TWI363762B - Antibodies to madcam - Google Patents

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TWI363762B
TWI363762B TW094100530A TW94100530A TWI363762B TW I363762 B TWI363762 B TW I363762B TW 094100530 A TW094100530 A TW 094100530A TW 94100530 A TW94100530 A TW 94100530A TW I363762 B TWI363762 B TW I363762B
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Nicholas Pullen
Elizabeth Molloy
Sirid-Aimee Kellermann
Larry L Green
Mary Haak-Frendscho
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Pfizer
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九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發叼係關於特異性地結合至MAdCAM(以人類 MAdCAM為較佳）且發揮作用以抑制MAdCAM之抗體（包 括人類抗體）及其抗原結合部分。本發明亦係關於人類抗 MAdCAM抗體及其抗原結合部分。本發明亦係關於融合蛋 白質之嵌合、雙特異、衍生化、單鏈抗體或部分之抗體。 本發明亦係關於分離之源自人類抗MAdCAM抗體之重鏈 及輕鏈免疫球蛋白及編碼該等免疫球蛋白之核酸分子。本 發明亦係關於製造人類抗MAdCAM抗體之方法、包含該等 抗體之組合物及使用抗體及組合物供診斷及治療之方 法。本發明亦提供使用編碼包含人類抗MAdCAM抗體之重 及/或輕免疫球蛋白分子之核酸分子之基因治療方法。本 發明亦係關於包含本發明之核酸分子之轉基因動物或植 物。 【先前技術】 黏膜選址素細胞黏附分子（MAdCAM)為細胞黏附受體 之免疫球蛋白超家族之一員。淋巴細胞向特定淋巴組織及 胃腸道黏膜位點之歸巢（homing)選擇性係由MAdCAM之 内皮表現來決定（Berlin，C_ 等人，Cell, 80:413-422(1994); Berlin，C.等人，Cell，74:185-195(1993)及Erie，D.J·等人， J. Immunol., 153 : 5 17-528(1994))。MAdCAM獨特地表現 現於器官化腸淋巴組織（諸如派依爾小結（Peyer's patch)及 腸系膜淋巴結）之高内皮小靜脈之細胞表面上（Streeter等 98487.doc 人，Nature，331:41-6(1988) ; Nakache 等人，Nature, 337:179-81 (1989) ; Briskin 等人，Am· J. Pathol. 151-97-110(1997))，但亦在其他淋巴器官内，諸如胰腺、 膽囊及脾小靜脈及脾白髓之邊緣竇（Briskin等人（199 7)，如 上述；Kraal等人，Am. J. Path.，147: 763-771(1995))。 儘管MAdCAM在腸道免疫監督中發揮生理學作用，但在 慢性胃腸道炎症之情況下，其似乎促進炎症性腸病中過度 淋巴細胞溢出。TNF α及其他促發炎細胞激素增加了内皮 MAdCAM表現，且在取自患有克羅恩氏症（Crohn’s disease) 及潰癌性結腸炎之患者的活組織檢查樣本中，在炎症位點 的MAdCAM表現現有約2-3倍之局部增加（Briskin等人 (1997)、Souza等人，Gut, 45:856-63(1999) ; Arihiro等人， Pathol Int.，52:3 67-74(2002))。增高表現之類似模式已在 結腸炎之實驗模型中觀察到（Hesterberg等人， Gastroenterology，111:1373-1380(1997); Picarella等人，J. Immunol., 158: 2099-2106(1997) ; Connor等人，J Leukoc Biol·, 65:349-55(1999) ; Kato等人，J Pharmacol Exp Ther.， 295:183-9(2000) ; Hokari 等人，Clin Exp Immunol., 26:259-65(2001) ; Shigematsu 等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol·，281 :G1309-1 5(2001))。在炎性 病症之其它臨床前模型中，諸如胰島素依賴型糖尿病 (Yang等人，Diabetes, 46:1542-7(1997) ; Hanninen等人，J Immunol.，160:6018-25(1998))、移植物抗宿主疾病 (Fujisaki等人，Scand J Gastroenterol.，38:437-42(2003)、 1363762
Mur ai 等人，Nat Immunol.，4:154-60 (2 003))、慢性肝疾病 (Hillan 等人，Liver, 19:509-18(1999) ; Grant 等人， Hepatology，33:1065- 72(2001))、炎性腦病（Stalder等人， Am J Pathol.，153:767- 83(1998) ; Kanawar等人，Immunol Cell Biol.，78:641-5(2000))及胃炎（Barrett等人，JLeukoc Biol.，67:169-73(2000); Hatanaka等人，Clin Exp Immunol.， 13〇:183_9(2〇〇2))，亦存在胎兒MAdCAM表現之再喚醒及 活化之α4β7+淋巴細胞參與疾病發病機理中。在該等炎症模 型及半抗原調控（例如TNBS、DSS等）或過繼轉移 (CD4 + CD45Rb*)小鼠結腸炎模型中，Ρ且滯α4β7 +淋巴細胞結 合至MAdCAM之大鼠抗小鼠MAdCAM單株抗體 (mAb)MECA-367減少淋巴細胞募集、組織溢出、炎症及疾 病嚴重性。抗人類MAdCAM之小鼠單株抗體（mAbs)亦已報 道（參見例如 WO 96/24673 及 WO 99/5 8573)。 給出MAdCAM在炎性腸疾病（IBD)及與胃腸道或其它組 織相關之其它炎性疾病中之作用，則需要一種用於抑制 α4β7結合及MAdCAM調控之白血球募集之方法。進一步應 需要具有有利性質之該等治療方法，該等性質包括（但不 限於）不存在非所要之與患者中其它藥物之相互作用及良 好之物理化學性質諸如人類中之pK/pD值、溶解性、穩定 性、貯藏壽命及活體内半衰期。諸如抗體之治療性蛋白質 應有利地沒有非所要轉譯後修飾或聚集形成。因此，迫切 需要治療性抗MAdCAM之抗體。 【發明内容】 98487.doc ⑧ 1363762 本發明提供一特異結合MAdCAM之經分離之抗體或該 抗體之抗原結合部分，其中該抗體之至少CDR序列為人類 CDR序列。在一些實施例中抗體為人類抗體，較佳為充當 MAdCAM拮抗劑之抗體。亦提供包含該抗體或部分之組合 物。 本發明亦提供一組合物，其包含該抗MAdCAM拮抗劑抗 體之重鏈及/或輕鏈或其可變區或其它抗原結合部分或編 碼任何前述之核酸分子及醫藥上可接受之載劑。本發明之 組合物可進一步包含另一諸如治療劑或診斷劑之組份。診 斷及治療方法亦由本發明提供。 本發明進一步提供一產生該抗MAdCAM抗體或其抗原 結合部分之分離細胞株。 本發明亦提供編碼該抗MAdCAM抗體之重鏈及/或輕鏈 或其可變區或其抗原結合部分之核酸分子。 本發明提供包含該等核酸分子之載體及宿主細胞及重 組產生藉由核酸分子編碼之多肽之方法。 亦提供表現該抗MAdCAM抗體或其抗原結合部分之重 鏈及/或輕鏈之非人類轉基因動物或植物。 【實施方式】 定義及通用技術 除非本文另外定義，否則與本發明有關之所用科學及技 術術語將具有普通熟習此項技術者通常瞭解之含義。此 外，除非上下文另外要求，否則單數術語將包括複數且複 數術語將包括單數。通常，與本文所述之細胞及組織培 98487.doc ⑧ 1363762 養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白質及 核酸化學及雜化有關之命名法及其技術係此項技術中熟 知及通常使用之彼等。本發明之方法及技術通常根據此項 技術中熟知之習知方法且如各種通用及更特定文獻中所 述執行，除非另外指示’否則該等文獻貫穿本專利說明書 中引用並討論。參見例如以引用方式併入本文之Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)及 Harlow及
Lane, Antibodies ： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N_Y.(1 990)。酶反應及純化技術根據製造商說明書如此項 技術中通常所實現或如本文所述來執行。標準技術用於化 學合成、化學分析 '醫藥製備、調配及傳輸及患者之治療。 除非另外指示’否則下列術語應理解為具有下列含義： 術語多.狀’包含原生或人造蛋白質、蛋白片段及蛋白序 <列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合體。 術語”經分離之蛋白質"或”經分離之多肽"係一藉由其 起源或衍生來源而（1)不與以其原生狀態伴隨其之天然相 關組份相關聯、（2)無來自相同物種之其它蛋白質、（3)以 來自不同物種之細胞來表現或（4)自然中不出現的蛋白質 或多肽。因此’化學合成或在與其天然起源之細胞不同之 細胞系統中合成之多肽將自其天然相關組份中"分離，，。蛋 98487.doc - 10- ⑧ 用此項技術中熟知之蛋白質純化技術藉由分離亦 /、大體上無天然相關組份。 或:I少約60至75%之樣品展現單物種之多肽時，蛋白質 ::肽為"大體上純"、"大體上均質"或”大體上純淨'多 或蛋白質可為單體或多聚體。大體上純之多肽或 、承包含約50〇/〇、60%、70%、80%或90¾ W/W之蛋白質 樣。α ’更通常約95%且較佳將大於99%純度。蛋白質純度 或均質性可藉由此項技術中熟知之許多方法指示，諸如蛋 白質樣品之聚丙烯醯胺凝膠電泳，繼之以此項技術中熟知 之染劑使凝膠染色來可視化單一多肽帶。為了某些目的， 較高解析度可藉由使用HPLC或此項技術中用於純化之熟 知之其它方法而提供。 本文所用之術語"多肽片段"係指一種具有—胺基末端 及/或羧基末端缺失，但其中其餘胺基酸序列與天然出現 序列中之相應位置一致之多肽。在一些實施例中，片段至 少為5、6、8或10個胺基酸長。在其它實施例中，片段至 少為14個胺基酸長，更佳至少20個胺基酸長，通常至少5〇 個胺基酸長，甚至更佳至少70、80、90、100、150或200 個胺基酸長。 本文所用之術語"多肽類似物"係指一種包含至少2 5個 胺基酸區段（其與胺基酸序列之一部分具有大體上一致性） 且具有至少一項下列性質之多肽：（1)在適當結合條件下 特異結合至MAdCAM、（2)抑制α4β1合素及/或l-選擇蛋 白結合至MAdCAM之能力、或（3)降低MAdCAM細胞表面 98487.doc 1363762 活體外或活體内表現之能力。通常多肽類似物勺人— 匕3 —相關 於天然出現序列之守恆胺基酸取代（或插入岑 &缺失）。類似 物通常為至少20個胺基酸長，較佳至少5〇、& ' 70、8〇、 90、1〇〇、150或200個胺基酸長或更長，且可常常與入長 天然出現之多肽同樣長。 較佳胺基酸取代為下列者：（1)降低蛋白質水解之易感 性、（2)降低氧化之易感性、（3)改變形成蛋白質複合物之 結合親和力、（4)改變結合親和力 '或（5)賦予或調整該等 類似物之其它物理化學或功能性質。類似物可包括一序列 而非天然出現之肽序列之各種突變蛋白質。例如，單―或 多胺基酸取代（較佳守恆胺基酸取代）可在天然出現序列 (較佳在形成分子間接觸之區域外之多肽部分内）中進 行。守恆胺基酸取代不應大體上改變親本序列之結構特徵 (例如置換胺基酸不應趨於斷裂在親本序列中出現之螺旋 或破壞表徵親本序列之其它類型之次級結構）。此技術已 識別多肽次級及三級結構之實例描述於proteins，
Structures and Molecular Principles(Creighton編，W. Η
Freeman and Company, New York(1984)) ； Introduction to
Protein Structure(C· Branden 及 J. Tooze 編，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))及 Thornton等人，Nature， 3 54:105(1991)，其各自以引用方式併入本文。 非肽類似物通常作為性質類似於模板肽之彼等的藥物 用於醫藥工業中。該等類型之非肽化合物稱為"肽擬似物" 或"擬肽物”。Fauchere，J. Adv. Drug Res·，15:29(1986); 98487.doc -12· ⑧ 1363762
Veber及 Freidinger，TINS，第 392 頁（1985)及 Evans 等人，j
Med. Chem” 3 0:1229(1987)，其以引用方式併入本文。該 4化合物常常借助於電腦化分子模型開發。結構類似於治 療上有用之肽類之肽擬似物可用於產生一相等治療或預 防效應。通常’肽擬似物結構上類似於範例多肽（意即具 有所要生物化學性質或藥理學活性之多肽），諸如人類抗 體，但其所具有之一或多個肽鍵以此項技術中熟知之方法 視情況藉由諸如下列之鍵置換：·CHzNH-、-CH2S-、 -CH2-CH2·、-CH=CH-(順式及反式）、_c〇CH2_、 -CH(OH)CH2·及-CHJO-。共有序列之一或多個胺基酸以 相同類型之D-胺基酸系統性取代（例如D-離胺酸取代l —離 胺酸）亦可用於生成更穩定之肽類。此外，包含共有序列 或大體上一致之共有序列變化之約束肽類可藉由此項技 術中已知之方法生成（Rizc^ Gierasch Ann. Rev. Biochem 61:3 87(1992)，其以引用方式併入本文）；例如藉由添加可 形成使肽環化之分子間二硫橋之内半胱胺酸殘基。 ”免疫球蛋白"係一四聚體分子。在天然出現之免疫球蛋 白中’各四聚體由兩個一致對多肽鏈組成，各對具有一 "輕"（約25 kDa)及—重"鏈（約50_70 kDa)。各鏈之胺基末 端部分包括一主要負責抗原識別之約100至110或更多胺 基酸之可變區。各鏈之羧基末端部分界定了一主要負責效 應子功Hb之恨定區。人類輕鏈分為χ輕鏈。重鏈分為卩、 δ、γ、a或ε且分別定義抗體同種型為IgM、IgD、、IgA 及IgE。在輕鏈及重鏈内，可變區及恆定區由約l2或更多 98487.doc ⑧ • 13 - 1363762 胺基酸之”J"區接合，且重鏈亦包括一約ίο或更多胺基酸 之"D"區》通常參見 Fundamental Immunology ’ 第 7 章（paui， W·編’第二版。Raven Press, N.Y.(1989))(其全部以引用方 式併入本文用於所有目的）。各輕/重鏈對之可變區形成抗 體結合位點以使一完整之免疫球蛋白具有兩個結合位點。 免疫球蛋白鏈展現由三個超變區接合之相對守恆骨架 區（FR)之相同一般結構，該等超變區亦稱為互補決定區或 CDR。自各對之兩條鏈之CDR藉由骨架區排列以形成一抗 原決定部位特異性結合位點。自N-末端至C-末端，輕鏈及 重鏈均包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4 域。各域胺基酸之分配根據各自全部以引用方式併入本文 之 Kabat， Sequences of Proteins of Immunological
Interest(National Institutes of Health, Bethesda,'Md.( 1987 及 1991))或 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987); Chothia等人，Nature, 342:878-883(1989)之定 義。 ”抗體"係指一完整免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特 異結合之抗原結合部分。在一些實施例中，抗體為其抗原 結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整 抗體之酶或化學分裂產生。抗原結合部分包括尤其Fab、 Fab、F(ab)2、Fv、dAb及互補決定區（CDR)片段、單鏈抗 體（scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體及含有足夠賦予特定抗 原結合至多肽之免疫球蛋白之至少一部分的多狀。F ab片 段為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片 98487.doc 1363762 段為包含兩個藉由二硫橋連接於鉸鏈區之Fab片段之二價 片段；Fd片段由VH及CH1域組成；Fv片段由抗體單臂之 VL及VH域組成且dAb片段（Ward等人，Nature， 341:544-546(1989))由 VH域組成。 如本文所用’稱為例如1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.34.2、 6.67.1、6.77.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4或9.8.2之抗體係藉 由相同名稱之融合瘤產生之單株抗體。例如抗體1 72係藉 由融合瘤 1.7.2 產生。稱為 6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1-mod、6.77.1-mod 或7.26.4-mod 之抗體係其序列已藉 由定點突變自其相應親本修飾之單株抗體。 單鏈抗體（scFv)係經由使其成為單蛋白鏈之合成連接體 使VL與VH區配對以形成單價分子之抗體（Bird等人，
Science, 242:423-426(1988)及 Huston 等人，Proc. Natl· Acad· Sci. USA，85:5 879-5 883(1988))。雙功能抗體為二價 雙特異抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使 用太短而不允許在相同鏈之兩域之間配對之連接體，因而 迫使域與另一鏈之互補域配對且建置兩個抗原結合位點 (參見例如Holliger，P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 90 ·· 6444-6448 (1993)及 Poljak，R. j.等人，structure: 2^2^^230994))。自本發明之抗體之一或多個cdr可共 價或非共價併人分子中以使其成為特異結合至MAdCAM 之免疫黏附素。免疫黏附素可合併作為較大多肽鏈之部分 的⑽，可共價連接CDR至另一多肽鏈或可非共價合併 CDR° CDR允許免疫黏附素特異結合至所關注之特定抗 98487.doc -15· 1363762 原。 抗體可具有一或多個結合位點。若有一個以上結合位 點，則結合位點可彼此一致或可不同。例如一天然出現之 免疫球蛋白具有兩個一致結合位點、一單鏈抗體或Fab片 段具有一個結合位點，而"雙特異”或"雙功能”抗體（雙功能 抗體）具有兩個不同之結合位點。 ”經分離之抗體”係一抗體，其（1)不與以其原生狀態伴隨 鲁 其之天然相關組份（包括其它天然相關抗體）相關聯、（2) 無來自相同物種之其它蛋白質、（3)藉由自不同物種之細 胞表現或（4)自然中不出現。分離之抗體之實例包括使用 MAdCAM親和純化之抗MAdCAM抗體、藉由融合瘤或活 體外其它細胞株產生之抗MAdCAM抗體及源自轉基因哺 乳動物或植物之人類抗MAdC AM抗體。 如本文所用之術語"人類抗體，，意謂其中可變區及恆定 區序列為人類序列之抗體。術語包含具有源自人類基因但 • 已改變例如以減少可能之免疫原性、增加親和力、消除可 引起非所要折疊之半胱胺酸或糖基化位點等之序列之抗 體。術語包含該等重組產生於非人類細胞中可給予非典型 人類細胞糖基化之抗體，術語亦包含在含有一些或所=人 類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之轉基因錢中培瘦之 抗體。 在一態樣中，本發明提供一人源化抗體。纟一些實施例 中，人源化抗體係源自非人類物種之抗體，其中重鏈及輕 鏈之骨架錄定域中之某些胺基酸突變以避免或消除人 98487.doc 1363762 類中之免疫反應。在一些實施例中’人源化抗體可藉由將 來自人類抗體之恆定域融合至非人類物種之可變域產 生。如何製造人源化抗體之實例可在美國專利第6,054,297 號 '第5,886，152號及第5,877,293號中找到。在一些實施例 中，本發明之人源化抗MAdC AM抗體包含一或多個本發明 之人類抗MAdCAM抗體之一或多個骨架區之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明包括一"嵌合抗體”。在一些實施 例中，嵌合抗體係指含有來自一抗體之一或多個區及來自 一或多個其它抗體之一或多個區之抗體。在一較佳實施例 中，一或多個CDR源自本發明之人類抗MAdC AM抗體。在 一更佳實施例中，所有CDR皆源自本發明之人類抗 MAdC AM抗體。在另一較佳實施例中，自一個以上本發明 之人類抗MAdC AM抗體之CDR混合且配對於嵌合抗體 中。例如，嵌合抗體可包含來自第一人類抗MAdC AM抗體 輕鏈之CDIU，CDR1可與自第二人類抗MAdCAM抗體輕鏈 之CDR2及CDR3組合且重鏈之CDR可源自第三人類抗 MAdC AM抗體。此外，骨架區可源自一個相同抗MAdC AM 抗體、一或多個不同抗體諸如人類抗體或自人源化抗體。 "中和抗體"、"抑制抗體”或拮抗抗體係以至少約20%抑 制α4β7或表現之細胞或任何其它同源配位體或同源 配位體表現之細胞結合至MAdCAM。在一較佳實施例中， 抗體以至少40%、更佳60°/。、甚至更佳80°/。、85%、90%、 95%或100%降低抑制α4β7整合素或α4β7_表現之細胞結合 至MAdCAM。結合降低量可藉由普通熟習此項技術者已知 98487.doc -17- ⑧ 1363762 之任何方法量測，例如以活體外競爭結合檢定法量測。量 測表現之細胞結合至MAdCAM之降低量之一實例在 實例I中提出。 抗體之片段或類似物可藉由普通熟習此項技術者根據 本專利5兒明書之教示而易於製備。片段或類似物之較佳胺 基或缓基末端出現於功能域之相近界。結構及功能域可藉 由核苷酸及/或胺基酸序列資料與公開或專有序列資料庫 比較而識別。較佳地使用電腦化比較方法以識別預測出現 於已知結構及/或功能之其它蛋白質中之序列基元或蛋白 質構型域。識別折疊成已知三維結構之蛋白質序列之方法 已知（Bowie等人，Science，253:164(1991))。 本文所用之術語"表面電漿共振"係關於一種允許藉由 偵測蛋白質濃度在生物傳感器基質中之變化而分析即時 生物特異性相互作用之光學現象，例如使用BIAcore系統 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden及 Piscataway, N_J_)。為進一步描述，參見Jonsson，U_等人，Ann. Biol.
Clin.，51:19-26(1993); Jonsson，U.等人，Biotechniques， 1 1:620-627(1991) ; Johnsson, B.等人，j. Mol. Recognit·, 8:125-131(1995)及 Johnnson，B.等人，Anal. Biochem.， 198:268· 277(1991)。 術語” k ⑯"係指抗體自抗體/抗原複合物離解之脫離速 率常數。 術語”Kd”係指特定抗體_抗原相互作用之離解常數。據 信當離解常數為μΜ、較佳S100 nM且最佳$10 nM時， 98487.doc -18- ⑧ 1363762 抗體可結合抗原。 術語"抗原決定部位"包括可特異結合至免疫球蛋白或τ 細胞受體或另外與分子相互作用之任何蛋白質決定因 子。抗原決定部位決定因子通常由諸如胺基酸或碳水化人 物侧鏈之好之化學活絲面基㈣成且通常具有特i 三維結構特徵及特定電荷特徵。抗原決定部位可為"線性" 或"構象"。在線性抗原決；t部位中，蛋白質及相互作用分 子（諸如抗體）之間之所有相互作用點沿著蛋白質之主要 胺基酸序列線性出現。在構象抗原決定部位中，相互作用 點橫貫互相分離之蛋白質上之胺基酸殘基出現。 如本文所用，二十種習知胺基酸及其縮寫根據習知用 法。參見Immunology-A Synthesis(第二版，E s ⑸⑽及 D.R. Gren 編，Sinauer Associates, Sunderland， 其以引用方式併入本文。二十種習知胺基 酸之立體異構體（例如D_胺基酸）、非天然胺基酸諸如心、心 雙取代胺基酸、Ν-烷基胺基酸、乳酸及其它非習知胺基酸 亦可為本發明之多肽之適當組份。非習知胺基酸之實例包 括：4-羥基脯胺酸、γ_羧基麩胺酸、ε_Ν，Ν，Ν_三甲基離胺 酸、ε-Ν-乙醯基離胺酸、〇_磷醯基絲胺酸、Ν_乙醯基絲胺 酸' Ν-甲醯甲硫胺酸、3·甲基組胺酸、5_羥基離胺酸、s_N_ 曱基精胺酸及其它類似胺基酸及亞胺基酸（例如4_羥基脯 胺酸）°在本文所用之多肽表示法中，根據標準用法及習 知’左手方向為胺基末端方向且右手方向為羧基末端方 向0 98487.doc 1363762 本文涉及之術語"聚核苷酸"意謂—長度上至少1〇個鹼 基之核糖核普酸或脫氧核苷酸或任—類型核苷酸之修飾 形式之聚合物形式核苷酸。術語包括單鏈或雙鏈形式之 DNA。 如本文所用之術語”分離之聚核苷酸"應意謂一基因 體、cDNA或合成起源或其某種組合之聚核苷酸，其藉由 其起源”分離之聚核苷酸"（1)不與"分離之聚核苷酸”在自 然中出現於其中之聚核苷酸之全部或一部分相關聯、（2) 可操作連接至自然中不與其連接之聚核苷酸、或自然 中不以較大序列之部分出現。 本文涉及之術語"寡核苷酸”包括天然出現及藉由天然 出現及非天然出現之寡核苷酸鍵連接在一起之修飾之核 苷酸。募核苷酸為通常包含200個鹼基或更少長度之聚核 苷酸子集。較佳寡核苷酸長度為10至60個鹼基且最佳長度 為 12、13、14、15、16、17、18、19或 20 至 40個驗基。寡 核苷酸通常為單鏈例如用於探針；雖然寡核苷酸可為雙鏈 例如用於基因突變體之構造。本發明之寡核苷酸可為正義 或反義募核皆酸。 本文涉及之術語”天然出現之核苷酸"包括脫氧核糖核 苷酸及核糖核苷酸。本文涉及之術語”修飾核苷酸，，包括具 有修飾或取代糖基及其類似物之核苷酸。本文涉及之術語 ”募核苷酸鍵包括諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代 磷酸酯、'二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、 磷醯胺化物及其類似物之寡核苷酸鍵。參見例如 98487.doc •20· ⑧ 1363762
LaPlanche等人，Nucl. Acids Res. 14:9081(1986) ; Stec等 人，J. Am· Chem. Soc. 106:6077(1984) ; Stein等人，Nucl. Acids Res.，16:3209(1988) ; Zon等人，Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991) ; Zon 等人，Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach，第 87-108 頁（F. Eckstein 編 ’ Oxford University Press，Oxford England(1991)); Stec 等人，美國專利.第5,151,510號；Uhlmann及Peyman， Chemical Reviews, 90:543(1990)，其揭示内容因而以引用 方式併入本文《若需要，則寡核苷酸可包括用於偵測之標 記0 "可操作連接"序列包括與所關注基因鄰接之表現控制 序列及表現反置或隔一定距離起作用來控制所關注基因 之表現控制序列。如本文所用之術語"表現控制序列"係指 為實現其所配接之編瑪序列的表現及處理所必須之聚核 苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動 子及強化子序列；有效RNA處理訊號諸如剪接及聚腺苷酸 化訊號；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯作用效率之 序列（意即Kozak共有序列）；增強蛋白質穩定性之序列及 所要時增強蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿 主有機體而不同；在原核生物中，該等控制序列通常包括 啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物 中，通常該等控制序列包括啟動子及轉錄終止序列。術語 "控制序列"意欲至少包括其存在對於表現及處理而言必 不可少之所有組份且亦可包括其存在係有利之額外组 98487.doc ⑧ 1363762 份’例如前導序列及.融合搭配物序列。 本文所用之術語"載體"意欲指一種可輸送所連接之另 一核酸的核酸分子。一類型之載體為"質體"，其係指一圓 形雙鏈DNA環，其中可配接額外DNA區段。另一類型之載 體為病毒載體，其中額外DNA區段可配接至病毒基因體。 某些載體可在其所引入之宿主細胞中自動複製（例如具有 細菌複製起點之細菌載體及游離基因哺乳動物載體）。其 φ 它載體（例如非游離基因哺乳動物載體）可在引入宿主細 胞時整合至宿主細胞之基因體中，且因而連同宿主基因體 一起複製。此外，某些載體可指導其可操作連接之基因的 表現。該等载體本文稱為"重組表現載體，，（或簡稱，，表現載 體"）。通常在重組DNA技術中所用之表現載體常常為質體 形式。在本專利說明書中，由於質體為最通用載體形式， 所以”質體"及”載體"可互換使用。然而’本發明意欲包括 具有等效功能之該等其它形式之表現載體諸如病毒載體 •(例如複製缺損性反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。 如本文所用之術語”重組宿主細胞"（或簡稱"宿主細胞") 意欲指其中已引入重組表現載體之細胞。應瞭解該等術語 ’如奴不僅扣特疋受檢細胞亦指該細胞之後代。因為某些變 異可由於大變作用或環境影響出現於繼代中，所以該後代 事實上可與親本細胞不—致但仍包括於本文所用之術語 "宿主細胞"範圍内。 本文涉及之術語”選擇性雜化”意謂可偵測地且特異地 結合。根據本發明之聚核苦酸、募核普酸及其片段在使可 98487.doc ⑧ •22· 1363762 谓測結合至非特異性核酸之可估量最小化之雜化及洗滌 條件下選擇性雜化至核酸鏈。，，高嚴格度"或"高度嚴格，，條 件可用於達成此項技術中已知及本文討論之選擇性雜化 條件。"高嚴格度"或"高度嚴格"條件之一實例係培育一聚 核苷酸以及另一聚核苷酸之方法，其中一聚核苷酸可固定 於諸如膜之固體表面，此係於6X SSPE或SSC、5 0%甲醯 胺、5X Denhardt's試劑、0.5% SDS ' 100 Mg/ml變性片段 化鮭魚精子DNA之雜化緩衝液中在42°C之雜化溫度下歷 經12-16小時，繼之在55°C下使用IX SSC、0.5% SDS洗滌 緩衝液洗務兩次。亦參見Sambrook等人，如上述，第 9.50-9.55 頁。 在核苷酸序列情形中之術語”百分比序列一致性"係指 當為達成最大程度對應而排列對比時兩序列中之相同殘 基。序列一致性比較之長度可遍及至少約九個核苷酸之展 幅、通常至少約1 8個核苷酸、更通常至少約24個核苷酸、 典型至少約28個核苷酸、更典型至少約32個核苷酸且較佳 至少約36、48或更多核苷酸。此項技術中已知有許多不同 運算法則可用於量測核苷酸序列一致性。例如聚核苷酸序 列可使用FASTA、Gap或Bestfit比較，彼等為Wisconsin Package Version 10.3，Accelrys，San Diego，CA 中之程式。 包括例如程式FASTA2及FASTA3之FASTA提供查詢及搜 尋序列之間最佳重疊區之排列對比及百分比序列一致性 (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98(1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219(2000); Pearson, Methods 98487.doc -23 - 1363762
