TW201738272A - 抗ｐａｃａｐ抗體及其用途 - Google Patents

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amino acid
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瑪麗亞克里斯蒂娜 盧米斯
李奧 F. 賈西亞馬帝茲
班傑明 H. 杜薩
丹尼爾 S. 艾利森
凱瑟琳 L. 漢德里克斯
艾森 W. 歐加拉
珮 樊
傑佛瑞 T.L. 史密斯
約翰 A. 雷特漢
查理 卡拉塞克
珍妮 穆里根
米歇爾 斯考利金
艾瑞卡 史都華
凡妮莎 L. 魯賓
珍斯 J. 比爾葛林
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艾爾德生物製藥股份有限公司
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Abstract

本發明係有關對PACAP具有結合特異性之抗體及其抗原結合片段。該等抗體及其抗原結合片段包含本文所述之VH、VL及CDR多肽之序列，及編碼其之聚核苷酸。本文所述之抗體及抗原結合片段結合於及/或競爭結合於人類PACAP上與抗PACAP抗體相同之線性或構形抗原決定基。本發明涵蓋結合於一或多種官能或可偵測部分之抗PACAP抗體及其結合片段之結合物。亦涵蓋製備該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段之方法。本發明之其他實施例涵蓋使用抗PACAP抗體及其結合片段來診斷、分析及治療與PACAP有關之疾病及病症及其中諸如血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活之PACAP相關活性的拮抗作用將在治療上有益之病狀。

Description

抗PACAP抗體及其用途
本申請案主張2016年4月15日申請之美國臨時申請案第62/322,939號(代理人案號43257.5809)、2016年4月15日申請之美國臨時申請案第62/322,957號(代理人案號43257.5810)、2016年4月15日申請之美國臨時申請案第62/323,495號(代理人案號43257.6200)、2016年4月15日申請之美國臨時申請案第62/323,573號(代理人案號43257.6201)、2016年7月26日申請之美國臨時申請案第62/366,902號(代理人案號43257.6202)及2016年10月14日申請之美國臨時申請案第62/408,347號(代理人案號43257.6203)的權益，該等美國臨時申請案各自特此以引用之方式整體併入。
本申請案包括具有640,325位元大小且在2017年4月12日創建之名稱為「43257o6274.txt」的電子序列表文本檔案作為其揭示內容之一部分，該文本文檔特此整體併入。
本發明大體而言係關於抗體及其抗原結合片段，較佳地人類化、嵌合及人類抗體及其抗原結合片段，及含有該等抗體及其抗原結合片段之組合物，其中該等抗體及其抗原結合片段特異性地結合於垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)，及關於該等抗體、抗原結合片段及其組合物之治療及診斷用途。
垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)為分泌素/血管活性腸肽(「VIP」)/生長激素釋放激素(「GHRH」)家族之成員。PACAP為多官能血管擴張肽，其以兩種α-醯胺化活性形式存在，一種具有38個胺基酸(PACAP38；SEQ ID NO: 1241)，而另一種具有27個胺基酸(PACAP27；SEQ ID NO: 1242)。兩種肽具有相同N端27個胺基酸且由同一種前驅體蛋白前PACAP原合成(參見Moody等人,Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1):61-67 (2011))。PACAP38為更普遍活性形式，代表哺乳動物組織中高達90%之PACAP形式(參見Kaiser及Russo,Neuropeptides , 47:451-461 (2013))。PACAP38之序列在所有哺乳動物中一致且與禽及兩棲動物異種同源物之區別在於僅一個胺基酸(參見Vaudry等人,Pharmacol. Rev., 52:269-324 (2000))。分泌素/VIP/GHRH家族包括哺乳動物肽組胺酸甲硫胺酸醯胺(「PHM」)、分泌素、升糖素、升糖素樣肽-1 (「GLP1」)、升糖素樣肽-2 (「GLP2」)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽(「GIP」)及生長激素釋放因子(「GRF」)。PACAP27在胺基酸層面上與VIP具有68%序列一致性(參見Vaudry等人(2000))。
PACAP廣泛分佈於腦及周圍器官，例如內分泌系統、性腺、交感神經元、呼吸系統、胃腸道、心血管系統及尿殖道中(參見Schytz等人,Neurotherapeutics , 7:191-196 (2010))。詳言之，PACAP表現於整個神經系統中，包括存在於三叉神經血管系統、三叉神經節、脊髓、下視丘及垂體中。PACAP在神經發育、神經保護、神經調節、神經性發炎及具有多種作用之傷害感受中具有作用(參見Kaiser及Russo (2013))。
與其廣泛分佈一致，PACAP發揮多效性效應，包括神經傳遞質釋放之調節、血管擴張、枝氣管擴張及腸運動性激活、胰島素及組織胺分泌增加以及細胞增殖及/或分化之刺激。PACAP已顯示用作激素、神經激素、神經傳遞質及多種組織中的營養因子(Vaudry等人,Pharmacological Rev. , 52(2):269-324, 2000)。
PACAP之生物效應經由三種不同G蛋白偶合受體介導：PAC1-R、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)。此等受體表現於不同組織中。PAC1-R在神經系統(例如，嗅球、丘腦、下丘腦、小腦及脊髓背角)、垂體及腎上腺中尤其豐富。相比之下，VPAC1-R及VPAC2-R主要表現於肺、肝及睪丸中，不過其亦已在其他組織中偵測出。VPAC1-R表現已在神經系統(例如，大腦皮層及海馬)、肺、肝、腸之平滑肌細胞、巨核細胞及血小板中偵測出。VPAC1-R與受體締合膜蛋白(「RAMP」，特定言之RAMP2)締合。(Christopoulos等人,J. Biol. Chem. , 278:3293-3297, 2002)。VPAC2-R表現型態包括神經(例如，丘腦、海馬、腦幹及背根神經節(「DRG」))、心血管系統、胃腸系統、胰臟及生殖系統。(Usdin等人,Endocrin. , 135:2662-2680, 1994；Sheward等人,Neurosci. , 67:409-418, 1995)。
PAC1-R對於PACAP38及PACAP27具選擇性。詳言之，PAC1-R以比VIP大100-1000倍的親和力結合於PACAP，亦即，關於PACAP27/PACAP38約0.5 nM之KD 對關於VIP約500 nM之KD 。相反地，VPAC1-R及VPAC2-R對於PACAP及VIP具有相等親和力(KD 約1 nM) (參見Schytz等人(2010))。
在激活時，此等受體均能夠引起環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)之下游產生，及/或磷脂酶C (「PLC」))之激活，及/或磷脂酶D (「PLD」))之調節。詳言之，PAC1-R偶合於經由cAMP及Ca2+ 起作用之雙重信號轉導路徑，而VPAC1-R及VPAC2-R主要地偶合於腺苷酸環化酶。PAC1-R偶合於Gs 蛋白，該Gs 蛋白激活腺苷酸環化酶以形成cAMP，cAMP又激活蛋白激酶A。PAC1-R亦偶合於Gq且由此激活PLC，PLC產生磷酸肌醇，該磷酸肌醇增加細胞內鈣儲存之細胞溶質鈣釋放。有一些跡象表明PAC1-R在PLD激活中之作用。參見McCulloch等人,Ann. N. Y. Acad. Sci., 921:175-185 (2000)。另一PACAP信號傳導路徑導致經由激活非選擇性陽離子通道提高細胞內鈉含量。參見Roy等人,American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 304(12):R1070-R1084 (2013)。
假設PACAP在多種疾病及病症中起作用，包括但不限於偏頭痛、頭痛及疼痛，不過關於PACAP之該作用尚未在臨床上得到證實。咸信偏頭痛具有神經血管組分。偏頭痛在美國影響了大約10%的成人群體且典型地伴隨有劇烈頭痛。大約20-30%之偏頭痛患者經歷先兆，包含先於及/或伴隨該事件之局部神經現象。PACAP在偏頭痛中之作用已由數種觀察結果表明：(1)在人類中，PACAP之血漿含量在偏頭痛發作(發作性)期間如與發作間含量相比有所提高(參見Tuka等人,Cephalalgia, 33(13):1085-1095 (2013))；(2) PACAP38之輸注在健康個體中觸發頭痛，在偏頭痛患者中觸發頭痛、隨後偏頭痛樣發作(分別參見Schytz等人,Brain, 132:16-25 (2009)；及Amin等人,Brain, 137:779-794 (2014))；(3) PACAP誘導之血管擴張可在神經性發炎中起作用(參見Kaiser及Russo,Neuropeptides, 47:451-461 (2013))；及(4) PACAP誘導之偏頭痛導致畏光、聲音恐怖、噁心，且回應於曲坦類(參見Amin等人,Brain , 32:140-149 (2012))。PACAP亦已顯示誘導血管擴張、畏光以及肥大細胞去顆粒及神經元激活(參見Markovics等人,Neurobiology of Disease, 45:633-644 (2012)；Baun等人,Cephalalgia, 32(4):337-345 (2012)；Chan等人,Pharmacology & Therapeutics, 129:332-351 (2011))。
偏頭痛之一種有效治療為投與曲坦類，該等曲坦類為基於色胺之藥物的家族，包括舒馬曲坦(sumatriptan)及利紮曲坦(rizatriptan)。此家族之成員對包括5-HT1B 、5-HT1D 及5-HT1F 之多種血清素受體具有親和力。此藥物家族之成員選擇性地收縮腦血管，而且對冠狀血管引起血管收縮效應。參見Durham,New Eng. J. Med. , 350 (11):1073-75 (2004)。具有確定心臟病之患者在投與之後存在冠狀痙攣的理論風險，且在極少情況中在服用曲坦類之後可發生心臟事件。因此，其禁忌用於一些具有冠狀血管疾病之患者。
類似地，疼痛可通常經由投與某些麻醉劑或非類固醇消炎藥(「NSAID」)來解決。然而，此等治療之投與通常具有不利後果。NSAID有可能引起腎衰竭、腸出血及肝功能障礙。麻醉劑有可能引起噁心、嘔吐、受損心理功能及上癮。因此，可需要鑑別疼痛之替代治療以便避免此等不利後果中之某些。
PACAP亦可牽涉於除偏頭痛、頭痛及疼痛外之疾病及病症中。例如，PACAP可與焦慮症(WO 2012/106407)；血小板減少症(WO 2004/062684)；及發炎性皮膚病(WO 2010/007175)有關或甚至起因果作用。PACAP及PAC1-R多型性與雌性創傷後壓力症候群(「PTSD」)、重度憂鬱症及廣泛性焦慮症有關，表明PACAP在此等病狀中之作用。此外，支持PACAP在血小板減少症中之作用，三染色體18患者具有過量PACAP且展現缺陷性巨核細胞成熟(參見Schytz等人(2010)；及Moody等人,Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1):61-67 (2011))。
另外，PACAP及諸如抑鈣素基因相關肽(「CGRP」)、P物質、神經激肽A、緩激肽及內皮素-1之其他神經肽表現於下泌尿道(「LUT」)中(參見Arms及Vizzard,Handbook Exp. Pharmacol., 202:395-423 (2011))且據報道可在LUT功能障礙及泌尿道病症中起作用，諸如泌尿道感染(「UTI」)、異常排尿、尿急、夜尿症、尿失禁、膀胱過動症及與該等病狀有關之疼痛。
PACAP及PACAP受體亦已表明調節發炎及神經病變性疼痛且已牽涉於促傷害感受及抗傷害感受中(參見Davis-Taber等人,J. Pain, 9(5):449-56 (2008)。亦已報道PACAP為脊椎去敏感及神經病變性疼痛誘導所需(參見Mabuchi等人,J. Neurosci ., 24(33):7283-91 (2004))。另外，據報道嗎啡戒斷行為在PACAP受體缺陷小鼠中經修正，進一步表明PACAP在嗎啡戒斷抗焦慮藥反應中之作用(參見Martin等人,Mol. Brain Res., 110(1):109-18 (2003))。
在一態樣中，本發明大體而言係關於抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段，其拮抗、抑制、中和或阻斷與人類PACAP有關之至少一種生物效應。在某些實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應，該PACAP包括如下文所論述之PACAP27及/或PACAP38。在其他實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；及/或中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；及/或抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)。在其他實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；或能夠抑制PACAP結合於PAC1-R。在其他實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段抑制PACAP誘導之cAMP產生。在其他實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段當單獨或組合投與個體(例如，人類)時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。在相關實施例中，該等人類或人類化抗PACAP抗體及其抗原結合片段適用於治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體。
在另一實施例中，該方法提供選自由幼倉鼠腎(「BHK」)細胞；中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞；小鼠足細胞(「TM4」細胞)；非洲綠猴腎細胞(「VERO-76」細胞)；人類子宮頸癌(「HELA」)細胞；犬腎細胞(「MDCK」)；布法羅大鼠肝(「BRL」)細胞；人類肺細胞；人類肝(「Hep G2」)細胞；小鼠乳房腫瘤(「MMT」)細胞；TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞組成之群的哺乳動物真核宿主細胞。較佳地，該哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。更佳地，該哺乳動物宿主細胞為CHO K1細胞。
在一較佳實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段實質上不與VIP相互作用(結合)。本發明亦涵蓋該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段之治療用途(作為單一療法或組合療法)及診斷用途。
更特定言之，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包括人類、人類化及嵌合抗體及其片段，以及scFv、駱駝抗體、鯊魚抗體、奈米抗體、免疫球蛋白新抗原受體(「IgNAR」)、片段抗原結合(「Fab」)片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、雙特異性抗體、單價抗體片段及F(ab')2 片段。另外，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段可實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化。在一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含人類恆定域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其片段之人類恆定域。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含已經修飾以改變(增強或削弱)效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區。例如，該Fc區可含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變。
在一些實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之KD 結合於PACAP，例如，如藉由ELISA、生物層干涉術(「BLI」)、動力學排除分析(KINEXA®, Sapidyne Instruments, Boise, ID)或SPR例如在25℃或37℃下所測定。較佳地，該等人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之KD 結合於PACAP。較佳地，該等人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段以小於約100 nM、小於約40 nM、小於約1 nM、小於約100 pM、小於約50 pM或小於約25 pM之KD 結合於PACAP。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段以約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP。在另一實施例中，該等人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(koff )結合於PACAP。
在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段將特異性地結合於線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自由Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H組成之群的抗PACAP抗體相同之線性或構形抗原決定基(此等抗PACAP抗體之可變區及恆定區的特異性胺基酸序列，及編碼該等可變區及恆定區之核酸，及如使用丙胺酸掃描方法所測定之由此結合的抗原決定基揭示於下文)。詳言之，本發明包括特異性地結合於人類PACAP上與選自由Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H組成之群的抗PACAP抗體相同之線性或構形抗原決定基的抗PACAP抗體及其抗原結合片段。如下文所揭示，在例示性實施例中，該等抗原決定基使用丙胺酸掃描突變策略來測定。
