MXPA06007843A - Anticuerpos contra madcam. - Google Patents

Anticuerpos contra madcam.

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MXPA06007843A
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MX
Mexico
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antibody
madcam
seq
mod
human
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Application number
MXPA06007843A
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Larry L Green
Sirid-Aimee Kellermann
Mary Haak-Frendscho
Nicholas Pullen
Elizabeth Mdloy
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Pfizer
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Publication date
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Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos que incluyen anticuerpos humanos y porciones que ligan antigeno de los mismos que se ligan especificamente a MAdCAM, preferentemente a MAdCAM humano y que funcionan para inhibir MAdCAM. La invencion tambien se refiere a anticuerpos anti- MAdCAM humanos y porciones que ligan antigeno de los mismos. La invencion tambien se refiere a anticuerpos que son quimericos, biespecificos, derivatizados, anticuerpos de cadena simple o porciones de proteinas de fusion. la invencion tambien se refier a inmunoglobulinas aisladas de cadena pesada y liviana derivadas de anticuerpos anti- MAdCAM humanos y a moleculas de acido nucleico que codifican tales inmunoglobulinas. La presente invencion tambien se refiere a metodos para fabricar anticuerpos anti- MAdCAM humanos, a composiciones que comprenden estos anticuerpos y a metodos para usar los anticuerpos y composiciones para diagnostico y tratamiento. La invencion tambien provee metodos de terapia con genes que usan moleculas de acido nucleico que codifican la cadena pesada y/o liviana de moleculas de inmunoglobulina que comprenden los anticuerpos anti- MAdCAM humanos. La invencion tambien se refiere a plantas o animales transgenicos que comprenden moleculas de acido nucleico de la invencion.

Description

ANTICUERPOS CONTRA MAdCAM Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional estadounidense 60X535,490, presentada el dia 9 de enero de 2004. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La molécula de adhesión celular de adresina mucosal (M?dCAM) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de receptores de adhesión celular. La selectividad de linfocitos que se dirigen a un tejido linfoide especializado y a sitios mucosales del tracto gastrointestinal está determinada por la expresión endotelial de MAdCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80:413-422 (1994); Berlin, C, et al., Cell, 74:185-195 (1993); y Erle, D.J., et al., J. Immunol . , 153: 517-528 (1994)). MAdCAM es expresado exclusivamente sobre la superficie celular de vénulas endoteliales altas de tejido linfoide intestinal organizado, tales como los parches de Peyer y nodos linfáticos mesentéricos (Streeter et al , Nature. 331:41-6 (1988); Nakache et al., Na ture, 337:179-81 (1989); Briskin et al. , Am . J. Pathol . 151-97-110 (1997)), pero también en otros órganos linfoides, tales como páncreas, vesícula biliar y vénulas esplénicas y el seno marginal de la pulpa blanca del bazo (Briskin et al. (1997), supra; Kraal et al. , Am . J. Pa th . , 147: 763-771 (1995)). Mientras que MAdCAM juega un rol fisiológico en la vigilancia de la inmunidad del intestino, parece facilitar una extravasación excesiva de linfocitos en la enfermedad inflamatoria del intestino bajo condiciones de inflamación crónica del tracto intestinal. TNFa y otras citoquinas pro- inflamatorias aumentan la expresión de MAdCAM endotelial y, en muestras de biopsia sacadas de pacientes con enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, hay un aumento focal de aproximadamente 2-3 veces de la expresión de MAdCAM en los sitios de inflamación (Briskin et al. (1997), Souza et al., Gut, 45:856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int . , 52:367-74 (2002) ) . En modelos experimentales de colitis se observaron pautas similares de expresión elevada (Hesterberg et al. , Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol . , 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol . , 65:349-55 (1999); Kato et al. , J Pharmacol Exp Ther. , 295:183-9 (2000); Hokari et al . , Clin Exp Im unol . , 26:259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol . , 281:G1309-15 (2001)). En otros modelos preclinicos de condiciones inflamatorias, tales como diabetes insulina-dependiente (Yang et al. Diabetes, 46:1542-7 (1997); Hanninen et al., J Immunol . , 160:6018-25 (1998)), enfermedad de injerto versus hospedante (Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol . , 38:437-42 (2003), Murai et al. , Nat I munol . , 4:154-60 (2003)), enfermedad hepática crónica (Hillan et al., Liver, 19:509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33:1065-72 (2001)), encefalopatía inflamatoria (Stalder et al., Am J Pathol . , 153:767-83 (1998); Kanawar et al. , Im unol Cell Biol . , 78:641-5 (2000)), y gastritis (Barrett et al. , J Leukoc Biol . , 67:169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin Exp Immunol . , 130:183-9 (2002)), también hay un despertar de la expresión de MAdCAM fetal y una participación de linfocitos o¡ß7+ activados en la patogénesis de la enfermedad. En estos modelos de inflamación, tanto como los modelos de colitis de ratón mediada por hapteno (por ejemplo, TNBS, DSS, etc.) o por transferencia adoptiva (CD4+CD45Rbaltas) , el anticuerpo monoclonal (mAb) MAdCAM antiratón de rata, MECA-367, que bloquea la ligadura de los linfocitos a4ß7+ a MAdCAM, reduce el reclutamiento de linfocitos, la extravasación al tejido, la inflamación y la severidad de la enfermedad. También se ha informado sobre anticuerpos monoclonales (mAbs) de ratón contra MAdCAM humano (vea, por ej emplo, WO 96/24673 y WO 99/58573) . Dado el rol de MAdCAM en la enfermedad inflamatoria del intestino (inflammatory bo el disease = IBD) y otras enfermedades inflamatorias asociadas con el tracto gastrointestinal u otros tejidos, es deseable proveer un medio para inhibir la ligadura de a4ß7 y el reclutamiento de leucocitos mediado por MAdCAM. Seria además deseable que tales medios terapéuticos tengan propiedades ventajosas incluyendo, pero no estando limitadas a, la ausencia de interacciones no deseadas con otras medicaciones en pacientes y propiedades fisico-quimicas favorables tales como valores pK/pD en humanos, solubilidad, estabilidad, vida de estante y vida media in vivo . Una proteina terapéutica, tal como un anticuerpo, estarla ventajosamente libre de modificaciones no deseadas después de la traducción o formación de agregados. Por lo tanto, existe una necesidad critica por anticuerpos terapéuticos anti-MAdCAM. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un anticuerpo aislado que liga específicamente MAdCAM, donde al menos las secuencias CDR (secuencias de la región determinante complementaria) de dicho anticuerpo son secuencias CDR humanas, o una porción que liga antigeno de dicho anticuerpo. En algunas modalidades el anticuerpo es un anticuerpo humano, preferentemente un anticuerpo que actúa como un antagonista de MAdCAM. También se proveen composiciones que comprenden dichos anticuerpos o porciones. La invención también provee una composición que comprende la cadena pesada y/o liviana de dicho anticuerpo antagonista anti-MAdCAM o la región variable u otra porción que liga antigeno del mismo o moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de la invención pueden comprender además otro componente, tal como un agente terapéutico o un agente diagnóstico. La invención también provee métodos diagnósticos y terapéuticos. La invención provee además una linea celular aislada, que produce dicho anticuerpo anti-MAdCAM o una porción que liga antigeno del mismo. La invención también provee moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y/o liviana de dicho anticuerpo anti-MAdCAM o la región variable del mismo o la porción que liga antigeno del mismo. La invención provee vectores y células hospedantes que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, asi como métodos para producir recombinantemente los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico. También se proveen plantas o animales transgénicos no humanos que expresan la cadena pesada y/o liviana de dicho anticuerpo anti-MAdCAM, o la porción que liga antigeno del mismo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una alineación de las secuencias de aminoácidos previstas de las regiones variables de la cadena pesada y liviana kappa de doce anticuerpos monoclonales anti-M?dCAM con las secuencias de aminoácidos de la linea germinal de los genes humanos correspondientes . La Figura 1A muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 con el producto génico VH 3-15 humano de la linea germinal .
La Figura IB muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.14.2 con el producto génico VH 3-23 humano de la linea germinal . La Figura 1C muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.22.2 con el producto génico VH 3-33 humano de la linea germinal . La Figura ID muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.34.2 con el producto génico VH 3-30 humano de la linea germinal . La Figura 1E muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.67.1 con el producto génico VH 4-4 humano de la linea germinal . La Figura 1F muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.73.2 con el producto génico VH 3-23 humano de la linea germinal . La Figura 1G muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 6.77.1 con el producto génico VH 3-21 humano de la linea germinal . La Figura 1H muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 con el producto génico VH 1-18 humano de la linea germinal . La Figura II muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 7.20.5 con el producto génico VH 4-4 humano de la linea germinal . La Figura 1J muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena pesada para el anticuerpo 9.8.2 con el producto génico VH 3-33 humano de la linea germinal . La Figura 1K muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para los anticuerpos 1.7.2 y 1.8.2 con el producto génico A3 humano de la linea germinal. La Figura 1L muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.14.2 con el producto génico 012 humano de la linea germinal. La Figura 1M muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.22.2 con el producto génico A26 humano de la linea germinal. La Figura 1N muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.34.2 con el producto génico 012 humano de la linea germinal. La Figura 10 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.67.1 con el producto génico B3 humano de la linea germinal. La Figura 1P muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.73.2 con el producto génico 012 humano de la linea germinal. La Figura 1Q muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 6.77.1 con el producto génico A2 humano de la linea germinal . La Figura IR muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para los anticuerpos 7.16.6 y 7.26.4 con el producto génico A2 humano de la linea germinal. La Figura 1S muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 7.20.5 con el producto génico A3 humano de la linea germinal. La Figura 1T muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de la cadena liviana kappa para el anticuerpo 9.8.2 con el producto génico 018 humano de la linea germinal . La Figura 2 muestra alineaciones CLUSTAL de las secuencias de aminoácidos previstas de la cadena pesada y liviana kappa de anticuerpos anti-MAdCAM humanos. La Figura 2A muestra una alineación CLUSTAL y el árbol de ramificaciones de las secuencias de aminoácidos previstas de las cadenas livianas kappa, mostrando el grado de similitud entre las cadenas livianas kappa de los anticuerpos anti- MAdCAM. La Figura 2B muestra una alineación CLUSTAL y el árbol de ramificaciones de las secuencias de aminoácidos pesadas previstas, mostrando el grado de similitud entre las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-MAdCAM. La Figura 3 es una alineación CLUSTAL de secuencias de aminoácidos de los dominios terminales 2 N de MAdCAM cynomolgus y humano que forman el dominio que liga aß7. Las cadenas ß están alineadas de acuerdo con Tan et al., Structure (1998) 6, 793-801. La Figura 4 es un gráfico que representa los efectos de varias dosis de 1.7.2 y 7.16.6 biotinilados purificados sobre la adhesión de linfocitos de sangre periférica humana a secciones congeladas del endotelio del higado humano que expresa M?dCAM. La Figura 5 muestra una representación gráfica bidimensional, basada en los datos de la Tabla 7, de la diversidad de los epitopes MAdCAM a los cuales se ligan los anticuerpos MAdCAM 1.7.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2. Los anticuerpos anti-MAdCAM dentro del mismo circulo muestran el mismo modelo de reactividad, pertenecen al mismo grupo de epitopes y reconocen probablemente el mismo epitope sobre MAdCAM. Clones de anticuerpos anti-MAdCAM con circuios superpuestos son incapaces de ligarse simultáneamente y, por lo tanto, probablemente reconocen un epitope solapado sobre MAdCAM. Circuios separados representan clones de anticuerpos anti-MAdCAM con una separación espacial nitida de los epitopes. La Figura 6 muestra datos del análisis sandwich ELISA con los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 7.16.6 marcado con Alexa 488, mostrando que los dos anticuerpos que son capaces de detectar diferentes epitopes sobre MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM soluble con fines diagnósticos. La Figura 7 muestra el efecto de un anticuerpo anti-MAdCAM inhibitorio (1 mg/kg) sobre el número de linfocitos aß+ periféricos circulantes, expresado como el aumento (las veces que aumentó el número de linfocitos) con respecto al efecto de un anticuerpo monoclonal (mAb) IgG2a o un vehículo de control, usando mAb anti-MAdCAM 7.16.6 en un modelo de mono cynomolgus . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y técnicas generales Salvo que se indique lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención tendrán los significados entendidos comúnmente por las personas con conocimientos ordinarios en el arte. Además, siempre que el contexto no requiera lo contrario, los términos en singular deben incluir el plural y los términos en plural deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y- las técnicas de, cultivos celulares y de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en ésta son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en el arte. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en el arte y según lo descrito en varias referencias generales y más especificas que son citadas y discutidas en la presente memoria descriptiva, siempre que no sea indicado de otro modo. Vea, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) , y Harlow y Lañe, Antibodies : A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que son incorporados en ésta por referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, según lo realizado comúnmente en el arte o de acuerdo con lo descrito en ésta. Se usan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes. Los términos siguientes, salvo indicación en contrario, deben entenderse con los significados siguientes: El término "polipéptido" comprende proteínas naturales o artificiales, fragmentos^ proteicos y análogos polipeptidicos de una secuencia proteica. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "proteina aislada" o "polipéptido aislado" significa una proteina o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado natural, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente o (4) no se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula en la cual se origina naturalmente estará "aislado" de los componentes con los que está asociado naturalmente. Una proteina también puede convertirse en una proteina substancialmente libre de componentes con los cuales está asociada naturalmente mediante una aislación, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en el arte. Una proteína o polipéptido es "substancialmente puro", "substancialmente homogéneo" o "substancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido. El polipéptido o proteina puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteina substancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra proteica, más usualmente aproximadamente 95%, y preferentemente tendrá una pureza mayor de 99%. La pureza u homogeneidad de la proteina puede ser indicada por un número de medios bien conocidos en el arte, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteina, seguida por la visualización de una sola banda polipeptídica al colorear el gel con un colorante bien conocido en el arte. Para ciertos propósitos, puede proveerse una resolución mayor usando HPLC u otros medios de purificación bien conocidos en el arte. El término "fragmento polipeptidico", según lo usado en ésta, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción aminoterminal y/o carboxi-terminal, pero cuya secuencia de aminoácidos remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural. En algunas modalidades, los fragmentos tienen una longitud de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos. En otras modalidades, los fragmentos tienen una longitud de al menos 14 aminoácidos, más preferentemente de al menos 20 aminoácidos, usualmente de al menos 50 aminoácidos, aún más preferentemente de al menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos. El término "análogo polipeptidico", según lo usado en ésta, se refiere a un polipéptido que comprende un segmento de al menos 25 aminoácidos que es substancialmente idéntico a una porción de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las propiedades siguientes: (1) ligadura específica a MAdCAM bajo condiciones de ligadura adecuadas, (2) capacidad para inhibir la ligadura de la integrina a4ß y/o la selectina L a M?dCAM, o (3) la capacidad de reducir in vitro o in vivo la expresión de M?dCAM en la superficie celular. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución conservadora (o inserción o deleción) de aminoácidos con respecto a la secuencia que ocurre naturalmente. Análogos tienen típicamente una longitud de al menos 20 aminoácidos, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos o mayor, y muchas veces pueden tener la longitud del polipéptido de longitud completa que ocurre naturalmente . Substituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) modifican la afinidad de ligadura para formar complejos proteicos, (4) modifican afinidades de ligadura, o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias mutaciones de una secuencia diferente a la secuencia peptidica que ocurre normalmente. Por ejemplo, en la secuencia que ocurre normalmente pueden realizarse substituciones simples o múltiples de aminoácidos, preferentemente substituciones conservadoras con aminoácidos, preferentemente en la porción del polipéptido fuera del dominio (de los dominios) que forma (n) contactos intermoleculares. Una substitución conservadora con un aminoácido no deberla modificar substancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no deberla tender a romper una hélice que existe en la secuencia parental, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental) . Ejemplos de estructuras polipeptidicas secundarias y terciarias reconocidas por el arte se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman y Company, New York (1984) ) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 'y Thornton et al., Na ture 354:105 (1991), que son incorporados cada uno en ésta por referencia. Análogos no peptidicos son usados comúnmente en la industria farmacéutica como drogas con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se llaman "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos" . Fauchere, J. Adv. Drug Res . , 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS p.392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem . 30:1229 (1987), que son incorporados en ésta por referencia. Tales compuestos son desarrollados muchas veces con la ayuda de un modelaje molecular computarizado. Los peptidomiméticos estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada) , tal como un anticuerpo humano, pero tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace tal como: -CH2NH-, -CH2S~, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en el arte. También puede usarse la substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) , para generar péptidos más estables. Además, péptidos minimizados (constrained peptides) que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden ser generados por métodos conocidos en el arte (Rizo y Gierasch, Ann . Rev. Biochem . 61:387 (1992), incorporado en ésta por referencia); por ejemplo, agregando residuos internos de cisteina capaces de formar puentes intramoleculares de disulfuro que ciclizan el péptido. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que ocurre naturalmente, cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "liviana" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal- de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, primariamente responsable por el reconocimiento del antigeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante, primariamente responsable por la función efectora. Las cadenas livianas humanas son clasificadas como cadenas livianas K y ?. Las cadenas pesadas son clasificadas como µ, d, y, a, o e, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas livianas y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Vea en general, Fundamental Immunology, Capitulo 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadenas liviana/pesada forman el sitio de ligadura del anticuerpo, de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de ligadura. Las cadenas de inmunoglobulina exhiben la misma estructura general de regiones framework (FR) relativamente conservadoras unidas mediante tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes complementarias o CDRs . Las CDRs de las dos cadenas de cada par están alineadas mediante las regiones framework para formar un sitio de ligadura epítope-específico. Desde el terminal N hasta el terminal C, tanto las cadenas livianas como las pesadas comprenden los dominios FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Seguences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989), cada uno de los cuales es incorporado en ésta por referencia en su totalidad. Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o una porción que liga antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por ligadura específica. En algunas modalidades, un anticuerpo es una porción que liga antígeno de la misma. Pueden producirse porciones que ligan antígeno mediante técnicas de DNA recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones que ligan antígeno incluyen, ínter alia, fragmentos Fab, Fab, F(ab)2, Fv, dAb y fragmentos de regiones determinantes complementarias (CDR) , anticuerpos de cadena simple (scFv) , anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir al polipéptido ligadura a un antígeno específico. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro a la región bisagra; un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) consiste de un dominio VH. Según lo usado en ésta, un anticuerpo al cual se hace referencia como, por ejemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 ó 9.8.2, es un anticuerpo monoclonal que se produce mediante el hibridoma del mismo nombre. Por ejemplo, el anticuerpo 1.7.2 se produce mediante el hibridoma 1.7.2. Un anticuerpo al cual se hace referencia como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod es un anticuerpo monoclonal cuya secuencia se modificó a partir de su anticuerpo parental correspondiente mediante mutagénesis dirigida a un sitio.
Un anticuerpo de una sola cadena (scFv) es un anticuerpo en el cual las regiones VL y VH están emparejadas para formar una molécula monovalente via un engarce sintético que posibilita que las regiones formen una sola cadena proteica (Bird et al., Science 242:423-426, (1988) y Huston et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:5879-5883, (1988)). Diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan sobre una sola cadena polipeptídica, pero usando un engarce demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de ligadura de antígeno (vea, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90: 6444-6448 (1993) y Poljak, R. J. , et al., Structure, 2:1121-1123 (1994)) . Una o más CDRs de un anticuerpo de la invención pueden ser incorporadas en una molécula, ya sea covalentemente o no covalentemente, para trasformarla en una inmunoadhesina que se liga específicamente a MAdCAM. Una inmunoadhesina puede incorporar la(s) CDR(s) como parte de una cadena polipeptidica más larga, puede ligar la(s) CDR(s) covalentemente a otra cadena polipeptídica o puede incorporar la(s) CDR(s) no covalentemente. Las CDRs permiten que la inmunoadhesina se ligue específicamente a un antigeno particular de interés .
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de ligadura. Si existen varios sitios de ligadura, los sitios de ligadura pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina que ocurre naturalmente tiene dos sitios de ligadura idénticos, un anticuerpo de cadena simple o fragmento Fab tiene un sitio de ligadura, mientras que un anticuerpo "biespecifico" o "bifuncional" (diacuerpo) tiene dos sitios de ligadura diferentes. Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes naturalmente asociados, incluyendo otros anticuerpos naturalmente asociados, que lo acompañan en su estado natural, (2 ) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo anti-MAdCAM que ha sido purificado por afinidad usando MAdCAM, un anticuerpo anti-MAdCAM que ha sido producido in vitro mediante un hibridoma u otra línea celular y un anticuerpo anti-MAdCAM humano derivado de un mamífero o planta transgénico. Según lo usado en ésta, el término "anticuerpo humano" significa un anticuerpo en el cual las secuencias de la región variable y constante son secuencias humanas. El término comprende anticuerpos con secuencias derivadas de genes humanos, pero que han sido cambiadas, por ejemplo, para disminuir inmunogenicidad posible, aumentar afinidad, eliminar cisteínas o sitios de glicosilación que podrían causar un plegado indeseable, etc. El término comprende tales anticuerpos producidos recombinantemente en células no humanas, que podrían impartir glicosilación no tipica de células humanas. El término también comprende anticuerpos que han sido cultivados en un ratón transgénico que comprende algunos o todos los loci de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina humana . En un aspecto, la invención provee un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que se deriva de una especie no humana, en la cual ciertos aminoácidos en el framework y los dominios constantes de las cadenas pesadas y livianas han sido mutados de modo de evitar o anular la respuesta inmune en humanos. En algunas modalidades, puede producirse un anticuerpo humanizado fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de como producir anticuerpos humanizados pueden encontrarse en las patentes U.S. Nos. 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-MAdCAM humanizado de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de una o más regiones framework de uno o más anticuerpos anti-MAdCAM humanos de la invención. En otro aspecto, la invención incluye un "anticuerpo quimérico". En algunas modalidades, el anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En una modalidad preferida, una o más de las CDRs se derivan de un anticuerpo anti-MAdCAM humano de la invención. En una modalidad más preferida, todas las CDRs se derivan de un anticuerpo anti-MAdCAM humano de la invención. En otra modalidad preferida, las CDRs de más de un anticuerpo anti-MAdCAM humano de la invención se mezclan y unen para formar un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDRl de la cadena liviana de un primer anticuerpo anti-MAdCAM humano que puede combinarse con la CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de un segundo anticuerpo anti-MAdCAM humano, y las CDRs de la cadena pesada pueden estar derivadas de un tercer anticuerpo anti-MAdCAM. Además, las regiones framework pueden derivarse de uno de los mismos anticuerpos anti-MAdCAM, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado . Un "anticuerpo neutralizante", "un anticuerpo inhibitorio" o anticuerpo antagonista es un anticuerpo que inhibe la ligadura de a4ß7 o células que expresan a4ß7, o cualquier otro ligando análogo o células que expresan un ligando análogo, a M?dCAM en al menos aproximadamente 20%. En una modalidad preferida, el anticuerpo reduce la inhibición de la ligadura de integrina aß7 o células que expresan aß7 a MAdCAM en al menos 40%, más preferentemente en 60%, aún más preferentemente en 80%, 85%, 90%, 95% ó 100%. La reducción de la ligadura puede medirse mediante cualquier medio conocido por un entendido en el arte, por ejemplo, mediante un ensayo de ligadura competitiva in vitro . Un ejemplo de la medición de la reducción de la ligadura de células que expresan aß a MAdCAM se presenta en el Ejemplo I. Los fragmentos o análogos de anticuerpos pueden prepararse fácilmente por los entendidos en el arte siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva. Los terminales amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se encuentran cerca de los limites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con los datos de bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos secuenciales o dominios previstos de conformación proteica que se encuentran en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida (Bowie et al., Science, 253:164 (1991) ) . El término "resonancia en la superficie de un plasmon" (surface plasmon resonance) , según lo usado en ésta, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones de concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, vea Jonsson, U., et al., Ann . Biol . Clin . , 51:19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Bíotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson, B., et al., J. Mol . Recognit . , 8:125-131 (1995); y Johnsson, B., et al., Anal . Biochem . , 198:268-277 (1991).
