ES2654040T3 - Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos - Google Patents

Abstract

Un método para producir un anticuerpo multiespecífico que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido cuyos puntos isoeléctricos son diferentes, en donde el método comprende los pasos de: (A) modificar ambos o uno cualquiera de un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del segundo polipéptido, tal que la diferencia entre el punto isoeléctrico del primer polipéptido y el del segundo polipéptido será 0,5 o más, en el que la(s) posición(es) modificada(s) de dicho ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste en (i) y (ii) a continuación: (i) al menos una de las posiciones 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 68, 71, 72 , 73, 75, 76, 81, 82b, 83, 85, 86, 97, 105, 108, 110 y 112, numeración Kabat, en la región variable de la cadena H, y (Ii) al menos una de las posiciones 137, 196, 203, 214, 217, 233, 268, 274, 276, 297, 355, 392, 419, y 435, numeración de la UE, en la región constante de la cadena H; (b) cultivar células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos; y (c) recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de la célula huésped, usando la diferencia en el punto isoeléctrico, en el que el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden una región variable de la cadena pesada.

Description

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sustituido con IgG2, y en la combinación del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado y el anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4. A: coexpresión del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado y el anticuerpo PM1 humanizado sustituido con IgG2; B: coexpresión del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado y el anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4.

La Fig. 19 representa el resultado de la purificación de los homodímeros y el heterodímero mediante cromatografía de intercambio catiónico a partir de la coexpresión del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado y el anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4. Como resultado, se eluyeron tres picos en el siguiente orden: homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4, anticuerpo híbrido PM-1 humanizado no modificado sustituido con PM-1/IgG4 y homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado no modificado. Estos picos fueron fraccionados. Las flechas indican los intervalos aproximados de fraccionamiento.

La figura 20 representa el resultado de la recromatografía del homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado no modificado, anticuerpo híbrido PM-1 humanizado no modificado sustituido con PM-1/IgG4 y homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4, que se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo híbrido isotipo se purificó.

La figura 21 es una fotografía que representa el resultado del análisis de enfoque isoeléctrico del homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado no modificado, anticuerpo híbrido PM-1 humanizado no modificado/IgG4-sustituido y homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado IgG4-sustituido, que se purificaron mediante cromatografía de intercambio catiónico. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo híbrido isotipo de interés se purificaba. A: coexpresión del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado y el anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4;

B: fracción del anticuerpo PM-1 humanizado no modificado; C: fracción del anticuerpo híbrido PM-1 humanizado PM1/IgG4-sustituido humanizado no modificado; D: fracción del anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4.

La figura 22 representa el resultado de evaluar la actividad neutralizante de IL-6 humana del homodímero de anticuerpo PM-1 humanizado no modificado, anticuerpo híbrido PM-1 humanizado sustituido con PM-1/IgG4 no modificado humanizado y homodímero del anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4, que se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico. Como resultado, todos los anticuerpos mostraron una actividad neutralizante equivalente a la del anticuerpo PM-1 humanizado purificado. A y B: línea celular BaF3 que expresa gp130 humana; C y D: línea celular BaF3 que coexpresa gp130 humano y receptor de IL-6 humano. Círculo relleno (•): producto purificado del anticuerpo PM-1 humanizado (a granel); cuadrado abierto (□): anticuerpo PM-1 humanizado no modificado; triángulo abierto (Δ): anticuerpo PM-1 humanizado sustituido con IgG4; x: anticuerpo híbrido PM-1 humanizado sustituido con PM-1/IgG4 humanizado no modificado.

El mejor modo para llevar a cabo la invención

La presente invención se refiere a métodos para modificar anticuerpos para la producción de anticuerpos multiespecíficos. Una realización preferida de los métodos de producción de la presente invención es un método que comprende modificar uno o ambos de un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos de un primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido, de modo que los puntos isoeléctricos del primer polipéptido y el segundo polipéptido serán diferentes, como se define en las reivindicaciones.

Es decir, se pueden producir anticuerpos multiespecíficos basándose en las diferencias en el punto isoeléctrico (pI), y la diferencia se puede introducir en los polipéptidos alterando las cargas de los residuos de aminoácidos en el primer polipéptido y el segundo polipéptido.

El método descrito en este documento comprende las siguientes etapas de:

(a)

modificar ambos o cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos del primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del segundo polipéptido, de modo que la diferencia entre los puntos isoeléctricos del primer polipéptido y el segundo polipéptido se incrementará;

(b)

cultivar células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos; y

(c)

recuperar un anticuerpo multiespecífico del cultivo de la célula huésped.

En la presente invención, los "polipéptidos" generalmente se refieren a péptidos y proteínas cuya longitud es de aproximadamente diez aminoácidos o más. Los polipéptidos se derivan generalmente de organismos, pero no están particularmente limitados a los mismos, y, por ejemplo, pueden estar compuestos por una secuencia diseñada artificialmente. También pueden ser polipéptidos derivados naturalmente, polipéptidos sintéticos, polipéptidos recombinantes, o similares. Adicionalmente, los fragmentos de los polipéptidos mencionados anteriormente también se incluyen en los polipéptidos de la presente descripción.

En la presente invención, la frase "la diferencia entre los puntos isoeléctricos de los polipéptidos" significa que los puntos isoeléctricos de dos o más polipéptidos se vuelven desiguales y es 0,5 o más al modificar las cargas de los aminoácidos sobre la superficie de cada polipéptido. La diferencia en los puntos isoeléctricos se puede observar, por

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ejemplo, mediante el uso de una técnica tal como el enfoque isoeléctrico. En la presente invención, los puntos isoeléctricos se modifican preferiblemente sin alterar la estructura y/o la función (actividad) de los polipéptidos.

Es decir, se describe un método para producir un anticuerpo multiespecífico que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el método comprende las etapas de:

(a)

modificar ambos o cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos del primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del segundo polipéptido, de modo que la diferencia entre el punto isoeléctrico del primer polipéptido y el del segundo polipéptido será de 0,5 o más, 0,7 o más, o 0,9 o más;

(b)

cultivar células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos; y

(c)

recuperar el anticuerpo multiespecífico del cultivo de la célula huésped.

