 아미노산 서열인 Fc 영역, 더욱 구체적으로는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Fc 영역을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물로서 구체적으로는, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 항체의 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn이 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 및 Trp에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물, EU 인덱스 393번째의 Thr이 Pro로 개변된 개변 항체 조성물 및 EU 인덱스 394번째의 Thr이 Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Trp 및 Tyr에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물로서 보다 구체적으로는, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 항체의 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn이 Lys로 개변된 개변 항체 조성물, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 개변 항체 조성물 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체 조성물로서는, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 항체의 Fc 영역에 있어서, 상술한 아미노산 개변에 더하여 EU 인덱스 339번째의 Thr이 Tyr로 개변된 개변 항체 조성물, EU 인덱스 397번째의 Met이 Gln, Asn, Asp 및 Phe에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물도 들 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체로서는, 서열 번호 3에 나타내어지는 아미노산 서열을 지니고, 또한 EU 인덱스 339번째의 Thr이 Tyr로 개변된 개변 항체 조성물, 및 EU 인덱스 397번째의 Met이 Gln, Asn, Asp 및 Phe에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물도 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn, X 및 Ser/Thr의 어느 쪽의 아미노산 잔기를 어떤 아미노산 잔기로 개변하는지에 관해서는, 아미노산 개변의 결과, 새로운 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열이 생기지 않도록, 아미노산 잔기 개변을 행하는 위치, 개변 후의 아미노산 잔기를 고려함으로써 행할 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물은, 상술한 아미노산 잔기를 개변함으로써, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열의 Asn 잔기에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄가 감소 또는 결손되고, 또한 아미노산 잔기 개변을 행하기 전의 항체와 비교하여, 동등 이상의 이펙터 활성을 갖는다.
본 발명의 개변 항체 조성물로서는, 구체적으로는, EU 인덱스 392번째의 Asn에 당쇄가 결합하지 않고, 또한 아미노산 잔기의 개변을 행하기 전의 항체와 비교하여, 동등 이상의 이펙터 활성을 갖는 개변 항체 조성물을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 Asn에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손된다는 것은, 아미노산 잔기 개변을 하기 전의 개변 항체 조성물과 비교하여, 아미노산 잔기 개변을 행한 후의 개변 항체 조성물에서는 실질적으로 당쇄가 결합하지 않음을 나타낸다.
실질적으로 당쇄가 결합하지 않는다는 것은, 하기에 설명하는 당쇄 분석 방법 등을 이용하여 당쇄를 분석한 경우에, 상기 아미노산 잔기 개변 부위에 결합하는 당쇄가 검출되지 않거나 또는 검출 한계 이하임을 나타낸다.
본 발명의 개변 항체로서는, 변이 Fc를 지니고, 또한 표적 분자에의 결합 활성을 갖는 단백질이라면 어느 것이나 포함된다. 구체적으로는, 변이 Fc를 갖는 모노클로널 항체, 변이 Fc와 항체 단편이 결합한 융합 단백질, 변이 Fc와 천연에 존재하는 리간드 또는 수용체가 결합한 Fc 융합 단백질(이뮤노아드헤신이라고도 함), 복수의 Fc 영역을 융합시킨 Fc 융합 단백질 등도 본 발명에 포함된다.
표적 분자와의 결합 활성을 갖는 항체 단편으로서는, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Diabody, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체란, 변이 Fc를 갖는 단백질을 말한다.
본 발명에 있어서 변이 Fc란, 항체 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄 중, EU 인덱스 297∼299번째 이외의 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열에 결합하는 당쇄를 감소 또는 결손시키도록 아미노산 개변된 Fc 영역을 말한다.
즉, 본 발명의 변이 Fc는, Fc 영역의 EU 인덱스 297번째의 Asn에 N-글리코시드 결합형 당쇄가 결합하고, 또한 그 이외의 여분의 N-글리코시드 결합 당쇄가 결합하지 않도록, N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열을 감소 또는 결손시킨 Fc 영역을 말한다.
또한, 본 발명에 있어서 항체 Fc 영역 또는 단순히 Fc란, Kabat 등[시퀀스 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 제5판(1991)]에 보고되어 있는, 천연에 존재하는 이뮤노글로불린 또는 그 알로타입의 Fc 아미노산 서열, 또는 이펙터 활성의 제어, 항체의 안정성이나 혈중 반감기의 연장 등을 목적으로 하여 아미노산 개변된 Fc 아미노산 서열(국제공개 제00/42072호, 국제공개 제2006/033386호, 국제공개 제2006/105338, 국제공개 제2005/070963호, 국제공개 제2007/011041호, 국제공개 제2008/145142호)의 어느 아미노산 서열이라도 좋으며, Fc 영역과 Fc 수용체와의 결합 활성을 갖고 있는 Fc 영역, 및/또는 Fc 영역과 Fc 수용체를 통한 이펙터 활성을 갖고 있는 Fc 영역이라면, 어느 Fc 영역이라도 좋다.
즉, 본 발명의 개변 항체 조성물은, 항체 Fc에 결합하는 EU 인덱스 297번째 이외의 여분의 N-글리코시드 결합형 당쇄의 결합을 감소 또는 결손시킨 변이 Fc를 지니고, 또한 Fc 수용체와의 결합 활성 및/또는 이펙터 활성이 제어된 개변 항체 조성물이다.
본 발명에 있어서 모노클로널 항체란, 단일 클론의 항체 생성 세포가 분비되는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하여, 모노클로널 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 구조)이 균일하다. 본 발명의 개변 항체 조성물은 실질적으로 모노클로널 항체의 성질을 갖고 있는 개변 항체이며, 모노클로널 항체에 포함된다.
에피토프란, 모노클로널 항체가 인식하여, 결합하는 단일의 아미노산 서열, 아미노산 서열로 이루어지는 입체 구조, 당쇄가 결합한 아미노산 서열 및 당쇄가 결합한 아미노산 서열로 이루어지는 입체 구조 등을 들 수 있다. 입체 구조는 천연에 존재하는 단백질이 갖는 3차원 입체 구조이며, 세포내 또는 세포막 상에 발현하고 있는 단백질이 구성하는 입체 구조를 말한다.
항체 분자는 이뮤노글로불린(이하, Ig라 표기함)이라고도 불리며, 인간 항체는 분자 구조의 차이에 따라서 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM의 아이소타입으로 분류된다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭하여 IgG라고도 한다.
항체 분자는 중쇄(Heavy chain, 이하 H쇄라고 기재함) 및 경쇄(Light chain, 이하 L쇄라고 기재함)라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다.
또한, H쇄는 N 말단 측에서부터 H쇄 가변 영역(VH라고도 표기됨), H쇄 정상 영역(CH라고도 표기됨), L쇄는 N 말단 측에서부터 L쇄 가변 영역(VL이라고도 표기됨), L쇄 정상 영역(CL이라고도 표기됨)의 각 영역에 의해 각각 구성된다.
CH는 각 서브클래스마다 α, δ, ε, γ 및 μ쇄가 각각 알려져 있다. CH는 또한, N 말단 측에서부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다.
도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, CH2 도메인과 CH3 도메인을 합하여 Fc 영역 또는 단순히 Fc라고 한다. CL은 Cλ쇄 및 Cκ쇄가 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 Fc 영역은, EU 인덱스에 의해, N 말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다.
구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118∼215번의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216∼230번의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231∼340번의 아미노산 서열, CH3은 EU 인덱스 341∼447번의 아미노산 서열로 각각 특정된다.
본 발명의 개변 항체 조성물로서는, 특히 인간형 키메라 항체(이하, 단순히 키메라 항체라고도 약기함), 인간화 항체[상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; CDR) 이식 항체라고도 함] 및 인간 항체 등도 포함된다.
키메라 항체란, 인간 이외 동물(비인간 동물)의 항체의 VH 및 VL과, 인간 항체의 CH 및 CL로 이루어지는 항체를 의미한다. 비인간 동물로서는, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 토끼 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하다면, 어떠한 것이나 이용할 수 있다.
하이브리도마란, 비인간 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마우스 등에 유래하는 미엘로마 세포를 세포 융합시켜 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 지닌 모노클로널 항체를 생성하는 세포를 말한다. 따라서, 하이브리도마가 생성하는 항체를 구성하는 가변 영역은 비인간 동물 항체의 아미노산 서열로 이루어진다.
인간형 키메라 항체는, 모노클로널 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간화 항체란, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 대응하는 CDR에 이식한 항체를 말한다. VH 및 VL의 CDR 이외의 영역은 프레임워크 영역(이하, FR이라 표기함)이라 불린다.
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열로 이루어지는 VH의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA와, 비인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열로 이루어지는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA를 구축하여, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간 항체는 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자공학적, 세포공학적, 발생공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 존재하는 항체는, 예컨대, 인간 말초혈로부터 단리한 림프구를, EB 바이러스 등을 감염시킴으로써 불사화한 후, 클로닝함으로써, 이 항체를 생성하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양물 중에서 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 표면에 발현시킨 파지의 라이브러리이다.
인간 항체 파지 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은, 또한 유전자공학적 수법에 의해, 2 가닥의 완전한 H쇄 및 2 가닥의 완전한 L쇄로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생성 트랜스제닉 동물은 인간 항체 유전자가 세포 내에 들어간 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하여, 이 ES 세포를 다른 마우스의 초기배에 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다.
인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상의 인간 이외의 포유 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생성 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양물 속에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.
본 발명의 개변 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 또는 비인간 동물 항체의 CDR을 인간 항체의 프레임워크에 이식한 인간화 항체의 아미노산 서열의 어느 것이라도 좋다.
구체적으로는, 예컨대, 하이브리도마가 생성하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 및 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체에 있어서의 CL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 아미노산 서열의 어느 것이라도 좋지만, 인간 항체의 아미노산 서열의 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명의 개변 항체의 CH로서는, 이뮤노글로불린에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 IgG 클래스에 속하는 서브클래스인, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3) 및 γ4(IgG4)의 어느 것이나 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체의 CH의 아미노산 서열로서는, 천연에 존재하는 이뮤노글로불린 CH 서열(각 서브클래스의 알로타입을 포함함)뿐만 아니라, 천연에 존재하는 2 종류 이상의 이뮤노글로불린 CH 서열을 조합시킨 키메라형의 CH 서열이나, 항체의 이펙터 활성을 제어하기 위해서 아미노산 잔기 개변이 행해진 그 밖의 CH의 아미노산 서열도 포함된다.
본 발명의 개변 항체의 CH로서는, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn, 393번째의 Thr 및 394번째의 Thr에 있어서, Asn에서 Ser/Thr 이외의 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, Thr에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 개변이 행해진 변이 Fc를 갖는 CH를 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체의 CH로서 구체적으로는, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn이 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 및 Trp에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 변이 Fc를 갖는 CH, EU 인덱스 393번째의 Thr가 Pro로 개변된 항체 Fc 영역을 갖는 CH 및 EU 인덱스 394번째의 Thr이 Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Trp 및 Tyr에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 변이 Fc를 갖는 CH 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체의 CH로서 보다 구체적으로는, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn이 Lys로 개변된 변이 Fc를 갖는 CH를 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체의 CH로서는, 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, 상술한 아미노산 개변에 더하여 EU 인덱스 339번째의 Thr이 Tyr로 개변된 CH, EU 인덱스 397번째의 Met가 Gln, Asn, Asp 및 Phe에서 선택되는 어느 한 아미노산 잔기로 개변된 변이 Fc를 갖는 CH 등도 포함된다.
또한 본 발명의 개변 항체의 CH로서는, Fc 영역 이외의 CH 도메인으로서 CH1 및 힌지 도메인이 인간 IgG1인 CH가 포함된다.
또한 본 발명의 개변 항체의 CH로서 구체적으로는, CH1 및 힌지 도메인이 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 서열 번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 392번째 Asn, 393번째 Thr 및 394번째 Thr에 있어서, Asn에서 Ser/Thr 이외의 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, Thr에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 개변이 행해진 CH, 서열 번호 2의 CH에 있어서, EU 인덱스 392번째의 Asn, 393번째의 Thr 및 394번째의 Thr에 있어서, Asn에서 Ser/Thr 이외의 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, Thr에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 개변이 행해진 CH 등을 들 수 있다.
이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해 유발되는 항체 의존성의 활성을 말하며, 항체 의존성 세포 상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity; ADCC 활성), 보체 의존성 상해 활성(Complement-Dependent cytotoxicity activity; CDC 활성)이나, 대식세포나 수상세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 파고사이토시스(Antibody-dependent phagocytosis activity; ADP 활성) 등이 알려져 있다.
본 발명에 있어서 ADCC 활성 및 CDC 활성은 공지된 측정 방법[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]을 이용하여 측정할 수 있다.
ADCC 활성이란, 표적 세포 상의 항원에 결합한 항체가, 항체의 Fc 영역을 통해 면역 세포의 Fc 수용체와 결합함으로써 면역 세포(자연 살해 세포 등)를 활성화하여, 표적 세포를 상해하는 활성을 말한다.
Fc 수용체(이하, FcR이라고 기재하는 경우도 있음)란, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체이며, 항체의 결합에 의해 여러 가지 이펙터 활성을 유도한다.
FcR은 항체의 서브클래스에 대응하고 있으며, IgG, IgE, IgA, IgM은 각각 FcγR, FcεR, FcαR, FcμR에 특이적으로 결합한다.
더욱이 FcγR에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)의 서브타입이 존재하며, 각각 FcγRIA, FcγRIB, FcγRIC, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB의 아이소폼이 존재한다. 이들 상이한 FcγR은 상이한 세포 상에 존재하고 있다(Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)).
인간에게 있어서는, FcγRIIIB는 호중구에 특이적으로 발현하고 있으며, FcγRIIIA는 단구, 자연 살해 세포(NK 세포) 및 일부의 T 세포에 발현하고 있다. FcγRIIIA를 통한 항체의 결합은 NK 세포 의존적인 ADCC 활성을 유도한다.
CDC 활성이란 표적 세포 상의 항원에 결합한 항체가 혈액 중의 보체 관련 단백질군으로 이루어지는 일련의 캐스케이드(보체 활성화 경로)를 활성화하여, 표적 세포를 상해하는 활성을 말한다. 또한, 보체의 활성화에 의해 생기는 단백질 단편에 의해 면역 세포의 유주 및 활성화를 유도할 수 있다.
CDC 활성의 캐스케이드는, 항체의 Fc 영역과의 결합 도메인을 갖는 C1q가, Fc 영역에 결합하여, 2개의 세린 프로테아제인 C1r 및 C1s와 결합함으로써 C1 복합체를 형성함으로써 개시된다.
본 발명의 Fc 영역에 결합하는 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄를 감소 또는 결손시킨 개변 항체는, 297번째 이외의 Asn 잔기에 당쇄가 결합하고 있는 항체와 동등 이상의 이펙터 활성, C1q 결합 활성, FcR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 개변 항체 조성물은, 아미노산 개변 전의 항체(친(親)항체라고도 함)와 비교하여, 실질적으로 동등하거나 또는 실질적으로 동등 이상의 C1q 결합 활성, FcR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
친항체와 비교하여, 실질적으로 동등 이상의 C1q 결합 활성, FcR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다는 것은, 본 발명의 개변 항체와 친항체를 동시에 동일한 실험계에서 해석했을 때에, FcR 결합 활성, ADCC 활성 및 CDC 활성에서 선택되는 어느 하나 이상의 활성이 친항체의 활성과 비교하여 동등하거나 그 이상임을 나타낸다.
아미노산 개변을 하기 전의 친항체의 활성과 비교하여 동등하다는 것은, 친항체의 활성을 100%로 했을 때에, 개변 항체의 활성이 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 보다 더욱 바람직하게는 90%, 보다 더욱 바람직하게는 95%, 보다 더욱 바람직하게는 96%, 보다 더욱 바람직하게는 97%, 보다 더욱 바람직하게는 98%, 특히 바람직하게는 99%, 가장 바람직하게는 100% 이상임을 나타낸다. 또한, 아미노산 개변을 하기 전의 친항체의 활성과 비교하여 동등 이상이라는 것은, 바람직하게는 100%, 보다 바람직하게는 110%, 더욱 바람직하게는 120%, 보다 더욱 바람직하게는 130%, 특히 바람직하게는 140%, 가장 바람직하게는 150% 이상의 활성임을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 개변 항체는, EU 인덱스 297번째 이외의 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 컨센서스 서열에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 개변을 행함으로써, 개변 항체의 C1q 결합 활성, FcR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 제어하는 것이 가능하고, 또한 297번째 이외의 Asn 잔기에 결합하는 당쇄를 감소 또는 결손시킬 수 있다.
더욱이 본 발명의 개변 항체 조성물은, 조성물 중에 포함되는 중합체(회합체)량 및/또는 항체 분해물량이 감소하고 있다. 중합체란, 1 분자의 항체 분자(1량체)가 소수 결합이나 수소 결합 등의 결합을 통해 2개 이상 중합된 것을 말하며, 다이머, 트리머, 또 수 분자가 중합된 올리고머 및 수 분자 이상이 중합된 폴리머 등을 들 수 있다.
또한 중합체를 응집체라고 표현하는 경우도 있다. 또한, 항체 분해물이란, 효소적, 비효소적으로 생길 수 있는 항체 분자의 분해물이라면 어느 것이라도 좋고, 단편화된 항체, 산화체, 데아미데이션체 및 이성화체 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 EU 인덱스 297번째 이외의 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 컨센서스 서열에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변 중, 적어도 어느 하나의 아미노산 잔기 개변을 포함하는 개변 항체 조성물은, 항체를 제작·제조할 때에 중합체량 및/또는 항체 분해물량이 감소하고 있으므로, 항체 의약품으로서 유용하다. 이 개변 항체 조성물로서는, 보다 구체적으로는, EU 인덱스의 392번째를 Lys로 아미노산 잔기 개변한 개변 항체 조성물을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 항체 단편으로서는, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Diabody, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단됨), H쇄의 N 말단 측 약 반과 L쇄 전체가 디술피드 결합(S-S 결합)으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단됨), Fab가 힌지 영역의 S-S 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는, 1 가닥의 VH와 1 가닥의 VL을 12 잔기 이상의 적당한 펩티드 링커(P)를 이용하여 연결한, VH-P-VL 또는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Diabody는, 항원 결합 특이성이 같거나 또는 다른 scFv가 2량체를 형성한 항체 단편으로, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 2 특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 사이의 S-S 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는 CDR끼리를 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다.