El término "koff" se refiere a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno . El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antigeno particular. Se dice que un anticuerpo se liga con un antigeno si la constante de disociación es = 1 µM, preferentemente = 100 nM y lo más preferentemente = 10 nM. El término "epitope" incluye cualquier determinante proteico capaz de ligarse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o célula T o de interactuar de otro modo con una molécula. Los determinantes epitópicos consisten usualmente de grupos superficiales químicamente activos de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o hidratos de carbono y usualmente tienen características estructurales tridimensionales especificas, como así también características de carga específicas. Un epítope puede ser "lineal" o "conformacional" . En un epitope lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interactuante (tal como un anticuerpo) se encuentran linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. En un epítope conformacional, los puntos de interacción se encuentran a través de residuos de aminoácidos sobre la proteina que están separados entre sí. Según lo usado en ésta, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vea Immunology - A Synthesis ( 2ná Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que es incorporado en ésta por referencia. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos - , a-disubstituidos, aminoácidos N-alquilados, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados de los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ej emplo, 4- hidroxiprolina) . En la forma usada en ésta para representar un polipéptido, la dirección izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso convencional estándar. El término "polinucleótido" según lo referido en ésta, significa una forma polimérica de nucleótidos de una longitud de al menos 10 bases, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de hebra simple y de hebra doble del DNA. El término "polinucleótido aislado", según lo usado en ésta, significa un polinucleótido ' de origen genómico, cDNA, o sintético o alguna combinación de los mismos, que debido a su origen de "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo el polinucleótido o una porción del mismo con el cual se encuentra el "polinocleótido aislado" en la naturaleza, (2) está ligado operativamente a un polinucleótido al cual no está ligado en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. El término "oligonucleótido", al cual se hace referencia en ésta, incluye nucleótidos que se encuentran naturalmente, y nucleótidos modificados ligados entre si mediante enlaces oligonucleotidicos que se encuentran naturalmente, y enlaces oligonucleotidicos que no se encuentran naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto polinucleotidico que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menor. Preferentemente los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y más preferentemente una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases. Los oligonucleótidos usualmente tienen una sola hebra, por ejemplo, para sondas; si bien oligonucleótidos pueden ser de doble hebra, por ej emplo, para el uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. El término "nucleótidos que se encuentran naturalmente", referido en ésta, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados", referido en ésta, incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o substituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotidicos" referido en ésta incluye enlaces oligonucleotidicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosfofodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Vea, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucí . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am . Chem . Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucí . Acids Res . , 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., U.S. Patente No. 5.151.510; Uhlmann y Peyman, Chemical .Revíews 90:543 (1990), cuyas revelaciones están incorporadas en ésta por referencia. Si deseado, un oligonucleótido puede incluir un marcador para la detección. Secuencias "enlazadas operativamente" incluyen ambas, secuencias de control de expresión que se encuentran en posición contigua con el gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expesión", según lo usado en ésta, se refiere a secuencias polinucleotidicas que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras adecuadas; señales de procesamiento de RNA eficientes, tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el mRNA citoplasmático; secuencias que aumentan la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia de consenso de Kozak) ; secuencias que aumentan la estabilidad de la proteína; y, si deseado, secuencias que aumentan la secreción de la proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere en dependencia del organismo hospedante; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de ligadura ribosomal y la secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" tiene la intención de incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias de compañero de fusión. El término "vector", según lo usado en ésta, tiene la intención de referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", término que hace referencia a un bucle circular de DNA de doble hebra al cual pueden ligarse segmentos adicionales de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, al cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ej emplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedante al ser introducidos en la célula hospedante, y de ese modo son replicados conjuntamente con el genoma del hospedante. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente. A tales vectores se hace referencia en ésta como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión") . Generalmente, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran muchas veces en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse en forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención tiene la intención de incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ej emplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) , que tienen funciones equivalentes. El término "célula hospedante recombinante" (o simplemente "célula hospedante") , según lo usado en ésta, tiene la intención de referirse a una célula en la cual ha sido introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que tales términos tienen la intención de referirse no solamente a la célula sujeto particular, sino también a la progenie de tal célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas, debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie, de hecho, puede ser no idéntica a la célula parental, pero aún estar incluida dentro del alcance del término "célula hospedante" usado en ésta. El término "hibridar selectivamente" referido en ésta significa ligar en forma detectable y especifica. Polinucleótidos, oligonocleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de ligaduras detectables a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "elevada severidad" o "altamente estrictas" para lograr condiciones de hibridación selectiva, condiciones que son conocidas en el arte y discutidas en ésta. Un ejemplo de condiciones de "elevada severidad" o "altamente estrictas" es un método de incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, donde un polinucleótido puede ser fijado a una superficie sólida, tal como una membrana, en un buffer de hibridación de SSPE o SSC 6X, formamida al 50%, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5%, 100 µg/ml de DNA de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42 °C durante 12-16 horas, seguido por dos lavados a 55 °C, usando un buffer de lavado de SSC IX, SDS al 0,5%. Vea también Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55. El término "porcentaje de identidad de secuencias", en el contexto de secuencias nucleotidicas, se refiere a los residuos en dos secuencias que son iguales cuando las secuencias son alineadas para su máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede abarcar al menos aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferentemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. En el arte se conoce un número de algoritmos diferentes que pueden usarse para medir la identidad de secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, secuencias polinucleotídicas pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas de la versión 10.3 del paquete de software Wisconsin Package, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineamientos y porcentaje de identidad de secuencias de las regiones que presentan la mejor superposición entre las secuencias problema y de referencia (between the query and search sequences) (Pearson, Methods Enzymol . , 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Enzymol . Biol . , 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol . , 266 : 227-258 (1996); Pearson, J. Mol . Biol . 276: 71-84 (1998); incorporadas en ésta por referencia) . Siempre que no sea especificado de otro modo, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencias entre secuencias nucleotídicas puede determinarse usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntaje) o usando Gap con sus parámetros predeterminados provistos en la versión 10.3 de Wisconsin Package, incorporada en ésta por referencia. Una referencia a una secuencia nucleotidica comprende su complemento, siempre que no sea especificado de otro modo. Por lo tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular comprende su hebra complementaria, que es su secuencia complementaria. En el arte de la biología molecular, los investigadores usan los términos "porcentaje de identidad de secuencias", "porcentaje de similitud de secuencias" y "porcentaje de homología de secuencias" en forma intercambiable. En esta solicitud, estos términos tendrán el mismo significado solamente con respecto a las secuencias nucleotidicas . El término "similitud substancial" o "similitud substancial de secuencias", al hacer referencia a un ácido nucleico o un fragmento del mismo, indica que al estar alineado el ácido nucleico óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiados, con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria) , existe una identidad de secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente 85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido para determinar la identidad de secuencias, tales como FASTA, BLAST o Gap, discutidos precedentemente. Cuando se aplica a polipéptidos, el término "identidad substancial" significa que dos secuencias peptídicas, al ser alineadas óptimamente, tal como por el programa GAP o BESTFIT, usando pesos predeterminados del intervalo no homólogo (GAP) , comparten una identidad de secuencias de al menos 75% u 80%, preferentemente al menos una identidad de secuencias de 90% ó 95%, aún más preferentemente una identidad de secuencia de al menos 98% ó 99%. Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticos difieren en sustituciones conservadoras con aminoácidos. Una "substitución conservadora con un aminoácido" es una substitución en la cual un residuo de aminoácido es substituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) . En general, una substitución conservadora con un aminoácido no cambiará substancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los cuales dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por substituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias o grado de similitud puede ser ajustado hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la substitución.
Medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los entendidos en el arte. Vea, por ejemplo, Pearson, Methods Mol . Biol . , 24: 307-31 (1994), incorporadas en ésta por referencia. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxil- alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Grupos de substitución conservadora preferidos de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina . Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de semejanza algorítmica (log-likelihood matrix) PAM250 revelada en Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), incorporado en ésta por referencia. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de semejanza logarítmica PAM250. La similitud de secuencias para polipéptidos se mide típicamente usando software para análisis de secuencias. Un software para análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias substituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo substituciones conservadoras con aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que pueden usarse con parámetros predeterminados para determinar homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Vea, por ejemplo, Wisconsin package, versión 10.3. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros predeterminados o recomendados, un programa en Wisconsin package, versión 10.3. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y porcentaje de identidad de secuencias de las regiones que presentan la mejor superposición entre las secuencias problema y de referencia (between the query and search sequences) (Pearson (1990) ; Pearson (2000)). Otro algoritmo preferido, al comparar una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa de computación BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados. Vea, por ej emplo, Altschul et al., J. Mol . Biol . 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res . 25:3389-402 (1997); 58 incorporadas en ésta por referencia. La longitud de las secuencias polipeptídicas cuya homología se compara será generalmente de al menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, usualmente al menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente al menos aproximadamente 24 residuos, típicamente al menos aproximadamente 28 residuos, y preferentemente mayor de aproximadamente 35 residuos. Cuando se investiga en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos. De acuerdo con lo usado en ésta, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una modalidad, el marcador es un marcador detectable, por ej emplo, la incorporación de un aminoácido con marcador radioactivo o fijación de grupos de biotinilo a un polipéptido, grupos que pueden ser detectados por avidina marcada (por ej emplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o colorimétricos) . En otra modalidad, la etiqueta o marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de droga o toxina. En el arte se conocen varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteinas que pueden usarse. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionuclidos (por ejemplo, JH, 14C, 115StN> , 3 J5ÜSc , 9 a0u?Y, 9 s9aTp c, l Xl1l1pln, 125-I, 1i3O1J'-I), marcadores fluorescentes (por ej emplo, FITC, rodamina, sustancias fosforescentes a base de lantánidos) , marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes polipeptídicos predeterminados reconocidos por un repórter secundario (por ejemplo, secuencias apareadas de cierres de leucina (leucine zipper pair sequences) , sitios de ligadura para anticuerpos secundarios, dominios que ligan metales, rótulos de epítopes) , agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tal como toxina pertusis, taxol, citocalacina B, gramicidina D, bromuro de etilio, hemetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, toxorubicina, daunoruvicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. En algunas modalidades, los marcadores están unidos mediante brazos espaciadores de longitudes variadas para reducir el potencial de impedimento esférico . El término "agente" se usa en ésta para señalar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto de materiales biológicos. El término "agente farmacéutico o droga" según lo usado en ésta, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado al ser administrado adecuadamente a un paciente. Otros términos químicos se usan en ésta de acuerdo con el uso convencional en el arte, según lo ejemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado en ésta por referencia) . El término agente "anti-inflamatorio" o "inmuno-modulatorio" se usa en ésta para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir inflamación, incluyendo una enfermedad inflamatoria, en un sujeto, incluyendo un humano. En varias modalidades de esta invención, la enfermedad inflamatoria puede consistir de, pero no está limitada a, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, diverticulitis, gastritis, enfermedad del hígado, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante. Las enfermedades inflamatorias también incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad abdominal (incluyendo peritonitis, apendicitis, enfermedad del tracto biliar) , mielitis transversal aguda, dermatitis alérgica (incluyendo piel alérgica, eczema alérgico, atopia de la piel, eczema atópico, dermatitis atópica, inflamación cutánea, eczema inflamatorio, dermatitis inflamatoria, piel de mosca, dermatitis miliaria, eczema de miliaria, piel de acáridos del polvo de la casa) , espondilitis anquilosante (síndrome de Reiter) , asma, inflamación de las vías respiratorias, arterosclerosis, arteriosclerosis, atresia biliar, inflamación de la vejiga, cáncer de las mamas, inflamación cardiovascular (incluyendo vasculitis, infartos periungeales reumatoides, úlceras de la pierna, polimiositis, inflamación vascular crónica, pericarditis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica) , pancreatitis crónica, inflamación perineural, colitis (incluyendo colitis amebiana, colitis infecciosa, colitis bacteriana, colitis de Crohn, colitis isquémica, colitis ulcerativa, proctocolitis idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis pseudomembranosa) , trastornos vasculares del colágeno (artritis reumatoide, SLE, esclerosis sistémica progresiva, enfermedad mixta del tejido conectivo, diabetes mellitus) , enfermedad de Crohn (enteritis regional, íleitis granulomatosa, ileocolitis, inflamación del sistema digestivo) , enfermedad de desmielinación (incluyendo mielitis, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, encefalomielitis diseminada aguda, desmielinación perivenosa, deficiencia en vitamina B12, síndrome de Guillain-Barre, retrovirus asociado a esclerosis múltiple (MS) ) , dermatomiositis, diverticulitis, diarrea exudativa, gastritis, hepatitis granulomatosa, inflamación granulomatosa, colecistitis, diabetes mellitus insulina-dependiente, enfermedades inflamatorias del hígado, fibrosis del hígado (cirrosis biliar primaria, hepatitis, colangitis esclerosante) , inflamación pulmonar (fibrosis pulmonar idiopática, granuloma eosinofilico del pulmón, histiocitosis X pulmonar, inflamación peribronquiolar, bronquitis aguda) , linfogranuloma venéreo, melanoma maligno, enfermedad de boca/dientes (incluyendo gengivitis, enfermedad periodontal) , mucositis, inflamación del sistema musculoesquelético (miositis) , esteatohepatitis no alcohólica (enfermedad del hígado graso no alcohólica) , inflamación ocular y orbital (incluyendo uveitis, neuritis óptica, ulceración reumatoide periférica, inflamación periférica de la córnea) , osteoartritis, osteomielitis, inflamación de la faringe, poliartritis, proctitis, psoriasis, daño por radiación, sarcoidosis, necropatia de los drepanocitos, tromboflebitis superficial, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del injerto versus hospedante, daño por quemadura aguda, síndrome de Behget, síndrome de Sjógren. Los términos paciente y sujeto incluyen sujetos humanos y veterinarios. Anticuerpos anti-MAdCAM humanos y caracterización de los mismos En una modalidad, la invención provee anticuerpos anti-MAdCAM que comprenden secuencias CDR humanas . En una modalidad preferida, la invención provee anticuerpos anti-MAdCAM humanos. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-MAdCAM humanos se producen mediante la inmunización de un animal transgénico no humano, por ej emplo, un roedor, cuyo genoma comprende genes de inmunoglobulina humana, de modo que el animal transgénico produce anticuerpos humanos. En algunas modalidades, la invención provee un anticuerpo anti-MAdCAM que no liga complemento. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68 (con o sin secuencia señal) o la región variable de cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos, o una o más CDRs de estas secuencias de aminoácidos. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 (con o sin la secuencia señal) o la secuencia de aminoácidos de la región variable, o de una o más CDRs de dichas secuencias de aminoácidos. La invención también incluye anticuerpos anti-MAdCAM humanos que comprenden la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDRl hasta el final de la CDR3 de cualquiera de las secuencias arriba mencionadas. La invención provee además un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una o más regiones FR de cualquiera de las secuencias arriba mencionadas. La invención provee además un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una de las secuencias de aminoácidos arriba mencionadas en la cual se efectuaron una o más modificaciones. En algunas modalidades, cisteínas en el anticuerpo, que pueden ser químicamente reactivas, se substituyen con otro residuo, tales como, sin limitación, alanina o serina. En una modalidad, la substitución es la de una cisteina no canónica. La substitución puede efectuarse en una región CDR o framework de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la cisteína es canónica. En algunas modalidades, la substitución de aminoácidos se efectúa para eliminar sitios proteoliticos potenciales en el anticuerpo. Tales sitios pueden encontrarse en una región CDR o framework de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La substitución de residuos de cisteína y la separación de sitios proteoliticos puede disminuir la heterogeneidad en el anticuerpo producido. En algunas modalidades, se eliminan pares de asparagina-glicina, que forman sitios potenciales de desamidación, mediante la alteración de uno o ambos residuos. En algunas modalidades, se efectúa una substitución de aminoácidos para agregar o remover sitios potenciales de glicosilación en la región variable de un anticuerpo de la invención. En algunas modalidades, se desdobla la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-MAdCAM de la invención. En varias modalidades de la invención, las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos anti-MAdCAM pueden incluir opcionalmente una secuencia señal. En un aspecto, la invención provee doce anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM humanos inhibitorios y las líneas celulares de hibridoma que los producen. La Tabla 1 enumera los identificadores de secuencia (SEQ ID NO:) de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y livianas de longitud completa (incluyendo la secuencia señal) , y las correspondientes secuencias de aminoácidos deducidas de longitud completa. Tabla 1 ANTICUERPOS ANTI-MAdCAM HUMANOS IDENTIFICADOR DE SECUENCIAS Anticuerpo (SEQ ID NO:) monoclol Longitud completa Pesado Liviano DNA Proteína DNA Proteína 1.7.2 10 En otro aspecto, la invención provee una versión modificada de ciertos anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM humanos arriba identificados. La Tabla 2 enumera los identificadores ¡5 de secuencias para el DNA y las secuencias proteicas de los anticuerpos modificados. Tabla 2 0 5 Clase y subclase de anticuerpos anti-MAdCAM El anticuerpo puede ser una molécula IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En una modalidad preferida, el anticuerpo es una clase IgG y es una subclase IgGi, IgG2, IgG3 o IgG . En una modalidad más preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es de la subclase IgG2 o IgG . En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM pertenece a la misma clase y subclase que el anticuerpo 1,7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod que es IgG2, o 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 ó 9.8.2, que son IgG . La clase y subclase de anticuerpos anti-MAdCAM puede determinarse mediante cualquier método conocido en el arte. En general, la clase y subclase de un anticuerpo 'puede determinarse usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular de anticuerpos. Tales anticuerpos están comercialmente disponibles. La clase y subclase puede determinarse mediante ELISA, transferencia de Western como así también mediante otras técnicas. Alternativamente, la clase y subclase puede determinarse mediante la secuenciación del total o de una porción de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o livianas de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos como la clase que muestra la mayor identidad de secuencias. Selectividad para especies y moléculas En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-MAdCAM muestra ambas, selectividad para especies y selectividad molecular. En una modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM se liga a MAdCAM humano, de cynomolgus o de perro. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM no se liga a una especie de mono New World tal como un marmoset. Siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva, puede determinarse la selectividad para especies del anticuerpo anti-MAdCAM usando métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad para especies usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoquímica. En una modalidad preferida, puede determinarse la selectividad para especies usando inmunohistoquímica. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM que liga específicamente MAdCAM tiene una selectividad para MAdCAM mayor que para VCAM, fibronectina o cualquier otro antígeno, selectividad que es al menos 10 veces, preferentemente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 veces, lo más preferentemente al menos 100 veces mayor. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM no exhibe ninguna ligadura apreciable a VCAM, fibronectina o cualquier otro antígeno distinto a MAdCAM. Puede determinarse la selectividad del anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM usando métodos bien conocidos en el arte, siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando transferencia de Western, FACS, ELISA o inmunohistoquímica. Afinidad de ligadura de anticuerpos anti-MAdCAM a MAdCAM En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-MAdCAM se ligan específicamente a MAdCAM con afinidad elevada. En una modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM se liga específicamente a MAdCAM con una Kd de 3 x 10"8 M o menor, medida mediante resonancia en la superficie de un plasmón, tal como BIAcore. En modalidades más preferidas, el anticuerpo se liga específicamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10~s o menor o 1 x 10"9 M o menor. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo se liga específicamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-10 M o menor. En otras modalidades preferidas, un anticuerpo de la invención se liga específicamente a MAdCAM con una Kd de 2,66 x 10~10 M o menor, 2,35 x 10-11 M o menor ó 9 x 10-12 M o menor. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se liga específicamente a MAdCAM con una Kd de 1 x 10-11 M o menor. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se liga específicamente a MAdCAM con substancialmente la misma K¿ como un anticuerpo seleccionado entre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- od, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. Un anticuerpo con "substancialmente la misma Kd" como un anticuerpo de referencia tiene una Kd que es ± 100 pM, preferentemente ± 50 pM, más preferentemente ± 20 pM, aún más preferentemente ± 10 pM, ± 5 pM o + 2 pM, en comparación con la Kd del anticuerpo de referencia en el mismo experimento. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se liga a MAdCAM con substancialmente la misma Kd como un anticuerpo que comprende uno o más dominios variables o una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado entre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En aún otra modalidad preferida, el anticuerpo se liga a MAdCAM con substancialmente la misma Kd como un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68 (con o sin la secuencia señal), o el dominio variable de las mismas. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se liga a MAdCAM con substancialmente la misma Kd como un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68. La afinidad de ligadura de un anticuerpo anti-MAdCAM a MAdCAM puede determinarse mediante cualquier método conocido en el arte. En una modalidad, la afinidad de ligadura puede medirse mediante ensayos competitivos ELISA, RÍA o mediante resonancia en la superficie de un plasmón, tal como BIAcore. En una modalidad más preferida, la afinidad de ligadura se mide mediante resonancia en la superficie de un plasmón. En una modalidad aún más preferida, la afinidad de ligadura y la velocidad de disociación se miden usando BIAcore. Un ejemplo de determinación de afinidad de ligadura se describe más abajo en el Ejemplo II. Vida media de anticuerpos anti-MAdCAM De acuerdo con otro objeto de la invención, el anticuerpo anti-MAdCAM tiene una vida media de al menos un día in vi tro o in vivo . En una modalidad preferida, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de al menos tres días. En una modalidad más preferida, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de cuatro días o mayor. En otra modalidad, el anticuerpo o una porción del mismo tiene una vida media de ocho dias o mayor. En otra modalidad, el anticuerpo o la porción que liga antigeno del mismo está derivatizado o modificado de modo que tiene una vida media mayor, según lo discutido más abajo. En otra modalidad preferida, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales para aumentar la vida media en suero, tal como descrito en WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 2000. La vida media del anticuerpo puede medirse mediante cualquier medio conocido por un entendido en el arte. Por ejemplo, la vida media del anticuerpo puede medirse mediante transferencia de Western, ELISA o RÍA durante un período de tiempo apropiado. La vida media del anticuerpo puede medirse en cualquier animal apropiado, tal como un primate, por ejemplo, mono cyno olgus, o un humano. Identificación de epí topes MAdCAM reconocidos por un anticuerpo anti -MAdCAM La invención también provee un anticuerpo anti-MAdCAM humano que liga el mismo antígeno o epítope como un anticuerpo anti-MAdCAM humano provisto por ésta. Además, la invención provee un anticuerpo anti-MAdCAM humano que compite o compite en forma cruzada con un anticuerpo anti-MAdCAM humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM humano es 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM humano comprende uno o más dominios variables o una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado entre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En aún otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM humano comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68 (con o sin la secuencia señal), o un dominio variable de las mismas. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM humano comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68. En una modalidad altamante preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es otro anticuerpo humano. Puede determinarse si un anticuerpo anti-MAdCAM se liga al mismo antígeno que otro anticuerpo anti-MAdCAM usando una variedad de métodos conocidos por el arte. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo anti-MAdCAM conocido para captar el antígeno, eluir el antígeno del anticuerpo anti-MAdCAM y determinar luego si el anticuerpo de ensayo se ligará al antigeno eluído. Puede determinarse si un anticuerpo compite con un anticuerpo anti-MAdCAM, ligando el anticuerpo anti-MAdCAM a MAdCAM bajo condiciones de saturación y midiendo luego la capacidad del anticuerpo de ensayo para ligarse a MAdCAM. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de ligarse a MAdCAM simultáneamente con el anticuerpo anti-MAdCAM, entonces el anticuerpo de ensayo se liga a un epitope diferente que el anticuerpo anti-MAdCAM. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de ligarse a MAdCAM simultáneamente, entonces el anticuerpo de ensayo compite con el anticuerpo anti-MAdCAM humano. Este experimento puede realizarse usando ELISA, o resonancia en la superficie de un plasmón o, preferentemente, BIAcore. Para ensayar si un anticuerpo anti-MAdCAM compite en forma cruzada con otro anticuerpo anti-MAdCAM, puede usarse el método de competición arriba descrito en dos direcciones, es decir, determinando si el anticuerpo conocido bloquea el anticuerpo de ensayo y viceversa. ¡7so de genes de cadena liviana y pesada La invención también provee un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una región variable de cadena liviana codificada por un gen K humano. En una modalidad preferida, la región variable de la cadena liviana es codificada por un gen VK de la familia A2, A3, A26, B3, 012 u 018. En varias modalidades, la cadena liviana comprende no más de once, no más de seis o no más de tres substituciones de aminoácidos de la secuencia VK A2, A3, A26, B3, 012 u 018 humana de la linea germinal. En una modalidad preferida, las substituciones de aminoácidos son substituciones conservadoras.
Las SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 y 48 proveen las secuencias de aminoácidos de las cadenas livianas kappa de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2. Las Figuras 1K-1T son alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena liviana de doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de la línea germinal de la cual están derivadas. La Figura 2A muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena liviana de las cadenas livianas kappa de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre si. Siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva, un entendido en el arte puede determinar las diferencias entre las secuencias de la linea germinal y las secuencias de anticuerpo de los anticuerpos anti-MAdCAM adicionales. Los SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 ó 68 proveen las secuencias de aminoácidos de las cadenas livianas kappa de longitud completa de cinco anticuerpos anti-MAdCAM adicionales, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, modificadas por substitución de los aminoácidos de sus anticuerpos anti-MAdCAM parentales, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 ó 7.26.4, respectivamente. En una modalidad preferida, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, con relación a las secuencias de aminoácidos de la línea germinal, que una o más cualesquiera de las VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. La invención incluye un anticuerpo anti-MAdCAM que utiliza los mismos genes VK humanos y Jk humanos que un anticuerpo ejemplificado. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una o más de las mismas mutaciones de la linea germinal como uno o más de los anticuerpos ejemplificados. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende diferentes substituciones en una o más de las mismas posiciones como uno o más de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VL del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o más substituciones de aminoácidos que son las mismas que aquellas presentes en el anticuerpo 7.16.6, y otra substitución de aminoácidos que es la misma del anticuerpo 7.26.4. De este modo, se pueden mezclar y unir diferentes características de ligadura del anticuerpo con el fin de modificar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo para MAdCAM o su velocidad de disociación del antígeno. En otra modalidad, las mutaciones se efectúan en la misma posición como aquella encontrada en una o más cualesquiera de las VL de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod, pero se hacen mas bien substituciones conservadoras con aminoácidos en vez de utilizar el mismo aminoácido. Por ejemplo, si el aminoácido substituido en comparación con la linea germinal en uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod es glutamato, se puede substituir conservadoramente con aspartato. Similarmente, si el aminoácido substituido es serina, puede substituirse conservadoramente con treonina. En otra modalidad preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la VL de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad altamente preferida, la cadena liviana comprende secuencias de aminoácidos que son las mismas de las regiones CDR de la cadena liviana de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos con al menos una región CDR de la cadena liviana de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena liviana comprende secuencias de aminoácidos con CDRs de diferentes cadenas livianas que usan los mismos genes Vk y Jk. En una modalidad más preferida, las CDRs de diferentes cadenas livianas se obtienen a partir de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 ó 68 con o sin la secuencia señal. En otra modalidad, la cadena liviana comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada entre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67 (con o sin la secuencia señal) , o una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-11 inserciones, deleciones o substituciones de aminoácido de la misma. Preferentemente, las substituciones de aminoácidos son substituciones conservadoras con aminoácidos. En otra modalidad, el anticuerpo o una porción del mismo comprende una cadena liviana lambda. La presente invención también provee un anticuerpo anti-MAdCAM o una porción del mismo que comprende una secuencia del gen VH humano o una secuencia derivada del gen VH humano. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada se deriva de una familia de genes VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4 humanos. En varias modalidades, la cadena pesada comprende no más de quince, no más de seis o no más de tres cambios de aminoácidos de la secuencia génica VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4 humana de la linea germinal . Las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 y 46 proveen las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de longitud completa de doce anticuerpos anti-MAdCAM. Las Figuras 1A-1J son alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de •doce anticuerpos anti-MAdCAM con las secuencias de la línea germinal de las cuales están derivadas. La Figura 2B muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de doce anticuerpos anti-MAdCAM entre si. Siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva y las secuencias nucleotídicas de la invención, un entendido en el arte puede determinar las secuencias de aminoácidos codificadas de las doce cadenas pesadas anti-MAdCAM y las cadenas pesadas de la línea germinal y determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo. Las SEQ ID NOS: 52, 56, 60 y 64 proveen las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de longitud completa de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod y 6.67.1-mod, modificadas mediante la substitución de aminoácidos de sus anticuerpos anti-MAdCAM parentales, 6.22.2, 6.34.2 y 6.67.1, respectivamente. Un anticuerpo anti-MAdCAM modificado adicional, 7.26.4-mod, tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa que es SEQ ID NO: 42. En una modalidad preferida, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM contiene las mismas mutaciones, con relación a las secuencias de aminoácidos de la línea germinal, que una o más cualesquiera de las VH de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. Similarmente a lo discutido precedentemente, el anticuerpo comprende una o más de las mismas mutaciones de la linea germinal como uno o más de los anticuerpos ejemplificados. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende diferentes substituciones en una o más de las mismas posiciones como uno o más de los anticuerpos ejemplificados. Por ejemplo, la VH del anticuerpo anti-MAdCAM puede contener una o más substituciones de aminoácidos que son las mismas que aquellas presentes en el anticuerpo 7.16.6, y otra substitución de un aminoácido que es la misma del anticuerpo 7.26.4. De este modo, se pueden mezclar y unir diferentes características de ligadura del anticuerpo con el fin de modificar, por ej emplo, la afinidad del anticuerpo para MAdCAM o su velocidad de disociación del antígeno. En otra modalidad, se efectúa una substitución de aminoácidos en comparación con la línea germinal en la misma posición como una substitución de la línea germinal encontrada en una o varias cualesquiera de las VH del anticuerpo de referencia 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod, pero la posición es substituida con un residuo diferente, que es un residuo de substitución conservadora en comparación con el anticuerpo de referencia. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod.