Además, la presente invención se refiere a métodos para modificar anticuerpos para la purificación de anticuerpos multiespecíficos. Una realización preferida de los métodos de purificación de la presente invención es un método que comprende la etapa de modificar ambos o cualquiera de un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos de un primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos de un segundo polipéptido, de modo que los puntos isoeléctricos del primer polipéptido y el segundo polipéptido serán diferentes, como se define en las reivindicaciones. Es decir, la diferencia en el punto isoeléctrico (pI) se introduce en los polipéptidos alterando las cargas de los residuos de aminoácidos del primer polipéptido y las del segundo polipéptido. Por lo tanto, los anticuerpos multiespecíficos se pueden purificar usando esta diferencia en los puntos isoeléctricos. Un método de purificación descrito en este documento comprende las siguientes etapas de:

(a)

modificar ambos o cualquiera de un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del primer polipéptido y un ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácidos del segundo polipéptido, de modo que la diferencia entre el punto isoeléctrico del primer polipéptido y el segundo polipéptido aumentará;

(b)

cultivar células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos; y

(c)

purificar dicho anticuerpo multiespecífico del cultivo de la célula huésped mediante cromatografía estándar.

Los métodos para producir anticuerpos multiespecíficos que comprenden las etapas de purificación de los métodos de purificación mencionados anteriormente también se incluyen en la presente invención.

Los ácidos nucleicos de la presente descripción generalmente se clonan (insertan) en vectores adecuados y luego se introducen en células hospedadoras. Estos vectores no están particularmente limitados siempre que los ácidos nucleicos insertados se mantengan de forma estable. Por ejemplo, cuando se usa Escherichia coli como huésped, los vectores de clonación pueden ser vectores pBluescript (Stratagene) y similares, aunque se pueden usar varios vectores comercialmente disponibles. Cuando se usan vectores con el fin de producir los anticuerpos multiespecíficos (polipéptidos) de la presente descripción, los vectores de expresión son particularmente útiles. No existe una limitación particular en los vectores de expresión, siempre que puedan expresar polipéptidos en tubos de ensayo, E. coli, células cultivadas u organismos individuales. Por ejemplo, los vectores pueden incluir vectores pBEST (Promega) para la expresión en tubos de ensayo, vectores pET (Invitrogen) en E. coli, el vector pME18S-FL3 (número de entrada de GenBank AB009864) en células cultivadas, y el vector pME18S (Mol. Cell Biol. 8: 466-472 (1998)) en organismos individuales. La inserción de los ADN de la presente descripción en vectores se puede realizar, por ejemplo, mediante métodos estándar tales como reacciones de ligasa usando sitios de enzimas de restricción (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel y col. ( 1987) Ed. John Wiley & Sons. Sección 11.411.11).

No existe una limitación particular sobre las células hospedadoras mencionadas anteriormente, y se usan varias células hospedadoras dependiendo del propósito. Las células usadas para expresar polipéptidos incluyen las células bacterianas (por ejemplo, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis), células fúngicas (por ejemplo, levadura y Aspergillus), células de insecto (por ejemplo, Drosophila S2 y Spodoptera SF9), células animales (por ejemplo, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, células de melanoma Bowes) y células vegetales. Los vectores pueden introducirse en células hospedadoras usando métodos conocidos, tales como el método de precipitación con fosfato de calcio, el método de electroporación (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel y col. (1987) Ed. John Wiley & Sons. Sección 9.1-9.9), método de lipofección y método de microinyección.

Para secretar polipéptidos expresados en células hospedadoras en el lumen del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción adecuadas en los polipéptidos de interés. Estas señales pueden ser intrínsecas o ajenas a los polipéptidos de interés.

Cuando los polipéptidos de la presente descripción se secretan en medios de cultivo, los anticuerpos multiespecíficos (polipéptidos) producidos por los métodos mencionados anteriormente pueden recuperarse recuperando los medios. Cuando los polipéptidos de la presente descripción se producen dentro de las células,

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isoeléctrico, diálisis, recristalización, y similares.

Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak y otros, (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Estas cromatografías pueden llevarse a cabo usando cromatografía en fase líquida tal como HPLC y FPLC. Los ejemplos de columnas para la cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de las columnas que usan proteína A incluyen Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Pharmacia).

Un anticuerpo puede modificarse arbitrariamente, y los péptidos pueden eliminarse parcialmente del anticuerpo por tratamiento con una enzima modificadora de proteínas apropiada antes o después de la purificación del anticuerpo, según sea necesario. Dichas enzimas modificadoras de proteínas incluyen, por ejemplo, tripsinas, quimotripsinas, lisil endopeptidasas, proteínas quinasas y glucosidasas.

Otra realización preferida de la presente invención incluye un método para producir un anticuerpo multiespecífico, en el que el método comprende las etapas de cultivar las células hospedadoras como se describió anteriormente y recuperar el polipéptido del cultivo celular, como se define en las reivindicaciones.

En la presente invención, la expresión "anticuerpo multiespecífico" se refiere a un anticuerpo que se puede unir específicamente a al menos dos tipos diferentes de antígenos. Los ejemplos de anticuerpos multiespecíficos obtenidos mediante los métodos de producción o métodos de purificación de la presente invención incluyen anticuerpos biespecíficos (BsAbs) (también denominados anticuerpos de doble especificidad) que se pueden unir específicamente a dos antígenos.

En la presente invención, la expresión "antígenos diferentes" no significa necesariamente que los propios antígenos sean diferentes, y puede significar que los epítopos sean diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, epítopos diferentes dentro de una sola molécula también se incluyen en los "diferentes antígenos" de la presente descripción. En la presente invención, dos anticuerpos que reconocen diferentes epítopos dentro de una sola molécula se consideran anticuerpos que reconocen diferentes antígenos.

Los anticuerpos multiespecíficos descritos en este documento son anticuerpos que tienen especificidad por dos o más antígenos diferentes, o moléculas que comprenden fragmentos de tales anticuerpos.

En los métodos anteriormente mencionados de la presente invención, la frase "modificación de ácidos nucleicos" comprende la modificación de ácidos nucleicos que da como resultado picos separados de un primer polipéptido y un segundo polipéptido mediante análisis de cromatografía estándar.

En los métodos de la presente invención, la frase "modificación de ácidos nucleicos" se refiere a la modificación de ácidos nucleicos que corresponden a los residuos de aminoácidos que se introducen por la "modificación" descrita en este documento. Más específicamente, la frase se refiere a la alteración de ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos originales (antes de la modificación) en ácidos nucleicos que codifican residuos de aminoácidos que se introducen por la modificación.