Enzymol., 266: 227-25 8(1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84(1998);以引用方式併入本文）。除非另外指出，否 則使用特定程式或運算法則之預設參數。例如，核苷酸序 列之間之百分比序列一致性可使用具有其預設參數（用於 計分矩陣的為6之字尺寸及NOPAM因子）之FASTA或使用 具有以引用方式併入本文之Wisconsin Package Version 10.3中提供之其預設參數之Gap測定。 除非另外指出’否則涉及核苷酸序列包含其互補序列。 因而’涉及具有特定序列之核酸分子應理解為包含具有其 互補序列之互補鏈。 在分子生物學技術中’研究者互換使用術語"百分比序 列一致性”、"百分比序列相似性"及"百分比序列同系性"。 在本申請案中，該等術語應具有僅相關於核苷酸序列之相 同含義。 當涉及核睃或其片段時，術語”大體上相似性”或，，大體 上序列相似性•，指示當藉由適當核苷酸插入或缺失而與另 一核酸（或其互補鏈）最佳排列對比時，核苷酸序列一致性 藉由諸如上文論述之FASTA、BLAST或Gap之任何習知序 列一致性運算法則量測存在於至少約85%，較佳至少約 90%且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苦酸 酴基中。 當應用於多肽時，術語"大體上一致性”意謂當諸如藉由 程式GAP或BESTFIT使用預設間隔量來最佳排列時，兩個 狀序列共享至少75%或80%之序列一致性，較佳至少9 〇 % 98487.doc -24- ⑧ 1363762 或95%序列一致性，甚至更佳至少98%或99%序列一致 性。較佳地，不一致之殘基位置藉由守恆胺基酸取代而不 同。"守恆胺基酸取代"為其中胺基酸殘基藉由具有類似化 學性質（例如電荷或疏水性）側鏈（R基團）之另—胺基酸殘 基取代者。通常守恆胺基酸取代將大體上不改變蛋白質之 功能性質《在兩或兩個以上胺基酸序列藉由守恆取代而互 相不同之情況下，百分比序列一致性或相似度可向上調節 φ 以校正取代之守恆性質。用於進行該調節之方法為熟習此 項技術者熟知。參見例如pearson，Methods MdI. Biol.， 24 : 307-31(1994)，其以引用方式併入本文。具有相似化 學性質側鏈之胺基酸基團之實例包括丨）脂肪族側鏈：甘胺 酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂肪族羥基 側鏈.絲胺酸及穌胺酸；3 )含醯胺側鍵：天冬醯胺酸及麵 醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、路胺酸及色胺酸；5)驗 性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；及6)含硫侧鏈為半胱 春 胺酸及甲硫胺酸。較佳守怪胺基酸取代基團為：纈胺酸-白胺駿-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸_精胺酸、丙 !胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺酸_麩醯胺酸。 或者’寸怪置換為具有以引用方式併入本文之Gonnet 等人 ’ Science, 256 : 1443-45(1992)揭示之PAM250 對數 相似度矩陣中正值之任何改變。"中等守恆"置換為具有 PAM25 0對數相似度矩陣中非負值之任何改變。 多肽之序列相似性通常使用序列分析軟體量測。蛋白質 分析軟體使用指派給各種取代、缺失及其它修飾包括守恆 98487.doc -25- 1363762 胺基酸取代之相似性度量來匹配類似序列。例如，GCG含 有諸如"Gap”及"Bestfit"之程式，其可與預設參數一起使用 以確定密切相關之多肽諸如自不同物種有機體之同源多 狀之間或野生型蛋白質及其突變蛋白質之間序列同系性 或序列一致性。參見例如Wisconsin套件（package)Version 10.3。多肽序列亦可使用FASTA(Wisconsin套件Version 10.3中之程式）使用預設或建議參數來比較。faSTA(例如 FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜尋序列之間最佳重疊區 之排列對比及百分比序列一致性（Pearson(1990); Pearson(2000))。本發明之序列與含有大量來自不同生物 體之序列資料庫比較時，另一較佳運算法則為電腦程式 BLAST，尤其為blastp或tblastn，使用預設參數。參見例 如 Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 : 403-410(1990); Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997)，其以引用方 式併入本文。 用於同系性比較之多肽序列長度將一般為至少約丨6個 胺基酸殘基’通常至少約20個殘基，更通常至少約24個殘 基’典型至少約28個殘基且較佳大於約35個殘基。當搜尋 含有來自大量不同生物體之序列之資料庫時，較佳比較胺 基酸序列。 如本文所用之術語"標記"或"經標記"係指將另一分子 併入抗體中。在一實施例中，標記為一可偵測標誌，例如 併入放射性標記之胺基酸或附接至可藉由經標誌之抗生 物素蛋白（例如含可藉由光學或比色法偵測之螢光標誌或 98487.doc •26- d 1363762 酶活性之鏈黴抗生物素蛋白）偵測之生物素基部分之多肽 中。在另一實施例中，標記或標誌可為治療劑例如藥物共 軛體或毒素。標記多肽及糖蛋白之各種方法在此項技術中 已知且可使用。用於多肽標記之實例包括（但不限於）下 列：放射性同位素或放射性核素（例如3H、14c、15n、35s、 9〇Y、99Tc、⑴In、丨251、1、）、螢光標記（例如FITC、若丹 明（rhodamine)、鑭系元素磷光體）、酶標記（例如辣根過氧 化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、驗性碟酸酯酶）、化 學發光標誌'生物素基、藉由二次報告體識別之預定多肽 抗原決定部位（例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合 位點、金屬結合域、抗原決定部位標籤）、磁性劑諸如亂 螯合物、毒素諸如百曰咳毒素、紫杉醇鹼、細胞鬆弛素Β、 短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、足葉乙戒、 特諾波賽（tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、羥 道諾紅黴素、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、 光輝黴素、放線菌素D、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普 魯卡因（procaine)、丁卡因（tetracaine)、利多卡因 (hdocaine)、普萘洛爾（propran〇i〇i)及嘌呤黴素及其類似物 或同系物。在一些實施例中，標記藉由各長度之間隔臂附 接以減小潛在空間位阻。 本文所用之術語"劑"表示化學化合物、化學化合物之混 合物、生物大分子或自生物原料製得之提取物。本文所用 之術語”醫藥劑或藥物”係指適當投藥於患者時可誘導產 生所要治療效應之化學化合物或組合物。本文其它化學術 98487.doc 1η ⑧ 1363762 語根據此項技術中習知用法使用，如The McGraw-Hill
Dictionary of Chemical Terms(Parker，S.編，McGraw-Hill,
San Francisco(198 5))，以引用方式併入本文）例示。 本文所用之術語”消炎"劑或"免疫調節"劑係指具有抑 制受治者（包括人類）中炎症（包括炎性疾病）之功能性質之 劑。在本發明之各種實施例中’炎性疾病可為（但不限於） 包括克羅恩氏症（Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、憩室疾
病、胃炎、肝病、原發性膽管硬化、硬化性膽管炎之胃腸 道炎性疾病。炎性疾病亦包括（但不限於）腹部疾病（包括腹 膜炎、闌尾炎、膽管疾病）、急性橫貫性脊髓炎、過敏性 皮炎（包括過敏性皮膚、過敏性濕疹、皮膚遺傳性過敏症、 遺傳性過敏症濕疹、遺傳性過敏症皮炎 '皮膚炎症、炎性 濕療、炎性皮炎、蚤皮冑、粟粒狀皮《、粟粒狀濕疹、房 塵蟎皮膚）、強直性脊椎炎（瑞特症候群（Rehers syndrome))、哮喘、氣道炎症、動脈粥樣硬化、動脈硬化、
膽道閉鎖、膀胱炎症、乳癌、心血管炎症(包括脈管炎 風濕性指襞梗塞、腿潰瘍、多肌炎、慢性脈管炎症、心 炎、慢性阻礙性肺部疾病）、慢性跋腺炎、周神經炎症 結腸炎(包括阿米巴結腸炎、傳染性結腸炎、細菌性結 人克、-隹心氏結腸炎、缺血性結腸炎 '潰瘍性結腸炎、 天：直腸尨腸炎、炎性腸疾病、假膜性結腸炎)、膠原 脈管失調症（風渴性關銘* „ 關即炎、SLE、進行性系統硬化症、 合結締組織疾病、糖尿、庄、 展病）、克羅恩氏症（節段性腸炎、 芽腫性回腸炎、回腸沾 、、°腸尤、消化系統炎症）、脫髓鞘 98487.doc •28· 1363762 病（包括脊髓炎、各路ω 夕發性硬化、彌散性硬化、急性 腦脊趙炎、靜脈周脫趙勒、維生素Β12缺乏症、古立散 白瑞（Guillain-BarreV;i 仿被 ,. 6)症候群、MS相關反轉錄病毒）、皮肌 人心至X渗出性腹填、胃炎、肉芽腔性肝炎、肉芽腫 性炎症、膽囊炎、姨島素依賴型糖尿病、肝臟炎性疾病（肝 臟纖維化原純膽道硬化、肝炎、硬化性膽管幻、肺部 炎症（先天性肺部纖维# , 纖維化、肺部之嗜伊紅肉芽腫、肺组織
細胞=多病X、細支氣管周炎症、急性支氣管炎）、性病淋 巴肉牙腫、惡性黑素瘤、σ /齒疾病（包括酿炎、牙周疾病）、 黏膜炎、肌骨系統炎症（肌炎）、非酒精性脂肪性肝炎（非酒 精性脂肪肝疾病）、眼部&眼眶炎症（包括色素層炎、眼神 經炎、外周風濕性潰癌、外周角膜炎症）、骨關節炎、骨 趙炎、咽部炎症、多發性關節炎、直腸炎、牛皮癬、放射 性損傷、結節病、鐮刀細胞腎病、淺表性血检靜脈炎、系 統性炎性反應症候群、甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、移植 物抗宿主疾病、急性燒灼損傷、Beh?et，s症候群、啡㈣,s 症候群。 術語患者及受治者包括人類及獸類受治者。 人類抗MAdCAM抗體及其特徵 在一實施例中，本發明提供包含人類€1)11序列之抗 MAdCAM抗體。在-較佳實施例中，本發明提供人類抗 MAdCAM抗體。在-些實施例中，人類抗MAdcAM抗體 之產生藉由免疫處理非人類轉基因動物，例如齧齒動物， 其基因體包含人類免疫球蛋白基因以致轉基因動物產生 98487.doc •29· 1363762 人類抗體。在一些實施例中，本發明提供不結合補體之抗 MAdCAM 抗體。 在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為1.7.2、1.8.2、 6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、 7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。在另一較佳實施例 中，抗MAdCAM抗體包含一輕鏈，該輕鏈包含選自SEQ ID NO : 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、 54、58、62、66或68(有或無訊號序列）之胺基酸序列或該 等胺基酸序列中任一種之可變區或自該等胺基酸序列之 一或多個CDR。在另一較佳實施例中，抗MAdC AM抗體包 含一重鏈，該重鏈包含選自SEQ ID NO : 2、6、10、14、 18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64(有 或無訊號序列）之胺基酸序列或可變區之胺基酸序列或自 該等胺基酸序列之一或多個CDR。亦包括於本發明中者係 包含自上文提及序列中任一種之CDR1起始處至CDR3終 止處之胺基酸序列之人類抗MAdC AM抗體。本發明進一步 提供包含任何上文提及序列之一或多個FR區之抗 MAdCAM抗體。 本發明進一步提供包含其中已進行一或多個修飾之上 文提及胺基酸序列之一的抗MAdCAM抗體。在一些實施例 中，抗體中可化學反應之半胱胺酸以另一殘基（諸如（無限 制性)丙胺酸或絲胺酸)取代。在-實施例中，取代係處於 非標準半胱胺酸。取代可在可變域之CDR4骨架區中或抗 98487.doc -30· ⑧ 體之怪定域中進行。在一些實施例中’半胱胺酸係標準的β 在一些實施例中，胺基酸取代用於消除抗體中潛在蛋白 水解位點。該等位點可出現在可變域之CDR或骨架區中或 抗體之怪定域中。半胱胺酸殘基之取代及蛋白水解位點之 移除可減少抗體產物中之異質性。在一些實施例中，形成 潛在脫醯胺作用位點之天冬醯胺酸_甘胺酸對藉由改變一 或兩個殘基而消除。在一些實施例中，進行胺基酸取代以 添加或移除本發明之抗體可變區中潛在糖基化作用位點。 在一些實施例中，本發明之抗MAdCAM抗體之重鏈之 C-末端離胺酸裂解。在本發明之各種實施例中，抗 MAdCAM抗體之重及輕鏈可視情況包括訊號序列。 在一態樣中’本發明提供十二個抑制人類抗MAdCAM 之單株抗體及產生其之融合瘤細胞株。表1列出編碼全長 重鏈及輕鏈（包括訊號序列）及相應全長推導之胺基酸序 列之核酸序列標識符（SEQ ID NO :)。 表1 人類抗MAdCAM之抗體 單株抗體 序列識別符 (SEOIDNO:') ___全長 重 輕 DNA 蛋白質 DNA 蛋白質 1.7.2 1 2 3 4 1.8.2 5 6 7 8 6.14.2 9 10 11 12 6.22.2 13 14 15 16 6.34.2 17 18 19 20 6.67.1 21 22 ~~ 23 24 6.73.2 25 26 27 28 6.77.1 29 30 31 32 7.16.6 33 34 35 36 7.20.5 37 38 39 40 98487.doc -31- 1363762 人類抗MAdCAM之抗體 單株抗體 序列識別符 (SEQ ID NO:) 全長 重 輕 DNA 蛋白質 DNA 蛋白質 7.26.4 41 42 43 44 9.8.2 45 46 47 48 在另一態樣中，本發明提供某些上文識別之人類抗 MAdCAM單株抗體之修飾變體。表2列出了修飾抗體之 DNA及蛋白質序列之序列識別符。 人類抗MAdCAM抗體 修飾之單株抗體 序列識別符 (SEQ ID NO:) 全長 重 輕 DNA 蛋白質 DNA 蛋白質 6.22.2-mod 51 52 53 54 6.34.2-mod 55 56 57 58 6.67.1-mod 59 60 61 62 6.77.1-mod 63 64 65 66 7.26.4-mod 41 42 67 68
抗MAdCAM抗體之類及亞類 抗體可為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在一較佳實 施例中，抗體為IgG類且為IgGi、IgG2、IgG3或IgG4亞類。 在一更佳實施例中，抗MAdCAM抗體為亞類IgG2*IgG4。 在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為與IgG2之1.7.2、 1.8.2、 7.16.6、7.20.5、7.26.4、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod 或 IgG4 之 6.14.2、 6.22.2、 6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1或 9.8.2抗體相同的 類及亞類。 抗MAdCAM抗體之類及亞類可藉由此項技術中任何已 98487.doc -32- ⑧ 知方法確定。通常抗MAdC AM抗體之類及亞類可使用對特 定類及亞類之抗體具特異性之抗體來確定。該等抗體可購 得。ELISA、西方轉潰（Western Blot)及其它技術可破定類 及亞類。或者，類及亞類可藉由測序抗體重及/或輕鏈之 恆定域的所有或一部分，比較其胺基酸序列與各種類及亞 類之免疫球蛋白的已知胺基酸序列且確定抗體類及亞類 作為顯示最高序列一致性之類。 物種及分子選擇性 在本發明之另一態樣中，抗MAdCAM抗體表現物種及分 子選擇性兩者。在一實施例中，抗MAdC AM抗體結合至人 類、獼猴或狗MAdCAM。在一些實施例中，抗MAdCAM 抗體不結合至諸如狨猴之新世界猴物種。遵循本專利說明 書之教示，吾人可使用此項技術中熟知之方法確定抗 MAdC AM抗體之物種選擇性。例如吾人可使用西方轉潰、 FACS、ELISA或免疫組織化學破定物種選擇性。在一較佳 實施例中，吾人可使用免疫組織化學確定物種選擇性。 在一些實施例中，特異結合MAdCAM之抗MAdCAM抗 體具有超過VCAM、纖維結合素或任何其它抗原至少10 倍，較佳至少20、30、40、50、60、70、80或90倍，最佳 至少100倍之MAdC AM選擇性。在一較佳實施例中，抗 MAdC AM抗體不展現任何明顯結合至VCAM、纖維結合素 或除MAdCAM之外之任何其它抗原。遵循本專利說明書之 教示使用此項技術中熟知方法吾人可確定抗MAdCAM抗 體之MAdC AM選擇性。例如，吾人可使用西方轉潰、 98487.doc -33- FACS、ELISA或免疫組織化學確定選擇性。 抗MAdCAM抗體至MAdCAM之結合親和力 在本發明之另一態樣中，抗MAdC AM抗體以高親和力特 異結合至MAdCAM。在一實施例中，抗MAdCAM抗體以 藉由表面電漿共振諸如BIAcore量測之3xl(T8 Μ或更小之 特異結合至MAdCAM。在更佳實施例中，抗體以1x1 〇-8 或更小或ΙχΗΤ9 Μ或更小之1特異結合至MAdCAM。在一 甚佳實施例令，抗體以1χ10·1() Μ或更小之Kd特異結合至 MAdCAM。在其它較佳實施例中，本發明之抗體以 2.66x1(T1qM或更小、2_35xlO_nM或更小或9χ1〇·12Μ或更小 之Kd特異結合至MAdCAM。在另一較佳實施例中，抗體以 1 xlO·11 Μ或更小之Kd特異結合至MAdC AM。在另一較佳實 施例中，抗體以與選自 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、 6.22.2-mod、6.34_2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod之抗體大體上相同之Kd特異結合至 MAdC AM。與相同實驗中參照抗體之Kd比較，具有與參照 抗體"大體上相同Kd”之抗體具有土100 pM、較佳±50 pM、 更佳±20 pM、仍更佳±10 pM、±5 pM或±2 pM之Kd。在另 一較佳實施例中，抗體以與包含選自1.7.2' 1.8.2' 6.14.2、 6.22.2 、 6.34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、 6.77.1-mod或7.26.4-mod之抗體之一或多個可變域或一或 多個CDR之抗體大體上相同之Kd結合至MAdCAM。在另一 98487.doc •34· 較佳實施例中，抗體以與包含一種選自SEQIDN0S: 2、 4 、 6 、 8 、 10 、 12 、 14 、 16 、 18 、 2〇 、 22 、 24 、 26 、 28 、 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、 58、62、64、66或68(有或無訊號序列）或其可變域之胺基 酸序列之抗體大體上相同之Kd結合至MAdCAM。在另一較 佳實施例中，抗體以與包含一或多個CDR之抗體大體上相 同之Kd結合至MAdCAM，其中該一或該等多個(：1)11來自一 包含選自 SEQIDNOS:2、4、6、8、1()、12、14、16、 18、2〇、22、24、26、28、3〇、32、34、36、38 4〇42、 44、46、48、52、54 ' 56、“ 58 ' 62、64、66或68之胺基酸 序列之抗體。 抗MAdCAM抗體至MAdCAM之結合親和力可藉由此項 技術中任何已知方法測定。在_實施例中，結合親和力可 藉由競爭性ELIS As、RiAs志皂工办收
As次表面電漿共振諸如BiAcore量 測。在一更佳實施例中，沾人 、，=口親和力藉由表面電漿共振量 測。在一甚佳實施例， J甲 、、、°合親和力及解離速率使用 BIAcore量測。測定结人鉬 .. σ親和力之實例在下文實例Π中描 述0 抗MAdCAM抗體之半衰期 根據本發明之另一目 ^ s , 知^MAdCAM抗體具有活體外或 活體内至少一天之半衰 1兄 ^ 5 , 月。在—較佳實施例中，抗體或其 #分具有至少三天之半衰 其部分具有四天或更長之丰較佳實施例中，抗體或 或其部分具有八天 ::期。在另-實施例中，抗體 ^長之半衰期。在另一實施例中，抗 98487.doc * 35 - -1363762 體或其抗原結合部分衍生化或修飾以使其具有更長之半 哀期’如下文論述。在另一較佳實施例中，抗體可含有點 突變作用以增加血清半衰期，諸如2〇〇〇年2月24日公開之 W0 00/09560所述。 抗體半衰期可藉由普通熟習此項技術者已知之任何方 法量測。例如抗體半衰期可藉由西方轉潰、 經一段適當時間量測。抗體半衰期可在任何適當動物諸如 靈長類動物例如獼狼或人中量測。 以抗MAdCAM抗體辨識之MAdCAM抗原決定部位之識別 本發明亦提供與本文提供之人類抗MAdC AM抗體一樣 結合相同抗原或抗原決定部位之人類抗]VlAdCAM抗體。進 一步，本發明提供與人類抗MAdC AM抗體競爭或交又競爭 之人類抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，人類抗 MAdCAM抗體為 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6·73·2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2 ' 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，人類抗MAdCAM抗體 包含選自下列抗體之一或多個可變域或一或多個匸〇艮： 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67」、6.73.2、6.77.1、 7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1-mod ' 6.77.1-mod或 7.26.4-mod。在另一較佳實施例 中，人類抗MAdC AM抗體包含一種選自SEQ ID NOS: 2、 4 、 6 、 8 、 1〇 、 12 、 14 、 16 、 18 、 20 、 22 、 24 、 26 、 28 、 98487.doc -36- 1363762 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、 58、62、64、66或68(有或無訊號序列）或其可變區之胺基 酸序列。在另一較佳實施例中’人類抗MAdCAM抗體包含 一或多個CDR，該一或該等多個CDR來自包含一種選自 SEQ ID NOS : 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、52、54、56、58、62、64、66或68之胺基酸序列之抗 體。在一甚佳實施例中，抗MAdC AM抗體為另一人類抗體。 使用此項技術中各種已知之方法吾人可測定是否抗 MAdCAM抗體與另一抗MAdCAM抗體一樣結合至相同抗 原。例如吾人可使用已知抗MAdCAM抗體捕獲抗原，自抗 MAdC AM抗體中溶離抗原且隨後測定是否測試抗體將結 合至經溶離之抗原。吾人可測定是否抗體與抗MAdC AM抗 體競爭，此係藉由在飽和條件下使抗MAdC AM抗體結合至 MAdCAM，且隨後量測測試抗體結合至MAdCAM之能 力。若測試抗體在與抗MAdCAM抗體相同之時間下可結合 至MAdCAM，則測試抗體與抗MAdC AM抗體相比結合至 不同抗原決定部位。然而？若測試抗體在相同時間下不能 結合至MAdCAM，則測試抗體與人類抗MAdCAM抗體競 爭。該實驗可使用ELISA或表面電漿共振或較佳BIAcore 執行。為測試是否抗MAdC AM抗體與另一抗MAdCAM抗 體交叉競爭，吾人可在兩個方向中使用上文所述之競爭方 法，意即測定是否已知抗體阻滯測試抗體且反之亦然。 輕鏈及重鏈基因用法 98487.doc -37- 1363762 本發-明亦提供包含藉由人類忙基因編碼之輕鏈可變區之 抗MAdC AM抗體。在一較佳實施例中，輕鏈可變區藉由人 類VK A2、A3、A26、B3、012或018基因家族編碼。在各 種實施例中，輕鏈包含不超過七 '不超過六或不超過三個 自種株人類¥忙八2、八3、八26、83、〇12或〇18序列之胺基 酸取代。在一較佳實施例中，胺基酸取代為守恆取代。 SEQ ID NOS : 4、8、12、16、20、24、28、32、36、 40、44 及 48 提供十二個抗 MAdCAM抗體 1_7.2、1.8.2、 6.14.2 、 6.22.2 、 6.34.2 、 6_67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7-20.5、7.26.4及9.8.2之全長κ輕鏈之胺基酸序列。圖1K_1T 為十二個抗MAdC AM抗體之輕鏈可變域胺基酸序列與其 所衍生自之種株序列之排列對比。圖2A顯示十二個抗 MAdCAM抗體κ輕鏈之輕鏈可變域之胺基酸序列互相排列 對比。遵循本專利說明書之教示，普通熟習此項技術者可 測定種株序列與額外抗MAdC AM抗體之抗體序列之間差 異。SEQ ID NOS.. 54、58、62、66或68提供藉由分別自 其親本抗 MAdCAM 抗體 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1 或 7.26.4進行胺基酸取代而修飾之五個額外抗MAdCAM抗體 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 及 7.26.4-mod之全長κ輕鏈之胺基酸序列。 在一較佳實施例中，相對於種株胺基酸序列，抗 MAdC AM抗體之VL含有與任一或多個下列抗體之Vl相同 之突變作用：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22_2、6.34_2、6.67.1、 6.73.2、6.77_1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6,22.2-mod、 98487.doc -38- 1363762
6.34.2_m°d、以7·1.4、6.77.l,cl或 7.26.4-m〇d。本發 明包括利用與例示抗體相同人類Vk及人類几基因之抗 MAdCAM抗體。在一些實施例中，抗體包含—或多個與― 或多個例示抗體相同之自種株之突變作用。在一些實施例 中’抗體在-或多個與一或多個例示抗體相同之位置包含 不同取代。例如，抗MAdCAM抗體之¥:可含有一或多個 與存在於抗體7.16.6中之彼等招同之胺基酸取代及另一與 抗體7.26.4相同之胺基酸取代。以該方式，吾人可混合且 匹配抗體結合之不同特徵以改變例如用於MAdCAM之抗 體親和力或其自抗原之解離速率。在另一實施例中，突變 作用進行於與任一或多個下列抗體之發現之彼等相 同的位置.1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、 6.73.2、6.77.卜 7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-mod、0.77_；Umod或 7.26.4-mod，但守
恆胺基酸取代並非使用相同胺基酸來進行。例如，若與種 株相比下列抗體 1.7.2、1.8.2、0.14.2、0.22.2、0.34.2、 6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、 6.22.2-mod、6,34.2-mod、6.67.卜mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod之一中之胺基酸取代基為麩胺酸，則吾人可守 怪取代天冬胺酸。類似地，若胺基酸取代基為絲胺酸，則 吾人可守恆取代酥胺酸。 在另一較佳實施例中，輕鏈包含與下列抗體之VL胺基 酸序列相同之胺基酸序列：1 7 2、1 8 2、6 14 2、6 22 2、 6.34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4 、 98487.doc •39· 9.8.2、 6.22.2-mod、6·34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或7.26.4-mod。在另一甚佳實施例中’輕鏈包含與下列抗 體之輕鏈之CDR區相同之胺基酸序列：1.7.2、1.8.2、 634.2、 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、 7·2〇·5 、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod ' 6.34.2-mod ' 6-67.1-mod、6.77.1 - mod或 7.26_4-mod。在另一較佳實施例 中’輕鏈包含具有下列抗體之輕鏈之至少一個CDR區之胺 基酸序列·· 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、 6·73.2、6.77」、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9_8.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。在另 —較佳實施例中，輕鏈包含具有來自使用相同VK及jk基因 之不同輕鏈的CDR之胺基酸序列。在一更佳實施例中，自 不同輕鏈之CDR自下列抗體獲得：1.7.2、1,8.2、6.14.2、 6.22.2、 6.34.2、6·67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、 7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34，2-mod、6.67.1-mod、 6.77.1-mod或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，輕鏈包 含選自 SEQ ID NOS : 4、8、12、16、20、24、28、32、 36、40、44、48、54、58、62、64、66或68(有或無訊號 序列）之胺基酸序列。在另一實施例中，輕鏈包含藉由選 自 SEQ ID NOS : 3、7、11、15、19、23、27、31、35 ' 39、43、47、53、57、61、65或67(有或無訊號序列）之核 苦酸序列編碼之胺基酸序列，或編碼具有1 _ 1 1胺基酸插 入、缺失或自其取代之胺基酸序列之核苷酸序列。較佳地 胺基酸取代為守恆胺基酸取代。在另一實施例中，抗體或 98487.doc -40- 1363762 其部分包含λ輕鏈。 本發明亦提供包含人類VH基因序列或源自人類VH基 因之序列之抗MAdCAM抗體或其部分。在一實施例中，重 鏈胺基酸序列源自人類VH 1-18、3-15、3-2卜3-23、3-30、 3-33或4-4基因家族。在各種實施例中’重鏈包含自人類 VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33 或 4-4基因序列不 超過十五、不超過六或不超過三個胺基酸改變。 SEQ ID NOS : 2、6、10、14、18、22、26、30 ' 34、 38、42及46提供十二個抗MAdCAM抗體之全長重鏈之胺基 酸序列。圖1A-1J為十二個抗MAdCAM抗體之重鏈可變區 胺基酸序列與其所衍生自之種株序列之排列對比。圖2B 顯示十二個抗MAdCAM抗體之重鏈可變區胺基酸序列之 互相排列對比。遵循本專利說明書之教示及本發明之核普 酸序列’普通熟習此項技術者可測定十二個抗MAdCAM重 鏈及種株重鏈之經編碼之胺基酸序列且測定種株序列與 抗體序列之間之差異。SEQ ID NOS : 52、56、60及64提 供藉由分別自其親本抗MAdCAM抗體6.22.2、6_34.2及 6.67.1進行胺基酸取代而修飾之6.22.2-mod、6.34.2-mod 及6.67.1-mod之抗MAdCAM抗體全長重鏈之胺基酸序 列。另一修飾抗MAdCAM抗體7.26.4-mod具有SEQ ID NO : 42之全長重鏈胺基酸序列。 在一較佳實施例中，相對於種株胺基酸序列，抗 MAdCAM抗體之VH含有與任一或多個下列抗體之vh相 同之突變作用：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、 98487.doc -41· ⑧ 1363762 6.73.2、 6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-m〇d、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。與上 文論述類似’抗體包含自種株一或多個與一或多個例示抗 體相同之突變作用。在一些實施例中，抗體包含一或多個 與一或多個例示抗體相同位置之不同取代。例如，抗 M AdC AM抗體之VH可含有一或多個與抗體7.16.6中存在 之彼等相同之胺基酸取代，及與抗體7.26.4相同之另一胺 基酸取代。以該方式’吾人可混合且匹配抗體結合之不同 特徵以改變例如用於MAdCAM之抗體親和力或其自抗原 之解離速率。在另一實施例中，與種株比較之胺基酸取代 係在與任一或多個下列參照抗體之VH中發現之來自種株 之取代相同之位置進行：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、 6.34.2 ' 6.67.1 ' 6.73.2 ' 6.77.1 ' 7.16.6 ' 7.20.5 ' 7.26.4 ' 9.8.2、 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或7.26.4-mod，但此位置以不同殘基取代，其與參照抗體 比較為守恆取代。 在另一較佳實施例中，重鏈包含與下列抗體之VH之胺 基酸序列相同之胺基酸序列：i.7.2、18.2、6,142、6 22 2、 6·34·2、6.67.1、6·73.2、6.77.1、7_16.6、7 2〇 5、7 2“、 9.8.2 > 6.22.2-mod ^ 6.34.2-mod ^ 6.67.1-m〇d ^ 6.77.1-mod 或7.26.4-mod。在另一甚佳實施例中，重鏈包含與下列抗 體之重鏈CDR區相同之胺基酸序列：丨7 2、i 8 2、6 2、 6.22.2、 6.34.2、6.67」、6.73.2、6·771、716 6、7 2〇 5、 7.26.4 ^ 9.8.2 > 6.22.2-mod ^ 6.34.2-mod，6.67.1-mod > ·42· 98487.doc ⑧ 6.77.1 -mod或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，重鍵包 含自下列抗體之重鏈之至少一個CDR區之胺基酸序列： 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73 2、6 77 1、 7.16.6、 7.20.4、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1-mod、6.77.1-mod或 7.26.4-mod。在另一較佳實施例 中’重鏈包含具有自不同重鏈之CDR之胺基酸序列。在一 更佳實施例中’自不同重鏈之CDR係自下列抗體獲得： 1-7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6 77 1、 7.16.6、 7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1 -mod、6.77.1 -mod或 7.26.4-mod。在另一較佳實施例 中，重鏈包含選自 SEQ ID NOS : 2、6、10、14、18、22、 26、30 ' 34、38、42、46 ' 52、56、60或 64(有或無訊號 序列）之胺基酸序列。在另一實施例中，重鏈包含藉由選 自 SEQIDNOS. 1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、 41、45、51、55、59或63之核苷酸序列編碼之胺基酸序列， 或編碼具有1-15胺基酸插入、缺失或自其取代之胺基酸序 列之核苷酸序列。在另一實施例中’取代為守恆胺基酸取 代。 產生抗體及抗體產生細胞株之方法 免疫 在本發明之一實施例中’人類抗體藉由以MAdCAM抗原 免疫包含一些或所有人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座 之非人類動物而產生。在一較佳實施例中，非人類動物為 XENOMOUSE™動物’其為包含人類免疫球蛋白基因座之 98487.doc •43- 1363762 大片段且不足以產生小鼠抗體之經設計之小鼠品系。參見 例如Green等人，Nature Genetics 7:.13-21(1994)及美國專 利 5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075，18卜 6,091，001、6,114,598及6，130,364。亦參見界〇 91/10741、 WO 94/02602、W0 96/34096 及 WO 96/33735、W0 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、 WO 99/53049、WO 00/09560 及 WO 00/037504。 XENOMOUSETM動物產生完全人類抗體之類成年人人類 譜庫且產生抗•原特異性人類mAbs。次代XENOMOUSE™動 物經由人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之百萬鹼基規模、 種株組態YAC片段之引入而含有約80%之人類抗體V基因 譜庫。在其它實施例中，XENOMOUSETlvM、鼠含有約所有 人類重鍵及λ輕鍵基因座。參見]Vfendez等人，Nature