본 발명의 개변 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코드하는 DNA를 구축하고, 이 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하여, 그 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물은, 어떠한 특이성을 갖는 항체나 포함하지만, 종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련된 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련된 항원을 인식하는 항체, 자기면역 질환에 관련된 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 관련된 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하고, 종양 관련 항원을 인식하는 항체인 것이 보다 바람직하다.
종양 관련 항원으로서는, 예컨대, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, CD40 리간드(CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD55, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD98, CD105, CD134, CD137, CD138, CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, 아드레노메둘린(adrenomedullin), 안지오포이에틴 관련 단백질(angiopoietin related protein) 4(ARP4), 오로라(aurora), B7-H1, B7-DC, 인테글린(integlin), 골수 기질 항원(bone marrow stromal antigen) 2(BST2), CA125, CA19.9, 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) 9(CA9), 카데린(cadherin), cc-케모카인 수용체(chemokine receptor)(CCR)4, CCR7, 암태아성 항원(CEA), 시스테인 풍부 섬유아세포 성장 인자 수용체(cysteine-rich fibroblast growth factor receptor)-1(CFR-1), c-Met, c-Myc, 콜라겐, CTA, 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor)(CTGF), CTLA-4, 시토케라틴(cytokeratin)-18, DF3, E-카테린(catherin), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, EGFR2(HER2), EGFR3(HER3), EGFR4(HER4), 헤파린 결합성 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF), 엔도글린(endoglin), 상피세포 유착 분자(epithelial cell adhesion molecule)(EpCAM), 내피세포 단백질 C 수용체(EPCR), 에프린(ephrin), 에프린 수용체(Eph), EphA2, 엔도텔리아제(endotheliase)-2(ET2), FAM3D, 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activating protein)(FAP), Fc 수용체 호몰로그 1(FcRH1), 페리틴, 섬유아세포 성장 인자-8(FGF-8), FGF8 수용체, 염기성 FGF(bFGF), bFGF 수용체, FGF 수용체(FGFR)3, FGFR4, FLT1, FLT3, 엽산 수용체, 프리즐드 호몰로그(Frizzled homologue) 10(FZD10), 프리즐드 수용체(frizzled receptor) 4(FZD-4), G250, G-CSF 수용체, 강글리오시드(예컨대, GD2, GD3, GM2 및 GM3 등), globo H, gp75, gp88, GPR-9-6, 헤파라나제 I, 간세포 성장 인자(HGF), HGF 수용체, HLA 항원(예컨대, HLA-DR 등), HM1.24, 인간 유지방구(HMFG), hRS7, 히트 쇼크 단백질 90(hsp90), 이디오타입 에피토프(idiotype epitope), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF 수용체(IGFR), 인터루킨(예컨대, IL-6, IL-12 및 IL-15 등), 인터루킨 수용체(예컨대, IL-2R, IL-3R, IL-6R, IL-10R 및 IL-15R 등), 인테그린, 면역 수용체 전좌 관련(immune receptor translocation associated)-4(IRTA-4), 칼리크레인 1, KDR, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KS1/4, lamp-1, lamp-2, 라미닌-5, 루이스(Lewis) y, 시알릴 루이스(sialyl Lewis) x, 림포톡신-베타 수용체(LTBR), LUNX, 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan)(MCSP), 메소텔린(mesothelin), MICA, 뮬러 억제 물질 타입(Mullerian inhibiting substance type) II 수용체(MISIIR), 뮤신, 신경세포부착분자(NCAM), Necl-5, Notch1, 오스테오폰틴(osteopontin), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor)(PDGF), PDGF 수용체, 혈소판 인자-4(PF-4), 포스파티딜세린, 전립선 특이 항원(PSA), 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막항원(PSMA), 부갑상선 호르몬 관련 단백질/펩티드(PTHrP), NF-kappaB 리간드의 수용체 활성화제(RANKL), 히알루론산 매개 이동성에 대한 수용체(receptor for hyaluronic acid mediated motility)(RHAMM), ROBO1, SART3, 세마포린(semaphorin) 4B(SEMA4B), 분비성 백혈구 프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor)(SLPI), SM5-1, 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate), 종양 관련 당단백질(tumor-associated glycoprotein)-72(TAG-72), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor)(TfR), TGF-베타, Thy-1, Tie-1, Tie2 수용체, T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 1(TIM-1), 인간 조직 인자(hTF), Tn 항원, 종양 괴사 인자(TNF), Thomsen-Friedenreich 항원(TF 항원), TNF 수용체, 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도성 리간드(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)(TRAIL), TRAIL 수용체(예컨대, DR4 및 DR5 등), system ASC 아미노산 트랜스포터 2(ASCT2), trkC, TROP-2, TWEAK 수용체 Fn14, 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR), 타입 IV 콜라게나제, 우로키나제 수용체, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(예컨대, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3 등), 비멘틴(vimentin) 및 VLA-4 등을 들 수 있다.
종양 관련 항원을 인식하는 항체로서는, 예컨대, 항GD2 항체[안티 캔서 리서치(Anticancer Res.), 13, 331(1993)], 항GD3 항체[캔서 이뮤놀로지 이뮤노테라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 260(1993)], 항GM2 항체[캔서 리서치(Cancer Res.), 54, 1511(1994)], 항HER2 항체[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992), 유럽 특허 제882794호 명세서], 항CD52 항체[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992)], 항CD4 항체, 항MAGE 항체[브리티시 저널 오브 캔서(British J. Cancer), 83, 493(2000)], 항CCR4 항체(미국 특허 제6,989,145호 명세서, 국제공개 제2009/086514호), 항HM1.24 항체[몰리큘러 이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 36, 387(1999), 국제공개 제2002/057316호], 항부갑상선 호르몬 관련 단백(PTHrP) 항체[캔서(Cancer), 88, 2909(2000)], 항bFGF 항체, 항FGF-8 항체[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 9911(1989)], 항bFGFR 항체, 항FGF-8R 항체[저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(J. Biol. Chem.), 265, 16455(1990)], 항IGF 항체[저널 오브 뉴로사이언스 리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항IGF-IR 항체[저널 오브 뉴로사이언스 리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항PSMA 항체[저널 오브 유롤로지(J. Urology), 160, 2396(1998)], 항VEGF 항체[캔서 리서치(Cancer Res.), 57, 4593(1997)], 항VEGFR 항체[온코진(Oncogene), 19, 2138(2000), 국제공개 제96/30046호], 항c-Met 항체(미국 특허 제7,498,420호 명세서), 항CD20 항체[Rituxan(등록상표), 커런트 오피니언 인 온콜로지(Curr. Opin. Oncol.), 10, 548(1998), 미국 특허 제5,736,137호 명세서], 항HER2 항체[Herceptin(등록상표), 미국 특허 제5,725,856호 명세서], 항HER3 항체(국제공개 제2008/100624호, 국제공개 제2007/077028호), 항Bip 항체(국제공개 제2008/105560호), 항CD10 항체, 항HB-EGF 항체(국제공개 제2007/142277호), 항EGFR 항체(Erbitux(등록상표), 국제공개 제1996/402010호), 항Apo-2R 항체(국제공개 제98/51793호), 항ASCT2 항체(국제공개 제2010/008075호), 항5T4 항체(미국 특허출원공개 제2006/0088522호 명세서), 항CA9 항체(미국 특허 제7,378,091호 명세서), 항CEA 항체[캔서 리서치(Cancer Res.), 55(23 suppl):5935s-5945s, (1995)], 항LewisY 항체, 항엽산 수용체 항체(국제공개 제2005/080431호), 항TROP-2 항체(미국 특허 제6,794,494호 명세서), 항CD38 항체, 항CD33 항체[Mylotag(등록상표)], 항CD22 항체(Epratuzumab), 항EpCAM 항체, 항A33 항체, 항IL-3Rα 항체(국제공개 제2010/126066호), 항uPAR 항체(미국 특허 제2008/0152587호 명세서), TRAIL2 항체(국제공개 제2002/94880호) 등을 들 수 있다.
알레르기 또는 염증에 관련된 항원을 인식하는 항체로서는, 예컨대, 항인터류킨 6 항체[이뮤놀로지컬 리뷰즈(Immunol. Rev.), 127, 5(1992)], 항인터류킨 6 수용체 항체[몰리큘러 이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 31, 371(1994)], 항인터류킨 5 항체[이뮤놀로지컬 리뷰즈(Immunol.Rev.), 127, 5(1992)], 항인터류킨 5 수용체 항체, 항인터류킨 4 항체[시토킨(Cytokine), 3, 562(1991)], 항인터류킨 4 수용체 항체[저널 오브 이뮤놀로지컬 메소즈(J. Immunol. Methods), 217, 41(1998)], 항인터류킨 10 수용체(IL-10R) 항체(국제공개 제2009/154995호), 항종양 괴사 인자 항체[하이브리도마(Hybridoma), 13, 183(1994)], 항종양 괴사 인자 수용체 항체[몰리큘러 파마콜로지(Molecular Pharmacol.), 58, 237(2000)], 항CCR4 항체[네이처(Nature), 400, 776, (1999)], 항CCR5 항체, 항CCR6 항체, 항케모카인 항체(Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994) 또는 항케모카인 수용체 항체[저널 오브 이뮤놀로지컬 메소즈(J. Exp. Med.), 186, 1373(1997)]이며, 순환기 질환에 관련된 항원을 인식하는 항체가 항GPIIb/IIIa 항체[저널 오브 이뮤놀로지(J. Immunol.), 152, 2968(1994)], 항혈소판 유래 증식 인자 항체[사이언스(Science), 253, 1129(1991)], 항혈소판 유래 증식 인자 수용체 항체[저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(J. Biol. Chem.), 272, 17400(1997)], 항혈액 응고 인자 항체[서큘레이션(Circulation), 101, 1158(2000)], 항IgE 항체[Xolair(등록상표)], 항CD22 항체(Epratuzumab), 항BAFF 항체(Belimumab) 항αVβ3 항체 및 α4β7 항체 등을 들 수 있다.
바이러스 또는 세균 감염에 관련된 항원을 인식하는 항체로서는, 예컨대, 항gp120 항체[스트럭쳐(Structure), 8, 385(2000)], 항인플루엔자 A형 바이러스의 매트릭스 단백질 2(M2, 국제공개 제2003/078600호), 항CD4 항체[저널 오브 류마톨로지(J. Rheumatology), 25, 2065(1998)], 항CCR5 항체 및 항베로독소 항체[저널 오브 클리니컬 마이크로바이올로지(J. Clin. Microbiol.), 37, 396(1999)] 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체는 프로테인 A 결합 활성을 갖는다.
프로테인 A 결합 활성을 갖는다는 것은, 개변 항체 조성물이 프로테인 A를 이용하여 정제 가능함을 말한다.
프로테인 A 결합 활성은, ELISA법, 표면 플라즈몬 공명법 등을 이용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 플레이트에 고상화된 프로테인 A에, 항체 조성물을 반응시킨 후, 각종 표지를 행한 그 항체를 인식하는 항체를 추가로 반응시켜, 프로테인 A에 결합된 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
IgG1 항체와 동등한 프로테인 A 결합 활성이란, 상술한 측정계를 이용하여, 본 발명의 개변 항체 조성물 및 IgG1 항체의 프로테인 A에 대한 결합 활성을 측정한 경우, IgG1 항체와 실질적으로 동등한 결합 활성 또는 어피니티를 갖는 활성을 말한다.
또는 세파로스 등의 담체에 결합시킨 프로테인 A에, pH 5∼8 전후의 높은 pH 조건으로 항체 조성물을 반응시키고, 세정 후, 또 pH 2∼5 전후의 낮은 pH 조건으로 용출하는 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
항체 분자의 Fc 영역에는, 297번째의 Asn 잔기에 N-글리코시드 결합형 당쇄가 결합하는데, 그 이외의 Fc 영역의 Asn 잔기에는 당쇄는 결합하는 것은 거의 알려져 있지 않다. 따라서, 통상, 항체 1 분자당 2 가닥의 당쇄가 결합하고 있다.
Fc 영역의 297번째의 Asn 잔기에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄로서는, 코어 구조(트리만노실 코어 구조)의 비환원 말단 측에 갈락토오스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라 표기함)의 측쇄를 병행하여 1 내지는 복수 가닥 지니고, 또한 Gal-GlcNAc의 비환원 말단 측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등을 갖는 콤플렉스형(복합형) 당쇄를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 코어 푸코오스(core-fucose) 또는 α1,6-푸코오스란, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민(이하, GlcNAc라고 기재하는 경우도 있음)의 6위와 푸코오스(이하, Fuc라고 기재하는 경우도 있음)의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 말한다. 또한, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하지 않는 것을, 단순히 푸코오스가 없거나 또는 코어 푸코오스가 없는 당쇄라고 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 코어 구조 또는 트리만노실 코어 구조(tri-mannosyl core structure)란, Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4 GlcNAc 구조를 말한다.
본 발명에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄는 하기 화학식으로 나타내어진다.
Figure 112012070328018-pct00001
본 발명의 개변 항체 조성물은, 297번째의 Asn에 N-글리코시드 결합형 당쇄가 결합한 Fc 영역을 갖는 항체 분자이며, 상기한 당쇄 구조를 갖고 있으면, 단일의 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있더라도 좋고, 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있더라도 좋다.
즉, 본 발명의 개변 항체 조성물이란, 단일 또는 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 개변 항체 분자로 이루어지는 조성물을 의미한다(전형적인 콤플렉스형 당쇄 구조를 도 1에 도시함).
더욱이, 본 발명의 개변 항체 조성물 중, 297번째의 Asn에 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합한 Fc 영역을 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물이며, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 코어 푸코오스가 없는 당쇄를 갖는 항체 조성물은 CDC 활성 외에 높은 ADCC 활성을 갖는다.
코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율로서는, ADCC 활성이 증가한다면, 어느 비율의 항체나 포함되지만, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 51%∼100%, 더욱 바람직하게는 80%∼100%, 특히 바람직하게는 90%∼99%, 가장 바람직하게는 100%의 비율을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 푸코오스가 없는 당쇄로서는, 상기에서 나타낸 화학식 중, 환원 말단 측의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있지 않으면, 비환원 말단의 당쇄 구조는 어떠한 것이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 있지 않다(코어 푸코오스가 없다)는 것은, 실질적으로 푸코오스가 결합되어 있지 않음을 말한다. 실질적으로 푸코오스가 결합되지 있지 않은 항체 조성물이란, 구체적으로는, 후술하는 4에 기재한 당쇄 분석에 있어서, 푸코오스를 실질적으로 검출할 수 없을 정도의 항체 조성물인 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없는 정도란, 측정의 검출 한계 이하임을 말한다. 모든 당쇄에 코어 푸코오스가 없는 항체 조성물은 가장 높은 ADCC 활성을 갖는다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합한 Fc 영역을 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 중에 포함되는, 푸코오스가 없는 당쇄를 갖는 항체 분자의 비율은, 항체 분자로부터 히드라진 분해나 효소 소화 등의 공지된 방법[생물화학실험법 23-당단백질당쇄연구법(학회출판센터) 타카하시 레이코 편(1989)]을 이용하여 당쇄를 유리시키고, 유리시킨 당쇄를 형광 표지 또는 동위원소 표지하여, 표지한 당쇄를 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다.
또한, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합한 Fc 영역을 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 중에 포함되는, 푸코오스가 없는 당쇄를 갖는 항체 분자의 비율은, 유리시킨 당쇄를 HPAED-PAD법[저널 오브 리퀴드 크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해서 분석함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 생산하는 형질전환주는, 항체 분자의 가변 영역 및 정상 영역을 코드하는 DNA를 삽입한 개변 항체 조성물 발현 벡터를 동물 세포에 도입함으로써 취득할 수 있다.
개변 항체 발현 벡터는 다음과 같이 구축한다.
전술한 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 각각 개변 항체 발현용 벡터에 삽입함으로써, 개변 항체 조성물 발현 벡터를 제작한다.
개변 항체 발현용 벡터로서는, 예컨대, pAGE107[일본 특허공개 평3-22979호 공보; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)], pAGE103[Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)], pHSG274[Brady G. et al., Gene, 27, 223-232(1984)], pKCR[O'Hare K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531(1981)] 및 pSG1βd2-4[Miyaji H. et al., Cytotechnology, 4, 173-180(1990)] 등을 들 수 있다.
개변 항체 발현용 벡터에 이용하는 프로모터와 인핸서로서는, 예컨대, SV40의 초기 프로모터와 인핸서[Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서[Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968(1987)] 및 면역글로불린 H쇄의 프로모터[Mason J. O. et al., Cell, 41, 479-487(1985)]와 인핸서[Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728(1983)] 등을 들 수 있다.
개변 항체 조성물 발현용 벡터는, H쇄 및 L쇄가 따로따로의 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 어느 것이나 이용할 수 있지만, 개변 항체 조성물 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포에의 도입 용이성, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 잡힌다는 등의 점에서 탠덤형의 개변 항체 조성물 발현용 벡터 쪽이 바람직하다[Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278(1994)].
