ES2372733T3 - ANTICUERPOS FRENTE A MAdCAM. - Google Patents

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ES2372733T3
ES2372733T3 ES10150359T ES10150359T ES2372733T3 ES 2372733 T3 ES2372733 T3 ES 2372733T3 ES 10150359 T ES10150359 T ES 10150359T ES 10150359 T ES10150359 T ES 10150359T ES 2372733 T3 ES2372733 T3 ES 2372733T3
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ES
Spain
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antibody
madcam
antigen binding
monoclonal antibody
amino acid
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ES10150359T
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English (en)
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Nicholas Pullen
Elizabeth Molloy
Sirid-Aimee Kellermann
Larry L. Green
Mary Haak-Frendscho
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Pfizer Ltd
Pfizer Inc
Amgen Fremont Inc
Original Assignee
Pfizer Ltd
Pfizer Inc
Amgen Fremont Inc
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MAdCAM con una Kd de 2,35x10 11 M o menos según se mide por resonancia de plasmón superficial e inhibe la unión de MAdCAM humana a α4ß7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende la secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y en el que la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende las secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Número de Acceso de ECACC 03090909 (designación interna 7.16.6).

Description

Anticuerpos frente a MAdCAM.
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/535.490 presentada el 9 de enero de 2004.
5 Antecedentes de la invenci6n
La molecula de adhesi6n celular mucosa adresina (MAdCAM) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina de receptores de adhesi6n celular. La selectividad de direcci6n de linfocitos a tejido linfoide especializado y sitios de mucosa del tracto gastrointestinal se determina por la expresi6n endotelial de MAdCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80:413-422(1994); Berlin, C., et al., Cell, 74:185-195 (1993); y Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)).
10 MAdCAM se expresa unicamente en la superficie celular de venulas endoteliales altas de tejido linfoide intestinal organizado, tales como placas de Peyer y ganglios linfaticos mesentericos (Streeter et al., Nature, 331: 41-6 (1988); Nakache et al., Nature, 337: 179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)), pero tambien en otros 6rganos linfoides, tales como pancreas, vesfcula biliar y venulas del bazo y senos marginales de la pulpa blanca del bazo (Briskin et al (1997), mencionado anteriormente; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).
15 Aunque MAdCAM desempefa un papel fisiol6gico en la vigilancia inmunol6gica del intestino, parece facilitar una extravasaci6n excesiva de linfocitos en enfermedad inflamatoria del intestino en condiciones de inflamaci6n del tracto gastrointestinal cr6nica. TNFα y otras citocinas proinflamatorias aumentan la expresi6n de MAdCAM endotelial y, en muestras de biopsia tomadas de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, hay un aumento de aproximadamente 2-3 veces focal en expresi6n de MAdCAM en los sitios de inflamaci6n (Briskin et al. (1997), Souza
20 et al., Gut, 45: 856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52: 367-74 (2002)). Se han observado patrones similares de expresi6n elevada en modelos experimentales de colitis (Hesterberg et al., Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol., 65:349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295:183-9 (2000); Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26:259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281:G1309-15 (2001)). En otros modelos preclfnicos para afecciones
25 inflamatorias, tales como diabetes insulino dependiente (Yang et al. Diabetes, 46: 1542-7 (1997); Hanninen et al., J Immunol., 160: 6018-25 (1998)), enfermedad de injerto contra hospedador (Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol.,
38: 437-42 (2003), Murai et al., Nat Immunol., 4: 154-60 (2003)), enfermedad hepatica cr6nica (Hillan et al., Liver, 19: 509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33: 1065-72 (2001)), encefalopatfa inflamatoria (Stalder et al., Am J Pathol.,
153: 767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78: 641-5 (2000)), y gastritis (Barrett et al., J Leukoc Biol., 67:
30 169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin Exp Immunol., 130: 183-9 (2002)), tambien existe una reactivaci6n de la expresi6n de MAdCAM fetal y participaci6n de linfocitos α4β7/ activados en patogenesis de enfermedad. En estos modelos inflamatorios asf como modelo de colitis de rat6n mediada por hapteno (por ejemplo, TNBS, DSS, etc.) o transferencia adoptiva (CD4/CD45Rbalta), el anticuerpo monoclonal (mAb) de rata anti MAdCAM de rat6n, MECA367, que bloquea la uni6n de linfocitos α4β7/ a MAdCAM, reduce el reclutamiento de linfocitos, la extravasaci6n
35 tisular, inflamaci6n y gravedad de la enfermedad. Tambien se han presentado anticuerpos monoclonales de rat6n (mAb) contra MAdCAM humana (vease, por ejemplo el documento WO 96/24673 y documento WO 99/58573).
Dado el papel de MAdCAM en enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y otras enfermedades inflamatorias asociadas con el tracto gastrointestinal u otros tejidos, es deseable un medio para inhibir la uni6n de α4β7 y reclutamiento de leucocitos mediado por MAdCAM. Serfa deseable ademas tener tales medios terapeuticos con
40 propiedades ventajosas incluyendo pero sin limitaci6n la ausencia de interacciones no deseadas con otras medicaciones en pacientes y propiedades fisicoqufmicas favorables tales como valores de pK/pD en seres humanos, solubilidad, estabilidad, periodo de caducidad y semivida in vivo. Una protefna terapeutica, tal como un anticuerpo, estarfa ventajosamente sin modificaciones postraduccionales no deseadas o formaci6n de agregados. En consecuencia, existe una necesidad crftica de anticuerpos anti-MAdCAM terapeuticos.
45 Compendio de la invenci6n
La presente invenci6n proporciona:
Realizaci6n ("R") 1. Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 2,35x1011 M o menos segun se mide por resonancia de plasm6n superficial e inhibe la uni6n de MAdCAM humana a α4β7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de
50 uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y en el que la cadena ligera del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencia de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de Acceso de ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R2. Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a
55 MAdCAM con una Kd de 2,35x1011 M o menos segun se mide por resonancia de plasm6n superficial e inhibe la uni6n de MAdCAM humana a α4β7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera
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del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID N°: 36.
R3. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1 6 2, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena pesada que utiliza un gen VH 1-18 humano.
R4. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1 6 2, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena ligera que utiliza un gen VK A2 humano.
R5. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1 en el que dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos FR1, FR2, FR3 y FR4 del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R6. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R2, en el que dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos FR1, FR2, FR3 y FR4 en SEC ID N°: 34 o SEC ID N°: 36.
R7. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo, en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoacidos del comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R8. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R7, en el que los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R9. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R7, que comprende las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R10. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con R9, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal humano producido por el hibridoma de Numero de Acceso de ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R11. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R7, que comprende las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma 03090909 (designaci6n interna 7.16.6) en el que la lisina C terminal de la cadena pesada se escinde.
R12. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID N°: 4.
R13. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R12, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera en SEC ID N°: 36.
R14. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con R12, que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N° 34 y 36 sin las secuencias sefal.
R15. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con R12, que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N° 34 y 36 sin las secuencias sefal y en el que la lisina C terminal de la cadena pesada se escinde.
R16. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1 a R15 que es una molecula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD o un anticuerpo biespecffico.
R17. Una parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 15 que es un fragmento de Fab, un fragmento de F(ab')2, un fragmento Fvo un anticuerpo de cadena sencilla.
R18. Una composici6n farmaceutica que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
R19. La composici6n farmaceutica de acuerdo con R18 que comprende adicionalmente uno o mas agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales.
R20. La composici6n farmaceutica de acuerdo con R19, en la que el o los agentes antiinflamatorios o
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inmunomoduladores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en corticosteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK306, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNFα y antagonistas de molecula de adhesi6n.
R21. Una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
R22. La vacuna de acuerdo con R21, siendo la vacuna mucosa.
R23. Un kit de diagn6stico que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17.
R24. Una lfnea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une especfficamente a Molecula de Adhesi6n Celular Mucosa Adresina (MAdCAM), en la que el hibridoma es hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
R25. Una lfnea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17.
R26. La lfnea celular de acuerdo con R25 que produce el anticuerpo de la reivindicaci6n 9 6 14.
R27. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1 a 16.
R28. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de acuerdo con R27.
R29. Una celula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con R28 o la molecula de acido nucleico de acuerdo con R27.
R30. Una celula hospedadora que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma del anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17.
R31. Un metodo para producir un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende cultivar la celula hospedadora de acuerdo con R29 o 30 o la lfnea celular de acuerdo con R24 6 25 en condiciones adecuadas y recuperar el anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno.
R32. Un animal transgenico no humano o planta transgenica que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de R1 a 16, en el que los polipeptidos de cadena pesada y cadena ligera codificados por las moleculas de acido nucleico se expresan.
R33. Un metodo para aislar un anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo del animal transgenico no humano o planta transgenica de acuerdo con R32.
R34. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17, en el que el anticuerpo o parte inhibe la uni6n de MAdCAM a α4β7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite.
R35. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de R34, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal.
R36. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de R35; en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepatica, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante.
R37. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de R35, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal es enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
R38. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de R34, en el que la enfermedad inflamatoria es diabetes insulinodependiente o enfermedad de injerto contra hospedador.
R39. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17, en el que el anticuerpo o parte se marca de forma detectable, para su uso en detecci6n de inflamaci6n en un sujeto.
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R40. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17 para su uso en la determinaci6n de si existe un aumento en el nivel de leucocitos que expresan α4β7en circulaci6n y de este modo detectar el efecto de la administraci6n de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM o parte de uni6n a antfgeno del mismo a un sujeto.
R41. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R40, en el que los leucocitos son linfocitos.
R42. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R40, en el que el aumento en el nivel de leucocitos que expresan α4β7en circulaci6n se determina por analisis de FACS.
R43. Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17 para su uso como un medicamento.
R44. Un metodo para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humana soluble en circulaci6n que comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biol6gica con el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1 a 17 y (2) detectar la uni6n del anticuerpo o parte a MAdCAM.
R45. Un vector de acuerdo con R28, en el que el vector comprende una secuencia de control de la expresi6n unida operativamente a la molecula de acido nucleico.
Breve descripci6n de los dibujos
La Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoacidos predichas de las regiones variables de cadena ligera kappa y pesada de doce anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM humanos con la secuencia de aminoacidos de lfnea germinal de los genes humanos correspondientes.
La Figura 1A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 con el producto del gen VH 3-15 humano de lfnea germinal.
La Figura 1B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.14.2 con el producto del gen VH 3-23 humano de lfnea germinal.
La Figura 1C muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.22.2 con el producto del gen VH 3-33 humano de lfnea germinal.
La Figura 1D muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.34.2 con el producto del gen VH 3-30 humano de lfnea germinal.
La Figura 1E muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.67.1 con el producto del gen VH 4-4 humano de lfnea germinal.
La Figura 1F muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.73.2 con el producto del gen VH 3-23 humano de lfnea germinal.
La Figura 1G muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 6.77.1 con el producto del gen VH 3-21 humano de lfnea germinal.
La Figura 1H muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 con el producto del gen VH 1-18 humano de lfnea germinal.
La Figura 1I muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 7.20.5 con el producto del gen VH 4-4 humano de lfnea germinal.
La Figura 1J muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena pesada para el anticuerpo 9.8.2 con el producto del gen VH 3-33 humano de lfnea germinal.
La Figura 1K muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 con el producto del gen A3 humano de lfnea germinal.
La Figura 1L muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.14.2 con el producto del gen 012 humano de lfnea germinal.
La Figura 1M muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.22.2 con el producto del gen A26 humano de lfnea germinal.
La Figura 1N muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.34.2 con el producto del gen 012 humano de lfnea germinal.
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La Figura 1O muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.67.1 con el producto del gen B3 humano de lfnea germinal.
La Figura 1P muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.73.2 con el producto del gen 012 humano de lfnea germinal.
La Figura 1Q muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 6.77.1 con el producto del gen A2 humano de lfnea germinal.
La Figura 1R muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 con el producto del gen A2 humano de lfnea germinal.
La Figura 1S muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 7.20.5 con el producto del gen A3 humano de lfnea germinal.
La Figura 1T muestra un alineamiento de la secuencia de aminoacidos predicha de la cadena ligera kappa para el anticuerpo 9.8.2 con el producto del gen 018 humano de lfnea germinal.
La Figura 2 son alineamientos de CLUSTAL de la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa y pesada predichas de anticuerpos anti-MAdCAM humanos.
La Figura 2A es un alineamiento de CLUSTAL y arbol radial de las secuencias de aminoacidos de cadena ligera kappa predichas, que muestra el grado de similitud entre las cadenas ligeras kappa de anticuerpo anti-MAdCAM.
La Figura 2B es un alineamiento de CLUSTAL y arbol radial de las secuencias de aminoacidos pesadas predichas, que muestran el grado de similitud entre las cadenas pesadas del anticuerpo anti-MAdCAM.
La Figura 3 es un alineamiento de CLUSTAL de secuencias de aminoacidos de los 2 dominios N-terminal de MAdCAM de cynomolgus y humana que forman el dominio de uni6n α4β7. Las cadenas β se alinean de acuerdo con Tan et al., Structure (1998) 6: 793-801.
La Figura 4 es un grafico que representa los efectos de dosis de 1.7.2 y 7.16.6 biotinilados purificados en la adhesi6n de linfocitos de sangre periferica humanas a secciones de endotelio de hfgado humano congelado que expresa MAdCAM.
La Figura 5 muestra una representaci6n grafica bidimensional basada en los datos capturados en la Tabla 7 de la diversidad de epftopos de MAdCAM a los que los anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2 se unen. Los anticuerpos anti-MAdCAM dentro del mismo cfrculo muestran el mismo patr6n de reactividad, pertenecen al mismo conjunto de epftopos y probablemente reconocen el mismo epftopo en MAdCAM. Los clones de anticuerpo anti-MAdCAM dentro de cfrculos solapantes son incapaces de unirse simultaneamente y, por lo tanto, probablemente reconozcan un epftopo solapante en MAdCAM. Los cfrculos no integrantes representan clones de anticuerpo anti-MAdCAM con distinta separaci6n espacial de epftopos.
La Figura 6 muestra datos de ELISA de tipo sandwich con anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y un 7.16.6 marcado con Alexa 488, que muestran que dos anticuerpos que son capaces de detectar diferentes epftopos en MAdCAM podrfan usarse para detectar MAdCAM soluble para fines de diagn6stico.
La Figura 7 muestra el efecto de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM (1 mg/kg) en el numero de linfocitos α4β7/ perifericos circulantes, expresados como un aumento de veces sobre el mAb IgG2a control ovehfculo, usando mAb anti-MAdCAM 7.16.6 en un modelo de mono cynomolgus.
Descripci6n detallada
Definiciones y tecnicas generales
A no ser que se defina de otro modo en la presente memoria, los terminos cientfficos y tecnicos usados en relaci6n con la presente invenci6n tendran los significados que se entienden habitualmente por los expertos en la materia. Ademas, a no ser que se requiera de otro modo por el contexto, los terminos singulares incluiran plurales y los terminos plurales incluiran los singulares. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relaci6n con, y las tecnicas de, cultivo celular y tisular, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica, qufmica de protefnas y acido nucleico e hibridaci6n descritas en la presente memoria son las bien conocidas y habitualmente usadas en la tecnica. Los procedimientos y tecnicas de la presente invenci6n generalmente se realizan de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describen en diversas referencias generales y mas especfficas que se nombran y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a no ser que se indique de otro modo. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimaticas y tecnicas de purificaci6n se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza habitualmente en la tecnica o como se describe en
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la presente memoria. Se usan tecnicas convencionales para sfntesis qufmicas, analisis qufmicos, reparaci6n farmaceutica, formulaci6n y suministro y tratamiento de pacientes.
Se entendera que los siguientes terminos, a no ser que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:
El termino "polipeptido" abarca protefnas nativas o artificiales, fragmentos proteicos y analogos polipeptfdicos de una secuencia de protefna. Un polipeptido puede ser monomerico o polimerico.
La expresi6n "protefna aislada" o "polipeptido aislado" es una protefna o un polipeptido que en virtud de su origen o fuente de derivaci6n (1) no esta asociado con componentes asociados de forma natural que lo acompafan en su estado nativo, (2) esta sin otras protefnas de la misma especie, (3) se expresa por una celula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Por lo tanto, un polipeptido que se sintetiza qufmicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la celula de la que se origina de forma natural estara "aislado" de sus componentes asociados de manera natural. Una protefna tambien puede hacerse sustancialmente sin componentes asociados de forma natural por aislamiento, usando tecnicas de purificaci6n proteica bien conocidas en la materia.
Una protefna o polipeptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogeneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75 % de una muestra presenta una especie unica de polipeptido. El polipeptido o protefna puede ser monomerico o multimerico. Un polipeptido o protefna sustancialmente puro tfpicamente comprendera aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % P/P de una muestra proteica, mas habitualmente aproximadamente 95 % y preferiblemente estara por encima de 99 % de pureza. La pureza u homogeneidad proteica puede indicarse por varios medios bien conocidos en la tecnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguido de visualizaci6n de una banda polipeptfdica unica tras tefir el gel con una tinci6n bien conocida en la tecnica. Para ciertos fines, puede proporcionarse una mayor resoluci6n usando HPLC u otro medio bien conocido en la tecnica para la purificaci6n.
La expresi6n "fragmento polipeptfdico" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipeptido que tiene una deleci6n amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia de aminoacidos restante es identica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8 6 10 aminoacidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son de al menos 14 aminoacidos de longitud, mas preferiblemente al menos 20 aminoacidos de longitud, habitualmente al menos 50 aminoacidos de longitud, incluso mas preferiblemente al menos 70, 80, 90,100, 150 6 200 aminoacidos de longitud.
La expresi6n "analogo polipeptfdico" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipeptido que comprende un segmento de al menos 25 aminoacidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoacidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) uni6n especffica a MAdCAM en condiciones de uni6n adecuadas, (2) capacidad para inhibir integrina α4β7 y/o uni6n de L-selectina a MAdCAM o (3) capacidad para reducir la expresi6n en superficie celular de MAdCAM in vitro o in vivo. Tfpicamente, los analogos polipeptfdicos comprenden una sustituci6n de aminoacidos conservativa (o inserci6n o deleci6n) con respecto a la secuencia de origen natural. Los analogos tfpicamente son de al menos 20 aminoacidos de longitud, preferiblemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 6 200 aminoacidos de longitud o mas largos y con frecuencia pueden ser tan largos como un polipeptido de origen natural de longitud completa.
Las sustituciones de aminoacidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a prote6lisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidaci6n, (3) alteran la afinidad de uni6n para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de uni6n o (5) confieren o modifican otras propiedades ffsico-qufmicas o funcionales de tales analogos. Los analogos pueden incluir diversas mutefnas de una secuencia distinta de la secuencia peptfdica de origen natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoacidos sencillas o multiples (preferiblemente sustituciones de aminoacidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la parte del polipeptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustituci6n de aminoacidos conservativa no deberfa cambiar sustancialmente las caracterfsticas estructurales de la secuencia parental (por ejemplo un aminoacido de reemplazo no deberfa tender a romper una helice que aparece en la secuencia parental o interrumpir otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipeptidos reconocidos en la tecnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature, 354: 105 (1991).
Habitualmente se usan analogos no peptfdicos en la industria farmaceutica como farmacos con propiedades analogas a las del peptido molde. Estos tipos de compuesto no peptfdico se denominan "mimeticos peptfdicos" o "peptidomimeticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber y Freidinger, TINS, p.392(1985); y Evans et al.,
J. Med. Chem., 30:1229(1987). Tales compuestos se desarrollan con frecuencia con la ayuda de modelos moleculares informaticos. Los mimeticos peptfdicos que son estructuralmente similares a peptidos terapeuticamente utiles pueden usarse para producir un efecto equivalente terapeutico o profilactico. Generalmente, los peptidomimeticos son estructuralmente similares a un polipeptido paradigmatico (es decir un polipeptido que tiene una propiedad bioqufmica o actividad farmacol6gica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero que tiene uno o mas enlaces peptfdicos opcionalmente reemplazados por un enlace tal como -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-,
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CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por metodos bien conocidos en la tecnica. La sustituci6n sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia consenso con un aminoacido D del mismo tipo (por ejemplo D-lisina en lugar de L-lisina) tambien puede usarse para generar peptidos mas estables. Ademas, pueden generarse peptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variaci6n de secuencia consenso sustancialmente identica por metodos conocidos en la tecnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992); por ejemplo, afadiendo restos de cistefna internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que hacen al peptido cfclico.
Una "inmunoglobulina" es una molecula tetramerica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetramero esta compuesto de dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La parte aminoterminal de cada cadena incluye una regi6n variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento de antfgenos. La parte carboxi terminal de cada cadena define una regi6n constante responsable principalmente de la funci6n efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras κ y λ. Las cadenas pesadas se clasifican como μ, δ, γ, α o ε y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen por una regi6n "J" de aproximadamente 12 o mas aminoacidos, incluyendo tambien la cadena pesada una regi6n "D" de aproximadamente 10 o mas aminoacidos. Vease generalmente, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de uni6n a anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de uni6n.
Las cadenas de inmunoglobulina muestran la misma estructura general de regiones flanqueantes (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, tambien llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones flanqueantes para formar un sitio de uni6n especffico de epftopo. De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignaci6n de aminoacidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917(1987); Chothia et al, Nature, 342: 878-883(1989).
Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de uni6n a antfgeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para uni6n especffica. En algunas realizaciones, un anticuerpo es una parte de uni6n a antfgeno del mismo. Puede producirse partes de uni6n a antfgeno por tecnicas de ADN recombinante o por escisi6n enzimatica o qufmica de anticuerpos intactos. Las partes de uni6n a antfgeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, y fragmentos de regiones determinantes de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quimericos, diacuerpos y polipeptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir uni6n a antfgeno especffico al polipeptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la regi6n bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1, un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de una rama sencilla de un anticuerpo; y un fragmento de dAb (Ward et al., Nature, 341: 544-546(1989)) consiste en un dominio VH.
Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo que se denomina, por ejemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 o 9.8.2, es un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma del mismo nombre. Por ejemplo, el anticuerpo 1.7.2 se produce por el hibridoma 1.7.2. Un anticuerpo que se denomina 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod es un anticuerpo monoclonal cuya secuencia se ha modificado de su parental correspondiente por mutagenesis dirigida.
Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molecula monovalente mediante un enlazador sintetico que les permite formarse como una cadena proteica sencilla (Bird et al, Science, 242: 423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecfficos en los que se expresan dominios VH y VL y en una cadena polipeptfdica sencilla, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de uni6n a antfgeno (vease, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) y Poljak, R. J., et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Una o mas CDR de un anticuerpo de la invenci6n pueden incorporarse a una molecula de forma covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina que se une especfficamente a MAdCAM. Una inmunoadhesina puede incorporar la CDR o las CDR como parte de una cadena polipeptfdica mayor, puede enlazar covalentemente la CDR o las CDR a otra cadena polipeptfdica o puede incorporar la CDR o las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una especfficamente a un antfgeno particular de interes.
Un anticuerpo puede tener uno o mas sitios de uni6n. Si existe mas de un sitio de uni6n, los sitios de uni6n pueden ser identicos entre sf o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de uni6n identicos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de uni6n, mientras que un anticuerpo "biespecffico" o "bifuncional" (diacuerpo) tiene dos sitios de uni6n diferentes.
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Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no esta asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados de forma natural, que lo acompafan en su estado nativo, (2) esta sin otras protefnas de la misma especie, (3) se expresa por una celula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha purificado para afinidad usando MAdCAM, un anticuerpo anti-MAdCAM que se ha producido por un hibridoma u otra lfnea celular in vitro y un anticuerpo humano anti-MAdCAM derivado de un mamffero o planta transgenicos.
Como se usa en la presente memoria, la expresi6n "anticuerpo humano" significa un anticuerpo en el que las secuencias de regi6n variable y constantes son secuencias humanas. La expresi6n abarca anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos, pero que se han cambiado, por ejemplo, para reducir la posible inmunogenicidad, aumentar la afinidad, eliminar cistefnas o sitios de glucosilaci6n que podrfan provocar plegamiento indeseado, etc. La expresi6n abarca tales anticuerpos producidos de forma recombinante en celulas no humanas que podrfan transmitir glucosilaci6n no tfpica de celulas humanas. La expresi6n tambien abarca anticuerpos que se han inducido en un rat6n transgenico que comprende algunos o todos los loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana.
En un aspecto, la invenci6n proporciona un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que deriva de una especie no humana, en el que ciertos aminoacidos en el armaz6n y dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se han mutado para evitar o anular una respuesta inmune en seres humanos. En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Los ejemplos de c6mo hacer anticuerpos humanizados pueden hallarse en las Patentes de Estados Unidos N° 6.054.297, 5.886.152 y
5.877.298. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado anti-MAdCAM de la invenci6n comprende la secuencia de aminoacidos de una o mas regiones flanqueantes de uno o mas anticuerpos humanos anti-MAdCAM de la invenci6n.
En otro aspecto, la invenci6n incluye un "anticuerpo quimerico". En algunas realizaciones el anticuerpo quimerico se refiere a un anticuerpo que contiene una o mas regiones de un anticuerpo y una o mas regiones de uno o mas anticuerpos adicionales. En una realizaci6n preferida, una o mas de las CDR derivan de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invenci6n. En una realizaci6n mas preferida, todas las CDR derivan de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invenci6n. En otra realizaci6n preferida, las CDR de mas de un anticuerpo humano anti-MAdCAM de la invenci6n se mezclan y emparejan en un anticuerpo quimerico. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo humano anti-MAdCAM, puede combinarse con CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo humano anti-MAdCAM y las CDR de la cadena pesada pueden derivar de un tercer anticuerpo anti-MAdCAM. Ademas, las regiones flanqueantes pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-MAdCAM, de uno o mas anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano o de un anticuerpo humanizado.
Un "anticuerpo neutralizador", "un anticuerpo inhibidor" o anticuerpo antagonista es un anticuerpo que inhibe la uni6n de α4β7 o celulas que expresan α4β7 o cualquier otro ligando affn o celulas que expresan ligando affn, con MAdCAM en al menos aproximadamente 20 %. En una realizaci6n preferida, el anticuerpo reduce la inhibici6n de la uni6n de integrina α4β7 o celulas que expresan α4β7 a MAdCAM en al menos 40 % mas preferiblemente 60 %, incluso mas preferiblemente 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. La reducci6n de la uni6n puede medirse por cualquier medio conocido para un experto en la materia, por ejemplo, segun se mide en un ensayo de uni6n competitiva in vitro. Un ejemplo de medici6n de la reducci6n en uni6n de celulas que expresan α4β7 a MAdCAM se presenta en el Ejemplo I.
Pueden prepararse facilmente fragmentos o analogos de anticuerpos por los expertos en la materia siguiendo las ensefanzas de la presente memoria descriptiva. Los extremos amino y carboxi terminales preferidos de fragmentos
o analogos aparecen cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparaci6n de los datos de secuencia de nucle6tidos y/o aminoacidos con bases de datos de secuencia publica o patentada. Preferiblemente, se usan metodos de comparaci6n informaticos para identificar motivos de secuencia o dominios de conformaci6n proteica predichos que aparecen en otras protefnas de estructura y/o funci6n conocida. Se conocen metodos para identificar secuencias de protefnas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida (Bowie et al., Science, 253: 164 (1991)).
La expresi6n "resonancia de plasm6n superficial", como se usa en la presente memoria; se refiere a un fen6meno 6ptico que permite el analisis de interacciones bioespecfficas en tiempo real mediante detecci6n de alteraciones en las concentraciones de protefnas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, vease Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Biotechniques, 11: 620-627 (1991); Johnsson, B., et al.,
J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995); y Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).
El termino "koff"" se refiere a la constante de disociaci6n para la disociaci6n de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antfgeno.
El termino "Kd" se refiere a la constante de disociaci6n de una interacci6n anticuerpo/antfgeno particular. Se dice que un anticuerpo se une a un antfgeno cuando la constante de disociaci6n es ≤ 1 μM, preferiblemente ≤ 100 nM y mas
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preferiblemente ≤ 10 nM.
El termino "epftopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de uni6n especffica a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T o interacci6n distinta con una molecula. Los determinantes epit6picos habitualmente consisten en agrupamientos de superficie qufmicamente activos de moleculas tales como aminoacidos o cadenas laterales de carbohidratos y habitualmente tienen caracterfsticas estructurales tridimensionales especfficas, asf como caracterfsticas de carga especfficas. Un epftopo puede ser "lineal" o "conformacional". En un epftopo lineal, todos los puntos de interacci6n entre la protefna y la molecula de interacci6n (tales como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia de aminoacidos primaria de la protefna. En un epftopo conformacional, los puntos de interacci6n se producen entre restos aminoacfdicos en la protefna que estan separados entre sf.
Como se usa en la presente memoria, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Immunology -A Synthesis (2a Edici6n, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinaner Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereois6meros (por ejemplo, aminoacidos D) de los veinte aminoacidos convencionales, aminoacidos no naturales tales como aminoacidos α, α disustituidos, aminoacidos N-alquilo, acido lactico y otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para polipeptidos de la presente invenci6n. Los ejemplos de aminoacidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil lisina, ε-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoacidos e iminoacidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notaci6n polipeptfdica usada en la presente memoria, la direcci6n hacia la izquierda es la direcci6n amino terminal y la direcci6n hacia la derecha es la direcci6n carboxi terminal, de acuerdo con el uso convencional y la convenci6n.
El termino "polinucle6tido" como se indica en la presente memoria significa una forma polimerica de polinucle6tidos de al menos 10 bases de longitud, ribonucle6tidos o desoxinucle6tidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucle6tido. El termino incluye formas mono y bicatenarias de ADN.
La expresi6n "polinucle6tido aislado" como se usa en la presente memoria significara un polinucle6tido de origen gen6mico, ADNc o sintetico o alguna combinaci6n de los mismos que en virtud de su origen el "polinucle6tido" aislado (1) no esta asociado con toda o una parte de un polinucle6tido en el que el "polinucle6tido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta unido operativamente a un polinucle6tido al que no esta unido en la naturaleza o
(3) no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.
El termino "oligonucle6tido" referido en la presente memoria incluye nucle6tidos de origen natural y modificados unidos entre sf por enlazadores oligonucleotfdicos de origen natural y no natural. Los oligonucle6tidos son un subconjunto de polinucle6tidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente los oligonucle6tidos son de 10 a 60 bases de longitud y mas preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 6 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucle6tidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas; aunque los oligonucle6tidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcci6n de un mutante genico. Los oligonucle6tidos de la invenci6n pueden ser oligonucle6tidos sentido o antisentido.
La expresi6n "nucle6tido de origen natural" referido en la presente memoria incluye desoxirribonucle6tidos y ribonucle6tidos. La expresi6n "nucle6tidos modificados" referida en la presente memoria incluye nucle6tidos con grupos de azucares modificados o sustituidos y similares. La expresi6n "enlaces oligonucleotfdicos" referida en la presente memoria incluye enlaces oligonucleotfdicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Vease, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem Soc. 106: 6077(1984); Stein et al, Nucl. Acids Res.,
16: 3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogue: A Practical Approach, pag. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al., Patente de Estados Unidos N° 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews, 90: 543(1990). Un oligonucle6tido puede incluir un marcador para la detecci6n, si se desea.