En otra modalidad altamente preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son las mismas de las regiones CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos una región CDR de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos con CDRs de diferentes cadenas pesadas. En una modalidad más preferida, las CDRs de diferentes cadenas pesadas se obtienen a partir de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 con o sin la secuencia señal. En otra modalidad, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada entre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63, o una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 1-15 inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos de la misma. En otra modalidad, las substituciones son substituciones conservadoras con aminoácidos . Métodos para producir anticuerpos y lineas celulares que producen anticuerpos Inmunización En una modalidad de la presente invención, se producen anticuerpos humanos inmunizando un animal no humano que comprende alguno o todos los loci de la cadena pesada y liviana de inmunoglobulina humana con un antígeno MAdCAM. En una modalidad preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE™, que es una cepa de ratón producida por ingeneria genética que comprende grandes fragmentos de loci de inmunoglublina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Vea, por ej emplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) y Patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 y 6.130.364. Vea también WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504. El animal XENOMOUSE™ produce un repertorio de anticuerpos completamente humanos similares a los de humanos adultos y genera anticuerpos monoclonales (mAbs) humanos antígeno-específicos . Una segunda generación del animal XENOMOUSE™ contiene aproximadamente 80% del repertorio de genes V del anticuerpo humano, mediante la introducción de fragmentos del cromosoma artificial de levadura (YAC) con configuración de la línea germinal del tamaño megabase de los loci de cadena pesada humana y los loci de cadena liviana K. En otras modalidades, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente todo del locus de la cadena pesada y la cadena liviana ? humana. Vea Méndez et al., Na ture Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp . Med. 188:483-495 (1998), cuyas revelaciones están incorporadas en ésta por referencia. La invención también provee un método para producir anticuerpos anti-MAdCAM a partir de animales no ratón, no humanos mediante la inmunización de animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Pueden producirse tales animales usando los métodos- descritos inmediatamente más arriba. Los métodos revelados en estos documentos pueden modificarse según lo descrito en la patente U.S. 5.994.619 (la "patente 619"), que es incorporada en ésta por referencia. La patente "619" describe métodos para producir nuevas células y líneas celulares de masa celular interior cultivada (CICM) , derivadas de cerdos y vacas, y células CICM transgénicas en las cuales se había insertado DNA heterólogo. Las células CICM transgénicas pueden usarse para producir embriones, fetos y progenie transgénicos clonados. La patente ?619 también describe métodos para producir animales transgénicos capaces de transmitir el DNA heterólogo a su progenie. En una modalidad preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, los animales no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el enfoque de minilocus, se mímetiza un locus de Ig exógena mediante la inclusión de genes individuales del locus de la Ig. De este modo, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, (un) dominio (dominios) constante (s) µ y (un) segundo dominio (dominios) constante (s) (preferentemente (un) dominio (dominios) constante (s) gamma) son conformados en una construcción para la inserción en un animal. Este enfoque está descrito, ínter alia , en las patentes U.S. No. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 y 5.643.763, incorporadas en ésta por referencia. Una ventaja del enfoque minilocus es la rapidez con la cual pueden generarse e introducirse en animales construcciones que incluyen porciones de locus Ig. Sin embargo, una desventaja potencial del enfoque minilocus es que no podría existir una diversidad de inmunoglobulinas suficiente para sustentar el desarrollo completo de células B, de modo que podría haber una menor producción de anticuerpos . Para producir un anticuerpo anti-MAdCAM humano, se inmuniza un animal no humano que comprende alguno o todos los loci de la inmunoglobulina humana con un antígeno MAdCAM y se aisla del animal un anticuerpo o la célula que produce el anticuerpo. El antigeno MAdCAM puede ser MAdCAM aislado y/o purificado y es preferentemente un MAdCAM humano. En otra modalidad, el antigeno MAdCAM es un fragmento de MAdCAM, preferentemente el dominio extracelular de MAdCAM. En otra modalidad, el antígeno MAdCAM es un fragmento que comprende al menos un epítope de M?dCAM. En otra modalidad, el antigeno MAdCAM es una célula que expresa M?dCAM sobre su superficie celular, preferentemente una célula que sobreexpresa MAdCAM sobre su superficie celular. La inmunización de animales puede efectuarse mediante cualquier método conocido en el arte. Vea, por ej emplo, Harlow y Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990) . Métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno y caballos son bien conocidos en el arte. Vea, por ejemplo, Harlow y Lañe y la patente de los Estados Unidos 5.994.619. En una modalidad preferida, el antigeno MAdCAM se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen al adyuvante de Freund completo o incompleto, RIBI (didéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes) . Tales adyuvantes pueden proteger al polipéptido de una dispersión rápida, secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener substancias que estimulan al hospedante para segregar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferentemente, cuando se administra un polipéptido, el plan de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido repartidas en varias semanas.
El Ejemplo I provee un protocolo para inmunizar un animal XENOMOUSE ™ con MAdCAM humano de longitud completa en solución fisiológica buferada con fosfato. Producción de anticuerpos y líneas celulares que producen anticuerpos Después de la inmunización de un animal con un antígeno M?dCAM, pueden obtenerse del animal anticuerpos y/o células que producen anticuerpos. Se obtiene del animal un suero que contiene el anticuerpo anti-MAdCAM desangrando o sacrificando al animal. El suero puede usarse tal como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse anticuerpos anti-MAdCAM del suero. En otra modalidad, a partir del animal inmunizado pueden prepararse células inmortalizadas que producen anticuerpos. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y se inmortalizan células B usando métodos bien conocidos en el arte. Métodos para inmortalizar células incluyen, pero no están limitados a, transfectar las células con oncogenes, infectarlas con un virus oncogénico y cultivarlas bajo condiciones selectivas para células inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogénicos o mutantes, fusionarlas con una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula de mieloma, e inactivar un gen supresor de tumores. Vea, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra . En modalidades que implican las células de mieloma, éstas no segregan polipéptidos de inmunoglobulina (una linea celular no secretoria) . Después de inmortalización y selección con antibiótico, las células inmortalizadas, o sobrenadantes del cultivo de las mismas, son rastreadas usando MAdCAM, una porción del mismo, o una célula que expresa MAdCAM. En una modalidad preferida, el rastreo inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RÍA) , preferentemente un ELISA. Un ejemplo de rastreo con ELISA se provee en la publicación PCT No. WO 00/37504, incorporada en ésta por referencia. En otra modalidad, pueden prepararse células que producen anticuerpos a partir de un humano que tiene un trastorno autoinmune y que expresa anticuerpos anti-MAdCAM. Células que expresan los anticuerpos anti-MAdCAM pueden aislarse mediante la aislación de células de leucocitos y sometiéndolas a clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o mediante incubación sobre placas recubiertas con MAdCAM o una porción de las mismas. Estas células pueden fusionarse con un mieloma humano no secretorio para producir hibridomas humanos que expresan anticuerpos anti-MAdCAM humanos. Generalmente, esta es una modalidad menos preferida porque es probable que los anticuerpos anti-MAdCAM tendrán una baja afinidad para MAdCAM. Las células que producen anticuerpos anti-MAdCAM, por ejemplo, hibridomas, son seleccionadas, clonadas y rastreadas adicionalmente para obtener características deseables, incluyendo crecimiento celular robusto, elevada producción de anticuerpos y características deseables del anticuerpo, según lo discutido más abajo. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en anima es singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en un cultivo celular in vitro . Métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos por los entendidos en el arte. Preferentemente, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B del bazo se fusionan con un mieloma derivado de la misma especie del animal no humano. Más preferentemente, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE*" y la linea celular de mieloma es un mieloma de ratón no secretorio, tal como la linea celular de mieloma P3-X63-AG8-653 (ATCC) . Vea, por ejemplo, Ejemplo I. Por lo tanto, en una modalidad, la invención provee métodos para producir una linea celular que produce un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo dirigido a MAdCAM, métodos que comprenden (a) inmunizar un animal transgénico no humano descrito en ésta con MAdCAM, una porción de MAdCAM o una célula o tejido que expresa MAdCAM; (b) esperar que el animal transgénico tenga una respuesta inmune a MAdCAM; (c) aislar células que producen anticuerpos del animal transgénico; (d) inmortalizar las células que producen el anticuerpo; (e) crear poblaciones monoclonales individuales de las células inmortalizadas que producen el anticuerpo; y (f) rastrear las células inmortalizadas que producen el anticuerpo o sobrenadantes del cultivo de las mismas para identificar un anticuerpo dirigido a MAdCAM. En un aspecto, la invención provee hibridomas que producen anticuerpos anti-MAdCAM humanos. En una modalidad preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, según lo descrito anteriormente. En otra modalidad, los hibridomas se producen en una especie no humana, no ratón, tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, vacunos o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, en los cuales se fusiona un mieloma no secretorio humano con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM. Ácidos nucleicos, vectores, células hospedantes y métodos recombinantes para fabricar anticuerpos Ácidos nucleicos Se proveen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-MAdCAM de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y/o liviana de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En una modalidad preferida, una sola molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada de una inmunoglobulina anti-MAdCAM y otra molécula de ácido nucleico codifica la cadena liviana de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En una modalidad más preferida, la inmunoglobulina codificada es una inmunoglobulina humana, preferentemente una IgG humana. La cadena liviana codificada puede ser una cadena ? o una cadena K, preferentemente una cadena K. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana comprende la secuencia de la linea germinal de un gen VK A2, A3, A26, B3, 012 u 018 humano o una variante de dicha secuencia. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana comprende una secuencia derivada de un gen J?l, J?2, J?3, J?4 o J?5 humano. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana codifica no más de once cambios de aminoácidos del gen VK A2, A3, A26, B3, 012 u 018 de la línea germinal, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos, y aún más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico que codifica la cadena liviana es la secuencia de la línea germinal . La invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena liviana (VL) que contiene hasta once cambios de aminoácidos en comparación con la secuencia de la linea germinal, donde los cambios de aminoácidos son idénticos a los cambios de aminoácidos de la secuencia de la linea germinal de la VL de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de las cadenas livianas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, .9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de las cadenas livianas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia nucleotídica de una de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende una secuencia nucleotidica de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. En una modalidad más preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 o comprende la secuencia nucleotidica de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una VL arriba descrita, particularmente a una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68. La invención también provee una secuencia nucleotidica que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia nucleotídica de una de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que codifica una VL como arriba descrita, particularmente una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica de una de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ó 67. La invención también provee una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada (VH) que utiliza un gen VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4 humano. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica el gen VH utiliza además un gen humano de la familia JH4 o JH6. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica el gen VH utiliza el gen JH4b o JH6b humano. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia derivada de un gen D 3-10, 4-23, 5-5, 6-6 ó 6-19 humano. En una modalidad aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene no más de quince cambios de aminoácidos de los genes VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ó 4-4 de la linea germinal, preferentemente no más de seis cambios de aminoácidos, y aún más preferentemente no más de tres cambios de aminoácidos. En una modalidad altamente preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica la VH contiene al menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, donde el cambio de aminoácido es idéntico a un cambio de aminoácido de la secuencia de la' línea germinal de la cadena pesada de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En una modalidad aún más preferida, la VH contiene no más de quince cambios de aminoácidos en comparación con las secuencias de la línea germinal, donde los cambios son idénticos a aquellos cambios de la secuencia de la linea germinal de la VH de uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de la VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos de todas las CDRs de la cadena pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o que comprende una secuencia nucleotídica de una de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o comprende una secuencia nucleotídica de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica las secuencias de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64 o comprende una secuencia nucleotídica de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59 ó 63. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica una región contigua desde el comienzo de CDRl hasta el final de CDR3 de una cadena pesada o liviana de cualquiera de los anticuerpos anti-MAdCAM arriba mencionados. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de una VH que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos que codifican una VH como descrito recientemente, particularmente a una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64. La invención también provee una secuencia nucleotídica que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia nucleotídica de una de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63.
En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una VH es una molécula que hibrida bajo condiciones altamente severas con una secuencia nucleotidica que codifica una VH como descrito precedentemente, particularmente una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 64. La invención también provee una secuencia nucleotidica que codifica una VH que hibrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica de una de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59 ó 63. La secuencia nucleotídica que codifica cualquiera o ambas de las cadenas pesada y liviana de un anticuerpo anti-MAdCAM o las regiones variables de las mismas puede obtenerse a partir de cualquier fuente que produce un anticuerpo anti-MAdCAM. Métodos para aislar mRNA que codifica un anticuerpo son bien conocidos por el arte. Vea, por ejemplo, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . El mRNA puede usarse para producir cDNA a ser utilizado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o en la clonación con cDNA de genes del anticuerpo. En una modalidad de la invención, las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse a partir de un hibridoma que expresa un anticuerpo anti-MAdCAM, según lo descrito precedentemente, preferentemente un hibridoma que tiene como uno de sus partícipes de fusión una célula de un animal transgénico que expresa genes de la inmunoglobulina humana, tal como un animal XENOMOUSE '", un animal transgénico ratón, no humano o un animal transgénico no ratón, no humano. En otra modalidad, el hibridoma se deriva de un animal no transgénico, no humano, que puede usarse, por ejemplo, para anticuerpos humanizados. Una molécula de ácido nucleico que codifica toda la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse mediante la fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica todo el dominio variable de una cadena pesada o un dominio que liga antigeno de la misma con un dominio constante de una cadena pesada. Similarmente, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana de un anticuerpo anti-MAdCAM puede construirse mediante la fusión de una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio variable de una cadena liviana o un dominio que liga antigeno de la misma con un dominio constante de una cadena liviana. Moléculas de ácido nucleico que codifican regiones VH y VL pueden convertirse en genes de anticuerpo de longitud completa, insertándolas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena liviana, respectivamente, de modo que el segmento VH está ligado operativamente con el segmento (los segmentos) de la región constante de la cadena pesada (CH) dentro del vector y el segmento VL está ligado operativamente con el segmento de la región constante de cadena liviana (CL) dentro del vector. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas VH o VL son convertidas en genes de anticuerpo de longitud completa mediante enlace, por ejemplo, ligando la molécula de ácido nucleico que codifica una cadena VH con una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena CH usando técnicas estándar de biología molecular. Lo mismo puede lograrse utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada y liviana humana son conocidas en el arte. Vea, por ej emplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. , NIH Publ. No. 91-3242 (1991). Luego pueden expresarse las moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y/o livianas de longitud completa a partir de una célula en la cual han sido introducidas y se aisla el anticuerpo antí-MAdCAM. En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada codifica la región variable de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ó 6 , y la molécula de ácido nucleico que codifica la región variable de las cadenas livianas codifica la región variable de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66 ó 68. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM o una porción que liga antigeno de la misma, o la cadena liviana de un anticuerpo anti-MAdCAM o una porción que liga antigeno de la misma puede aislarse de un animal no humano, no ratón que expresa genes de inmunoglobulina humana y ha sido inmunizado con un antígeno MAdCAM. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico puede aislarse de una célula que produce anticuerpo anti-MAdCAM derivada de un animal no transgénico o de un paciente humano que produce anticuerpos anti-MAdCAM. El mRNA de células que producen anticuerpos anti-MAdCAM puede ser aislado mediante técnicas estándar, clonado y/o amplificado usando técnicas de PCR y de construcción de bibliotecas y ser rastreado usando protocolos estándar para obtener moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas anti-MAdCAM. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar recombinantemente grandes cantidades de anticuerpos anti-MAdCAM, según lo descrito más abajo. Las moléculas de ácido nucleico también pueden usarse para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, inmunoadhesinas, diacuerpos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpos, según lo descrito más abajo. Si las moléculas de ácido nucleico se derivan de un animal no humano, no transgénico, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para la humanización de anticuerpos, también según lo descrito más abajo . En otra modalidad, pueden usarse las moléculas de ácido nucleico de la invención como sondas o cebadores de PCR para secuencias especificas del anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse una sonda de molécula de ácido nucleico en métodos diagnósticos o puede usarse un cebador PCR de molécula de ácido nucleico para amplificar regiones de DNA que pueden ser usadas, ínter alia, para aislar secuencias nucleotídicas a ser usadas en la producción de dominios variables de anticuerpos anti-MAdCAM. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos pertenecen a regiones altamente variables de las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo de interés. En una modalidad aún más preferida, los oligonucleótidos codifican el total o una parte de una o más CDRs . Vectores La invención provee vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada o la porción que liga antígeno de la misma. La invención también provee vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la cadena pesada o la 8: porción que liga antígeno de la misma. La invención también provee vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de los mismos. Para expresar los anticuerpos o porciones de anticuerpos de la invención, se insertan DNAs que codifican cadenas livianas y pesadas parciales o de longitud completa, obtenidas como descrito precedentemente, en vectores de expresión, de modo que los genes son ligados operativamente a secuencias de control de transcripción y traducción. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV) , virus de plantas tales como virus del mosaico de coliflor, virus del mosaico de tabaco, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV y similares. El gen del anticuerpo es ligado dentro de un vector de modo que secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector pueden ejercer su función de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo que sean compatibles con la célula hospedante usada para la expresión. El gen de la cadena liviana del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una modalidad preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector, o ligadura con formación de extremos romos si no existen sitios de restricción) . Un vector conveniente es un vector que codifica una secuencia CH o CL funcionalmente completa de la inmunoglobulina humana, con sitios de restricción apropiados construidos por métodos de ingeniería genética de modo que cualquier secuencia VH o VL puede ser insertada y expresada fácilmente, según lo descrito precedentemente. En tales vectores, el corte y empalme se produce usualmente entre el sitio dador de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede la región C humana, y también se produce en las regiones de corte y empalme que existen dentro de los exones de la CH humana. La poliadenilación y terminación de la transcripción se producen en sitios cromosomales nativos corriente abajo de las regiones de codificación. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo por una célula hospedante. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en el vector, de modo que el péptido señal sea ligado en el marco de lectura con el terminal amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no sea una inmunoglobulina) . Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias regulatorias que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedante. Será apreciado por los entendidos en el arte que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias regulatorias, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante a ser transformada, el nivel de expresión deseado de la proteína, etc. Secuencias regulatorias preferidas para la expresión en células hospedantes mamíferas incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteina en células mamiferas, tales como promotores y/o intensificadores derivados de secuencias largas terminales repetidas (LTRs) de retrovirus, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/intensificador de CMV), Virus Simian 40 (SV40) (tal como el promotor/intensificador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor principal tardio de adenovirus (adenovirus ma or late promoter = AdMLP) ) , polioma y promotores fuertes de mamíferos tales como promotores de inmunoglobulina natural y actina. Para una descripción adicional de elementos regulatorios virales y secuencias de los mismos, vea, por ejemplo, U.S. Patentes Nos. 5.168.062, 4.510.245y 4.968.615, cada una de las cuales es incorporada en ésta por referencia.
El arte conoce métodos para expresar anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de promotores y vectores, como asi también la transformación de plantas. Vea, por ej emplo, patente de los Estados Unidos 6.517.529. El arte también conoce bien métodos para expresar polipéptidos en células bacterianas o células fúngicas, por ej emplo, células de levadura . Además de los genes de las cadenas del anticuerpo y de secuencias regulatorias, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedantes (por ej emplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de las células hospedantes en las cuales se introdujo el vector (vea, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a drogas, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedante en la cual se introdujo el vector. Genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) (a ser usado en células hospedantes dhfr con selección/amplificación de metotrexato) el gen neo (para la selección de G418) y el gen glutamato -sintetasa. Células hospedantes no hibridoma y métodos recombinantes para producir proteínas Moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma y/o la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM, y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, pueden usarse para la transformación de una célula hospedante mamifera, vegetal, bacteriana o de levadura adecuada. La transformación puede realizarse mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante. Métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células mamíferas son bien conocidos por el arte e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del (de los) polinucleótido (s) en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del DNA en núcleos. Además, moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células mamíferas mediante vectores virales. Métodos para la transformación de células son bien conocidos por el arte. Vea, por ejemplo, patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455 (patentes que son incorporadas en ésta por referencia) . Métodos de transformación de células vegetales son bien conocidos por el arte, incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por agrobacterium, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Métodos para transformar células bacterianas y de levadura también son bien conocidos por el arte. Lineas celulares mamiferas disponibles como hospedantes para la expresión son bien conocidas por el arte e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección American Type Culture Collection (ATCC) . Estas lineas celulares incluyen, ínter alia, células del ovario del hámster chino (Chinese hámster ovary (CHO) cells) , células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de riñon de la cria de hámster (baby hámster kidney (BHK) cells) , células del riñon del mono (COS) , células del carcinoma hepatocelular humano (por ej emplo, Hep G2) , células A549, células 3T3 y un número de otras líneas celulares. Células hospedantes mamíferas incluyen células humanas, de ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovino, caballo y hámster. Lineas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando aquellas líneas celulares que tienen elevados niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insectos, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican la cadena pesada o la porción que liga antigeno de la misma, la cadena liviana y/o la porción que liga antigeno de la misma en células hospedantes mamiferas, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedantes durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedantes o, más preferentemente, mediante la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedantes. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos estándar para la purificación de proteínas. Células vegetales hospedantes incluyen, por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lenteja de agua (duckweed) , maíz, trigo, papa, etc. Células hospedantes bacterianas incluyen las especies E. coli y Streptomyces . Células hospedantes de levadura incluyen Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisíae y Pichia pastoris . Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otros grupos funcionales de los mismos) de líneas celulares de producción puede intensificarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de genes con glutamina sintetasa (el sistema GS) es un enfoque común para aumentar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se discute total o parcialmente en conexión con las Patentes Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055, 0 338 841 y 0 323 997. Es probable que anticuerpos expresados por diferentes lineas celulares o en animales transgénicos tendrán una glicosilación diferente entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico provistas en ésta, o que comprenden las secuencias de aminoácidos provistas en ésta, forman parte de la presente invención, independientemente de la glicosilación de los anticuerpos . Animales y plantas transgénicos La invención también provee animales no humanos transgénicos y plantas transgénicas que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de la invención que pueden ser usados para producir anticuerpos de la invención. Los anticuerpos pueden ser producidos en y recuperados de tejidos o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hamsters u otros animales. Vea, por ej emplo, Patentes U.S. Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957. Según lo descrito precedentemente, pueden inmunizarse animales transgénicos humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana con MAdCAM o una porción del mismo. Métodos para producir anticuerpos en plantas están descritos, por ejemplo, en las patentes U.S. 6.046.037 y 5.959.177, incorporadas en ésta por referencia. En otra modalidad, animales no humanos transgénicos y plantas transgénicas son producidos mediante la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico de la invención en el animal o planta mediante técnicas transgénicas estándar. Vea Hogan, supra . Las células transgénicas usadas para hacer al animal transgénico pueden ser células del tronco embriónico, células somáticas o células de huevo fertilizado. Los organismos transgénicos no humanos pueden ser quiméricos, heterocigotas no quiméricos y ho ocigotas no quiméricos. Vea, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2 ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al . , Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press (2000) ; y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) . En otra modalidad, los organismos transgénicos no humanos pueden tener una ruptura dirigida y reemplazo que codifica una cadena pesada y/o una cadena liviana de interés. En una modalidad preferida, los animales o plantas transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y livianas que se combinan para ligarse específicamente a MAdCAM, preferentemente MAdCAM humano. En otra modalidad, los animales o plantas transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden fabricarse en cualquier animal transgénico. En una modalidad preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales. Bibliotecas de exhibición en fagos La invención provee un método para producir un anticuerpo anti-MAdCAM o una porción que liga antígeno del mismo que comprende las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos humanos en fagos, rastrear la biblioteca con MAdCAM o una porción del mismo, aislar el fago que liga MAdCAM y obtener el anticuerpo del fago. Un método para preparar la biblioteca de anticuerpos comprende las etapas de inmunizar un animal hospedante no humano que comprende un locus de inmunoglobulina humana con MAdCAM o una porción antigénica del mismo para crear una respuesta inmune, extraer células del animal hospedante que son responsables para la producción de anticuerpos; aislar de las células extraídas RNA, someter el RNA a transcripción inversa para producir cDNA, amplificar el cDNA usando un cebador, e insertar el cDNA en un vector de exhibición en fagos, de modo que los anticuerpos sean expresados en el fago. De este modo pueden obtenerse anticuerpos anti-MAdCAM recombinantes de la invención. Anticuerpos humanos anti-MAdCAM recombinantes de la invención, además de los anticuerpos anti-MAdCAM revelados en ésta, pueden aislarse mediante el rastreo de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos, preferentemente una biblioteca que exhibe en fagos scFv, preparada usando cDNAs de VL y VH humanas preparadas a partir de mRNA aislado de linfocitos humanos . Las metodologías para preparar y rastrear tales bibliotecas son conocidas en la técnica.
