NL1027975C2 - Antilichamen tegen MAdCAM. - Google Patents

Antilichamen tegen MAdCAM. Download PDF

Info

Publication number
NL1027975C2
NL1027975C2 NL1027975A NL1027975A NL1027975C2 NL 1027975 C2 NL1027975 C2 NL 1027975C2 NL 1027975 A NL1027975 A NL 1027975A NL 1027975 A NL1027975 A NL 1027975A NL 1027975 C2 NL1027975 C2 NL 1027975C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
antibody
madcam
coco
mod
seq
Prior art date
Application number
NL1027975A
Other languages
English (en)
Other versions
NL1027975A1 (nl
Inventor
Sirid-Aimee Kellermann
Larry L Green
Mary Haak-Frendscho
Elizabeth Molloy
Nicolas Pullen
Original Assignee
Pfizer
Abgenix
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34794356&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NL1027975(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer, Abgenix filed Critical Pfizer
Publication of NL1027975A1 publication Critical patent/NL1027975A1/nl
Application granted granted Critical
Publication of NL1027975C2 publication Critical patent/NL1027975C2/nl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Description

Titel: Antilichamen tegen MAdCAM
ACHTERGROND VAN DE UITVINDING Mucosaal addressine celadhesie molecuul (MAdCAM) is een lid van de immunoglobuline superfamilie van celadhesie receptoren. De selectiviteit van lymfocyt aflevering aan gespecialiseerd lymfatisch 5 weefsel en mucosalé plaatsen van het maagdarmkanaal wordt door de endotheliale expressie van MAdCAM bepaald (Berlin, C. et al., Cell, 80: 413-422 (1994); Berlin, C. et al., Cell, 74: 185-195 (1993); en Erle, D.J. et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). MAdCAM wordt uniek tot expressie gebracht aan het celoppervlak van hoge endotheliale venulae 10 van georganiseerd lymfatisch weefsel in de darmen, zoals lapjes van Peyer en mesenterische lymfeknopen (Streeter et al., Nature, 331: 41-6 (1988); Nakache et al., Nature, 337:179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151: 97-110 (1997)), maar ook in andere lymfatische organen, zoals pancreas, galblaas en milt venulae en marginale sinus van het 15 witte merg van de milt (Briskin et al. (1997), supra; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).
Hoewel MAdCAM een fysiologische rol in de immuunbewaking van de darmen speelt, blijkt het een buitensporige lymfocyt extra-vasatie mogelijk te maken in ontstoken-darmziekte onder condities van 20 chronische ontsteking van het maagdarmkanaal. TNFa en andere pro-inflammatoire cytokines verhogen endotheliale MAdCAM expressie en in biopsiemonsters uit patiënten met de ziekte van Crohn en ulceratieve colitis is er op plaatsen van ontsteking een 2-3 voudige focale toename van MAdCAM expressie (Briskin et al. (1997), Souza et al., Gut, 45: 25 856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52: 367-74 (2002)). Soortgelijke patronen van verhoogde expressie zijn waargenomen in experimentele modellen van colitis (Hesterberg et al., Gastroenterology, 111: 1373- 1027975 2 1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997);
Connor et al., J Leukoc Biol., 65: 349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295: 183-9 (2000); Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26: 259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol 5 Gastrointest Liver Physiol., 281: G1309-15 (2001)). In andere preklinische modellen voor inflammatoire condities, zoals insuline-afhankelijke diabetes (Yang et al., Diabetes, 46: 1542-7 (1997); Hanninen et al., JImmunol., 160: 6018-25 (1998)), graft versus host ziekte (Fujisaki et al., Scand, J Gastroenterol., 38: 437-42 (2003), Murai 10 et al., Nat Immunol., 4: 154-60 (2003)), chronische leverziekte (Hillan et al., Liver, 19: 509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33: 1065-72 (2001)); inflammatoire encefalopathie (Stalder et al., Am J Pathol., 153: 767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol CellBiol., 78: 641-5 (2000)), en gastritis (Barrett et al., J Leukoc Biol., 67: 169-73 (2000); Hatanaka et 15 al., Clin Exp Immunol., 130: 183-9 (2002)) is er eveneens een opnieuw ontwaken van foetale MAdCAM expressie en deelname van geactiveerde α.4β7+ lymfocyten aan ziekte-pathogenese. In deze inflammatoire modellen, alsmede in hapteen-gemedieerde (bijv. TNBS, DSS, enz.) of adoptieve overdracht (CD4+CD45Rbh0°e) muizen colitische modellen 20 vermindert het ratten anti-muizen MAdCAM monoklonale antilichaam (mAb) MECA-367, dat de binding van α4β7+ lymfocyten aan MAdCAM blokkeert, de lymfocyt recrutering, weefselextravasatie, ontsteking en ernst van de ziekte. Muizen monoklonale antilichamen (mAbs) tegen menselijk MAdCAM zijn eveneens gerapporteerd (zie bijv. WO 96/24673 25 en WO 99/58573).
Gezien de rol van MAdCAM in ontstoken-darmziekte (IBD) en andere ontstekingsziekten geassocieerd met het maagdarmkanaal of andere weefsels, is een middel gewenst voor het remmen van θ4β7 binding en MAdCAM-gemedieerde leukocyt recrutering. Het zou verder 30 gewenst zijn over dergelijke therapeutische middelen met voordeüge eigenschappen te beschikken, waaronder, zonder beperking daartoe, de 1027975 3 afwezigheid van ongewenste interacties met andere medicaties in patiënten en gunstige fysisch-chemische eigenschappen, zoals pK/pD waarden in mensen, oplosbaarheid, stabiliteit, bewaartijd en in vivo halfwaardetijd. Een therapeutisch eiwit, zoals een antilichaam, zou bij 5 voorkeur vrij zijn van ongewenste post-translationele modificaties of aggregaatvorming. Er is derhalve een kritische behoefte aan therapeutische anti-MAdCAM antilichamen.
SAMENVATTING VAN DE UITVINDING 10 De onderhavige uitvinding verschaft een geïsoleerd antilichaam dat specifiek MAdCAM bindt, waarbij ten minste de CDR sequenties van genoemd antilichaam menselijke CDR sequenties zijn, of een antigeen-bindend deel van genoemd antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen is het antilichaam een menselijk antilichaam, bij 15 voorkeur een antilichaam dat als een MAdCAM antagonist werkt. Ook worden samenstellingen verschaft, die genoemde antilichamen of delen omvatten.
De uitvinding verschaft tevens een samenstelling die de zware en/of lichte keten van genoemd anti-MAdCAM antagonist antilichaam 20 of de variabele regio of ander antigeen-bindend gedeelte ervan, of nucleïnezuur moleculen die voor een van de voorgaande zaken coderen, alsmede een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Samenstellingen volgens de uitvinding kunnen verder een andere component omvatten, zoals een therapeutisch middel of een diagnostisch middel. 25 Diagnostische en therapeutische methoden worden eveneens door de uitvinding verschaft.
De uitvinding verschaft verder een geïsoleerde cellijn, die genoemd anti-MAdCAM antilichaam of antigeen-bindend deel ervan produceert.
T 027975 4
De uitvinding verschaft tevens nucleïnezuur moleculen die voor de zware en/of lichte keten van genoemd anti-MAdCAM antilichaam of de variabele regio ervan of het antigeen-bindend deel ervan coderen.
De uitvinding verschaft vectoren en gastheercellen die genoemde 5 nucleïnezuur moleculen omvatten, alsmede methoden voor recombinante productie van de polypeptiden die door de nucleïnezuur moleculen worden gecodeerd.
Niet-menselijke transgene dieren of planten, die de zware en/of lichte keten van genoemd anti-MAdCAM antilichaam, of antigeen-10 bindend deel ervan tot expressie brengen, worden eveneens verschaft.
BEKNOPTE FIGUURBESCHRIJVING
Figuur 1 is een uitlijning van de voorspelde aminozuursequenties van de variabele regio's van de zware en kappa lichte keten van twaalf 15 menselijke anti-MAdCAM monoklonale antilichamen met de kiemlijn aminozuursequenties van de corresponderende menselijke genen.
Figuur IA toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichamen 1.7.2 en 1.8.2 met het kiemlijn menselijke VH 3-15 genproduct.
20 Figuur 1B toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur- sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.14.2 met het kiemlijn menselijke VH 3-23 genproduct.
Figuur IC toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.22.2 met het kiemlijn 25 menselijke VH 3-33 genproduct.
Figuur 1D toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.34.2 met het kiemlijn menselijke VH 3-30 genproduct.
Figuur IE toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-30 sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.67.1 met het kiemlijn menselijke VH 4-4 genproduct.
1 02 79 75 5
Figuur 1F toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.73.2 met het kiemlijn menselijke VH 3-23 genproduct.
Figuur 1G toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-5 sequentie van de zware keten voor antilichaam 6.77.1 met het kiemlijn menselijke VH 3-21 genproduct.
Figuur 1H toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichamen 7.16.6 en 7.26.4 met het kiemlijn menselijke VH 1-18 genproduct.
10 Figuur II toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur- sequentie van de zware keten voor antilichaam 7.20.5 met het kiemlijn menselijke VH 4-4 genproduct.
Figuur IJ toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de zware keten voor antilichaam 9.8.2 met het kiemlijn 15 menselijke VH 3-33 genproduct.
Figuur IK toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichamen 1.7.2 en 1.8.2 met het kiemlijn menselijke A3 genproduct.
Figuur 1L toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur- 20 sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.14.2 met het kiemlijn menselijke 012 genproduct.
Figuur 1M toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.22.2 met het kiemlijn menselijke A26 genproduct.
25 Figuur IN toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur- sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.34.2 met het kiemlijn menselijke 012 genproduct.
Figuur 10 toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.67.1 met het 30 kiemlijn menselijke B3 genproduct.
1027975 --- 6
Figuur 1P toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.73.2 met het kiemlijn menselijke 012 genproduct.
Figuur IQ toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-5 sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 6.77.1 met het kiemlijn menselijke A2 genproduct.
Figuur IR toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichamen 7.16.6 en 7.26.4 met het kiemlijn menselijke A2 genproduct.
10 Figuur IS toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur- sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 7.20.5 met het kiemlijn menselijke A3 genproduct.
Figuur 1T toont een uitlijning van de voorspelde aminozuur-sequentie van de kappa lichte keten voor antilichaam 9.8.2 met het 15 kiemlijn menselijke 018 genproduct.
Figuur 2 zijn CLUSTAL uitlijningen van de voorspelde amino-zuursequenties van de zware en kappa lichte keten van menselijke anti-MAdCAM antilichamen.
Figuur 2A is een CLUSTAL uitlijning en radiale boom van de 20 voorspelde kappa lichte keten aminozuursequenties, die de mate van gelijkenis tussen de anti-MAdCAM antilichaam kappa lichte ketens toont.
Figuur 2B is een CLUSTAL uitlijning en radiale boom van de voorspelde zware keten aminozuursequenties, die de mate van 25 gelijkenis tussen de anti-MAdCAM antilichaam zware ketens toont.
Figuur 3 is een aminozuursequentie CLUSTAL uitlijning van de 2 N-terminale domeinen van cynomolgus (= Java-aap of monjet) en menselijk MAdCAM die het oi4p7 bindingsdomein vormen. De β strengen zijn uitgelijnd volgens Tan et al., Structure (1998) 6: 793-801. 30 Figuur 4 is een grafiek die de effecten van de dosis van gezuiverd gebiotinyleerd 1.7.2 en 7.16.6 op de adhesie van menselijke periferaal- 1 0279 75 7 bloed lymfocyten aan secties van MAdCAM tot expressie brengend ingevroren endotheel van menselijke lever weergeeft.
Figuur 5 toont een twee-dimensionale grafische weergave op basis van de in Tabel 7 bijeengebrachte gegevens over de diversiteit van 5 MAdCAM epitopen waaraan de anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2 binden. Anti-MAdCAM antilichamen in dezelfde cirkel vertonen hetzelfde patroon van reactiviteit, horen in dezelfde epitopen mand en herkennen waarschijnlijk dezelfde epitoop op MAdCAM. Anti-MAdCAM 10 antilichaam kloons in overlappende cirkels kunnen niet tegelijk binden en herkennen daarom waarschijnlijk een overlappende epitoop op MAdCAM. Niet-integrerende cirkels vertegenwoordigen anti-MAdCAM antilichaam kloons met duidelijke ruimtelijke epitoopscheiding.
Figuur 6 toont sandwich ELISA gegevens met anti-MAdCAM 15 antilichamen 1.7.2 en een Alexa 488-gelabeld 7.16.6, die laten zien dat twee antilichamen die verschillende epitopen op MAdCAM kunnen detecteren, voor de detectie van oplosbaar MAdCAM voor diagnostische doeleinden gebruikt konden worden.
Figuur 7 toont het effect van een remmend anti-MAdCAM 20 antilichaam (1 mg/kg) op het aantal van circulerende periferale <Χ4β7+ lymfocyten, uitgedrukt als een zoveelvoudige toename over controle IgG2a mAb of vehiculum, waarbij anti-MAdCAM mAb 7.16.6 wordt gebruikt in een cynomolgus aap model.
25 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING
Definities en Algemene Technieken Tenzij hierin anders gedefinieerd, zullen in verband met de onderhavige uitvinding gebruikte wetenschappelijke en technische termen de betekenis hebben die algemeen door de vakman daaraan 30 wordt gegeven. Verder zullen, tenzij de context iets anders vereist, termen in het enkelvoud meervouden omvatten en zullen termen in het 1027975 8 meervoud het enkelvoud omvatten. In het algemeen zullen benamingen die gebruikt worden in verband met, en technieken van, cel* en weefselkweek, moleculaire biologie, immunologie, microbiologie, genetica, eiwit- en nucleïnezuurchemie en hybridisatie die hierin worden be-5 schreven, degene zijn die op zichzelf bekend zijn en algemeen gebruikt worden. De methoden en technieken van de onderhavige uitvinding worden in het algemeen uitgevoerd volgens op zichzelf bekende conventionele methoden zoals beschreven in verschillende algemene en meer specifieke referenties die door de gehele huidige beschrijving 10 worden geciteerd en besproken, tenzij anders is aangegeven. Zie bijv. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), en Harlow en Lane, Antibodies: A 15 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), die door verwijzing hierin worden opgenomen. Enzymatische reacties en zuiveringstechnieken worden uitgevoerd conform aanwijzingen van de fabrikant, zoals ze gewoonlijk in dit vakgebied worden uitgevoerd, of zoals hierin beschreven. Standaard 20 technieken worden gebruikt voor chemische syntheses, chemische analyses, farmaceutische bereiding, formulering en afgifte, en behandeling van patiënten.
De volgende termen zullen, tenzij anders is aangegeven, geacht worden de volgende betekenissen te hebben: 25 De term "polypeptide" omvat natieve of artificiële eiwitten, eiwitfragmenten en polypeptide-analoga van een eiwitsequentie. Een polypeptide kan monomerisch of polymerisch zijn.
De term "geïsoleerd eiwit" of "geïsoleerd polypeptide" is een eiwit of polypeptide dat dankzij zijn oorsprong, of de bron waarvan het is 30 afgeleid, (1) niet is geassocieerd met van nature geassocieerde componenten, die het in zijn natieve toestand vergezellen, (2) vrij is van 1027975 9 andere eiwitten uit dezelfde species, (3) tot expressie wordt gebracht door een cel uit een andere species, of (4) niet in de natuur voorkomt. Derhalve zal een polypeptide, dat chemisch wordt gesynthetiseerd of wordt gesynthetiseerd in een celsysteem dat verschilt van de cel waarin 5 het van nature zijn oorsprong vindt, van zijn van nature geassocieerde componenten zijn "geïsoleerd". Een eiwit kan ook in hoofdzaak vrij van natuurlijk geassocieerde componenten worden gemaakt door isolatie, waarbij op zichzelf bekende technieken van eiwitzuivering worden toegepast.
10 Een eiwit of polypeptide is "in hoofdzaak zuiver", "in hoofdzaak homogeen" of "in hoofdzaak gezuiverd" wanneer ten minste ongeveer 60 tot 75% van een monster één enkele polypeptide species vertoont. Het polypeptide of eiwit kan monomerisch of multimerisch zijn. Een in hoofdzaak zuiver polypeptide of eiwit zal typisch ongeveer 50%, 60%, 15 70%, 80% of 90% W/W van een eiwitmonster omvatten, meer gewoonlijk ongeveer 95%, en zal bij voorkeur meer dan 99% zuiver zijn. Zuiverheid of homogeniteit van eiwit kan door een aantal van op zichzelf bekende middelen worden aangegeven, zoals polyacrylamide gelelektroforese van een eiwitmonster, gevolgd door visualisatie van een enkele 20 polypeptideband na kleuring van de gel met een op zichzelf bekende kleurstof. Voor bepaalde doeleinden kan een hogere resolutie worden verkregen door HPLC of andere op zichzelf bekende middelen voor zuivering te gebruiken.
De term "polypeptidefragment" zoals hierin gebruikt, duidt op 25 een polypeptide met een amino-terminale en/of carboxy-terminale deletie, maar waarin de resterende aminozuursequentie identiek is aan de corresponderende posities in de natuurlijk voorkomende sequentie.
In sommige uitvoeringsvormen zijn fragmenten ten minste 5, 6, 8 of 10 aminozuren lang. In andere uitvoeringsvormen zijn de fragmenten ten 30 minste 14 aminozuren lang, liever ten minste 20 aminozuren lang, 1027975 10 gewoonlijk ten minste 50 aminozuren lang, nog liever ten minste 70, 80, 90, 100, 150 of 200 aminozuren lang.
De term "polypeptide analogon" zoals hierin gebruikt, duidt op een polypeptide dat een segment van ten minste 25 aminozuren omvat, 5 dat in hoofdzaak identiek is aan een deel van een aminozuursequentie en ten minste een van de volgende eigenschappen bezit: (1) specifieke binding aan MAdCAM onder geschikte condities voor binding, (2) het vermogen om cufii integrine en/of L-selectine binding aan MAdCAM te remmen, of (3) het vermogen om MAdCAM expressie aan het cel-10 oppervlak in vitro of in vivo te reduceren. Polypeptide analoga omvatten typisch een conservatieve aminozuur substitutie (of insertie of deletie) ten opzichte van de in de natuur voorkomende sequentie. Analoga zijn typisch ten minste 20 aminozuren lang, bij voorkeur ten minste 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 of 200 aminozuren lang of langer, en kunnen vaak 15 net zo lang zijn als een in de natuur voorkomend polypeptide van volle lengte.
Aminozuur substituties die voorkeur hebben, zijn degene die: (1) ontvankelijkheid voor proteolyse verminderen, (2) ontvankelijkheid voor oxidatie verminderen, (3) bindingsaffiniteit voor de vorming van eiwit-20 complexen wijzigen, (4) bindingsaffiniteiten wijzigen, of (5) andere fysisch-chemische of functionele eigenschappen van dergelijke analoga verlenen of modificeren. Analoga kunnen verscheidene muteïnes van een sequentie, anders dan de in de natuur voorkomende peptide sequentie omvatten, bijv. kunnen enkelvoudige of meerdere aminozuur 25 substituties (bij voorkeur conservatieve aminozuur substituties) worden uitgevoerd in de van nature voorkomende sequentie (bij voorkeur in het deel van het polypeptide gelegen buiten het (de) intermoleculaire contacten vormende domein(en)). Een conservatieve aminozuur substitutie zou de structurele karakteristieken van de moedersequentie 30 niet substantieel moeten veranderen (bijv. een vervangend aminozuur zou niet de neiging moeten hebben om een helix die in de moeder- 1027975 11 sequentie voorkomt te verbreken, of om andere typen van secundaire structuur die de moedersequentie karakteriseren te verstoren). Voorbeelden van in het vakgebied erkende secundaire en tertiaire structuren van polypeptiden worden beschreven in Proteins, Structures 5 and Molecular Principles (Creighton, ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introductie to Protein Structure (C. Branden en J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); en Thornton et al., Nature, 354: 105 (1991), die elk hierin door verwijzing worden opgenomen.
10 Non-peptide analoga worden in de farmaceutische industrie algemeen gebruikt als geneesmiddelen met eigenschappen analoog aan die van het als voorbeeld dienende peptide. Deze typen van non-peptide verbindingen worden "peptide mimetica" of "peptidomimetica" genoemd. Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15: 29 (1986); Veber en Freidinger, TINS, 15 p. 392 (1985); en Evans et al., J. Med. Chem., 30: 1229 (1987), die hierin door verwijzing worden opgenomen. Dergelijke verbindingen worden vaak met behulp van gecomputeriseerde moleculaire modellering ontwikkeld. Peptide mimetica met structurele gelijkenis ten opzichte van therapeutisch bruikbare peptiden kunnen worden gebruikt om een 20 equivalent therapeutisch of profylactisch effect te produceren. In het algemeen hebben peptidomimetica structurele gelijkenis met een model polypeptide (d.w.z. een polypeptide dat een gewenste biochemische eigenschap of farmacologische activiteit heeft), zoals een menselijk antilichaam, maar zijn daarin door op zichzelf bekende methoden een of 25 meer peptide koppelingen optioneel vervangen door een koppeling, zoals: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis en trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, en -CH2SO-. Systematische substitutie van een of meer aminozuren van een consensus sequentie door een D-aminozuur van hetzelfde type (bijv. D-lysine in plaats van L-lysine) kan ook worden 30 benut om stabielere peptiden te genereren. Bovendien kunnen door op zich bekende methoden peptiden met een beperking worden 1027975 12 gegenereerd, die een variatie van een consensus sequentie of een in hoofdzaak identieke consensus sequentie omvatten (Rizo en Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), hierin opgenomen door verwijzing); bijv. door interne cysteïne residuen toe te voegen die in staat zijn 5 intramoleculaire disulfidebruggen te vormen, die het peptide cycliseren.
Een "immunoglobuline" is een tetramerisch molecuul. In een natuurlijk voorkomend immunoglobuline is elk tetrameer samengesteld uit twee identieke paren van polypeptide ketens, waarbij elk paar één "lichte" (ongeveer 25 kDa) en één "zware" keten (ongeveer 50-70 kDa) 10 heeft. Het amino-terminale deel van elke keten omvat een variabele regio van ongeveer 100 tot 110 of meer aminozuren, die primair verantwoordelijk is voor herkenning van het antigeen. Het carboxy-terminale deel van elke keten definieert een constante regio, die primair verantwoordelijk is voor de effector functie. Menselijke lichte 15 ketens zijn geklassificeerd als κ en λ lichte ketens. Zware ketens zijn geklassificeerd als μ, δ, γ, α, of ε, en definiëren het isotype van het antilichaam als resp. IgM, IgD, IgG, IgA en IgE. In lichte en zware ketens zijn de variabele en constante regio's met elkaar verbonden door een " J" regio van ongeveer 12 of meer aminozuren, waarbij de zware 20 keten tevens een "D" regio omvat van ongeveer 10 of meer aminozuren. Zie algemeen Fundamental Immunology, Hoofdstuk 7 (Paul, W., ed., 2e ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (voor alle doeleinden in zijn geheel opgenomen door verwijzing). De variabele regio’s van elk lichte/zware keten paar vormen de bindingsplaats van het antilichaam, zodat een 25 intact immunoglobuline twee bindingsplaatsen heeft.
Immunoglobuline ketens vertonen dezelfde algemene structuur van relatief geconserveerde raamwerk (framework) regio's (FR), met elkaar verbonden door drie hypervariabele regio's, die ook wel complementariteit bepalende regio's of CDRs worden genoemd. De 30 CDRs van de twee ketens van elk paar worden door de raamwerk regio's zo uitgelijnd dat ze een epitoop-specifieke bindingsplaats 1027975 13 vormen. Vanaf de N-terminus tot de C*terminus omvatten zowel de lichte als de zware keten de domeinen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 en FR4. De toekenning van aminozuren aan elk domein geschiedt volgens de definities van Kabat, Sequences of Proteins of Immunological 5 Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 en 1991)), of Chothia & Lesk, J. Mol. BioL, 196: 901-917 (1987); Chotia et al., Nature, 342: 878-883 (1989), die hierin elk in hun geheel worden opgenomen door verwijzing.
Een "antilichaam" duidt op een intact immunoglobuline of op een 10 antigeen-bindend deel ervan, dat met het intacte antilichaam competitie aangaat voor specifieke binding. In sommige uitvoeringsvormen is een antilichaam een antigeen-bindend deel ervan. Antigeen-bindende delen kunnen worden geproduceerd door recombinant DNA technieken of door enzymatische of chemische klieving van intacte antilichamen.
15 Antigeen-bindende delen omvatten onder andere Fab, Fab, F(ab)2, Fv, dAb, en complementariteit bepalende regio (CDR) fragmenten, antilichamen uit één enkele keten (scFv), chimaere antilichamen, diabodies en polypeptiden die ten minste een deel van een immunoglobuline bevatten dat voldoende is om aan het polypeptide specifieke antigeen 20 binding te verlenen. Een Fab fragment is een monovalent fragment bestaande uit de VL, VH, CL en CH1 domeinen; een F(ab)2 fragment is een bivalent fragment dat twee Fab fragmenten omvat, die bij de scharnier-regio met elkaar verbonden zijn door een disulfidebrug; een Fd fragment bestaat uit de VH en CH1 domeinen; een Fv fragment 25 bestaat uit de VL en VH domeinen van één enkele arm van een antilichaam; en een dAb fragment (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)) bestaat uit een VH domein.
Zoals hierin gebruikt, is een antilichaam waarnaar verwezen wordt als bijv. 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 30 7.26.4 of 9.8.2, een monoklonaal antilichaam dat is geproduceerd door de hybridoma met dezelfde naam. bijv. wordt antilichaam 1.7.2 door 1027975 14 hybridoma 1.7.2 geproduceerd. Een antilichaam dat wordt aangeduid als 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-xnod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod is een monoklonaal antilichaam waarvan de sequentie is gemodificeerd vanuit zijn overeenkomstige ouder door plaatsgerichte mutagenese.
5 Een antilichaam uit één enkele keten (scFv) is een antilichaam
waarin VL en VH regio’s zijn gepaard om een monovalent molecuul te vormen via een synthetische linker die mogelijk maakt dat ze worden gemaakt als een enkele eiwit keten (Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988) en Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 10 (1988)). Diabodies zijn bivalente, bispecifieke antilichamen waarin VH
en VL domeinen tot expressie zijn gebracht op een enkele polypeptide keten, maar onder gebruikmaking van een linker die te kort is om paarvorming tussen de twee domeinen op dezelfde keten mogelijk te maken, waardoor de domeinen worden gedwongen om te paren met 15 complementaire domeinen van een andere keten en twee antigeen bindingsplaatsen worden gecreëerd (zie bijv. Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) en Poljak, R. J., et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Eén of meer CDRs uit een antilichaam van de uitvinding kunnen hetzij op covalente wijze hetzij niet-covalente 20 wijze in een molecuul worden geïncorporeerd, teneinde er een immuno-adhesine van te maken dat specifiek bindt aan MAdCAM. Een immuno-adhesine kan de CDR(s) als deel van een grotere polypeptide keten opnemen, kan de CDR(s) op covalente wijze koppelen aan een andere polypeptide keten, of kan de CDR(s) op niet-covalente wijze opnemen.
25 De CDRs maken mogelijk dat het immunoadhesine specifiek bindt aan een bepaald antigeen waarnaar de belangstelling uitgaat.
Een antilichaam kan één of meer bindingsplaatsen hebben. Als er meer dan één bindingsplaats is, kunnen de bindingsplaatsen identiek zijn aan elkaar of kunnen verschillend zijn. bijv. heeft een in de natuur 30 voorkomend immunoglobuline twee identieke bindingsplaatsen, een antilichaam uit één enkele keten of Fab fragment heeft één bindings- 1027975 15 plaats, hoewel een "bispecifiek" of "bifunctioneel" antilichaam (diabody) heeft twee verschillende bindingsplaatsen.
Een "geïsoleerd antilichaam" is een antilichaam dat (1) niet is geassocieerd met van nature geassocieerde componenten, inclusief 5 andere natuurlijk geassocieerde antilichamen, die het in zijn natieve toestand vergezellen, (2) vrij is van andere eiwitten uit dezelfde species, (3) tot expressie is gebracht door een cel uit een verschillende species, of (4) niet in de natuur voorkomt. Voorbeelden van geïsoleerde antilichamen omvatten een anti-MAdCAM antilichaam dat affiniteit-gezuiverd 10 is onder gebruikmaking van MAdCAM, een anti-MAdCAM antilichaam dat is geproduceerd door een hybridoma of andere cellijn in vitro, en een menselijk anti-MAdCAM antilichaam afkomstig van een transgeen zoogdier of plant.
Zoals hierin gebruikt duidt de term "menselijk antilichaam" op 15 een antilichaam waarin de sequenties van de variabele en constante regio menselijke sequenties zijn. De term omvat antilichamen met sequenties afgeleid van menselijke genen, maar die zijn veranderd, bijv. om mogelijke immunogeniciteit te verlagen, affiniteit te verhogen, cysteïnes of glycosyleringsplaatsen te elimineren die ongewenste 20 vouwing zouden kunnen veroorzaken, etc. De term omvat antilichamen die op recombinante wijze zijn geproduceerd in niet-menselijke cellen die een glycosylering zouden kunnen verlenen die niet typisch is voor menselijke cellen. De term omvat ook antilichamen die zijn opgewekt in een transgene muis die sommige of alle loei van de zware en lichte 25 keten van menselijke immunoglobulines bevat.
In één aspect verschaft de uitvinding een gehumaniseerd antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen is het gehumaniseerde antilichaam een antilichaam afkomstig uit een niet-menselijke species, waarin bepaalde aminozuren in de raamwerk en constante domeinen 30 van de zware en lichte ketens zijn gemuteerd om een immuunrespons in mensen te vermijden of af te schaffen. In sommige uitvoeringsvormen 1027975 16 kan een gehumaniseerd antilichaam worden geproduceerd door de constante domeinen uit een menselijk antilichaam te fuseren met de variabele domeinen van een niet-menselijke species. Voorbeelden van de bereiding van gehumaniseerde antilichamen kunnen worden 5 gevonden in U.S. octrooi nrs. 6,054,297, 5,886,152 en 5,877,293. In sommige uitvoeringsvormen omvat een gehumaniseerd anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding de aminozuursequentie van één of meer raamwerk regio's van één of meer menselijke anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding.
10 In een ander aspect omvat de uitvinding een "chimaer antilichaam". In sommige uitvoeringsvormen verwijst het chimaere antilichaam naar een antilichaam dat één of meer regio's uit één antilichaam en één of meer regio's uit één of meer andere antilichamen omvat. In een geprefereerde uitvoeringsvorm zijn één of meer van de 15 CDRs afkomstig uit een menselijk anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm zijn alle CDRs afkomstig uit een menselijk anti-MAdCAM antilichaam volgens de uitvinding. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm zijn de CDRs uit meer dan één menselijk anti-MAdCAM antilichaam volgens de 20 uitvinding in een chimaer antilichaam gemengd en op elkaar afgestemd, bijv. kan een chimaer antilichaam een CDR1 uit de lichte keten van een eerste menselijk anti-MAdCAM antilichaam omvatten en gecombineerd zijn met CDR2 en CDR3 uit de lichte keten van een tweede menselijk anti-MAdCAM antilichaam, en de CDRs uit de zware 25 keten kunnen afkomstig zijn van een derde anti-MAdCAM antilichaam. Verder kunnen de raamwerk regio's uit één van dezelfde anti-MAdCAM antilichamen, uit één of meer andere antilichamen, zoals een menselijk antilichaam, of uit een gehumaniseerd antilichaam afkomstig zijn.
Een "neutraliserend antilichaam", een "remmend antilichaam" of 30 antagonist antilichaam is een antilichaam dat de binding van α$η of α.4β7 tot expressie brengende cellen, of willekeurig welk ander verwant 1027975 17 ligand of verwant ligand tot expressie brengende cellen aan MAdCAM met ten minste ongeveer 20% remt. In een voorkeursuitvoeringsvorm reduceert/remt het antilichaam de binding van ci4p7 of 0C4p7 tot expressie brengende cellen aan MAdCAM met ten minste 40%, meer bij voorkeur 5 met 60%, met nog meer voorkeur met 80%, 85%, 90%, 95% of 100%. De vermindering van binding kan op elke aan de vakman bekende wijze worden gemeten, bijv. zoals gemeten in een in vitro competitieve binding assay. Een voorbeeld van het meten van de vermindering van binding van cuP? tot expressie brengende cellen aan MAdCAM wordt in 10 Voorbeeld I gegeven.
Fragmenten of analoga van antilichamen kunnen gemakkelijk door de vakman worden bereid volgens de aanwijzingen in deze beschrijving. Geprefereerde amino- en carboxy-termini van fragmenten of analoga zijn aanwezig in de nabijheid van grenzen van functionele 15 domeinen. Structurele en functionele domeinen kunnen worden geïdentificeerd door vergelijking van de nucleotide en/of aminozuursequentie data met publieke of eigen sequentie databases.
Bij voorkeur worden gecomputeriseerde vergelijkingsmethoden gebruikt voor het identificeren van sequentie motieven of voorspelde 20 eiwit conformatie domeinen die aanwezig zijn in andere eiwitten van bekende structuur en/of functie. Methoden om eiwit sequenties te identificeren die tot een bekende drie-dimensionale structuur vouwen, zijn bekend (Bowie et al., Science, 253: 164 (1991)).
De term "oppervlak plasmon resonantie" zoals hierin gebruikt 25 duidt op een optisch fenomeen dat de analyse van echte-tijd biospecifieke interacties mogelijk maakt door detectie van wijzigingen in eiwit concentraties in een biosensor matrix, bijv. met gebruikmaking van het BIAcore systeem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Zweden en Piscataway, N.J.). Voor verdere beschrijvingen, zie Jonsson, U., et 30 al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Biotechniques, 1027975 18 11: 620-627 (1991); Johnsson, B., et al., J. Mol. Recognit., 8:125-131 (1995); en Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).
De term "k0ff" duidt op de off snelheidsconstante voor dissociatie van een antilichaam uit het antilichaam/antigeen complex.
5 De term "Kd" duidt op de dissociatieconstante van een bepaalde antilichaam-antigeen interactie. Men zegt dat een antilichaam aan een antigeen bindt wanneer de dissociatieconstante is < 1 μΜ, bij voorkeur < 100 nM en met de meeste voorkeur < 10 nM.
De term "epitoop" omvat elke eiwit determinant die in staat is 10 specifiek te binden aan een immunoglobuline of T-cel receptor of anderszins interactie met een molecuul te hebben. Determinanten van een epitoop bestaan gewoonlijk uit chemisch actieve groepen aan het oppervlak van moleculen zoals aminozuren of koolhydraat zijketens en hebben gewoonlijk specifieke drie-dimensionale structurele karakteris-15 tieken, evenals specifieke ladingskarakteristieken. Een epitoop kan "lineair" of "conformationeel" zijn. In een lineaire epitoop zijn alle punten van interactie tussen het eiwit en het molecuul dat daarmee interactie heeft (zoals een antilichaam) lineair langs de primaire aminozuursequentie van het eiwit aanwezig. In een conformationele 20 epitoop zijn de punten van interactie over aminozuur residuen op het eiwit aanwezig, die van elkaar gescheiden zijn.
Zoals hierin gebruikt volgen de twintig conventionele aminozuren en hun afkortingen de conventionele gebruiken. Zie Immunology - A Synthesis (2e editie, E.S. Golub en D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, 25 Sunderland, Mass. (1991)), die hierin wordt opgenomen door verwijzing. Stereoisomeren (bijv. D-aminozuren) van de twintig conventionele aminozuren, onnatuurlijke aminozuren zoals α-,α-di-gesubstitueerde aminozuren, N-alkyl aminozuren, melkzuur, en andere onconventionele aminozuren kunnen ook geschikte componenten zijn voor polypeptiden 30 van de onderhavige uitvinding. Voorbeelden van onconventionele aminozuren omvatten: 4-hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, ε-Ν,Ν,Ν- 1027975 19 trimethyllysine, ε-Ν-acetyllysine, O-fosfoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, s-N-methyl-arginine, en andere soortgelijke aminozuren en iminozuren (bijv. 4- j hydroxyproline). In de hierin gebruikte polypeptide notatie is de 5 richting naar links de amino -terminale richting en de richting naar rechts de carboxy-terminale richting, volgens standaard gebruik en conventie.
De term "polynucleotide" zoals hierin aangeduid, betekent een polymere vorm van nucleotiden van ten minste 10 basen in lengte, 10 hetzij ribonucleotiden hetzij deoxynucleotiden of een gemodificeerde vorm van een van deze typen van nucleotiden. De term omvat enkel- en dubbelstrengs vormen van DNA.
De term "geïsoleerd polynucleotide" zoals hierin gebruikt, zal een polynucleotide van genomisch, cDNA, of synthetische oorsprong of een 15 of andere combinatie ervan aanduiden, waarbij dankzij zijn oorsprong het "geïsoleerde polynucleotide" (1) niet is geassocieerd met het geheel of een deel van een polynucleotide waarin het "geïsoleerde polynucleotide" in de natuur wordt aangetroffen, (2) werkzaam verbonden is met een polynucleotide waarmee het niet verbonden is in de natuur, of (3) 20 niet in de natuur voorkomt als deel van een grotere sequentie.
De term "oligonucleotide" waarnaar hierin verwezen wordt, omvat in de natuur voorkomende en gemodificeerde nucleotiden die met elkaar zijn verbonden door in de natuur voorkomende, en niet in de natuur voorkomende oligonucleotide koppelingen. Oligonucleotiden 25 vormen een subset van polynucleotiden die in het algemeen een lengte van 200 basen of minder omvatten. Bij voorkeur zijn oligonucleotiden 10 tot 60 basen lang en liefst 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, of 20 tot 40 basen lang. Oligonucleotiden zijn gewoonlijk enkelstrengs, bijv. voor probes; hoewel oligonucleotiden dubbelstrengs kunnen zijn, bijv. voor 30 gebruik in de constructie van een gen mutant. Oligonucleotiden van de uitvinding kunnen sense of antisense oligonucleotiden zijn.
1027975 20
De term "in de natuur voorkomende nucleotiden" waarnaar hierin wordt verwezen, omvat deoxyribonucleotiden en ribonucleotiden. De term "gemodificeerde nucleotiden" waarnaar hierin wordt verwezen, omvat nucleotiden met gemodificeerde of gesubstitueerde suiker 5 groepen en dergelijke. De term "oligonucleotide koppelingen" waarnaar hierin wordt verwezen, omvat oligonucleotide koppelingen, zoals fosforothioaat, fosforodithioaat, fosforoselenoaat, fosforodiselenoaat, fosforoanilothioaat, fosforaniladaat, fosforoamidaat, en dergebjke. Zie bijv. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stee et al., J.
10 Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res., 16: 3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stee et al., U.S. octrooi nr. 5,151,510; Uhlmann en Peyman, Chemische 15 Reviews, 90: 543 (1990), waarvan de inhoud hierin wordt opgenomen door verwijzing. Een oligonucleotide kan desgewenst een label voor detectie omvatten.
"Werkzaam verbonden" sequenties omvatten zowel expressie controle sequenties die aaneengesloten zijn met het gen van interesse 20 en expressie controle sequenties die in trans of op een afstand werken om het gen van interesse te reguleren. De term "expressie controle sequentie" zoals hierin gebruikt duidt op polynucleotide sequenties die nodig zijn om de expressie en bewerking van coderende sequenties waarmee ze geligeerd zijn, te bewerkstelligen. Expressie controle 25 sequenties omvatten geschikte transcriptie initiatie, terminatie, promoter en enhancer sequenties; efficiënte RNA verwerkingssignalen zoals splicing en polyadenylatie signalen; sequenties die cytoplasmisch mRNA stabiliseren; sequenties die translatie efficiëntie verhogen (d.w.z., Kozak consensus sequentie); sequenties die eiwit stabiliteit 30 verhogen; en indien gewenst sequenties die eiwit secretie verhogen. De aard van zulke controle sequenties verschilt, afhankelijk van het 1027975 21 gastheerorganisme; in prokaryoten omvatten zulke controle sequenties in het algemeen promoter, ribosomale bindingsplaats, en transcriptie terminatie sequentie; in eukaryoten omvatten zulke controle sequenties in het algemeen promoters en transcriptie terminatie sequentie. De 5 term "controle sequenties" bedoelt ten minste alle componenten te omvatten waarvan de aanwezigheid essentieel is voor expressie en bewerking, en kan ook extra componenten omvatten, waarvan de aanwezigheid voordelen biedt, bijv., leader sequenties en fusie partner sequenties.
10 De term "vector", zoals hierin gebruikt bedoelt te verwijzen naar een nucleïnezuur molecuul dat in staat is om een ander nucleïnezuur waarmee het is verbonden, te transporteren. Eén type van vector is een "plasmide", wat duidt op een circulaire dubbelstrengs DNA lus waarin i extra DNA segmenten geligeerd kunnen zijn. Een ander type van vector 15 is een virale vector, waarbij extra DNA segmenten in het virale genoom geligeerd kunnen zijn. Bepaalde vectoren zijn in staat tot autonome replicatie in een gastheercel waarin ze zijn geïntroduceerd (bijv. bacteriële vectoren met een bacteriële oorsprong van replicatie en episomale zoogdierlijke vectoren). Andere vectoren (bijv. niet-episomale 20 zoogdierlijke vectoren) kunnen in het genoom van een gastheercel worden geïntegreerd na introductie in de gastheercel, en daardoor samen met het gastheergenoom worden gerepliceerd. Bovendien zijn bepaalde vectoren in staat om de expressie van genen waarmee ze werkzaam verbonden zijn, te sturen. Zulke vectoren worden hierin 25 aangeduid als "recombinante expressievectoren" (of eenvoudigweg "expressievectoren"). In het algemeen zijn expressievectoren die bruikbaar zijn in recombinant DNA technieken vaak in de vorm van plasmiden. In de onderhavige beschrijving kunnen "plasmide" en "vector" uitwisselbaar worden gebruikt omdat het plasmide de meestal 30 gebruikte vorm van vector is. Echter bedoelt de uitvinding zulke andere vormen van expressievectoren te omvatten, zoals virale vectoren (bijv.
1 027975 22 replicatie defectieve retrovirussen, adenovirussen en adeno-geassocieerde virussen), die equivalente functies dienen.
De term "recombinante gastheercel" (of eenvoudigweg "gastheercel"), zoals hierin gebruikt bedoelt te verwijzen naar een cel 5 waarin een recombinante expressievector is geïntroduceerd. Het moet duidelijk zijn dat dergelijke termen bedoeld zijn om niet alleen te verwijzen naar de bepaalde cel in kwestie maar ook naar de nakomelingen van zo’n cel. Omdat zich bepaalde modificaties kunnen voordoen in opvolgende generaties als gevolg van hetzij mutatie hetzij 10 invloeden van de omgeving, kan het zijn dat zulke nakomelingen in feite niet identiek zijn aan de moedercel, maar ze vallen nog onder de omvang van de term "gastheercel" zoals hierin gebruikt. i
De term "selectief hybridiseren" waarnaar hierin wordt verwezen, betekent detecteerbaar en specifiek binden. Polynucleotiden, oligo-15 nucleotiden en fragmenten ervan volgens de uitvinding hybridiseren selectief met nucleïnezuur strengen onder hybridisatie en was condities die merkbare hoeveelheden van detecteerbare binding aan niet-specifieke nucleïnezuren tot een minimum beperken. "Hoge stringentie" of "hoogstringente" condities kunnen worden gebruikt om 20 selectieve hybridisatie condities te realiseren, zoals op zichzelf bekend en hierin besproken. Een voorbeeld van "hoge stringentie" of "hoogstringente" condities is een methode van incuberen van een polynucleo-tide met een ander polynucleotide, waarbij één polynucleotide aan een vast oppervlak zoals een membraan bevestigd kan zijn, in een hybridi-25 satiebuffer van 6X SSPE of SSC, 50% formamide, 5X Denhardt’s reagens, 0.5% SDS, 100 pg/ml gedenatureerd, gefragmenteerd zalm-sperma DNA bij een hybridisatie temperatuur van 42°C voor 12-16 uur, gevolgd door twee maal wassen bij 55°C onder gebruikmaking van een wasbuffer van IX SSC, 0.5% SDS. Zie ook Sambrook et al., supra, pp.
30 9.50-9.55.
1 0279 75 23
De term "procent sequentie identiteit" in de context van nucleotide sequenties duidt op de residuen in twee sequenties die, wanneer ze zijn uitgelijnd voor maximale overeenstemming, hetzelfde zijn. De lengte van sequentie identiteit vergelijking kan zijn over een 5 stuk van ten minste ongeveer negen nucleotiden, gewoonlijk ten minste ongeveer 18 nucleotiden, meer gewoonlijk ten minste ongeveer 24 nucleotiden, typisch ten minste ongeveer 28 nucleotiden, meer typisch ten minste ongeveer 32 nucleotiden, en bij voorkeur ten minste ongeveer 36, 48 of meer nucleotiden. Er zijn een aantal verschillende 10 algoritmen bekend in de techniek die kunnen worden gebruikt voor het meten van nucleotide sequentie identiteit, bijv. kunnen polynucleotide sequenties worden vergeleken onder gebruikmaking van FASTA, Gap of Bestfit, wat programma’s zijn in Wisconsin Package Versie 10.3,
Accelrys, San Diego, CA. FASTA, dat bijv. de programma’s FASTA2 en 15 FASTA3 omvat, geeft uitlijningen en procenten sequentie identiteit van de regio's met de beste overlap tussen de gezochte en gevonden sequenties (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson,
Methoden Mol. Biol., 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol, 276: 71-84 (1998); hierin 20 opgenomen door verwijzing). Tenzij anders is aangegeven, worden default parameters voor een bepaald programma of algoritme gebruikt, bijv. kan procentuele sequentie identiteit tussen nucleotide sequenties worden bepaald onder gebruikmaking van FASTA met zijn default parameters (een woord grootte van 6 en de NOPAM factor voor de 25 scoringsmatrix) of onder gebruikmaking van Gap met zijn default parameters zoals voorzien in Wisconsin Package Versie 10.3, hierin opgenomen door verwijzing.
Een referentie naar een nucleotide sequentie omvat zijn complement tenzij anders is aangegeven. Derhalve moet duidelijk zijn 30 dat een referentie naar een nucleïnezuur molecuul met een bepaalde 1027975
_____ _________J
24 sequentie de daarmee complementaire streng, met zijn complementaire sequentie omvat.
Op het vakgebied van de moleculaire biologie gebruiken onderzoekers de termen "procent sequentie identiteit", "procent sequentie 5 gelijkenis" en "procent sequentie homologie" uitwisselbaar. In deze aanvrage zullen deze termen dezelfde betekenis hebben met betrekking tot alleen nucleotide sequenties.
De term "substantiële gelijkenis" of" substantiële sequentie gelijkenis," wanneer wordt verwezen naar een nucleïnezuur of fragment 10 ervan, geeft aan dat, wanneer optimaal is uitgelijnd met geschikte nucleotide inserties of deleties met een ander nucleïnezuur (of zijn complementaire streng), er nucleotide sequentie identiteit is in ten minste ongeveer 85%, bij voorkeur ten minste ongeveer 90%, en meer bij voorkeur ten minste ongeveer 95%, 96%, 97%, 98% of 99% van de 15 nucleotide basen, zoals gemeten door willekeurig welk bekend algoritme van sequentie identiteit, zoals FASTA, BLAST of Gap, zoals hierboven besproken.
Zoals toegepast bij polypeptiden, betekent de term "substantiële identiteit" dat twee peptide sequenties, wanneer optimaal uitgelijnd, 20 zoals door de programma’s GAP of BESTFIT onder gebruikmaking van default tussenruimte gewichten, ten minste 75% of 80% sequentie identiteit delen, bij voorkeur ten minste 90% of 95% sequentie identiteit, nog meer bij voorkeur ten minste 98% of 99% sequentie identiteit. Bij voorkeur verschillen residue posities die niet identiek 25 zijn, door conservatieve aminozuur substituties. Een "conservatieve aminozuur substitutie" is er één waarin een aminozuur residue door een ander aminozuur residue met een zijketen (R groep) met soortgelijke chemische eigenschappen (bijv. lading of hydrofobiciteit) is vervangen. In het algemeen zal een conservatieve aminozuur 30 substitutie de functionele eigenschappen van een eiwit niet substantieel veranderen. In gevallen dat twee of meer aminozuursequenties door 1027975 25 conservatieve substituties van elkaar verschillen, kan de procentuele sequentie identiteit of mate van gelijkenis naar boven worden bij gesteld om te corrigeren voor de conservatieve aard van de substitutie.
Middelen voor het maken van deze bijstelling zijn aan de vakman 5 bekend. Zie bijv. Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994), hierin opgenomen door verwijzing. Voorbeelden van groepen van aminozuren die zijketens met gelijksoortige chemische eigenschappen hebben, omvatten 1) alifatische zijketens: glycine, alanine, valine, leucine en isoleucine; 2) alifatisch-hydroxyl zijketens: serine en threonine; 3) 10 amide-bevattende zijketens: asparagine en glutamine; 4) aromatische zijketens: fenylalanine, tyrosine, en tryptofaan; 5) basische zijketens: lysine, arginine, en histidine; en 6) zwavel-bevattende zijketens zijn cysteïne en methionine. Geprefereerde groepen van conservatieve aminozuur substituties zijn: valine-leucine-isoleucine, fenylalanine-15 tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamate-aspartaat, en asparagine-glutamine.
Alternatief is een conservatieve vervanging elke wijziging met een positive waarde in de PAM250 log-waarschijnlijkheids matrix beschreven in Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992), hierin 20 opgenomen door verwijzing. Een "matig conservatieve" vervanging is elke verandering met een niet-negatieve waarde in de PAM250 log-waarschijnlijkheids matrix.
Sequentie gelijkenis voor polypeptiden wordt typisch gemeten onder gebruikmaking van sequentie analyse software. Eiwit analyse 25 software vergelijkt soortgelijke sequenties onder gebruikmaking van maatstaven van gelijkenis toegekend aan verscheidene substituties, deleties en andere modificaties, inclusief conservatieve aminozuur substituties, bijv. bevat GCG programma’s zoals "Gap" en "Bestfit" die kunnen worden gebruikt met default parameters om sequentie 30 homologie of sequentie identiteit vast te stellen tussen nauwverwante polypeptiden, zoals homologe polypeptiden uit verschillende soorten van 1 027975 26 organismen of tussen een wild type eiwit en een muteïne ervan. Zie bijv. Wisconsin package Versie 10.3. Polypeptide sequenties kunnen ook worden vergeleken met behulp van FASTA onder gebruikmaking van default of aanbevolen parameters, een programma in Wisconsin 5 package Versie 10.3. FASTA (bijv. FASTA2 en FASTA3) geeft uitlijningen en procentuele sequentie identiteit van de regio's met de beste overlap tussen de gezochte en gevonden sequenties (Pearson (1990); Pearson (2000)). Een ander geprefereerd algoritme, wanneer een sequentie van de uitvinding wordt vergeleken met een database die 10 een groot aantal sequenties uit verschillende organismen bevat, is het computer programma BLAST, vooral blastp of tblastn, met gebruik van default parameters. Zie bijv. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997); hierin op genomen door verwijzing.
15 De lengte van polypeptide sequenties die vóór homologie worden vergeleken, zal in het algemeen ten minste ongeveer 16 aminozuur residuen, gewoonlijk ten minste ongeveer 20 residuen, meer gewoonlijk ten minste ongeveer 24 residuen, typisch ten minste ongeveer 28 residuen, en bij voorkeur meer dan ongeveer 35 residuen bedragen.