탠덤형의 개변 항체 조성물 발현용 벡터로서는, pKANTEX93(국제공개 제97/10354호), pEE18[Bentley K. J. et al., Hybridoma, 17, 559-567(1998)] 등을 들 수 있다.
구축된 개변 항체 조성물 발현용 벡터의 CH 및 CL을 코드하는 DNA의 상류에, 각종 항원에 대한 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 클로닝함으로써, 개변 항체 조성물 발현 벡터를 구축할 수 있다.
숙주 세포에의 발현 벡터의 도입법으로서는, 예컨대, 일렉트로포레이션법[일본 특허공개 평2-257891호 공보; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)] 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 예컨대, 동물 세포, 식물 세포 및 미생물 등, 재조합 단백질 생산에 일반적으로 이용되는 숙주 세포라면 어떠한 것이나 포함된다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포, 래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 마우스 미엘로마 세포주 NS0 세포, 마우스 미엘로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리아 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포, 인간 버키트 림프종 유래 나말바 세포, 인간 망막아종 유래 PER.C6 세포, 인간 배성(胚性) 신장 조직 유래 HEK293 세포, 인간 골수성 백혈병 유래 NM-F9 세포, 배성 줄기세포 및 수정란 세포 등을 들 수 있다.
바람직하게는, 유전자 재조합 당단백질 의약품을 제조하기 위한 숙주 세포, 유전자 재조합 당단백질 의약품을 생산하는 인간 이외의 트랜스제닉 동물을 제조하기 위해서 이용하는 배성 줄기 세포 또는 수정란 세포 및 유전자 재조합 당단백질 의약품을 생산하는 트랜스제닉 식물을 제조하기 위해서 이용하는 식물 세포 등을 들 수 있다.
친주 세포로서는, GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소 또는 GDP-L-푸코오스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질의 게놈 유전자를 개변시킨 세포 및 유전자 개변을 행하기 전의 세포 어느 것이나 포함한다. 예컨대, 이하의 세포를 적합하게 들 수 있다.
NS0 세포의 친주 세포로서는, 예컨대, 바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 10, 169(1992), 바이오테크놀로지 바이오엔지니어링(Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001) 등의 문헌에 기재되어 있는 NS0 세포를 들 수 있다. 또한, 예컨대, 이화학연구소 세포개발은행에 등록되어 있는 NS0 세포주(RCB0213), 또는 이들 주를 다양한 무혈청 배지에 순화시킨 아주(亞株) 등도 들 수 있다.
SP2/0-Ag14 세포의 친주 세포로서는, 예컨대, 저널 오브 이뮤놀로지(J. Immunol.), 126, 317, (1981), 네이처(Nature), 276, 269, (1978) 및 휴먼 안티바디즈 앤드 하이브리도마즈(Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129, (1992) 등의 문헌에 기재되어 있는 SP2/0-Ag14 세포를 들 수 있다. 또한, 예컨대, ATCC에 등록되어 있는 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL-1581) 또는 이들 주를 다양한 무혈청 배지에 순화시킨 아주(ATCC CRL-1581.1) 등도 들 수 있다.
차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포의 친주 세포로서는, 예컨대, Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968), Genetics, 55, 513(1968), Chromosoma, 41, 129(1973), Methods in Cell Science, 18, 115(1996), Radiation Research, 148, 260(1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275(1968), Cell, 6, 121(1975), Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(p883-900) 등의 문헌에 기재되어 있는 CHO 세포를 들 수 있다.
또한, 예컨대, ATCC에 등록되어 있는 CHO-K1주(ATCC CCL-61), DUXB11주(ATCC CRL-9096), Pro-5주(ATCC CRL-1781) 및 시판되는 CHO-S주(Life technologies사 제조 Cat#11619), 및 이들 주를 다양한 무혈청 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.
래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포의 친주 세포로서는, 예컨대, Y3/Ag1.2.3 세포(ATCC CRL-1631)로부터 수립된 주화 세포가 포함된다. 그 구체적인 예로서는, J. Cell. Biol., 93, 576(1982), Methods Enzymol. 73B, 1(1981) 등의 문헌에 기재되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포를 들 수 있다. 또한, ATCC에 등록되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL-1662) 또는 이들 주를 다양한 무혈청 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.
본 발명에 있어서 CDC 활성뿐만 아니라, ADCC 활성이 높은 개변 항체 조성물을 발현시키는 숙주 세포로서는, 코어 푸코오스를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 숙주 세포, 예컨대, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 결합한 Fc를 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물이며, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 푸코오스가 결합하지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산할 능력을 갖는 숙주 세포, 예컨대 이하의 (a)∼(c)에 예로 드는 적어도 하나의 단백질의 활성이 저하 또는 실활되는 세포 등을 들 수 있다.
(a) 세포내 당뉴클레오티드 GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소; GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제(GMD), Fx, GDP-베타-L-푸코오스-피로포스포릴라아제(GFPP), 푸코키나아제.
(b) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위에 푸코오스의 1위가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소; α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(FUT8).
(c) GDP-L-푸코오스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질; GDP-L-푸코오스 트랜스포터.
또한, 이들 효소 및 트랜스포터 단백질의 아미노산 서열을, BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕 및 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63(1990)〕 등의 해석 소프트를 이용하여 비교, 계산했을 때에, 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 효소 또는 트랜스포터 단백질이며, 이 효소 또는 트랜스포터 단백질의 활성을 갖는 것도 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체를 생산하는 세포로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(FUT8)를 코드하는 유전자가 넉아웃된 CHO 세포, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제(GMD)를 코드하는 유전자가 넉아웃된 CHO 세포, 또는 GDP-L-푸코오스 트랜스포터를 코드하는 유전자가 넉아웃된 CHO 세포 등(국제공개 제02/31140호, 국제공개 제03/85107호)을 들 수 있다.
이러한 세포를 취득하는 방법으로서는, 목적으로 하는 게놈의 개변을 할 수 있으면, 어느 수법이라도 이용할 수 있다. 상술한 효소 활성을 결실시키는 수법으로서, 이하의 (a)∼(e) 등을 들 수 있다.
(a) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법
(b) 효소의 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 수법
(c) 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법
(d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법
(e) N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위와 푸코오스의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법
N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스를 인식하는 렉틴으로서는, 상기 당쇄 구조를 인식할 수 있는 렉틴이라면, 어느 렉틴이라도 이용할 수 있다. 렉틴의 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 및 아스페르길루스 오리제 렉틴 AOL(Aspergillus oryzae 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.
렉틴에 내성인 세포란, 렉틴을 유효 농도 부여했을 때에도 생육이 저해되지 않는 세포를 말한다. 유효 농도란, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포(이하, 「친주 세포」라고도 부름)가 정상적으로 생육할 수 없는 농도 이상이며, 바람직하게는 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포가 생육할 수 없는 농도와 같은 농도, 보다 바람직하게는 2∼5배, 더욱 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 20배 이상이다.
본 발명에 있어서, 생육이 저해되지 않는 렉틴의 유효 농도는, 세포주에 따라서 적절하게 정하면 되지만, 통상 10 ㎍/mL∼10 mg/mL, 바람직하게는 0.5 mg/mL∼2.0 mg/mL인 것이 좋다.
본 발명에 이용하는 트랜스제닉 동물로서는, 예컨대, GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소 또는 GDP-L-푸코오스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질의 활성을 결실시키도록 게놈 유전자를 개변시킨 트랜스제닉 동물 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 예컨대, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자가 넉아웃된 트랜스제닉 동물, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제를 코드하는 유전자가 넉아웃된 트랜스제닉 동물, 또는 GDP-L-푸코오스 트랜스포터를 코드하는 유전자가 넉아웃된 트랜스제닉 동물 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체에는, 개변 항체 또는 이 항체 단편에 방사성 동위원소, 저분자의 약제, 고분자의 약제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자공학적으로 결합시킨 융합 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 개변 항체와 하기에 기재하는 저분자 약제, 고분자 약제, 면역 부활제 및 시토킨 등의 치료약을 동시에 또는 축차적으로 투여하는 의약이라도 좋고, 각각의 약제 성분을 혼합시킨 합제라도 좋다. 각각의 약제 성분을 혼합시킨 합제에는, 본 발명의 개변 항체 및 그 항체 단편에 적어도 1 종류의 약제를 결합시킨 융합 항체 등도 포함한다.
더욱이, 각각의 약제를 함유하는 의약 키트를 조제하여, 이들 약제를 동시에 또는 축차적으로 환자에게 투여하더라도 좋고, 혼합시킨 후에 환자에게 투여하더라도 좋다.
본 발명에 있어서의 융합 항체는, 본 발명의 개변 항체 또는 그 항체 단편의 H쇄 혹은 L쇄의 N 말단 측 혹은 C 말단 측, 항체 또는 그 항체 단편 중의 적당한 치환기 혹은 측쇄, 나아가서는 항체 또는 그 항체 단편 중의 당쇄 등에, 방사성 동위원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 면역 부활제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 수법[항체공학입문, 치진쇼칸(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체 또는 그 항체 단편을 코드하는 DNA와, 결합시키고 싶은 단백질 또는 항체 의약을 코드하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하고, 이 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시키는 유전자공학적 수법으로 제조할 수 있다.
방사성 동위원소로서는, 예컨대, 111In, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At 및 212Bi 등을 들 수 있다. 방사성 동위원소는, 클로라민T법 등에 의해서 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시키더라도 좋다.
킬레이트제로서는, 예컨대, 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타초산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자 약제로서는, 예컨대, 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사 길항제, 항생 물질, 식물 알카로이드, 토포이소메라제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타아제 저해제, P당단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제 및 키나아제 저해제 등의 항암제[임상종양학, 암과 화학요법사(1996)] 또는 하이드로코르티손 및 프리드니손 등의 스테로이드제, 아스피린 및 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금(金)티오말레이트 및 페니실라민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드 및 아조티오푸린 등의 면역 억제제, 및 말레산클로르페니라민 및 클레마시틴 등의 항히스타민제 등의 항염증제[염증과 항염증 요법, 의치약 출판주식회사(1982)] 등을 들 수 있다.
항암제로서는, 예컨대, 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(니트로겐 머스터드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 젬시타빈(젬자), 다우노루비신, 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(탁소텔), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캄토테신, 10-히드록시-7-에틸-캄토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미토산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 멜캅토퓨린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 스트렙토조신, 타목시펜, 고세렐린, 류프로레린, 플루타미드, 테니포시드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토무덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티닙(이레사), 이마티닙(STI571), 엘로티닙, FMS-유사 티로신 키나제 3(Flt3) 저해제, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체(VEGFR) 저해제, 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 저해제, 이레사 및 타르세바 등의 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스-레티노인산, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오푸린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류플린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 아자티오푸린, 페니실라민, 금티오말레이트, 말레산클로르페니라민, 클로르페니라민, 클레마시틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로푸리놀, 칼리케아마이신, 이브리투모맙 튜세탄, 타르그레틴, 오조가민, 클라리트로마신, 류코보린, 이파스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 메토트렉세이트, 마이탄시노이드, 마이탄시노이드 DM1 및 마이탄시노이드 DM4 또는 그 유도체 등을 들 수 있다.
저분자 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 예컨대, 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법 및 수용성 카르보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자의 약제로서는, 예컨대, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG라 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산 코폴리머, 폴리비닐피롤리돈, 피란 코폴리머 및 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다.
이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 여러 가지 인자에 대한 안정성 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 생성의 억제 등의 효과가 기대된다[바이오컨쥬게이트 의약품, 히로카와쇼텐(1993)].
PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 예컨대, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다[바이오컨쥬게이트 의약품, 히로카와쇼텐(1993)].
PEG화 수식 시약으로서는, 예컨대, 리신의 ε-아미노기에의 수식제(일본 특허공개 소61-178926호 공보), 아스파라긴산 및 글루타민산의 카르복실기에의 수식제(일본 특허공개 소56-23587호 공보) 및 아르기닌의 구아니디노기에의 수식제(일본 특허공개 평2-117920호 공보) 등을 들 수 있다.
면역 부활제로서는, 예컨대, 면역 보조 물질로서 알려져 있는 천연물이라도 좋으며, 구체예로서는, 면역을 항진하는 약제가, β(1→3)글루칸(렌티난, 시조피란) 및 α갈락토실세라미드 등을 들 수 있다.
단백질로서는, 예컨대, NK 세포, 대식세포 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화하는 시토킨 또는 증식 인자 및 독소 단백질 등을 들 수 있다.
시토킨 또는 증식 인자로서는, 예컨대, 인터페론(이하, INF라고 기재함)-α, INF-β, INF-γ, 인터류킨(이하, IL이라고 기재함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), Fas 리간드(FasL) 및 TRAIL 리간드(Apo2L) 등을 들 수 있다.
독소 단백질로서는, 예컨대, 리신, 디프테리아톡신, 약독화 디프테리아톡신 CRM197 및 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해서 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로서는, 예컨대, 항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관련한 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원 및 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원으로서는, 예컨대, 분화 클러스터(Cluster of differentiation)(이하, CD라 기재함)19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), Fas 수용체, TRAIL 수용체, 인간 백혈구 항원(HLA)-클래스 II 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관련한 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, 예컨대, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(예컨대, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 및 B7-H4 등), B7 패밀리 분자의 리간드(예컨대, CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 및 BTLA 등), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리 분자(예컨대, DR4, DR5, TNFR1 및 TNFR2 등), TNF-관련 아폽토시스 유도성 리간드 수용체(TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(예컨대, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 및 TRAIL-R4 등), 핵인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제(RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체 4, 시토킨[예컨대, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 트랜스포밍 성장 인자(transforming growth factor)(TGF)β 및 TNFα 등], 이들 시토킨의 수용체, 케모카인(예컨대, SLC, ELC, I-309, TARC, MDC 및 CTACK 등) 또는 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, 예컨대, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 섬유아세포 성장 인자(FGF), EGF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 에리트로포이에틴(EPO), TGFβ, IL-8, 에필린(Ephilin) 및 SDF-1, 및 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는, 모노클로널 항체 또는 항체 단편을 코드하는 cDNA에 단백질을 코드하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코드하는 DNA를 구축하고, 이 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에게 도입함으로써 발현시켜, 융합 항체를 제조할 수 있다.
상기 융합 항체를 검출 방법, 정량 방법, 검출용 시약, 정량용 시약 또는 진단약으로서 사용하는 경우에, 본 발명의 개변 항체 또는 그 항체 단편에 결합하는 약제로서는 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 이용되는 표지체를 들 수 있다.
표지체로서는, 예컨대, 알칼리포스파타아제, 페록시다아제 및 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄에스테르 및 로핀 등의 발광 물질, 및 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 및 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체는, 항체가 특이적으로 결합하는 항원이 발현하고 있는 질환이라면, 어느 질환의 치료약이라도 좋지만, 상술한 암, 자기면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 순환기 질환, 바이러스 또는 세균의 감염증에 관련된 항원을 발현하고 있는 질환의 치료약이 바람직하다.
본 발명의 개변 항체는, Fc 영역에의 불필요한 당쇄 결합이 없고, 또한 높은 이펙터 활성을 지니므로, 암, 자기면역 질환 등의 원인 세포의 치료에 유효하다.
암으로서는, 예컨대, 혈액암, 두경부암, 글리오마, 설암, 후두암, 식도암, 위암, 췌장암(예컨대, 췌두암, 췌체암, 췌미암 및 췌관암), 소장암, 대장암, 폐암(예컨대, 소세포성 폐암, 대세포성 폐암, 선암 및 편평상피암), 중피종, 간암, 담낭암, 담관암, 신장암, 자궁암(예컨대, 자궁경부암 및 자궁체암), 난소암, 난소배세포종양, 전립선암, 방광암, 골육종, 피부암, 균상식육증, 유잉종양, 악성골종양 및 멜라노마 등을 들 수 있다.
혈액암으로서는, 예컨대, 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, T세포 유래의 암 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 피부 T 세포성 림프종(Cutaneous T cell lymphoma, CTCL), 말초 T 세포성 림프종(peripheral T cell lymphoma, PTCL), 미분화대세포형 림프종(Anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 급성 림프성 백혈병(Acute lympatic leukemia, ALL), 다발성 골수종, 호지킨림프종 또는 비호지킨림프종(예컨대, 버키트림프종, 림프아구성 림프종, 미만성 대세포성 B세포성 림프종, 미분화대세포 림프종, MANTL 림프종 및 여포성 림프종) 등을 들 수 있다.
자기면역 질환으로서는, 예컨대, 하시모토병, 바세도우병, 돌발성 혈소판감소성 자반병, 돌발성 호중구감소증, 거적아구성 빈혈, 용혈성 빈혈, 중증근무력증, 건선, 천포창, 유천포창, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척수염, 다발성 경화증, I형당뇨병, 간염, 심근염, 쉐그렌증후군, 관절류머티즘, 전신성 에리테마토데스(SLE), 항인지질항체증후군, 다발성근염, 피부근염, 전신성 피부경화증 및 이식후 거부 반응 등을 들 수 있다.
알레르기성 질환으로서는, 예컨대, 급성 또는 만성 기도과민증, 기관지천식, 아토피성 피부염 및 알레르기성 비염 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 개변 항체 조성물의 제조 방법을 구체적으로 설명한다.
1. 개변 항체 조성물의 제조 방법
본 발명의 개변 항체 조성물은, 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약칭함), Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로널 안티바디즈라고 약칭함) 및 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티바디엔지니어링이라 약칭함) 등에 기재된 방법을 이용하여, 예컨대 다음과 같이 숙주 세포 속에서 발현시켜 취득할 수 있다.
(1) 본 발명의 개변 항체 조성물 발현 벡터의 구축
본 발명의 개변 항체 조성물 발현 벡터란, 본 발명의 개변 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코드하는 유전자가 들어간 동물 세포용 발현 벡터이다.