Equipos para generar bibliotecas que exhiben en fagos están comercialmente disponibles (por ejemplo, el sistema de anticuerpos recombinantes en fagos Pharmacia (Pharmacia Recombinant Phage Antibody System) , número de catálogo 27-9400-01; y el equipo de exhibición en fagos Stratagene SurfZAP*", número de catálogo 240612) . También hay otros métodos y reactivos que pueden usarse para generar y rastrear bibliotecas de exhibición de anticuerpos (vea, por ejemplo, Patente U.S. No. 5.223.409; Publicación PCT No. 92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. 92/20791; Publicación PCT No. WO 92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO 92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9:1369-1372; Hay et al., Hum . Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol . Biol . , 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res, 19:4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 88:7978-7982 (1991). En una modalidad preferida, para aislar anticuerpos anti-MAdCAM humanos con las características deseadas, primero se usa un anticuerpo anti-MAdCAM humano descrito en ésta para seleccionar secuencias de cadenas pesadas y livianas humanas que tienen actividad de ligadura similar hacia MAdCAM, usando métodos de imprinting de epitopes descritos en Hoogenboom et al., Publicación PCT No. WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpos usadas en este método son preferentemente bibliotecas en scFv preparadas y rastreadas según lo descrito en McCafferty et al., Publicación PCT No. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J 12:725-734 (1993). Las bibliotecas de anticuerpos en scFv son rastreadas preferentemente usando como antígeno MAdCAM humano. Una vez seleccionados los segmentos VL y VH iniciales humanos, se realizan experimentos de "mix and match" ("mezclar y unir") , en los cuales se rastrean diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados para la ligadura con MAdCAM, para seleccionar combinaciones preferidas de pares VL/VH. Adicionalmente, para mejorar aún más la calidad del anticuerpo, los segmentos VL y VH del (de los) par (es) preferido (s) VL/VH pueden ser sometidos a mutación aleatoria, preferentemente dentro de la región CDR3 de la VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable por la maduración de la afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración de la afinidad in vitro puede lograrse mediante la amplificación de regiones VH y VL, usando cebadores PCR complementarios a la CDR3 de la VH o CDR3 de la VL, respectivamente, cebadores que han sido "sembrados" [spiked] con una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en ciertas posiciones, de modo que los productos PCR resultantes codifiquen segmentos VH y VL en los cuales han sido introducidas mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de la VH y/o CDR3 de la VL. Estos segmentos VH y VL sometidos a mutación aleatoria pueden rastrearse nuevamente para la ligadura con MAdCAM. Después de la selección y aislación de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención a partir de una biblioteca que exhibe inmunoglobulina recombinante, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo seleccionado pueden recuperarse del paquete de exhibición (display package) (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresión mediante técnicas de DNA recombinante estándar. Si deseado, el ácido nucleico puede ser sometido a manipulación adicional para crear otras formas del anticuerpo de la invención, según lo descrito más abajo. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado mediante el rastreo de una biblioteca combinatoria, el DNA que codifica el anticuerpo es clonado en un vector de expresión recombinante e introducido en células hospedantes mamíferas, según lo descrito precedentemente. Conmutación de clases Otro aspecto de la presente invención es proveer un mecanismo mediante el cual la clase de un anticuerpo anti-MAdCAM puede ser conmutada por otra. En un aspecto de la invención, se aisla una molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH usando métodos bien conocidos en el arte de modo que no incluye cualquier secuencia nucleotidica que codifica CL o CH. Luego, la molécula de ácido nucleico que codifica VL o VH es ligada operativamente con una secuencia nucleotídica que codifica una CL o CH de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto puede lograrse usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica CL o CH, según lo descrito precedentemente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-MAdCAM que originalmente fue una IgM puede ser conmutado de clase a una IgG. Además, la conmutación de clase puede usarse para convertir una subclase IgG a otra subclase, por ejemplo, de IgG4 a IgG2. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprende una subclase de isotipo o anticuerpo deseada comprende los pasos de aislar un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM y un ácido nucleico que codifica la cadena liviana de un anticuerpo anti-MAdCAM, obtener la región variable de la cadena pesada, ligar la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar la cadena liviana y la cadena pesada ligada en una célula, y recolectar el anticuerpo anti-MAdCAM con el isotipo deseado. Derivados de anticuerpos Pueden usarse las moléculas de ácido nucleico descritas precedentemente para generar derivados de anticuerpos usando técnicas y métodos conocidos por un entendido en el arte. Anticuerpos humanizados La inmunogenicidad de anticuerpos no humanos puede ser reducida en alguna medida usando técnicas de humanización, empleando potencialmente técnicas de exhibición usando bibliotecas apropiadas. Será apreciado que anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies pueden ser humanizados o primatizados usando técnicas bien conocidas en el arte. Vea, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et al. Cri t . Reviews in Immunol . , 12125-168 (1992) . El anticuerpo de interés puede ser preparado mediante ingeniería genética usando técnicas de DNA recombinante para substituir los dominios visagra CH1, CH2, CH3, y/o el dominio framework con la secuencia humana correspondiente (vea WO 92/02190 y patentes U.S. Nos. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 y 5.777.085). En otra modalidad, un anticuerpo anti-MAdCAM no humano puede ser humanizado substituyendo el CH1, dominio visagra, CH2, CH3 y/o los dominios framework con la secuencia humana correspondiente de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención. Anticuerpos mutados En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y las células hospedantes pueden usarse para fabricar anticuerpos anti-MAdCAM mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o livianas para modificar una propiedad de ligadura del anticuerpo. Por ejemplo, puede efectuarse una mutación en una o varias de las regiones CDR para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo para MAdCAM. Técnicas de mutagénesis dirigidas a un sitio son bien conocidas por el arte. Vea, por ejemplo, Sambrook et al . y Ausubel et al . , supra . En una modalidad preferida, se efectúan mutaciones en un residuo de aminoácidos del cual se sabe que está modificado, en comparación con la línea germinal, en una región variable de un anticuerpo anti-MAdCAM. En una modalidad más preferida, se efectúan una o más mutaciones en un residuo de aminoácidos del cual se sabe que está cambiado en comparación con la linea germinal en una región variable o una región CDR de uno de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad, se efectúan una o más mutaciones en un residuo de aminoácidos del cual se sabe que está modificado con respecto a la linea germinal en una región variable o región CDR cuya secuencia de aminoácidos está presente en SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68 o cuya secuencia nucleotídica está presente en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 ó 67. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico son sometidas a mutación en una o más de las regiones framework. Puede efectuarse una mutación en una región framework o un dominio constante para aumentar la vida media del anticuerpo anti-MAdCAM. Vea, por ejemplo, WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 2000, incorporada en ésta por referencia. En una modalidad, puede haber una, tres o cinco o diez mutaciones puntuales y no más de quince mutaciones puntuales. También puede efectuarse una mutación en una región framework o en un dominio constante para modificar la inmunogenecidad del anticuerpo, para proveer un sitio para la ligadura covalente o no covalente con otra molécula, o para modificar propiedades tales como fijación de complemento. Pueden efectuarse mutaciones en cada una de las regiones framework, el dominio constante y las regiones variables de un anticuerpo mutado simple. Alternativamente, pueden efectuarse mutaciones en solo una de las regiones framework, las regiones variables o el dominio constante en un anticuerpo mutado simple. En una modalidad, no hay modificaciones mayores que de quince aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-MAdCAM mutado en comparación con el anticuerpo anti-MAdCAM previo a la mutación. En una modalidad más preferida, no hay más de diez modificaciones de aminoácidos en cualquiera de las regiones VH o VL del anticuerpo anti-MAdCAM mutado, más preferentemente no más de cinco modificaciones de aminoácidos, o aún más preferentemente no más de tres modificaciones de aminoácidos. En otra modalidad, no hay más de quince modificaciones de aminoácidos en los dominios constantes, más preferentemente, no más de diez cambios de aminoácidos, aún más preferentemente, no más de cinco cambios de aminoácidos. Anticuerpos modificados En otra modalidad, puede fabricarse un anticuerpo de fusión o una inmunoadhesina que comprende el total o una porción de un anticuerpo anti-MAdCAM ligado con otro polipéptido. En una modalidad preferida, solo las regiones variables del anticuerpo anti-MAdCAM están ligadas con el polipéptido. En otra modalidad preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-MAdCAM está ligado con un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-MAdCAM está ligado con un segundo polipéptido, asociado con el primer polipéptido de modo tal que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí para formar un sitio de ligadura de anticuerpo. En otra modalidad preferida, el dominio VH está separado del dominio VL mediante un engarce, de modo que los dominios VH y VL pueden interactuar entre sí (vea abajo bajo anticuerpos de cadena simple) . Luego, el anticuerpo VH-engarce-VL es ligado con el polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido hacia una célula o tejido que expresa MAdCAM. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, un factor de crecimiento u otra proteína regulatoria, o puede ser un agente diagnóstico, tal como una enzima que puede ser fácilmente visualizada, tal como peroxidasa de rábano picante. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena simple están ligados entre si. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo bivalente o polivante sobre una sola cadena polipeptidica, o si se desea crear un anticuerpo biespecifico. Para crear un anticuerpo de cadena simple (scFv) , los fragmentos del DNA que codifican VH y VL son ligados operativamente con otro fragmento que codifica un engarce flexible, por ejemplo, codifica la secuencia de aminoácidos (Gly -Ser) 3, de modo que las secuencias VH y VL pueden ser expresadas como una proteina de cadena simple contigua, con las regiones VL y VH unidas por el engarce flexible (vea, por ejemplo, Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)). El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si se usa solamente una sola VH y VL, bivalente, si se usan dos VH y VL, o polivante, si se usan más de dos VH y VL. En otra modalidad, pueden prepararse otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifican anti-MAdCAM. Por ejemplo, pueden prepararse "cuerpos Kappa" (111 et al., Protein Eng, 10: 949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diacuerpos" (Holliger et al . , PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10: 0:3655-3659 (1991) y Traunecker et al., "Janusin: un nuevo diseño molecular para reactivos biespecificos", Int J Cáncer Suppl 7:51-52 (1992)) usando técnicas estándar de biología molecular siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva. En otro aspecto, pueden generarse anticuerpos quiméricos y biespecificos. Puede fabricarse un anticuerpo quimérico que comprende regiones CDRs y framework de diferentes anticuerpos. En una modalidad preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDRs de la región variable de una cadena liviana o cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM humano, mientras que las regiones framework se derivan de uno o más anticuerpos diferentes. En una modalidad más preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDRs de las regiones variables -de la cadena liviana y la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM humano. Las regiones framework pueden ser de otras especies y, en una modalidad preferida, pueden ser humanizadas. Alternativamente, las regiones framework pueden ser de otro anticuerpo humano. Puede generarse un anticuerpo biespecífico que se liga específicamente a MAdCAM a través de un dominio ligante y a una segunda molécula a través de un segundo dominio ligante. El anticuerpo biespecífico puede producirse mediante técnicas recombinantes de biología molecular, o las moléculas pueden ser conjugadas físicamente entre si. Además, puede generarse un anticuerpo de cadena simple que contiene más de una VH y VL que se liga específicamente a MAdCAM y a otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas bien conocidas, por ejemplo, en conexión con (i) y (ii) vea , por ejemplo, Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, supra . , y en conexión con (iii) vea , por ejemplo, Traunecker et al. Int . J. Cáncer (Suppl . ) 7: 51-52 (1992) . En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico se liga a MAdCAM y a otra molécula expresada con alto nivel sobre células endoteliales. En una modalidad más preferida, la otra molécula es VCAM, ICAM o L-selectina. En varias modalidades, los anticuerpos modificados arriba descritos se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más de las regiones CDRs de uno de los anticuerpos seleccionados entre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ó 7.26.4-mod. En otra modalidad, los anticuerpos modificados se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más regiones CDR cuya secuencia de aminoácidos está presente en SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ó 68 o cuya secuencia nucleotídica está presente en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65 ó 67. Anticuerpos derivatizados y marcados Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser derivatizado o ligado a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína) . Generalmente, los anticuerpos o porciones de los mismos son derivatizados de modo que la ligadura con MAdCAM no sea afectada adversamente por la derivatización o el marcado. Por lo tanto, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención tienen la intención de incluir ambas, las formas intactas y las formas modificadas de los anticuerpos anti-MAdCAM humanos descritos en ésta. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede estar ligado funcionalmente (mediante enlace químico, función genética, asociación no covalente o de otro modo) con una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo) , un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o porción del anticuerpo con otra molécula, tal como una región del núcleo de estreptavidina o un rótulo de polihistidina. Un tipo de anticuerpo derivatizado es producido mediante la reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos) . Reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos claramente separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimídico) , o homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo) . Tales reticulantes están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, 111. Otro tipo de anticuerpo derivatizado es una anticuerpo marcado. Agentes de detección útiles con los cuales puede derivatizarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceina, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamino-l-naftalensulfonilo, ficoeritrina, sustancias fosforescentes a base de lantánidos y similares. Un anticuerpo también puede marcarse con enzimas útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo está marcado con una enzima detectable, es detectado mediante el agregado de reactivos adicionales usados por la enzima para producir un producto de reacción que puede ser discernido. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, el agregado de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado detectable. Un anticuerpo también puede ser marcado con biotina y ser detectado mediante medición indirecta de la ligadura de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede ser marcado con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede ser marcado con un epítope polipeptídico predeterminado reconocido por un repórter secundario (por ejemplo, secuencias apareadas de cierres de leucina, sitios de ligadura para anticuerpos secundarios, dominios que ligan metales, rótulos de epitopes) . En algunas modalidades, los marcadores están unidos mediante brazos espaciadores de longitudes variadas para reducir el potencial de impedimento esférico. Un anticuerpo anti-MAdCAM también puede estar marcado con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede ser usado tanto con propósitos diagnósticos como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar tejidos que expresan MAdCAM mediante rayos x u otras técnicas de diagnóstico. Además, el radiomarcador puede usarse terapéuticamente como una toxina para tejidos enfermos o tumores que expresan MAdCAM. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos o radionuclidos siguientes: H, C, 15„N, 35Sc, 90Y, "Te , X11ln , 125I , 131I . Un anticuerpo anti-MAdCAM también puede ser derivatizado con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG) , un grupo metilo o etilo o un grupo de hidrato de carbono. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la vida media en suero o para aumentar la ligadura al tejido. Esta metodología también se aplicará a fragmentos o versiones cualesquiera de anticuerpos anti-MAdCAM que ligan antigeno. Composiciones y equipos farmacéuticos En otro aspecto, la invención provee composiciones que comprenden un anticuerpo inhibitorio anti-MAdCAM humano y métodos para tratar sujetos con tales composiciones. En algunas modalidades, el sujeto de tratamiento es un humano. En otras modalidades, el sujeto es un sujeto veterinario. En algunas modalidades, el sujeto veterinario es un perro o un primate no humano. El tratamiento puede implicar la administración de uno o más anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM inhibitorios de la invención, o fragmentos que ligan antígeno de los mismos, solos o con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos anti-MAdCAM inhibitorios de la invención y las composiciones que los comprenden pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, diagnósticos o profilácticos adicionales. Agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes anti-inflamatorios o inmunomodulatorios . Estos agentes incluyen, pero no están limitados a, los corticosteroides tópicos y orales tales como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 o budesonida; los aminosalicilatos tales como mesalazina, olsalazina, balsalazida o NCX-456; la clase de inmunomoduladores tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilodecacina) , IL-11 (Oprelevcina) , IL-12, antagonistas de MIF/CD74, antagonistas de CD40, tales como TNX-100/5-D12, antagonistas de OX40L, GM- CSF, pimecrolimus o rapamicina; la clase de agentes anti-TNF tales como infliximab, adalimumab, • CDP-870, onercept, etanercept; la clase de agentes antiinflamatorios, tales como inhibidores de PDE-4 (roflumilast, etc) , inhibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc) e inhibidores de ICE (VX-740, etc) como así también antagonistas del receptor IL-2, tal como daclizumab, la clase de antagonistas de moléculas de adhesión selectivas, tales como natalizumab, MLN-02, o alicaforsen, clases de agentes analgésicos tales como, pero no estando limitados a, inhibidores de COX-2, tales como rofecoxib, valdecoxib, celecoxib, moduladores de canales de sensibilización de voltaje del tipo P/Q (c¿2d) , tales como gabapentina y pregabalina, antagonistas del receptor NK-1, modulares del receptor cannabinoide, y agonistas del receptor opioide delta, como asi también agentes anti-neoplásticos, anti-tumorales, anti-angiogénicos o quimioterapéuticos. Tales agentes adicionales pueden incluirse en la misma composición o administrarse por separado. En algunas modalidades, pueden usarse uno o más anticuerpos anti-MAdCAM inhibitorios de la invención como vacuna o como adjuvantes de una vacuna. Particularmente, debido a que MAdCAM es expresado en tejido linfoide, los antígenos de una vacuna pueden ser dirigidos ventajosamente al tejido linfoide conjugando el antigeno con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención. Según lo usado en ésta, "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos e intensificantes o retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución fisiológica, solución fisiológica buferada con fosfato, buffer de acetato con cloruro de sodio, dextrosa, glicerol, polietilenglicol, etanol y similares, como así también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Ejemplos adicionales de substancias farmacéuticamente aceptables son agentes tensoactivos, agentes de humectación o cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsión, preservativos o bufferes, que aumentan la vida de estante o efectividad del anticuerpo. Las composiciones de esta invención pueden encontrarse en una variedad de formas, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión) , dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, tortas liofilizadas, polvos secos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Composiciones preferidas típicas están en la forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como las composiciones similares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos. El modo de administración preferido es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico) . En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular, intradérmica o subcutánea. Composiciones terapéuticas típicas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como solución, torta liofilizada, polvo seco, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de droga. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del anticuerpo anti-MAdCAM en la cantidad requerida de un solvente apropiado con un, o una combinación de los, ingrediente (s) arriba enumerado (s) , según lo requerido, seguido de esterilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización, que proveen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada de dichos ingredientes. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre aquellos arriba enumerados. Pueden mantenerse las características deseadas de una solución usando, por ejemplo, agentes tensoactivos y el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión mediante el uso de agentes tensoactivos, fosfolipidos y polímeros. Puede lograrse una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato, materiales poliméricos, aceites y gelatina. Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos por el arte, si bien para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta / el modo preferido de administración es la infusión subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa. Como será apreciado por el entendido en el arte, la ruta y/o el modo de administración variará en dependencia de los resultados deseados . En ciertas modalidades, las composiciones del anticuerpo pueden prepararse con un excipiente que protegerá el anticuerpo contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados . Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o generalmente conocidos por los entendidos en el arte. Vea, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978) . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un excipiente comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si deseado) también puede ser encerrado en una cápsula de gelatina dura o blanda, comprimido en tabletas o incorporado directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden ser incorporados con excipientes y ser usados en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante otro tipo de administración que la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-admínistrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Las composiciones de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o una porción que liga antigeno de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una cantidad con la cual se compensan efectos tóxicos o perniciosos cualesquiera del anticuerpo o porción de anticuerpo mediante los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica se usa en sujetos previo a, o en una etapa anterior de, la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proveer la respuesta óptima deseada (por ej emplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, varias dosis divididas durante un periodo de tiempo, o la dosis puede ser reducida o aumentada proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en la forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. "Forma de unidad de dosificación", según lo usado en ésta, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el tratamiento de sujetos mamíferos; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el excipiente farmacéutico requerido. La especificación de las formas de unidad de dosificación de la invención es dictada por, y directamente dependiente de, (a) las características únicas del anticuerpo anti-MAdCAM o la porción del mismo y del efecto terapéutico o profiláctico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes al arte de formular la composición de tal anticuerpo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Una gama típica, no limitativa, para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,025 a 50 mg/kg, más preferentemente 0,1 a 50 mg/kg, más preferentemente 0,1-25, 0,1 a 10 ó 0,1 a 3 mg/kg. En algunas modalidades, una formulación contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un buffer de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM y 0,2 mg/ml de polisorbato 80. Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la severidad de la condición a ser aliviada. Debe entenderse, además, que para cualquier sujeto particular deben ajustarse regímenes de dosificación específicos a lo largo del tiempo, de acuerdo con la necesidad del individuo y la evaluación profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las gamas de dosificación establecidas en ésta son dadas solamente a modo de ejemplo y no tienen la intención de limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. Otro aspecto de la presente invención provee equipos que comprenden un anticuerpo anti-MAdCAM o un porción de anticuerpo de la invención o una composición que comprende tal anticuerpo. Un equipo puede incluir, además del anticuerpo o la composición, agentes diagnósticos o terapéuticos. Un equipo también puede incluir instrucciones de uso para un método diagnóstico o terapéutico. En una modalidad preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y un agente diagnóstico que puede ser usado en un método descrito más abajo. En otra modalidad preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición que lo comprende y uno o más agentes terapéuticos que pueden usarse en un método descrito más abajo.
Terapia con genes Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden administrarse a un paciente que lo necesita via terapia con genes. La terapia puede ser o in vivo o ex vivo . En una modalidad preferida, se administran a un paciente moléculas de ácido nucleico que codifican ambas, una cadena pesada y una cadena liviana. En una modalidad más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de modo tal que se integran en forma estable en los cromosomas de células B, debido a que estas células están especializadas para producir anticuerpos. En una modalidad preferida, células B precursoras se transfectan o infectan ex vivo y se re-transplantan en un paciente que lo necesita. En otra modalidad, células B precursoras u otras células se infectan in vivo usando un virus recombinante conocido por infectar el tipo celular de interés. Vectores típicos usados para terapia con genes incluyen liposomas, plásmidos y vectores virales. Vectores virales típicos son retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados . Después de la infección in vivo o ex vivo, pueden monitorearse los niveles de expresión del anticuerpo tomando una muestra del paciente tratado y usando cualquier inmunoensayo conocido en el arte o discutido en ésta . En una modalidad preferida, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción que liga antigeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y expresar la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM y expresar la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, el método de terapia con genes comprende las etapas de administrar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena liviana o la porción que liga antígeno de la misma de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención y expresar las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia con genes también puede comprender la etapa de administrar otro agente antiinflamatorio o inmunomodulatorio . Métodos diagnósticos usados Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en una muestra biológica in vitro o in vivo . Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse en un inmunoensayo convencional, incluyendo, sin limitación, un ensayo ELISA, un ensayo RÍA, FACS, inmunohistoquimica de tejidos, transferencia de Western o inmunoprecipitación. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención pueden usarse para detectar MAdCAM de humanos. En otra modalidad, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM de primates Oíd World tales como monos cynomolgus y rhesus, chimpancés y simios. La invención provee un método para detectar MAdCAM en una muestra biológica, método que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención y detectar el anticuerpo ligado a MAdCAM. En una modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM es derivatizado directamente con un marcador detectable. En otra modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM (el primer anticuerpo) no está marcado y un segundo anticuerpo u otra molécula que puede ligar al anticuerpo anti-MAdCAM está marcado. Como es bien conocido por un entendido en el arte, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de ligar específicamente la especie y clase especifica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-MAdCAM es una IgG humana, entonces el segundo anticuerpo puede ser una IgG anti-humana. Otras moléculas que pueden ligarse con anticuerpos incluyen, sin limitación, Proteína A y Proteína G, ambas disponibles comercialmente, por ejemplo, de Pierce Chemical Co. Marcadores adecuados para el anticuerpo o anticuerpo secundario se han revelado supra , e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radioactivos.
Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. En una modalidad alternativa, MAdCAM puede ensayarse en una muestra biológica mediante un inmunoensayo de competición utilizando estándares de MAdCAM marcados con una substancia detectable y un anticuerpo anti-MAdCAM no marcado. En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los estándares de MAdCAM marcados y el anticuerpo anti-MAdCAM, y se determina la cantidad de MAdCAM estándar marcado ligada al anticuerpo no marcado. La cantidad de MAdCAM en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de MAdCAM estándar marcado ligada al anticuerpo anti-MAdCAM. Los inmunoensayos arriba expuestos pueden usarse para varios propósitos. En una modalidad, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para detectar MAdCAM en células de un cultivo celular. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti- MAdCAM pueden usarse para determinar el nivel de expresión de MAdCAM en la superficie celular después del tratamiento de las células con varios compuestos. Este método puede usarse para ensayar compuestos que pueden usarse para activar o inhibir MAdCAM. En este método, una muestra de células se trata con un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo mientras que se deja otra muestra sin tratar, pudiendo determinarse luego la expresión en la superficie celular mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica, transferencia de Western, ELISA o RÍA. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en mayor escala para una clasificación de alto rendimiento, con el fin de ensayar un gran número de compuestos, ya sea para la activación o inhibición de MAdCAM. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención también pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM en un tejido o en células derivadas del tejido. En una modalidad preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una modalidad más preferida, el tejido es el tracto gastrointestinal inflamado o una biopsia del mismo. En una modalidad preferida del método, un tejido o una biopsia del mismo es extirpado de un paciente. Luego, el tejido o biopsia se usa en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, niveles de MAdCAM, niveles de MAdCAM en la superficie celular o la ubicación de MAdCAM mediante los métodos discutidos precedentemente. El método puede usarse para determinar si un tejido inflamado expresa un elevado nivel de MAdCAM. El método diagnóstico arriba descrito puede usarse para determinar si un tejido expresa altos niveles de MAdCAM, lo que puede ser una indicación de que el tejido responderá bien al tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM. Además, el método diagnóstico también puede usarse para determinar si el tratamiento con anticuerpo anti-MAdCAM (vea más abajo) tiene el efecto de que un tejido expresa niveles menores de MAdCAM, pudiendo usarse el método de este modo para determinar si el tratamiento es exitoso. Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse in vivo para localizar tejidos y órganos que expresan MAdCAM. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para localizar tejido inflamado. La ventaja de los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente invención es que no generarán una respuesta inmune con la administración. El método comprende las etapas de administrar un anticuerpo anti-MAdCAM o una composición farmacéutica del mismo a un paciente que necesita tal ensayo diagnóstico y someter al paciente a un análisis por imagen para determinar la ubicación de los tejidos que expresan MAdCAM. El análisis por imagen es bien conocido por el arte médico, e incluye, sin limitación, análisis con rayos x, gammagrafía, diagnóstico por imagen con resonancia magnética (MRI) , tomografía de emisión de positrones o tomografía computada (CT) . En otra modalidad del método, en vez de someter al paciente a un análisis por imagen, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa MAdCAM. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden marcarse con un agente detectable que puede ser determinado en un paciente mediante análisis por imagen. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un agente de contraste, tal como bario, que puede usarse para análisis con rayos x, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, que puede usarse para MRI o CT. Otros agentes marcadores incluyen, sin limitación, radioisótopos, tal como 99Tc. En otra modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM no estará marcado y será diagnosticado por imagen mediante la administración de un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que pueda ligar el anticuerpo anti-MAdCAM. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la invención también pueden usarse para determinar los niveles de MAdCAM soluble presentes en sangre, suero, plasma u otro biofluido de un donante, incluyendo, pero no estando limitado a, una muestra de deposición, orina, esputo o biopsia. En una modalidad preferida, el biofluido es plasma. Luego, el biofluido se usa en un inmunoensayo para determinar niveles de MAdCAM soluble. MAdCAM soluble puede ser un marcador sustituto para una inflamación gastrointestinal en curso y el método de detección puede usarse como un marcador diagnóstico para medir la severidad de la enfermedad. El método diagnóstico arriba descrito puede usarse para determinar si un individuo expresa altos niveles de MAdCAM soluble, lo que puede ser una indicación de que el individuo responderá bien al tratamiento con un anticuerpo anti-MAdCAM. Además, el método diagnóstico también puede usarse para determinar si el tratamiento de la enfermedad con anticuerpo anti-MAdCAM (vea más abajo) u otro agente farmacéutico tiene el efecto de que el individuo expresa niveles menores de MAdCAM, y de este modo el método puede usarse para determinar si el tratamiento es exitoso. Inhibición de la adhesión a ß7/MAdCAM-dependiente mediante un anticuerpo anti-MAdCAM: En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo anti-MAdCAM que liga MAdCAM e inhibe la ligadura y adhesión de células que llevan la integrina a4ß7 a MAdCAM o de otros ligandos análogos, tal como L-selectina, a MAdCAM. En una modalidad preferida, la M?dCAM es humana y o es una forma soluble o es expresada sobre la superficie de una célula. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra modalidad, el anticuerpo o una porción del mismo inhibe la ligadura entre a4ß7 y MAdCAM con un valor de la IC50 no mayor de 50 nM. En una modalidad preferida, el valor de la IC50 no es mayor de 5 nM. En una modalidad más preferida, el valor de la IC50 es menor de 5 nM. En una modalidad más preferida, el valor de la IC50 es menor de 0,05 µg/mL, 0,04 µg/mL o 0,03 µg/mL. En otra modalidad preferida, el valor de la IC50 es menor de 0,5 µg/mL, 0,4 µg/mL o 0,3 µg/mL. El valor de la IC50 puede medirse mediante cualquier método conocido en el arte. Típicamente, el valor de la IC50 puede medirse mediante ELISA o un ensayo de adhesión. En una modalidad preferida, el valor de la IC50 se mide mediante un ensayo de adhesión usando células o tejidos que expresan MAdCAM naturalmente o células o tejidos que han sido fabricados mediante ingeniería genética para expresar MAdCAM. Inhibición del reclutamiento de linfocitos para el tejido linfoide asociado al intestino mediante anticuerpos anti-MAdCAM En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo anti-MAdCAM que liga M?dCAM naturalmente expresado e inhibe la ligadura de linfocitos al tejido linfoide gastrointestinal especializado. En una modalidad preferida, el MAdCAM expresado naturalmente es MAdCAM humano o de primate y o se encuentra en una forma soluble, o es expresado sobre la superficie de una célula. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra modalidad, el anticuerpo o una porción del mismo inhibe el reclutamiento de linfocitos a4ß7+' intestino-tróficos para tejidos que expresan MAdCAM con un valor de la IC50 no mayor de 5 mg/kg. En una modalidad preferida, el valor de la IC50 no es mayor de 1 mg/kg. En una modalidad más preferida, el valor de la IC50 es menor de 0,1 mg/kg. En una modalidad, puede determinarse el valor de la IC50 midiendo la relación dosis-efecto del reclutamiento de linfocitos de la sangre periférica marcados con tecnecio para el tracto gastrointestinal, usando gammagrafia o tomografia computarizada de emisión monofotónica . • En otra modalidad, el valor de la IC50 puede determinarse midiendo en la circulación periférica el aumento en linfocitos ß -intestino-tróficos, tales como, pero no estando limitados a, células T de memoria CD4+ aß7+ usando citometria de flujo como una función de la dosis del anticuerpo anti-MAdCAM. Con el fin de un mejor entendimiento de esta invención, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos tienen solamente el propósito de ilustración y no deben ser interpretados como limitativos de cualquier modo del alcance de la invención. EJEMPLO 1: Generación de hibridomas que producen anti-MAdCAM Se prepararon, ensayaron y seleccionaron anticuerpos de la invención de acuerdo con el presente Ejemplo. Preparación del inmunógeno primario: Se prepararon dos inmunógenos para la inmunización de ratones XenoMouse™: (i) una proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe y (ii) membranas celulares preparadas a partir de células transfectadas establemente con M?dCAM. (i) Proteína de fusión MAdCAM-IgGx Fe Construcción del vector de expresión: Se escindió un fragmento de cDNA EcoRI/BglII que codifica el dominio maduro extracelular, similar a inmunoglobulina, de MAdCAM de un clon pINCY Incyte (3279276) y se clonó en sitios EcoRI/BamHI del vector pIGl (Simmons, D. L. (1993) in Cellular Interactions in Development : A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.)) para generar una proteína de fusión IgG? Fe en el marco de lectura. El inserto resultante se cortó con EcoRI/Notl y se clonó en pCDNA3.1+ (Invitrogen). Se confirmó la secuencia del cDNA MAdCAM-IgGi Fe en el vector. La secuencia de aminoácidos de la proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe se muestra más abajo: Proteina de fusión MAdCAM-IgGx Fe: MDFGLALLLAGLLGLLLGQS QVKPLQVEPPEPWAVALG?SRQLTCRLACADRGASVQWR GLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAA6TRVCVGSCGGRTPQH VQLLVYAPPDQLTVSP AALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSL VGGQE EGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLF RVTERWR PPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTT SPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTR TRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK ATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107) Subrayado: péptido señal Negrita: dominio extracelular MAdCAM Expresión/purificación de la proteína recombinante: Células CHO-DHFR se transfectaron con el vector pCDNA3.1+ que contiene el cDNA de la proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe y clones estables que expresan la proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe seleccionados en el medio de Iscove que contiene 600 µg/mL de G418 y 100 ng/mL de metotrexato. Para la expresión de la proteina, se sembró un bioreactor de fibra hueca con células CHO que expresan establemente MAdCAM-IgGi Fe en medio de Iscove que contiene 10% de suero bovino fetal de bajo título de IgG (Gibco) , aminoácidos no esenciales (Gibco) , glutamina 2 mM (Gibco) , piruvato de sodio (Gibco) , 100 µg/mL de G418 y 100 ng/mL de metotrexato y se usó para generar un sobrenadante del medio concentrado. La proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe se purificó a partir del sobrenadante cosechado mediante cromatografía de afinidad. Brevemente, el sobrenadante se aplicó a una columna HiTrap con proteina G sefarosa (5 mL, Pharmacia) (2 mL/min), se lavó con Tris 25 mM, pH 8, NaCl 150 mM (5 volúmenes de columna) y se eluyó con glicina 100 mM, pH 2,5 (1 mL/min), neutralizando inmediatamente las fracciones a pH 7,5 con Tris 1 M, pH 8. Las fracciones que contienen proteina de fusión MAdCAM-IgG? Fe se identificaron mediante SDS-PAGE, se reunieron y se aplicaron a una columna Sephacryl S100 (Pharmacia) , pre- equilibrada con BisTris 35 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM. La filtración por gel se realizó a 0,35 mL/min, recolectando un pico de proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe en aproximadamente 3 fracciones de 5 mL. Estas muestras se reunieron y se aplicaron a una columna Resource Q (6 mL, Pharmacia), pre-equilibrada en BisTris 35 mM, pH 6,5. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Bis Tris 35 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM (6 mL/min) y la proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe se eluyó en una fracción de 4-6 mL con Bis Tris 35 mM, pH 6,5, NaCl 400 mM. En esta etapa, la proteína tenía una pureza de 90% y migró como una banda simple a aproximadamente 68 kD mediante SDS-PAGE. Para su uso como inmunógeno y en todos los ensayos subsecuentes, el material se intercambió al buffer HEPES 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, glicerol al 50% y se almacenó en alícuotas a -80°C. (ii) Membranas celulares que expresan establemente MAdCAM Un fragmento Sacl/Notl que comprende los nucleótidos 645-1222 de la secuencia MAdCAM publicada (Shyjan AM, et al., J Immunol . , 156, 2851-7 (1996)) se amplificó mediante PCR a partir de una biblioteca de cDNA de colon y se clonó en sitios de Sacl/Notl del vector pIND-Hygro (Invitrogen) . En esta construcción se subclonó un fragmento Sacl, que comprende la secuencia codificadora 5' adicional, a partir de pCDNA3.1 MAdCAM-IgGx Fe, para generar el cDNA de MAdCAM de longitud completa. Luego se clonó un fragmento Kpnl/Notl que contiene el cDNA de MAdCAM en los sitios correspondientes de un vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) y reemplazando la secuencia codificadora CAT. Se verificó la secuencia del inserto de cDNA y se usó en transíecciones para generar clones simples de expresión estable en células Flpln NIH 3T3 (Invitrogen) mediante la tecnología de Flp recombinasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron clones de expresión estable por su capacidad de sustentar la ligadura de una línea celular linfoblastoide B humana JY 4ß7+ (Chan BM, et al. J. Biol . Chem . , 267:8366-70 (1992)), resumida más abajo. Del mismo modo se prepararon clones estables de células CHO que expresan MAdCAM, usando células Flpln CHO (Invitrogen) . Se cultivaron células Flpln NIH-3T3 que expresan MAdCAM en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) que contiene L-glutamina 2 mM, suero de ternero Donor al 10% (Gibco) y 200 µg/mL dé higromicina B (Invitrogen) y se expandieron en botellas con una gran superficie interior (roller bottles) . Se cultivaron células Flpln CHO que expresan MAdCAM en el medio de Ham F12 / medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) que contiene L-glutamina 2 mM, suero de ternero Donor al 10% (Gibco) y 350 µg/mL de higromicina B (Invitrogen) y se expandieron en botellas "roller". Las células se cosecharon usando una solución de disociación celular no enzimática (Sigma) y por raspado, lavando en solución fisiológica con buffer de fosfato mediante centrifugación. Las membranas celulares se prepararon a partir de la pella celular mediante dos rondas de homogenización politron en Bis Tris 25 mM pH 8, MgCl2 10 mM, aprotinina al 0,015% (p/v), bacitracina 100 U/mL y centrifugación. La pella final se resuspendió en el mismo buffer, y se agregaron en alícuotas 50xl06 equivalentes celulares en tubos eppendorf de pared gruesa y se centrifugaron a >100.000 g para generar pellas de membrana celular para la inmunización de ratones XenoMouse. El sobrenadante se decantó y las membranas se almacenaron en tubos eppendorf a -80°C hasta su uso. La confirmación de la expresión de proteina en las membranas celulares se determinó mediante SDS-PAGE y transferencia de Western con un anticuerpo anti-péptido de conejo dirigido contra los residuos N-terminales de MAdCAM ( [C] -KPLQVEPPEP) . Inmunización y generación de hibridomas: Ratones XENOMOUSE'" de ocho a diez semanas de edad se inmunizaron intraperitonealmente o en las plantas de sus patas traseras con la proteína de fusión recombinante purificada MAdCAM-IgGi Fe (10 µg/dosis/ratón) , o con membranas celulares preparadas a partir de células MAdCAM-CHO o células NIH 3T3 de expresión estable (10 x 106 células/dosis/ratón) . Esta dosis se repitió cinco a siete veces durante un período de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final del dominio extracelular de MAdCAM humano en PBS. Los linfocitos del bazo y del nodo linfático de los ratones inmunizados se fusionaron con la linea celular no secretoria del mieloma P3-X63-Ag8.653 y se sometieron a selección en medio HAT como previamente descrito (Galfre y Milstein, Methods Enzymol . 73:3-46 (1981)). Se recuperó y se subclonó un panel de hibridomas que segregan todos anticuerpos IgG2? e IgG4? humanos específicos para MAdCAM. Doce subclones de hibridoma, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, que producen anticuerpos monoclonales específicos para MAdCAM se recuperaron y se detectaron con ensayos descritos más abajo. Las líneas parentales 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16, 7.20, 7.26 y 9.8, de las cuales se derivaron las lineas de hibridoma subclonado 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, tenían todas actividad anti-MAdCAM. Ensayos ELISA: La detección de anticuerpos antígeno-específicos en suero de ratón y sobrenadante de hibridoma se determinó mediante ELISA según lo descrito (Coligan et al., Unit 2.1 "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current Protocolslinlmmunology (1994)) utilizando la proteina de fusión MAdCAM-IgG? Fe para captar los anticuerpos. Para los animales que se inmunizaron con proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe, los anticuerpos se clasificaron según su reactividad no especifica contra IgGi humana y su capacidad para ligarse a células Flpln CHO MAdCAM mediante citometría de flujo. En un ensayo ELISA preferido, se usan las técnicas siguientes: Placas ELISA se recubrieron durante la noche a 4°C con 100 µL/cavidad de proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe (4,5 µg/mL), conteniendo las placas buffer (buffer de carbonato / bicarbonato de sodio 100 mM, pH 9,6). Después de la incubación, se sacó el buffer de recubrimiento y la placa se bloqueó con 200 µL/cavidad de buffer de bloqueo (5% de BSA, 0,1% de Tween 20, en solución fisiológica con buffer de fosfato) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El buffer de bloqueo se separó y se agregaron durante 2 horas a temperatura ambiente 50 µL/cavidad de sobrenadante de hibridoma u otro suero o sobrenadante (por ej emplo, control positivo) . Después de la incubación, la placa se lavó con PBS (3 x 100 µL/cavidad) y se detectó la ligadura del mAb del hibridoma con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (es decir, IgG2-HRP anti-humana de ratón 1:1000 (Cat. SB No. 9060-05) para anticuerpos IgG2 o IgG4-HRP anti-humana de ratón 1:1000 (Cat. Zymed No. 3840) para anticuerpos IgG4) diluidos en PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron en PBS (3 x 100 µL/cavidad) y finalmente se desarrollaron con 100 µL de OPD (o-fenilendiamina (DAKO S2405) + 5 µL de H202 al 30% / 12 mL) . Las placas se dejaron desarrollar durante 10-20 minutos, deteniendo la reacción con 100 µL de H2S0 2 M. Las placas se leyeron a 490 nm. Ensayos de adhesión: Anticuerpos que mostraron mediante ELISA una ligadura a la proteína de fusión MAdCAM-IgGl Fe se evaluaron por su actividad antagonista en ensayos de adhesión con células JY a4ß7+ y (i) proteína de fusión MAdCAM-IgGa Fe o (ii) células MAdCAM-CHO. (i) Ensayo con la proteina de fusión MAdCAM-IgG? Fe lOOµL de una solución de 4,5 µg/mL de proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe en PBS de Dulbecco se adsorbieron sobre placas Black Microfluor "B" de fondo en u con 96 cavidades (Dynex #7805) durante la noche a 4°C. Luego, las placas recubiertas con M?dCAM se invirtieron y se separó el exceso de liquido con papel secante, antes de bloquear a 37 °C durante al menos 1 hora en BSA/PBS al 10%. Durante este tiempo se contaron células JY cultivadas utilizando selección con azul de triptano (debe haber aproximadamente 8 x 105 células/mL) y en un tubo de centrifuga de 50 mL se pipetearon 20 x 10 células/placa de ensayo. Las células JY se cultivaron en medio RPMI1640 (Gibco) , que contiene L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (Life Technologies #10108-165) , y se sembraron a 1-2 x 105/mL cada 2-3 dias para prevenir la diferenciación del cultivo. Las células se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 (Gibco) que contiene L- glutamina 2 mM (Gibco) mediante centrifugación (240 g) , resuspendiendo la pella celular final a 2 x 106 células/mL en RPMI 1640 para cargar calceina AM. A las células se agregó calceína AM (Sondas Moleculares #C-3099) en la forma de una dilución 1:200 en DMSO (concentración final aproximadamente 5 µM) y las células se protegieron de la luz durante la incubación (37°C durante 30 min) . Durante esta etapa de incubación de las células, los anticuerpos a ser ensayados se diluyeron como sigue: para el ensayo de una sola dosis, los anticuerpos se llevaron a la concentración de 3 µg/mL (1 µg/mL final) en 0,1 mg/mL de BSA (Sigma#A3059) en PBS; para curvas completas de IC50, los anticuerpos se diluyeron en 0,1 mg/mL de BSA/PBS, siendo la concentración máxima de 3 µg/mL (1 µg/mL final) , luego se duplicaron las diluciones (relación 1:2) a través de la placa. La cavidad final de la fila se usó para determinar ligadura total, de modo que se usó 0,1 mg/ml de BSA en PBS. Después del bloqueo, se sacó el contenido de la placa golpeando ligeramente, y a cada placa se agregaron 50 µL de anticuerpos/controles y se incubó a 37 °C durante 20 minutos. Durante este tiempo, células JY cargadas con calceina se lavaron con centrifugación, una vez con medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal y una vez con BSA/PBS 1 mg/mL, resuspendiendo la pella celular final en 1 mg/mL de BSA/PBS a la concentración de 1 x 106 mg/mL. A cada cavidad de la placa con fondo en U se agregaron 100 µL de células, la placa se cerró, se centrifugó brevemente (1000 rpm durante 2 min) y luego se incubó la placa a 37°C durante 45 min. Después de este tiempo, las placas se lavaron con un lavador de placas Skatron y se midió la fluorescencia con un instrumento Wallac Victor2 1420 Multilabel Reader (excitación ?485nm, emisión ? 535nm, conteo desde arriba, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 seg con apertura de emisión normal) . Para cada concentración de anticuerpo, el porcentaje de adhesión se expresó como un porcentaje de la respuesta máxima de fluorescencia en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con ligadura no específica. El valor IC5o se define como la concentración de anticuerpo anti-MAdCAM a la cual la respuesta de adhesión está disminuida al 50% de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Se consideró que los anticuerpos capaces de inhibir la ligadura de células JY a la proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe con un valor IC50<0,1 µg/mL tienen una actividad antagonista potente y estos anticuerpos se pasaron al ensayo de adhesión a MAdCAM-CHO. Todos los doce anticuerpos ensayados mostraron una actividad antagonista potente (Tabla 3). Los anticuerpos monoclonales 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 y 7.26.4 se derivaron de las lineas IgG2?, y los anticuerpos monoclonales 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 y 9.8.2 se derivaron de las lineas IgG?. (ii) Ensayo de adhesión a células MAdCAM-CHQ Se cultivaron células JY según lo descrito precedentemente. Las células CHO que expresan MAdCAM se generaron con la construcción pEF5FRT cDNA de MAdCAM y usando la tecnología de Flp reco binasa (Invitrogen) según lo descrito precedentemente. Se seleccionaron clones individuales estables de células CHO que expresan MAdCAM en base a su capacidad de sostener la adhesión de células JY y la ligadura, mediante citometria de flujo, del anticuerpo antipéptido de conejo dirigido contra el N-terminal de MAdCAM y descrito precedentemente. Células CHO que expresan MAdCAM se cultivaron en un medio DMEM/F12 (Gibco # 21331-020) que contiene L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10% (Gibco) e higromicina B 350 µg/mL (Invitrogen), dividiendo 1:5 cada 2/3 dias. Para el ensayo de adhesión, las células CHO que expresan MAdCAM se sembraron a 4 x 104 células/cavidad en placas negras de 96 cavidades con fondo claro (Costar # 3904) en 200 µL de medio de cultivo y se cultivaron durante la noche a 37 °C / 5% de C02. Al dia siguiente, un sobrenadante de hibridoma o un anticuerpo monoclonal purificado se diluyó desde una concentración inicial de 30 µg/mL (equivalente a una concentración final de 10 µg/mL) en 1 mg/mL de BSA/PBS, según lo descrito previamente. Se sacó el contenido de las placas con MAdCAM CHO golpeando ligeramente, se agregaron 50 µL de anticuerpos/controles a cada placa y se incubó a 37°C durante 20 min. La cavidad final de la fila se usó para determinar la ligadura total, de modo que se usó 0,1 mg/mL de BSA en PBS. Se prepararon células JY cargadas con calceína AM con una concentración final de 1 x 106/mL en BSA/PBS 1 mg/mL según lo arriba indicado, luego se agregaron a la placa 100 µL después del perído de incubación de 20 min con el anticuerpo. Luego, la placa se incubó a 37°C durante 45 min, se lavó con un lavador de placas Tecan (PW 384) y se midió la fluorescencia con un lector de placas Wallac según lo descrito precedentemente. Para cada concentración de anticuerpo, el porcentaje de adhesión se expresó como un porcentaje de la respuesta máxima de fluorescencia en ausencia de cualquier anticuerpo menos la fluorescencia asociada con ligadura no especifica. Se consideró que los anticuerpos capaces de inhibir la ligadura de células JY a células MAdCAM CHO con un valor IC5o<l µg/mL tienen una actividad antagonista potente.
Como antes, el valor IC50 se define como la concentración de anticuerpo anti-MAdCAM a la cual la respuesta de adhesión está disminuida al 50% de la respuesta en ausencia de anticuerpo anti-MAdCAM. Las potencias IC50 para 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 en este ensayo se describen en la Tabla 3 siguiente. Tabla 3. Valores IC50 de anticuerpos anti-MAdCAM ej emplificados Proteína de fusión Ensayo MAdCAM Flpln Clon MAdCAM IgGi Fe IC50 CHO IC50 promedio prornedio (µg/mL) n (µg/mL) n 1.7.2 0.030 + 0.011 6 0.502 + 0.280 9 1.8.2 0.027 ± 0.011 4 0.424 ± 0.107 8 7.16.6 0.019 ± 0.009 7 0.389 + 0.093 16 7.20.5 0.025 ± 0.027 7 0.387 ± 0.202 9 7.26.4 0.021 ± 0.040 4 0.574 ± 0.099 15 6 1¿ •"* 0.011 ± 0.005 4 0.291 ± 0.096 6 0.018 ± 0.011 4 0.573 ± 0.168 7 6.34.2 0.013 ± 0.008 4 0.285 ± 0.073 7 6.67,1 0.013 ± 0.070 4 0.298 + 0.115 8 0.020 ± 0.010 4 0.369 ± 0.103 8 6.77.1 0.022 ± 0.004 4 0.520 + 0.100 4 9.8.2 0.020 ± 0.050 4 0.440 ± 0.342 8 llgG2 IgG4 j Para medir la potencia antagonista de anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-MAdCAM en ensayos a base de flujometria, bajo condiciones de stress por cizallamiento diseñadas para mimetizar el efecto del ambiente microvascular sobre las vénulas altas endoteliales que irrigan el tejido linfoide asociado con el intestino, se depositaron células CHO que expresan MAdCAM sobre microportaobjetos (microslides) de vidrio (50 x 4 mm) y se dejaron adherir las células para formar una monocapa confluyente ( aprox . 2,5 x 105 células). Luego, las células se incubaron con una gama de concentraciones (0,1-10 µg/mL) de un cuerpo monoclonal purificado por afinidad durante 20 minutos a 37°C, antes de la conexión con el sistema de determinación de flujo. Como control negativo se usó un anticuerpo monoclonal del isotipo IgG2 o IgG (10 µg/mL) . La monocapa celular se perfusionó con linfocitos de la sangre periférica (peripheral blood lymphocytes = PBLs) de un donante normal con un stress por cizallamiento constante de 0,05 Pa. Los experimentos se grabaron en vídeo y se calculó la adhesión total de los linfocitos (rodadura + adhesión firme) . Se mostró que todos los anticuerpos monoclonales ensayados eran antagonistas potentes bajo las condiciones descritas, (iii) Ensayos Stamper-Woodruff Para visualizar vasos MAdCAM+, se generaron anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM biotinilados sobre 1-2 mg de proteina purificada por afinidad, usando un exceso 20 molar de biotina-NHS (Pierce) en solución fisiológica con buffer de fosfato, según las instrucciones del fabricante. La reacción se deja proceder a temperatura ambiente (30 min), se desmineralizó con una columna PD-10 (Pharmacia) y se determinó la concentración de la proteina. Nodos linfáticos de hígado normal se separaron del órgano de un donante, se congelaron rápidamente en nitrógeno liquido y se almacenaron a -70°C hasta el uso. Previo al ensayo se cortaron secciones criostáticas de 10 µm, se secaron con aire sobre portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina y se fijaron en acetona. Las secciones se bloquearon usando un sistema de bloqueo con avidina-biotina (DAKO) y luego se incubaron con una gama de concentraciones (1-50 µg/mL) de anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM biotinilado a temperatura ambiente (2 h) . Como control negativo se usó un anticuerpo monoclonal del tipo IgG2 o IgG (50 µg/mL) y como control positivo se usó un anticuerpo anti-ß bloqueante (50 µg/mL) . Linfocitos de sangre periférica, tomados de donantes normales, se marcaron con mAb CD2 anti-humano de ratón (DAKO) para posibilitar la visualización subsecuente de células adherentes. 5 x 105 PBLs se agregaron a cada sección del nodo linfático y se incubaron durante 30 minutos antes de enjuagar suavemente para evitar el desprendimiento de células adheridas. Luego las secciones se refijaron en acetona y se reincubaron con mAb anti-MAdCAM biotinilado (10 µg/mL) , seguido de mAb anti-ratón de cabra biotinilado (para reconocer PBLs marcados con CD2 y vasos MAdCAM+ sin teñir) y luego del complejo streptABcomplex/HRP (DAKO) . Finalmente, los vasos MAdCAM+ y las PBLs marcados con CD2 se visualizaron mediante el agregado de substrato DAB (DAKO) a las secciones, señalando un producto de reacción marrón las áreas de coloración positiva. La adhesión de linfocitos fue cuantificada mediante el conteo del número de linfocitos que se adhirieron a 50 vasos MAdCAM-l+ de tractos portales, venas o sinusoides. Los datos, expresados como valores promedio, luego se normalizaron a porcentajes de adhesión, tomando la adhesión de PBLs en ausencia de cualquier anticuerpo como 100%. Los datos se compilaron sobre la base de n = 3 donantes diferentes de PBL y para donantes diferentes de nodos linfáticos del hígado. Datos representativos para los anticuerpos monoclonales purificados biotinilados 1.7.2 y 7.16.6 se representan en la Figura 4 en comparación de un control de anticuerpo anti-ß7 bloqueante. Ensayos de selectividad: VCAM y fibronectina tienen una estructura cercana y secuencias homologas a MAdCAM. Se evaluaron anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM purificados por afinidad por su especificidad para MAdCAM mediante la determinación de su capacidad de bloquear la ligadura de células T Jurkat aß1+/?í5ß?+ (ATCC) a su molécula de adhesión celular análoga. lOOµL de una solución de 4,5 µg/mL de un fragmento de ligadura celular de fibronectina (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Cat. No. UBF4215-18) o de VCAM (Panvera) en PBS de Dulbecco se adsorbieron sobre placas Black Microfluor "B" de fondo en u con 96 cavidades (Dynex #7805) durante la noche a 4°C. Luego, las placas recubiertas se invirtieron y se separó el exceso de liquido, antes de bloquear a 37 °C durante al menos 1 hora en BSA/PBS al 10%. Durante este tiempo se contaron células T Jurkat cultivadas mediante exclusión con azul triptano y se cargaron con colorante calceína AM según lo descrito previamente para células JY. Los anticuerpos a ser ensayados se diluyeron en 0,1 mg/mL de BSA en PBS, comenzando con una concentración máxima de 10 µg/mL. La cavidad final de la fila se usó para determinar ligadura total, de modo que se usó 0,1 mg/ml de BSA en PBS. Se usó una preparación de Echistatin (Bachem, Cat. No. H-9010) en PBS con una concentración máxima de 100 nM para bloquear la interacción sßi/fibronectina. Se usó un mAb anti-CD106 (Clon 51-10C9, BD Pharmingen Cat. No. 555645) con una concentración máxima de 1 µg/mL para bloquear la interacción aß?/VCAM. Después del bloqueo, se sacó el contenido de la placa mediante golpeo ligero y se agregaron a cada cavidad 50 µL de anticuerpos/controles y se incubó la placa a 37 °C durante 20 min. Las células T Jurkat cargadas con calceína se lavaron una vez como antes, resuspendiendo la pella celular final hasta lxl06/mL en BSA/PBS 1 mg/mL. A cada cavidad de la placa con fondo en U se agregaron 100 µL de células, la placa se cerró, se centrifugó brevemente (1000 rpm durante 2 min) y luego se incubó la placa a 37 °C durante 45 min. Después de este tiempo, las placas se lavaron con un lavador de placas Skatron y se midió la fluorescencia con un lector de placas Wallac Victor2 1420 Multilabel Reader (excitación ?485nm, emisión ?535nm, conteo desde arriba, 8 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 seg con apertura de emisión normal). En la Tabla 4 siguiente se expresa gráficamente el grado de inhibición para cada anticuerpo (- significa inhibición de la adhesión insignificante, ***signífica inhibición de la adhesión completa) . Todos los anticuerpos monoclonales ejemplificados son antagonistas anti-MAdCAM potentes y selectivos, mostrando una selectividad para MAdCAM substancialmente mayor de 100 veces que VCAM y fibronectina. Tabla 4. Selectividad comparativa del anticuerpo anti-MAdCAM para MAdCAM con respecto a otras moléculas de adhesión celular, fibronectina VCAM El 9 de septiembre de 2003 se depositaron hibridomas en la colección "European Collection of Cell Cultures" (ECACC) , H.P.A en CAMR, Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG con los siguientes números de depósito: Hibridoma No. de depósito 1.7.2 03090901 1.8.2 03090902 6.14,2 03090903 6.22.2 03090904 6.34.2 03090905 6.67.1 03090906 6.73.2 03090907 6.77.1 03090908 7.16.6 03090909 7.20.5 03090910 7.26.4 03090911 9.8.2 03090912 EJEMPLO II Determinación de constantes de afinidad (Kd) de anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM completamente humanos mediante BIAcore Realizamos mediciones de afinidad de anticuerpos purificados mediante resonancia en la superficie de un plasmón usando el instrumento BIAcore 3000, siguiendo los protocolos del fabricante. Protocolo 1 Para realizar análisis cinéticos, se preparó una superficie de anticuerpo anti-humano de ratón (IgG2 e IgG4) de alta densidad sobre un chip sensor CM5 BIAcore usando copulación de amina rutinaria. Los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron 10, 5 y 2 veces en buffer de corrimiento HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, agente tensoactivo P20 al 0,005%) que contiene 100 µg/mL de BSA y 10 mg/mL de carboximetildextrano o se utilizaron puros. Cada mAb se capturó sobre una superficie separada utilizando un tiempo de contacto de 1 min y un lavado de 5 min para estabilizar la linea base del mAb. Luego se inyectó proteina de fusión MAdCAM-IgGa Fe (141 nM) en todas las superficies durante un minuto, seguido de una disociación durante 3 min. Los datos se normalizaron para la cantidad de anticuerpo capturada sobre cada superficie y se evaluaron con ajuste global Langmuir 1:1, usando modelos de desplazamiento de la linea base disponibles en el software de BIAevaluación provisto por BIAcore. Protocolo 2 Un mAb purificado por afinidad se inmovilizó sobre la capa de dextrano de un chip biosensor CM5 usando copulación de amina. Los chips se prepararon utilizando como buffer de inmovilización un buffer de acetato de pH 4,5 y se lograron densidades de proteína de 2,5-5,5 kRU. Se prepararon muestras de proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe en buffer de corrimiento a concentraciones en la gama de 0,2-55 nM (como referencia cero se incluyó una solución 0 nM que comprende solamente buffer de corrimiento) . Las muestras se aleatorizaron y se inyectaron cada una por duplicado durante 3 minutos en 4 celdas de flujo, usando como buffer de corrimiento HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, agente tensoactivo P20 al 0,005%). Se utilizó una velocidad de flujo de 100 µL/min para minimizar las limitaciones debidas al transporte de masas. La disociación de la proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe se monitoreó durante 180 min, se regeneró la superficie mediante una inyección durante 6 seg de H3P0 25 mM (50 µL/min), o NaOH 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) a 25 mM (6.34.2) y 45 mM (6.14.2) y se analizaron los datos usando el paquete de software BIAevaluación (v3.1). La Tabla 5 enumera mediciones de afinidad para anticuerpos anti-MAdCAM representativos de la presente invención: Tabla 5. Determinación de la constante de afinidad, Kd, mediante resonancia en la superficie de un plasmón (BIAcore) Rx?ccdol R?ÍOCOIOI kon QM¡) koff (1/s) KüfM) lon (1/iVfe) koff (1/s) Ko f 1.7.2 2.4X1CT 1x10" 42 5.5 x 10° 1.3 x10"7 23.6 -5 -5 1.8.2 2.9x10£ 1x10 35 1.8x10' ,-6 7.16.6 1.5x10e 2.2x10 1.5 2.9x10£ 7.20.5 4.5 x105 1.9x10_l 42.2 1.6x10£ 7.28.4 9.6x10£ 2.6x10 271 1.5x10£ 1.3 x105 1 x 10"5 7.7 5x105 6.22.2 1.5 x106 1.4x10' 9.3 2.3 x105 1.2 x106 1.9x10"" 15.8 3.3 x105 6.67,1 5.9 x105 1x10"5 17 2.4x105 1.4x105 1.3X10"4 93 6.77.1 1.5x105 1 x 10"5 6.7 9.8.2 2.3 x106 2.3X10"1 100 4.4x10^ Los análisis cinéticos indican que los anticuerpos preparados de acuerdo con la invención poseen elevadas afinidades y fuertes constantes de ligadura para el dominio extracelular de MAdCAM.