在一些實施例中，本發明提供抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段，其包含選自由Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H組成之群的抗PACAP抗體之至少2個互補決定區(「CDR」)、或至少3個CDR、或至少4個CDR、或至少5個CDR、或全部六個CDR。在其中全部6個CDR不存在之情形中，較佳地至少VH CDR3及VL CDR3存在。在例示性實施例中，該等抗體及其抗原結合片段包含Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之一的可變重(「VH」)鏈及/或可變輕(「VL」)鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1124組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1126組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1128組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1144組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1146組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1148組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1122具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1142具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1122之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1121之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1084組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1086組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1088組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1104組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1106組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1108組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1082之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1081之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1004組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1006組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1008組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1024組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1026組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1028組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1002具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1022具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1002之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1001之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1164組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1166組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1168組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1184組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1186組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1188組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1162具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1182具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1162之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1161之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1044組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1046組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1048組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1064組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1066組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1068組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1042之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1041之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈。
又，在一些實施例中，該等抗PACAP抗體及抗原結合片段可包含任何所揭示抗體之序列變異體，該等序列變異體藉由突變誘發(例如親和力成熟)經修飾以改變一或多種特性，諸如結合親和力或免疫原性。
在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段直接地或間接地連接於另一部分，諸如可偵測標記或治療劑。
在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R；及/或抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由GAG；抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
在另一實施例中，該等人類或人類化抗PACAP抗體及其抗原結合片段適用於治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體。
在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段實質上不與VIP相互作用(亦即，結合)。較佳地，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段如與VIP相比對PACAP具有較強親和力，亦即，儘管存在一些交叉反應性，該等抗體如與VIP相比優先結合於PACAP。例如，該等抗體及其抗原結合片段對PACAP之親和力為該等抗體及其抗原結合片段對VIP之親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更強(例如，該抗體或片段結合於人類PACAP之KD 比結合於VIP之KD 低10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍或30000000倍)。
在一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段連接於至少一種效應子部分，例如其包含化學連接子。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段連接於一或多種可偵測部分，例如其包含螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物。
在一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段連接於一或多種官能部分。
本發明亦涵蓋針對如上文所述之抗PACAP抗體及其抗原結合片段產生之抗體，例如抗個體基因型抗體。此外，本發明提供一種使用該抗個體基因型抗體來監測該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段在個體中之活體內水準或中和在正投與該抗PACAP抗體或其抗原結合片段之個體中的該抗PACAP抗體之方法。
此外，本發明涵蓋一種適用於治療、預防或診斷用途之組合物，其包含治療、預防或診斷有效量的至少一種如本文所述之抗PACAP抗體或其抗原結合片段。詳言之，本文提供用於治療或預防偏頭痛或其他頭痛適應症之含有本發明抗PACAP抗體或其結合片段之組合物及劑型。本文亦提供用於治療或預防畏光之含有本發明抗PACAP抗體或其結合片段之劑型。該組合物可適用於皮下投與、肌肉內投與及/或靜脈內投與。該組合物可經凍乾。在一些實施例中，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑或其混合物。
另外，在一些實施例中，該組合物進一步包含另一活性劑，例如化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑及止吐劑。較佳地，該另一治療劑為止痛劑，例如NSAID、類阿片止痛劑、抗體(例如抗人類神經生長因子(「NGF」)抗體或抗體片段；或抗人類CGRP或抗人類CGRP-受體抗體或抗體片段)；或非抗體生物製劑，諸如NGF或CGRP多肽片段或結合物；或BOTOX®(肉毒桿菌毒素)。與本發明抗PACAP抗體組合使用之合適NSAID包括但不限於環加氧酶1及/或環加氧酶2抑制劑；丙酸衍生物，包括伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen/naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)及酮洛芬(ketoprofen)；乙酸衍生物，包括妥美丁(tolmetin)及舒林酸(sulindac)；芬那酸衍生物，包括甲芬那酸(mefenamic acid)及甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；聯苯基甲酸衍生物，包括二氟尼柳(diflunisal)及氟苯柳(flufenisal)；及昔康類，包括吡羅昔康(piroxim)、舒多昔康(sudoxicam)及伊索昔康(isoxicam)。與本發明抗PACAP抗體組合使用之合適類阿片止痛劑包括例如可待因(codeine)、二氫可待因、嗎啡或嗎啡衍生物或其醫藥學上可接受之鹽、二乙醯基嗎啡、氫可酮(hydrocodone)、氫嗎啡酮(hydromorphone)、左啡諾(levorphanol)、氧化嗎啡酮(oxymorphone)、阿芬太尼(alfentanil)、布諾啡(buprenorphine)、布托啡諾(butorphanol)、芬太奴(fentanyl)、舒芬太尼(sufentanil)、得美樂(meperidine)、美沙酮(methadone)、納布啡(nalbuphine)、丙氧芬(propoxyphene)及鎮痛新(pentazocine)、或其醫藥學上可接受之鹽。該類阿片止痛劑及該抗PACAP抗體或其抗原結合片段之組合投與可增加由此引起之止痛效應。
本發明進一步涵蓋一或多種編碼本文所述的抗PACAP抗體或抗原結合片段之分離核酸序列，以及一或多種含有此或此等分離核酸序列之載體。
另外，本發明提供包含此或此等分離核酸序列或上文所陳述之載體的宿主細胞。該宿主細胞可為選自由幼倉鼠腎(「BHK」)細胞；中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞；小鼠足細胞(「TM4」細胞)；非洲綠猴腎細胞(「VERO-76」細胞)；人類子宮頸癌(「HELA」)細胞；犬腎細胞(「MDCK」)；布法羅大鼠肝(「BRL」)細胞；人類肺細胞；人類肝(「Hep G2」)細胞；小鼠乳房腫瘤(「MMT」)細胞；TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞組成之群的哺乳動物真核宿主細胞。較佳地，該哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。更佳地，該哺乳動物宿主細胞為CHO K1細胞。該宿主細胞可為原核細胞(亦即，細菌細胞)或真核細胞(包括哺乳動物、真菌、酵母、禽或昆蟲細胞)。在一實施例中，該宿主細胞為絲狀真菌或為酵母細胞。較佳地，該酵母物種具有畢赤酵母屬。最佳地，該畢赤酵母屬物種係選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母及多形漢森酵母(安格斯畢赤酵母)。
本發明進一步提供一種表現抗PACAP抗體及其抗原結合片段、典型地人類、人類化或嵌合抗體及其抗原結合片段之方法，該方法包含在提供該抗體或其抗原結合片段之表現的條件下培養本文所述之宿主細胞。該宿主細胞可為細胞培養物，諸如中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞，或穩定地表現且分泌至少10-25 mg/公升之該抗體或其抗原結合片段至培養基中的多倍體酵母培養物。該多倍體酵母可藉由如下方法製造，該方法包含：(i)將至少一種含有一或多種可操作地連接至啟動子及信號序列之編碼該抗體的異源聚核苷酸之表現載體引入至單倍體酵母細胞中；(ii)藉由交配或球形質體融合由該第一及/或第二單倍體酵母細胞產生多倍體酵母；(iii)選擇穩定地表現該抗體之多倍體酵母細胞；及(iv)由穩定地表現該抗體至培養基中之該等多倍體酵母細胞產生穩定多倍體酵母培養物。較佳地，該酵母物種具有畢赤酵母屬。
在其他實施例中，該哺乳動物細胞培養物可藉由如下方法製造，該方法包含：(i)將至少一種含有一或多種可操作地連接至啟動子及信號序列之編碼該抗體的異源聚核苷酸之表現載體引入至哺乳動物細胞中；(ii)產生用於培養之單細胞以表現一或多種編碼該抗體的異源聚核苷酸；(iii)選擇穩定地表現該抗體之哺乳動物細胞；及(iv)由穩定地表現該抗體至培養基中之該哺乳動物細胞產生細胞培養物。較佳地，該等哺乳動物物種為CHO細胞。
本發明進一步係關於抗PACAP抗體及其抗原結合片段、較佳地人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體或其片段之治療及診斷用途。
在一實施例中，本發明提供一種用於阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法包含向個體投與有效量之拮抗、抑制、中和或阻斷至少一種與人類PACAP有關之生物效應的人類或人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段。在一特定實施例中，該方法使用特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明提供一種用於阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法包含向個體投與有效量之拮抗、抑制、中和或阻斷至少一種與人類PACAP有關之生物效應且實質上不與VIP相互作用(結合)的人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，例如該抗PACAP抗體或其抗原結合片段如與VIP相比對PACAP具有較強親和力，亦即，儘管存在一些交叉反應性，該等抗體如與VIP相比優先結合於PACAP。例如，該抗體或其抗原結合片段對PACAP之親和力為該抗體或其抗原結合片段對VIP之親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更高(例如，該抗體或片段結合於人類PACAP之KD 比結合於VIP之KD 低10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更低)。在一特定實施例中，該方法使用特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明提供一種用於阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法包含向個體投與有效量之人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R；及/或能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由GAG；抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。在一特定實施例中，該方法使用特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防個體中之頭痛或偏頭痛的發作、頻率、嚴重程度或持續時間之方法，該方法包含向個體投與有效量之人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；能夠抑制PACAP結合於PAC1-R；及/或能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由GAG；抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防人類個體中與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的方法。
在一特定實施例中，該方法使用特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段。該抗原決定基可使用例如丙胺酸掃描突變策略來鑑別。
在一特定實施例中，藉由投與本發明抗PACAP抗體及其抗原結合片段治療及/或預防之頭痛或偏頭痛係選自具有或不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛及緊張性頭痛。
在另一特定實施例中，該個體具有與畏光有關之眼部病症，其選自由色盲、無虹膜畸形、由抗膽鹼藥物引起之畏光、無晶狀體(缺乏眼睛的晶狀體)、牛眼症(角膜與虹膜之間異常窄的角)、白內障、視錐細胞營養不良、眼睛先天異常、病毒性結膜炎(「火眼」)、角膜擦破、角膜營養不良、角膜潰瘍、角膜上皮破裂、晶狀體異位、眼內炎、由疾病、損傷或感染引起之眼睛創傷(諸如瞼板腺囊腫、鞏膜外層炎、青光眼、圓錐形角膜或視神經發育不全、水眼、或先天性青光眼虹膜炎、視神經炎、色素分散症候群、瞳孔擴大(天然或以化學方式誘導)、視網膜脫落、角膜或鞏膜瘢痕形成及葡萄膜炎)組成之群。
在另一特定實施例中，該個體具有與畏光有關之神經系統相關或神經病狀，其選自由泛自閉症障礙、希阿里畸形(Chiari malformation)、誦讀困難、包括肌痛性腦脊髓炎(亦稱作「慢性疲勞症候群」)在內之腦炎、腦膜炎、蛛網膜下出血、後面顱窩腫瘤、僵直性脊椎炎、白化病、核黃素缺乏病、苯二氮平類(長期使用或戒斷苯二氮平類)、化學療法、屈公病(chikungunya)、胱胺酸病、艾登二氏症候群(Ehlers-Danlos syndrome)、宿醉、流行性感冒、傳染性單核白血球增多症、缺鎂症、汞中毒、偏頭痛、狂犬病及II型酪胺酸血症(亦稱作「Richner-Hanhart症候群」)組成之群。
在另一特定實施例中，該個體具有與畏光有關之病症，其選自由偏頭痛(具有或不具有先兆)、虹膜炎、葡萄膜炎、腦膜炎、抑鬱症、躁鬱症、叢集性頭痛或另一種三叉自律神經性頭痛(「TAC」)或瞼痙攣、抑鬱症、曠野恐怖、創傷後壓力病症(「PTSD」)、創傷性腦損傷及躁鬱症組成之群。
在另一實施例中，本發明提供一種用於中和PACAP誘導之PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R信號傳導的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。