Las secuencias "unidas operativamente" incluyen secuencias de control de la expresi6n que son contiguas al gen de interes y secuencias de control de la expresi6n que actuan en trans o a una distancia para controlar el gen de interes. La expresi6n "secuencia de control de la expresi6n" como se usa en la presente memoria se refiere a secuencias polinucleotfdicas que son necesarias para efectuar la expresi6n y procesamiento de secuencias codificantes a las que se ligan. Las secuencias de control de la expresi6n incluyen secuencias de inicio, terminaci6n, promotoras y potenciadoras de la transcripci6n apropiadas; sefales de procesamiento de ARN eficaces tales como sefales de corte y empalme y poliadenilaci6n; secuencias que estabilizan ARNm citoplasmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducci6n (es decir, secuencias consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad proteica; y, cuando se desea, secuencias que potencian la secreci6n proteica. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen un sitio de uni6n ribos6mica, promotor y secuencia de terminaci6n de la transcripci6n; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminaci6n de la transcripci6n. La expresi6n "secuencias de control" pretende incluir, como mfnimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresi6n y procesamiento y tambien pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de compafero de fusi6n.
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El termino "vector" como se usa en la presente memoria, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicaci6n aut6noma en una celula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicaci6n y vectores de mamffero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamffero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una celula hospedadora tras la introducci6n en la celula hospedadora y por lo tanto se replican junto con el genoma hospedador. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresi6n de genes a los que se unen operativamente. Tales vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresi6n recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresi6n"). En general, los vectores de expresi6n de utilidad en las tecnicas de ADN recombinante estan con frecuencia en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable puesto que el plasmido es la forma mas habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invenci6n pretende incluir tales otras formas de vectores de expresi6n, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectivos en replicaci6n, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven funciones equivalentes.
La expresi6n "celula hospedadora recombinante" (o simplemente "celula hospedadora"), como se usa en la presente memoria pretende referirse a una celula en la que se ha introducido un vector de expresi6n recombinante. Deberfa entenderse que tales terminos pretenden referirse no solamente a la celula sujeto particular sino a la descendencia de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaci6n o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser identica a la celula parental, pero aun se incluye dentro del alcance de la expresi6n "celula hospedadora" como se usa en la presente memoria.
La expresi6n "hibridar selectivamente" referida en la presente memoria significa unir especfficamente y de forma detectable. Los polinucle6tidos, oligonucle6tidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invenci6n hibridan selectivamente con cadenas de acido nucleico en condiciones de hibridaci6n y lavado que minimizan las cantidades apreciables de uni6n detectable a acidos nucleicos no especfficos. Pueden usarse condiciones de "alta rigurosidad"
o "altamente rigurosas" para conseguir condiciones de hibridaci6n selectivas como se conocen en la tecnica y se analizan en la presente memoria. Un ejemplo de condiciones de "alta rigurosidad" o "altamente rigurosas" es un metodo de incubar un polinucle6tido con otro polinucle6tido, en el que un polinucle6tido puede fijarse a una superficie s6lida tal como una membrana, en un tamp6n de hibridaci6n de SSPE o SSC 6X, formamida 50 %, reactivo de Denhardt 5X, SDS 0,5 %, ADN de esperma de salm6n fragmentado, desnaturalizado 100 μg/ml a una temperatura de hibridaci6n de 42 °C durante 12-16 horas, seguido de lavado dos veces a 55 °C usando un tamp6n de lavado de SSC 1X, SDS 0,5 %. Vease tambien Sambrook et al., mencionado anteriormente, pag. 9.50-9.55.
La expresi6n "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de nucle6tidos se refiere a los restos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para maxima correspondencia. La longitud de la comparaci6n de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente 9 nucle6tidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucle6tidos, mas habitualmente al menos aproximadamente 24 nucle6tidos, tfpicamente al menos aproximadamente 28 nucle6tidos, mas tfpicamente al menos aproximadamente 32 nucle6tidos y preferiblemente al menos aproximadamente 36, 48 o mas nucle6tidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la tecnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucle6tidos. Por ejemplo, la secuencias de polinucle6tidos pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versi6n 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de busqueda y consulta (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132; 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998). A no ser que se especifique de otro modo, se usan los parametros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de nucle6tidos puede determinarse usando FASTA con sus parametros por defecto (un tamafo de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuaci6n) o usando Gap con sus parametros por defecto como se proporciona en Wisconsin Package Versi6n 10.3.
Una referencia a secuencia de nucle6tidos abarca su complemento a no ser que se especifique de otro modo. Por lo tanto, una transferencia a una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia particular deberfa entenderse que abarca su hebra complementaria con su secuencia complementaria.
En la tecnica de biologfa molecular, los investigadores usan las expresiones "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia" y "porcentaje de homologfa de secuencia" de forma intercambiable. En la presente solicitud, estas expresiones tendran el mismo significado con respecto a las secuencias de nucle6tidos solamente. La expresi6n "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se refieren a un acido nucleico o fragmento del mismo indica que, cuando se alinean de forma 6ptima con inserciones o deleciones de nucle6tidos apropiadas con otro acido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de nucle6tidos en al menos aproximadamente 85 %, preferiblemente al menos aproximadamente 90 % y mas preferiblemente al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotfdicas, segun se mide por cualquier algoritmo buen conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se ha analizado anteriormente.
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Como se aplica a polipeptidos, la expresi6n "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptfdicas, cuando se alinean de forma 6ptima, tales como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 75 % u 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia, incluso mas preferiblemente al menos 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son identicas difieren por sustituciones de aminoacidos conservativas. Una "sustituci6n de aminoacido conservativa" es una en la que un resto aminoacfdico se sustituye con otro resto aminoacfdico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades qufmicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustituci6n de aminoacidos conservativa no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de una protefna. En casos en los que dos o mas secuencias de aminoacidos difieren entre sf por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud pueden ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustituci6n. Los expertos en la materia conocen bien medios para realizar este ajuste. Vease, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qufmicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifaticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifatico: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromaticas: fenilanalina, tirosina y tript6fano; 5) cadenas laterales basicas: lisina, arginina e histidina; y 6) las cadenas laterales que contienen azufre son cistefna y metionina. Los grupos de sustituci6n de aminoacidos conservativa descritos son: valina-leucina-isoleucina, fenilanalina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina.
Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250 desvelada en Gonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992). Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarftmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipeptidos se mide tfpicamente usando software de analisis de secuencia. El software de analisis de protefnas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituci6n de aminoacidos conservativa. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que pueden usarse con parametros por defecto para determinar la homologfa de secuencia o identidad de secuencia entre polipeptidos cercanamente relacionados, tales como polipeptidos hom6logos de diferentes especies de organismos o entre una protefna de tipo silvestre y una mutefna de la misma. Vease, por ejemplo, Wisconsin package Versi6n 10.3. Las secuencias polipeptfdicas tambien pueden compararse usando FASTA usando parametros por defecto o recomendados, un programa en Wisconsin package Versi6n 10.3. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de busqueda y consulta (Pearson (1990); Pearson (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invenci6n con una base de datos que contiene un gran numero de secuencias de diferentes organismos es el programa informatico BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando los parametros por defecto. Vease, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).
La longitud de las secuencias polipeptfdicas comparadas con respecto a homologfa generalmente sera de al menos aproximadamente 16 restos aminoacfdicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 restos, mas habitualmente al menos aproximadamente 24 restos, tfpicamente al menos aproximadamente 28 restos y preferiblemente mas de aproximadamente 35 restos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran numero de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoacidos.
Como se usa en la presente memoria, los terminos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporaci6n de otra molecula en el anticuerpo. En una realizaci6n, el marcador es un marcador detectable, por ejemplo, incorporaci6n de un aminoacido radiomarcado o uni6n a un polipeptido de restos biotinilados que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse por metodos 6pticos o colorimetricos). En otra realizaci6n, el marcador o indicador puede ser terapeutico, por ejemplo, un conjugado de farmaco o toxina. Se conocen en la tecnica y pueden usarse diversos metodos para marcar polipeptidos y glicoprotefnas. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero sin limitaci6n, los siguientes radiois6topos o radionuclidos (por ejemplo, 3H,14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, f6sforos de lantanido), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano rusticano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias en pareja de cremallera de leucina, sitios de uni6n para anticuerpos secundarios, dominios de uni6n a metales, marcadores epit6picos), agentes magneticos, tales como quelados de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etop6sido, tenop6sido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procafna, tetracafna, lidocafna, propanolol y puromicina y analogos u hom6logos de los mismos. En algunas realizaciones, se unen marcadores por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento histerico potencial.
El termino "agente" se usa en la presente memoria para indicar un compuesto qufmico, una mezcla de compuestos qufmicos, una macromolecula biol6gica o un extracto preparado a partir de materiales biol6gicos. La expresi6n
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"agente o farmaco farmaceutico" como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto qufmico o composici6n capaz de inducir un efecto terapeutico deseado cuando se administra de forma apropiada a un paciente. Otros terminos qufmicos en la presente memoria se usan de acuerdo con el uso convencional en la tecnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985).
La expresi6n agente "antiinflamatorio" o "inmunomodulador" se usa en la presente memoria para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir la inflamaci6n, incluyendo enfermedad inflamatoria en un sujeto, incluyendo en un ser humano. En diversas realizaciones de la presente invenci6n, la enfermedad inflamatoria puede ser, pero sin limitaci6n enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepatica, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante. Las enfermedades inflamatorias tambien pueden incluir pero sin limitaci6n enfermedad abdominal (incluyendo peritonitis, apendicitis, enfermedad del tracto biliar), mielitis transversa aguda, dermatitis alergica (incluyendo piel alergica, eccema alergico, atopia cutanea, eccema at6pico, dermatitis at6pica, inflamaci6n cutanea, eccema inflamatorio, dermatitis inflamatoria, piel con pulgas, dermatitis biliar, eccema biliar, piel con acaros del polvo), espondilitis anquilosante (sfndrome de Reiters), asma, inflamaci6n de las vfas respiratorias, aterosclerosis, arteriosclerosis, atresia biliar, inflamaci6n de la vejiga, cancer de mama, inflamaci6n cardiovascular (incluyendo vasculitis, infartos unguales reumatoides, ulceras de la pierna, polimiositis, inflamaci6n vascular cr6nica, pericarditis, enfermedad pulmonar obstructiva cr6nica), pancreatitis cr6nica, inflamaci6n perineural, colitis (incluyendo colitis amebica, colitis infecciosa, colitis bacteriana, colitis de Crohn, colitis isquemica, colitis ulcerosa, protocolitis idiopatica, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis pseudomembranosa), trastornos vasculares de colageno (artritis reumatoide, SLE, esclerosis sistemica progresiva, enfermedad de tejido conectivo mixta, diabetes mellitus), enfermedad de Crohn (enteritis regional, ileitis granulomatosa, ileocolitis, inflamaci6n del sistema digestivo), enfermedad desmielinizante (incluyendo mielitis, esclerosis multiple, esclerosis diseminada, encefalomielitis diseminada aguda, desmielinizaci6n perivenosa, deficiencia de vitamina B12, sfndrome de Guillain Barre, retrovirus asociado con MS), dermatomiositis, diverticulitis, diarrea exudativa, gastritis, hepatitis granulomatosa, inflamaci6n granulomatosa, colecistitis, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedades inflamatorias del hfgado (fibrosis hepatica, cirrosis biliar primaria, hepatitis, colangitis esclerosante), inflamaci6n de los pulmones (fibrosis pulmonar idiopatica, granuloma eosin6filo del pulm6n, histiocistosis pulmonar X, inflamaci6n peribronquiolar, bronquitis aguda), linfogranuloma venereo, melanoma maligno, enfermedad de la boca/dientes (incluyendo gingivitis, enfermedad periodontal), mucositis, inflamaci6n del sistema musculoesqueletico (miositis), esteatohepatitis no alcoh6lica (enfermedad del hfgado graso no alcoh6lica), inflamaci6n ocular y orbital (incluyendo uveftis, neuritis 6ptica, ulceraci6n reumatoide periferica, inflamaci6n corneal periferica), osteoartritis, osteomielitis, inflamaci6n farfngea, poliartritis, proctitis, psoriasis, lesi6n por radiaci6n, sarcoidosis, necropatfa falciforme, tromboflebitis superficial, sfndrome de respuesta inflamatoria sistemica, tiroiditis, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de injerto contra hospedador, lesi6n de quemadura aguda, sfndrome de Behcet, sfndrome de Sjogren.
Los terminos paciente y sujetos incluyen sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos humanos Anti-MAdCAM y Caracterizaci6n de los mismos
Se describen anticuerpos anti-MAdCAM que comprenden secuencias CDR humanas. Se describen anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En algunas descripciones, se producen anticuerpos humanos anti-MAdCAM por inmunizaci6n de un animal transgenico no humano, por ejemplo, un roedor, cuyo genoma comprende genes de inmunoglobulina humana de modo que el animal transgenico produce anticuerpos humanos. En algunas descripciones, el anticuerpo anti-MAdCAM no se une al complemento.
En una descripci6n el anticuerpo anti-MAdCAM es 7.16.6. En otra descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 6 68 (con o sin la secuencia sefal) o la regi6n variable de una cualquiera de dichas secuencias de aminoacidos, o una o mas CDR de estas secuencias de aminoacidos. En otra descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 (con o sin la secuencia sefal) o la secuencia de aminoacidos de la regi6n variable o de una o mas CDR de dichas secuencias de aminoacidos. Tambien se describen anticuerpos humanos anti-MAdCAM que comprenden la secuencia de aminoacidos del comienzo de la CDR1 al final de la CDR3 de una cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas. Se describe adicionalmente un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una o mas regiones FR de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente
Adicionalmente se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una de las secuencias de aminoacidos anteriormente mencionadas en las que se han realizado una o mas modificaciones. En algunas descripciones, las cistefnas en el anticuerpo, que pueden ser qufmicamente reactivas, se sustituyen con otro resto, tal como, sin limitaci6n, alanina o serina. En una descripci6n, la sustituci6n es en una cistefna no can6nica. La sustituci6n puede realizarse en una CDR o regi6n flanqueante de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas descripciones, la cistefna es can6nica.
En algunas descripciones, se realiza una sustituci6n de aminoacidos para eliminar sitios proteolfticos potenciales en
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el anticuerpo. Tales sitios pueden aparecer en una regi6n CDR o flanqueante de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustituci6n de restos de cistefna y retirada de sitios proteolfticos puede reducir la heterogeneidad en el producto de anticuerpo. En algunas descripciones, los pares de asparagina-glicina, que forman sitios de desamidaci6n potencial, se eliminan alterando uno o ambos de los restos. En algunas descripciones, se
5 realiza una sustituci6n de aminoacidos para afadir o retirar sitios de glucosilaci6n potenciales en la regi6n variable de un anticuerpo de la invenci6n.
En algunas descripciones, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n se escinde. En diversas descripciones, las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-MAdCAM pueden incluir opcionalmente una secuencia sefal.
10 Se describen doce anticuerpos monoclonales humanos anti-MAdCAM y las lfneas de celulas de hibridoma que los producen. La Tabla 1 enumera los identificadores de secuencia (SEC ID N°:) de los acidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera de longitud completa (incluyendo secuencia sefal) y las secuencias de aminoacidos deducidas de longitud completa correspondientes.
Tabla 1
15 Se describe la versi6n modificada de ciertos anticuerpos monoclonales humanos anti-MAdCAM anteriormente identificados. La Tabla 2 enumera los identificadores de secuencia para las secuencias proteicas y de ADN de los anticuerpos modificados.
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Tabla 2
ANTICUERPOS HUMANOS ANTI-MAdCAM IDENTIFICADOR DE SECUENCIA (SEC ID N°)
Longitud Completa
Ligera
Protefna
-
54
-
58
-
62
-
66
-
68
Clase y Subclase de anticuerpos antiiMAdCAM
El anticuerpo puede ser una molecula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una descripci6n el anticuerpo es una clase IgG y es una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM es de subclase IgG2 o IgG4. En una descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM es de la misma clase y subclase que el anticuerpo 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod que es IgG2, o 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 o 9.8.2, que es IgG4.
La clase y subclase de anticuerpos anti-MAdCAM puede determinarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo puede determinarse usando anticuerpos que son especfficos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Tales anticuerpos estan disponibles en el mercado. ELISA, Transferencia de Western asf como otras tecnicas pueden determinar la clase y subclase. Como alternativa, la clase y subclase pueden determinarse por secuenciaci6n de todos o una parte de los dominios constantes de las cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoacidos con las secuencias de aminoacidos conocidas de diversas clases y subclases de inmunoglobulinas y determinando la clase y subclase de los anticuerpos como la clase que muestra la mayor identidad de secuencia.
Selectividad de Moleculas y Especies
En otra descripci6n el anticuerpo anti-MAdCAM demuestra selectividad tanto de especies como de moleculas. En una descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM se une a MAdCAM humano, de cynomolgus o de perro. En algunas descripciones, el anticuerpo anti-MAdCAM no se une a una especie de mono del Nuevo Mundo tal como un titf. Siguiendo las ensefanzas de la memoria descriptiva, puede determinarse la selectividad de especie para el anticuerpo anti-MAdCAM usando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad de especies usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoqufmica. En una descripci6n preferida, puede determinarse la selectividad de especies usando inmunohistoqufmica.
En algunas descripciones, un anticuerpo anti-MAdCAM que se une especfficamente a MAdCAM tiene selectividad para MAdCAM frente a VCAM, fibronectina o cualquier otro antfgeno que es de al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 6 90 veces, mas preferiblemente al menos 100 veces. En una descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM no muestra ninguna uni6n apreciable a VCAM, fibronectina o cualquier otro antfgeno distinto de MAdCAM. Puede determinarse la selectividad del anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM usando metodos bien conocidos en la tecnica siguiendo las ensefanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoqufmica.
Afinidad de Uni6n de anticuerpos AntiiMAdCAM a MAdCAM
En una descripci6n, los anticuerpos anti-MAdCAM se unen especfficamente a MAdCAM con alta afinidad. En una descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 3 x 10-8 M o menos, segun se mide por resonancia de plasm6n superficial, tal como BIAcore. En una descripci6n, el anticuerpo se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-8o menos o 1 x 10-9M o menos. En una descripci6n, el anticuerpo se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de o 1 x 10-10 M o menos. En otras descripciones, un anticuerpo se une especfficamente a MAdCAM con una Kdde 2,66 x 10-10 M o menos, 2,35 x 10-11 M o menos o 9 x 10-12 M o menos. En otra descripci6n, el anticuerpo se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-11 M o menos. En otra descripci6n, el anticuerpo se une especfficamente a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,
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6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Un anticuerpo con "sustancialmente la misma Kd" como un anticuerpo de referencia tiene una Kd que es ± 100 pM, preferiblemente ± 50 pM, mas preferiblemente ± 20 pM, aun mas preferiblemente ± 10 pM, ± 5 pM o ± 2 pM, en comparaci6n con la Kd del anticuerpo de referencia del mismo experimento. En otra descripci6n, el anticuerpo se une a MAdCAM sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo que comprende uno mas dominios variables o una o mas CDR de un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n mas, el anticuerpo se une a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoacidos seleccionadas de SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 (con
o sin la secuencia sefal), o el dominio variable de las mismas. En otra descripci6n, el anticuerpo se une a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una o mas CDR de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 2, 4, 6, 8,10, 12,14,16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68.
La afinidad de uni6n de un anticuerpo anti-MAdCAM con MAdCAM puede determinarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. En una descripci6n, la afinidad de uni6n puede medirse por ELISA competitivos, RIA o resonancia de plasm6n superficial, tal como BIAcore. En otra descripci6n, la afinidad de uni6n se mide por resonancia de plasm6n superficial. En otra descripci6n, la afinidad de uni6n y la tasa de disociaci6n se miden usando un BIAcore. Un ejemplo para determinar la afinidad de uni6n se describe posteriormente en el Ejemplo II.
Semivida de los Anticuerpos antiiMAdCAM
De acuerdo con otro objeto de la descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM tiene una semivida de al menos un dfa in vitro o in vivo. En una descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de al menos tres dfas. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de cuatro dfas o mas. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo tiene una semivida de ocho dfas o mas. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo se deriva o modifica de modo que tenga una semivida mas larga, como se analiza posteriormente. En otra descripci6n, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales para aumentar la semivida en suero, tal como se describe en el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000.
La semivida del anticuerpo puede medirse por cualquier medio conocido por un experto en la materia. Por ejemplo, la semivida del anticuerpo puede medirse por transferencia de Western, ELISA o RIA durante un periodo apropiado de tiempo. La semivida del anticuerpo puede medirse en cualquier animal apropiado, tal como un primate, por ejemplo, mono cynomolgus o un ser humano.
Identificaci6n de Epitopos de MAdCAM Reconocidos por Anticuerpo AntiiMAdCAM
Tambien se describe un anticuerpo humano anti-MAdCAM que se une al mismo antfgeno o epftopo que un anticuerpo humano anti-MAdCAM proporcionado en la presente memoria. Se describe adicionalmente un anticuerpo humano anti-MAdCAM que compite o compite de manera cruzada con un anticuerpo humano anti-MAdCAM. En una descripci6n, el anticuerpo humano anti-MAdCAM es 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende uno o mas dominios variables o una o mas CDR de un anticuerpo seleccionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n mas el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende una de las secuencias de aminoacidos seleccionadas de SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 (con o sin la secuencia sefal) o un dominio variable de las mismas. En otra descripci6n, el anticuerpo humano anti-MAdCAM comprende una o mas CDR de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68. En una descripci6n altamente preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es otro anticuerpo humano.
Puede determinarse si un anticuerpo anti-MAdCAM se une al mismo antfgeno que otro anticuerpo anti-MAdCAM usando una diversidad de metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo conocido anti-MAdCAM para capturar el antfgeno, eluir el antfgeno del anticuerpo anti-MAdCAM y despues determinar si el anticuerpo de ensayo se unira al antfgeno elufdo. Puede determinarse si un anticuerpo compite con un anticuerpo anti-MAdCAM por uni6n del anticuerpo anti-MAdCAM con MAdCAM en condiciones de saturaci6n y midiendo despues la capacidad del anticuerpo de ensayo para unirse a MAdCAM. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la MAdCAM al mismo tiempo que el anticuerpo anti-MAdCAM, entonces el anticuerpo de ensayo se une a un epftopo diferente que el anticuerpo anti-MAdCAM. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la MAdCAM al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo compite con el anticuerpo anti-MAdCAM humano. Este experimento puede realizarse usando ELISA o resonancia de plasm6n superficial o, preferiblemente, BIAcore. Para ensayar si un anticuerpo anti-MAdCAM compite de manera cruzada con otro anticuerpo anti-MAdCAM puede usarse el metodo de competici6n descrito anteriormente en dos direcciones, es decir determinando si el anticuerpo conocido bloquea al anticuerpo de ensayo y viceversa.
Uso de Gen de Cadena Ligera y Pesada
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Tambien se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una regi6n variable de cadena ligera codificada por un gen κ humano. En una descripci6n, la regi6n variable de cadena ligera esta codificada por una familia de genes Vκ A2, A3, A26, B3, O12 u O18. En diversas descripciones, la cadena ligera comprende no mas de once, no mas de seis o no mas de tres sustituciones de aminoacidos de la secuencia humana de lfnea germinal Vκ, A2, A3, A26, B3, O12 u O18. En una descripci6n, las sustituciones de aminoacidos son sustituciones conservativas. Las SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 y 48 proporcionan las secuencias de aminoacidos de las cadenas ligeras kappa de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2. Las Figuras 1K-1T son alineamientos de las secuencias de aminoacidos de los dominios variables de cadena ligera de doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de lfnea germinal de las que derivan. La Figura 2A muestra un alineamiento de las secuencias de aminoacidos de los dominios variables de cadena ligera de las cadenas ligeras Kappa de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre sf. Siguiendo las ensefanzas de la presente memoria descriptiva, un experto en la materia podrfa determinar las diferencias entre las secuencias de lfnea germinal y las secuencias de anticuerpos de anticuerpos anti-MAdCAM adicionales. Las SEC ID N°: 54, 58, 62, 66 6 68 proporciona la secuencias de aminoacidos de las cadenas ligeras kappa de longitud completa de cinco anticuerpos anti-MAdCAM adicionales, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, modificadas por sustituci6n de aminoacidos de sus anticuerpos parentales anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 o 7.26.4, respectivamente.
En una descripci6n, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, en relaci6n con la secuencia de aminoacidos de lfnea germinal, que una cualquiera o mas de las VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que utiliza los mismos genes Vκ y Jk humano como un anticuerpo ejemplificado. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende una o mas de las mismas mutaciones de la lfnea germinal que uno o mas anticuerpos ejemplificados. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende diferentes sustituciones en una o mas de las mismas posiciones que uno o mas de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos que son la misma que las presentes en el anticuerpo 7.16.6 y otra sustituci6n de aminoacidos que es la misma que el anticuerpo 7.26.4. De esta manera, pueden mezclarse y emparejarse diferentes caracterfsticas de uni6n de anticuerpos para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por MAdCAM o su tasa de disociaci6n del antfgeno. En otra descripci6n, las mutaciones se realizan en la misma posici6n que las encontradas en una cualquiera o mas de la VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 726.4-mod, pero se realizan sustituciones de aminoacidos conservativas en lugar de usar el mismo aminoacido. Por ejemplo, si la sustituci6n de aminoacidos comparada con la lfnea germinal en uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod es glutamato, puede sustituirse de forma conservativa aspartato. De forma similar, si la sustituci6n de aminoacidos es serina, se puede sustituir conservativamente treonina.
En otra descripci6n, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es la misma que la secuencia de aminoacidos de la VL de 1:7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.25.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena ligera comprende secuencias de aminoacidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos cuando al menos una regi6n CDR de la cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 634.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena ligera comprende secuencias de aminoacidos con CDR de diferentes cadenas ligeras que usan los mismos genes Vκ y Jκ. En una descripci6n mas preferida, las CDR de diferentes cadenas ligeras se obtienen de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 6 68 con o sin la secuencia sefal. En otra descripci6n, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucle6tidos seleccionada de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 6 67 (con o sin la secuencia sefal) o una secuencia de nucle6tidos que codifica una secuencia de aminoacidos que tiene 1-11 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos de la misma. Preferiblemente, las sustituciones de aminoacidos son sustituciones de aminoacidos conservativas. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo comprende una cadena ligera lambda.
Tambien se describe un anticuerpo anti-MAdCAM o parte del mismo que comprende una secuencia de gen VH humano o una secuencia derivada de un gen VH humano. En una descripci6n, la secuencia de aminoacidos de cadena pesada deriva de una familia de genes humanos VH 1-8, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 6 4-4. En diversas descripciones, la cadena pesada comprende no mas de quince, no mas de seis o no mas de tres cambios de aminoacidos de la secuencia genica humana de lfnea germinal VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 6 4-4.
Las SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 y 46 proporcionan las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesadas de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM. Las Figuras 1A-1J son alineamientos de
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las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de lfnea germinal de las que derivan. La Figura 2B muestra los alineamientos de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre sf. Siguiendo las ensefanzas de la presente memoria descriptiva y las secuencias de nucle6tidos de la descripci6n, un experto en la materia podrfa determinar la secuencia de aminoacidos codificada de las doce cadenas pesadas anti-MAdCAM y las cadenas pesadas de lfnea germinal y determinar las diferencias entre las secuencias de lfnea germinal de las secuencias de anticuerpo. Las SEC ID N°: 52, 56, 60 y 64 proporcionan las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesadas de longitud completa de los anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod y 6.67.1-mod, modificados por sustituci6n de aminoacidos de sus anticuerpos parentales anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2 y 6.67.1 respectivamente. Un anticuerpo anti-MAdCAM modificado adicional, 7.26.4-mod, tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa que es SEC ID N°: 42.
En una descripci6n preferida, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, en relaci6n con la secuencia de aminoacidos de lfnea germinal, como una cualquiera o mas de las VH de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67,1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. De forma similar a la analizada anteriormente, el anticuerpo comprende una o mas de las mismas mutaciones de lfnea germinal que uno o mas anticuerpos ejemplificados. En algunas descripciones, el anticuerpo comprende diferentes sustituciones en una o mas de las mimas posiciones que uno o mas de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos que son las mismas que las presentes en el anticuerpo 7.16.6 y otra sustituci6n de aminoacidos que es la misma que el anticuerpo 7.26.4. De esta manera pueden mezclarse y emparejarse diferentes caracterfsticas de uni6n de anticuerpos para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por MAdCAM o su tasa de disociaci6n del antfgeno. En otra descripci6n, una sustituci6n de aminoacidos en comparaci6n con la lfnea germinal se realiza en la misma posici6n que una sustituci6n de la lfnea germinal como se encuentra en una cualquiera o mas de las VH del anticuerpo de referencia 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2. 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod, pero la posici6n se sustituye con un resto diferente, que es una sustituci6n conservativa en comparaci6n con el anticuerpo de referencia.
En otra descripci6n, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es la misma que la secuencia de aminoacidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod. 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena pesada comprende secuencias de aminoacidos que son las mismas que las regiones CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos de al menos una regi6n CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena pesada comprende secuencias de aminoacidos con CDR de diferentes cadenas pesadas. En una descripci6n mas, las CDR de cadenas pesadas diferentes se obtienen de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 con o sin la secuencia sefal. En otra descripci6n, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucle6tidos seleccionada de SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 6 63, o una secuencia de nucle6tidos que codifica una secuencia de aminoacidos que tiene 1-15 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos de la misma. En otra descripci6n, las sustituciones son sustituciones de aminoacidos conservativas.
Metodos para Producir Anticuerpos y Lfneas Celulares productoras de Anticuerpos
Inmunizaci6n
En una realizaci6n de la presente invenci6n, se producen anticuerpos humanos inmunizando a un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana con un antfgeno de MAdCAM. En una realizaci6n preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE™, que es una estirpe de rat6n modificado por ingenierfa genetica que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en producci6n de anticuerpos de rat6n. Vease, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las Patentes de Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001,
6.114.598 y 6.130.364. Veanse tambien los documentos WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735, WO 98/16654. WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560 y WO 00/037504. El animal XENOMOUSE™ produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y genera mAb humanos especfficos de antfgeno. Un animal XENOMOUSE™ de segunda generaci6n contiene aproximadamente 80 % del repertorio del gen de anticuerpo V humano a traves de la introducci6n de fragmentos YAC de configuraci6n de lfnea germinal con tamafo de megabases de los loci de cadena pesada y loci de cadena ligera κ humanos. En otras realizaciones, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente todos los locus de cadena pesada y cadena ligera λ humanos. Vease See Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. E.xp. Med. 188: 483-495 (1998).
La descripci6n tambien proporciona un metodo para preparar anticuerpos anti-MAdCAM de animales no humanos,
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no ratones inmunizando animales transgenicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Pueden producirse tales animales usando los metodos descritos inmediatamente antes. Los metodos descritos en los presentes documentos pueden modificarse como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.994.619 (la "patente 619"). La patente 619 describe metodos para producir nuevas lfneas celulares y celulas de masa celular interna cultivada (CICM) derivadas de cerdos y vacas y celulas CICM transgenicas en las que se ha insertado ADN heter6logo. Las celulas transgenicas CICM pueden usarse para producir embriones, fetos y descendencia transgenicos clonados. La patente 619 tambien describe metodos para producir animales transgenicos que son capaces de transmitir el ADN heter6logo a sus descendientes. En una realizaci6n preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos.
En otra realizaci6n, el animal no humano que comprende el loci de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque de minilocus, un locus de Ig ex6geno se imita a traves de la inclusi6n de genes individuales del locus de Ig. Por lo tanto, uno o mas genes de VH, uno o mas genes de DH, uno o mas genes de JH, un dominio o dominios μ constantes y un segundo dominio o dominios constantes (preferiblemente un dominio o dominios constantes gamma) se forman en una construcci6n para inserci6n en un animal. Este enfoque se describe, entre otros, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807, 5.545.806, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y
5.643.763.