Usualmente, la frase significa manipulación génica o mutagénesis que modifica los ácidos nucleicos originales insertando, eliminando o sustituyendo al menos un nucleótido, para producir un codón que codifica un residuo de aminoácido de interés. Más específicamente, un codón que codifica el residuo de aminoácido original se reemplaza por un codón que codifica el residuo de aminoácido que se va a introducir mediante la modificación. Dichas modificaciones de ácido nucleico pueden llevarse a cabo apropiadamente por los expertos en la técnica usando técnicas conocidas, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis por PCR.

Las posiciones de modificación pueden incluir, por ejemplo, (1) residuos de aminoácidos en la superficie de un polipéptido, (2) residuos de aminoácidos en la región variable, preferiblemente en la región FR, y (3) residuos de aminoácidos en la región constante.

"Aminoácidos en la superficie de un polipéptido" son aminoácidos cuyas cadenas laterales pueden entrar en contacto con moléculas de disolvente (generalmente moléculas de agua). No es necesario que toda la cadena lateral esté en contacto con moléculas de disolvente, e incluso si solo parte de la cadena lateral está en contacto con moléculas de disolvente, se considera que el aminoácido es un aminoácido en la superficie. Los expertos en la técnica pueden producir modelos de homología de polipéptidos o anticuerpos mediante modelado de homología y tal uso de software comercialmente disponible, y seleccionar de ese modo los residuos apropiados como aminoácidos en la superficie.

Los expertos en la materia pueden seleccionar adecuadamente los aminoácidos de superficie en la región variable del anticuerpo usando modelos de homología producidos por modelado de homología y similares. Por ejemplo, en la región FR de la cadena H, H1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110 y H112 son ejemplos de aminoácidos de superficie. Sin embargo, los aminoácidos de superficie descritos en este documento no están

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Un anticuerpo multiespecífico adicional puede ser un anticuerpo multiespecífico, en el que el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden la región constante de IgG4 humana, y en el que el tercer polipéptido comprende la región constante de kappa humana.

En este documento, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, e incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos mutantes, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, minicuerpos (incluidos fragmentos de anticuerpos) y anticuerpos multiespecíficos, siempre que muestren una actividad biológica deseada. En este documento, los métodos de modificación de anticuerpos de la presente descripción se pueden usar favorablemente sobre estos anticuerpos cuando se obtienen (producen).

Los "anticuerpos" de la presente descripción incluyen anticuerpos en los que la carga de residuos de aminoácidos se ha modificado como se describió anteriormente, y cuyas secuencias de aminoácidos se han modificado adicionalmente mediante sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos se han modificado por sustitución, deleción, adición y/o inserción de aminoácidos, o quimerización, humanización, o similares, y en los que la carga de residuos de aminoácidos se ha modificado adicionalmente. En resumen, se pueden realizar modificaciones al mismo tiempo cuando los anticuerpos de ratón se humanizan, o se pueden realizar modificaciones adicionales en anticuerpos humanizados.

Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos, tales como sustituciones, deleciones, adiciones, y/o inserciones de aminoácidos, y la humanización y la quimerización, se pueden lograr por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Cuando los anticuerpos de la presente descripción se preparan como anticuerpos recombinantes, del mismo modo, las secuencias de aminoácidos de las regiones variable y constante del anticuerpo también se pueden modificar por sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, o quimerización, humanización y similares.

Los anticuerpos de la presente descripción se pueden derivar de cualquier animal, tal como un ratón, ser humano, rata, conejo, cabra o camello. Además, pueden modificarse anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y, en particular, anticuerpos modificados que incluyen sustituciones de aminoácidos en su secuencia, tales como anticuerpos humanizados. Los anticuerpos pueden ser cualquier tipo de anticuerpo, tales como productos de modificación de anticuerpos unidos a diversas moléculas, fragmentos de anticuerpos y minicuerpos.

Los "anticuerpos quiméricos" son anticuerpos preparados combinando secuencias derivadas de diferentes animales. Un ejemplo es un anticuerpo que tiene regiones variables (V) de cadena pesada y ligera a partir de un anticuerpo de ratón y regiones constantes de cadena pesada y ligera (C) de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse por métodos conocidos. Para obtener tales anticuerpos quiméricos, por ejemplo, un ADN que codifica una región V de anticuerpo se puede ligar con un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano; el producto de ligación resultante puede insertarse en un vector de expresión; y la construcción se puede introducir en un huésped para producir el anticuerpo quimérico.

Los "anticuerpos humanizados" también se denominan anticuerpos humanos reconfigurados, y se pueden obtener sustituyendo la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano por la CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón. Los métodos para identificar CDR son conocidos en la técnica (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). También se conocen técnicas generales de recombinación genética adecuadas para este fin (véanse la solicitud de patente europea EP 125023 y el documento WO 96/02576). Por ejemplo, la CDR de un anticuerpo de ratón se puede determinar mediante métodos conocidos, y se puede preparar un ADN de manera que codifique un anticuerpo en el que la CDR se lige con la región marco (FR) de un anticuerpo humano. Entonces puede producirse un anticuerpo humanizado usando un sistema que use vectores de expresión convencionales. Dichos ADN pueden sintetizarse por PCR, usando como cebadores varios oligonucleótidos diseñados para incluir porciones que se solapan con los extremos tanto de las regiones CDR como FR (véase el método descrito en el documento WO 98/13388). Los FR de anticuerpos humanos unidos a través de CDR se seleccionan de manera que las CDR formen un sitio de unión a antígeno adecuado. Si es necesario, los aminoácidos en las FR de una región variable de anticuerpo pueden estar sustituidos de modo que las CDR del anticuerpo humano reconfigurado pueden formar un sitio de unión a antígeno adecuado (Sato, K. y col., Cancer Res. (1993)53: 851 -856). Los residuos de aminoácidos modificables en las FR incluyen porciones que se unen directamente a enlaces no covalentes a través del antígeno (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), porciones que tienen algún impacto o efecto sobre la estructura de la CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901 -17), y porciones implicadas en la interacción entre VH y VL (documento EP 239400).