在另一實施例中，本發明提供一種用於抑制PACAP誘導之cAMP產生的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。
在另一實施例中，本發明提供一種用於抑制PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防個體中與升高之PACAP水準有關的病狀之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段特異性結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與選自Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。該抗原決定基可使用例如丙胺酸掃描突變策略來鑑別。
適用於本發明之例示性抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含具有與選自SEQ ID NO: 1122；1082；1002；1162；及1042之VH 鏈具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100%序列一致性之胺基酸序列的VH 鏈，及/或具有與選自選自SEQ ID NO: 1142；1102；1022；1182；1062之VL 鏈具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100%序列一致性之胺基酸序列的VL 鏈，及/或其中所包含之至少2、3、4、5或全部6個CDR。
在一實施例中，用於該等方法之抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R。在另一實施例中，用於該等方法之抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者。較佳地，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R。
更特定言之，根據本發明之用於該等方法之抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包括人類、人類化及嵌合抗體及其片段，以及scFv、駱駝抗體、鯊魚抗體、奈米抗體、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、雙特異性抗體、單價抗體片段及F(ab')2 片段。另外，根據本發明之由該等方法使用之抗PACAP抗體或其抗原結合片段可實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化。在一實施例中，用於所涵蓋方法之抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含人類恆定域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在另一實施例中，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含已經修飾以改變(增強或削弱)效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區。例如，該Fc區可含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變。
在一實施例中，本發明方法使用以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之KD 結合於PACAP的抗PACAP抗體或其抗原結合片段。較佳地，該人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之KD 結合於PACAP。更佳地，該等方法使用以小於約100 nM、小於約40 nM、小於約1 nM、小於約100 pM、小於約50 pM或小於約25 pM之KD 結合於PACAP的人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段。或者，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段以約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP。在另一實施例中，該人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(koff )結合於PACAP。
在另一實施例中，用於本發明方法之抗PACAP抗體或其抗原結合片段直接地或間接地連接於另一部分，諸如可偵測標記或治療劑；連接於至少一種效應子部分，例如其包含化學連接子；及/或連接於一或多種可偵測部分，例如其包含螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物；及/或連接於一或多種官能部分。
在另一實施例中，該方法進一步包含分別地投與或共投與另一試劑，例如選自化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑及止吐劑。較佳地，該另一治療劑為止痛劑，例如NSAID (諸如環加氧酶1及/或環加氧酶2抑制劑；丙酸衍生物，包括伊布洛芬、萘普生(naproxen/naprosyn)、雙氯芬酸及酮洛芬；乙酸衍生物，包括妥美丁及舒林酸；芬那酸衍生物，包括甲芬那酸及甲氯芬那酸；聯苯基甲酸衍生物，包括二氟尼柳及氟苯柳；及昔康類，包括吡羅昔康、舒多昔康及伊索昔康)、類阿片止痛劑(諸如嗎啡或嗎啡衍生物或其醫藥學上可接受之鹽；可待因、二氫可待因、二乙醯基嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡諾、氧化嗎啡酮、阿芬太尼、布諾啡、布托啡諾、芬太奴、舒芬太尼、得美樂、美沙酮、納布啡、丙氧芬及鎮痛新或其醫藥學上可接受之鹽)、另一抗體(諸如抗NGF抗體或抗體片段或抗CGRP或抗CGRP受體(「抗CGRP-R」)抗體或抗體片段)、或非抗體生物製劑(例如BOTOX®)。
在一實施例中，該類阿片止痛劑及該抗PACAP抗體或其抗原結合片段之組合投與如與單獨投與之該類阿片止痛劑或該抗PACAP抗體或其抗原結合片段相比會增加止痛效應。
在另一實施例中，個體先前已經治療(「經治療個體」)且接受抗CGRP或抗CGRP-R抗體或其抗體片段。經治療個體可為未適當地回應於抗CGRP或抗CGRP-R抗體治療之偏頭痛患者(「不良回應者」)。或者，經治療個體可先前已接受至少一種抗CGRP或抗CGRP-R抗體或其抗體片段投與，且已引起對該抗體或其抗體片段之免疫反應。例示性抗CGRP及抗CGRP-R抗體及其抗體片段揭示於美國專利第9,102,731號；第9,115,194號；第8,734,802號；第8,623,366號；第8,597,649號；及第8,586,045號；及美國專利申請公開案第20120294822號、第20120294802號及第20120294797號，其中每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明之一態樣大體上係關於抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗人類PACAP抗體或其抗體片段，其可特異性結合於人類PACAP上與選自Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9、Ab9.H及Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。此外，本發明大體上係關於可特異性結合於人類PACAP上與Ab9或Ab9.H相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體及其抗原結合片段，其可包括人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段。另外，本發明之一實施例係關於抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗人類PACAP抗體或其抗體片段，其可實質上不與VIP相互作用(結合)。
在另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包括人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段，其可包含或可引起以下效應之一：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，大概經由GAG；(k)抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或(l)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
本發明另外涵蓋抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段，其可適用於治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體。本發明之一額外實施例係關於抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段，其可特異性結合於人類PACAP上與Ab9.H相同或重疊的線性或構形抗原決定基，例如該抗體或其抗體片段與人類PACAP之殘基7、10、12、13、14及17中的至少1者、2者、3者、4者、5者或全部6者相互作用。
本發明之另一實施例涵蓋抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段，其可包含Ab3.H之重鏈CDR2。在另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段可包含Ab3.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
本發明之另一實施例涵蓋抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段，其可包含Ab5.H之重鏈CDR2。在另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段可包含Ab5.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段較佳地為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 804組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 806組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 808組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 824組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 826組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 828組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含含有與SEQ ID NO: 802具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或包含與SEQ ID NO: 822具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 802之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 822之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 801之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 821之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1124組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1126組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1128組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1144組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1146組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1148組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1122具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1142具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1122之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1121之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1084組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1086組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1088組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1104組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1106組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1108組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1082之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)包含與SEQ ID NO: 1081具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1101具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1081之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1004組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1006組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1008組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1024組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1026組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1028組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1002具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1022具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1002之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1001之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1164組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1166組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1168組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1184組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1186組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1188組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1162具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1182具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1162之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1161之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈。
在另一特定實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1044組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1046組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1048組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1064組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1066組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1068組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1042之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1041具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1061具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1041之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈。
在本發明之一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗體片段可結合PACAP之抗原決定基，其中由該抗體結合的該抗原決定基可藉由丙胺酸掃描(例如，如實例12中所揭示)或另一本領域認可的方法來鑑別。
另外，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段可包括人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段可選自由scFv、駱駝抗體、奈米抗體、免疫球蛋白新抗原受體(「IgNAR」)、片段抗原結合(「Fab」)片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、單價抗體片段及F(ab’)2片段組成之群。在另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段可實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化。另外，本發明涵蓋本發明之一實施例，其中本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段可包含人類恆定域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其片段之人類恆定域。