개변 항체 조성물 발현용 벡터는, 동물 세포용 발현 벡터에 개변 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코드하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역을 코드하는 유전자는, IgG1 항체의 H쇄 정상 영역을 코드하는 유전자를 클로닝한 후, 원하는 아미노산 서열을 코드하는 유전자 단편을 연결시킴으로써 제작할 수 있다.
또한, 합성 DNA를 이용하여 전체 DNA를 합성할 수도 있으며, PCR법에 의한 합성도 가능하다(몰리큘러 클로닝 제2판). 또한, 이들 수법을 복수 조합함으로써, 개변 항체의 H쇄 정상 영역을 제작할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn, X 및 Ser/Thr의 어느 아미노산 잔기를 어떤 아미노산 잔기로 개변하는지는, N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열의 N 말단 측 또는 C 말단 측의 아미노산 서열을 고려함으로써 결정할 수 있다.
즉, 아미노산 개변의 결과, 새로운 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열이 생기지 않도록 아미노산 잔기를 행하는 위치, 개변 후의 아미노산 잔기를 고려하여 행함으로써 적절한 아미노산 개변을 할 수 있다. 본 발명에 있어서 구체적으로는 하기와 같이 디자인을 결정할 수 있다.
인간 항체의 Fc 영역(서열 번호 1)에 있어서 EU 인덱스 297∼299번 이외의 결합형 당쇄 컨센서스 서열은 392∼394번째에 Asn-Thr-Thr이 존재하며, 그 전후의 아미노산 서열은 Asn389-Asn390-Tyr391-Asn392-Thr393-Thr394-Pro395-Pro396이다(도 4 참조).
Asn392를 Ser/Thr로 아미노산 개변한 경우는, 390번째에는 Asn이 존재하기 때문에, 새롭게 390Asn-391Tyr-392Ser/Thr의 컨센서스 서열이 생겨 버린다. 따라서, Asn392는 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 및 Trp에서 선택되는 아미노산 잔기로 개변하는 것이 바람직하다. 또한, Thr393은 Pro로 개변하는 것이 바람직하고, 394Thr은 Ser/Thr 이외의 아미노산 잔기로 개변하는 것이 바람직하다.
이와 같이, N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열의 근방에 존재하는 아미노산 잔기(1∼3 잔기)와, 아미노산 개변 후의 아미노산 서열을 디자인함으로써, 적절한 아미노산 개변 위치 및 적절한 아미노산 개변 잔기를 선택할 수 있다.
동물 세포용 발현 벡터로서는, 상술한 항체 분자의 정상 영역을 코드하는 유전자를 집어넣어 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, pKANTEX93[몰리큘러 이뮤놀로지(Mol. Immunol.), 37, 1035(2000)], pAGE107[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAGE103[저널 오브 바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], pHSG274[진(Gene), 27, 223(1984)], pKCR[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527(1981)], pSG1βd2-4[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 4, 173(1990)] 등을 들 수 있다.
동물 세포용 발현 벡터에 이용하는 프로모터와 인핸서로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서[저널 오브 바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR[바이오케미컬 앤드 바이오피지컬 리서치 커뮤니케이션즈(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960(1987)], 면역글로불린 H쇄의 프로모터[셀(Cell), 41, 479(1985)]와 인핸서[셀(Cell), 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터는, 항체 H쇄 및 L쇄가 따로따로의 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라 표기함)의 어느 쪽이나 이용할 수 있지만, 본 발명의 개변 항체 조성물 발현 벡터의 구축 용이성, 동물 세포에의 도입 용이성 및 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이룬다는 등의 점에서 탠덤형의 항체 발현용 벡터 쪽이 바람직하다[저널 오브 이뮤놀로지컬 메소즈(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)].
구축한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현 벡터는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2) 비인간 동물 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA의 취득
비인간 동물 항체, 예컨대, 마우스 항체의 H쇄 가변 영역(이하, VH라 표기함) 및 L쇄 가변 영역(이하, VL이라 표기함)을 코드하는 cDNA는 다음과 같이 하여 취득할 수 있다.
임의의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 이용하여 cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작한다.
상기 라이브러리로부터, 기존의 마우스 항체의 정상 영역 또는 가변 영역을 코드하는 DNA를 프로브로서 이용하여, VH를 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 및 L쇄 가변 영역을 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다.
재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적의 마우스 항체의 VH 및 VL의 전체 염기 서열을 결정하여, 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
임의의 비인간 동물 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 항체가 결합하는 항원을 비인간 동물에게 면역하여, 주지된 방법[몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약칭함), Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로널 안티바디즈라고 약칭함), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티바디엔지니어링이라고 약칭함)]에 따라서, 면역된 동물의 항체 생성 세포와 미엘로마 세포로 하이브리도마를 제작한다. 이어서 싱글 셀 클로닝한 하이브리도마를 선택하고, 이것을 배양하여, 배양 상청으로부터 정제하여, 취득할 수 있다.
비인간 동물로서는, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 및 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하다면, 어떠한 것이나 이용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 티오시안산구아니딘-트리플루오로초산세슘법[메소즈 인 엔자이몰로지(Methods in Enzymol.), 154, 3(1987)], RNeasy kit(QIAGEN사 제조)을 들 수 있다.
전체 RNA에서 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 컬럼법[몰리큘러 클로닝 : 어 라보라토리 매뉴얼(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다.
또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제하는 키트로서는, 예컨대, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사 제조) 및 Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 예컨대, 통상의 방법[몰리큘러 클로닝 : 어 라보라토리 매뉴얼(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34] 및 시판되는 키트를 이용하는 방법을 들 수 있다.
시판되는 키트로서는, 예컨대, Super Script(등록상표) Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL사 제조) 및 ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작할 때, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 집어넣는 벡터는, 그 cDNA를 집어넣을 수 있는 벡터라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다.
예컨대, ZAP Express[스트라테지즈(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익 애시즈 리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11[디엔에이 클로닝 : 어 프랙티컬 어프로치(DNA Cloning : A Practical Approach), I, 49(1985)], Lambda BlueMid(Clontech사 제조), λExCell, pT7T3 18U(Pharmacia사 제조), pcD2[몰리큘러 앤드 셀룰러 바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 이용할 수 있다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다.
예컨대, XL1-Blue MRF'[스트라테지즈(strategies), 5, 81(1992)], C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], NM522[저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], K802[저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 이용된다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA 클론을 선택하는 방법으로서는, 아이소토프 또는 형광 등으로 표지한 프로브를 이용한 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 플라크 하이브리다이제이션법[몰리큘러 클로닝 : 어 라보라토리 매뉴얼(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]에 의해 선택할 수 있다.
또한, 프라이머를 조제하고, cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR[몰리큘러 클로닝 : 어 라보라토리 매뉴얼(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34]에 의해 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA를 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행하여, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써 상기 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 이미 알려진 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[시퀀시즈 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL을 완전히 포함하고 있는 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 항체 가변 영역의 아미노산 서열 또는 이 가변 영역을 코드하는 DNA의 염기 서열이 이미 공지인 경우에는 이하의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
아미노산 서열이 공지인 경우에는, 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려하여 그 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 설계하고, 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100∼150 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 가닥의 합성 DNA를 합성한다. 그 후, 합성 DNA를 이용하여 PCR법을 행하거나 완전 길이의 DNA를 합성함으로써 DNA를 얻을 수 있다. 염기 서열이 공지인 경우에는, 그 정보를 기초로 상술한 것과 같은 식으로 DNA를 얻을 수 있다.
(3) 비인간 동물 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 해석
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 이미 알려진 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[시퀀시즈 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가서는 항체가 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 관해서도 같은 방법으로 알아낼 수 있다.
(4) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본항 1의 (1)에 기재한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코드하는 유전자의 상류에, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 각각 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예컨대, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를, 비인간 동물 항체 VH 및 VL의 3' 말단 측의 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL의 5' 말단 측의 염기 서열로 이루어지고, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양끝에 갖는 합성 DNA와 각각 연결한다. 각각을 본항 1의 (1)에 기재한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코드하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5) 인간화 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA는 다음과 같이 하여 구축할 수 있다. 우선, 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크 영역(이하, FR이라 표기함)의 아미노산 서열을 선택한다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체인 것이라면, 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[시퀀시즈 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해서는, 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
이어서, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열에 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈 오브 프로테인즈 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려하여 DNA 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열을 완전 합성한다.
또한, 양끝에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본항 1의 (1)에서 구축한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 본항 1의 (2)에 기재한 방법에 의해 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6) 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 동물 항체에 비교하여 저하되어 버리는 것이 알려져 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)].
이 원인으로서는, 원래의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL에서는, CDR뿐만 아니라, FR의 몇 개의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있어, 이들 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 따라, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR이 다른 아미노산 잔기로 변화되어 버리는 것이 생각되고 있다.
이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하여, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하여, 이들을 원래의 비인간 동물 항체에 유래하는 아미노산 잔기로 개변하여, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 행해지고 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)].
인간화 항체의 제작에 있어서는, 이들 항원 결합 활성에 관련한 FR의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정할지가 가장 중요한 점이며, 그 때문에 X선 결정 해석[저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[프로테인 엔지니어링(Protein Engineering), 7, 1501(1994)] 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 행해지고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져왔다.
그러나, 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제작법은 아직 확립되지 못했다. 현재로서는 각각의 항체에 대해서 여러 종류의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지 시행착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA를 이용하여 본항 1의 (5)에 기재한 PCR법을 행함으로써 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대해서 본항 1의 (2)에 기재한 방법에 의해 염기 서열을 결정하여, 목적의 개변이 실시되었음을 확인한다.
(7) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
본항 1의 (1)에 기재한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자의 상류에, 본항 1의 (5) 및 (6)에서 구축한 인간화 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예컨대, 본항 1의 (5) 및 (6)에서 인간화 항체의 VH 및 VL을 구축할 때에 이용하는 합성 DNA 중, 양끝에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본항 1의 (1)에 기재한 본 발명의 개변 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(8) 인간화 항체의 안정적 생산
본항 1의 (4) 및 (7)에 기재한 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 동물 세포에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질전환주를 얻을 수 있다.
동물 세포에의 인간화 항체 발현 벡터의 도입법으로서는, 일렉트로포레이션법[일본 특허공개 평2-257891호 공보; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)] 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물 세포로서는, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산시킬 수 있는 동물 세포라면, 어떠한 세포라도 이용할 수 있다.
구체적으로는, 예컨대, 마우스 미엘로마 세포인 NS0 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO/dhfr- 세포, CHO/DG44 세포, 래트 미엘로마 세포 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리아 햄스터 신장에서 유래하는 BHK 세포, 인간 미엘로마 세포인 나말바 세포 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포 및 래트 미엘로마 YB2/0 세포 등이 바람직하다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터의 도입 후, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질전환주는, 일본 특허공개 평2-257891호 공보에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 황산염(이하, G418이라 표기함; SIGMA사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 의해 선택할 수 있다.
동물 세포 배양용 배지로서는, 예컨대, RPMI1640 배지(닛수이세이야쿠사 제조), GIT 배지(닛폰세이야쿠사 제조), EX-CELL302 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM 배지(GIBCO BRL사 제조), Eagle의 MEM 배지[사이언스(Science), 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[바이롤로지(Virology), 8, 396(1959)], 199 배지[프로시딩 오브 더 소사이어티 포 더 바이올로지컬 메디신(Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1(1950)] 및 Whitten 배지[발생공학 실험 매뉴얼-트랜스젝션 마우스를 만드는 방법(코단샤) 카츠키 모토야 편(1987)] 및 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FCS라 표기함) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.
얻어진 형질전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[이하, ELISA법이라 표기함; 안티바디즈 : 어 라보라토리 매뉴얼(Antibodies : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, 모노클로널 안티바디즈 : 프린시플즈 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등에 의해 측정할 수 있다.
또한, 형질전환주는, 일본 특허공개 평2-257891호 공보에 개시되어 있는 방법에 따라서, DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체는, 형질전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다[안티바디즈 : 어 라보라토리 매뉴얼(Antibodies : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988, 모노클로널 안티바디즈 : 프린시플즈 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996].
또한, 그 밖에 통상 단백질의 정제에서 이용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외여과 등을 조합 실시하여 정제할 수 있다.
정제한 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 H쇄, L쇄 혹은 항체 분자 전체의 분자량은, 예컨대 SDS 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동[이하, SDS-PAGE라 표기함; 네이처(Nature), 227, 680(1970)] 및 웨스턴 블로팅법[안티바디즈 : 어 라보라토리 매뉴얼(Antibodies : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, 모노클로널 안티바디즈 : 프린시플즈 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등으로 측정할 수 있다.
이상, 동물 세포를 숙주로 한 항체 조성물의 제조 방법을 나타냈지만, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 또는 식물 개체에 있어서도 동물 세포와 같은 방법에 의해 항체 조성물을 제조할 수 있다.
따라서, 숙주 세포가 항체 분자를 발현할 능력을 갖는 경우에는, 이하에 나타내는 항체 분자를 발현시키는 숙주 세포에 항체 유전자를 도입한 후에, 이 세포를 배양하여, 이 배양물로부터 목적으로 하는 항체 조성물을 정제함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제조할 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051) 및 YCp50(ATCC37419) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 균주 속에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것을 이용하더라도 좋다. 예컨대, 헥소스키나아제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터 및 CUP1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 사카로미세스속, 시조사카로미세스속, 클류이베로미세스속, 트리코스포론속, 슈와니오미세스속 등에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클류이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈와니오미세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, 일렉트로포레이션법[메소즈 인 엔자이몰로지(Methods. Enzymol.), 194, 182(1990)], 스페로플라스트법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929(1978)], 초산리튬법[저널 오브 박테리올로지(J. Bacteriology), 153, 163(1983) 및 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929(1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, pcDNAI, pcDM8(푸나코시사에서 시판), pAGE107[일본 특허공개 평3-22979호 공보; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133,(1990)], pAS3-3[일본 특허공개 평2-227075호 공보], pCDM8[네이처(Nature), 329, 840,(1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사), pREP4(Invitrogen사), pAGE103[저널 오브 바이오케미스트리(J. Biochemistry), 101, 1307(1987)] 및 pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 속에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 및 SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용하더라도 좋다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 인간의 세포인 나말바(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637(일본 특허공개 소63-299호 공보), 래트 미엘로마 세포, 마우스 미엘로마 세포, 시리아 햄스터 신장에서 유래하는 세포, 배성 줄기세포 및 수정란 세포 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 예컨대, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992) 및 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 6, 47(1988) 등에 기재된 방법에 의해서 단백질을 발현할 수 있다.
즉, 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 함께 도입하여 곤충 세포 배양 상청 속에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 발현시킬 수 있다.
이 방법에 있어서 이용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 Invitorogen사) 등을 들 수 있다.
바큘로바이러스로서는, 예컨대, 도둑나방과 곤충을 감염시키는 바이러스인 아우토그라파 칼리포르니카 누클레아 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)를 들 수 있다.
곤충 세포로서는, 예컨대, Spodoptera frugiperda의 난소 세포인 Sf9, Sf21[커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지-Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)] 및 Trichoplusiani의 난소 세포인 High 5(Invitrogen사) 등을 이용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포에의 상기 발현 도입 벡터와 상기 바큘로바이러스를 함께 도입하는 방법으로서는, 예컨대, 인산칼슘법(일본 특허공개 평2-227075호 공보) 및 리포펙션법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물 세포를 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, Ti 플라스미드, 담배모자이크바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 식물 세포 속에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것을 이용하더라도 좋으며, 예컨대, 콜리플라워모자이크바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 담배, 감자, 토마토, 당근, 콩, 유채, 알팔파, 벼, 밀 및 보리 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 식물 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, 아그로박테리움(Agrobacterium)[일본 특허공개 소59-140885호 공보, 일본 특허공개 소60-70080호 공보, 국제공개 제94/00977호], 일렉트로포레이션법[일본 특허공개 소60-251887호 공보] 및 파티클 건(유전자 총)을 이용하는 방법[일본 특허 제2606856호 명세서, 일본 특허 제2517813호 명세서] 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예컨대 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, 일렉트로포레이션법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], 인산칼슘법[일본 특허공개 평2-227075호 공보], 리포펙션법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)], 인젝션법[매니퓰레이팅 더 마우스 엠브리오 어 라보라토리 매뉴얼], 파티클 건(유전자총)을 이용하는 방법[일본 특허 제2606856호 명세서, 일본 특허 제2517813호 명세서], DEAE-덱스트란법[바이오 매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법(요도샤) 요코타 타카시·아라이 켄이치 편(1994)], 바이러스 벡터법[매니퓰레이팅 마우스 엠브리오 제2판] 등을 들 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 예컨대, 몰리큘러 클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산 또는 Fc와 다른 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질전환체를 배지에 배양하여, 배양물 속에 항체 분자를 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주 세포의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 이 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면 천연 배지 및 합성 배지의 어느 것을 이용하더라도 좋다.
탄소원으로서는, 상기 생물이 자화할 수 있는 것이라면 좋으며, 예컨대, 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 및 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 초산 및 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류 등을 이용할 수 있다.
질소원으로서는, 예컨대, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 초산암모늄 및 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 함질소 화합물, 펩톤, 육류 엑기스, 효모 엑기스, 콘 스팁 리커, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 및 각종 발효 균체 및 그 소화물 등을 이용할 수 있다.
무기 염류로서는, 예컨대, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산동 및 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.
배양은, 통상 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 15∼40℃가 바람직하고, 배양 시간은 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 pH는 3.0∼9.0로 유지한다. pH의 조제는 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서 암피실린 및 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 유도 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가하더라도 좋다.
배양은 통상 pH 6.0∼8.0, 30∼40℃, 5% CO2 존재 등의 조건 하에서 1∼7일간 행하는 것이 바람직하다.
또한, 배양 중 필요에 따라서 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다.
곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 예컨대, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사), Sf-900 II SFM 배지(Life Technologies사), ExCell400, ExCell405(모두 JRH Biosciences사), Grace's Insect Medium[네이처(Nature), 195, 788(1962)] 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6.0∼7.0, 25∼30℃ 등의 조건 하에서 1∼5일간 행하는 것이 바람직하다.
또한, 배양 중 필요에 따라서 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다.
식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는, 세포로서 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 이 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 예컨대, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿠그(MS) 배지 및 화이트(White) 배지 및 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등의 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH 5.0∼9.0, 20∼40℃의 조건 하에서 3∼60일간 행하는 것이 바람직하다.
또한, 배양 중 필요에 따라서 카나마이신 및 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가하더라도 좋다.
상기한 것과 같이, 항체 분자를 코드하는 DNA를 집어넣은 발현 벡터를 보유하는 동물 세포 또는 식물 세포 유래의 형질전환체를 통상의 배양 방법에 따라서 배양하여, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 예컨대, 몰리큘러 클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법에 준하여, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
항체 조성물의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포나 생산시키는 항체 분자의 구조를 바꿈으로써 상기 방법을 선택할 수 있다.
항체 조성물이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 예컨대, 폴슨 등의 방법[저널 오브 바이올로지컬 케미스트리(J. Biol. Chem.), 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227(1989); 진 디벨로프먼트(Genes Develop.), 4, 1288(1990)], 일본 특허공개 평05-336963호 공보 및 국제공개 제94/23021호 공보 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 상기 항체 조성물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합 수법을 이용하여, 발현 벡터에, 항체 분자를 코드하는 DNA 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코드하는 DNA를 삽입하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입 후에 항체 분자를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 항체 분자를 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 특허공개 평2-227075호 공보에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 이용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
더욱이, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체(트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체(트랜스제닉 식물)를 조성하여, 이들 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조할 수도 있다.
형질전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우는, 통상의 방법에 따라서 사육 또는 재배하여 항체 조성물을 생성 축적시키고, 이 동물 개체 또는 식물 개체로부터 상기 항체 조성물을 채취함으로써, 상기 항체 조성물을 제조할 수 있다.
동물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대, 공지된 방법[아메리칸 저널 오브 클리니컬 뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S(1996); 아메리칸 저널 오브 클리니컬 뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S(1996); 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 9, 830(1991)]에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 목적으로 하는 항체 조성물을 생산시키는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우는, 예컨대, 항체 분자를 코드하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하여, 항체 조성물을 그 동물 중에 생성·축적시키고, 그 동물 속에서 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다. 상기 동물 중의 생성·축적 장소로서는, 예컨대, 그 동물의 젖(일본 특허공개 소63-309192호 공보) 또는 난(卵) 등을 들 수 있다.
이 때에 이용되는 프로모터로서는, 동물에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 예컨대, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카제인 프로모터, β 카제인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터 및 훼이 산성 프로테인 프로모터 등이 적합하게 이용된다.
식물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대, 항체 분자를 코드하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법[조직배양, 20(1994); 조직배양, 21(1995); 트렌드 인 바이오테크놀로지(Trends in Biotechnology), 15, 45(1997)]에 준하여 재배하여, 항체 조성물을 그 식물 중에 생성·축적시키고, 그 식물 중에서 상기 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 형질전환체에 의해 제조된 항체 조성물은, 예컨대, 항체 조성물이, 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하여, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤-가울린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다.
상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75[미쓰비시가가쿠(주) 제조] 등 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법 및 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합하여 이용하여, 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 항체 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하여, 원심 분리를 함으로써, 침전 분획으로서 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 이 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 항체 조성물을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 같은 단리 정제법에 의해 그 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
항체 조성물이 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 상기 항체 조성물 또는 그 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 상기 배양물을 상기와 같은 원심 분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상청을 취득하여, 그 배양 상청으로부터, 상기와 같은 단리 정제법을 이용함으로써 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
본 발명의 정제된 개변 항체 조성물은, Fc 영역에 있어서 EU 인덱스 297번째의 Asn 이외에 당쇄가 결합하지 않는 항체 분자를 단일로 포함하고 있는 조성물이다. 즉, 본 발명의 정제된 개변 항체 조성물은, Fc 영역에 있어서 EU 인덱스 297번째의 Asn에만 당쇄가 결합하고 있는 개변 항체 분자를 단일로 포함하고 있는 조성물이다.
또한, 본 발명의 정제된 개변 항체 조성물은, Fc 영역에 있어서 EU 인덱스 297번째의 Asn 이외의 여분의 당쇄가 결합하지 않은 항체 분자를 균일하게 포함하는 항체 조성물이기 때문에, 여분의 당쇄가 결합한 항체 분자를 포함하는 항체 조성물과 비교하여 보다 의약품으로서 유용하다.
2. 본 발명의 개변 항체 조성물을 생산하는 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물에 있어서, Fc 영역의 297번째의 Asn에 결합하는 당쇄의 코어 푸코오스를 제어함으로써, 297번째 이외의 Asn에 결합하는 당쇄가 감소 또는 결손되고, 또한 높은 ADCC 활성을 갖는 개변 항체 조성물을 제작할 수 있다. 코어 푸코오스를 제어한 세포는 이하에 설명하는 수법에 의해 제작할 수 있다.
구체적으로는, 항체 Fc 영역의 297번째의 Asn에 결합하는 당쇄의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련된 효소인 GDP-L-푸코오스의 합성 혹은 골지체에의 수송에 관여하는 효소, 또는 코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소가 실활된 세포를 선택하거나 또는 후술하는 여러 가지 인위적 수법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 이용할 수도 있다. 이하, 상세히 설명한다.
구체적으로는, 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련된 효소 활성을 감소 또는 결손시키는 방법, 또는 코어 푸코오스 절단 효소 활성을 증가시킴으로써, 코어 푸코오스를 제어한 세포를 제작할 수 있다.
코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련된 효소로서는, 예컨대 GDP-L-푸코오스의 합성 또는 수송에 관여하는 효소 및 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소를 들 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성 또는 골지체에의 수송에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, 예컨대, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제(이하, GMD라 표기함), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제(이하, Fx라 표기함), GDP-베타-L-푸코오스-피로포스포릴라아제(GFPP), 푸코키나아제 및 GDP-L-푸코오스 트랜스포터 등을 들 수 있다.
코어 푸코오스의 결합에 관여하는 효소로서는, 예컨대 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(이하, FUT8이라 표기함), α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 생산하는 세포로서는, 상술한 하나의 효소 활성을 저하 또는 결손시키더라도 좋고, 복수의 효소 활성을 조합시켜 저하 또는 결손시키더라도 어떠하더라도 좋다. 또한, 원래 코어 푸코오스의 당쇄 수식에 관련된 효소 활성이 낮은 세포의 코어 푸코오스의 당쇄 수식에 관련된 효소 활성을 더욱 저하, 결손시킬 수도 있다.
(1) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법
높은 ADCC 활성을 갖는 항체(이하, 고ADCC 활성 항체라고 함) 생성 세포의 제작을 위해서 이용하는 숙주 세포는, 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관련된 효소의 유전자를 파괴함으로써 제작할 수 있다.
여기서 말하는 유전자란, DNA 또는 RNA를 포함한다.
유전자 파괴의 방법으로서는, 표적으로 하는 효소의 유전자를 파괴할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법도 포함된다. 그 예로서는, 안티센스법, 리보자임법, 상동재조합법, RNA-DNA 올리고 뉴클레오티드법(이하, 「RDO법」이라고 표기함), RNA인터페어런스법(이하, 「RNAi법」이라고 표기함), 레트로바이러스를 이용한 방법, 트랜스포존을 이용한 방법 등을 들 수 있다. 이하 이들을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용되는 숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖고 있거나, 또는 원래 상기 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖지 않는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 상기 1.에 기재한 숙주 세포의 어느 것이나 이용할 수 있다.
식물 세포를 이용하는 경우에는, α1,3-푸코오스의 결합에 관여하는 효소 및 β1,2-자일로오스의 결합에 관여하는 효소의 유전자를 감소 또는 결손시켜 이용함으로써 인간형 당쇄를 갖는 단백질을 생산할 수 있다.
(a) 안티센스법 또는 리보자임법에 의한 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물의 제작을 위해서 이용하는 숙주 세포는, 푸코오스 수식에 관련된 효소 유전자를 표적으로 하고, 세포공학, 12, 239(1993), 바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097(1999), 휴먼 몰리큘러 제네틱스(Hum. Mol. Genet.), 5, 1083(1995), 세포공학, 13, 255(1994) 및 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886(1999) 등에 기재된 안티센스법 또는 리보자임법을 이용하여, 예컨대 다음과 같이 제작할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA를 조제한다. 조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다. 결정한 DNA의 서열에 기초하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 DNA 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임의 콘스트럭트를 설계한다.
상기 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 세포 내에서 발현시키기 위해서, 조제한 DNA의 단편 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다. 이 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질전환체를 얻는다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다. 또한, 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조 또는 생성 당단백질 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나 또는 염색체 속에 집어넣을 수 있어, 설계한 안티센스 유전자 혹은 리보자임를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 예컨대 후술하는 3에 기재한 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포에의 유전자의 도입 방법으로서는, 예컨대 후술하는 2에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 이하의 방법을 들 수 있다.
(형질전환체를 선택하는 방법)
푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성이 결실된 세포를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 문헌[신생화학실험강좌 3-당질 I, 당단백질(도쿄가가쿠도진) 일본생화학회편(1988)], 문헌[세포공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글라이코바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질·당지질·프로테오글리칸(슈쥰샤 제조) 타니구치 나오유키·스즈키 아키라미·후루카와 키요시·스가하라 카즈유키 감수(1996)], 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 및 유전자공학적인 방법 등을 이용하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 측정하는 방법을 들 수 있다.
생화학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 특이적인 기질을 이용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전자공학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 유전자의 mRNA량을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR법 등을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 5에 기재한 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 5에 기재한 방법을 들 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
(cDNA의 조제 방법)
각종 숙주 세포의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 조제한다. 조제한 전체 RNA 또는 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. 푸코오스 수식에 관련된 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 디제네레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법으로 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득한다.
취득한 유전자 단편을 프로브로서 이용하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 DNA를 취득할 수 있다. 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포의 mRNA는 시판되는 것(예컨대, Clontech사)을 이용하더라도 좋고, 다음과 같이 하여 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 조제하더라도 좋다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 티오시안산구아니딘-트리플루오로초산세슘법[메소즈 인 엔자이몰로지(Methods in Enzymology), 154, 3(1987)] 및 산성 티오시안산구아니딘·페놀·클로로포름(AGPC)법[애널리디컬 바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 162, 156(1987); 실험의학, 9, 1937(1991)] 등을 들 수 있다.
또한, 전체 RNA로부터 poly(A)+ RNA로서 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 컬럼법(몰리큘러 클로닝 제2판) 등을 들 수 있다.
더욱이, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사) 등의 시판되는 키트를 이용함으로써 mRNA를 조제할 수 있다.
이어서, 조제한 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 예컨대, 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989) 등에 기재된 방법 및 시판되는 키트를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
시판되는 키트로서는, 예컨대, SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies사) 및 ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE사)를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로서는, 대장균 K12주 속에서 자립 복제할 수 있는 것이라면, 파지 벡터 및 플라스미드 벡터 등의 어느 것이라도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 예컨대 ZAP Express[STRATAGENE사, 스트라테지즈(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익 애시드 리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(STRATAGENE사), λgt10, λgt11[디엔에이 클로닝 어 프랙티컬 어프로치(DNA cloning, A Practical Approach), 1, 49(1985)], λTriplEx(Clontech사), λExCell(Pharmacia사), pT7T318U(Pharmacia사), pcD2[몰리큘러 셀룰러 바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 숙주 미생물로서는, 미생물이라면 어느 것이라도 이용할 수 있지만, 바람직하게는 대장균이 이용된다. 구체적으로는, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue MRF'[STRATAGENE사, 스트라테지즈(Strategies), 5, 81(1992)], 에스케리치아 콜라이 C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], 에스케리치아 콜라이 Y1088[사이언스(Science), 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜라이 Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜라이 NM522[저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], 에스케리치아 콜라이 K802[저널 오브 몰리큘러 바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 에스케리치아 콜라이 JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 이용된다.
이 cDNA 라이브러리는 그대로 이후의 해석에 이용하더라도 좋지만, 불완전 길이 cDNA의 비율을 내려, 가능한 한 완전 길이 cDNA를 효율적으로 취득하기 위해서, 스가노 등이 개발한 올리고캡법[진(Gene), 138, 171(1994); 진(Gene), 200, 149(1997); 단백질핵산효소, 41, 603(1996); 실험의학, 11, 2491(1993); cDNA 클로닝(요도샤)(1996); 유전자 라이브러리의 제작법(요도샤)(1994)]을 이용하여 조제하여 이하의 해석에 이용하더라도 좋다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 상기 아미노산 서열을 코드하는 것이 예측되는 염기 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 염기 서열에 특이적인 데제네레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법[피씨알 프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)]을 이용하여 DNA의 증폭을 행함으로써, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.
취득한 유전자 단편이 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 DNA인 것은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 및 ABI PRISM377DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써 확인할 수 있다.
상기 유전자 단편을 프로브로 하여, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터, 콜로니 하이브리다이제이션 및 플라크 하이브리다이제이션(몰리큘러 클로닝 제2판) 등을 이용하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 DNA를 취득할 수 있다.
또한, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득하기 위해서 이용한 프라이머를 이용하여, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법을 이용하여 증폭함으로써, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
취득한 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 DNA의 염기 서열은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 및 ABI PRISM377DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 그 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 cDNA의 염기 서열을 바탕으로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 이용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하고 있는 유전자임을 확인할 수도 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대 국제공개 제2005/035741호에 기재된 GMD, 및 Fx의 염기 서열을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대, 미국 특허 제7393683호 명세서에 기재된 FUT8의 염기 서열을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 GDP-L-푸코오스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질로서는, 예컨대, 미국 특허출원공개 제2004/0110282호 명세서에 기재된 GDP-L-푸코오스 트랜스포터의 염기 서열을 들 수 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 모델 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대 이하에 기재한 방법을 들 수 있다.
(게놈 DNA의 조제 방법)
게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 몰리큘러 클로닝 제2판 및 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다.
또한, 예컨대, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems사) 및 Universal GenomeWalker(등록상표) Kits(CLONTECH사) 등을 이용함으로써, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
취득한 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 DNA의 염기 서열은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 및 ABI PRISM377DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 상기 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 게놈 DNA의 염기 서열을 바탕으로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 이용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하고 있는 유전자임을 확인할 수도 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 모델 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임은 통상의 방법 또는 DNA 합성기에 의해 조제할 수 있다.
구체적으로는, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 cDNA 및 게놈 DNA의 염기 서열 중, 연속하여 바람직하게는 5∼150 염기, 보다 바람직하게는 5∼60 염기, 더욱 바람직하게는 10∼40 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 이 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 해당하는 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 상기 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보자임을 합성하여 조제할 수 있다.
올리고뉴클레오티드로서는, 올리고 RNA 및 상기 올리고뉴클레오티드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 함) 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체로서는, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-O-프로필리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 및 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-메톡시에톡시리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다[세포공학, 16, 1463(1997)].
(b) 상동 재조합법에 의한 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 표적으로 하여, 염색체 상의 표적 유전자를 상동재조합법을 이용하여 개변함으로써 제작할 수 있다.
염색체 상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)(이하, 「매니퓰레이팅 더 마우스 엠브리오 어 라보라토리 매뉴얼」이라고 약칭함), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작, 요도샤(1995)(이하, 「ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작」이라고 약칭함) 등에 기재된 방법을 이용하여, 예컨대 다음과 같이 행할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 조제한다. 게놈 DNA의 염기 서열에도 기초하여, 개변하는 표적 유전자(예컨대, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 구조 유전자 및 프로모터 유전자)를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다.
제작한 타겟 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 염색체 상의 표적 유전자와 타겟 벡터의 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등의 표적으로 하는 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2에 기재한 숙주 세포를 들 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 본항 1(a)에 기재한 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터는, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993) 및 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작(요도샤)(1995) 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다.
타겟 벡터는 리플레이스먼트 타입 및 인서션 타입의 어느 것이나 이용할 수 있다.
각종 숙주 세포에의 타겟 벡터의 도입에는, 후술하는 3에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로서, 예컨대, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993) 및 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작(요도샤)(1995) 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네가티브 선택 및 폴리 A 선택 등의 방법을 이용할 수 있다.
선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 게놈 DNA에 대한 서전 하이브리다이제이션법(몰리큘러 클로닝 제2판) 및 PCR법[피씨알 프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)] 등을 들 수 있다.
(c) RDO 방법에 의한 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 표적으로 하여, RDO법을 이용하여, 예컨대 다음과 같이 제작할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA를 본항 1(a)에 기재한 방법을 이용하여 조제한다. 조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다. 결정한 DNA의 서열에 기초하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 RDO의 콘스트럭트를 설계하여 합성한다.
합성한 RDO를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 즉 푸코오스 수식에 관련된 효소에 변이가 생긴 형질전환체를 선택함으로써, 본 발명의 조성물 제작을 위한 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등의 표적으로 하는 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 3에 기재한 숙주 세포를 들 수 있다.
각종 숙주 세포에의 RDO의 도입에는, 후술하는 3에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 본항 1(a)에 기재한 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 본항 1(a)에 기재한 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
DNA의 염기 서열은, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 서브클로닝하여, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행하여, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM377DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써 확인할 수 있다.
RDO는 통상의 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다.
RDO를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자에 변이가 생긴 세포를 선택하는 방법으로서는, 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지 등에 기재된 염색체 상의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기에 기재한, 도입한 푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법, 후술하는 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법, 또는 후술하는 생성 당단백질 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법도 이용할 수 있다.