20 Wanneer een database met daarin sequenties uit een groot aantal van verschillende organismen wordt afgezocht, heeft het de voorkeur dat aminozuursequenties worden vergeleken.
Zoals hierin gebruikt, duiden de termen "label" of "gelabeld" op de opname van een ander molecuul in het antilichaam. In één 25 uitvoeringsvorm is het label een detecteerbare merker, bijv. opname van een radiogelabeld aminozuur of bevestiging aan een polypeptide van biotinyl groepen die door gemerkt avidine kunnen worden gedetecteerd (bijv. streptavidine dat een fluorescente merker bevat, of enzymatische activiteit die kan worden gedetecteerd door optische of 30 colorimetrische methoden). In een andere uitvoeringsvorm kan het label of de merker therapeutisch zijn, bijv. een geneesmiddel conjugaat 1027975 27 of toxine. Verscheidene methoden voor de labeling van polypeptiden en glycoproteïnes zijn op zichzelf bekend en kunnen worden gebruikt. Voorbeelden van labels voor polypeptiden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de volgende: radioisotopen of radionucUden (bijv. 3H, l4C, 5 15N, 35S, 9ογ> 99Tc, mIn, 1251,131I), fluorescente labels (bijv. FITC, rhodamine, lanthanide fosfors), enzymatische labels (bijv. mierikswortel peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkalisch fosfatase), chemi-luminescente merkers, biotinyl groepen, voorafbepaalde polypeptide epitopen die worden herkend door een secondaire rapporteur (bijv.
10 leucine zipper paar sequenties, bindingsplaatsen voor secondaire antilichamen, metaal bindende domeinen, epitoop tags), magnetische middelen, zoals gadolinium chelaten, toxines zoals kinkhoest toxine, taxol, cytochalasine B, gramicidine D, ethidiumbromide, emetine, mitomycine, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, 15 doxorubicine, daunorubicine, dihydroxyanthracinedion, mitoxantrone, mithramycine, actinomycine D, 1-dehydrotestosteron, glucocorticoiden, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, en puromycine en analoga of homologen ervan. In sommige uitvoeringsvormen worden labels verbonden door spacer-armen van verschillende lengtes om potentiële 20 sterische hindering te verminderen.
De term "middel" wordt hierin gebruikt om een chemische verbinding, een mengsel van chemische verbindingen, een biologisch macromolecuul, of een extract gemaakt uit biologische materialen aan te geven. De term "farmaceutisch middel of geneesmiddel” zoals hierin 25 gebruikt verwijst naar een chemische verbinding of samenstelling die in staat is om een gewenst therapeutisch effect te induceren bij correcte toediening aan een patiënt. Andere chemische termen hierin worden gebruikt volgens conventioneel gebruik in de techniek, zoals toegelicht door The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., 30 McGraw-Hill, San Francisco (1985)), hierin opgenomen door verwijzing).
1027975 28
De term "anti-inflammatoir" of "immuno-modulatoir" middel wordt hierin gebruikt om middelen aan te geven die de functionele eigenschap van het remmen van ontsteking hebben, inclusief een inflammatoire ziekte in een subject, inclusief in een mens. In ver-5 schillende uitvoeringsvormen van deze uitvinding kan de inflammatoire ziekte zijn, zonder beperking daartoe, inflammatoire ziektes van het maagdarmkanaal, inclusief de ziekte van Crohn, ulceratieve colitis, diverticula ziekte, gastritis, lever ziekte, primaire gal sclerose, sclerosing eholangitis. Inflammatoire ziektes omvatten ook, zonder 10 daartoe beperkt te zijn, abdominale ziekte (inclusief peritonitis, j blindedarm ontsteking, galbuis ziekte), acute transverse myelitis, allergische dermatitis (inclusief allergische huid, allergisch eczeem, huid atopie, atopisch eczeem, atopische dermatitis, cutaneuze ontsteking, inflammatoir eczeem, inflammatoire dermatitis, vlooienhuid, 15 miliaire dermatitis, miliair eczeem, huisstof mijt huid), ankylosing spondylitis (Reiters syndroom), astma, luchtweg ontsteking, athero-sclerose, arteriosclerose, gal atresia, blaasontsteking, borstkanker, cardiovasculaire ontsteking (inclusief vasculitis, reumateuze nagel-vouw infarcten, beenzweren, polymyositis, chronische vaatontsteking, 20 pericarditis, chronische obstructieve longziekte), chronische pancreatitis, perineurale ontsteking, colitis (inclusief amoebische colitis, infectieve colitis, bacteriële colitis, Crohn’s colitis, ischemische colitis, ulceratieve colitis, idiopathische proctocolitis, ontstoken-darm ziekte, pseudomembraneuze colitis), collageen vaatstoornissen (reumateuze 25 artritis, SLE, progressieve systemische sclerosis, gemengde bindweefsel ziekte, diabetes mellitus), ziekte van Crohn (regionale enteritis, granulomateuze ileitis, ileocolitis, spijsverteringssysteem ontsteking), demyelinatie ziekte (inclusief myelitis, multiple sclerosis, uitgezaaide sclerosis, acute uitgezaaide encefalomyelitis, periveneuze demyelinatie, 30 vitamine B12 deficiëntie, Guillain-Barre syndroom, MS-geassocieerd retrovirus), dermatomyositis, diverticulitis, exudatieve diarree, 1027975 29 gastritis, granulomateuze hepatitis, granulomateuze ontsteking, cholecystitis, insuline-afhankelijke diabetes mellitus, lever ontstekingsziektes (lever fibrosis primaire gal cirrhosis, hepatitis, sclerosing cholangitis), longontsteking (idiopathische pulmonaire 5 fibrosis, eosinofilische granuloma van de long, pulmonaire histiocytosis X, peribronchiolaire ontsteking, acute bronchitis), lymfogranuloma venereum, mahgne melanoma, mond/tand ziekte (inclusief gingivitis, periodontale ziekte), mucositis, ontsteking van het musculoskeletaal systeem (myositis), nonalcoholische steatohepatitis (nonalcoholische 10 vettige lever ziekte), oculaire & orbitale ontsteking (inclusief uveitis, optische neuritis, periferale reumateuze ulceratie, periferale corneale ontsteking), osteoartritis, osteomyelitis, faryngeale ontsteking, polyartritis, proctitis, psoriasë, stralingsschade, sarcoidosis, sikkelcel necropathie, oppervlakkige thromboflebitis, systemisch inflammatoir 15 respons syndroom, thyroiditis, systemische lupus erythematosus, graft versus host ziekte, acute brandwonden, Behget's syndroom, Sjögren’s syndroom.
De termen patiënt en subject omvatten menselijke en veterinaire subjecten.
20 Menseliik anti-MAdCAM antilichamen en karakterisering ervan
In één uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding anti-MAdCAM antilichamen die menselijke CDR sequenties omvatten. In een voorkeursuitvoeringsvorm verschaft de uitvinding menselijke anti-MAdCAM antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen worden 25 menselijke anti-MAdCAM antilichamen geproduceerd door een niet- menselijk transgeen dier te immuniseren, bijv. een knaagdier waarvan het genoom menselijke immunoglobuline genen omvat, zodat het transgene dier menselijke antilichamen produceert. In sommige uitvoeringsvormen verschaft de uitvinding een anti-MAdCAM 30 antilichaam dat niet aan complement bindt.
1 027 9 75 --- ----- 30
In een voorkeursuitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat het 5 anti-MAdCAM antilichaam een lichte keten welke een aminozuur-
sequentie omvat, gekozen uit SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 of 68 (met of zonder de signaal sequentie) of de variabele regio van willekeurig welke van genoemde aminozuur-sequenties, of één of meer CDRs uit deze aminozuursequenties. In een 10 andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat het anti-MAdCAM
antilichaam een zware keten welke een aminozuursequentie omvat, gekozen uit SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 (met of zonder de signaal sequentie) of de aminozuursequentie van de variabele regio, of van één of meer CDRs uit genoemde 15 aminozuursequenties. Ook omvat de uitvinding menselijke anti- MAdCAM antilichamen die de aminozuursequentie uit het begin van de CDR1 tot het einde van de CDR3 van willekeurig welke van de bovengenoemde sequenties omvatten. De uitvinding verschaft verder een anti-MAdCAM antilichaam dat één of meer FR regio's van een van de 20 bovengenoemde sequenties omvat.
De uitvinding verschaft verder een anti-MAdCAM antilichaam dat één van de bovengenoemde aminozuursequenties omvat waarin één of meer modificaties zijn aangebracht. In sommige uitvoeringsvormen zijn cysteïnes in het antilichaam, die chemisch reactief kunnen zijn, 25 gesubstitueerd door een ander residue, zoals, zonder beperking, alanine of serine. In één uitvoeringsvorm is de substitutie gedaan bij een niet-canonicaal cysteïne. De substitutie kan worden uitgevoerd in een CDR of raamwerk regio van een variabel domein of in het constante domein van een antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen is de cysteïne 30 canonicaal.
1027975 31
In sommige uitvoeringsvormen is een aminozuur substitutie gedaan om potentiële proteolytische plaatsen in het antilichaam te elimineren. Zulke plaatsen kunnen in een CDR of raamwerk regio van een variabel domein of in het constante domein van een antilichaam 5 voorkomen. Substitutie van cysteïne residuen en verwijdering van proteolytische plaatsen kunnen de heterogeniteit in het antilichaam product verminderen. In sommige uitvoeringsvormen zijn asparagine-glycine paren, die potentiële deamideringsplaatsen vormen, geëlimineerd door één of beide residuen te wijzigen. In sommige 10 uitvoeringsvormen is een aminozuur substitutie gedaan om potentiële glycosyleringsplaatsen in de variabele regio van een antilichaam van de uitvinding toe te voegen of te verwijderen.
In sommige uitvoeringsvormen is het C-terminale lysine van de zware keten van het anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding 15 afgesplitst. In verschillende uitvoeringsvormen van de uitvinding kunnen de zware en lichte ketens van de anti-MAdCAM antilichamen optioneel een signaal sequentie omvatten.
In één aspect verschaft de uitvinding twaalf remmende menselijke anti-MAdCAM monoklonale antilichamen en de hybridoma 20 cellijnen die hen produceren. Tabel 1 bevat een lijst van de sequentie identificaties (SEQ ID NO:) van de nucleïnezuren coderend voor de complete zware en lichte ketens (inclusief signaal sequentie), en de overeenkomstige volledige gededuceerde aminozuursequenties.
25 1027975 32 TABEL 1 MENSELIJKE ANTbïftAdGAM?
v £-ANTÏLieHAMEM
F iTsË^
IDENTIFICATIE
Mönoklonaal· - - (SEQT^NOQ. ,
Antilichaam ’ Volle J-gngtW ^ V
?ware -ÖMS. ItEiwit^ _ ,t yj' 4 * :»#*:' iïxSt&t.? 1.7.2 12 3 4 ÏA2 5 6 7 8 6.14.2 9 ÏÖ Π 12 6.22.2 13 14 15 16 6.34.2 17 18 19 20 6.67.1 21 22 23 24 6.73.2 25 26 27 28 6.77.1 29 30 31 32 7.16.6 33 34 35 36 7.20.5 37 38 39 40 7.26.4 41 42 43 44 9.8.2 45 46 47 48
In een andere aspect verschaft de uitvinding een gemodificeerde versie van bepaalde van de hierboven-geïdentificeerde menselijke anti-5 MAdCAM monoklonale antilichamen. Tabel 2 bevat een bjst van de 1027975 33 sequentie identificaties voor de DNA en eiwit sequenties van de gemodificeerde antilichamen.
Tabel 2 tïiSaseaed teÉgMtfpÉ» ï? - ^ *'^‘~: .* .^jpj 6.22.2- mod ~~5Ï 52 53 54 6.34.2- mod 55 56 57 58 6.67.1- mod 59 60 61 62 6.77.1- mod 63 64 65~ 66 7 26.4-mod 41 42 67 68~ 5 Klasse en subklasse van anti-MAdCAM antilichamen
Het antilichaam kan een IgG, een IgM, een IgE, een IgA of een IgD molecuul zijn. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het antilichaam een IgG klasse en is het een IgGi, IgG2, IgGa of IgG4 subklasse. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam 10 subklasse IgG2 of IgG4- In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam dezelfde klasse en subklasse als antilichaam 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod dat IgG2 is, of 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 of 9.8.2, dat IgG4 is.
1027975 34
De klasse en subklasse van anti-MAdCAM antilichamen kan door elke op zichzelf bekende methode worden bepaald. In het algemeen kunnen de klasse en subklasse van een antilichaam worden bepaald onder gebruikmaking van antilichamen die specifiek zijn voor een 5 bepaalde klasse en subklasse van antilichaam. Zulke antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. ELISA, Western Blot en andere technieken kunnen de klasse en subklasse bepalen. Alternatief kunnen de klasse en subklasse worden bepaald door de sequentie te bepalen van het geheel of een deel van de constante domeinen van de zware en/of lichte 10 ketens van de antilichamen, hun aminozuursequenties te vergelijken met de bekende aminozuursequenties van verschillende klassen en subklassen van immunoglobulines, en de klasse en subklasse van de antilichamen te bepalen als de klasse die de hoogste sequentie identiteit vertoont.
15 Species en molecuul selectiviteit
In een ander aspect van de uitvinding vertoont het anti-MAdCAM antilichaam zowel species als molecuul selectiviteit. In één uitvoeringsvorm bindt het anti-MAdCAM antilichaam aan menselijk, cynomolgus of honden MAdCAM. In sommige uitvoeringsvormen bindt 20 het anti-MAdCAM antilichaam niet aan een apen species van de
Nieuwe Wereld, zoals een oestiti (zijdeaapje). Door de aanwijzingen in de beschrijving te volgen kan men de species selectiviteit voor het anti-MAdCAM antilichaam bepalen onder gebruikmaking van op zichzelf bekende methoden, bijv. kan men species selectiviteit bepalen met 25 behulp van Western blot, FACS, ELISA of immunohistochemie. In een voorkeursuitvoeringsvorm kan men de species selectiviteit bepalen met behulp van immunohistochemie.
In sommige uitvoeringsvormen heeft een anti-MAdCAM antilichaam dat specifiek aan MAdCAM bindt, een selectiviteit voor 30 MAdCAM boven VCAM, fibronectine of elk ander antigeen, die ten 1027975 35 minste 10 voudig, bij voorkeur ten minste 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 of 90 voudig, met de meeste voorkeur ten minste 100 voudig is. In een voorkeursuitvoeringsvorm vertoont het anti-MAdCAM antilichaam geen aanmerkelijke binding aan VCAM, fibronectine of elk ander 5 antigeen anders dan MAdCAM. Men kan de selectiviteit van het anti-MAdCAM antilichaam voor MAdCAM bepalen onder gebruikmaking van op zichzelf bekende methoden door de aanwijzingen van de beschrijving te volgen, bijv. kan men de selectiviteit bepalen door middel van Western blot, FACS, ELISA, of immunohistochemie.
10 Bindingsaffiniteit van anti-MAdCAM antiliehamen voor MAdCAM
In een ander aspect van de uitvinding binden de anti-MAdCAM antiliehamen specifiek aan MAdCAM met hoge affiniteit. In één uitvoeringsvorm bindt het anti-MAdCAM antilichaam specifiek aan MAdCAM met een Ka van 3 x ΙΟ 8 M of minder, zoals gemeten door 15 oppervlak plasmon resonantie, zoals BIAcore. In meer geprefereerde uitvoeringsvormen bindt het antilichaam specifiek aan MAdCAM met een Ka van 1 x 10 8 of minder of 1 x ΙΟ 9 M of minder. In een nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm bindt het antilichaam specifiek aan MAdCAM met een Ka of 1 x 10-10 M of minder. In andere geprefereerde 20 uitvoeringsvormen bindt een antilichaam van de uitvinding specifiek aan MAdCAM met een Ka van 2.66 x 10~10M of minder, 2.35 x 10-UM of minder of 9 x 10~12M of minder. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm bindt het antilichaam specifiek aan MAdCAM met een Ka of 1 x 10·11 M of minder. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm 25 bindt het antilichaam specifiek aan MAdCAM met in hoofdzaak dezelfde Ka als een antilichaam gekozen uit 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. Een antilichaam met "in hoofdzaak dezelfde Ka" als een referentie antilichaam heeft een Ka 30 die is ± 100 pM, bij voorkeur ± 50 pM, meer bij voorkeur ± 20 pM, nog 1027975 36 meer bij voorkeur ± 10 pM, ± 5 pM of ± 2 pM, vergeleken met de Kd van het referentie antilichaam in hetzelfde experiment. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm bindt het antilichaam aan MAdCAM met in hoofdzaak dezelfde Kd als een antilichaam dat één of meer variabele 5 domeinen of één of meer CDRs omvat uit een antilichaam gekozen uit 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In weer een andere voorkeursuitvoeringsvorm bindt het antilichaam aan MAdCAM met in hoofdzaak dezelfde Ka als een 10 antilichaam dat één van de aminozuursequenties omvat gekozen uit SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 68 (met of zonder de signaal sequentie), of het variabele domein ervan. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm bindt het antilichaam aan MAdCAM met in 15 hoofdzaak dezelfde Ka als een antilichaam dat één of meer CDRs omvat uit een antilichaam dat een aminozuursequentie omvat gekozen uit SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 68.
De bindingsafïiniteit van een anti-MAdCAM antilichaam aan 20 MAdCAM kan worden bepaald door elke op zichzelf bekende methode. In één uitvoeringsvorm kan de bindingsaffiniteit worden gemeten door competitieve ELISAs, RIAs of oppervlak plasmon resonantie, zoals BIAcore. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm wordt de bindingsaffiniteit gemeten door oppervlak plasmon resonantie. In een nog meer 25 geprefereerde uitvoeringsvorm worden de bindingsaffiniteit en dissociatiesnelheid gemeten onder gebruikmaking van een BIAcore.
Een voorbeeld van de bepaling van bindingsaffiniteit wordt hieronder beschreven in Voorbeeld II.
1027975 37
Halfwaardetijd van Anti-MAdCAM antilichamen
Volgens een ander doel van de uitvinding heeft het anti-MAdCAM antilichaam een halfwaardetijd van ten minste één dag in vitro of in vivo. In een voorkeursuitvoeringsvorm heeft het antilichaam 5 of deel ervan een halfwaardetijd van ten minste drie dagen. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm heeft het antilichaam of deel ervan een halfwaardetijd van vier dagen of langer. In een andere uitvoeringsvorm heeft het antilichaam of deel ervan een halfwaardetijd van acht dagen of langer: In een andere uitvoeringsvorm is het antilichaam of antigeen-10 bindende deel ervan zodanig gederivatiseerd of gemodificeerd dat het een langere halfwaardetijd heeft, zoals hieronder besproken. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm kan het antilichaam puntmutaties bevatten om de serum halfwaardetijd te verhogen, zoals beschreven in WO 00/09560, gepubliceerd 24 februari 2000.
15 De antilichaam halfwaardetijd kan worden gemeten door elk aan de vakman bekend middel, bijv. kan de antilichaam halfwaardetijd worden gemeten door Western blot, ELISA of RIA over een geschikte tijdsperiode. De antilichaam halfwaardetijd kan worden gemeten in elk geschikt dier, zoals een primaat, bijv. cynomolgus aap, of een mens.
20 Identificatie van MAdCAM epitopen die door anti-MAdCAM antilichaam worden herkend
De uitvinding verschaft ook een menselijk anti-MAdCAM antilichaam dat aan hetzelfde antigeen of epitoop bindt als een hierin verschaft menselijk anti-MAdCAM antilichaam. Verder verschaft de 25 uitvinding een menselijk anti-MAdCAM antilichaam dat competeert of kruis-competeert met een menselijk anti-MAdCAM antilichaam. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het menselijk anti-MAdCAM antilichaam 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4- 1 027975 38 mod. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het menselijk anti-MAdCAM antilichaam één of meer variabele domeinen of één of meer CDRs uit een antilichaam gekozen uit 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 5 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In weer een andere
geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het menselijk anti-MAdCAM antilichaam één van de aminozuursequenties gekozen uit SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 68 (met of zonder de signaal 10 sequentie), of een variabel domein ervan. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het menselijk anti-MAdCAM antilichaam één of meer CDRs uit een antilichaam dat één van de aminozuursequenties omvat gekozen uit SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 15 68. In een zeer geprefereerde uitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM
antilichaam een ander menselijk antilichaam.
Men kan bepalen of een anti-MAdCAM antilichaam bindt aan hetzelfde antigeen als een ander anti-MAdCAM antilichaam onder gebruikmaking van een verscheidenheid van op zichzelf bekende 20 methoden, bijv. kan men een bekend anti-MAdCAM antilichaam gebruiken voor het vangen van het antigeen , het antigeen van het anti-MAdCAM antilichaam elueren, en daarna bepalen of het test antilichaam aan het geëlueerde antigeen zal binden. Men kan bepalen of een antilichaam competeert met een anti-MAdCAM antilichaam door 25 het anti-MAdCAM antilichaam onder verzadigende condities te binden aan MAdCAM, en daarna het vermogen van het test antilichaam om aan MAdCAM te binden te meten. Als het test antilichaam in staat is te binden aan het MAdCAM tegelijk met het anti-MAdCAM antilichaam, dan bindt het test antilichaam aan een verschillende epitoop dan het 30 anti- MAdCAM antilichaam. Echter, als het test antilichaam niet in staat is tegelijkertijd aan het MAdCAM te binden, dan competeert het 1027975 39 test antilichaam met het menselijk anti-MAdCAM antilichaam. Dit experiment kan worden uitgevoerd onder gebruikmaking van ELISA, of oppervlak plasmon resonantie of, bij voorkeur, BIAcore. Om te testen of een anti-MAdCAM antilichaam kruiscompeteert met een ander anti-5 MAdCAM antilichaam, kan men de hierboven beschreven competitie methode gebruiken in twee richtingen, d.w.z. bepalen of het bekende antilichaam het test antilichaam blokkeert en vice versa.
Lichte en zware keten gen gebruik
De uitvinding verschaft ook een anti-MAdCAM antilichaam dat 10 een lichte keten variabele regio gecodeerd door een menselijk κ gen omvat. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de lichte keten variabele regio gecodeerd door een menselijk Vk A2, A3, A26, B3, 012 of 018 gen familie. In verscheidene uitvoeringsvormen omvat de lichte keten niet meer dan elf, niet meer dan zes of niet meer dan drie aminozuur 15 substituties uit de kiemlijn menselijk Vk A2, A3, A26, B3, 012 of 018 sequentie. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de aminozuur substituties conservatieve substituties.
SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 en 48 verschaffen de aminozuursequenties van de complete kappa lichte 20 ketens van twaalf anti-MAdCAM antilichamen, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2. Figuren 1K-1T zijn uitlijningen van de aminozuursequenties van de lichte keten variabele domeinen van twaalf anti-MAdCAM antilichamen met de kiemlijn sequenties waarvan de zijn afgeleid.
25 Figuur 2A toont een uitlijning van de aminozuursequenties van de lichte keten variabele domeinen van de kappa lichte ketens van twaalf anti-MAdCAM antilichamen met elkaar. Volgens de aanwijzingen in deze beschrijving zou de vakman de verschillen kunnen bepalen tussen de kiemlijn sequenties en de antilichaam sequenties van additionele 30 anti-MAdCAM antilichamen. SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 of 68 geven de 1027975 40 aminozuursequenties van de complete kappa lichte ketens van vijf additionele anti-MAdCAM antilichamen, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod, gemodificeerd door aminozuur substitutie uit hun moeder anti-MAdCAM antilichamen, resp. 6.22.2, 5 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 of 7.26.4.
In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat de VL van het anti-MAdCAM antilichaam dezelfde mutaties, ten opzichte van de kiemlijn aminozuursequentie, als één of meer van de VL van antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 10 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. De uitvinding omvat een anti-MAdCAM antilichaam dat dezelfde menselijke Vk en menselijke Jk genen gebruikt als een als voorbeeld getoond antilichaam. In sommige uitvoeringsvormen omvat het antilichaam één of meer van dezelfde mutaties t.o.v. de kiemlijn als één 15 of meer als voorbeeld getoonde antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen omvat het antilichaam verschillende substituties op één of meer van dezelfde posities als één of meer van de als voorbeeld getoonde antilichamen. bijv. kan de VL van het anti-MAdCAM antilichaam één of meer aminozuur substituties omvatten die dezelfde zijn als aanwezig 20 zijn in antilichaam 7.16.6, en een andere aminozuur substitutie die dezelfde is als.antilichaam 7.26.4. Op deze wijze kan men verschillende kenmerken van antilichaam binding mengen en matchen om bijv. de affiniteit van het antilichaam voor MAdCAM of zijn dissociatiesnelheid van het antigeen te wijzigen. In een andere uitvoeringsvorm worden de 25 mutaties gemaakt op dezelfde positie als gevonden in één of meer van de VL van antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1- mod of 7.26.4-mod, maar liever worden conservatieve aminozuur substituties gemaakt dan gebruik te maken van hetzelfde aminozuur.
30 bijv. als de aminozuur substitutie vergeleken met de kiemlijn in één van de antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 1027975 41 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1- mod of 7.26.4-mod glutamaat is, kan men conservatief substitueren met aspartaat. Evenzo, als de aminozuur substitutie serine is, kan men conservatief substitueren met threonine.
5 In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de lichte keten een aminozuursequentie die dezelfde is als de aminozuursequentie van de VL van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere zeer geprefereerde uitvoeringsvorm 10 omvat de lichte keten aminozuursequenties die dezelfde zijn als de CDR regio's van de lichte keten van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat de lichte keten een aminozuursequentie met ten 15 minste één CDR regio van de lichte keten van 1.7.-2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. Ineen andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de lichte keten aminozuursequenties met CDRs uit verschillende lichte ketens die dezelfde Vk en Jk genen 20 gebruiken. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm worden de CDRs uit verschillende lichte ketens verkregen uit 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de lichte keten een aminozuur- 25 sequentie gekozen uit SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 of 68 met of zonder de signaal sequentie. In een andere uitvoeringsvorm omvat de lichte keten een aminozuursequentie gecodeerd door een nucleotidesequentie gekozen uit SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 of 67 (met of zonder 30 de signaal sequentie), of een nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie met 1-11 aminozuur inserties, deleties of substi- 1 0 2 79 75 42 tuties ten opzichte daarvan. Bij voorkeur zijn de aminozuur substituties conservatieve aminozuur substituties. In een andere uitvoeringsvorm omvat het antilichaam of deel ervan een lambda lichte keten.
De onderhavige uitvinding verschaft ook een anti-MAdCAM anti-5 lichaam of deel ervan dat een menselijk VH gen sequentie of een van een menselijk VH gen afgeleide sequentie omvat. In één uitvoeringsvorm is de zware keten aminozuursequentie afgeleid van een menselijk VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 of 4-4 gen familie. In verscheidene uitvoeringsvormen omvat de zware keten niet meer dan vijftien, niet 10 meer dan zes of niet meer dan drie aminozuur veranderingen ten opzichte van kiemlijn menselijk VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 of 4-4 gen sequentie.
SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 en 46 geven de aminozuursequenties van de complete zware ketens van twaalf anti-15 MAdCAM antilichamen. Figures IA-IJ zijn uitlijningen van de aminozuursequenties van de zware keten variabele regio's van twaalf anti-MAdCAM antilichamen met de kiemlijn sequenties waarvan ze zijn afgeleid. Figuur 2B toont de uitlijningen van de aminozuursequenties van de zware keten variabele regio's van twaalf anti-MAdCAM 20 antilichamen met elkaar. Volgens de aanwijzingen van de beschrijving en de nucleotidesequenties van de uitvinding zou de vakman de gecodeerde aminozuursequentie van de twaalf anti-MAdCAM zware ketens en de kiemlijn zware ketens kunnen bepalen en de verschillen tussen de kiemlijn sequenties en de antilichaam sequenties vaststellen. 25 SEQ ID NOS: 52, 56, 60 en 64 geven de aminozuursequenties van de complete zware ketens van anti-MAdCAM antilichamen, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod en 6.67.1-mod, gemodificeerd door aminozuur substitutie vanuit hun moeder anti-MAdCAM antilichamen, resp. 6.22.2, 6.34.2 en 6.67.1. Eén verder gemodificeerd anti-MAdCAM antilichaam, 7.26.4-30 mod, heeft een complete zware keten aminozuursequentie die SEQ ID NO: 42 is.
1027975 43
In een voorkeursuitvoeringsvorm bevat de VH van het anti-MAdCAM antilichaam dezelfde mutaties, ten opzichte van de kiemlijn aminozuursequentie, als één of meer van de VH van antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 5 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod.
Net zoals hierboven besproken omvat het antilichaam één of meer van dezelfde mutaties t.o.v. de kiemlijn als één of meer als voorbeeld getoonde antilichamen. In sommige uitvoeringsvormen omvat het antilichaam verschillende substituties op één of meer van dezelfde 10 posities als één of meer van de als voorbeeld getoonde antilichamen. bijv. kan de VH van het anti-MAdCAM antilichaam één of meer aminozuur substituties omvatten die dezelfde zijn als aanwezig zijn in antilichaam 7.16.6, en een andere aminozuur substitutie die dezelfde is als antilichaam 7.26.4. Op deze wijze kan men verschillende kenmerken 15 van antilichaam binding mengen en matchen om bijv. de affiniteit van het antilichaam voor MAdCAM of zijn dissociatiesnelheid van het antigen te wijzigen. In een andere uitvoeringsvorm is een aminozuur substitutie vergeleken met de kiemlijn gemaakt op dezelfde positie als een substitutie uit de kiemlijn zoals gevonden in één of meer van de VH 20 van referentie antilichaam 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod, maar de positie is gesubstitueerd met een verschillend residue, dat een conservatieve substitutie is vergeleken met het referentie antilichaam.
25 In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de zware keten een aminozuursequentie die dezelfde is als de aminozuursequentie van de VH van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere zeer geprefereerde uitvoeringsvorm 30 omvat de zware keten aminozuursequenties die dezelfde zijn als de CDR regio's van de zware keten van 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 1027975 44 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat de zware keten een aminozuursequentie uit ten minste één CDR regio van de zware keten van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 5 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2- mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat de zware keten aminozuur-sequenties met CDRs uit verschillende zware ketens. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm zijn de CDRs uit verschillende zware 10 ketens verkregen uit 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, ! 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de zware keten een aminozuursequentie gekozen uit SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 met of 15 zonder de signaal sequentie. In een andere uitvoeringsvorm omvat de zware keten een aminozuursequentie gecodeerd door een nucleotide-sequentie gekozen uit SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 of 63, of een nucleotidesequentie die codeert voor een aminozuursequentie met 1-15 aminozuur inserties, deleties of 20 substituties ten opzichte daarvan. In een andere uitvoeringsvorm zijn de substituties conservatieve aminozuur substituties.
Methoden voor het produceren van antilichamen en antilichaam- I
producerende cellijnen
Immunisatie 25 In één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding worden menselijke antilichamen geproduceerd door immunisatie van een niet-menselijk dier dat sommige of alle van de menselijke immunoglobuline zware en lichte keten loei omvat, met een MAdGAM antigeen. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het niet-menselijke dier een 1 027 9 75 45 XENOMOUSE™ dier, dat een gemodificeerde muizenstam is die grote fragmenten van de menselijke immunoglobuline loei omvat en deficiënt is in de productie van muizen antilichaam. Zie bijv. Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) en U.S. octrooien 5,916,771, 5,939,598, 5 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 en 6,130,364. Zie ook WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 en WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560 en WO 00/037504. Het XENOMOUSE ™ dier produceert een volwassen-achtig menselijk repertoire van volledig menselijke 10 antilichamen en genereert antigeen-specifieke menselijk mAbs. Een tweede generatie XENOMOUSE ™ dier bevat ongeveer 80% van het menselijke antilichaam V gen repertoire door introductie van megabase grote, kiemlijn configuratie YAC fragmenten van de menselijk zware keten loei en κ lichte keten loei. In andere uitvoeringsvormen bevatten 15 XENOMOUSE ™muizen ongeveer alles van de menselijk zware keten en λ lichte keten locus. Zie Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green en Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), waarvan de beschrijvingen hierin worden opgenomen door verwijzing.
De uitvinding verschaft ook een methode voor het maken van 20 anti-MAdCAM antilichamen uit niet-menselijke, niet-muis dieren door immunisatie van niet-menselijke transgene dieren die menselijke immunoglobuline loei omvatten. Men kan zulke dieren produceren door gebruik te maken van de onmiddellijk hierboven beschreven methoden. De in deze documenten beschreven methoden kunnen worden 25 gemodificeerd zoals beschreven in U.S. octrooi 5,994,619 (het "‘619 octrooi"), dat hierin wordt opgenomen door verwijzing. Het ‘619 octrooi beschrijft methoden voor het produceren van nieuwe gekweekte inwendige celmassa (CICM) cellen en cellijnen, afkomstig van varkens en koeien, en transgene CICM cellen waarin heteroloog DNA is 30 ingevoegd. CICM transgene cellen kunnen worden gebruikt voor het produceren van gekloonde transgene embryos, foetussen, en 1027975 46 nakomelingen. Het ‘619 octrooi beschrijft ook methoden voor het produceren van transgene dieren die in staat zijn het heterologe DNA aan hun nakomelingen door te geven. In een voorkeursuitvoeringsvorm kunnen de niet-menselijke dieren ratten, schapen, varkens, geiten, 5 koeien of paarden zijn.
In een andere uitvoeringsvorm zijn de niet-menselijke dieren die menselijke immunoglobuline loei omvatten, dieren die een "minilocus" van menselijke immunoglobulines hebben. In de minilocus aanpak wordt een exogene Ig locus nagebootst door de insluiting van 10 individuele genen uit de Ig locus. Aldus worden één of meer VH genen, één of meer DH genen, één of meer JH genen, een μ constant domein (of domeinen), en een tweede constant domein (of domeinen) (bij voorkeur een gamma constant domein (of domeinen)) gevormd in een construct voor insertie in een dier. Dezeaanpak is, inter alia, beschreven in U.S.
15 octrooi Nr. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, en 5,643,763, hierin opgenomen door verwijzing.
Een voordeel van de minilocus aanpak is de snelheid waarmee constructen met daarin porties van de Ig locus kunnen worden 20 gegenereerd en geïntroduceerd in dieren. Een potentieel nadeel van de minilocus aanpak is echter dat er mogelijk niet voldoende immunoglobuline diversiteit is om volledige B-cel ontwikkeling te ondersteunen, zodat er mogelijk een geringere antilichaam productie is.
Om een menselijk anti-MAdCAM antilichaam te produceren 25 wordt een niet-menselijk dier dat sommige of alle menselijke immunoglobuline loei omvat, geïmmuniseerd met een MAdCAM antigeen en een antilichaam of de antilichaam-producerende cel wordt geïsoleerd uit het dier. Het MAdCAM antigeen kan geïsoleerd en/of gezuiverd MAdCAM zijn en is bij voorkeur een menselijk MAdCAM. In een andere 30 uitvoeringsvorm is het MAdCAM antigeen een fragment van MAdCAM, bij voorkeur het extracellulaire domein van MAdCAM. In een andere 1027975 47 uitvoeringsvorm is het MAdCAM antigeen een fragment dat ten minste één epitoop van MAdCAM omvat. In een andere uitvoeringsvorm is het MAdCAM antigeen een cel die MAdCAM op zijn celoppervlak tot expressie brengt, bij voorkeur een cel met overexpressie van MAdCAM 5 op zijn celoppervlak.
Immunisatie van dieren kan door elke op zichzelf bekende methode worden uitgevoerd. Zie bijv. Harlow en Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990). Methoden voor immunisatie van niet-menselijke dieren, zoals muizen, 10 ratten, schapen, geiten, varkens, koeien en paarden zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. Harlow en Lane en U.S. octrooi 5,994,619. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het MAdCAM antigeen toegediend met een adjuvant om de immuunrespons te stimuleren. Zulke adjuvantia omvatten compleet of incompleet Freund’s adjuvant, RIBI 15 (muramyl dipeptiden) of ISCOM (immunostimulerende complexen). Zulke adjuvantia kunnen het polypeptide beschermen tegen snelle verstrooiing door sequestratie ervan in een locaal depot, of ze kunnen stoffen bevatten die de gastheer stimuleren factoren uit te scheiden die chemotactisch zijn voor macrofagen en andere componenten van het 20 immuunsysteem. Bij voorkeur zal het immunisatieschema, als een polypeptide wordt toegediend, twee of meer toedieningen van het polypeptide inhouden, uitgespreid over verscheidene weken.
Voorbeeld I verschaft een protocol voor de immunisatie van een XENOMOUSE ™ dier met compleet menselijk MAdCAM in fosfaat-25 gebufferde zoutoplossing.
Productie van antilichamen en antilichaam-producerende cellijnen
Na immunisatie van een dier met een MAdCAM antigeen, kunnen antilichamen en/of antilichaam-producerende cellen uit het dier worden verkregen. Een anti-MAdCAM antilichaam-bevattend serum is 30 verkregen uit het dier door bloed af te nemen of het dier te offeren. Het 1027975 48 serum kan worden gebruikt zoals het uit het dier is verkregen, een immunoglobuline fractie kan uit het serum worden verkregen, of de anti-MAdCAM antilichamen kunnen uit het serum worden gezuiverd.
In een andere uitvoeringsvorm kunnen antilichaam-5 producerende geïmmortaliseerde cellijnen worden bereid uit het geïmmuniseerde dier. Na immunisatie wordt het dier gedood en worden B-cellen geïmmortaliseerd met gebruikmaking van op zichzelf bekende methoden. Methoden voor het immortaliseren van cellen omvatten, zonder beperking daartoe, transfectie ervan met oncogenen, infectie 10 ervan met een oncogeen virus en kweken ervan onder condities die selecteren voor geïmmortaliseerde cellen, onderwerpen ervan aan carcinogene of muterende verbindingen, fusie ervan met een geïmmortaliseerde cel, bijv. een myeloma cel, en inactivatie van een tumor suppressor gen. Zie bijv. Harlow en Lane, supra. In uitvoerings-15 vormen waarbij de myeloma cellen zijn betrokken, scheiden'de myeloma cellen geen immunoglobuline polypeptiden uit (een niet-secreterende cellijn). Na immortalisatie en antibioticum selectie worden de j geïmmortaliseerde cellen, of kweek supematanten ervan, gescreend onder gebruikmaking van MAdCAM, een deel ervan, of een cel die 20 MAdCAM tot expressie brengt. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de initiële screening uitgevoerd onder gebruikmaking van een enzym-verbonden immunoassay (ELISA) of een radioimmunoassay (RIA), bij voorkeur een ELISA. Een voorbeeld van ELISA screening wordt gegeven in PCT publicatie Nr. WO 00/37504, hierin opgenomen door 25 verwijzing.
In een andere uitvoeringsvorm kunnen antilichaam-producerende cellen worden bereid uit een mens die een autoimmuun stoornis heeft en anti-MAdCAM antilichamen tot expressie brengt.
Cellen die de anti-MAdCAM antilichamen tot expressie brengen, 30 kunnen worden geïsoleerd door isolatie van witte bloedcellen en onderwerping ervan aan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 1027975 49 of door panning op platen die bekleed zijn met MAdCAM of een deel ervan. Deze cellen kunnen worden gefuseerd met een menselijke niet-secreterende myeloma om menselijke hybridoma's te produceren die menselijke anti-MAdCAM antilichamen tot expressie brengen. In het 5 algemeen is dit een minder geprefereerde uitvoeringsvorm omdat de anti-MAdCAM antilichamen waarschijnlijk een lage affiniteit voor MAdCAM zullen hebben.
Anti-MAdCAM antilichaam-producerende cellen, bijv. hybridoma's worden geselecteerd, gekloneerd en verder gescreend voor 10 wenselijke karakteristieken, inclusief robustecel groei, hoge antilichaam productie en wenselijke antilichaam karakteristieken, zoals verder hieronder besproken. Hybridoma's kunnen worden gekweekt en geëxpandeerd in vivo in syngene dieren, in dieren die een immuunsysteem missen, bijv. naakte muizen, of in celkweek in vitro.
15 Methoden van selectie, klonering en expansie van hybridoma's zijn aan de vakman bekend.
Bij voorkeur is het geïmmuniseerde dier een niet-menselijk dier dat menselijke immunoglobuline genen tot expressie brengt en de B-cellen uit de milt worden gefuseerd met een myeloma afkomstig van 20 dezelfde species als het niet-menselijke dier. Meer bij voorkeur is het geïmmuniseerde dier een XENOMOUSE™ dier en is de myeloma cellijn een niet-secreterende muizen myeloma, zoals de myeloma cellijn is P3-X63-AG8-653 (ATCC). Zie bijv. Voorbeeld I.
Derhalve verschaft de uitvinding in één uitvoeringsvorm 25 methoden voor het produceren van een cellijn die een menselijk mono-klonaal antilichaam of een fragment ervan, gericht tegen MAdCAM, produceert, omvattende (a) het immuniseren van een hierin beschreven niet-menselijk transgeen dier met MAdCAM, een deel van MAdCAM of een cel of weefsel dat MAdCAM tot expressie brengt; (b) het door het 30 transgene dier laten lanceren van en immuunrespons tegen MAdCAM; (c) het isoleren van antilichaam-producerende cellen uit transgeen dier; 1027975 50 (d) het immortaliseren van de antilichaam-producerende cellen; (e) het creëren van individuele monoklonale populaties van de geïmmortali-seerde antilichaam-producerende cellen; en (f) het screenen van de geïmmortaliseerde antilichaam-producerende cellen of kweek-5 supernatanten ervan om een antilichaam te identificeren dat tegen MAdCAM is gericht.
In één aspect verschaft de uitvinding hybridoma's die menselijke anti-MAdCAM antilichamen produceren. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de hybridoma's muizen hybridoma's, zoals boven beschreven. 10 In een andere uitvoeringsvorm worden de hybridoma's geproduceerd in een niet-menselijke, niet-muizen species zoals ratten, schapen, varkens, geiten, koeien of paarden. In een andere uitvoeringsvorm zijn de hybridoma's menselijke hybridoma's, waarin een menselijke niet-secreterende myeloma is gefuseerd met een menselijk cel die een anti-15 MAdCAM antilichaam tot expressie brengt.
Nucleïnezuren. vectoren, gastheercellen en recombinante methoden voor het maken van antilichamen
Nucleïnezuren
Er worden nucleïnezuur moleculen coderend voor anti-MAdCAM 20 antilichamen van de uitvinding verschaft. In één uitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur molecuul voor een zware en/of lichte keten van een anti-MAdCAM immunoglobuline. In een voorkeursuitvoeringsvorm codeert een enkel nucleïnezuur molecuul voor een zware keten van een anti- MAdCAM immunoglobuline en codeert een ander nucleïnezuur 25 molecuul voor de lichte keten van een anti-MAdCAM immunoglobuline. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is het gecodeerde immunoglobuline een menselijk immunoglobuline, bij voorkeur een menselijk IgG. De gecodeerde lichte keten kan een λ keten of een κ keten zijn, bij voorkeur een κ keten.
1027975 51
In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul dat voor de variabele regio van de lichte keten codeert, de kiemlijn sequentie van een menselijk Vk het A2, A3, A26, B3, 012 of Q18 gen of een variant van genoemde sequentie. In een voorkeurs-5 uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul dat voor de lichte keten codeert, een sequentie afkomstig van een menselijk JkI, Jk2, Jk3, Jk4 of Jk5 gen. In een voorkeursuitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur molecuul dat voor de lichte keten codeert, voor niet meer dan elf aminozuur wijzigingen ten opzichte van het kiemlijn A2, A3, 10 A26, B3, 012 of 018 Vk gen, bij voorkeur niet meer dan zes aminozuur wijzigingen, en nog meer bij voorkeur niet meer dan drie aminozuur wijzigingen. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur dat voor de lichte keten codeert, de kiemlijn sequentie.
De uitvinding verschaft een nucleïnezuur molecuul dat codeert 15 voor een variabele regio van de lichte keten (VL) welke tot aan elf aminozuur wijzigingen vergeleken met de kiemlijn sequentie bevat, waarbij de aminozuur wijzigingen identiek zijn aan aminozuur wijzigingen ten opzichte van de kiemlijn sequentie uit de VLvan één van de antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 20 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mód of 7.26.4-mod. De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuur molecuul dat een nucleotide sequentie omvat, coderend voor de amino-zuursequentie van de variabele regio van de lichte keten van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 25 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuur molecuul dat een nucleotide sequentie omvat, coderend voor de aminozuursequentie van één of meer van de CDRs van willekeurig welke van de lichte ketens van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 30 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een 1027975 52 nucleotide sequentie coderend voor de aminozuursequentie van alle CDRs van willekeurig welke van de lichte ketens van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een 5 andere uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie coderend voor de aminozuursequentie van één van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 of omvat het een nucleotide sequentie van één van SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 of 67. In een andere 10 voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie coderend voor de aminozuursequentie van één of meer van de CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 of omvat het een nucleotide sequentie van één of meer van de CDRs van willekeurig 15 welke van SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, of 67. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie coderend voor de aminozuursequentie van alle CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 of 20 omvat het de nucleotide sequentie van alle CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, of 67.
De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuur molecuul coderend voor een aminozuursequentie van een VL die een aminozuursequentie 25 heeft die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan een boven beschreven VL, in het bijzonder aan een VL die een aminozuursequentie van één van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 of 68 omvat. De uitvinding verschaft ook een nucleotide sequentie die ten minste 70%, 75%, 80%, 30 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan een nucleotide 1 027975 53 sequentie van één van SEQ ID NOS: 3, 7, 11,15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 of 67.
In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een nucleïnezuur molecuul dat onder hoogstringente condities hybridiseert 5 met een nucleïnezuur molecuul coderend voor een VL zoals boven beschreven, in het bijzonder een nucleïnezuur molecuul dat een nucleotide sequentie coderend voor een aminozuursequentie van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 of 68 omvat. De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuur molecuul dat 10 onder hoogstringente condities hybridiseert met een nucleïnezuur molecuul dat een nucleotide sequentie van één van SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 of 67 omvat.
De uitvinding verschaft ook een nucleïnezuur molecuul coderend voor een zware keten variabele regio (VH) welk een menselijk VH 1-18, 15 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 of 4-4 VH gen gebruikt. In sommige .
uitvoeringsvormen gebruikt het nucleïnezuur molecuul coderend voor het VH gen verder een menselijk gen uit de JH4 of JH6 familie. In sommige uitvoeringsvormen gebruikt het nucleïnezuur molecuul coderend voor het VH gen het menselijke JH4b of JH6b gen. In een 20 andere uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een sequentie afkomstig van een menselijk D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 of 6-19 gen. In een nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuur molecuul coderend voor de VH niet meer dan vijftien aminozuur wijzigingen ten opzichte van de kiemlijn VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 25 3-33 of 4-4 genen, bij voorkeur niet meer dan zes aminozuur wijzigingen, en nog meer bij voorkeur niet meer dan drie aminozuur wijzigingen. In een zeer geprefereerde uitvoeringsvorm bevat het nucleïnezuur molecuul coderend voor de VH ten minste één aminozuur wijziging vergeleken met de kiemlijn sequentie, waarbij de aminozuur 30 wijziging identiek is aan een aminozuur wijziging t.o.v. de kiemlijn sequentie uit de zware keten van één van de antilichamen 1.7.2,1.8.2, _1 027975 54 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2- mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm bevat de VH niet meer dan vijftien aminozuur wijzigingen vergeleken met de kiemlijn sequenties, 5 waarbij de wijzigingen identiek zijn aan die wijzigingen t.o.v. de kiemlijn sequentie uit de VH van één van de antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2- mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod.
In één uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een 10 nucleotide sequentie die codeert voor de aminozuursequentie van de VH van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie die codeert voor de aminozuur -15 sequentie van één of meer van de CDRs van de zware keten Van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul nucleotide sequenties die coderen voor de aminozuursequenties van alle 20 CDRs van de zware keten van 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,
6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie die codeert voor de aminozuursequentie van één van SEQ ID
25 NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 of omvat het een nucleotide sequentie van één van SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 of 63. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie die codeert voor de aminozuursequentie van één of meer van 30 de CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 2, 6, 10,14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 of omvat het een nucleotide 1027975 55 sequentie van één of meer van de CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 1, 5, 9,13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 of 63. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie die codeert voor de aminozuursequenties van alle 5 CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 of omvat het een nucleotide sequentie van alle CDRs van willekeurig welke van SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 of 63. In sommige uitvoeringsvormen omvat het nucleïnezuur molecuul een nucleotide sequentie coderend 10 voor een aaneengesloten regio vanaf het begin van CDR1 tot aan het einde van CDR3 van een zware of lichte keten van een van de bovengenoemde anti-MAdCAM antilichamen.