Una ventaja del enfoque de minilocus es la rapidez con la que las construcciones que incluyen partes del locus de Ig pueden generarse e introducirse en animales. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque de minilocus es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulinas para soportar el desarrollo de linfocitos B completo, de modo que puede haber una producci6n de anticuerpos menor.
Para producir un anticuerpo anti-MAdCAM humano, un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de inmunoglobulina humana se inmuniza con un antfgeno de MAdCAM y un anticuerpo o la celula productora de anticuerpos se afsla del animal. El antfgeno de MAdCAM puede ser MAdCAM aislada y/ purificada y es preferiblemente una MAdCAM humana. En otra realizaci6n, el antfgeno de MAdCAM es un fragmento de MAdCAM, preferiblemente el domino extracelular de MAdCAM. En otra realizaci6n, el antfgeno de MAdCAM es un fragmento que comprende al menos un epftopo de MAdCAM. En otra realizaci6n, el antfgeno de MAdCAM es una celula que expresa MAdCAM en su superficie celular, preferiblemente una celula que sobreexpresa MAdCAM en su superficie celular.
La inmunizaci6n de animales puede realizarse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press (1990). Se conocen bien en la tecnica metodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas y caballos. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane y Patente de Estados Unidos N° 5.994.619. En una realizaci6n preferida, el antfgeno de MAdCAM se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipeptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger el polipeptido de dispersi6n rapida por secuestro en un dep6sito local o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador para que secrete factores que son quimiotacticos para macr6fagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, si se administra un polipeptido, el programa de inmunizaci6n implicara dos o mas administraciones del polipeptido, extendidas a lo largo de varias semanas.
El Ejemplo I proporciona un protocolo para inmunizar un animal XENOMOUSE™ con MAdCAM humana de longitud completa en soluci6n salina tamponada con fosfato.
Producci6n de Anticuerpos y Lineas Celulares Productoras de Anticuerpos
Despues de la inmunizaci6n de un animal con un antfgeno de MAdCAM, pueden obtenerse anticuerpos y/o celulas productoras de anticuerpos del animal. Un suero que contiene anticuerpos anti-MAdCAM se obtiene del animal por sangrado o sacrificio del animal. El suero puede usarse como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracci6n de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse los anticuerpos anti-MAdCAM del suero.
En otra realizaci6n, pueden prepararse lfneas celulares inmortalizadas que producen anticuerpos del animal inmunizado. Despues de la inmunizaci6n, el animal se sacrifica y se inmortalizan los linfocitos B usando metodos bien conocidos en la tecnica. Los metodos de inmortalizaci6n de celulas incluyen, pero sin limitaci6n, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogenicos y cultivarlas en condiciones que seleccionen celulas inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogenicos o mutantes, fusionarlas con una celula inmortalizada, por ejemplo, una celula de mieloma e inactivar un gen supresor de tumores. Vease, por ejemplo, Harlow y Lane, mencionado anteriormente. En realizaciones que implican a las celulas de mieloma, las celulas de mieloma no secretan polipeptidos de inmunoglobulina (una lfnea celular no secretora). Despues de inmortalizaci6n y selecci6n por antibi6ticos, las celulas inmortalizadas o sobrenadantes de cultivo de las mismas, se exploran usando MAdCAM, una parte de la misma o una celula que expresa MAdCAM. En una realizaci6n preferida, la exploraci6n inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferiblemente un ELISA. Un ejemplo de exploraci6n con ELISA se proporciona en la publicaci6n de PCT N° WO 00/37504.
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En otra realizaci6n, las celulas productoras de anticuerpos pueden prepararse a partir de un ser humano que tiene un trastorno autoinmune y que expresa anticuerpos anti-MAdCAM. Las celulas que expresan los anticuerpos anti-MAdCAM pueden aislarse aislando gl6bulos blancos y sometiendolos a separaci6n de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o seleccionando en placas recubiertas con MAdCAM o una parte de la misma. Estas celulas pueden fusionarse con un mieloma no secretor humano para producir hibridomas humanos que expresan anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En general, esta es una realizaci6n menos preferida debido a que es probable que los anticuerpos anti-MAdCAM tengan una baja afinidad para MAdCAM.
Las celulas productoras de anticuerpo anti-MAdCAM, por ejemplo, hibridomas se seleccionan, clonan y exploran adicionalmente con respecto a caracterfsticas deseables, incluyendo crecimiento celular robusto, alta producci6n de anticuerpos y caracterfsticas de anticuerpos deseables, como se analiza adicionalmente a continuaci6n. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singenicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos o en cultivo celular in vitro. Los metodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas se conocen bien por los expertos en la materia.
Preferiblemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana y los linfocitos B de bazo se fusionan con un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. Mas preferiblemente, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE™ y la lfnea celular de mieloma es un mieloma de rat6n no secretor, tal como la lfnea celular de mieloma P3-X63-AG8-653 (ATCC). Vease, por ejemplo, el Ejemplo I.
De este modo, la descripci6n proporciona metodos para producir una lfnea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo dirigido a MAdCAM que comprende (a) inmunizar un animal transgenico no humano descrito en el presente memoria con MAdCAM, una parte de MAdCAM o una celula o tejido que expresa MAdCAM; (b) permitir al animal transgenico montar una respuesta inmune a MAdCAM; (c) aislar celulas productoras de anticuerpo de animal transgenico; (d) inmortalizar las celulas productoras de anticuerpos; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las celulas productoras de anticuerpos inmortalizadas; y (f) explorar las celulas productoras de anticuerpos inmortalizadas o los sobrenadantes de cultivo de las mismas para identificar un anticuerpo dirigido a MAdCAM.
En un aspecto, la invenci6n proporciona hibridomas que producen anticuerpos humanos anti-MAdCAM. En una realizaci6n preferida, los hibridomas son hibridomas de rat6n, como se ha descrito anteriormente. En otra realizaci6n, los hibridomas se producen en una especie no humana, no de rat6n tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. En otra realizaci6n, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que un mieloma no secretor humano se fusiona con una celula humana que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM.
Acidos nucleicos, Vectores, Celulas Hospedadoras y Metodos Recombinantes para Preparar Anticuerpos
Acidos nucleicos
Se proporcionan moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos anti-MAdCAM de la invenci6n. En una realizaci6n, la molecula de acido nucleico codifica una cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En una realizaci6n preferida, una molecula de acido nucleico sencilla codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-MAdCAM y otra molecula de acido nucleico codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En una realizaci6n mas preferida, la inmunoglobulina modificada es una inmunoglobulina humana, preferiblemente una Ig humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena λ o una cadena κ, preferiblemente una cadena κ.
En una realizaci6n preferida la molecula de acido nucleico que codifica la regi6n variable de la cadena ligera comprende la secuencia de lfnea germinal de un gen humano Vκ A2, A3, A26, B3, O12 u O18 o una variante de dicha secuencia. En una realizaci6n preferida, la molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera comprende una secuencia derivada de un gen humano Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, o Jκ5. En una realizaci6n preferida, la molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera codifica no mas de once cambios de aminoacidos del gen Vκ de lfnea germinal A2, A3, A26, B3, O12 u O18, preferiblemente no mas de seis cambios de aminoacidos e incluso mas preferiblemente no mas de tres cambios de aminoacidos. En una realizaci6n mas preferida, el acido nucleico que codifica la cadena ligera es la secuencia de lfnea germinal.
Se describe una molecula de acido nucleico que codifica una regi6n variable de la cadena ligera (VL) que contiene hasta once cambios de aminoacidos en comparaci6n con la secuencia de lfnea germinal, en la que los cambios de aminoacidos son identicos a los cambios de aminoacidos de la secuencia de lfnea germinal de la VL de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Tambien se describe una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la regi6n variable de cadena ligera de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. Tambien se describe una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una o mas de las CDR de una cualquiera de las cadenas ligeras de 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En una descripci6n, la molecula de acido nucleico
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comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de todas las CDR de una cualquiera de las cadenas ligeras de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia de nucle6tidos de una de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 6 67. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una o mas de las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia de nucle6tidos de una o mas de las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, 6 67. En una descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende las secuencias de nucle6tidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, 6 67.
Tambien se describe una molecula de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de una VL que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una VL descrita anteriormente, particularmente a una VL que comprende una secuencia de aminoacidos de una de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 6 68. Tambien se describe una secuencia de nucle6tidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una secuencia de nucle6tidos de una de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 6 67.
Se describe una molecula de acido nucleico que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molecula de acido nucleico que codifica una VL como se ha descrito anteriormente, particularmente una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica una secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 4, 8,12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 6 68. Tambien se proporciona una molecula de acido nucleico que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos de una de SEC ID N°: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 6 67.
Tambien se describe una molecula de acido nucleico que codifica una regi6n variable de cadena pesada (VH) que utiliza un gen de VH humano 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 6 4-4. En algunas descripciones, la molecula de acido nucleico que codifica el gen VH utiliza ademas un gen de la familia humana JH4 o JH6. En algunas descripciones, la molecula de acido nucleico que codifica el gen de VH utiliza el gen humano JH4b o JH6b. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia derivada de un gen humano D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 6 6-19. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico que codifica la VH no contiene mas de quince cambios de aminoacidos de los genes de lfnea germinal VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 6 4-4, preferiblemente no mas de seis cambios de aminoacidos e incluso mas preferiblemente no mas de tres cambios de aminoacidos. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoacidos en comparaci6n con la secuencia de lfnea germinal, en la que el cambio de aminoacidos es identico a un cambio de aminoacidos de la secuencia de lfnea germinal de la cadena pesada de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod
o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la VH contiene no mas de quince cambios de aminoacidos en comparaci6n con las secuencias de lfnea germinal, en la que los cambios son identicos a los cambios de la secuencia de lfnea germinal de la VH de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod.
En una descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5; 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una o mas de las CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En una descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende secuencias de nucle6tidos que codifican las secuencias de aminoacidos de todas las CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,
6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 o que comprende una secuencia de nucle6tidos de una de SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 6 63. En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la secuencia de aminoacidos de una o mas de las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 o comprende una secuencia de nucle6tidos de una o mas de las CDR de una cualquiera de las SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 6 63. En una descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica las secuencias de aminoacidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 o comprende una secuencia de nucle6tidos de todas las CDR de una cualquiera de SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 6
63. En una descripci6n, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica una
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regi6n contigua desde el comienzo de CDR1 hasta el final de CDR3 de una cadena pesada o ligera de cualquiera de los anticuerpos anti-MAdCAM anteriormente mencionados.
En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de una VH que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una de las secuencias de aminoacidos que codifican una VH como se ha descrito inmediatamente antes, particularmente a una VH que comprende una secuencia de aminoacidos de una de las SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 52, 56, 60 6 64. Tambien se describe una secuencia de nucle6tidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %. 98 % o 99 % identica a una secuencia de nucle6tidos de una de las SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 6 63.
En otra descripci6n, la molecula de acido nucleico que codifica una VH es una que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una secuencia de nucle6tidos que codifica una VH como se ha descrito anteriormente, particularmente una VH que comprende una secuencia de aminoacidos de una de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64. Tambien se proporciona una secuencia de nucle6tidos que codifica una VH que hibrida en condiciones altamente rigurosas con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucle6tidos de una de SEC ID N°: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 6 63.
La secuencia de nucle6tidos que codifica una o ambas de las cadenas pesada y ligera completas de un anticuerpo anti-MAdCAM o las regiones variables de las mismas puede obtenerse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo anti-MAdCAM. Los metodos para aislar ARNm que codifica un anticuerpo se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). El ARNm puede usarse para producir ADNc para su uso en la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) o clonaci6n de ADNc de genes de anticuerpo. En una realizaci6n de la invenci6n, las moleculas de acido nucleico pueden obtenerse de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM, como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un hibridoma que tiene como uno de sus compaferos de fusi6n una celula de animal transgenico que expresa genes de inmunoglobulina humana, tal como un animal XENOMOUSET, un animal transgenico rat6n no humano o un animal transgenico no humano, no rat6n. En otra realizaci6n, el hibridoma deriva de un animal no transgenico, no humano, que puede usarse, por ejemplo, para anticuerpos humanizados.
Una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada completa de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse por fusi6n de una molecula de acido nucleico que codifica el dominio variable completo de una cadena pesada o un dominio de uni6n a antfgeno de la misma con un dominio constante de una cadena pesada. De forma similar, una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse por fusi6n de una molecula de acido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena ligera o un dominio de uni6n a antfgeno de la misma con un dominio constante de una cadena ligera. Las moleculas de acido nucleico que codifican las regiones VH y VL pueden convertirse a genes de anticuerpo de longitud completa insertandolas en vectores de expresi6n que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH esta unido operativamente al segmento o segmentos de regi6n constante de cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL esta unido operativamente al segmento de regi6n constante de cadena ligera (CL) dentro del vector. Como alternativa, las moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas VH o VL se convierten a genes de anticuerpo de longitud completa uniendo, por ejemplo, ligando, la molecula de acido nucleico que codifica una cadena VH a una molecula de acido nucleico que codifica una cadena CH usando tecnicas de biologfa molecular convencionales. Lo mismo puede conseguirse usando moleculas de acido nucleico que codifican cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de regi6n constante de cadena pesada y ligera humanos se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., NIH Publ. N°. 91-3242 (1991). Las moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa pueden expresarse despues a partir de una celula en la que se han introducido y aislarse el anticuerpo anti-MAdCAM.
En una descripci6n, el acido nucleico que codifica la regi6n variable de la cadena pesada codifica la regi6n variable de las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 6 64 y la molecula de acido nucleico que codifica la regi6n variable de las cadenas ligeras codifica la regi6n variable de la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 6 68.
En una realizaci6n, una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM o una parte de uni6n a antfgeno del mismo o la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM o una parte de uni6n a antfgeno del mismo puede aislarse de un animal no humano, no rat6n que expresa genes de inmunoglobulina humana y se ha inmunizado con un antfgeno de MAdCAM. En otra realizaci6n, la molecula de acido nucleico puede aislarse de una celula productora de anticuerpo anti-MAdCAM derivada de un animal no transgenico o de un paciente humano que produce anticuerpos anti-MAdCAM. Puede aislarse ARNm de las celulas productoras de anticuerpo anti-MAdCAM por tecnicas convencionales, clonarse y/o amplificarse usando PCR y tecnicas de construcci6n de bibliotecas y explorarse usando protocolos convencionales para obtener moleculas de acido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera anti-MAdCAM.
Las moleculas de acido nucleico pueden usarse para expresar de forma recombinante grandes cantidades de
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anticuerpos anti-MAdCAM, como se describe posteriormente. Las moleculas de acido nucleico tambien pueden usarse para producir anticuerpos quimericos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe adicionalmente a continuaci6n. Si las moleculas de acido nucleico derivan de un animal no transgenico, no humano, las moleculas de acido nucleico pueden usarse para humanizaci6n de anticuerpos, tambien como se describe posteriormente.
En otra realizaci6n, las moleculas de acido nucleico de la invenci6n pueden usarse como sondas o cebadores de PCR para secuencias de anticuerpo especfficas. Por ejemplo, puede usarse una sonda de molecula de acido nucleico en metodos de diagn6stico o puede usarse un cebador de PCR de molecula de acido nucleico para amplificar regiones de ADN que podrfan usarse, entre otras, para aislar secuencias de nucle6tidos para su uso en la producci6n de dominios variables de anticuerpos anti-MAdCAM. En una realizaci6n preferida, las moleculas de acido nucleico son oligonucle6tidos. En una realizaci6n mas preferida, los oligonucle6tidos son de regiones altamente variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de interes. En una realizaci6n aun mas preferida, los oligonucle6tidos codifican todas o una parte de una o mas de las CDR.
Vectores
La invenci6n proporciona vectores que comprenden las moleculas de acido nucleico de la invenci6n que codifican la cadena pesada o la parte de uni6n a antfgeno de la misma. La invenci6n tambien proporciona vectores que comprenden las moleculas de acido nucleico de la invenci6n que codifican la cadena ligera o parte de uni6n a antfgeno de la misma. La invenci6n tambien proporciona vectores que comprenden moleculas de acido nucleico que codifican protefnas de fusi6n, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de los mismos.
Para expresar los anticuerpos o partes de anticuerpos de la invenci6n, se insertan ADN que codifican cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parcial, obtenidas como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresi6n de modo que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. Los vectores de expresi6n incluyen plasmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus vegetales tales como virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, c6smidos, YAC, episomas derivados de EBV y similares. El gen del anticuerpo esta ligado en un vector de modo que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirven su funci6n pretendida de regular la transcripci6n y traducci6n del gen de anticuerpo. El vector de expresi6n y las secuencias de control de la expresi6n se seleccionan para ser compatibles con la celula hospedadora de expresi6n usada. El gen de cadena ligera de anticuerpos y el gen de cadena pesada de anticuerpos pueden insertarse en vectores separados. En una realizaci6n preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresi6n. Los genes de anticuerpos se insertan en el vector de expresi6n por metodos convencionales (por ejemplo, ligaci6n de sitios de restricci6n complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector o ligaci6n de extremos romos si no estan presentes sitios de restricci6n).
Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricci6n apropiados modificados por ingenierfa genetica de modo que cualquier secuencia VH o VL pueda insertarse y expresarse facilmente, como se ha descrito anteriormente. En tales vectores, el corte y empalme sucede habitualmente entre el sitio donador de corte y empalme en la regi6n J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la regi6n C humana y tambien en las regiones de corte y empalme que aparecen dentro de los exones CH humanos. La poliadenilaci6n y la terminaci6n de la transcripci6n se producen en sitios cromos6micos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El vector de expresi6n recombinante tambien puede codificar un peptido sefal que facilite la secreci6n de la cadena de anticuerpos de una celula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el peptido sefal se una en fase con el extremo amino terminal del gen de cadena de anticuerpo. El peptido sefal puede ser un peptido sefal de inmunoglobulina o un peptido sefal heter6logo (es decir, un peptido sefal de una protefna no inmunoglobulina).
Ademas de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresi6n recombinante de la invenci6n portan secuencias reguladoras que controlan la expresi6n de los genes de cadena de anticuerpos en una celula hospedadora. Se apreciara por los expertos en la materia que el disefo del vector de expresi6n incluyendo la selecci6n de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la selecci6n de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresi6n de la protefna deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresi6n de celulas hospedadoras de mamffero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresi6n proteica en celulas de mamffero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardfo principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores de mamffero fuertes tales como promotores de actina e inmunoglobulina nativa. Para una descripci6n adicional de elementos reguladores virales y secuencias de los mismos vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.168.062, 4.510.245 y 4.968.615. Se conocen en la tecnica metodos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripci6n de promotores y vectores, asf como transformaci6n de plantas. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.517.529. Tambien se conocen bien en la tecnica metodos para expresar polipeptidos en celulas bacterianas o celulas fungicas, por ejemplo, celulas de levadura.
Ademas de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresi6n recombinantes de la invenci6n pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicaci6n del vector
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en celulas hospedadoras (por ejemplo, orfgenes de replicaci6n) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selecci6n de celulas hospedadoras en las que el vector se ha introducido (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, tfpicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas hospedadoras dhfr-con selecci6n/amplificaci6n de metotrexato) y el gen neo (para selecci6n de G418) y el gen de la glutamato sintetasa.
Celulas Hospedadoras No de Hibridoma y Metodos para Producir Proteina de Forma Recombinante
Pueden usarse moleculas de acido nucleico que codifican la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y/o la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y vectores que comprenden estas moleculas de acido nucleico, para transformaci6n de una celula hospedadora de mamffero, planta, bacteriana o de levadura adecuada. La transformaci6n puede ser por cualquier metodo conocido para introducir polinucle6tidos en una celula hospedadora. Los metodos para introducci6n de polinucle6tidos heter6logos en celulas de mamffero se conoce bien en la tecnica e incluye transfecci6n mediada por dextrano, precipitaci6n de fosfato calcico, transfecci6n mediada por polibreno, fusi6n de protoplastos, electroporaci6n, encapsulaci6n del polinucle6tido o polinucle6tidos en liposomas, inyecci6n biolfstica y microinyecci6n directa del ADN en nucleos. Ademas, las moleculas de acido nucleico pueden introducirse en celulas de mamffero por vectores virales. Los metodos para transformar celulas se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. Se conocen bien en la tecnica metodos para transformar celulas vegetales, incluyendo, por ejemplo, transformaci6n mediada por Agrobacterium, transformaci6n biolfstica, inyecci6n directa, electroporaci6n y transformaci6n viral. Tambien se conocen bien en la tecnica metodos para transformar celulas bacterianas y de levadura.
Las lfneas celulares de mamffero disponibles como huespedes para expresi6n se conocen bien en la tecnica e incluyen muchas lfneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colecci6n Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, celulas de ovario de hamster Chino (CHO), NS0, celulas SP2, celulas HEK-293T, celulas NIH-3T3, celulas HeLa, celulas de rif6n de hamster recien nacido (BHK), celulas de rif6n de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), celulas A549, celulas 3T3 y varias otras lfneas celulares. Las celulas hospedadoras de mamffero incluyen celulas humanas, de rat6n, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovinas, de caballo y de hamster. Se seleccionan lfneas celulares de preferencia particular a traves de la determinaci6n de las lfneas celulares que tienen altos niveles de expresi6n. Otras lfneas celulares que pueden usarse son lfneas celulares de insecto, tales como celulas Sf9, celulas de anfibio, celulas bacterianas, celulas vegetales y celulas fungicas. Cuando los vectores de expresi6n recombinante que codifican la cadena pesada o la parte de uni6n a antfgeno de la misma, la cadena ligera y/o parte de uni6n a antfgeno de la misma se introducen en celulas hospedadoras de mamffero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresi6n del anticuerpo en las celulas hospedadoras o, mas preferiblemente, la secreci6n del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se dejan crecer las celulas hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando metodos de purificaci6n de protefnas convencionales. Las celulas hospedadoras vegetales incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja acuatica, mafz, trigo, patata, etc. Las celulas hospedadoras bacterianas incluyen E. coli y especies de Streptomyces. Las celulas hospedadoras de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Ademas, la expresi6n de anticuerpos de la invenci6n (u otros restos de los mismos) de las lfneas celulares de producci6n pueden potenciarse usando varias tecnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresi6n del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque habitual para potenciar la expresi6n en ciertas condiciones. El sistema GS se realiza en su totalidad o en parte con relaci6n a las Patentes Europeas N° 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 y 0 323 997.
Es probable que los anticuerpos expresados por lfneas celulares diferentes o en animales transgenicos tengan diferente glucosilaci6n entre sf. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moleculas de acido nucleico proporcionadas en la presente memoria o que comprenden las secuencias de aminoacidos proporcionadas en la presente memoria son parte de la presente invenci6n, independientemente de la glucosilaci6n de los anticuerpos.
Animales Transgenicos y Plantas
La invenci6n tambien proporciona animales no humanos transgenicos y plantas transgenicas que comprenden una o mas de las moleculas de acido nucleico de la invenci6n que pueden usarse para producir anticuerpos de la invenci6n. Los anticuerpos pueden producirse en y recuperarse de tejido o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hamsteres u otros mamfferos. Vease, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. Como se ha descrito anteriormente, los animales transgenicos no humanos que comprende loci de inmunoglobulina humanos pueden inmunizarse con MAdCAM o una parte de la misma. Se describen metodos para preparar anticuerpos en plantas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.046.037 y 5.959.177.
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En otra realizaci6n, se producen animales transgenicos no humanos y plantas transgenicas introduciendo una o mas moleculas de acido nucleico de la invenci6n en el animal o la planta por tecnicas transgenicas convencionales. Vease Hogan, mencionado anteriormente. Las celulas transgenicas usadas para preparar al animal transgenico pueden ser celulas madre embrionarios, celulas somaticas u 6vulos fertilizados. El organismo no humano transgenico puede ser quimerico, heterocigoto no quimerico y homocigoto no quimerico. Vease, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En otra realizaci6n, el organismo no humano transgenico puede tener una interrupci6n diana y reemplazo que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de interes. En una realizaci6n preferida, los animales o plantas transgenicas comprenden y expresan moleculas de acido nucleico que codifican cadenas pesada y ligera que se combinan para unirse especfficamente a MAdCAM, preferiblemente MAdCAM humana. En otra realizaci6n, los animales o plantas transgenicas comprenden moleculas de acido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden realizarse en cualquier animal transgenico. En una realizaci6n preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacas o caballos. El animal transgenico no humano expresa dichos polipeptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lagrimas, mucus u otros fluidos corporales.
�ibliotecas de Presentaci6n de Fagos
La descripci6n proporciona un metodo para producir un anticuerpo anti-MAdCAM o parte de uni6n a antfgeno del mismo que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, explorar la biblioteca con una MAdCAM o una parte de la misma, aislar fagos que se unen a MAdCAM y obtener el anticuerpo del fago. Un metodo para preparar la biblioteca de anticuerpos comprende las etapas de inmunizar a un animal hospedador no humano que comprende un locus de inmunoglobulina con MAdCAM o una parte antigenica de la misma para crear una respuesta inmune, extraer celulas del animal hospedador, las celulas que son responsables de la producci6n de anticuerpos; aislar ARN de las celulas extrafdas, transcribir de formar inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando un cebador e insertar el ADNc en un vector de presentaci6n de fagos de modo que los anticuerpos se expresan en el fago. Pueden obtenerse de esta manera anticuerpos anti-MAdCAM recombinantes de la invenci6n.
Los anticuerpos humanos anti-MAdCAM recombinantes de la invenci6n ademas de los anticuerpos anti-MAdCAM descritos en la presente memoria pueden aislarse por exploraci6n de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de presentaci6n de fagos scFv, preparada usando ADNc de VL y VH humanas preparados a partir ARNm aislado de linfocitos humanos. Se conocen en la tecnica metodologfas para preparar y explorar tales bibliotecas. En el mercado hay disponibles kits para generar bibliotecas de presentaci6n de fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n° de catalogo 27-9400-01; y el kit de presentaci6n de fagos Stratagene SurfZAPT, n° de catalogo 240612). Tambien existen otros metodos y reactivos que pueden usarse para generar y explorar bibliotecas de presentaci6n de anticuerpos (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.223.409; Publicaci6n de PCT N° WO 92/18619; Publicaci6n de PCT N° WO 91/17271; Publicaci6n de PCT N° WO 92/20791; Publicaci6n de PCT N° WO 92/15679; Publicaci6n de PCT N° WO 93/01288; Publicaci6n de PCT N° WO 92/01047; Publicaci6n de PCT N° WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9: 1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 12751281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res,
19: 4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991).
Para aislar anticuerpos humanos anti-MAdCAM con las caracterfsticas deseadas, un anticuerpo humano anti-MAdCAM como se ha descrito en la presente memoria se usa primero para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tienen actividad de uni6n similar hacia MAdCAM, usando los metodos de impronta de epftopos descritos en Hoogenboom et al., Publicaci6n de PCT N° WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este metodo son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y exploradas como se ha descrito en McCafferty et al., Publicaci6n de PCT N° WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos scFv se exploran preferiblemente usando MAdCAM humana como antfgeno.
Una vez que se seleccionan los segmentos VL y VH humanos iniciales, se realizan experimentos de "mezclar y emparejar", en los que se exploran diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados con respecto a uni6n a MAdCAM, para seleccionar combinaciones de pares VL/VH preferidas. Adicionalmente, para mejorar mas la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del par o pares VL/VH pueden mutarse aleatoriamente, preferiblemente dentro de la regi6n CDR3 de VH y/o VL, en un proceso analogo al proceso de mutaci6n somatica in vivo responsable de la maduraci6n de afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduraci6n de afinidad in vitro puede conseguirse amplificando las regiones VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la VH CDR3 o VL CDR3, respectivamente, cuyos cebadores se han "afadido" a una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotfdicas en ciertas posiciones de modo que los productos de PCR resultantes codifican segmentos VH y VL en los que se ha introducido mutaciones aleatorias en las regiones
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VH y/o VL CDR3. Estos segmentos VH y VL mutados de forma aleatoria pueden volver a explorarse con respecto a uni6n a MAdCAM.
Despues de la exploraci6n y aislamiento de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n de una biblioteca de presentaci6n de inmunoglobulina recombinante, puede recuperarse el acido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado del envase de presentaci6n (por ejemplo, del genoma de fago) y subclonarse en otros vectores de expresi6n por tecnicas de ADN recombinante convencionales. Si se desea, el acido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invenci6n como se describe posteriormente. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por exploraci6n de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresi6n recombinante y se introduce en celulas hospedadoras de mamffero, como se ha descrito anteriormente.
Cambio de Clase
Otra descripci6n es para proporcionar uno por el que la clase de un anticuerpo anti-MAdCAM puede cambiarse con otra. Se afsla una molecula de acido nucleico que codifica que codifica VL o VH usando metodos bien conocidos en la tecnica de modo que no incluya ninguna secuencia de nucle6tidos que codifique CL o CH. La molecula de acido nucleico que codifica VL o VH se une operativamente despues a una secuencia de nucle6tidos que codifica una CL
o CH de una clase diferente de molecula de inmunoglobulina. Esto puede conseguirse usando un vector o molecula de acido nucleico que comprende una secuencia codificante de CL o CH, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-MAdCAM que originalmente era IgM puede cambiarse de clase a una IgG. Ademas, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase IgG a otra, por ejemplo, de IgG4 a IgG2. Un metodo preferido para producir un anticuerpo de la invenci6n que comprende una isotipo o subclase de anticuerpo deseado comprende las etapas de aislar un acido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM y un acido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM, obteniendo la regi6n variable de la cadena pesada, ligando la regi6n variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresando la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una celula y recogiendo el anticuerpo anti-MAdCAM con el isotipo deseado.
Derivados de Anticuerpo
Se pueden usar las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente para generar derivados de anticuerpo usando tecnicas y metodos conocidos para los expertos en la materia.
Anticuerpos Humanizados
La inmunogenicidad de anticuerpos no humanos puede reducirse en cierto grado usando tecnicas de inmunizaci6n, potencialmente empleando tecnicas de presentaci6n que usan bibliotecas apropiadas. Se apreciara que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden humanizarse o primatizarse usando tecnicas bien conocidas en la materia. Vease, por ejemplo, Winter y Harris, Immunol Today, 14:43-46 (1993) y Wright et al, Crit. Reviews in Immunol, 12125-168 (1992). El anticuerpo de interes puede obtenerse por ingenierfa genetica mediante tecnicas de ADN recombinante para sustituir CH1. CH2. CH3, dominios bisagra y/o el dominio flanqueante con la secuencia humana correspondiente (vease el documento WO 92/02190 y la Patente de Estados Unidos N° 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). En otra realizaci6n, puede humanizarse un anticuerpo no humano anti-MAdCAM sustituyendo el CH1, dominio bisagra, CH2, CH3 y/o los dominios flanqueantes con la secuencia humana correspondiente de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n.