Cuando los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, las regiones C de estos anticuerpos derivan preferiblemente de anticuerpos humanos. Por ejemplo, Cγ1, Cγ2, Cγ3 y Cγ4 se pueden usar para la cadena H, mientras que Cκ y Cλ se pueden usar para la cadena L. Mientras tanto, la región C del anticuerpo humano se puede modificar según se requiera para mejorar la estabilidad del anticuerpo o la producción. Un anticuerpo quimérico de la presente descripción puede incluir una región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y una región constante de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede incluir las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y regiones FR y C de un anticuerpo

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heteróloga y similar frente a humanos, pueden producirse apropiadamente si es necesario para anticuerpos tales como anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de hámster, anticuerpos de oveja y anticuerpos de camello. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos compuestos por una cadena H de anticuerpo de mamífero no humano y regiones variables de la cadena L, tales como anticuerpos de ratón, y las regiones constante de la cadena H y la cadena L del anticuerpo humano. Se pueden obtener ligando el ADN que codifica una región variable de un anticuerpo de ratón al ADN que codifica una región constante de un anticuerpo humano, incorporándolos en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un huésped para la producción del anticuerpo. Un anticuerpo humanizado, que también se denomina anticuerpo humano reconfigurado, se puede sintetizar por PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos de modo que tengan partes solapantes en los extremos de las secuencias de ADN diseñadas para unir las regiones determinantes complementarias (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano tal como un ratón. El ADN obtenido se puede ligar a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano. El ADN ligado se puede incorporar en un vector de expresión, y el vector se puede introducir en un huésped para producir el anticuerpo (véanse los documentos EP239400 y WO96/02576). Las FR del anticuerpo humano que se ligan a través de la CDR se seleccionan cuando la CDR forma un sitio de unión a antígeno favorable. Si es necesario, los aminoácidos en la región estructural de una región variable de anticuerpo pueden estar sustituidos de manera que la CDR del anticuerpo humano reformado forme un sitio de unión a antígeno apropiado (K. Sato y col., Cancer Res. 1993, 53: 851 -856).

Además de las técnicas de humanización descritas anteriormente, los anticuerpos pueden modificarse para mejorar sus propiedades biológicas, por ejemplo, la afinidad antigénica. Tales modificaciones se pueden llevar a cabo usando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA 82: 488), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete. En general, los anticuerpos mutantes cuyas propiedades biológicas se han mejorado muestran homología y/o similitud de secuencia de aminoácidos de 70% o superior, 80% o superior, o 90% o superior (por ejemplo, 95% o superior, 97%, 98%, 99%, etc.), en comparación con la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo original. En este documento, la homología y/o similitud de secuencia se define como la proporción de residuos de aminoácidos que son homólogos (mismo residuo) o similares (residuos de aminoácidos clasificados en el mismo grupo en función de las propiedades generales de las cadenas laterales de aminoácidos) de los residuos del anticuerpo original, después de que el valor de homología de secuencia se haya maximizado por alineamiento de secuencia e introducción del intervalo, si es necesario. En general, los residuos de aminoácidos de origen natural se clasifican en grupos en función de las características de sus cadenas laterales: (1) hidrofóbicas: alanina, isoleucina, valina, metionina y leucina; (2) hidrófilo neutro: asparagina, glutamina, cisteína, treonina y serina; (3) ácido: ácido aspártico y ácido glutámico; (4) básico: arginina, histidina y lisina; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: glicina y prolina; y (6) aromático: tirosina, triptófano y fenilalanina.

Normalmente, un total de seis regiones determinantes complementarias (CDR, regiones hipervariables) presentes en las regiones variables de la cadena H y de la cadena L interactúan para formar el(los) sitio(s) de unión a antígeno de un anticuerpo. Incluso se sabe que una de estas regiones variables tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque la afinidad será menor que cuando se incluyen todos los sitios de unión. Por lo tanto, los genes de anticuerpos de la presente descripción que codifican la cadena H y la cadena L solo tienen que codificar porciones de fragmentos que tienen cada uno de los sitios de unión a antígeno de la cadena H y la cadena L, y los polipéptidos codificados por estos genes solo tienen que mantener la afinidad con los antígenos deseados.

Por ejemplo, como se describió anteriormente, los anticuerpos biespecíficos deseados que realmente tienen actividades se pueden obtener de manera eficiente mediante los métodos de la presente invención.

Las regiones variables de cadena pesada generalmente están compuestas por tres regiones CDR y cuatro regiones FR, como se describió anteriormente. Los residuos de aminoácidos sometidos a "modificación" pueden seleccionarse apropiadamente, por ejemplo, a partir de residuos de aminoácidos en las regiones CDR o regiones FR. Generalmente, la modificación de residuos de aminoácidos en las regiones CDR puede disminuir la afinidad hacia los antígenos. Por lo tanto, los residuos de aminoácidos sometidos a "modificación" no están particularmente limitados, pero pueden seleccionarse apropiadamente a partir de residuos de aminoácidos en las regiones FR.

Además, las secuencias que pueden usarse como FR de región variable para anticuerpos en organismos tales como el humano o el ratón pueden obtenerse de manera apropiada por los expertos en la técnica usando bases de datos públicas. Más específicamente, la información de las secuencias de aminoácidos de las regiones FR se puede obtener por los medios descritos más adelante en los Ejemplos.

Ejemplos

A continuación en este documento, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los Ejemplos, pero no debe interpretarse como limitada a los mismos.

[Ejemplo 1] Humanización de anticuerpos biespecíficos que llevan una cadena L híbrida

Un anticuerpo biespecífico compuesto por una combinación del anticuerpo anti-Factor IXa A69-VH, anticuerpo B26-VH anti-Factor X y cadena L híbrida (BBA), que fue el más eficaz para acortar el tiempo de coagulación sanguínea

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en la solicitud de patente japonesa No. 2005-112514, se humanizó de la siguiente manera.

1-1. Búsqueda de homología de anticuerpos humanos

Se construyó una base de datos obteniendo datos de la secuencia de aminoácidos de anticuerpos humanos de la base de datos pública de Kabat (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) y de la base de datos IMGT (http://imgt. cines.fr/), y se realizó la búsqueda de homología en la base de datos para la región variable de la cadena H de A69 de ratón (secuencia de aminoácidos: SEQ ID Nº: 19), región variable de cadena H de B26 de ratón (secuencia de aminoácidos: SEQ ID Nº: 20), y la región variable de la cadena L de BBA de ratón (secuencia de aminoácidos: SEQ ID Nº: 21). Los resultados confirmaron que tienen una alta homología con las secuencias de anticuerpos humanos a continuación y, por lo tanto, se decidió que podrían usarse como región estructural (en lo sucesivo denominada FR) para anticuerpos humanizados.