In een andere uitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur molecuul voor een aminozuursequentie van een VH die ten minste 70%, 75%, 15 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan één van de aminozuursequenties coderend voor een VH als onmiddellijk hierboven beschreven, in het bijzonder aan een VH die een aminozuursequentie van één van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 omvat. De uitvinding verschaft ook een nucleotide 20 sequentie die ten minste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan een nucleotide sequentie van één van SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 of 63.
In een andere uitvoeringsvorm is het nucleïnezuur molecuul dat voor een VH codeert, er één dat onder hoogstringente condities met een 25 nucleotide sequentie coderend voor een VH als hierboven beschreven hybridiseert, in het bijzonder met een VH die een aminozuursequentie van één van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14,18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64 omvat. De uitvinding verschaft ook een voor een VH coderende nucleotide sequentie die onder hoogstringente condities met 30 een nucleïnezuur molecuul hybridiseert, dat een nucleotide sequentie 1 027975 56 van één van SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 of 63 omvat.
De nucleotide sequentie die voor een van beide, of beide, van de gehele zware en lichte ketens van een anti-MAdCAM antilichaam of de 5 variabele regio's ervan codeert, kan worden verkregen uit elke bron die een anti-MAdCAM antilichaam produceert. Methoden voor het isoleren van mRNA coderend voor een antilichaam zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). 10 Het mRNA kan worden gebruikt om cDNA te produceren voor gebruik in de polymerase ketting reactie (PCR) of cDNA klonering van antilichaam genen. In één uitvoeringsvorm van de uitvinding kunnen de nucleïnezuur moleculen worden verkregen uit een hybridoma die een anti-MAdCAM antilichaam tot expressie brengt, zoals hierboven 15 beschreven, bij voorkeur een hybridoma die als één van zijn fusie- partners een cel heeft van een transgeen dier, dat menselijke immuno-globuline genen tot expressie brengt, zoals een XENOMOUSE ™ dier, een niet-menselijk muizen transgeen dier of een niet-menselijk, niet-muizen transgeen dier. In een andere uitvoeringsvorm is de hybridoma 20 afkomstig van een niet-menselijk, niet-transgeen dier, dat kan worden gebruikt, bijv. voor gehumaniseerde antilichamen.
Een nucleïnezuur molecuul coderend voor de gehele zware keten van een anti-MAdCAM antilichaam kan worden geconstrueerd door fuseren van een nucleïnezuur molecuul coderend voor het gehele 25 variabele domein van een zware keten of een antigeen-bindend domein ervan met een constant domein van een zware keten. Evenzo kan een nucleïnezuur molecuul coderend voor de lichte keten van een anti-MAdCAM antilichaam worden geconstrueerd door fuseren van een nucleïnezuur molecuul coderend voor het variabele domein van een 30 lichte keten of een antigeen-bindend domein ervan met een constant domein van een lichte keten. Nucleïnezuur moleculen coderend voor de 1027975 57 VH en VL regio's kunnen worden geconverteerd tot complete antilichaam genen door ze te inserteren in expressievectoren die al coderen voor resp. de zware keten constante en lichte keten constante regio's, zodat het VH segment werkzaam verbonden is met het zware 5 keten constante regio (CH) segment (of segmenten) in de vector en het VL segment werkzaam verbonden is met het lichte keten constante regio (CL) segment in de vector. Alternatief worden de nucleïnezuur moleculen coderend voor de VH of VL ketens geconverteerd tot complete antilichaam genen door koppeling, bijv. ligatie, van het nucleïnezuur 10 molecuul coderend voor een VH keten aan een nucleïnezuur molecuul coderend voor èen CH keten onder gebruikmaking van standaard moleculair biologische technieken. Hetzelfde kan worden gerealiseerd onder gebruikmaking van nucleïnezuur moleculen coderend voor VL en CL ketens. De sequenties van menselijke genen voor de zware en lichte 15 keten constante regio zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. Nr. 91-3242 (1991). Nucleïnezuur moleculen coderend voor de complete zware en/of lichte ketens kunnen dan tot expressie worden gebracht uit een cel waarin ze zijn geïntroduceerd en het anti-MAdCAM antilichaam 20 worden geïsoleerd.
In éen voorkeursuitvoeringsvorm codeert het nucleïnezuur dat voor de variabele regio van de zware keten codeert, voor de variabele regio van aminozuursequenties van SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 of 64, en codeert het nucleïnezuur 25 molecuul dat voor de variabele regio van de lichte ketens codeert, voor de variabele regio van aminozuursequentie van SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 of 68.
In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuur molecuul coderend voor hetzij de zware keten van een anti-MAdCAM antilichaam of een 30 antigeen-bindend deel ervan, hetzij de lichte keten van een anti-MAdCAM antilichaam of een antigeen-bindend deel ervan, worden 1027975 58 geïsoleerd uit een niet-mens, niet-muis dier dat menselijke immuno-globuline genen tot expressie brengt en is geïmmuniseerd met een MAdCAM antigeen. In een andere uitvoeringsvorm kan het nucleïne-zuur molecuul worden geïsoleerd uit een anti-MAdCAM antilichaam-5 producerende cel afkomstig van een niet-transgeen dier of van een menselijke patiënt die anti-MAdCAM antilichamen produceert. mRNA uit de anti-MAdCAM antilichaam-producerende cellen kan worden geïsoleerd door standaard technieken, gekloneerd en/of geamplificeerd onder gebruikmaking van PCR en bibhotheek constructie technieken, 10 en gescreend onder gebruikmaking van standaard protocols voor het verkrijgen van nucleïnezuur moleculen coderend voor anti-MAdCAM zware en lichte ketens.
De nucleïnezuur moleculen kunnen worden gebruikt om grote hoeveelheden van anti-MAdCAM antilichamen op recombinante wijze 15 tot expressie te brengen, zoals hieronder beschreven. De nucleïnezuur moleculen kunnen ook voor het produceren van chimaere antilichamen, antilichamen uit een enkele keten, immunoadhesines, diabodies, gemuteerde antilichamen en antilichaam derivaten worden gebruikt, zoals verder hieronder beschreven. Als de nucleïnezuur moleculen van 20 een niet-menselijk, niet-transgeen dier afkomstig zijn, kunnen de nucleïnezuur moleculen worden gebruikt voor antilichaam humanisatie, zoals eveneens hieronder beschreven.
In een andere uitvoeringsvorm kunnen de nucleïnezuur moleculen van de uitvinding worden gebruikt als probes of PCR primers 25 voor specifieke antilichaam sequenties, bijv. kan een nucleïnezuur molecuul probe worden gebruikt in diagnostische methoden of kan een nucleïnezuur molecuul PCR primer worden gebruikt om regio's van DNA te amplificeren die zouden kunnen worden gebruikt, inter alia, om nucleotide sequenties te isoleren voor gebruik in het produceren van 30 variabele domeinen van anti-MAdCAM antilichamen. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de nucleïnezuur moleculen oligonucleotiden. In 1027975 59 een meer geprefereerde uitvoeringsvorm zijn de oligonucleotiden uit zeer variabele regio's van de zware en lichte ketens van het antilichaam van interesse. In een nog meer geprefereerde uitvoeringsvorm coderen de oligonucleotiden voor het geheel of een deel van één of meer van de 5 CDRs.
Vectoren
De uitvinding verschaft vectoren omvattende de nucleïnezuur moleculen van de uitvinding die voor de zware keten of het antigeen-bindende deel ervan coderen. De uitvinding verschaft ook vectoren 10 omvattende de nucleïnezuur moleculen van de uitvinding die voor de lichte keten of het antigeen-bindende deel ervan coderen. De uitvinding verschaft ook vectoren die nucleïnezuur moleculen omvatten, coderend voor fusie-eiwitten, gemodificeerde antilichamen, antilichaam fragmenten, en probes ervan.
15 Om de antilichamen, of antilichaam delen van de uitvinding tot expressie te brengen, worden DNAs coderend voor partiële of complete lichte en zware ketens, verkregen zoals boven beschreven, zodanig in expressie vectoren ingevoegd, dat de genen werkzaam verbonden zijn met transcriptionele en translationale controle sequenties.
20 Expressievectoren omvatten plasmiden, retrovirussen, adenovirussen, adeno-geassocieerde virussen (AAV), plantenvirussen zoals bloemkool mozaïek virus, tabak mozaïek virus, cosmiden, YACs, van EBV afgeleide episomen, en dergelijke. Het antilichaam gen wordt zodanig geligeerd in een vector dat transcriptionele en translationale controle 25 sequenties in de vector hun beoogde functie van regulatie van de transcriptie en translatie van het antilichaam gen uitoefenen. De expressievector en expressie controle sequenties worden zo gekozen, dat ze compatibel met de toegepaste expressie gastheercel zijn. Het antilichaam lichte keten gen en het antilichaam zware keten gen 30 kunnen in aparte vectoren worden ingevoegd. In een 1027975 60 voorkeursuitvoeringsvorm worden beide genen in dezelfde expressievector ingevoegd. De antilichaam genen worden in de expressievector ingevoegd door standaard methoden (bijv. ligatie van complementaire restrictie plaatsen op het antilichaam gen fragment en 5 vector, of ligatie van stompe uiteinden als er geen restrictie plaatsen aanwezig zijn).
Een handige vector is er één die codeert voor een functionele complete menselijke CH of CL immunoglobuline sequentie, met zodanig geconstrueerde geschikte restrictie plaatsen dat willekeurig welke VH 10 of VL sequentie gemakkelijk kan worden ingevoegd en tot expressie gebracht, zoals hierboven beschreven. In dergelijke vectoren treedt gewoonlijk splicing op tussen de splice donor plaats in de ingevoegde J regio en de splice acceptor plaats die voorafgaat aan de menselijke C regio, en ook bij de splice regio's die voorkomen in de menselijke CH 15 exons. Polyadenylering en transcriptie terminatie treden op bij natieve chromosomale plaatsen stroomafwaarts van de coderende regio's. De recombinante expressievector kan ook coderen voor een signaalpeptide dat secretie van de antilichaam keten uit een gastheercel faciliteert.
Het gen voor de antilichaam keten kan zodanig worden gekloneerd in 20 de vector dat het signaalpeptide in leesraam is verbonden met de amino terminus van het gen voor de antilichaam keten. Het signaalpeptide kan een immunoglobuline signaalpeptide of een heteroloog signaalpeptide zijn (d.w.z. een signaalpeptide uit een niet-immunoglobuline eiwit).
25 Behalve de genen voor de antilichaam keten dragen de recombi nante expressie vectoren van de uitvinding regulatoire sequenties die de expressie van de antilichaam keten genen in een gastheercel reguleren. De vakman zal begrijpen dat het ontwerp van de expressievector, inclusief de selectie van regulatoire sequenties kan afhangen van factoren 30 zoals de keuze van de te transformeren gastheercel, het gewenste eiwit expressieniveau, etc. Geprefereerde regulatoire sequenties voor 1027975 61 expressie in een zoogdierlijke gastheercel omvatten virale elementen die hoge niveau's van eiwitexpressie in zoogdiercellen aansturen, zoals promoters en/of enhancers afkomstig van retrovirale LTRs, cytomegalovirus (CMV) (zoals de CMV promoter/enhancer), Simian 5 Virus 40 (SV40) (zoals de SV40 promoter/enhancer), adenovirus, (bijv. de adenovirus major late promoter (AdMLP)), polyoma en sterke zoogdierlijke promoters zoals natieve immunoglobuline en actine promoters. Voor een verdere beschrijving van virale regulatoire elementen, en sequenties ervan, zie bijv. U.S. octrooi nrs. 5,168,062, 10 4,510,245 , en 4,968,615, die elk hierin door verwijzing worden opgenomen. Methoden voor het tot expressie brengen van antilichamen in planten, inclusief een beschrijving van promoters en vectoren, en transformatie van planten zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. U.S. octrooi 6,517,529. Methoden voor expressie van polypeptiden in bacteriële 15 cellen of fungale cellen, bijv. gistcellen, zijn eveneens op zichzelf bekend.
Behalve de genen voor de antilichaam keten en de regulatoire sequenties kunnen de recombinante expressievectoren van de uitvinding extra sequenties dragen, zoals sequenties die replicatie van 20 de vector in gastheercellen reguleren (bijv. oorsprongen van replicatie) en selecteerbare merker genen. Het selecteerbare merker gen faciliteert selectie van gastheercellen waarin de vector wordt geïntroduceerd (zie bijv. U.S. octrooi nrs. 4,399,216, 4,634,665 en 5,179,017). bijv. verleent het selecteerbare merker gen typisch resistentie tegen medicinale 25 stoffen, zoals G418, hygromycine of methotrexaat, aan een gastheercel waarin de vector is geïntroduceerd. Geprefereerde selecteerbare merker genen omvatten het dihydrofolaat reductase (DHFR) gen (voor gebruik in dhfr- gastheercellen met methotrexaat selectie/amplificatie) en het neo gen (voor G418 selectie), en het glutamaat synthetase gen.
10279^5 62
Niet-hybridoma gastheercellen en methoden voor het recombinant produceren van eiwit
Nucleïnezuur moleculen coderend voor de zware keten of een antigeen bindend deel ervan en/of de lichte keten of een antigeen 5 bindend deel ervan van een anti-MAdCAM antilichaam, en vectoren die deze nucleïnezuur moleculen omvatten, kunnen worden gebruikt voor transformatie van een geschikte zoogdierlijke, planten, bacteriële of gist gastheercel. Transformatie kan door elke bekende methode voor het introduceren van polynucleotiden in een gastheercel worden uitgevoerd. 10 Methoden voor de introductie van heterologe polynucleotiden in zoogdierlijke cellen zijn op zichzelf bekend en omvatten door dextran gemedieerde transfectie, calciumfosfaat precipitatie, polybrene-gemedieerde transfectie, protoplast fusie, elektroporatie, inkapseling van de polynucleotide(n) in liposomen, biolistische injectie en directe 15 microinjectie van het DNA in kernen. Bovendien kunnen nucleïnezuur moleculen worden geïntroduceerd in zoogdierlijke cellen door virale vectoren. Methoden voor het transformeren van cellen zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. U.S. octrooi nrs. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, en 4,959,455 (welke octrooien hierin worden opgenomen door verwijzing). 20 Methoden voor het transformeren van plantencellen zijn op zichzelf bekend, inclusief bijv. Agrobacterium-gemedieerde transformatie, biolistische transformatie, directe injectie, elektroporatie en virale transformatie. Methoden voor het transformeren van bacteriële en gist cellen zijn eveneens op zichzelf bekend.
25 Zoogdierlijke cellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie, zijn op zichzelf bekend en omvatten vele geïmmortaliseerde cellijnen verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC). Deze omvatten, inter alia, Chinese hamster ovarium (CHO) cellen, NS0, SP2 cellen, HEK-293T cellen, NIH-3T3 cellen, HeLa cellen, baby 30 hamster nier (BHK) cellen, apen niercellen (COS), menselijke hepato- 1027975 63 cellulair carcinoma cellen (bijv. Hep G2), A549 cellen, 3T3 cellen, en een aantal andere cellijnen. Zoogdierlijke gastheercellen omvatten mensen-, muizen-, ratten-, honden-, apen-, varkens-, geiten-, runder-, paarden-en hamstercellen. Cellijnen met bijzondere voorkeur worden gekozen 5 door te bepalen welke cellijnen hoge expressieniveau's hebben. Andere cellijnen die kunnen worden gebruikt, zijn insekten cellijnen, zoals Sf9 cellen, amfibie cellen, bacteriële cellen, plantencellen en fungale cellen. Wanneer recombinante expressievectoren coderend voor de zware keten of antigeen bindend deel ervan, de lichte keten en/of antigeen bindend 10 deel ervan worden geïntroduceerd in zoogdierlijke gastheercellen, worden de antilichamen geproduceerd door de gastheercellen te kweken gedurende een voldoende lange tijdsperiode om expressie van het antilichaam in de gastheercellen of, meer bij voorkeur, secretie van het antilichaam in het kweekmedium waarin de gastheercellen worden 15 gegroeid, mogelijk te maken. Antilichamen kunnen uit het kweekmedium worden gewonnen door middel van standaard methoden van eiwitzuivering. Plantaardige gastheercellen omvatten bijv. Nicotiana, Arabidopsis, eendenkroos, mais, tarwe, aardappel, etc. Bacteriële gastheercellen omvatten E. coli en Streptomyces species. Gist gastheer-20 cellen omvatten Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris.
Verder kan expressie van antilichamen van de uitvinding (of andere stukken daaruit) uit productie cellijnen worden verhoogd onder gebruikmaking van een aantal bekende technieken. Bijv. is het 25 glutamine synthetase gen expressiesysteem (het GS systeem) een algemene aanpak voor verhoging van de expressie onder bepaalde condities. Het GS systeem geheel of gedeeltelijk besproken in verband met Europees octrooi nrs. 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 en 0 323 997.
Het is waarschijnlijk dat antilichamen, welke door verschillende 30 cellijnen of in transgene dieren tot expressie zijn gebracht, t.o.v. elkaar verschillende glycosylering zullen hebben. Alle antilichamen die worden 1027975 64 gecodeerd door de hierin verschafte nucleïnezuur moleculen, of die de hierin verschafte aminozuursequenties omvatten, maken echter deel uit van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylering van de antilichamen.
5 Transgene dieren en planten
De uitvinding verschaft ook transgene niet-menselijke dieren en transgene planten omvattende één of meer nucleïnezuur moleculen van de uitvinding die kunnen worden gebruikt voor het produceren van antilichamen van de uitvinding. Antilichamen kunnen worden 10 geproduceerd in en gewonnen uit weefsel of lichaamsvloeistoffen, zoals melk, bloed of urine, van geiten, koeien, paarden, varkens, ratten, muizen, konijnen, hamsters of andere zoogdieren. Zie bijv. U.S. octrooi nrs. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, en 5,741,957. Zoals hierboven is beschreven, kunnen niet-menselijke transgene dieren die menselijke 15 immunoglobuline loei omvatten, worden geïmmuniseerd met MAdCAM
of een deel ervan. Methoden voor het maken van antilichamen in planten worden beschreven, bijv. in U.S. octrooien 6,046,037 en 5,959,177, hierin opgenomen door verwijzing.
In een andere uitvoeringsvorm worden niet-menselijke transgene 20 dieren en transgene planten geproduceerd door introductie van één of meer nucleïnezuur moleculen van de uitvinding in het dier of de plant door standaard transgene technieken. Zie Hogan, supra. De transgene cellen gebruikt voor het maken van het transgene dier kunnen embryonische stamcellen, somatische cellen of bevruchte eicellen zijn. 25 De transgene niet-menselijke organismen kunnen chimaere, non- chimaere heterozygoten, en non-chimaere homozygoten zijn. Zie bijv. Hogan et al.„ Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenes: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); 30 en Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 1027975 65
Academie Press (1999). In een andere uitvoeringsvorm kunnen de transgene niet-menselijke organismen een doelgerichte verstoring en vervanging hebben, die voor een zware keten en/of een lichte keten van interesse codeert. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvatten en 5 exprimeren de transgene dieren of planten nucleïnezuur moleculen coderend voor zware en lichte ketens die combineren om specifiek te binden aan MAdCAM, bij voorkeur menselijk MAdCAM. In een andere uitvoeringsvorm omvatten de transgene dieren of planten nucleïnezuur moleculen coderend voor een gemodificeerd antilichaam zoals een 10 antilichaam uit een enkele keten, een chimaer antilichaam of een gehumaniseerd antilichaam. De anti-MAdCAM antilichamen kunnen worden gemaakt in elk transgeen dier. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn de niet-menselijke dieren muizen, ratten, schapen, varkens, geiten, koeien of paarden. Het niet-menselijke transgene dier brengt 15 genoemde gecodeerde polypeptiden tot expressie in bloed, melk, urine, speeksel, tranen, mueus en andere lichaamsvloeistoffen.
Faag display bibliotheken
De uitvinding verschaft een methode voor het produceren van een anti-MAdCAM antilichaam of antigeen bindend deel ervan omvattende 20 de stappen van het synthetiseren van een bibliotheek van menselijke antilichamen op faag, het screenen van de bibliotheek met een MAdCAM of een deel ervan, het isoleren van faag die MAdCAM bindt, en het verkrijgen van het antilichaam uit de faag. Eén methode voor de bereiding van de bibliotheek van antilichamen omvat de stappen van 25 het immuniseren van een niet-menselijk gastheer dier omvattende een menselijke immunoglobuline locus met MAdCAM of een antigeen deel ervan om een immuunrespons te creëren, het extraheren van cellen uit het gastheer dier, de cellen die verantwoordelijk zijn voor productie van antilichamen; het isoleren van RNA uit de geëxtraheerde cellen, het 30 uitvoeren van reverse transcriptie van het RNA om cDNA te 1027975 66 produceren, het amplificeren van het cDNA onder gebruikmaking van een primer, en het inserteren van het cDNA in een faag display vector zodanig dat antilichamen op de faag tot expressie worden gebracht. Recombinante anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding kunnen 5 op deze wijze worden verkregen.
Recombinante anti-MAdCAM menselijke antilichamen van de uitvinding in aanvulling op de hierin beschreven anti-MAdCAM antilichamen kunnen worden geïsoleerd door screening van een recombinante combinatoriële antilichaam bibliotheek, bij voorkeur een 10 scFv faag display bibliotheek, bereid onder gebruikmaking van menselijke VL en VH cDNAs bereid uit mRNA geïsoleerd uit menselijke lymfocyten. Methodieken voor bereiding en screening van dergelijke bibliotheken zijn op zichzelf bekend. Er zijn commercieel verkrijgbare kits voor het genereren van faag display bibliotheken (bijv. het 15 Pharmacia Recombinant Faag Antilichaam Systeem, catalogus nr.
27-9400-01; en de Stratagene SurfZAP™ faag display kit, catalogus nr. 240612). Er zijn ook andere methoden en reagentia die kunnen worden gebruikt bij het genereren en screenen van antilichaam display bibliotheken (zie bijv. U.S. octrooi nr. 5,223,409; PCT publicatie nr. WO 20 92/18619; PCT publicatie nr. WO 91/17271; PCT publicatie nr. WO
92/20791; PCT publicatie nr. WO 92/15679; PCT publicatie nr. WO 93/01288; PCT publicatie nr. WO 92/01047; PCT publicatie nr. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9: 1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridoma's, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 25 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990);
Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., NucAcid 30 Res, 19: 4133-4137 (1991); en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991).
1027975 67
In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt, om menselijke anti-MAdCAM antilichamen met de gewenste karakteristieken te isoleren, eerst een menselijk anti-MAdCAM antilichaam zoals hierin beschreven gebruikt voor het selecteren van menselijke zware en lichte keten 5 sequenties met soortgelijke bindingsactiviteit t.o.v. MAdCAM, onder gebruikmaking van de epitoop inprentmethoden beschreven in Hoogenboom et al., PCT publicatie nr. WO 93/06213. De antilichaam bibliotheken die in deze methode worden gebruikt, zijn bij voorkeur scFv bibliotheken bereid en gescreend zoals beschreven in McCafferty 10 et al., PCT publicatie nr. WO 92/01Ó47, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). De scFv antilichaam bibliotheken worden bij voorkeur gescreend met gebruik van menselijk MAdCAM als het antigeen.
Wanneer eenmaal initiële menselijke VL en VH segmenten zijn 15 geselecteerd, worden "meng en match" experimenten, waarin verschillende paren van de initieel geselecteerde VL en VH segmenten worden gescreend voor MAdCAM binding, uitgevoerd om geprefereerde VL/VH paar combinaties te selecteren. Om de kwaliteit van het antilichaam verder te verbeteren, kunnen bovendien de VL en VH 20 segmenten van het geprefereerde VL/VH paar (of paren) willekeurig worden gemuteerd, bij voorkeur in de CDR3 regio van VH en/of VL, in een proces analoog aan het in vivo somatische mutatie proces dat gedurende een natuurlijke immuunrespons voor affiniteit maturatie van antilichamen verantwoordelijk is. Deze in vitro affiniteit maturatie 25 kan worden uitgevoerd door amplificatie van VH en VL regio’s onder gebruikmaking van PCR primers complimentair aan resp. de VH CDR3 of VL CDR3, welke primers zijn "spiked" met een willekeurig mengsel van de vier nucleotide basen op bepaalde posities zodanig dat de resulterende PCR producten coderen voor VH en VL segmenten waarin 30 willekeurige mutaties zijn geïntroduceerd in de VH en/of VL CDR3 1 027975 υυ regio's. Deze willekeurig gemuteerde VH en VL segmenten kunnen opnieuw worden gescreend voor binding aan MAdCAM.
Na screening en isolatie van een anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding uit een display bibliotheek van recombinante immuno-5 globulinen kan nucleïnezuur dat voor het geselecteerde antilichaam codeert, uit het display pakket worden gewonnen (bijv. uit het faag genoom) en gesubkloneerd worden in andere expressievectoren door standaard recombinant DNA technieken. Desgewenst kan het nucleïnezuur verder worden gemanipuleerd om andere antilichaam 10 vormen van de uitvinding te creëren, zoals hieronder beschreven. Om een recombinant menselijk antilichaam tot expressie te brengen, dat is geïsoleerd door screening van een combinatoriële bibliotheek, wordt het DNA dat voor het antilichaam codeert, gekloneerd in een recombinante expressievector en geïntroduceerd in een zoogdierlijke gastheercel, zoals 15 hierboven beschreven.
Switching van klasse
Een ander aspect van de onderhavige uitvinding is om een mechanisme te verschaffen waardoor de klasse van een anti-MAdCAM antilichaam door een andere kan worden vervangen. In één aspect van 20 de uitvinding wordt een nucleïnezuur molecuul coderend voor VL of VH
geïsoleerd onder gebruikmaking van op zichzelf bekende methoden zodanig dat het geen nucleotide sequenties coderend voor CL of CH insluit. Het nucleïnezuur molecuul coderend voor VL of VH wordt daarna werkzaam verbonden met een nucleotide sequentie coderend 25 voor een CL of CH uit een verschillende klasse van immunoglobuline molecuul. Dit kan worden uitgevoerd onder gebruikmaking van een vector of nucleïnezuur molecuul dat een CL of CH coderende sequentie omvat, zoals hierboven beschreven. Bijv. kan een anti-MAdCAM antilichaam dat oorspronkelijk IgM was, een klasse switch ondergaan 30 naar een IgG. Verder kan de klasse switch worden gebruikt om de ene 1027975 69
IgG subklasse om te zetten in een andere, bijv. van IgG4 naar IgG2. Een geprefereerde methode voor het produceren van een antilichaam van de uitvinding dat een gewenst isotype of antilichaam subklasse omvat, omvat de stappen van het isoleren van een nucleïnezuur coderend voor 5 de zware keten van een anti-MAdCAM antilichaam en een nucleïnezuur coderend voor de lichte keten van een anti-MAdCAM antilichaam, het verkrijgen van de variabele regio van de zware keten, het ligeren van de variabele regio van de zware keten met het constante domein van een zware keten van het gewenste isotype, het tot expressie brengen van de 10 lichte keten en de geligeerde zware keten in een cel, en het verzamelen van het anti-MAdCAM antilichaam van het gewenste isotype.
Antilichaam derivaten
De hierboven beschreven nucleïnezuur moleculen kunnen worden gebruikt om antilichaam derivaten te genereren onder gebruikmaking 15 van aan de vakman bekende technieken en methoden.
Gehumaniseerde antilichamen
De immunogeniciteit van niet-menselijke antilichamen kan enigszins worden gereduceerd door middel van technieken van humanisatie, potentieel gebruikmakend van display technieken met 20 behulp van geschikte bibliotheken. Men zal begrijpen dat muizen antilichamen of antilichamen uit andere species onder gebruikmaking van op zichzelf bekende technieken kunnen worden gehumaniseerd of geprimatiseerd. Zie bijv. Winter en Harris, Immunol Today, 14: 43-46 (1993) en Wright et al., Crit. Reviews in Immunol., 12125-168 (1992).
25 Het antilichaam van interesse kan door recombinant DNA technieken worden gemodificeerd om de ChI, Ch2, Ch3, scharnier domeinen, en/of het raamwerk domein te vervangen door de overeenkomstige menselijke sequentie (zie WO 92/02190 en U.S. octrooi nrs. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, en 5,777,085). In een andere 10279 75 70 uitvoeringsvorm kan een niet-menselijk anti-MAdCAM antilichaam worden gehumaniseerd door de ChI, scharnier domein, Ch2, Ch3, en/of de raamwerk domeinen door de overeenkomstige menselijke sequentie van een anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding te vervangen.
5 Gemuteerde antilichamen
In een andere uitvoeringsvorm kunnen de nucleïnezuur moleculen, vectoren en gastheercellen worden gebruikt voor het maken van gemuteerde anti-MAdCAM antilichamen. De antilichamen kunnen worden gemuteerd in de variabele domeinen van de zware en/of lichte 10 ketens om een bindingseigenschap van het antilichaam te veranderen. Bijv. kan een mutatie worden gemaakt in één of meer van de CDR regio's om de Ka van het antilichaam voor MAdCAM te verhogen of te verlagen. Technieken in plaatsgerichte mutagenese zijn op zichzelf bekend. Zie bijv. Sambrook et al., en Ausubel et al., supra. In een 15 voorkeursuitvoeringsvorm worden mutaties gemaakt bij een aminozuur residue dat zoals bekend veranderd is, vergeleken met de kiemlijn, in een variabele regio van een anti-MAdCAM antilichaam. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm worden één of meer mutaties gemaakt bij een aminozuur residue dat zoals bekend veranderd is, vergeleken 20 met de kiemlijn, in een variabele regio of CDR regio van één van de anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. Ineen andere uitvoeringsvorm worden één of meer mutaties gemaakt bij een aminozuur residue dat 25 zoals bekend veranderd is, vergeleken met de kiemlijn, in een variabele regio of CDR regio waarvan de aminozuursequentie is getoond in SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 68, of waarvan de nucleotide sequentie is getoond in SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 30 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 1 0279 75 71 61, 63, 65 of 67. In een andere uitvoeringsvorm worden de nucleïnezuur moleculen gemuteerd in één of meer van de raamwerk regio's. Een mutatie kan worden gemaakt in een raamwerk regio of constant domein om de halfwaardetijd van het anti-MAdCAM antilichaam te verhogen.
5 Zie bijv. WO 00/09560, gepubliceerd 24 februari 2000, hierin opgenomen door verwijzing. In één uitvoeringsvorm kunnen er één, drie of vijf of tien puntmutaties en niet meer dan vijftien puntmutaties zijn. Een mutatie in een raamwerk regio of constant domein kan ook worden gemaakt om de immunogeniciteit van het antilichaam te veranderen, 10 om een plaats voor covalente of niet-covalente binding aan een ander molecuul te verschaffen, of om zulke eigenschappen als complement fixatie te veranderen. Mutaties kunnen worden gemaakt in elke van de raamwerk regio’s, het constante domein en de variabele regio's in een enkel gemuteerd antilichaam. Alternatief kunnen mutaties worden 15 gemaakt in slechts één van de raamwerk regio's, de variabele regio's of het constante domein in een enkel gemuteerd antilichaam.
In één uitvoeringsvorm zijn er niet meer dan vijftien aminozuur wijzigingen in of de VH of VL regio's van het gemuteerde anti-MAdCAM antilichaam vergeleken met het anti-MAdCAM antilichaam vóór de 20 mutatie. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm zijn er niet meer dan tien aminozuur wijzigingen in of de VH of VL regio's van het gemuteerde anti-MAdCAM antilichaam, meer bij voorkeur niet meer dan vijf aminozuur wijzigingen, of nog meer bij voorkeur niet meer dan drie aminozuur wijzigingen. In een andere uitvoeringsvorm zijn er niet 25 meer dan vijftien aminozuur wijzigingen in de constante domeinen, meer bij voorkeur niet meer dan tien aminozuur wijzigingen, nog meer bij voorkeur niet meer dan vijf aminozuur wijzigingen.
Gemodificeerde antilichamen
In een andere uitvoeringsvorm kan een fusie antilichaam of 30 immunoadhesine worden gemaakt dat het geheel of een deel van een 1 027975 72 anti-MAdCAM antilichaam verbonden met een ander polypeptide omvat. In een voorkeursuitvoeringsvorm zijn slechts de variabele regio's van het anti-MAdCAM antilichaam verbonden met het polypeptide. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is het VH domein van een anti-5 MAdCAM antilichaam verbonden met een eerste polypeptide, terwijl het VL domein van een anti-MAdCAM antilichaam is verbonden met een tweede polypeptide dat met het eerste polypeptide associeert op een wijze waarbij de VH en VL domeinen wisselwerking met elkaar kunnen ondergaan om een antilichaam bindingsplaats te vormen. In een andere 10 voorkeursuitvoeringsvorm is het VH domein zo door een linker van het VL domein gescheiden, dat de VH en VL domeinen wisselwerking met elkaar kunnen ondergaan (zie hieronder onder Antilichamen uit een enkele keten). HetVH-linker-VL antilichaam wordt daarna verbonden met het polypeptide van interesse. Het fusie antilichaam is bruikbaar 15 om een polypeptide doelgericht naar een MAdCAM-exprimerende cel of weefsel te sturen. Het polypeptide kan een therapeutisch middel zijn, zoals een toxine, groeifactor of ander regulatoir eiwit, of kan een diagnostisch middel zijn, zoals een enzym dat gemakkelijk zichtbaar kan worden gemaakt, zoals mierikswortel peroxidase. Bovendien 20 kunnen fusie antilichamen worden gecreëerd waarin twee (of meer) antilichamen uit een enkele keten met elkaar worden verbonden. Dit is bruikbaar als men een divalent of polyvalent antilichaam op een enkele polypeptide keten wil creëren, of als men een bispecifiek antilichaam wil creëren.
25 Om een antilichaam uit een enkele keten te creëren (scFv), worden de VH- en VL-coderende DNA fragmenten werkzaam verbonden met een ander fragment dat voor een flexibele linker codeert, bijv. voor de aminozuursequentie (Gly4 -Ser)3 codeert, zodanig dat de VH en VL sequenties tot expressie kunnen worden gebracht in de vorm van een 30 aaneengesloten enkele-keten eiwit, met de VL en VH regio's door de flexibele linker met elkaar verbonden (zie bijv. Bird et al., Science, 242: 1 f)97Q 7ς _ 73 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)). Het antilichaam uit een enkele keten kan monovalent zijn, als slechts een enkele VH en VL worden gebruikt, bivalent, als er twee VH en VL worden gebruikt, of 5 polyvalent, als er meer dan twee VH en VL worden gebruikt.
In een andere uitvoeringsvorm kunnen andere gemodificeerde antilichamen worden bereid onder gebruikmaking van anti-MAdCAM-coderende nucleïnezuur moleculen. Bijv. kunnen "Kappa bodies" (111 et al., Protein Eng, 10: 949-57(1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO 10 J, 13: 5303-9(1994)), "Diabodies" (Holliger et al., PNAS USA, 90:6444-6448(1993)), of "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J, 10: 3655-3659 (1991) en Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl, 7: 51-52 (1992)) worden bereid onder gebruikmaking van standaard moleculair biologische technieken 15 volgens de aanwijzingen van de beschrijving.
In een ander aspect kunnen chimaere en bispecifieke antilichamen worden gegenereerd. Een chimaer antilichaam kan worden gemaakt dat CDRs en raamwerk regio's uit verschillende antilichamen omvat. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvatten de CDRs van het 20 chimaere antilichaam alle CDRs van de variabele regio van een lichte keten of zware keten van een menselijk anti-MAdCAM antilichaam, terwijl de raamwerk regio's uit één of meer verschillende antilichamen afkomstig zijn. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm omvatten de CDRs van het chimaere antilichaam alle CDRs van de variabele regio's 25 van de lichte keten en de zware keten van een menselijk anti-MAdCAM antilichaam. De raamwerk regio's kunnen uit een andere species zijn en kunnen, in een voorkeursuitvoeringsvorm, zijn gehumaniseerd. Als alternatief kunnen de raamwerk regio's uit een andere menselijk antilichaam zijn.
30 Er kan een bispecifiek antilichaam worden gegenereerd dat specifiek bindt aan MAdCAM via één bindend domein en aan een 1027975 74 tweede molecuul via een tweede bindend domein. Het bispecifieke antilichaam kan worden geproduceerd door recombinante moleculair biologische technieken, of kan fysisch samen worden geconjugeerd. Bovendien kan een antilichaam uit een enkele keten, dat meer dan één 5 VH en VL bevat, worden gegenereerd dat specifiek bindt aan MAdCAM en aan een ander molecuul. Zulke bispecifieke antilichamen kunnen worden gegenereerd onder gebruikmaking van technieken, op zichzelf bekend bijv. in verband met (i) en (ii) zie bijv. Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) en Wright en Harris, supra. en in verband met 10 (iii) zie bijv. Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). In een voorkeursuitvoeringsvorm bindt het bispecifieke antilichaam aan MAdCAM en aan een ander molecuul dat in hoge mate op endotheel cellen tot expressie wordt gebracht. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is het andere molecuul VCAM, ICAM of L-selectine.
15 In verscheidene uitvoeringsvormen worden de boven beschreven gemodificeerde antilichamen bereid onder gebruikmaking van één of meer van de variabele regio's of één of meer CDR regio's uit één van de antilichamen gekozen uit 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 20 6.67.1-mod, 6.77.1-mod of 7.26.4-mod. In een andere uitvoeringsvorm worden de gemodificeerde antilichamen bereid onder gebruikmaking van één of meer van de variabele regio's of één of meer CDR regio's waarvan de aminozuursequentie wordt getoond in SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 25 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 of 68 of waarvan de nucleotide sequentie wordt getoond in SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15,17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 of 67.
1 027975 75
Gederivatiseerde en gelabelde antilichamen
Een antilichaam of antilichaam deel van de uitvinding kan worden gederivatiseerd of verbonden met een ander molecuul (bijv. een ander peptide of eiwit). In het algemeen worden de antilichamen of 5 delen ervan zo gederivatiseerd, dat de MAdCAM binding niet nadelig wordt beïnvloed door de derivatisering of labeling. Dienovereenkomstig zijn de antilichamen en antilichaam delen van de uitvinding bedoeld om zowel intacte als gemodificeerde vormen van de hierin beschreven menselijke anti-MAdCAM antilichamen te omvatten. Bijv. kan een anti-10 lichaam of antilichaam deel van de uitvinding functioneel verbonden zijn (door chemische koppeling, genetische fusie, non-covalente associatie of op andere wijze) met één of meer andere moleculaire entiteiten, zoals een ander antilichaam (bijv. een bispecifiek antilichaam of een diabody), een detectiemiddel, een cytotoxische middel, een 15 farmaceutisch middel, en/of een eiwit of peptide dat associatie van het antilichaam of antilichaam deel met een ander molecuul (zoals een streptavidine kernregio of een polyhistidine tag) kan mediëren.
Eén type van gederivatiseerd antilichaam wordt geproduceerd door crosslinking van twee of meer antilichamen (van hetzelfde type of 20 van verschillende types, bijv. om bispecifieke antilichamen te creëren). Geschikte crosslinkers omvatten er die heterobifunctioneel zijn, met twee verschillend reactieve groepen gescheiden door een geschikte spacer (bijv. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) of homobifunctioneel zijn (bijv. disuccinimidyl suberaat). Zulke linkers 25 zijn verkrijgbaar bij Pierce Chemical Company, Rockford, 111.
Een ander type van gederivatiseerd antilichaam is een gelabeld antilichaam. Bruikbare detectie middelen waarmee een antilichaam of antilichaam deel van de uitvinding kan worden gederivatiseerd, omvatten fluorescente verbindingen, inclusief fluoresceine, fluoresceine 30 isothiocyanaat, rhodamine, 5-dimethylamine-l-naftaleensulfonyl- 1027975 76 chloride, fycoerythrine, lanthanide fosfors en dergelijke. Een anti-lichaam kan ook worden gelabeld met enzymen die bruikbaar zijn voor detectie, zoals mierikswortel peroxidase, 8-galactosidase, luciferase, alkalisch fosfatase, glucose oxidase en dergelijke. Wanneer een 5 antilichaam wordt gelabeld met een detecteerbaar enzym, wordt het gedetecteerd door toevoegen van extra reagentia die het enzym gebruikt voor het produceren van een reactieproduct dat kan worden waargenomen. Bijv. wanneer het middel mierikswortel peroxidase aanwezig is, leidt de toevoeging van waterstofperoxide en diaminobenzidine tot een 10 gekleurd reactieproduct, dat detecteerbaar is. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met biotine, en gedetecteerd door indirecte meting van avidine of streptavidine binding. Een antilichaam kan worden gelabeld met een magnetisch middel, zoals gadolinium. Een antilichaam kan ook worden gelabeld met een voorafbepaalde polypeptide epitoop die door 15 een secondaire rapporteur wordt herkend (bijv. leucine zipper paar sequenties, bindingsplaatsen voor secondaire antilichamen, metaal bindende domeinen, epitoop tags). In sommige uitvoeringsvormen worden labels bevestigd door spacer armen van verschillende lengtes om potentiële sterische hindering te reduceren.
20 Een anti-MAdCAM antilichaam kan ook worden gelabeld met een radiogelabeld aminozuur. Het radiolabel kan voor zowel diagnostische als therapeutische doeleinden worden gebruikt. Bijv. kan het radiolabel worden gebruikt voor het detecteren van weefsels die MAdCAM tot expressie brengen, door röntgen of andere diagnostische technieken.
25 Verder kan het radiolabel therapeutisch worden gebruikt als een toxine voor ziek weefsel of MAdCAM exprimerende tumors. Voorbeelden van labels voor polypeptiden omvatten, maar zijn daartoe niet beperkt, de volgende radioisotopen of radionucliden - 3H, 14C, 15N, 35S, "Y, "Tc, min, 1251, i3il.
30 Een anti-MAdCAM antilichaam kan ook worden gederivatiseerd met een chemische groep zoals polyethyleenglycol (PEG), een methyl- of 1 027975 77 ethylgroep, of een koolhydraatgroep. Deze groepen kunnen bruikbaar zijn voor verbetering van de biologische karakteristieken van het antilichaam, bijv. om de serum halfwaardetijd te vergroten of weefsel binding te verhogen. Deze methodologie zou ook van toepassing zijn op 5 willekeurig welke antigeen bindende fragmenten of versies van anti-MAdCAM antilichamen.
Farmaceutische samenstellingen en kits
In een verder aspect verschaft de uitvinding samenstellingen die een remmend menselijk anti-MAdCAM antilichaam omvatten en 10 methoden voor behandeling van subjecten met zulke samenstellingen. In sommige uitvoeringsvormen is het subject van de behandeling een mens. In andere uitvoeringsvormen is het subject een veterinair subject. In sommige uitvoeringsvormen is het veterinaire subject een hond of een niet-menselijke primaat.
15 Behandeling kan toediening inhouden van één of meer remmende anti-MAdCAM monoklonale antilichamen van de uitvinding, of antigeen bindende fragmenten ervan, alleen of met een farmaceutisch aanvaardbare drager. Remmende anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding en samenstellingen die hen omvatten, kunnen worden 20 toegediend in combinatie met één of meer andere therapeutische, diagnostische of profylactische middelen. Additionele therapeutische middelen omvatten anti-inflammatoire of immunomodulatoire middelen. Deze middelen omvatten, zonder beperking daartoe, de topicale en orale corticosteroiden zoals prednisolon, methylprednisolon, 25 NCX-1015 of budesonide; de aminosalicylaten zoals mesalazine, olsalazine, balsalazide of NCX-456; de klasse van immunomodulatoren zoals azathioprine, 6-mercaptopurine, methotrexaat, cyclosporine, FK506, IL-10 (Ilodecakin), IL-11 (Oprelevkin), IL-12, MIF/CD74 antagonisten, CD40 antagonisten, zoals TNX-100/5-D12, OX40L 30 antagonisten, GM-CSF, pimecrolimus of rapamycine; de klasse van 1027975 78 anti-TNFa middelen zoals infliximab, adalimumab, CDP-870, onercept, etanercept; de klasse van anti-inflammatoire middelen, zoals PDE-4 remmers (roflumilast, etc), TACE remmers (DPC-333, RDP-58, etc) en ICE remmers (VX-740, etc) evenals IL-2 receptor antagonisten, zoals 5 daclizumab, de klasse van selectieve adhesie molecuul antagonisten, zoals natalizumab, MLN-02, of alicaforsen, klassen van analgetische middelen zoals, zonder beperking daartoe, COX-2 remmers, zoals rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, P/Q-type volatge senstize kanaal (α2δ) modulatoren, zoals gabapentine en pregabaline, NK-1 receptor anta-10 gonisten, cannabinoid receptor modulatoren, en delta opioid receptor agonisten, evenals anti-neoplastische, anti-tumor, anti-angiogene of chemotherapeutische middelen. Zulke additionele middelen kunnen in dezelfde samenstelling zijn opgenomen of apart worden toegediend. In sommige uitvoeringsvormen kunnen één of meer remmende anti-15 MAdCAM antilichamen van de uitvinding worden gebruikt als een vaccin of als adjuvanten voor een vaccin. In het bijzonder, aangezien MAdCAM tot expressie wordt gebracht in lymfatisch weefsel, kunnen vaccin antigenen op gunstige wijze gericht zijn op lymfatisch weefsel door conjugatie van het antigeen met een anti-MAdCAM antilichaam 20 van de uitvinding.
Zoals hierin gebruikt duidt "farmaceutisch aanvaardbare drager" op elk en alle solvents, dispersie media, coatings, antibacteriële en antifungale middelen, isotone en absorptie versterkende of vertragende middelen, en dergelijke die fysiologisch compatibel zijn. Enige voorbeel-25 den van farmaceutisch aanvaardbare dragers zijn water, zoutoplossing, fosfaatgebufferde zoutoplossing, acetaatbuffer met natriumchloride, dextrose, glycerol, Polyethyleenglycol, ethanol en dergelijke, evenals combinaties ervan. In veel gevallen zal het de voorkeur hebben dat isotone middelen, bijv. suikers, polyalcoholen zoals mannitol, sorbitol, of 30 natriumchloride in de samenstelling worden op genomen. Additionele voorbeelden van farmaceutisch aanvaardbare stoffen zijn surfactants, 1 027975 79 bevochtigingsmiddelen of ondergeschikte hoeveelheden van hulpstoffen zoals bevochtigings- of emulgeermiddelen, conserveermiddelen of buffers, die de houdbaarheid of effectiviteit van het antilichaam verhogen.
5 De samenstellingen van deze uitvinding kunnen in verscheidene vormen zijn, bijv. vloeibare, halfvaste en vaste doseringsvormen, zoals vloeibare oplossingen (bijv. injecteerbare en infuseerbare oplossingen), dispersies of suspensies, tabletten, pillen, gevriesdroogde koek, droge poeders, liposomen en zetpillen. De geprefereerde vorm hangt af van de 10 beoogde wijze van toediening en therapeutische applicatie. Typische geprefereerde samenstellingen hebben de vorm van injecteerbare of infuseerbare oplossingen, zoals samenstellingen gelijksoortig aan die welke worden gebruikt voor passieve immunisatie van mensen. De geprefereerde wijze van toediening is parenteraal (bijv. intraveneus, 15 subcutaan, intraperitoneaal, intramusculair, intradermaal). In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door intraveneuze infusie of injectie. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm wordt het antilichaam toegediend door intramusculaire, intradermale of subcutane injectie.
20 Therapeutische samenstellingen moeten typisch steriel en stabiel zijn onder de condities van bereiding en opslag. De samenstelling kan als een oplossing, gevriesdroogde koek, droog poeder, microemulsie, dispersie, liposoom, of andere geordende structuur geschikt voor hoge geneesmiddel concentratie worden geformuleerd. Steriele injecteerbare 25 oplossingen kunnen worden bereid door het anti-MAdCAM antilichaam in de vereiste hoeveelheid in een geschikt solvent op te nemen met naar behoefte één of een combinatie van hierboven opgesomde ingrediënten, gevolgd door sterilisatie. In het geval van steriele poeders voor de bereiding van steriele injecteerbare oplossingen zijn de geprefereerde 30 methoden van bereiding vacuum drogen en vriesdrogen dat een poeder van de actieve ingrediënt plus elke additionele gewenste ingrediënt uit 1027975 80 een tevoren steriele oplossing ervan oplevert. In het algemeen worden dispersies bereid door de actieve verbinding op te nemen in een steriel vehiculum dat een basis dispersie medium bevat en de vereiste andere ingrediënten uit de groep die hierboven is opgesomd. De gewenste 5 karakteristieken van een oplossing kunnen worden behouden, bijv. door het gebruik van surfactants en de vereiste partikelgrootte in het geval van een dispersie door het gebruik van surfactants, fosfolipiden en polymeren. Langere absorptie van injecteerbare samenstellingen kan worden verkregen door in de samenstelling een middel op te nemen dat 10 absorptie vertraagt, bijv. monostearaatzouten, polymere materialen, oliën en gelatine.
De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegediend door een verscheidenheid van op zichzelf bekende methoden, hoewel subcutane, intramusculaire, intradermale of intraveneuze 15 infusie voor veel therapeutische toepassingen de geprefereerde route/wijze van toediening is. Zoals de vakman zal inzien, zullen de route en/of wijze van toediening variëren afhankelijk van de gewenste resultaten.
In bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de antilichaam 20 samenstellingen worden bereid met een drager die het antilichaam zal beschermen tegen snelle afgifte, zoals een formulering met gereguleerde afgifte, inclusief implantaten, transdermale pleisters, en microcapsule afgifte systemen. Er kunnen bioafbreekbare, biocompatibele polymeren worden gebruikt, zoals etheenvinylacetaat, polyanhydriden, polyglycol-25 zuur, collageen, polyorthoesters, en polymelkzuur. Vele methoden voor de bereiding van zulke formuleringen zijn geoctrooieerd of algemeen bekend aan de vakman. Zie bijv. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Ine., New York (1978)).
30 In bepaalde uitvoeringsvormen kan een anti-MAdCAM