本發明之一額外實施例係關於抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段可包含已經修飾以改變效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區，例如，其中該Fc區含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變，及/或該Fc區可包含SEQ ID NO:1244、1245或1246中任一者之序列。
在本發明之另一實施例中，抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段可以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之結合親和力(KD )結合於PACAP，例如，如藉由ELISA、生物層干涉術(「BLI」)、KINEXA或表面電漿共振在25℃或37℃下所測定。另外，本發明之另一實施例係關於抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其中該等抗體或抗體片段可以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之結合親和力(KD )結合於PACAP。另外，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段可包括以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(koff )結合於PACAP之抗PACAP抗體或抗體片段。
本發明之另一實施例係關於抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其中該等抗體及抗體片段可直接地或間接地連接於可偵測標記或治療劑。
在本發明之另一實施例中，抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段可以小於約100 nM之KD ；以小於約40 nM之KD ；以小於約100 pM之KD ；以小於約50 pM之KD ；以小於約25 pM之KD ；或以約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP。本發明亦涵蓋抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其如與VIP相比可對PACAP具有較強結合親和力及/或可不結合於VIP，及/或其中該等抗體或其抗體片段可對PACAP具有親和力，該親和力可為該抗體或抗體片段對VIP之親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更強。
在另一實施例中，本發明係關於抗PACAP抗體及抗原結合片段，較佳地人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，其可連接於至少一種效應子或官能部分及/或一或多種可偵測部分，例如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物。
本發明之另一實施例係關於可針對抗PACAP抗體或抗體片段產生之抗個體基因型抗體，其中該等抗個體基因型抗體視情況中和其所結合之抗PACAP抗體的一或多種生物效應。本發明之一實施例亦可關於一種使用該抗個體基因型抗體來監測該抗PACAP抗體或抗體片段在個體中之活體內水準或中和該抗PACAP抗體在個體中之活體內效應的方法。
在另一實施例中，本發明係關於一種可適用於治療、預防或診斷用途之組合物，由此該組合物可包含治療、預防或診斷有效量之至少一種抗PACAP抗體或抗體片段或抗個體基因型抗體，例如，其中該組合物可適用於皮下投與，及/或適用於靜脈內或肌肉內投與。本發明亦涵蓋本發明之一實施例，其中至少一種抗PACAP抗體或抗體片段或抗個體基因型抗體之該組合物可經凍乾、穩定化、及/或經調配以藉由注射投與。本發明亦涵蓋本發明之一實施例，其中至少一種抗PACAP抗體或抗體片段或抗個體基因型抗體之該組合物可包含醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑或其混合物。本發明之該組合物可進一步包含至少一種其他活性劑，例如，其中該其他活性劑可選自由化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑、止吐劑及/或細胞毒素組成之群。
本發明之另一實施例涵蓋一或多種可編碼抗PACAP抗體或抗體片段或抗個體基因型抗體之分離核酸序列，且其中該或該等分離核酸序列可含於一或多種載體內。另外，在本發明之一實施例中，宿主細胞可包含該或該等分離核酸序列及/或該或該等載體，其中該宿主細胞可為哺乳動物、細菌、真菌、酵母、禽、兩棲動物、植物、CHO或昆蟲細胞。其中該宿主細胞可為絲狀真菌或酵母，該宿主細胞可選自以下屬：阿克斯酵母屬(Arxiozyma )；埃克波眉酵母屬(Ascobotryozyma )；固囊酵母屬(Citeromyces )；德巴利酵母屬(Debaryomyces )；德克酵母屬(Dekkera )；假囊酵母屬(Eremothecium )；伊薩酵母屬(Issatchenkia )；哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )；柯達酵母屬(Kodamaea )；洛德酵母屬(Lodderomyces )；管囊酵母屬(Pachysolen )；畢赤酵母屬(Pichia )；酵母菌屬(Saccharomyces )；土星形酵母屬(Saturnispora )；特派斯酵母屬(Tetrapisispora )；孢圓酵母屬(Torulaspora )；擬威爾酵母屬(Williopsis )；及接合酵母屬(Zygosaccharomyces )，較佳地畢赤酵母屬且更佳地巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica )或多形漢森酵母(Hansenula polymorpha ) (安格斯畢赤酵母(Pichia angusta ))。
本發明亦係關於一種表現抗PACAP抗體或抗體片段之方法，該方法可包含在可提供該抗體或抗體片段之表現的條件下培養任何但不限於本文所揭示之宿主細胞。在另一實施例中，本發明亦涵蓋一種在宿主細胞中表現抗PACAP抗體或抗體片段之方法，其中該宿主細胞可為可穩定地表現且分泌至少10-25 mg/公升之該抗體或抗原結合片段至培養基中的多倍體酵母培養物或CHO細胞。在另一實施例中，本發明係關於一種表現抗PACAP抗體或抗體片段之方法，其中表現可使用作為宿主細胞之該多倍體酵母、較佳地畢赤酵母屬酵母而發生，且該多倍體酵母細胞可藉由如下方法製得，該方法包含：(i)將至少一種含有一或多種可操作地連接至啟動子及信號序列之編碼該抗體的異源聚核苷酸之表現載體引入至單倍體酵母細胞中；(ii)藉由交配或球形質體融合由該第一及/或第二單倍體酵母細胞產生多倍體酵母；(iii)選擇穩定地表現該抗體之多倍體酵母細胞；及(iv)由穩定地表現該抗體至培養基中之該等多倍體酵母細胞產生穩定多倍體酵母培養物。
本發明之另一態樣大體上係關於一種可阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的根據本發明之抗PACAP抗體或抗原結合片段。本發明之一額外實施例係關於一種可阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的有效量的根據本發明之抗PACAP抗體或抗原結合片段或根據本發明之組合物，其可拮抗、抑制、中和或阻斷至少一種與人類PACAP有關之生物效應且可實質上不與VIP相互作用(結合)。
另外，本發明係關於一種可阻斷、抑制或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的根據本發明之抗PACAP抗體或抗原結合片段或根據本發明之組合物，其可引起或可包含以下一或多者：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(k)抑制PACAP誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生；及/或(l)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
本發明之一額外實施例係關於一種可治療或預防個體中之頭痛或偏頭痛的發作、頻率、嚴重程度或持續時間的方法，例如其中該頭痛或偏頭痛可選自具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、慢性偏頭痛、藥物過度使用頭痛及緊張性頭痛，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的根據本發明之人類、人類化或嵌合抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或根據本發明之組合物，其可引起或可包含以下一或多者：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(k)抑制PACAP誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生；及/或(l)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
本發明之另一實施例涵蓋一種可治療可具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及神經元激活中至少一者或上述任一者的組合有關之急性、偶爾發生或慢性病狀之人類個體的方法，其中該方法可包含向有需要之個體投與有效量的根據本發明之抗PACAP抗體或抗原結合片段或根據本發明之組合物。
本發明另外涵蓋一種可阻斷、抑制或中和一或多種可與PACAP有關之生物效應的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的可特異性結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或可競爭結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或根據本發明之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或根據本發明之組合物。
本發明另外涵蓋一種可中和PACAP誘導之PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R信號傳導的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的可特異性結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或可競爭結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如本文所論述之抗PACAP抗體或抗原結合片段或如本文所論述之組合物。
在另一實施例中，本發明涵蓋一種可抑制垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的可特異性結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或可競爭結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如本文所論述之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如本文所論述之組合物。
本發明之另一實施例係關於一種可抑制垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)誘導之血管擴張的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的可特異性結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或可競爭結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如本文所論述之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如本文所論述之組合物。
在另一實施例中，本發明係關於一種可治療或預防個體中與升高之抗人類垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)水準有關之病狀的方法，該方法可包含向有需要之個體投與有效量的可特異性結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或可競爭結合於人類PACAP上與可包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如本文所論述之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如本文所論述之組合物。
本發明亦係關於任何本文所論述之方法，其中該抗體或抗原結合片段可為可特異性結合於人類PACAP上與可選自Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9、Ab9.H及Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之人類化抗PACAP抗體或抗原結合片段。本發明亦係關於任何本文所論述之方法，其中該抗PACAP抗體或抗原結合可實質上不與血管活性腸肽(「VIP」)相互作用(結合)。
本發明另外係關於任何本文所論述之方法，其中抗體或抗原結合片段可包含或可引起以下效應之一：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(k)抑制PACAP誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生；及/或(l)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
本發明另外涵蓋任何本文所論述之方法，其中該抗體或抗原結合片段可適用於治療可具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀之人類個體。
本發明亦係關於任何本文所揭示之方法，其可藉由抗PACAP抗體實現，該抗PACAP抗體可為人類抗體或其抗原結合片段；及/或其中該抗體可為人類化抗體或其抗原結合片段；及/或其中該抗體可為嵌合抗體或其抗原結合片段。
本發明之另一實施例亦係關於任何本文所論述之方法，其中本發明之抗PACAP抗體或抗體片段可結合於PACAP27及/或PACAP38且可阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R。本發明之另一實施例係關於任何本文所論述之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可結合於PACAP27及/或PACAP38且可阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者。本發明之另一實施例係關於任何本文所論述之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可結合於PACAP27及/或PACAP38且可阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R表現細胞。另外，可關於任何本文所揭示之方法之本發明之該抗PACAP抗體或抗體片段可對PACAP具有親和力，該親和力可為該抗體或抗體片段對VIP之親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更強。
本發明涵蓋一種可阻斷、抑制、阻斷或中和個體中與PACAP有關之一或多種生物效應的方法，該方法可包含向該個體投與治療或預防有效量的人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段可拮抗、抑制、中和或阻斷與人類PACAP有關之至少一種生物效應，且其中該個體可具有可選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、緊張性頭痛、普通頭痛、熱潮紅、畏光、慢性陣發性半側顱痛、歸因於頭部潛在結構問題之繼發性頭痛、歸因於頸部潛在結構問題之繼發性頭痛、腦神經痛、竇性頭痛、與竇炎有關之頭痛、過敏誘導之頭痛、過敏誘導之偏頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、反射性交感神經失養症、疼痛、慢性疼痛、發炎疼痛、術後切口疼痛、術後疼痛、創傷相關疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、複雜性區域疼痛症候群、癌症疼痛、原發性或轉移性骨癌疼痛、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、由燒傷引起之疼痛、痛風關節疼痛、與鐮狀細胞危象有關之疼痛、與顳頜關節病症有關之疼痛、硬化、肝炎、神經性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟疼痛、痛經、卵巢痛、骨關節炎疼痛、類風濕性關節炎疼痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、消化不良、腸易激症候群、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、迴腸炎、潰瘍性結腸炎、腎絞痛、痛經、膀胱炎、間質性膀胱炎、月經期、分娩、停經、胰臟炎、精神分裂症、抑鬱症、創傷後壓力病症(「PTSD」)、焦慮症、自體免疫糖尿病、休格輪氏症候群(Sjögren’s syndrome)、多發性硬化、膀胱過動症、枝氣管高反應性、氣喘、中風、枝氣管炎、枝氣管擴張、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(「COPD」)、發炎性皮炎、腺組織腺癌、器官胚性組織胚細胞瘤、上皮組織癌瘤、形成血細胞之組織的白血病、淋巴組織淋巴瘤、骨髓之骨髓瘤、結締組織或支撐組織肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌腫瘤、子宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞減少症、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭部癌、頸部癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病、神經系統腫瘤、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌(stomach cancer)、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、骨髓癌、多發性骨髓瘤、轉移至骨骼之腫瘤、浸潤神經及空腔臟器之腫瘤、在神經結構附近之腫瘤、尋常性痤瘡、異位性皮炎、蕁麻疹、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及紅斑痤瘡、內皮功能障礙、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、冠心病(「CHD」)、冠狀動脈疾病(「CAD」)、心臟衰竭、外周動脈疾病(「PAD」)、糖尿病、肺性高血壓(「PH」)、結締組織病症、過敏性皮炎、牛皮癬、瘙癢、神經性皮膚發紅、紅斑、類肉瘤病、休克、敗血症、鴉片劑戒斷症候群、嗎啡耐受性及癲癇組成之群的病狀。另外，該個體可具有可選自由偏頭痛、頭痛及疼痛相關疾病或病狀組成之群的病狀，其中該頭痛或偏頭痛可選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、慢性偏頭痛、藥物過度使用頭痛及緊張性頭痛組成之群。另外，該個體可具有與畏光有關之眼部病症，其選自由色盲、無虹膜畸形、由抗膽鹼藥物引起之畏光、無晶狀體、牛眼症、白內障、視錐細胞營養不良、眼睛先天異常、病毒性結膜炎、角膜擦破、角膜營養不良、角膜潰瘍、角膜上皮破裂、晶狀體異位、眼內炎、由疾病引起之眼睛創傷、由損傷引起之眼睛創傷、由感染引起之眼睛創傷、瞼板腺囊腫、鞏膜外層炎、青光眼、圓錐形角膜、視神經發育不全、水眼、先天性青光眼虹膜炎、視神經炎、色素分散症候群、瞳孔擴大、視網膜脫落、角膜、鞏膜瘢痕形成及葡萄膜炎組成之群。此外，該個體可具有與畏光有關之神經系統相關或神經病狀，其選自由泛自閉症障礙、希阿里畸形、誦讀困難、腦炎、腦膜炎、蛛網膜下出血、後面顱窩腫瘤、僵直性脊椎炎、白化病、核黃素缺乏病、苯二氮平類、化學療法、屈公病、胱胺酸病、艾登二氏症候群、宿醉、流行性感冒、傳染性單核白血球增多症、缺鎂症、汞中毒、偏頭痛、狂犬病及II型酪胺酸血症組成之群。另外，該個體可具有畏光相關病症，其選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、虹膜炎、葡萄膜炎、腦膜炎、抑鬱症、躁鬱症、叢集性頭痛或另一種三叉自律神經性頭痛(「TAC」)或瞼痙攣、抑鬱症、曠野恐怖及躁鬱症組成之群。