(1) Región variable de la cadena A69 H: KABATID-000064 (base de datos Kabat) (Kipps et al., J. Clin. Invest. 1991;

87: 2087-2096)

(2)

Región variable de la cadena H B26: Nº de entrada EMBL AB063872 (base de datos IMGT) (datos no publicados)

(3)

Región variable de la cadena L de BBA: KABATID-024300 (base de datos Kabat) (Welschof et al. J. Immunol. Method. 1995; 179: 203-214).

La región determinante de la complementariedad (en lo sucesivo denominada CDR) de cada uno de los anticuerpos de ratón se injertó en la FR de anticuerpos humanos de (1) -(3), y se prepararon así anticuerpos humanizados.

Además, el sitio web de búsqueda de homología descrito públicamente por NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) se utilizó para buscar secuencias de señal secretoras de anticuerpos humanos que son altamente homólogas a los anticuerpos humanos de (4) -(6). Se usaron las siguientes secuencias de señal secretoras obtenidas mediante la búsqueda.

(4)

Región variable de la cadena H A69: Nº de entrada GenBank AF062257

(5)

Región variable de la cadena B B26: Nº de entrada GenBank ACC18248

(6)

Región variable de la cadena L BBA: Nº de entrada Genbank AAA59100

1-2. Construcción de vectores de expresión de genes de anticuerpos humanizados

Para una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que cubre desde la secuencia señal secretora a la región variable del anticuerpo, se prepararon doce oligo-ADN sintéticos de aproximadamente 50 bases, de manera que aproximadamente 20 bases en el extremo 3' se hibridan entre sí. Los oligo-ADN sintéticos se diseñaron de manera que codifican una secuencia humana en el lado 5' y una secuencia de ratón en el lado 3', o de manera que todos los nucleótidos codifican una secuencia humana. Además, se preparon un cebador que se hibrida con el extremo 5' de un gen de la región variable del anticuerpo y tiene la secuencia de escisión de XhoI, y un cebador que codifica la secuencia del extremo 5' de la secuencia del intrón, se hibrida con el extremo 3' de un gen de la región variable del anticuerpo, y tiene la secuencia de escisión SfiI.

Se mezclaron 1 μL de cada oligo-ADN sintético preparado a 2,5 μM, y se añadieron 1x TaKaRa Ex Taq Buffer, 0,4 mM dNTPs y 0,5 unidades de TaKaRa Ex Taq (todos de Takara) para preparar una solución de reacción de 48 μL. Después de calentar a 94ºC durante cinco minutos, se llevaron a cabo dos ciclos de reacción a 94ºC durante dos minutos, 55ºC durante dos minutos y 72ºC durante dos minutos para ensamblar y alargar cada uno de los oligo-ADN sintéticos. A continuación, se añadieron 1 μL (10 μM cada uno) de cada uno de los cebadores que se hibridan al extremo 5' y al extremo 3' del gen del anticuerpo, y el gen de la región variable del anticuerpo se amplificó mediante 35 ciclos de reacción a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante un minuto, y luego la reacción a 72ºC durante cinco minutos. Después de llevar a cabo la PCR, la cantidad total de la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron usando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con 30 μL de agua esterilizada. Los fragmentos se clonaron usando el sistema pGEM-T Easy Vector (Promega) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. La secuencia de nucleótidos de cada fragmento de ADN se determinó usando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator (Applied Biosystems) y el secuenciador de ADN ABI PRISM 3730xL o el secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto.

El plásmido insertado en el fragmento de la región variable de la cadena H se digirió con XhoI y SfiI, y el plásmido insertado en el fragmento de la región variable de la cadena L se digirió con EcoRI, después de confirmarse que tenían la secuencia del gen de la región variable del anticuerpo humanizado correcta. Luego, las soluciones de reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN que tenían el tamaño

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concentraciones del sobrenadante del cultivo y los productos purificados en Biacore 1000 (BIACORE). Se usó HBS-EP Buffer (BIACORE) para la inmovilización del chip sensor y para las mediciones de la concentración. Se realizaron seis diluciones en serie de dos veces de un anticuerpo IgG4 humanizado (anticuerpo anti-TF humanizado, véase el documento WO99/51743) a partir de 4000 ng/ml con tampón HBS-EP, y se usaron como patrón para las mediciones de la concentración.

1-6. Ensayo de actividad de coagulación sanguínea para anticuerpos biespecíficos humanizados

Para determinar si un anticuerpo biespecífico era capaz de corregir la capacidad de coagulación de la sangre en hemofilia A, se determinaron los efectos del anticuerpo sobre el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) usando plasma deficiente en Factor VIII. Se mezclaron 50 μL de una solución de anticuerpo a una variedad de concentraciones, 50 μL de plasma deficiente en Factor VIII (Biomerieux) y 50 μL del reactivo APTT (Dade Behring) y se calentaron a 37ºC durante tres minutos. La reacción de coagulación se inició añadiendo 50 μl de CaCl2 20 mM (Dade Behring) a la mezcla. El período de tiempo hasta la coagulación se midió con KC10A (Amelung) unido a CR-A (Amelung).

Utilizando una curva de calibración producida definiendo el tiempo de coagulación del plasma deficiente en Factor VIII como 0% y el tiempo de coagulación del plasma normal como 100%, se calculó la actividad (%) tipo Factor VIII de un anticuerpo biespecífico a partir del tiempo de coagulación medido cuando se agregó el anticuerpo biespecífico.

1-7. Adquisición de anticuerpos biespecíficos humanizados que tienen actividad de coagulación sanguínea

El anticuerpo FR humano de anticuerpos biespecíficos humanizados que presentaba una capacidad de coagulación sanguínea disminuida en el ensayo de actividad de coagulación sanguínea mencionado anteriormente se sometió a modificación de aminoácidos para aumentar la actividad. Más específicamente, se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene) para introducir mutaciones en la región variable del anticuerpo humanizado de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. El plásmido insertado en el fragmento de la región variable de la cadena H digerido con XhoI y SfiI, y el plásmido insertado en el fragmento de la región variable de la cadena L se digirieron con EcoRI, después de que se confirmó que tenían la secuencia deseada del gen de la región variable del anticuerpo humanizado. Luego, las soluciones de reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN que tenían el tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron usando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con 30 μL de agua esterilizada. Luego, se prepararon plásmidos para expresión en células animales de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1-2. Los anticuerpos biespecíficos humanizados se prepararon de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos 1-3, 1-4 y 1-5, y la actividad de la coagulación sanguínea se evaluó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1-6.