Anticuerpos Mutados
En otra realizaci6n, las moleculas de acido nucleico, vectores y celulas hospedadoras pueden usarse para preparar anticuerpos mutados anti-MAdCAM. Los anticuerpos pueden mutarse en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una propiedad de uni6n del anticuerpo. Por ejemplo, puede realzarse una mutaci6n en una o mas de las regiones CDR para aumentar o reducir la Kd del anticuerpo para MAdCAM. Se conocen bien en la materia tecnicas de mutagenesis dirigida. Vease, por ejemplo, Sambrook et al y Ausubel et al., mencionado anteriormente. En una descripci6n las mutaciones se realizan en un resto aminoacfdico que se sabe que cambia en comparaci6n con la lfnea germinal en una regi6n variable de un anticuerpo anti-MAdCAM. En otra realizaci6n de la descripci6n, se realizan una o mas mutaciones en un resto aminoacfdico que se sabe que cambia en comparaci6n con la lfnea germinal de una regi6n variable o regi6n CDR de uno de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.342, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, se realizan una o mas mutaciones en un resto aminoacfdico que se sabe que cambia en comparaci6n con la lfnea germinal en una regi6n variable o regi6n CDR cuya secuencia de aminoacidos se presenta en SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68, o cuya secuencia de nucle6tidos se presenta en SEC ID N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 o 67. En otra realizaci6n, las moleculas de acido nucleico se mutan en una o mas de las regiones flanqueantes. Puede realizarse una mutaci6n en una regi6n flanqueante o dominio constante para aumentar la semi-vida del anticuerpo anti-MAdCAM. Vease, por ejemplo, el documento WO 00/09560, publicado el 24 de febrero de 2000. En una realizaci6n,
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pueden existir una, tres o cinco o diez mutaciones puntuales y no mas de quince mutaciones puntuales. Una mutaci6n en una regi6n flanqueante o dominio constante tambien puede realizarse para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para uni6n covalente o no covalente a otra molecula o para alterar tales propiedades como fijaci6n de complemento. Pueden realizarse mutaciones en cada una de las regiones flanqueantes, el dominio constante y las regiones variables en un anticuerpo mutado sencillo. Como alternativa, pueden realizarse mutaciones en solamente una de las regiones flanqueantes, las regiones variables o el dominio constante en un anticuerpo mutado sencillo.
En una realizaci6n, no existen mas de quince cambios de aminoacidos en las regiones VH o VL del anticuerpo mutado anti MAdCAM en comparaci6n con el anticuerpo anti-MAdCAM antes de la mutaci6n. En una realizaci6n mas preferida, no existen mas de diez cambios de aminoacidos en las regiones VH o VL del anticuerpo mutado anti-MAdCAM, mas preferiblemente no mas de cinco cambios de aminoacidos o incluso mas preferiblemente no mas de tres cambios de aminoacidos. En otra realizaci6n, no existen mas de quince cambios de aminoacidos en los dominios constantes, mas preferiblemente, no mas de diez cambios de aminoacidos, incluso mas preferiblemente, no mas de cinco cambios de aminoacidos.
Anticuerpos Modificados
En otra realizaci6n, puede realizarse un anticuerpo de fusi6n o inmunoadhesina que comprende todo o una parte de un anticuerpo anti-MAdCAM unido a otro polipeptido. En una realizaci6n preferida, solamente las regiones variables del anticuerpo anti-MAdCAM se unen al polipeptido. En otra realizaci6n preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-MAdCAM se une a un primer polipeptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-MAdCAM se une a un segundo polipeptido que se asocia con el primer polipeptido de una manera en la que los dominios VH y VL puede interaccionar entre sf para formar un sitio de uni6n a anticuerpo. En otra realizaci6n preferida, el dominio VH se separa del dominio VL por un enlazador de modo que los dominios VH y VL pueden interaccionar entre sf (vease posteriormente bajo Anticuerpos de Cadena Sencilla). El anticuerpo VH-enlazador-VL se une despues al polipeptido de interes. El anticuerpo de fusi6n es util para dirigir un polipeptido a una celula o tejido que expresa MAdCAM. El polipeptido puede ser un agente terapeutico, tal como una toxina, factor de crecimiento u otra protefna reguladora o puede ser un agente de diagn6stico, tal como una enzima que puede visualizarse facilmente, tal como peroxidasa de rabano rusticano. Ademas, pueden crearse anticuerpos de fusi6n en los que se unen dos (o mas) anticuerpos de cadena sencilla entre sf. Esto es util si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena polipeptfdica sencilla o si se quiere crear un anticuerpo biespecffico.
Para crear un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3 de modo que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una protefna de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (vease, por ejemplo, Bird et al., Science,
242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si s6lo se usa un VH y VL sencillo, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan mas de dos VH y VL.
En otra realizaci6n, pueden prepararse otros anticuerpos modificados usando moleculas de acido nucleico que codifican anti-MAdCAM. Por ejemplo pueden prepararse "cuerpos Kappa" (I11 et al., Protein Eng, 10: 949-57(1997)), "Minicuerpos" (Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9(1994)), "Diacuerpos" (Holliger et al., PNAS USA, 90: 64446448(1993)) o "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., "Janusin : new molecular design for bispecific reagents,� Int J Cancer Suppl, 7:51-52 (1992)) usando tecnicas de biologfa molecular convencionales siguiendo las ensefanzas de la memoria descriptiva.
En otro aspecto, puede generarse anticuerpos quimericos y biespecfficos. Puede realizarse un anticuerpo quimerico que comprende CDR y regiones flanqueantes de diferentes anticuerpos. En una realizaci6n preferida, las CDR del anticuerpo quimerico comprenden todas las CDR de la acci6n variable de una cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM, mientras que las regiones flanqueantes derivan de uno o mas anticuerpos diferentes. En una realizaci6n mas preferida, las CDR del anticuerpo quimerico comprenden todas las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo humano anti-MAdCAM. Las regiones flanqueantes pueden ser de otra especie y pueden, en una realizaci6n preferida, humanizarse. Como alternativa, las regiones flanqueantes pueden ser de otro anticuerpo humano.
Puede generarse un anticuerpo biespecffico que se une especfficamente a MAdCAM a traves de un dominio de uni6n y a una segunda molecula a traves de un segundo dominio de uni6n. El anticuerpo biespecffico puede producirse a traves de tecnicas de biologfa molecular recombinantes o pueden conjugarse ffsicamente juntos. Ademas, puede generarse un anticuerpo de cadena sencilla que contiene mas de un VH y VL que se une especfficamente a MAdCAM y a otra molecula. Tales anticuerpos biespecfficos pueden generarse usando tecnicas que se conocen bien por ejemplo, en relaci6n con (i) y (ii) vease, por ejemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 7281 (1994) y Wright y Harris, mencionado anteriormente y en relaci6n con (iii), vease, por ejemplo, Traunecker et al., Int. J Cancer (Supl) 7: 51-52 (1992). En una realizaci6n preferida, el anticuerpo biespecffico se une a MAdCAM y a otra molecula expresada a alto nivel en celulas endoteliales. En una realizaci6n mas preferida, la otra molecula es VCAM, ICAM o L-selectina.
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En diversas descripciones, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando una o mas de las regiones variables o una o mas de la regiones CDR de uno de los anticuerpos seleccionados de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 720.5, 7, 26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod o 7.26.4-mod. En otra descripci6n, los anticuerpos modificados se preparan usando una o mas de las regiones variables o una o mas de las regiones CDR cuya secuencia de aminoacidos se presenta en SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 o 68 o cuya secuencia de nucle6tidos se presenta en SEC ID N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 6 67.
Anticuerpos Derivatizados y Marcados
Un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invenci6n puede derivatizarse o unirse a otra molecula (por ejemplo, otro peptido o protefna). En general, los anticuerpos o partes de los mismos se derivatizan de modo que la uni6n a MAdCAM no se vea afectada de forma negativa por la derivatizaci6n o el marcaje. En consecuencia, se pretende que los anticuerpos y partes de anticuerpos de la invenci6n incluyan formas tanto intactas como unificadas de los anticuerpos humanos anti-MAdCAM descritos en la presente memoria en el grado en que estos estan abarcados por las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invenci6n puede unirse funcionalmente (por acoplamiento qufmico, fusi6n genetica, asociaci6n no covalente o de otro modo) con una o mas entidades moleculares adicionales, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecffico o un diacuerpo), un agente de detecci6n, un agente citot6xico, un agente farmaceutico y/o una protefna o peptido que pueda mediar la asociaci6n del anticuerpo o parte de anticuerpo con otra molecula (tal como una regi6n de nucleo de estreptavidina o un marcador de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por entrecruzamiento de dos o mas anticuerpos (del mismo tipo o tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecfficos). Los agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen los que son heterobifuncionales que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ester) u homobifuncional (por ejemplo, disuccinimidil suberato). Tales enlazadores estan disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detecci6n utiles con los que un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invenci6n puede derivatizarse incluyen compuestos fluorescentes incluyendo fluorescefna, fluorescefna isotiocianato, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, f6sforos de lantanido y similares. Un anticuerpo tambien puede marcarse con enzimas que son utiles para detecci6n, tales como peroxidasa de rabano rusticano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando se marca un anticuerpo con una enzima detectable, se detecta por adici6n de reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacci6n que pueda apreciarse. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rabano rusticano esta presente, la adici6n de per6xido de hidr6geno y de diaminobenzidina conduce a un producto de reacci6n coloreado, que es detectable. Un anticuerpo tambien puede marcarse con biotina y detectarse a traves de medici6n indirecta de uni6n a avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede marcarse con un agente magnetico, tal como gadolinio. Un anticuerpo tambien puede marcarse con un epftopo polipeptfdico predeterminado reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, secuencia de pares de cremallera de leucina, sitios de uni6n para anticuerpos secundarios, dominios de uni6n a metales, marcadores epit6picos). En algunas realizaciones, los marcadores se unen por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento esterico potencial.
Un anticuerpo anti-MAdCAM tambien puede marcarse con un aminoacido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse para fines tanto diagn6sticos como terapeuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar tejidos que expresan MAdCAM por rayos X u otras tecnicas de diagn6stico. Ademas, el radiomarcador puede usarse terapeuticamente como una toxina para tejido enfermo o tumores que expresan MAdCAM. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero sin limitaci6n, los siguientes radiois6topos o radionuclidos: 3H, 14C, 15N,35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Tambien puede derivatizarse un anticuerpo anti-MAdCAM con un grupo qufmico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser utiles para mejorar las caracterfsticas biol6gicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semi-vida en suero o para aumentar la uni6n a tejido. Esta metodologfa tambien se aplicarfa a cualquier fragmento de uni6n a antfgeno o versiones de anticuerpos anti-MAdCAM.
Composiciones y Kits Farmaceuticos
En un aspecto adicional, la invenci6n proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humano anti-MAdCAM y metodos para tratar sujetos con tales composiciones. En algunas realizaciones, el sujeto de tratamiento es un ser humano. En otras realizaciones, el sujeto es un sujeto veterinario. En algunas realizaciones, el sujeto veterinario es un perro o un primate no humano.
El tratamiento puede implicar la administraci6n de uno o mas anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM inhibidores de la invenci6n o fragmentos de uni6n a antfgeno de los mismos, solos o con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Pueden administrarse anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM de la invenci6n y composiciones que los comprenden
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en combinaci6n con uno o mas agentes terapeuticos, de diagn6stico o profilacticos adicionales. Los agentes terapeuticos adicionales incluyen agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores. Estos agentes incluyen, pero sin limitaci6n, los corticosteroides t6picos y orales tales como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 o budesonida; los aminosalicilatos tales como mesalazina, olsalazina, balsalazida o NCX-456; la clase de inmunomoduladores tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilodecakina), IL-11 (Oprelevkina), IL12, antagonistas de MIF/CD74, antagonistas de CD40, tales como TNX-100/5-D12, antagonistas de OX40L, GM-CSF, pimecrolimus o rapamicina; la clase de agentes anti-TNFα tales como infliximab, adalimumab, CDP-870, onercept, etanercept; la clase de agentes antiinflamatorios, tales como inhibidores de PDE-4 (roflumilast, etc.), inhibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc) e inhibidores de ICE (VX-740, etc.) asf como antagonistas del receptor de IL-2, tales como daclizumab, la clase de antagonistas de moleculas de adhesi6n selectiva, tales como natalizumab, MLN-02 o alicaforsen, clases de agentes analgesicos tales como, pero sin limitaci6n, inhibidores de COX-2, tales como rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, moduladores del canal sensible a voltaje de tipo P/Q29 (α2δ), tales como gabapentina y pregabalina, antagonistas del receptor de NK-1, moduladores del receptor cannabinoide y agonistas del receptor delta opioide, asf como agentes anti-neoplasicos, anti-tumorales, anti-angiogenicos o quimioterapeuticos. Tales agentes adicionales pueden incluirse en la misma composici6n o administrarse por separado. En algunas realizaciones, uno o mas anticuerpos inhibidores anti-MAdCAM de la invenci6n pueden usarse como una vacuna o como adyuvantes a una vacuna. En particular, debido a que MAdCAM se expresa en tejido linfoide, los antfgenos de vacuna pueden dirigirse de forma ventajosa a tejido linfoide conjugando el antfgeno con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n.
Como se usa en la presente memoria, "vehfculo farmaceuticamente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersi6n, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isot6nicos y potenciadores de la absorci6n o retardantes y similares que son fisiol6gicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehfculos farmaceuticamente aceptables son agua, soluci6n salina, soluci6n salina tamponada con fosfato, tamp6n de acetato con cloruro s6dico, dextrosa, glicerol, Polietilenglicol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isot6nicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro s6dico en la composici6n. Son ejemplos adicionales de sustancias farmaceuticamente aceptables tensioactivos, agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el periodo de caducidad o eficacia del anticuerpo.
Las composiciones de la presente invenci6n pueden estar en una diversidad de formas, por ejemplo, formas de dosificaci6n lfquida, semi-s6lida y s6lida, tales como soluciones lfquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones de suspensiones, comprimidos, pfldoras, torta liofilizada, polvos secos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administraci6n y aplicaci6n terapeutica. Las composiciones preferidas tfpicas estan en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunizaci6n pasiva de seres humanos. El modo preferido de administraci6n es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutaneo, intraperitoneal, intramuscular, intradermico). En una realizaci6n preferida, el anticuerpo se administra por infusi6n o inyecci6n intravenosa. En otra realizaci6n preferida, el anticuerpo se administra por inyecci6n intramuscular, intradermica o subcutanea.
Las composiciones terapeuticas tfpicamente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricaci6n y almacenamiento. La composici6n puede formularse como una soluci6n, torta liofilizada, polvo seco, microemulsi6n, dispersi6n, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a alta concentraci6n de farmaco. Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse por incorporaci6n del anticuerpo anti-MAdCAM en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinaci6n de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizaci6n. En el caso de polvos esteriles para la preparaci6n de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparaci6n son secado en vacfo y liofilizaci6n que produce un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una soluci6n previamente esteril del mismo. Generalmente, se prepararon dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersi6n basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. Las caracterfsticas deseadas de una soluci6n pueden mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de tensioactivos y el tamafo de partfcula requerido en el caso de dispersi6n por el uso de tensioactivos, fosfolfpidos y polfmeros. Puede proporcionarse absorci6n prolongada de composiciones inyectables mediante la inclusi6n en la composici6n de un agente que retarde la absorci6n, por ejemplo, sales de monoestearato, materiales polimericos, aceites y gelatina.
Los anticuerpos de la presente invenci6n pueden administrarse por una diversidad de metodos conocidos en la tecnica, aunque para muchas aplicaciones terapeuticas, la vfa/modo preferido de administraci6n es la infusi6n subcutanea, intramuscular, intradermica o intravenosa. Como se apreciara por el experto en la materia, la vfa y/o modo de administraci6n variara dependiendo de los resultados deseados.
En ciertas realizaciones, las composiciones de anticuerpo pueden prepararse con un vehfculo que protegera al anticuerpo contra una liberaci6n rapida, tal como una formaci6n de liberaci6n controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polfmeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenvinil acetato, polianhfdridos, acido poliglic6lico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparaci6n de tales formulaciones estan patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery
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Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978)).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n puede administrarse por vfa oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehfculo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) tambien pueden incluirse en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administraci6n terapeutica oral, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invenci6n por una administraci6n distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivaci6n.
Las composiciones de la invenci6n pueden incluir una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "cantidad profilacticamente eficaz" de un anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno de la invenci6n. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patologfa, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto t6xico o perjudicial del anticuerpo o parte de anticuerpo se compensa por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Tfpicamente, puesto que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de o en una etapa mas temprana de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz puede ser menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.
Los regfmenes de dosificaci6n pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada 6ptima (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica). Por ejemplo, puede administrarse una embolada sencilla, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun se indique por las exigencias de la situaci6n terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificaci6n para facilidad de administraci6n y uniformidad de dosificaci6n. La forma unitaria de dosificaci6n como se usa en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamfferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociaci6n con el vehfculo farmaceutico requerido. La especificaci6n para las formas unitarias de dosificaci6n de la invenci6n se dicta por y depende directamente de (a) las caracterfsticas unicas del anticuerpo anti-MAdCAM o parte del mismo y el efecto terapeutico o profilactico particular a conseguir y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de la formaci6n de compuestos de un anticuerpo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invenci6n es de 0,025 a 50 mg/kg, mas preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg, mas preferiblemente 0,1-25, 0,1 a 10 o 0,1 a 3 mg/kg. En algunas realizaciones, una formulaci6n contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un tamp6n de acetato s6dico 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM y polisorbato 80 0,2 mg/ml. Debe observarse que los valores de dosificaci6n pueden variar con el tipo y gravedad de la afecci6n a aliviar. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regfmenes de dosificaci6n especfficos deberfan ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administraci6n de las composiciones y que los intervalos de dosificaci6n expuestos en la presente memoria son solamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o practica de la composici6n reivindicada.
Otro aspecto de la presente invenci6n proporciona kits que comprenden un anticuerpo anti-MAdCAM o parte de anticuerpo de la invenci6n o una composici6n que comprende dicho anticuerpo. Un kit puede incluir, ademas del anticuerpo o composici6n, agentes de diagn6stico o terapeuticos. Un kit tambien incluir instrucciones para su uso en un metodo de diagn6stico o terapeutico. En una realizaci6n preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composici6n que lo comprende y un agente de diagn6stico que puede usarse en un metodo descrito posteriormente. En otra realizaci6n preferida, el kit incluye el anticuerpo o una composici6n que lo comprende y uno o mas agentes terapeuticos que pueden usarse en un metodo descrito posteriormente.
Terapia Genica
Las moleculas de acido nucleico de la presente invenci6n pueden administrarse a un paciente que lo necesite mediante terapia genica. La terapia puede ser in vivo o e� vivo. En una realizaci6n preferida, se administran moleculas de acido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera a un paciente. En una realizaci6n mas preferida, las moleculas de acido nucleico se administran de modo que se integran de forma estable en los cromosomas de linfocitos B debido a que estas celulas estan especializadas para producir anticuerpos. En una realizaci6n preferida, los linfocitos B precursores se transfectan o infectan e� vivo y se vuelven a trasplantar a un paciente que lo necesite. En otra realizaci6n, los linfocitos B precursores u otras celulas se infectan in vivo usando un virus recombinante que se sabe que infecta el tipo celular de interes. Los vectores tfpicos usados para terapia genica incluyen liposomas, plasmidos y vectores virales. Los vectores virales ejemplares son retrovirus, adenovirus y
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virus adenoasociados. Despues de la infecci6n in vivo o e� vivo, los niveles de expresi6n de anticuerpo pueden controlarse tomando una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido de la tecnica o analizado en la presente memoria.
En una realizaci6n preferida, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y que expresa la molecula de acido nucleico. En otra realizaci6n, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y que expresa la molecula de acido nucleico. En un metodo mas preferido, el metodo de terapia genica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o la parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n y que expresa las moleculas de acido nucleico. El metodo de terapia genica tambien puede comprender la etapa de administrar otro agente antiinflamatorio o inmunomodulador.
Metodos Diagn6sticos de Uso
Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en una muestra biol6gica in vitro o in vivo. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitaci6n, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoqufmica de tejido, transferencia de Western o inmunoprecipitaci6n. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invenci6n pueden usarse para detectar MAdCAM de seres humanos. En otra realizaci6n, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM de primates del Viejo Mundo tales como cynomolgus y monos Rhesus, chimpances y simios. La invenci6n proporciona un metodo para detectar MAdCAM en una muestra biol6gica que comprende poner en contacto una muestra biol6gica con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invenci6n y detectar del anticuerpo unido a MAdCAM en el grado en que este esta abarcado por las reivindicaciones adjuntas. En una realizaci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM se derivatiza directamente con un marcador detectable. En otra realizaci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM (el primer anticuerpo) no esta marcado y un segundo anticuerpo u otra molecula que puede unirse con el anticuerpo anti-MAdCAM esta marcado. Como se conoce bien por un experto en la materia, se selecciona un segundo anticuerpo que es capaz de unirse especfficamente a la especie y clase especfficas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-MAdCAM es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser un anti-IgG humana. Otras moleculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, pero sin limitaci6n, protefna A, y protefna G, ambas de las cuales estan disponibles en el mercado, por ejemplo, de Pierce Chemical Co.
Se han descrito marcadores adecuados para el anticuerpo o secundario anteriormente e incluyen diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magneticos y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano rusticano, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescefna, isotiocianato de fluorescefna, rodamina, fluorescefna de diclorotriacinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnetico incluye gadolinio; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35So 3H.
En una realizaci6n alternativa, MAdCAM puede ensayarse en una muestra biol6gica por un inmunoensayo de competici6n utilizando patrones de MAdCAM marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-MAdCAM no marcado. En este ensayo, la muestra biol6gica, los patrones de MAdCAM marcados y anticuerpo anti-MAdCAM se combinan y la cantidad de patr6n de MAdCAM marcado unido al anticuerpo no marcado se determina. La cantidad de MAdCAM en la muestra biol6gica es inversamente proporcional a la cantidad de patr6n de MAdCAM marcado unido al anticuerpo anti-MAdCAM.
Se pueden usar los inmunoensayos descritos anteriormente para varios fines. En una realizaci6n, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en celulas en cultivo celular. En una realizaci6n preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para determinar el nivel de expresi6n de MAdCAM en superficie celular despues del tratamiento de las celulas con diversos compuestos. Este metodo puede usarse para ensayar compuestos que pueden usarse para activar o inhibir MAdCAM. En este metodo, se trata una muestra de celulas con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo mientras que otra muestra se deja sin tratar, la expresi6n en superficie celular podrfa despues determinarse por citometrfa de flujo, inmunohistoqufmica, transferencia de Western, ELISA o RIA. Ademas, los inmunoensayos pueden cambiarse de escala para exploraci6n de alto rendimiento para ensayar una gran variedad de compuestos con respecto a activaci6n o inhibici6n de MAdCAM.
Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invenci6n tambien pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM en un tejido o en celulas derivadas del tejido. En una realizaci6n preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una realizaci6n mas preferida el tejido es tracto gastrointestinal inflamado o una biopsia del mismo. En una realizaci6n preferida del metodo, un tejido o una biopsia del mismo se escinde de un paciente. El tejido o biopsia se usa despues en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, los niveles de MAdCAM, los niveles en superficie celular de MAdCAM o la localizaci6n de MAdCAM por los metodos analizados anteriormente. El metodo puede
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usarse para determinar si un tejido inflamado expresa MAdCAM a un alto nivel.
El metodo de diagn6stico anteriormente descrito puede usarse para determinar si un tejido expresa altos niveles de MAdCAM, lo que puede ser indicativo de que el tejido respondera bien al tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM. Ademas, el metodo de diagn6stico tambien puede usarse para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM (vease posteriormente) esta provocando que un tejido exprese niveles inferiores de MAdCAM y por lo tanto pueda usarse para determinar si el tratamiento es exitoso.
Los anticuerpos de la presente invenci6n pueden tambien usarse in vivo para localizar tejidos y 6rganos que expresan MAdCAM. En una realizaci6n preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para localizar tejido inflamado. La ventaja de los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente invenci6n es que no generaran una respuesta inmune tras su administraci6n. El metodo comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-MAdCAM o una composici6n farmaceutica del mismo a un paciente que necesite un ensayo de diagn6stico tal y someter al paciente a analisis de imagenes para determinar la localizaci6n de los tejidos que expresan MAdCAM. El analisis de imagenes se conoce bien en la tecnica medica e incluye, sin limitaci6n, analisis de rayos X, gammagraffa, imagen de resonancia magnetica (MRI), tomograffa de emisi6n de positrones o tomograffa computerizada (CT). En otra realizaci6n del metodo, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interes expresa MAdCAM en vez de someter al paciente a analisis de imagenes. En una realizaci6n preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden marcarse con un agente detectable que puede detectarse en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un agente de contraste, tal como bario, que puede usarse para analisis de rayos X o un agente de contraste magnetico, tal como un quelado de gadolinio, que puede usarse para MRI o CT. Otros agentes de marcaje incluyen, sin limitaci6n, radiois6topos tales como 99Tc. En otra realizaci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM no estara marcado y se detectara administrando un segundo anticuerpo u otra molecula que es detectable y que puede unirse al anticuerpo anti-MAdCAM.
Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invenci6n tambien pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM soluble presente en sangre, suero, plasma u otro biofluido del donante, incluyendo, pero sin limitaci6n, heces, orina, esputo o muestra de biopsia. En una realizaci6n preferida, el biofluido es plasma. El biofluido puede usarse despues en un inmunoensayo para determinar los niveles de MAdCAM soluble. MAdCAM soluble podrfa ser un marcador sustituto para inflamaci6n gastrointestinal en curso y el metodo de detecci6n podrfa usarse como un marcador de diagn6stico para medir la gravedad de la enfermedad.
El metodo de diagn6stico anteriormente descrito puede usarse para determinar si un individuo expresa altos niveles de MAdCAM soluble, que pueden ser indicativos de que el individuo respondera bien al tratamiento con un anticuerpo anti-MAdCAM. Ademas, el metodo de diagn6stico tambien puede usarse para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM (vease posteriormente) u otro agente farmaceutico de la enfermedad esta provocando que un individuo exprese niveles menores de MAdCAM y por lo tanto puede usarse para determinar si el tratamiento es exitoso.
Inhibici6n de adhesi6n dependiente de α4β7/MAdCAM por anticuerpo anti-MAdCAM
Se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que se une a MAdCAM e inhibe la uni6n y adhesi6n de celulas que portan integrina α4β7 a MAdCAM u otros ligandos afines, tales como L-selectina, a MAdCAM. En una descripci6n, la MAdCAM es humana y esta en forma soluble o se expresa en la superficie de una celula. En otra descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo inhibe la uni6n entre α4β7 y MAdCAM con un valor de CI50 de no mas de 50 nM. En una descripci6n, el valor de CI50 no es mayor de 5 nM. En una descripci6n, el valor de CI50 es menor de 5 nM. En una descripci6n, el valor de CI50 es menor de 0,05 μg/ml, 0,04 μg/ml o 0,03 μg/ml. En otra descripci6n, el valor de CI50 es menor de 0,5 μg/ml, 0,4 μg/ml o 0,3 μg/ml. El valor de CI50 puede medirse por cualquier metodo conocido en la tecnica. Tfpicamente, un valor de CI50 puede medirse por ELISA o ensayo de adhesi6n. En una descripci6n, el valor de CI50 se mide por ensayo de adhesi6n usando celulas o tejido que expresan de forma nativa MAdCAM o celulas o tejido que pueden modificarse por ingenierfa genetica para expresar MAdCAM.
Inhibici6n de reclutamiento de linfocitos a tejido linfoide asociado a intestino por anticuerpos anti-MAdCAM.
Se describe un anticuerpo anti-MAdCAM que se une a MAdCAM expresada de forma nativa e inhibe la uni6n de linfocitos a tejido linfoide gastrointestinal especializado. En una descripci6n, la MAdCAM expresada de forma nativa es MAdCAM humana o de primate y esta en una forma soluble o se expresa en la superficie de una celula. En otra descripci6n, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra descripci6n, el anticuerpo o parte del mismo inhibe el reclutamiento de linfocitos α4β7/ tr6ficos para intestino a tejidos que expresan MAdCAM con un valor de CI50 de no mas de 5 mg/kg. En una descripci6n, el valor de CI50 no es mayor de 1 mg/kg. En una descripci6n, el valor de CI50 es menor de 0,1 mg/kg. En una descripci6n, el valor de CI50 puede determinarse midiendo la relaci6n de efecto de dosis del reclutamiento de linfocitos de sangre periferica marcados con tecnecio al tracto gastrointestinal usando gammagraffa o tomograffa computerizada por emisi6n de fotones individuales. En otra descripci6n, el valor de CI50 puede determinarse midiendo el aumento en linfocitos α4β7/ tr6ficos para intestino, tales como, pero sin limitaci6n, linfocitos T de memoria CD4/ α4β7/, en la circulaci6n periferica usando citometrfa de flujo como una funci6n de la dosis de anticuerpo anti-MAdCAM.
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Para que la presente invenci6n pueda entenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para fines de ilustraci6n solamente y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invenci6n de ninguna manera.
Ejemplo 1: Generaci6n de hibridomas productores de anti-MAdCAM Los anticuerpos de la invenci6n se prepararon, ensayaron y seleccionaron de acuerdo con el presente Ejemplo Preparaci6n de Inmun6geno Primario: Se prepararon dos inmun6genos para inmunizaci6n de los ratones XenoMouse™: (i) una protefna de fusi6n
MAdCAM-IgG1 Fc y (ii) membranas celulares preparadas a partir de celulas transfectadas de forma estable con MAdCAM.
(i) Protefna de Fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc
Construcci6n del vector de expresi6n:
Se escindi6 un fragmento de ADNc EcoRI/BgIII que codificaba el dominio de tipo inmunoglobulina extracelular maduro de MAdCAM de un clon pINCY Incyte (3279276) y se clon6 en los sitios EcoRI/BamHI del vector pIG1 (Simmons, D. L. (1993) en Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pag 93-127) para generar una fusi6n en fase IgG1 Fc. El inserto resultante se escindi6 con EcoRI/NotI y se clon6 en pCDNA3.1/ (Invitrogen). Se confirm6 la secuencia del ADNc de MAdCAM-IgG1 Fc en el vector. La secuencia de aminoacidos de la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc se muestra a continuaci6n:
Protefna de Fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc:
Subrayado: peptido sefal
Negrita: dominio extracelular de MAdCAM
Expresi6n/Purificaci6n de Protefna Recombinante:
Se transfectaron celulas CHO-DGFR con vector pCDNA3.1/ que contenfa ADNc de la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc y clones estables que expresaban la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc seleccionados en medio de Iscove que contenfa G418 600 μg/ml y metotrexato 100 ng/ml. Para la expresi6n proteica, se sembraron en un biorreactor de fibra hueca celulas CHO que expresaban de forma estable MAdCAM-IgG1 Fc en medio de Iscove que contenfa suero bovino fetal de IgG bajo 10 % (Gibco), aminoacidos no esenciales (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato s6dico (Gibco), G418 100 μg/ml y metotrexato 100 ng/ml y se usaron para generar sobrenadantes de medios concentrados. La protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc se purific6 a partir del sobrenadante recolectado por cromatograffa de afinidad. Brevemente, se aplic6 el sobrenadante a una columna de Sepharose de protefna G HiTrap (5 ml, Pharmacia) (2 ml/min), se lav6 con Tris 25 mM pH 8, NaCl 150 mM (5 volumenes de columna) y se eluy6 con glicina 100 mM pH 2,5 (1 ml/min), neutralizando inmediatamente las fracciones a pH 7,5 con Tris 1 M pH
8. Las fracciones que contenfan protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc se identificaron por SDS-PAGE, se agruparon juntas y se aplicaron a una columna de Sephacryl S100 (Pharmacia), preequilibrada con Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM. La filtraci6n en gel se realiz6 a 0,35 ml/min, recogiendo un pico de protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc en fracciones de aproximadamente 3 x 5 ml. Estas muestras se agruparon y se aplicaron a una columna de Resource Q (6 ml, Pharmacia), preequilibrada en Bis Tris 35 mM pH 6,5. La columna se lav6 con 5 volumenes de columna de Bis Tris 35 mM pH 6,5, NaCl 150 mM (6 ml/min) y se eluy6 la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc en
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una fracci6n de 4-6 ml con Bis Tris 35 mM pH 6,5 NaCl 400 mM. En esta etapa la protefna era 90 % pura y migr6 como una banda sencilla a aproximadamente 68 kD por SDS-PAGE. Para su uso como un inmun6geno y todos los ensayos posteriores, se intercambi6 el tamp6n del material a HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1mM, NaCl 100 mM, glicerol 50 % y se almacen6 como alfcuotas a -80 °C.