antilichaam van de uitvinding oraal worden toegediend, bijv. met een 1027975 81 inert verdunningsmiddel of een assimileerbare eetbare drager. De verbinding (en desgewenst andere ingrediënten) kan ook in een gelatine capsule met harde of zachte mantel worden ingesloten, tot tabletten worden gecomprimeerd, of direct in het dieet van het subject worden 5 opgenomen. Voor orale therapeutische toediening kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden geïncorporeerd met excipiënten en worden gebruikt in de vorm van in te slikken tabletten, buccale tabletten, troches, capsules, elixirs, suspensies, siropen, wafels, en dergelijke. Voor de toediening van een verbinding van de uitvinding 10 door andere dan parenterale toediening kan het nodig zijn dat de verbinding wordt gecoat met, of de verbinding wordt toegediend samen met, een materiaal om zijn inactivatie te verhinderen.
De samenstellingen van de uitvinding kunnen een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" of een "profylactisch effectieve hoeveelheid" van 15 een antilichaam of antigeen bindend deel van de uitvinding omvatten. Een "therapeutisch effectieve hoeveelheid" duidt op een hoeveelheid die effectief is, bij doseringen en gedurende tijdsperioden nodig, om het gewenste therapeutische resultaat te bereiken. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid van het antilichaam of antilichaam deel kan 20 variëren met factoren zoals de ziekte toestand, leeftijd, geslacht, en gewicht van het individu, en het vermogen van het antilichaam of antilichaam deel om een gewenste respons in het individu op te wekken. Een therapeutisch effectieve hoeveelheid is ook een hoeveelheid waarin eventuele toxische of schadelijke effecten van het 25 antilichaam of antilichaam deel door de therapeutische gunstige effecten worden overtroffen. Een "profylactisch effectieve hoeveelheid" duidt op een hoeveelheid die effectief is, bij doseringen en gedurende tijdsperioden nodig, om het gewenste profylactische resultaat te bereiken. Typisch, omdat een profylactische dosis wordt gebruikt in 30 subjecten vóór of bij een vroeger stadium van ziekte, kan het zijn dat de 1027975 82 profylactisch effectieve hoeveelheid kleiner is dan de therapeutisch effectieve hoeveelheid.
Doseringsschema's kunnen worden ingesteld om de optimale gewenste respons te verschaffen (bijv. een therapeutische of 5 profylactische respons). Bijv. kan een enkele bolus worden toegediend, kunnen verscheidene verdeelde doses worden toegediend over de tijd of kan de dosis proportioneel verminderd of verhoogd worden zoals door de behoeften van de therapeutische situatie wordt geïndiceerd. Het is vooral gunstig om parenterale samenstellingen te formuleren in de 10 vorm van een doseringeenheid voor het gemak van toediening en uniformiteit van dosering. De vorm van een doseringseenheid zoals hierin gebruikt duidt op fysisch afzonderlijke eenheden geschikt als unitaire doseringen voor de te behandelen zoogdierlijke subjecten; waarbij elke eenheid een voorafbepaalde hoeveelheid van actieve 15 verbinding bevat berekend om het gewenste therapeutische effect te verschaffen in associatie met de vereiste farmaceutische drager. De specificatie voor de vormen van de doseringseenheid van de uitvinding wordt gedicteerd door en is direct afhankelijk van (a) de unieke karakteristieken van het anti-MAdCAM antilichaam of deel ervan en 20 het gegeven therapeutische of profylactische effect dat moet worden verkregen, en (b) de beperkingen inherent aan het vakgebied van het samenstellen van een dergeüjk antilichaam voor de behandeling van gevoeligheid in individuen.
Een als voorbeeld dienend niet-beperkend bereik voor een 25 therapeutisch of profylactisch effectieve hoeveelheid van een antilichaam of antilichaam deel van de uitvinding is 0,025 tot 50 mg/kg, meer bij voorkeur 0,1 tot 50 mg/kg, meer bij voorkeur 0,1-25 mg/kg,
0,1 tot 10 mg/kg of 0,1 tot 3 mg/kg. In sommige uitvoeringsvormen bevat een formulering 5 mg/mL van antilichaam in een buffer van 30 20 mM natriumacetaat, pH 5,5, 140 mM NaCl, en 0,2 mg/mL
polysorbaat 80. Opgemerkt wordt dat waarden voor de dosering kunnen 1027 9 75 83 variëren met het type en de ernst van de te verlichten conditie. Verder zij gezegd dat voor een bepaald subject specifieke doseringsschema's over de tijd aangepast zouden moeten worden al naargelang de individuele behoefte en het professionele oordeel van de persoon die de 5 samenstellingen toedient of supervisie over de toediening uitoefent, en dat hierin gegeven doseringsbereiken slechts als voorbeeld dienen en niet bedoeld zijn om de omvang of praktijk van de geclaimde samenstelling te beperken.
Een ander aspect van de onderhavige uitvinding verschaft kits 10 omvattende een anti-MAdCAM antilichaam of antilichaam deel van de uitvinding of een samenstelling omvattende een dergelijk antilichaam. Een kit kan, naast het antilichaam of de samenstelling, diagnostische of therapeutische middelen omvatten. Een kit kan ook instructies voor gebruik in een diagnostische of therapeutische methode omvatten. In 15 een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de kit het antilichaam of een samenstelling die het omvat, en een diagnostische middel dat kan worden gebruikt in een hieronder beschreven methode. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat de kit het antilichaam of een samenstelling die het omvat, en één of meer therapeutische middelen 20 die kunnen worden gebruikt in een hieronder beschreven methode.
Gen therapie
De nucleïnezuur moleculen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegediend aan een patiënt die daaraan behoefte heeft via gen therapie. De therapie kan in vivo of ex vivo zijn. In een 25 voorkeursuitvoeringsvorm worden nucleïnezuur moleculen coderend voor zowel een zware keten als een lichte keten toegediend aan een patiënt. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm worden de nucleïnezuur moleculen zo toegediend dat ze stabiel worden geïntegreerd in chromosomen van B-cellen omdat deze cellen zijn 30 gespecialiseerd voor het produceren van antilichamen. In een 1027975 84 voorkeursuitvoeringsvorm worden precursor B-cellen getransfecteerd of geïnfecteerd ex vivo en opnieuw getransplanteerd in een patiënt die daaraan behoefte heeft. In een andere uitvoeringsvorm worden precursor B-cellen of andere cellen geïnfecteerd in vivo onder 5 gebruikmaking van een recombinant virus waarvan bekend is dat het het celtype van interesse infecteert. Typische vectoren, die worden gebruikt voor gen therapie, omvatten liposomen, plasmiden en virale vectoren. Voorbeelden van virale vectoren zijn retrovirussen, adenovirussen en adeno-geassocieerde virussen. Na infectie in vivo of ex 10 vivo kunnen antilichaam expressieniveau's worden gemonitord door een monster uit de behandeld patiënt te nemen en willekeurig welke op zichzelf bekende of hierin besproken immunoassay te gebruiken.
In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de gen therapie methode de stappen van toediening van een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul 15 coderend voor de zware keten, of een antigeen bindend deel ervan, van een anti-MAdCAM antilichaam en expressie van het nucleïnezuur molecuul. In een andere uitvoeringsvorm omvat de gen therapie methode de stappen van toediening van een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul coderend voor de lichte keten, of een antigeen bindend deel 20 ervan, van een anti-MAdCAM antilichaam en expressie van het nucleïnezuur molecuul. In een meer geprefereerde methode omvat de gen therapie methode de stappen van toediening van een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul coderend voor de zware keten of een antigeen bindend deel ervan en een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul coderend 25 voor de lichte keten of een antigeen bindend deel ervan van een anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding en expressie van de nucleïnezuur moleculen. De gen therapie methode kan ook de stap van toediening een ander anti-inflammatoir of immunomodulatoir middel omvatten.
1 0279 75 85
Diagnostische methoden van gebruik
De anti-MAdCAM antilichamen kunnen worden gebruikt om MAdCAM in een biologisch monster in vitro of in viuo te detecteren. De anti-MAdCAM antilichamen kunnen worden gebruikt in een 5 conventionele immunoassay, inclusief, zonder beperking, een ELISA, een RIA, FACS, weefsel immunohistochemie, Western blot of immunoprecipitatie. De anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding kunnen worden gebruikt voor detectie van MAdCAM bij mensen. In een andere uitvoeringsvorm kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden 10 gebruikt voor detectie van MAdCAM bij primaten van de Oude Wereld, zoals cynomolgus en rhesus apen, chimpanzees en apens. De uitvinding verschaft een methode voor detectie van MAdCAM in een biologisch monster omvattende het in contact brengen van een biologisch monster met een anti-MAdCAM antilichaam van de uitvinding en het detecteren 15 van het antilichaam gebonden aan MAdCAM. In één uitvoeringsvorm wordt het anti-MAdCAM antilichaam direct gederivatiseerd met een detecteerbaar label. In een andere uitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam (het eerste antilichaam) ongelabeld en is een tweede antilichaam of ander molecuul dat het anti-MAdCAM 20 antilichaam kan binden gelabeld. Zoals bekend aan de vakman wordt een tweede antilichaam gekozen dat in staat is specifiek te binden aan de specifieke species en klasse van het eerste antilichaam. Bijv. als het anti-MAdCAM antilichaam een menselijk IgG is, dan kan het secundaire antilichaam een anti-menselijk-IgG zijn. Andere moleculen 25 die aan antilichamen kunnen binden omvatten, zonder beperking, proteïne A en proteïne G, die beide commercieel verkrijgbaar zijn, bijv. bij Pierce Chemical Co.
Geschikte labels voor het antilichaam of secondaire zijn hierboven beschreven en omvatten verscheidene enzymen, prosthetische 30 groepen, fluorescente materialen, luminescente materialen, 1027975 86 magnetische middelen en radioactieve materialen. Voorbeelden van geschikte enzymen omvatten mierikswortel peroxidase, alkalisch fosfatase, β-galactosidase, of acetylcholinesterase; voorbeelden van geschikte prosthetische groep complexen omvatten streptavidine/biotine 5 en avidine/biotine; voorbeelden van geschikte fluorescente materialen omvatten umbelliferone, fluoresceine, fluoresceine isothiocyanaat, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluoresceine, dansyl chloride of phycoerythrine; een voorbeeld van een luminescent materiaal omvat luminol; een voorbeeld van een magnetische middel omvat gadolinium; 10 en voorbeelden van geschikte radioactieve materialen omvatten 125I, 1311, 35Sof3H.
In een alternatieve uitvoeringsvorm kan MAdCAM worden getest in een biologisch monster door een competitie immunoassay die gebruik maakt van MAdCAM standaarden gelabeld met een detecteerbare stof 15 en een ongelabeld anti-MAdCAM antilichaam. In deze assay worden het biologische monster, de gelabelde MAdCAM standaarden en het anti-MAdCAM antilichaam gecombineerd en wordt de hoeveelheid bepaald van gelabelde MAdCAM standaard gebonden aan het ongelabelde antilichaam. De hoeveelheid van MAdCAM in het biologische monster 20 is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid van gelabelde MAdCAM standaard gebonden aan het anti-MAdCAM antilichaam.
De hierboven beschreven immunoassays kunnen voor een aantal doeleinden worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden gebruikt voor detectie van MAdCAM 25 in cellen in celkweek. In een voorkeursuitvoeringsvorm kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden gebruikt om het niveau van cel oppervlak MAdCAM expressie na behandeling van de cellen met verscheidene verbindingen te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt voor het testen van verbindingen die kunnen worden gebruikt 30 voor activatie of remming van MAdCAM. In deze methode wordt één monster van cellen gedurende een tijdsperiode met een testverbinding 1027975 i 87 behandeld, terwijl een ander monster onbehandeld wordt gelaten, daarna zou celoppervlak expressie bepaald kunnen worden door middel van stroom cytometrie, immunohistochemie, Western blot, ELISA of RIA. Bovendien kunnen de immunoassays worden opgeschaald voor 5 hoge doorvoer screening om een groot aantal verbindingen te testen voor activatie of inhibitie van MAdCAM.
De anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding kunnen ook worden gebruikt om de niveau's van MAdCAM op een weefsel of in cellen afkomstig uit het weefsel te bepalen. In een uitvoeringsvorm die 10 de voorkeur heeft, is het weefsel een ziek weefsel. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is het weefsel ontstoken maagdarm-kanaal of een biopsie ervan. In een voorkeursuitvoeringsvorm van de methode wordt een weefsel of een biopsie ervan uit een patiënt uitgesneden. Het weefsel of de biopsie wordt daarna gebruikt in een 15 immunoassay ter bepaling van bijv. MAdCAM niveau's, celoppervlak niveau's van MAdCAM, of localisatie van MAdCAM door de methoden die hierboven zijn besproken. De methode kan worden gebruikt om te bepalen of een ontstoken weefsel MAdCAM op een hoog niveau tot expressie brengt.
20 De hierboven beschreven diagnostische methode kan worden gebruikt om te bepalen of een weefsel hoge niveau's van MAdCAM tot expressie brengt, wat een indicatie kan zijn dat het weefsel goed zal reageren op behandeling met anti-MAdCAM antilichaam. Verder kan de diagnostische methode ook worden gebruikt om te bepalen of 25 behandeling met anti-MAdCAM antilichaam (zie beneden) veroorzaakt dat een weefsel lagere niveau's van MAdCAM tot expressie brengt en derhalve kan worden gebruikt om te bepalen of de behandeling succesvol is.
De antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen ook 30 worden gebruikt in vivo om weefsels en organen die MAdCAM tot expressie brengen te localiseren. In een voorkeursuitvoeringsvorm 10 27975 i 88 kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden gebruikt om ontstoken weefsel te localiseren. Het voordeel van de anti-MAdCAM antilichamen van de onderhavige uitvinding is dat ze bij toediening geen immuun-respons zullen genereren. De methode omvat de stappen van toediening 5 van een anti-MAdCAM antilichaam of een farmaceutische samenstelling ervan aan een patiënt die zo'n diagnostische test behoeft en onderwerping van de patiënt aan beeldvormingsanalyse om de locatie van de MAdCAM-exprimerende weefsels te bepalen. Beeldvormingsanalyse is bekend in de medische techniek en omvat, zonder beperking, i 10 röntgen analyse, gamma scintigrafie, magnetische resonantie beeld- j
vorming (MRI), positron emissie tomografie of gecomputeriseerde tomografie (CT). In een andere uitvoeringsvorm van de methode wordt, in plaats van de patiënt aan beeldvormingsanalyse te onderwerpen, een I
j biopsie verkregen uit de patiënt om te bepalen of het weefsel van 15 interesse MAdCAM tot expressie brengt. In een voorkeursuitvoerings- j vorm kunnen de anti-MAdCAM antilichamen worden gelabeld met een j detecteerbaar middel waarvan een beeld kan worden gevormd in een ! patiënt. Bijv. kan het antilichaam worden gelabeld met een contrast i middel, zoals barium, dat kan worden gebruikt voor röntgen analyse, of 20 een magnetisch contrast middel, zoals een gadolinium chelaat, dat kan ' worden gebruikt voor MRI of CT. Andere middelen voor labeling omvatten, zonder beperking, radioisotopen, zoals "Tc. In een andere uitvoeringsvorm zal het anti-MAdCAM antilichaam ongelabeld zijn en zal een beeld worden gevormd door toediening een tweede antilichaam 25 of ander molecuul dat detecteerbaar is en dat het anti-MAdCAM antilichaam kan binden.
De anti-MAdCAM antilichamen van de uitvinding kunnen ook worden gebruikt voor het bepalen van de niveau's van oplosbaar MAdCAM aanwezig in donor bloed, serum, plasma, of andere 30 biovloeistof, inclusief, maar niet beperkt tot, stoelgang, urine, sputum of biopsie monster. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de biovloeistof 1 0279 75 89 plasma. De biovloeistof wordt daarna gebruikt in een immunoassay om niveau's van oplosbaar MAdCAM te bepalen. Oplosbaar MAdCAM zou een surrogaat merker kunnen zijn voor een voortschrijdende maagdarm ontsteking en de methode van detectie zou kunnen worden gebruikt als 5 een diagnostische merker om de ernst van de ziekte te meten.
De boven beschreven diagnostische methode kan worden gebruikt om te bepalen of een individu hoge niveau's van oplosbaar MAdCAM tot expressie brengt, wat een indicatie kan zijn dat het individu goed zal reageren op behandeling met een anti-MAdCAM antilichaam. Verder 10 kan de diagnostische methode ook worden gebruikt om te bepalen of behandeling met anti-MAdCAM antilichaam (zie beneden) of ander farmaceutische middel van de ziekte veroorzaakt dat een individu lagere niveau's van MAdCAM tot expressie brengt en kan derhalve worden gebruikt om te bepalen of de behandeling succesvol is.
15 Remming van ouP7/MAdCAM-afhankelüke adhesie door anti-MAdCAM antilichaam:
In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een anti-MAdCAM antilichaam dat MAdCAM bindt en de binding en adhesie van a4P7-integrine dragende cellen aan MAdCAM of andere verwante 20 liganden, zoals L-selectine, aan MAdCAM remt. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het MAdCAM menselijk en is het in een oplosbare vorm, of tot expressie gebracht op het oppervlak van een cel. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam een menselijk antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm remt het anti-25 lichaam of deel ervan de binding tussen oup7 en MAdCAM met een IC50 waarde van niet meer dan 50 nM. In een voorkeursuitvoeringsvorm is de IC50 waarde is niet meer dan 5 nM. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de IC50 waarde lager dan 5 nM. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de IC50 waarde lager dan 0.05 pg/mL, 30 0.04 pg/mL of 0.03 pg/mL. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm 1027975 90 is de IC50 waarde lager dan 0.5 pg/mL, 0.4 μg/ïnL of 0.3 μg/InL. De IC50 waarde kan worden gemeten door willekeurig welke op zichzelf bekende methode. Typisch kan een IC50 waarde worden gemeten door ELISA of adhesie assay. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de IC50 waarde 5 gemeten door adhesie assay onder gebruikmaking van cellen of weefsel j met natieve expressie van MAdCAM of cellen of weefsel die zijn gemodificeerd om MAdCAM tot expressie te brengen.
Remming van lvmfocvt recrutering naar darm-geassocieerd lymfatisch weefsel door anti-MAdCAM antilichamen 10 In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een anti- MAdCAM antilichaam dat natief geëxprimeerd MAdCAM bindt en de binding van lymfocyten aan gespecialiseerd lymfatisch maagdarm weefsel remt. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het natief geëxprimeerde MAdCAM menselijk of primaten MAdCAM en is het in 15 een oplosbare vorm, of tot expressie gebracht op het oppervlak van een cel. In een andere voorkeursuitvoeringsvorm is het anti-MAdCAM antilichaam een menselijk antilichaam. In een andere uitvoeringsvorm remt het antilichaam of deel ervan de recrutering van darm-trofische a4p7+ lymfocyten aan weefsels die MAdCAM tot expressie brengen met 20 een IC50 waarde van niet meer dan 5 mg/kg. In een geprefereerde uitvoeringsvorm is de IC50 waarde niet meer dan 1 mg/kg. In een meer geprefereerde uitvoeringsvorm is de IC50 waarde lager dan 0.1 mg/kg.
In één uitvoeringsvorm kan de IC50 waarde worden bepaald door bepaling van de dosis effect relatie van recrutering van technetium-25 gelabelde periferaal bloed lymfocyten naar het maagdarmkanaal onder gebruikmaking van gamma scintigrafie of enkele foton emissie gecomputeriseerde tomografie. In een een andere uitvoeringsvorm kan de IC50 waarde worden bepaald door de toename van darm-trofische α,4β7+ lymfocyten te meten, zoals, maar niet beperkt tot, CD4+ α4β7+ 30 geheugen T-cellen, in de periferale circulatie onder gebruikmaking van 1027975 91 stroomcytometrie als functie van de dosis van anti-MAdCAM antilichaam.
Opdat deze uitvinding beter kan worden begrepen, worden de volgende voorbeelden gegeven. Deze voorbeelden dienen slechts ter 5 illustratie en behoren op geen enkele wijze zo te worden geconstrueerd dat ze de omvang van de uitvinding beperken.
1027975 92 VOORBEELD 1:
Generatie van anti-MAdCAM producerende hvbridoma's
Antilichamen van de uitvinding werden bereid, getest en geselecteerd volgens het onderhavige Voorbeeld.
5 Primaire Immunogeen Bereiding:
Twee immunogenen werden bereid voor immunisatie van de XenoMouse™ muizen: (i) een MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit en (ii) cel-membranen bereid uit cellen die stabiel waren getransfecteerd met MAdCAM.
10 (i) MAdCAM-IgGi Fc Fusie-eiwit
Exnressievector constructie:
Een EcoRI/BglII cDNA fragment coderend voor het rijpe extracellulaire, immunoglobuline-achtige domein van MAdCAM werd uit een pINCY Incyte kloon (3279276) uitgesneden en gekloneerd in 15 EcoRI/BamHI plaatsen van de pIGl vector (Simmons, D. L. (1993) in
Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127)) om een in-leesraam IgGi Fc fusie te genereren. De resulterende insertie werd met EcoRI/Notl uitgesneden en gekloneerd in pCDNA3.1+ (Invitrogen). Het 20 MAdCAM-IgGi Fc cDNA in de vector werd aan de sequentie bevestigd. De aminozuursequentie van het MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit wordt hieronder getoond: MAdCAM-IgGi Fc Fusie-eiwit: 25 1027975 93 MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQ LTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLS AAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDP EVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEE 5 EPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELS HRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTT SQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGST RTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY 10 RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK ATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107) 15 Onderstreept: signaalpeptide
Vet: MAdCAM extracellulair domein
Recombinant eiwit Expressie/Zuiverine: CHO-DHFR cellen werden getransfecteerd met pCDNA3.1+ vector bevattende MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit cDNA en stabiele 20 kloons die MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit exprimeren geselecteerd in Iscove’s medium bevattende 600 pg/mL G418 en 100 ng/mL methotrexaat. Voor eiwit expressie werd een holle vezel bioreactor geënt met stabiel exprimerende MAdCAM-IgGi Fc CHO cellen in Iscove’s medium met daarin 10% laag IgG foetaal runderserum (Gibco), 25 non-essentiële aminozuren (Gibco), 2 mM glutamine (Gibco), natrium pyruvaat (Gibco), 100 pg/mL G418 en 100 ng/mL methotrexaat, en gebruikt voor het genereren van geconcentreerd medium supematant. Het MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit werd gezuiverd uit de geoogste supernatant door affiniteitschromatografie. In het kort, supematant 30 werd aangebracht op een HiTrap proteïne G Sepharose (5 mL, _1 027975 94
Pharmacia) kolom (2 mL/min), gewassen met 25 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl (5 kolom volumes) en geëlueerd met 100 mM glycine pH 2,5 (1 mL/min), met onmiddellijke neutralisatie van fracties tot pH 7,5 met 1M Tris pH 8. Fracties bevattende MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit 5 werden geïdentificeerd door SDS-PAGE, samengevoegd en aangebracht op een Sephacryl S100 kolom (Pharmacia), voor-geëquilibreerd met 35 mM BisTris pH 6,5, 150 mM NaCl. De gel filtratie werd uitgevoerd bij 0,35 mL/min, waarbij een piek werd verzameld van MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit in ca. 3 x 5 mL fracties. Deze monsters werden 10 samengevoegd en aangebracht op een Resource Q (6 mL, Pharmacia) kolom, voor-geëquilibreerd in 35 mM BisTris pH6,5. De kolom werd gewassen met 5 kolom volumes van 35 mM Bis Tris pH 6,5, 150 mM NaCl (6 mL/min) en MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit geëlueerd naar een 4-6 mL fractie met 35 mM Bis Tris pH 6,5, 400 mM NaCl. In dit 15 stadium was het eiwit 90% zuiver en het migreerde als een enkele band bij ongeveer 68 kD door SDS-PAGE. Voor gebruik als een immunogeen en alle latere assays kreeg het materiaal een buffer uitwisseling naar 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 50% glycerol en werd bewaard in porties bij -80°C.
20 (ii) Celmembranen met stabiele expressie van MAdCAM
Een Sacl/Notl fragment omvattende nucleotiden 645-1222 van de gepubliceerde MAdCAM sequentie (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156. 2851-7 (1996)) werd PCR geamplificeerd uit een eolon cDNA bibliotheek en in Sacl/Notl plaatsen van pIND-Hygro vector (Invitrogen) geklo-25 neerd. Een SacI fragment dat de additionele 5’ coderende sequentie omvat, werd gesubkloneerd in dit construct uit pCDNA3.1 MAdCAM-IgGi Fc, om het complete MAdCAM cDNA te genereren. Een KpnI/Notl fragment bevattende het MAdCAM cDNA werd daarna gekloneerd in overeenkomstige plaatsen in een pEF5FRTV5GWCAT vector 30 (Invitrogen) en met vervanging van de CAT coderende sequentie. De 1027975 95 cDNA insertie werd qua sequentie geverifieerd en in transfecties gebruikt om enkele stabiel exprimerende kloons te genereren in Flpln NIH 3T3 cellen (Invitrogen) door Flp recombinase technologie, volgens de instructies van de fabrikant. Stabiel exprimerende kloons werden 5 geselecteerd door hun vermogen om de binding te ondersteunen van een α4β7+ JY menselijke B-lymfoblastoid cellijn (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267: 8366-70 (1992)), hieronder geschetst. Stabiele kloons van CHO cellen die MAdCAM tot expressie brengen, werden op dezelfde wijze bereid, onder gebruikmaking van Flpln CHO cellen (Invitrogen). 10 MAdCAM-exprimerende Flpln NIH-3T3 cellen werden gegroeid in Dulbecco’s gemodificeerd Eagles Medium (Gibco), bevattende 2 mM L-glutamine, 10% Donor kalverserum (Gibco) en 200 pg/mL Hygromycine B (Invitrogen) en geëxpandeerd in rolflessen. MAdCAM-exprimerende Flpln CHO cellen werden gegroeid in Ham’s F12/ 15 Dulbecco’s gemodificeerd Eagles Medium (Gibco), bevattend 2 mM L-glutamine, 10% Donor kalverserum (Gibco) en 350 pg/mL Hygromycine B (Invitrogen) en geëxpandeerd in rolflessen. Cellen werden geoogst door gebruik van een niet-enzymatische cel dissociatie oplossing (Sigma) en schrapen, wassen in fosfaatgebufferde zout-20 oplossing door centrifugatie. Celmembranen werden uit de celpellet bereid door twee ronden van polytron homogenisatie in 25 mM Bis Tris pH 8, 10 mM MgCh, 0,015% (w/v) aprotinine, 100 U/mL bacitracine en centrifugatie. De uiteindelijke pellet werd geresuspendeerd in dezelfde buffer, en porties van 50x106 cel equivalenten gebracht in dikwandige 25 eppendorfs en gecentrifugeerd bij >100,000# om celmembraan pellets te genereren voor XenoMouse muizen immunisaties. Supernatant werd gedecanteerd en membranen werden in eppendorfs bij -80°C bewaard totdat ze nodig waren. Bevestiging van eiwit expressie in de celmembranen werd bepaald door SDS-PAGE en Western blotting met 30 een konijn anti-peptide antilichaam opgewekt tegen de N-terminale residuen van MAdCAM ([C]-KPLQVEPPEP).
1027975 96
Immunisatie en hvbridoma generatie:
Acht tot tien weken oude XENOMOUSE™ muizen werden intra-peritoneaal of in hun achterpootkussens geïmmuniseerd met hetzij het gezuiverd recombinant MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit (10 pg/dosis/muis), 5 hetzij celmembranen bereid uit of stabiel exprimerende MAdCAM-CHO of NIH 3T3 cellen (10x10® cellen/dosis/muis). Deze dosis werd vijf tot zeven keer over een periode van drie tot acht weken herhaald. Vier dagen vóór fusie ontvingen de muizen een laatste injectie van het extracellulaire domein van menselijk MAdCAM in PBS. Milt en 10 lymfeknoop lymfocyten uit geïmmuniseerde muizen werden met de niet-secreterende myeloma P3-X63-Ag8.653 cellijn gefuseerd en werden aan HAT selectie onderworpen, zoals eerder beschreven (Galfre en Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)). Een panel van hybridoma's, die alle MAdCAM specifieke menselijke IgG2K en IgG4K antilichamen 15 uitscheidden, werd gewonnen en gesubkloneerd. Er werden twaalf hybridoma sub-kloons, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2, die monoklonale antilichamen specifiek voor MAdCAM produceerden, gewonnen en gedetecteerd met hieronder beschreven assays. De parentale lijnen 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 20 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 en 9.8, waarvan de subkloon hybridoma lijnen, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2, afkomstig waren, hadden alle anti* MAdCAM activiteit.
ELISA assavs: 25 Detectie van antigeen-specifieke antilichamen in muizen serum en hybridoma supernatant werd bepaald door ELISA zoals beschreven (Coligan et al., Unit 2.1 "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current Protocolslinlmmunology (1994)) onder gebruikmaking van MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit voor het vangen van de antilichamen.
1 027975 97
Voor dieren die werden geïmmuniseerd met MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit, werden antilichamen gescreend voor niet-specifieke reactiviteit tegen menselijk IgGi en voor het vermogen te binden aan Flpln CHO MAdCAM cellen door stroomcytometrie.
5 In een geprefereerde ELISA assay worden de volgende technieken gebruikt: ELISA platen werden overnacht bij 4°C gecoat met 100 pL/putje van MAdCAM-IgGi Fc fusie (4,5 pg/mL) in plaat bevattende buffer (100 mM natriumcarbönaat/bicarbonaat buffer pH 9,6). Na incubatie 10 werd coating buffer verwijderd en werd de plaat met 200 pL/putje blokkeringsbuffer (5% BSA, 0,1% Tween 20, in fosfaatgebufferde zoutoplossing) geblokkeerd en gedurende 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Blokkeringsbuffer werd verwijderd en 50 pL/putje van hybridoma supernatant of ander serum of supernatant (bijv.
15 positieve controle) toegevoegd voor 2 uur bij kamertemperatuur. Na incubatie werd de plaat gewassen met PBS (3 x 100 pL/putje) en de binding van het hybridoma mAb gedetecteerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (id.w.z. 1:1000 muizen anti-menselijk IgG2-HRP (SB Cat. Nr. 9060-05) voor IgG2 antilichamen of 1:1000 muizen 20 anti-menselijk IgG4-HRP (Zymed Cat. Nr. 3840) voor IgG4 antilichamen) verdund in PBS. De platen werden 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, gewassen in PBS (3 x 100 pL/putje) en tenslotte ontwikkeld met 100 pL OPD (o-fenyleendiamine (DAKO S2405) + 5 pL 30% H2O2/I2 mL). De platen werd 10-20 minuten gegeven voor 25 ontwikkeling, de reactie werd gestopt met 100 pL 2M H2SO4. De platen werden afgelezen bij 490 nm.
Adhesie assavs:
Antilichamen die binding aan MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit vertoonden door ELISA, werden beoordeeld voor antagonist activiteit in 1027975 98 adhesie assays met cup7+ JY cellen en of (i) MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit of (ii) MAdCAM-CHO cellen.
(i) MAdCAM-IgGi Fc fusie assav 100pL van een 4.5pg/mL oplossing van gezuiverd MAdCAM-IgGi 5 Fc fusie-eiwit in Dulbecco’s PBS werd overnacht bij 4°C geadsorbeerd aan 96 putjes Black Microfluor "B" u-bodem (Dynex #7805) platen. De MAdCAM gecoate platen werden daarna omgekeerd en overmaat vloeistof weggedept, vóór blokkering bij 37°C voor ten minste 1 uur in 10% BSA/ PBS. Gedurende deze tijd gekweekte JY cellen werden geteld 10 onder gebruikmaking van tryptan blauw exclusie (zou ongeveer 8xl05 cellen/mL moeten zijn) en 20xl06 cellen/assay plaat gepipetteerd in een 50 mL centrifuge buis. JY cellen werden in RPMI1640 medium (Gibco) gekweekt, dat 2 mM L-glutamine en 10% door verhitting geïnactiveerd foetaal runderserum (Life Technologies #10108-165) bevatte en-geënt 15 bij l-2xl05/mL elke 2-3 dagen om te verhinderen dat de culture differentieert. De cellen werden twee keer gewassen met RPMI 1640 medium (Gibco) met daarin 2 mM L-glutamine (Gibco) door centrifugatie (240g), resuspenderen van de uiteindelijke celpellet bij 2xl06 cellen/mL in RPMI 1640 voor Calcein AM lading. Calcein AM 20 (Molecular Probes #C-3099) werd aan de cellen toegevoegd als een 1:200 verdunning in DMSO (co. eindconcentratie 5 μΜ) en de cellen tegen licht beschermd gedurende het verloop van de incubatie (30 min 37°C). Gedurende deze cel incubatiestap werden de te testen antilichamen als volgt verdund: voor enkele dosis tests werden de antilichamen aange-25 maakt tot 3 pg/mL (1 pg/mL finaal) in 0,1 mg/mL BSA (Sigma#A3059) in PBS; voor volledige IC50 curves werden de antilichamen verdund in 0,1 mg/mL BSA/ PBS, met 3 pg/mL (1 pg/mL finaal) als de top concentratie, daarna verdubbeling van verdunningen (1:2 verhouding) over de plaat. Het laatste putje van de rij werd gebruikt voor bepaling 30 van totale binding, dus werd O.lmg/ml BSA in PBS gebruikt.
1027975 99
Na blokkering werden de plaat inhouden afgeschud en werd 50 pL van antilichamen/controles aan elk putje toegevoegd en de plaat geïncubéerd voor 20 min bij 37°C. Gedurende deze tijd werden Calcein-beladen JY cellen eenmaal met RPMI1640 medium met daarin 10% 5 foetaal runderserum en eenmaal met 1 mg/mL BSA/PBS gewassen door centrifugatie, met resuspenderen van de uiteindelijke celpellet tot lxl06/mL in 1 mg/mL BSA/PBS. 100 pL van cellen werd aan elk putje van de plaat met U bodem toegevoegd, de plaat afgesloten, kort gecentrifugeerd (1000 rpm voor 2 min) en de plaat daarna geïncubeerd 10 voor 45 min bij 37° C. Aan het einde van deze periode werden de platen gewassen met een Skatron plaatwasser en fluorescentie gemeten onder gebruikmaking van een Wallac Victor2 1420 Multilabel Reader (excitatie λ 485nm, emissie λ 535nm telling vanaf de top, 8 mm vanaf de bodem van de plaat, voor 0,1 sec met normale emissie apertuur).
15 Voor elke antilichaam concentratie werd procent adhesie uitgedrukt als een percentage van maximale fluorescentie respons in de afwezigheid van enig antilichaam minus fluorescentie geassocieerd met niet-specifieke binding. De IC50 waarde is gedefinieerd als de anti-MAdCAM antilichaam concentratie waarbij de adhesie respons wordt verlaagd tot 20 50% van de respons in de afwezigheid van anti-MAdCAM antilichaam.
Antilichamen die de binding van JY cellen aan MAdCAM-IgGi Fc fusie konden remmen met een IC50 waarde <0,1 pg/mL, werden geacht sterke antagonist activiteit te hebben en werden doorgeleid naar de MAdCAM-CHO adhesie assay. Alle twaalf van de geteste Abs vertoonden sterke 25 antagonist activiteit (Tabel 3). Monoklonale antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 en 7.26.4 waren afgeleid van IgG2K afstammingen, en monoklonale antilichamen 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 en 9.8.2 waren afgeleid van IgG-ΐκ afstammingen.
(ii) MAdCAM-CHO cel adhesie assav.
1027975 100 JY cellen werden gekweekt zoals hierboven. CHO cellen die MAdCAM tot expressie brengen, werden gegenereerd met het pEF5FRT MAdCAM cDNA construct en met toepassing van de Flp recombinase technologie (Invitrogen) zoals hierboven beschreven. Enkele stabiele 5 kloons van MAdCAM-exprimerende CHO cellen werden geselecteerd op basis van hun vermogen om de adhesie te ondersteunen van JY cellen en de binding, door stroomcytometrie, van het konijn anti-peptide antilichaam, opgewekt tegen de N-terminus van MAdCAM en boven beschreven. MAdCAM-exprimerende CHO cellen werden gekweekt in 10 een DMEM/F12 medium (Gibco # 21331-020) dat 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum (Gibco) en 350 μg/mL Hygromycine B (Invitrogen) bevatte, waarbij elke 2/3 dagen 1:5 gesplitst werd.Voor de adhesie assay werden MAdCAM-exprimerende CHO cellen geënt bij 4xl04 cellen/putje in 96-puts zwarte platen-heldere bodem (Costar # 15 3904) in 200 pL kweekmedium en overnacht bij 37°C/5% CO2 gekweekt.
De volgende dag werd hybridoma supernatant of gezuiverd monoklonaal antilichaam vanaf een startconcentratie van 30 pg/mL (equivalent aan een eindconcentratie van 10 pg/mL) in 1 mg/mL BSA/PBS verdund, zoals hierboven beschreven. Voor de MAdCAM CHO 20 platen werden de plaat inhouden afgeschud en aan elk putje werd 50 pL van antilichamen/controles toegevoegd en de plaat geïncubeerd bij 37°C voor 20 min. Het laatste putje van de rij werd gebruikt voor bepaling van totale binding, dus werd 0,1 mg/mL BSA in PBS gebruikt. Calcein AM-beladen JY cellen, tot een eindconcentratie van lxl06/mL in 25 1 mg/mL BSA/PBS, werden bereid zoals hierboven, daarna werd 100 pL
aan de plaat toegevoegd na de 20 min incubatie periode met het antilichaam. De plaat werd daarna geïncubeerd bij 37°C voor 45 min, daarna gewassen op een Tecan plaatwasser (PW 384) en fluorescentie gemeten onder gebruikmaking van de Wallac plaat aflezer zoals boven 30 beschreven. Voor elke antilichaam concentratie werd procent adhesie uitgedrukt als een percentage van maximale fluorescentie respons in de 1 027975 101 afwezigheid van enig antilichaam minus fluorescentie geassocieerd met niet-specifieke binding. Antilichamen die de binding van JY cellen aan MAdCAM CHO cellen konden remmen met een IC50 waarde <1 pg/mL werden geacht sterke antagonist activiteit te hebben. Zoals hiervoor is 5 de IC50 waarde gedefinieerd als de anti-MAdCAM antilichaam concentratie waarbij de adhesie respons is verminderd tot 50% van de respons in de afwezigheid van anti-MAdCAM antilichaam. De IC50 sterktes voor 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2 in deze assay zijn hieronder beschreven in 10 Tabel 3.
Tabel 3. IC50 waarden van als voorbeeld getoonde anti-MAdCAM antilichamen MAdCAM lgG1 I MAdCAM Flpln Fc fusie CHO Assay
Kloon
Gem. IC50 Gem. IC50 __(pg/mL) n (pg/mL) n 1.7.2 0.030 ± 0.011 6 0.502 ± 0.280 9 1.8.2 0.027 ± 0.011 4 0.424 ± 0.107 8 7.16.6 0.019 ± 0.009 7 0.389 ± 0.093 16 7.20.5 0.025 ± 0.027 7 0.387 ± 0.202 9 7.26.4 0.021 ± 0.040 4 0.574 ± 0.099 15 10.011 ± 0.005 4 0.291 ± 0.096 6 0.018 ± 0.011 4 0.573 ±0.168 7 0.013 ± 0.008 4 0.285 ± 0.073 7 0.013 ± 0.070 4 0.298 ± 0.115 8 0.020 ± 0.010 4 0.369 ±0.103 8 0.022 ± 0.004 4 0.520 ±0.100 4 0.020 ± 0.050 4| 0.440 ± 0.342 8 lgG2^~
15 Voor het meten van de antagonist sterkte van anti-MAdCAM
mAbs in op vloeiing gebaseerde assays, onder condities van afschuif· spanning die ontworpen zijn om de microvasculaire omgeving op de 1027975 102 hoge endotheliale venules die het darm-geassocieerde lymfatische weefsel nabootsen, werden CHO cellen die MAdCAM exprimeerden, uitgeplaat op glazen microglaasjes (50 x 4 mm) en gelegenheid gegeven te hechten onder vorming van een confluente monolaag (ca. 2,5 x 105 5 cellen). De cellen werden daarna voor 20 mins bij 37°C geïncubeerd met affiniteit-gezuiverd mAb over een bereik van concentraties (0,1-10 pg/mL), voordat verbonden werd met het vloeiings assay systeem. Een aan het isotype aangepast IgG2 of IgG4 mAb (10 pg/mL) werd gebruikt als een negatieve controle. Normale donor periferaal bloed lymfocyten 10 (PBLs) werden over de cel monolaag geperfundeerd bij een constante afschuifspanning van 0,05 Pa. Experimenten werden op de video op genomen en totale adhesie van lymfocyten (rollend + stevige adhesie) werd berekend. Alle van de geteste monoklonale antilichamen bleken sterke antagonisten onder de beschreven condities.
15 (iii) Stamper-Woodruff assavs
Om MAdCAM+ vaten te visualiseren werd gebiotinyleerd anti- i MAdCAM mAb gegenereerd op 1-2 mg van affiniteit-gezuiverd eiwit, onder gebruikmaking van een 20 molaire overmaat van biotine-NHS 20 (Pierce) in fosfaatbuffer zoutoplossing, volgens instructies van de fabrikant. De reaction werd bij kamertemperatuur gelaten (30 min), en ontzout met een PD-10 (Pharmacia) kolom en de eiwitconcentratie werd bepaald.
Normale lever lymfeknoop werd verwijderd uit een donororgaan, 25 overhaast ingevroren in vloeibare stikstof en bij -70°C bewaard tot gebruik. 10 pm cryostaat secties werden gesneden, aan de lucht gedroogd op poly-L lysine gecoate glaasjes, en gefixeerd in aceton voorafgaande aan de assay. Secties werden geblokkeerd onder gebruikmaking van een avidine-biotine blokkeringssysteem (DAKO), en daarna bij kamertem-30 peratuur (2 uur) geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-MAdCAM mAb over een bereik van concentraties (1-50 pg/mL). Een aan het isotype 1027975 103 aangepast IgG2 of IgG4 mAb (50 pg/mL) werd gebruikt als een negatieve controle en een blokkerend anti-β? antilichaam (50 pg/mL) als een positieve controle.
Periferaal bloed lymfocyten, genomen uit normale donors, werden 5 gelabeld met een muizen anti-menselijk CD2 mAb (DAKO) om latere visualisatie van aanhechtende cellen mogelijk te maken. 5xl05 PBLs werden toe gevoegd aan elke lymfeknoop sectie en geïncubeerd gedurende 30 mins voordat ze voorzichtig werden afgespoeld om het loslaten van hechtende cellen te voorkomen. Secties werden daarna 10 weer in aceton gefixeerd en opnieuw geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-MAdCAM mAb (10 pg/mL), gevolgd door gebiotinyleerd geiten-anti-muizen mAb (voor herkenning van CD2 gelabelde PBLs en ongekleurde MAdCAM+ vaten) en daarna streptABcomplex/HRP (DAKO). Tenslotte werden MAdCAM+ vaten & CD2 gelabelde PBLs 15 gevisualiseerd door toevoeging van DAB substraat (DAKO) aan de secties, waarbij een bruin reactieproduct gebieden van positieve kleuring toont. Lymfocyt adhesie werd gekwantificeerd door het aantal lymfocyten hechtend aan 50 MAdCAM-l+ vaten van portaal trajecten, venen of sinusoiden te tellen. Data, uitgedrukt als gemiddelde waarden, 20 werden daarna genormaliseerd tot procent adhesie, met gebruik van de adhesie van PBLs in de afwezigheid van enig antilichaam genomen als 100%. De data werden gecompileerd op basis van n=3 verschillende PBL donors en voor verschillende lever lymfeknoop donors. Representatieve data voor gebiotinyleerde gezuiverde monoklonale 25 antilichamen 1.7.2 en 7.16.6 worden getoond in Figuur 4 vergeleken met een blokkerend anti-p? antilichaam controle.
Selectiviteit assavs: VCAM en fibronectine zijn qua structuur en sequentie nauw verwante homologen van MAdCAM. Affiniteit-gezuiverde anti-30 MAdCAM mAbs werden beoordeeld voor MAdCAM-specificiteit door 1 0279 75 104 hun vermogen om de binding te blokkeren van θ4βι+Λχδβι+ Jurkat T-cellen (ATCC) aan hun verwante cel adhesie molecuul te bepalen. lOOpL van een 4.5pg/mL oplossing van Fibronectine cel bindend fragment (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Cat. Nr. UBF4215-18) of 5 VCAM (Panvera) in Dulbecco’s PBS werd overnacht bij 4°C aan 96 puts Black Microfluor "B" u-bodem (Dynex #7805) platen geadsorbeerd. De gecoate platen werden daarna omgekeerd en overmaat vloeistof opgedept, vóór blokkering bij 37°C voor ten minste 1 uur in 10% BSA/ PBS. Gedurende deze tijd werden gekweekte Jurkat T cellen geteld 10 onder gebruikmaking van tryptan blauw exclusie en geladen met
Calcein AM kleurstof zoals eerder hierboven beschreven voor JY cellen. De te testen antilichamen werden verdund van een top concentratie van 10 μg/mL in 0,1 mg/ml BSA in PBS. Het laatste putje van de rij werd gebruikt voor bepaling van totale binding, dus werd 0,lmg/ml BSA in 15 PBS gebruikt. Echistatine (Bachem, Cat. Nr. H-9010) bereid in PBS werd gebruikt bij een top concentratie van 100 nM om de αδβ ι/Fibronectine interactie te blokkeren. Een anti-CD106 mAb (Kloon 51-10C9, BD Pharmingen Cat. Nr. 555645) bij een top concentratie van 1 μg/mL werd gebruikt om de ouPi/VCAM interactie te blokkeren.
20 Na blokkering werden de plaat inhouden afgeschud en werd 50 μΐ^ van antilichamen/controles aan elk putje toegevoegd en de plaat bij 37°C voor 20 min geïncubeerd. Calcein-beladen Jurkat T cellen werden zoals tevoren eenmaal gewassen, met resuspenderen van de uiteindelijke cel pellet tot lxl06/mL in 1 mg/mL BSA/PBS. 100 pL van 25 cellen werd toegevoegd aan elk putje van de plaat met U bodem, de plaat afgesloten, kort gecentrifugeerd (1000 rpm voor 2 min) en de plaat daarna bij 37° C voor 45 min geïncubeerd. Aan het einde van deze periode werden de platen gewassen met een Skatron plaatwasser en fluorescentie gemeten onder gebruikmaking van een Wallac Victor2 30 1420 Multilabel Reader (excitatie λ 485nm, emissie λ 535nm telling vanaf de top, 8 mm vanaf de bodem van de plaat, voor 0,1 sec met _1 0279 75_ 105 normale emissie apertuur). Voor elk antüichaam wordt de mate van remming hieronder in beeld uitgedrukt, in Tabel 4 (- verwaarloosbare inhibitie van adhesie, *** complete inhibitie van adhesie). Alle als voorbeeld getoonde mAbs zijn krachtige en selectieve anti-MAdCAM 5 antagonisten, die substantieel grotere dan 100 voudige selectiviteit voor MAdCAM t.o.v. VCAM en fibronectine vertonen.
Tabel 4. Vergelijkende selectiviteit van anti-MAdCAM antilichaam voor MAdCAM t.o.v. andere cel adhesie moleculen. Fibronectine en VCAM
Inhibition in Inhibition in Inhibition in
Clone αδβΙ/Fibronectin <x4p1/VCAM assay α4β7/ΜΑ(10ΑΜ __assay (10 μ9/ιηΙ.) (10 μg/mL) assay (0.1 μο/ητιΙ.) 1.7.2 - - *** 1.8.2 - - **♦ 7.16.6 - - *** 7.20.5 - - *** 7.26.4 - - *** è.1A.‘2^' - - *** 6>22.2f - - *** .6^r%= - - *** iBllI - *** - - *** 6riK7-ir, - - *** fellll__ l - I .*♦*_ pjGT^ 10
Hybridoma's werden gedeponeerd in de European Collection of Cell Cultures (ECACC), H.P.A te CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG op 9 sept. 2003 met de volgende depotnummers: 10279 75 106
Hvbridoma Depot Nr.
1.7.2 03090901 1.8.2 03090902 5 6.14.2 03090903 6.22.2 03090904 6.34.2 03090905 6.67.1 03090906 6.73.2 03090907 10 6.77.1 03090908 7.16.6 03090909 7.20.5 03090910 7.26.4 03090911 9.8.2 03090912 15 VOORBEELD II:
Bepaling van affiniteitsconstanten (Ka) van volledig menseliike Anti-MAdCAM monoklonale antilichamen door BIAcore
We voerden affiniteitsmetingen uit van gezuiverde antilichamen door oppervlak plasmon resonantie met gebruikmaking van het BIAcore 20 3000 instrument, volgens de protocols van de fabrikant.
Protocol 1
Voor het uitvoeren van kinetische analyses werd een hoge dichtheid muis anti-menselijk (IgG2 en IgG4) antilichaam oppervlak op een CM5 BIAcore sensor chip bereid gebruikmakend van routine amine 25 koppeling. Hybridoma supernatanten werden verdund 10, 5, 2-voudig in HBS-P (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Surfactant P20) loopbuffer die 100 pg/mL BSA en 10 mg/mL carboxymethyldextran bevat of netto gebruikt. Elk mAb werd gevangen op een apart oppervlak _1 0279 75_ 107 onder gebruikmaking van een 1 min contacttijd en 5 min wassen voor stabilisatie van de mAb basislijn. MAdCAM-IgGi Fc (141 nM) fusie-eiwit werd daarna geïnjecteerd over alle oppervlakken voor één minuut, gevolgd door een 3 min dissociatie. De data werden genormaliseerd voor 5 de hoeveelheid van antilichaam die op elk oppervlak was gevangen en geëvalueerd met globale fit Langmuir 1:1, met gebruik van basislijn verloop modellen verkrijgbaar op de BIAevaluation software geleverd door BIAcore.
Protocol 2 10 Affiniteit-gezuiverde mAb werden geïmmobiliseerd op de dextran laag van een CM5 biosensor chip gebruikmakend van amine koppeling.
Chips werden bereid onder gebruikmaking van pH 4,5 acetaatbuffer als de immobilisatiebuffer en eiwit dichtheden van 2,5-5,5 kRU werden bereikt. Monsters van MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit in loopbuffer 15 werden bereid met concentraties variërend van 0,2-55 nM (er werd een 0 nM oplossing die alleen loopbuffer omvatte ingesloten als een nul referentie). Monsters werden willekeurig gemaakt en in duplo geïnjecteerd voor 3 min elk over 4 vloeiingscellen onder gebruikmaking van HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 20 0,005% Surfactant P20) als loopbuffer. Er werd een vloeisnelheid van 100 μΕ/ιηϊη gebruikt om massa transport beperkingen te minimaliseren. Dissociatie van MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit werd gemonitord voor 180 mins, het oppervlak geregenereerd door een 6 sec injectie van 25 mM H3PO4 (50 nL/min), of 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 25 6.77.1) tot 25 mM (6.34.2) en 45 mM NaOH (6.14.2) en de data geanalyseerd onder gebruikmaking van het BIAevaluation (v3.1) software pakket.
Tabel 5 somt de affmiteitsmetingen op voor representatieve anti-MAdCAM antilichamen van de onderhavige uitvinding: 1027975 --------- ---- 108
Tabel 5. Bepaling van affiniteitsconstant. Kh. door oppervlak plasmon resonantie (BIAcore)
Protocol 1 Protocol 2 CLONE kon (1/Ms) kpff(l/s) I (pM) ^on (1/MS) I kpffd/s) |KD(pM) 1.7.2 2.4 x105 IxlO*5 42 5.5 x103 1.3 x10'7 23.6 1.8.2 2.9 x105 1 x 10® 35 1.8 x 105 2.3x10® 128 7.16.6 1.5 x106 2.2X10"6 1.5 2.9 x 105 1.4x10-® 4.8 5 7.20.5 4.5x10® 1.9x10-® 42.2 1.6x10® 1.2 x 10"® 75 7.26.4 9.6x10® 2.6 x 10"4 271 1.5x10® 1.2x10 ® 80 H 1.3x10® 1x10’5 7.7 5x 10® <5x10-® <10 1.5x10® 1.4 x10"5 9.3 2.3x10® 8.7 x10'7 3.8 l2x1°6 1·9χ10'5 15.8 3.3x10® <5x10-® <15 5.9x10® 1x10® 17 2.4x10® <5x10-® <20 1.4x10® 1.3x10'4 93 Ί.5 x Ί0® 1x10"® 6.7 flÉlBref 2.3x10® 2.3 x IQ-4 100 4.4x 10® 1.4x10'® 32.5 10 lgG2
De kinetische analyses geven aan dat de antilichamen bereid volgens de uitvinding hoge affiniteiten en sterke bindingsconstanten voor het extracellulaire domein van MAdCAM bezitten.
15 VOORBEELD III:
Identificatie van epitoop selectiviteit en species kruis-reactiviteit van anti-MAdCAM mAhs j
Antilichamen herkennen aan het oppervlak blootliggende epitopen op antigenen als regio's van lineaire (primaire) sequentie of 20 structurele (secondaire) sequentie. Luminex epitoop opberging, BIAcore opberging en species immunohistochemische analyse werden gebruikt in vereniging teneinde het functionele epitoop landschap van de anti-MAdCAM antilichamen te definiëren.
102797b 109
Op Luminex gebaseerde enitoon opberging:
MxhlgG 2,3.4-geconjugeerde kralen (Calbiochem Ml 1427) werden aan het primaire onbekende anti-MAdCAM antilichaam gekoppeld. We voegden 150 pL van primaire onbekende antilichaam 5 verdunning (0,1 pg/mL verdund in hybridoma medium) toe aan het putje van een 96-puts plaat voor weefselkweek. De kralenvoorraad werd voorzichtig gevortext en verdund in supernatant tot een concentratie van 0,5 x 105 kralen/mL. De kralen werden op een schudder overnacht in het donker bij 4°C geïncubeerd in de supernatant.
10 Elk putje van een 96-puts microtiter filterplaat (Millipore # MABVN1250) werd voorbevochtigd door 200 pL wasbuffer (PBS dat 0,05% Tween20 bevat) toe te voegen en verwijderd door opzuiging. Daarna werd 50 pL/putje van de 0,5 x 105 kralen/mL voorraad aan de filterplaat toegevoegd, en werden de putjes gewassen met wasbuffer 15 (2 xlOO pL/putje). 60 pL/putje van MAdCAM-IgGi Fc antigeen verdund in hybridoma medium (0,1 pg/mL) werd toegevoegd. De platen werden afgedekt en één uur bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden geïncubeerd. De putjes werden twee keer gewassen door toevoeging van 100 pL/putje wasbuffer gevolgd door opzuiging. Daarna voegden we 20 60 pL/putje van secondair onbekend anti-MAdCAM antilichaam
verdund in hybridoma medium (0,1 pg/mL) toe. De platen werden bij kamertemperatuur in het donker voor twee uur geschud. Vervolgens werden de putjes twee keer gewassen door toevoeging van 100 pL/putje wasbuffer gevolgd door opzuiging. Dan werd 60 pL/putje van 25 gebiotinyleerd MxhlgG 2,3,4 (0,5 pg/mL) toegevoegd. De platen werden bij kamertemperatuur in het donker voor één uur geschud. De putjes werden twee keer gewassen door toevoeging van 100 pL/putje wasbuffer gevolgd door opzuiging. Aan elk putje werd 60 pL van 1 pg/mL MxhlgG