Repitiendo modificaciones de aminoácidos de la secuencia de FR y la evaluación de la capacidad de coagulación sanguínea, se obtuvo un anticuerpo biespecífico humanizado (A69 humanizado (hA69a)/B26 humanizado (hB26F123e4)/BBA humanizado (hAL-F123j4)) que tenía el mismo nivel de actividad que el anticuerpo biespecífico quimérico (A69/B26/BBA) (Fig. 1) Las secuencias de la región variable del anticuerpo se muestran en las siguientes SEQ ID NOs.

(1)

VH del anticuerpo A69 humanizado (hA69a): SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID NO: 2 (secuencia de aminoácidos)

(2)

VH del anticuerpo B26 humanizado (hB26-F123e4): SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID Nº: 4 (secuencia de aminoácidos)

(3)

VL del anticuerpo BBA humanizado (hAL-F123j4): SEQ ID Nº: 5 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID Nº: 6 (secuencia de aminoácidos)

[Ejemplo 2] Selección de sitios en las posiciones de modificación de aminoácidos de la región variable para la separación de anticuerpos biespecíficos

En la preparación de un anticuerpo biespecífico, cuando se usan dos tipos de cadenas H y un tipo de cadena L para la expresión, se expresan los siguientes tres tipos de anticuerpos: un homodímero de la cadena H humanizada A69 y la cadena L de BBA humanizada, un homodímero de la cadena H B26 humanizada y la cadena L de BBA humanizada, y un heterodímero de la cadena H A69 humanizada, la cadena H B26 humanizada y la cadena L de BBA humanizada. El objetivo es purificar solo el anticuerpo biespecífico separando estos tres tipos de anticuerpos y, por lo tanto, se llevaron a cabo modificaciones de aminoácidos para disminuir el punto isoeléctrico de la región variable de la cadena H humanizada A69 y aumentar el punto isoeléctrico de la región variable de la cadena H humanizada B26.

Primero, se prepararon modelos de la región Fv de anticuerpo para el anticuerpo humanizado A69 y el anticuerpo B26 humanizado mediante modelado de homología usando el software MOE (Chemical Computing Group Inc.), y se confirmaron los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de las regiones variables del anticuerpo A69

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prepararon y analizaron anticuerpos modificados por isoelectroenfoque.

El vector de expresión de la cadena L de BBA humanizado (hAL-F123j4) se expresó simultáneamente junto con el vector de expresión de la cadena H de hA69a no modificado, o hA69-p18, hA69-p8, hA69-p17 o hA69-p16 modificado a partir de la cadena H de A69 humanizado. Se prepararon cinco tipos de anticuerpos compuestos por los homodímeros hA69a, hA69-p18, hA69-p8, hA69-p17 o hA69-p16. De forma similar, el vector de expresión de la cadena L de BBA humanizado se expresó simultáneamente junto con el vector de expresión de la cadena H de hB26-F123e4 no modificado, o hB26-p19 o hB26-p15 modificado a partir de la cadena H B26 humanizada. Se prepararon tres tipos de anticuerpos compuestos por los homodímeros hB26-F123e4, hB26-p19 o hB26-p15. El enfoque isoeléctrico se realizó de la siguiente manera. El gel PhastGel Dry IEF (Amersham Biosciences) se hinchó durante aproximadamente 30 minutos en la solución de hinchamiento que se describe a continuación usando el Casete Phastsystem (Amersham Biosciences).

20% de glicerol 0,95 mL

agua MilliQ 0,95 mL

Bio-Lyte 7/9 (Bio-Rad) 10 μL

Bio-Lyte 3/10 (Bio-Rad) 10 μL

Pharmalyte 8-10.5 para IEF (Amersham Biosciences) 80 μL

La electroforesis se realizó usando el gel hinchado por PhastSystem (Amersham Biosciences) de acuerdo con el siguiente programa. Las muestras se aplicaron al gel en el Paso 2. Se utilizó un kit de calibración pI (Amersham Biosciences) como marcador pI.

Paso 1: 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15ºC 75 Vh

Paso 2: 200 V 2,5 mA 3,5 W 15ºC 15 Vh

Paso 3: 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15ºC 410 Vh

Después de la electroforesis, el gel se fijó con 20% de TCA, y luego se tiñó con plata usando un kit de tinción de plata, proteína (Amersham Biosciences) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Después de la tinción, los puntos isoeléctricos de las muestras se calcularon a partir de los puntos isoeléctricos conocidos del marcador pI.

Los resultados del análisis de los homodímeros de anticuerpo A69 no modificados y modificados y el homodímero de anticuerpo B26 humanizado se muestran en la Fig. 3. Se observaron cambios de banda en el enfoque isoeléctrico debido a la modificación de la carga superficial. Los puntos isoeléctricos de los respectivos anticuerpos estimados en referencia al marcador pI fueron aproximadamente 8,4 para hA69-p18 modificado, aproximadamente 8,2 para hA69-p17 modificado, aproximadamente 8,2 para hA69-p8 modificado, y aproximadamente 8,1 para hA69p16 modificado, en contraste a aproximadamente 8,8 para el homodímero hA69a no modificado. Es decir, la modificación fue capaz de proporcionar una diferencia máxima de punto isoeléctrico de aproximadamente 0,7. De forma similar, con respecto a los homodímeros B26 humanizados, los puntos isoeléctricos fueron aproximadamente 9,3 para hB26-p19 modificado y aproximadamente 9,4 para hB26-p15 modificado, en contraste con aproximadamente 9,1 para hB26-F123e4 no modificado. Es decir, la modificación fue capaz de proporcionar una diferencia máxima de punto isoeléctrico de aproximadamente 0,3. Se demostró que el punto isoeléctrico puede alterarse modificando las cargas en los aminoácidos de superficie en la región variable seleccionada para este examen: H12, H23, H39, H43 y H105.

[Ejemplo 5] Análisis cromatográfico de intercambio catiónico de anticuerpos humanizados modificados

El análisis cromatográfico de intercambio catiónico se realizó por el siguiente método usando los anticuerpos modificados producidos en el Ejemplo 4 para evaluar el efecto de la modificación sobre la separación de los dos anticuerpos. Las condiciones para el análisis cromatográfico de intercambio catiónico fueron las siguientes. El tiempo de retención se calculó para el homodímero de anticuerpo A69 humanizado y el homodímero de anticuerpo B26 humanizado.