本發明之另一實施例大體上係關於任何本文所論述之方法，其中該等方法中任一者之抗體可為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段。另外，本發明可關於任何本文所揭示之方法，其中該等方法中任一者之抗體或抗原結合片段可特異性結合於人類PACAP上與Ab9或Ab9.H相同或重疊的線性或構形抗原決定基，例如，該抗體或抗原結合片段可與人類PACAP之殘基7、10、12、13、14及17中的至少1者、2者、3者、4者、5者或全部6者相互作用。
另外，本發明可關於任何本文所揭示之方法，其中該抗體或抗原結合片段可包含Ab3.H之重鏈CDR2；及/或其中該抗體或抗原結合片段可包含Ab3.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
另外，本發明可關於任何本文所揭示之方法，其中該抗體或抗原結合片段可包含Ab5.H之重鏈CDR2；及/或其中該抗體或抗原結合片段可包含Ab5.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段較佳地為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體及其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 804組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 806組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 808組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 824組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 826組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 828組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含含有與SEQ ID NO: 802具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或包含與SEQ ID NO: 822具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 802之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 822之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 801之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 821之輕鏈。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1124組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1126組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1128組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1144組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1146組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1148組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1122具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1142具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1122之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1121之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1084組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1086組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1088組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1104組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1106組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1108組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1082之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)包含與SEQ ID NO: 1081具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1101具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1081之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1004組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1006組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1008組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1024組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1026組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1028組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1002具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1022具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1002之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1001之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含由SEQ ID NO: 1164組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1166組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1168組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含由SEQ ID NO: 1184組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1186組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1188組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1162具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1182具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1162之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1161之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈。
在另一特定實施例中，本發明亦涵蓋任何本文所揭示之方法，其中根據本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段，且包含(a)可變重鏈，其包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1044組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1046組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1048組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，其包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1064組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1066組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1068組成之CDR3序列。或者，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈。在另一實施例中，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1042之可變重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)包含與SEQ ID NO: 1041具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1061具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈。更特定言之，該等抗PACAP抗體及其抗原結合片段可包含(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1041之重鏈，及/或(b)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈。
在另一實施例中，本發明大體上係關於任何本文所論述之方法，其中由該抗體結合之抗原決定基可藉由丙胺酸掃描(例如，如實例12中所揭示)或藉由另一本領域認可的方法來鑑別。
本發明亦係關於任何本文所揭示之方法，其中該等抗PACAP抗體或抗體片段可選自由scFv、駱駝抗體、奈米抗體、免疫球蛋白新抗原受體(「IgNAR」)、片段抗原結合(「Fab」)片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、單價抗體片段及F(ab')2片段組成之群。另外，本發明係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化。另外，本發明係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可包含人類恆定域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體之人類恆定域。
本發明之另一態樣係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可包含已經修飾以改變效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區，及/或該Fc區可包含SEQ ID NO:1244、1245或1246中任一者之序列。例如，該Fc區可含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變。
本發明之另一態樣係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之結合親和力(KD )結合於PACAP。另外，任何本文所揭示之方法之該抗PACAP抗體或抗體片段可以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之結合親和力(KD )結合於PACAP。本發明之另一實施例係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(koff )結合於PACAP。
此外，本發明涵蓋任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可直接地或間接地連接於可偵測標記或治療劑。另外，本發明係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可以可小於約100 nM、小於約40 nM、小於約1 nM、小於約100 pM、小於約50 pM或小於約25 pM之KD 結合於PACAP。另外，本發明涵蓋任何本文所揭示之方法，其中該抗PACAP抗體或抗體片段可以約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP。本發明進一步係關於任何本文所揭示之方法，其中該方法可進一步包含分別地投與或共投與另一試劑，例如，其中該另一試劑可選自化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑、止吐劑或細胞毒素。另外，本發明涵蓋任何本文所揭示之方法，其中該另一治療劑可為止痛劑，且該止痛劑可為非類固醇消炎藥(「NSAID」)、類阿片止痛劑、另一抗體或非抗體生物製劑，且進一步其中該另一抗體可為抗NGF抗體或抗體片段；及/或可為抗抑鈣素基因相關肽(「CGRP」)抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段。本發明亦係關於任何本文所揭示之方法，其中該NSAID可為環加氧酶1及/或環加氧酶2抑制劑；及/或其中該NSAID可選自由(1)丙酸衍生物，包括伊布洛芬、萘普生(naproxen/naprosyn)、雙氯芬酸及酮洛芬；(2)乙酸衍生物，包括妥美丁及舒林酸；(3)芬那酸衍生物，包括甲芬那酸及甲氯芬那酸；(4)聯苯基甲酸衍生物，包括二氟尼柳及氟苯柳；及(5)昔康類，包括吡羅昔康、舒多昔康及伊索昔康組成之群。本發明進一步係關於任何本文所揭示之方法，其中該類阿片止痛劑可選自由可待因、二氫可待因、二乙醯基嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡諾、氧化嗎啡酮、阿芬太尼、布諾啡、布托啡諾、芬太奴、舒芬太尼、得美樂、美沙酮、納布啡、丙氧芬、鎮痛新及其醫藥學上可接受之鹽組成之群；及/或其中該類阿片止痛劑可為嗎啡或嗎啡衍生物或其醫藥學上可接受之鹽；及/或其中該類阿片止痛劑及該抗PACAP抗體或抗原結合片段之組合投與如與單獨投與之該類阿片止痛劑或該抗PACAP抗體或抗原結合片段相比可增加止痛效應。
本發明另外係關於任何本文所揭示之方法，其中該抗體或抗原結合片段可連接於至少一種效應子或官能部分及/或一或多種可偵測部分，例如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物。
此外，本發明係關於任何本文所揭示之方法，其中任何本文所揭示之方法的個體可先前已接受抗CGRP抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段；及/或其中該個體可為可未適當地回應於抗CGRP抗體及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段治療之偏頭痛患者；及/或其中該個體可先前已接受至少一種抗CGRP抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段投與，該投與可已引起對該抗CGRP抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段之免疫反應。
定義 應瞭解，本發明不限於所描述之特定方法、方案、細胞株、動物物種或屬、及試劑，照此可變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲限制本發明之範圍，該範圍將僅受隨附申請專利範圍限制。除非本文另外清楚指示，否則如本文所用，單數形式「一(a)」、「一(and)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，對「細胞(a cell)」之提及包括複數個該等細胞且對「該蛋白(the protein)」之提及包括提及熟習此項技術者已知之一或多種蛋白及其相等物等。除非清楚地另外指示，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之相同意義。
垂體腺苷酸環化酶激活多肽 (PACAP) ：如本文所用，除非另外規定，否則PACAP包括PACAP之任何哺乳動物形式，且詳言之涵蓋以下智人PACAP27及智人PACAP38胺基酸序列： PACAP38：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO: 1241)，其中C端離胺酸經醯胺化；以及此序列之任何突變體、剪接變異體、同功異型物、直系同源物、同系物及變異體。 PACAP27：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 1242)，其中C端白胺酸經醯胺化；以及此序列之任何突變體、剪接變異體、同功異型物、直系同源物、同系物及變異體。
「畏光」在本文中係指對視覺光覺異常不耐受之症狀，有時另外藉由對光之異常或無理性恐懼或藉由眼睛之實際物理光敏性定義。在本發明中，畏光詳言之包括與偏頭痛、叢集性頭痛及可觸發偏頭痛或叢集性頭痛之厭光行為的其他神經學原因有關之厭光。患者/個體可由於與眼睛或神經系統有關之數種不同醫學病狀而發展畏光。畏光可藉由視覺系統中在任何步驟處開始之光反應增加而引起，諸如：(i)過多光進入眼睛，(ii)如果眼睛受損，諸如具有角膜擦破及視網膜損壞，或如果瞳孔不能正常地收縮(可見對動眼神經造成損壞)，那麼過多光可進入眼睛，(iii)過度刺激視網膜中之光感受器，(iv)視神經之過量電脈衝，及(v)中樞神經系統中之過量反應。
「有效治療或預防畏光」在本文中係指在投與有效量的根據本發明之抗PACAP抗體或其抗原結合片段之後抑制有需要之個體中的厭光行為或畏光或抑制厭光行為或畏光之發作，例如具有主動偏頭痛發作或叢集性頭痛之個體或傾向於偏頭痛或叢集性頭痛、或在本文中鑑別之其他畏光相關病症之一的個體。該治療可作為單一療法或與諸如妥泰或雙氫麥角胺之另一活性劑聯合實現。