(ii) Membranas celulares que expresan de forma estable MAdCAM
Se amplific6 por PCR un fragmento de SacI/NotI que comprendfa los nucle6tidos 645-1222 de la secuencia de MAdCAM publicada (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)) de una biblioteca de ADNc de colon y se clon6 en sitios SacI/NotI del vector pIND-Hygro (Invitrogen). Se subclon6 un fragmento de SacI, que comprendfa la secuencia codificante 5' adicional en esta construcci6n de pCDNA3.1 MAdCAM-IgG1 Fc, para generar el ADNc de MAdCAM de longitud completa. Se clon6 despues un fragmento de KpnI/NotI que contenfa el ADNc de MAdCAM en los sitios correspondientes en un vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) y se reemplaz6 la secuencia codificante de CAT. Se verific6 la secuencia del inserto de ADNc y se us6 en transfecciones para generar clones sencillos que se expresan de forma estable en celulas Flpln NIH 3T3 (Invitrogen) por tecnologfa Flp recombinasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron clones que se expresaban de forma estable por su capacidad para soportar la uni6n de una lfnea de celulas linfoblastoides B humanas α4β7/ JY (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)), descrita posteriormente. Se prepararon clones estables de celulas CHO que expresaban MAdCAM de la misma manera, usando celulas FlpIn CHO (Invitrogen).
Se cultivaron celulas Flpln NIH-3T3 que expresaban MAdCAM en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco), que contenfa L-glutamina 2 mM, suero de ternero donante 10 % (Gibco) e Higromicina B 200μg/ml (Invitrogen) y se expandieron en frascos rotatorios. Las celulas Flpln CHO que expresaban MAdCAM se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 de Ham (Gibco), que contenfa L-glutamina 2 mM, suero de ternero donante 10 % (Gibco) e Higromicina B 350 μg/ml (Invitrogen) y se expandieron en frascos rotatorios. Las celulas se recolectaron mediante el uso de una soluci6n de disociaci6n celular no enzimatica (Sigma) y raspado, lavando en soluci6n salina tamponada con fosfato por centrifugaci6n. Las membranas celulares se prepararon a partir del sedimento celular por dos ciclos de homogeneizaci6n de politron en Bis Tris 25 mM pH 8, MgCl2 10 mM, aprotinina 0,015 % (p/v), bacitracina 100 U/ml y centrifugaci6n. El sedimento final se resuspendi6 en el mismo tamp6n y se separaron en alfcuotas 50 x 106 equivalentes celulares en eppendorfs de pared gruesa y se centrifugaron a mas de 100.000 g para generar sedimentos de membrana celular para inmunizaciones de ratones XenoMouse. Se decant6 el sobrenadante y se almacenaron las membranas en eppendorfs a -80 °C hasta que se necesitaran. Se determin6 la confirmaci6n de expresi6n de protefnas en las membranas celulares por SDS-PAGE y transferencia de Western con un anticuerpo anti-peptido de conejo inducido contra los restos N-terminales de MAdCAM ([C]-KPLQVEPPEP).
Inmunizaci6n y generaci6n de hibridoma:
Se inmunizaron ratones XENOMOUSE™ de ocho a diez semanas de edad por vfa intraperitoneal o en sus almohadillas plantares traseras con la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc recombinante purificada (10 μg/dosis/rat6n) o membranas celulares preparadas a partir de celulas NIH 3T3 o CHO que expresan de forma estable MAdCAM (10 x 106 celulas/dosis/rat6n). Esta dosis se repiti6 de cinco a siete veces durante un periodo de tres a ocho semanas. Cuatro dfas antes de la fusi6n, los ratones recibieron una inyecci6n final del dominio extracelular de MAdCAM humana en PBS. Se fusionaron linfocitos de ganglio linfatico y bazo de ratones inmunizados con la lfnea celular de mieloma no secretor P3-X63-Ag8.653 y se sometieron a selecci6n de HAT como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)). Se recuper6 y subclon6 un panel de hibridomas que secretaban anticuerpos IgG2κ e IgG4κ humanos especfficos de MAdCAM. Se recuperaron doce subclones de hibridoma, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2., 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, que producfan anticuerpos monoclonales especfficos para MAdCAM y se detectaron con ensayos descritos posteriormente. Las lfneas parentales 1.7,1.8,6.14, 6.22,6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 y 9.8, de las que derivaron las lfneas de hibridoma subclonadas, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, tenfan todas actividad anti-MAdCAM.
Ensayos de ELISA:
La detecci6n de anticuerpos especfficos de antfgeno en suero de rat6n y sobrenadante de hibridoma se determin6 por ELISA como se ha descrito (Coligan et al., unidad 2.1 �Enzyme-linked immunosorbent assays,� in Current ProtocolsIinImmunology (1994)) usando protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc para capturar los anticuerpos. Para animales que se inmunizaron con protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc, se exploraron los anticuerpos con respecto a reactividad no especffica frente a IgG1 humana y con respecto a la capacidad para unirse a celulas de MAdCAM Flpln CHO por citometrfa de flujo.
En un ensayo ELISA preferido, se usan las siguientes tecnicas:
Se recubrieron placas de ELISA durante una noche a 4 °C con 100 μl/pocillo de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc (4,5 μg/ml) en placa que contenfa tamp6n (tamp6n de bicarbonato/carbonato s6dico 100 mM pH 9,6). Despues de la incubaci6n, se retir6 el tamp6n de recubrimiento y la placa se bloque6 con tamp6n de bloqueo 200 μl/pocillo (BSA 5 %, Tween 20 0,1, en soluci6n salina tamponada con fosfato) y se incub6 a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retir6 el
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tamp6n de bloqueo y se afadieron 50 μl/pocillo de sobrenadante de hibridoma u otro suero o sobrenadante (por ejemplo, control positivo) durante 2 horas a temperatura ambiente. Despues de la incubaci6n la placa se lav6 con PBS (3 x 100 μl/pocillo) y se detect6 la uni6n del mAb de hibridoma con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (es decir IgG2-HRP anti ser humano de rat6n 1:1000 (SB cat. n° 9060-05) para anticuerpos IgG2 o IgG4-HRP anti ser humano de rat6n 1:1000 (Zymed cat. n° 3840) para anticuerpos IgG4) diluidos en PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron en PBS (3 x 100 μl/pocillo) y se desarrollaron finalmente con 100 μl de OPD (o-fenilendiamina (DAKO S2405) / 5 μl de H2O2 30 %/12 ml). Se permiti6 que las placas se desarrollaran durante 10-20 minutos, deteniendo la reacci6n con 100 μl de H2SO4 2 M. Las placas se leyeron a 490 nm.
Ensayos de adhesi6n
Los anticuerpos que demostraron uni6n a protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc por ELISA, se evaluaron con respecto a actividad antagonista en ensayos de adhesi6n con celulas α4β7/ JY y (i) protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc o (ii) celulas MAdCAM-CHO.
(i) Ensayo de fusi6n de MAdCAM-IgG1
Se adsorbieron 100 μl de una soluci6n de protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc purificada 4,5 μg/ml en PBS de Dulbecco a placas de fondo en u Microfluor "B" negras de 96 pocillos (Dynex n° 7805) durante una noche a 4 °C. Las placas recubiertas con MAdCAM se invirtieron despues y se separ6 por transferencia el exceso de lfquido, antes de bloquear a 37 °C durante al menos 1 hora en PBS/BSA 10 %. Durante este tiempo las celulas JY cultivadas se contaron usando exclusi6n de azul de tripano (deberfan ser aproximadamente 8 x 105 celulas/ml) y se pipetearon 20 x 106 celulas/placa de ensayo en un tubo de centrffuga de 50 ml. Se cultivaron celulas JY en medio RPMI1640 (Gibco), que contenfa L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal inactivado por calor 10 % (Life Technologies n° 10108165) y se sembraron a 1-2 x 105 /ml cada 2-3 dfas para evitar que se diferenciara el cultivo. Las celulas se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 (Gibco) que contenfa L-glutamina 2 mM (Gibco) por centrifugaci6n (240g), resuspendiendo el sedimento celular final a 2 x 106 celulas/ml en RPMI 1640 para carga de calcefna AM. Se afadi6 Calcefna AM (Molecular Probes n° C-3099) a las celulas como una diluci6n 1:200 en DMSO (concentraci6n final de aproximadamente 5 μM) y las celulas se protegieron de la luz durante el transcurso de la incubaci6n (37 °C durante 30 minutos). Durante esta etapa de incubaci6n de las celulas los anticuerpos a ensayar se diluyeron como sigue: para ensayo de dosis sencilla, los anticuerpos se compusieron hasta 3 μg/ml (1 μg/ml, final) en BSA 0,1 mg/ml (Sigma n° A3059) en PBS; para curvas completas de CI50, los anticuerpos se diluyeron en BSA/PBS 0,1 mg/ml, siendo 3 μg/ml (1 μg/ml final) la concentraci6n maxima, doblando despues las diluciones (relaci6n 1:2) en toda la placa. El pocillo final de la fila se us6 para determinar la uni6n total, de modo que se us6 BSA en PBS 0,1 mg/ml.
Despues de bloquear, los contenidos de la placa se retiraron y se afadieron 50 μl de anticuerpos/controles a cada pocillo y la placa se incub6 a 37 °C durante 20 minutos. Durante este tiempo, las celulas JY cargadas con calcefna se lavaron una vez con medio RPMI 1640 que contenfa suero bovino fetal al 10 % y una vez con BSA/PBS 1 mg/ml por centrifugaci6n, resuspendiendo el sedimento celular final a 1 x 106 ml en BSA/PBS 1 mg/ml. Se afadieron 100 μl de celulas a cada pocillo de la placa de fondo en U, se sell6 la placa, se centrifug6 brevemente (1000 rpm durante 2 minutos) y la placa se incub6 despues a 37 °C durante 45 minutos. Al final deeste periodo, las placas se lavaron con un lavador de placa Skatron y se midi6 la fluorescencia usando un Lector Multimarcador Wallac Victor2 1420 (conteo desde la parte superior a λ de excitaci6n 485 nm, λ de emisi6n 535 nm, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisi6n normal). Para cada concentraci6n de anticuerpos, se expres6 la adhesi6n porcentual como un porcentaje de respuesta de fluorescencia maxima en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con la uni6n no especffica. El valor de CI50 se define como la concentraci6n de anticuerpo anti-MAdCAM a la que la respuesta de adhesi6n se reduce a 50 % de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Se consider6 que los anticuerpos que fueron capaces de inhibir la uni6n de celulas JY a fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc con un valor de CI50 < 0,1 μg/ml, tenfan actividad antagonista potente y se llevaron al ensayo de adhesi6n de MAdCAM-CHO. Los doce AB ensayados mostraron potente actividad antagonista (Tabla 3). Los anticuerpos monoclonales 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 y 7.26.4 derivaron de linajes IgG2κ y los anticuerpos monoclonales 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 y 9.8.2 derivaron de linajes IgG4κ.
(ii) Ensayo de adhesi6n de celulas MAdCAM-CHO.
Las celulas JY se cultivaron como anteriormente. Se generaron celulas CHO que expresaban MAdCAM con la construcci6n de ADNc de MAdCAM pEF5FRT y usando la tecnologfa de Flp recombinasa (Invitrogen) como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron clones estables sencillos de celulas CHO que expresaban MAdCAM basandose en su capacidad para soportar la adhesi6n de celulas JY y la uni6n, por citometrfa de flujo, del anticuerpo de conejo anti-peptido, inducido contra el extremo N-terminal de MAdCAM y descrito anteriormente. Las celulas CHO que expresaban MAdCAM se cultivaron en un medio DMEM/F12 (Gibco n° 21331-020) que contenfa Lglutamina 2 mM, suero bovino fetal 10 % (Gibco) e Higromicina B 350 μg/ml (Invitrogen), dividiendo 1:5 cada 2/3 dfas. Para el ensayo de adhesi6n, se sembraron celulas CHO que expresaban MAdCAM a 4 x 104 celulas/pocillo en placas negras de 96 pocillos-fondo claro (Costar n° 3904) en 200 μl de medio de cultivo y se cultivaron durante una noche a 37 °C/CO2 5 %.
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El dfa siguiente, se diluy6 el sobrenadante de hibridoma o anticuerpo monoclonal purificado a partir de una concentraci6n de partida de 30 μg/ml (equivalente a una concentraci6n final de 10 μg/ml) en BSA/PBS 1 mg/ml, como se ha descrito anteriormente. Para las placas de MAdCAM CHO, los contenidos de la placa se retiraron y se afadieron 50 μl de anticuerpos/controles a cada pocillo y la placa se incub6 a 37 °C durante 20 minutos. El pocillo 5 final de la fila se us6 para determinar la uni6n total, de modo que se us6 BSA 0,1 mg/ml en PBS. Se prepararon celulas JY cargadas con calcefna AM a una concentraci6n final de 1 x 106/ml en BSA/PBS 1 mg/ml como anteriormente, despues se afadieron 100 μl a la placa despues del periodo de incubaci6n de 20 minutos con el anticuerpo. La placa se incub6 despues a 37 °C durante 45 minutos, despues se lav6 en un lavador de placa Tecan (PW 384) y se midi6 la fluorescencia usando el lector de placa Wallac como se ha descrito anteriormente. Para cada 10 concentraci6n de anticuerpo, se expres6 el porcentaje de adhesi6n como un porcentaje de respuesta de fluorescencia maxima en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con uni6n no especffica. Se consider6 que los anticuerpos que fueron capaces de inhibir la uni6n de celulas JY a celulas MAdCAM CHO con un valor de CI50 < 1 μg/ml tenfan actividad antagonista potente. Como antes, el valor de CI50 se define como la concentraci6n de anticuerpo anti-MAdCAM a la que la respuesta de adhesi6n se ha reducido a 50 % de la respuesta
15 en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Las potencias de CI50 para 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 en el presente ensayo se describen a continuaci6n en la Tabla 3.
Tabla 3. Valores de CI50 de anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados
CI50 Media (μg/ml) de fusi6n MAdCAM IgG 1 Fc
n
0,030 ± 0,011
0,502 ± 0,280 9
0,027 ± 0,011
0,424 ± 0,107 8
0,019 ± 0,009
0,389 ± 0,093 16
0,025 ± 0,027
0,387 ± 0,202 9
0,021 ± 0,040
0,574 ± 0,099 15
6.14.2
0,011 ± 0,005 0,291 ± 0,096 6
6.22.2
0,018 ± 0,011 0,573 ± 0,168 7
6.34.2
0,013 ± 0,008 0,285 ± 0,073 7
6.67.1
0,013 ± 0,070 0,298 ± 0,115 8
6.73.2
0,020 ± 0,010 0,369 ± 0,103 8
6.77.1
0,022 ± 0,004 0,520 ± 0,100 4
9.8.2
8
IgG2
IgG4
Para medir la potencia antagonista de mAb anti-MAdCAM en ensayos basados en flujo en condiciones de tensi6n de
20 cizallamiento que se disefan para imitar el ambiente microvascular en las venulas endoteliales altas que sirven al tejido linfoide asociado a intestino, se sembraron celulas CHO que expresaban MAdCAM en microportaobjetos de vidrio (50 x 4 mm) y se permiti6 que se adhirieran hasta formar una monocapa confluyente (aproximadamente 2,5 x 105 celulas). Las celulas se incubaron despues con mAb purificado para afinidad sobre un intervalo de concentraciones (0,1-10 μg/ml) durante 20 minutos a 37 °C, antes de conectarse al sistema de ensayo de flujo. Se
25 us6 un mAb IgG2 o IgG4 de isotipo coincidente (10 μg/ml) como un control negativo. Se perfundieron linfocitos de sangre periferica de donante normal (PBL) sobre la monocapa celular a una tensi6n de cizallamiento constante de 0,05 Pa. Los experimentos se filmaron y se calcul6 la adhesi6n total de linfocitos (rodantes / adhesi6n firme). Se mostr6 que todos los anticuerpos monoclonales ensayados eran antagonistas potentes en las condiciones descritas.
(iii) Ensayos de Stamper-Woodruff
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Para visualizar vasos MAdCAM/, se gener6 mAb anti-MAdCAM biotinilado en 1-2 mg de protefna purificada para afinidad, usando un exceso 20 molar de biotina-NHS (Pierce) en soluci6n salina tamponada con fosfato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se permiti6 que la reacci6n se asentara a temperatura ambiente (30 minutos) y se desalara con una columna de PD-10 (Pharmacia) y la concentraci6n de protefna determinada.
Se retir6 el ganglio linfatico de hfgado normal de un 6rgano de donante, se congel6 rapidamente en nitr6geno lfquido y se almacen6 a -70 °C hasta su uso. Se cortaron secciones de cryostat de 10 μm, se secaron al aire en portaobjetos recubiertos de poli-L lisina y se fijaron en acetona antes del ensayo. Las secciones se bloquearon usando un sistema de bloqueo de avidina-biotina (DAKO) y despues se incubaron con mAb anti-MAdCAM biotinilado sobre un intervalo de concentraciones (1-50 μg/ml) a temperatura ambiente (2 horas). Se us6 un mAb IgG2 o IgG4 de isotipo coincidente (50 μg/ml) como un control negativo y un anticuerpo anti-β7 de bloqueo (50 μg/ml) como un control positivo.
Se marcaron linfocitos de sangre periferica, tomados de donantes normales, con un mAb anti CD2 humano de rat6n (DAKO) para permitir la visualizaci6n posterior de celulas adherentes. Se afadieron 5 x105 PBL a cada secci6n de ganglio linfatico y se incubaron durante 30 minutos antes de aclararse suavemente para evitar la separaci6n de celulas adherentes. Las secciones se volvieron a fijar despues en acetona y se volvieron a incubar con mAb anti-MAdCAM biotinilado (10 μg/ml), seguido de mAb anti rat6n de cabra biotinilado (para reconocer PBL marcadas con CD2 y vasos MAdCAM/ no tefidos) y despues complejo streptAB/HRP (DAKO). Finalmente se visualizaron vasos MAdCAM/ y PBL marcadas con CD2 por adici6n de sustrato DAB (DAKO) a las secciones, mostrando un producto de reacci6n marr6n areas de tinci6n positiva. La adhesi6n de linfocitos se cuantific6 contando el numero de linfocitos que se adhieren a 50 vasos MAdCAM-1/ de tractos portales, venas o sinusoides. Los datos, expresados como valores medios se normalizaron despues a porcentaje de adhesi6n, usando la adhesi6n de PBL en ausencia de cualquier anticuerpo tomado como 100 %. Los datos se compilaron basandose en n=3 donantes de PBL diferentes y para diferentes donantes de ganglio linfatico de hfgado. Se presentan datos representativos para anticuerpos monoclonales purificados biotinilados 1.7.2 y 7.16.6 en la Figura 4 en comparaci6n con un control de anticuerpo antiβ7 de bloqueo.
Ensayos de selectividad:
VCAM y fibronectina son hom6logos cercanos de secuencia y estructurales de MAdCAM. Se evaluaron mAb anti-MAdCAM purificados por afinidad con respecto a especificidad de MAdCAM determinando su capacidad para bloquear la uni6n de linfocitos T Jurkat α4β1//α5β1/ (ATCC) a su molecula de adhesi6n celular affn. Se adsorbieron 100 μl de una soluci6n de 4,5 μg/ml de fragmento de uni6n a celulas de Fibronectina (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Cat. N° UBF4215-18) o VCAM (Panvera) en PBS de Dulbecco a placas de fondo en u Microfluor &quot;B&quot; Negras de 96 pocillos (Dynex n° 7805) durante una noche a 4 °C. Las placas recubiertas se invirtieron despues y se retir6 por transferencia el exceso de lfquido, antes de bloquear a 37 °C durante al menos 1 hora en BSA/PBS 10 %. Durante este tiempo los linfocitos T Jurkat cultivados se contaron usando exclusi6n de azul de tripano y se cargaron con colorante calcefna AM como se ha descrito previamente para celulas JY anteriormente. Los anticuerpos a ensayar, se diluyeron a partir de una concentraci6n superior de 10 μg/ml en BSA 0,1 mg/ml en PBS. El pocillo final de la fila se us6 para determinar la uni6n total, de modo que se us6 BSA en PBS 0,1 mg/ml. Se us6 equistatina (Bachem, Cat. n° H-9010) preparada en PBS a una concentraci6n superior de 100 nM para bloquear la interacci6n α5β1/Fibronectina. Se us6 un anticuerpo anti-CD106 (Clon 51-10C9, BD Pharmingen Cat. n° 555645) a una concentraci6n superior de 1 μg/ml para bloquear la interacci6n α4β1/VCAM.
Despues de bloquear, los contenidos de la placa se retiraron y se afadieron 50 μl de anticuerpos/controles a cada pocillo y se incub6 la placa a 37 °C durante 20 minutos. Los linfocitos T Jurkat cargados con calcefna se lavaron una vez como anteriormente, resuspendiendo el sedimento celular final a 1 x 106/ml en BSA/PBS 1 mg/ml. Se afadieron 100 μl de celulas a cada pocillo de la placa de fondo en U, se sell6 la placa, se centrifug6 brevemente (1000 rpm durante 2 minutos) y la placa se incub6 despues a 37 °C durante 45 minutos. Al final de este periodo, las placas se lavaron con un lavador de placa Skatron y se midi6 la fluorescencia usando un lector de multiplaca Wallac Victor2 1420 (conteo desde la parte superior λ de excitaci6n 485 nm, λ de emisi6n 535 nm, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisi6n normal). Para cada anticuerpo, el grado de inhibici6n se expresa a continuaci6n graficamente, en la Tabla 4 (-inhibici6n insignificante de adhesi6n, *** inhibici6n completa de adhesi6n). Todos los mAb ejemplificados son antagonistas anti-MAdCAM potentes y selectivos, que demuestran selectividad sustancialmente mayor de 100 veces para MAdCAM frente a VCAM y fibronectina.
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Tabla 4. Selectividad comparativa de anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM sobre otras moleculas de adhesi6n celular, Fibronectina y VCAM.
Clon
Inhibici6n en ensayo de α5β1/Fibronectina (10 μg/ml) Inhibici6n en ensayo de α4β1/VCAM (10 μg/ml) Inhibici6n en ensayo de α4β7/MAdCAM (0,1 μg/ml)
1.7.2
- - ***
1.8.2
- - ***
7.16.6
- - ***
7.20.5
- - ***
7.26.4
- - ***
6.14.2
- - ***
6.22.2
- - ***
6.34.2
- - ***
6.67.1
- - ***
6.73.2
- - ***
6.77.1
- - ***
9.8.2
- - ***
IgG2
IgG4
Los hibridomas se depositaron en la Colecci6n Europea de Cultivos Celulares (ECACC), H.P.A en CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG el 9 de septiembre de 2003 con los siguientes numeros de dep6sito:
Hibridoma N° de Dep6sito
1.7.2 03090901
1.8.2 03090902
6.14.2 03090903
6.22.2 03090904
6.34.2 03090905
6.67.1 03090906
6.73.2 03090907
6.77.1
03090908
7.16.6
03090909
7.20.5 03090910
7.26.4 03090911
9.8.2 03090912
Ejemplo II:
Determinaci6n de Constantes de Afinidad (Kd) de Anticuerpos Monoclonales Anti-MAdCAM Completamente Humanos por BIAcore
Los inventores realizaron medidas de afinidad de anticuerpos purificados por resonancia de plasm6n superficial
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usando el instrumento BIAcore 3000, siguiendo los protocolos del fabricante.
Protocolo 1
Para realizar analisis cineticos, se prepar6 una superficie de anticuerpo anti humano (IgG2 e IgG4) de rat6n de alta densidad sobre una microplaca sensora de BIAcore CM5 usando un acoplamiento de amina rutinario. Se diluyeron 5 los sobrenadantes de hibridoma 10, 5, 2 veces en tamp6n de ejecuci6n HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 0,005 %) que contenfa BSA 100 μg/ml y carboximetildextrano 10 μg/ml o se usaron puros. Cada mAb se captur6 en una superficie separada usando un tiempo de contacto de 1 minuto y un lavado de 5 minutos para estabilizaci6n de la cantidad inicial de mAb. Se inyect6 despues protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc (141 nM) sobre todas las superficies durante 1 minuto, seguido de una disociaci6n de 3 minutos. Los datos se
10 normalizaron para la cantidad de anticuerpo capturado en cada superficie y se evaluaron con ajuste global de Langmuir 1:1, usando modelos de deriva de medida inicial disponibles en el software BIAevaluation proporcionado por BIAcore.
Protocolo 2
Se inmovilizaron mAb purificados para afinidad sobre la capa de dextrano de una microplaca biosensora CM5
15 usando acoplamiento de amina. Se prepararon las microplacas usando tamp6n acetato pH 4,5 como el tamp6n de inmovilizaci6n y se consiguieron densidades proteicas de 2,5-5,5 kRU. Se prepararon muestras de protefna de fusi6n de MAdCAM-IgG1 Fc en tamp6n de ejecuci6n a concentraciones que variaban de 0,2 a 55 nM (se incluy6 una soluci6n de 0 nM que comprendfa solamente tamp6n de ejecuci6n como una referencia cero). Las muestras se seleccionaron aleatoriamente y se inyectaron por duplicado durante 3 minutos cada una a traves de 4 celdas de flujo
20 usando HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) como tamp6n de ejecuci6n. Se us6 un caudal de 100 μl/minuto para minimizar las limitaciones de transporte de masa. Se control6 la disociaci6n de protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc durante 180 minutos, se regener6 la superficie por una inyecci6n de 6 segundos de H3PO4 25 mM (50 μl/minuto) o 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) a 25 mM (6.34.2) y NaOH 45 mM (6.14.2) y se analizaron los datos usando el paquete desoftware BIAevaluation (versi6n 3.1).
25 La Tabla 5 enumera mediciones de afinidad para anticuerpos anti-MAdCAM representativos de la presente invenci6n:
Tabla 5. Determinaci6n de la constante de afinidad, Kd, por resonancia de plasm6n superficial (BIAcore)
Protocolo 1 Protocolo 2
CLON
kon (I/Ms) koff (l/s) KD (pM) kon (I/MS) koff(l/s) KD (pM)
1.7.2
2,4 x105 1 x 10-5 42 5,5 x 103 1,3 x 10-7 23,6
1.8.2
2,9 x 105 1 x 10-5 35 1,8 x 105 2,3 x 10-5 128
7.16.6
1,5 x106 2,2 x 10-6 1,5 2,9 x105 1,4 X10-6 4,8
7.20.5
4,5 x 105 1,9 x 10-5 42,2 1,6 x105 1,2 x10-5 75
7.26.4
9,6 x 105 2,6 x 10-4 271 1,5 x 105 1,2 x10-5 80
1,3 x 105
1 x 10-5 7,7 5 x 105 < 5x10-6 < 10
6.14.2
1,5 x 106
1,4 x 10-5 9,3 2,3 x 105 8,7 x10-7 3,8
6.22.2
1,2 x 106 1,4 x 105
1,9x 10-5 1,3 x 10-4 15,8 93 3,3 x105 < 5 x 10-6 <15 <20
6.34.2
6.67.1
6.73.2
1,5 x 105 2,3 x 106
1 x 10-5 2,3 x 10-4 6,7 100 4,4 x105 1,4 x10-5 32,5
6.77.1
9.8.2
IgG2 IgG4
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fuertes constantes de uni6n para el dominio extracelular de MAdCAM.
Ejemplo III:
Identificaci6n de selectividad de epftopo y reactividad cruzada de especies de los mAb anti-MAdCAM
Los anticuerpos reconocen epftopos expuestos en superficie en antfgenos como regiones de secuencia lineal (primaria) o secuencia estructural (secundaria). Se usaron agrupaci6n de epftopos Luminex, agrupaci6n de BIAcore y analisis inmunohistoqufmico de especies en sintonfa, para definir el paisaje de epftopo funcional de los anticuerpos anti-MAdCAM.
Agrupaci6n de Epftopos basado en Luminex:
Se acoplaron perlas conjugadas con MxhlgG 2,3.4 (Calbiochem M1 1427) al anticuerpo anti-MAdCAM desconocido primario. Los inventores afadieron 150 μl de diluci6n de anticuerpo desconocido primario (0,1 μg/ml diluidos en medio de hibridoma) al pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. La reserva de perlas se agit6 por v6rtex suavemente y se diluy6 en sobrenadante hasta una concentraci6n de 0,5 105 perlas/ml. Las perlas se incubaron en el sobrenadante en un agitador durante una noche en oscuridad a 4 °C.
Cada pocillo de una placa de filtro de microtitulaci6n de 96 pocillos (Millipore n° MABVN1250) se pre humect6 afadiendo 200 μl de tamp6n de lavado (PBS que contenfa Tween 20 0,05 %) y se retir6 por aspiraci6n. A continuaci6n, se afadieron 50 μl/pocillo de la reserva de 0,5 x 105 perlas/ml a la placa de filtro y se lavaron los pocillos con tamp6n de lavado (2 x 100 μl/pocillo). Se afadieron 60 μl/pocillo de antfgeno de MAdCAM-IgG1 Fc diluido en medio de hibridoma (0,1 μg/ml). Las placas se cubrieron y se incubaron a temperatura ambiente con agitaci6n suave durante una hora. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adici6n de tamp6n de lavado 100 μl/pocillo seguido de aspiraci6n. A continuaci6n, los inventores afadieron 60 μl/pocillo de anticuerpo anti-MAdCAM desconocido secundario diluido en medio de hibridoma (0,1 μg/ml). Las placas se agitaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas. A continuaci6n, los pocillos se lavaron dos veces por adici6n de tamp6n de lavado 100 μl/pocillo seguido de aspiraci6n. A continuaci6n, se afadieron 60 μl/pocillo de MxhIgG 2,3,4 (0.5 μg/ml) biotinilado. Las placas se agitaron a temperatura ambiente en oscuridad durante una hora. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adici6n de tamp6n de lavado 100 μl/pocillo seguido de aspiraci6n. A cada pocillo, se afadieron 60 μl de MxhIgG 2,3,4 Estreptavidina-PE (Pharmacia n° 554061) 1 μg/ml diluido en medio de hibridoma. Las placas se agitaron a temperatura ambiente en oscuridad durante veinte minutos. Los pocillos se lavaron dos veces mediante adici6n de tamp6n de lavado 100 μl/pocillo seguido de aspiraci6n. A continuaci6n, cada pocillo se resuspendi6 en 80 μl de tamp6n de bloqueo (PBS con albumina de suero bovino 0,5 %, TWEEN 0,1 % y Timerosal 0,01 %) pipeteado arriba y abajo con cuidado para resuspender las perlas.