Columna: ProPac WCX-10, 4 x 250 mm, (Dionex)

Fase móvil: A: 10 mmol/l NaH2PO4/Na2HPO4, pH 6,25

B: 10 mmol/l NaH2PO4/Na2HPO4, 500 mmol/l NaCl, pH 6,25

Caudal: 1,0 mL/min

Gradiente: 10% B (5 min) → (40 min) → 60% B → (5 min) → 100% B (5 min)

Detección: 220 nm

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Los resultados del análisis de los cinco tipos de homodímeros de anticuerpos A69 no modificados y modificados humanizados, y los tres tipos de homodímeros de anticuerpos B26 humanizados no modificados y modificados se muestran en la Fig. 4 y la Fig. 5, respectivamente. El tiempo de retención para el homodímero de anticuerpo A69 humanizado no modificado y el homodímero de anticuerpo B26 humanizado fue de aproximadamente 25 minutos, y por lo tanto la separación de estos homodímeros fue imposible, y mucho menos el aislamiento del anticuerpo biespecífico deseado. Se observaron desplazamientos de los máximos al comparar el anticuerpo A69 humanizado no modificado con los que se modificaron para tener puntos isoeléctricos inferiores, y el tiempo de retención disminuyó a aproximadamente 22,4 minutos, aproximadamente 21,2 minutos y aproximadamente 20,2 minutos, a medida que aumentaba el número de modificaciones. Se observaron desplazamientos de los máximos al comparar el anticuerpo B26 humanizado no modificado con los que se modificaron para tener puntos isoeléctricos superiores para la región variable, y el tiempo de retención aumentó a aproximadamente 28,4 minutos y a aproximadamente 29,4 minutos, a medida que aumentaba el número de modificaciones. Por lo tanto, se demostró que el tiempo de retención se puede modificar modificando las cargas en los aminoácidos de superficie en la región variable seleccionada para este examen, H12, H23, H39, H43 y H105, y modificando así las cargas superficiales de los dos tipos de anticuerpos.

Según las mediciones del punto isoeléctrico en el Ejemplo 4, a pesar de una diferencia pI de 0,3 entre el homodímero hA69a no modificado y el homodímero hB26-F123e4 no modificado, el tiempo de retención para ambos homodímeros fue de alrededor de 25 minutos, y por lo tanto no pudieron separarse (Fig. 9). Sin embargo, la diferencia de pI entre el homodímero hA69a no modificado y hB26-p19 fue de 0,5, y por lo tanto se separaron por una diferencia de tiempo de retención de aproximadamente 2,6 minutos. Además, la diferencia de pI entre hA69-p18 y el homodímero hB26 fue 0,7, y por lo tanto se separaron por una diferencia de tiempo de retención de aproximadamente 3,4 minutos. Además, se generó una diferencia de pI máxima de 1,3 entre hA69-p16 y hB26-p15, y por lo tanto se separaron por una diferencia de tiempo de retención de aproximadamente 9,2 minutos. Como se describió, las modificaciones hicieron posible separar los dos homodímeros por primera vez.

[Ejemplo 6] Evaluación de la actividad de coagulación de anticuerpos biespecíficos humanizados modificados

Basándose en la observación de la alteración de la carga superficial realizada a través de los análisis en los Ejemplos 4 y 5, se expresaron dos tipos de cadenas H de anticuerpo humanizado modificado (hA69-p8 y hB26-p15) y una cadena L humanizada (hAL-F123j4) para preparar anticuerpos biespecíficos humanizados. Un vector de expresión, en el que la región constante de IgG4 basada en la técnica de botón en hojal se insertó en un vector de expresión, se usó como el vector de expresión de la cadena H para promover eficazmente la heterodimerización. Las actividades de coagulación se evaluaron de acuerdo con el método descrito a continuación usando anticuerpos biespecíficos humanizados preparados.

Para determinar si un anticuerpo biespecífico era capaz de corregir la capacidad de coagulación de la sangre en hemofilia A, se determinaron los efectos del anticuerpo sobre el tiempo de la tromboplastina parcial activada (APTT) usando plasma deficiente en Factor VIII. Se mezclaron 50 μL de una solución de anticuerpo a una variedad de concentraciones, 50 μL de plasma deficiente en Factor VIII (Biomerieux) y 50 μL del reactivo APTT (Dade Behring) y se calentaron a 37ºC durante tres minutos. La reacción de coagulación se inició añadiendo 50 μl de CaCl2 20 mM (Dade Behring) a la mezcla. El período de tiempo hasta la coagulación se midió con KC10A (Amelung) unido a CR-A (Amelung).

Utilizando una curva de calibración producida definiendo el tiempo de coagulación del plasma deficiente en Factor VIII como 0% y el tiempo de coagulación del plasma normal como 100%, se calculó la actividad (%) tipo Factor VIII de un anticuerpo biespecífico a partir del tiempo de coagulación medido cuando se agregaba el anticuerpo biespecífico.

Los resultados de la evaluación de la actividad se muestran en la Fig. 6. Dado que el anticuerpo biespecífico humanizado con una región variable modificada mostraba una actividad de coagulación equivalente a la del anticuerpo biespecífico humanizado no modificado, se demostró que la modificación de la región variable en este ejemplo no afectaba a las actividades de los anticuerpos.

[Ejemplo 7] Preparación y evaluación de anticuerpos humanizados modificados con CDR

Como resultado del análisis del modelo de anticuerpo A69 humanizado producido en el Ejemplo 2, se confirmó que H97 era un aminoácido expuesto a la superficie. De los anticuerpos mostrados en la Tabla 1, la cadena H humanizada A69 hA69-N97R tiene una secuencia en la que la asparagina en la posición 97 en CDR3 ha sido reemplazada por arginina. Los anticuerpos modificados se prepararon produciendo un vector de expresión que portaba hA69-N97R de acuerdo con el método del Ejemplo 1-2, y expresándolo junto con la cadena L de BBA humanizada hAL-F123j4. Para evaluar la alteración de la carga superficial de este anticuerpo, se realizó el enfoque isoeléctrico de acuerdo con el método del Ejemplo 4. Como se indica en la Fig. 7, mientras que el punto isoeléctrico del anticuerpo no modificado (hA69a/hAL-F123j4) fue de 8,9, el del anticuerpo modificado (hA69-N97R/hAL-F123j4) fue de 9,1 y, por lo tanto, la alteración de la carga superficial también se observó en la sustitución de aminoácidos de CDR.