術語「偏頭痛」係指複雜且失能神經病症，其可在四個階段期間進展：前驅症狀、先兆、頭痛及後期症狀。偏頭痛由國際頭痛協會定義為持續4-72小時之頭痛且特徵在於以下至少兩者：單側定位、脈動性質、中度至嚴重疼痛強度；及藉由諸如步行之移動加劇。另外，頭痛肯定伴隨以下至少一者:噁心及/或嘔吐、畏光或聲音恐怖。偏頭痛亦可伴隨先兆，該先兆典型地早於在前兆或前驅症狀期期間之最終期限，且通常導致視覺改變，例如在視場中移動之閃爍盲點。前驅症狀亦可伴隨其他症狀，例如疲勞、胃腸問題及情緒改變。偏頭痛患者通常在延長時期內喪失能力。後期症狀為末期且在發作之後出現，在此期間偏頭痛患者可感覺筋疲力盡或略微欣快。
術語「頭痛」係指頭部任何區域中之疼痛。頭痛可出現於頭部一側或兩側，經隔離至某一位置，在頭部自一個點發散，或具有老虎鉗樣性質。頭痛可為銳痛、悸跳感覺或鈍疼。頭痛可逐漸地或突然出現，且其可持續不足一小時或持續數日。
術語「疼痛相關疾病或病狀」係指全部或部分地藉由急性及/或慢性疼痛定義之任何疾病或病狀。疼痛一般地定義為與實際或潛在組織損壞有關之不適感覺及情緒經歷，或就該損壞而言加以描述。疼痛可分類為神經性、神經病變性、發炎或傷害感受性的。
術語「類阿片止痛劑」在本文中係指具有嗎啡樣作用之所有天然或合成藥物。合成及半合成類阿片止痛劑為五種化學類別之化合物的衍生物：菲；苯基庚胺；苯基哌啶；嗎啡喃；及苯并嗎啡烷，其均在該術語之範圍內。例示性類阿片止痛劑包括可待因、二氫可待因、二乙醯基嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡諾、氧化嗎啡酮、阿芬太尼、布諾啡、布托啡諾、芬太奴、舒芬太尼、得美樂、美沙酮、納布啡、丙氧芬及鎮痛新或其醫藥學上可接受之鹽。
術語「NSAID」係指非類固醇消炎化合物。NSAID憑藉其抑制環加氧酶之能力分類。環加氧酶1及環加氧酶2為環加氧酶之兩種主要同功異型物且最標準NSAID為該兩種同功異型物之混合抑制劑。最標準NSAID屬於以下五種結構種類之一：(1)丙酸衍生物，諸如伊布洛芬、萘普生(naproxen/naprosyn)、雙氯芬酸及酮洛芬；(2)乙酸衍生物，諸如妥美丁及舒林酸；(3)芬那酸衍生物，諸如甲芬那酸及甲氯芬那酸；(4)聯苯基甲酸衍生物，諸如二氟尼柳及氟苯柳；及(5)昔康類，諸如吡羅昔康、舒多昔康及伊索昔康。已描述選擇性抑制環加氧酶2之另一類NSAID。COX-2抑制劑已描述於例如美國專利第5,616,601號；第5,604,260號；第5,593,994號；第5,550,142號；第5,536,752號；第5,521,213號；第5,475,995號；第5,639,780號；第5,604,253號；第5,552,422號；第5,510,368號；第5,436,265號；第5,409,944號；及第5,130,311號中，該等美國專利特此以引用之方式併入。某些例示性COX-2抑制劑包括塞來昔布(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(CGP-28238)、美洛昔康、6-甲氧基-2萘基乙酸(6-MNA)、羅非昔布、MK-966、萘丁美酮(6-MNA之前藥)、尼美舒利、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614；或其組合。
如本文所用，「治療」為用於獲得有益或所需臨床結果之方法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下一或多者：諸如偏頭痛或頭痛之PACAP相關病狀的任何態樣之改良。例如在頭痛或偏頭痛治療之背景中，此包括減輕嚴重程度、緩解疼痛強度及其他相關症狀、降低復發頻率、增加遭受頭痛者之生活品質及減少治療頭痛所需之其他藥物的劑量。關於偏頭痛，其他相關症狀包括但不限於噁心、嘔吐及對光、聲音及/或移動敏感。關於叢集性頭痛，其他相關症狀包括但不限於在眼睛下方或周圍腫脹、眼淚過多、紅眼、鼻漏或鼻充血、及面紅。
「降低發病率」或「預防(prophylaxis)」或「預防(prevention)」意謂降低特定疾病、病狀、症狀或病症之嚴重程度中任一者(該等術語疾病、病狀及病症在本申請書中可互換使用)。嚴重程度之降低包括降低一般用於病狀之藥物及/或療法，例如降低藥物或療法之需要、量及/或暴露。嚴重程度之降低亦包括降低特定病狀、症狀或病症之持續時間及/或頻率(包括例如延遲或增加個體中下一陣發性發作之時間)。
「改善」頭痛或頭痛或偏頭痛或其他PACAP相關病狀之一或多種症狀意謂如與不投與抗PACAP拮抗劑抗體相比，該病狀(例如頭痛或偏頭痛)之一或多種症狀的減輕或改良。「改善」亦包括縮短或降低症狀之持續時間。
如本文所用，「控制頭痛」或「控制偏頭痛」或「控制」另一PACAP相關病狀係指維持或降低個體中該病狀(例如頭痛或偏頭痛)之一或多種症狀的嚴重程度或持續時間或頭痛或偏頭痛發作之頻率(如與治療前之水準相比)。例如，如與治療前之水準相比，個體中頭部疼痛之持續時間或嚴重程度、或發作頻率降低達至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中任一者。頭部疼痛之持續時間或嚴重程度、或發作頻率之降低可持續任何時間長度，例如2週、4週(1個月)、8週(2個月)、16週(3個月)、4個月、5個月、6個月、9個月、12個月等。
如本文所用，「延遲」PACAP相關病狀(諸如偏頭痛或頭痛)之發展意謂推遲、阻礙、減慢、延緩、穩定化及/或延期該病狀或疾病之進展。此延遲可具有變化時間長度，視該病狀或疾病之病史及/或所治療之個體而定。如熟習此項技術者應顯而易知，充足或顯著延遲可實際上涵蓋預防，因為個體不發展頭痛(例如，偏頭痛)。「延遲」症狀之發展的方法為當與不使用該方法相比時，降低在既定時段內發展該症狀之概率及/或降低在既定時段內該等症狀之程度。該等比較典型地基於使用統計學顯著數目之個體之臨床研究。
諸如偏頭痛或頭痛之PACAP相關病狀的「發展」或「進展」意謂該病症之初始呈現及/或隨後進展。頭痛或偏頭痛之發展可為可偵測的且使用如此項技術中熟知之標準臨床技術來分析。然而，發展亦指可無法偵測之進展。出於本發明之目的，發展或進展係指症狀之生物過程。「發展」包括發生、復發及發作。如本文所用，諸如頭痛或偏頭痛之病狀的「發作」或「發生」包括初始發作及/或復發。
如本文所用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」為足以實現有益或所需結果之量。關於預防性用途，有益或所需結果包括諸如消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度、或延遲疾病之開始的結果，包括該疾病、其併發症及在該疾病之發展期間存在的中間病理表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。關於治療性用途，有益或所需結果包括諸如降低頭痛發作之疼痛強度、持續時間或頻率、及減少由頭痛(包括其併發症及在該疾病之發展期間存在的中間病理表型)引起之一或多種症狀(生物化學、組織學及/或行為)、增加遭受該疾病者之生活品質、減少治療該疾病所需之其他藥物的劑量、增強另一藥物的效應及/或延遲患者疾病之進展的臨床結果。有效劑量可在一或多次投與中投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接地或間接地實現預防性或治療性治療之量。如臨床背景中應瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或可不聯合另一藥物、化合物或醫藥組合物來實現。因此，「有效劑量」可在投與一或多種治療劑之背景中考慮，且單一試劑若聯合一或多種其他試劑可實現或實現所需結果，則可考慮以有效量給予。
「合適宿主細胞」或「宿主細胞」一般而言包括任何細胞，其中本發明抗PACAP抗體及其抗原結合片段可使用容易獲得之技術及材料重組產生。例如，本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段可根據習知技術在經遺傳工程改造之宿主細胞中產生。合適宿主細胞為可經外源DNA轉型或轉染且在培養物中生長之彼等細胞類型，且包括細菌、真菌細胞(例如，酵母)及經培養之高等真核細胞(包括多細胞生物體之經培養細胞)，尤其經培養哺乳動物細胞，例如人類或非人類哺乳動物細胞。在一例示性實施例中，此等抗體可在CHO細胞中表現。用於操縱經選殖DNA分子及將外源DNA引入至多種宿主細胞中之技術由Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，及Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel等人編輯, New York, NY: Green and Wiley and Sons (1993)揭示。
在一些例示性實施例中，該等抗體可在交配勝任酵母中表現，例如可在培養物中生長之任何單倍體、二倍體或四倍體酵母。適用於醱酵表現方法之酵母可以單倍體、二倍體或其他多倍體形式存在。既定倍數性之細胞可在適當條件下以彼形式增殖持續無限數目的代。二倍體細胞亦可形成孢子以形成單倍體細胞。連續交配可經由二倍體菌株之進一步交配或融合產生四倍體菌株。本發明涵蓋單倍體酵母以及例如藉由交配或球形質體融合產生之二倍體或其他多倍體酵母細胞的用途。舉例而言，該酵母可包括酵母菌科之成員，該酵母菌科包括阿克斯酵母屬；埃克波眉酵母屬；固囊酵母屬；德巴利酵母屬；德克酵母屬；假囊酵母屬；伊薩酵母屬；哈薩克斯坦酵母屬；克魯維酵母屬；柯達酵母屬；洛德酵母屬；管囊酵母屬；畢赤酵母屬；酵母菌屬；土星形酵母屬；特派斯酵母屬；孢圓酵母屬；擬威爾酵母屬；及接合酵母屬。潛在適用於本發明之其他類型的酵母包括耶氏酵母屬(Yarrowia )；紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium )；假絲酵母屬(Candida )；漢森酵母屬(Hansenula )；黑粉酵母屬(Filobasium )；鎖擲酵母屬(Sporidiobolus )；布勒擲孢酵母屬(Bullera )；白冬孢酵母屬(Leucosporidium )及擬線黑粉酵母屬(Filobasidella )。
在本發明之一較佳例示性實施例中，用於抗體表現之交配勝任酵母可包含畢赤酵母屬之成員。在本發明之一進一步較佳例示性實施例中，畢赤酵母屬之交配勝任酵母為以下物種之一：巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母及多形漢森酵母(安格斯畢赤酵母)。在本發明之一尤其較佳實施例中，畢赤酵母屬之交配勝任酵母為巴斯德畢赤酵母物種。
「可選擇標記物」在本文中係指基因或基因片段，其對例如經由轉型事件接受彼基因之細胞賦予生長表型(物理生長特徵)。該可選擇標記物允許彼細胞在選擇性生長培養基中在其中未接受彼可選擇標記物基因之細胞無法生長的條件下存活且生長。可選擇標記物基因一般屬於數種類型，包括陽性可選擇標記物基因，諸如對細胞賦予對抗生素或其他藥物、當兩種溫度敏感性(「ts」)突變體雜交或ts突變體轉型時的溫度之抗性之基因；陰性可選擇標記物基因，諸如生物合成基因，其對細胞賦予在不含有不具有彼生物合成基因之所有細胞所需的特定養分之培養基中生長的能力，或經突變誘發之生物合成基因，其對細胞賦予無能力使不具有野生型基因之細胞生長；及其類似物。合適標記物包括但不限於：ZEO；G418；LYS3；MET1；MET3a；ADE1；ADE3；URA3；及其類似物。
「表現載體」在本文中係指DNA載體，其含有促進操縱外來蛋白在靶標宿主細胞(例如，細菌、昆蟲、酵母、植物、兩棲動物、爬行動物、禽或哺乳動物細胞，且最典型地酵母或哺乳動物細胞，例如CHO細胞)內之表現之元件。便利地，對用於轉型之DNA之序列及產生的操縱首先在例如大腸桿菌之細菌宿主中執行且通常地載體將包括促進該等操縱之序列，包括細菌複製起點及適當細菌選擇標記物。選擇標記物編碼在選擇性培養基中生長之轉型宿主細胞的存活或生長所必需之蛋白。未用含有該選擇基因之載體轉型之宿主細胞將不會在該培養基中存活。典型選擇基因編碼(a)賦予對抗生素或其他毒素之抗性，(b)補充營養缺陷型缺乏，或(c)供應未從複雜培養基獲得之關鍵養分的蛋白。用於酵母轉型之例示性載體及方法描述於例如Burke, D.、Dawson, D.及Stearns, T.,Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual , Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)中。用於本發明方法之表現載體可包括酵母或哺乳動物特異性序列，包括用於鑑別轉型宿主菌株之可選擇營養缺陷型或藥物標記物。藥物標記物可進一步用於擴增酵母宿主細胞中之載體的複本數。
目標多肽編碼序列可操作地連接至提供該多肽在例如酵母或哺乳動物細胞之所需宿主細胞中的表現之轉錄及轉譯調節序列。此等載體組分可包括但不限於以下一或多者：增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。亦可包括用於多肽分泌之序列，例如信號序列及其類似物。複製起點(例如，酵母複製起點)為視情況選用的，因為表現載體通常整合至宿主細胞基因組中。在本發明之一實施例中，目標多肽可操作地連接或融合至提供該多肽自酵母二倍體細胞之最佳化分泌的序列。
當與另一核酸序列呈功能性關係安置時，核酸為「可操作地連接的」。例如，若用於信號序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可操作地連接至用於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至該序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為鄰近的，且在分泌前導序列之情況下為鄰近的且在閱讀框中。然而，增強子不必為鄰近的。連接藉由在便利限制位點處接合或替代地經由熟習此項技術者所熟悉之PCR/重組方法(GATEWAYR Technology; Invitrogen, Carlsbad California)實現。若該等位點不存在，則根據習知規範使用合成寡核苷酸接頭或連接體。
啟動子為位於結構基因之起始密碼子上游(5')的未轉譯序列(一般在約100至1000 bp內)，其控制其可操作地連接之特定核酸序列的轉錄及轉譯。該等啟動子屬於數種類別：誘導性、組成性、及阻抑啟動子(其回應於抑制因子之不存在增加轉錄水準)。誘導性啟動子可回應於培養物條件之一些改變(例如養分之存在或不存在或溫度改變)在其控制下起始DNA之轉錄水準增加。
啟動子片段亦可充當用於表現載體同源重組及整合至宿主細胞(例如，酵母細胞、基因組)中之同一位點中的位點；或者，可選擇標記物可用作用於同源重組之位點。畢赤酵母轉型描述於Cregg等人,Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385 (1985)中。用於不同真核及原核細胞之合適啟動子為熟知且可購得的。
目標多肽不僅可直接地重組產生，而且可呈與異源多肽(例如，信號序列或在成熟蛋白或多肽之N端處具有特定裂解位點之其他多肽)之融合多肽形式產生。一般而言，該信號序列可為載體之組分，或其可為插入至載體中之多肽編碼序列的一部分。所選擇之異源信號序列較佳地為經由宿主細胞(例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞)內可獲得之標準路徑之一識別且加工的序列。另外，此等信號肽序列可經工程改造以提供表現系統中之增強分泌。目標分泌信號亦包括哺乳動物及酵母信號序列，其可與所分泌之蛋白異源，或可為所分泌之蛋白的原生序列。信號序列包括前肽序列，且在一些情況下可包括肽原序列。多種該等信號序列為此項技術中已知的，包括在免疫球蛋白鏈上發現之信號序列，例如K28前毒素原序列、PHA-E、FACE、人類MCP-1、人類血清白蛋白信號序列、人類Ig重鏈、人類Ig輕鏈及其類似物。例如，參見Hashimoto等人,Protein Eng., 11(2):75 (1998)；及Kobayashi等人,Therapeutic Apheresis, 2(4):257 (1998))。
轉錄可藉由將轉錄活化子序列插入至載體中而增加。此等活化子為DNA之順式作用元件，通常約10至300 bp，其作用於啟動子以增加其轉錄。轉錄增強子為相對定向及位置獨立性的，已在轉錄單元之5'及3'、在內含子內以及在編碼序列自身內發現。該增強子可剪接至表現載體中在編碼序列之5'或3'位置處，但較佳地位於啟動子之位點5'處。
用於真核宿主細胞中之表現載體亦可含有轉錄終止及穩定化mRNA所必需之序列。該等序列通常可自轉譯終止密碼子之3'獲得，在真核或病毒DNA或cDNA之未轉譯區中。此等區含有轉錄為mRNA之未轉譯部分中之聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。
含有一或多種上文列出之組分之合適載體的構築使用了標準接合技術或PCR/重組方法。分離之質體或DNA片段經裂解、定製且以產生所需質體所需之形式或經由重組方法再接合。為了分析以確認所構築之質體中的正確序列，使用接合混合物使宿主細胞轉型，且在適當時藉由抗生素抗性(例如，安比西林或吉歐黴素)選擇成功轉型體。製備來自該等轉型體之質體，藉由限制核酸內切酶消化進行分析，及/或測序。
作為片段之限制及接合的替代，基於特異性連接(「att 」)位點及重組酶之重組方法可用於將DNA序列插入至載體中。該等方法例如由Landy,Ann. Rev. Biochem .,58 :913-949 (1989)描述；且為熟習此項技術者已知。該等方法利用分子間DNA重組，該重組藉由λ及大腸桿菌編碼之重組蛋白的混合物介導。重組發生於相互作用之DNA分子上的att 位點之間。關於att 位點之描述，參見Weisberg及Landy,Site-Specific Recombination in Phage Lambda ,Lambda II , 第211-250頁, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1983)。側接該等重組位點之DNA區段經轉換，以致在重組之後，該等att 位點為包含由各親本載體貢獻之序列的雜合序列。該重組可發生在任何拓撲學之DNA之間。
Att 位點可藉由將目標序列接合至適當載體中；經由使用特異性引子產生含有att B位點之PCR產物；產生選殖至含有att位點之適當載體中的cDNA文庫；及其類似步驟引入至目標序列中。
如本文所用，摺疊 係指多肽及蛋白之三維結構，其中在胺基酸殘基之間之相互作用用於穩定化該結構。雖然非共價相互作用在決定結構方面至關重要，但通常目標蛋白將具有藉由兩個半胱胺酸殘基形成之分子內及/或分子間共價二硫鍵。關於天然存在之蛋白及多肽或其衍生物及變異體，適當摺疊典型地為如下排列，其導致最佳生物活性，且可便利地藉由針對活性(例如，配位體結合、酶活性等)之分析來監測。
在一些情況下，例如在所需產物具有合成起源時，基於生物活性之分析將不太有意義。該等分子之適當摺疊可基於物理特性、能量考慮、建模研究及其類似因素來確定。
表現宿主可進一步藉由引入編碼一或多種增強摺疊及二硫鍵形成之酶(亦即，摺疊酶、伴侶蛋白等)的序列而經修飾。該等序列可使用如此項技術中已知之載體、標記物等組成性或誘導性表現於酵母宿主細胞中。較佳地，該等序列(包括足以用於所需表現模式之轉錄調節元件)經由靶向方法穩定地整合於酵母基因組中。
例如，真核蛋白二硫鍵異構酶(「PDI」)不僅為蛋白半胱胺酸氧化及二硫鍵異構化之有效催化劑，而且展現伴侶蛋白活性。PDI之共表現可促進產生具有多個二硫鍵之活性蛋白。亦關注免疫球蛋白重鏈結合蛋白(「BIP」)；親環蛋白；及其類似物之表現。在本發明之一實施例中，各單倍體親本菌株表現不同摺疊酶，例如一種菌株可表現BIP，且另一菌株可表現PDI或其組合。