EJEMPLO III: Identificación de selectividad para epítopes y reactividad cruzada con especies de anticuerpos monoclonales (mAbs) anti- MAdCAM Los anticuerpos reconocen epitopes expuestos sobre la superficie de antígenos como regiones de secuencia lineal (primaria) o secuencia estructural (secundaria) . Con el fin de definir el panorama funcional de epítopes de los anticuerpos anti-MAdCAM, se usaron conjuntamente el agrupamiento de epítopes en base a Luminex (Luminex epitope binning) , el agrupamiento en base a BIAcore y el análisis inmunohistoquímico de especies. Agrupamiento de epítopes (Epitope Binning) en base a Luminex: Perlas conjugadas con MxhlgG 2,3.4 (Calbiochem Ml 1427) se copularon con el anticuerpo primario desconocido anti-MAdCAM.
Agregamos 150 µL de la dilución del anticuerpo desconocido (0,1 µg/mL diluidos en medio de hibridoma) a la cavidad de una placa para cultivo de tejidos de 96 cavidades. El material de perlas se agitó suavemente con movimiento circular y se diluyó en sobrenadante hasta una concentración de 0,5 x 105 perlas/mL. Las perlas se incubaron en el sobrenadante sobre un agitador en la oscuridad durante la noche a 4°C. Cada cavidad de una placa filtrante para microtitulación de 96 cavidades (Millipore # MABVN1250) se prehumedeció mediante el agregado de 200 µL de buffer de lavado (PBS que contiene 0,05% de Tween20) y se retiró el exceso por aspiración. Luego, se agregaron a la placa filtrante 50 µL/cavidad del material de 0,5 x 105 perlas/mL y se lavaron las cavidades con buffer de lavado (2 x 100 µL/cavidad) . Se agregaron 60 µL/cavidad de antígeno MAdCAM-IgGi Fe diluidos en medio de hibridoma (0,1 µg/mL). Las placas se cubrieron y se incubaron a temperatura ambiente con sacudimiento suave durante una hora. Las placas se lavaron dos veces mediante el agregado de 100 µL/cavidad de buffer de lavado seguido de aspiración. Luego, agregamos 60 µL/cavidad de anticuerpo anti-MAdCAM secundario desconocido diluido en medio de hibridoma (0,1 µg/mL). Las placas se sacudieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas. Luego, las placas se lavaron dos veces mediante el agregado de 100 µL/cavidad de buffer de lavado seguido de aspiración. Luego, se agregaron 60 µL/cavidad de MxhlgG 2,3,4 biotinilado (0,5 µg/mL). Las placas se sacudieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Las cavidades se lavaron dos veces mediante el agregado de 100 µL/cavidad de buffer de lavado seguido de aspiración. A cada cavidad se agregaron 60 µL de 1 µg/mL de MxhlgG 2,3,4 Streptavidin-PE (Pharmacia #554061) diluidos en medio de hibridoma. Las placas se sacudieron a temperatura ambiente en la oscuridad durante veinte minutos. Las cavidades se lavaron dos veces mediante el agregado de 100 µL/cavidad de buffer de lavado seguido de aspiración. Luego, cada cavidad se resuspendió en 80 µL de buffer de bloqueo (PBS con 0,5% de albúmina de suero bovino, 0,1% de TWEEN y 0,01% de Thimerosal) y se pipeteó cuidadosamente con movimiento ascendente y descendente para resuspender las perlas. Utilizando Luminex 100 y el software que lo acompaña (Luminex® Corporation) se leyeron las placas para determinar lecturas de luminiscencia. En base a los datos de luminiscencia obtenidos para los varios anticuerpos anti-MAdCAM ensayados, los anticuerpos anti-MAdCAM se agruparon de acuerdo con sus especificidades de ligadura. Los anticuerpos anti-MAdCAM ensayados caen dentro de una serie de grupos de epitope (epitope bins) , representados en la Tabla 8. Agrupamiento BIAcore: En un método similar al arriba descrito, también puede usarse BIAcore para determinar la exclusividad para epitopes de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados por esta invención. Nueve clones de anticuerpo anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6, se inmovilizaron sobre la capa de dextrano de celdas de flujo separadas de un chip biosensor CMS usando copulación de amina. El buffer de inmovilización fue un buffer de acetato 10 mM, pH 4,5 (clones 6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 y 7.16.6) o un buffer de acetato 10 mM, pH 5,5 (clones 6.67.1 y 6.77.1) . En todos los casos se logró una densidad de proteina de aproximadamente 3750 RU. La desactivación de • esteres de N-hidroxisuccinimida sin reaccionar se realizó usando clorhidrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. La proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe se diluyó a una concentración de 1,5 µg/mL (aproximadamente 25 nM) en buffer de corrimiento HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Polisorbato 20 al 0,005%). Luego se inyectó a través de la primera celda de flujo, en un volumen de 50 µL a una velocidad de 5 µL/min. Una vez completada la inyección, se agregó la primera sonda de anticuerpo a la misma celda de flujo. Todos los anticuerpos de ensayo se diluyeron a una concentración de aproximadamente 20 µg/mL en HBS-EP, y también se inyectaron en un volumen de 50 µL con un caudal de 5 µL/min. Cuando no se observó ninguna ligadura del anticuerpo de ensayo, se inyectó el próximo clon de ensayo inmediatamente después. Cuando se produjo ligadura, se regeneró la superficie del sensor para separar ambos, la proteína de fusión MAdCAM-IgGi Fe y el anticuerpo de ensayo. Se usaron varias soluciones de regeneración en dependencia del anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo de ensayo presente. Un resumen de las condiciones de regeneración usadas se representa en la Tabla 6. Tabla 6. Resumen de las condiciones de regeneración usadas para realizar la elaboración de mapas de epitopes en base a BIAcore (El caudal fue 50 µL/min durante todos los procedimientos de regeneración) Después de la regeneración, la proteína de fusión MAdCAM-IgG? Fe se ligó nuevamente y se inyectaron anticuerpos de ensayo adicionales. Estos procedimientos se llevaron a cabo hasta inyectar el panel entero de clones sobre la superficie del anticuerpo inmovilizado con la proteina de fusión MAdCAM-IgGi Fe ligada. Luego se usó una nueva celda de flujo con un anticuerpo inmovilizado diferente y MAdCAM ligado para ensayar con los nueve clones de ensayo. Se esperó que los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 1.8.2 reconocieran el mismo epitope MAdCAM, en base a la homología cercana de las secuencias de aminoácidos primarias de sus cadenas pesada y liviana kappa, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, respectivamente. Por lo tanto, se evaluó solo 1.7.2 mediante la matriz de respuesta BIAcore. Los anticuerpos 6.14.2 y 6.73.2 se omitieron de este análisis, pero todas las demás combinaciones de pares de anticuerpos anti-MAdCAM se ensayaron de este modo. Se eligió un nivel arbitrario de 100 RU como umbral entre ligadura / no ligadura y se creó una matriz de respuesta (Tabla 7) en base a la observación positiva o negativa de ligadura. Tabla 7. Matriz de respuesta de agrupamiento de epítopes en base a BIAcore Matriz de respuesta para todas las combinaciones de pares de anticuerpos. - indica no ligadura de la sonda de anticuerpo, x indica que se observó ligadura (por encima de un nivel umbral seleccionado de 100 RU) .
La diagonal de la matriz en la Tabla 7 (sombreada en gris) contiene los datos de ligadura para pares de sondas idénticas. En todos los casos, con excepción de los dos clones 7.16.6 y 9.8.2, los anticuerpos eran autobloqueantes . Los anticuerpos 7.16.6 y 9.8.2 no compiten en forma cruzada. La ausencia del efecto autobloqueante puede deberse a un cambio conformacional inducido por el anticuerpo monoclonal en la proteína de fusión que permite que el anticuerpo monoclonal se ligue adicionalmente a un segundo sitio sobre MAdCAM-IgFc. El agrupamiento de los clones que muestran el mismo molde de reactividad da lugar a al menos seis agrupamientos de epítopes diferentes, según lo mostrado en la representación gráfica, Figura 5. Puede determinarse una identificación precisa adicional de las secuencias de epítope de MAdCAM con las cuales interactúa un anticuerpo anti-MAdCAM mediante varios métodos, incluyendo, pero no estando limitados a, análisis Western de arreglos punteados de bibliotecas de péptidos (Reineke et al., Curr. Topícs in Microbiol . and Immunol 243: 23-36, (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer- Verlag , Berlin) , expresión en fago o flagellin/fliC bacteriano de una biblioteca, o simplemente análisis MALDI- TOF de fragmentos de proteína ligada seguido de proteolisis limitada.
Ensayos inmunohistoquímicos : Muestras de tejido congelado embebido con OCT o sacarosa de ileo (parches de Peyer) , nodo linfático mesentérico, bazo, estómago, duodeno, jejuno y colon se usaron como controles de coloración positivos para los anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM. Para colorear secciones humanas con mAbs IgG2 humanos, se generaron derivados biotinilados de los mAbs anti-MAdCAM. Secciones de 10 µm de tejido congelado se cortaron sobre portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se colocaron directamente en acetona al 100% a 4°C (10 min), luego en agua oxigenada al 3% en metanol (10 min) , lavando entre las etapas con PBS. Los portaobjetos se bloquearon con el sistema de bloqueo con biotina (DAKO Cat. No. X0590) , previo a la incubación con el anticuerpo primario (1:100 -1:1000) en PBS (1 h) se lavó con PBS-Tween 20 (0,05%) y luego se desarrolló la ligadura con HRP-estreptavidina (BD Bioscience Cat. No.550946, 30 min) y substrato de DAB (Sigma Cat. No. D5905) . Para los anticuerpos monoclonales (mAbs) IgG4, se usó un IgG4 anti-humano de ratón secundario (Zymed Cat. No. 3840) conjugado con HRP. Los portaobjetos se contracolorearon con Haemalum de Mayer (1 min) , se lavaron y luego se armaron en DPX. Se comparó la afinidad de ligadura para varias especies (tejido de ratón, rata, conejo, perro, cerdo, cynomolgus y humano) . Al analizar mediante inmunohistoquímica, no se observó reactividad para tejido de rata, conejo y cerdo y al analizar mediante ELISA no se observó reactividad cruzada de los anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM de ratón recombinante. Los datos para tejido humano, de cynomolgus y perro se presentan en forma de tabla en la Tabla 8 siguiente: Tabla 8. Molde de reactividad cruzada de anticuerpos anti- n.d.: no determinado De acuerdo con la clave, la ligadura de anti-MAdCAM a estructuras endoteliales especializadas y tejido linfoide se indica mediante sombreado. Para cada anticuerpo se indican el agrupamiento de epítopes basado en el análisis de epítopes Luminex y el molde de reactividad cruzada con MAdCAM. Los datos de agrupamiento de epítopes en base a Luminex para los anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.3 y 6.77.1 (cursiva) se derivaron de experimentos distintos que los datos para 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 (negrita), según lo indicado por las diferencias en la fuente de los caracteres. Todos los anticuerpos anti-MAdCAM ensayados tenian la capacidad de reconocer un epítope MAdCAM humano expresado sobre compartimentos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal. Con excepción de 1.7.2 y 1.8.2, todos los demás anticuerpos anti-MAdCAM ensayados eran capaces de ligar específicamente los compartimentos endoteliales vasculares del tracto gastrointestinal de cynomolgus. Ciertos otros anticuerpos anti-MAdCAM, a saber 6.14.2 y 6.67.1 tenían también la capacidad de reconocer específicamente el ortólogo de MAdCAM de perro como así también el MAdCAM de cynomolgus. Generación de una línea celular CHO que expresa MAdCAM de cynomolgus/humano quimérico funcionalmente activa: Las diferencias en la afinidad de ligadura de ciertos anticuerpos anti-MAdCAM para MAdCAM humano y de cynomolgus nos llevó a determinar si se puede encontrar una base estructural para esta observación. En base a la secuencia de aminoácidos publicada para MAdCAM de Macaque (Shyjan AM, et al., J Immunol . , 156, 2851-7 (1996) ) , se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia del dominio que liga a4ß7de MAdCAM de cynomolgus mediante PCR.
Se preparó RNA total a partir del nodo linfático mesentérico extirpado congelado de cynomolgus ( aprox. 200 mg) usando el método Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1-2 µg se cebaron con oligo-dT y se sometieron a transcripción inversa con transcriptasa inversa AMV (Promega) . Una proporción del producto sometido a transcripción inversa se sometió a PCR con el cebador adelantado 5 ' -AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3 ' (SEQ ID NO: 67) y el cebador inverso 5 ' -GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3 ' (SEQ ID NO: 68) con polimerasa GC-2 en GC-melt 1 M (Clontech) y a una temperatura de reasociación de 62 °C. Se escindió un producto RT-PCR del tamaño apropiado y se purificó a partir de un gel con 1% de agarosa después de electroforesis, luego se clonó con TOPO-TA (Invitrogen) entre los sitios EcoRI de pCR2.1. El inserto se confirmó por secuenciación. La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos traducida pronosticada se muestran en SEQ ID NOS 49 y 50, respectivamente . Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de M?dCAM humano y de cynomolgus para el dominio que liga a4ß muestran un alto grado de identidad de secuencia (90,8%) al ser alineadas (la Figura 3 provee esta alineación de secuencias) . Para generar una linea celular funcionalmente activa que expresa MAdCAM de cynomolgus, que mimetiza el molde de ligadura anti-MAdCAM representado por la Tabla 8, un fragmento Sacl correspondiente a la secuencia del dominio que liga ß7de cynomolgus en pCR2.1 se subclonó directamente en la construcción pIND-Hygro C-terminal de MAdCAM humano arriba descrita que contiene el tallo de mucina carboxil-terminal y el dominio de transmembrana. Se verificó la secuencia y la orientación, y luego se clonó un fragmento Kpnl/Notl en el vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) , reemplazando la secuencia codificadora CAT y usando el vector obtenido en transfecciones para generar clones simples que se expresan establemente en células Flp In CHO (Invitrogen) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ligadura de clones de anticuerpos anti-MAdCAM a las células CHO que expresan M?dCAM quimérico de cynomolgus/humano se evaluó mediante citometría de flujo y la actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM se determinó usando un ensayo de adhesión de células JY muy similar al descrito precedentemente. La ligadura y actividad funcional de anticuerpos anti-MAdCAM se expresan en la Tabla 9. Tabla 9. Correlación entre la actividad funcional en el ensayo de adhesión MAdCAM de cynomolgus/humano - CHO/JY y la ligadura a células MAdCAM de cynomolgus/humano - CHO, medida mediante FACS, para una gama de anticuerpos anti-MAdCAM.
Tomado en conjunto, existe una buena correlación entre la capacidad de un anticuerpo anti-MAdCAM dado para ligar MAdCAM humano o de cynomolgus, según lo detectado por inmunohistoquímica (Tabla 8), con ligadura recombínante a base de células, y la actividad funcional (Tabla 9) . Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2, por ejemplo, muestran una falta consistente de ligadura a tejido de cynomolgus y células que expresan una proteína de MAdCAM quimérica de cynomolgus/humano . Los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 6.73.2 tampoco tenían la capacidad de detectar actividad bloqueadora funcional en el ensayo de adhesión MAdCAM de cynomolgus/humano / JY.' Pueden usarse enfoques similares para definir el epítope de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.14.2 y 6.67.1 que reconocen MAdCAM de perro. EJEMPLO IV: Uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-MAdCAM en la detección de MAdCAM soluble circulante como método para el diagnóstico de enfermedades Los anticuerpos anti-MAdCAM pueden usarse para la detección de MAdCAM soluble circulante (sMAdCAM) . La detección de sMAdCAM en plasma clínico, muestras de suero u otro biofluido, tales como, pero no estando limitado a, deposición, orina, esputo, es probablemente un sustituto útil para un biomarcador de enfermedades subyacentes, incluyendo, pero no estando limitado a, enfermedad inflamatoria del intestino. En base a los datos de agrupamiento de epítopes (Tablas 7 y 8), los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 y 7.16.6 parecen reconocer epítopes diferentes sobre MAdCAM humano. Se recubrieron placas ELISA durante la noche a 4°C con 100 µL/cavidad de una solución de 50 µg/mL de 1.7.2 en solución fisiológica con buffer de fosfato (PBS) . Después de la incubación, la placa se bloqueó durante 1,5 horas con un buffer de bloqueo de PBS que contiene leche al 10% (200 µL/cavidad) . Después de la incubación, la placa se lavó con PBS (2 x 100 µL/cavidad) y se agregaron a la placa soluciones seriadas de proteína de fusión MAdCAM-IgGl-Fe, desde una concentración máxima de 50 µg/mL hasta aproximadamente 5 ng/mL en PBS, llevando a volumen final de 100 µL, para la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente. En un enfoque similar, la proteína MAdCAM-IgGl-FC puede diluirse en plasma o suero, o algún otro biofluido relevante tal, y usarse para determinar la expresión de MAdCAM soluble en una muestra clínica, según lo descrito más abajo. Como control negativo, se agregó solamente buffer a las cavidades que contiene anticuerpo anti-MAdCAM primario. Luego, la placa se lavó con PBS (3 x 100 µL/cavidad) y luego la placa se incubó en la oscuridad con un 7.16.6 marcado con Alexa488 (100 µL, 5 µg/mL) . El 7.16.6 marcado con Alexa488 se generó usando un equipo comercialmente disponible (Molecular Probes, A-20181) , siguiendo los protocolos del fabricante. La placa se lavó con PBS que contiene 0,05% de Tween-20, y se determinó la ligadura del 7.16.6 marcado al MAdCAM soluble capturado midiendo la fluorescencia (lector Wallac Víctor2 1420 Multilabel Reader, excitación ? 485nm, emisión ? 535nm, conteo desde la parte superior, 3 mm desde el fondo de la placa, durante 0,1 seg con abertura de emisión normal). Cuando la fluorescencia es representada gráficamente en función de la concentración de la proteína de fusión MAdCAM-IgGl-Fc, Figura 6, se observa que un 1.7.2 y un 7.16.6 marcado pueden usarse con fines de diagnóstico para determinar el nivel de MAdCAM soluble circulante expresado en un biofluido o una muestra clínica. Este enfoque de sandwich ELISA no está restringido al uso de 1.7.2 y 7.16.6, sino puede usarse cualquier combinación de anticuerpos anti-MAdCAM que reconoce diferentes epítopes sobre MAdCAM, según lo resumido por los datos y la interpretación de la Tabla 7 y la Figura 5. Pueden aplicarse estrategias similares para el desarrollo de ensayos similares, tales como inmunohistoquimica y transferencia de Western, con los otros anticuerpos anti-MAdCAM descritos, usando diferentes partícipes, variantes, marcadores, etc. EJEMPLO V: Estructura de aminoácidos de anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invención En la discusión siguiente, se provee información estructural relacionada con los mAbs anti-MAdCAM preparados de acuerdo con la invención. Para analizar estructuras de mAbs producidos de acuerdo con la invención, clonamos los genes que codifican los fragmentos de cadena pesada y liviana a partir del clon de hibridoma específico. La clonación de genes y la secuenciación se realizaron como sigue: mRNA Poly(A)+ se aisló a partir de aproximadamente 2 x 105 células de hibridoma derivadas de ratones XenoMouse inmunizados usando un equipo Fast-Track (Invitrogen) . Después de la generación de cDNA sintetizado con cebadores aleatorios se siguió con PCR. Se usaron cebadores específicos de la familia VH o VK humana (Marks et al., 01igonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes ' ; Eur. J. Immunol . , 21_, 985-991 (1991)) o un cebador VH humano universal, MG-30 (5' -CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEQ ID NO: 108) conjuntamente con cebadores específicos para el CD2 humano, MG40-d (5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEQ ID NO: 109) o la región constante CD4, MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEQ ID NO: 110), o la región constante CK (h?P2; según lo descrito previamente en Green et al., 1994). Las secuencias de los transcriptos de cadena pesada y liviana kappa derivadas del mAb humano de hibridomas se obtuvieron mediante la secuenciación directa de productos PCR generados a partir de RNA poly (A+) usando los cebadores descritos precedentemente. Los productos PCR se clonaron en pCR2.1 usando un equipo de clonación TOPO-TA (Invitrogen) y se secuenciaron ambas hebras usando equipos de secuenciación "Prism dye terminator" y una máquina de secuenciación ABI 377. Todas las secuencias se analizaron mediante alineaciones con la base de datos V BASE sequence directory' (To linson, et al, J. Mol . Biol . , 227, 776-798 (1992); Hum . Mol . Genet . , 3, 853-860 (1994); EMBO J. , 14, 4628-4638 (1995) ) . Además cada uno de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, se sometieron a secuenciación de DNA de longitud completa. Con tal fin, se aisló RNA total a partir de aproximadamente 3-6 x 106 células de hibridoma usando un equipo RNeasy (Qiagen) . El mRNA se sometió a transcripción inversa usando oligo-dT y un sistema de transcriptasa inversa en base a AMV (Promega) . Se usó V BASE para diseñar cebadores de amplificación 5' específicos que contienen una secuencia Kozak óptima y un codón de iniciación ATG (subrayado) y cebadores inversos 3' para las cadenas pesada y kappa específicas, según lo representado en la Tabla 10. Tabla 10: Pares de cebadores PCR para la amplificación de cDNA a partir de hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM y cebadores usados en la construcción de versiones modificadas de anticuerpos anti- MAdCAM. Secuencia de oligonucleótidos VH1-18 TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAG CATCCTT 3' (SEQ ID NO: 70) VH3-15 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGATT 3' (SEQ ID NO: 71) VH3-21 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAACTGGGG CTCCGCTGGGTT 3' (SEQ IDNO: 72) VH3-23 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAG CTGGCTT 3' (SEQ ID NO: 73) VH3-30 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGGTT 3' (SEQ ID NO: 74) VH3-33 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGGTT 3' (SEQ ID NO: 75) VH4-4 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTG TGGTTCTTCCTC 3' (SEQ IDNO: 76) A2/A3 5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCT GCTCAGCTCCTG 3' (SEQ ID NO: 77) A26 5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACT CATTGGG 3' (SEQ ID NO: 78) B3 5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCA GGTCTTC 3' (SEQ ID NO: 79) 012 5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGG GTCCCCGCTCAG 3' (SEQ ID NO: 80) 018 5' TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGG GTCCCTGCTCAG 3a (SEQ ID NO: 81) RevIgG2 5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 82) RevIgG4 5 ' TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3' (SEQ ID NO: 83) RevKappa 5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 84) 6.22.2VK Fl 5' -GGA TCT GGG ACÁ GAT TTC ACC CTC ACC ATC AAT AGC CTG GAA GC-3' (SEQ ID NO: 85) 6.22.2VK Rl 5'~GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC-3' (SEQ ID NO: 86) 6.22.2VH Fl 5'-GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3' (SEQ ID NO: 87) 6.22.2VH Rl 5'-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC-3' (SEQ ID NO: 88) 6.22.2VH CS* 5' -CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3' (SEQ ID NO: 89) 6.34.2VK Fl 5'-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CC-3' (SEQ ID NO: 90) 6.34.2VK Rl 5' -GGT TTC TGC TGA TAC CAÁ TTT AAA TAG CTA CTA ATA CTC TGA CTT GC-3' (SEQ ID NO: 91) 6.34.2VK F2 5'-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAÁ CTT ACT ACT GTC ACC-3' (SEQ ID NO: 92) 6.34.2VK R3 5' -GGT GAC AGT AGT AAG TTG CAÁ AAT CCT CAG GTT GCA GAG AAC TGA TGG-3' (SEQ ID NO: 93) 6.34.2VH_F16 5'-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G- .34. 3' (SEQ ID NO: 94) 2VH Rl 5'-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG C- 3' (SEQ ID NO: 95) 6.67.1VK Fl 5' -CAÁ TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACÁ GAA ACC AGG ACÁ GCC-3' (SEQ ID NO: 96) 6.67.1VK Rl 5' -GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAÁ GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3' (SEQ ID NO: 97) 6.67.1VH Fl 5'-CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACÁ CGT CCA AGA ACC-3' (SEQ ID NO: 98) 6.67.1VH Rl 5' -GGT TCT TGG ACG TGT CTA CTG ACÁ TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3' (SEQ ID NO: 99) 6.67.1VH CS* 5' -ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3' (SEQ ID NO: 100) 6.77.1VK Fl 5' -CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC- 3' (SEQ ID NO: 101) 6.77.1VK Rl 5' -GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG- 3' (SEQ ID NO: 102) 6.77.1VK F2 5' -GGT TTA TTA CTG CAT GCA AAG TAT ACÁ GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC -3' (SEQ ID NO: 103) 6.77.1VK R2 5' -GGC CAÁ AAC TGG ACÁ TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AAA CC -3' (SEQ ID NO: 104) 7.26.4K Fl 5' -CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3' (SEQ ID NO: 105) 7.26.4K Rl 5' -GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3' (SEQ ID NO: 106) Se usaron los pares de cebadores para amplificar los cDNAs usando Taq polimerasa Expand High Fidelity (Roche) , y los productos PCR se clonaron en pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen) para la secuenciación subsecuente. Luego, los clones con las secuencias de cadena pesada y liviana kappa verificada se clonaron en los vectores pEEd.l y pEE12.1 (LONZA) usando los sitios Xbal/EcoRI e HindIII/EcoRI respectivamente. Análisis de genes utilizados La Tabla 11 exhibe el gen de cadena pesada y liviana kappa utilizado para cada híbridoma expuesto en la invención.
Tabla 11: Utilización de genes de la cadena pesada y liviana kappa Análisis de secuencias Para examinar aún más la estructura del anticuerpo, se obtuvieron secuencias de aminoácidos pronosticadas de los anticuerpos a partir de los cDNAs obtenidos a partir de los clones.