RDO의 콘스트럭트는, 예컨대, 사이언스(Science), 273, 1386(1996); 네이처 메디신(Nature Medicine), 4, 285(1998); 헤파톨로지(Hepatology), 25, 1462(1997); 진 테라피(Gene Therapy), 5, 1960(1999); 진 테라피(Gene Therapy), 5, 1960(1999); 저널 오브 몰리큘러 메디신(J. Mol. Med.), 75, 829(1997); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774(1999); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768(1999); 뉴클레익 애시드 리서치(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323(1999); 인베스티게이션 오브 더마톨로지(Invest. Dematol.), 111, 1172(1998); 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 16, 1343(1998); 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 43(2000); 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 555(2000) 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(d) RNAi법에 의한 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 표적으로 하여, RNAi법을 이용하여, 예컨대 다음과 같이 제작할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 상기 1에 기재한 방법을 이용하여 cDNA를 조제한다. 조제한 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 결정한 cDNA의 서열에 기초하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소를 코드하는 부분 또는 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 콘스트럭트를 설계한다.
상기 RNAi 유전자를 세포 내에서 발현시키기 위해서, 조제한 cDNA의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
상기 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질전환체를 얻는다.
도입한 푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성 또는 생성 당단백질 분자 혹은 세포 표면 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질전환체를 선택함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등의 표적으로 하는 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 후술하는 3에 기재한 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능하거나 내지는 염색체에 집어넣을 수 있고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 후술하는 3에 기재한 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포에의 유전자 도입에는, 후술하는 3에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 본항 1에 기재한 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본항 1(a)에 기재한 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 5의 방법을 들 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대 본항 1(a)에 기재된 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 RNAi 유전자를 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
RNAi 유전자는 통상의 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다. RNAi 유전자의 콘스트럭트는, 예컨대, [네이처(Nature), 391, 806(1998); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502(1998); 네이처(Nature), 395, 854(1998); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049(1999); 셀(Cell), 95, 1017(1998); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451(1999); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959(1998); 네이처 셀 바이올로지(Nature Cell Biol.), 2, 70(2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(e) 트랜스포존을 이용한 방법에 의한, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 네이처 제네틱스(Nature Genetics, 25, 35(2000) 등에 기재된 트랜스포존의 시스템을 이용하여, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성 또는 생성 당단백질 분자 혹은 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 돌연변이체를 선택함으로써, 본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
트랜스포존의 시스템이란, 외래 유전자를 랜덤하게 염색체 상에 삽입시킴으로써 돌연변이를 유발시키는 시스템이다. 통상, 트랜스포존에 끼워진 외래 유전자에 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 이용하여, 이 유전자를 염색체 상에 랜덤하게 삽입시키기 위한 트랜스포사제의 발현 벡터를 동시에 세포 속에 도입한다.
트랜스포사제는, 이용하는 트랜스포존의 서열에 알맞은 것이라면 어떠한 것이나 이용할 수 있다.
외래 유전자로서는, 숙주 세포의 DNA에 변이를 일으키는 것이라면 어떠한 유전자나 이용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등의 표적으로 하는 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 후술하는 2에 기재한 숙주 세포를 들 수 있다. 각종 숙주 세포에의 유전자의 도입에는, 후술하는 2에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 조직 전환 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
푸코오스 수식에 관련된 효소의 활성을 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본항 1(a)에 기재한 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본항 1(a)에 기재한 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 5에 기재한 방법을 들 수 있다.
(2) 효소의 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 수법
본 발명의 개변 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 푸코오스 수식에 관련된 효소의 유전자를 표적으로 하여, 그 효소의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는 예컨대 GMD 및 Fx 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, 예컨대 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 등을 들 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질로서는, 구체적으로는, 예컨대 GDP-L-푸코오스 트랜스포터 등을 들 수 있다.
이들 효소 또는 단백질은, 기질 특이성을 지닌 어느 특정한 반응을 촉매하는 효소나 단백질이며, 이러한 기질 특이성을 지닌 촉매 작용을 갖는 효소나 단백질의 활성 중심을 파괴함으로써, 이들 효소의 도미넌트 네가티브체를 제작할 수 있다.
표적으로 하는 효소 중, GMD를 예로 하여, 그 도미넌트 네가티브체 제작에 관해서 구체적으로 이하에 설명한다.
대장균 유래의 GMD의 입체 구조를 해석한 결과, 4개의 아미노산(133번째의 Thr, 135번째의 Glu, 157번째의 Tyr, 161번째의 Lys)이 효소 활성에 중요한 기능을 담당하고 있는 것이 밝혀졌다(Structure, 8, 2, 2000).
그래서, 입체 구조의 정보에 기초하여 이들 4개의 아미노산을 상이한 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 제작한 결과, 어느 변이체에 있어서도 유의적으로 효소 활성이 저하되었음이 드러났다.
한편, GMD의 보효소 NADP나 기질인 GDP-만노오스와의 결합 능력에 관해서는, 어느 변이체에 있어서도 거의 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, GMD의 효소 활성을 담당하는 이들 4개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네가티브체를 제작할 수 있다.
대장균 유래의 GMD의 도미넌트 네가티브체의 제작 결과에 기초하여, 아미노산 서열 정보를 바탕으로 한 상동성 비교나 입체 구조를 예측함으로써, 예컨대, CHO 세포 유래의 GMD에서는, 155번째의 Thr, 157번째의 Glu, 179번째의 Tyr 및 183번째의 Lys를 다른 아미노산으로 치환함으로써 도미넌트 네가티브체를 제작할 수 있다.
이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 제작은, 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 행할 수 있다.
고ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 상술한 것과 같이 제작한 표적 효소의 도미넌트 네가티브체를 코드하는 유전자(이하, 도미넌트 네가티브체 유전자라 약기함)를 이용하여, 몰리큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰리큘러 바이올로지, 매니퓰레이팅 마우스 엠브리오 제2판 등에 기재된 유전자 도입 방법에 따라서, 예컨대 다음과 같이 제작할 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 도미넌트 네가티브체유전자를 조제한다. 조제한 도미넌트 네가티브체 유전자의 전체 길이 DNA를 바탕으로 하여, 필요에 따라서, 상기 단백질을 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
상기 DNA 단편 또는 전체 길이 DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다. 이 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질전환체를 얻는다.
GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성 또는 생성 항체 분자 혹은 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질전환체를 선택함으로써, 고ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 등의 표적으로 하는 GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 전술한 1에 기재한 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능하고 내지는 염색체 속에 집어넣을 수 있고, 목적으로 하는 도미넌트 네가티브체를 코드하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 예컨대 전술한 1에 기재한 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포에의 유전자 도입에는, 전술한 1에 기재한 각종 숙주 세포에 알맞은 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 2(1)의 (a)에 기재한 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 2의 (5)에 기재한 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재한 방법을 들 수 있다.
(3) 효소에 돌연변이를 도입하는 수법
고ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자에 돌연변이를 도입하여, 그 효소에 돌연변이를 일으킨 세포주를 선택하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다.
GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, 예컨대 GMD 및 Fx 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, 예컨대 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 및 α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
효소에 돌연변이를 도입하는 방법으로서는, 예컨대, 1) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 생산 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 및 3) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 그 세포의 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
돌연변이 유발 처리로서는, 친주의 세포의 DNA에 점 돌연변이, 결실 또는 프레임 시프트 돌연변이를 일으키는 것이라면 어떠한 처리나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리 및 방사선 조사 등을 들 수 있다. 또한, 예컨대, 여러 가지 알킬화제 및 발암 물질 등도 돌연변이 유발 물질로서 이용할 수 있다.
돌연변이 유발 물질을 세포에 작용시키는 방법으로서는, 예컨대, 조직 배양의 기술 제3판(아사쿠라쇼텐) 일본조직배양학회 편(1996) 및 네이처 제네틱스(Nature Genet.), 24, 314,(2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
자연발생적으로 생긴 돌연변이체로서는, 예컨대, 특별한 돌연변이 유발 처리를 실시하지 않고서, 통상의 세포 배양 조건으로 계대 배양을 계속함으로써 자연발생적으로 생기는 돌연변이체를 들 수 있다.
(4) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법
고ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, GDP-L-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하여, 안티센스 RNA/DNA 기술[바이오사이언스와 인더스트리, 50, 322(1992), 화학, 46, 681(1991), Biotechnology, 9, 358(1992), Trends in Biotechnology, 10, 87(1992), Trends in Biotechnology, 10, 152(1992), 세포공학, 16, 1463(1997)], 트리플 헬릭스 기술[Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)] 등을 이용하여, 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제함으로써 제작할 수 있다.
(5) N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법
고ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다.
N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 코어 푸코오스를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법으로서는, 예컨대, 소마틱스 셀 앤드 몰리큘러 제네틱스(Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51(1986) 등에 기재된 렉틴을 이용한 방법을 들 수 있다.
렉틴으로서는, N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위와 푸코오스의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴이라면 어느 렉틴이라도 이용할 수 있다.
그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Viciafaba 유래의 Agglutinin) 및 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuriaaurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 1 ㎍/mL∼1 mg/mL 농도의 상술한 렉틴을 포함하는 배지로 바람직하게는 1일∼2주간, 보다 바람직하게는 1일∼1주일 배양하여, 생존하고 있는 세포를 계대 배양 또는 콜로니를 픽업하여 다른 배양 용기로 옮긴다. 또 계속해서 렉틴을 포함하는 배지로 배양을 계속함으로써, N-글리코시드 결합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위와 푸코오스의 1위가 α 결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택할 수 있다.
3. 항체 조성물의 활성 평가
정제한 개변 항체 조성물의 단백량, FcR 결합 활성, C1q 결합 활성, 항원 결합 활성, 및 ADCC 활성 및 CDC 활성 등의 세포 상해 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 모노크로널 안티바디즈 및 안티바디 엔지니어링 등에 기재된 공지된 방법을 이용할 수 있다.
구체적인 예로서는, 항체 조성물이 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은, ELISA법 및 형광항체법[캔서 이뮤놀로지 이뮤노테라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)] 등에 의해 측정할 수 있다.
또한, 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 상해 활성은, CDC 활성 및 ADCC 활성 등을 측정함으로써 평가할 수 있다[캔서 이뮤놀로지 이뮤노테라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993), 미국 특허출원공개 제2004/0259150호 명세서].
본 발명의 개변 항체 조성물이 FcR에의 결합 활성을 갖는 것은, 유전자 재조합 FcγRIIIA 단백질이나 유전자 재조합 태아 FcR(neonatal Fc receptor, FcRn) 단백질을 제작하여, 결합 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다(미국 특허출원공개 제2004/0259150호 명세서).
ADCC 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해된 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성 또는 유리하는 효소의 생리 활성 등을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
CDC 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해된 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성 또는 유리되는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 297번째의 Asn 이외에 불필요한 당쇄가 결합하지 않도록 아미노산 개변된 개변 항체 조성물은, 아미노산 개변을 하기 전의 항체와 비교하여, 동등 이상의 FcγR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
즉, 본 발명의 개변 항체 조성물은, Fc 영역에 있어서 Asn297번째 이외의 N-글리코시드 결합형 당쇄가 결합하는 아미노산 서열의 아미노산 개변을 했음에도 불구하고, 원래의 Fc 영역을 갖는 항체와 동등 이상의 FcR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
또한 본 발명의 개변 항체 조성물은, 인간 IgG1 및 인간 IgG3보다도 높은 CDC 활성을 지니고, 또한 아미노산 개변을 하기 전의 항체와 비교하여, 실질적으로 동등 이상의 FcγR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
더욱이, 본 발명의 서열 번호 3에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 정상 영역을 갖는 개변 항체 조성물은, 인간 IgG1 및 인간 IgG3보다도 높은 CDC 활성을 지니고, 또한 서열 번호 1의 Fc 영역을 갖는 항체 조성물과 비교하여, 실질적으로 동등 이상의 FcγR 결합 활성, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖는다.
또한, 항체 조성물의 인간에서의 안전성, 치료 효과는, 필리핀 원숭이 등의 인간과 비교적 가까운 동물종의 적당한 모델을 이용하여 평가할 수 있다.
4. 항체 조성물의 당쇄의 분석
각종 세포에서 발현시킨 항체 분자의 당쇄 구조는, 통상의 당단백질의 당쇄 구조의 해석에 준하여 행할 수 있다. 예컨대, IgG 분자에 결합하고 있는 당쇄는, 갈락토오스(Gal), 만노오스(Man) 및 푸코오스(Fuc) 등의 중성당, 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 등의 아미노당, 시알산(Sial) 등의 산성당으로 구성되어 있으며, 당조성 분석 및 이차원 당쇄 맵법 등을 이용한 당쇄 구조 해석 등의 수법을 이용하여 행할 수 있다.
(1) 중성당·아미노당 조성 분석
항체 조성물의 당쇄의 조성 분석은, 트리플루오로초산 등으로, 당쇄의 산 가수분해를 행함으로써 중성당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로서, 예컨대, Dionex사 제조 당조성 분석 장치를 이용하는 방법을 들 수 있다. BioLC는, HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법[저널 오브 리퀴드 크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해서 당 조성을 분석하는 장치이다.
또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 공지된 방법[어그리컬처럴 앤드 바이올로지컬 케미스트리(Agric. Biol. Chem.), 55(1), 283-284(1991)]에 따라서 산 가수분해된 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하고, HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.
(2) 당쇄 구조 해석
항체 조성물의 당쇄의 구조 해석은, 2차원 당쇄 맵법[애날리티컬 바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988), 생물화학실험법 23-당단백질당쇄연구법(학회출판센터) 타카하시레이코 편(1989년)]에 의해 행할 수 있다.
2차원 당쇄 맵법은, 예컨대, X축에는 역상 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y축에는 순상 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를 각각 플롯하여, 이미 알려진 당쇄의 이들의 결과와 비교함으로써, 당쇄 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는, 항체를 히드라진 분해하고, 항체로부터 당쇄를 유리하여, 2-아미노피리딘(이하, PA라 약기함)에 의한 당쇄의 형광 표지[저널 오브 바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197(1984)]를 행한 후, 겔 여과에 의해 당쇄를 과잉의 PA화 시약 등으로 분리하여, 역상 크로마토그래피를 행한다.
이어서, 분취한 당쇄의 각 피크에 대해서 순상 크로마토그래피를 행한다. 이들 결과를 바탕으로, 2차원 당쇄 맵 상에 플롯하여, 당쇄 스탠다드(TaKaRa사 제조), 문헌[애날리티컬 바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988)]와의 스폿의 비교로부터 당쇄 구조를 추정할 수 있다.
또한 각 당쇄의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 하여, 2차원 당쇄 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
항체 Fc 영역의 어느 부분에 당쇄가 결합하고 있는 것인지는, 환원 알킬화 처리한 항체를 트립신, 펩신, Lys-C, Asp-N 등의 엔도프로테아제로 처리한 것을 역상 크로마토그래피(LC)로 분리한 후에, 질량 분석계(MS) 등으로 분석함으로써 확인할 수 있다.
즉, 목적으로 하는 Fc 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 프로테아제 처리에 의해 생성할 수 있는 펩티드의 분자량 및 당쇄가 결합한 펩티드의 분자량과, MS의 분석치가 일치하는지 여부에 의해, 실제로 당쇄가 결합하고 있는지 여부를 확인할 수 있다.
5. 항체 분자의 당쇄 구조의 식별 방법
본 발명의 항체 조성물은, 항체 Fc의 297번째의 Asn에 결합하는 당쇄 구조가 다른 항체 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 개변 항체 조성물의 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물은 높은 ADCC 활성을 보인다. 이러한 항체 조성물은 상기 4.에 기재한 항체 분자의 당쇄 구조의 분석법을 이용함으로써 식별할 수 있다. 또한, 렉틴을 이용한 면역학적 정량 방법을 이용함에 의해서도 식별할 수 있다.
렉틴을 이용한 면역학적 정량 방법을 이용한 항체 분자의 당쇄 구조의 식별은, 문헌[모노클로널 안티바디즈 : 프린시플즈 앤드 애플리케이션즈(Monoclonal Antibodies : Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc.,(1995); 효소면역측정법, 제3판, 의학서원(1987); 개정판, 효소항체법, 가쿠사이기가쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(Radioimmunoassay), VIA(Viroimmunoassay, EIA(Enzymoimmunoassay), FIA(Fluoroimmunoassay) 및 MIA(Metalloimmunoassay) 등의 면역학적 정량 방법에 준하여, 예컨대 다음과 같이 행할 수 있다.
항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴을 표지하여, 표지한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 이어, 표지한 렉틴과 항체 분자의 복합체의 양을 측정한다.