2,3,4 Streptavidine-PE (Pharmacia #554061) verdund in hydridoma 30 medium toegevoegd. De platen werden in het donker voor twintig 1-0279 110 minuten bij kamertemperatuur geschud. De putjes werden twee keer gewassen door toevoeging van 100 pL/putje wasbuffer gevolgd door opzuiging. Daarna werd elk putje in 80 pL blokkeringsbuffer (PBS met 0,5% runderserum albumine, 0,1% TWEEN en 0,01% Thimerosal) 5 geresuspendeerd zorgvuldig op en neer gepipetteerd om de kralen te resuspenderen.
Onder gebruikmaking van Luminex 100 en de bijbehorende software (Luminex® Corporation) werden de platen afgelezen om de luminescentie aflezingen vast te stellen. Gebaseerd op de luminescentie 10 data verkregen voor de verscheidene anti-MAdCAM antilichamen die werden getest, werden de anti-MAdCAM antilichamen gegroepeerd volgens hun bindingsspecificiteiten. De anti-MAdCAM antilichamen die werden getest vallen in een reeks van epitoopbakken, weergegeven in Tabel 8.
15 BIAcore opberging:
In een soortgelijke methode als boven beschreven, kan BIAcore ook worden gebruikt voor bepaling van de epitoop exclusiviteit van de anti-MAdCAM antilichamen die als voorbeeld zijn getoond door deze 20 uitvinding. Negen anti-MAdCAM antilichaam kloons, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 en 7.16.6, werden met gebruik van amine koppeling op de dextran laag van aparte vloeiingscellen van een CM5 biosensor chip geïmmobiliseerd. De immobilisatiebuffer was of 10 mM acetaatbuffer pH 4,5 (kloons 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 25 7.26.4 en 7.16.6) of 10 mM acetaatbuffer pH 5,5 (kloons 6.67.1 en 6.77.1). Een eiwit dichtheid van ongeveer 3750 RU werd bereikt in alle gevallen. Deactivatie van N-hydroxysuccinimide esters die niet hadden gereageerd, werd uitgevoerd met gebruikmaking van 1 M ethanolamine hydrochloride, pH 8,5. MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit werd verdund tot 30 een concentratie van 1,5 pg/mL (ongeveer 25 nM) in HBS-EP loopbuffer (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Polysorbaat 1027975 111 20). Het werd daarna geïnjecteerd over de eerste vloeicel, in een volume van 50 pL met een snelheid van 5 pL/min. Nadat de injectie compleet was, werd de eerste antilichaam probe toegevoegd aan dezelfde vloeicel. Alle test antilichamen werden verdund tot een concentratie van 5 ongeveer 20 pg/mL in HBS-EP, en ook geïnjecteerd in een volume van 50 pL met een vloeisnelheid van 5 pL/min. Wanneer geen binding van het test antilichaam werd waargenomen, werd de volgende test kloon onmiddellijk daarna geïnjecteerd. Wanneer wel binding optrad, werd het sensor oppervlak geregenereerd om zowel het MAdCAM-IgGi Fc 10 fusie-eiwit als het test antilichaam te verwijderen. Er werden verscheidene regeneratie oplossingen gebruikt afhankelijk van het geïmmobiliseerde antilichaam en het aanwezige test antilichaam. Een samenvatting van de gebruikte regeneratie condities is afgebeeld in Tabel 6.
15
Tabel 6. Samenvatting van regeneratie condities gebruikt voor het uitvoeren van BIAcore enitoop manning
Geïmmobiliseerd Te verwijderen Regeneratie Injectie antilichaam antilichaam oplossing volume probe
7.16.6 6.22.2 40 mM Fosforzuur 20 pL
6.34.2 40 mM Fosforzuur 40 pL
7.20.5 40 mM Fosforzuur 20 pL
6.77.1 9.8.2 40 mM Fosforzuur 10 pL
1.7.2 40 mM Fosforzuur 5 pL
7.16.6 40 mM Fosforzuur 10 pL
1.7.2 6.77.1 25 mM Fosforzuur 5 pL
9.8.2 25 mM Fosforzuur 5 pL
7.20.5 25 mM Fosforzuur 5 pL
6.22.2 25 mM Fosforzuur 5 pL
102797b 112
6.34.2 25 mM Natrium- 5 pL
__hydroxide__ 6.67.1 25 mM Natrium- 5 μΐ, __,___hydroxide__
6.22.2 9.8.2 25 mM Natrium- 20 pL
__hydroxide__
7.26.4 25 mM Natrium- 5 pL
___hydroxide__
6.34.2 9.8.2 25 mM Natrium- 70 pL
__hydroxide__
1.7.2 40 mM Natrium- 5 pL
__hydroxide__
7.26.4 40 mM Natrium- 5 pL
____hydroxide__
6.67.1 9.8.2 40 mM Natrium- 5 pL
__hydroxide__
1.7.2 40 mM Natrium- 5 pL
___hydroxide__
7.20.5 9.8.2 25 mM Fosforzuur 5 pL
1.7.2 25 mM Fosforzuur 5 pL
7.26.4 25 mM Fosforzuur 5 pL
7.26.4 9.8.2 40 mM Natrium- 20 pL
__hydroxide__
6.22.2 75 mM Fosforzuur 20 pL
7.20.5 75 mM Fosforzuur 20 pL
7.16.6 75 mM Fosforzuur 20 pL
9.8.2 9.8.2 25 mM Fosforzuur 15 pL
6.22.2 25 mM Fosforzuur 10 pL
7.20.5 25 mM Fosforzuur 20 pL
7.16.6 25 mM Fosforzuur 10 pL
(Vloeisnelheid was 50 pL/min gedurende alle regeneratie procedures)
Na regeneratie werd MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit opnieuw gebonden en werden verdere test antilichamen geïnjecteerd. Deze 5 procedures werden uitgevoerd totdat het gehele panel van kloons was geïnjecteerd over het oppervlak van het geïmmobiliseerde antilichaam, met gebonden MAdCAM-IgGi Fc fusie-eiwit. Een nieuwe vloeicel met 1027975 113 een verschillend geïmmobiliseerd antilichaam en gebonden MAdCAM werd daarna gebruikt voor probe-onderzoek met de negen test kloons. Anti-MAdCAM antüichamen 1.7.2 en 1.8.2 werden verwacht dezelfde MAdCAM epitoop te herkennen, gebaseerd op de nauwe primaire 5 aminozuur sequentie homologie van hun zware en kappa lichte ketens, resp. SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8. Dienovereenkomstig werd slechts 1.7.2 beoordeeld door de BIAcore respons matrix. Antilichamen 6.14.2 en 6.73.2 werden uit deze analyse weggelaten, maar alle andere combinaties van anti-MAdCAM antilichaamparen werden op deze wijze getest. 10 Een willekeurig niveau van 100 RU werd gekozen als de drempel tussen binding/niet-binding en er werd een respons matrix, (Tabel 7) gecreëerd op de basis of binding werd waargenomen.
1 o 27 9 75 ----------
X
φ ρΩ Ο
U
ft J5 X X ' X X X X X |li| S * x ' · χ · ' Β ' 'g X X X X X I * · Ο QO X X X X X · y g § ' ' 1 ' Μ Μ Μ M & | ^ ^ ' ' ' IS1 * * 1 1 ft § S Λ ^ ·Γ 'o ö § ^ 1 ' 1 'XX' ' f3 ® 5 1 »1 | ê fl φ m 1 Br · ' χ χ χ X * ö 'g .¾ «D lil .2 |
Ja 'Ö d Ö § § 2 H s & § t» I» M________8 g § ^ Ί2 Φ *H ^ £ £ 4» fi O £ 8 φ d ^ SJ3 H i3 S «. «. Γί ^ Ν N « .al
ffl 45 71 Φ »h S
O .2 NMttl*N.iN H -e .9 g 5 e «.«5 <e i-' 05 ^ t-* ;ι>* g f| S β GQ Êj t> :-h cö ö 2 ^-, <D o 85 | ° | -g
« L-J—......I l I l -I.............. -1 3, S
_1 02 79 75___ 115
De matrix diagonaal in Tabel 7 (grijze schaduw) bevat de bindings data voor identieke probe paren. In alle gevallen, behalve voor de twee kloons 7.16.6 en 9.8.2, waren de antilichamen zelf-blokkerend.
5 Antilichamen 7.16.6 en 9.8.2 vertonen geen kruiscompetitie. Het niet optreden van zelf-blokkering zou een gevolg kunnen zijn van een mAb-geïnduceerde conformationele wijziging in het fusie-eiwit die additionele binding van het mAb aan een tweede plaats op MAdCAM-IgFc toestaat.
10
Groepering van de kloons die hetzelfde reactiviteitspatroon laten zien, geeft aanleiding tot ten minste zes verschillende epitoopbakken, zoals getoond in de grafische weergave, Figuur 5).
15 Verdere preciese identificatie van de MAdCAM epitoop sequenties waarmee een anti-MAdCAM antilichaam wisselwerkt, kan worden bepaald door elke van een aantal methoden, inclusief, maar niet daartoe beperkt, Western analyse van gespotte peptide bibliotheek arrays (Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. en Immunol 243: 23-36 20 (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag ,
Berlin), faag of bacterieel flagelline/fliC expressie bibliotheek display, of simpele MALDI-TOF analyse van gebonden eiwit fragmenten na beperkte proteolyse.
Immunohistoehemische assavs: 25 OCT of in sucrose ingebedde ingevroren weefsel monsters van ileum (lapjes van Peyer), mesenterische lymfeknoop, milt, maag, duodenum, jejunum en colon werden gebruikt als positieve kleuring controles voor de anti-MAdCAM mAbs. Voor kleuring van menselijke secties met menselijk IgG2 mAbs werden gebiotinyleerde derivaten van 30 de anti-MAdCAM mAbs gegenereerd. 10 pm ingevroren weefselsecties 1027975 116 werden gesneden op poly L-lysine gecoate glaasjes, direct in 100% aceton geplaatst bij 4°C (10 min), daarna 3% waterstofperoxide in methanol (10 min), wassen tussen stappen met PBS. De glaasjes werden geblokkeerd met Biotin Blocking System (DAKO Cat. Nr.
5 X0590), vóór incubatie met het primaire antilichaam (1:100 -1:1000) in PBS (1 uur), gewassen met PBS-Tween 20 (0,05%) en daarna binding ontwikkeld met HRP-Streptavidine (BD Bioscience Cat. Nr.550946, 30 min) en DAB substraat (Sigma Cat. Nr. D5905). Voor IgG4 mAbs werd een HRP-geconjugeerd, muis anti-menselijk IgG4 (Zymed Cat. Nr. 10 3840) secondair gebruikt. De glaasjes werden tegengekleurd met
Mayer’s Haemalum (1 min), gewassen en daarna in DPX gezet.
Bindingsaffiniteit werd vergeleken voor een aantal species (muis, rat, konijn, hond, varken, cynomolgus en menselijk weefsel). Er was geen reactiviteit voor ratten-, konijnen- en varkensweefsel door 15 immunohistochemie en geen kruis-reactiviteit van de anti-MAdCAM antilichamen voor recombinant muis MAdCAM, wanneer geanalyseerd door ELISA. De data voor menselijk, cynomolgus en hondenweefsel worden gepresenteerd in tabelvorm, Tabel 8 hieronder: 1 027975 117 i
Tabel 8. Patroon van kruisre activiteit van anti-MAdCAM antilichamen voor MAdCAM species orthologen __ IHC kruisreactlvlteit
Luminex mens cyno marmoset hond KLOON BIN ileum ileum tleum ileum 1.7.2 3a 3a 2b 3b _
Ifpiii PH·· fe 5 ,,d mam 6.7-3T2 3 ^·η£] n.d 7 ^B··* «·< ^__ lgG2 UïeenBtou^^^l n.d. niet bepaald 5
Anti-MAdCAM binding aan gespecialiseerde endotheliale structuren en lymfatisch weefsel wordt aangegeven door de schaduwen, volgens de sleutel. De epitoopbak gebaseerd op Luminex epitoop analyse en het patroon van MAdCAM kruisreactiviteit zijn voor elk 10 antilichaam aangegeven. Luminex epitoop opbergingsdata voor anti-MAdCAM antilichamen 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.3 en 6.77.1 (schuingedrukt) werden afgeleid uit aparte experimenten dan die voor 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2 (vet type), zoals door het verschil in font karakter is aangegeven.
15 Alle anti-MAdCAM antilichamen die getest werden, hadden het vermogen om een menselijke MAdCAM epitoop, tot expressie gebracht op vaatendotheliale compartimenten van het maagdarmkanaal te 1027975 118 herkennen. Afgezien van 1.7.2 en 1.8.2, waren alle andere anti-MAdCAM antilichamen die getest werden in staat om specifiek de vaatendotheliale compartimenten van het cynomolgus maagdarmkanaal te binden. Bepaalde andere anti-MAdCAM 5 antilichamen, namely 6.14.2 en 6.67.1 hadden ook het vermogen om specifiek de hond MAdCAM ortholoog alsmede cynomolgus MAdCAM te herkennen.
Generatie van een functioneel actieve chimaere cvnomolgus/menseliik MAdCAM-exprimerfinde CHO cellijn :
10 De verschillen in bindingsaifiniteit van bepaalde anti-MAdCAM
antilichamen voor menselijk en cynomolgus MAdCAM hebben ons doen bepalen of een structurele basis voor deze waarneming kon worden gemaakt. Gebaseerd op de gepubliceerde aminozuursequentie voor Makaak MAdCAM (Shyjan AM, et al., J Immunol, 156, 2851-7 (1996)), 15 werden primers ontworpen voor PCR amplificatie van de cynomolgus MAdCAM oc4p7 bindingsdomein sequentie. Totaal RNA werd bereid uit ingevroren uitgesneden cynomolgus mesenterische lymfeknoop (ca.
200 mg) onder gebruikmaking van de Trizol methode (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. 1-2 pg werd met oligo-dT 20 geprimed en aan reverse transcriptie onderworpen met AMV reverse transcriptase (Promega). Een deel van het door reverse transcriptie verkregen product werd onderworpen aan PCR met voorwaartse 5’-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3’ (SEQ ID NO: 67) en achterwaartse 5’-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3’ (SEQ ID NO: 68) primers 25 met GC-2 polymerase in 1M GC smelt (Clontech) en bij een annealing temperatuur van 62°C. Een RT-PCR product van de geschikte grootte werd uitgesneden en gezuiverd uit een 1% agarose gel na elektroforese, daarna TOPO-TA gekloneerd (Invitrogen) tussen EcoRI plaatsen van pCR2.1. De insertie werd aan de hand van de sequentie bevestigd. De 1 02 79 75 119 nucleotide en voorspelde, door middel van translatie verkregen aminozuursequenties worden getoond in resp. SEQ ID NOS 49 en 50.
Dé voorspelde menselijke en cynomolgus MAdCAM aminozuursequenties voor het <m$i bindingsdomein vertonen een hoge mate van 5 sequentie identiteit (90.8%) bij uitlijning (Figuur 3 verschaft deze sequentie uitlijning). Om een functioneel actieve cynomolgus MAdCAM-exprimerende cellijn te genereren, die het anti-MAdCAM bindings-patroon weergegeven door Tabel 8 nabootste, werd een SacI fragment corresponderend met de cynomolgus oi4p7 bindingsdomein sequentie in 10 pCR2.1 direct gesubkloneerd in het C-terminale menselijk MAdCAM pIND-Hygro construct bevattende carboxyl-terminaal mucine steel en transmembraan domein, dat hierboven is beschreven. De sequentie en oriëntatie werden geverifieerd, daarna werd een KpnI/Notl fragment gekloneerd in pEF5FRTV5GWCAT vector (Invitrogen), met vervanging 15 van de CAT coderende sequentie en gebruikt in transfecties voor het genereren van enkele stabiel exprimerende kloons in Flp In CHO cellen (Invitrogen), volgens de instructies van de fabrikant.
De binding van anti-MAdCAM antilichaam kloons aan de CHO cellen die cynomolgus/menselijk MAdCAM chimaera exprimeren, werd 20 beoordeeld door stroomcytometrie en de functionele activiteit van anti-MAdCAM antilichamen werd bepaald onder gebruikmaking van een zeer soortgelijke JY cel adhesie assay als boven is beschreven. De binding en functionele activiteit van anti-MAdCAM antilichamen worden uitgedrukt in Tabel 9.
25 1 0279 75 120
Tabel 9. Correlatie tussen de functionele activiteit in de cynomolgus/ mens MAdCAM-CHO/JY adhesie assay en mens en cynomolgus/mens MAdCAM CHO cel binding, als gemeten door FACS, voor een bereik van anti-MAdCAM antilichamen.
5
Functi- FACS binding oneel IC50 " ,,, _ . ... mens cyno/mens KLOON (ug/mL) _ _ inactief 7.26.4 lgG2
Tezamen genomen is er een goede correlatie tussen het vermogen van een gegeven anti-MAdCAM antilichaam te binden aan menselijk of cynomolgus MAdCAM, zoals gedetecteerd door immunohistochemie 10 (Tabel 8), met recombinant cel-gebaseerde binding en functionele activiteit (Tabel 9). Anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2, 1.8.2 en 6.73.2, bijv., vertoonden een consistent ontbreken van binding aan cynomolgus weefsel en cellen die een chimaer cynomolgus/menselijk MAdCAM eiwit exprimeren. Anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2, 1.8.2 en 6.73.2 hadden 15 ook niet het vermogen om functionele blokkeringsactiviteit in de cynomolgus/menselijk MAdCAM/JY adhesie assay te detecteren.
1027975 121
Soortgelijke benaderingen konden worden gebruikt om de epitoop te definiëren van de anti-MAdCAM antilichamen 6.14.2 en 6.67.1 die honden MAdCAM herkennen.
VOORBEELD IV: 5 Gebruik van anti-MAdCAM mAbs in de detectie van circulerend oplosbaar MAdCAM als een methode van ziekte diagnose
Anti-MAdCAM antilichamen kunnen worden gebruikt voor de detectie van circulerend oplosbaar MAdCAM (sMAdCAM). Detectie van sMAdCAM in klinisch plasma, serummonsters of andere biovloeistoffen, 10 zoals, zonder beperking daartoe, stoelgang, urine, sputum, zal waarschijnlijk een bruikbare surrogaat ziekte biomerker zijn voor de daaraan ten grondslag liggende ziekte, inclusief, zonder beperking daartoe, ontstoken-darm ziekte.
Op basis van de epitoopopbergings data (Tabellen 7 en 8), blijken 15 anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2 en 7.16.6 verschillende epitopen op menselijk MAdCAM te herkennen. ELISA platen werden overnacht bij 4°C met 100 pL/putje van een 50 pg/mL oplossing van 1.7.2 in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gecoat. Na incubatie werd de plaat voor 1,5 uur geblokkeerd met een PBS blokkeringsbuffer bevattende 10%
20 melk (200 pL/putje). Na incubatie werd de plaat gewassen met PBS
(2 x 100 pL/putje) en seriëleverdunningen van MAdCAM-IgGl-Fc fusie-eiwit, van een top concentratie van 50 pg/mL naar beneden tot ongeveer 5 ng/mL in PBS, tot een eindvolume van 100 pL, werden aan de plaat toegevoegd voor incubatie van 2 uur bij kamertemperatuur. In een 25 soortgelijke aanpak kan het MAdCAM-IgGl-Fc eiwit worden verdund in plasma of serum, of sommige andere van zulke relevante biovloeistoffen en gebruikt om de expressie van oplosbaar MAdCAM in een klinisch monster te bepalen, zoals hieronder beschreven. Als een negatieve controle werd slechts buffer toegevoegd aan de putjes die het 1027975 122 primaire anti-MAdCAM antilichaam bevatten. Na deze tijd werd de plaat gewassen met PBS (3 x 100 pL/putje) en werd de plaat daarna geïncubeerd in het donker met een Alexa488-gelabeld 7.16.6 (100 pL, 5 pg/mL). Het Alexa488-gelabeld 7.16.6 werd gegenereerd onder 5 gebruikmaking van een commercieel verkrijgbare kit (Molecular Probes, A-20181), volgens protocols van de fabrikant.
De plaat werd gewassen met PBS bevattende 0,05% Tween-20, en binding van gelabeld 7.16.6 aan gevangen oplosbaar MAdCAM bepaald door meting van de fluorescentie (Wallac Victor2 1420 Multilabel 10 Reader, excitatie λ 485nm, emissie λ 535nm telling van de top, 3 mm van de bodem van de plaat, voor 0,1 sec met normale emissie apertuur). Wanneer fluorescentie als een functie van de concentratie van MAdCAM-IgGl-Fc fusie-eiwit wordt uitgezet, Figuur 6, geeft deze aan dat 1.7.2 en een gelabeld 7.16.6 voor diagnostische doeleinden kunnen 15 worden gebruikt om het niveau te bepalen van circulerend oplosbaar MAdCAM dat tot expressie is gebracht in een biovloeistof of klinisch monster. Deze sandwich ELISA aanpak is niet beperkt tot het gebruik van 1.7.2 en 7.16.6, maar elke combinatie van anti-MAdCAM antilichamen die verschillende epitopen op MAdCAM herkennen, zoals 20 geschetst door de data en interpretatie van tabel 7 en Figuur 5. Soortgelijke strategieën zouden kunnen worden toegepast op de ontwikkeling van soortgelijke assays, zoals immunohistochemie en Western Blot, met de andere anti-MAdCAM antilichamen die zijn beschreven, onder gebruikmaking van verschillende partners, varianten, labels, etc.
1027975 123 VOORBEELD V:
Aminozuur structuur van anti-MAdCAM mAhs bereid volgens de uitvinding
In de volgende discussie wordt structurele informatie met 5 betrekking tot de anti-MAdCAM mAbs, bereid volgens de uitvinding, verschaft.
Voor het analyseren van structuren van mAbs geproduceerd volgens de uitvinding, hebben we de genen gekloneerd coderend voor de zware en lichte keten fragmenten uit de specifieke hybridoma kloon.
10 Gen klonering en sequentiebepaling werden als volgt uitgevoerd:
Poly(A)+ mRNA werd geïsoleerd uit ongeveer 2xl05 hybridoma cellen afkomstig van geïmmuniseerde XenoMouse muizen onder gebruikmaking van Fast-Track kit (Invitrogen). De vervaardiging van cDNA met random primers werd gevolgd door PCR. Menselijk VH of Vk 15 familie specifieke primers (Marks et al., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes’;
Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)) of een universele menselijke VH primer, MG-30 (5’-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEQID 20 NO: 108) werd gebruikt tezamen met primers die specifiek waren voor de menselijke Cy2, MG40-d (5’-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEQ ID NO: 109) of Cy4 constante regio, MG-40d (5’GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEQ ID NO: 110), of Ck constante regio (1ικΡ2; zoals eerder beschreven in Green et al., 1994).
25 Sequenties van de menselijke mAb-afkomstige zware en kappa keten transcripten uit hybridoma's werden verkregen door directe sequentiebepaling van PCR producten die waren gegenereerd uit poly (A+) RNA onder gebruikmaking van de bovenbeschreven primers. PCR producten werden gekloneerd in pCR2.1 onder gebruikmaking van een TOPO-TA
1027975 ----------------------- 124 kloneringskit (Invitrogen) en van beide strengen werd de sequentie bepaald onder gebruikmaking van Prism kleurstof terminator sequentiebepalingskits en een ABI 377 sequentiebepalingsmachine.
Alle sequenties werden geanalyseerd door uitlijningen met de ‘V BASE 5 sequence directory’ (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995).)
Verder werd elk van de antilichamen, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod, onderworpen aan 10 sequentiebepaling over de volle lengte van het DNA. Daarvoor werd totaal RNA geïsoleerd uit ongeveer 3-6xl06 hybridoma cellen onder gebruikmaking van een RNeasy kit (Qiagen). Het mRNA werd aan reverse transcriptie onder gebruikmaking van oligo-dT en een AMV-gebaseerd reverse transcriptase systeem (Promega) onderworpen. V 15 BASE werd gebruikt voor het ontwerpen van 5’ specifieke amplificatie primers, die een optimale Kozak sequentie en ATG startcodon (onderstreept) en 3’ reverse primers voor de specifieke zware en kappa ketens omvatten, zoals afgebeeld in Tabel 10.
20 1027975 125
Tabel 10: PCR primer paren voor cDNA amplificatie uit anti-MAdCAM mAb-exprimerende hybridoma's en primers gebruikt in de constructie van gemodificeerde versies van anti-MAdCAM antilichamen.
. 7V- r. è '* Jj*"* ^ ?|
VHl-18 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
ACTGGACCTGGAGCATCCTT 3’ (SEQID NO: 70) VH3-15 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
AGTTTGGGCTGAGCTGGATT 3’ (SEQ ID NO: 71) VH3-21 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
AACTGGGGCTCCGCTGGGTT 3’ (SEQ ID NO: 72) VH3-23 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
AGTTTGGGCTGAGCTGGCTT 3’ (SEQ ID NO: 73) VH3-30 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
AGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3’ (SEQ ID NO: 74) VH3-33 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGG
AGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3’ (SEQ ID NO: 75) VH4-4 5’ TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGA
AACACCTGTGGTTCTTCCTC 3’ (SEQ ID NO: 76) ~A2/A3 5’ TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGA
GGCTCCCTGCTCAGCTCCTG 3’ (SEQ ID NO: 77)
A26 5’ TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGT
TGCCATCACAACTCATTGGG 3’ (SEQ ID NO: 78)
B3 5’ TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGG
TGTTGCAGACCCAGGTCTTC 3’ (SEQ ID NO: 79)
012 5’ TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGG
ACATGAGGGTCCCCGCTCAG 3’ (SEQ ID NO: 80) 018 5’ TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGG
ACATGAGGGTCCCTGCTCAG 3’ (SEQ ID NO: 81) RevIgG2 5’ TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGA
GACAGGGAGAG 3’ (SEQ ID NO: 82) _ 1 0279 75 126
____ - ^ — '-'-ς._ ^ ^ I
Gligo-sëqüeiiti^
RevIgG4 5’ TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCC
TGTTGAAGC 3’ (SEQID NO: 83)
RevKappa 5’ TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGA
GACAGGGAGAG 3’ (SEQ ID NO: 84) i
6.22.2VK_F1 5’-GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC
ATC AAT AGC CTG GAA GC-3’(SEQ ID NO: 85) 6.22.2VK_R1 5’-GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG | AAA TCT GTC CCA GAT CC-3’(SEQ ID NO: 86) j 6.22.2VH_F1 5’-GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC- | 3’(SEQ ID NO: 87) 6.22.2VH.R1 5’-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC- 3’(SEQ ID NO: 88) | 6.22.2VH_CS* 5’-CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3’(SEQ | ID NO: 89) |
6.34.2VK_F1 5’-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT
TGG TAT CAG CAG AAA CC-3’(SEQ ID NO: 90) 6.34.2VK_R1 5’-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA 1 CTA ATA CTC TGA CTT GC-3’(SEQ ID NO: 91) 6.34.2VK_F2 5’-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT ACT GTC ACC-3’(SEQ ID NO: 92)
6.34.2VK_R3 5’-GGT GAC AGT AGT AAG TTG CAA AAT CCT
CAG GTT GCA GAG AAC TGA TGG-3’(SEQ ID NO: 93) 6.34.2VH.F1 5’-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G-3’(SEQ ID NO: 94) 6.34.2VH.R1 5’-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG C-3’(SEQ ID NO: 95)
6.67.1VK_F1 5’-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA
ACA GAA ACC AGG ACA GCC-3’(SEQ ID NO: 96) 1 027975 127 • ':··/. :-.ri·. -:-· 6.67.1VK_R1 5’-GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3’(SEQ ID NO: 97) 6.67.1VH_F1 5’-CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA ACC-3’(SEQ ID NO: 98) 6.67.1VHJEU 5’-GGT TCT TGG ACG TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3’(SEQ ID NO: 99) 6.67.1VH_CS* 5’-ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3’(SEQ ID NO: 100)
6.77.1VK_F1 5’-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC
TCC-3’(SEQ ID NO: 101) 6.77.1VK_R1 5’-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3’(SEQ ID NO: 102)
6.77.1VK_F2 5’-GGT TTA TTA CTG CAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC -3’(SEQ ID NO: 103) 6.77.1VK_R2 5’-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TT
T GCA TGC AGT AAT AAA CC -3’(SEQ ID NO: 104) 7.26.4K_F1 5’-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3’(SEQ ID NO: 105) 7.26.4K_R1 5’-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3’(SEQ ID NO: 106)
De primer paren werden gebruikt voor amplificatie van de cDNAs onder gebruikmaking van Expand High Fidelity Taq polymerase (Roche), en de PCR producten gekloneerd in pCR2.1 TOPO-TA 5 (Invitrogen) voor daaropvolgende sequentiebepaling. Zware en kappa lichte keten sequentie geverifieerde kloons werden daarna gekloneerd in pEE6.1 en pEE12.1 vectoren (LONZA) onder gebruikmaking van resp. Xbal/EcoRI en HindlII/EcoRI plaatsen.
1027975 128
Gengebruik analyse (
Tabel 11 toont het gengebruik voor de zware en kappa lichte keten voor elke in de uitvinding geschetste hybridoma.
Tabel 11: Zware en Kappa lichte keten gengebruik _ Zware keten_ Kappa lichte keten KLOON VH 1 D 1 JH Vk 1 Jk 1.7.2 VH3-15 D6-19 JH4b A3 JK5 1.8.2 VH3-15 D6-19 JH4b A3 JK5 7.16.6 VH1-18 D6-6 JH6b A2 JK1 7.20.5 VH4-4 D3-10 JH6b A3 JK4 7.26.4 VH1-18 D6-6 JH6b A2 JK1 VH3-23 D5-5 JH4b 012 JK5 VH3-33 D5-12 JH6b A26 JK4 VH3-30 D4-23 JH6b 012 JK3 VH4-4 D3-10 JH4b B3 JK4 VH3-23 D6-19 JH6b 012 JK2 VH3-21 D6-19 JH6b A2 JK2 VH3-33 D3-10orD3-16 JH4b 018 JK5 lgG2 5
Sequentie analyse
Voor een verder onderzoek naar antilichaam structuur werden voorspelde aminozuursequenties van de antilichamen verkregen uit de cDNAs die uit de kloons waren verkregen.
10 Sequentie identificatie nummers (SEQ ID NO:) 1-48 en 51-68 geven de nucleotide en aminozuursequenties van de zware en kappa lichte ketens van de anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2 (SEQ ID NOS 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NOS 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NOS 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NOS 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NOS 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NOS 21-24),
15 6.73.2 (SEQ ID NOS 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NOS 29-32), 7.16.6 (SEQ ID
NOS 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NOS 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NOS 41-44),
9.8.2 (SEQ ID NOS 45-48) en de gemodificeerde anti-MAdCAM
1027975 129 antilichamen 6.22.2-mod (SEQ ID NOS 51-54), 6.34.2-mod (SEQID NOS 55-58), 6.67.1-mod (SEQ ID NOS 59-62) en 6.77.1-mod (SEQ ID NOS 63-66) en 7.26.4-mod (SEQ ID NOS 41-42, 67-68). Voor elke gekloneerde anti-MAdCAM antilichaam sequentie zijn de sequenties 5 van de signaalpeptide sequentie (of de basen die daarvoor coderen) met kleine letters en onderstreept aangegeven.
Figuren IA-IJ geven sequentie uitlijningen tussen de voorspelde zware keten aminozuursequenties van antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2 en de 10 aminozuursequentie van de respectievelijke kiemlijn genproducten. De posities van de CDR1, CDR2 en CDR3 sequenties van de antilichamen zijn onderstreept, verschillen tussen de tot expressie gebrachte sequentie de overeenkomstige kiemlijn sequentie zijn in vet aangegeven en waar er addities zijn in de tot expressie gebrachte sequentie 15 vergeleken met de kiemlijn zijn deze als een (-) in de kiemlijn sequentie aangegeven.
Figuren 1K-1T geven sequentie uitlijningen tussen de voorspelde kappa lichte keten aminozuursequenties van de antilichamen 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 20 en 9.8.2 en de aminozuursequentie van de respectievelijke kiemlijn gen producten. De posities van de CDR1, CDR2 en CDR3 sequenties van de antilichamen zijn onderstreept, verschillen tussen de tot expressie gebrachte sequentie en de overeenkomstige kiemlijn zijn in vet aangegeven en waar er addities zijn in de tot expressie gebrachte 25 sequentie vergeleken met de kiemlijn zijn deze als een (-) in de kiemlijn sequentie aangegeven.
Aanwezigheid van post-translationele modificatie: glycosylering en deamidering:
Het effect van sommige van de wijzigingen in de tot expressie 30 gebrachte anti-MAdCAM antilichaam sequentie, vergeleken met de 1 0279 75 130 afgeleide kiemlijn sequentie, is de introductie van residuen die potentieel onderhevig kunnen zijn aan N-gebonden glycosylering (Asn-X-Ser/Thr) en/of deamidering (Asn-Gly) (zie Tabel 12). De nucleïnezuur sequenties coderend voor de kappa lichte keten variabele domein 5 aminozuursequenties van de anti-MAdCAM antilichamen 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 en 9.8.2, (SEQ ID NOS: 16, 20, 24, 28, 32, 44 en 48) en de zware keten variabele domein van antilichaam 6.14.2, (SEQ ID NO: 10), voorspellen de aanwezigheid van N-gebonden glycosylering. De aanwezigheid van deze post-translationele modificatie 10 werd onderzocht onder gebruikmaking van een combinatie van SDS-PAGE en Pro-Q® Emerald 488 Glycoprotein (Molecular Probes) kleuring met mAbs 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 en 9.8.2.
In het kort, ongeveer 2 pg van gereduceerd anti-MAdCAM antilichaam werd geladen op een 4-12% SDS-polyacrylamide gel onder 15 gebruikmaking van een MOPS buffer. Na elektroforese werd de gel gefixeerd in 50% MeOH, 5% azijnzuur en gewassen in 3% azijnzuur. Eventuele koolhydraten op de gel werden daarna geoxideerd met perjoodzuur en gekleurd onder gebruikmaking van Pro-Q® Emerald 488 Glycoprotein Stain Kit (Molecular Probes). Na een finale wasstap 20 werd glycoproteïne kleuring gevisualiseerd onder gebruikmaking van een fluorescentie scanner set bij een golflengte van 473 nm.
Na glycoproteïne kleuring werd de gel gekleurd voor totaal eiwit onder gebruikmaking van SYPRO Ruby eiwit gel kleuring en onder gebruikmaking van een fluorescentie scanner set bij een golflengte van 25 473 nm geanalyseerd. De kappa lichte ketens van anti-MAdCAM
antilichamen, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 en 9.8.2, kleurden alle positief voor de aanwezigheid van glycosylering. Als een extra bevestiging werd anti-MAdCAM antilichaam 7.26.4 onderworpen aan tryptische/chymotryptische digestie, de LC-MS/MS analyse 30 bevestigde de aanwezigheid van een gemodificeerd tryptisch peptide en verschafte extra bevestiging van kappa lichte keten glycosylering.
1027975 131
Specifieke Asn-Gly sequenties in de CDR1 regio's van anti-MAdCAM antilichamen, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 en 7.20.5, maken deze regio's gevoelig voor deamidering. Deamidering bij neutrale pH introduceert een negatieve lading en kan ook leiden tot β-isomerisatie, 5 wat de eigenschappen van een antilichaam zou kunnen beïnvloeden. Voor anti-MAdCAM antilichamen 1.7.2, 1.8.2 en 7.20.5 werd de aanwezigheid van gedeamideerde Asn-isoaspartaat residuen beoordeeld door massaspectroscopie na trapping van de isoaspartaat zijketen met MeOH.
10 In het kort, voor het anti-MAdCAM antilichaam 1.7.2, werd de status van het tryptische/Asp-N peptide SSQSLLQSNGYNYL (SEQ ID NO: 69) (1573.7 Da) geselecteerd voor monitoring door LC-MS/MS. Anti-MAdCAM antilichaam 1.7.2 werd gereduceerd in 10 mM DTT, gealkyleerd in 5 mM Na jodoacetaat en daarna aan buffer uitwisseling 15 naar trypsine digestiebuffer (50mM Tris-HCl, ImM CaCk, pH 7.6) onderworpen. Het antilichaam werd daarna met gemodificeerd trypsine (Promega) van sequentiebepalingskwaliteit gemengd in een protease:eiwit verhouding van 1:20. Eiwit werd voor 15 uur bij 30°C in trypsine gedigesteerd en de resulterende peptiden werden gescheiden 20 door HPLC onder gebruikmaking van een C-18 RPC op een Ettan LC systeem. Het 33Asn-bevattende peptide (4032 Da) werd verzameld uit de kolom en verdund in Asp-N digestiebuffer (50 mM natriumfosfaat buffer, pH 8,0). Endoproteinase Asp-N (Roche) werd daarna toegevoegd bij een peptide:enzym verhouding van bij benadering 10:1.
25 Acetylchloride (100 pL) werd toegevoegd aan een monster van methanol (1 mL, -20°C), het mengsel verwarmd tot kamertemperatuur. Het tryptische+Asp-N digestieproduct werd gedroogd in een Speed-Vac en daarna werd 5 pL van het methanol/acetylchloride toegevoegd (45 min, kamertemperatuur), daarna opnieuw gedroogd in een Speed-Vac. 30 Het resulterende residue werd gereconstrueerd in 0,1% TFA en peptiden werden initieel geanalyseerd op de Voyager-DE STR MALDI- 1027975 132 TOF massaspectrometer onder gebruikmaking van hetzij de nitrocellulose dunne-laag monsterbereidingsmethode hetzij reverse fase zuivering onder gebruikmaking van C18 ZipTips (Millipore) gevolgd door druppel vermenging met α-cyano matrix. Het gemethyleerde 5 peptide mengsel werd ook geanalyseerd onder gebruikmaking van LC-MS/MS op een Deca XP Plus Ion Trap Massaspectrometer zoals boven. De elutie werd recht in de Ion Trap MS geleid en peptiden werden vervolgens geanalyseerd door MS en MS/MS. De MS werd ingesteld op analyse van alle ionen tussen 300 en 2000 Da. Het sterkste ion in een 10 bepaalde scan werd daarna aan MS/MS analyse onderworpen.
Tabel 12. Post-translationele modificatie van anti-MAdCAM antilichamen
Zware keten Kappa lichte keten
Glycosylering Glycosylering Deamidering KLOON (NXS/T) Bevestigd (NXS/T) Bevestigd (NG)__Bevestigd
1.7.2 LQSHGYN MS
1.8.2 LQSNGYN MS
7.16.6
7.20.5 HGNGYNY MS
7.26.4 CKSNQSLLY MS /PAGE
ITFNNSAMT N.D
SGTNFTLTI PAGE LTINGLEA N.D
ASQNISSYL PAGE
SSNNKTYLA PAGE
RASQNITN PAGE
SCNSSQSL PAGE
___HSDNLSIT PAGE___ lgG2^
Mutagenese studies:
15 De primaire aminozuursequentie van de anti-MAdCAM
antilichamen die als voorbeeld zijn getoond in deze uitvinding, kan worden gemodificeerd, door plaatsgerichte mutagenese, om potentiële plaatsen van post-translationele modificatie (bijv. glycosylering, de- 102797b 133 amidering) te verwijderen of om de isotype achtergrond te wijzigen, of om andere wijzigingen te construeren die de therapeutische bruikbaarheid kunnen verbeteren. Als voorbeeld werd PCR gebruikt om wijzigingen te construeren voor de anti-MAdCAM antilichamen 6.22.2, 5 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 en 7.26.4, voor reversie van bepaalde raamwerk sequenties naar kiemlijn, voor verwijdering van potentiële glycosyle-ringsplaatsen en/of voor wijziging van de isotype achtergrond naar een menselijk IgG2. pCR2.1 TOPO-TA gekloneerde cDNAs (100 ng), die overeenkwamen met zware keten nucleotide SEQID NOS: 13,17, 21 en 10 29, en kappa lichte nucleotide SEQ ID NOS: 15,19, 23, 31 en 43, werden als een templaat gebruikt in een reeks van PCRs met gebruik van overlap-extensie en een panel van primer sets beschreven in Tabel 10.
6.22.2 Zware keten: PCR primer sets 6.22.2_VH_F1 en 15 6.22.2VH_CS* (1) en VH3-33 en 6.22.2_VH_R1 (2) werden gebruikt om aparte PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 13. Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde 20 PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met VH3-33 en VK6.22.2_CS* primers, om het gemodificeerde 6.22.2 zware keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een His/Phe mutatie in FR1 en introduceert een Xbal restrictieplaats om in-leesraam klonering mogelijk te maken in een van pEE6.1 afgeleide vector, genaamd 25 pEE6.1CH, die het overeenkomstige menselijke IgG2 constante domein bevat. Het laatste PCR fragment werd gekloneerd in de Xbal plaats van pEE6.1CH, gecontroleerd op oriëntatie en de volledige sequentie van de insertie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.22.2 zware keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 51 en de overeen-30 komstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 52. De wijzigingen in de 1027975 134 nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder, zijn aangegeven.
6.22.2 kappa lichte keten: PCR primer sets 6.22.2_VK_F1 en revKappa (1), en A26 en 6.22.2_VK_R1 (2) werden gebruikt om aparte 5 PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQID NO: 15. Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met A26 en revKappa primers, om het 10 gemodificeerde 6.22.2 kappa lichte keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat Asn/Asp en Gly/Ser wijzigingen in de FR3 sequentie. Het resulterende PCR product werd gekloneerd in pEE12.1 onder gebruikmaking van HindlII/EcoRl plaatsen en volledig sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.22.2 15 kappa lichte keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 53 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 54. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
6.34.2 Zware keten: PCR primer sets 6.34.2_VH_F1 en 20 6.22.2VH_CS* (1) en VH3-30 en 6.34.2_VH_R1 (2) werden gebruikt om aparte PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 17. Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde 25 PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met VH3-30 en VK6.22.2_CS* primers, om het gemodificeerde 6.34.2 zware keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een Ser/Arg mutatie in FR3 en introduceert een Xbal restrictieplaats om in-leesraam klonering mogelijk te maken in een van pEE6.1 afgeleide vector, genaamd 30 pEE6.1CH, die het overeenkomstige menselijke IgG2 constante domein bevat. Het laatste PCR fragment werd gekloneerd in de Xbal plaats van 1027975 135 pEE6.1CH, gecontroleerd voor oriëntatie en de insertie volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.34.2 zware keten wordt gevonden in SEQID NO: 55 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 56. De wijzigingen in de 5 nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
6.34.2 kanna lichte keten: PCR primer sets 012 en 6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 en 6.34.2_VK_R2 (2), evenals 6.34.2_VK_F2 en revKappa (3) werden gebruikt om aparte PCR 10 producten (1), (2) en (3) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq pólymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 19. Producten (1), (2) en (3) werden gezuiverd en (1) en (2) werden gecombineerd in een derde PCR stap (ca. 50 ng elk), tezamen met 012 15 en 6.34.2_VK_R2 primers, om het PCR product (4) te genereren. PCR producten (2) en (3) werden gecombineerd in een vierde PCR stap (ca. 50 ng elk), tezamen met 6.34.2_VK_F1 en revKappa, om het PCR product (5) te genereren. PCR producten (4) en (5) werden gezuiverd en tezamen gecombineerd (ca. 50 ng elk) met primers 012 en revKappa om 20 het gemodificeerde 6.34.2 kappa lichte keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een Asn/Ser wijziging in CDR1, een Phe/Tyr wijziging in FR2 en Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu en Ser/Tyr wijzigingen in de FR3 sequentie. Het resulterende PCR product werd gekloneerd in pEE12.1 onder gebruikmaking van HindlII/EcoRl 25 plaatsen en volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.34.2 kappa lichte keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 57 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 58. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
30 6.67.1 Zware keten: PCR primer sets 6.67.1_VH_F1 en 6.67.1VH_CS* (1) en VH4-4 en 6.67.1_VH_R1 (2) werden gebruikt om 1027975 136 aparte PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQID NO: 21. Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde 5 PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met VH4-4 en VK6.67.1_CS* primers, om het gemodificeerde 6.67.1 zware keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val conversie in FR3 en introduceert een Xbal restrictieplaats om in-leesraam klonering mogelijk te maken in een van pEE6.1 afgeleide vector, genaamd 10 pEE6.1CH, die het overeenkomstige menselijke IgG2 constante domein bevat. Het laatste PCR fragment werd gekloneerd in de Xbal plaats van pEE6.1CH, gecontroleerd voor oriëntatie en de insertie volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.67.1 zware keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 59 en de overeen-15 komstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 60. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
6.67.1 kappa lichte keten: PCR primer sets 6.67.1_VK_F1 en revKappa (1), en B3 en 6.67.1_VK_R1 (2) werden gebruikt om aparte 20 PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 23. Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met B3 en revKappa primers, om het 25 gemodificeerde 6.67.1 kappa lichte keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een Thr/Asn wijziging in CDR1 en een Arg/Gly wijziging in FR2. Het resulterende PCR product werd in pEE12.1 gekloneerd onder gebruikmaking van HindlII/EcoRl plaatsen en volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de 30 gemodificeerde 6.67.1 kappa lichte keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 61 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 62.
1 Ü 2 7 9 75 137
De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
6.77.1 Zware keten: PCR primer sets VH 3-21 en 6.22.2VH_CS* werden gebruikt om een enkel PCR product te genereren onder gebruik- 5 making van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQID NO: 29. De PCR producten werden gedigesteerd met Xbal, gel gezuiverd en gekloneerd in de Xbal plaats van pEE6.1CH, waarbij voor oriëntatie werd gecontroleerd. De insertie werd volledig op sequentie 10 geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 6.77.1 zware keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 63 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 64. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
6.77.1 kanna lichte keten: PCR primer sets A2 en 6.77.1_VK_R1 15 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 en 6.77.1_R2 (2), alsmede 6.77.1_VK_F2 en revKappa (3) werden gebruikt om aparte PCR producten (1), (2) en (3) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 31. Producten (1), (2) en (3) werden 20 gezuiverd en (1) en (2) werden gecombineerd in een derde PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met A2 en 6.77.1_VK_R2 primers, om PCR product (4) te genereren. PCR product (2) en (3) werden gecombineerd in een vierde PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met 6.77.1_VK_F1 en revKappa primers, om PCR product (5) te genereren. PCR producten (4) 25 en (5) werden gezuiverd en tezamen gecombineerd (ca.50 ng elk) met primers A2 en JK2 om het gemodificeerde 6.77.1 kappa lichte keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat een Asn/Lys wijziging in CDR1, een Ser/Tyr wijziging in FR3 en een Cys/Ser residue wijziging in CDR3 sequentie. Het resulterende PCR product werd in 30 pEEl2.1 gekloneerd onder gebruikmaking van HindlII/EcoRl plaatsen en volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de 1027975 138 gemodificeerde 6.77.1 kappa lichte keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 65 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 66. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
5 7.26.4 kappa lichte keten: PCR primer sets 7.26.4_VK_F1 en revKappa (1), en A2 en 7.26.4_VK_R1 (2) werden gebruikt om aparte PCR producten (1) en (2) te genereren, onder gebruikmaking van een Expand Taq polymerase en een pCR2.1 TOPO-TA cDNA templaat (100 ng) vertegenwoordigd door nucleotide sequentie SEQ ID NO: 43.
10 Producten (1) en (2) werden gezuiverd en gecombineerd in een derde PCR stap (ca. 50 ng elk) tezamen met A2 en revKappa primers, om het gemodificeerde 7.26.4 kappa lichte keten V-domein te genereren. Deze gemodificeerde versie bevat eën Asn/Ser wijziging in CDR1. Het resulterende PCR product werd gekloneerd in pEE12.1 gebruikmakend 15 van HindlII/EcoRl plaatsen en volledig op sequentie geverifieerd. De nucleotide sequentie voor de gemodificeerde 7.26.4 kappa lichte keten wordt gevonden in SEQ ID NO: 67 en de overeenkomstige aminozuursequentie in SEQ ID NO: 68. De wijzigingen in de nucleotide en aminozuursequenties vergeleken met de ouder zijn aangegeven.
20 Een functionele eukaryotische expressievector voor elk van de gemodificeerde versies van 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 en 7.26.4, aangeduid als 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod, en respectievelijk vertegenwoordigend de zware keten nucleotide sequenties SEQ ID NOS: 51, 55, 59, 63 en 41, en 25 overeenkomstige aminozuursequenties SEQ ID NOS: 52, 56, 60, 64 en 42, alsmede de kappa lichte keten nucleotide sequenties SEQ ID NOS: 53, 57, 61, 65 en 67, en de overeenkomstige aminozuursequenties SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 en 68 werden als volgt geassembleerd: De zware keten cDNA inserties overeenkomend met 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 30 6.67.1-mod en 6.77.1-mod werden uitgesneden uit de pEE6.1CH vector met Notl/Sall, de parentale versie van de zware ketens van 7.26.4 werd 1027975 139 uitgesneden uit de pEE6.1 vector met Notl/Sall, en de gezuiverde fragmenten werden op identieke plaatsen gekloneerd in de overeenkomstige pEE12.1 vector bevattende de gemodificeerde versies van de kappa lichte keten sequenties 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 5 6.77.1-mod en 7.26.4-mod. De sequenties van de vectoren werden bevestigd, en gezuiverde hoeveelheden gebruikt in transfecties van voorbijgaande aard met HEK 293T cellen. In het kort, 9xl06 HEK 293T cellen, geënt in een T165 kolf de dag vóór transfectie en gewassen in Optimem, werden tijdelijk getransfecteerd met vector cDNAs 10 overeenkomend met 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en
7.26.4- mod (40 pg) onder gebruikmaking van Lipofectamine PLUS (Invitrogen) volgens instructies van de fabrikant. De cellen werden voor 3 uur geïncubeerd, daarna werd het transfectie medium vervangen door DMEM (Invitrogen 21969-035) medium bevattende 10% ultra-laag IgG
15 foetaal kalverserum (Invitrogen 16250-078) en L-Glutamine (50 mL).
De medium supernatant werd 5 dagen later geoogst, filter gesteriliseerd en het anti-MAdCAM antilichaam gezuiverd onder gebruikmaking van proteïne G sepharose affiniteitschromatografie, op een soortgelijke wijze als hierboven beschreven. De gewonnen hoeveelheid van antilichaam 20 (20-100 pg) werd door een Bradford assay gekwantificeerd.
De anti-MAdCAM activiteit van affiniteit gezuiverd antilichaam overeenkomend met 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en
7.26.4- mod werd beoordeeld in de MAdCAM-IgGl-Fc fusie assay zoals eerder beschreven. De IC50 waardes van deze anti-MADCAM
25 antilichamen vergeleken met de parentale anti-MAdCAM antilichamen waarvan ze waren afgeleid, worden getoond in Tabel 13. Er was een minimaal effect van de bovenbeschreven aminozuur substituties op de activiteit van de gemodificeerde anti-MAdCAM antilichamen vergeleken met hun ouders was minimaal. De antilichamen behielden 30 ook hun binding aan CHO cellen die recombinant menselijk MAdCAM of de cynomolgus/mens MAdCAM chimaera exprimeren.
1027975 140
Tabel 13. Activiteit van gemodificeerde versies van anti-MAdCAM antilichamen, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod vergeleken met hun ouders.
5 MAdCAM IgGl Fc fusie Assay gemiddelde IC50 (gg/mL) KLOON Ouder Gemodificeerd 6.22.2 0,018 0,058 10 6.34.2 0,018 0,049 6.67.1 0,013 0,037 6.77.1 0,022 0,077 7.26.4 0,021 0,033
15 VOORBEELD VI
Toename in β7+ lvmfocvten in de periferale circulatie door blokkerende anti-MAdCAM antilichamen 20 Er werd een assay ontwikkeld voor het identificeren en correleren van een mechanistisch effect van een anti-MAdCAM antilichaam en zijn circulerende niveau in bloed. Een remmend anti-MAdCAM antilichaam zou het effect moeten hebben van het remmen van de recrutering van leukocyten die het α4β7 integrine exprimeren naar het 25 maagdarmkanaal. Klassen van α4β7 integrine-dragende leukocyten zouden derhalve beperkt moeten zijn tot de periferale circulatie.
Dit werd aangetoond met een volledig menselijk anti-menselijk MAdCAM mAb 7.16.6, in cynomolgus.
Gezuiverd anti-menselijk MAdCAM mAb 7.16.6 (1 mg/kg) of 30 vehiculum (20 mM Na acetaat, 0,2 mg/mL polysorbaat 80, 45 mg/mL mannitol, en 0,02 mg/mL EDTA bij pH 5,5) werden beoordeeld op een gelijke manier door intraveneuze toediening via de vena saphena aan 1 027975 141 twee groepen van cynomolgus apen (n=4/groep). Op dag 3 na toediening werden bloedmonsters verzameld in EDTA buizen door femorale venipunctuur. LPAM-specifieke antilichamen, die kruisreageren met het cynomolgus oup7 integrine, zijn niet commercieel verkrijgbaar, 5 daarom werd in plaats daarvan een anti-β? antilichaam (dat <Χ4β7 en a.Ep7 integrine herkent) gebruikt. Antilichamen (30 pL), volgens de volgende tabel, tabel 15, werden toegevoegd aan buizen die 100 pL van cynomolgus bloed bevatten, gemengd door voorzichtig vortexen en geïncubeerd gedurende 20-30 min bij 4°C.
10
Tabel 15. Antilichamen (BD Pharmingen), gebruikt in immuno-fenotypering van cynomologus bloed
Catalogus nummer Antilichaam of Isotype
555748 mlgGl, k-FITC
555844 mIgG2a, k-PE
559425 mlgGl - PerCP
555751 mlgGl, k-APC
555728 CD 28-FITC
555945 D7-PE
558814 CD 95-APC
550631 CD 4-PerCP
15 Aan elke buis werd 1 mL van 1:10 FACSlyse oplossing (BD # 349202) toegevoegd, gemengd door voorzichtig vortexen en geïncubeerd bij kamertemperatuur voor ongeveer 12 minuten in het donker totdat rode bloedcel lyse compleet was. Daarna werd aan elke buis 2 mL van BD kleuringsbuffer (# 554656) toegevoegd, gemengd en gecentrifugeerd 20 bij 250 x g voor 6-7 mins bij kamertemperatuur. De supernatant werd gedecanteerd en de pellet geresuspendeerd in 3 mL van kleuringsbuffer, opnieuw gemengd en bij 250 x g voor 6-7 mins bij kamertemperatuur 1027975___ 142 gecentrifugeerd. Cytofix buffer (BD # 554655) die w/v paraformaldehyde (100 pL) bevatte, werd toegevoegd aan de celpellets uit periferaal bloed van aap en grondig gemengd door vortexen met lage/matige snelheid.
De monsters werden bij 4°C in het donker gehouden totdat ze de 5 FACSCalibur verwierven. Vlak voor verwerving werd PBS (100 μΐι) aan alle buizen onmiddellijk voor verwerving toegevoegd. De absolute cel aantallen van CD4+p7+CD951oCD28+ (naief), CD4+P7+CD95hiCD28+ (centrale geheugen), CD4+P7-CD95hiCD28+ (centrale geheugen), CD4+P7+CD95hiCD28- (effector geheugen) werden verworven door 10 geschikte gating en quandrant analyses. Andere T-cel subsets bijv.
CD8+ T centrale geheugen cel (p7+CD8+CD28+CD95+) en eventuele andere leukocyten die een MAdCAM ligand dragen, kunnen ook door deze methode met de geschikte antilichamen worden geanalyseerd. Vergeleken met de vehiculum controle veroorzaakt anti-MAdCAM mAb 15 7.16.6 een bij benadering 3 voudige toename van de niveau's van circulerende CD4+P7+CD95hiCD28+ centrale geheugen T-cellen, zoals getoond in Figuur 7. Er waren geen effecten op de populatie van circulerende CD4+P7-CD95hiCD28+ centrale geheugen T-cellen, wat aangeeft dat het effect van anti-MAdCAM mAb 7.16.6 specifiek is voor 20 naar de darm terugkerende T-cellen. De effecten van anti-MAdCAM mAb 7.16.6, in cynomolgus, op populaties van circulerende (<X4)P7+ lymfocyten geven aan dat dit een robuust surrogaat bewijs is van mechanisme biomerker, in het bijzonder in de context van practische toepassing in een klinische setting.