Genetics 15:146-156(1997)、Green及 Jakobovits，J. Exp. Med. 188:483-495(1998)，其揭示内容以引用方式併入本 文。 本發明亦提供一種用於自非人類、非小鼠動物藉由免疫 包含人類免疫球蛋白基因座之非人類轉基因動物製造抗 MAdCAM抗體之方法。吾人可使用剛剛上文所述之方法產 生該等動物。該等文獻中揭示之方法可按以引用方式併入 本文之美國專利5,994,619(，619專利）中所述調整。，619專 利描述了用於產生源自豬及牛之新穎培養内細胞團 (CICM)細胞及細胞株及其中插入異質DNA之轉基因CICM 細胞之方法。CICM轉基因細胞可用於產生經選殖之轉基 98487.doc •44- ⑧ 1363762 因胚、胎及後裔。’619專利亦描述了產生可傳輸異質dna 至其後代之轉基因動物之方法。在一較佳實施例中，非人 類動物可為大鼠、绵羊、豬、山羊、牛或馬。 在另一實施例中，包含人類免疫球蛋白基因座之非人類 動物為具有人類免疫球蛋白之"微型基因座"之動物。在微 型基因座途徑中，外源性Ig基因座經由包括來自Ig基因座 之獨立基因而被模擬。因此，一或多個VH基因、一或多 個DH基因、一或多個JH基因、μ悝定域及次級怪定域（較 佳γ恆定域）形成一結構供插入動物。該途徑尤其描述於以 引用方式併入本文之美國專利第5,5 45,807號、第5,545,806 號 '第 5,625，126號、第 5,633,425號、第 5,661，016號、第 5,770,429號、第 5,789,650號、第 5,814,318號、第 5,591，669 號、第 5,612,205號、第 5,721，367號、第 5,789,215 號及第 5,643,763號中。 微型基因座途徑之一優勢係可藉以產生包括Ig基因座 部分之結構且引入動物中之快速性。然而，微型基因座途 徑之一潛在劣勢為可能沒有足夠免疫球蛋白多樣性以支 持全B細胞發育以致抗體產量可能較低。 為產生人類抗MAdC AM抗體，包含一些或所有人類免疫 球蛋白基因座之非人類動物以MAdCAM抗原免疫且抗體 或抗體產生細胞自動物中分離。MAdCAM抗原可為經分離 及/或經純化之MAdCAM且較佳為人類MAdCAM。在另一 實施例中，MAdCAM抗原為MAdCAM之片段，較佳 MAdC AM細胞外域。在另一實施例中，MAdC AM抗原為 98487.doc •45- 包含MAdCAM之至少一個抗原決定部位之片段。在另一實 施例中，MAdCAM抗原為表現MAdCAM於其細胞表面之 細胞，較佳過度表現MAdC AM於其細胞表面之細胞。 動物之免疫可藉由此項技術中已知之任何方法進行。參 見例如Harlow 及 Lane, Antibodies : A Laboratory Manual， New York : Cold Spring Harbor Press(1990)。用於免疫非 人類動物諸如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬之方 法在此項技術中熟知。參見例如Harlow及Lane及美國專利 5，994,6 19。在一較佳實施例中，MAdC AM抗原與一佐劑投 藥以刺激免疫反應。該等佐劑包括完全或不完全之弗氏佐 劑（Freund’s adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽）或ISCOM(免疫 刺激複合物）。該等佐劑可藉由將其封存於局部沉積中而 防止多肽快速分散，或其可含有刺激宿主分泌對巨噬細胞 及免疫系統之其它組份具趨化性之因子的物質。較佳，若 投藥多肽，則免疫時程表將涉及分散於數週内之兩或兩次 以上多肽之投藥。 實例I提供用於以全長人類MAdCAM在磷酸鹽緩衝鹽水 中免疫XENOMOUSE™動物之方案。 抗體及抗體產生細胞株之產生 以MAdCAM抗原免疫動物之後，抗體及/或抗體產生細 胞可自動物獲得。含抗MAdCAM抗體之血清自動物中藉由 出血或處死動物而獲得。血清可如自動物中獲得而使用， 免疫球蛋白部分可自血清獲得或抗MAdCAM抗體可自血 清純化。 98487.doc -46- 在另一實施例中，產生抗體之永生化細胞株可自免疫動 物製備。免疫之後，動物處死且B細胞使用此項技術中熟 知方法永生化。永生化細胞之方法包括（但不限於）以致癌 基因將其轉染、以致癌基因病毒將其感染且在選擇永生化 細胞之條件下培養、使其經受致癌物或突變化合物、將其 與永生化細胞例如骨髓瘤細胞融合且滅活腫瘤抑制基 因。參見例如Harlow及Lane,如上述。在包括骨髓瘤細胞 之實施例中，骨髓瘤細胞不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌 性細胞株）。永生化及抗生素選擇之後，永生化細胞或其 培養上清液使用MAdCAM、其部分或表現MAdCAM之細 胞篩選。在一較佳實施例中，起始篩選使用酶連接免疫檢 定法（ELISA)或放射免疫檢定法（RIA)較佳ELISA執行。 ELISA篩選之一實例提供在以引用方式併入本文之PCT公 開案第WO 00/37504號中。 在另一實施例中，抗體產生細胞可自具有自體免疫失調 症及表現抗MAdCAM抗體之人製備。表現抗MAdCAM抗 體之細胞可藉由分離白血球且使其經受螢光活化細胞分 選（FACS)或藉由展平於以MAdCAM或其部分塗布之板上 來分離。該等細胞可與人類非分泌性骨髓瘤融合以產生表 現人類抗MAdCAM抗體之人類融合瘤。通常此為一欠佳實 施例，因為抗MAdCAM抗體可能將對MAdCAM具有低親 和力。 抗MAdCAM抗體產生細胞例如融合瘤被選擇、選殖且進 一步篩選以獲得所要特徵，包括強盛之細胞生長、高抗體 98487.doc •47- 產量及如下文進一步論述之所要抗體特徵。融合瘤可在同 源動物中、無免疫系統之動物例如裸鼠中活體内培養且擴 增或在活體外細胞培養物中培養且擴增。選擇、選殖及擴 增融合瘤之方法為普通熟習此項技術者熟知。 較佳地，免疫之動物為表現人類免疫球蛋白基因之非人 類動物且脾臟B細胞融合至源自與非人類動物相同種之骨 髓瘤中。更佳地，免疫之動物為XENOMOUSE™動物且骨 髓瘤細胞株為非分泌性小鼠骨髓瘤諸如骨髓瘤細胞株為 P3-X63-AG8-653(ATCC)。參見例如實例 I。 因此，在一實施例中，本發明提供用於產生一產生針對 MAdC AM之人類單株抗體或其片段之細胞株之方法，其包 含（a)以MAdCAM、MAdCAM之部分或表現MAdCAM之細 胞或組織免疫本文所述之非人類轉基因動物；（b)允許轉 基因動物發動對MAdCAM之免疫反應；（c)自轉基因動物 中分離抗體產生細胞；（d)永生化抗體產生細胞；（e)建置 永生化抗體產生細胞之獨立單株群落；且（f)篩選永生化抗 體產生細胞或其培養上清液以識別針對MAdCAM之抗體。 在一態樣中，本發明提供產生人類抗MAdC AM抗體之融 合瘤。在一較佳實施例中，融合瘤為上文所述之小鼠融合 瘤。在另一實施例中，融合瘤產生於非人類、非小鼠物種 諸如大鼠、錦羊、豬、山羊、牛或馬中。在另一實施例中， 融合瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌性骨髓瘤與表現抗 MAdCAM抗體之人類細胞融合。 核酸、載體、宿主細胞及製造抗體之重組方法 98487.doc • 48- 1363762 核酸 提供編碼本發明之抗MAdC AM抗體之核酸分子。在一實 施例中，核酸分子編碼抗MAdCAM免疫球蛋白之重鏈及/ 或輕鏈。在一較佳實施例中，單一核酸分子編碼抗 MAdCAM免疫球蛋白之重鏈且另一核酸分子編碼抗 MAdCAM免疫球蛋白之輕鏈。在一更佳實施例中，編碼之 免疫球蛋白為人類免疫球蛋白’較佳人類IgG。編碼之輕 鏈可為λ鏈或κ鏈，較佳κ鏈。 在一較佳實施例中’編瑪輕鏈可變區之核酸分子包含人 類VK Α2、A3、Α26、Β3、012或018基因之種株序列或該 序列之變體。在一較佳實施例中，編碼輕鏈之核酸分子包 含源自人類JkI、JK2、JK3、Jk4或Jk5基因之序列。在一較 佳實施例中’編碼輕鏈之核酸分子編碼有別於種株A2、 A3、A26、B3、012或〇18 Vk基因的不超過十一個胺基酸 改變’較佳不超過六個胺基酸改變且更佳不超過三個胺基 酸改變。在一更佳實施例中，編碼輕鏈之核酸為種株序列。 本發明提供編碼與種株序列比較含有高達十一個胺基 酸改變之輕鏈可變區（VL)之核酸分子，其中胺基酸改變與 來自下列抗體之一之VL的有別於種株序列之胺基酸改變 -致：1.7.2' 1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67」、6.73.2、 6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。本發 明亦提供包含編碼下列抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列 之核苦酸序列的核酸分子：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、 98487.doc -49- 1363762 6.34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20,5 、 7.26.4 、 9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67J-mod、6.77.l-m〇d 或7.26.4-m〇d。本發明亦提供包含編碼下列抗體之任—輕 鏈之一或多個CDR之胺基酸序列之核苷酸序列的核酸分 子：1-7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、 6.77.1、 7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、 6.34_2-m〇d' 6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。在一 較佳實施例中，核酸分子包含編碼下列抗體之任一輕鏈之 所有CDR之胺基酸序列之核苷酸序列：1.7 2、ι.8,2、 6.14.2、 6.22.2、6.34.2、6.67.1、0.73.2、6.77.1、7.16.6、 7.20.5 、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67_1-111〇(1、6.77.1-111〇(1或7.26.4-111〇(1。在另一實施例中， 核酸分子包含編瑪 SEQ ID NOS : 4、8、12、1 6、20、24、 28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68之一之胺 基酸序列之核苷酸序列或包含SEQ ID NOS : 3、7、11、 15、19、23、27、31、35、39 ' 43、47、53、57、61、65
或67之一之核苷酸序列。在另一較佳實施例中，核酸分子 包含編碼任一下列 SEQIDNOS: 4' 8、12、16、20、24、 28、32、36、40、44、48、54、58、62 ' 66、68之一或多 個C D R之胺基酸序列之核皆酸序列或包含任^一下列S E Q ID N0S : 3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、 47、53、57、61、65或67之一或多個CDR《核苷酸序列。 在一更佳實施例中，核酸分子包含編碼任—不列SEQ ID NOS : 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、 98487.doc -50- ⑧ 1363762
54、58、62、66、68之所有CDR之胺基酸序列之核苷酸序 列或包含任一下列 SEQIDNOS: 3、7、11、15、19、23、 27、31、35、39、43、47、53、57、61、65 或 67之所有 CDR 之核苷酸序列。
本發明亦提供編碼VL之胺基酸序列的核酸分子，其中 該VL所具有之胺基酸序列與上述VL，尤其與包含SEQ ID NOS : 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、 54、58、62、66或68之一之胺基酸序列的vl至少70%、 750/〇、80%、85%、90%、950/〇、96%、97%、98%或 990/〇 — 致。本發明亦提供與SEQ ID NOS :3、7、11、15、19、 23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65 或 67 之一 之核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98°/。或99%—致之核苷酸序列。 在另一實施例中，本發明提供在高度嚴格條件下與編碼 上述VL之核酸分子雜化之核酸分子，尤其包含編碼SEq ID NOS : 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、
48、54、58、62、66或68之胺基酸序列之核苷酸序列的核 酸分子。本發明亦提供在高度嚴格條件下與包含SEq ID NOS : 3、7、11 ' 15、19、23、27、31、35、39、43、47、 53、57、61、65或67之一之核苷酸序列雜化之核酸分子。 本發明亦提供編碼利用人類VH 1-18、3-15、3-21、3-23、 3-30、3-33或4-4 VH基因之重鏈可變區（VH)之核酸分子。 在一些實施例中’編碼VH基因之核酸分子進一步利用人 類JH4或JH6豕族基因。在一些實施例中，編碼基因之 98487.doc S1 ⑧ 1363762 核酸分子利用人類JH4b或JH6b基因。在另一實施例中，核 酸分子包含源自人類D 3-10、4-23、5-5、0-6或6-19基因 之序列。在一甚至更佳實施例中，編碼VH之核酸分子包 含有別於種株VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33或 4-4基因的不超過十五個胺基酸改變，較佳不超過六個胺 基酸改變且甚至更佳不超過三個胺基酸改變。在一甚佳實 施例中’編碼VH之核酸分子與種株序列比較含有至少一 個胺基酸改變，其中胺基酸改變與來自下列抗體之一重鏈 的有別於種株序列之胺基酸改變一致：1 7 2、i 8 2、 6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77」、7.16.6、 7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1- mod、6.77.1-mod或 7.26.4-mod。在一甚至更佳實施 例中’ VH與種株序列比較含有不超過十五個胺基酸改 變’其中改變與來自下列抗體之一之VH的有別於種株序 列之彼等改變一致：1·7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4 、 9.8.2 、 6.22.2- mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。 在一實施例中，核酸分子包含編媽下列抗體之vh之胺 基酸序列之核苷酸序列：1·7·2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、 6.34.2 、 6_67_1 、 6.73.2 、 6.77.1 ' 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4 、 9.8.2 > 6.22.2-mod ' 6.34.2-mod > 6.67.1.m〇d > 6.77.1-mod 或7.26_4-mod ^在另一實施例中，核酸分子包含編碼下列 抗體之重鍵一或多個CDR之fe基酸序列之核苦酸序列： 98487.doc -52- 1363762 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.卜 6.73.2、6.77」、 7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、 6.67.1- mod、6.77.1-mod 或 7.26.4-mod。_ 在一較佳實施例 中，核酸分子包含編碼下列抗體之重鏈之所有CDR之胺基 酸序列之核苷酸序列·· 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、 6.22.2- mod、6.34.2-mod ' 6.67.l-m〇d、6.77.1-mod 或 7.26.4-111〇心在另一較佳實施例中，核酸分子包含編碼8£() IDNOS: 2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、 46、52、56、60或64之一之胺基酸序列之核苷酸序列或其 包含 SEQ IDNOS: 1 ' 5 ' 9 ' 13 ' 17 ' 21 ' 25 ' 29 ' 33 ' 37、41、45、51、55、59或63之一之核苷酸序列。在另一 較佳實施例中，核酸分子包含編碼任一下列SEQ ID NOS : 2、6、10、14 ' 18、22、26 ' 30、34、38、42、46、 52、56、60或64之一或多個CDR之胺基酸序列之核苷酸序 列或包含任一下列 SEQ ID NOS : 1、5、9、13、17、21、 25、29、33、37、41、45、51、55、59 或 63 之一或多個 CDR 之核苷酸序列。在一較佳實施例中，核酸分子包含編碼任 一下列 SEQ ID N0S : 2、6、10、14、18、22、26、30、 34、38、42、46、52、56、60或64之所有CDR之胺基酸序 列之核苷酸序列或包含任一下列SEQ ID NOS : 1、5、9 ' 13、 17、 2卜 25、 29、 33'37、 41、 45、 51、 55、 59或63 之所有CDR之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包 含編碼自任一上文提及之抗MAdC AM抗體之重鏈或輕鏈 98487.doc -53- ⑧ 1363762 之CDR1起始處至CDR3終止處之相鄰區之核苷酸序列。
在另一實施例中，核酸分子編碼一 VH之胺基酸序列， 該VH與編碼剛剛上文所述之VH之胺基酸序列之一，尤其 包含 SEQ ID NOS : 2、6、10、14、18、22、26、30、34、 38、42、46、52、56、60或64之一之胺基酸序列之VH至 少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%—致。本發明亦提供與SEQ ID NOS : 1、5、9、13、 17、21、25、29、33、37、41、45、51、55' 59 或 63 之一 之核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98°/。或99%—致之核苷酸序列。
在另一實施例中，編碼VH之核酸分子為在高度嚴格條 件下雜化至編碼上文所述之VH之核苷酸序列者，尤其至 包含 SEQ ID NOS: 2、6、10、14、18、22、26、30、34、 38、42、46、52、56、60或64之一之胺基酸序列之VH。 本發明亦提供編碼一 VH之核苷酸序列，該 該VH在高度 嚴格條件下雜化至包含SEQ ID NOS : 1、5、9、13、17、 21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或 63之一之核 苷酸序列之核酸分子。 編碼抗MAdCAM抗體之整個重鏈及輕鏈任一或兩者或 其可變區之核苷酸序列可自產生抗MAdCAM抗體之任何 來源獲得。分離編碼抗體之mRNA之方法在此項技術中熟 知。參見例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manua卜第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N.Y_(1989)。mRNA可用於產生 98487.doc -54- ⑧ cDNA用於聚合酶鏈反應（PCR)或抗體基因之cDNA選殖 中。在本發明之一實施例中，核酸分子可自上述表現抗 MAdC AM抗體之融合瘤獲得，較佳具有轉基因動物細胞作 為其融合搭配物之一的融合瘤，該轉基因動物細胞表現人 類免疫球蛋白基因諸如XENOMOUSE™動物、非人類小鼠 轉基因動物或非人類、非小鼠轉基因動物。在另一實施例 中，融合瘤源自非人類、非轉基因動物，其可用於例如人 源化抗體。 編碼抗MAdCAM抗體整個重鏈之核酸分子可藉由融合 編碼重鏈之整個可變域或其抗原結合域的核酸分子與重 鏈之恆定域而建構。類似地，編碼抗MAdC AM抗體輕鏈之 核酸分子可藉由融合編碼輕鏈之可變域或其抗原結合域 的核酸分子與輕鏈之恆定域而建構。編碼VH及VL區之核 酸分子可藉由將其分別插入已編碼重鏈恒定及輕鏈恒定 區之表現載體中以使VH區段可操作地連接至載體内之重 鏈恆定區（CH)區段且VL區段可操作地連接至載體内之輕 鏈恆定區（CL)區段而轉換成全長抗體基因。或者，編碼VH 或VL鏈之核睃分子藉由使用標準分子生物技術連接（例如 配接）編碼VH鏈之核酸分子至編碼CH鏈之核酸分子轉換 成全長抗體基因。使用編碼VL及CL鏈之核酸分子可達成 相同結果。人類重鏈及輕鏈恆定區基因之序列在此項技術 中已知。參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publ.第 91-3242 號 (1991)。編碼全長重及/或輕鏈之核酸分子隨後可自已將其 98487.doc •55· 引入之細胞十表現且分離抗MAdC AM抗體。 在一較佳實施例中，編碼重鏈可變區之核酸編碼SEQ ID NOS : 2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、 52、56、60或64之胺基酸序列之可變區，且編碼輕鏈可變 區之核酸分子編碼 SEQ ID NOS : 4、8、12、16、20、24、 28、32、36、40、44、48、54、58、62、66 或 68 之胺基酸 序列之可變區。 在一實施例中，編碼抗MAdC AM抗體之重鏈或其抗原結 合部分或抗MAdCAM抗體之輕鏈或其抗原結合部分之核 酸分子可自表現人類免疫球蛋白基因且以MAdCAM抗原 免疫之非人類、非小鼠動物中分離。在其它實施例中，核 酸分子可自源於產生抗MAdCAM抗體之非轉基因動物或 人類患者之抗MAdC AM抗體產生細胞中分離。來自抗 MAdCAM抗體產生細胞之mRNA可藉由標準技術分離，使 用PCR及文庫建構技術選殖及/或擴增且使用標準方案筛. 選以獲得編碼抗MAdC AM重鏈及輕鏈之核酸分子。 核酸分子可用於重組表現大量抗MAdCAM抗體，此如下 文所述。核酸分子亦可用於產生嵌合抗體、單鏈抗體、免 疫黏附素、雙功能抗體、突變抗體及抗體衍生物，此如下 文進一步描述。若核酸分子源自非人類、非轉基因動物， 則核酸分子可用於抗體人源化，此亦如下文描述。 在另一實施例中，本發明之核酸分子可用作特定抗體序 列之探.針或PCR引子。例如，核酸分子探針可用於診斷方 法或核酸分子PCR引子可用於擴增DNA區，該等DNA區可 98487.doc •56- 1363762 尤其用於分離供產生抗MAdCAM抗體之可變域的核苦酸 序列。在一較佳實施例中’核酸分子為寡核苷酸。在一更 佳實施例中’寡核苷酸來自所關注之抗體重鏈及輕鏈之高 可變區。在一甚佳實施例中，寡核苷酸編碼一或多個cDR 之所有或一部分。 載體 本發明提供包含本發明之編碼重鏈或其抗原結合部分 φ 之核酸分子之載體。本發明亦提供包含本發明之編碼輕鏈 或其抗原結合部分之核酸分子之載體。本發明亦提供包含 編碼融合蛋白質、修飾抗體、抗體片段及其探針之核酸分 子之載體。 為表現本發明之抗體或抗體部分，編碼上述獲得之部分 或全長輕及重鏈之DNAs插入表現載體以使基因可操作連 接至轉錄及轉澤控制序列。表現載體包括質體、反轉錄病 毒、腺病毒、腺相關病毒（AAV)、植物病毒諸如花椰菜花 • 葉病毒、煙草花葉病毒、黏粒、YACs、EBV衍生之游離基 因及其類似物。抗體基因配接至載體中以使载體中轉錄及 !轉譯控制序列實現其調節抗體基因之轉錄及轉譯之預期 功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用之表現宿 主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入獨立載 體。在一較佳實施例中，兩種基因插入相同表現載體中。 抗體基因藉由標準方法（例如抗體基因片段及載體上互補 限制位點之配接，或若無限制位點則存在鈍末端配接）插 入表現載體中。 98487.doc ⑧ 57 · 1363762 適宜之載體為編碼功能性完全之人類CH或CL免疫球蛋 白序列者’其具有經設計之適當限制位以使任何VH或VL 序列可易於如上所述般插入及表現。在該等載體中，剪接 通常發生在插入後之J區中剪接供體位與人類C區前之剪 接受體位之間，且亦發生於人類CH外顯子中所出現之剪 接區。聚腺苷酸化及轉譯終止發生在編碼區下游之原生染 色體位。重組表現載體亦可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈 ^ 之訊號肽。抗體鏈基因可被選殖至載體中以使訊號肽以骨 架方式連接至抗體鏈基因之胺基末端《該訊號肽可為一免 疫球蛋白訊號肽或異源訊號肽（意即自非免疫球蛋白蛋白 質之訊號肽）。 除了抗體鏈基因，本發明之重組表現載體承載控制抗體 鏈基因在宿.主細胞中表現之調節序列。熟習此項技術者應 瞭解表現載體之設計，包括調節序列之選擇可視如待轉殖 之宿主細胞之選擇、所要蛋白質表現之程度等之等因素而 # 疋。較佳用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括指引 哺礼動物細胞中蛋白質高度表現之病毒性成份，諸如源自 反轉錄病毒LTRs、細胞巨化病毒（CMV)(諸如cMV啟動子/ 增強子）、猿病毒4〇(SV4〇)(諸如SV40啟動子/增強子）、腺 病毒（例如腺病毒主要晚期啟動子（AdMLp))之啟動子及/ 或增強？、多瘤病毒及強哺乳動物啟動子諸如原生免疫球 蛋白及肌動蛋白啟動子。對於調節成份及其序列之進一步 為述，參見例如美國專利第5，168,〇62號、第4,51〇,245號及 第4,968,615號’以引用方式將料併人本文。在植物中表 98487.doc ⑧ -58- 1363762 現抗體之方法’包括啟動子及載體之描述及植物之轉殖屬 本項技藝中所已知者。參見例如美國專利6,5 17,529。表現 細菌性細胞或真菌性細胞例如酵母細胞中之多肽的方法 亦屬本項技藝所熟知者。 除了抗體鏈基因及調節序列’本發明之重組表現載體可 承載額外序列，諸如調節宿主細胞中載體之複製的序列 (例如複製之起點）及可選擇之標誌基因。可選擇之標誌基 因便於已引入有載體之宿主細胞的選擇（參見例如美國專 利第4,399,216號第4,634,665號及第5,179,017號）。例如， 通常可選擇之標誌基因將對於諸如G418、高黴素或甲胺喋 吟之類的藥物抗性賦予已引入載體之宿主細胞。較佳可選 擇之標諸基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於具有 甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞中）及新近基因（用於 G418選擇）及麩胺酸合成酶基因。 非融合瘤宿主細胞及重組產生蛋白質之方法 編碼抗MAdCAM抗體之重鏈或其抗原結合部分及/或輕 鏈或其抗原結合部分之核酸分子及包含該等核酸分子之 載體可用於適當哺乳動物植物、細菌或酵母宿主細胞之轉 殖。轉殖可藉由用於引入聚核苷酸至宿主細胞之任何已知 方法。異質聚核發酸引入哺乳動物細胞之方法在此項技術 中熟知且包括葡聚糖調控之轉染、磷酸鈣沉澱作用、凝聚 胺調控之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸於脂質 體中之封裝、基因搶注射（biolistic injection)及直接微注射 DNA至核中。此外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動 98487.doc -59· ⑧ 1363762 物細胞中。轉殖細胞之方法在此項技術中熟知。參見例如 美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號 及第4,959,45 5號（該等專利因而以引用方式併入本文）。轉 殖植物細胞之方法在此項技術中熟知，包括例如土壤桿菌 調控之轉殖、基因槍轉殖、直接注射、電穿孔及病毒轉殖。 轉殖細菌及酵母細胞之方法在此項技術中亦熟知。 用作表現宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中熟知且 包括自美國菌種保藏中心（ATCC)獲得之許多永生化細胞 株。該等尤其包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、NSO、SP2 細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、幼倉 鼠腎（BHK)細胞、猴腎細胞（COS)、人類肝細胞之癌細胞（例 如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞及諸多其它細胞株。哺 乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猶、豬、山羊、 牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株經由測定具有高表 現程度之細胞株來選擇。可使用之其它細胞株為昆蟲細胞 株，諸如S f9細胞、兩棲動物細胞、細菌性細胞、植物細 胞及真菌細胞。當編瑪重键或其抗原結合部+分、輕鏈及/ 或其抗原結合部分之重組表現載體引入哺乳動物宿主細 胞中時，抗體藉由培養宿主細胞經一段足夠允許抗體在宿 主細胞中表現或更佳地允許抗體分泌至宿主細胞生長之 培養基中之時間而產生。抗體可自培養基中使用標準蛋白 質純化方法回收。植物宿主細胞包括例如煙草、芬菜屬、 浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌性宿主細胞包括大腸 桿菌及鏈黴菌物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母、釀 98487.doc -60- 1363762 酒酵母及甲醇酵母。 此外，本發明之抗體（或來自其之其它部分）自產製細胞 表現可使用諸多已知技術增強。例如，麵醯胺酸合成 酶基因表⑽、統（咐統）A—種在特定條件下增強表現 之普通途徑。GS系統完全或部分地與歐洲專利第〇 216 846號、第〇 256 〇55號、第Q爪841號及第〇如997號相 聯繫而論述。 藉由不同細胞株或在轉基因動物中表現之抗體將可能 具有彼此不同之糖基化。然而，藉由本文提供之核酸分子 編碼或包含本文提供之胺基酸序列之所有抗體為本發明 之部分，而不論抗體之何種糖基化。 轉基因動物及植物 本發明亦提供包含一或多個本發明之核酸分子之轉基 因非人類動物及轉基因植物，其可用於產生本發明之抗 體。抗體可產生於下列動物之組織或體液（乳汁、血液或 尿）中且自其回收：諸如山羊、牛、馬、豬、大鼠、小鼠、 兔 '倉鼠或其它哺乳動物。參見例如美國專利第5,827,690 號、第 5,756,687號、第 5,750，172 號及第 5,741,957號》如 上所述，包含人類免疫球蛋白基因座之非人類轉基因動物 可以MAdCAM或其部分免疫。用於製造植物中之抗體之方 法描述於例如美國專利6,046,037及5,959，177中，其以引用 方式併入本文。 在另一實施例中’非人類轉基因動物及轉基因植物藉由 以標準轉基因技術引入一或多個本發明之核酸分子至動 98487.doc -61 - 物或植物中而產生。參見Hogan，如上述。用於製造轉基 因動物之轉基因細胞可為胚胎幹細胞、體細胞或受精卵細 胞。轉基因非人類有機體可為嵌合、非嵌合雜合子及非嵌 合純合子。參見例如Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 第二版，Cold Spring Harbor Press(1999) ; Jackson 等人，Mouse Genetics and Transgenics : A Practical Approach, Oxford University Press(2000)；及 Pinkert，Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook，Academic Press(1999)。在另一實施 例中，轉基因非人類有機體可具有編碼所關注之重鏈及/ 或輕鏈之靶向分裂及置換。在一較佳實施例中，轉基因動 物或植物包含且表現編碼聯合以特異結合至MAdCAM較 佳人類MAdCAM之重鏈及輕鏈之核酸分子。在另一實施例 中，轉基因動物或植物包含編碼修飾抗體諸如單鏈抗體、 嵌合抗體或人源化抗體之核酸分子。抗MAdC AM抗體可製 造於任何轉基因動物中。在一較佳實施例中，非人類動物 為小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或馬。非人類轉基因 *動物表現該編碼之多肽於血液、乳汁、尿、唾液、眼淚、 黏液及其它體液中。 嗤菌體展示文庫 本發明提供一種用於產生抗MAdCAM抗體或其抗原結 合部分之方法，其包含下列步驟：合成人類抗體文庫於噬 菌體上、以MAdCAM或其部分篩選該文庫、分離結合 MAdCAM之噬菌體且自噬菌體獲得抗體。製備抗體文庫之 98487.doc -62· 1363762 一方法包含下列步驟：以MAdCAM或其抗原部分免疫包含 人類免疫球蛋白基因座之非人類宿主動物以建置免疫反 應、自宿主動物中提取負責產生抗體之細胞；自提取之細 胞中分離RNA '反轉錄RNA以產生cDNA、使用引子擴增 cDNA且將cDNA插入至噬菌體展示載體以使抗體表現於 噬菌體上。本發明之重組抗MAdCAM抗體可以該方式獲 得。 除了本文揭示之抗MAdCAM抗體的本發明之重組抗 MAdCAM人類抗體可藉由篩選重組組合抗體文庫，較佳 scFv噬菌體展示文庫而分離，該文庫使用自人類淋巴細胞 分離之mRNA製備之人類VL及VH cDNAs製備。用於製備 及篩選該等文庫之方法學在此項技術中已知。用於產生噬 菌體展示文庫套組可購得（例如法瑪西亞（Pharmacia)重組 噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01 ;及Stratagene SurfZAP™噬菌體展示套組，目錄號240612)。