Usando Luminex 100 y su software adjunto (Luminex® Corporation) las placas se leyeron para determinar lecturas de luminiscencia. Basandose en los datos de luminiscencia obtenidos para los diversos anticuerpos anti-MAdCAM ensayados, los anticuerpos anti-MAdCAM se agruparon de acuerdo con sus especificidades de uni6n. Los anticuerpos anti-MAdCAM que se ensayaron quedan en una serie de grupos de epftopos, representados en la Tabla
8.
Agrupaci6n de BIAcore:
En un metodo similar al descrito anteriormente, tambien puede usarse BIAcore para determinar la exclusividad de epftopos de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados por la presente invenci6n. Se inmovilizaron nueve clones de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6 sobre la capa de dextrano de celdas de flujo separadas de una microplaca biosensora CM5 usando acoplamiento de amina. El tamp6n de inmovilizaci6n fue tamp6n acetato 10 mM pH 4,5 (clones 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6) o tamp6n de acetato 10 mM pH 5,5 (clones 6.67.1 y 6.77.1). Se consigui6 una densidad proteica de aproximadamente 3750 RU en todos los casos. La desactivaci6n de esteres de N-hidroxisuccinimida no reaccionados se realiz6 usando clorhidrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. Se diluy6 protefna de fusi6n [0230] MAdCAM-IgG1 Fc a una concentraci6n de 1,5 μg/ml (aproximadamente 25 nM) en tamp6n de ejecuci6n HBS-EP (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, polisorbato 20 0,005 %). Se inyect6 despues a traves de una primera celda de flujo en un volumen de 50 μl a una velocidad de 5 μl/minuto. Despues de completarse la inyecci6n, se afadi6 la primera sonda de anticuerpo a la misma celda de flujo. Todos los anticuerpos de ensayo se diluyeron a una concentraci6n de aproximadamente 20 μg/ml en HBS-EP y tambien se inyectaron en un volumen de 50 μl a un caudal de 5 μl/minuto. Cuando no se observ6 uni6n del anticuerpo de ensayo, se inyect6 el siguiente clon de ensayo inmediatamente despues. Cuando se produjo uni6n, la superficie sensora se regener6 para retirar tanto la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc como el anticuerpo de ensayo. Se us6 una diversidad de soluciones de regeneraci6n dependiendo del anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo de ensayo presente. Se representa un compendio de las condiciones de regeneraci6n usadas en la Tabla 6.
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Tabla 6. Compendio de condiciones de regeneraci6n usadas para realizar mapeo de epftopos por BIAcore
Anticuerpo inmovilizado
Sonda de anticuerpo a retirar Soluci6n de regeneraci6n Volumen de inyecci6n
7.16.6
6.22.2 Acido Fosf6rico 40 mM 20 μl
6.34.2
Acido Fosf6rico 40 mM 40 μl
7.20.5
Acido Fosf6rico 40 mM 20 μl
6.77.1
9.8.2 Acido Fosf6rico 40 mM 10 μl
1.7.2
Acido Fosf6rico 40 mM 5 μl
7.16.6
Acido Fosf6rico 40 mM 10 μl
1.7.2
6.77.1 Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
9.8.2
Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
7.20.5
Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
6.22.2
Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
6.34.2
Hidr6xido S6dico 25 mM 5 μl
6.67.1
Hidr6xido S6dico 25 mM 5 μl
6.22.2
9.8.2 Hidr6xido S6dico 25 mM 20 μl
7.26.4
Hidr6xido S6dico 25 mM 5 μl
6.34.2
9.8.2 Hidr6xido S6dico 25 mM 70 μl
1.7.2
Hidr6xido S6dico 40 mM 5 μl
7.26.4
Hidr6xido S6dico 40 mM 5 μl
6.67.1
9.8.2 Hidr6xido S6dico 40 mM 5 μl
1.7.2
Hidr6xido S6dico 40 mM 5 μl
7.20.5
9.8.2 Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
1.7.2
Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
7.26.4
Acido Fosf6rico 25 mM 5 μl
7.26.4
9.8.2 Hidr6xido S6dico 40 mM 20 μl
6.22.2
Acido Fosf6rico 75 mM 20 μl
7.20.5
Acido Fosf6rico 75 mM 20 μl
7.16.6
Acido Fosf6rico 75 mM 20 μl
9.8.2
9.8.2
Acido Fosf6rico 25 mM 15 μl
6.22.2
Acido Fosf6rico 25 mM 10 μl
7.20.5
Acido Fosf6rico 25 mM 20 μl
7.16.6
Acido Fosf6rico 25 mM 10 μl
(El caudal fue de 50 μl/minuto durante todos los procedimientos de regeneraci6n)
Despues de la regeneraci6n, la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc se uni6 de nuevo y se inyectaron anticuerpos de ensayo adicionales. Estos procedimientos se llevaron a cabo hasta que se hubo inyectado el panel completo de 5 clones sobre la superficie del anticuerpo inmovilizado, con la protefna de fusi6n MAdCAM-IgG1 Fc unida. Se us6 despues una nueva celda de flujo con un anticuerpo inmovilizado diferente y MAdCAM unido para ensayar con los nueve clones de ensayo. Se esperaba que los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 1.8.2 reconocieran el mismo epftopo de MAdCAM, basandose en la homologfa de secuencia de aminoacidos primaria cercana de sus cadenas ligera kappa y pesada, SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 respectivamente. En consecuencia, solamente se evalu6 1.7.2 a traves 10 de la matriz de respuesta BIAcore. Los anticuerpos 6.14.2 y 6.73.2 se omitieron de este analisis, pero todas las
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demas combinaciones de pares de anticuerpos anti-MAdCAM se ensayaron de esta manera. Se seleccion6 un nivel arbitrario de 100 RU como el umbral entre uni6n/no uni6n y se cre6 una matriz de respuesta (Tabla 7) basandose en si se observ6 uni6n.
Tabla 7. Matriz de respuesta de agrupaci6n de epftopos por BIAcore
Anticuerpo
Anticuerpo secundario
inmovilizado
6.22.2
6.34.2 6.67.1 6.77.1 7.20.5 9.8.2 1.7.2 7.26.4 7.16.6
6.22.2
- - - - - X X X X
6.34.2
- - - - - X X X X
6.67.1
- - - - - X X - -
6.77.1
- - - - - X X - X
7.20.5
- - - - - X X X X
9.8.2
X X X X X X - - X
1.7.2
X X X X X X - - X
7.26.4
X X - - X X - - X
7.17.6
X X - - X - - - -
Matriz de respuesta para todas las combinaciones de pares de anticuerpos. indica no uni6n de la sonda de anticuerpo, x indica que se observ6 uni6n (por encima de un nivel de umbral seleccionado de 100 RU).
La diagonal de la matriz en la Tabla 7 (sombreada en gris) contiene los datos de uni6n para pares de sondas identicas. En todos los casos, excepto para los dos clones 7.16.6 y 9.8.2, los anticuerpos eran autobloqueantes. Los anticuerpos 7.16.6 y 9.8.2 no compiten de forma cruzada. La falta de autobloqueo podrfa deberse a un cambio conformacional inducido por mAb en la protefna de fusi6n que permite uni6n adicional de mAb a un segundo sitio en MAdCAM-IgFc.
La agrupaci6n de los clones que muestran el mismo patr6n de reactividad da lugar al menos a seis conjuntos de epftopos diferentes, como se muestra en la representaci6n grafica, (Figura 5).
Puede determinarse una identificaci6n precisa adicional de las secuencias de epftopos de MAdCAM con las que interacciona un anticuerpo anti-MAdCAM por cualquiera de varios metodos, incluyendo, pero sin limitaci6n, analisis de Western de series de bibliotecas peptfdicas de aplicaci6n puntual (Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol 243: 23-36 (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag, Berlfn), presentaci6n de biblioteca de expresi6n de fagos o flagelina bacteriana/fliC o analisis de MALDI-TOF sencillo de fragmentos proteicos unidos despues de prote6lisis limitada.
Ensayos inmunohistoqufmicos:
Se usaron OCT o muestras de ensayo de tejido congelado incluidas en sacarosa de fleon (placas de Peyer), ganglio linfatico mesenterico, bazo, est6mago, duodeno, yeyuno y colon como controles de tinci6n positiva para los mAb anti-MAdCAM. Para tefir secciones humanas con mAb de IgG2 humanos, se generaron derivados biotinilados de los mAb anti-MAdCAM. Se cortaron secciones de tejido congelado de 10 μm en portaobjetos recubiertos con poli Llisina, se colocaron directamente en acetona 100 % 4 °C (10 minutos), despues per6xido de hidr6geno 3 % en metanol (10 minutos), lavando entre etapas con PBS. Los portaobjetos se bloquearon con sistema de bloqueo de biotina (DAKO Cat. n° X0590), antes de incubaci6n con el anticuerpo primario (1:100 -1:1000) en PBS (1 hora), se lavaron con PBS-Tween 20 (0,05 %) y despues se desarroll6 la uni6n con HRP-Estreptavidina (BD Bioscience Cat. n° 550946, 30 minutos) y sustrato DAB (Sigma Cat n° D5905). Para mAb de IgG4, se us6 secundario anti IgG4 humano de rat6n conjugado con HRP (Zymed Cat n° 3840). Los portaobjetos se contratiferon con Haemalum de Mayer (1 minuto), se lavaron y despues se montaron en DPX.
La afinidad de uni6n se compar6 para varias especies (tejido de rat6n, rata, conejo, perro, cerdo, cynomolgus y ser humano). No hubo reactividad para tejidos rata, conejo y cerdo por inmunohistoqufmica y no hubo reactividad cruzada de los anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM recombinante de rat6n, cuando se analizaron por ELISA. Los datos para tejido de ser humano, cynomolgus y perro se presentan en forma de tabla, Tabla 8 a continuaci6n:
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Tabla 8. Patr6n de reactividad cruzada de anticuerpos anti-MAdCAM con ort6logos de especies de MAdCAM
Reactividad cruzada de I C
CLON
Agrupaci6n de Luminex leon leon de leon de leon de
umano
cyno tit perro
1.7.2
3a
1.8.2
3a
7.16.6
3b
7.20.5
2b n.d
7.26.4
3b n.d
6.14.2
2 n.d
6.22.2
2 n.d
6.34.2
6 n.d
6.67.1
5 n.d
6.73.2
3 n.d n.d
6.77.1
1 n.d
9.8.2
3a n. d
IgG2
Sin uni6n
IgG4
_ni6n
n.d: no determinado
La uni6n anti-MAdCAM con estructuras endoteliales especializadas y tejido linfoide se indica por el sombreado, de acuerdo con la clave. El grupo de epftopos basandose en el analisis de epftopos de Luminex y el patr6n de
5 reactividad cruzada de MAdCAM se indican para cada anticuerpo. Los datos de agrupaci6n de epftopos de Luminex para anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.3 y 6.77.1 (cursiva) se deriv6 de experimentos separados de los de 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 (en negrita), como se indica por la diferencia en la fuente tipografica.
Todos los anticuerpos anti-MAdCAM ensayados tuvieron la capacidad de reconocer un epftopo de MAdCAM
10 humano expresado en compartimientos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal. Aparte de 1.7.2 y 1.8.2, todos los demas anticuerpos anti-MAdCAM ensayados fueron capaces de unirse especfficamente a los compartimentos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal de cynomolgus. Ciertos anticuerpos anti-MAdCAM distintos, concretamente 6.14.2 y 6.67.1 tambien tuvieron la capacidad de reconocer especfficamente el ort6logo de MAdCAM de perro asf como MAdCAM de cynomolgus.
15 Generaci6n de una lfnea celular de CHO que expresa MAdCAM de ser humano/cynomolgus quimerica funcionalmente activa:
Las diferencias en afinidad de uni6n de ciertos anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM de ser humano y cynomolgus condujo a los investigadores a determinar si podrfa hacerse una base estructural para esta observaci6n.
Basandose en la secuencia de aminoacidos publicada para MAdCAM de macaco (Shyjan AM, et al., J Immunol.,
20 156, 2851-7 (1996)), se disefaron cebadores para amplificar por PCR la secuencia de dominio de uni6n α4β7 de MAdCAM de cynomolgus. Se prepar6 ARN total a partir de ganglio linfatico mesenterico de cynomolgus escindido congelado (aproximadamente 200 mg) usando el metodo de Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1-2 μg se cebaron con oligo-dT y se transcribieron de forma inversa con transcriptasa inversa AMV (Promega). Se someti6 una proporci6n del producto transcrito inverso a PCR con cebadores directo 5'-AGC ATG
25 GAT CGG GGC CTG GCC-3' (SEC ID N°: 67) e inverso 5'-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3' (SEC ID N°: 68) con polimerasa GC-2 en fusi6n de GC 1 M (Clontech) y a una temperatura de hibridaci6n de 62 °C. Se escindi6 un producto de RT-PRC del tamafo apropiado y se purific6 a partir de un gel de agarosa 1 % despues de electroforesis,
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despues se clon6 con TOPO-TA (Invitrogen) entre sitios EcoRI de pCR2.1. Se confirm6 la secuencia del inserto. El nucle6tido y las secuencias de aminoacidos traducidas predichas se muestran en SEC ID N°: 49 y 50, respectivamente.
Las secuencias de aminoacidos de MAdCAM de cynomolgus y ser humano predichas para el dominio de uni6n α4β7
5 muestran un alto grado de identidad de secuencia (90,8 %) cuando se alinean (la Figura 3 proporciona este alineamiento de secuencia). Para generar una lfnea celular que exprese MAdCAM de cynomolgus funcionalmente activa, que imite el patr6n de uni6n anti-MAdCAM representado por la Tabla 8, se subclon6 un fragmento de SacI correspondiente a la secuencia de dominio de uni6n de α4β7 de cynomolgus en pCR2.1, directamente en la construcci6n de MAdCAM pIND-Hygro humana C-terminal que contenfa dominio transmembrana y tallo de mucina
10 carboxi terminal, descrito anteriormente. Se verific6 la secuencia y la orientaci6n, despues se clon6 un fragmento de KpnI/NotI en vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen), reemplazando la secuencia codificante de CAT y se us6 en transfecciones para generar clones que se expresan de forma estable sencillos en celulas Flp In CHO (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La uni6n de clones de anticuerpo anti-MAdCAM a las celulas CHO que expresan quimera MAdCAM de
15 cynomolgus/ser humano se evalu6 por citometrfa de flujo y se determin6 la actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM usando un ensayo de adhesi6n de celulas JY muy similar al que se ha descrito anteriormente. La uni6n y actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM se expresa en la Tabla 9.
Tabla 9. Correlaci6n entre la actividad funcional en el ensayo de adhesi6n de MAdCAM-CHO/JY de cynomolgus/ser humano y uni6n de celulas MAdCAM CHO de cynomolgus/ser humano, segun se mide por FACS, para un intervalo
20 de anticuerpos anti-MAdCAM.
CLON
CI50 Funcional (μg/ml) _ni6n de FACS
ser umano
cyno/ umano
1.7.2
inactivo
1.8.2
inactivo
7.16.6
0,72
7.20.5
0,62
7.26.4
0,96
6.14.2
0,53
6.22.2
0,83
6.34.2
0,47
6.67.1
0,75
6.73.2
inactivo
6.77.1
0,64
9.8.2
0,83
IgG2
IgG4
No uni6n
Uni6n
Tomados juntos existe una buena correlaci6n entre la capacidad de un anticuerpo anti-MAdCAM dado para unirse a MAdCAM de ser humano o cynomolgus, segun se detect6 por inmunohistoqufmica (Tabla 8), con actividad funcional y de uni6n basada en celulas recombinantes (Tabla 9). Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2, por
25 ejemplo, demostraron una falta consistente de uni6n a tejido de cynomolgus y celulas que expresan una protefna MAdCAM de cynomolgus/ser humano quimerica. Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2 tampoco tenfan la capacidad de detectar actividad de bloqueo funcional en el ensayo de adhesi6n de MAdCAM/JY de cynomolgus/ser humano.
Podrfan usarse enfoques similares para definir el epftopo de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2 y 6.67.1 que 30 reconocen MAdCAM de perro.
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Ejemplo IV:
Uso de mAb anti-MAdCAM en la detecci6n de MAdCAM soluble en circulaci6n como un metodo de diagn6stico de enfermedad
Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detecci6n de MAdCAM soluble en circulaci6n (sMAdCAM). La detecci6n de sMAdCAM en plasma lfquido, muestras de suero u otro biofluido, tales como, pero sin limitaci6n, heces, orina, esputo es probablemente un biomarcador de enfermedad sustituto util para enfermedad subyacente, incluyendo, pero sin limitaci6n, enfermedad inflamatoria del intestino.
Basandose en los datos de agrupaci6n de epftopos (Tabla 7 y 8), los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 7.16.6 parecen reconocer diferentes epftopos en MAdCAM humana. Las placas de ELISA se recubrieron durante una noche a 4 °C con 100 μl/pocillo de una soluci6n de 50 μg/ml de 1.7.2 en soluci6n salina tamponada con fosfato (PBS). Despues de la incubaci6n la placa se bloque6 durante 1,5 horas con un tamp6n de bloqueo de PBS que contenfa leche 10 % (200 μl/pocillo). Despues de la incubaci6n la placa se lav6 con PBS (2 x 100 μl/pocillo) y se afadieron diluciones en serie de protefna de fusi6n MAdCAM-IgGI Fc, a partir de una concentraci6n superior de 50 μg/ml bajando hasta aproximadamente 5 ng/ml en PBS, a un volumen final de 100 μl, a la placa para incubaci6n de 2 horas a temperatura ambiente. En un enfoque similar la protefna MAdCAM-IgGI Fc puede diluirse en plasma o suero o algun otro biofluido relevante similar y usarse para determinar la expresi6n de MAdCAM soluble en una muestra clfnica, como se describe posteriormente. Como un control negativo, solamente se afadi6 tamp6n a los pocillos que contenfan el anticuerpo primario anti-MAdCAM. Despues de este tiempo, la placa se lav6 con PBS (3 x 100 μl/pocillo) y la placa se incub6 despues en oscuridad con un 7.16.6 marcado con Alexa488 (100 μl, 5 μg/ml). El
7.16.6 marcado con Alexa488 se gener6 usando un kit disponible en el mercado (Molecular Probes, A-20181), siguiendo los protocolos del fabricante.
La placa se lav6 con PBS que contenfa Tween 20 0,05 % y se determin6 la uni6n de 7.16.6 marcado a MAdCAM soluble capturada mediante la medici6n de la fluorescencia (Lector de Multimarcador Wallac Victor2 1402, conteo desde la parte superior de λ de excitaci6n 485 nm, λ de emisi6n 535 nm, 3 mm desde el fondo de placa, durante 0,1 segundos con apertura de emisi6n normal). Cuando se representa la fluorescencia como una funci6n de la concentraci6n de la protefna de fusi6n MAdCAM-IgGI Fc, Figura 6, indica que 1.7.2 y un 7.16.6 marcados pueden usarse para fines de diagn6stico para determinar el nivel de MAdCAM soluble en circulaci6n expresado en un biofluido o muestra clfnica. Este enfoque de ELISA de tipo sandwich no se restringe al uso de 1.7.2 y 7.16.6, sino a cualquier combinaci6n de anticuerpos anti-MAdCAM que reconozcan diferentes epftopos en MAdCAM, como se describe por los datos e interpretaci6n de la Tabla 7 y Figura 5. Podrfan aplicarse estrategias similares al desarrollo de ensayos similares, tales como inmunohistoqufmica y transferencia de Western, con los otros anticuerpos anti-MAdCAM descritos, usando diferentes compaferos, variantes, marcadores, etc.
Ejemplo V:
Estructura de aminoacidos de mAb anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invenci6n
En el siguiente analisis, se proporciona informaci6n estructural relacionada con los mAb anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invenci6n.
Para analizar las estructuras de mAb producidos de acuerdo con la invenci6n, los inventores clonaron los genes que codifican los fragmentos de cadena pesada y ligera fuera del clon de hibridoma especffico. La clonaci6n de genes y la secuenciaci6n se consigui6 como sigue:
Se aisl6 ARNm Poly(A)/ de aproximadamente 2 x 105 celulas de hibridoma derivadas de ratones XenoMouse inmunizados usando un kit Fast-Track (Invitrogen). La generaci6n de ADNc con cebadores aleatorios se sigui6 de PCR. Se usaron cebadores especfficos de familia Vκ o VH humana (Marks et al., 'Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes'; Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)) o un cebador VH humano universal, MG-30 (5'-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEC ID N°: 108)) junto con cebadores especfficos para el Cγ2 humano, MG40-d (5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEC ID N°: 109)) o la regi6n constante de Cγ4, MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEC ID N°: 110)) o regi6n constante de Cκ (hκP2; como se ha descrito previamente en Green et al., 1994). Se obtuvieron secuencias de los transcritos de cadena kappa y pesada derivada de mAb de hibridomas por secuenciaci6n directa de productos de PCR generados a partir de ARN poli (A/) usando los cebadores descritos anteriormente. Los productos de PCR se clonaron en pCR2.1 usando un kit de clonaci6n TOPO-TA (Invitrogen) y se secuenciaron ambas hebras usando kits de secuenciaci6n de terminador de colorante Prism y una maquina de secuenciaci6n ABI 377. Todas las secuencias se analizaron por alineamientos con el 'directorio de secuencias V BASE' (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14,4628-4638 (1995)).
Ademas se someti6 a cada uno de los anticuerpos, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, a secuenciaci6n de ADN de longitud completa. Para esto, se aisl6 ARN total de aproximadamente 3-6 x 106 celulas de hibridoma usando un kit
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RNeasy (Qiagen). El ARNm se transcribi6 de forma inversa usando un sistema de transcriptasa inversa basado en AMV y oligo-dT (Promega). Se us6 V BASE para disefar cebadores de amplificaci6n especfficos de 5', que contenfan una secuencia Kozak 6ptima y un cod6n de inicio ATG (subrayado) y cebadores inversos 3' para las cadenas kappa y pesada especfficas como se representa en la Tabla 10.
Tabla 10: Pares de cebadores de PCR para amplificaci6n de ADNc a partir de hibridomas que expresan mAb anti-MAdCAM y cebadores usados en la construcci6n de versiones modificadas de anticuerpos anti-MAdCAM.
Oligo secuencia
VH1-18
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTT 3' (SEC ID
N°: 70)
VH3-15
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATT 3' (SEC ID
N°: 71)
VH3-21
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGGGTT 3' (SEC
ID N°: 72)
VH3-23
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTT 3' (SEC ID
N°: 73)
VH3-30
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEC ID
N°: 74)
VH3-33
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3' (SEC ID
N°: 75)
VH4-4
5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGGGTTCTTCCTC 3' (SEC ID
N°: 76)
A2/A3
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTG 3' (SEC
ID N°: 77)
A26
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACTCATTGGG 3' (SEC ID
N°: 78)
B3
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTC 3' (SEC
ID N°: 79)
012
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG 3' (SEC
ID N°: 80)
018
5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTCCTCAG 3' (SEC
ID N°: 81)
InvIgG2 InvIgG4 InvKappa
5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3' (SEC ID N°: 82) 5' TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3' (SEC ID N°: 83) 5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3' (SEC ID N°: 84)
6.22.2VK F1
5'-GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AAT AGC CTG GAA GC-3'(SEC ID N°:
85)
6.22.2VK R1
5'-GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC-3'(SEC ID N°:
86)
6.22.2VH F1
5'-GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3'(SEC ID N°: 87)
6.22.2VH R1
5'-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC-3'(SEC ID N°: 88)
6.22.2VH CS*
5'-CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3'(SEC ID N°: 89)
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Oligo secuencia
6.34.2VK F1
5'-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CC
3' (SEC ID N°: 90)
6.34.2VK R1
5'-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA CTA ATA CTC TGA CTT GC
3' (SEC ID N°: 91)
6.34.2VK F2
5'-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT ACT GTC ACC
3' (SEC ID N°: 92)
6.34.2VK R3
5'-GGT GAC AGT AGT AAG TTG CAA AAT CCT CAG GTT GCA GAG AAC TGA TGG
3' (SEC ID N°: 93)
6.34.2VH F16.34.
5'-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G-3'(SEC ID N°: 94)
2VH R1
5'-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG C-3'(SEC ID N°: 95)
6.67.1VK F1
5'-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACA GAA ACC AGG ACA GCC3' (SEC ID N°: 96)
6.67.1VK R1
5'-GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3 ' (SEC ID N°: 97)
6.67.1VH F1
5' -CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA ACC-3' (SEC ID N°: 98)
6.67.1VH R1
5'-GGT TCT TGG AC G TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3'(SEC ID N°: 99)
6.67.1VH CS*
5'-ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3'(SEC ID N°: 100)
6.77.1VK F1
5'-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEC ID N°: 101)
6.77.1VK R1
5'-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3'(SEC ID N°: 102)
6.77.1VK F2
5'-GGT TTA ITA CTG CAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC
3' (SEC ID N°: 103)
6.77.1VK R2
5'-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AAA CC
3' (SEC ID N°: 104)
7.26.4K F1
5'-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEC ID N°: 105).
7.26.4K R1
5'-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3'(SEC ID N°: 106)
Los pares de cebadores se usaron para amplificar los ADNc usando Taq polimerasa de alta afinidad de expansi6n (Roche) y los productos de PCR se clonaron en pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen) para secuenciaci6n posterior. Despues los clones verificados para secuencia de cadena ligera kappa y pesada se clonaron en vectores pEE6.1 y pEE12.1 (LONZA) usando sitios de XbaI/EcoRI y HindIII/EcoRI.
Analisis de Utilizaci6n de Genes
La Tabla 11 presenta la utilizaci6n de gen de cadena ligera kappa y pesada para cada hibridoma descrito en la invenci6n.
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Tabla 11: Utilizaci6n de Gen de cadena ligera Kappa y pesada
CLON
Cadena Pesada Cadena ligera Kappa
D
J Vκ Jκ
1.7.2 1.8.2 7.16.6 7.20.5 7.26.4
V 3-15 V 3-15 V 1-18 V 4-4 V 1-18 V 3-23 V 3-33 V 3-30 V 4-4 V 3-23 V 3-21 V 3-33 D6-19 D6-19 D6-6 D3-10 D6-6 D5-5 D5-12 D4-23 D3-10 D6-19 D6-19 D3-10 o D3-16 J 4b J 4b J 6b J 6b J 6b J 4b J 6b J 6b J 4b J 6b J 6b J 4b A3 JK5 A3 JK5 A2 JK1 A3 JK4 A2 JK1 O12 JK5 A26 JK4 O12 JK3 B3 JK4 O12 JK2 A2 JK2 O18 JK5
6.14.2
6.22.2
6.34.2
6.67.1
6.73.2
6.77.1
9.8.2
IgG2 IgG4
Analisis de Secuencia
Para examinar adicionalmente la estructura de anticuerpo se obtuvieron secuencias de aminoacidos predichas de 5 los anticuerpos a partir de los ADNc obtenidos de los clones.
Los numeros de identificador de secuencia (SEC ID N°:) 1-48 y 51-68 proporcionan las secuencias de aminoacidos y nucle6tidos de las cadenas ligera kappa y pesada de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 (SEC ID N°: 1-4), 1.8.2 (SEC ID N°: -5-8), 6.14.2 (SEC ID N°: 9-12), 6.22.2 (SEC ID N°: 13-16), 6.34.2 (SEC ID N°: 17-20), 6.67.1 (SEC ID N°: 21-24), 6.73.2 (SEC ID N°: 25-28), 6.77.1 (SEC ID N°: 29-32), 7.16.6 (SEC ID N°: 33-36), 7.20.5 (SEC ID N°: 37
10 40), 7.26.4 (SEC ID N°: 41-44), 9.8.2 (SEC ID N°: 45-48) y los anticuerpos anti-MAdCAM modificados 6.22.2-mod (SEC ID N°: 51-54), 6.34.2-mod (SEC ID N°: 55-58), 6.67.1-mod (SEC ID N°: 59-62) and 6.77.1-mod (SEC ID N°: 6366) y 7.26.4-mod (SEC ID N°: 41-42, 67-68). Para cada secuencia de anticuerpo anti-MAdCAM clonada, las secuencias de la secuencia de peptido sefal (o las bases que codifican la misma) se indican en minuscula y subrayadas.
15 Las Figuras 1A-1J proporcionan alineamientos de secuencia entre las secuencias de aminoacidos de cadena pesada predichas de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 y la secuencia de aminoacidos de los productos genicos de lfnea germinal respectivos. Las posiciones de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos estan subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada y la secuencia de lfnea germinal correspondiente se indican en negrita y cuando existen adiciones en la secuencia
20 expresada en comparaci6n con la lfnea germinal estas se indican como un (-) en la secuencia de lfnea germinal.
Las Figuras 1K-1T proporcionan alineamientos de secuencia entre las secuencias de aminoacidos de cadena ligera kappa predichas de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y
9.8.2 y la secuencia de aminoacidos de los productos genicos de lfnea germinal respectivos. Las posiciones de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos estan subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada
25 y la lfnea germinal correspondiente se indican en negrita y cuando existen adiciones en las secuencias expresada en comparaci6n con la lfnea germinal estas se indican como un (-) en la secuencia de lfnea germinal.
Presencia de modificaci6n postitraduccional: glucosilaci6n y desamidaci6n:
El efecto de algunos de los cambios en la secuencia de anticuerpo anti-MAdCAM expresada, en comparaci6n con la secuencia de lfnea germinal derivada, es introducir restos que potencialmente podrfan someterse a glucosilaci6n
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ligada a N (Asn-X-Ser/Thr) y/o desamidaci6n (Asn-Gly) (vease Tabla 12). Las secuencias de acido nucleico que codifican las secuencias de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, (SEC ID N°: 16, 20, 24, 28, 32, 44 y 48) y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 6.14.2 (SEC ID N°: 10), predicen la presencia de glucosilaci6n ligada a N. La presencia de esta modificaci6n post-traduccional se investig6 usando una combinaci6n de SDS-PAGE y tinci6n de Glucoprotefna Emerald 488 Pro-Q® (Molecular Probes) con los mAb 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2.
Brevemente, se cargaron 2 μg anticuerpo anti-MAdCAM reducido en un gel de SDS-poliacrilamida 4-12 % usando un tamp6n MOPS. Despues de electroforesis, el gel se fij6 en MeOH 50 %, acido acetico 5 % y se lav6 en acido acetico 3 %. Cualquier carbohidrato en el gel se oxid6 despues con acido pery6dico y se tif6 usando un Kit de Tinci6n de Glucoprotefna Emerald 488 Pro-Q® (Molecular Probes). Despues de una etapa de lavado final se visualiz6 la tinci6n de glucoprotefna usando un escaner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm.
Despues de la tinci6n de glucoprotefnas, el gen se tif6 para protefna total usando tinci6n de gel de protefnas SYPRO Ruby y se analiz6 usando un escaner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm. Las cadenas ligeras kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, se tiferon todas positivamente para la presencia de glucosilaci6n. Como una confirmaci6n adicional, se someti6 el anticuerpo anti-MAdCAM 7.26.4 a digesti6n trfptica/quimiotrfptica, el analisis de CL-EM/EM confirm6 la presencia de un peptido trfptico modificado y proporcion6 confirmaci6n adicional de glucosilaci6n de cadena ligera kappa.
Secuencias de Asn-Gly especfficas en las regiones CDR1 de anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 y 7.20.5, hacen a estas regiones sensibles a desamidaci6n. La desamidaci6n a pH neutro introduce una carga negativa y puede conducir tambien a β-isomerizaci6n, lo que puede afectar a las propiedades de un anticuerpo. Para anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 7.20.5, la presencia de restos de Asn-isoaspartato desamidados se evalu6 por espectroscopia de masas despues de atrapamiento de la cadena lateral de isoaspartato con MeOH.