Los números de identificación de secuencias (SEQ ID NO:) 1-48 y 51-68 proveen las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de las cadenas pesada y liviana kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2 (SEQ ID NOS 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NOS 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NOS 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NOS 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NOS 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NOS 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NOS 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NOS 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NOS 33- 36), 7.20.5 (SEQ ID NOS 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NOS 41-44), 9.8.2 (SEQ' ID NOS 45-48) y los anticuerpos anti-MAdCAM modificados 6.22.2-mod (SEQ ID NOS 51-54), 6.34.2-mod (SEQ ID NOS 55-58), 6.67.1-mod (SEQ ID NOS 59-62) y 6.77.1-mod (SEQ ID NOS 63-66) y 7.26.4-mod (SEQ ID NOS 41-42, 67-68). Para cada secuencia del anticuerpo anti-MAdCAM clonado, se indican las secuencias de la secuencia peptídica señal (o las bases que la codifican) en minúscula y subrayadas. Las Figuras 1A-1J proveen alineaciones de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de cadena pesada pronosticadas de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 y la secuencia de aminoácidos de los productos génicos de la línea germinal respectiva. Las posiciones de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos están subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada y la secuencia de la línea germinal correspondiente están indicadas en negrita y cuando hay agregados en la secuencia expresada en comparación con la línea germinal, estos se indican como (-) en la secuencia de la línea germinal. Las Figuras 1K-1T proveen alineaciones de secuencias entre las secuencias pronosticadas de aminoácidos de la cadena liviana kappa de los anticuerpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2 y la secuencia de aminoácidos de los productos génicos de la línea germinal respectiva. Las posiciones de las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 de los anticuerpos están subrayadas, las diferencias entre la secuencia expresada y la línea germinal correspondiente están indicadas en negrita y cuando hay agregados en la secuencia expresada en comparación con la línea germinal, estos se indican como (-) en la secuencia de la línea germinal. Presencia de modificaciones post-traducción : glicosilación y desamidación : El efecto de algunos de los cambios en la secuencia del anticuerpo anti-MAdCAM expresada, en comparación con la secuencia derivada de la línea germinal, consiste en introducir residuos que potencionalmente podrían estar sujetos a glicosilación ligada a N (Asn-X-Ser/Thr) y/o desamidación (Asn-Gly) (vea Tabla 12) . Las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena liviana kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, (SEQ ID NOS: 16, 20, 24, 28, 32, 44 y 48) y el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 6.14.2, (SEQ ID NO: 10), predicen la presencia de una glicosilación ligada a N. La presencia de esta modificación post-traducción se investigó usando con los anticuerpos monoclonales 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2 una combinación de SDS-PAGE y coloración de glicoproteína con Pro-Q® Emerald 488 (Molecular Probes) . Brevemente, aproximadamente 2 µg de anticuerpo anti-MAdCAM reducido se cargaron sobre un gel con 4-12% de SDS-poliacrilamida usando un buffer MOPS. Después de la electroforesis, el gel se fijó en MeOH al 50%, ácido acético al 5% y se lavó en ácido acético al 3%. Carbohidratos cualesquiera sobre el gel se oxidaron luego con ácido periódico y se coloreó usando el equipo de coloración de glicoproteína Pro-Q® Emerald 488 (Molecular Probes) . Después de una etapa de lavado final, se visualizó la coloración de glicoproteína usando un escaner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm. Después de la coloración de la glicoproteína, el gel se coloreó para proteína total usando una coloración de proteína en gel con SYPRO Ruby y analizando con un escáner de fluorescencia ajustado a una longitud de onda de 473 nm. Las cadenas livianas kappa de los anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 y 9.8.2, se colorearon todas positivamente indicando la presencia de glicosilación. Como confirmación adicional, el anticuerpo anti-MAdCAM 7.26.4 se sometió a digestión tríptica/quimiotríptica, confirmando el análisis LC-MS/MS la presencia de un péptido tríptico modificado y proveyendo confirmación adicional de la glicolisación de la cadena liviana kappa. Las secuencias específicas Asn-Gly en las regiones CDRl de los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 y 7.20.5, hacen estas regiones sensibles a desamidación. La desamidación a pH neutro introduce una carga negativa y también puede llevar a isomerización ß, la que podría afectar las propiedades de un anticuerpo. Para los anticuerpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 y 7.20.5, se evaluó la presencia de residuos Asn-isoaspartato desamidados mediante espectroscopia de masa después del atrapamiento de la cadena lateral de isoaspartato con MeOH. En breve, para el anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2, se seleccionó el estado del péptido tríptico/Asp-N SSQSLLQSNGYNYL (SEQ ID NO: 69) (1573.7 Da) para monitorear mediante LC-MS/MS. El anticuerpo anti-MAdCAM 1.7.2 se redujo en DTT 10 mM, se alquiló en Na iodoacetato 5 mM y subscuentemente se cambió el buffer por buffer de digestión de tripsina (Tris-HCl 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,6). Luego, el anticuerpo se mezcló con tripsina modificada del grado secuenciación (Promega) en una relación proteasa: proteína de 1:20. La proteína se digirió en tripsina durante 15 horas a 30°C, y los péptidos resultantes se separaron mediante HPLC usando cromatografía de fase inversa (RPC) C-18 en un sistema LC Ettan. El péptido que contiene 33Asn (4032 Da) se recolectó de la columna y se diluyó en el buffer de digestión de Asp-N (buffer de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0) . Luego se agregó endoproteinasa Asp-N (Roche) en una relación aproximada péptido: enzima de 10:1. Se agregó cloruro de acetilo (100 µL) a una muestra de metanol (1 mL, -20°C) y se calentó la mezcla a temperatura ambiente. La digestión tríptica + Asp-N se secó en un Speed- Vac y luego se agregaron 5 µL de metanol/cloruro de acetilo (45 min, temperatura ambiente) , luego se secó nuevamente en un Speed-Vac. El residuo resultante se reconstituyó en TFA al 0,1% y los péptidos se analizaron inicialmente con el espectrómetro de masa Voyager-DE STR MALDI-TOF, usando el método de preparación de muestra en capa delgada de nitrocelulosa o la purificación en fase inversa con ZipTips C18 (Millipore) , seguida por mezclado de gotas con matriz de a-ciano. La mezcla de péptidos metilados también se analizó mediante LC-MS/MS con un espectó etro de masa Deca XP Plus Ion Trap como arriba indicado. La elución se hizo caer directamente al espectrómetro de masa Ion Trap y subsecuentemente se analizaron los péptidos mediante MS y MS/MS. El MS se ajustó para analizar todos los iones entre 300 y 2000 Da. Luego, el ion más fuerte de cualquier barrido particular se sometió a análisis MS/MS. Tabla 12. Modificación post-traducción de anticuerpos anti- MAdCAM Cadena pesada Cadena liviana kappa CLON Glicosila Confirm Glicosila Confirm Desamidac Confirm ción ado ción ado ion ado (NXS/T) (NXS/T) (NG) 1.7. LQSNGYN MS 2 1.8. LQSNGYN MS 2 7.16 .6 7.20 HGNGYNY MS .5 7.26 CKSNQSLLY MS ? PAGE 6.14 TFNNSAMT N.D .2 6.22 SGTNFTLTI PAGE LTINGLEA N.D .2 6.34 ASQNISSYL PAGE .2 6.67 SSNNKTYLA PAGE Estudios de mutagénesis : Las secuencias de aminoácidos primarios de los anticuerpos anti-MAdCAM ejemplificados en esta invención pueden modificarse, mediante mutagénesis dirigida a un sitio, para separar potenciales sitios de modificación post-traducción (por ejemplo, glicosilación, desamidación) o para cambiar el fondo de isotipo o para realizar otros cambios mediante ingeniería genética que pueden mejorar la utilidad terapéutica. Como ejemplo, se usó PCR para introducir cambios a los anticuerpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, para revertir ciertas secuencias framework a las de la línea germinal, para separar sitios potenciales de glicosilación y/o para modificar el fondo de isotipo a un IgG2 humano. cDNAs (100 ng) clonados en pCR2.1 TOPO-TA, correspondientes a los nucleótidos de cadena pesada SEQ ID NOS: 13, 17, 21 y 29, y los nucleótidos de cadena liviana kappa SEQ ID NOS: 15, 19, 23, 31 y 43, se usaron como molde en una serie de PCRs utilizando extensión solapada y un panel de conjuntos de cebadores descritos en la Tabla 10. Cadena pesada de 6.22.2: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 6.22.2_VH_F1 y 6.22.2VH_CS* (1) y VH3-33 y 6.22.2_VH_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2), usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 13 . Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) conjuntamente con cebadores VH3-33 y VK6.22.2_CS*, para generar el dominio V modificado de la cadena pesada 6.22.2. Esta versión modificada contiene una mutación His/Phe en FRl e introduce un sitio de restricción Xbal para posibilitar la clonación en marco de lectura en un vector derivado de pEEd.l, llamado pEE6.1CH, que contiene el dominio constante IgG2 humano correspondiente. El fragmento PCR final se clonó en el sitio Xbal de pEEd.ICH, se controló su orientación y se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia nucleotídica para la cadena pesada de 6.22.2 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 51 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 52. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental.
Cadena liviana kappa de 6.22.2: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 6.22.2_VK_F1 y revKappa (1) y A26 y 6.22.2_VK_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2) , usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotidica SEQ ID NO: 15. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) conjuntamente con cebadores A26 y revKappa, para generar el dominio V modificado de la cadena liviana kappa 6.22.2. Esta versión modificada contiene cambios Asn/Asp y Gly/Ser con respecto a la secuencia FR3. El producto PCR resultante se clonó en pEEl2.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verificó la secuencia completamente. La secuencia nucleotídica para la cadena liviana kappa de 6.22.2 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 53 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 54. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental. Cadena pesada de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 6.34.2_VH_F1 y 6.22.2VH_CS* (1) y VH3-30 y 6.34.2_VH_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2) , usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 17. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) conjuntamente con cebadores VH3-30 y VK6.22.2_CS*, para generar el dominio V modificado de la cadena pesada de 6.34.2. Esta versión modificada contiene una mutación Ser/Arg en FR3 e introduce un sitio de restricción Xbal para posibilitar la clonación en marco de lectura en un vector derivado de pEEd.l, llamado pEE6.1CH, que contiene el dominio constante IgG2 humano correspondiente. El fragmento PCR final se clonó en el sitio Xbal de pEEd.ICH, se controló su orientación y se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia nucleotídica para la cadena pesada de 6.34.2 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 55 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 56. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental. Cadena liviana kappa de 6.34.2: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 012 y 6.34.2_VK_R1 (1), 6.34.2_VK_F1 y 6.34.2_VK_R2 (2), como así también 6.34.2_VK_F2 y revKappa (3) para generar los productos PCR separados (1), (2) y (3), usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 19. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) , conjuntamente con los cebadores 012 y 6.34.2_VK_R2 , para generar el producto PCR (4) . Los productos PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) , conjuntamente con 6.34.2_VK_F1 y revKappa, para generar el producto PCR (5) . Los productos PCR (4) y (5) se purificaron y combinaron conjuntamente ( aproximadamente 50 ng cada uno) con cebadores 012 y revKappa para generar el dominio V modificado de la cadena liviana kappa de 6.34.2. Esta versión modificada contiene un cambio Asn/Ser en CDRl, un cambio Phe/Tyr en FR2 y cambios Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu y Ser/Tyr en la secuencia FR3. El producto PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verificó la secuencia completamente. La secuencia nucleotídica para la cadena liviana kappa de 6.34.2 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 57 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 58. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental. Cadena pesada de 6.67.1: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 6.67.1_VH_F1 y 6.67.1VH_CS* (1) y VH4-4 y 6.67.1_VH_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2) , usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 21. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) conjuntamente con cebadores VH4-4 y VK6.67.1_CS* para generar el dominio V modificado de la cadena pesada de 6.67.1. Esta versión modificada contiene una conversión Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val en FR3 e introduce un sitio de restricción Xbal para posibilitar la clonación en marco de lectura en un vector derivado de pEE6.1, llamado pEEd.ICH, que contiene el dominio constante IgG2 humano correspondiente. El fragmento PCR final se clonó en el sitio Xbal de pEEd.ICH, se controló su orientación y se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia nucleotídica para la cadena pesada de 6.67.1 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 59 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 60. Se indican los cambios en las secuencias nucleotidica y de aminoácidos en comparación con la línea parental. Cadena liviana kappa de 6.67.1: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 6.67.1_VK__F1 y revKappa (1) y B3 y 6.67.1_VK_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2) , usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 23. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa de PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) conjuntamente con cebadores B3 y revKappa, para generar el dominio V modificado de la cadena liviana kappa de 6.67.1. Esta versión modifica contiene un cambio Thr/Asn en CDRl y un cambio Arg/Gly en FR2. El producto PCR resultante se clonó en pEEl2.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verificó la secuencia completamente. La secuencia nucleotídica para la cadena liviana kappa de 6.67.1 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 61 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 62. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental. Cadena pesada de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR VH 3-21 y 6.22.2VH__CS* para generar un producto PCR simple usando Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 29. Los productos PCR se digirieron con Xbal, se purificaron en gel y se clonaron en el sitio Xbal de pEE6.1CH, controlando la orientación. Se verificó la secuencia completa del inserto. La secuencia nucleotídica para la cadena pesada de 6.77.1 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 63 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 64. Se indican los cambios en las secuencias nucleotidica y de aminoácidos en comparación con la línea parental . Cadena liviana kappa de 6.77.1: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR A2 y 6.77.1_VK_R1 (1), 6.77.1_VK_VK_F1 y 6.77.1_R2 (2), como asi también 6.77.1_VK_F2 y revKappa (3) para generar los productos PCR separados (1) , (2) y (3) , usando una Taq polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotidica SEQ ID NO: 31. Los productos (1), (2) y (3) se purificaron y (1) y (2) se combinaron en una tercera etapa de PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) , conj ntamente con los cebadores A2 y 6.77.1_VK_R2 , para generar el producto PCR (4) . Los productos PCR (2) y (3) se combinaron en una cuarta etapa PCR (aproximadamente 50 ng cada uno) , conjuntamente con los cebadores 6.77.1_VK_F1 y revKappa, para generar los productos PCR (5) . Los productos PCR (4) y (5) se purificaron y combinaron conjuntamente ( aproximadamente 50 ng cada uno) con cebadores A2 y JK2 para generar el dominio V modificado de la cadena liviana kappa de 6.77.1. Esta versión modificada contiene un cambio Asn/Lys en CDRl, un cambio Ser/Tyr en FR3 y un cambio del residuo Cys/Ser en la secuencia CDR3. El producto PCR resultante se clonó en pEEl2.1 usando sitios HindIII/EcoRI y se verificó la secuencia completamente. La secuencia nucleotidica para la cadena liviana kappa de 6.77.1 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 65 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 66. Se indican los cambios en las secuencias nucleotídica y de aminoácidos en comparación con la línea parental . Cadena liviana kappa de 7.26.4: Se usaron los conjuntos de cebadores PCR 7.26.4_VK_F1 y revKappa (1) y A2 y 7.26.4_VK_R1 (2) para generar los productos PCR separados (1) y (2), usando una Tag polimerasa Expand y un molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 43. Los productos (1) y (2) se purificaron y combinaron en una tercera etapa PCR ( aproximadamente 50 ng cada uno) conj ntamente con cebadores A2 y revKappa, para generar el dominio V modificado de la cadena liviana kappa de 7.26.4. Esta versión modificada contiene un cambio Asn/Ser en CDRl. El producto PCR resultante se clonó en pEE12.1 usando sitios HindllI/EcoRl y se verificó la secuencia completamente. La secuencia nucleotídica para la cadena liviana kappa de 7.26.4 modificada se encuentra en SEQ ID NO: 67 y la secuencia de aminoácidos correspondiente en SEQ ID NO: 68. Se indican los cambios en las secuencias nucleotidica y de aminoácidos en comparación con la línea parental . Se ensambló un vector de expresión eucariótico funcional para cada una de las versiones modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 y 7.26.4, a las cuales se hace referencia como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, y que representan respectivamente las secuencias nucleotídicas de cadena pesada SEQ ID NOS: 51, 55, 59, 63 y 41, y las secuencias de aminoácidos correspondientes SEQ ID NOS: 52, 56, 60, 64 y 42, como así también las secuencias nucleotídicas de cadena liviana kappa SEQ ID NOS: 53, 57, 61, 65 y 67, y las secuencias de aminoácidos correspondientes SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 y 68 como sigue: Los insertos de cDNA de la cadena pesada correspondiente a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod y 6.77.1-mod se cortaron a partir del vector pEEd.ICH con Notl/Sall, la versión parental de las cadenas pesadas de 7.26.4 se cortaron a partir del vector pEE6.1 con Notl/Sall, y los fragmentos purificados se clonaron en sitios idénticos en el vector pEEl2.1 correspondiente que contiene las versiones modificadas de las secuencias de cadena liviana kappa de 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. Se confirmaron las secuencias de los vectores y se usaron cantidades purificadas en transfecciones transientes con células HEK 293T. Brevemente, 9 x 106 células HEK 293T, sembradas en un frasco T165 el día antes de la transfección y lavadas en Optimem, se transfectaron transientemente con vectores cDNAs correspondientes a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod (40 µg) usando Lipofectamina PLUS (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron durante 3 horas, luego se reemplazó el medio de transfección con medio DMEM (Invitrogen 21969-035) que contiene 10% de suero de ternero fetal IgG ultra low (Invitrogen 16250-078) y L-glutamina (50 mL) . Después de 5 días se cosechó el sobrenadante del medio, se esterilizó por filtración y se purificó el anticuerpo anti-MAdCAM usando cromatografía por afinidad con proteína G sefarosa, de un modo similar al descrito precedentemente. La cantidad del anticuerpo recuperado (20-100 µg) se cuantificó mediante un ensayo Bradford. La actividad anti-MAdCAM del anticuerpo purificado por afinidad correspondiente a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod se evaluó con el ensayo con proteina de fusión MAdCAM-IgGl-Fc según lo descrito previamente. La Tabla 13 presenta los valores IC50 de estos anticuerpos anti-MAdCAM en comparación con los anticuerpos anti-MAdCAM parentales de los cuales han sido derivados. Las substituciones con aminoácidos descritas precedentemente tuvieron un efecto mínimo sobre la actividad de los anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparación con sus anticuerpos parentales. Los anticuerpos también mantuvieron su ligadura a células CHO que expresan MAdCAM humano recombinante o al M?dCAM quimérico de cynomolgus/humano . Tabla 13. Actividad de versiones modificadas de anticuerpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod, en comparación con sus anticuerpos parentales. Ensayo con proteina de fusión MAdCAM IgGl Fe IC50 promedio (µg/mL) CLON Parental Modificado 6.22.2 0,018 0,058 6.34.2 0,013 0,049 6.67.1 0,013 0,037 6.77.1 0,022 0,077 7.26.4 0,021 0,033 EJEMPLO VI Aumento de linfocitos ß7+ en la circulación periférica por anticuerpos anti-MAdCAM bloqueantes Se desarrolló un ensayo para identificar y correlacionar un efecto mecanístico de un anticuerpo anti-MAdCAM y su nivel de circulación en la sangre. Un anticuerpo anti-MAdCAM inhibitorio debería tener el efecto de inhibir el reclutamiento de leucocitos que expresan la integrina a4ß al tracto gastrointestinal. Por lo tanto, las clases de leucocitos que llevan integrina a4ß7 deberían estar restringidas a la circulación periférica. Esto se demostró con un anticuerpo monoclonal MAdCAM antihumano completamente humano 7.16.6 en cynomolgus. Un anticuerpo monoclonal MAdCAM anti-humano 7.16.6 purificado (1 mg/kg) o vehículo (acetato de Na 20 mM, 0,2 mg/mL de polisorbato 80, 45 mg/mL de manitol y 0,02 mg/mL de EDTA a pH 5,5) se evaluó de un modo similar mediante administración intravenosa vía la vena safena a dos grupos de monos cynomolgus (n = 4/grupo) . El tercer día después de la administración de la dosis se recolectaron muestras de sangre en tubos con EDTA mediante la punción de la vena femoral. Anticuerpos específicos para LPAM, que reaccionan en forma cruzada con la integrina ß de cynomolgus, no están disponibles comercialmente, de modo que se utilizó, en cambio, un anticuerpo anti-ß7 (que reconoce integrina aß7 y aEß7 Los anticuerpos (30 µL) de acuerdo con la tabla siguiente, Tabla 15, se agregaron a tubos que contienen 100 µL de sangre cynomolgus, se mezcló mediante agitación suave con formación de vórtice y se incubó durante 20-30 minutos a 4°C. Tabla 15. Anticuerpos (BD Pharmingen) utilizados para determinar el fenotipo inmunológico de sangre de cynomologus Número de catálogo Anticuerpo o isotipo 555748 mlgGl, k-FITC 555844 mIgG2a, k-PE 559425 mlgGl - PerCP 555751 mlgGl, k-APC 555728 CD 28-FITC 555945 ß7-PE 558814 CD 95-APC 550631 CD 4-PerCP A cada tubo se agregó 1 L de solución FACSlyse 1:10 (BD # 349202) , se mezcló mediante agitación suave con formación de vórtice y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 minutos en la oscuridad hasta que la lisis de los eritrocitos se había completado. Luego se agregaron a cada tubo 2 mL de buffer de coloración BD (# 554656) , se mezcló y se centrifugó a 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó y la pella se resuspendió en 3 mL de buffer de coloración, se mezcló nuevamente y se centrifugó a 250 x g durante 6-7 minutos a temperatura ambiente. Se agregó buffer Cytofix (BD # 554655) que contiene paraformaldehido (100 µL) a las pellas de células de sangre periférica de mono y se mezcló cuidadosamente con turbo mezclador (vortexer) a velocidad baja/moderada. Las muestras se mantuvieron a 4°C en la oscuridad hasta la determinación con el FACSCalibur. Inmediatamente antes de la determinación se agregó PBS (100 µL) a todos los tubos. Se determinaron los números celulares absolutos de CD4+ß7+CD951oCD28+ (naive) , CD4+ß7+CD95hiCD28+ (memoria central) , CD4+ß7-CD95hiCD28+ (memoria central) , CD4+ß7+CD95hiCD28" (memoria efectora) mediante selección celular y análisis de cuadrante (gating and quandrant analyses) apropiados. Este método también permite analizar otros subconjuntos de células T, por ejemplo, células T CD8+ de memoria central (ß7+CD8+CD28+CD95+) y otros leucocitos cualesquiera que llevan un ligando MAdCAM, con los anticuerpos apropiados. En comparación con el vehículo de control, el anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM 7.16.6 causó un incremento de aproximadamente 3 veces en los niveles de circulación de células T de memoria central CD4+ß7+CD95hiCD28+ según lo mostrado en la Figura 7. No se produjo ningún efecto sobre la población de células T de memoria central en circulación CD4+ß7-CD95hiCD28+ lo que indica que el efecto del anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM 7.16.6 es específico para células T que recalan en el intestino. Los efectos del anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM 7.16.6, en cynomolgus, sobre poblaciones de linfocitos (o¡4) ß7+ circulantes indica que esto constituye una fuerte prueba substituto de un mecanismo biomarcador, particularmente en el contexto de una aplicación práctica de regulación clínica. Secuencias Los SEQ ID NO: 1-48 y 51-68 proveen secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de las cadenas pesada y liviana kappa para doce anticuerpos anti-MAdCAM humanos, secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del dominio que liga a4ß7 a MAdCAM de cynomolgus y secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de cinco anticuerpos anti-MAdCAM humanos modificados . Los SEQ ID NO: 1-48 proveen las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la cadena pesada y liviana kappa de doce anticuerpos monoclonales anti-MAdCAM humanos: 1.7.2 (SEQ ID NO: 1-4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NO: 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NO: 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NO: 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NO: 41-44), y 9.8.2 (SEQ ID NO: 45-48).
Los SEQ ID NO: 49-50 proveen las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de un dominio que liga a4ß7 a MAdCAM de cynomolgus . Los SEQ ID NO: 51-68 proveen las secuencias nucleotidicas y de aminoácidos de la cadena pesada y liviana kappa para los anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales modificados: 6.22.2 (SEQ ID NO: 51-54), 6.34.2 modificado (SEQ ID NO: 55-58), 6.67.1 modificado (SEQ ID NO: 59-62), 6.77.1 modificado (SEQ ID NO: 63-66) y las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la cadena liviana kappa del anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal modificado: 7.26.4 modificado (SEQ ID NO: 67-68). Los SEQ ID NOS: 70-106 y 108-110 proveen varias secuencias de cebadores .