亦有其它方 法及試劑可用於產生且篩選抗體展示文庫（參見例如美國 專利第5,223,409號；？(：丁公開案第界〇 92/18619號；？(：丁 公開案第WO 91/17271號；PCT公開案第WO 92/20791號； PCT公開案第WO 92/15679號；PCT公開案第WO 93/01288 號；卩(：丁公開案第臀〇 92/01047號；？(：丁公開案第'\^〇 92/09690 號；Fuchs 等人（1991)， Biotechnology, 9:1369-1372 ; Hay 等人，Hum. Antibod. Hybridomas， 3:81-85(1992) ; Huse等人，Science，246:1275-1281(1989); McCafferty 等人，Nature，348:552-554(1990) ; Griffiths 98487.doc -63 - ⑧ 1363762 等人，EMBO J，12:725-734 (1993) ; Hawkins等人，J. Mol. Biol., 226:889-896(1992) ； Clackson 等人，Nature, 352:624-628(1991); Gram等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 89:3576-3580(1992) ; Garrad 等人，Biotechnology， 9:1373-1377(1991) ; Hoogenboom 等人，Nuc Acid Res, 19:4133-4137(1991);及 Barb as等人，Proc. Natl· Acad. Sci· USA，88:7978-7982(1991)。 在一較佳實施例中，為分離具有所要特徵之人類抗 MAdCAM抗體，本文所述之人類抗MAdCAM抗體首先使 用Hoogenboom等人PCT公開案第WO 93/06213號中描述 之抗原決定部位印記方法選擇具有針對MAdCAM之類似 結合活性之人類重鏈及輕鏈序列。用於該方法之抗體文庫 較佳為scFv文庫，其製備及筛選描述於McCafferty等人， PCT公開案第 WO 92/01047號、McCafferty 等人，Nature， 348:552-554(1990)及 Griffiths 等人，EMBO J，12:725-734( 1993)中。scFv抗體文庫較佳使用人類MAdCAM作為 抗原來篩選。 一旦選擇了初始人類VL及VH區段，其中為了 MAdCAM 結合而將不同對之初始選擇之VL及VH區段進行篩選之 "混合及匹配”實驗執行以選擇較佳VL/VH對組合。此外， 為進一步改良抗體品質，較佳VL/VH對之VL及VH區段可 隨機突變，較佳在VH及/或VL之CDR3區内’以與活體内 負責抗體在天然免疫反應期間之親和力成熟之體細胞突 變作用方法類似之方法。該活體外親和力成熟可使用分別 98487.doc • 64 · ⑧ 與VH CDR3或VL CDR3互補之PCR引子而擴增VH及VL區 來實現’該等引子以四個核苷酸鹼基之隨機混合物於特定 位置增強以使所得PCR產物編碼其中隨機突變作用已引 入VH及/或VL CDR3區的VH及VL區段。該等隨機突變之 VH及VL區段可再篩選用於結合至MAdCAM。 本發明之抗MAdC AM抗體自重組免疫球蛋白展示文庫 之篩選及分離之後，編碼所選擇抗體之核酸可自展示組 (例如噬菌體基因體）中回收且藉由標準重組DNA技術次 選殖至其它表現載體中。若需要，核酸可進一步操作以建 置下文所述之本發明之其它抗體形式。為表現藉由組合文 庫之篩選而分離之重組人類抗體，編碼抗體之DNA如上述 選殖至重組表現載體中且引入至哺乳動物宿主細胞中。 類別轉換 本發明之另一態樣係提供一抗MAdCAM抗體之類別可 藉以與另一個類別轉換之機制。在本發明之一態樣中，編 碼VL或VH之核酸分子使用此項技術中熟知之方法分離以 使其不包括編碼CL或CH之任何核苷酸序列。編碼VL或VH 之核酸分子隨後可操作地連接至編碼來自不同類之免疫 球蛋白分子之CL或CH之核苷酸序列。此可如上述使用包 含CL或CH編碼序列之載體或核酸分子而達成。例如，初 為IgM之抗MAdC AM抗體可類別轉換至IgG。此外，類別 轉換可用於轉化一 IgG亞類至另一個，例如自IgG4至 IgG2。一用於產生包含所要同楂型或抗體亞類之本發明抗 體之較佳方法包含下列步驟：分離編碼抗MAdCAM抗體重 98487.doc •65- 1363762 鏈之核酸及編碼抗MAdC AM抗體輕鏈之核酸、獲得重鏈之 可變區、配接重鏈之可變區與所要同種型重鏈之恆定域、 在細胞中表現輕鏈及所配接之重鏈且收集具有所要同種 型之抗MAdCAM抗體。 抗趙衍生物 吾人可利用上述核酸分子使用普通熟習此項技術者已 知之技術及方法產生抗體衍生物。 人源化抗體 非人類抗體之免疫原性可使用人源化技術潛在使用適 當文庫運用展示技術降低至一定程度。應瞭解到鼠科動物 抗體或自其它物種之抗體使用此項技術中熟知技術可人 源化或靈長源化。參見例如Winter及Harris，Immunol Today, 14:43-46(1993)及 Wright 等人，Crit. Reviews in Immunol.，12 125-168(1992)。所關注之抗體可藉由重組 DNA技術設計·以用相應人類序列取代CH1、CH2、CH3、鉸 鏈域及/或骨架域（參見WO 92/02190及美國專利第 5,530，101號、第 5,585,089號、第 5,693,761號、第 5,693,792 號、第5,714,350號及第5,777,085號）。在另一實施例中， 非人類抗MAdCAM抗體可藉由用本發明之抗MAdCAM抗 體之相應人類序列取代Ch 1、欽鍵域、Ch2、Ch3及/或骨架 域而人源化。 突變抗體 在另一實施例中，核酸分子、載體及宿主細胞可用於製 造突變抗MAdCAM抗體。抗體可在重鏈及/或輕鏈之可變 98487.doc -66- ⑧ 1363762 域突變以改變抗體之結合性質。例如突變作用可在一或多 個CDR區進行以增加或減小MAdCAM之抗體之定點誘 變之技術在此項技術中熟知。參見例如Sambr〇〇k等人及 Ausubel等人，如上述。在一較佳實施例中，突變作用於 抗MAdCAM抗體之可變區中已知與種株比較可改變之胺 基酸殘基上進行。在一更佳實施例令，一或多個突變作用 於下列抗MAdCAM抗體之一之可變區或CDR區中已知與 種株比較可改變之胺基酸殘基上進行：1 72、1.82、 6.14.2 、 6.22.2 、 6.34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-m〇d、 6.67.1-则£1、6.77.1-111〇(1或7.26.4-111〇(1。在另一實施例中， 一或多個突變作用於一可變區或CDR區中已知與種株比 車乂可改變之胺基酸殘基上進行，該可變區或cdr區的胺基 酸序列存在於SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14、 16、18、2〇、22'24、26、28、3〇、32、34、36 38 4〇、 42、44、46、48、52、54、56、58、62 64 66或68，或 其核苦酸序列存在於SEQ ID N〇s : i、3、5、7、9、u、 13、15、17、19、2卜23、25、27 29、31、33、3537' 41 43、45、47、51、53、55、57、6卜 63、65或 67。 實知例中，核酸分子於一或多個骨架區中突變。突 變作用可於骨架區妹定域中進行以增加抗购匚趙抗 體之半衰期。參見例如以引用方式併入本文之2_年2月 24日公開之W〇 00/09560 e在一實施例中，可具有一、三 5、或十點大變作用且不超過十五點突變作用。亦可進行 98487.doc -67· 骨架區或恆定域之突變作用以改變抗體之免疫原性，以提 供共價或非共價結合於另一分子之位點，或以改變諸如補 體結合（complement fixation)之性質。突變作用可於單一 突變抗體中各個骨架區、恆定域及可變區中進行。或者， 突變作用可僅於單一突變抗體中之骨架區、可變區或恆定 域中之一中進行。 在一實施例中，與突變作用前之抗MAdCAM抗體相比， 突變之抗MAdCAM抗體之VH或VL區中具有不超過十五 個胺基酸改變。在一更佳實施例中，突變之抗MAdCAM抗 體之VH或VL.區中具有不超過十個胺基酸改變，更佳不超 過五個胺基酸改變，或甚佳不超過三個胺基酸改變。在另 一實施例中，恆定域具有不超過十五個胺基酸改變，更佳 不超過十個胺基酸改變，甚佳不超過五個胺基酸改變。 修飾抗體 在另一實施例中，可製造包含連接至另一多肽之抗 MAdCAM抗體之全部或一部分的融合抗體或免疫黏附 素。在一較佳實施例中，僅抗MAdCAM抗體可變區連接至 多肽。在另一較佳實施例中，抗MAdC AM抗體之VH域連 接至第一多肽，而抗MAdCAM抗體之VL域連接至第二多 肽，其與第一多肽以VH及VL域可互相作用以形成抗體結 合位點之方式而關聯。在另一較佳實施例中’ VH域藉由 連接體自VL域分離以致VH及VL域可互相作用（參見下文 單鏈抗體項下）。VH-連接體-VL抗體隨後連接至所關注之 多肽。融合抗體用於將多肽引導至MAdC AM表現細胞或組 98487.doc -68· 織。多肽可為治療劑，諸如毒素、生長因子或其它調節蛋 白質或可為診斷劑’諸如可易於顯影之酶’諸如辣根過氧 化物酶。此外，可建置其中兩個（或兩個以上）單鏈抗體互 相連接的融合抗體。若吾人需要於單一多肽鏈上建置二價 或多價抗體或若吾人需要建置雙特異性抗體，則此係適用 的。 為建置單鏈抗體，（scFv)VH-及VL-編碼之DNA片段可操 作連接至另一編碼可撓性連接體例如編瑪胺基酸序列 (Gly4-Ser)3之片段’以使VH及VL序列可作為鄰近單鏈蛋 白質表現，且VL及VH區藉由可撓性連接體接合（參見例如 Bird等人，Science，242:423-426(1988) ; Huston等人，卩1*〇〇· Natl. Acad. Sci. USA，85:5879-5883(1988) ; McCafferty等 人，Nature, 348:5 52-5 54(1990))。若僅使用單一 VH 及 VL， 則單鏈抗體可為單價，若使用兩個VH及VL，則為二價， 若使用兩個以上VH及VL ’則或為多價。 在另一實施例中，其它修飾抗體可使用編碼抗MAdCAM 抗體之核酸分子來製備。例如，"κ抗體"（111等人，Protein Eng, 10 ·· 949-57(1997))、"微型抗體"（Martin等人，EMBO J，13 : 5303-9(1994))、”雙功能抗體"（Holliger等人，PNAS USA, 90 : 6444-6448(1993))或"Janusins"(Traunecker 等 人，EMBO J，10:3655-3659( 199 1)及 Traunecker 等人， ”Janusin: new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl，7:51-52(1992))可使用標準分子生物學 技術遵循本發明說明書之教示而製備。 98487.doc -69- 1363762 在另一態樣中，可產生嵌合及雙特異抗體。可製成包含 來自不同抗體之CDR及骨架區的嵌合抗體。在一較佳實施 例中’嵌合抗體之CDR包含人類抗MAdCAM抗體輕鏈或重 鏈可變區之所有CDR ’而骨架區源自一或多個不同抗體。 在一更佳實施例中，嵌合抗體之CDR包含人類抗MAdCAM 抗體輕鏈或重鏈可變區之所有CDR。骨架區可來自另一物 種且在一較佳實施例中可人源化。或者，骨架區可來自另 一人類抗體。 可產生經由一個結合域特異結合至MAdCAM及經由第 二結合域至第二分子的雙特異抗體。雙特異抗體可經由重 組分子生物學技術產生或可實體上共轆於一起。此外，可 產生特異結合至MAdCAM及至另一分子的含有多個VH及 VL之單鏈抗體《該等雙特異抗體可使用熟知技術產生， 3亥專技術例如與⑴及（ii)關聯’參見例如Fanger等人，
Immunol Methods 4: 72-81(1994)及 Wright及 Harris，如上 述及與（iii)關聯，參見例如Traunecker等人，int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52(1992)。在一較佳實施例中，雙特異抗體 結合至MAdCAM及至另一以南程度表現於内皮細胞上之 分子。在一更佳實施例中’該另一分子為VCAM、ICAM 或L-選擇蛋白。 在各種實施例中，上述修飾抗體使用自選自下列抗體之 一之一或多個可變區或一或多個CDR區製備：1.7.2、 1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、 7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8_2、6.22.2_m〇d、6.34.2-mod、 98487.doc -70- ⑧
衍生化及標記抗體 6.67.1 -mod > ( 修飾抗體使用 本發明之抗體或抗體部分可衍生化或連接至另一分子 (例如另一肽或蛋白質）。通常，抗體或其部分衍生化使 MAdCAM結合不受衍生化或標記之不利影響。因而，本發 明之抗體及抗體部分意欲包括完整及修飾形式之本文所 述之人類抗MAdCAM抗體。例如，本發明之抗體或抗體部 • 分可功能性連接（藉由化學偶合、基因融合、非共價連接 或其它方式）至一或多個其它分子實體，諸如另一抗體（例 ‘如雙特異抗體或雙功能抗體）、偵測劑、細胞毒素劑、醫 藥劑及/或可調控抗體或抗體部分與另一分子連接之蛋白 質戈狀（堵如鍵徽抗生物素蛋白核心區或聚組胺酸標藏）。 類型之衍生化抗體藉由交聯兩或兩個以上抗體（相同 類型或不同類型’例如以建置雙特異抗體）而產生。適當 之交聯劑包括異基雙功能之彼等，其具有兩個藉由合適間 隔基（例如間馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯） 98487.doc 71 1363762 而分離的不同反應基團或同質雙功能者(例如二琥㈣亞 胺基辛二酸扑該等連接體自pieree Chemieai 叫 Rockford，111取得。 衍生化抗體之3卖員㉝為標記抗體。本發明之抗體或抗 體部分可藉以衍生化的適用偵測劑包括螢光化合物包括 營光素、螢光素異硫氰酸g旨、若丹日月、5二？胺· i•蔡續酿 氯、藻紅蛋白、鑭系元素磷光體及其類似物。抗體亦可以 用於偵測之酶標記，諸如辣根過氧化物酶、卜半乳糖苷 酶、螢光素酶、鹼性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶及其類似物。 當抗體以可偵測酶標記，其藉由添加額外試劑偵測，酶使 用該等試劑產生可辨別之反應產物。例如，當存在試劑辣 根過氧化物酶時，過氧化氫及對二胺基聯苯之添加導致可 偵測之有色反應產物。抗體亦可以生物素標記，且經由間 接量測抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白結合而伯測。抗 體可以磁性劑諸如釓標記β抗體亦可以藉由第二報告體識 別之預疋多狀抗原決定部位（例如白胺酸拉鏈對序列、供 第一抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定部位標藏） 標記。在一些實施例中，標記附接以各種長度之間隔臂以 減小潛在空間位阻》 抗MAdC AM抗體亦可以放射性標記之胺基酸標記。放射 性標記可用於診斷及治療之目的。例如，放射性標記可拜 由X-射線或其它診斷技術用於偵測MAdCAM表現之組 織。此外，放射性標記可治療性用作針對患病組織或 MAdCAM表現之腫瘤的毒素。用於多肽標記之實例包括 98487.doc • 72- 1363762 (但不限於）下列放射性同位素或放射性核素__3h、Me、 丨5N、35s、，、99Tc' "ιΙη、⑴卜丨31卜 抗MAdCAM抗體亦可以化學基團諸如聚乙二醇（pEG)、 甲基或乙基或碳水化合物基衍生化。該等基團可用於改良 抗體之生物學特徵，例如增加血清半衰期或增加組織結 合。該方法學亦應適用於抗MAdCAM抗體之任何抗原結合 片段或變體。 醫藥組合物及套組
在另一態樣中，本發明提供包含抑制性人類抗MAdCAM 抗體之組合物及以該等組合物治療受治者之方法。在一些 實施例中’治療之受治者為人類。在其它實施例中，受治 者為獸類受治者。在一些實施例中，獸類受治者為狗或非 人類之靈長類動物。 ’口療可涉及單獨或與醫藥上可接受之載劑一起投藥一 或夕個本發明之抑制性抗MAdcAM單株抗體或其抗原結
合°本發明之抑制性抗MAdc AM抗體及包含彼等之組 β物可_ 4乡個其n療劑、診斷劑或預防劑組合投 藥額外…療劑包括消炎劑或免疫調節劑。該等藥劑包括 (但不限於）局部及口服皮質類固醇諸如潑尼松龍 (prednisolone)、甲基潑尼松龍、或布地萘德 (budesonide) ’胺基水揚酸酿諸如美沙拉嘻（mesaiazine)、 奥"拉秦（〇13&1&21加）、巴柳氮（1)山山2；心）或]^(：又_456;免 疫調節劑類諸如硫唑過w 坐’下、6-巯基嘌呤、曱胺喋呤、環胞 黴素、FK506、II】n m」 1U (Ilodecakin(介白素-i〇衍生物））、 98487.doc IL-ll(Oprelevkin(介白素-11衍生物））、IL-12、MIF/CD74 拮抗劑、CD40拮抗劑諸如TNX-100/5-D12、OX40L拮抗 劑、GM-CSF、°比美莫司（pimecrolimus)或雷帕黴素；抗 -TNFa劑類諸如英利昔單抗（infliximab)、阿達木單抗 (adalimumab)、CDP-870、奥那西普（onercept)、依那西普 (etanercept);消炎劑類諸如PDE-4抑制劑（羅氟司特 (roflumilast)等）、TACE抑制劑（DPC-333、RDP-58 等）及 ICE 抑制劑（VX-740等）及IL-2受體拮抗劑諸如達利珠單抗 (daclizumab)、選擇性黏附分子拮抗劑類諸如那他珠單抗 (natalizumab)、MLN-02或阿利卡弗森、止痛劑類諸如（但 不限於）COX-2抑制劑諸如羅非考昔（rofecoxib)、伐地考昔 (valdecoxib)、塞内昔布（celecoxib)、P/Q-型電壓敏感通道 (α2δ)調節劑諸如加巴喷丁（gabapentin)及普瑞巴林、NK-1 受體拮抗劑、大麻鹼受體調節劑及德耳塔類鴉片受體激動 劑及抗贅瘤、抗腫瘤、抗血管生成或化學治療劑。該等額 外藥劑可包括於相同組合物中或獨立投藥。在一些實施例 中，一或多個本發明之抑制性抗MAdCAM抗體可用作疫苗 或疫苗之佐劑。詳言之，由於MAdCAM表現於淋巴組織 中，所以疫苗抗原可藉由抗原共軛至本發明之抗MAdC AM 抗體而有益地靶向淋巴組織。 本文所用之”醫藥上可接受之載劑”意謂生理上相容之 任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗細菌及抗真菌劑、 等張及吸收增強或延遲劑及類似物。醫藥上可接受之載劑 之一些實例為水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、具有氣化鈉、 98487.doc -74· 1363762 右旋糖、甘油、聚乙二痕、7 —% 乙私及其類似物之醋酸鹽缓衝 液及其組合。在許多愔a , _ 月况下較佳包括等張劑例如糖類、 多元醇類諸如甘露醇、山犁撼 — 山呆糖醇或氣化鈉於組合物中。醫 藥上可接受之物質之額外眚 θ 貞卜貫例為界面活性劑、濕潤劑或少 置之辅助物質諸如渴湖逾丨丨点牵丨儿愈丨 、潤劑或礼化劑、防腐劑或緩衝劑，其 增強了抗體之保存期或有效性。 、 本發明之組口物可為各種形式，例如液體、半固體及固 體劑型’諸如液體溶液（例如可注射或可灌輸溶液）、分散 液或懸浮液、錠劑、丸劑、；東乾塊、乾粉、脂質體及栓劑。 較佳形式視投藥及所欲投藥模式及治療應用而定。典型較 佳組合物為可注射或可灌輸溶液之形式，諸如類似於用於 人類之被動免疫之彼等的組合物。較佳之投藥模式為非經 腸方式(例如靜脈内、皮下、腹膜内' 肌肉内、皮内)。在 一較佳實施例中’抗體藉由靜脈内㈣或注射投藥。在另 -較佳實施例中，抗體藉由肌肉内、皮内或皮下注射投藥。 治療組合物通常必須無菌且在製造及儲藏條件下穩 定。組合物可調配為溶液、凍乾塊、乾粉、微乳劑、分散 液1質體或適於高藥物濃度之其它有序結構。無菌之可 主射溶液可藉由將所需量之抗MAdcAM抗體併人具有所 需之上文列舉成份之一或組合之適當溶劑中製傷，繼之減 菌。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，較 佳製備方法為真空乾燥及冷;東乾燥’其產生活性成份加上 =何自先前其無菌溶液t任何額外所要成份之散劑。通 予’分散液藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質且所 98487.doc -75- 1363762 需要之來自上文列舉之其它成份的盔 匕取忉的無鹵媒劑中而製備。溶 液之所要特徵可例如藉由作用見；S* 精田使用界面活性劑來保持且分散
液情況下所要粒子尺寸藉由#用見& X J稽田便用界面活性劑、磷脂及聚合 物。可注射組合物延長之吸收可藉由在組合物中包括一種
本發明之抗體可藉由此項技術中已知之各種方法投 藥，雖然對於許多治療應用來說，較佳投藥途徑/模式為 皮下、肌肉内、皮内或靜脈灌輸。所熟習此技術者所瞭解， 投藥途徑及/或模式將視所要結果而改變。
延遲吸收之藥劑例如單硬脂酸鹽、聚合物材料、油及凝膠 引起。 ^ 在某些實施例中，可製備具有將保護抗體避免快速釋放 之載劑的抗體組合物，該載劑諸如控釋調配物，包括植入 體、經皮貼片及微膠囊化遞送系統。可使用生物降解、生 物相容之聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇 酸、膠原質、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備該等調配物之 許多方法取得專利或通常為熟習此項技術者所知。參見例 如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems(J. R_ Robinson 編，Marcel Dekker，lnc.，New
York(1978))〇 在某些實施例中，本發明之抗MAdC AM抗體可例如與情 性稀釋劑或可吸收之食用載劑一起口服投藥。化合物（及 其它成份，若需要）亦可封裝入硬或軟殼凝膠膠囊中、壓 縮成錠劑或直接併入受治者飲食中。對於口服治療投藥， 抗MAdC AM抗體可併有賦形劑且以可攝取之錢劑、口腔錠 98487.doc -76- ⑧ 剤、片劑、膠囊劑、酒劑、縣 物田a u 〜子夜、糖漿、晶圓及其類似 之化合物，可需要以„,,卜之方式投樂投予本發明 心二防止其失活之材料塗布該化合物或 興其一起共投用該化合物。 本發明之組合物可包括 郝丨旦"+ + Λ。 /α蜃有效劑量"或"預防有效 Μ里之本發明之抗體哎枋周 係於^… 部分。，，治療有效劑量"
#ΙΘ , 奴時間下達成所要治療結果之有效 、、ff . 療有效劑I可視諸如疾病狀 =、年齡、性別及個體體重及抗體或抗體部分在個體中引 所要反應之能力之因素改變。治療有效劑量亦為其中治 、、有益效應超過抗體或抗體部分之任何毒性㈣害效應 的劑量。”預防有效劑量”係指在所需用量及—段時間下達 成所要預防結果之有效劑量。通常，由於預防劑量在疾病 前或疾病較！階段用於受治者，所以預防有效劑量可小於 治療有效劑量。
劑量療法可調節以提供最佳所要反應（例如治療或預防 反應）。例如，依據治療情況之緊迫性所指示可投予單 大丸藥’可隨時間投予若干劃分劑量或劑量可按比例減 小或增加。以達成投藥便易性及劑量均一性的單位劑型來 調配非經腸級合物係尤其有利的。本文所用之單位劑型係 指適合供待治療之哺乳動物受治者之單一劑量之實體離 散單位；含有與所要醫藥載劑結合的經計算可產生所要治 療效應之預定數量活性化合物的每一單位。本發明之單位 劑型之規格受下列支配且直接視下列而定：（a)抗 98487.doc -77- 1363762 MAdCAM抗體或其部分之獨特特徵及待達成之特定治療 或預防效應，及（b)結合該抗體用於個體敏感性治療技術 中之固有侷限性。 本發明之抗體或抗體部分之治療或預防有效劑量之一 例示性非限制性範圍為0.025至5〇 mg/kg，更佳〇丨至” mg/kg，更佳〇.ι·25、〇 1至1〇或〇在一些實施 例中，調配物含有5 mg/m£2抗體於2〇 111河醋酸鈉、pH值
5.5、140 mM NaCl及0.2 mg/mL·聚山梨醇酯80之緩衝液 中應注忍劑量值可隨所減輕之病症類型及嚴重性改變。 進一步瞭解對於任何特殊受治者，特定劑量療法應隨時間 «個人需要及指導或監督組合物投藥者之職業判斷調 整且本文所列之劑量範圍僅為例示性且不意欲限制專利 申請之組合物的範圍或實務。 之另—態樣提供了包含本發明之抗MAdCAM抗 抗體部分或包含該抗體之組合物的套組。除了抗體或
組合物’套組可包括診斷劑或治療劑。套組亦可包括用於 診斷或治療方法夕# '. . “方法之心不。在-較佳實施例中’套組包括抗 s其之組合物及可用於下述方法之診斷劑。在另一 較佳實施例中，套組包括抗體或包含其之 種可用於下述方法之治療劑。 及或夕 基因治療 明之核酸分子可經由基因治療投藥於需要直之 -者。治療可為活體内或活體外。在： 編碼重鍤另h, 你孕又佳實施例中， 鏈及輕鏈之核酸分子投藥於受治者。 98437.doc -78· 例中，核酸分子經投藥以使其穩定併入至B細胞染色體 中，此歸因於該等細胞特定用於產生抗體。在一較佳實施 例中，前軀體B細胞活體外轉染或感染且再移植至需要其 之受治者中。在另一實施例中，前軀體B細胞或其它細胞 使用已知感染所關注之細胞類型之重組病毒活體内感 染。用於基因治療之典型載體包括脂質體、質體及病毒性 載體。例示性病毒性載體為反轉錄病毒、腺病毒及腺相關 病毒。活體内或活體外感染之後，抗體表現之程度可藉由 自治療之受治者中取樣品且使用任何此項技術中已知或 本文論述之免疫檢定法來監測。 在一較佳實施例中，基因治療方法包含投藥編碼抗 MAdCAM抗體之重鏈或其抗原結合部分之分離核酸分子 且表現核酸分子之步驟。在另一實施例中，基因治療方法 包含投藥編碼抗MAdCAM抗體之輕鏈或其抗原結合部分 之分離核酸分子且表現核酸分子之步驟。在一更佳方法 中，基因治療方法包含投藥編碼本發明之抗MAdCAM抗體 之重鏈或其抗原結合部分之分離核酸分子及編碼本發明 之抗MAdCAM抗體之輕鏈或其抗原結合部分之分離核酸 分子且表現核酸分子之步驟。基因治療方法亦可包含投藥 另一消炎性或免疫調節劑之步驟。 使用之診斷方法 抗MAdCAM抗體可用於活體外或活體内偵測生物學樣 品中之MAdCAM。抗MAdCAM抗體可用於習知免疫檢定 法包括（無限制性）ELIS A、RIA、FACS、組織之免疫組織 98487.doc -79- 化學、西方轉潰或免疫沉澱反應。本發明之抗MAdcAM抗 體可用於偵測來自人類之MAdcAM。在另一實施例中’抗 MAdCAM抗體可用於偵測來自舊世界靈長類動物諸如獼 猴及恆河猴、黑猩猩及猿的MAdCAM。本發明提供一種用 於偵測生物樣品中MAdCAM之方法’其包含以本發明之抗 MAdCAM抗體與生物樣品接觸且偵測結合至MAdCAM之 抗體。在一實施例中，抗MAdCAM抗體直接以可偵測標記 衍生化。在另一實施例中’抗MAdCAM抗體（第一抗體）未 經標記且第二抗體或可結合抗MAdCAM抗體之其它分子 經標記。如熟習此項技術者熟知，選擇可特異結合特定物 種及類之第一抗體的第二抗體。例如，若抗MAdCAM抗體 為人類IgG，則第二抗體可為抗人類IgG。可結合至抗體之 其它分子包括（無限制性）蛋白質A及蛋白質G，該等兩者可 例如購自 Pierce Chemical Co。 抗體或二次抗體之適當標記上文已揭示且包括各種 酶、輔基、螢光材料、發光材料、磁性劑及放射性材料。 適當酶之實例包括辣根過氧化物酶、酴性磷酸酯酶、β-半 乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適當輔基複合物之實例包括鏈 黴抗生物素蛋白/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適當螢 光材料之實例包括傘形酮、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、 若丹明、二氣三嗪基胺基螢光素、丹醯基氣或藻紅蛋白； 發光材料之實例包括魯米諾（luminol);磁性劑之實例包括 釓；且適當放射性材料之實例包括1251、1311、35S或3H。 在另一實施例中，MAdCAM可在生物樣品中藉由競爭免 98487.doc -80 - 疫檢定法利用以可偵測物質標記之MAdCAM標準及未標 記之抗MAdC AM抗體檢定。在該檢定中，生物樣品、標記 之MAdCAM標準及抗MAdCAM抗體組合且測定結合至未 標記之抗體中之經標記之MAdCAM標準之含量。生物樣品 中MAdCAM之含量與結合至抗MAdCAM抗體之經標記之 MAdCAM標準之含量成反比。 上文揭示之免疫檢定法可用於諸多目的。在一實施例 中，抗MAdCAM抗體可用於偵測細胞培養基中細胞中之 MAdCAM。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體可用於 測定以各種化合物處理細胞之後細胞表面MAdCAM表現 之程度。該方法可用於測試可用以活化或抑制MAdCAM之 化合物。在該方法中，細胞之一樣品以測試化合物處理一 段時間，而另一樣品留置未處理，細胞表面表現隨後可藉 由流式細胞計數術、免疫組織化學、西方轉潰、ELISA或 RIA測定。此外，為了測試用於活化或抑制MAdCAM之大 量化合物，免疫檢定法可按比例擴大用於高通量篩選。 本發明之抗MAdCAM抗體亦可用於測定組織上或源自 f組織之細胞中MAdCAM含量。在一較佳實施例中，組織係 患病組織。在一更佳實施例中，組織為發炎之胃腸道或其 活組織切片。在方法之一較佳實施例中，組織或其活組織 切片自患者切離。組織或活組織切片隨後用於免疫檢定法 中以藉由上文論述之方法測定，例如MAdCAM含量、細胞 表面MAdCAM含量或MAdCAM之定位。該方法可用於測 定是否發炎組織表現高含量之MAdCAM。 98487.doc 81· 1363762 上述診斷方法可用於測定是否組織表現高含量之 MAdCAM，其可指示組織將對使用抗MAdCAM抗體進行 之治療很好地反應。此外，診斷方法亦可用於測定是否抗 MAdCAM抗體之治療（參見下文）引起組織表現更低含量 之MAdCAM且因此可用於測定是否治療成功。 本發明之抗體亦玎用於活體内以定位表現MAdCAM之 組織及器官。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體可用於 定位發炎組織。本發明之抗MAdCAM抗體之優點係其在投 藥時將不產生免疫反應。該方法包括投藥抗MAdCAM抗體 或其醫藥組合物至需要該診斷測試之患者且使患者經受 造影分析測定MAdCAM表現組織之位置之步驟。造影分析 在醫學技術t熟知’且包括（無限制性）x_射線分析、伽馬 閃爍掃描法、磁共振造影（MRI)、正子放射斷層攝影術或 電腦斷層攝影術（CT)。在該方法之另一實施例中，活組織 切片自患者獲得以測定是否所關注之組織表現MAdCAM 而非使患者經受造影分析。在一較佳實施例中’抗 MAdCAM抗體可以可在患者中造影之偵測劑標記。例如， 抗體可以可用於X-射線分析之對比劑（諸如鋇）或可用於 MRI或CT之磁性對比劑（諸如釓螯合物）標記。其它標記劑 包括（無限制性）放射性同位素諸如"Tc。在另一實施例 中，抗MAdCAM抗體將為未標記且將藉由投藥第二抗體或 可偵測且可結合抗MAdCAM抗體之其它分子造影。 本發明之抗MAdCAM抗體亦可用於測定供體血液、血 清、血漿或其它生物流體包括（但不限於）糞便、尿、唾液 98487.doc •82· ⑧ 或活組織切片樣品中存在之可溶性MAdCAM之含量。在一 較佳實施例_，生物流體為血漿。生物流體隨後以免疫檢 定法用於測定可溶性MAdCAM之含量。可溶性MAdCAM 可為用於進行性胃腸道炎症之替代標記且偵測之方法可 用作量測疾病嚴重性之診斷標記。 上述診斷方法可用於測定是否個體表現高含量之可溶 性MAdCAM，其可指示個體將對使用抗MAdCAM抗體進 行之治療很好地反應。此外，診斷方法亦可甩於測定是否 以抗MAdCAM抗體（參見下文）或其它藥劑對疾病進行之 治療引起個體表現更低含量之MAdCAM且因此可用於測 定是否治療成功。 藉由抗MAdCAM抗體抑制a4p7/MAdCAM依賴性黏附： 在另一實施例中，本發明提供結合MAdC AM且抑制α4β7 整合素承載細胞結合及黏附至MAdC AM或其它同源配位 體（諸如L-選擇蛋白）至MAdC AM之抗MAdCAM抗體。在一 較佳實施例中，MAdCAM為人類的且為可溶性形式或表現 於細胞表面上。在另一較佳實施例中，抗MAdC AM抗體為 人類抗體。在另一實施例中，抗體或其部分以不超過50 nM 之IC5〇值抑制α4β7與MAdCAM之間之結合。在一較佳實施 例中，IC50值不超過5 nM。在一更佳實施例中，IC50值小 於5 nM。在一更佳實施例中，IC50值小於0.05 pg/mL、0.04 pg/mL或0.03 pg/mL。在另一較佳實施例中，IC5〇值小於0.5 gg/mL、0.4 pg/mL或0.3 pg/mL。IC50值可藉由此項技術中 任何已知方法量測。通常，IC5〇值可藉由ELISA或黏附分 98487.doc -83 - 1363762 析法量測。在一較佳實施例中，ic50值藉由黏附分析法使 用天然表現MAdCAM之細胞或組織或已設計表現 MAdCAM之細胞或組織量測。 藉由抗MAdC AM抗體抑制淋巴細胞募集至内臟相關淋巴 組織
在另一實施例中’本發明提供結合天然表現之MAdC AM 且抑制淋巴細胞結合至特定胃腸道淋巴組織之抗 MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，天然表現之MAdCAM 為人類或靈長類動物MAdCAM且為可溶性形式或表現於 細胞表面上。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為人 類抗體。在另一實施例中，抗體或其部分以不超過5mg/kg 之值抑制内臟營養味+淋巴細胞募集至表現 MAdCAM之組織。在—較佳實施例中，％。值不超過i 在—較佳實施例中，％。值小於(μ mg/kg。在一 實施例中，K：5。值可藉由❹伽馬閃爍掃描法或單光子放 射電腦斷層攝影術量測鍀標記 c之外周血液淋巴細胞募集 至胃腸道之劑量效應關係來測定。
疋在另一實施例中，IC 值可藉由使用流式細胞計數術量 卜周循核中内臟營卷 〜β7淋巴細胞（諸如（但不限於）c 4 α4β·7記憶Τ細胞）之掸 加作為抗MAdCAM抗體劑量之函數而測定。 胞)之日 為了可更好理解本發明，列出下 了例示說明之目的且不以任何'"等實例僅為 圍。 ^切解為限制本發明範 實例1 : 98487.doc
，84· 1363762 抗MAdCAM產製融合瘤之產生 本發明之抗體根據本實例製備、檢定及選擇。 初級免疫原之製備 兩個免疫原經製備用於XenoMouse™小鼠之免疫： (DMAdCAM-IgG! Fc融合蛋白質及（ii)自以MAdCAM穩定 轉染之細胞製備之細胞膜。 (OMAdCAM-IgGi Fc融合蛋白質 表現載體建構 編碼MAdCAM之成熟細胞外免疫球蛋白狀區域之
EcoRI/Bglll cDNA片段自 pINCY Incyte純系（3279276)切離 且選殖至pIGl載體之EcoRI/BamHI位點（Simmons, D.