항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 데 이용되는 렉틴으로서는, 예컨대, WGA(T. vulgaris 유래의 밀배아 응집소(wheat-germ agglutinin)), ConA(C. ensiformis 유래의 콘카나발린(concanavalin) A), RIC(R. communis 유래의 독소), L-PHA(P. vulgaris 유래의 백혈구응집소, LCA(L. culinaris 유래의 렌틸 응집소(lentil agglutinin)), PSA(P. sativum 유래의 완두콩 렉틴), AAL(들주발버섯 렉틴(Aleuria aurantia Lectin)), ACL(줄맨드라미 렉틴(Amaranthus caudatus Lectin)), BPL(바우히니아 프르푸리아 렉틴(Bauhinia purpurea Lectin)), DSL(독말풀 렉틴(Datura stramonium Lectin)), DBA(돌리코스 비플로우스 응집소(Dolichos biflorus Agglutinin)), EBL(엘더베리 수피 렉틴(Elderberry Bark Lectin)), ECL(에리스리나 크리스타갈리 렉틴(Erythrina cristagalli Lectin)), EEL(유니머스 유로파우스 렉틴(Euonymus europaeus Lectin)), GNL(갈란투스 니발리스 렉틴(Galanthus nivalis Lectin)), GSL(그리포니아 심플리시폴리아 렉틴(Griffonia simplicifolia Lectin)), HPA(헬릭스 포마티아 응집소(Helix pomatia Agglutinin)), HHL(아마릴리스 렉틴(Hippeastrum Hybrid Lectin)), 자칼린(Jacalin), LTL(로터스 테트라고놀로부스 렉틴(Lotus tetragonolobus Lectin)), LEL(토마토 렉틴(Lycopersicon esculentum Lectin)), MAL(다릅나무 렉틴(Maackia amurensis Lectin)), MPL(오세이지 오렌지 렉틴(Maclura pomifera Lectin)), NPL(나팔수선 렉틴(Narcissus pseudonarcissus Lectin)), PNA(땅콩 응집소(Peanut Agglutinin)), E-PHA(강낭콩 적혈구응집소(Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin)), PTL(날개콩 렉틴(Psophocarpus tetragonolobus Lectin)), RCA(피마자 응집소(Ricinus communis Agglutinin)), STL(감자 렉틴(Solanum tuberosum Lectin)), SJA(회화나무 응집소(Sophora japonica Agglutinin)), SBA(대두 응집소(Soybean Agglutinin)), UEA(울렉스 유로파우스 응집소(Ulex europaeus Agglutinin)), VVL(벳지 렉틴(Vicia villosa Lectin)) 및 WFA(등나무 응집소(Wisteria floribunda Agglutinin))를 들 수 있다.
코어 푸코오스를 특이적으로 인식하는 렉틴을 이용하는 것이 바람직하다. 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 렌틸 응집소(Lentil Agglutinin)), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 완두콩 렉틴(Pea Lectin)), 잠두콩 렉틴 VFA(Vicia faba 유래의 응집소(Agglutinin)) 및 들주발버섯 AAL(들주발버섯(Aleuria aurantia) 유래의 렉틴(Lectin))을 들 수 있다.
6. 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 사용
본 발명의 개변 항체 조성물은, Fc 영역의 297번째 이외의 Asn의 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 분자를 단일로 포함하는 조성물이며, 단일의 항체 분자를 제조해야만 하는 단백질 의약품 제조에 있어서 매우 유용하다.
또한, 본 발명의 항체 조성물 중, 코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율이 조성물 전체의 당쇄의 20% 이상인 항체 조성물은, Fc 영역의 297번째 이외의 Asn의 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 분자를 단일로 포함하는 조성물이며, 또한 높은 ADCC 활성을 갖고 있기 때문에, 종래의 항체 조성물보다도 치료 효과가 우수한 성질을 갖고 있다.
또한, 본 발명의 개변 항체 조성물 중, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, 392번째의 Asn이 Lys로 개변된 변이 Fc를 갖는 항체로서, 코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율이 조성물 전체의 당쇄의 20% 이상인 항체 조성물은, Fc 영역의 297번째 이외의 Asn의 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 분자를 단일로 포함하는 조성물이며, 인간 IgG1 및 인간 IgG3보다도 높은 CDC 활성을 지니고, 또한 높은 ADCC 활성을 갖는다.
또한, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, 392번째의 Asn이 Lys로 개변된 변이 Fc를 갖는 항체로서, 코어 푸코오스가 없는 당쇄의 비율이 100%인 항체 조성물은, Fc 영역의 297번째 이외의 Asn의 당쇄가 감소 또는 결손된 개변 항체 분자를 단일로 포함하는 조성물이며, 인간 IgG1 및 인간 IgG3보다도 높은 CDC 활성을 지니고, 또한 가장 높은 ADCC 활성이므로, 높은 임상 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 개변 항체 조성물을 함유하는 의약은 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 예컨대, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 항체 제제인 경우, 정맥내 투여가 바람직하다.
투여 형태로서는, 예컨대, 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 및 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 예컨대, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 및 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은, 예컨대, 물, 자당, 솔비톨 및 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유 및 대두유 등의 오일류, p-히드록시안식향산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 플레이버 및 페파민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 예컨대, 젖당, 포도당, 자당 및 만니톨 등의 부형제, 전분 및 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘 및 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 및 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 및 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 예컨대, 주사제, 좌제 및 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는, 예컨대, 염 용액 및 포도당 용액 및 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 조제된다. 또는, 항체 조성물을 통상의 방법에 따라서 동결 건조하여, 이것에 염화나트륨을 가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.
좌제는 카카오지, 수소화지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 조제된다.
또한, 분무제는 상기 항체 조성물 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 상기 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 이용하여 조제된다.
담체로서, 구체적으로는, 예컨대, 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 항체 조성물 및 이용하는 담체의 성질에 따라, 에어로졸 및 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라 다르지만, 유효 성분의 양으로서, 통상 성인 1일당 10 ㎍/kg∼20 mg/kg이다.
또한, 항체 조성물의 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은, 인비트로 실험으로서는, 예컨대, CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있다. 또한, 인비보 실험으로서는, 예컨대, 마우스 등의 실험 동물에서의 종양계를 이용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.
CDC 활성, ADCC 활성 및 항종양 실험은 문헌[캔서 이뮤놀로지 이뮤노테라피(Cancer Immunology Immunotherapy), 36, 373(1993); 캔서 리서치(Cancer Research), 54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
실시예
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 이하의 실시예에 있어서 아미노산 잔기를 3 문자 또는 1 문자 표기하며, N392K는 EU 인덱스 392번째의 Asn(N)를 Lys(K)로 아미노산 개변한 개변 항체를 나타낸다.
[실시예 1] 고 CDC 활성형 항체의 당쇄 분석
인간 항체의 Fc 영역에 있어서, EU 인덱스 297∼299번째의 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열의 Asn에 당쇄가 결합하는 것이 알려져 있지만, 297∼299번째 이외의 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열에 당쇄가 결합하는 것은 알려져 있지 않다.
국제공개 제2007/011041호에 기재된 고CDC 활성형 CH 서열을 갖는 항체 1133, 113D, 113E, 113F, 113G 및 113H는 모두 인간 IgG1의 Fc 영역과 인간 IgG3의 Fc 영역의 전부 또는 일부의 도메인이 교환된 항체이며, CH3 도메인의 EU 인덱스 392번째가 Asn이기 때문에, N-글리코시드 결합 당쇄 컨센서스 서열 Asn-X-Ser/Thr이 존재하고 있다.
또한, 천연의 인간 IgG3 항체도 동일한 N-글리코시드 결합 당쇄 컨센서스 서열 Asn-X-Ser/Thr을 갖고 있다. 그래서 인간 IgG3형 항체 및 국제공개 제2007/011041호에 기재된 IgG1/IgG3 도메인 교환 항체의 Asn392에 당쇄가 부가되어 있는지 여부를 검토하기 위해서, 이들 항체의 당쇄를 분석했다.
IgG1/IgG3 도메인 교환 항체로서는, 국제공개 제2007/011041호에 기재된 113F형 항GM2 항체 GM2-113F를 이용했다. 113F 항체의 구조는, 도 2의 (a)∼(c)에 모식적으로 도시하는 것과 같이, CH의 118∼230번째가 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열, 231∼422번째가 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열 및 423∼447번째가 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다(서열 번호 2).
인간 IgG3형의 항체로서는, IgG1/κ형의 항CD20 키메라 항체 리툭시맵(미국 특허 제5,736,137호 명세서)의 CH를 인간 IgG3형으로 치환한 KM3523(Journal of Immunological methods 2005, 306: 151-60) 및 IVIG(정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulins)) 제제로부터 정제한 천연에 존재하는 인간 IgG3 항체를 이용했다.
우선 처음에, GM2-113F 및 KM3523을 환원 조건 하에서 8% 겔(Novex)을 이용하여 SDS-PAGE를 행했다. 그 결과를 도 3에 도시한다.
도 3에 도시하는 것과 같이, GM2-113F의 H쇄의 밴드(밴드 B)의 바로 위쪽에 마이너 밴드(밴드 A)를 검출했다. 또한, GM2-113F의 분자량을 액체 크로마토그래피 질량 분석계(LC-MS)를 이용하여 측정한 결과, GM2-113F에 상당하는 분자량(약 148 kDa) 외에 약 1380 Da 큰 분자량을 갖는 성분을 검출했다.
한편, KM3523 및 천연에 존재하는 인간 IgG3 항체의 H쇄의 밴드는 단일의 분자량을 보였다.
상술한 대로 Asn392 및 Thr394는 N-글리코시드 결합 당쇄 컨센서스 서열이므로, 113F형 항체의 Asn392에 높은 만노오스 타입의 N형 당쇄(Man6GlcNAc2, 분자량 1378.48, 이하 Man6형 당쇄라 표기함)가 부가되어 있을 가능성이 시사되었기 때문에, 이하에 보다 상세한 해석을 실시했다.
GM2-113F 및 KM3523을 6 mol/L 구아니딘염산을 포함하는 0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 완충액에 용해하고, 디티오트레이톨(nacalai tesque사 제조)를 최종 농도 1.8 mg/mL가 되도록 가하여, 56℃에서 1시간 환원 반응을 했다. 반응 후의 용액에 요오드아세트아미드(nacalai tesque사 제조)를 최종 농도 11 mg/mL로 첨가하여, 차광하에 있어서 37℃에서 1시간 반응하여 알킬화했다.
이어서, 한외여과막을 이용하여 반응액을 효소 소화용 완충액(1 mol/L Urea, 0.1 mol/L NH4HCO3)으로 치환하고, 또한 Asp-N 용액(Sequencing Grade, Roche 제조)을 가하여(E/S=1/50), 37℃에서 16시간 소화하고, 반응은 1 mol/L의 HCl을 적량 가하여 정지했다.
Asp-N 소화에 의해서 얻어지는 펩티드 단편은 LC-MS로 해석했다. 즉, 펩티드 단편 혼합물을 역상 HPLC(사용 컬럼 : YMC Pro C18,1 mm I.D.×250 mm, YMC 제조, 유속 : 60 μL/min)를 사용하고, 이동상 A(0.1% TFA)로부터 이동상 B(0.1% TFA, 90% CH3CN)의 직선 농도 구배에 의해 분리했다.
용출액은 일렉트로스프레이화에 따라서 질량 분석계(LTQ Orbitrap, thermo scientific 제조)에 도입하여, 펩티드 단편의 분자량을 측정했다.
얻어진 데이터는 질량 분석계에 부속된 소프트웨어(Xcalibur Qual Browser)를 이용하여 해석하여, Asn392를 포함하는 펩티드 단편(서열 DIAVEWESSGQPENNYNTTPPML)의 분자 이온(m/z=1296.58, z=2)과, 그 펩티드 단편에 Man6형 당쇄에 상당하는 분자량(m/z=689.24, z=2)이 부가된 분자 이온(m/z=1985.81, z=2)의 피크를 추출하여, 시그널 강도를 수치화했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
표 1은 GM2-113F 및 KM3523의 펩티드 맵핑에 있어서 얻어진, Asn392를 포함하는 펩티드 단편에 관한 LC-MS 해석 결과를 나타내는 표이다. 표 1 중의 수치는 질량 분석계에 있어서의 시그널 강도를 나타내고 있다. N.D.는 시그널이 검출되지 않았음을 나타낸다.
Figure 112012070328018-pct00002
표 1에 나타내는 것과 같이, GM2-113F에는 Man6형 당쇄가 부가된 분자 이온이 검출되었다. 한편, KM3523에서는 당쇄 부가 시그널은 검출되지 않았다. 이로부터, Asn392에의 당쇄 부가는 GM2-113F에 고유의 사상이라고 생각되었다.
GM2-113F의 LC-MS 측정 결과로부터 항체 1 분자에 Man6형 당쇄가 1 분자 결합하고 있다고 가정한 경우, 표 1에 나타낸 결과로부터, Man6형 당쇄가 결합한 항체는 항체 조성물 전체의 10% 정도라고 생각되었다.
이상으로부터, 동일한 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열을 가짐에도 불구하고, 인간 IgG3 항체의 H쇄 정상 영역의 Asn392에는 전혀 N형 당쇄가 결합하지 않은 한편, 113F형 항체의 Asn392 위치에는 일정한 비율로 Man6형 당쇄가 부가되는 것이 분명하게 되었다.
[실시예 2] 개변 항체의 디자인과 제작
1. 개변 서열의 디자인
실시예 1에서 분명하게 된, 113F형의 H쇄 정상 영역의 Asn392의 당쇄 부가를 회피하기 위해서, Asn392, Thr393, Thr394를 별도의 아미노산으로 치환함으로써 N-글리코시드 결합형 당쇄 컨센서스 서열을 파괴한 46 종류의 아미노산 개변체의 제작을 시도했다(하기 표 2 및 표 3).
또한, 일부의 개변 항체에서는, 113F형의 Fc 영역의 276, 339 및 397번째의 인간 IgG3 항체에 특유의 아미노산 잔기를 개변함으로써, 개변 항체의 생물 활성에 주는 영향을 확인했다.
도 4는 인간 IgG1 항체, 인간 IgG3 항체 및 113F형 항체의 H쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 얼라인먼트이며, 본 연구에서 개변을 행한 113F형 항체 Fc 영역의 6 아미노산 잔기를 도시한다.
이 중, Lys276, Thr339, Asn392, Met397의 4 잔기는 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체에서 상이한 아미노산 잔기이다. 한편, CL의 DNA 서열은 인간 Κ형 서열을 이용하고, V 영역의 DNA 서열은 항인간 CD20 항체 리툭시맵(미국 특허 제5,736,137호 명세서)와 동일한 서열을 이용했다.
2. 개변 항체의 제작
(1) 발현 벡터의 구축
발현 벡터 구축의 개요는 도 5에 도시한다.
이하에 기재하는 개변 항체의 CH를 코드하는 DNA에의 부위 특이적 변이 도입에는 Prime STAR Mutagenesis Basal Kit(타카라슈죠사)를 이용했다. 프라이머는, CH 영역에 각종 아미노산 잔기 개변(표 1)을 도입하는 서열을 제품 과정서에 따라서 설계하여 합성했다(Invitrogen사 제조).
주형에는 국제공개 제2007/011041호에 기재된 pKTX93/113F 벡터를 이용했다. 이들 프라이머와 주형을 이용하여 PCR 반응을 행하여, H쇄 정상 영역 유전자 서열 중에 목적의 변이를 갖는 벡트를 취득했다.
N392K 아미노산 개변과, 276, 339, 393 및 397에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기 개변을 조합시킨, 2 아미노산 개변을 갖는 항체의 아미노산 서열은, 상기한 과정으로 제작한 N392K 변이를 갖는 개변 항체 발현 벡터(pKTX93/113F-N392K)를 주형으로 하여 같은 조작을 함으로써 취득했다.
목적의 변이를 갖는 H쇄 정상 영역 유전자 서열을 ApaI와 NruI(New England Biolabs사 제조)에 의해 pKTX93/113F로 옮겨 개변시켰다.
(2) 항체 생성 세포의 제작
세포의 배양은 37℃의 5% CO2 인큐베이터로 행했다. 고ADCC형의 탈(脫)푸코실화 항체를 취득하기 위해서, 숙주 세포에는 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자를 넉아웃한 CHO/DG44 세포(이하, FUT8KO 세포라 약기함)(미국 특허 제6,946,292호 명세서)를 이용했다.
일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해, 4 ㎍의 발현 벡터를 1.6×106개의 FUT8KO 세포에 도입한 후, IMDM-(10)[투석 소 혈청(dFBS)을 10% 포함하는 IMDM 배지(GIBCO사)]에서 배양했다. 2일간 배양 후, G418 황산염(나카라이테스크사)을 0.5 mg/mL의 농도로 포함하는 IMDM-(10)[이하 IMDM-(10G)이라 표기]로 배지를 교환하여 배양을 계속한 세포를 G418 내성주로 했다.
(3) 항체의 발현과 정제
표 2 및 에 도시하는 개변 항체와 113F에 관해서 이하의 방법으로 정제 항체를 취득했다.
앞의 항에서 취득한 G418 내성주를 3×105 개/mL가 되도록 IMDM-(10G)에 현탁하여 3일간 배양한 후, Ex-cell 302(SAFC Biosciences사)로 배지를 교환하여 7∼11일간 배양한 후, 배양 상청을 회수했다.
MabSelect SuRe(GE healthcare사) 담체 0.5 mL를 충전한 컬럼에, 앞의 항에서 취득한 배양 상청을 유속 0.5∼1.0 mL/분으로 통과시켰다. 3 mL의 붕산 완충액(0.2 M 붕산나트륨, 150 mM 염화나트륨)과 0.25 mL의 0.1 M 시트르산나트륨 용액(pH 3.6)을 순차 첨가하여 세정한 후, 1.5 mL의 0.1 M 시트르산나트륨 용액(pH 3.6)으로 용출한 분획을 조(粗)용출 분획으로서 회수했다.
10 mL의 Econo-Pac 10DG(BIO RAD)를 충전한 컬럼에 조용출 분획 1.5 mL를 통과시켰다. 1.5 mL의 시트르산 완충액(150 mM 염화나트륨, 10 mM 시트르산나트륨, 수산화나트륨으로 pH 6.0로 조정)으로 세정 후, 3.0 mL의 동 시트르산 완충액으로 용출한 분획을 항체 용액으로서 회수했다.
(4) 개변 항체의 SDS-PAGE 해석
표 2 및 표 3에 나타내는 개변 항체 중, N392K/K276S 이외의 정제 항체에 관해서 이하의 방법으로 SDS-PAGE 해석을 실시했다. 0 mM(비환원 조건) 또는 10 mM(환원 조건)의 디티오트레이톨을 함유하는 샘플 완충액[0.3 M 트리스염산(pH 6.8), 10% 도데실황산나트륨, 50% 글리세롤]으로 0.1 mg/mL로 조제하여, 100℃에서 5분간 처리한 항체 용액을, 폴리아크릴아미드 겔(ATTO사)에 1 레인당 10 μL 충전하여, 겔 1장당 20 mA로 대략 2시간 전기 영동을 했다. 겔을 회수한 후, CBB stain one(나카라이테스크사)을 이용하여 제품 과정서에 따라서 염색했다.