經培養之哺乳動物細胞亦為用於產生所揭示之抗PACAP抗體及其抗原結合片段的較佳例示性宿主。如所提及，CHO細胞尤其適用於抗體之表現。此項技術中已知多種用於在哺乳動物細胞中製造單株抗體之程序。(參見Galfre, G.及Milstein, C.,Methods Enzym. , 73:3-46, 1981；Basalp等人,Turk. J. Biol. , 24:189-196, 2000；Wurm, F.M.,Nat. Biotechnol. , 22:1393-1398, 2004；及Li等人,mAbs , 2(5):466-477, 2010)。如下文更詳細提及，用於哺乳動物單株抗體製造機制中之常見宿主細胞株包括但不限於人類胚胎視網膜母細胞株PER.C6® (Crucell N.V., Leiden, The Netherlands)、NS0鼠類骨髓瘤細胞(Medical Research Council, London, UK)、CV1猴腎細胞株、293人類胚胎腎細胞株、BHK幼倉鼠腎細胞株、VERO非洲綠猴腎細胞株、人類子宮頸癌細胞株HELA、MDCK犬腎細胞、BRL布法羅大鼠肝細胞、W138人類肺細胞、HepG2人類肝細胞、MMT小鼠乳房腫瘤細胞、TRI細胞、MRC5細胞、Fs4細胞、骨髓瘤或淋巴瘤細胞、或中國倉鼠(灰倉鼠)卵巢(CHO)細胞及其類似細胞株。此項技術中已知適用且最佳化用於產生重組單株抗體之CHO細胞的多種不同次純系或子細胞株（諸如DP12 (CHO K1 dhfr-)細胞株、NS0細胞）為抵抗氮鳥嘌呤之NS-1細胞的非Ig分泌性、非輕鏈合成性次純系。其他中國倉鼠及CHO細胞可購得(購自ATCC等)，包括CHO-DXB11 (CHO-DUKX)、CHO-pro3、CHO-DG44、CHO 1-15、CHO DP-12、Lec2、M1WT3、Lec8、pgsA-745及其類似細胞，其均經遺傳改變以針對多種參數最佳化該細胞株。單株抗體通常使用分批饋料方法製造，由此單株抗體鏈表現於哺乳動物細胞株中且分泌至生物反應器中之組織培養基中。培養基(或進料)連續地供應至該生物反應器以使重組蛋白表現增至最大。重組單株抗體接著自收集之培養基中純化。在一些情況下，需要額外步驟以經由二硫鍵之還原等重裝配該等抗體。在單一批料或更多批料中，該等產生方法可定標為10,000 L大。現在常規經由使用該等細胞株及方法獲得多達20 pg/細胞/日，從而提供高達10 g/L或更大之效價，由10 kL至25 kL生物反應器總計15至100 kg。(Li等人, 2010)。下文提供此產生方法之多種詳情，包括編碼該等抗體之聚核苷酸選殖至表現載體中、用此等表現載體轉染細胞、針對經轉染細胞進行選擇、及自此等細胞表現及純化重組單株抗體。
關於哺乳動物細胞中抗PACAP抗體或抗原結合片段之重組產生，編碼該抗體或其片段之核酸一般地插入至可複製載體中用於進一步選殖(DNA擴增)或用於表現。編碼該抗體之DNA容易地分離或使用習知程序合成(例如，藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體重鏈及輕鏈之DNA的寡核苷酸探針)。載體組分一般地包括但不限於以下一或多者：信號序列、複製起點、一或多種標記物基因、增強子元件、啟動子、及轉錄終止序列。啟動子、終止子、可選擇標記物、載體、及其他元件之選擇大概為一般技術者之水準內的常規設計。多種該等元件為此項技術中已知的且可經由商業供應商獲得。
本發明抗體不僅可直接地重組產生，而且可呈與異源多肽之融合多肽形式產生，該異源多肽較佳地為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N端處具有特定裂解位點之其他多肽。較佳地選擇之同源或異源信號序列為由宿主細胞識別及加工(亦即，藉由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可獲得哺乳動物信號序列以及病毒性分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。
該等表現載體及選殖載體一般地將含有使該載體能夠在一或多種所選擇之宿主細胞中複製的核酸序列。典型地，在選殖載體中，此序列為使該載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製的序列，且包括複製起點或自主複製序列。該等序列關於多種細菌、酵母及病毒為熟知的，例如來自質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌，2mu質體起點適用於酵母，且多種病毒起點(猿病毒40 (「SV40」)、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(「VSV」)、或牛乳頭瘤病毒(「BPV」)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，複製起點組分並非哺乳動物表現載體所需(可典型地僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
此等載體亦將典型地含有選擇基因，該選擇基因亦稱作可選擇標記物。典型選擇基因編碼(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、胺甲喋呤或四環素)之抗性，(b)補充營養缺陷型缺乏，或(c)供應未從複雜培養基獲得之關鍵養分(例如編碼用於桿菌之D-丙胺酸消旋酶的基因)的蛋白。
選擇機制之一實例利用藥物來阻止宿主細胞之生長。藥物選擇一般地用於針對其中已插入外來DNA之經培養哺乳動物細胞進行選擇。該等細胞通常稱作「轉染體」。已在選擇性試劑存在下培養且能夠使目標基因傳代至其後代之細胞稱作「穩定轉染體」。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。例示性可選擇標記物為編碼對抗生素新黴素之抗性之基因。選擇在諸如G-418或其類似物之新黴素類型藥物存在下進行。用異源基因成功地轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白且因此經受得住該選擇方案。
選擇系統亦可用於增加目標基因的表現水準，即稱作「擴增」之方法。轉染體之擴增典型地藉由在低水準之選擇性試劑存在下培養該等細胞且接著增加選擇性試劑之量以針對產生高水準之所引入基因的產物之細胞進行選擇而發生。用於哺乳動物細胞之例示性合適可選擇標記物為使得能夠鑑別有能力吸收抗體核酸之細胞的彼等標記物，諸如二氫葉酸還原酶(「DHFR」)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II (較佳地靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
例如，用於哺乳動物細胞之可擴增可選擇標記物為二氫葉酸還原酶，其賦予對胺甲喋呤之抗性。亦可使用其他抗藥性基因(例如，潮黴素抗性、多重抗藥性、嘌呤黴素乙醯基轉移酶)。用DHFR選擇基因轉型之細胞首先藉由在含有DHFR之競爭性拮抗劑胺甲喋呤(「MTX」)之培養基中培養所有轉型體來鑑別。當使用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞株。
或者，用編碼抗體之DNA序列、野生型DHFR蛋白及諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(「APH」)之另一可選擇標記物轉型或共轉型之宿主細胞(尤其含有內源DHFR之野生型宿主)可藉由在含有用於可選擇標記物之選擇試劑的培養基中進行細胞生長來選擇，該選擇試劑諸如胺基糖苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G-418。參見美國專利第4,965,199號。
此等載體可包含促進編碼該抗體之DNA的轉錄之增強子序列。已知多種增強子序列來自哺乳動物基因(例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。頻繁使用之增強子為源於真核細胞病毒之增強子。其實例包括在複製起點之後期側的SV40增強子(bp 100-270)、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、在複製起點之後期側的多瘤病毒增強子、及腺病毒增強子(關於用於真核啟動子之激活的增強元件亦參見Yaniv,Nature, 297:17-18 (1982))。該增強子可剪接至載體中在抗體編碼序列之位置5'或3'處，但較佳地位於啟動子之位點5'處。
表現及選殖載體亦將一般包含由宿主生物體識別且可操作地連接至抗體核酸之啟動子。已知用於真核細胞之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於起始轉錄之位點上游大約25至30個鹼基處的富AT區。在多種基因之轉錄開始上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因之3'末端處為AATAAA序列，其可為用於添加poly A尾至編碼序列之3'末端中的信號。所有此等序列均合適地插入至真核表現載體中。
哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體例如藉由獲自病毒(諸如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、BPV、禽肉瘤病毒、細胞巨化病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒且最佳地SV40)之基因組、獲自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋啟動子或免疫球蛋白啟動子)、獲自熱休克啟動子之啟動子控制，限制條件在於該等啟動子可與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子便利地以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式獲得。人類細胞巨化病毒之即刻早期啟動子便利地以HindIII E限制片段形式獲得。使用BPV作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之修改描述於美國專利第4,601,978號中。關於在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下人類β-干擾素cDNA在小鼠細胞中之表現，亦參見Reyes等人,Nature, 297:598-601 (1982)。或者，勞斯肉瘤病毒長末端重複序列可用作啟動子。
可使用強轉錄啟動子，諸如來自SV40、細胞巨化病毒或骨髓增生性肉瘤病毒之啟動子。參見例如美國專利第4,956,288號及美國專利公開案第20030103986號。其他合適啟動子包括來自金屬硫蛋白基因(美國專利第4,579,821號及第4,601,978號)之彼等啟動子及腺病毒主要晚期啟動子。用於哺乳動物細胞中之表現載體包括pZP-1、pZP-9及pZMP21，其分別已以寄存號98669、98668及PTA-5266寄存於American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA. USA，及此等載體之衍生物。
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自另一多細胞生物體之成核細胞)中之表現載體亦將一般含有轉錄終止及穩定化mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'未轉譯區獲得。此等區含有轉錄為編碼抗體之mRNA之未轉譯部分中之聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
用於選殖或表現本發明抗體之合適宿主細胞包括原核細胞、酵母或上文所述之高等真核細胞。然而，已最大地關注脊椎動物細胞，且培養物中脊椎動物細胞之增殖已成為常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1株(COS-1 (ATCC編號CRL 1650)；及COS-7, ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎株(293或經次選殖用於懸浮培養物中之生長的293細胞(ATCC編號CRL 1573；Graham等人,J. Gen. Virol., 36:59-72 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10, ATCC編號CRL 1632；BHK 570, ATCC編號CRL 10314)；CHO細胞(CHO-K1, ATCC編號CCL 61；CHO-DG44, Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980))；小鼠足細胞(TM4, Mather,Biol. Reprod ., 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci ., 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤株(Hep G2)。額外合適細胞株為此項技術中已知的且可獲自公共寄存處，諸如American Type Culture Collection, Manassas, VA。
宿主細胞經上文關於抗體產生所述之表現或選殖載體轉型且在習知營養培養基中培養，該等營養培養基適當時經改良用於誘導啟動子、選擇轉型體、或擴增如上文所論述之編碼所需序列的基因。
用於產生本發明抗體之哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。可購得之培養基適用於培養該等宿主細胞，諸如Ham's F10 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、最低必需培養基((「MEM」(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、Roswell Park Memorial Institute-1640培養基(「RPMI-1640」, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)及杜氏改良伊格爾氏培養基((「DMEM」Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)。另外，Ham等人,Meth. Enz. , 58:44 (1979)；Barnes等人,Anal. Biochem. , 102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利再審第30,985號中所述之任何培養基均可用作該等宿主細胞之培養基。任何此等培養基均可在必要時補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健他黴素藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或相等能源。亦可包括在熟習此項技術者將已知之適當濃度下之任何其他必要補充物。諸如溫度、pH及其類似因素之培養條件為先前用於針對表現所選擇之宿主細胞的彼等條件，且將為一般技術者顯而易知的。培養基之開發及最佳化方法及培養條件為此項技術中已知的(參見Gronemeyer等人,Bioengineering , 1(4):188-212, 2014)。
在培養條件經最佳化且選擇較佳細胞株純系之後，此等細胞最典型地以分批饋料方法在生物反應器(多種模型可購得)中培養(黏附細胞或懸浮培養物)，該生物反應器涉及連續地饋入針對所選特定細胞株進行最佳化且選擇用於此目的之具有培養基及進料之細胞培養物。(參見Butler, M.,Appl. Microbiol. Biotechnol. , 68:283-291, 2005；及Kelley, B.,mAb , 1(5):443-452, 2009)。亦可獲得灌注系統，其中培養基及進料連續地供應至該培養物，同時自該生物反應器中抽出相同體積之培養基。(Wurm, 2004)。合成培養基(亦可購得)可用於使細胞在分批饋料培養物中生長，從而避免外部來源之污染可能性，諸如使用動物組分，諸如牛血清白蛋白等。然而，可購得無動物組分水解產物以幫助增強細胞密度、培養物生存力及生產率。(Li等人, 2010)。已執行多項研究以試圖最佳化細胞培養基，包括小心注意滾筒瓶中可獲得之頂部空間、在生長及表現期期間之氧化還原電位、還原劑之存在以在產生期間維持二硫鍵等。(參見例如Hutterer等人,mAbs , 5(4):608-613, 2013；及Mullan等人,BMC Proceed. , 5(增刊8):P110, 2011)。已開發多種方法來解決在重組單株抗體產生期間之有害氧化的可能性。(參見例如美國專利第8,574,869號)。經培養細胞可藉由連續地或以分別投與之量饋入養分而生長。通常藉由在細胞生長期間使用探針來監測多種過程參數，諸如細胞濃度、pH、溫度、CO2 、dO2 、重量滲透濃度、諸如葡萄糖、乳酸鹽、麩醯胺及麩胺酸鹽之代謝物的量及其類似參數，該等探針藉由直接連接至經校準分析器線上使用或藉由操作者之干預離線使用。培養步驟亦典型地涉及確保在培養物中生長之細胞藉由此項技術中已知用於細胞選擇之任何方式維持經轉染重組基因。
在醱酵之後，亦即在達到最大細胞生長及重組蛋白表現時，該培養步驟之後典型地為收集步驟，藉此該等細胞自培養基分離且由此獲得收集之細胞培養基。(參見Liu等人,mAbs , 2(5):480-499, 2010)。培養之後典型地為涉及管柱層析及其類似方法之多種純化步驟以分離重組單株抗體與細胞組分及細胞培養基組分。重組單株抗體之此產生期所需的精確純化步驟取決於蛋白之表現位點(亦即，在細胞自身之細胞溶質中)，或排泄至細胞培養基中之蛋白的更通常較佳途徑。多種細胞組分可使用此項技術中已知之技術分離，諸如差速離心技術、基於重力之細胞沈降、及/或尺寸排阻層析/過濾技術，該等過濾技術可包括切向流微過濾或深層過濾。(參見Pollock等人,Biotechnol. Bioeng. , 110:206-219, 2013，及Liu等人, 2010)。細胞組分之離心可藉由使用連續盤堆疊離心機、隨後使用深層及膜過濾器澄清而大規模實現。(參見Kelley, 2009)。最通常地，在澄清之後，該重組蛋白歸因於蛋白A對於抗體Fc域之高親和力而進一步藉由蛋白A層析來純化，且典型地使用低pH/酸化溶離步驟發生(典型地，該酸化步驟與預防性病毒去活步驟組合)。使用酸性或陽離子性聚電解質之絮凝及/或沈澱步驟亦可用於分離懸浮培養物中之動物細胞與可溶性蛋白。(Liu等人, 2010)。最後，陰離子及陽離子交換層析、疏水性相互作用層析(「HIC」)、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、使用陶瓷羥磷灰石(Ca5 (PO4 )3 OH)2 之羥磷灰石層析及此等技術之組合典型地用於濾清重組單株抗體之溶液。所需單株抗體之最終調配及濃縮可藉由使用超離心技術來實現。純化產率典型地為70至80%。(Kelley, 2009)。
術語「所需蛋白 」或「所需抗體 」可互換使用且一般係指對靶標(亦即，PACAP)具特異性之親本抗體或如本文所述之嵌合或人類化抗體或源於其之其結合部分。術語「抗體」意欲包括具有符合且識別抗原決定基之特定形狀的任何含多肽鏈分子結構，其中一或多種非共價結合相互作用穩定化該分子結構與該抗原決定基之間的複合物。原型抗體分子為免疫球蛋白，且來自所有來源(例如，人類、囓齒動物、兔、牛、綿羊、豬、犬、其他哺乳動物、雞、其他禽等)之所有類型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)均被視為「抗體」。適用作根據本發明之起始材料的用於產生抗體之較佳來源為兔。其實例包括嵌合抗體、人類抗體及其他非人類哺乳動物抗體、人類化抗體、單鏈抗體(諸如scFv)、駱駝抗體、奈米抗體、IgNAR (可源於例如鯊魚之單鏈抗體)、小模塊免疫藥物(「SMIP」)，及抗體片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2 及其類似物(參見Streltsov等人,Protein Sci., 14(11):2901-9 (2005)；Greenberg等人,Nature, 374(6518):168-73 (1995)；Nuttall等人,Mol. Immunol., 38(4):313-26 (2001)；Hamers-Casterman等人,Nature, 363(6428):446-8 (1993)；Gill等人,Curr. Opin. Biotechnol., (6):653-8 (2006))。