25
Sequenties SEQ ID NO: 1-48 en 51-68 verschaffen nucleotide en aminozuur-sequenties van de zware en kappa lichte ketens voor twaalf menselijke anti-MAdCAM antilichamen, nucleotide en aminozuursequenties van 30 cynomolgus MAdCAM (X4P7 bindend domein sequenties en nucleotide en 1027975 143 aminozuursequenties van vijf gemodificeerde menselijke anti-MAdCAM antilichamen.
SEQID NO: 1-48 verschaffen de zware en kappa lichte keten nucleotide en aminozuursequenties van twaalf menselijke monoklonale 5 anti-MAdCAM antilichamen: 1.7.2 (SEQ ID NO: 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NO: 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NO: 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NO: 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NO: 41-44), en 9.8.2 (SEQ ID NO: 10 45-48).
SEQ ID NO: 49-50 verschaffen de nucleotide en aminozuur-sequenties van een cynomolgus MAdCAM 0467 bindend domein.
SEQ ID NO: 51-68 verschaffen de zware en kappa lichte keten nucleotide en aminozuursequenties voor de gemodificeerde monoklonale 15 anti-MAdCAM antilichamen: 6.22.2 (SEQ ID NO: 51-54), gemodificeerd 6.34.2 (SEQ ID NO: 55-58), gemodificeerd 6,67.1 (SEQ ID NO: 59-62), gemodificeerd 6.77.1 (SEQ ID NO: 63-66) en de kappa lichte keten nucleotide en aminozuursequenties van gemodificeerd monoklonaal anti-MAdCAM antilichaam: gemodificeerd 7.26.4 (SEQ ID NO: 67-68). 20 SEQ ID NOS: 70-106 en 108-110 verschaffen verscheidene primer sequenties.
1 027975 144
Sleutel:
Signaalsequentie: onderstreept kleine letters
Aminozuurwijzigingen in gemodificeerde anti-MAdCAM antilichamen 5 sequentie vergeleken met ouder: onderstreept hoofdletters SEQID NR. 1 1.7.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie
1 atqqaqtttq qgctqaqctq qattttcctt qctqctattt taaaaqqtqt 10 51 ccagtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG
101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGCCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 15 301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG
351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 20 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC
601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 · CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 25 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC
851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 30 1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT
1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC 1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 35 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC
1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA
1 0279 /d 145 SEQID NR. 2 1.7.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefqlswif1 aailkqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVASGFTFTN
51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL
5 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP
151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
201 SLSSWTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP
251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV
301 HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTWHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK
10 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN
401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN
451 HYTQKSLSLS PGK
SEQ ID NR. 3 1.7.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 15 1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqqtctctqq
51 atccaqtqqq GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA
101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CAAAGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA
201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC
20 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC
301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 25 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC
551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC
601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
30 SEQ ID NR. 4 1.7.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
1 mrlpaqllql lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL
51 QSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK
35 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
1027975 146 SEQ ID NR. 5 1.8.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqaqtttq qqctqaqctg qattttcctt qctqctattt taaaaqgtgt
51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG
5 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGTCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC
151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC
251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG
301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG
10 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA
401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 15 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC
651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 20 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG
901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 25 1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC
1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 30 1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA
SEQ ID NR. 6 1.8.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefglswif1 aailkqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVVSGFTFTN
51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL
35 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP
151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
201 SLSSWTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP
251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV
301 HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK
40 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN
401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN
451 HYTQKSLSLS PGK
1027975 147 SEQ ID NR. 7 1.8.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqqtctctqq 51 atccaqtqqq GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 5 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CAAAGTAATG GATTCAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA
201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGGTCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT
10 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG
401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 15 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NR. 8 1.8.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mrlpaqllgl lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL
51 QSNGFNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
25 1027975 148 SEQ ID NR. 9 6.14.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqagtttg ggctqaqctq gctttttctt qtqqctattt taaaaqqtqt
51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG
5 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGACTCAC CTTTAACAAT
151 TCTGCCATGA CCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 CTCAACTACT AGTGGAAGTG GTGGTACCAC ATACTACGCA GACTCCGTGA
251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACTCTC CCAAGAACAC GCTCTATCTG
301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGGC
10 351 CCGTGGATAC AGCTATGGTA CGACCCCCTA TGAGTACTGG GGCCAGGGAA
401 CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC
451 CTGGCGCCCT GTTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG
501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG
551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA
15 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG
651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG
701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ATCATGCCCA
751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC
801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG
20 851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT
901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA
951 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC
1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC
1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA
25 1101 GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA
1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 1251 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA 1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 30 1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTAA
1401 ATGA
SEQ ID NR. 10 6.14.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefqlswlf1 vailkqvqcE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGLTFNN 35 51 SAMTWVRQAP GKGLEWVSTT SGSGGTTYYA DSVKGRFTIS RDSPKNTLYL
101 QMNSLRAEDT AVYYCAARGY SYGTTPYEYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
201 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP
251 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSQED PEVQFNWYVD
40 301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
351 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
401 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
451 ALHNHYTQKS LSLSLGK
1027975 149 SEQ ID NR. 11 6.14.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atqqacatqa qqqtccccgc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctgqct 51 ccqaqqqqcc aqatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 5 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCGGAGC
151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA
201 AGTCCTGATC TTTTTTGTGT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAATT ACATTCCCCC
10 351 TATTACCTTC GGCCAGGGGA CACGACTGGA GATCAGACGA ACTGTGGCTG
401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 15 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA
651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG
701 GAGAGTGTTA G
SEQ ID NR. 12 6.14.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASRS
51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKVLI FFVSSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQNYIPPITF GQGTRLEIRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST
202 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
25 1027975 150 SEQ ID NR. 13 6.22.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt
51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG
5 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGACACAC CTTCAGTAGC
151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA
251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG
301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG
10 351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG
401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG
451 CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGG GCTGCCTGGT
501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC
551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC
15 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA
651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA
701 AGAGAGTTGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT
751 GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA
801 CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG
20 851 TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG
901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC
951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG
1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC
1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA
25 1101 CACCCTGCCC CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA
1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCGCGCCTC CCGTGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGGA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 30 1351 CACAACCAC.T ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG GTAAATGA
SEQ ID NR. 14 | 6.22.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefglswvf1 vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGHTFSS 51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 35 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA
151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 YSLSSWTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP
251 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV
301 EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI 40 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
401 SNGQPENNYK TAPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL
451 HNHYTQKSLS LSLGK
1027975 151 SEQ ID NR. 15 6.22.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atqttgccat cacaactcat tqqqtttctq ctqctctqqq ttccaqcttc 51 caggggtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 5 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT
151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT
201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA
251 GTGGATCTGG GACAAATTTC ACCCTCACCA TCAATGGCCT GGAAGCTGAA
301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT
10 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG
401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 15 601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA
651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT
701 AGTGA
SEQ ID NR. 16 6.22.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mlpsqllqfl llwvpasrqE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS
51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTNF TLTINGLEAE
101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS
151 VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
25 1027975 152 SEQ ID NR. 17 6.34.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taagaqqtqt
51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG
5 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC
151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 10 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC
401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC
451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT
501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA
551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG
15 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG
651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCATCA 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 20 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 25 1101 GCCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC
1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG ACAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC
1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG
1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
30 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT
1401 GGGTAAATGA
SEQ ID NR. 18 6.34.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefglswvfl vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 35 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
101 QMNSLSAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV
151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
201 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS
251 CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY
40 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL
351 PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSLGK
1 027 9 75 153 SEQ ID NR. 19 6.34.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atqqacatqa qqqtccccgc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct 51 ccqaqqtqcc aqatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 5 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAT
151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGGACTCTG 301 CAACCTGATG ATTTTGCAAC TTACTCCTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 10 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG
401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 15 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA
651 AGTCAGCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG
701 GAGAGTGTTA GTGA
SEQ ID NR. 20 6.34.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mdmrvpaqll qllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQN
51 ISSYLNWFQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTIRTL 101 QPDDFATYSC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST
201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
25 1027975 154 SEQID NR. 21 6.67.1 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaaacacc tqtqqttctt cctcctqctq qtqqcaqctc ccaqatqqqt
51 cctqtCcCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT
5 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT
151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT
201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG
251 GTCGAGTCAC CATTTTAGCA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA
301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA
10 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG
401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCCGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA 15 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG
651 CAGCTTGGGC ACGAAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA
701 ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGTCCA AATATGGTCC CCCATGCCCA
751 TCATGCCCAG CACCTGAGTT CCTGGGGGGA CCATCAGTCT TCCTGTTCCC
801 CCCAAAACCC AAGGACACTC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT
20 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CAGGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG
901 TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA
951 GCAGTTCAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC
1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC
1051 CTCCCGTCCT CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG
25 1101 AGAGCCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCAGGAGGAG ATGACCAAGA
1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC GAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAGGCTAA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGGAGGGGA ATGTCTTCTC ATGCTCCGTG 30 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACA CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC
1401 TCTGGGTAAA TGA
SEQ ID NR. 22 6.67.1 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS
35 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTILA DTSKNQFSLK
101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS
151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
201 QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP
251 SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW
40 301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG
351 LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI
401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV
.451 MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
1027975 155 SEQ ID NR. 23 6.67.1 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqtqttqc agacccaqgt cttcatttct ctgttqctct gqatctctqq
51 tgcctacggq GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT
5 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA
151 TACAGCTCCA ACAATAAGAC CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAAG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA
10 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA
401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA
501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG
551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC
15 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA
651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA
701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA
SEQ ID NR. 24 6.67.1 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mvlqtqvfis lllwisqayq DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL
51 YSSNNKTYLA WYQQKPRQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
25 1027975 156 SEQ ID NR. 25 6:73.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqgaqtttq qqctqaqctq qctttttctt qtqqctattt taaaaqqtqt
51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGACTTG GTCCAGCCTG
5 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGAAGT
151 TATGCCATGA ACTGGGTCCG ACAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 CTCAGTTATT AGTGGTCGTG GTGGTACTAC ATACTACGCA GACTCCGTGA
251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG
301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACGCG GCCGTATATT ACTGTGCGAA
10 351 GATAGCAGTG GCTGGAGAGG GGCTCTACTA CTACTACGGT ATGGACGTCT
401 GGGGCCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CAGCTTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCCGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAACACAGC 501 CGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC 15 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC
651 TAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGC 751 CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 20 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC
901 TGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC 25 1101 CCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA
1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC
1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC
1251 CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC
1301 TAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCC
30 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCT
1401 GTCTCTGGGT AAATGATAG
SEQ ID NR. 26 6.73.2 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mefqlswlfl vailkqvqcE VQLLESGGDL VQPGGSLRLS CAASGFTFRS 35 51 YAMNWVRQAP GKGLEWVSVI SGRGGTTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
101 QMNSLRAEDA AVYYCAKIAV AGEGLYYYYG MDVWGQGTTV TVSSASTKGP
151 SVFPLAPCSR STSENTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
201 LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC
251 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SQEDPEVQFN
40 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK
351 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD
401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS
451 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K
1027975 157 SEQ ID NR. 27 6.73.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atgqacatqa qqqtccccqc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct 51 ccqaqgtqcc aqatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 5 101 CTGCATCTGT AGGTGACAGA GTCACCTTCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAC
151 ATTACCAACT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AGGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCGT CCAGTTTGCC AAGAGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCCGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAGTT ACAGTAATCC 10 351 TCCGGAGTGC GGTTTTGGCC AGGGGACCAC GCTGGATATC AAACGAACTG
401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 15 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NR. 28 6.73.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mdmrvpaqll qllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTFTCRASQN
51 ITNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASSLPRGV PSRFRGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQSYSNPPEC GFGQGTTLDI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
25 1027975 158 SEQ ID NR. 29 6.77.1 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqaactqg qqctccqctq qqttttcctt qttqctattt taqaaqqtqt
51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG
5 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC
151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 10 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG
401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 15 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC
651 CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG AGTCCAAATA TGGTCCCCCA 751 TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT 801 GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG 20 851 TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC
901 AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT AATGCGAAGA CAAAGCCGCG 951 GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC 1001 TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 1051 AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 25 1101 GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCAG GAGGAGATGA
1151 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTACCCCAGC
1201 GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA
1251 GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA
1301 GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG AGGGGAATGT CTTTTCACGC
30 1351 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC
1401 CCTGTCTCTG GGTAAATGAT AGGAATTCTG ATGA
SEQ ID NR. 30 6.77.1 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 melqlrwvf1 vailegvgcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS
35 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL
101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG
151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP
251 CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSQEDPEVQF
40 301 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN
351 KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS
401 DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSR
451 SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK
1027975 159 SEQID NR. 31 6.77.1 Kappa Lachte Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaqqctcc ctgctcaqct cctqqqgctq ctaatqctct qgatacctqq
51 atccaqtqca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA
5 101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA ACTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTCCTGCA TGCAAAGTAT 10 351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG
451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG
501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT
551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC
15 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA
651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
SEQ ID NR. 32 6.77.1 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mrlpaqllgl lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCNSSQSLL
51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM CSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEÖL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
25 1 0279 75 160 SEQ ID NR. 33 7.16.6 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqactqqa cctqqaqcat ccttttcttq qtqgcaqcaq caacaqqtqc
51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG
5 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC
151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT
201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC
251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG
301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG
10 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG
401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG
451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC
501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT
551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA
15 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG
651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 20 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA
951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG
1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC
1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA
25 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 30 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC
1401 GGGTAAATGA
SEQ ID NR. 34 7.16.6 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
35 1 mdwtwsilf1 vaaatqahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS
51 YGINWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM 101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP
40 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY
301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL
351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
45 1 027 9 75 161 SEQID NR. 35 7.16.6 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie
1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqatacctqq 51 atccaqtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 5 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT 10 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 15 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA
651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
SEQ ID NR. 36 7.16.6 Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL
51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE 1KRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
.201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
25 1027975 162 SEQ ID NR. 37 7.20.5 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaaacacc tqtqqttctt cctcctqctq qtqqcaqctc ccaqatqqqt
51 cctqtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT
5 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTAGCTC CATCAGTAGT
151 TACCACTGGA ACTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGAGCACCAA CTACAACCCC TCCCTCAAGA 251 GTCGAGTCAC CATGTCACTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG 301 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 10 351 GGGGGTCAGG TATTACTATG CTTCGGGGAG TTATTACTAC GGTCTGGACG
401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCCTC CACCAAGGGC 451 CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 15 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC
651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 20 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC
901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 25 1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA
1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC
1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC
1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC
1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC
30 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT
1401 GTCTCCGGGT AAATGA
SEQ ID NR. 38 7.20.5 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mkhlwff111 vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGSSISS 35 51 YHWNWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGSTNYNP SLKSRVTMSL DTSKNQFSLK
101 LSSVTAADTA VYYCAREGVR YYYASGSYYY GLDVWGQGTT VTVSSASTKG
151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE
251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVQFN
40 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK
351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD
401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS
451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
1027975 163 SEQ ID NR. 39 7.20.5 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqqtctctgg
51 atccaqtqqq GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA
5 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CATGGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT
10 351 ACAAACTCTC ACTTTCGGCG GAGGGACCAA GGTGGAGATC AAACGAACTG
401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA
451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA
501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC
551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC
15 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NR. 40 7.20.5 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mrlpaqllql lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL
51 HGNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
25 1027975 164 SEQ ID NR. 41 7.26.4 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqactgqa cctqqaqcat ccttttcttq gtqqcaqcaq caacaqqtqc
51 CCactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG
5 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCGAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC
151 TATGGTATCG ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGCTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGTCC ACAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 10 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA CTACGGTATG GACGTCTGGG
401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 15 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG
651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC
801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG
20 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TTGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 25 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 30 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC
1402 GGGTAAATGA
SEQ ID NR. 42 7.26.4 Voorspelde Zware Keten eiwit Sequentie
1 mdwtwsilf1 vaaatqahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CEASGYTFTS
35 51 YGIDWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKLQGRVTMS TDTSTSTAYM
101 ELRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS WTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH EDPEVQFNWY
40 301 vdgvevhnak tkpreeqfns tfrwsvltv vhqdwlngke ykckvsnkgl
351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
1027975 165 SEQ ID NR. 43 7.26.4 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqatacctqq
51 atccaqtqcq GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA
5 ' 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAATCA GAGCCTCCTG
151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 10 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 15 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA
651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
SEQ ID NR. 44 7.26.4 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSNQSLL
51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
25 1027975 166 SEQ ID NR. 45 9.8.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqqaqtttq ggctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt
51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG
5 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC
151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TGGTATGATG GAAGTAATGA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 10 351 GGGGGCGTAC CACTTTGCCT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT
401 CCTCAGCTTC CACCAAGGGC CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC 451 AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA 501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG 551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC 15 601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC
651 CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG 701 AGTCCAAATA TGGTCCCCCA TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG 751 GGGGGACCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT 801 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG 20 851 AAGACCCCGA GGTCCAGTTC AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT
901 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT 951 GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT 1001 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC 25 1101 CCCATCCCAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG
1151 TCAAAGGCTT CTACCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 1201 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 1251 CTCCTTCTTC CTCTACAGCA GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG 1301 AGGGGAATGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC 30 1351 TACACACAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG GGTAAATGA
SEQ ID NR. 46 9.8.2 Voorspelde Zware Keten Keten eiwit Sequentie
1 mefqlswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI WYDGSNEYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
35 101 QMNSLRAEDT AVYYCARGAY HFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS
151 RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
201 SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPSCPAPEFL
251 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH
301 NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT
40 351 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
401 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH
451 YTQKSLSLSL GK
1027975 167 SEQID NR. 47 9.8.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 1 atgqacatga qqqtccctqc tcaqctcctq qqqctcctqc tqctctqqct
51 ctcaqtcgca qgtqccaqat qtGACATCCA GATGACCCAG TCTCCATCCT
5 101 CCCTGTCTGC ATCTGTAGGA GACAGAGTCA CCATCACTTG CCAGGCGAGT
151 CAGGACATTA GCAACTATTT AAATTGGTAT CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC 201 CCCTAAGCTC CTGATCTACG ATGCATCCAA TTTGGAAACA GGGGTCCCAT 251 CAAGGTTCAG TGGAAGTGGA TCTGGGACAG ATTTTACTTT CACCATCAGC 301 AGCCTGCAGC CTGAAGATAT TGCAACATAT TCCTGTCAAC ACTCTGATAA 10 351 TCTCTCGATC ACCTTCGGCC AGGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG
401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ACCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 15 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NR. 48 9.8.2 Voorspelde Kappa Lichte Keten eiwit Sequentie
20 1 mdmrvpaqll gllllwlsva qarcDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCQAS
51 QDISNYLNWY QQKPGKAPKL LIYDASNLET GVPSRFSGSG SGTDFTFTIS 101 SLQPEDIATY SCQHSDNLSI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS
201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
25 1027975 168 SEQ ID NR. 49
Nucleotide Sequentie van cynomolgus MAdCAM <Χ4β7 bindend domein
1 ATGGATCGGG GCCTGGCCCT CCTGCTGGCG GGGCTTCTGG GGCTCCTCCA 5 51 GCCGGGCTGC GGCCAGTCCC TCCAGGTGAA GCCCCTGCAG GTGGAGCCCC
101 CGGAGCCGGT GGTGGCCGTG GCCCTGGGCG CCTCTCGCCA GCTCACCTGC 151 CGCCTGGACT GCGCGGACGG CGGGGCCACG GTGCAGTGGC GGGGCCTGGA 201 CACCAGCCTG GGCGCGGTGC AGTCGGACGC GGGCCGCAGC GTCCTCACCG 251 TGCGCAACGC CTCGCTGTCG GCGGCCGGGA CCCGTGTGTG CGTGGGCTCC
10 301 TGCGGGGGCC GCACCTTCCA GCACACCGTG CGGCTCCTTG TGTACGCCTT
351 CCCGGACCAG CTGACCATCT CCCCGGCAGC CCTGGTGCCT GGTGACCCGG 401 AGGTGGCCTG TACGGCTCAC AAAGTCACGC CTGTGGACCC CAATGCGCTC 451 TCCTTCTCCC TGCTCCTGGG GGACCAGGAA CTGGAGGGGG CCCAGGCTCT 501 GGGCCCGGAG GTGGAGGAGG AGGAGGAGCC CCAGGAGGAG GAGGACGTGC
15 551 TGTTCAGGGT GACAGAGCGC TGGCGGCTGC CGACCCTGGC AACCCCTGTC
601 CTGCCCGCGC TCTACTGCCA GGCCACGATG AGGCTGCCTG GCTTGGAGCT
651 CAGCCACCGC CAGGCCATCC CGGTCCTGCA C
SEQ ID NR. 50
Aminozuursequentie van cynomolgus MAdCAM <X4p7 bindend domein
20 1 MDRGLALLLA GLLGLLQPGC GQSLQVKPLQ VEPPEPWAV ALGASRQLTC
51 RLDCADGGAT VQWRGLDTSL GAVQSDAGRS VLTVRNASLS AAGTRVCVGS 101 CGGRTFQHTV RLLVYAFPDQ LTISPAALVP GDPEVACTAH KVTPVDPNAL 151 SFSLLLGDQE LEGAQALGPE VEEEEEPQEE EDVLFRVTER WRLPTLATPV
201 LPALYCQATM RLPGLELSHR QAIPVLH
25 1 0279 75 SEQ ID NR. 51
Gemodificeerde 6.22.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 169
1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt 5 51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG
101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC
151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA
251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG
10 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG
351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG
401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG
451 CCCTGCTCTA GAAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT
501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC
15 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC
601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA
651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA
701 AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA
751 CCTGTGGCAG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC
20 801 CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA
851 GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG 901 GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT 951 CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA 1001 AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CCCCATCGAG 25 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC
1101 CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACGT 1151 GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC 1201 AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC 1251 CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT 30 1301 GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC
1351 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AATGATAG
SEQ ID NR. 52 35 Gemodificeerde 6.22.2 Zware Keten Aminozuursequentie
1 mefqlswvfl vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA
40 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
201 YSLSSWTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP
251 PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE
301 VHNAKTKPRE EQFNSTFRW SVLTWHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE
351 KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY.PSDIAVEWES
45 401 NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVP KSRWQQGNVF SCSVMHEALH
451 NHYTQKSLSL SPGK
1 027 9 75 SEQID NR. 53
Gemodificeerde 6.22.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 170
1 atqttqccat cacaactcat tqqqtttctq ctqctctqqq ttccaqcttc 51 cagqqqtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 5 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT
151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 10 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG
401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG
501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 15 601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA
651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA
SEQ ID NR. 54 20 Gemodificeerde 6.22.2 Kappa Lichte Keten Aminozuursequentie
1 mlpsqliqf1 llwvpasrqE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS
51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE 101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS 151 WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
25 201 SKADYEKHECV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
i i ! 1027975 SEQID NR. 55
Gemodificeerde 6.34.2 Zware Keten Nucleotide Sequentie 171 1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt
51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG
5 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC
151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGCGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 10 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC
401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC
451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC TAGAAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT
501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA
551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG
15 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA
651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTGCTCT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 20 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC 25 1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC
1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG
1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
30 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG
1401 TAAATGATAG
SEQ ID NR. 56
Gemodificeerde 6.34.2 Zware Keten Aminozuursequentie
35 1 mefqlswvfl vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
101 QMNSLRAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV
151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP
40 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVQFNWYV
301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTW HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP
351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSIjTCLV KGFYPSDIAV
401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
451 EALHNHYTQK SLSLSPGK
45 1Ü2?y 75 SEQ ID NR. 57
Gemodificeerde 6.34.2 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 172
1 atqqacatqa qqqtccccqc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct 51 ccqaqqtqcc aqatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 5 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCGGGGC AAGTCAGAGT
151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGTTCTCTG 301 CAACCTGAGG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 10 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG
401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 15 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA
651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG
701 GAGAGTGTTA GTGA
SEQ ID NR. 58 20 Gemodificeerde 6.34.2 Kappa Lichte Keten Aminozuursequentie
1 mdmrvpaqll qllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS 51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 25 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
1027975 SEQ ID NR. 59 173
Gemodificeerde 6.67.1 Zware Keten Nucleotide Sequentie 1 atqaaacacc tqtqqttctt cctcctqctq qtqqcaqctc ccaqatqqqt
51 cctqtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT
5 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT
151 AACTATTGGA gctggatccg GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC tggagtggat
201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG
251 GTCGAGTCAC CATGTCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA
301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA
10 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG
401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCTAGAAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 15 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG
651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA
701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA
751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC
801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG
20 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 25 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC
1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC
1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG
1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
30 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC
1401 GGGTAAATGA TAG
SEQ ID NR. 60
Gemodificeerde 6.67.1 Zware Keten Aminozuursequentie
35 1 mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS
51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTMSV DTSKNQFSLK
101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS
151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
201 QSSGLYSLSS WTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP
40 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY
301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL
351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
45 10279 75 SEQ ID NR. 61
Gemodificeerde 6.67.1 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 174
1 atqqtqttqc aqacccaqqt cttcatttct ctqttqctct qqatctctqq 5 51 tqcctacqqq GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT
101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA ACAATAAGAA CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAGG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG. GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 10 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA
351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG
15 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC
601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA
651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA
701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA
20 SEQ ID NR. 62
Gemodificeerde 6.67.1 Kappa Lichte Keten Aminozuursequentie
1 mvlqtqvfis lllwisqayq DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL
51 YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT
25 101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE
151 QLKSGTASW CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
1 027975
Gemodificeerde 6.77.1 Zware Keten Nucleotide Sequentie 175 SEQIDNR. 63
1 atqqaactqq qqctccqctq qqttttcctt qttqctattt taqaaqqtqt 5 51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG
101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 10 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG
351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCT AGAAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 15 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT
601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAAC TTCGGCAGCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 20 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA
851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 25 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAAGCA AAGGGCAGCC
1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 30 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC
1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT
1401 GTCTCCGGGT AAATGATAG
35 SEQ ID NR. 64
Gemodificeerde 6.77.1 Zware Keten eiwit Sequentie
1 melqlrwvfl vaileqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS
51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL
40 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG
151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
201 VLQSSGLYSL SSWTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE
251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHEDPEVQFN
301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TWHQDWLNG KEYKCKVSNK
45 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD
401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS
451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
1027975 SEQID NR. 65
Gemodificeerde 6.77.1 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 176
1 atqaqqctcc ctgctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqatacctqq 5 51 atccaqtqca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA
101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 10 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT
351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 15 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC
601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
20 SEQ ID NR. 66
Gemodificeerde 6.77.1 Kappa Lichte Keten Aminozuursequentie
1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL
51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
25 101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM SSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
1027975 SEQIDNR. 67
Gemodificeerde 7.26.4 Kappa Lichte Keten Nucleotide Sequentie 177 1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqatacctqq
51 atccaqtqcq GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA
5 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 10 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 . CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC
15 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA
651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
20 SEQ ID NR. 68
Gemodificeerde 7.26.4 Kappa Lichte Keten Aminozuursequentie
1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL
51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
25 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
1027975