En breve, para el anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2, el estado del peptido trfptico/Asp-N SSQSLLQSNGYNYL (SEC ID N°: 69) (1573,7 Da) se seleccion6 para control por CL-EM/EM. El anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2 se redujo en DTT 10 mM, se alquil6 en yodacetato Na 5 mM y se intercambi6 el tamp6n posteriormente a tamp6n de digesti6n de tripsina (Tris-HCl 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,6). El anticuerpo se mezcl6 despues con tripsina modificada de uso en secuenciaci6n (Promega) en una relaci6n de proteasa:protefna de 1:20. La protefna se digiri6 en tripsina durante 15 horas a 30 °C y los peptidos resultantes se separaron por HPLC usando un C-18 RPC en un sistema Ettan LC. El peptido que contenfa 33Asn (4032 Da) se recogi6 de la columna y se diluy6 en tamp6n de digesti6n de Asp-N (tamp6n de fosfato s6dico 50 mM, pH 8,0). Se afadieron despues endoproteinasa Asp-N (Roche) a una relaci6n aproximada de peptido:enzima de 10:1.
Se afadi6 cloruro de acetilo (100 μl) a una muestra de metanol (1 ml, 20 °C), se calent6 la mezcla a temperatura ambiente. La digesti6n de trfptico/Asp-N se sec6 en un Speed-Vac y despues se afadieron 5 μl del metanol/cloruro de acetilo (45 minutos, temperatura ambiente), despues se sec6 de nuevo en un Speed-Vac. El resto resultante se reconstituy6 en TFA 0,1 % y se analizaron los peptidos inicialmente en el espectr6metro de masas Voyager-DE STR MALDI-TOF usando el metodo de preparaci6n de muestras en capa fina de nitrocelulosa o purificaci6n de fase inversa usando C18 ZipTips (Millipore) seguido de mezcla en gotas con matriz α-ciano. La mezcla de peptido metilado se analiz6 tambien usando CL-EM/EM en un Espectr6metro de Masas de Trampa I6nica Deca XP Plus como anteriormente. La eluci6n se introdujo directamente en la EM de Trampa I6nica y los peptidos se analizaron posteriormente por EM y EM/EM. La EM se ajust6 para analizar todos los iones entre 300 y 2000 Da. El ion mas fuerte en cualquier exploraci6n particular se someti6 despues a analisis de EM/EM.
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Tabla 12. Modificaci6n post-traduccional de anticuerpos anti-MAdCAM
CLON
Cadena Pesada Cadena ligera kappa
Glucosilaci6n (NXS/T)
Confirmado Glucosilaci6n (NXS/T) Confirmado Desamidaci6n (NG) Confirmado
1.7.2
TFNNSAMT N.D CKSNQLLY SGTNFTLTI ASQNISSYL SSNNKTYLA RASQNITN SCNSSQSL SDNLSIT EM/PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE PAGE LQSNGYN LQSNGYN GNGYNY LTINGLEA EM EM EM N.D
1.8.2
7.16.6
7.20.5
7.26.4
6.14.2
6.22.2
6.34.2
6.67.1
6.73.2
6.77.1
9.8.2
Estudios de Mutagenesis:
La secuencia de aminoacidos primaria de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados en la presente invenci6n
5 pueden modificarse, por mutagenesis dirigida, para retirar sitios potenciales de modificaci6n post-traduccionales (por ejemplo, glucosilaci6n, desamidaci6n) o para alterar el fondo de isotipo o para obtener por ingenierfa genetica otros cambios que puedan mejorar la utilidad terapeutica. Como ejemplo, se us6 PCR para obtener por ingenierfa genetica cambios en los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, para revertir ciertas secuencias flanqueantes a la lfnea germinal, para retirar sitios de glucosilaci6n potenciales y/o para cambiar el fondo
10 de isotipo a IgG2 humano. ADNc clonados en pCR2.1 TOPO-TA (100 ng), correspondientes a las SEC ID N°: 13, 17, 21 y 29 de nucle6tidos de cadena pesada y SEC ID N°: 15, 19, 23, 31 y 43 de nucle6tidos de cadena ligera kappa se usaron como un molde en una serie de PCR usando extensi6n de solapamiento y un panel de conjuntos de cebadores descritos en la Tabla 10.
Cadena pesada de 6.22.2: Se usaron conjuntos de cebadores de PCR 6.22.2 VH F1 y 6.22.2VH CS* (1) y VH3-33
15 y 6.22.2 VH R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 13. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores VH3-33 y VK6.22.2 CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de 6.22.2 modificado. Esta versi6n modificada contiene una mutaci6n His/Phe en FR1 e introduce un sitio de restricci6n XbaI
20 para permitir la clonaci6n en fase en un vector derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1CH, que contiene el dominio constante IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clon6 en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, se comprob6 con respecto a orientaci6n y se verific6 la secuencia completa insertada. La secuencia de nucle6tidos para la cadena pesada de 6.22.2 modificada se encuentra en SEC ID N°: 51 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 52. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en
25 comparaci6n con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.22.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.22.2 VK F1 e invKappa (1), y A26 y 6.22.2 VK R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 15. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno)
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junto con cebadores A26 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.22.2 modificado. Esta versi6n modificada contiene cambios Asn/Asp y Gly/Ser a la secuencia FR3. El producto de PCR resultante se clon6 en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verific6 la secuencia completamente. La secuencia de nucle6tidos para la cadena ligera kappa de 6.22.2 modificada se encuentra en SEC ID N°: 53 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 54. Los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental se indican.
Cadena pesada de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.34.2 VH F1 y 6.22.2VH CD* (1) y VH3-30 y 6.34.2 VH R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Ta� polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 17. Se purificaron los productos (1) y (2) y se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores VH3-30 y VK6.22.2 CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de 6.34.2 modificado. Esta versi6n modificada contiene una mutaci6n de Ser/Arg en FR3 e introduce un sitio de restricci6n de XbaI para permitir la clonaci6n en fase en un vector derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1 CH, que contiene el dominio constante de IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clon6 en el sitio XbaI de pEE6.1CH, se comprob6 con respecto a orientaci6n y se verific6 la secuencia completa del inserto. La secuencia de nucle6tidos para la cadena pesada de 6.34.2 modificada se encuentra en SEC ID N°: 55 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 56. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR O12 y 6.34.2 VK R1 (1),
6.34.2 VK F1 y 6.34.2 VK R2 (2), asf como 6.34.2 VK F2 e invKappa (3) para generar los productos de PCR (1),
(2) y (3), usando una Ta� polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 19. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno), junto con los cebadores O12 y
6.34.2 VK R2, para generar el producto de PCR (4). Los productos de PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno), junto con 6.34.2 VK F1 e invKappa, para generar el producto de PCR (5). Los productos de PCR (4) y (5) se purificaron y se combinaron juntos (aproximadamente 50 ng cada uno) con los cebadores O12 e invKappa para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.34.2 modificado. Esta versi6n modificada contiene un cambio Asn/Ser en CDR1, un cambio Phe/Tyr en FR2 y cambios Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu y Ser/Tyr a la secuencia FR3. El producto de PCR resultante se clon6 en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verific6 la secuencia completamente. La secuencia de nucle6tidos para la cadena ligera kappa de
6.34.2 modificada se encuentra en SEC ID N°: 57 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 58. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental.
Cadena pesada de 6.67.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 6.67.1 VH F1 y 6.67.1 VH CS* (1) y VH4-4 y 6.67.1 VH R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 21. Los productos (1) y (2) se purificaron y se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng de cada uno) junto con los cebadores VH4-4 y VK6.67.1 CS*, para generar el dominio V de cadena pesada de
6.67.1 modificado. Esta versi6n modificada contiene una conversi6n de Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val en FR3 e introduce un sitio de restricci6n XbaI para permitir la clonaci6n en fase en un vector derivado de pEE6.1 denominado pEE6.1 CH, que contiene el dominio constante de IgG2 humano correspondiente. El fragmento de PCR final se clon6 en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, se comprob6 con respecto a orientaci6n y se verific6 la secuencia completa del inserto. La secuencia de nucle6tidos para la cadena pesada de 6.67.1 modificada se encuentra en SEC ID N°: 59 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 60. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental.
Cadena ligera kappa de 6.67.1: Se usaron conjuntos de cebadores de PCR 6.67.1 VK F1 e invKappa (1) y B3 and
6.67.1 VK R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 23. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con cebadores B3 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.67.1. Esta versi6n modificada contiene un cambio de Thr/Asn en CDR1 y un cambio de Arg/Gly en FR2. El producto de PCR resultante se clon6 en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verific6 la secuencia completamente. La secuencia de nucle6tidos para la cadena ligera kappa de 6.67.1 modificada se encuentra en SEC ID N°: 61 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 62. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con el parental.
Cadena pesada de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR VH 3-21 and 6.22.2VH CS* para generar un producto de PCR sencillo usando una Ta� polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 29. Los productos de PCR se digirieron con XbaI, se purificaron en gel y se clonaron en el sitio de XbaI de pEE6.1CH, comprobando la orientaci6n. Se verific6 completamente la secuencia del inserto. La secuencia de nucle6tidos para la cadena pesada de 6.77.1 modificada se encuentra en SEC ID N°: 63 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 64. Se indican los cambios en las secuencias de aminoacidos y nucle6tidos en comparaci6n con la parental.
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Cadena ligera kappa de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores de PCR A2 y 6.77.1 VK R1 (1),
6.77.1 VK VK F1 y 6.77.1 R2 (2), asf como 6.77.1 VK F2 e invKappa (3) para generar productos de PCR separados (1), (2) y (3), usando una Taq polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 31. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng de cada uno) junto con los cebadores A2 y
6.77.1
VK R2, para generar el producto de PCR (4). Los productos de PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores 6.77.1 VK F1 e invKappa, para generar el producto de PCR 5. Los productos de PCR (4) y (5) se purificaron y combinaron juntos (aproximadamente 50 ng cada uno) con los cebadores A2 y JK2 para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 6.77.1 modificado. Esta versi6n modificada contiene un cambio de Asn/Lys en CDR1, un cambio de Ser/Tyr en FR3 y un cambio de restos Cys/Ser en la secuencia de CDR3. El producto de PCR resultante se clon6 en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoR1 y se verific6 la secuencia completamente. La secuencia de nucle6tidos para la cadena ligera kappa de 6.77.1 modificada se encuentra en SEC ID N°: 65 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 66. Se indican los cambios en la secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental.
Cadena ligera kappa de 7.26.4: se usaron los conjuntos de cebadores de PCR 7.26.4 VK F1 e invKappa (1), y A2 y
7.26.4
VK R1 (2) para generar productos de PCR separados (1) y (2), usando una Ta� polimerasa de Expansi6n y un molde de ADNc de pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia de nucle6tidos SEC ID N°: 43. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) junto con los cebadores A2 e invKappa, para generar el dominio V de cadena ligera kappa de 7.26.4 modificado. Esta versi6n modificada contiene un cambio de Asn/Ser en CDR1. El producto de PCR resultante se clon6 en pEE12.1 usando sitios HindIII/ECoR1 y se verific6 la secuencia completamente. La secuencia de nucle6tidos para la cadena ligera kappa de 7.26.4 modificada se encuentra en SEC ID N°: 67 y la secuencia de aminoacidos correspondiente en SEC ID N°: 68. Se indican los cambios en las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos en comparaci6n con la parental.
Se ensambl6 un vector de expresi6n eucariota funcional para cada una de las versiones modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, denominadas 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, y que representan respectivamente las secuencias de nucle6tidos de cadena pesada SEC ID N°: 51, 55, 59, 63 y 41 y las secuencias de aminoacidos correspondientes SEC ID N°: 52, 56, 60, 64 y 42 asf como las secuencias de nucle6tidos de cadena ligera kappa SEC ID N°: 53, 57, 61, 65 y 67 y las secuencias de aminoacidos correspondientes SEC ID N°: 54, 58, 62, 66 y 68 como sigue: los insertos de ADNc de cadena pesada que corresponden a 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod y 6.77.1-mod se escindieron del vector pEE6.1 CH con NotI/SalI, la versi6n parental de las cadenas pesadas de 7.26.4 se escindi6 del vector pEE6.1 con NotI/SalI y los fragmentos purificados se clonaron en sitios identicos en el vector pEE12.1 correspondiente que contenfa las versiones modificadas de las secuencias de cadena ligera kappa 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. Las secuencias de los vectores se confirmaron y se usaron cantidades purificadas en transfecciones transitorias con celulas HEK 293T. Brevemente, 9 x 106 celulas HEK 293T, sembradas en un matraz T165 el dfa antes de la transfecci6n y lavadas en Optimem, se transfectaron transitoriamente con ADNc del vector correspondientes a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1mod y 7.26.4-mod (40 μg) usando Lipofectamine PLUS (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas se incubaron durante 3 horas, despues el medio de transfecci6n se reemplaz6 con medio DMEM (Invitrogen 21969-035) que contenfa suero de ternero fetal de IgG ultrabajo 10 % (Invitrogen 16250-078) y L-Glutamina (50 ml). El sobrenadante del medio se recogi6 5 dfas despues, se esteriliz6 por filtro y el anticuerpo anti-MAdCAM se purific6 usando cromatograffa de afinidad en sepharose de protefna G, de una manera similar a la descrita anteriormente. La cantidad de anticuerpo recuperado (20-100 μg) se cuantific6 por un ensayo de Bradford.
La actividad anti-MAdCAM del anticuerpo purificado por afinidad correspondiente a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod se evalu6 en el ensayo de fusi6n de MAdCAM-IgG1 Fc como se ha descrito previamente. Los valores de CI50 de estos anticuerpos anti-MAdCAM en comparaci6n con los anticuerpos anti-MAdCAM parentales de los que derivaban se presentan en la Tabla 13. Existe un efecto mfnimo de las sustituciones de aminoacidos descritas anteriormente sobre la actividad de los anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparaci6n con sus parentales. Los anticuerpos tambien mantuvieron su uni6n a celulas CHO que expresaban MAdCAM humana recombinante o la quimera de MAdCAM de cynomolgus/ser humano.
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Tabla 13. Actividad de versiones modificadas de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod en comparaci6n con sus parentales.
CLON
CI50 Media del Ensayo de fusi6n de MAdCAM IgG1 Fc (mg/ml)
Parental
Modificado
6.22.2 6.34.2 6.67.1 6.77.1 7.26.4
0,018 0,013 0,013 0,022 0,021 0,058 0,049 0,037 0,077 0,033
Ejemplo VI
Aumento en linfocitos β7/ en la circulaci6n periferica por bloqueo de anticuerpos anti-MAdCAM
5 Se desarroll6 un ensayo para identificar y correlacionar un efecto de mecanismo de un anticuerpo anti-MAdCAM y su nivel en circulaci6n en sangre. Un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM deberfa tener el efecto de inhibir el reclutamiento de leucocitos que expresan la interina α4β7 en el tracto gastrointestinal. Las clases de leucocitos que portan integrina α4β7 deberfan, por lo tanto, restringirse a la circulaci6n periferica.
Esto se demostr6 con un mAb anti-MAdCAM humana completamente humano 7.16.6 en cynomolgus.
10 Se evaluaron mAb anti-MAdCAM humana purificado 7.16.6 (1 mg/kg) o vehfculo (NaAcetato 20 mM, polisorbato 80, 0,2 mg/ml, manitol 45 mg/ml y EDTA 0,02 mg/ml a pH 5,5) de una manera similar por administraci6n intravenosa a traves de la vena safena a dos grupos de monos cynomolgus (n=4/grupo). El dfa 3 despues de la dosificaci6n se recogieron muestras de sangre en tubos de EDTA por venipuntura femoral. Los anticuerpos especfficos paraLPAM, que reaccionan de forma cruzada con la integrina α4β7 de cynomolgus, no estan disponibles en el mercado, de modo
15 que se us6 un anticuerpo anti-β7 (que reconoce integrina α4β7 y αEβ7) en su lugar. Se afadieron anticuerpos (30 μl), de acuerdo con la siguiente tabla, tabla 15, a tubos que contenfan 100 μl de sangre de cynomolgus, se mezclaron por agitaci6n en v6rtex suave y se incubaron durante 20-30 minutos a 4 °C.
Tabla 15. Anticuerpos (BD Pharmingen) usados en inmunofenotipaci6n de sangre de cynomolgus
Numero de Catalogo
Anticuerpo o Isotipo
555748
mIgG1, k-FITC
555844
mIgG2a, k-PE
559425
mIgG1 -PerCP
555751
mIgG1, k-APC
555728
CD 28-FITC
555945
β7-PE
558814
CD 95-APC
550631
CD 4-PerCP
A cada tubo, se afadi6 1 ml de soluci6n FACSlyse 1:10 (BD n° 349202), se mezcl6 por v6rtex suave y se incub6 a
20 temperatura ambiente durante aproximadamente 12 minutos en oscuridad hasta que se complet6 la lisis de gl6bulos rojos. Despues se afadieron 2 ml de tamp6n de tinci6n BD (n° 554656) a cada tubo, se mezclaron y centrifugaron a 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se decant6 y el sedimento se resuspendi6 en 3 ml de tamp6n de tinci6n, se mezcl6 de nuevo y se centrifug6 a 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. Se afadi6 tamp6n Cytofix (BD n° 554655) que contenfa paraformaldehfdo p/v (100 μl) a los sedimentos
25 celulares de sangre periferica de mono y se mezclaron exhaustivamente por velocidad baja/moderada del agitador vorticial. Las muestras se mantuvieron a 4 °C en la oscuridad hasta que se adquirieron en el FACSCalibur. Justo antes de la adquisici6n, se afadi6 PBS (100 μl) a todos los tubos inmediatamente antes de la adquisici6n. Los
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numeros de celulas absolutos de CD4/β7/CD95loCD28/ (vfrgenes), CD4/β7/CD95hiCD28/ (memoria central), CD4/β7-CD95hiCD28/ (memoria central), CD4/β7/CD95hiCD28 (memoria efectora) se adquirieron por selecci6n apropiada y analisis de cuadrantes. Otros subconjuntos de linfocitos T, por ejemplo, linfocito T CD8/ de memoria central (β7/CD8/CD28/CD95/) y cualquier otro leucocito que porte un ligando MAdCAM, tambien pueden analizarse por este metodo con los anticuerpos apropiados. En comparaci6n con el control de vehfculo, mAb anti-MAdCAM
7.16.6 provoc6 un aumento de aproximadamente 3 veces en los niveles de linfocitos T de memoria central CD4/β7/CD95hiCD28/ en circulaci6n, como se muestra en la Figura 7. No hubo efectos sobre la poblaci6n de linfocitos T de memoria central CD4/β7-CD95ChiCD28/ en circulaci6n, lo que indica que el efecto del mAb anti-MAdCAM 7.16.6 es especffico para linfocitos T que se dirigen al intestino. Los efectos de mAb anti-MAdCAM 7.16.6, en cynomolgus, en poblaciones de linfocitos (α4)β7/ en circulaci6n indican que esta es una prueba sustituta s6lida de biomarcador del mecanismo, particularmente en el contexto de aplicaci6n practica en una situaci6n clfnica.
Secuencias
SEC ID N°: 1-48 y 51-68 proporcionan secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de las cadenas pesada y ligera kappa para doce anticuerpos anti-MAdCAM humanos, secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de secuencias de dominio de uni6n a α4β7 de MAdCAM de cynomolgus y secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de cinco anticuerpos anti-MAdCAM humanos modificados.
SEC ID N°: 1-48 proporcionan las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de cadena ligera kappa y pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales humanos: 1.7.2 (SEC ID N°: 1-4), 1.8.2 (SEC ID N°: 5-8), 6.14.2 (SEC ID N°: 9-12), 6.22.2 (SEC ID N°: 13-16), 6.34.2 (SEC ID N°: 17-20), 6.67.1 (SEC ID N°: 21-24), 6.73.2 (SEC ID N°: 25-28), 6.77.1 (SEC ID N°: 29-32), 7.16.6 (SEC ID N°: 33-36), 7.20.5 (SEC ID N°: 37-40), 7.26.4 (SEC ID N°: 41-44) y 9.8.2 (SEC ID N°: 45-48).
SEC ID N°: 49-50 proporcionan la secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de un dominio de uni6n a α4β7 de MAdCAM de cynomolgus.
SEC ID N°: 51-68 proporcionan las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de cadena ligera kappa y pesada para los anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales modificados: 6.22.2 (SEC ID N°: 51-54), 6.34.2 modificado (SEC ID N°: 55-58), 6.67.1 modificado (SEC ID N°: 59-62), 6.77.1 modificado (SEC ID N°: 63-66) y las secuencias de nucle6tidos y aminoacidos de cadena ligera kappa de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal modificado: 7.26.4 modificado (SEC ID N°: 67-68).
SEC ID N°: 70-106 y 108-110 proporcionan diversas secuencias de cebadores.
La presente divulgaci6n describe:
R1. Un anticuerpo monoclonal humano o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a molecula de adhesi6n celular mucosa adresina (MAdCAM)
R2. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1, poseyendo dicho anticuerpo o parte al menos una de las siguientes propiedades:
(a)
se une a celulas humanas;
(b)
tiene una selectividad por MAdCAM frente a VCAM o fibronectina de al menos 100 veces;
(c)
se une a MAdCAM humana con una Kd de 3 x 10-10 M o menos;
(d)
inhibe la uni6n de celulas que expresan α4β7 a MAdCAM humana.
(e)
inhibe el reclutamiento de linfocitos a tejido linfoide gastrointestinal.
R3. El anticuerpo monoclonal humano o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R2, en el que dicho anticuerpo o parte se une a MAdCAM humana con una Kd de 3 x 10-10 M o menos e inhibe la uni6n deα4β7 a MAdCAM humana.
R4. Una lfnea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con R1, en el que el hibridoma es el hibridoma se selecciona del grupo que consiste en 1.7.2 (Numero de Acceso ECACC 03090901), 1.8.2 (Numero de Acceso ECACC 03090902), 6.14.2 (Numero de Acceso ECACC 03090903),
6.22.2 (Numero de Acceso ECACC 03090904), 6.34.2 (Numero de Acceso ECACC 03090905), 6.67.1 (Numero de Acceso ECACC 03090906), 6.73.2 (Numero de Acceso ECACC 03090907), 6.77.1 (Numero de Acceso ECACC 03090908), 7.16.6 (Numero de Acceso ECACC 03090909), 7.26.4 (Numero de Acceso ECACC 03090911) y 9.8.2 (Numero de Acceso ECACC 03090912).
R5. El anticuerpo monoclonal producido por la lfnea celular de hibridoma de acuerdo con R4 o una parte de uni6n a antfgeno de dicho anticuerpo monoclonal.
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R6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con R5, en el que la lisina C terminal de la cadena pesada se escinde.
R7. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo, de acuerdo con R1 o 5, en el que dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno inhibe la uni6n de MAdCAM humana a α4β7 y en el que el anticuerpo o parte del mismo tiene al menos una de las siguientes propiedades:
(a)
compite de forma cruzada con un anticuerpo de referencia por la uni6n a MAdCAM;
(b)
compite con un anticuerpo de referencia por la uni6n a MAdCAM;
(c)
se une al mismo epftopo de MAdCAM como un anticuerpo de referencia;
(d)
se une a MAdCAM con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo de referencia;
(e)
se une a MAdCAM con sustancialmente la misma tasa de disociaci6n que un anticuerpo de referencia;
seleccionandose el anticuerpo de referencia del grupo que consiste en: anticuerpo monoclonal 1.7.2, anticuerpo monoclonal 1.8.2, anticuerpo monoclonal 6.14.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2, anticuerpo monoclonal 6.34.2, anticuerpo monoclonal 6.67.1, anticuerpo monoclonal 6.73.2, anticuerpo monoclonal 6.77.1, anticuerpo monoclonal 7.16.6, anticuerpo monoclonal 7.20.5, anticuerpo monoclonal 7.26.4, anticuerpo monoclonal 9.8.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.34.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.67.1-mod, anticuerpo monoclonal 6.77.1-mod y anticuerpo monoclonal 7.26.4-mod.
R8. Un anticuerpo monoclonal que se une especfficamente a MAdCAM, seleccionandose el anticuerpo del grupo que consiste en:
(a)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 4, sin las secuencias sefal;
(b)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 6 y SEC ID N°: 8, sin las secuencias sefal;
(c)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 10 y SEC ID N°: 12, sin las secuencias sefal;
(d)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 14 y SEC ID N°: 16, sin las secuencias sefal;
(e)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 18 y SEC ID N°: 20, sin las secuencias sefal;
(f)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 22 y SEC ID N°: 24, sin las secuencias sefal;
(g)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 26 y SEC ID N°: 28, sin las secuencias sefal;
(h)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 30 y SEC ID N°: 32, sin las secuencias sefal;
(i)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 34 y SEC ID N°: 36, sin las secuencias sefal;
(j)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 38 y SEC ID N°: 40, sin las secuencias sefal;
(k)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 42 y SEC ID N°: 44, sin las secuencias sefal;
(l)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 46 y SEC ID N°: 48, sin las secuencias sefal;
(m)un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 52 y SEC ID N°: 54, sin las secuencias sefal;
(n)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 56 y SEC ID N°: 58, sin las secuencias sefal;
(o)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 60 y SEC ID N°: 62,
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sin las secuencias sefal;
(p)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 64 y SEC ID N°: 66, sin las secuencias sefal;
(q)
un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N°: 42 y SEC ID N°: 68, sin las secuencias sefal;
R9. Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo, en el que la cadena pesada de dicho anticuerpo o parte del mismo comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada o en el que la cadena ligera comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod.
R10. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R9, en el que dicho anticuerpo o parte comprende una cadena pesada que utiliza un gen de VH 1-18 humano, un gen de VH 3-15 humano, un gen de VH 3-21 humano, un gen de VH 3-23 humano, un gen de VH 3-30 humano, un gen de VH 3-33 humano y un gen de VH 4-4 humano.
R11. El anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con R10, en el que dicho anticuerpo o parte comprende una cadena ligera que utiliza un gen de VK A2 humano, un gen de VK A3 humano, un gen de VK A26 humano, un gen de VK B3 humano, un gen de VK O12 humano o un gen de VK O18 humano.
R12. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1, en el que la regi6n variable de cadena pesada, la regi6n variable de cadena ligera o ambas son al menos 90 % identicas en secuencia de aminoacidos a la regi6n o regiones correspondientes de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: . anticuerpo monoclonal 1.7.2, anticuerpo monoclonal 1.8.2, anticuerpo monoclonal 6.14.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2, anticuerpo monoclonal 6.34.2, anticuerpo monoclonal 6.67.1, anticuerpo monoclonal 6.73.2, anticuerpo monoclonal 6.77.1, anticuerpo monoclonal 7.16.6, anticuerpo monoclonal 7.20.5, anticuerpo monoclonal 7.26.4, anticuerpo monoclonal 9.8.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.34.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.67.1-mod, anticuerpo monoclonal 6.77.1-mod y anticuerpo monoclonal 7.26.4-mod.
R13. Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, en el que:
(a)
la cadena pesada comprende las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod.
(b)
la cadena ligera comprende las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod.
(c)
el anticuerpo comprende una cadena pesada de (a) y una cadena ligera de (b); y
(d)
el anticuerpo de (c) en el que las secuencias de aminoacidos de CDR de cadena pesada y cadena ligera se seleccionan del mismo anticuerpo de referencia.
R14. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R13, en el que la cadena pesada, la cadena ligera o ambas comprenden la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada, la cadena ligera o ambas, respectivamente, del anticuerpo de referencia.
R15. El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R13, en el que dicho anticuerpo comprende:
(a)
una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de regi6n variable de cadena pesada de un anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en: 1.7.2 (SEC ID N°: 2); 1.8.2 (SEC ID N°: 6); 6.14.2 (SEC ID N°: 10); 6.22.2 (SEC ID N°: 14); 6.34.2 (SEC ID N°: 18); 6.67.1 (SEC ID N°: 22); 6.73.2 (SEC ID N°: 26); 6.77.1 (SEC ID N°: 30); 7.16.6 (SEC ID N°: 34); 7.20.5 (SEC ID N°: 38); 7.26.4 (SEC ID N°: 42); y 9.8.2 (SEC ID N°: 46); 6.22.2-mod (SEC ID N°: 52); 6.34.2-mod (SEC ID N°: 56); 6.67.1-mod (SEC ID N°: 60);
6.77.1 (SEC ID N°: 64); y 7.26.4 (SEC ID N°: 42);
(b)
una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de regi6n variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en: 1.7.2 (SEC ID N°: 4); 1.8.2 (SEC ID N°: 8); 6.14.2 (SEC ID N°: 12); 6.22.2 (SEC ID N°: 16); 6.34.2 (SEC ID N°: 20); 6.67.1 (SEC ID N°: 24); 6.73.2 (SEC ID N°: 28);
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6.77.1 (SEC ID N°: 32); 7.16.6 (SEC ID N°: 36); 7.20.5 (SEC ID N°: 40); 7.26.4 (SEC ID N°: 44); y 9.8.2 (SEC ID N°: 48); 6.22.2-mod (SEC ID N°: 54); 6.34.2-mod (SEC ID N°: 58); 6.67.1-mod (SEC ID N°: 62);
6.77.1 (SEC ID N°: 66); y 7.26.4 (SEC ID N°: 68); o
(c) la cadena pesada de (a) y la cadena ligera de (b).
R16. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-15 que es una molecula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo biespecffico.
R17. La parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1-3, 5-7 y 9-16 que es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fvo un anticuerpo de cadena sencilla.
R18. Una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
R19. Un metodo para tratar enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 en el dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno inhibe la uni6n de MAdCAM a α4β.
R20. El metodo de R19, en el que la enfermedad inflamatoria es enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal.
R21. El metodo de R20, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de los divertfculos, gastritis, enfermedad del hfgado, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante.
R22. El metodo de R20, en el que la enfermedad inflamatoria del intestino es enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o ambas.
R23. El metodo de R20, en el que las enfermedades inflamatorias son diabetes insulino-dependiente y enfermedad de injerto contra huesped.
R24. Una lfnea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo o de dicha parte del mismo.
R25. La lfnea celular de acuerdo con R4 o 24 que produce un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 o un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos de uno de dichos anticuerpos.
R26. La lfnea celular de acuerdo con R25 que produce un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: .6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod o un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoacidos de uno de dichos anticuerpos.
R27. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma o la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y5-17.
R28. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de acuerdo con R27, en el que el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de la expresi6n unida operativamente a la molecula de acido nucleico.
R29. Una celula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con R28 o la molecula de acido nucleico de acuerdo con R27.
R30. Una celula hospedadora de acuerdo con R29 que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17.
R31. Un metodo para producir un anticuerpo monoclonal humano o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende cultivar la celula hospedadora de acuerdo con R29 o R30
o la lfnea celular de acuerdo con R4 6 25 en condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno.
R32. Un animal transgenico no humano o planta transgenica que comprende (a) molecula de acido nucleico
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que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma; (b) una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma; o (c) tanto (a) como (b) de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de R1-3 a R5-17, en el que el animal transgenico no humano o planta transgenica expresa dicha cadena pesada o cadena ligera o ambas.
R33. Un metodo para aislar un anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo del animal transgenico no humano o planta transgenica de acuerdo con R32.
R34. Un metodo para tratar a un sujeto que lo necesite con un anticuerpo humano o parte de uni6n a antfgeno que se une especfficamente a MAdCAM e inhibe la uni6n a α4β7 que comprende las etapas de:
(a)
administrar una cantidad eficaz de una molecula de acido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma, una molecula de acido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma o moleculas de acido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pasada o partes de uni6n a antfgeno de las mismas; y
(b)
expresar la molecula de acido nucleico.