비환원 조건 하의 샘플의 SDS-PAGE에서는, 모든 개변 항체에서 개변 전의 113F형 항체와 유사한 밴드 패턴을 확인할 수 있어, 정제품의 순도에 문제는 없음이 드러났다. 환원 처리를 한 샘플의 SDS-PAGE 결과, 113F에 있어서 H쇄의 고분자량 측에 마이너 밴드가 관찰되었지만, 개변 항체에서는 동 밴드의 소실이 인정되어, 제작한 개변 항체에 있어서 392Asn 잔기에 부가한 당쇄가 제거되었음이 분명하게 되었다.
[실시예 3] 개변 항체의 활성 평가
1. CDC 활성의 측정
마우스 흉선종 세포주 EL4에 인간 CD20 유전자를 도입한 형질전환 세포 KC1156[Clin. Cancer Res., 11, 2327(2005)]과 CD20 양성 종양 세포주 Daudi(JCRB), Raji(JCRB), ST486(ATCC), EHEB(DSMZ), MEC-1(DSMZ)를 표적 세포로 하여 개변 항체의 CDC 활성을 측정했다.
IgG1형의 H쇄 정상 영역을 갖는 항체의 컨트롤로서 항CD20 항체 리툭시맵(미국 특허 제5,736,137호 명세서)를 이용했다. 96웰 평저 플레이트(스미토모베이크라이트사)의 각 웰에, 10% FBS(JRH사)를 포함하는 RPMI1640(와코쥰야쿠고교사)를 이용하여 1.0×106 개/mL로 희석한 표적 세포 50 μL와 최종 농도의 3배로 조정한 항체 용액 50 μL와 2배 혹은 EL4/CD20-A에서는 8배로 희석한 인간 보체(SIGMA사) 50 μL를 분주했다.
또한, 항체를 포함하지 않는 웰을 0% 반응 웰, 표적 세포를 포함하지 않는 웰을 100% 반응 웰로서 준비했다. 37℃(5% CO2)에서 2시간 배양 후, 각 반응 웰에 WST-1(ROCHE사)을 15 μL씩 첨가하여 37℃(5% CO2)에서 3시간 배양했다. 반응 종료 후, 각 웰의 OD450을 측정하고, 하기 식을 이용하여 세포 상해 활성(%)을 산출했다.
세포 상해 활성(%)=100×{1-(반응 웰 흡광도－100% 반응 웰 흡광도)/(0% 반응 웰 흡광도－100% 반응 웰 흡광도)}
전체 개변 항체의 CDC 활성을 동일 조건에서 비교하기 위해서, 항체 농도 1 ㎍/mL에 있어서의 KC1156에 대한 CDC 활성 측정을 전체 샘플 동일 플레이트 상에서 행하여, 결과를 표 2 및 표 3에 나타낸다.
Figure 112012070328018-pct00003
Figure 112012070328018-pct00004
표 2 및 표 3에 나타내는 것과 같이, T393P, T394Y, T394F, N392K/T339Y는 개변 전의 113F보다 CDC 활성이 상승하고 있었다. 또한, 392위와 397위는 망라적으로 개변을 했지만, Asn392의 개변 항체는 113F와 비교하여 동등 이상의 CDC 활성을 보이고, Met397의 일부의 개변 항체는 활성이 저하되는 경향이 분명하게 되었다.
N392K, T394Y 및 T394F에 대해서, CD20 트랜스펙턴트 KC1156에 대한 CDC 활성 측정을 보다 상세히 행했다. 그 결과를 도 6의 (a) 및 (b)에 나타낸다.
도 6에 나타내는 것과 같이, N392K는 개변 전의 113F형 항체와 동등한 CDC 활성이었다. 또한, T394Y와 T394F는 113F형 항체와 비교하여 현저한 CDC 활성의 증가가 인정되었다.
N392K, T394Y, T394F 및 N392K/T339Y의 CD20 양성 종양 세포에 대한 CDC 활성을 측정한 결과를 도 7의 (a)∼(e)에 도시한다.
도 7의 (a)∼(e)에 도시하는 것과 같이, CD20 양성 종양 세포에 대한 CDC 활성도 마찬가지로, N392K는 113F형 항체와 동등한 CDC 활성이며, T394Y, T394F 및 N392K/T339Y는 개변 전의 113F형 항체와 비교하여, CDC 활성의 증가가 인정되었다.
2. 보체 결합 활성
보체 제1 성분인 C1q와 개변 항체의 결합 활성을 플로우사이토미터를 이용하여 측정했다. 비교 대조로서 113F형 항체 및 IgG1형 항체의 리툭시맵을 이용했다. 96웰 U 바닥 플레이트(팔콘사)의 각 웰에, RPMI1640(GIBCO사)으로 1.5× 107 개/mL로 희석한 Daudi 세포 50 μL와 최종 농도의 3배로 조정한 항체 용액 50 μL를 분주하여 37℃(5% CO2)에서 10분간 정치한 후, 6%로 희석한 인간 혈청(SIGMA사)을 1 웰당 50 μL씩 첨가하여 37℃(5% CO2)에서 15분간 정치했다.
PBS로 2회 세정 후, FACS용 완충액[1% BSA, 0.02% 에틸렌디아민사초산, 0.05% 아지화나트륨, PBS에 용해]으로 100배로 희석한 FITC 표지 항인간 C1q 항체(DakoCytomation사)를 1 웰당 50 μL씩 첨가하여, 차광 하에 4℃에서 30분 반응시켰다.
세포를 FACS용 완충액 200 μL로 2회 세정 후, 200 μL의 FACS용 완충액에 현탁하여, Cytomics FC 500MPL(베크만코울터사)로 형광 강도를 측정했다.
한편, 반응의 50% 효과 농도(EC50)는, KaleidaGraph(휴린크스사)의 투여 반응 로지스틱(dosersplgst)으로부터 최소치를 0으로 고정하여 산출했다. 그 결과를 도 8에 도시한다.
또한, 그래프로부터 산출한 EC50의 값을 표 4에 나타낸다. 표 4 중의 Ymax는 근사 곡선의 최대치를 나타낸다.
Figure 112012070328018-pct00005
도 8 및 표 4에 나타내는 것과 같이, N392K의 C1q 결합 활성은 113F와 동등했다. 본 해석에서 T394F와 T394Y의 C1q 결합 활성은 개변 전의 113F형 항체보다도 더욱 상승하고 있었다.
3. ADCC 활성
상기 실시예 2에서 제작한 개변 항체의 ADCC 활성은 국제공개 제2007/011041호에 기재한 방법에 의해 측정했다. 제작한 개변 항체는 전부 코어 푸코오스가 없는 고ADCC형 항체이기 때문에, 음성 대조로서 리툭시맵을 이용했다.
표적 세포로서 CD20 양성 종양 세포 Daudi, Raji 및 ST486을 이용하고, 이펙터 세포에는 건강한 보통 사람의 도너로부터 조제한 PBMC를 이용했다.
타겟 세포에 대한 이펙터 세포의 비는 1:20, 1:25, 1:30으로 실험을 하고, 세포 상해 활성(%)은 이하의 식으로부터 산출했다.
세포 상해 활성(%)=100×(S-Ab)/(Max-T)
S = 샘플 반응 웰 흡광도－배지 웰 흡광도
Ab = 항체 무첨가 웰 흡광도－배지 웰 흡광도
T = 표적 웰 흡광도－배지 웰 흡광도
Max = 100% 반응 웰 흡광도－100% 반응 대조 웰 흡광도
그 결과, N392K, T394F 및 T394Y의 ADCC 활성은 113F형 항체와 동등하며, 리툭시맵보다도 크게 현저히 증가했다.
4. FcRn 및 β2 마이크로글로불린(β2-microglobulin) 단백질의 제작
가용성 인간 태아성 Fc 수용체(FcRn)의 C 말단에 히스티딘 태그(6개의 His가 연속된 아미노산 서열)를 갖는 단백질을 제작하기 위해서, 인간 태반 유래 cDNA 라이브러리(클론테크사 제조)를 주형으로 하고, 프라이머 FcRn fw(서열 번호 4) 및 프라이머 FcRn rv(서열 번호 5)를 이용하여 PCR를 행하여, FcRnα쇄의 세포막 도메인의 C 말단에 히스티딘 태그를 갖는 단백질을 코드하는 cDNA를 증폭했다.
PCR 반응은 KOD 폴리머라아제(토요보사 제조)에 첨부된 설명서에 기초하여 행하여, FcRnα쇄의 C 말단에 히스티딘 태그를 포함하는 단백질을 코드하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pCRFcRnα를 취득했다.
한편, 이하의 순서로 인간 β2 마이크로글로불린을 코드하는 cDNA를 구축했다. 인간 β2 마이크로글로불린의 DNA 서열을 커버하는 4 가닥의 합성 DNA를 제작하고, 상기와 같은 식으로 PCR을 행하여, 인간 β2 마이크로글로불린의 cDNA를 코드하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pCRB2M을 취득했다.
이어서, 국제공개 제97/10354호 기재의 동물 세포용 인간화 항체 발현 벡터 pKANTEX93을 제한 효소 NotI 및 BamHI로 소화하여, 인간 항체의 중쇄 정상 영역을 코드하는 cDNA 영역이 제거된 약 11 Kbp의 DNA 단편을 회수했다.
한편, pCRB2M을 제한 효소 NotI 및 BamHI로 소화함으로써, 인간 β2 마이크로글로불린을 코드하는 약 400 bp의 DNA 단편을 얻었다. 이들 약 11 Kbp의 DNA 단편과 약 400 bp의 DNA 단편을 Ligation High(토요보사 제조)를 이용하여 연결하여, 대장균 DH5α주(토요보세키사 제조)를 형질전환하여 플라스미드 pKANTEXB2M을 구축했다.
이어서 pKANTEXB2M을 제한 효소 EcoRI 및 DraIII로 소화함으로써 인간 항체 경쇄 정상 영역을 코드하는 cDNA가 제거된 약 11 Kbp의 플라스미드 단편을 회수했다. 한편, 플라스미드 pCRFcRnα를 EcoRI 및 DraIII로 소화하여 얻어지는 약 0.9 Kbp의 FcRnα쇄를 코드하는 cDNA를 회수했다.
상기한 약 11 Kbp의 DNA 단편과 약 0.9 Kbp의 DNA 단편을 Ligation High를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α를 형질전환함으로써, 플라스미드 pKANTEXFcRnHis를 얻었다.
얻어진 플라스미드는 제한 효소 AatII(New England BioLab사 제조)로 절단하여, 직쇄화한 후, 세포에의 도입에 이용했다. 절단 후에는 반응액을 아가로스 전기 영동에 제공하여, 상기 플라스미드가 정확히 직쇄화되어 있음을 확인했다.
FcRn과 β2 마이크로글로불린을 함께 발현시킨 세포는 상술한 것과 같은 식으로 제작하여 배양을 했다. 배양 후, 배양 상청을 회수하여, Ni-NTA agarose(QIAGEN사 제조) 컬럼을 이용하여, 첨부된 설명서에 따라서, 가용형 FcRn 정제를 하여, 가용성 FcRn 단백질과 β2 마이크로글로불린의 복합체 단백질을 취득했다.
취득한 가용성 FcRn 단백질과 β2 마이크로글로불린의 복합체 단백질을 가용성 FcRn으로서 이용했다.
5. FcRn 결합 활성
항체의 혈중 반감기는 엔도좀에 존재하는 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor; FcRn)에 대한 pH 6.0과 pH 7.4에 있어서의 결합 활성과 관계되어 있음이 알려져 있다[J. Immunol., 176, 346(2006)].
개변에 의한 혈중 반감기에의 영향을 검토하기 위해서, 개변 항체의 pH 6.0 또는 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합 활성을 Biacore T-100(GE healthcare사)으로 평가했다.
컨트롤에는, 리툭시맵 및 공지된 문헌에 기재가 있는 FcRn에 대한 결합 활성이 상승된 IgG1 개변 서열(T250Q/M428L)[J. Immunol., 176, 346(2006)]을 갖는 리툭시맵을 이용했다.
아세테이트 5.5로 10 ㎍/mL에 희석한 항β2-마이크로글로블린 항체(abcam사)를 유속 10 μL/분으로 420초간 반응시켜, 아민 커플링법으로 CM5 센서 칩(GE healthcare 사)에 고정화했다(목표량 : 10,000 RU).
또한, pH 6.0 또는 pH 7.4로 조정한 HBS-EP+ 버퍼(GE healthcare사)로 1 ㎍/mL 가용성 FcRn을 유속 5 μL/분으로 24초간 반응시켜 센서 칩 표면에 포착했다(목표량 : 100 RU).
항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 HBS-EP+ 버퍼로 희석하여 유속 30 μL/분으로 120초간 반응시켜, 결합·해리 반응을 측정했다. 센서 칩의 재생은 Glycine-HCl pH 2.0을 유속 60 μL/분으로 60초간 반응시킴으로써 행했다.
KD치는 Biacore T-100 Evaluation 소프트웨어(GE healthcare사)로 이가 결합 모델(Bivalent binding model)을 이용한 해석에 의해 산출했다.
표 5에 개변 항체의 pH 6.0에 있어서의 각종 반응 상수를 나타낸다.
Figure 112012070328018-pct00006
표 5에 나타내는 것과 같이, N392K, T394Y 및 T394F의 pH 6.0에 있어서의 반응 속도 상수 KD는 113F형 항체나 리툭시맵과 동등했다. 또한, pH 7.4에 있어서는 어느 항체도 결합 활성이 인정되지 않았다.
본 발명을 특정한 양태를 이용하여 상세히 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고서 여러 가지 변경 및 변형이 가능한 것은 당업자에게 있어서 분명하다. 한편, 본 출원은 2010년 3월 2일자로 출원된 미국 가출원(61/309631호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
서열목록 프리텍스트
서열 번호 1 : 113F Fc 영역의 아미노산 서열
서열 번호 2 : 113F 정상 영역의 아미노산 서열
서열 번호 3 : N392K 정상 영역의 아미노산 서열
서열 번호 4 : FcRn fw 프라이머의 염기 서열
서열 번호 5 : FcRn rv 프라이머의 염기 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> antibody variant compositions <130> W501764 <150> US61/309631 <151> 2010-03-02 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 113F Fc region <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 113F constant region <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N392K constant region <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: FcRn fw primer <400> 4 agtaaacctg aatctttgga gtacgctgga tagcctccag gccagaaaga gagagtagcg 60 cgagcacagc taaggccacg gagcgagaca tggtgagggg tc 102 <210> 5 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: FcRn rv primer <400> 5 tccaaagatt caggtttact cacgtcatcc agcagagaat ggaaagtcaa atttcctgaa 60 ttgctatgtg tctgggtttc atccatccga cattgaagtt gacttactga agaatggaga 120

Claims (18)

  1. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 개변이 행해지고, EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열이 EU 인덱스 392∼394번째이며, 인간 IgG 항체의 Fc 영역이 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 개변 항체 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, EU 인덱스의 392∼394번째 중 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이하의 아미노산 잔기로 개변된 개변 항체 조성물.
    EU 인덱스 392번째 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 또는 Trp
    EU 인덱스 393번째 : Pro
    EU 인덱스 394번째 : Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Tyr 또는 Trp
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, CH1 도메인 및 힌지 도메인을 포함하고, 이 CH1 도메인 및 힌지 도메인이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는 개변 항체 조성물.
  7. 제1항에 있어서, EU 인덱스 339번째의 Thr이, Asn 또는 Tyr의 아미노산 잔기로 개변된 Fc 영역을 포함하는 개변 항체 조성물.
  8. 제1항에 있어서, EU 인덱스 397번째의 Met이, Gln, Asn, Asp 및 Phe에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기로 개변된 항체 Fc 영역을 포함하는 개변 항체 조성물.
  9. 제1항에 기재한 개변 항체의 아미노산 서열을 코드하는 DNA.
  10. 제9항에 기재한 DNA를 함유하는 벡터.
  11. 제10항에 기재한 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
  12. 제1항에 기재한 개변 항체의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 함유하는 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체를 배지 내에서 배양하여, 배양액 중에 제1항에 기재한 개변 항체를 생성 축적시키고, 배양액으로부터 개변 항체를 정제하는, 제1항에 기재한 개변 항체 조성물을 제조하는 방법.
  13. 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열을 구성하는 아미노산 잔기에 있어서, Asn에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변, X에서 Pro로의 아미노산 개변 및 Ser/Thr에서 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 개변에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 개변을 행하고, EU 인덱스 297∼299번째 이외에 존재하는 Asn-X-Ser/Thr(X는 Pro 이외의 아미노산 잔기) 서열이 EU 인덱스 392∼394번째인, 상기 Asn-X-Ser/Thr 서열의 Asn 잔기에 결합하는 N-글리코시드 결합형 당쇄를 감소시키는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서, EU 인덱스의 392∼394번째 중 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이하의 아미노산 잔기로 개변된 방법.
    EU 인덱스 392번째 : Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg, His, Phe, Tyr 또는 Trp
    EU 인덱스 393번째 : Pro
    EU 인덱스 394번째 : Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Tyr 또는 Trp
  17. 제13항에 있어서, 인간 IgG 항체의 Fc 영역이 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 인간 IgG 항체가 CH1 도메인 및 힌지 도메인을 포함하고, 이 CH1 도메인 및 힌지 도메인이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
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