Claims (9)

000 IH ss o o I co xx XX SSS I fi oo
1. Menselijk monoklonaal antilichaam of een antigeen bindend deel ervan dat specifiek bindt aan Mucosaal Adressine Cel Adhesie Molecuul (MAdCAM). j
2 OOO XX ZZ ZZ ZZ -XX MM xxx zz zu goop cox zz Zg XX COX XX ZZZ XX zz HQQQ OO COCO 01 2 CO O oo COCO OOO coco coco xxx oo oo oo oo oo coco zmm oo oo ZZZ COCO QQ QQ COCO CO « COCO XXX COCO QQ COKK OO XX xz XX OO COCO «;>> xx xx ZZZ COCO SS COCO XX COCO COCO COCOCO XX SS MHH MX MM MM MM MM MM MMM MM MM OOO coco 3>4 i<3 OO coco coco ooo OO «4«; £&& && &> >> .MM >> >> SSS Μ H >> SSS SS SS SS s^ 3 S SS SSS SS SS UUU HU HU HU HU HU HU HUU HU HU QQQ QQ QQ QQ QQ QQ QQ QQQ QQ QQ ooo oo oo oo oo oo oo o o o o o o o ZZZ zz zz zz zz zz zz ooo zz zz ooo oo oo oo oo oo oo ooo oo oo HHH U« QjQj QjOi *4*4 «Ou 0j« «HOu *4< CUCU 44 4 <. < rtrt < < 0)« I4i4 «4*4 <4i4i4 «0< i4< 999 99 0,01 oo oo oo aa ooo aa oo ««« «« «« et et et et et et et et et et et et et «« S££ fefe >? > > > mm >> SSS SS SS 3S SS SS SS s S S SS SS muhh en X ^ κ « K enen en Z zg en » Q eng gg Pa Pu SS §3 enen ooo Sm oo O 4 4 4 XW XQ XX xz XX xx XXX xx xx zzz eng enen enen enen enen enen enenen enen enen co X X enz enen enen enen enpi enen xxx enen enen tamm w w bi Cu Cu Cu HM Cu Eu Cu Cu puCuw MH Ui Cu ΗΗΕη ΜΗ HM Η H WW ΙΗΗ HH HHH WW E-*F Cufahi Cu H Cm B3 Cm Cu (D Q w u Cu h >4 >i >-i OW EmIm OOO OO OO OO OO OO OO OOO OO OO WWW WW WW WW WW WW WW WWW WW WW SS SS SS tt SS SS SSS tt SS OOL) OU OO OO OU oo oo ooo oo oo WWW WW WW WW h H WW WW WWW H£-« WW ÖSÖ ÖS && «Ö £2 gg fn en tn in 52 3'S xx enen enen umm xx men pop pp «« «« HU OO OO 14(4(4 HH «« OOO OO OO OO mm OO OO OOO mm oo Η«Η H « U« HH HH HH HHH HH HH ZZZ OO O O OO ZZ O O ZZ ZZZ ZZ OO 2>?ï> ï>> ï>> ZZZ ^ï> QQH QQ &> 33 q3 3q >5> QQ OOO OO OO OO OO UQ oo Huu OO OO ppp pp oo öo HH oo oö 23< hh oo ooo oo oo oo oo oo ou ooo oo oo PPP PP en en mm mm mm mm en en en mm enen m Q Q gg o8 Q Q gg 88 gg m S9 oo 8S SS S8 88 888 88 88 ω u u tt 88 88 88 u u tt 888 88 88 ge S S S § S S SS S c <U0> <-> +1 -P 4J 4-1 4->4J IJ £ .. "tlf ili ^ O* <D (L) ü) 0) <D Q) dl rt> i,j n 2 S ** M VMM M 4J .φ y ·* ^ 3 O O P U O U Li π >0* ÖJ 3 (1. ^ ® 3 0) 3<Ü Ü4) 30) 34)4) Oü) 3 « o2ï ·5Μ ·ο n ·ο n -ave -onn 3ÏÏ ^ n -i ? ï ï 0(0 O O *0*0 OiO OflJ o 4 (0 Otfl OU 2 5nS2 «Π3 UU3 QM3 U03 HU3 OU5 *U33 MOS h ° 4 *^ην mhn MUen μ H en μην μ h en en muu mHS br S w n αίσιοι mooi ο μ αίσιοι oimm oi oo vo t αι^ιη αισιΝ wi U m 01 01 y I . y σι . u σι . u ·α· · u 01 · u en . um · . S» . u en 01 Kr, Jïr'.“ O"» >® “'pR §>ΛΡ OIHHN ο>4·° Οιηω Η > Μ Μ H > vo H > eo H > co H > co H > co’ H > co' S*oV H > x' H > en' 1027975 J 1 CC A m u k κ u u ^ M αia: * « * > > 5 5 S m 5 SS a a Ρ5°ζ ωω www μη 333 ** gg «« ss ss gg gg ees OS 2 A AA AA AA O O Q O HH HHH AA ^ ^ HHH HM hm MM Ü O HiJ OU U ΰ ü b h MM üüo uw uu oo bh 55 o o o o o 55 5 5 O O O Η Η >> >> Η Η HH OO UüS 58 33 pop 2 2 aa aa ^ j 55 && a £ ë Sö 22 A A A HH HH HH | A OÖ ICO HHH b. rT HH HHH O O OO OO CU 2 8ö IO SsS HH SS HHH O» O» ÖtD AA HH h h *2 A A A J j OÖ HHH OU pp Op WW I O iJ 3 A *1 *1 HH 58 ΟΟΌ AA AA h h >-» >h i o O O OOO O O AA wddd ζ* f* f* IM HM mmm 8 o HH S ί£, ίί, IH I hl Uitv O O l 01 WW W 2 W ¢¢2 MM o gsg a a i S a a o o a a α o ooo o o 7 SS U 2 2 2 HA »-P J H tA U U HZ 22 222 22 j j pop WH wg WW » A W W 88 UOO Üü zz >* ?* WCD >* >* >< P HH HW HHH HH O O HHH W Z WW WW >> WW HH HHH HH HW >>> Og 0*0 O O* 4 4 OÖ >> >H> >> OW pop o*lal wal o w >> oo oo Soo oo oo >>> pp pp po O O O O >> > > > > > OO QOQ Η H HH HM UW HH OO OQO OO HW W U W HH HH HH 4 4 HH U U U U U UU HH 4 4 4 HH HH HH OO HH 4 4 2 2 rtj S 3 mm wwu 4 < grf 44 ^ ^ 44 as aas sa s s > ;> > AA S5 AA WW AA > > > > > >5 μη WWW O O OO OO WW ΩΟ WW WWW WW OO WWW AU WM UQ MM UU WW WWW WW UU HHH A Α 4 A A HH AA HH Η Μ H HH AA WWW OO 3u OO* oo WW WWW WW oo QQQ Q Q Q Q Q Q Η H Q Q Q Q QQQ J j q Q HHH co co co O co H b ε SS SS SÖS SS SS b b h COCO Z Z co & Q Q co co bh bbb bb co CO QOQ HM HH HH HH HH QQ QQQ QQ HH HHH Ei Éi Η H Η H O O HH HH HHH HH HH OOO J J fl>l Q Q COCO QQ U O UOO OO btu {3 59 52 PP pp pp O O HH COCO CO CO CO CO CO HH O O O bb bb bb COCO bb OO OOO ÖO bb co co co Q Q Q Z QQ OO QQ coco co co co co co QQ OOO HH HH HH COCO HH OO OOO OO HH CO CO CO OO OO OO bb OO CO CO CO CO CO COCO OO bbb COCO COCO COCO CC CC co CO bb bbb bb coco ggg OO OO OO QQ OO SS SSS SS OO QQQ COCO COCO COCO bb COCO QQ QQQ QQ COCO o,bb OO OO OO >> OO bb bbb bb OO >>> COCO COCO COCO OO CO ¢6 >> >>> >> coco OOO b b bb hb COX bb OO OOO OO bb www. ot CC cC cC cc cC hu cc iC coco cococo coco tc cc (¾¾¾¾ CO CO CO <0 0303 bb CO co bb bbb <f£ COCO S « g « b b bb bb HH bb g Bi CCtCcC SS bb qSS2 > > >> COCO. >> SS SZS SS >> cj co co co oo oo OO rtril OO coco cn m cn coco oo OOO COCO H CO O g SS SS >> >>> oo HH PPÖ Q Q bb co 2 !»S oS wu ω w w qq ΞΞ HH>1 QQ 5SSS QQ HH QQ HH HHH HH Q Q HHH COCO OO CO O QQ COCO HH HHH HH sS i’i d 2 S 5¾ «2 ïï d d ΰ ïï dd d ^ ^ ^ q coco ?! fC bb <1=5 QQ QQQ QQ n*S?5? r r· ÖÖ SS °* P «« oo ooa oa qq bbb bb bb HH bb HH bb bbb bb HH 2159,¾ HH HH HH O O HH bb bbb COCO HH OOO QQ QQ QQ O Ui QQ O O OOO O O QQ ΰ O O &> J J AA OO OOO OO J J SSS gg SS gg SS SSS SS SS sss ss sa ss ηh ss ss sss ss ss III Sg S2 g£ 33 gg II ëë gg QQQ W A W W W W ni a WW Pz ? S S OO WW h! ij o* o oo oo ><>· oo a j j a j j oo 2*9 99 99 S δ o o S5 S Ö Ö SS o o* 5 5? >J WW >< » HH HHH zS HH Η Η A 2 2 22 22 ZZ 22 WW WHW C S OOO ZZ WW ZZ ZZ ZZ oo OOO OO tz fz ^ ZZZ ^ ^ WW ^3 DO OQO ZZ SS Ωύ ¥1 ¥1 Ά η H WW HH WW HH WW WHW OO HH «OÖO WW WW WW HH WZ W»J WWH WW ZZ
2. Menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend ! 5 deel volgens conclusie 1, waarbij genoemd antilichaam of deel ten minste één van de volgende eigenschappen bezit: (a) bindt aan menselijk cellen; (b) heeft een selectiviteit voor MAdCAM over VCAM of fibronectine van ten minste 100 voudig; 10 (c) bindt aan menselijk MAdCAM met een Ka van 3 x 1010 M of lager; (e) remt de binding van oup7 exprimerende cellen aan menselijk MAdCAM; of (f) remt de recrutering van lymfocyten naar lymfatisch 15 weefsel van maagdarm.
3. Menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens conclusie 2, waarbij genoemd antilichaam of deel menselijk MAdCAM bindt met een Ka van 3 x 10·10 M of lager en ou β7 binding aan menselijk MAdCAM remt.
4. Hybridoma cellijn die het menselijk monoklonaal antilichaam volgens conclusie 1 produceert, waarbij de hybridoma is gekozen uit de groep bestaande uit 1.7.2 (ECACC Toegang Nr. 03090901), 1.8.2 (ECACC Toegang Nr. 03090902), 6.14.2 (ECACC 1027975- Toegang Nr. 03090903), 6.22.2 (ECACC Toegang Nr. 03090904), 6.34.2 (ECACC Toegang Nr. 03090905), 6.67.1 (ECACC Toegang Nr. 03090906), 6^73.2 (ECACC Toegang Nr. 03090907), 6.77.1 (ECACC Toegang Nr. 03090908), 7.16.6 (ECACC Toegang Nr. 03090909), 7.20.5 5 (ECACC Toegang Nr. 03090910), 7.26.4 (ECACC Toegang Nr. 03090911), en 9.8.2 (ECACC Toegang Nr. 03090912).
5 S | K* g g X X ipi xx xx xxx en én oo XXX 10* QQ XX Μ Η XX XX XXX OO OO QQQ I » SS XX > Q IQ | S i QQ m en SS m ι h w * 6* op xx oo i o ss i80 o 3 xiS g « f po xx χ x « « iw oo m en en x x a ,4 S > > > x £ X X g Η > H i O mm m m m xx H 5 u 'SS PP x X S» 3 SH rtrt en en η οι n xx ibj 1 o ö xx io χ x e-»h >> xx co m m t ct ix xxx oo io· icn mm «4 «4 oo ioo i> ! 2 XXX 1(¾ IQ IQ 1« MM |Q I U U 6 O yyo 3 3 «2 «2 ia is «2 «SS in ! 2 xxx « « 3 3 *4 <4 «2 <3 3c a < < «2 c« xxx pp po po «: *c oo oo ooo 33 oo >>> XX XX XX. oo XX XX XXX OO XX (4 (4 »4 XX xx xx xx xx xx xxx χχ χ χ QQQ *4 (4 «4 3 tt ft >> ft ft (4 tf tt ft ft >> ft ft WWW XX X X Η H (4 (4 X 3 XX h H ft ft X X XXX QQ QQ QQ h h QQ QQ QQQ χ χ QQ ZZZ HU HU U Η Ω Q HU HU QQQ QQ ω H QQQ S ^ < < < ft ft < rt ft rtrt m en en ft ft 33 co en co « « « « «co 33 « « 2 2 et et et 33 2 2 ggg QQ QQ QQ XX QQ QQ QQQ HH QQ. SSS co eo coco coco >> coco coco co co CO >> coco OOO gg g g gg COCO gg gg ««« COCO Z Z QQQ SS SS SS coco 2 2 SS qqq coco SS XXX OO OO OO QQ OO OO HOU QQ ΘΘ QQQ QQ QQ QQ Z Z QQ QQ SSS Z Z QQ Η X Η XX XX XX QQ XX XX XXX QQ XX g g g pp pp PP Q Q Q 4 4 < COCO QQ Z Z Z XX XX XX HU XX COCO XXX Η H XX co co co g Z ZB ZZ OO ZZ 22 co co co OO ZZ qqq 22 hh Hz z z 2 z 22 xxx zz 2z §QQ CO Οι COCO COCO «2 COCO 3)4 co co co 22 coco «« zen zz ZZ coco ZZ ZZ XXX coco ZZ COCOCO QQ QQ QQ XX QQ QQ QQQ χχ Qq MMM «« «« «« aq «« 2 « x 3 X QQ et 2 XXX COCO COCO COCO >3 COCO COCO X X co >Q coco EubH MM MM MM CO Q MM MM SSS COCO MM ««« XX XX χχ SH χχ χχ XXX SS XX OOO HU Eu b Hm XX Hm HH >^> XX WH HHH « « «« «« >> «« 2 « Ct Ct Ct >> Ct Ct >>> OO OO OO «« OO OO OOO «« OO OiOiOj HZ ZZ ZZ CO O ZZ ZZ OOO COCO zz 4 4 4 >> >> >> z et >> >> «Z >> »4 >4 COCO COCO COCO QQ coco coco ZzZ QQ coco XXX QQ QQ QQ COCO QQ QQ OOO COCO QQ qqq «:«: <4<< 3 rt HH rte; «:«: rtirtrt «« <3 XXX XX XX XX ZZ XX XX xxx ZZ xx XXX XX XX XX XCO XX XX ZZZ XX XX
5. Menselijk monoklonaal antilichaam geproduceerd door de hybridoma cellijn volgens conclusie 4 of een antigeen bindend deel van genoemd monoklonaal antilichaam.
6. Menselijk monoklonaal antilichaam volgens conclusie 5, waarbij het C-terminale lysine van de zware keten is afjgesplitst.
7. Menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel ervan volgens een van conclusies 1 of 5, waarbij genoemd antilichaam of antigeen bindend deel binding van menselijk MAdCAM 15 aan α4β7 remt en waarbij het antilichaam of deel ervan ten minste één van de volgende eigenschappen heeft: (a) kruis-competeert met een referentie antilichaam voor binding aan MAdCAM; (b) competeert met een referentie antilichaam voor binding 20 aan MAdCAM; (c) bindt aan dezelfde epitoop van MAdCAM als een referentie antilichaam; (d) bindt aan MAdCAM met in hoofdzaak dezelfde Ka als een referentie antilichaam; 25 (e) bindt aan MAdCAM met in hoofdzaak dezelfde af-snelheid als een referentie antilichaam; waarbij het referentie antilichaam is gekozen uit de groep die bestaat uit: monoklonaal antilichaam 1.7.2, monoklonaal antilichaam 1.8.2, monoklonaal antilichaam 6.14.2, monoklonaal 1027975- antilichaam 6.22.2, monoklonaal antilichaam 6.34.2, monoklonaal antilichaam 6.67.1, monoklonaal antilichaam 6.73.2, monoklonaal antilichaam 6.77.1, monoklonaal antilichaam 7.16.6, monoklonaal antilichaam 7.20.5, monoklonaal antilichaam 7.26.4, monoklonaal 5 antilichaam 9.8.2, monoklonaal antilichaam 6.22.2-mod, monoklonaal antilichaam 6.34.2-mod, monoklonaal antilichaam 6.67.1-mod, monoklonaal antilichaam 6.77.1-mod en monoklonaal antilichaam 7.26.4-mod.
8. Monoklonaal antilichaam dat specifiek MAdCAM bindt, 10 waarbij het antilichaam is gekozen uit de groep die bestaat uit: (a) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQID NO: 2 en SEQID NO: 4, zonder de signaal sequenties; (b) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties 15 gegeven in SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, zonder de signaal sequenties; (c) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 10 en SEQ ID NO: 12, zonder de signaal sequenties; 20 (d) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 14 en SEQ ID NO: 16, zonder de signaal sequenties; (e) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 18 en SEQ ID NO: 20, zonder de signaal 25 sequenties; (f) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 22 en SEQ ID NO: 24, zonder de signaal sequenties; 1 027975- (g) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 26 en SEQID NO: 28, zonder de signaal sequenties; (h) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties 5 gegeven in SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 32, zonder de signaal sequenties; (i) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 36, zonder de signaal sequenties; 10 (j) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 38 en SEQ ID NO: 40, zonder de signaal sequenties; (k) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 42 en SEQ ID NO: 44, zonder de signaal 15 sequenties; (l) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 46 en SEQ ID NO: 48, zonder de signaal sequenties; (m) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties 20 gegeven in SEQ ID NO: 52 en SEQ ID NO: 54, zonder de signaal sequenties; (n) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 56 en SEQ ID NO: 58, zonder de signaal sequenties; 25 (o) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 60 en SEQ ID NO: 62, zonder de signaal sequenties; (p) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQ ID NO: 64 en SEQ ID NO: 66, zonder de signaal 30 sequenties; and 1027975- (q) een antilichaam omvattende de aminozuursequenties gegeven in SEQID NO: 42 en SEQID NO: 68, zonder de signaal sequenties.
9. Monoklonaal antilichaam of een antigeen bindend deel 5 ervan, waarbij de zware keten van genoemd antilichaam of deel ervan omvat de zware keten CDRl, CDR2 en CDR3 of waarbij de lichte keten omvat de lichte keten CDRl, CDR2 en CDR3 van een monoklonaal antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2- 10 mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod.
10. Monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens conclusie 9, waarbij genoemd antilichaam of deel omvat een zware keten die een menselijk VH 1-18 gen, een menselijk VH 3-15 gen, een menselijk VH 3-21 gen, een menselijk VH 3-23 gen, een menselijk VH 3- 15 30 gen, een menselijk VH 3-33 gen of een menselijk VH 4-4 gen gebruikt.
11. Monoklonaal antilichaam of een antigeen bindend deel ervan volgens conclusie 10, waarbij genoemd antilichaam of deel omvat een lichte keten die een menselijk Vk A2 gen, een menselijk Vk A3 gen, 20 een menselijk Vk A26 gen, een menselijk Vk B3 gen, een menselijk Vk 012 gen of een menselijk Vk 018 gen gebruikt.
12. Menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens conclusie 1, waarbij de zware keten variabele regio, de lichte keten variabele regio of beide ten minste 90% identiek in 25 aminozuursequentie zijn aan de overeenkomstige regio of regio's van een monoklonaal antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: monoklonaal antilichaam 1.7.2, monoklonaal antilichaam 1.8.2, monoklonaal antilichaam 6.14.2, monoklonaal antilichaam 6.22.2, monoklonaal antilichaam 6.34.2, monoklonaal antilichaam 6.67.1, 1027975- monoklonaal antilichaam 6.73.2, monoklonaal antilichaam 6.77.1, monoklonaal antilichaam 7.16.6, monoklonaal antilichaam 7.20.5, monoklonaal antilichaam 7.26.4 monoklonaal antilichaam 9.8.2, monoklonaal antilichaam 6.22.2-mod, monoklonaal antilichaam 6.34.2-5 mod, monoklonaal antilichaam 6.67.1-mod, monoklonaal antilichaam 6.77.1- mod en monoklonaal antilichaam 7.26.4-mod..
13. Monoklonaal antilichaam of een antigeen bindend deel ervan dat specifiek bindt MAdCAM, waarbij: (a) de zware keten omvat de zware keten CDR1, CDR2 en
10 CDR3 aminozuursequenties van een referentie antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod (b) de lichte keten omvat de lichte keten CDR1, CDR2 en
15 CDR3 aminozuursequenties van een referentie antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod (c) het antilichaam omvat een zware keten van (a) en een 20 lichte keten van (b); en (d) het antilichaam van (c) waarbij de zware keten en lichte keten CDR aminozuursequenties zijn gekozen uit hetzelfde referentie antilichaam.
14. Monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens 25 conclusie 13, waarbij de zware keten, de lichte keten of beide omvatten de aminozuursequentie vanaf het begin van de CDR1 tot en met het einde van de CDR3 van respectievelijk de zware keten, de lichte keten, of beide, van het referentie antilichaam. 1027975-
15. Monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens conclusie 13, waarbij genoemd antilichaam omvat: (a) een zware keten omvattende de zware keten variabele regio aminozuursequentie van een antilichaam gekozen uit de groep die 5 bestaat uit: 1.7.2 (SEQID NO: 2); 1.8.2 (SEQID NO: 6); 6.14.2 (SEQ ID NO: 10); 6.22.2 (SEQ ID NO: 14); 6.34.2 (SEQ ID NO: 18); 6.67.1 (SEQ ID NO: 22); 6.73.2 (SEQ ID NO: 26); 6.77.1 (SEQ ID NO: 30); 7.16.6 (SEQ ID NO: 34); 7.20.5 (SEQ ID NO: 38); 7.26.4 (SEQ ID NO: 42); en 9.8.2 (SEQ ID NO: 46); 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 52); 6.34.2-mod 10 (SEQ ID NO: 56); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64); en 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42); (b) een lichte keten omvattende de lichte keten variabele regio aminozuursequentie van een antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2 (SEQ ID NO: 4); 1.8.2 (SEQ ID NO: 8); 6.14.2 (SEQ
15 ID NO: 12); 6.22.2 (SEQ ID NO: 16); 6.34.2 (SEQ ID NO: 20); 6.67.1 (SEQ ID NO: 24); 6.73.2 (SEQ ID NO: 28); 6.77.1 (SEQ ID NO: 32); 7.16.6 (SEQ ID NO: 36); 7.20.5 (SEQ ID NO: 40); 7.26.4 (SEQ ID NO: 44); en 9.8.2 (SEQ ID NO: 48); 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 54); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 62); 6.77.1-mod (SEQ ID
20 NO: 66); en 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 68); of (c) de zware keten van (a) en de lichte keten van (b).
16. Monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17, dat een immunoglobuline G (IgG), een IgM, een IgE, een IgA of een IgD molecuul, een gehumaniseerd antilichaam, een chimaer 25 antilichaam of een bispecifiek antilichaam is.
17. Antigeen bindend deel volgens een van conclusies 1-3, 5-7 en 9-16, dat een Fab fragment, een F(ab’)2 fragment, een Fv fragment of een antilichaam uit een enkele keten is. 1027975-
18. Farmaceutische samenstelling omvattende een effectieve hoeveelheid van het monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel ervan volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 en een farmaceutisch aanvaardbare drager.
19. Methode voor behandeling van inflammatoire ziekte in een subject dat daaraan behoefte heeft, omvattende de stap van toediening aan genoemd subject van het monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel ervan volgens een van conclusies 1-3 en 5-17, waarbij genoemd antilichaam of antigeen bindend deel binding van MAdCAM 10 aan oup7 remt.
20. Methode volgens conclusie 19, waarbij de inflammatoire ziekte een inflammatoire ziekte van het maagdarmkanaal is.
21. Methode volgens conclusie 20, waarbij de inflammatoire ziekte van het maagdarmkanaal is gekozen uit de groep bestaande uit 15 ontstoken-darm ziekte, ziekte van Crohn, ulceratieve colitis, diverticula ziekte, gastritis, lever ziekte, primaire gal sclerosis en sclerosing cholangitis.
22. Methode volgens conclusie 20, waarbij de ontstoken-darm ziekte de ziekte van Crohn, ulceratieve colitis of beide is. 2Ω
23. Methode volgens conclusie 20, waarbij de inflammatoire ziektes insuline-afhankelijke diabetes en graft versus host ziekte zijn.
24. Geïsoleerde cellijn die het monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of de zware keten of lichte keten van genoemd antilichaam of van genoemd 25 deel ervan produceert.
25. Cellijn volgens een van conclusies 4 of 24 die een antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 1027975- 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 en 9.8.2, of een antilichaam omvattende de aminozuursequenties van één van genoemde antilichamen produceert.
26. Cellijn volgens conclusie 25 die een monoklonaal 5 antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod of een antilichaam omvattende de aminozuursequenties van één van genoemde antilichamen produceert.
27. Geïsoleerd nucleïnezuur molecuul omvattende een 1° nucleotide sequentie die codeert voor de zware keten of een antigeen bindend deel ervan of de lichte keten of een antigeen bindend deel ervan van een antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17.
28. Vector omvattende het nucleïnezuur molecuul volgens conclusie 27, waarbij de vector optioneel omvat een expressie controle 15 sequentie werkzaam verbonden met het nucleïnezuur molecuul.
29. Gastheercel omvattende de vector volgens conclusie 28 of het nucleïnezuur molecuul volgens conclusie 27.
30. Gastheercel volgens conclusie 29 omvattende een nucleïnezuur molecuul coderend voor de zware keten of een antigeen 20 bindend deel ervan en een nucleïnezuur molecuul coderend voor de lichte keten of een antigeen bindend deel ervan van een antilichaam of antigeen bindend deel volgens een van conclusies 1-3 en 5-17.
31. Methode voor het produceren van een menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel ervan dat specifiek
25 MAdCAM bindt, omvattende het kweken van de gastheercel volgens conclusie 29 of 30 of de cellijn volgens een van conclusies 4 of 24 onder geschikte condities en het winnen van genoemd antilichaam of antigeen bindend deel. 1 027975-
32. Niet-menselijk transgeen dier of transgene plant omvattende (a) een nucleïnezuur molecuul coderend voor de zware keten of een antigeen bindend deel ervan; (b) een nucleïnezuur molecuul coderend voor de lichte keten of een antigeen bindend deel 5 ervan; of (c) zowel (a) als (b) van een antilichaam volgens een van conclusies 1-3 of 5-17, waarbij het niet-menselijke transgene dier of transgene plant genoemde zware keten of lichte keten of beide tot expressie brengt.
33. Methode voor het isoleren van een antilichaam of antigeen 10 bindend deel ervan dat specifiek bindt aan MAdCAM, omvattende de stap van het isoleren van het antilichaam uit het niet-menselijke transgene dier of transgene plant volgens conclusie 32. f
34. Methode van behandeling van een subject dat daaraan behoefte heeft, met een menselijk antilichaam of antigeen bindend deel 15 ervan dat specifiek bindt aan MAdCAM en binding aan 014 β7 remt omvattende de stappen van: (a) toediening van een effectieve hoeveelheid van een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul coderend voor de zware keten of een antigeen bindend deel ervan, een geïsoleerd nucleïnezuur molecuul 20 coderend voor de lichte keten of een antigeen bindend deel ervan, of nucleïnezuur moleculen coderend voor de lichte keten en de zware keten of antigeen bindende delen ervan; en (b) expressie van het nucleïnezuur molecuul.
35. Methode voor het produceren van een menselijk 25 monoklonaal antilichaam dat specifiek MAdCAM bindt, omvattende de stappen van: (a) immunisatie van een niet-menselijk transgeen dier dat in staat is tot productie van menselijke antilichamen, met MAdCAM, met 1027975- ι een immunogeen deel van MAdCAM of met een cel of weefsel dat MAdCAM tot expressie brengt; en (b) het transgene dier een immuunrespons tegen MAdCAM laten lanceren.
36. Menselijk monoklonaal antilichaam geproduceerd door de methode volgens conclusie 35. |
37. Methode voor het remmen van (X4 β7 binding aan cellen die menselijk MAdCAM tot expressie brengen, omvattende het in contact brengen van de cellen met het monoklonaal antilichaam volgens een 10 van conclusies 1-3 en 5-17 of een antigeen bindend deel ervan.
38. Methode voor het remmen van MAdCAM-gemedieerde leukocyt-endotheelcel adhesie omvattende het in contact brengen van | de endotheelcellen met het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of een antigeen bindend deel ervan.
39. Methode voor het remmen van MAdCAM-gemedieerde leukocyt adhesie, migratie en infiltratie in weefsels omvattende de stap van het in contact brengen van de endotheelcellen met het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of een antigeen bindend deel ervan.
40. Methode voor het remmen van ou β7 /MAdCAM- afhankelijke cellulaire adhesie omvattende de stap van het in contact brengen van cellen die menselijk MAdCAM tot expressie brengen, met het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of antigeen bindend deel ervan.
41. Methode voor het remmen van de MAdCAM-gemedieerde recrutering van lymfocyten naar lymfatisch weefsel van maagdarm, omvattende de stap van het in contact brengen van cellen die menselijk 1027975- MAdCAM tot expressie brengen, met het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of antigeen bindend deel ervan.
42. Monoklonaal antilichaam of een antigeen bindend deel ervan dat specifiek MAdCAM bindt, waarbij genoemd antilichaam of 5 deel ervan omvat één of meer van een FR1, FR2, FR3 of FR4 aminozuursequentie van een menselijk monoklonaal antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod.
43. Menselijk monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens conclusie 1, waarbij het antilichaam omvat: (a) een zware keten aminozuursequentie die ten minste 90% identiek is aan de zware keten aminozuursequentie van een monoklonaal antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 15 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod; (b) een lichte keten aminozuursequentie die ten minste 90% identiek is aan de lichte keten aminozuursequentie van een monoklonaal antilichaam gekozen uit de groep die bestaat uit: 1.7.2, 20 1-8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod en 7.26.4-mod; (c) zowel (a) als (b); of (d) of (a), of (b) of (c), met of zonder de signaal sequentie.
44. Methode voor diagnose van een stoornis die door 25 circulerend oplosbaar menselijk MAdCAM wordt gekenmerkt, omvattende de stappen van: (1) het in contact brengen van een biologisch monster met het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of antigeen bindend deel en (2) het detecteren van binding. 1 027975-
45. Methode voor detectie van ontsteking in een subject omvattende de stappen van: (1) toediening aan genoemd subject van het monoklonaal antilichaam of antigeen bindend deel volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 waarbij genoemd antilichaam of deel ervan 5 detecteerbaar gelabeld is en (2) detectie van binding.
46. Diagnostische kit omvattende het monoklonaal antilichaam volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of antigeen bindend deel.
47. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 18 verder 10 omvattende één of meer additionele anti-inflammatoire of immuno- modulatoire middelen.
48. Farmaceutische samenstelling volgens conclusie 47, waarbij de één of meer additionele anti-inflammatoire of immuno-modulatoire middelen zijn gekozen uit de groep die bestaat uit: corticosteroiden, aminosalicylaten, azathioprine, methotrexaat, cyclosporine, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamycine, anti-TNFa middelen en adhesie molecuul antagonisten.
49. Vaccin omvattende een effectieve hoeveelheid van het menselijk antilichaam ervan volgens een van conclusies 1-3 en 5-17 of 20 antigeen bindend deel en een farmaceutisch aanvaardbare drager.
50. Vaccin volgens conclusie 49, waarbij het vaccin mucosaal is.
51. Methode voor het detecteren van het effect van toediening van een remmend anti-MAdCAM antilichaam of antigeen bindend deel
25 Qrvan aan een subject omvattende de stappen van: (a) toediening aan een subject van een menselijk monoklonaal antilichaam dat specifiek bindt aan MAdCAM; en 1027975- (b) bepaling of er een toename is in de niveau's van circulerende ouPv-exprimerende leukocyten.
52. Methode volgens conclusie 51, waarbij genoemde leukocyten lymfocyten zijn.
53. Methode volgens conclusie 51, waarbij genoemde toename in de niveau's van circulerende ot4P7-exprimerende leukocyten door FACS analyse wordt bepaald. 1027975- »· I < < < < __ ^ < < co co co co , < *t w w co co djrtjrtj co co < < co co co CO >> CO co co >> £ w co co >> hh wenen Η h (4 (4 en en >> Η H > > >>> > ·> CO CO >> χ X SS El EL CEjEh El £ ^ ~ - E25? < < XX >> XX H H >>> EH H *5 *ï 'Ï £*5* CO CO ^ > Q Q XX O O XXX o O 5252¾ Ejfj pp x x x x o o o o h h h SS CO CO CO > > >> XX O O O O OU O O O OO < ft >>s» q q x x oo qS oo ss ασο ss Sm xxx x x >> σα ö o 33 5? ooo Ss mm >>> 5¾¾ ε-* ei oo ss SS α α 333 aa >> qqq oo* x x 3 ? z x qq ss SSS s ü e-ieh fht< OO OO SS QQ S2 OO QQQ ÖÖ >> OOO SS OO QQ HH 88 * χ SSS SS 33 Soa SS oo 2S i Cu xx xx ooo xx χ χ
9 WW OO WW WH »4h a H WW »^h3i-3 HH HH H HH HH J J J J J HH WWW WW CO pd CO Z WW WZ WW WWW WW Q Q OOO 04 ÖO OÖ oo o 5 oo* o o o oo oo WWW WW WW WW WW WW WW CO W z WW WW ggg SS SS SS bb SS 3S Sb b 22 SS OOO OO OO OO OO OO OÖ OOO oo oo 2 52 “ HH HH Z Z HH Ui W WWW OTOT Η H η H HH HH HH H h HH HHH HH HH 5?i2S && H Η H HH cg cn ui ui cn cn cn hh 4 rt! rt ^ ^ ^ ^ ^ ^ 44 ^ ^ 4 4 4 4 4 4 id! s s ?ί Ρΐ Pi riK SS CC CC bb bbb bb CC CC WWW SS MW QQ UU QQ oo OOO WW QQ ggg gg 5? ï? “U uo oo oo ooo oo oo PiPlpi PPi >> QQ >> b04 bbb bb >> ggg <22 È5&1 wm mw HHH hh Ui Ui S· > > C Λ t»> <«< >> «ca: >> >>> ε S ft ri bbb coco cn CO COCO rtrt COCO COCO COCOCO bb MO QQQ QQ O O QQ QQ QQ QQ j j j qq qq qqq 52S Pip! 0303 ^303 0303 ϋ3Μ COCOCO COCO COCO iPïPïP gg PP o co qq coco qq qqq qq men . SSS SS SS SS SS SS HH HHH SS SS -Η οσσ oo oo SS 88 SS δα SSS SS SS η Ëë 5S gg gg gg gg ggg gg gg !? SSS o o >> ö o 55 SS >5 5 5 io O o S q SS SS SS SS SS SS SSS SS SS SS 2 S S S S S §§ § c ωαΐ ω ® o ω ω α> β> « “ — — 5 *0 *0 m <0 (om (0 ^ A boaa Q«| -al ü& Λ·^ο: Üft w α ua 3 “III -!* sls 2IS aja 33a 33a! ssl slS 5P ssw. SS^· 88Ί 8 8 2^ rV, -H PI ^ ^ 0<wP O'0'^ S aH ¢5 0“*° §>C0CD P"( h ft Η H h o Ό ’h ft CD b o co h m Vf> b o co h < co h < r~’ p-’ h S r·’ tooi 1027975 I I 3 of 9 Figure 2 Figure 2A 1.7.2 —MRLPAQLLGLLMLWV S—GSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLQS-NGY 1.8.2 —MRLPAQLLGLLMLWVS—GSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLQS-NGF 7.20.5 —MRLPAQLLGLLMLWVS—GSSGDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHG-NGY 7.16.6 —MRLPAQLLGLLMLWIP—GSSADIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHT-DGT 7.26.4 —MRLPAQLLGLLMLWIP—GSSADIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSNQSLLYS-DGK 6.77.1 —MRLPAQLLGLLMLWIP—GSSADIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCNSSQSLLLS-DGK 6.67.1 —MVLQTQVFISLLLWIS—GAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNK 6.34.2 MDMRVPAQLLGLLLLWLR—GARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSY---- 6.73.2 MDMRVPAQLLGLLLLWLR—GARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQNITNY---- 6.14.2 MDMRVPAQLLGLLLLWLR—GARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRSISSY---- 9.8.2 MDMRVPAQLLGLLLLWLSVAGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNY---- 6.22.2 ---MLPSQLIGFLLLWVP—ASRGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQRIGSS---- • · ★ · . ★ · ** . ^ » ··*.*★·★ . · «*··> 1.7.2 NYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYGMQ 1.8.2 NYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ 7.20.5 NYLDWYLQKPGQS PQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ 7.16.6 TYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQ 7.26.4 TYLFWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ 6.77.1 TYLNWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYSCMQ 6.67.1 TYLAWYQQKPRQPPKLLIYWASIREYGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQ 6.34.2 —LNWFQQKPGKAPKLLIYAASGLKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRTLQPDDFATYSCHQ 6.73.2 —LNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLPRGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ 6.14.2 —LNWYQQKPGKAPKVLIFFVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ 9.8.2 —LNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYSCQH 6.22.2 —LHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTNFTLTINGLEAEDAATYYCHQ ★ * J * * * · ^ ★ · · * * * * * * ^ * * *★**★*.★*. ^* . . ^ ★ *· * · 1.7.2 ALQT---ITFGQGTRLEIKR 1.8.2 ALQT---ITFGQGTRLEIKR 7.20.5 ALQT---LTFGGGTKVEIKR 7.16.6 NIQLP—WTFGQGTKVEIKR 7.26.4 SIQLP—WTFGQGTKVEIKR 6.77.1 SIQLM—CSFGQGTKLEIKR 6.67.1 YYSIPP-LTFGGGTKVEIKR 6.34.2 SYSLP—FTFGPGTKVDIKR 6.73.2 SYSNPPECGFGQGTTLDIKR 6.14.2 NYIPP—ITFGQGTRLEIRR 9.8.2 SDNLS—ITFGQGTRLEIKR 6.22.2 SGRLP—LTFGGGTKVEIKR ****..*.* 6.73.2 6.14.2 6.67.1 _______6.22.2 7.20.5 7.16.6 i.flsi \ 7·25·4 6.77.1 1027975 I I 4 of 9 Figure 2B 7.16.6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGINWVRQAPGQGLEWMGWIS--VYSGNT 7.26.4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTSYGIDWVRQAPGQGLEWMGWIS--VYSGNT 1.7.2 BVQLVBSGGGLVKPGGSLRLS CVASG FTFTNAWMIWVRQAP GKGLEWVGRIKRKTDGGTT 1.8.2 EVQLVESGGGLVKPGG SLRLS CWSG FTFTNAWMIWVRQAPGKGLBWVGRI KRKTDGGTT 6.14.2 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLS CAASGLTFNHSAMTWVRQAPGKGLBWVSTTS--GSGGTT 6.73.2 EVQLLBSGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMNHVRQAPGKGLEWVSVIS-'GRGGTT 6.77.1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIS--SSSSYI 6.22.2 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAASGHTFSSDGMHWVRQAP GKGLEWVAIIW - -YDGSNK 6.34.2 QVQLVE SGGGWQPGR SLRLS CAASGFTFSS YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS - - NDGNNK 9.8.2 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGK6LBWVAVIW- - YDGSNE 7.20.5 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSSISSYHWNWIRQPAGKGLEMIGRIY---TSGST 6.67.1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISSNYWSWIRQPAGKGLEWIGRIY---TSGGT .·*** ;** ; .*. ;* .** . *;** *.****., 7.16.6 NYAQKVQGRVTMTADTSTSTAYMDLRSLRSDDTAVYYCAREG-SS--SSGDYYYGMDVWG 7.26.4 NYAQKLQGRVTMSTDT STSTAFFLLRSLRSDDTAVYYCARBG-SS--SSGDYYYGMDVWG 1.7.2 DYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTGG------VABDY-----WG 1.8.2 DYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTBDTAVYYCTTGG------VABDY-----MG 6.14.2 YYADSVKGRFTISRDS PKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARG-YSYGTTPYBY-----WG 6.73.2 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKIA-VAGEGLYYYYG-MDVWG 6.77.1 YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDG-YSSGWSYYYYYGMDVWG 6.22.2 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYIiQMNSLRAEDTAVYYCARD-------PGYYYG-MDVWG 6.34.2 Y YADSVKGRFTISRDN SKNTL YLQMNSLSAEDTAVYYCARD S - TA - - ITYYYYG - MDVWG 9.8.2 YYADSVKGRFTISRDN SKNTL YLQMNSLRABDTAVYY CARG----------AYH-FAYWG 7.20.5 NYNPSLKSRVTMSLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGVRYYYASGSYYYGLDVWG 6.67.1 NSNPSLRGRVTILADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARD --RITIIRGLIPSFFDYWG * ... : : : *;·****; ** 7.16.6 QGTTVTVSSA 7.26.4 QGTTVTVSSA 1.7.2 QGTLVTVSSA 1.8.2 QGTLVTVSSA 6.14.2 QGTLVTVSSA 6.73.2 QGTTVTVSSA 6.77.1 QGTTVTVSSA 6.22.2 QGTTVTVSSA 6.34.2 QGTTVTVSSA 9.8.2 QGTLVTVSSA 7.20.5 QGTTVTVSSA 6.67.1 QGTLVTVSSA *** ****** 1.7.2··*·2 \ 6-2S.&.2 5.67.1 \ K, 9.3.2 7.50.5 '—J / \ ^0.14.2 / 6.73.2 6 77 1 7.26.4 7.16.6 1027975 5 of 9 Figure 3 Domein 1 A A' B cyno MAdCAM MDRGLALLLAGLLGLLQPGCGQSLQVKPLQVEPPEPWAVALGASRQLTCRLDCADGGAT mens MAdCAM MDFGLALLLAGLLGLLL---GQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQLTCRLACADRGAS ** ************* ******************************** *** **. _C_ D E F G_ cyno MAdCAM . VQWRGLDTSLGAVQSDAGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVRLLVYAFPDQ mens MAdCAM VQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQ *+★★*****★**·**★★♦★*★★**★*·********★****★★★★★****★ + *»**★*·*★★** Domein 2 _A_ B C D cyno MAdCAM LTISPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLLGDQELEGAQALGPEVEEEEE-PQE mens MAdCAM LTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQG **·*************·*******************· *^ **★**********·**** *★ E F G cyno MAdCAM EEDVLFRVTERWRX.PTLATPVLPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLH mens MAdCAM DEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLH .****************** ************************** 1027975 i
NL1027975A 2004-01-09 2005-01-07 Antilichamen tegen MAdCAM. NL1027975C2 (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53549004P 2004-01-09 2004-01-09
US53549004 2004-01-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NL1027975A1 NL1027975A1 (nl) 2005-07-12
NL1027975C2 true NL1027975C2 (nl) 2005-12-23