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Para evaluar la función de los anticuerpos modificados, la actividad de unión al antígeno, Factor IXa, se ensayó mediante el siguiente método. Se dispensó factor IXaβ (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 μg/ml con tampón de recubrimiento (bicarbonato sódico 100 mM, pH 9,6, azida sódica al 0,02%) a 100 μL/pocillo en una placa Nunc-Immuno (placas Nunc-Immuno™ 96 MicroWell™ MaxiSorp™ (Nalge Nunc International)), y luego se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de tres lavados con PBS (-) que contenía Tween® 20, la placa se bloqueó con tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, albúmina de suero bovino al 1%, MgCl2 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween® 20 al 0,05%, 0,02% de azida sódica) a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la eliminación del tampón, se añadió un anticuerpo purificado diluido en el tampón diluyente a la placa a 100 μl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La placa se lavó tres veces, luego se añadió IgG de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (BIOSOURCE) diluida a 1/4000 con el tampón diluyente a 100 μL/pocillo. Esto se incubó después a temperatura ambiente durante una hora. La placa se lavó cinco veces, luego se añadió un sustrato cromogénico (Sigma) a 100 μL/pocillo. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia a 405 nm (control: 655 nm) se midió usando el lector de microplacas Model 3550 (Bio-Rad Laboratories). Como resultado, como se muestra en la Fig. 8, el anticuerpo en el que la CDR se había modificado para alterar la carga superficial mostró una actividad de unión equivalente a la del anticuerpo antes de la modificación. Por lo tanto, se demostró que cuando se modificaba la carga superficial, los sitios de modificación podían estar no solo en el FR indicado en el Ejemplo 5, sino también en el CDR.

[Ejemplo 8] Preparación y evaluación de anticuerpos PF biespecíficos humanizados

Se preparó un anticuerpo biespecífico humanizado no modificado usando los anticuerpos no modificados (cadena H humanizada A69 hA69a y cadena B26 H humanizada hB26-F123e4) mostrados en la Tabla 1, así como la cadena L de BBA humanizada hAL-F123j4 (SEQ ID NO: 5). Se preparó un anticuerpo PF biespecífico humanizado usando los anticuerpos modificados (la forma modificada de la cadena H humanizada A69 hA69-PFL y la forma modificada de la cadena H B26 humanizada hB26-PF) mostrados en la Tabla 1, así como la cadena L humanizada BBA hAL-s8 (SEQ ID NO: 17). De acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1-2, los vectores de expresión de la cadena H se prepararon usando un vector de expresión que portaba la región constante de tipo natural, y los anticuerpos se prepararon por el método descrito en los Ejemplos 1-3, 1-4, y 1-5. Usando una solución de mezcla que contenía los dos tipos de homodímeros y el anticuerpo biespecífico, se llevó a cabo un análisis cromatográfico de intercambio catiónico de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 5.

Los resultados del análisis del anticuerpo biespecífico humanizado no modificado y el anticuerpo PF biespecífico humanizado se muestran en las Figs. 9 y 10. Con respecto al anticuerpo biespecífico humanizado no modificado, los resultados mostraron que los dos tipos de homodímeros y el anticuerpo biespecífico no se separaron, y se eluyeron como un único pico. Por el contrario, con respecto al anticuerpo PF biespecífico humanizado, cada uno de los dos tipos de homodímeros y el anticuerpo biespecífico deseado se separaron y se eluyeron como tres picos en el siguiente orden: homodímero hA69-PF, anticuerpo PF biespecífico humanizado y homodímero hB26-PF. Mediante el fraccionamiento de los tres tipos de picos en el análisis cromatográfico de intercambio catiónico, se purificaron los dos tipos de homodímeros y el anticuerpo PF biespecífico humanizado. Estas fracciones se concentraron utilizando Amicon Ultra, MWCO 10000 (Millipore), luego se dializaron durante la noche frente a acetato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0 mientras se enfriaban. Luego, las concentraciones fueron medidas.

Después de purificar cada anticuerpo, se realizó el enfoque isoeléctrico de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 4. Como se muestra en la Fig. 11, las tres bandas de anticuerpos estaban presentes antes del análisis cromatográfico de intercambio catiónico, y así se confirmó que cada uno de los anticuerpos se puede purificar por cromatografía de intercambio catiónico. Lo siguiente también fue confirmado. Los puntos isoeléctricos del homodímero de anticuerpo A69-PF humanizado, anticuerpo PF biespecífico humanizado, homodímero de anticuerpo B26-PF humanizado fueron aproximadamente 7,9, aproximadamente 8,6, y aproximadamente 9,2, respectivamente. La diferencia del punto isoeléctrico entre el homodímero de anticuerpo A69-PF humanizado y el anticuerpo PF biespecífico humanizado fue de aproximadamente 0,7, mientras que la diferencia del punto isoeléctrico entre el homodímero de anticuerpo B26-PF humanizado y el anticuerpo PF biespecífico humanizado fue de aproximadamente 0,6.

A continuación, se evaluó la actividad de coagulación del anticuerpo PF biespecífico purificado de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6. La actividad de coagulación se comparó con las de los tres tipos siguientes de anticuerpos expresados usando una región constante de IgG4 con la técnica de botón en hojal: el anticuerpo biespecífico quimérico mencionado anteriormente; el anticuerpo biespecífico compuesto por hA69a (SEQ ID NO: 2), hB26-F123e4 (SEQ ID NO: 4) y hAL-F123j4 (SEQ ID NO: 6) cuyas regiones variables no se modificaron; y el anticuerpo biespecífico que tiene las mismas regiones variables que las del anticuerpo PF biespecífico purificado. Los resultados de la evaluación se muestran en la Fig. 12. La actividad de coagulación del anticuerpo PF biespecífico que lleva una región constante de IgG4 preparada en base a la técnica de botón en hojal fue equivalente a la del anticuerpo PF biespecífico que lleva una región constante de tipo natural purificada por cromatografía de intercambio catiónico. Por lo tanto, se demostró que en el presente ejemplo, las modificaciones en H10, H12, H23, H39, H43 y H105 en la región variable permiten la purificación de anticuerpos biespecíficos a una alta pureza sin afectar sus actividades.

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