L.(1993)在 Cellular Interactions in Development: A
Practical Approach, Hartley, D· A.編（Oxford Univ. Press,
Oxford)，第93-127頁中））以產生一骨架方式之IgGi Fc融 合。所得插入物與EcoRI/Notl —起切離且選殖至 pCDNA3.1+ (Invitrogen)。載體中之 MAdCAM-IgGi Fc cDNA經序列驗證。MAdCAM-IgG〗Fc融合蛋白質之胺基酸 f序列顯示如下： MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白質： ΜΡΓΰίΑίΕίΑΟίίΰίίίΟ〇5^νΚΡί〇νΕΡΡΕΡννΑνΑ16Α3Κ〇ΕΤΟΚΙΑαΑΡΚ6Α5νΰΐίΚ
GLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSP
AALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVG6QELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLF
RVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTT
SPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTR
TRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 98487.doc -85· ⑧ 1363762 ATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107) 下劃線：訊號肽 黑體：MAdCAM細胞外區域 重組蛋白質表現/純化： CHO-DHFR細胞以含有MAdCAM-IgG] Fc融合蛋白質 cDNA之pCDNA3.1 +載體轉染且表現MAdCAM-IgGi Fc融 合蛋白質之穩定純系選擇於含600 pg/mL G41 8及100 ng/mL甲胺嗓吟之Iscove氏培養基中。為了蛋白質表現， 中空纖維生物反應器以穩定表現MAdCAM-IgG〗Fc之CHO 細胞接種於含10%低IgG胎牛血清（Gibco)、非基本胺基酸 (Gibco)、2 mM 麵酿胺酸（Gibco)、丙酿I 酸納（Gibco)、100 pg/mL G418及100 ng/mL甲胺嗓吟之Iscove氏培養基中且 用於產生濃培養基上清液。MAdCAM-IgGi Fc融合蛋白質 藉由親和層析法自收穫之上清液中純化。簡言之，上清液 施加於HiTrap蛋白質G瓊脂糖凝膠（5 mL，Pharmacia)柱（2 mL/min)上，以 25mMTrispH值 8、150mMNaCl(5個柱容 積）洗滌且以100 mM甘胺酸pH值2.5(1 mL/min)溶離，立即 :以1M Tris pH值8中和溶離份至pH值7·5。含MAdCAM-IgGi Fc融合蛋白質之溶離份以SDS-PAGE識別，合併至一起且 施加於以35 mM BisTris pH值6.5、150 mM NaCl預平衡之 丙稀葡聚糖凝膠（Sephacryl) S 1 00柱（Pharmacia)上。凝膠過 滤在〇.35 1111^/111丨11下執行，收集1*^^£10入1^1-1§〇1尸<:融合蛋白 質在約3x5 mL溶離份中之峰值。該等樣品合併且施加於以 3 5 mM BisTris pH 值 6.5 預平衡之 Resource Q(6 mL， 98487.doc -86- ⑧ 1363762
Pharmacia)柱上。柱以5個枉容積之35 mM Bis Tris pH值 6.5、150 mM NaCl(6 mL/min)洗滌且 MAdCAM-IgG】Fc 融 合蛋白質以35 mM Bis Tris pH值6.5、400 mM NaCl之溶離 成4-6 mL溶離份。在該階段蛋白質為90%純且藉由 SDS-PAGE以單帶在約68 kD下遷移。為用作免疫原及所有 後繼檢定，材料經緩衝液交換成25 mM HEPES pH值7.5、 1 mM EDTA、1 mM DTT、100 mM NaCM、50%甘油且以等 分量儲存於-80°C下。 (ii)穩定表現MAdCAM之細胞膜 包含公開之MAdCAM序列之核苷酸645-1222之 Sacl/Notl 片段（Shyjan AM 等人，J Immunol，， 156, 2 851-7(1996))自結腸cDNA文庫經PCR擴增且選殖至 pIND-Hygro載體（Invitrogen)之 Sacl/Notl位點。包含額外 5' 編碼序列之SacI片段自pCDNA3.1 MAdCAM-IgG! Fc次選 殖至該結構以產生全長MAdCAM cDNA。含MAdCAM cDNA之KpnI/Notl片段隨後選殖至pEF5FRTV5GWCAT載 體（Invitrogen)中相應位點且置換CAT編碼序列。序列驗證 CDNA插入物且藉由Flp重組酶技術根據製造商說明書在 Flpln NIH 3T3細胞（Invitrogen)中用於轉染以產生單一穩 定表現之純系。穩定表現之純系如下文概述係藉由其支持 α4β7+ JY人類B淋巴母細胞株之結合的能力來選擇（Chan BM 等人，J. Biol. Chem.，267:8366-70(1992))。表現 MAdCAM之CHO細胞穩定純系以相同方式使用Flpln CHO 細胞（Invitrogen)製備。 98487.doc -87- 1363762 MAdCAM表現之Flpln NIH-3T3細胞在含2 mM L-麩醯 胺酸、10%供體牛血清（Gibco)及200 pg/mL潮黴素 B(Invitrogen)之 Dulbecco 氏改質之 Eagles培養基（Gibco)中 生長且擴大於轉瓶中。MAdCAM表現之Flpln CHO細胞在 含2 mM L-麩醯胺酸、10°/。供體牛血清（Gibco)及350 pg/mL 潮黴素 B(Invitrogen)之 Ham 氏 F12/Dulbecco 氏改質之 Eagles培養基（Gibco)中生長且擴大於轉瓶中。細胞藉由使 用非酶細胞解離溶液（Sigma)且刮取，藉由離心法在磷酸 鹽緩衝鹽水中洗滌而收穫。細胞膜自細胞小球藉由於25 mM BisTrispH值 8、10 mM MgCl2、0·01 5%(w/v)抑肽酶、 1 00 U/mL桿菌肽中進行兩輪polytron(—種勻襞器）勻質化 且離心而製備。最終之小球懸浮於相同緩衝液中，且 5 0乂106細胞當量等分至厚壁6口口6!1(1〇“移液器中且在 >100,00(^下旋轉以產生用於又611〇]^〇1^6小鼠免疫之細胞 膜小球。上清液傾析且膜在-80°c下儲存於移液器中直至 需要時。細胞膜中蛋白表現之證實藉由SDS-PAGE及西方 轉潰法以針對MAdCAM之N-末端殘基（[C]-KPLQVEPPEP) 而培殖之兔坑肽抗體來確定。 免疫及融合瘤之產生： 八至十週大之XENOMOUSE™小鼠經腹膜内或在其後 足底中以純化重組MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白質（10 μβ/劑 量/小鼠）或自穩定表現MAdCAM之CHO或NIH 3Τ3細胞 (10x1 06細胞/劑量/小鼠）製備之細胞膜免疫。該劑量經三 至八週時間重複五至七次。融合之前四天，小鼠接受人類 98487.doc •88- ⑧ MAdCAM之細胞外區域於PBS中之最終注射。自免疫小鼠 之脾及淋巴結淋巴細胞與非分泌性骨髓瘤 P3-X63-Ag8_653細胞株融合且經受先前所述之HAT選擇 (Galfre及 Milstein，Methods Enzymol. 73:3-46(1981))。所 有分泌MAdCAM特異性人類IgG2K及IgG4K抗體之融合瘤 群組回收且次選殖。產生特定用於MAdCAM之單株抗體之 十二個融合瘤次純系 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4及 9.8.2回 收且以下述檢定法偵測。次選殖融合瘤株1.7.2、1.8.2、 6.14.2 、 6.22.2 、 6.34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5、7.26.4及 9.8.2所衍生自之親本株 1.7、1.8、6.14、 6.22、6.34、6.67、6.73、6.77、7.16、7.20、7.26及 9.8之 皆具有抗MAdCAM活性。 ELISA檢定： 小鼠血清t及融合瘤上清液中抗原特異抗體之偵測藉 由所述之 ELISA(Coligan 等人，2.1 單元"Enzyme-linked immunosorbent assays,"於 Current Protocolslinlmmunology (1994))使用MAdCAM-IgG! Fc融合蛋白質來捕獲抗體而 測定。對於以MAdCAM-IgG丨Fc融合蛋白質免疫之動物， 為對人類IgGi之非特異反應性且為結合至Flpln CHO MAdCAM細胞之能力藉由流式細胞計數法篩選抗體。 在一較佳ELISA檢定中，使用下列技術： ELISA板在4°C下以於含緩衝液（1〇〇 mM碳酸鈉/碳酸氫 納缓衝液pH值9·6)之板中之100 pL/孔MAdCAM-IgG丨Fc融 98487.doc -89- 1363762 合物（4.5 pg/mL)塗布隔夜◊培養之後，移除塗布緩衝液且 板以200 μυ孔阻滯缓衝液（5% BSA ' 0.1%吐溫20於磷酸鹽 緩衝鹽水中）阻滞且在室溫下培養1小時。移除阻滞緩衝液 且添加50 μί/孔之融合瘤上清液或其它血清或上清液（例 如陽性對照組）於室溫下2小時。培養之後，板以PBS(3xl00 μί/孔）洗滌且融合瘤mAb之結合以稀釋於PBS中之HRP共 軛之二次抗體（意即對於IgG2抗體1:1000小鼠抗人類 IgG2-HRP(SB Cat. No. 9060-05)或對於 IgG4 抗體 1:1000 小 鼠抗人類IgG4-HRP(Zymed Cat. No. 3840))來摘測。板在室 溫下培養1小時，在PBS(3xl00 μυ孔）中洗滌且最終以100 pL OPD(鄰苯二胺（DAKO S2405) + 5 μί 30% H202/12 mL) 顯影。允許板顯影10-20分鐘，以100 pL 2M H2S04停止反 應。板在490 nm下讀取。 黏附檢定： 在黏附檢定中以α4β7+ JY細胞及（DMAdCAM-IgG, Fc融 合蛋白質或（ii)MAdCAM-CHO細胞評定藉由ELISA證實結 合至MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白質之抗體之拮抗活性。 (OMAdCAM-IgGi Fc融合檢定 100 jiL 之 4.5 pg/mL 純淨 MAdCAM-IgGi Fc 融合蛋白質 於 Dulbecco’s PBS之溶液吸附至96 孔 Black Microfluor u-型底（Dynex #7805)板在4°C下隔夜。在37°C下10% BSA/PBS中阻滯至少1小時之前，MAdCAM塗布板隨後倒 轉且吸除過多液體。在該時間中，培養之JY細胞使用錐藍 排除法（tryptan blue exclusion)計數（應約 8xl05細胞/mL)且 98487.doc -90· ⑧ 1363762 20x106細胞/檢定板吸移至50 mL離心分離管中。jy細胞於 含2 mM L-麩醯胺酸及10%熱滅活胎牛血清（Life Technologies #10108-165)之 RPMI 1640 培養基（Gibco)中
培養，且每2-3天以l-2xl05/mL接種以防止培養物分化。 細胞以含2 mM L-麩醯胺酸（Gibco)之RPMI 1640培養基 (Gibco)藉由離心法（240g)洗蘇兩次，最終細胞小球以 2xl06細胞/mL懸浮於RPMI 1640用於約黃綠素AM裝載。約 黃綠素 AM(Molecular Prob6s #C-3099)以 1:2〇〇 稀釋於 DMSO(約最終濃度5 μΜ)添加至細胞中且細胞在培養過程 中（37°C保持30分鐘）避光。在該細胞培養步驟中，測試之 抗體稀釋如下：對於單劑量測試，抗體製成3 pg/mL (1 pg/mL最終）於 0.1 mg/mL BSA (Sigma #A3059)於 pbs 中； 對於全IC50曲線，抗體以3 pg/mL(l pg/mL最終）之最高濃 度稀釋至0.1 mg/mL BSA/ PBS，隨後雙倍稀釋（1:2比率） 於板上。行之最終孔用於測定總結合，因此使用於PB S中 之0.1 mg/ml BSA。 阻滯之後，板内容物拂出且50 pL之抗體/對照組添加至 各孔且板在37°C下培養20分鐘。在該時間中，鈣黃綠素裝 載之JY細胞以含10%胎牛血清之RPMI 1640培養基洗滌一 次及1 mg/mL BSA/PBS藉由離心法洗滌一次，最終細胞小 球在1 mg/mL BSA/PBS中懸浮至lxl06/mL。100 pL細胞添 加至U型底之板之各孔，密封板，短暫離心（1〇〇〇 rpm保持 2分鐘）且板隨後在37°C下培養45分鐘。在該時間之最後， 板以Skatron板洗滌機洗滌且螢光性使用Wallac Victor2 98487.doc •91 - ⑧ .1363762 1420多標記讀取器（激發λ 485nm，發射λ 535nm，自頂部 自板底部8 mm處以標準發射孔徑計數歷經0.1 sec)量測。 對於各個抗體濃度，百分比黏附以無任何抗體存在下之最 大螢光反應減去與非特異結合相關之螢光之百分數來表 示。IC50值定義為其中黏附反應減小至無抗MAdCAM抗體 存在下之反應之50%時的抗MAdCAM抗體濃度。可抑制JY 細胞結合至MAdCAM-IgG1 Fc融合體之具有IC5G值<0.1 pg/mL之抗體據認為具有有效拮抗活性且進行 MAdCAM-CHO黏附檢定。所有十二個測試之Abs顯示有效 拮抗活性（表3)。單株抗體1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5及 7.26.4 源自 IgG2K 譜系且單株抗體 6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6.73.2、6.77.1 及 9.8.2源自 IgG4K譜系。 (ii)MAdCAM-CHO細胞黏附檢定 JY細胞如上文培養。MAdCAM表現之CHO細胞以 pEF5FRT MAdCAM cDNA結構且使用上述Flp重組酶技術 (Invitrogen)產生。MAdCAM表現之CHO細胞之單一穩定純 系基於其支持JY細胞之黏附及（藉由流式細胞計數法）針 對MAdCAM之N-末端而培殖及如上述之兔抗肽抗體結合 能力而選擇。MAdCAM表現之CHO細胞在含有2 mM L-麩 醯胺酸、10%胎牛血清（Gibco)及35〇 pg/mL潮黴素 B(Invitrogen)之 DMEM/F12 培養基（Gibco # 21331-020)中 培養，每2/3天分裂1:5。為黏附檢定，MAdCAM表現之CHO 細胞以4x104細胞/孔接種於200 kL培養基中之96孔黑板透 明底部（Costar # 3904)且在37°C/5°/〇 C02下培養隔夜。 98487.doc •92- 1363762 次日，如上所述，融合瘤上清液或純化之單株抗體自30 pg/mL(相當於10 pg/mL之最終濃度）之起始濃度稀釋於1 mg/mL BSA/PBS中。對於MAdCAM CHO板，板内含物拂 出且50 μί之抗體/對照組添加至每個孔且板在37°C下培養 20分鐘。行之最終孔用於測定總結合，因此使用於PBS中 之0.1 mg/mL BSA。鈣黃綠素AM-裝載之JY細胞於1 mg/mL BSA/PBS中之lX106/mL·之最終濃度如上文製備，隨後在抗 體之20分鐘培養期之後添加100 pL至板中。板隨·後在37°C 下培養45分鐘，隨後在Tecan板洗滌機（PW 3 84)上洗滌， 且使用上述Wallac板讀取器量測螢光。對於各個抗體濃 度，百分比黏附以無任何抗體存在下之最大螢光反應減去 與非特異結合相關之螢光之百分數來表示。可抑制JY細胞 結合至MAdCAM CHO細胞之具有IC5〇值<1 pg/mL之抗體 據認為具有有效拮抗活性。如前所述，IC5G值定義為其中 黏附反應減小至無抗MAdCAM抗體存在下之反應之50% 時的抗MAdCAM抗體濃度。在該檢定中，1.7.2、1.8.2、 6·14·2 ' 6·22.2 、 6·34.2 、 6.67.1 、 6.73.2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5、7.26.4及9.8.2之IC50效價描述於下文表3中。 表3.例示性抗MAdCAM抗體之IC50值 98487.doc -93 - 1363762
MAdCAM IgG 1 Fc融合 平均IC50 (uq/mL) 0.030 ± 0.011 0.027 ± 0.011 0.019 ± 0.009 0.025 ± 0.027 0.021 ± 0.040 0.011 ±0.005 0.018 ± 0.011 0.013 ± 0.008 0.013 ± 0.070 0.020 ± 0.010 0.022 ± 0.004 0.020 ± 0.050 -647744444444 MAdCAM Flpln CHO檢定 平均IC50 (μα/mU 0.502 ± 0.280 0.424 ± 0.107 0.389 ± 0.093 0_387 ± 0.202 0.574 ± 0.099 0.291 ± 0.096 0.573 ± 0.168 0.285 ± 0.073 0.298 ± 0.115 0.369 土 0_ 103 0.520 ± 0.100 0.440 ± 0.342 η 9 8 6 9 5 6 8 8 4 81 lqG2 mmm ........ 為在基於流動之檢定中量測抗MAdCAM mAbs之拮抗效 價，在設計模擬適合内臟關聯之淋巴組織之高内皮小靜脈 之微脈管環境之完全應力條件下，表現MAdCAM之CHO 細胞塗布於玻璃顯微鏡玻片（50x4 mm)中且允許黏附以形 成連合單層（約2.5x1 05細胞）。細胞隨後在連接至流動檢定 系統之前在37°C下以親和純化mAb經一範圍濃度（0.1 -10 pg/mL)培養20分鐘。同型匹配之IgG2或IgG4 mAb( 10 pg/mL)用作陰性對照組。正常供體外周血液淋巴細胞 (PBLs)在0.05 Pa之恆定剪切應力下灌注於細胞單層。錄製 實驗且計算淋巴細胞之總黏附（滾動+固定黏附）。所有測 試之單株抗體在所述條件下顯示為有效拮抗劑。 (iii)Stamper-Woodruff 檢定 為了顯影MAdCAM+脈管，生物素化抗MAdCAM mAb根 據製造商說明書使用於磷酸鹽緩衝鹽水中之20莫耳過量 98487.doc •94- ⑧ 生物素-NHS(Pierce)產生於1-2 mg之親和純化蛋白質上。 允許反應持續於室溫下（30分鐘）且以PD-lO(Pharmacia)柱 除鹽且測定蛋白質濃度。 正常肝淋巴結自供體器官移除，立即冷凍於液氮中且在 -70°C下儲存直至使用。切割ΙΟμιη低溫切片，在聚-L離胺 酸塗布之載玻片上空氣乾燥且在檢定前固定於丙酮中。切 片使用抗生物素蛋白-生物素阻滯系統（DAKO)阻滯，且隨 後在室溫下與生物素化抗MAdCAM mAb以一範圍濃度 (1-50 pg/mL)培養（2 hrs)-。同型匹配之 IgG2 或 IgG4 mAb(50 pg/mL)用作陰性對照組且阻滯之抗β7抗體（50 pg/mL)作為 陽性對照組。 取自正常供體之外周血液淋巴細胞以小鼠抗人類CD2 mAb(DAKO)標記以允許隨後黏附細胞之顯影。5xl05 PBLs 添加至各個淋巴結切片且在輕輕沖洗以避免黏附細胞分 離之前培養30分鐘。切片隨後再固定於丙酮中，且與生物 素化抗MAdCAM mAb( 1 0 pg/mL)再培養，繼之生物素化山 羊抗小鼠mAb(以識別CD2標記之PBLs及未染色 MAdCAM+脈管）及隨後鏈Ab複合物/HRP(DAKO)。最終 MAdCAM+脈管& CD2標記之PBLs藉由添加DAB感光底層 (DAKO)至切片以顯示陽性染色區之褐色反應產物而顯 影。淋巴細胞黏附藉由計算黏附至門道、靜脈或竇狀隙之 5 0 MAdCAM-1 +脈管之淋巴細胞數目量化。以平均值表示 之資料隨後使用無任何抗體下取作100%之PBLs黏附標準 化百分比黏附。資料基於n=3不同PBL供體編輯及用於不 98487.doc -95 - 1363762 同肝淋巴結供體。生物素化純化單株抗體1.7.2及7.16.6之 代表性資料與阻滯之抗β7抗體對照組比較描述於表4中。 選擇性檢定： VCAM及纖維結合素為MAdCAM之接近結構及序列同 源物。藉由測定其阻滞α4βι+/α5βι+ Jurkat T細胞（ATCC)結 合至其同源細胞黏附分子之能力評定親和純化之抗 MAdCAM mAbs對於MAdCAM之特異性。100 pL之纖維結 合素細胞結合片段（110 Kd，Europa Bioproducts Ltd, Cat. No. UBF4215-18)或 VCAM(Panvera)於 Dulbecco's PBS 中之 4.5 pg/mL溶液吸附至 96孔 Black Microfluor "B" u-型底 (Dynex #7805)板在4°C下隔夜。在37°C 下 10% BSA/ PBS中 阻滯至少1小時之前，塗布之板隨後倒轉且吸除過多液 體。在該時間中培養之T細胞使用錐藍排除法計數且以先 前所述用於上文JY細胞之鈣黃綠素AM染料裝載。測試之 抗體自10 gg/mL之最高濃度稀釋至0.1 mg/ml BSA於PBS 中。行之最終孔用於測定總結合，因此使用於PB S中之0 · 1 mg/ml BSA。製備於PBS 中之艾奇單抗（Echistatin)(Bachem， Cat. No. H-9010)在100 nM之最高濃度下用於阻滯αβν纖 維結合素相互作用。抗CD106 mAb(純系51-10C9，BD Pharmingen Cat. No. 555645)在 1 pg/mL之最高濃度下用於 阻滯ouPi/VCAM相互作用。
阻滯之後，板内含物拂出且添加50 kL抗體/對照組至各 孔且板在37°C下培養20分鐘。鈣黃綠素裝載之Jurkat T細 胞如前文所述洗滌一次，最終細胞小球於1 mg/mL 98487.doc -96- 1363762 用純形式。每個mAb使用1分鐘接觸時間捕獲於分離表面 上及5分鐘洗滌以穩定mAb基線。MAdCAM-IgG丨Fc(141 nM)融合蛋白隨後注射於所有表面1分鐘，繼之3分鐘解 離。資料對捕獲於各表面之抗體量標準化且使用BIAcore 提供之ΒΙΑ評價軟體上可用之基線漂移模型以全面配適蘭 格谬爾（Langmuir) 1:1評價。 方案2 親和純化之mAb使用胺偶合固定於CM5生物傳感器芯 片之葡聚糖層上。芯片使用pH值4.5醋酸鹽緩衝液作為固 定緩衝液製備且達成2.5-5.5 kRU之蛋白質密度。於電泳緩 衝液中之MAdCAM-IgGt Fc融合蛋白質樣品在0.2-55 nM(包括僅包含電泳緩衝液之0 nM溶液作為零參照）範圍 濃度下製備。樣品隨機化且雙份注射3分鐘，每個穿過4 個貫流分析池（flow cell)，分析池使用HBS-EP(10 mM HEPES pH值 7.4、150 mM NaCM、3 mM EDTA、0.005%表 面活性劑P20)作為電泳緩衝液。使用100 pL/分鐘之流動速 率以使質量傳輸限制最小化。MAdCAM-IgGi Fc融合蛋白 質之解離監測180分鐘，表面藉由25 mM H3P〇4(50 gL/min) 或 10 mM (6.22.2)、20 mM(6.67.1、6.73.2、6.77.1)至 25 mM(6.34.2)及 45 mM NaOH(6.14.2)之 6 sec 注射再生且資 料使用ΒΙΑ評價（v3.1)軟體包分析。 表5列出本發明之代表性抗MAdCAM抗體之親和性量 測： 表5.藉由表面電漿共振（BIAcore)測定親和常數Kd 98487.doc -99- ⑧ 1363762
純系 1.7.2 1.8.2 7.16.6 7.20.5 7.26.4
k〇n(l/Ms) 2·4χ105 2.9χ105 1·5χ106 4.5χ105 9·6χ105 1.3χ105 1·5χ106 1.2χ106 5.9χ105 1.4χ105 1·5χ105 2.3χ106 1 — k〇ff(l/s) lxlO·5 lxlO*5 2.2x10' 1.9x10' 2.6x10' lxlO·5 1.4x10' 1.9x10· lxlO.5 1.3x10' lxlO·5 2.3x10'
K D(pM) 42 35 1.5 42.2 271 7.7 9.3 15.8 17 93 6.7 100 k〇n(l/Ms) 一方案2 -k〇ff(l/s) K, 5.5x10」 1.8xlOi 2.9xlOi 1.6xlOi 1.5xlO: 5x10s 2.3xlOi 3.3X105 2.4xl05 4.4x10· 1.3xl〇.: 2.3xl〇*; 1 -4xl〇-( 1.2x10。 1.2xl〇-! <5xl〇·6 8.7χ1〇·Ί <5xl〇·6 <5xl〇·6 1.4xl〇· 23.6 128 4.8 75 80 <10 3.8 <15 <20 32.5 動力學分析表明根據本發明製備之抗體具有對於 MAdCAM細胞外域之高親和力及強結合常數。 實例III : 識別抗MAdCAM mAbs的抗原決定部位選擇性及物種 交叉反應性 抗體識別抗原上表面暴露之抗原決定部位為線性（初級） ，序列或結構（次級）序列之區域。為了定義抗MAdCAM抗體 之功能抗原決定部位概貌，共同使用Luminex抗原決定部 位裝倉、BIAcore裝倉及物種免疫組織化學分析。 基於Luminex之抗原決定部位裝倉：
MxhlgG 2,3_4-共軛珠粒（Calbiochem Ml 1427)偶合至初 級未知之抗MAdCAM抗體。吾人添加150 pL初級未知抗聽 稀釋液（0.1 gg/mL稀釋於融合瘤培養基中）至96孔組織培 98487.doc • 100· 1363762 養板之孔卜珠粒原料在上清液中渴動且稀釋至〇 5χΐ〇5 珠粒/mL之濃度。珠粒在上清液中於震盈器上黑暗中代下 培養隔夜。 96孔微量滴定過滤板（MiUip〇re # MABVN125〇)之各孔 藉由添加200吣洗滌緩衝液（含〇 〇5%吐溫2〇之pBS)預潤 濕且藉由抽吸術移除。接著’ 5〇似孔之G 5χ1()5珠粒胤 原料添加至過濾板中，且孔以洗滌緩衝液（2χ丨〇〇 pL/孔） 洗滌。添加在融合瘤培養基（(M Mg/mL)*稀釋之6〇 #/孔 之MAdCAM-IgG! Fc抗原。板遮蓋且在室溫下以溫和振搖 來培養1小時。孔藉由添加1〇〇 pL/孔之洗滌緩衝液繼而抽 吸來洗滌兩次。接著，吾人添加於融合瘤培養基（〇丨^/mL) 中稀釋之60 μί/孔之次級未知抗MAdCAM抗體。板在室溫 下黑暗中振榣兩小時。接著孔藉由添加丨〇〇 μΕ/孔之洗滌 緩衝液繼而柚吸來洗滌兩次。接著添加6〇 孔之生物素 化MxhlgG 2,3,4(0.5 pg/mL)。板在室溫下黑暗中振搖1小 時。孔藉由添加100 pL/孔之洗滌緩衝液繼而抽吸來洗滌 兩次。每個孔中添加稀釋於融合瘤培養基之6〇叫之1 pg/mL MxhlgG 2,3,4鏈黴抗生物素蛋白邛玢汕訂咖“ #554061)。板在室溫下黑暗中振搖2〇分鐘。孔藉由添加1〇〇 μΐ^/孔之洗滌緩衝液繼而抽吸來洗滌兩次。接著各孔懸浮 於80 kL阻滯緩衝液中（具有0.5%牛血清白蛋白、〇」％吐溫 及0.01%硫柳汞之PBS)小心上下吸移以懸浮珠粒。 使用Luminex 1〇〇及其伴隨軟體（Luminex® Corporation) ’讀取板以確定發光讀數。基於獲得之用於 98487.doc -101 - 1363762 各種抗MAdC AM抗體測試的發光資料，抗MAdCAM抗體 根據其結合特異性分組。測試之抗MAdCAM抗體分成一系 列抗原決定部位庫，其描述於表8中。 BIAcore裝庫： 在與上述類似之方法中’ BIAcore亦可用於測定本發明 例示之抗MAdCAM抗體之抗原決定部位排他性。九種抗 MAdCAM 抗體純系 6.22.2、6.34.2、6.67.卜 6.77.卜 7.20.5、 φ 9，8.2、1.7.2、7.26.4及7.16.6使用胺偶合固定於CM5生物 傳感器芯片之分離貫流分析池之葡聚糖層上。固定緩衝液 為10 mM醋酸鹽緩衝液pH值4.5(純系6.22.2、6.34.2、 7.20.5、9.8_2、1.7.2、7.26.4及 7.16.6)或 10 mM醋酸鹽緩衝 液pH值5·5(純系6.67.1及6.77.1)。約3750 RU之蛋白質密度 在所有情況下達成。未反應之Ν-羥基琥珀醯亞胺酯類之滅 活使用1Μ鹽酸乙醇胺，pH值8.5執行。 MAdCAM-IgG〗Fc融合蛋白質在HBS_EP電泳緩衝液 φ (0.01 M HEPES PH值 7.4、0.15 M NaC卜 3 mM EDTA、 〇.〇〇5。/0聚山梨醇酯20)中稀釋至1>5 μ§/ιηί(約25 nM)之濃 度。隨後以50 pL之容積5 pL/分鐘之速率注射穿過第一貫 流分析池。注射完成之後，第一抗體探針添加至相同貫流 分析池。所有測試抗體在HBS-EP中稀釋至約20 濃度且亦以50 μΙ>之容積5 μ£7分鐘之流動速率注射。當觀 察不到測試抗體結合時，下一測試純系然後立即注射。當 出現結合時，傳感器表面再生以移除MAdCAM_IgGi以融 合蛋白質及測試抗體兩者。各種再生溶液視存在之固定抗 98487.doc 1363762
體及測試抗體而定來使用。所用再生條件之概述描述於表 6中0 表6.用於執行BIAcore抗原決定部位定位之再生條件之概述 固定之抗體 移除之抗體探針 再生溶液 注射體積 7.16.6 6.22.2 40 mM填酸 20 μί 6.34.2 40 mM填酸 40 μΐ 7.20.5 40 mM填酸 20 μί 6.77.1 9.8.2 40mM磷酸 10 pL 1.7.2 40 mM碟酸 5 μί 7.16.6 40 mM填酸 10 μί 1.7.2 6.77.1 25 mM填酸 5 μι 9.8.2 25 mM碟酸 5 μί 7.20.5 25 mM填酸 5 6.22.2 25 mM填酸 5 μί 6.34.2 25 mM氫氧化納 5 pL 6.67.1 25 mM氫氧化納 5 μί 6.22.2 9.8.2 25 mM氫氧化納 20 pL 7.26.4 25 mM氫氧化鈉 5 pL 6.34.2 9.8.2 25 mM氫氧化鈉 70 μί 1.7.2 40 mM氫氧化鈉 5 μί 7.26.4 40 mM氫氧化納 5 pL 6.67.1 9.8.2 40 mM氫氧化麵 5 pL 1.7.2 40 mM氫氧化納 5 μί 7.20.5 9.8.2 25 mM填酸 5 μί 1.7.2 25 mM峨酸 5 μι 7.26.4 25 mM填酸 5 μί 7.26.4 9.8.2 40 mM氫氧化納 20 pL 6.22.2 75 mM填酸 20 μί 7.20.5 75 mM碟酸 20 μί 7.16.6 75 mM填酸 20 μΐ 9.8.2 9.8.2 25 mM填酸 15 μί 6.22.2 25 mM構酸 10 μί 7.20.5 25 mM碟酸 20 pL 7.16.6 25 mM填酸 10 μί (在所有再生程序中流動速率為50 pL/分鐘） 再生之後，MAdCAM-IgG〗Fc融合蛋白質再結合且注射 另外測試抗體。該等程序進行直至整個群組之純系注射於 98487.doc -103· ⑧ 1363762 具有結合MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白質之固定抗體之表 面。具有不同固定抗體及結合MAdCAM之新貫流分析池隨 後用於探測九個測試純系。抗MAdCAM抗體1.7.2及1.8.2 預期識別相同MAdCAM抗原決定部位，此分別基於SEQ ID NOS : 2、4、6、8之重鏈及κ輕鏈之接近初級胺基酸序 列同源性。相應地，僅通過BIAcore反應矩陣評定1.7.2。 抗體6.14.2及6.73.2自該分析中忽略，但抗MAdCAM抗體 對之所有其它組合以此方式測試。選擇任意等級之1 〇〇 RU 作為結合/非結合之臨限值且基於是否觀察到結合而建置 反應矩陣（表7)。 表7· BIAcore抗原決定部位裝庫反應矩陣 ⑧
98487.doc -104- 1363762 料。在所有實例中，除了兩個純系7.16_6及9·8.2，抗體自 身阻滯。抗體7.16.6及9.8.2不完全交叉。自身阻滯之缺乏 應歸因於允許mAb額外結合至MAdCAM-IgFc上第二位點 之融合蛋白質中mAb-誘導之構象改變。 顯示相同反應模式純系的分組產生至少六個不同抗原 決定部位庫，如圖解表示之表5中所示。 抗MAdCAM抗體與其互相作用之MAdCAM抗原決定部 位序列之進一步精確識別可藉由許多方法中任一來測 定，包括（但不限於）污點肽文庫陣列之西方分析法 (Reineke等人，Curr. Topics in Microbiol, and Immunol 243 : 23-36 (1999)，M. Famulok、E-L Winnacker、C-H Wong
編’ Springer- Verlag，Berlin)，噬菌體或細菌鞭毛蛋白/fliC 表現文庫展示’或結合蛋白片段於有限蛋白水解作用後之 簡單MALDI-TOF分析。 免疫組織化學檢定： 回腸、腸系膜淋巴結、脾、胃、十二指腸、空腸及結腸 之OCT或蔗糖包埋之冷凍組織樣品（Peyer，s片）用作抗 MAdCAM mAbs之陽性染色對照組。為染色具有人類IgG2 mAbs之人類切片’產生抗MAdCAM mAbs之生物素化衍生 物。10 μιη冷凍組織切片切割於聚l·離胺酸塗布之載玻片 上’直接置於100%丙酮4°C (10分鐘），隨後3%過氧化氫於 甲醇中（10分鐘）’步驟之間以PBS洗滌。載玻片以生物素 阻滯系統（DAKO Cat. No. X0590)阻滯，而後以初級抗體培 養（1:100-1:1〇〇〇)於？88(1111*)中，以？68-吐溫20(0.05%) 98487.doc -105- 1363762 洗滌且隨後以HRP-鏈黴抗生物素蛋白（BD Bioscience Cat. Ν〇·550946，30 分鐘）及 DAB 感光底層（Sigma Cat. No· D5905)使結合顯影。對於IgG4 mAbs，使用HRP-共軛之小 鼠抗人類1§〇4(乙丫11^(1匚31.>1〇.3 840)次級。載玻片以]\^)^犷 氏Haemalum(蘇木精及明蓉之溶液）對比染色（1分鐘）、洗 滌且隨後安裝於DPX中。 比較許多物種（小鼠、大鼠、兔、狗、豬、獼狼及人類 組織）之結合親和性。藉由免疫組織化學大鼠、兔及豬組 織無反應性且藉由ELISA分析重組小鼠MAdCAM之抗 MAdCAM抗體無交又反應性。對於人類、獼猴及狗組織之 資料以表形式列於下文表8中： 表8.抗MAdC AM抗體與MAdC AM物種直系同源物交叉反 應之模式 IHC交叉反應
Luminex 人類 獮猴 i3a3a3b2b3b2265373a
腸 回 未測定 結合 狨猴 狗 腸 回 □ lgG2 Ig64 抗]VIAdCAM結合至特定内皮結構及淋巴組織根據圖解 藉由陰影表示。基於Luminex抗原決定部位分析之抗原決 98487.doc -106- ⑧ 定部位庫及MAdCAM交叉反應模式對於各抗體予以指 系。較之 1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4 及 9.8.2(粗 艘字），抗MAdCAM 抗體 6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、 6.73.3及6.77.1之Luminex抗原決定部位裝庫資料（斜體字） 源自獨立實驗，此藉由不同字體特徵指示。 所有測試之抗MAdCAM抗體具有識別表現於胃腸道血 管内皮腔隙之人類MAdCAM抗原決定部位之能力。除了 1.7.2及1.8.2，測試之所有其它抗MAdCAM抗體可特異結 合獼猴胃腸道血管内皮腔隙。某些其它抗MAdCAM抗體’ 即6.14.2及6.67.1亦具有特異識別狗MAdCAM直系同源物 及獼猴MAdCAM之能力。 功能性活性嵌合獼猴/人類MAdCAM表現CHO細胞株之 虞生： 對於人類及獼猴MAdCAM之某些抗MAdCAM抗體結合 親和性之差異引導吾人確定是否可獲得該觀察結果之結 構基礎。
基於短尾猿MAdCAM之公開胺基酸序列（Shyjan AM等 人，J Immunol” 156, 2851-7(1996))，設計引子以 PCR擴增 糰猴MAdCAM α4β7結合域序列。總RNA自冷凍離體獼猴腸 系膜淋巴結（約200 mg)使用Trizol方法（Invitrogen)根據製 造商說明書製備。寡dT啟動1-2 pg且以AMV反轉錄酶 (promega)反轉錄。反轉錄產物部分以具有GC-2聚合酶於 1M GC熔融物（Clontech)中之前置 5，-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3'(SEQ ID NO:67)及反置 5'-GTG CAG 98487.doc •107· 1363762
GAC CGG GAT GGC CTG-3，（SEQ ID NO:68)引子且在 62°C 之黏接溫度下經受PCR。適當尺寸之RT-PCR產物經切離且 自1%瓊脂糖凝膠於電泳之後純化，隨後在PCR2.1之EcoRI 位點之間經TOPO-TA選殖（Invitrogen)。插入物經序列證 實。核苷酸及預測轉譯胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NOS 49及 50 中。 排列對比時（圖3提供該序列排列對比），α4β7結合域之預 測人類及獼猴MAdCAM胺基酸序列顯示高度序列一致性 (90.8%)。為了產生模擬表8表示之抗MAdCAM結合模式之 功能性活性獼猴MAdCAM表現細胞株，對應於pCR2.1中獼 猴α4β7結合域序列之SacI片段直接次選殖至含有上述羧基 端黏蛋白柄及跨膜區之C-端人類MAdCAM pIND-Hygro結 構中《核實序列及方位，根據製造商說明書隨後KpnI/Notl 片段選殖至PEF5FRTV5GWCAT載體（Invitrogen)中，置換 CAT編碼序列且用於轉染以在Flp In CHO細胞（Invitrogen) 中產生單一穩定表現純系。 抗MAdCAM抗體純系結合至表現獼猴/人類MAdCAM嵌 合體之CHO細胞藉由流式細胞計數法評定且抗MAdCAM 抗體之功能活性使用與上述非常類似之JY細胞黏附檢定 來測定。抗MAdCAM抗體之結合及功能活性表現於表9中。 表9.對於一系列抗MAdCAM抗體，在獼猴/人類 MAdCAM- CHO/JY黏附檢定中之功能活性與藉由FACS量 測之人類及獼猴/人類MAdCAM CHO細胞結合之間之相關 性。 98487.doc -108- 1363762 功能性ICso 純系 (pg/mL) 1.7.2 1.8.2 7.16.6 無活性 無活性 0.72 7.20.5 0.62 7.26.4 0.96 0.53 0.83 0.47 0.75 無活性 0.64 sis®； 0.83 lgG2 丨Ig64麵 FACS結合 人類獮猴/人類
I未結合 結合
總之，已知抗MAdC AM抗體藉由基於重組細胞之結合而 結合人類或獼猴MAdCAM(如免疫組織化學（表8)所偵測） 之能力與功能性活性（表9)之間具有良好相關性。例如抗 MAdCAM抗體1.7.2、1_8.2及6.73.2—致表明未結合至表現 嵌合獼猴/人類MAdC AM蛋白質之獼猴組織及細胞。抗 MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2及6.73.2在獼猴/人類 MAdCAM/JY黏附檢定中亦不具有偵測功能性阻滯活性之 能力。 類似途徑可用於定義識別狗MAdCAM之抗MAdCAM抗 體6.14.2及6.67.1之抗原決定部位。 實例IV : 抗MAdCAM mAbs在以疾病診斷方法偵測循環可溶性 MAdCAM中之用途 抗MAdCAM抗體可用於偵測循環可溶性MAdCAM (sMAdCAM)。臨床血漿、血清樣品或其它生物流體諸如（但 98487.doc -109- ⑧ 不限於）糞便、尿、唾液中sMAdC AM之偵測可能為潛在疾 病包括（但不限於）炎性腸疾病之適用替代疾病生物標誌。 基於抗原決定部位裝庫資料（表7及8)，抗MAdCAM抗體 1.7.2及7.16.6似乎識別人類MAdCAM上之不同抗原決定 部位。£二18八板在4。(：下以1〇〇卩1^/孔之5〇4£/111[1.7.2於磷 酸鹽緩衝鹽水（PBS)中之溶液塗布隔夜。培養之後，板以 含10%牛奶之PBS阻滯緩衝液（200 pL/孔）卩尋滯1.5小時。培 養之後，板以PBS(2xl00 μΙ7孔）洗滌且在PBS中自50 pg/mL之最高濃度降至約5 ng/mL至100 μί之終容積之 MAdCAM-IgGl-Fc融合蛋白質之連續稀釋物添加至板 中，在室溫下培養2小時。在一類似途徑中， MAdCAM-IgGl-Fc蛋白質可稀釋於血漿或血清或某種其 它相關生物流體中且如下文所述用於測定臨床樣品中可 溶性MAdCAM之表現。作為陰性對照組，僅緩衝液添加至 含有初級抗MAdCAM抗體之孔中。該時間之後，板以 PBS(3xl00 μΐ^/孔）洗滌且板隨後在黑暗中以Alexa488-標 記之7.16.6(1〇〇41^，5 08/!111^)培養。人.16\&488-標記之7.16.6 使用購得套組（Molecular Probes，A-20181)遵循製造商方 案產生。 板以含有〇.〇5°/。吐溫-20之PBS洗滌，且標記之7.16.6結 合至捕獲之可溶性MAdCAM藉由量測螢光（Wallac Victor2 1420多標記讀取器，激發λ485ηπι，發射λ535ηιη，自頂部 自板底部8 mm處以標準發射孔徑計數歷經〇. 1 sec)來測 定。當圖6標繪螢光為MAdCAM-IgGl-Fc融合蛋白質濃度 98487.doc -110- 1363762 之函數時，其指示1.7.2及標記之7.16.6可用於診斷目的以 測定表現於生物流體或臨床樣品中之循環可溶性 MAdCAM之含量。該夾心ELISA途徑不限制於1.7.2及 7.16.6之使用，而可用於識別MAdCAM上不同抗原決定部 位之抗MAdCAM抗體之任何組合，此如表7及圖5之資料及 解釋所概述。類似策略可用於發展類似檢定諸如免疫組織 化學及西方轉潰，其藉由所述之其它抗MAdC AM抗體使用 不同搭配物、變體、標記等。 實例V : 根據本發明製備之抗MAdCAM mAbs之胺基酸結構 在下列論述中，提供與根據本發明製備之抗MAdCAM mAbs相關之結構信息。 為了分析根據本發明產生之mAbs結構，吾人選殖了編 碼來自特異性融合瘤純系之重鏈及輕鏈片段之基因。基因 選殖及定序完成如下： 聚（A)+mRNA自源於免疫XenoMouse小鼠之約2x105融 合瘤細胞使用Fast-Track套組（Invitrogen)分離。產生隨機 啟動cDNA，而後進行PCR。人類VH或Vk家族特異性引子 (Marks等人，'Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes' ; Eur. J. Immunol.，21，985-991(1991))或通用人類 VH 引子 MGJOP-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI 〇〇-3(8£卩1〇]^〇:108)與對人類€丫2具特異性之引子、 98487.doc 1363762
MG40-d(5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3(SEQ ID 1^〇:109)或對€丫4恆定域具特異性之引 子 ' MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA <：丁0丁-3(5£(5 10 1^0:110)或(^恆定域（1^?2;如先前0代611 等人，1994中所述）結合使用。來自融合瘤之人類mAb衍 生之重鏈及κ鏈轉錄物之序列藉由自聚（A+)RNA使用上述 引子產生之PCR產物之直接定序獲得。PCR產物使用 TOPO-TA選殖套組（Invitrogen)選殖至pCR2.1中且雙鏈使 用Prism染料終止劑定序套組及ABI 377定序機器定序。所 有序列藉由與'V BASE序列目錄（sequence directory)'排列 對比（Tomlinson等人，J. Mol. Biol·，227, 776-798(1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860(1994) ； EMBO J., 14, 4628-4638(1995)。）分析。 此外，各個抗體 1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1 、 6·73·2 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4 、 9.8.2 、 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 及 7.26.4-mod經受全長DNA定序。為此總RNA使用RNeasy套 組（Qiagen)自約3-6x106融合瘤細胞分離。mRNA使用寡dT 及基於AMV之反轉錄酶系統（Promega)反轉錄。VBASE用 於設計含有最佳Kozak序列及ATG起始密碼子（下劃線）之 5'特效擴增引子及表10中描述之特效重鏈及κ鏈之3'反置 引子。 表10:用於自抗MAdCAMmAb表現融合瘤之cDNA擴增 之PCR引子對及用於抗MAdCAM抗體修飾變體之建構的 98487.doc -112- 1363762 引子。 ：wm ： VHX-18 VH3-15 VH3-21 VH3-23 VH3-30 VH3-33 VH4-4 5，TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTT V (SEQ ID NO: 70) 5r TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATT 3f (SEQ ID NO: 71) 5' TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGMCTGGGGCTCCGCTGGGTT V (SEQ ID NO: 72) 5, TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTT 3， (SEQ ID NO: 73) 5, TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT 3f (SEQ ID NO： 74) 5r TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT y (SEQ ID NO： 75) 5* TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTC 3f (SEQ ID NO: 76) __ A2/A3 A2 6 B3 012 018 5, TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTG 3f (SEQ ID NO： 11) 5, TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACTCATTGGG 3r (SEQ ID NO: 78) 5, TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTC 3f (SEQ ID NO: 7 9) 5， TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG 3r (SEQ ID NO： 80) 5, TATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAG (SEQ ID NO： 81) __
RevIgG2 RevIgG4 RevKappa 6.22.2VK_F1 6.22.2VK_R1 6.22.2VH_F1 (6.22.2VH_R1 6.22.2VH CS^* 6.34.2VK_F1 6.34.2VK_R1 6.34.2VK_F2 6.34.2VK_R3 6.34.2VH_F16.34 .2VH R1
6.67.1VK_F1 6.67.1VK_R1 6.67.1VH FI 98487.doc 5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3r (SEQ ID NO: 82) 5, TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC (SEQ ID NO： 83) 5, TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3r (SEQ ID NO: 84) 5，-GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AAT AGC CTG GAA (SEQ ID NO: 85) S^GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC-3f (SEQ ID NO: 86) -GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3f (SEQ ID NO： 87) 5r-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC-3f (SEQ ID NO： 88) 5f-CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3f (SEQ ID NO: 89) 5,-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CC-3,（SEQ ID NO; 90) 5,-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA CTA ATA CTC TGA CTT GC-3r (SEQ 工D NO: 91) 5,-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT ACT GTC ACC-3,（SEQ ID NO： 92) 5f'GGT GAC AGT AGT AAG TTG CAA AAT CCT CAG GTT GCA GAG AAC TGA TGG-3f (SEQ ID NO: 93) 5'-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G-3f (SEQ ID NO: 94) 5'-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG 03,（SEQ ID NO: 95)
-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACA GAA ACC AGG ACA GCC-3f (SEQ ID NO: 96) S^GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTA TTG-3, (SEQ ID NO: 97) 5ΚΧ TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA ACC-3, (SEQ ID • 113 - 1363762 • . - ·' . · * *·— — * τ ^ . . _ . * ；,. 6.67.1VH_R1 6.67.1VH CS* NO: 98) 5'-GGT TCT TGG ACG TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA GGG-3, （SEQ ID NO: 99) 5'-ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3, （SEQ ID NO: 100) 6.77.1VK—F1 5，-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3f (SEQ ID NO: 101) 6.77.1VKJU 5,-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3' (SEQ ID NO: 102) 6.77.1VK—F2 S^GGT TTA TTA CTG CAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC -3/ (SEQ ID NO: 103) 6.77.1VK一R2 5f-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AAA CC -3, (SEQ ID NO: 104) 7.26.4K F1 5,-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3,（SEQ ID NO: 105) 7.26.4K R1 5f-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3f (SEQ ID NO: 106) 引子對使用擴展高置信度Taq聚合酶（Roche)以擴增 _ cDNAs，且 PCR產物選殖至pCR2.1 TOPO-TA(Invitrogen) 中用於隨後定序。重鏈及κ輕鏈序列驗證之純系隨後分別 使用 Xbal/EcoRI 及 Hindlll/EcoRI 位點選殖至 ρΕΕ6.1 及 ρΕΕ12·1 載體（LONZA)中。 基因利用之分析 表11顯示本發明中所概述各融合瘤之重鏈及κ輕鏈基因 利用。 表11 :重鏈及κ輕鏈基因利用 -114 - 98487.doc 1363762