R35. Un metodo para producir un anticuerpo monoclonal humano que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende las etapas de:
(a)
inmunizar un animal transgenico no humano que es capaz de producir anticuerpos humanos con MAdCAM, con una parte inmunogenica de MAdCAM o con celula o tejido que expresa MAdCAM; y
(b)
permitir que el animal transgenico monte una respuesta inmune a MAdCAM
R36. Un anticuerpo monoclonal humano producido por el metodo de acuerdo con R35.
R37. Un metodo para inhibir la uni6n de α4β7 a celulas que expresan MAdCAM humana que comprende poner en contacto las celulas con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o una parte de uni6n a antfgeno del mismo.
R38. Un metodo para inhibir adhesi6n de celulas endoteliales-leucocitos mediada por MAdCAM que comprende poner en contacto las celulas endoteliales con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y5-17 o una parte de uni6n a antfgeno del mismo.
R39. Un metodo para inhibir adhesi6n, migraci6n e infiltraci6n en tejidos de leucocitos mediadas por MAdCAM que comprende la etapa de poner en contacto las celulas endoteliales con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o una parte de uni6n a antfgeno del mismo.
R40. Un metodo para inhibir adhesi6n celular dependiente de MAdCAM/α4β7 que comprende la etapa de poner en contacto celulas que expresan MAdCAM humana con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y5-17 o una parte de uni6n a antfgeno del mismo.
R41. Un metodo para inhibir el reclutamiento de linfocitos mediado por MAdCAM a tejido linfoide gastrointestinal que comprende la etapa de poner en contacto celulas que expresan MAdCAM humana con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o una parte de uni6n a antfgeno del mismo.
R42. Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, comprendiendo dicho anticuerpo o parte del mismo una o mas de una secuencia de aminoacidos de FR1, FR2, FR3 o FR4 de un anticuerpo monoclonal humano seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod.
R43. El anticuerpo monoclonal humano o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con R1, comprendiendo el anticuerpo:
(a)
una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod;
(b)
una secuencia de aminoacidos de cadena ligera que es al menos 90 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod;
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(c)
tanto (a) como (b); o
(d)
(a), (b) o (c), con o sin la secuencia sefal.
R44. Un metodo para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humana soluble en circulaci6n que comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biol6gica con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y5-17 o parte de uni6n a antfgeno y (2) detectar la uni6n.
R45. Un metodo para detectar inflamaci6n en un sujeto que comprende las etapas de: (1) administrar a dicho sujeto el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 en el que dicho anticuerpo o parte del mismo se marca de forma detectable y (2) detectar la uni6n.
R46. Un kit de diagn6stico que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o parte de uni6n a antfgeno.
R47. La composici6n farmaceutica de acuerdo con R18 que comprende adicionalmente uno o mas agentes anti inflamatorios o inmunomoduladores adicionales.
R48. La composici6n farmaceutica de acuerdo con R47, en la que el o los agentes anti inflamatorios o inmunomoduladores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: corticoesteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti TNFα y antagonistas de moleculas de adhesi6n.
R49. Una vacuna que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo humano de la misma de acuerdo con una cualquiera de R1-3 y 5-17 o parte de uni6n a antfgeno y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
R50. La vacuna de acuerdo con R49, siendo la vacuna mucosa.
R51. Un metodo para detectar el efecto de la administraci6n de un anticuerpo anti MAdCAM inhibidor o parte de uni6n a antfgeno del mismo a un sujeto que comprende las etapas de:
(a)
administrar a un sujeto un anticuerpo monoclonal humano que se une especfficamente a MAdCAM; y
(b)
determinar si hay un aumento en los niveles de leucocitos que expresan α4β7 en circulaci6n. R52. El metodo de acuerdo con R51, en el que dichos leucocitos son linfocitos. R53. El metodo de acuerdo con R51, en el que dicho aumento de los niveles de leucocitos que expresan α4β7
en circulaci6n se determina por analisis de FACS.
Clave:
Secuencia sefal: minusculas subrayado
Cambios de aminoacidos en secuencia de anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparaci6n con parentales:
mayusculas subrayado SEC ID N° 1 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 1.7.2
E10150359 25-11-2011
SEC ID N° 2 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 1.7.2
SEC ID N° 3 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 1.7.2
E10150359 25-11-2011
SEC ID N° 4 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 1.7.2
SEC ID N° 5 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 1.8.2
SEC ID N° 6 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 1.8.2
10 SEC ID N° 7 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 1.8.2
SEC ID N° 8 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 1.8.2
SEC ID N° 9 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.14.2
SEC ID N° 10 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.14.2
SEC ID N° 11 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.14.2
SEC ID N° 12 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.14.2
SEC ID N° 13 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.22.2
SEC ID N° 14 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.22.2
SEC ID N° 15 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.22.2
SEC ID N° 16
Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.22.2
SEC ID N° 17 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.34.2
SEC ID N° 18 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.34.2
10 SEC ID N° 19 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2
SEC ID N° 20 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.34.2
SEC ID N° 21 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.67.1
SEC ID N° 22 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.67.1
SEC ID N° 23 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1
SEC ID N° 24 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.67.1
SEC ID N° 25 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.73.2
SEC ID N° 26 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.73.2
SEC ID N° 27 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.73.2
SEC ID N° 28
Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.73.2
SEC ID N° 29 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.77.1
SEC ID N° 30 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 6.77.1
10 SEC ID N° 31 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.77.1
SEC ID N° 32 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 6.77.1
SEC ID N° 33 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 7.16.6
SEC ID N° 34 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.16.6
SEC ID N° 35 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 7.16.6
SEC ID N° 36 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa 7.16.6
SEC ID N° 37 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 7.20.5
SEC ID N° 38 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.20.5
SEC ID N° 39 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 7.20.5
SEC ID N° 40 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 7.20.5
SEC ID N° 41 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 7.26.4
SEC ID N° 42 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 7.26.4
10 SEC ID N° 43 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4
SEC ID N° 44 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 7.26.4
SEC ID N° 45 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 9.8.2
SEC ID N° 46 Secuencia Proteica de Cadena Pesada Predicha de 9.8.2
SEC ID N° 47 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 9.8.2
SEC ID N° 48 Secuencia Proteica de Cadena Ligera Kappa Predicha de 9.8.2
SEC ID N° 49 Secuencia de Nucle6tidos de cadena de uni6n a α4β7 de MAdCAM de cynomolgus
SEC ID N° 50 Secuencia de aminoacidos de dominio de uni6n a α4β7 deMAdCAM de cynomolgus SEC ID N° 51 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Pesada de 6.22.2 Modificada
SEC ID N° 52 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Pesada de 6.22.2 Modificada
SEC ID N° 53 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.22.2 Modificada SEC ID N° 54 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Ligera kappa de 6.22.2 Modificada
SEC ID N° 55 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.34.2 Modificada
SEC ID N° 56 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Pesada de 6.34.2 Modificada SEC ID N° 57 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2 Modificada
SEC ID N° 58 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Ligera Kappa de 6.34.2 Modificada
SEC ID N° 59 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada SEC ID N° 60 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada
SEC ID N° 61 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada SEC ID N° 62
Secuencia de Aminoacidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada
SEC ID N° 63 Secuencia de Nucle6tidos de la Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada
SEC ID N° 64 Secuencia Proteica de Cadena Pesada de 6.67.1 Modificada
10 SEC ID N° 65 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 6.67.1 Modificada SEC ID N° 66 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Ligera Kappa 6.67.1 Modificada
SEC ID N° 67 Secuencia de Nucle6tidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4 Modificada
SEC ID N° 68 Secuencia de Aminoacidos de Cadena Ligera Kappa de 7.26.4 Modificada
LISTADO DE SECUENCIAS
<1100 PFIZER INC. ABGENIX, INC. PFIZER LIMITED
5 <1200 ANTICUERPOS PARA MAdCAM <1300 ABX-PF6 PCT <1400 PCT/US05/000370 <1410 07-01-2005 <1500 60/535.490
10 <1510 09-01-2004 <1600 147 <1700 PatentIn ver. 33 <2100 1 <2110 1392
15 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 1
<2100 2 <2110 463 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 2
<2100 3 <2110 720 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 3
<2100 4 <2110 238 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 4 <2100 5 <2110 1392 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 5 <2100 6 <2110 463 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 6
<2100 7 <2110 720 <2120 ADN
89 <2130 Homo sapiens <4000 7
<2100 8 <2110 238 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 8 <2100 9 <2110 1404 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 9
<2100 13
<2110 1398 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 13
<2100 17 <2110 1410
<2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 17
<2100 20
<2110 236 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 20
<2130 Homo sapiens <4000 24
<2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 27
<4000 28
<210039 <2110 720 <2120 ADN <2130 Homo sapiens <4000 39
<2100 50
<2110 227 <2120 PRT <2130 Macaca fascicularis <4000 50
<2100 54 <2110 233 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 54
<2100 57 <2100 58
<2110 236
<2120 PRT
<2130 Homo sapiens 10 <4000 58
146 <2130 Homo sapiens <4000 61
<4000 65 <2100 68
<2110 239
<2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 68
<2100 69
<2110 14
<2120 PRT
<2130 Secuencia artificial 10 <2200
<2230 Descripci6n de secuencia artificial: peptido sintetico
<4000 69 <2100 70 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 70
<2100 71 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 71
<2100 72 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 72
<2100 73 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 73
<2100 74 <2110 53 <2120 ADN
<2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 74
<2100 75 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 75
<2100 76 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 76
<2100 77 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 77
<2100 78 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200
<2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico
<4000 78
<2100 79 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 79
<2100 80 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 80
<2100 81 <2110 53 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 81
<2100 82 <2110 44 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 82
<2100 83 <2110 43
<2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 83
<2100 84 <2110 44 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 84
<2100 85 <2110 44 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 85
<2100 86 <2110 44 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 86
<2100 87 <2110 27 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 87
<2100 88 <2110 27 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 88
<2100 89 <2110 24 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 89
<2100 90 <211047 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 90
<2100 91 <2110 47 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 91
<2100 92 <2110 48
<2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 92
<2100 93 <2110 48 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <400093
<2100 94 <2110 31 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 94
<2100 95 <2110 31 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 95
<2100 96 <2110 45 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 96
<2100 97 <2110 45 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 97
<2100 98 <2110 45 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 98
<2100 99 <2110 45 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 99
<2100 100 <2110 21 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 100
<2100 101 <2110 30
<2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 101
<2100 102 <2110 30 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 102
<2100 103 <2110 47 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 103
<2100 104 <2110 47 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 104
<2100 105 <2110 24 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 105
<2100 106
5 <2110 24
<2120 ADN
<2130 Secuencia artificial
<2200
<2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico 10 <4000 106
<2100 107 <2110 543 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 107
<2100 108 <2110 23 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 108 <2100 109
<2110 24 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 109
<2100 110 <2110 28 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 110
<2100 111 <2110 21 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 111
<2100 112 <2110 21 <2120 ADN <2130 Secuencia artificial <2200 <2230 Descripci6n de secuencia artificial: Cebador sintetico <4000 112
<2100 113 <2110 116 <2120 PRT <2130 Homo sapiens
<4000 113
<2100 135 <2110 8
10 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 135
<2100 136
15 <2110 9 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 136
20 <2100 137 <2110 9 <2120 PRT <2130 Homo sapiens
<4000 137
<2100 138 <2110 9 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 138
<2100 139 <2110 9 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 139
<2100 140 <2110 8 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 140
<2100 141 <2110 8 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 141
<2100 142 <2110 8 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 142 <2100 143
<2110 7 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 143
<2100 144 <2110 7 <2120 PRT <2130 Homo sapiens . <4000 144
<2100 145 <2110 7 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 145
<2100 146 <2110 8 <2120 PRT <2130 Homo sapiens <4000 146
<2100 147 <2110 15 <2120 PRT <2130 Secuencia artificial <2200
<2230 Descripci6n de secuencia artificial: peptido enlazador sintetico <4000 147

Claims (45)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 2,35x1011 M o menos segun se mide por resonancia de plasm6n superficial e inhibe la uni6n de MAdCAM humana a α4β7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y en el que la cadena ligera del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencia de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de Acceso de ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  2. 2.
    Un anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM con una Kd de 2,35x1011 M o menos segun se mide por resonancia de plasm6n superficial e inhibe la uni6n de MAdCAM humana a α4β7, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera del anticuerpo
    o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, CDR2 y CDR3 en SEC ID N°: 36.
  3. 3.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 1 6 2, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena pesada que utiliza un gen VH 1-18 humano.
  4. 4.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 1 6 2, en el que el anticuerpo o parte comprende una cadena ligera que utiliza un gen VK A2 humano.
  5. 5.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 1 en el que dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos FR1, FR2, FR3 y FR4 del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  6. 6.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en el que dicho anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos FR1, FR2, FR3 y FR4 en SEC ID N°: 34 o SEC ID N°: 36.
  7. 7.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que la cadena pesada y la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoacidos del comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  8. 8.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno, en el que los dominios variables de cadena pesaday cadena ligera del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  9. 9.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 8, que comprende las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  10. 10.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal humano producido por el hibridoma de Numero de Acceso de ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  11. 11.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 8, que comprende las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal producido por hibridoma 03090909 (designaci6n interna 7.16.6) en el que la lisina C terminal de la cadena pesada se escinde.
  12. 12.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicaci6n 2 en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos desde el comienzo de la CDR1 hasta el final de la CDR3 en SEC ID N°: 4.
  13. 13.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno, en el que la cadena pesada del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada en SEC ID N°: 34 y la cadena ligera del anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo comprende la secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera en SEC ID N°: 36.
  14. 14.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicaci6n 13, que comprende las secuencias de aminoacidos expuestas en SEC ID N° 34 y 36 sin las secuencias sefal.
  15. 15.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicaci6n 13, que comprende las secuencias de aminoacidos
    expuestas en SEC ID N° 34 y 36 sin las secuencias sefal y en el que la lisina C terminal de la cadena pesada se escinde.
  16. 16.
    Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una molecula de inmunoglobulina G (IgG), una IgM, una IgE, una IgA o una IgD o un anticuerpo biespecffico.
  17. 17.
    Una parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que es un fragmento de Fab, un fragmento de F(ab')2, un fragmento Fv o un anticuerpo de cadena sencilla.
  18. 18.
    Una composici6n farmaceutica que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  19. 19.
    La composici6n farmaceutica de acuerdo con R18 que comprende adicionalmente uno o mas agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales.
  20. 20.
    La composici6n farmaceutica de acuerdo con la reivindicaci6n 19, en la que el o los agentes antiinflamatorios o inmunomoduladores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en corticosteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK306, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNFα y antagonistas de molecula de adhesi6n.
  21. 21.
    Una vacuna que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  22. 22.
    La vacuna de acuerdo con la reivindicaci6n 21, siendo la vacuna mucosa.
  23. 23.
    Un kit de diagn6stico que comprende el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
  24. 24.
    Una lfnea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal humano que se une especfficamente a Molecula de Adhesi6n Celular Mucosa Adresina (MAdCAM), en la que el hibridoma es hibridoma de Numero de Acceso ECACC 03090909 (designaci6n interna 7.16.6).
  25. 25.
    Una lfnea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
  26. 26.
    La lfnea celular de acuerdo con la reivindicaci6n 25 que produce el anticuerpo de la reivindicaci6n 9 6 14.
  27. 27.
    Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucle6tidos que codifica un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
  28. 28.
    Un vector que comprende la molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 27.
  29. 29.
    Una celula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con la reivindicaci6n 28 o la molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 27.
  30. 30.
    Una celula hospedadora que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma del anticuerpo monoclonal o una parte de uni6n a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
  31. 31.
    Un metodo para producir un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende cultivar la celula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones 29
    o 30 o la lfnea celular de acuerdo con las reivindicaciones 24 6 25 en condiciones adecuadas y recuperar el anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno.
  32. 32.
    Un animal transgenico no humano o planta transgenica que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la cadena pesada o una parte de uni6n a antfgeno de la misma y una molecula de acido nucleico que codifica la cadena ligera o una parte de uni6n a antfgeno de la misma de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que los polipeptidos de cadena pesada y cadena ligera o partes codificados por las moleculas de acido nucleico se expresan.
  33. 33.
    Un metodo para aislar un anticuerpo o parte de uni6n a antfgeno del mismo que se une especfficamente a MAdCAM, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo o parte del animal transgenico no humano o planta transgenica de acuerdo con la reivindicaci6n 32.
  34. 34.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el anticuerpo o parte inhibe la uni6n de MAdCAM a α4β7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite.
  35. 35.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de la reivindicaci6n 34, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal.
  36. 36.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de la reivindicaci6n 35; en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepatica, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante.
  37. 37.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de la reivindicaci6n 35, en el que la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal es enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
  38. 38.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de la reivindicaci6n 34, en el que la enfermedad inflamatoria es diabetes insulinodependiente o enfermedad de injerto contra hospedador.
  39. 39.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el anticuerpo o parte se marca de forma detectable, para su uso en detecci6n de inflamaci6n en un sujeto.
  40. 40.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en la determinaci6n de si existe un aumento en el nivel de leucocitos que expresan α4β7 en circulaci6n y de este modo detectar el efecto de la administraci6n de un anticuerpo inhibidor anti-MAdCAM o parte de uni6n a antfgeno del mismo a un sujeto.
  41. 41.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 40, en el que los leucocitos son linfocitos.
  42. 42.
    El anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con la reivindicaci6n 40, en el que el aumento en el nivel de leucocitos que expresan α4β7en circulaci6n se determina por analisis de FACS.
  43. 43.
    Un anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso como un medicamento.
  44. 44.
    Un metodo para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humana soluble en circulaci6n que comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biol6gica con el anticuerpo monoclonal o parte de uni6n a antfgeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y (2) detectar la uni6n del anticuerpo
    o parte a MAdCAM.
  45. 45. Un vector de acuerdo con reivindicaci6n 28, en el que el vector comprende una secuencia de control de la expresi6n unida operativamente a la molecula de acido nucleico.
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Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL228041B1 (pl) 2001-01-05 2018-02-28 Amgen Fremont Inc Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne.
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
NZ582210A (en) * 2003-02-13 2011-04-29 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
EP1664322B1 (en) 2003-05-22 2013-07-10 Fraunhofer USA, Inc. Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides
MX350383B (es) 2004-01-09 2017-09-04 Pfizer Anticuerpos contra madcam.
RU2453558C2 (ru) 2004-09-03 2012-06-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные антагонистические антитела против бета7 и их применение
NZ561137A (en) * 2005-03-08 2011-09-30 Pharmacia & Upjohn Co Llc Stable anti-CTLA-4 antibody compositions with chelating agents
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
JP2009500390A (ja) * 2005-07-08 2009-01-08 ファイザー・リミテッド 新規ＭＡｄＣＡＭ抗体
US20090214527A1 (en) * 2005-07-11 2009-08-27 Gary Burgess Combination Of Anti-Madcam Antibody And Antifibrotic Caspase Inhibitor To Treat Liver Fibrosis
WO2007007151A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema
WO2007007160A2 (en) * 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
WO2007117264A2 (en) 2005-08-03 2007-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Compositions and methods for production of immunoglobulins
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
WO2007114319A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
US7745584B2 (en) * 2006-05-22 2010-06-29 California Institute Of Technology Antibodies to sulfated carbohydrates
EP1878747A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
JP2010503668A (ja) * 2006-09-15 2010-02-04 フラウンホーファー ユーエスエー， インコーポレイテッド インフルエンザ抗体、組成物、および関連する方法
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
US8404252B2 (en) 2007-07-11 2013-03-26 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
US8912149B1 (en) 2007-11-28 2014-12-16 California Institute Of Technology Glycosaminoglycan mimetics
ES2834741T3 (es) 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
CN102124344B (zh) * 2008-05-16 2015-04-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 生物标记用于评估β7整联蛋白拮抗剂治疗胃肠道炎性病症的用途
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010037046A1 (en) 2008-09-28 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
TWI466681B (zh) 2009-03-20 2015-01-01 Amgen Inc α４β７雜二聚體專一性拮抗抗體
MX2011009798A (es) 2009-03-20 2011-12-08 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
BRPI1011145A2 (pt) 2009-05-15 2016-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-axl
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2011041391A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
US20110158982A1 (en) * 2009-10-05 2011-06-30 The Regents Of The University Of Michigan COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING MAdCAM
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
US20130011406A1 (en) * 2010-03-26 2013-01-10 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
SG188591A1 (en) 2010-09-22 2013-04-30 Amgen Inc Carrier immunoglobulins and uses thereof
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
CN102603649B (zh) * 2011-01-20 2016-05-25 赣南师范学院 一种以地巴唑为先导分子的荧光探针化合物及其制备方法
EP2668210B1 (en) 2011-01-26 2020-06-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
MX352889B (es) 2011-02-25 2017-12-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo de fc especifico para fcyriib.
CN103596985B (zh) 2011-04-19 2016-06-08 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
WO2012154987A1 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Nestec Sa Methods of disease activity profiling for personalized therapy management
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
SG11201500489YA (en) 2012-07-25 2015-02-27 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
IL282082B (en) * 2012-08-23 2022-08-01 Seagen Inc Antibody-drug conjugates (adc) binding to 158p1d7 proteins
US9273093B2 (en) 2012-10-11 2016-03-01 Protagonist Therapeutics, Inc. α4β7 peptide dimer antagonists
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
ES2901704T3 (es) 2013-03-15 2022-03-23 Protagonist Therapeutics Inc Análogos de hepcidina y usos de los mismos
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
CN105517571A (zh) 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药
US9770461B2 (en) 2013-08-02 2017-09-26 California Institute Of Technology Tailored glycopolymers as anticoagulant heparin mimetics
US10227370B2 (en) 2013-08-02 2019-03-12 California Institute Of Technology Heparan sulfate/heparin mimetics with anti-chemokine and anti-inflammatory activity
US11427627B2 (en) 2013-09-05 2022-08-30 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
RS58705B1 (sr) 2013-09-20 2019-06-28 Bristol Myers Squibb Co Kombinacija anti-lag-3 antitela i anti-pd-1 antitela za lečenje tumora
EP3050896B1 (en) 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
CA2949237C (en) 2014-05-16 2022-08-23 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
SG10201810321PA (en) 2014-05-16 2018-12-28 Protagonist Therapeutics Inc α4β7 INTEGRIN THIOETHER PEPTIDE ANTAGONISTS
CN113908269A (zh) 2014-05-23 2022-01-11 塞尔德克斯医疗公司 嗜酸性粒细胞或肥大细胞相关病症的治疗
SG10201810154WA (en) 2014-07-17 2018-12-28 Protagonist Therapeutics Inc Oral peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory bowel diseases
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3201217A4 (en) 2014-10-01 2018-07-18 Protagonist Therapeutics Inc. Novel cyclic monomer and dimer peptides having integrin antagonist activity
EP3200812B8 (en) 2014-10-01 2021-04-28 Protagonist Therapeutics, Inc. Novel alpha4beta7 peptide monomer and dimer antagonists
US20170327584A1 (en) 2014-11-26 2017-11-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Vedolizumab for the Treatment of Fistulizing Crohn's Disease
MY183415A (en) 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
CA2916283A1 (en) * 2015-01-09 2016-07-09 Pfizer Inc. Dosage regimen for madcam antagonists
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
BR112017014067B1 (pt) 2015-02-27 2021-01-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha usos de um anticorpo receptor de il-6 para no tratamento de doenças relacionadas a il-6
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
US10787490B2 (en) 2015-07-15 2020-09-29 Protaganist Therapeutics, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
WO2017115773A1 (ja) 2015-12-28 2017-07-06 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
WO2017117411A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Protagonist Therapeutics, Inc. Analogues of hepcidin mimetics with improved in vivo half lives
US20190077868A1 (en) 2016-03-14 2019-03-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating or preventing graft versus host disease
WO2017160699A2 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of preventing graft versus host disease
MX2018010988A (es) 2016-03-14 2019-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmaco terapeutico que induce lesion celular para usarse en terapia de cancer.
CA3017926C (en) 2016-03-23 2023-10-10 Protagonist Therapeutics, Inc. Methods for synthesizing .alpha.4.beta.7 peptide antagonists
WO2017165742A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments
US11760803B2 (en) 2016-03-24 2023-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
KR101877349B1 (ko) 2016-08-05 2018-07-17 농업회사법인 주식회사 한라종합식품 황칠 구운 소금 제조방법
MA47775A (fr) 2017-03-14 2020-01-22 Amgen Inc Contrôle des glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
EP3596108A4 (en) * 2017-03-15 2020-12-23 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNOTOLERANCE
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
BR112019024127A2 (pt) * 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
MX2019012076A (es) 2017-05-30 2019-12-09 Bristol Myers Squibb Co Composiciones que comprenden un anticuerpo anti gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) o un anticuerpo anti-lag-3 y un anticuerpo anti muerte celular programada 1 (pd-1) o anti ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1).
MX2019012032A (es) 2017-05-30 2019-10-30 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de tumores positivos a gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3).
US11162943B2 (en) 2017-05-31 2021-11-02 Prometheus Biosciences Inc. Methods for assessing mucosal healing in Crohn's disease patients
WO2019014572A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Pfizer, Inc. ANTIBODIES DIRECTED AGAINST MADCAM
WO2019051494A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Protagonist Therapeutics, Inc. OPIOID AGONIST PEPTIDES AND USES THEREOF
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
EP3720871A4 (en) * 2017-12-06 2021-09-15 Pandion Operations, Inc. TARGETED IMMUNTOLERANCE
EP3753952A4 (en) 2017-12-13 2022-04-13 XDCExplorer (Shanghai) Co., Ltd. EGFRVIII ANTIBODY AND CONJUGATE, METHOD FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF
WO2019157268A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Protagonist Therapeutics, Inc. Conjugated hepcidin mimetics
IL313983A (en) 2018-03-26 2024-08-01 Amgen Inc Fully fucose-free glycoforms of antibodies are produced in cell culture
WO2020061142A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
EP3972992A4 (en) * 2019-05-20 2023-07-19 Pandion Operations, Inc. ANTI-MADCAM IMMUNE TOLERANCE
MX2022000397A (es) 2019-07-10 2022-04-25 Protagonist Therapeutics Inc Inhibidores peptídicos del receptor de interleucina-23 y su uso para tratar enfermedades inflamatorias.
CA3152547A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN110887966B (zh) * 2019-12-17 2021-02-12 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
WO2021146454A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Janssen Biotech, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
US11845808B2 (en) 2020-01-15 2023-12-19 Janssen Biotech, Inc. Peptide inhibitors of interleukin-23 receptor and their use to treat inflammatory diseases
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN111714781B (zh) * 2020-06-24 2022-08-05 北京夏禾科技有限公司 一种牙齿美白组合及其使用方法
EP4229080A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
WO2022109328A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Janssen Pharmaceutica Nv Compositions of peptide inhibitors of interleukin-23 receptor
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
IL309631A (en) * 2021-06-21 2024-02-01 Roussy Inst Gustave Methods for diagnosing cancer- or antibiotic-induced dysbiosis and their use for improving cancer treatment by immunotherapy
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US12112433B2 (en) * 2022-04-06 2024-10-08 Qualcomm Incorporated Apparatus and methods for image reconstruction using machine learning processes
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20240166746A1 (en) 2022-11-22 2024-05-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited DOSAGE REGIMEN OF MAdCAM-1 ANTIBODY FOR TREATMENT OF NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5151540A (en) * 1986-11-26 1992-09-29 Hoechst Celanese Corporation Thio carbamates and their derivatives
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US20040010810A1 (en) 1990-01-12 2004-01-15 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE352612T1 (de) 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5462990A (en) * 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
ATE363532T1 (de) 1991-03-01 2007-06-15 Dyax Corp Verfahren zur herstellung bindender miniproteine
ES2315612T3 (es) 1991-04-10 2009-04-01 The Scripps Research Institute Genotecas de receptores heterodimericos usando fagemidos.
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69331089T2 (de) 1992-02-18 2002-07-18 Otsuka Kagaku K.K., Osaka Beta-Laktam und Cepham Verbindungen und Ihre Herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
WO1994013312A1 (en) 1992-12-15 1994-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mucosal vascular addressin, dna and expression
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US7803904B2 (en) 1995-09-01 2010-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressing and uses thereof
US7750137B2 (en) 1995-09-01 2010-07-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Mucosal vascular addressins
DE69637155T2 (de) 1995-02-10 2008-02-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge Addressine der schleimhaut und der blutgefässe und ihre verwendung
US6551593B1 (en) 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
WO1996033266A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic dna deletions
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69636868T2 (de) 1995-08-29 2007-10-25 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimäres tier und methode zu dessen herstellung
US6037324A (en) 1996-01-04 2000-03-14 Leukosite, Inc. Inhibitors of MAdCAM-1-mediated interactions and methods of use therefor
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US7147851B1 (en) 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US7090845B2 (en) 1998-05-13 2006-08-15 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
WO1999058573A1 (en) * 1998-05-13 1999-11-18 Genentech, Inc. Diagnosis and treatment of hepatic disorders
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
CZ303703B6 (cs) 1998-12-23 2013-03-20 Pfizer Inc. Monoklonální protilátka nebo její antigen-vázající fragment, farmaceutická kompozice obsahující tuto protilátku nebo fragment, bunecná linie produkující tuto protilátku nebo fragment, zpusob prípravy této protilátky, izolovaná nukleová kyselina kóduj
EP1212407A4 (en) 1999-09-03 2003-04-02 Human Genome Sciences Inc POLYNUCLEOTIDES, POLYPEPTIDES, AND ANTIBODIES OF THE IMMUNOGLOBULIN SUPERFAMILY
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
JP2003089656A (ja) * 2001-09-19 2003-03-28 Nippon Kayaku Co Ltd 移植による免疫反応抑制剤
CA2466034C (en) 2001-11-08 2012-12-18 Protein Design Labs, Inc. Stable aqueous pharmaceutical formulations of daclizumab antibodies
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
IL163725A0 (en) 2002-02-25 2005-12-18 Elan Pharm Inc Administration of agents for the treatment of inflammation
WO2004081049A1 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 Auckland Uniservices Limited Monoclonal antibodies that recognise mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (madcam-1), soluble madcam-1 and uses thereof
PL1610820T5 (pl) 2003-04-04 2014-01-31 Genentech Inc Preparaty zawierające wysokoskoncentrowane przeciwciała i białka
MX350383B (es) 2004-01-09 2017-09-04 Pfizer Anticuerpos contra madcam.
EP2394652A3 (en) 2004-02-06 2012-10-24 Elan Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating tumors and metastatic disease
NZ561137A (en) 2005-03-08 2011-09-30 Pharmacia & Upjohn Co Llc Stable anti-CTLA-4 antibody compositions with chelating agents
US20100119517A1 (en) 2005-07-08 2010-05-13 Pfizer Inc Use of Anti-MAdCAM Antibodies for the Treatment of Coeliac Disease and Tropical Sprue
JP2009500390A (ja) 2005-07-08 2009-01-08 ファイザー・リミテッド 新規ＭＡｄＣＡＭ抗体
WO2007007152A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat metastatic cancers and chloroma
WO2007007159A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat uterine disorders
WO2007007151A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Use of anti-mad-cam antibody for the treatment of emphysema
WO2007007160A2 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Pfizer Limited Anti-madcam antibodies to treat fever
US20090214527A1 (en) 2005-07-11 2009-08-27 Gary Burgess Combination Of Anti-Madcam Antibody And Antifibrotic Caspase Inhibitor To Treat Liver Fibrosis

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