Family

ID=34794356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL1027975A NL1027975C2 (nl) 2004-01-09 2005-01-07 Antilichamen tegen MAdCAM.

Country Status (38)

Country Link
US (6) US9328169B2 (nl)
EP (2) EP1709080B1 (nl)
JP (7) JP4315982B2 (nl)
KR (2) KR20120048644A (nl)
CN (1) CN1956738B (nl)
AP (1) AP2006003689A0 (nl)
AR (1) AR047372A1 (nl)
AT (2) ATE501174T1 (nl)
AU (1) AU2005204678B2 (nl)
BR (2) BRPI0506768B1 (nl)
CA (1) CA2552523C (nl)
CR (1) CR8485A (nl)
DE (1) DE602005026779D1 (nl)
DK (1) DK2177537T3 (nl)
DO (1) DOP2005000002A (nl)
EA (1) EA012872B1 (nl)
EC (1) ECSP066741A (nl)
ES (2) ES2362667T3 (nl)
HK (1) HK1099695A1 (nl)
IL (1) IL176749A0 (nl)
MA (1) MA28430B1 (nl)
MX (4) MX350383B (nl)
MY (1) MY140862A (nl)
NL (1) NL1027975C2 (nl)
NO (1) NO342054B1 (nl)
NZ (1) NZ548702A (nl)
OA (1) OA13358A (nl)
PA (1) PA8621301A1 (nl)
PE (1) PE20051053A1 (nl)
PL (1) PL2177537T3 (nl)
PT (1) PT2177537E (nl)
SI (1) SI2177537T1 (nl)
SV (1) SV2006001990A (nl)
TN (1) TNSN06216A1 (nl)
TW (2) TWI366570B (nl)
UY (1) UY28716A1 (nl)
WO (1) WO2005067620A2 (nl)
ZA (1) ZA200605825B (nl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL1032132C2 (nl) * 2005-07-08 2007-10-09 Pfizer Ltd Nieuwe MAdCAM-antilichamen.

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2433800C (en) * 2001-01-05 2016-09-13 Pfizer Inc. Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
NZ540971A (en) * 2003-02-13 2008-04-30 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
WO2005026375A2 (en) 2003-05-22 2005-03-24 Fraunhofer Usa, Inc. Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides
JP4315982B2 (ja) * 2004-01-09 2009-08-19 ファイザー インコーポレイティッド ＭＡｄＣＡＭに対する抗体
RU2453558C2 (ru) 2004-09-03 2012-06-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные антагонистические антитела против бета7 и их применение
WO2006096488A2 (en) * 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Composition comprising human igg2 antibody and chelating agent
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
WO2007007160A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
MX2008000659A (es) * 2005-07-11 2008-03-13 Pfizer Ltd Nueva combinacion de anticuerpo contra madcam y de inhibidor de caspasa antifibrotico.
WO2007007151A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema
WO2007117264A2 (en) 2005-08-03 2007-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Compositions and methods for production of immunoglobulins
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4342995A2 (en) * 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US7745584B2 (en) * 2006-05-22 2010-06-29 California Institute Of Technology Antibodies to sulfated carbohydrates
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
JP2010503668A (ja) * 2006-09-15 2010-02-04 フラウンホーファー ユーエスエー， インコーポレイテッド インフルエンザ抗体、組成物、および関連する方法
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
CA2692933C (en) 2007-07-11 2016-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
MX2010003450A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
US8912149B1 (en) 2007-11-28 2014-12-16 California Institute Of Technology Glycosaminoglycan mimetics
MX337081B (es) 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2279004B1 (en) * 2008-05-16 2015-01-14 F. Hoffmann-La Roche AG Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7integrin antagonists
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US8734803B2 (en) 2008-09-28 2014-05-27 Ibio Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
EP2408816B1 (en) * 2009-03-20 2019-09-04 Amgen Inc. Alpha-4-beta-7 heterodimer specific antagonist antibody
CA3018235C (en) 2009-03-20 2021-01-12 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
JP5669732B2 (ja) 2009-05-15 2015-02-12 中外製薬株式会社 抗ａｘｌ抗体
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
WO2011041391A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
US20110158982A1 (en) * 2009-10-05 2011-06-30 The Regents Of The University Of Michigan COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING MAdCAM
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
WO2011119948A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
EA201370076A1 (ru) 2010-09-22 2013-08-30 Амген Инк. Иммуноглобулины-переносчики и их применение
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
CN102603649B (zh) * 2011-01-20 2016-05-25 赣南师范学院 一种以地巴唑为先导分子的荧光探针化合物及其制备方法
WO2012103165A2 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
EP2998320B1 (en) 2011-04-19 2018-07-18 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
WO2012154987A1 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Nestec Sa Methods of disease activity profiling for personalized therapy management
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
EP4063391A1 (en) 2012-07-25 2022-09-28 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
SG11201501286PA (en) * 2012-08-23 2015-05-28 Agensys Inc Antibody drug conjugates (adc) that bind to 158p1d7 proteins
US9273093B2 (en) * 2012-10-11 2016-03-01 Protagonist Therapeutics, Inc. α4β7 peptide dimer antagonists
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
SG11201507226YA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Protagonist Therapeutics Inc Hepcidin analogues and uses therof
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
MX2015017852A (es) 2013-06-24 2016-08-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que comprende el anticuerpo anti-epirregulina humanizado con ingrediente activo contra el carcinoma de pulmon de celulas no pequeñas excluyendo el adenocarcinoma.
US9770461B2 (en) 2013-08-02 2017-09-26 California Institute Of Technology Tailored glycopolymers as anticoagulant heparin mimetics
US10227370B2 (en) 2013-08-02 2019-03-12 California Institute Of Technology Heparan sulfate/heparin mimetics with anti-chemokine and anti-inflammatory activity
MX2016002870A (es) 2013-09-05 2017-02-23 Amgen Inc Moleculas que contienen fc que presentan perfiles de glicoforma predecibles, consistentes y reproducibles.
SG11201601763SA (en) * 2013-09-20 2016-04-28 Bristol Myers Squibb Co Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
RS62392B1 (sr) 2014-05-16 2021-10-29 Protagonist Therapeutics Inc Tioetar peptidni antagonisti alfa4beta7 integrina
CN113908269A (zh) 2014-05-23 2022-01-11 塞尔德克斯医疗公司 嗜酸性粒细胞或肥大细胞相关病症的治疗
SG11201700327WA (en) 2014-07-17 2017-02-27 Protagonist Therapeutics Inc Oral peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory bowel diseases
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
AU2015328002A1 (en) 2014-10-01 2017-04-27 Protagonist Therapeutics, Inc. Novel alpha4beta7 peptide monomer and dimer antagonists
WO2016054445A1 (en) 2014-10-01 2016-04-07 Protagonist Therapeutics, Inc. Novel cyclic monomer and dimer peptides having integrin antagonist activity
JP2017537105A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 瘻孔を伴うクローン病の治療用ベドリズマブ
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
CA2916283A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-09 Pfizer Inc. Dosage regimen for madcam antagonists
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US10787490B2 (en) 2015-07-15 2020-09-29 Protaganist Therapeutics, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
WO2017117411A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Protagonist Therapeutics, Inc. Analogues of hepcidin mimetics with improved in vivo half lives
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
CN109153721A (zh) 2016-03-14 2019-01-04 千禧制药公司 治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法
US20200002422A1 (en) 2016-03-14 2020-01-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of preventing graft versus host disease
US10407468B2 (en) 2016-03-23 2019-09-10 Protagonist Therapeutics, Inc. Methods for synthesizing α4β7 peptide antagonists
EP3433275A1 (en) 2016-03-24 2019-01-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
TW201735949A (zh) 2016-03-24 2017-10-16 千禧製藥公司 治療抗ctla4及抗pd-1組合治療中的胃腸道免疫相關不良事件之方法
KR101877349B1 (ko) 2016-08-05 2018-07-17 농업회사법인 주식회사 한라종합식품 황칠 구운 소금 제조방법
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
JP2020513813A (ja) 2017-03-14 2020-05-21 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
CN110520436A (zh) * 2017-03-15 2019-11-29 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
EP3630163A4 (en) * 2017-05-24 2021-06-09 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNTOLERANCE
LT3631454T (lt) 2017-05-30 2023-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 atžvilgiu teigiamų navikų gydymas
AU2018275209A1 (en) 2017-05-30 2019-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising an anti-LAG-3 antibody or an anti-LAG-3 antibody and an anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibody
WO2018220588A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Nestec S.A. Methods for assessing mucosal healing in crohn's disease patients
CR20200076A (es) * 2017-07-14 2020-06-10 Pfizer ANTICUERPOS CONTRA MAdCAM
US10278957B2 (en) 2017-09-11 2019-05-07 Protagonist Therapeutics, Inc. Opioid agonist peptides and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
EP3720871A4 (en) * 2017-12-06 2021-09-15 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNTOLERANCE
WO2019114804A1 (zh) 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
CA3089868A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Protagonist Therapeutics, Inc. Conjugated hepcidin mimetics
SG11202009216YA (en) 2018-03-26 2020-10-29 Amgen Inc Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
US20220041713A1 (en) * 2018-09-18 2022-02-10 Pandion Operations, Inc Targeted immunotolerance
US11739146B2 (en) 2019-05-20 2023-08-29 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
AU2020311395A1 (en) 2019-07-10 2022-02-03 Protagonist Therapeutics, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
EP4034556A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN110887966B (zh) * 2019-12-17 2021-02-12 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
BR112022013957A2 (pt) 2020-01-15 2022-10-11 Janssen Biotech Inc Inibidores peptídicos do receptor de interleucina-23 e uso dos mesmos para tratar doenças inflamatórias
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN111714781B (zh) * 2020-06-24 2022-08-05 北京夏禾科技有限公司 一种牙齿美白组合及其使用方法
JP2023548767A (ja) 2020-10-15 2023-11-21 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体製造方法における相対不対グリカン
JP7397239B2 (ja) 2020-11-20 2023-12-12 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． インターロイキン－２３受容体のペプチド阻害剤の組成物
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
IL309631A (en) * 2021-06-21 2024-02-01 Roussy Inst Gustave Methods for diagnosing cancer- or antibiotic-induced dysbiosis and their use for improving cancer treatment by immunotherapy
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996024673A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-15 Leukosite, Inc. Mucosal vascular addressins and uses thereof
WO1999058573A1 (en) * 1998-05-13 1999-11-18 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
WO2001078779A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibody alpha4beta7 integrin and its use to treat inflammatory bowel disease
US6551593B1 (en) * 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5151540A (en) * 1986-11-26 1992-09-29 Hoechst Celanese Corporation Thio carbamates and their derivatives
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US20040010810A1 (en) 1990-01-12 2004-01-15 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5462990A (en) * 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69331089T2 (de) 1992-02-18 2002-07-18 Otsuka Kagaku Kk Beta-Laktam und Cepham Verbindungen und Ihre Herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
WO1994013312A1 (en) 1992-12-15 1994-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mucosal vascular addressin, dna and expression
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US7803904B2 (en) 1995-09-01 2010-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressing and uses thereof
US7750137B2 (en) 1995-09-01 2010-07-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressins
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CN101333516A (zh) 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
US6037324A (en) 1996-01-04 2000-03-14 Leukosite, Inc. Inhibitors of MAdCAM-1-mediated interactions and methods of use therefor
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US7090845B2 (en) * 1998-05-13 2006-08-15 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
NZ512553A (en) 1998-12-23 2004-02-27 Pfizer Human monoclonal antibodies to cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4)
CA2382161A1 (en) 1999-09-03 2001-03-15 Human Genome Sciences, Inc. Immunoglobulin superfamily polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
JP2003089656A (ja) * 2001-09-19 2003-03-28 Nippon Kayaku Co Ltd 移植による免疫反応抑制剤
CA2466034C (en) 2001-11-08 2012-12-18 Protein Design Labs, Inc. Stable aqueous pharmaceutical formulations of daclizumab antibodies
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
BR0307975A (pt) 2002-02-25 2005-01-11 Elan Pharm Inc Métodos para reduzir cronicamente a inflamação patológica em um paciente e para determinar a eficácia de um regime de administração crÈnica para tratar inflamação patológica em um indivìduo, composição e terapia combinada para tratamento crÈnico de inflamação patológica em um paciente e uso de um inibidor de alfa-4-integrina
WO2004081049A1 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 Auckland Uniservices Limited Monoclonal antibodies that recognise mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (madcam-1), soluble madcam-1 and uses thereof
JP4869064B2 (ja) 2003-04-04 2012-02-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 高濃度抗体及びタンパク質製剤
JP4315982B2 (ja) * 2004-01-09 2009-08-19 ファイザー インコーポレイティッド ＭＡｄＣＡＭに対する抗体
NZ584288A (en) 2004-02-06 2011-10-28 Elan Pharm Inc Methods and compositions for treating tumors and metastatic disease
WO2006096488A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Composition comprising human igg2 antibody and chelating agent
EP1904103A2 (en) 2005-07-08 2008-04-02 Pfizer Limited Use of anti-madcam antibodies for the treatment of coeliac disease and tropical sprue
EP1904531B1 (en) 2005-07-08 2010-10-06 Pfizer Limited Madcam antibodies
WO2007007160A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
WO2007007152A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat metastatic cancers and chloroma
MX2008000659A (es) 2005-07-11 2008-03-13 Pfizer Ltd Nueva combinacion de anticuerpo contra madcam y de inhibidor de caspasa antifibrotico.
WO2007007159A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat uterine disorders
WO2007007151A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996024673A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-15 Leukosite, Inc. Mucosal vascular addressins and uses thereof
US6551593B1 (en) * 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
WO1999058573A1 (en) * 1998-05-13 1999-11-18 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
WO2001078779A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibody alpha4beta7 integrin and its use to treat inflammatory bowel disease

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL1032132C2 (nl) * 2005-07-08 2007-10-09 Pfizer Ltd Nieuwe MAdCAM-antilichamen.

Also Published As

Publication number Publication date
TNSN06216A1 (en) 2007-12-03
JP6215875B2 (ja) 2017-10-18
KR20060129006A (ko) 2006-12-14
JP2018148901A (ja) 2018-09-27
ATE501174T1 (de) 2011-03-15
CA2552523A1 (en) 2005-07-28
EP1709080A2 (en) 2006-10-11
AU2005204678A2 (en) 2005-07-28
ES2362667T3 (es) 2011-07-11
WO2005067620A2 (en) 2005-07-28
USRE45847E1 (en) 2016-01-19
EA012872B1 (ru) 2009-12-30
US20050232917A1 (en) 2005-10-20
WO2005067620A3 (en) 2005-09-29
ATE522547T1 (de) 2011-09-15
JP2017079789A (ja) 2017-05-18
JP5094818B2 (ja) 2012-12-12
JP2009005695A (ja) 2009-01-15
AR047372A1 (es) 2006-01-18
AU2005204678A1 (en) 2005-07-28
UY28716A1 (es) 2005-08-31
IL176749A0 (en) 2006-10-31
JP5836896B2 (ja) 2015-12-24
TWI366570B (en) 2012-06-21
PA8621301A1 (es) 2006-09-22
EP2177537A2 (en) 2010-04-21
CN1956738B (zh) 2013-05-29
US20190300605A1 (en) 2019-10-03
MX370489B (es) 2019-12-16
NO20063601L (no) 2006-08-08
US9328169B2 (en) 2016-05-03
CN1956738A (zh) 2007-05-02
EP2177537B1 (en) 2011-08-31
WO2005067620A9 (en) 2009-10-01
US10259872B2 (en) 2019-04-16
PT2177537E (pt) 2011-12-13
ZA200605825B (en) 2007-11-28
EP1709080A4 (en) 2008-03-19
KR20120048644A (ko) 2012-05-15
MX350383B (es) 2017-09-04
DK2177537T3 (da) 2011-12-12
SI2177537T1 (sl) 2012-01-31
NL1027975A1 (nl) 2005-07-12
JP6423024B2 (ja) 2018-11-14
MA28430B1 (fr) 2007-02-01
US20070166308A1 (en) 2007-07-19
PE20051053A1 (es) 2005-12-12
MX2019015195A (es) 2020-02-07
CR8485A (es) 2007-02-22
AU2005204678B2 (en) 2008-09-25
ECSP066741A (nl) 2006-10-31
EP2177537A3 (en) 2010-05-05
EA200601297A1 (ru) 2007-02-27
US7932372B2 (en) 2011-04-26
TW200535144A (en) 2005-11-01
DE602005026779D1 (de) 2011-04-21
TW201217397A (en) 2012-05-01
KR101262032B1 (ko) 2013-05-13
TWI363762B (en) 2012-05-11
JP2008505606A (ja) 2008-02-28
JP2010042025A (ja) 2010-02-25
WO2005067620A8 (en) 2006-09-21
HK1099695A1 (en) 2007-08-24
ES2372733T3 (es) 2012-01-25
JP4729076B2 (ja) 2011-07-20
OA13358A (en) 2007-04-13
BRPI0506768A (pt) 2007-05-22
JP4315982B2 (ja) 2009-08-19
US20080124339A1 (en) 2008-05-29
JP2012250982A (ja) 2012-12-20
NZ548702A (en) 2009-06-26
CA2552523C (en) 2019-11-26
SV2006001990A (es) 2006-01-30
PL2177537T3 (pl) 2012-06-29
US20170051057A1 (en) 2017-02-23
BR122021007893B1 (pt) 2022-04-12
MY140862A (en) 2010-01-29
JP6637104B2 (ja) 2020-01-29
BRPI0506768B1 (pt) 2021-09-21
JP2015226539A (ja) 2015-12-17
MXPA06007843A (es) 2007-01-26
EP1709080B1 (en) 2011-03-09
NO342054B1 (no) 2018-03-19
AP2006003689A0 (en) 2006-08-31
DOP2005000002A (es) 2005-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10259872B2 (en) Antibodies to MAdCAM
AU2024200534A1 (en) Anti-TL1A/anti-TNF-alpha bispecific antigen binding proteins and uses thereof
KR102551269B1 (ko) 저-점도 항원 결합 단백질 및 이의 제조 방법
US7935794B2 (en) MAdCAM antibodies
CN110869389B (zh) 抗ror1抗体及其制备和使用方法
AU2021254602A1 (en) Humanized anti-MUC1* antibodies
DK2519543T3 (en) HETERODIMER BINDING PROTEINS AND USE THEREOF
TW202313684A (zh) 抗ｃｃｒ８抗體及其用途
US11802156B2 (en) Antibodies to MAdCAM
OA20299A (en) Antibodies to MAdCAM.
RU2800649C2 (ru) Моноклональные антитела против рецептор-связывающего домена spike-белка вируса sars-cov-2 и их антигенсвязывающие фрагменты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, а также способы применения
KR20230017841A (ko) Cd3 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
AD1A A request for search or an international type search has been filed
RD2N Patents in respect of which a decision has been taken or a report has been made (novelty report)

Effective date: 20050818

PD2B A search report has been drawn up
TD Modifications of names of proprietors of patents

Owner name: PFIZER INC.

Effective date: 20080731

Owner name: AMGEN FREMONT INC.

Effective date: 20080731

V1 Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20100801