VH
重鏈 D
JH ϊ 鏈 輕·
JK -:1¾¾mmm'mm% 純系 1.7.2 1.8.2 7.16.6 7.20.5 7.26.4 VH3-15 D6-19 JH4b VH3-15 D6-19 JH4b VH1-18 D6-6 JH6b VH4-4 D3-10 JH6b VH1-18 D6-6 JH6b VH3-23 D5-5 JH4b VH3-33 D5-12 JH6b VH3-30 D4-23 JH6b VH4-4 D3-10 JH4b VH3-23 D6-19 JH6b VH3-21 D6-19 JH6b VH3-33 D3-10 或 D3-16 JH4b 5 = 2^01220120^8
t%·2-¢/ yt ,···/fc κκκκκκκκ JJJJJJJJ K2K2K5 lgG2 igG4^： ： v 序列分析 為進一步研究抗體結構，抗體之預測胺基酸序列自獲得 於純系之cDNAs獲得。 序列識別號（SEQ ID ΝΟ:)1-48及51-68提供抗厘八4€八^1 抗體 1.7.2(SEQ ID NOS 1-4)、1.8.2(SEQ ID NOS 5-8)、 6.14.2(SEQ ID NOS 9-12)、6.22.2(SEQ ID NOS 13-16)、 6.34.2(SEQ ID NOS 17-20)、6.67.1(SEQ ID NOS 21-24)、 6.73.2(SEQ ID NOS 25-28)、6.77.1(SEQ ID NOS 29-32)、 7.16.6(SEQ ID NOS 33-36)、7.20.5(SEQ ID NOS 37-40)、 7.26.4(SEQ ID NOS 41-44)、9.8.2(SEQ ID NOS 45-48)及修 飾抗 MAdCAM 抗體 6.22.2-mod(SEQ ID NOS 51-54)、 6.34.2-mod(SEQ ID NOS 55-58) ' 6.67.1-mod(SEQ ID NOS 59-62)及 6.77.1_mod(SEQ ID NOS 63-66)及 7.26.4-mod(SEQ ID NOS 41-42、67-68)之重鏈及輕鏈核苷 酸及胺基酸序列。對於選殖之每個抗MAdCAM抗體序列， 訊號肽序列（或編碼相同之鹼基）之序列以小寫且劃下劃
98487.doc -115 - (D 1363762 線指示。 圖 1A-1J提供抗體 1.7·2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、 6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4及 9.8.2之 預測重鏈胺基酸序列與各種株基因產物之胺基酸序列之 間之序列排列對比。在抗體之CDR1、CDR2及CDR3序列 位置下面劃線’相應種株序列之表現序列之間之差異以黑 體指示且相對於種株在表現序列中存在添加時，種株序列 中該等以（-)指示》 圖 1Κ-1Τ提供抗體 ι·7_2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、 6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4及 9.8.2之 預測κ輕鏈胺基酸序列與各種株基因產物之胺基酸序列之 間之序列排列對比。在抗體之CDR1、CDR2及CDR3序列 位置下面劃線，相應種株之表現序列之間之差異以黑體指 示且相對於種株在表現序列中存在添加時，種株序列中該 等以（-)指示。 後轉譯修飾之存在：糖基化及脫醯胺：
表現之抗MAdCAM抗體序列中一些改變之作用與衍生 種株序列相比係引入潛在可經受N-連接糖基化（Asn-X-Ser/Thr)及/或脫醯胺（Asn-Gly)(參見表12)之殘基。編碼抗 MAdC AM抗體 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4 及9·8·2之κ輕鏈可變域胺基酸序列（SEQ ID NOS:16、20、 24、28、32、44及48)及抗體6.14.2重鍵可變域（SEQ ID NO·· 1 〇)之核酸序列預測N_連接糖基化之存在。該後轉譯修 飾之存在使用SDS-PAGE及Pro-Q® Emerald 488糖蛋白 98487.doc .116- 1363762 (Molecular Probes)之組合使 mAbs 6.22.2、6.34.2、6.67.1、 6.73.2、6.77.1、7.26.4 及 9.8.2 染色來研究。 簡言之，約2 pg之還原抗MAdCAM抗體使用MOPS緩衝 液裝載於4-12% SDS聚丙烯醯胺凝膠上。電泳之後，凝膠 固定於50% MeOH、5%醋酸中且洗滌於3%醋酸中。凝膠 上之任何碳水化合物隨後以高碘酸氧化且使用Pro_Q® Emerald 488糖蛋白染色套組（Molecular Probes)染色。最終 洗滌步驟之後，糖蛋白染色使用設定在473 nm波長下之螢 光掃描儀顯影。 糖蛋白染色之後，凝膠使用SYPRO Ruby蛋白凝膠染色 為總蛋白染色且使用設定在473 nm波長下之螢光掃描儀 分析。抗 MAdCAM 抗體 6·22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、 6.77.1、7.26.4及9.8.2之κ輕鏈均陽性染色以驗明糖基化之 存在。作為額外之證實，抗MAdCAM抗體7.26.4經受胰蛋 白酶/糜蛋白酶消化，LC-MS/MS分析證實修飾胰蛋白酶肽 之存在且提供κ輕鏈糖基化之額外證實。 抗 MAdCAM抗體 1.7.2、1.8.2、6.22.2 及 7.20.5 之 CDR1 區中特異Asn-Gly序列使該等區對脫醯胺敏感。在中性pH 下脫醯胺引入負電荷且亦可導致可影響抗體性質之β-異 構化作用。對於抗MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2及7.20.5，脫 醯胺基化Asn-異天冬醯胺酸酯殘基之存在在以MeOH捕獲 異天冬醯胺酸酯側鏈後藉由質譜術來評定。 簡言之，對於抗MAdCAM抗體1.7.2，選擇胰蛋白酶 /Asp-N肽 SSQSLLQSNGYNYL(SEQ ID NO:69)(1573.7 Da) 98487.doc 117 1363762 之狀態用於藉由LC-MS/MS監測。抗MAdCAM抗體1.7.2在 1 0 mM DTT中還原、烷基化於5 mM碘醋酸鈉中且隨後緩 衝液交換於胰蛋白酶消化緩衝液（50 mM Tris-HCl、1 mM CaCl2、pH值7.6)中〇抗體隨後與測序級修飾之騰蛋白酶 (Promega)混合於1:20之蛋白酶：蛋白質比率中。蛋白質在 30°C下於胰蛋白酶中消化15小時，且所得肽藉由HPLC使 用C-18 RPC於Ettan LC系統上分離。含33Asn之肽（4032 Da) 自柱收集且稀釋於Asp-N消化緩衝液中（50 mM磷酸鈉緩 衝液，pH值8.0)。内切蛋白酶Asp-N (Roche)隨後以約10 : 1之肽：酶比率添加。 乙醯氣（100 μΙ〇添加至曱醇（1 mL，-20°C)樣品中，混合 物溫至室溫。胰蛋白酶+Asp-N消化液在Speed-Vac中乾燥 且隨後添加5 pL之甲醇/乙醯氯（45分鐘，室溫），隨後在 Speed-Vac中再乾燥。所得殘基重構於0.1% TFA中且肽初 始於Voyager-DE STR MALDI-TOF質譜儀上使用硝化纖維 素薄層樣品製備方法或使用C18 ZipTips(Millipore)逆相 純化繼之與α-氰基基質進行液滴混合而分析。甲基化肽混 合物亦如上使用LC-MS/MS於Deca XP Plus離子阱質譜儀 上分析。溶離液直接垂直進入離子阱MS且肽隨後藉由MS 及MS/MS分析。MS經設定以分析300及2000 Da之間之所 有離子。在任何特定掃描中之最強離子隨後經受MS/MS 分析。 98487.doc -118 - ⑧ 1363762 表12.抗MAdCAM抗體之後轉譯修飾
重錢 ί /C輕鏈 純化 糖基化（NXS/T) 證實 糖基化<NXS/T} 證實 脫醯胺…G> 證實 1.7.2 LQSNGYN MS 1.8.2 LQSNGYN MS 7.16.6 7.20.5 HGNGYNY MS 7.26.4 CKSNQSLLY MS/PAGE Ι6]ίΐ：4.2 TFNNSAMT N.D SGTNFTLTI PAGE LTINGLEA N.D ASQNISSYL PAGE SSNNKTYLA PAGE mw RASQNITN PAGE ,8.77.1^ SCNSSQSL PAGE HSDNLSIT PAGE lgG2
jg^Z 突變形成研究：
本發明例示之抗MAdCAM抗體之初級胺基酸序列可藉 由位點定向突變形成而修飾以移除後轉譯修飾（例如糖基 化、脫醯胺）之潛在位點或改變同型背景或設計可改良治 療效用之其它變化。例如PCR用於設計抗MAdCAM抗體 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1 及 7.26.4之改變以將某些骨 架序列回復為種株、以移除潛在糖基化位點及/或以改變 同型背景為人類IgG2。對應於重鏈核苷酸SEQ ID NOS: 13、17、21及 29及 κ輕鏈核苷酸 SEQ ID NOS: 15、19、 23、31及 43 之 pCR2.1 TOPO-TA選殖之 cDNAs(100 ng)在一 系列使用交疊延伸之PCR中用作模板且引子組之群描述 於表10中。
6.22.2 重鏈：PCR 引子組 6.22.2_VH_F1 及 6.22.2VH _CS*(1)及 VH3-33 及 6.22.2_VH_R1(2)用於產生分離 PCR 產物（1)及（2)，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ
98487.doc 119 - IDNO:13表示之pCR2.1TOPO-TAcDNA模板（100ng)。產 物（1)及（2)純化且連同VH3-33及VK6.22.2_CS*引子組合 於第三PCR步驟中（各約50 ng)以產生修飾6.22.2重鏈V-域。該修飾變體在FR1中含有His/Phe突變且引入Xbal限制 位點以能夠骨架方式選殖至ρΕΕ6· 1衍生載體，命名為 PEE6.1CH，其含有相應人類IgG2恆定域。最終PCR片段選 殖至pEE6.1CH之Xbal位點，檢查定向且證實插入物全序 列。修飾6.22.2重鏈之核苷酸序列可見於SEQIDNO:51且 相應胺基酸序列在SEQ ID NO:52中。指示與親本相比之核 苷酸及胺基酸序列中之改變。 6.22·2κ 輕鏈：PCR 弓| 子組 6.22.2_VH_F1 及 revKappa(l) 及A26及6.22.2_VH_R1(2)用於產生分離PCR產物（1)及 (2)，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID ΝΟ·.15 表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。產物（1)及（2) 純化且連同A26及revKappa引子組合於第三PCR步驟中 (各約50 ng)以產生修飾6.22.2κ輕鏈V-域。該修飾變體在 FR3序列中含有Asn/Asp及Gly/Ser改變。所得PCR產物使用 Hindin/EcoRl位點選殖至pEE12.1且證實全序列。修飾 6.22.2<輕鏈之核苷酸序列可見於8£卩1〇1^0:53且相應胺 基酸序列在SEQ ID NO:54中。指示與親本相比之核苷酸及 胺基酸序列中之改變。 6.34.2 重鏈：PCR 引子組 6.34.2_VH_F1 及 6.22.2VH_CS*(1)及 VH3-30 及 6.34.2_VH_R1(2)用於產生 分離PCR產物（1)及（2)，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸 98487.doc -120- 1363762 序列 SEQ ID NO:17 表示之 pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板 (100 ng)。產物（1)及（2)純化且連同 VH3-30及 VK6.22.2_ CS*引子組合於第三PCR步驟中（各約50 ng)以產生修飾 6.34.2重鏈7-域。該修飾變體在卩113中含有8617八^突變且 引入Xbal限制位點以能夠骨架方式選殖至ρΕΕ6· 1衍生載 體，命名為PEE6.1CH，其含有相應人類IgG2恆定域。最 終PCR片段選殖至PEE6.1CH之Xbal位點，檢查定向且證實 插入物全序列。修飾6.34.2重鏈之核苷酸序列可見於SEQ ID NO:55且相應胺基酸序列在SEQ ID NO:56中。指示與親 本相比之核苷酸及胺基酸序列中之改變。 6.34.2k 輕鏈：PCR 引子組 012 及 6.34.2_VK_R1(1) 6.34.2—VK—F1 及 6.34.2_VH一R2(2)，及 6.34.2_VK_F2 及 revKappa(3)用於產生分離PCR產物（1)、（2)及（3)，此係使 用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO: 19表示之 pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。產物（1)、（2)及（3) 純化且（1)及（2)連同012及6.34.2_VK_R2引子組合於第三 PCR步驟中（各約50 ng)以產生PCR產物（4)。PCR產物（2) 及（3)連同6.34.2_VK_F1及revKappa組合於第四PCR步驟 中（各約50 ng)以產生PCR產物（5)。PCR產物（4)及（5)純化 且與引子012及revKappa組合於一起（各約50 ng)以產生修 飾6.34.21<輕鏈乂-域。該修飾變體在0〇111中含有八811/861*改
Ser/Tyr改變於FR3序列中。所得PCR產物使用 Hindlll/EcoRl位點選殖至ρΕΕ12·1且證實全序列。修飾 98487.doc -121 - 6.34·2κ輕鏈之核苷酸序列可見於SEQ ID NO:57且相應胺 基酸序列在SEQ ID ΝΟ··58中。指示與親本相比之核苷酸及 胺基酸序列令之改變。 6.67.1 重鏈：PCR 引子組 6.67.1_VH_F1 及 6.67.1VH_CS* (1) 及VH4-4及6.67.1_VH_R1(2)用於產生分離PCR產物（1) 及（2)，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID N0:21表示之 pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。產物（1) 及（2)純化且連同VH4-4及VK6.67.1_CS*引子組合於第三 PCR步驟中（各約50 ng)以產生修飾6.67.1重鏈V-域。該修 飾變體在FR3中含有Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val轉化且引入 Xbal限制位點以能夠骨架方式選殖至pEE6.1衍生載體，命 名為PEE6.1CH，其含有相應人類IgG2恆定域。最終PCR片 段選殖至pEE6.1CH之Xbal位點，檢查定向且證實插入物 全序列。修飾6.67.1重鏈之核苷酸序列可見於SEQ ID NO:59且相應胺基酸序列在SEQIDNO:60中。指示與親本 相比之核苷睃及胺基酸序列中之改變。 6.67.1κ 輕鏈：PCR 弓| 子組 6.67.1_VK_F1 及 revKappa(l) 及B3及6.67.1_VK_R1(2)用於產生分離PCR產物（1)及 (2) ，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO:23 表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。產物（1)及（2) 純化且連同B3及revKappa引子組合於第三PCR步驟中（各 約50 ng)以產生修飾6.67.1κ輕鏈V-域。該修飾變體在CDR1 中含有Thr/Asn改變且在FR2中Arg/Gly改變。所得PCR產物 使用Hindlll/EcoRl位點選殖至pEE12.1且證實全序列。修 98487.doc -122- 1363762 飾6.67·1κ輕鏈之核苷酸序列可見於SEQ ID N0:61且相應 胺基酸序列在SEQ ID NO:62中《指示與親本相比之核苷酸 及胺基酸序列中之改變。 6.77.1重鏈：PCR引子組 VH 3-21 及 6.22.2VH_CS*用於產 生單一 PCR產物，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列 SEQ ID NO:29 表示之 pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。PCR產物以Xbal消化、凝膠純化且選殖至pEE6.1CH 之Xbal位點，檢查定向。證實插入物全序列。修飾6.77.1 重鏈之核苷睃序列可見於SEQ ID NO:63且相應胺基酸序 列在SEQ IDNO:64中。指示與親本相比之核苷酸及胺基酸 序列中之改變。 6,77.11«輕鏈：？。11引子組八2及6.77.1_¥〖_111(1)'6.77.1_ VK_VK_F1 及 6.77.1_R2(2)及 6.77.1_VK_F2 及 revKappa(3) 用於產生分離PCR產物（1)、（2)及（3)，此係使用擴展Taq 聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO:31表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板（100 ng)。產物（1)、（2)及（3)純化且⑴ 及（2)連同A2及6.77.1_VK_R2引子組合於第三PCR步驟中 (各約50 ng)以產生PCR產物（4)。PCR產物（2)及（3)連同 6.77.1_VK_F1及revKappa引子組合於第四PCR步驟中（各 約50 ng)以產生PCR產物（5)。PCR產物（4)及（5)純化且與引 子A2及JK2組合於一起（各約50 ng)以產生修飾6.77.1κ輕 鏈V-域。該修飾變體在CDR1中含有Asn/Lys改變，在FR3 中Ser/Tyr改變及在CDR3序列中Cys/Ser殘基改變。所得 PCR產物使用Hindlll/EcoRl位點選殖至ρΕΕ12·1且證實全 98487.doc -123- ⑧ 1363762 序列。修飾6.77.11<：輕鏈之核苷酸序列可見於5£(51〇]^0:65 且相應胺基酸序列在SEQ ID NO:66中。指示與親本相比之 核苷酸及胺基酸序列中之改變。
7·26·4κ輕鏈：pCR引子組 7.26.4_VK F1&revKappa⑴ 及A2及7.26.4_VK_R1(2)用於產生分離PCR產物（1)及 (2)，此係使用擴展Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO:43 表示之 pCR2.1 TOPO-TAcDNA 模板（100 ng)。產物⑴及（2) 純化且連同A2及revKappa引子組合於第三PCR步驟中（各 約50 ng)以產生修飾7.26.4κ輕鏈V-域。該修飾變體在CDR1 中含有Asn/Ser改變。所得PCR產物使用Hindlll/EcoRl位點 選瘦至pEE 12.1且證實全序列。修飾7.26.4k輕鍵之核普酸 序列可見於SEQ ID NO:67且相應胺基酸序列在SEQ ID NO:68中。指示與親本相比之核苷酸及胺基酸序列中之改 變〇
功能性真核表現載體係用於6.22.2、6.34.2、6.67.1、 6.77.1 及 7.26.4之各修飾變體（稱為 6.22.2-mod、6.34.2-mod 、 6.67.1-mod 、 6.77.1-mod 及7.26.4-mod) ， 且該 載體分 別表示重鏈核苷酸序列SEQ ID NOS:5 1、55、59、63及41 及相應胺基酸序列SEQ ID NOS:52、56、60、64及42及κ 輕鏈核苷酸序列SEQ ID NOS:53、57、61、65及67及相應 胺基酸序列SEQ ID NOS:54、58、62、66及68，其組合如 下：對應於 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod 及 6.77.1-mod之重鏈cDNA插入物藉由NotI/SalI自pEE6·lCH 載體切離、7.26.4重鏈之親本變體藉由Notl/Sall自ρΕΕ6·1 98487.doc •124- 1363762 載體切離且純化片段選殖至含有K.輕鏈核苷酸序列 6.22.2- mod' 6.34.2-mod' 6.67.1-mod' 6.77.1-modA 7.26.4-mod修飾變體相應ρΕΕ12·1載體中之同一位點。證實載體之 序列且純化量用於以HEK 293Τ細胞進行之瞬時轉染。簡 言之，轉染之前一天9χ106 HEK 293Τ細胞接種於Τ165燒瓶 中且在Optimem中洗滌，以對應於6.22.2-mod、 6.34.2- mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod 及 7.26.4-mod 之載體 cDNAs(40 pg)使用 Lipofectamine PLUS (Invitrogen)根據 製造商說明書瞬間轉染。細胞培養3 hrs，隨後轉染培養基 以含 1 0°/。超低 IgG胎牛血清（Invitrogen 16250-078)及 L-楚 醯胺酸之 DMEM(Invitrogen 21969-035)培養基（50 mL)置 換。5天之後收集培養基上清液，濾液無菌化且抗MAdCAM 抗體使用蛋白質G瓊脂糖親和層析法以與上述類似之方式 純化。回收之抗體量（20-100 pg)藉由Bradford檢定法定量。 對應於6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1 -mod、6.77.1 -mod 及7.26.4-mod之親和純化抗體之抗MAdC AM活性以先前 所述之MAdCAM-IgGl-Fc融合檢定法來評定。與其源自之 親本抗MAdCAM抗體比較，該等抗MAdCAM抗體之IC50 值列於表13中。上述胺基酸取代對修飾抗MAdC AM抗體活 性之最小影響與其親本比較係最小的《抗體亦保持其結合 至表現重組人類MAdC AM或獮猴/人類MAdCAM嵌合體之 CHO細胞上。 表13.與其親本比較，抗MAdCAM抗體6.22.2-mod、 6.34.2- mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod及 7.26.4-mod修部變 98487.doc -125- ⑧ 1363762 體之活性。 純系 MAdCAM lgG1 Fc 融合 檢定平均値丨C5〇bg/mL) 親本 修飾 6.22.2 0.018 0.058 6.34.2 0.013 0.049 6.67.1 0.013 0.037 6.77.1 0.022 0.077 7.26.4 0.021 0.033
實例VI 外周循環中藉由阻滯抗MAdCAM抗體之p7+淋巴細胞之 增加 一檢定法經發展以驗明且關聯化抗MAdCAM抗體之機 械效應與其在血液中循環含量。抑制性抗MAdCAM抗應具 有抑制表現〇1407整合素之白血球募集至胃腸道之效應。承 載α4β7整合素之白血球之類別因此應限制於外周循環。 此以全人抗人類MAdCAM mAb 7.1 6.6在獼猴中論證。 純化抗 MAdCAM mAb 7.16.6(1 mg/kg)或媒劑（20 mM 醋酸納、0.2 mg/mL聚山梨醇自旨80、45 mg/mL甘露醇及0.02 mg/mL EDTA於pH值5.5下）以類似方式藉由靜脈内給藥經 由隱靜脈至兩組獼猴（n=4/組）評定。給藥後3天血液樣品藉 由股靜脈穿刺術收集於EDTA試管中。與獼猴α4β7整合素交 叉反應之LPAM特異抗體不能購得，因此使用抗β7抗體（識 別α4β7及αΕβ7整合素）代替。根據下表表15之抗體（30 μΙ〇 添加至含有100 μί獼猴血液之試管中，輕輕旋動混合且在 4°C下培養20-30分鐘。 表15.用於獮猴金液免疫表型化之抗體（BD Pharmingen) 98487.doc -126-
目錄號 抗體或同型 555748 mlgGl、k-FITC 555844 mIgG2a、k-PE 559425 mlgGl-PerCP 555751 mlgGl ' k-APC 555728 CD 28-FITC 555945 β7-ΡΕ 558814 CD 95-APC 550631 CD 4-PerCP 1363762 向每個試管中添加1 mL之1:10 FACSlyse溶液（BD # 349202) ’藉由輕輕漩動混合且在室溫下黑暗中培養約12 分鐘直至紅血球溶解完全。然後2 mL之BD染色緩衝液（# 554656)添加至各試管、混合且在室溫下以250 X g離心分 離6-7分鐘。上清液傾析且小球重懸浮於3 mL染色緩衝液 中、再混合且在室溫下以250 X g離心分離6-7分鐘。含有 w/v三聚甲醛（1〇〇 μΙ〇之CytoHx緩衝液（BD # 554655)添加 至來自猴外周血液之細胞小球中且藉由低/中等速度之漩 渦機完全混合。樣品在黑暗中保持在4°C下直至其獲得於 FACSCalibui^。恰在獲得之前，PBS(100 μΙ〇在獲得前立 即添加至所有試管中。CD4 + p7+CD951oCD28+(初始 (naifve))、CD4+p7+CD95hiCD28+(中樞記憶）、CD4+p7-CD95hiCD28+(中樞記憶）、CD4+p/CD95hiCD28-(效應器記 憶）之絕對細胞數目藉由適當門控及象限分析獲得。其它T 細胞子集例如CD8+ T中樞記憶細胞.（p7 + CD8+CD28 + CD95+) 及承載MAdC AM配位體之任何其它白血球亦可藉由該方 法以適當抗體分析。與媒劑對照組相比，抗MAdC AM mAb 7·16·6引起如圖7所示循環CD4+p7+CD95hiCD28+中樞記憶 98487.doc -127 - ⑧ T細胞含量增加約3倍。對循環CD4 + p7-CD95hiCD28+中樞 記憶T細胞集落無作用，此指示抗MAdCAMmAb7.16.6i 作用具有對於内臟歸巢T細胞的特異性。獼猴中抗 MAdCAM mAb 7.16.6對循環（〇14邛7+淋巴細胞集落之作用 指示此為機制生物標誌之有力替代證據，尤其在臨床環境 之實際應用之情形中。 序列 SEQ ID ΝΟ:1-48及51-68提供十二種人類抗MAdCAM抗 體之重及κ輕鏈核苷酸及胺基酸序列、獼猴MAdCAM α4β7 結合域序列之核苷酸及胺基酸序列及五個修飾人類抗 MAdCAM抗體之核苷酸及胺基酸序列。 SEQ ID NO: 1-48提供十二種人類單株抗MAdCAM抗體 之重及κ輕鏈核苷酸及胺基酸序列：1.7.2(SEQ ID NO: 1-4)、1.8.2(SEQ ID NO: 5-8)、6.14.2(SEQ ID NO: 9-12)、 6.22.2(SEQ ID NO: 13-16) ' 6.34.2(SEQ ID NO: 17-20) ' 6.67.1(SEQ ID NO: 21-24) > 6.73.2(SEQ ID NO: 25-28) ' 6.77.1(SEQ ID NO: 29-32)、7.16.6(SEQ ID NO: 33-36)、 7.20.5(SEQ ID NO: 37-40)、7.26.4(SEQ ID NO: 41-44)及 9.8.2(SEQ ID NO: 45-48)。 SEQ ID NO:49-50提供獼猴MAdCAM α4β7結合域之核苷 酸及胺基酸序列。 SEQ ID NO:51-68提供修飾單株抗MAdCAM抗體之重及 κ輕鏈核苷酸及胺基酸序列：6.22.2(SEQ ID NO: 51-54) ' 修飾 6.34.2(SEQ ID NO: 5 5-5 8)、修飾 6.67.1 (SEQ ID NO: 98487.doc •128- 1363762 59-62)、修飾 6.77.1(SEQ ID NO: 63-66)及修飾單株抗 MAdCAM抗體之κ輕鏈核苷酸及胺基酸序列:修飾 7.26.4(SEQ ID NO: 67-68)。 SEQ ID NOS: 70-106及108-110提供各種引子序列。 圖解： 訊號序列：加下劃線之小寫 與親本比較，修飾抗MAdCAM抗體序列胺基酸之改變：加 下劃線之大寫
SEQ ID NO. 1
1.7.2重鏈核苷酸序列
1 atcrqaqtttg qqctqaqctg qattttcctt qctqctattt taaaagqtqt 51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGCCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC 1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 98487.doc •129- ⑧ 1363762
1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA SEQ ID NO. 2 1.7.2預測重鏈蛋白質序列
1 mefqlswifl aailkqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVASGFTFTN 51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP 151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 201 SLSSWTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP 251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV 301 HNAKTKPREE QFNSTFRWS VLTWHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN 401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN 451 HYTQKSLSLS PGK
SEQ ID NO. 3 1.7.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqaqqctcc ctQCtcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qqqtctctqq 51 atccaqtqqq GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 4 1.7.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mrlpaqllql lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL
51 QSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK
151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS -130· 98487.doc 1363762
202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 5 1.8.2重鏈核苷酸序列
1 atqqaqtttQ qqctqaqctq qattttcctt qctqctattt taaaaqqtcft 51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGTCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC 1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA SEQ ID NO. 6 1.8.2預測重鏈蛋白質序列
1 mefqlswif1 aailkqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVVSGFTFTN 51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP 151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY 201 SLSSVVTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSMTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP 251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV 301 HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK -131 - 98487.doc 1363762
351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN
401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN
451 HYTQKSLSLS PGK SEQ ID NO. 7 1.8.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqaqqctcc ctgctcagct cctqqqqctq ctaatqctct qqqtctctcjci 51 atccaqtqqq GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTAATG GATTCAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGGTCAGGCA CAGATTTTAG ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NO. 8 1.8.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mrlpaqllql lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL 51 QSNGFNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO. 9 6.14.2重鏈核苷酸序列 1 atggagtttq gqctqagctq qctttttctt qtqgctattt taaaagqtgt
51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG
101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGACTCAC CTTTAACAAT
151 TCTGCCATGA CCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT
201 CTCAACTACT AGTGGAAGTG GTGGTACCAC ATACTACGCA GACTCCGTGA
251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACTCTC CCAAGAACAC GCTCTATCTG
301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGGC
351 CCGTGGATAC AGCTATGGTA CGACCCCCTA TGAGTACTGG GGCCAGGGAA 98487.doc •132- ⑧ 1363762
401 CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GTTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG 651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ATCATGCCCA 751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC 801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG 851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT 901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA 951 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC 1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA 1101 GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA 1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 1251 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA 1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTAA 1401 ATGA
SEQ ID NO. 10 6.14.2預測重鏈蛋白質序列
1 mefqlswlf1 vailkqvqcE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGLTFNN 51 SAMTWVRQAP GKGLEWVSTT SGSGGTTYYA DSVKGRFTIS RDSPKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCAARGY SYGTTPYEYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP 251 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD 301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 351 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 401 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 451 ALHNHYTQKS LSLSLGK SEQ ID NO. 11 6.14.2 κ輕鏈核苷酸序列 6.14.2 Kappa Light Chain Nucleotide Sequence 1 atqqacatga qggtccccgc tcagctcctq gggctcctqc tactctggct
51 ccqaqgqqcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT
101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCGGAGC -133 - 98487.doc 1363762
151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 AGTCCTGATC TTTTTTGTGT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAATT ACATTCCCCC 351 TATTACCTTC GGCCAGGGGA CACGACTGGA GATCAGACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA G SEQ ID NO. 12
6.14.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mdmrvpagll qllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASRS 51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKVLI FFVSSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQNYIPPITF GQGTRLEIRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG
151 TASWCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 202 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 13 6.22.2重鏈核苷酸序列 1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt 51 ccaqtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGACACAC CTTCAGTAGC 151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG 451 CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGG GCTGCCTGGT 501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA 651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 AGAGAGTTGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT 751 GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 98487.doc -134- ⑧ 1363762
951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCGCGCCTC CCGTGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGGA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG GTAAATGA SEQ ID NO. 14 6.2*2 .2預測重鏈蛋白質序列 '1 mefqlswvf1 vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGHTFSS 51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP 251 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TAPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSLGK
SEQ ID NO. 15 6.22.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqttqccat cacaactcat tqqqtttctq ctgctctaacr ttccaqcttc 51 caqqqqtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAAATTTC ACCCTCACCA TCAATGGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA SEQ ID NO. 16 98487.doc -135 ⑧ 1363762 6.22.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mlpsqliqfl llwvpasrqE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS
51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTNF TLTINGLEAE
101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS
151 VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC SEQ ID NO. 17 6.34.2重鏈核苷酸序列
1 atgqaqtttq qqctqagctq ggttttcctc qttqctcttt taaqaqgtqt 51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG 651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCATCA 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGQACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 GCCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG ACAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 18 6,34.2預測重鏈蛋白質序列 98487.doc 136 ⑧ 1363762
1 mefqlswvfl vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYff- D§.VKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLSAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS 251 CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSQ EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSLGK SEQ ID NO. 19 6.34 .2 κ輕鏈核苷酸序列 1 atqqacatqa qqqtccccqc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct 51 ccqaqqtqcc aaatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAT 151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGGACTCTG 301 CAACCTGATG ATTTTGCAAC TTACTCCTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA
SEQ ID NO. 20 6.3 4.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mdmrvpaqll qllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQN 51 ISSYLNWFQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTIRTL 101 QPDDFATYSC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 21 6.6 7.1重鏈核苦酸序列 1 atgaaacacc tgtqqttctt cctcctgctg gtqqcagctc ccagatqqgt 98487.doc •137· ⑧ 1363762
51 cctQtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT 151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 GTCGAGTCAC CATTTTAGCA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG 401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCCGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAGCTTGGGC ACGAAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGTCCA AATATGGTCC CCCATGCCCA 751 TCATGCCCAG CACCTGAGTT CCTGGGGGGA CCATCAGTCT TCCTGTTCCC 801 CCCAAAACCC AAGGACACTC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CAGGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG 901 TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA 951 GCAGTTCAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC 1051 CTCCCGTCCT CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG 1101 AGAGCCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCAGGAGGAG ATGACCAAGA 1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAGGCTAA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGGAGGGGA ATGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACA CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCTGGGTAAA TGA
SEQ ID NO. 22 6.67.1預測重鏈蛋白質序列
1 mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGR工 YTSGGTNSNP SLRGRVTILA DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP 251 SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW 301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV 451 MHEALHNHYT QKSLSLSLGK SEQ ID NO. 23 98487.doc -138 ⑧ 1363762 6.67.1 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqqtqttac aqacccaqqt cttcatttct ctqttqctct qqatctctqq 51 tacctacqqq GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA ACAATAAGAC CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAAG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 5〇1 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 7 01 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA
SEQ ID NO. 24
6.6 7.1預測κ輕鍵蛋白質序列