Clave: Secuencia señal: minúsculas subrayadas Cambios de aminoácidos en secuencias de anticuerpos anti-MAdCAM modificados en comparación con la secuencia parental: mayúsculas subrayadas SEQ ID NO. 1. Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 1.7.2 1 atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGCCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAA?GGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGT CAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC 1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA SEQ ID NO. 2 Secuencia proteica pronosticada de la cadena pesada de 1.7.2 1 efgls if1 aailkgvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVASGFTFTN 51AMI VRQAP GKG EWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST GPSVFPLAP 151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVS NS GA1TSGVHTF PAVLQSSGLY 201 SLSSWTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP 251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV 301 HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQD L NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN 401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SR QQGNVFS CSVMHEALHN 451 HYTQKSLSLS PGK SEQ ID NO. 3 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 1.7.2 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg 51 atccagtggg GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 4 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 1.7.2 l rlpaqllgl I lwvsgssg DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL 51 QSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 5 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 1 . 8 . 2 1 atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGTCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC 1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA SEQ ID NO. 6 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 1.8.2 l efglswifl aailkgvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CWSGFTFTN 51AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP 151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVS NS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 201 SLSSVVTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP 251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTC W DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV 301 HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTWHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN 401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SR QQGNVFS CSVMHEALHN 451 HYTQKSLSLS PGK SEQ ID NO. 7 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 1.8.2 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg 51 atccagtggg GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTA?TG GATTCAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGGTCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 8 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 1.8.2 1 mrlpaqllgl lmlwvsgssg DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL 51 QSNGFNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 9 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.14.2 1 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGACTCAC CTTTAACAAT 151 TCTGCCATGA CCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCAACTACT AGTGGAAGTG GTGGTACCAC ATACTACGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACTCTC CCAAGAACAC GCTCTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGGC 351 CCGTGGATAC AGCTATGGTA CGACCCCCTA TGAGTACTGG GGCCAGGGAA 401 CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GTTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG 651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ATCATGCCCA 751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC 801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG 851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT 901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA 951 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC 1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA 1101 GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA 1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 1251 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA 1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTAA 1401 ATGA SEQ ID NO. 10 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.14.2 lmefglswlfl vailkgvqcE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGLTFNN 51 SAMTWVRQAP GKGLE VSTT SGSGGTTYYA DSVKGRFTIS RDSPKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCAARGY SYGTTPYEYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSS VT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP 251 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFN YVD 301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 351 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 401 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 451 ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO. 11 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.14.2 1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct 51 ccgaqgggcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCGGAGC 151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 AGTCCTGATC TTTTTTGTGT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAATT ACATTCCCCC 351 TATTACCTTC GGCCAGGGGA CACGACTGGA GATCAGACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA G SEQ ID NO. 12 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.14.2 Imdmrvpaqll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASRS 51 ISSYLNWYQQ KPGKAP VLI FFVSSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQNYIPPITF GQGTRLEIRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASWCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 202 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 13 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.22.2 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt 51 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGACACAC CTTCAGTAGC 151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG 451 CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGG GCTGCCTGGT 501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA 651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 AGAGAGTTGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT 751 GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCGCGCCTC CCGTGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGGA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG GTAAATGA SEQ ID NO. 14 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.22.2 lmefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGHTFSS 51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP 251 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VDVSQEDPE VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TAPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSLGK SEQ ID NO. 15 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.22.2 1 atgttgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcttc 51 caggggtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAAATTTC ACCCTCACCA TCAATGGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 AGCA??GCAG ?CTACGAG?A ACACAAAGTC ACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA SEQ ID NO. 16 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.22.2 1 mlpsqligfl llwvpasrgE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS 51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTNF TLTINGLEAE 101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS 151 WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC SEQ ID NO. 17 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.34.2 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt 51 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 CTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG 651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCATCA 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 GCCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG ACAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 18 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.34.2 Imefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLE VAVI SNDGNNKYYA DSV GRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLSAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS 251 CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTC VVDVSQ EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQD LNGKE YKCKVSNKGL 351 PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSLGK SEQ ID NO. 19 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.34.2 1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct 51 ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAT 151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGGACTCTG 301 CAACCTGATG ATTTTGCAAC TTACTCCTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA SEQ ID NO. 20 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.34.2 lmdmrvpaqll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQN 51 ISSYLN FQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTIRTL 101 QPDDFATYSC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASWCLLNN FYPREA VQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLS ADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 21 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.67.1 1 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt 51 cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT 151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 GTCGAGTCAC CATTTTAGCA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG 401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCCGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAGCTTGGGC ACGAAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGTCCA AATATGGTCC CCCATGCCCA 751 TCATGCCCAG CACCTGAGTT CCTGGGGGGA CCATCAGTCT TCCTGTTCCC 801 CCCAAAACCC AAGGACACTC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CAGGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG 901 TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA 951 GCAGTTCAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC 1051 CTCCCGTCCT CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG 1101 AGAGCCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCAGGAGGAG ATGACCAAGA 1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAGGCTAA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGGAGGGGA ATGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACA CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCTGGGTAAA TGA SEQ ID NO. 22 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.67.1 lmkhlwfflll vaaprwylsQ VQLQESGPGL VKPSET1SLT CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP S1RGRVTILA DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DY GQGTLVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVS NSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP 251 SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS QEDPEVQFNW 301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV 451 MHEALHNHYT QKSLSLSLGK SEQ ID NO. 23 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.67.1 1 atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg 51 tgcctacggg GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA ACAATAAGAC CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAAG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAAA 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA SEQ ID NO. 24 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.67.1 Imylqtqvfis lllwisgayg DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL 51 YSSNNKTYLA WYQQKPRQPP KLLIY ASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C SEQ ID NO. 25 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.73.2 1 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGACTTG GTCCAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGAAGT 151 TATGCCATGA ACTGGGTCCG ACAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCAGTTATT AGTGGTCGTG GTGGTACTAC ATACTACGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACGCG GCCGTATATT ACTGTGCGAA 351 GATAGCAGTG GCTGGAGAGG GGCTCTACTA CTACTACGGT ATGGACGTCT 401 GGGGCCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CAGCTTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCCGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAACACAGC 501 CGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC 651 TAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGC 751 CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC 1301 TAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCTGGGT AAATGATAG SEQ ID NO. 26 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.73.2 l efglswlfl vailkgvqcE VQLLESGGDL VQPGGSLRLS CAASGFTFRS 51 YAMNWVRQAP GKGLEWVSVI SGRGGTTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDA AVYYCAKIAV AGEGLYYYYG MDVWGQGTTV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSENTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 201 LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC 251 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCWVDV SQEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K SEQ ID NO. 27 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.73.2 1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct 51 ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGTGACAGA GTCACCTTCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAC 151 ATTACCAACT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AGGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCGT CCAGTTTGCC AAGAGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCCGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAGTT ACAGTAATCC 351 TCCGGAGTGC GGTTTTGGCC AGGGGACCAC GCTGGATATC AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 28 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.73.2 1 mdmrvpaqll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTFTCRASQN 51 ITNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASSLPRGV PSRFRGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQSYSNPPEC GFGQGTTLDI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 29 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.77.1 1 atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG AGTCCAAATA TGGTCCCCCA 751 TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT 801 GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG 851 TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC 901 AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG 951 GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC 1001 TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 1051 AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 1101 GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCAG GAGGAGATGA 1151 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTACCCCAGC 1201 GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA 1251 GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA 1301 GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG AGGGGAATGT CTTTTCACGC 1351 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC 1401 CCTGTCTCTG GGTAAATGAT AGGAATTCTG ATGA SEQ ID NO. 30 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 6.77.1 1 melglrwvfl vailegvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP 251 CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSQEDPEVQF 301 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN 351 KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS 401 DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSR 451 SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK SEO ID NO. 31 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.77.1 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA ACTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTCCTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 32 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 6.77.1 lmrlpaqllgl I lwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCNSSQSLL 51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM CSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 33 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 7 . 16. 6 1 atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc 51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 34 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 7.16.6 Imdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YGINWVRQAP GQGLEWMG I SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM 101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS TVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 35 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 7.16.6 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 36 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa de 7.16.6 lmrlpaqllgl I lwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL 51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTAS VCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 37 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 7.20.5 1 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt 51 cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTAGCTC CATCAGTAGT 151 TACCACTGGA ACTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGAGCACCAA CTACAACCCC TCCCTCAAGA 251 GTCGAGTCAC CATGTCACTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG 301 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 GGGGGTCAGG TATTACTATG CTTCGGGGAG TTATTACTAC GGTCTGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCCTC CACCAAGGGC 451 CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 100Í ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCCGGGT AAATGA SEQ ID NO. 38 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 7.20.5 1 khlwff111 vaaprwylsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGSSISS 51 YHWNWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGSTNYNP SLKSRVTMSL DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCAREGVR YYYASGSYYY GLDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TWHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K SEQ ID NO. 39 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 7.20.5 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg 51 atccagtggg GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CATGGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTCTC ACTTTCGGCG GAGGGACCAA GGTGGAGATC AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 40 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 7.20.5 l rlpaqllgl Imlwvsgssg DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL 51 HGNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 41 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 7.26.4 1 atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc 51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCGAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCG ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGCTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGTCC ACAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA CTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TTGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1402 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 42 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 7.26.4 Imdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CEASGYTFTS 51 YGIDWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKLQGRVTMS TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 43 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 7.26.4 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 51 atccagtgcg GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAATCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 44 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 7.26.4 1 mrlpaqllgl I lwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSNQSLL 51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 45 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 9.8.2 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt 51 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TGGTATGATG GAAGTAATGA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 GGGGGCGTAC CACTTTGCCT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT 401 CCTCAGCTTC CACCAAGGGC CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC 451 AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA 501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG 551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC 601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC 651 CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG 701 AGTCCAAATA TGGTCCCCCA TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG 751 GGGGGACCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT 801 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG 851 AAGACCCCGA GGTCCAGTTC AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT 901 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT 951 GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT 1001 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC 1101 CCCATCCCAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG 1151 TCAAAGGCTT CTACCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 1201 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 1251 CTCCTTCTTC CTCTACAGCA GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG 1301 AGGGGAATGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC 1351 TACACACAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG GGTAAATGA SEQ ID NO. 46 Secuencia proteica de la cadena pesada pronosticada de 9.8.2 lmefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI WYDGSNEYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARGAY HFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS 151 RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL 201 SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPSCPAPEFL 251 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH 301 NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT 351 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 401 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH 451 YTQKSLSLSL GK SEQ ID NO. 47 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 9.8.2 1 atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct 51 ctcagtcgca ggtgccagat gtGACATCCA GATGACCCAG TCTCCATCCT 101 CCCTGTCTGC ATCTGTAGGA GACAGAGTCA CCATCACTTG CCAGGCGAGT 151 CAGGACATTA GCAACTATTT AAATTGGTAT CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC 201 CCCTAAGCTC CTGATCTACG ATGCATCCAA TTTGGAAACA GGGGTCCCAT 251 CAAGGTTCAG TGGAAGTGGA TCTGGGACAG ATTTTACTTT CACCATCAGC 301 AGCCTGCAGC CTGAAGATAT TGCAACATAT TCCTGTCAAC ACTCTGATAA 351 TCTCTCGATC ACCTTCGGCC AGGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ACCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 ?GGAG?GTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA ' SEQ ID NO. 48 Secuencia proteica de la cadena liviana kappa pronosticada de 9.8.2 Imdmrvpagll gllllwlsva garcDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCQAS 51 QDISNYLNWY QQKPGKAPKL LIYDASNLET GVPSRFSGSG SGTDFTFTIS 101 SLQPEDIATY SCQHSDNLSI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 49 Secuencia nucleotídica del dominio que liqa a4ß7 a MAdCAM de cynomolgus 1ATGGATCGGG GCCTGGCCCT CCTGCTGGCG GGGCTTCTGG GGCTCCTCCA 51 GCCGGGCTGC GGCCAGTCCC TCCAGGTGAA GCCCCTGCAG GTGGAGCCCC 101 CGGAGCCGGT GGTGGCCGTG GCCCTGGGCG CCTCTCGCCA GCTCACCTGC 151 CGCCTGGACT GCGCGGACGG CGGGGCCACG GTGCAGTGGC GGGGCCTGGA 201 CACCAGCCTG GGCGCGGTGC AGTCGGACGC GGGCCGCAGC GTCCTCACCG 251 TGCGCAACGC CTCGCTGTCG GCGGCCGGGA CCCGTGTGTG CGTGGGCTCC 301 TGCGGGGGCC GCACCTTCCA GCACACCGTG CGGCTCCTTG TGTACGCCTT 351 CCCGGACCAG CTGACCATCT CCCCGGCAGC CCTGGTGCCT GGTGACCCGG 401 AGGTGGCCTG TACGGCTCAC AAAGTCACGC CTGTGGACCC CAATGCGCTC 451 TCCTTCTCCC TGCTCCTGGG GGACCAGGAA CTGGAGGGGG CCCAGGCTCT 501 GGGCCCGGAG GTGGAGGAGG AGGAGGAGCC CCAGGAGGAG GAGGACGTGC 551 TGTTCAGGGT GACAGAGCGC TGGCGGCTGC CGACCCTGGC AACCCCTGTC 601 CTGCCCGCGC TCTACTGCCA GGCCACGATG AGGCTGCCTG GCTTGGAGCT 651 CAGCCACCGC CAGGCCATCC CGGTCCTGCA C SEQ ID NO. 50 Secuencia de aminoácidos del dominio que liga a4ß7 a MAdCAM de cynomolgus 1 MDRGLALLLA GLLGLLQPGC GQSLQVKPLQ VEPPEP VAV ALGASRQLTC 51 RLDCADGGAT VQWRGLDTSL GAVQSDAGRS VLTVRNASLS AAGTRVCVGS 101 CGGRTFQHTV RLLVYAFPDQ LTISPAALVP GDPEVACTAH KVTPVDPNAL 151 SFSLLLGDQE LEGAQALGPE VEEEEEPQEE EDVLFRVTER WRLPTLATPV 201 LPALYCQATM RLPGLELSHR QAIPVLH SEQ ID NO. 51 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.22.2 modificado 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt 51 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG 451 CCCTGCTCTA GAAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT 501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA 651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA 751 CCTGTGGCAG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC 801 CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA 851 GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG 901 GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT 951 CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA 1001 AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC 1101 CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT 1151 GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC 1201 AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC 1251 CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT 1301 GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 1351 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AATGATAG SEQ ID NO. 52 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 6.22.2 imefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGv' QPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 YSLSSWTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP 251 PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE 301 VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE 351 KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES 401 NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH 451 NHYTQKSLSL SPGK SEQ ID NO. 53 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.22.2 modificado 1 atgttgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcttc '51 caggggtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701AGTGA SEQ ID NO. 54 Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana kappa de 6.22.2 modificado Imlpsqligfl llwvpasrgE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS 51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE 101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS 151WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC SEQ ID NO. 55 Secuencia nucletídica de la cadena pesada de 6.34.2 modificado 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt 51 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGCGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC TAGAAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA 651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC ?AGTGCA?GG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC 1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG 1 01 TAAATGATAG SEQ ID NO. 56 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 6.34.2 modificado lmefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV 301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 EALHNHYTQK SLSLSPGK SEQ ID NO. 57 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.34.2 modificado 1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct 51 ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAGT 151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGTTCTCTG 301 CAACCTGAGG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA SEQ ID NO. 58 Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana kappa de 6.34.2 modificado 1 mdmrv aqll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS 51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASWCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 59 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6.67.1 modificado 1 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt 51 cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT 151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 GTCGAGTCAC CATGTCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG 401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCTAGAAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 GGGTAAATGA TAG SEQ ID NO. 60 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 6.67.1 modificado lmkhlwfflll vaaprwylsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTMSV DTSKNQFSLK 101LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS WTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 61 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.67.1 modificado 1 atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg 51tgcctacggg GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA ACAATAAGAA CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAGG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA SEQ ID NO. 62 Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana kappa de 6.67.1 modificado 1 mylqtqvfis lllwisgayg DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL 51 YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C SEQ ID NO. 63 Secuencia nucleotídica de la cadena pesada de 6,77.1 modificado 1 atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCT AGAAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAG??CCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCCGGGT AAATGATAG SEQ ID NO. 64 Secuencia proteica de la cadena pesada de 6.77.1 modificado 1 melglrwvfl vailegvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSWTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K SEQ ID NO. 65 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 6.77.1 modificado 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCA?? GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCC?? TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 66 Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana kappa de 6.77.1 modificado 1 mrlpaqllgl lpilwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL 51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM SSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 67 Secuencia nucleotídica de la cadena liviana kappa de 7.26.4 modificado 1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 51 atccagtgcg GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGG? AGGTGGATA? CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTG?G CA?AGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 68 Secuencia de aminoácidos de la cadena liviana kappa de 7.26.4 modificado 1 mrlpaqllgl lmlwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL 51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humano o una porción que liga antígeno del mismo que se liga específicamente a la molécula de adhesión celular de adresina mucosal (MAdCAM) . 2. El anticuerpo monoclonal humano o la porción que liga antígeno de conformidad con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o porción posee al menos una de las propiedades siguientes : (a) se liga a células humanas; (b) tiene una selectividad para MAdCAM al menos 100 veces mayor que para VCAM o fibronectina; (c) se liga a MAdCAM humano con una Kd de 3 x 10"10 M o menor; o (d) inhibe la ligadura de células que expresan a4ß7 a MAdCAM humano. (e) inhibe el reclutamiento de linfocitos al tejido linfoide gastrointestinal. 3. El anticuerpo monoclonal humano o la porción que liga antígeno de conformidad con la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo o porción liga M?dCAM humano con una Kd de 3 x 10" 10 M o menor e inhibe la ligadura de a4 ß7 a MAdCAM humano. • . Una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, donde el hibridoma se selecciona dentro del grupo formado por 1.7.2 (No. de acceso ECACC 03090901), 1.8.2 (No. de acceso ECACC 03090902), 6.14.2 (No. de acceso ECACC 03090903), 6.22.2 (No. de acceso ECACC 03090904), 6.34.2 (No. de acceso ECACC 03090905), 6.67.1 (No. de acceso ECACC 03090906), 6.73.2 (No. de acceso ECACC 03090907), 6.77.1 (No. de acceso ECACC 03090908), 7.16.6 (No. de acceso ECACC 03090909), 7.20.5 (No. de acceso ECACC 03090910), 7.26.4 (No. de acceso ECACC 03090911), y 9.8.2 (No. de acceso ECACC 03090912) . 5. El anticuerpo monoclonal humano producido por la línea celular de hibridoma de conformidad con la reivindicación 4 o una porción que liga antígeno de dicho anticuerpo monoclonal. 6. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 5, donde la lisina C-terminal de la cadena pesada está separada. 7. El anticuerpo monoclonal humano o la porción que liga antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho anticuerpo o porción que liga antígeno inhibe la ligadura de M?dCAM humano a aß7, y donde el anticuerpo o porción del mismo tiene al menos una de las propiedades siguientes: (a) compite en forma cruzada con un anticuerpo de referencia para ligarse a MAdCAM; (b) compite con un anticuerpo de referencia para ligarse a MAdCAM; (c) se liga al mismo epítope de MAdCAM como un anticuerpo de referencia; (d) se liga a MAdCAM con substancialmente la misma Kd como el anticuerpo de referencia; (e) se liga a MAdCAM con substancialmente el mismo grado de disociación como el anticuerpo de referencia; donde el anticuerpo de referencia se selecciona del grupo formado por: anticuerpo monoclonal 1.7.2, anticuerpo monoclonal 1.8.2, anticuerpo monoclonal 6.14.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2, anticuerpo monoclonal 6.34.2, anticuerpo monoclonal 6.67.1, anticuerpo monoclonal 6.73.2, anticuerpo monoclonal 6.77.1, anticuerpo monoclonal 7.16.6, anticuerpo monoclonal 7.20.5, anticuerpo monoclonal 7.26.4, anticuerpo monoclonal 9.8.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.34.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.67.1-mod, anticuerpo monoclonal 6.77.1-mod y anticuerpo monoclonal 7.26.4-mod. 8. Un anticuerpo monoclonal que liga específicamente MAdCAM, donde el anticuerpo se selecciona del grupo formado por: (a) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, sin las secuencias señal; (b) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, sin las secuencias señal; (c) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, sin las secuencias señal; (d) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, sin las secuencias señal; (e) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20, sin las secuencias señal; (f) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, sin las secuencias señal; (g) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28, sin las secuencias señal; (h) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, sin las secuencias señal; (i) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36, sin las secuencias señal; (j) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40, sin las secuencias señal; (k) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, sin las secuencias señal; (1) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 48, sin las secuencias señal; (m) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 54, sin las secuencias señal; (n) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 58, sin las secuencias señal; (o) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62, sin las secuencias señal; (p) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 66, sin las secuencias señal; y (q) un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 68, sin las secuencias señal. 9. Un anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno del mismo, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo o la porción del mismo comprende la CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada o donde la cadena liviana comprende la CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de un anticuerpo monoclonal seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7,2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. 10. El anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno de conformidad con la reivindicación 9, donde dicho anticuerpo o porción comprende una cadena pesada que utiliza un gen VH 1-18 humano, un gen VH 3-15 humano, un gen VH 3-21 humano, un gen VH 3-23 humano, un gen VH 3-30 humano, un gen VH 3-33 humano o un gen VH 4-4 humano. 11. El anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10, donde dicho anticuerpo o porción comprende una cadena liviana que utiliza un gen V? A2 humano, un gen V? A3 humano, un gen V? A26 humano, un gen V? B3 humano, un gen V? 012 humano o un gen V? 018 humano. 12. El anticuerpo monoclonal humano o porción que liga antígeno de conformidad con la reivindicación 1, donde la región variable de la cadena pesada, la región variable de la cadena liviana o ambas tienen secuencias de aminoácidos al menos 90% idénticas a la región o las regiones correspondientes de un anticuerpo monoclonal seleccionado dentro del grupo formado por: anticuerpo monoclonal 1.7.2, anticuerpo monoclonal 1.8.2, anticuerpo monoclonal 6.14.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2, anticuerpo monoclonal 6.34.2, anticuerpo monoclonal 6.67.1, anticuerpo monoclonal 6.73.2, anticuerpo monoclonal 6.77.1, anticuerpo monoclonal 7.16.6, anticuerpo monoclonal 7.20.5, anticuerpo monoclonal 7.26.4, anticuerpo monoclonal 9.8.2, anticuerpo monoclonal 6.22.2- od, anticuerpo monoclonal 6.34.2-mod, anticuerpo monoclonal 6.67.1-mod, anticuerpo monoclonal 6.77.1-mod y anticuerpo monoclonal 7.26.4-mod. 13. Un anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno del mismo que liga específicamente MAdCAM, donde: (a) la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo de referencia seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. (b) la cadena liviana comprende las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena liviana de un anticuerpo de referencia seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. (c) el anticuerpo comprende una cadena pesada de (a) y una cadena liviana de (b) ; y (d) el anticuerpo de (c) donde las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada y cadena liviana se seleccionan del mismo anticuerpo de referencia. 14. El anticuerpo monoclonal o porción que liga antígeno de conformidad con la reivindicación 13, donde la cadena pesada, la cadena liviana o ambas comprenden la secuencia de aminoácidos desde el comienzo de la CDRl hasta el final de la CDR3 de la cadena pesada, la cadena liviana o ambas, respectivamente, del anticuerpo de referencia. 15. El anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 13, donde dicho anticuerpo comprende: (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la reqión variable de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2 (SEQ ID NO: 2); 1.8.2 (SEQ ID NO: 6); 6.14.2 (SEQ ID NO: 10); 6.22.2 (SEQ ID NO: 14); 6.34.2 (SEQ ID NO: 18); 6.67.1 (SEQ ID NO: 22); 6.73.2 (SEQ ID NO: 26); 6.77.1 (SEQ ID NO: 30); 7.16.6 (SEQ ID NO: 34); 7.20.5 (SEQ ID NO: 38); 7.26.4 (SEQ ID NO: 42); y 9.8.2 (SEQ ID NO: 46); 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 52); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 56); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64); y 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42); (b) una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de la reqión variable de la cadena liviana de un anticuerpo seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2 (SEQ ID NO: 4); 1.8.2 (SEQ ID NO: 8); 6.14.2 (SEQ ID NO: 12); 6.22.2 (SEQ ID NO: 16); 6.34.2 (SEQ ID NO: 20); 6.67.1 (SEQ ID NO: 24); 6.73.2 (SEQ ID NO: 28); 6.77.1 (SEQ ID NO: 32); 7.16.6 (SEQ ID NO: 36); 7.20.5 (SEQ ID NO: 40); 7.26.4 (SEQ ID NO: 44); y 9.8.2 (SEQ ID NO: 48); 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 54); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 62); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 66); y 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 68); o (c) la cadena pesada de (a) y la cadena liviana de (b) . 16. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 que es una inmunoglobulina G (IgG) , una IgM, una IgE, e IgA o una molécula IgD, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico. 17. La porción que liga antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7 y 9-16 que es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv o un anticuerpo de cadena simple. 18. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal o una porción que liga antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 y un excipiente farmacéuticamente aceptable . 19. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el anticuerpo monoclonal o la porción que liga antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 donde dicho anticuerpo o porción que liga antígeno inhibe la ligadura de MAdCAM a a4ß7. 20. El método de la reivindicación 19, donde la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal. 21. El método de la reivindicación 20, donde la enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal se selecciona del grupo formado por enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, diverticulitis, gastritis, enfermedad del hígado, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante. 22. El método de la reivindicación 20, donde la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa o ambas. 23. El método de la reivindicación 20, donde las enfermedades inflamatorias son diabetes insulina-dependiente y enfermedad injerto versus hospedante. 24. Una línea celular aislada que produce el anticuerpo monoclonal o la porción que liga antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o la cadena pesada o cadena liviana de dicho anticuerpo o dicha porción del mismo. 25. La línea celular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 24 que produce un anticuerpo seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 y 9.8.2, o un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de uno de dichos anticuerpos. 26. La línea celular de conformidad con la reivindicación 25 que produce un anticuerpo monoclonal seleccionado dentro del grupo formado por: 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod o un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de uno de dichos anticuerpos. 27. Una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la cadena pesada o porción que liga antígeno de la misma o la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17. 28, Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27, donde el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de expresión ligada operativamente a la molécula de ácido nucleico . 29. Una célula hospedante que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 28 o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27. 30. Una célula hospedante de conformidad con la reivindicación 29 que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma de un anticuerpo o porción que liga antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17. 31. Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano o una porción que liga antígeno del mismo que liga específicamente MAdCAM, método que comprende cultivar la célula hospedante de conformidad con la reivindicación 29 ó 30 o la línea celular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 24 bajo condiciones adecuadas y recuperar dicho anticuerpo o porción que liga antígeno. 32. Un animal transgénico no humano o una planta transgénica que comprende (a) una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma; (b) una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma; o (c) ambas (a) y (b) de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 ó 5-17, donde el animal transgénico no humano o la planta transgénica expresa dicha cadena pesada o cadena liviana o ambas. 33. Un método para aislar un anticuerpo o una porción que liga antígeno del mismo que se liga específicamente a MAdCAM, método que comprende la etapa de aislar el anticuerpo a partir del animal transgénico no humano o la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 32. 34. Un método para tratar un sujeto que lo necesita con un anticuerpo humano o una porción que liga antígeno del mismo que se liga específicamente a MAdCAM e inhibe la ligadura a 4 ß7, método que comprende las etapas de: (a) administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o una porción que liga antígeno de la misma, una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la cadena liviana o una porción que liga antígeno de la misma, o moléculas de ácidos nucleicos que codifican la cadena liviana y la cadena pesada o porciones que ligan antígeno de las mismas; y (b) expresar la molécula de ácido nucleico. 35. Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente MAdCAM, método que comprende las etapas de: (a) inmunizar un animal transgénico no humano que es capaz de producir anticuerpos humanos con MAdCAM, con una porción inmunogénica de MAdCAM o con una célula o tejido que expresa MAdCAM; y (b) permitir que el animal transgénico produzca una respuesta inmune a MAdCAM. 36. Un anticuerpo monoclonal humano producido por el método de conformidad con la reivindicación 35. 37. Un método para inhibir la ligadura de a4 ß7 a células que expresan MAdCAM humano, método que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno del mismo. 38. Un método para inhibir la adhesión leucocitos - células endoteliales mediada por MAdCAM, método que comprende poner en contacto las células endoteliales con un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno del mismo. 39. Un método para inhibir la adhesión, migración e infiltración de leucocitos a tejidos mediadas por MAdCAM, método que comprende la etapa de poner en contacto las células endoteliales con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno del mismo. 40. Un método para inhibir adhesión celular a4 ß /MAdCAM dependiente, método que comprende la etapa de poner en contacto células que expresan MAdCAM humano con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno del mismo. 41. Un método para inhibir el reclutamiento mediado por MAdCAM de linfocitos para el tejido linfoide gastrointestinal, método que comprende la etapa de poner en contacto células que expresan MAdCAM humano con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno del mismo. 42. Un anticuerpo monoclonal o una porción que liqa antígeno del mismo que liga específicamente MAdCAM, donde dicho anticuerpo o porción del mismo comprende una o más de una secuencia de aminoácidos FR1, FR2, FR3 o FR4 de un anticuerpo monoclonal humano seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.3 .2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod. 43. El anticuerpo monoclonal humano o una porción que liga antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal seleccionado dentro del qrupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod y 7.26.4-mod; (b) una secuencia de aminoácidos de la cadena liviana que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena liviana de un anticuerpo monoclonal seleccionado dentro del grupo formado por: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, "d.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6,77.1-mod y 7.26.4-mod; (c) ambas cadenas, (a) y (b) ; o (d) cualquiera de (a) , (b) o (c) , con o sin la secuencia señal. 44. Un método para diagnosticar un trastorno caracterizado por MAdCAM humano soluble circulante, método que comprende las etapas de: (1) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno y (2) detectar la ligadura. 45. Un método para detectar inflamación en un sujeto, método que comprende las etapas de: (1) administrar a dicho sujeto el anticuerpo monoclonal o porción que liga antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17, donde dicho anticuerpo o porción del mismo está marcado en forma detectable y (2) detectar la ligadura. 46. Un equipo diagnóstico que comprende el anticuerpo - monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno. 47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18 que comprende además uno o más agentes antiinflamatorios o inmunomodulatorios adicionales. 48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, donde dicho uno o más agentes antiinflamatorios o inmunomodulatorios adicionales son seleccionados del grupo formado por: corticosteroides, aminosalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamacina, agentes anti-TNFa y antagonistas de moléculas de adhesión. 49. Una vacuna que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 5-17 o una porción que liga antígeno y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 50. La vacuna de conformidad con la reivindicación 49, donde la vacuna es mucosal. 51. Un método para detectar el efecto de la administración de un anticuerpo anti-MAdCAM inhibitorio o una porción que liqa antígeno del mismo a un sujeto, método que comprende la's etapas de : (a) administrar a un sujeto un anticuerpo monoclonal humano que se liga específicamente a MAdCAM; y (b) determinar si existe un aumento en los niveles de leucocitos que expresan a4ß en circulación. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, donde dichos leucocitos son linfocitos. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51, donde dicho aumento en los niveles de circulación de leucocitos que expresan 4ß7 se determina mediante análisis FACS.
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