1 mvlqtqvfis lllwisQayq DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL 51 YSSNNKTYLA WYQQKPRQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C SEQ ID NO. 25 6.73 .2重鏈核苷酸序列 1 atqqaqtttq qqctqaqctg qctttttctt qtgqctattt taaaaqqtqt 51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGACTTG GTCCAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGAAGT 151 TATGCCATGA ACTGGGTCCG ACAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCAGTTATT AGTGGTCGTG GTGGTACTAC ATACTACGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACGCG GCCGTATATT ACTGTGCGAA 351 GATAGCAGTG GCTGGAGAGG GGCTCTACTA CTACTACGGT ATGGACGTCT 401 GGGGCCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CAGCTTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCCGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAACACAGC 501 CGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC 98487.doc 139- ⑧ 1363762
651 TAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGC 751 CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC 1301 TAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCTGGGT AAATGATAG
SEQ ID NO. 26 6.73.2預測重鏈蛋白質序列
1 mefqlswlf1 vailkqvqcE VQLLESGGDL VQPGGSLRLS CAASGFTFRS 51 YAMNWVRQAP GKGLEWVSVI SGRGGTTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDA AVYYCAKIAV AGEGLYYYYG MDVWGQGTTV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSENTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 201 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC 251 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K SEQ ID NO. 27
1 atqqacatqa qqqtccccqc tcaqctcctq gggctcctqc tactctqqct 51 ccqaqqtqcc aqatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGTGACAGA GTCACCTTCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAC 151 ATTACCAACT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AGGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCGT CCAGTTTGCC AAGAGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCCGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAGTT ACAGTAATCC 351 TCCGGAGTGC GGTTTTGGCC AGGGGACCAC GCTGGATATC AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 6.73.2 κ輕鏈核苷酸序列 98487.doc -140- ⑧ 1363762
501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 28 6.73.2預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mdmrvpaqll gllllwlrqa rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTFTCRASQN 51 ITNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASSLPRGV PSRFRGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQSYSNPPEC GFGQGTTLDI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO. 29 6.77.1重鏈核苷酸序列
1 atcrqaactqcr qqctccqctq qqttttcctt qttqctattt taqaagqtqt 51 ccaqtqtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTAC.TCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG AGTCCAAATA TGGTCCCCCA 751 TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT 801 GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG 851 TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC 901 AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG 951 GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC 1001 TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 1051 AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 1101 GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCAG GAGGAGATGA 1151 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTACCCCAGC 1201 GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA 1251 GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA 1301 GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG AGGGGAATGT CTTTTCACGC 98487.doc -141 - ⑧ 1363762
1351 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC
1401 CCTGTCTCTG GGTAAATGAT AGGAATTCTG ATGA SEQ ID NO. 30 6.77.1預測重鏈蛋白質序列
1 melqlrwvf1 vaileqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP 251 CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSQEDPEVQF 301 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN 351 KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS 401 DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSR 451 SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK
SEQ ID NO. 31 6.7 7.1 κ輕鏈核普酸序列
1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqqctq ctaatqctct qcratacctqq 51 atccaqtqca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA ACTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTCCTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 32 6.7 7.1預測κ輕鏈蛋白質序列
1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCNSSQSLL
51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM CSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 98487.doc -142- ⑧ 1363762
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 33 7.16.6重鏈核苷酸序列
1 atqqactgqa cctqqaQcat CCttttcttQ qtqqcaqcaq caacaqqtqc 51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 34 7.16.6預測重鏈蛋白質序列 1 51 101 151 201 251
mdwtwsilfl vaaatqahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS
YGINWVRQAP
DLRSLRSDDT
VFPLAPCSRS
QSSGLYSLSS
PCPAPPVAGP
GQGLEWMGWI
AVYYCAREGS
TSESTAALGC
WTVPSSNFG
SVFLFPPKPK
SVYSGNTNYA
SSSGDYYYGM
LVKDYFPEPV
TQTYTCNVDH
DTLMISRTPE
QKVQGRVTMT
DVWGQGTTVT
TVSWNSGALT
KPSNTKVDKT
VTCVVVDVSH
ADTSTSTAYM
VSSASTKGPS
SGVHTFPAVL
VERKCCVECP
EDPEVQFNWY 98487.doc •143- ⑧ 1363762
301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRWSVLTV VHQDWLNGKE 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ 451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 35 7. 16.6 κ輕鏈核苷酸序列 1 atqaqqctcc ctcrctcaqct cctqaQQCtq ctaatqctct 51 atccaqtqca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA 151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA 451 AAATCTGGM CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 36 7. 1 6.6 κ輕鏈蛋白質序列 1 mrlpaqllql lmlwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS 51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS 101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV 151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC YKCKVSNKGL VKGFYPSDIA QGNVFSCSVM ISCKSSQSLL GSGTDFTLKI FIFPPSDEQL QDSKDSTYSL qqatacctgq
CTGTCCGTCA
GAGCCTCCTG
AGCCAGGCCA
TCTGGAGTGC
ACTGAAAATC
TGCAAAATAT
ATCAAACGAA
TGAGCAGTTG
TCTATCCCAG
TCGGGTAACT
CTACAGCCTC
ACAAAGTCTA
ACAAAGAGCT SEQ ID NO. 37 7.20.5重鏈核苷酸序列
1 atqaaacacc tgtqqttctt cctcctqctq qtqgcaqctc 51 cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTAGCTC 151 TACCACTGGA ACTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGAGCACCAA CTACAACCCC 251 GTCGAGTCAC CATGTCACTA GACACGTCCA AGAACCAGTT 301 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT 98487.doc •144·
ccaqatqqqt GTGAAGCCTT CATCAGTAGT TGGAGTGGAT TCCCTCAAGA CTCCCTGAAG GTGCGAGAGA 1363762
351 GGGGGTCAGG TATTACTATG CTTCGGGGAG TTATTACTAC GGTCTGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCCTC CACCAAGGGC 451 CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCCGGGT AAATGA
SEQ ID NO. 38 7.20.5預測重鏈蛋白質序列
1 mkhlwff111 vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGSSISS 51 YHWNWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGSTNYNP SLKSRVTMSL DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCAREGVR YYYASGSYYY GLDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K SEQ ID NO. 39 7.20.5 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqaggctcc ctgctcagct cctggggctq ctaatqctct gqqtctctqq 51 atccaqtggg GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CATGGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA 145- 98487.doc 1363762
201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAAACTCTC ACTTTCGGCG GAGGGACCAA GGTGGAGATC AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 40 7 · 2 0.5預測κ輕鍵蛋白質序列
1 mrlpaqllql lmlwvsqssq DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL 51 HGNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO. 41 7.26.4重鏈核苷酸序列
1 atqqactqqa cctqqaqcat CCttttCttQ qtaacaqcaq caacaqqtqc 51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCGAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCG ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGCTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGTCC ACAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA CTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 98487.doc •146· ⑧ 1363762
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 43 7.26.4 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctcrqqcrctq ctaatqctct qaatacctqq 51 atccaqtqcq GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAATCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TTGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1402 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 42 7.26.4預測重鏈蛋白質序列 1 mdwtwsilfl vaaatqahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CEASGYTFTS 51 YGIDWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKLQGRVTMS TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA SEQ ID NO. 44 •147 98487.doc 1363762 7.26.4預測κ輕鏈蛋白質序列
LSVTPGQPAS ISCKSNQSLL SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL SGNSQESVTE QDSKDSTYSL TKSFNRGEC 1 51 101 151 201
mrlpaqllql lmlwipgssa DIVMTQTPLS YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV SEQ ID NO. 45 9.8.2重鏈核苷酸序列
1 atqgaqtttq 51 ccaqtqtCAG 101 GGAGGTCCCT 151 TATGGCATGC 201 GGCAGTTATA 251 AGGGCCGATT 301 CAAATGAACA 351 GGGGGCGTAC 401 CCTCAGCTTC 451 AGGAGCACCT 501 CTTCCCCGAA 551 GCGTGCACAC 601 AGCAGCGTGG 651 CTGCAACGTA 701 AGTCCAAATA 751 GGGGGACCAT 801 GATCTCCCGG 851 AAGACCCCGA 901 AATGCCAAGA 951 GGTCAGCGTC 1001 ACAAGTGCAA 1051 ATCTCCAAAG 1101 CCCATCCCAG 1151 TCAAAGGCTT 1201 CAGCCGGAGA 1251 CTCCTTCTTC 1301 AGGGGAATGT 1351 TACACACAGA
gqctqagctq qgttttcctc GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GAGACTCTCC TGTGCAGCGT ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA TGGTATGATG GAAGTAATGA CACCATCTCC AGAGACAATT GCCTGAGAGC CGAGGACACG CACTTTGCCT ACTGGGGCCA CACCAAGGGC CCATCCGTCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTTCCCGGCT GTCCTACAGT TGACCGTGCC CTCCAGCAGC GATCACAAGC CCAGCAACAC TGGTCCCCCA TGCCCATCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTCCAGTTC AACTGGTACG CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG CTCACCGTCC TGCACCAGGA GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA CTACCCCAGC GACATCGCCG ACAACTACAA GACCACGCCT CTCTACAGCA GGCTAACCGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG
gttgctcttt taaqaqqtqt GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG CTGGATTCAC CTTCAGTAGC GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT ATACTATGCA GACTCCGTGA CCAAGAACAC GCTGTATCTG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG GGGAACCCTG GTCACCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG CCTCAGGACT CTACTCCCTC TTGGGCACGA AGACCTACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG GCCCAGCACC TGAGTTCCTG AAACCCAAGG ACACTCTCAT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT TTCAACAGCA CGTACCGTGT CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT CGTCCTCCAT CGAGAAAACC CCACAGGTGT ACACCCTGCC GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CCCGTGCTGG ACTCCGACGG GGACAAGAGC AGGTGGCAGG ATGAGGCTCT GCACAACCAC GGTAAATGA SEQ ID NO. 46 9.8.2預測重鏈蛋白質序列 98487.doc -148 ⑧ 1363762
1 mefglswvf1 vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI WYDGSNEYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARGAY HFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS 151 RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL 201 SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPSCPAPEFL 251 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH 301 NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT 351 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 401 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH 451 YTQKSLSLSL GK SEQ ID NO. 47 9.8.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqqacatqa qqqtccctqc tcaqctcctq aaactcctac tqctctqcyct 51 ctcaqtcqca qqtcjccaqat qtGACATCCA GATGACCCAG TCTCCATCCT 101 CCCTGTCTGC ATCTGTAGGA GACAGAGTCA CCATCACTTG CCAGGCGAGT 151 CAGGACATTA GCAACTATTT AAATTGGTAT CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC 201 CCCTAAGCTC CTGATCTACG ATGCATCCAA TTTGGAAACA GGGGTCCCAT 251 CAAGGTTCAG TGGAAGTGGA TCTGGGACAG ATTTTACTTT CACCATCAGC 301 AGCCTGCAGC CTGAAGATAT TGCAACATAT TCCTGTCAAC ACTCTGATAA 351 TCTCTCGATC ACCTTCGGCC AGGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ACCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA
SEQ ID NO. 48 9.8.2預測κ輕鏈蛋白質序列 1 mdmrvpaqll qllllwlsva qarcDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCQAS 51 QDISNYLNWY QQKPGKAPKL LIYDASNLET GVPSRFSGSG SGTDFTFTIS 101 SLQPEDIATY SCQHSDNLSI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC_ SEQ ID NO. 49 獼猴MAdCAM α4β7結合域之核苷酸序列
1 ATGGATCGGG GCCTGGCCCT CCTGCTGGCG GGGCTTCTGG GGCTCCTCCA 98487.doc -149- ⑧ 1363762
51 GCCGGGCTGC GGCCAGTCCC TCCAGGTGAA GCCCCTGCAG GTGGAGCCCC 101 CGGAGCCGGT GGTGGCCGTG GCCCTGGGCG CCTCTCGCCA GCTCACCTGC 151 CGCCTGGACT GCGCGGACGG CGGGGCCACG GTGCAGTGGC GGGGCCTGGA 201 CACCAGCCTG GGCGCGGTGC AGTCGGACGC GGGCCGCAGC GTCCTCACCG 251 TGCGCAACGC CTCGCTGTCG GCGGCCGGGA CCCGTGTGTG CGTGGGCTCC 301 TGCGGGGGCC GCACCTTCCA GCACACCGTG CGGCTCCTTG TGTACGCCTT 351 CCCGGACCAG CTGACCATCT CCCCGGCAGC CCTGGTGCCT GGTGACCCGG 401 AGGTGGCCTG TACGGCTCAC AAAGTCACGC CTGTGGACCC CAATGCGCTC 451 TCCTTCTCCC TGCTCCTGGG GGACCAGGAA CTGGAGGGGG CCCAGGCTCT 501 GGGCCCGGAG GTGGAGGAGG AGGAGGAGCC CCAGGAGGAG GAGGACGTGC 551 TGTTCAGGGT GACAGAGCGC TGGCGGCTGC CGACCCTGGC AACCCCTGTC 601 CTGCCCGCGC TCTACTGCCA GGCCACGATG AGGCTGCCTG GCTTGGAGCT 651 CAGCCACCGC CAGGCCATCC CGGTCCTGCA C
SEQ ID NO. 50 獼猴MAdCAM α4β7結合域之胺基酸序列
1 MDRGLALLLA GLLGLLQPGC GQSLQVKPLQ VEPPEPVVAV ALGASRQLTC 51 RLDCADGGAT VQWRGLDTSL GAVQSDAGRS VLTVRNASLS AAGTRVCVGS 101 CGGRTFQHTV RLLVYAFPDQ LTISPAALVP GDPEVACTAH KVTPVDPNAL 151 SFSLLLGDQE LEGAQALGPE VEEEEEPQEE EDVLFRVTER WRLPTLATPV 201 LPALYCQATM RLPGLELSHR QAIPVLH SEQ ID NO. 51 修飾6.22.2重鏈核苷酸序列 1 atqqaqtttq qqctqaqctq qqttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt 51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG 451 CCCTGCTCTA GAAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT 501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA 651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA 751 CCTGTGGCAG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC 801 CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA 851 GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG 98487.doc •150·
(I 1363762
901 GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT 951 CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA 1001 AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC 1101 CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT 1151 GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC 1201 AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC 1251 CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT 1301 GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 1351 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AATGATAG SEQ ID NO. 52 修飾6.22.2重鏈胺基酸序列
1 mefqlswvf1 vallrqvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL 201 SLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP 251 PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE 301 HNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTWHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE 351 TISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES 401 GQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH 451 HYTQKSLSL SPGK
SEQ ID NO. 53 修飾6.22.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqttqccat cacaactcat tqqqtttctq ctqctctqqq ttccaqcttc 51 cagqqqtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA 98487.doc -151 - ⑧ 1363762 SEQ ID NO. 54 修飾6.2 2.2 κ輕鏈胺基酸序列
1 mlpsqligfl llwvpasrqE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS 51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE 101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS 151 WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC SEQ ID NO. 55 修飾6.34.2重鏈核苷酸序列
1 atqqaqtttq qqctqaqctq qgttttcctc qttqctcttt taaqaqqtqt 51 ccaqtqtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGCGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC TAGAAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA 651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC 1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG 1401 TAAATGATAG SEQ ID NO. 56 98487.doc -152- ⑧ 1363762 修飾6.34.2重鏈胺基酸序列
1 mefqlswvf1 vallrQvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVQFNWYV 301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRWSVLTW HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 EALHNHYTQK SLSLSPGK SEQ ID NO. 57
修飾6.34.2 κ輕鏈核苷酸序列
1 atqqacatqa Qqqtccccqc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct 51 ccgagqtqcc aqatqtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAGT 151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGTTCTCTG 301 CAACCTGAGG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA
SEQ ID NO. 58 修飾6.34,2 κ輕鏈胺基酸序列 1 51 101 151 201
mdmrvpaqll qllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL
QPEDFATYYC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 59 98487.doc -153- ⑧ 1363762
修飾6.67.1重鏈核苷酸序列
1 atqaaacacc tqtqqttctt cctcctqctq qtqqcaqctc ccaqatqqqt 51 cctqtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT 151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 GTCGAGTCAC CATGTCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG 401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCTAGAAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 GGGTAAATGA TAG SEQ ID NO. 60 修飾6.67.1重鏈胺基酸序列
1 mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTMSV DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM -154· 98487.doc 1363762
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 61 修飾6.6 7.1 κ輕鏈核普酸序列
1 atqqtqttqc aqacccaqqt cttcatttct ctgttgctct qgatctctqq 51 tqcctacqqq GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA ACAATAAGAA CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAGG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGGC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA
SEQ ID NO. 62 修飾6.67. Ik輕鏈胺基酸序列
1 mvlqtqvfis lllwisgayq DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL 51 YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 工SSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C SEQ ID NO. 63 修飾6.77.1重鏈核苷酸序列 1 atqqaactqq qqctccqctq qqttttcctt qttqctattt tagaagcrtqt 51 ccaqtatGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCT AGAAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 98487.doc -155- ⑧ 1363762
551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTC-G AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC· 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCCGGGT AAATGATAG
SEQ ID NO. 64 修飾6.77.1重鏈蛋白質序列
1 melqlrwvf1 vaileqvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSWTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K SEQ ID NO. 65 修飾6.77. Ik輕鏈核苷酸序列 1 51 101 151 201 251 301 351
atgagqctcc ctqctcagct cctqqqqctQ ctaatgctct qqatacctqg atccaqtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 98487.doc • 156- ⑧ 1363762
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGM CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 66 修飾6.77.1k輕鏈胺基酸序列
1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL 51 LSDGKTYL-NW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM SSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 67 修飾7.26.4k輕鏈核苷酸序列
1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqqqcfctq ctaatqctct qqatacctqq 51 atccaqtqcq GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGM CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
SEQ ID NO. 68 修飾7.26.4k輕鏈胺基酸序列
1 mrlpaqllql lmlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL
51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 98487.doc -157. ⑧
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC 【圖式簡單說明】 圖1為十二種人類抗MAdCAM單株抗體之重鏈及K輕鏈 可變區預測之胺基酸序列與相應人類基因之種株胺基酸 序列之排列對比。 圖1Α顯示抗體1.7.2及1.8.2之重鏈之預測胺基酸序列與 種株人類VH 3-15基因產物之之排列對比。 圖1Β顯示抗體6.14.2之重鏈之預測胺基酸序列與種株 人類VH 3-23基因產物之排列對比。 圖1C顯示抗體6.22.2之重鏈之預測胺基酸序列與種株 人類VH 3-33基因產物之排列對比。 圖1D顯示抗體6.34.2之重鏈之預測胺基酸序列與種株 人類VH 3-30基因產物之排列對比。 圖1Ε顯示抗體6.67.1重鏈之預測胺基酸序列與種株人類 VH 4-4基因產物之排列對比 圖1F顯示抗體6.73.2之重鏈之預測胺基酸序列與種株人 類VH 3-23基因產物之排列對比。 圖1 G顯示抗體6.77· 1之重鏈之預測胺基酸序列與種株 人類VH 3-21基因產物之排列對比。 圖1Η顯示抗體7.16.6及7.26.4之重鏈之預測胺基酸序列 一具有種株人類VH 1-18基因產物之之排列對比。 圖Π顯示抗體7.2 0.5之重鏈之預測胺基酸序列與種株人 類VH 4-4基因產物之排列對比。 圖1J顯示抗體9.8.2之重鏈之預測胺基酸序列與種株人 98487.doc -158- 1363762 類VH 3 -33基因產物之排列對比。 圖1K顯不抗體1，7.2及1.8.2之輕κ鏈之預測胺基酸序列 與種株人類A3基因產物之排列對比。 圖1L顯示抗體6.14.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類012基因產物之排列對比。 圖1Μ顯不抗體6.22.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類Α26基因產物之排列對比。 圖1Ν顯不抗體6.34_2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類012基因產物之排列對比。 圖10顯示抗體6.67_1之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類Β 3基因產物之排列對比。 圖1Ρ顯示抗體6.73.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類012基因產物之排列對比。 圖1Q顯示抗體6·77· 1之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類Α2基因產物之排列對比。 圖1R顯示抗體7.16.6及7.26.4之κ輕鏈之預測胺基酸序 列與種株人類Α2基因產物之排列對比。 圖1S顯示抗體7.20.5之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株 人類A3基因產物之排列對比。 圖1Τ顯示抗體9.8.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與種株人 類018基因產物之排列對比。 圖2為人類抗MAdCAM抗體預測之重鏈及κ輕鏈胺基 酸序列之CLUSTAL排列對比。 圖2 Α為預測之κ輕鏈胺基酸序列之CLUSTAL排列對比 98487.doc -159-
⑧ A 及放射樹，顯示抗MAdC AM抗體κ輕鏈之間之類似度。 圖2Β為預測之重鏈胺基酸序列之CLUSTAL排列對比及 放射樹，顯示抗MAdC AM抗體重鏈之間之類似度。 圖3為形成α4β7結合領域之獼猴及人類MAdCAM之2 N-端域胺基酸序列之CLUSTAL排列對比。β鏈根據Tan等人 之 Structured998)6:793-801 來排列對比。 圖4為一表示純化生物素化1.7.2及7.16.6對於人類外周 血液淋巴細胞黏附至MAdCAM表現之冷凍人類肝内皮切 片劑量效應之圖表。 圖5顯示一基於表7中獲得之抗MAdCAM抗體I·7.2、 6.22.2 、 6.34.2 、 6.67.1 、 6.77.1 、 7.16.6 、 7.20.5 、 7.26.4 、 9.8.2所結合之MAdCAM抗原決定部位多樣性之資料二維 圖表之表示。相同圈中之抗MAdC AM抗體顯示相同反應模 式，屬於相同抗原決定部位庫且可能識別MAdCAM上之相 同抗原決定部位。在重疊圈中之抗MAdCAM抗體純系不能 同時結合且因此可能識別MAdCAM上之重疊抗原決定部 位。未整合之圈表示具有明顯空間之抗原決定部位分離的 抗MAdC AM抗體純系。 圖6顯示抗MAdCAM抗體1.7.2及Alexa 488-標記之 7.1 6.6之夾心ELISA資料，顯示可偵測MAdCAM上不同抗 原決定部位之兩抗體可以診斷目的用於偵測可溶性 MAdCAM。 圖7顯示一抑制性抗MAdC AM抗體（1 mg/kg)(使用獼猴 模型中之抗MAdCAM mAb 7.16.6)對於循環外周α4β7+淋巴 98487.doc -160- 1363762 細胞數目之效應，其表現為相對於對照組IgG2a mAb或媒 劑之增加倍數。
98487.doc -161 - ⑧ 1363762 序列表 〈11〇>美商輝瑞大藥廠 美商艾伯吉尼斯公司 <120〉MAdCAM之抗體
<130> ABX-PF6 PCT <140〉 094100530 <141〉 2005-01-07 <150〉 60/535,490 <151> 2004-01-09 <160〉 147
<170> Patentln Ver. 3.3 <210〉 1 <211> 1392 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 1 atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtgaagcctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagcct ctggattcac tttcactaac gcctggatga tctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt tggccgtatt aaaaggaaaa ctgatggtgg gacaacagac 240 tacgctgcac ccgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattcaaa aaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacagccg tgtattactg taccacaggg 360 ggagtggctg aggactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720
Stcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210〉 2 98487.doc <211〉 463 <212> PRT <213〉智人 <400〉 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp lie Phe Leu Ala Ala lie Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Thr Asn Ala Trp Met lie Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Gly Arg lie Lys Arg Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp 65 70 75 80
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Val Ala Glu Asp Tyr Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 98487.doc 1363762 245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285
Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320
Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 340 345 350
Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 〈210〉 3 <211〉 720 <212〉 DNA 〈213〉智人 <400〉 3 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg caaagtaatg gatacaacta tttggattgg 180 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 240 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactatc 360 98487.doc 1363762 accttcggcc aagggacacg actggagatt aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagtga 720 <210〉 4 <211〉 238 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 4
Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 15 10 15
Gly Ser Ser Gly Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45
Leu Leu Gin Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95
Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110
Cys Met Gin Ala Leu Gin Thr lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu 115 120 125
Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140
Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175
Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly -4· 98487.doc 1363762 210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 〈210〉 5 <211〉 1392 〈212〉 DNA <213〉智人 <400> 5 atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtgaagcctg gggggtccct tagactctcc 120 tgtgtagtct ctggattcac tttcactaac gcctggatga tctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt tggccgtatt aaaaggaaaa ctgatggtgg gacaacagac 240 tacgctgcac ccgtgaaagg cagattcacc atctcaagag atgattcaaa aaacacgctg 300 tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacagccg tgtattactg taccacaggg 360
ggagtggctg aggactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210〉 6 <211〉 463 <212> PRT <213〉智人 <400〉 6
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp He Phe Leu Ala Ala He Leu Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 2〇 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 98487.doc ⑧ 1363762
Thr Asn Ala Trp Met lie Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Gly Arg lie Lys Arg Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp 65 70 75 80
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Val Ala Glu Asp Tyr Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys ^ 225 230 235 240
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285
Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320
Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 98487.doc 1363762 325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 340 345 350
Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400
Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415
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Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 98487.doc - 53 · ⑧ 1363762
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr 210 215 220
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225 230 235 240
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 245 250 255
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285
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He Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 355 360 365
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 •54- 98487.doc 1363762
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460
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〈400〉 57 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt cggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagt attagtagct atttaaattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccggtttgaa gcgtggggtc 240 ccatcacggt tcagtggtag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagttctctg 300 caacctgagg attttgcaac ttactactgt caccagagtt acagtctccc attcactttc 360 ggccctggga ccaaagtgga tatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga 714 <210〉 58 <211〉 236 <212〉 PRT <213〉智人 X400> 58
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Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 245 250 255
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Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285
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Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 385 390 395 400
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 210 215 220
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Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 〈210〉 69 <211> 14 <212> PRT <213〉人工序列 98487.doc - 65 - 1363762 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 肽 <400〉 69
Ser Ser Gin Ser Leu Leu Gin Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu 1 5 10 <210〉 70 <211〉 53 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 <400> 70 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggactggac ctggagcatc ctt <210〉 71 <211> 53 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 71 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg att <210> 72 <211> 53 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成 引子 <400> 72 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggeiactggg sctccgctgg gtt
<210〉 73 <211〉 53 <212〉 DNA 66 98487.doc 1363762 <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成 引子 <400> 73 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg ctt 53 <210> 74 <211〉 53 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 74 53 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg gtt <210〉 75 <211〉 53 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400> 75 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tggagtttgg gctgagctgg gtt 53 <210> 76 <211> 53 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 76 tatctaagct tctagactcg agcgccacca tgaaacacct gtggttcttc etc 53
<210〉 77 <211〉 53 <212〉 DNA 98487.doc 67 ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 77 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tgaggctccc tgctcagctc ctg <210〉 78 <211〉 53 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 78 53 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tgttgccatc acaactcatt ggg <210〉 79 <211〉 53 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 79 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tggtgttgca gacccaggtc ttc 53 <210〉 80 ,<211> 53 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 80 "tctagacccg ggcgccacca "tggacatgag ggtccccgct cag
<210〉 81 〈211〉 53 <212> DNA 98487.doc _ 68 . ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 81 tatctaagct tctagacccg ggcgccacca tggacatgag ggtccctgct cag 53 <210〉 82 <211〉 44 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 82 44 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agag <210〉 83 <211〉 43 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 83 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga age 43 <210〉 84 /211> 44 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 84 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc agagacaggg agag 44
<210〉 85 <211〉 44 <212〉 DNA 98487.doc -69- ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 85 ggatctggga cagatttcac cctcaccatc aatagcctgg aagc 44 <210〉 86 <211〉 44 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 86 44 gcttccaggc tattgatggt gagggtgaaa tctgtcccag atcc 〈210〉 87 <211〉 27 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工序列之描述：合成 引子
<400> 87 gcagcgtctg gattcacctt cagtagc 27 <210> 88 ‘<211> 27 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述·.合成 引子 <400〉 88 27 gctactgaag gtgaatccag acgctgc
<210〉 89 <211〉 24 <212〉 DNA 98487.doc 70 ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 89 cggaggtgct tctagagcag ggcg 24 <210〉 90 <211> 47 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 <400〉 90 gcaagtcaga gtattagtag ctatttaaat tggtatcagc agaaacc 47 <210〉 91 <211〉 47 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 91 ggtttctgct gataccaatt taaatagcta ctaatactct gacttgc 47 <210> 92 ‘<211〉48 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 92 ccatcagttc tctgcaacct gaggattttg caacttacta ctgtcacc 48
<210〉 93 <211> 48 <212〉 DNA 98487.doc -71 - ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述·.合成 引子 <400〉 93 ggtgacagta gtaagttgca aaatcctcag gttgcagaga actgatgg 48 <210> 94 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉入工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 94 31 gcaaatgaac agcctgcgcg ctgaggacac g <210> 95 <211> 31 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 95 cgtgtcctca gcgcgcaggc tgttcatttg c 31 <210〉 96 <211> 45 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 96 45 caataagaac tacttagctt ggtaccaaca gaaaccagga cagcc
<210〉 97 <211> 45 <212〉 DNA 98487.doc 72 ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述··合成 引子 <400〉 97 ggctgtcctg gtttctgttg gtaccaagct aagtagttct tattg 45 <210〉 98 <211〉 45 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220>
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 98 45 ccctcagggg tcgagtcacc atgtcagtag acacgtccaa gaacc <210〉 99 <211> 45 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 99 ggttcttgga cgtgtctact gacatggtga ctcgacccct gaggg 45 <210〉 100 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 100 attctagagc agggcgccag g 21
<210〉 101 <211> 30 〈212> DNA 73 98487.doc 1363762 <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 101 ccatctcctg caagtctagt cagagcctcc 30 <210> 102 <211> 30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 <400〉 102 ggaggctctg actagacttg caggagatgg 30 <210〉 103 <211〉 47 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子
<400〉 103 ggtttattac tgcatgcaaa gtatacagct tatgtccagt tttggcc 47 <210> 104 <211> 47 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 104 47 ggccaaaact ggacataagc tgtatacttt gcatgcagta ataaacc
<210〉 105 <211> 24 <212〉 DNA 98487.doc 74 ⑧ 1363762 <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 105 cctgcaagtc tagtcagagc ctcc 24 <210〉 106 <211〉 24 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220〉
<223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 106 24 ggaggctctg actagacttg cagg <210〉 107 <211〉 543 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 107
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu 15 10 15
Leu Gly Gin Ser Leu Gin Val Lys Pro Leu Gin Val Glu Pro Pro Glu
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gin Leu Thr Cys Arg 35 40 45
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gin Trp Arg Gly Leu Asp 50 55 60
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gin Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr 65 70 75 80
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly 85 90 95
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gin His Thr Val Gin Leu Leu Val Tyr 100 105 110
Ala Phe Pro Asp Gin Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly 115 120 125 •75- 98487.doc 1363762
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala His Lys Val Thr Pro Val Asp Pro 130 135 140
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gin Glu Leu Glu Gly 145 150 155 160
Ala Gin Ala Leu Gly Pro Glu Val Gin Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gin 165 170 175
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro 180 185 190
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gin Ala Thr Met 195 200 205
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala lie Pro Val Leu 210 215 220
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser 225 230 235 240
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Gin Glu Pro 245 250 255
Pro Asp Thr Thr Ser Gin Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Gin Glu Pro 260 265 270
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro 275 280 285
Ala Pro Gin Gin Gly Ser Thr His Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr 290 295 300
Arg Thr Arg Arg Pro Glu lie Gin Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 305 310 315 320
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 325 330 335
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 340 345 350
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 355 360 365
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 370 375 380
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 385 390 395 400 98487.doc -76- i 1363762
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 405 410 415
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 420 425 430
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 435 440 445
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 450 455 460
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 465 470 475 480
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 485 490 495
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 500 505 510
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 515 520 525
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 530 535 540 <210> 108 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400> 108 caggtgcagc tggagcagtc tgg <210〉 109 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述·.合成 引子 <400〉 109 77 98487.doc 1363762 gctgagggag tagagtcctg agga 24 <210〉 110 <211〉 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成引子 <400> 110 gctgagggag tagagtcctg aggactgt 28
<210> 111 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 引子 <400〉 111 agcatggatc ggggcctggc c 21 <210〉 112 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列
〈223>人工序列之描述：合成 引子 <400〉 112 21 gtgcaggacc gggatggcct g <210〉 113 <211〉 116 <212> PRT <213〉智人 <400〉 113
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 98487.doc -78- ⑧ 1363762 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Val Ala Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser Ala 115 <210〉 114 <211〉 116 <212> PRT <213〉智人 <400〉 114
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val ' 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Ser Tyr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser Ala 115 98487.doc -79- ⑧ 1363762 <210〉 115 <211〉 117 <212> PRT <213〉智人 <400〉 115
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala 115 <210〉 116 <211〉 122 <212〉 PRT <213〉智人 ! <400〉116
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr -80- 98487.doc 1363762 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Thr Val Val Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 117 <211> 120 <212〉 PRT <213〉智人
<400〉 117
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg He Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg lie Thr Met Val Arg Gly Val lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly ' 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 118 <211〉 121 〈212〉 PRT <213〉智人 <400〉 118 Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 98487.doc -81· ⑧ 1363762
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala lie Ala Val Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 119 <211〉 125 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 119
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser He Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 98487.doc 82- ⑧ 1363762 <210〉 120 <211〉 121 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 120
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 121 <211〉 122 <212> PRT <213〉智人 <400> 121
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp He Arg Gin Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Arg lie Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 98487.doc -83· ⑧ 75 1363762
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210〉 122 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 122
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110
<210〉 123 <211> 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 123
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Gin Ser 20 25 30 • 84- 98487.doc 1363762
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Leu Gin Thr lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
<210〉 124 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 124
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu lie 35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 125 <211〉 106 <212〉 PRT <213〉智人 98487.doc 85- ⑧ 1363762 <400〉 125
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Gly Ser Ser 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Thr Phe 85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 126 <211〉 108 <212〉 PRT 〈213>智人 <400〉 126
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Ser Gin Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys Arg 100 105 <210> 127 86- 98487.doc 1363762 <211> 114 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 127
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 110
Lys Arg 〈210〉 128 <211〉 106 <212> PRT <213〉智人 <400〉 128
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 98487.doc • 87 * ⑧ 1363762 85 90 95
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Asp He Lys Arg 100 105 <210〉 129 <211〉 110 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 129
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
He Gin Leu Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110 <210〉 130 〈211〉 113 <212〉 PRT 〈213〉智人 <400> 130
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 98487.doc -88 - ⑧ 75 1363762
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95 lie Gin Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210〉 131 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 131
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Gly 20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Leu Gin Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110 <210〉 132 <211〉 107 <212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 132
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 15 98487.doc 89- ⑧ 1363762
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asn Leu He Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 133 <211〉 125 <212> PRT <213〉智人 <400> 133
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Gly lie Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Ser Val Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe ! 65 70 75 80
Phe Leu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 〈210〉 134 <211> 10 98487.doc -90· ⑧ 1363762 <212〉 PRT 〈213>食蟹猴 <400〉 134
Lys Pro Leu Gin Val Glu Pro Pro Glu Pro 1 5 10 <210〉 135 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 135
Thr Phe Asn Asn Ser Ala Met Thr 1 5
<210〉 136 <211> 9 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 136
Cys Lys Ser Asn Gin Ser Leu Leu Tyr 1 5 <210〉 137 <211> 9 <212> PRT <213〉智人 <400〉 137
Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr lie 1 5 <210> 138 <211〉 9 〈212〉 PRT <213〉智人 <400> 138
Ala Ser Gin Asn lie Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210〉 139 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉智人 98487.doc -91- ⑧ 1363762 <400〉 139
Ser Ser Asn Asn Lys Thr Tyr Leu Ala 1 5 <210> 140 <211〉 8 <212> PRT <213〉智人 <400> 140
Arg Ala Ser Gin Asn lie Thr Asn 1 5
<210> 141 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 141
Ser Cys Asn Ser Ser Gin Ser Leu 1 5 <210> 142 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 142 His Ser Asp Asn Leu Ser He Thr
<210> 143 <211〉 7 '<212> PRT <213〉智人 <400> 143
Leu Gin Ser Asn Gly Tyr Asn 1 5 <210〉 144 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 <400> 144 -92- 98487.doc 1363762
Leu Gin Ser Asn Gly Tyr Asn 1 5 <210〉 145 〈211〉 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 145
His Gly Asn Gly Tyr Asn Tyr 1 5
<210> 146 <211〉 8 <212> PRT <213〉智人 <400〉 146
Leu Thr lie Asn Gly Leu Glu Ala 1 5 <210〉 147 <211〉 15 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工序列之描述：合成 連接肽 <400> 147
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 98487.doc -93 - ⑧

Claims (1)

1363762 __V、窃 V 第 0941 1月） 曰修(更骑C却 十、申請專利案:園""： ,1. 一種人類單株抗體或其抗原結合部分，其特異性地結合 、 至黏膜選址素細胞黏附分子（Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule(MAdCAM))，其中該抗體包含單株抗 體7.16.6之重鏈00111、€0112及00113胺基酸序列及輕鏈 CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。 2. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗 體包含SEQ ID NO : 34之重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基 酸序列及8[(^10 1^0:3 6之輕鏈€0111、00112及€0113胺 基酸序列。 3. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 類單株抗體或其抗原结合部分具有至少一項下列性質： (a) 結合至人類細胞； (b) 具有一超過VCAM或纖維結合素（fibronectin)至少 100倍之MAdCAM選擇性； (c) 以3x10*1° Μ或更小之κΐ結合至人類MAdCAM ; (d) 抑制α4β7表現細胞結合至人類MAdCAM ;及 (e) 抑制淋巴細胞募集至胃腸淋巴組織。 4·如請求項3之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 類單株抗體或其抗原結合部分以3χ10·1() Μ或更小之{^結 合至人類MAdCAM且抑制α4 β7結合至人類MAdCAM。 5. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗 體包含單株抗體7.16.6之重鏈及輕鏈胺基酸序列。 6. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 98487-1010109.doc 類單株抗體或其抗原結合部分具有至少一項下列性質： (a) 與參照抗體交又競爭結合至MAdCAM ; (b) 與參照抗體競爭結合至MAdCAM ; (c) 如同參照抗體一樣結合至MAdCAM之相同抗原決定 部位； (d) 以與參照抗體大體上相同之Kd結合至MAdCAM;及 (e) 以與參照抗體大體上相同之脫離速率（off rate)結合 至 MAdCAM ; ----—.—- ________________ 其中該參照抗體係單株抗體7.16.6 » 7. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗 體係包含SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:36中不具有訊號序 列之胺基酸序列之抗體。 8. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 類單株抗體或其抗原結合部分包含一利用人類VH 1-18 基因之重鏈。 9. 如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 類單株抗體或其抗原結合部分包含一利用人類VK A2基 因之輕鏈。 1〇_如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗 體包含單株抗體7.16.6之重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序 列。 11.如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該重 鍵、該輕鏈或兩者分別包含單株抗體7 16 6之重鏈、輕鏈 或兩者之自該CDR1起始處直至該CDR3終止處之胺基酸 98487-1010109.doc 1363762 序列。 〜12.如請求項1之人類單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體 ‘ 包含SEQ ID NO : 34之重鏈可變域胺基酸序列及SEQ m NO : 36之輕鏈可變域胺基酸序列。 13.如請求項丨至12中任一項之人類單株抗體或其抗原結合 部刀其中該抗體為免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE及IgA 或IgD分子或雙特異抗體。 I4·如請求項1至12中任一項之人類單株抗體或其抗原結合 部分，其中該抗原結合部分為Fab片段、F(ab，)2片段、Fv 片段或單鍵抗體》 15·如請求項1之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該人 類單株抗體或其抗原結合部分包含單株抗體7 166之一 或多個FR1、FR2、FR3及FR4胺基酸序列。 16. —種融合瘤細胞株716 6(BCrc 960234)。 17. —種藉由如請求項16之融合瘤細胞株7166產生之人類 • 單株抗體或具有與該等所產生之單株抗體相同之胺基酸 序列之單株抗體。 …如請求項17之人類單株抗體’其中重鏈卩末端離胺酸經 過裂解。 19. -種醫藥組合物’其包含有效劑量之如請求項n5、η 及18中任-項之人類單株抗體或其抗原結合部分及醫藥 上可接受之載劑。 2 0.如清求項19之醫藥組合物 抗發炎劑或免疫調節劑。 ，其進一步包含一或多種額外 98487-1010109.doc 1363762 21. 如請求項20之醫藥組合物，其中該一或多種額外抗發炎 劑或免疫調節劑選自由下列者所組成之群組：皮質類固 醇、胺基水楊酸酯、硫唾嘌呤（aZathi〇prine)、甲胺嗓吟 (methotrexate)、環孢徽素、FK506、IL-10 ' GM-CSF、雷 帕黴素（rapamycin)、抗TNFa劑及黏附分子拮抗劑。 22. —種如請求項iib、17及18中任一項之人類單株抗體或 其抗原結合部分之用途，其係用於製備治療有需要之個 體之炎性疾病的藥物。 —- ------------ ---------------------- 23. 如請求項22之用途，其中該炎性疾病係胃腸道之炎症性 疾病。 24. 如請求項23之用途，其中該胃腸道之炎性疾病係選自於 由下列者所組成之群組：炎性結腸疾病'克羅恩氏病 (Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、憩室疾病 disease)、胃炎、肝病、原發性膽道硬化及硬化性膽管炎。 25. 如請求項23之用《，其中該胃腸道之炎性疾病為炎性結 腸疾病、克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。 26. 如請求項22之用it，其中該等炎性疾病為騰島素依賴型 糖尿病或移植物抗宿主疾病。 27. •樘如晴求項1至15、17及18中任一項 項之人類單株抗體 其抗原結合部分之用途，其係用於製備抑制結合至 現人類MAdCAM之細胞之藥物。 28. -種如請求項⑴^以㈣任一項之人類單株抗體 其抗原結合部分之用途，其係用於製備抑制以續颜 控之白血球·内皮細胞黏附之藥物。 98487-1010109.doc 29.1363762 種如-月求項1至15、17及18中任一項之人類單株抗體或 其抗原結合部分之用途，其係用於製備抑制ΜΑΚΑΜ調 控之白血球黏附、遷移及滲透至組織中之藥物。 30. 種如凊求項1至15、17及18中任-項之人類單株抗體或 其抗原結合部分之用途，其係用&製備抑制 〇14爲7/]^八(^八^1依賴型細胞黏附之藥物。
31·種如明求項n5、17及18中任一項之人類單株抗體或 其抗原結合部分之用途，其係用於製備抑制MAdCAM調 控之淋巴細胞募集至胃腸淋巴組織之藥物。 32. 一種分離核酸分子，其包含編碼如請求項^至Η、mu 中任一項之人類單株抗體之重鏈或其抗原結合部分或輕 鏈或其抗原結合部分之核苷酸序列。 33. -種包含如請求項32之核酸分子之載體，其中該載體視 情況包含-可經操作而連接至該㈣分子之表現控制序 列。
34. —種宿主細胞， 之核酸分子。 其包含如請求項33之載體或如請求項32 35. 如請求項34之宿主細胞，其包含編碼如請求項⑴5、U 及18中任一項之人類單株抗體或其抗原結合部分之重鏈 或其抗原結合部I之核酸分子及編碼如請求項、17 及18中任—項之人類單株抗體或其抗原結合部分之輕鍵 或其抗原結合部分之核酸分子。 36. -種用於產生特異性地結合至MAd(：AM之人類單株抗體 或其抗原結合部分之方法’其包括在合適條件下培養如 98487-101Q109.doc ?1363762 凊求項34或35之宿主細胞或如請求項16之融合瘤細胞株 7.16.6及回收該人類單株抗體或其抗原結合部分。 37. —種用於診斷以循環可溶性人類MAdCAM 症之方法，其包括下列步驟：⑴以如請求項^失^ 及18中任一項之人類單株抗體或其抗原結合部分接觸生 物樣品且（2)偵測結合。 38. —種診斷套組，其包含如請求項丨至·15、”及以中任一項 ___抗體或其抗原結合部分。 39. 一種疫苗’其包含有效劑量之如請中- 任一項之人類單株抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接 受之载劑。 40. 如請求項39之疫苗，其中該疫苗為黏臈性。 98487-1010109.doc
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