例如，抗體或其抗原結合片段可藉由遺傳工程改造產生。在此技術中，如同其他方法，抗體產生細胞經敏化為所需抗原或免疫原。自抗體產生細胞分離之信使RNA用作模板以使用PCR擴增製造cDNA。載體之文庫(各自含有一種重鏈基因及一種保持初始抗原特異性之輕鏈基因)藉由將經擴增免疫球蛋白cDNA之適當部分插入至表現載體中而產生。組合文庫藉由組合重鏈基因文庫與輕鏈基因文庫來構築。此產生共表現重鏈及輕鏈之純系(類似抗體分子之Fab片段或抗原結合片段)的文庫。攜帶此等基因之載體共轉染至宿主細胞中。當抗體基因合成在經轉染宿主中誘導時，重鏈及輕鏈蛋白自裝配以產生可藉由用該抗原或免疫原篩選而偵測之活性抗體。
目標抗體編碼序列包括藉由原生序列編碼之彼等序列，以及由於遺傳代碼簡併性而與所揭示之核酸的序列不一致之核酸，及其變異體。變異體多肽可包括胺基酸(「aa」)取代、添加或缺失。胺基酸取代可為保守胺基酸取代或取代以消除非必需胺基酸，諸如以改變糖基化位點，或以使藉由一或多種並非功能所必需之半胱胺酸殘基的取代或缺失造成之錯誤摺疊降至最低。變異體可經設計以便保持該蛋白之特定區(例如，功能域、催化性胺基酸殘基等)的生物活性或具有增強之生物活性。變異體亦包括本文所揭示之多肽的片段，尤其生物活性片段及/或對應於功能域之片段。已知用於經選殖基因之活體外突變誘發的技術。本發明中亦包括已使用普通分子生物學技術進行修飾以便改良其對蛋白水解降解之抗性或最佳化溶解度特性或使其更適用作治療劑之多肽。
嵌合抗體可藉由組合VL 及VH 區之重組方式製得，該等區獲自一種物種之抗體產生細胞，該等細胞具有來自另一物種之恆定輕鏈及重鏈區。典型地，嵌合抗體利用囓齒動物或兔可變區及人類恆定區，以便產生具有優勢人類域之抗體。該等嵌合抗體之產生為此項技術中熟知的，且可藉由標準方式實現(如例如美國專利第5,624,659號中所述，該專利以引用之方式整體併入本文)。進一步預期本發明之嵌合抗體的人類恆定區可選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恆定區。
人類化抗體經工程改造以含有甚至更多人類樣免疫球蛋白域，且僅併入動物源性抗體之互補決定區。此舉藉由小心地檢查該單株抗體之可變區的高變環序列且使其擬合至人類抗體鏈之結構而實現。儘管表面看來複雜，該過程實際上很簡單。參見例如美國專利第6,187,287號，該專利以引用之方式完全併入本文。
除了完整免疫球蛋白(或其重組配對物)，亦可合成包含抗原決定基結合位點之免疫球蛋白片段(例如，Fab’、F(ab’)2 或其他片段)。「片段」或最小免疫球蛋白可利用重組免疫球蛋白技術來設計。例如，用於本發明之「Fv」免疫球蛋白可藉由合成融合可變輕鏈區及可變重鏈區而產生。亦關注抗體之組合，例如雙功能抗體，其包含兩種不同Fv特異性。在本發明之另一實施例中，免疫球蛋白片段涵蓋小分子免疫藥物(「SMIP」)、駱駝抗體、奈米抗體及IgNAR。
免疫球蛋白及其片段可經轉譯後修飾，例如以添加效應子部分(諸如化學連接子)、可偵測部分(諸如螢光染料、酶、毒素、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分及其類似物)或特異性結合部分(諸如抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或生物素)及可用於本發明方法及組合物中之其類似物。額外效應子分子之實例提供於下文。
若聚核苷酸序列根據遺傳代碼之轉譯產生了多肽序列(亦即，該聚核苷酸序列「編碼」該多肽序列)，則該聚核苷酸序列「對應於」該多肽序列，如果兩種聚核苷酸序列編碼同一多肽序列，則一種聚核苷酸序列「對應於」另一聚核苷酸序列。
DNA構築體之「異源」區或域為較大DNA分子內之可鑑別DNA區段，其未被發現實際上與該較大分子締合。因此，當該異源區編碼哺乳動物基因時，側接該基因之DNA通常不側接源生物體之基因組中的哺乳動物基因組DNA。異源區之另一實例為如下構築體，其中實際上未發現編碼序列自身(例如cDNA，其中基因組編碼序列含有內含子或具有不同於原生基因之密碼子的合成序列)。等位基因變異或天然存在之突變事件未產生如本文所定義之DNA的異源區。
「編碼序列」為對應於或編碼蛋白或肽序列之密碼子的同框序列。若兩種編碼序列或其互補序列編碼同一胺基酸序列，則該等序列彼此對應。與適當調節序列締合之編碼序列可轉錄且轉譯成多肽。聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於該編碼序列之3'處。「啟動子序列」為能夠起始下游(3'方向)編碼序列之轉錄的DNA調節區，且典型地含有用於結合影響該編碼序列之轉錄的調節分子(例如，轉錄因子)之額外位點。當RNA聚合酶結合細胞中之啟動子序列且將編碼序列轉錄成mRNA，該mRNA接著又轉譯成由該編碼序列編碼之蛋白時，該編碼序列「在啟動子序列之控制下」或「可操作地連接至」啟動子。
脊椎動物中抗體之一般結構現得到充分瞭解。參見Edelman, G. M.,Ann. N.Y. Acad. Sci ., 190:5 (1971)。抗體由兩條具有大約23,000道爾頓之分子量的一致輕多肽鏈(「輕鏈」)及兩條具有53,000-70,000分子量的一致重鏈(「重鏈」)組成。該四條鏈由二硫鍵以「Y」組態接合，其中該等輕鏈用托架托住在該「Y」組態之口部處開始的重鏈。該「Y」組態之「分支」部分經指定為Fab 區；該「Y」組態之莖部分經指定為FC 區。胺基酸取向自該「Y」組態之頂部處的N末端到達各鏈底部處之C末端。該N末端具有引出該末端之對抗原具特異性的可變區，且為大約100個胺基酸長，在輕鏈與重鏈之間且在各抗體之間存在輕微變異。
該可變區在各鏈中連接至恆定區，該恆定區延伸該鏈之剩餘長度且在特定類別之抗體內不隨抗體(亦即，引出該區之抗原)特異性變化。存在五種已知之主要類別的恆定區，其決定免疫球蛋白分子之類別(對應於γ、μ、α、δ及ε (γ、μ、α、δ或ε)重鏈恆定區之IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)。該恆定區或類別決定抗體之後續效應子功能，包括補體激活(參見Kabat, E. A.,Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry , 第2版, 第413-436頁, New York, NY: Holt, Rinehart, Winston (1976))及其他細胞反應(參見Andrews等人,Clinical Immunology , 第1-18頁, W. B. Sanders, Philadelphia, PA (1980)；Kohl等人,Immunology , 48:187 (1983))；而該可變區決定將與其反應之抗原。輕鏈分類為κ或λ。各重鏈類別可用κ或λ輕鏈製備。當免疫球蛋白藉由融合瘤或藉由B細胞產生時，該等輕鏈及重鏈彼此共價鍵結，且該兩條重鏈之「尾」部分藉由共價二硫鍵彼此鍵結。
表述「可變區」或「VR」係指在抗體中之各輕鏈及重鏈對內之域，其直接牽涉於抗體結合於抗原中。各重鏈在一個末端處具有可變域(VH )，隨後為多個恆定域。各輕鏈在一個末端處具有可變域(VL )且在其另一末端處具有恆定域；該輕鏈之恆定區與該重鏈之第一恆定域對準，且該輕鏈可變域與該重鏈之可變域對準。
表述「互補決定區」、「高變區」或「CDR」係指在抗體輕鏈或重鏈之可變區中發現的一或多個高變或互補決定區(「CDR」)(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第4版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987))。此等表述包括如由Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest , NIH公開案第91-3242號, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institutes of Health (1983))定義之高變區或在抗體3維結構中之高變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987))。各鏈中之CDR藉由構架區(「FR」)緊密保持且與來自另一鏈之CDR一起促進形成抗原結合位點。在該等CDR內存在已描述為選擇性決定區(「SDR」)之所選胺基酸，其表示抗體-抗原相互作用中由該CDR使用之關鍵接觸殘基(參見Kashmiri等人,Methods , 36(1):25-34 (2005))。
「抗原決定基」或「結合位點」為抗原上與抗原結合肽(諸如抗體)特異性結合之區域或區。蛋白抗原決定基可包含直接牽涉於結合中之胺基酸殘基(亦稱為該抗原決定基之免疫顯性組分)及其他胺基酸殘基，該等其他胺基酸殘基未直接牽涉於結合中，諸如由特異性抗原結合肽有效阻斷之胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基在該特異性抗原結合肽之「足跡」內)。本文中術語抗原決定基包括在特異性結合於抗PACAP抗體之PACAP的任何特定區中之兩種類型之胺基酸結合位點(亦即，PACAP38及PACAP27)。PACAP可包含多種不同抗原決定基，該等抗原決定基可包括而不限於(1)線性肽抗原決定子，(2)由成熟PACAP構形中位於彼此附近的一或多個非鄰近胺基酸組成之構形抗原決定子；及(3)完全地或部分地由共價連接至PACAP蛋白(諸如碳水化合物基團)之分子結構組成的轉譯後抗原決定子。詳言之，術語「抗原決定基」包括蛋白或肽(例如PACAP)中之特異性殘基，其牽涉於抗體結合於該蛋白或肽中，如由諸如丙胺酸掃描技術之已知且公認方法所確定。該等方法例示於本文中。
措辭抗體(例如第一抗體)「實質上」或「至少部分地」結合與另一抗體(例如第二抗體)相同之抗原決定基意謂用於該第一抗體之抗原決定基結合位點包含抗原上構成該第二抗體之抗原決定基結合位點的胺基酸殘基之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。又，第一抗體實質上或部分地結合與第二抗體相同或重疊之抗原決定基意謂該等第一及第二抗體競爭結合於該抗原，如上文所述。因此，術語「實質上結合於與單株抗體相同之抗原決定基或決定子」意謂抗體與該抗體「競爭」。
措辭「結合於與所關注抗體相同或重疊之抗原決定基或決定子」意謂抗體與該所關注抗體「競爭」與該所關注抗體特異性結合之PACAP上的至少一個(例如，至少2個、至少3個、至少4個、至少5個)或所有殘基。實質上或基本上結合於與本文所述之單株抗體相同之抗原決定基的一或多種抗體之鑑別可使用丙胺酸掃描容易地確定。另外，多種免疫篩選分析中之任一種，其中可分析抗體競爭。多種該等分析經常規實踐且為此項技術中熟知的(參見例如1997年8月26日授權之美國專利第5,660,827號，其以引用之方式特定地併入本文中)。應瞭解，實際上確定本文所述之抗體所結合的抗原決定基在任何情況下均非鑑別結合於與本文所述之單株抗體相同或實質上相同或重疊之抗原決定基的抗體所需。
例如，在欲檢查之測試抗體獲自不同來源動物或甚至具有不同Ig同型的情況下，可使用簡單競爭分析，其中對照抗體與該測試抗體混合且接著應用於含有PACAP之樣品。基於ELISA之方案、放射性免疫分析、免疫印跡及使用BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析適用於該等簡單競爭研究。
在某些實施例中，對照抗PACAP抗體與變化量之該測試抗體預混合(例如，呈約1:1、1:2、1:10或約1:100之比率)持續一段時期，接著應用於PACAP38或PACAP27抗原樣品。在其他實施例中，對照物及變化量之測試抗體可簡單地在暴露於PACAP38或PACAP27抗原樣品期間分別地添加且摻合。只要結合抗體可與自由抗體區分(例如，藉由使用分離或洗滌技術來消除未結合抗體)且對照抗體可與測試抗體區分(例如，藉由使用物種特異性或同型特異性第二抗體或藉由用可偵測標記特異性標記對照抗體)，可確定該測試抗體是否降低該對照抗體與PACAP38或PACAP27抗原之結合，從而指示該測試抗體實質上識別與對照抗PACAP抗體相同之抗原決定基。在完全無關抗體(不結合PACAP)存在下(經標記)對照抗體之結合可充當對照高值。對照低值可藉由使經標記對照抗體與相同但未標記對照抗體一起培育來獲得，其中競爭將發生且降低經標記抗體之結合。在測試分析中，在測試抗體存在下經標記抗體反應性之顯著降低指示實質上識別相同抗原決定基之測試抗體，亦即與經標記對照抗體競爭之測試抗體。例如，在約1:1或1:10與約1:100之間之測試抗體的任何比率下降低對照抗體與PACAP38或PACAP27之結合達至少約50%、諸如至少約60%或更佳地至少約70% (例如，約65-100%)的任何測試抗體均被視為實質上結合於與對照抗體相同或重疊之抗原決定基或決定子的抗體。
較佳地，該測試抗體將降低該對照抗體與PACAP38或PACAP27抗原之結合，較佳地為在該測試抗體不存在下觀察到之該對照抗體之結合的至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如約95%)。
亦可有利地使用簡單競爭分析，其中測試抗體以飽和濃度塗覆於上面固定PACAP38或PACAP27之表面。該簡單競爭分析中之表面較佳地為BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)晶片(或適用於表面電漿共振(「SPR」)分析之其他介質)。量測結合PACAP38或PACAP27之對照抗體與經PACAP塗佈之表面的結合。單獨對照抗體之此與含PACAP38或PACAP27表面之結合與在測試抗體存在下該對照抗體之結合相比較。在測試抗體存在下該對照抗體與含PACAP38或PACAP27表面之結合的顯著降低指示了該測試抗體實質上識別與該對照抗體相同之抗原決定基，以致該測試抗體與該對照抗體「競爭」。降低對照抗體之結合達至少約20%或更高、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更高之任何測試抗體均可被視為實質上結合於與該對照抗體相同之抗原決定基或決定子的抗體。較佳地，該測試抗體將降低該對照抗體與PACAP38或PACAP27之結合達至少約50% (例如，至少約60%、至少約70%或更高)。應瞭解，對照及測試抗體之次序可顛倒；亦即，在競爭分析中，該對照抗體可首先結合於該表面且接著該測試抗體其後與該表面接觸。較佳地，使用下文實例9中例示之「夾心型」結合分析。或者，對PACAP38或PACAP27抗原具較大親和力之抗體首先結合於含PACAP38或PACAP27表面，如應預期針對第二抗體可見之結合減少(假定該等抗體競爭)將具有較大量值。該等分析之進一步實例提供於例如Saunal及Regenmortel,J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1995)中，該文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。
另外，抗體是否結合PACAP上與由測試抗體結合之另一抗體或抗原決定基相同或重疊之抗原決定基可尤其使用基於免疫印跡之分析來確定。在此分析中，製得對應於由該抗體結合之抗原(PACAP蛋白)的肽之文庫，該等肽包含該蛋白中典型地10-25、10-20或10-15個胺基酸長之重疊部分。此等涵蓋PACAP序列之不同重疊胺基酸肽經合成且共價結合於PEPSPOTSTM 硝基纖維素膜(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)。接著製備印跡且根據製造商之推薦進行探測。
基本上，該免疫印跡分析接著藉由螢光方式偵測該文庫中之何種肽結合於該測試抗體且由此可鑑別抗原(亦即，PACAP)上之何種殘基與該測試抗體相互作用。(參見美國專利第7,935,340號，其以引用之方式併入本文中)。
此項技術中已知多種抗原決定基定位技術。舉例而言，抗原及抗體之X射線共結晶學；NMR；SPR (例如，在25℃或37℃下)；基於陣列之寡肽掃描(或「肽掃描分析」)；定點突變誘發(例如，丙胺酸掃描)；突變誘發定位；氫-氘交換；噬菌體展示；及有限蛋白水解均為此項技術中熟知之抗原決定基定位技術(參見例如Epitope Mapping Protocols: 第二版 , Methods in Molecular Biology, , 編輯Mike Schutkowski及Ulrich Reineke, 第2版, New York, NY: Humana Press (2009)，及Epitope Mapping Protocols ,Methods in Molecular Biology, 編輯Glenn Morris, 第1版, New York, NY: Humana Press (1996)，其均以引用之方式整體併入本文中)。
實質上或基本上結合於與本文所述之單株抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)相同之抗原決定基的一或多種抗體之鑑別可容易地使用其中可分析抗體競爭之多種免疫篩選分析中之任一者來確定。多種該等分析經常規實踐且為此項技術中熟知的(參見例如1997年8月26日授權之美國專利第5,660,827號，其以引用之方式併入本文中)。應瞭解，確定本文所述之抗體所結合的抗原決定基在任何情況下均非鑑別結合於與本文所述之單株抗體相同或實質上相同之抗原決定基的抗體所需。
例如，在欲檢查之測試抗體獲自不同來源動物或甚至具有不同Ig同型的情況下，可使用簡單競爭分析，其中對照抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之一)與該測試抗體混合且接著應用於含有PACAP38及PACAP27中任一者或兩者之樣品，已知PACAP38及PACAP27各自由Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H結合。基於ELISA之方案、放射性免疫分析、免疫印跡及BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)分析(如本文實例部分中所述)適用於該等簡單競爭研究。
在某些實施例中，該方法包含預混合該對照抗體與變化量之該測試抗體(例如，呈約1:1、1:2、1:10或約1:100之比率)持續一段時期，接著應用於PACAP抗原樣品。在其他實施例中，對照物及變化量之測試抗體可在暴露於PACAP抗原樣品期間分別地添加且摻合。只要結合抗體可與自由抗體區分(例如，藉由使用分離或洗滌技術來消除未結合抗體)且對照抗體可與測試抗體區分(例如，藉由使用物種特異性或同型特異性第二抗體或藉由用可偵測標記特異性標記對照抗體)，可使用該方法來確定該測試抗體降低該對照抗體與PACAP抗原之結合，從而指示該測試抗體實質上識別與對照抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)相同之抗原決定基。在完全無關抗體(不結合PACAP)存在下(經標記)對照抗體之結合可充當對照高值。對照低值可藉由使經標記對照抗體與相同但未標記對照抗體一起培育來獲得，其中競爭將發生且降低經標記抗體之結合。在測試分析中，在測試抗體存在下經標記抗體反應性之顯著降低指示實質上識別相同抗原決定基之測試抗體，亦即與經標記對照抗體競爭之測試抗體。例如，在約1:1或1:10與約1:100之間之對照物Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H:測試抗體或Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H:測試抗體的任何比率下降低Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H與PACAP38及PACAP27抗原之結合達至少約50%、諸如至少約60%或更佳地至少約70% (例如，約65-100%)的任何測試抗體均被視為實質上結合於分別與Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H相同之抗原決定基或決定子的抗體。較佳地，該測試抗體將降低Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H與PACAP38及PACAP27抗原中至少一者、較佳地每一者之結合，較佳地為在該測試抗體不存在下觀察到之Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H之結合的至少約50%、至少約60%、至少約80%或至少約90% (例如約95%)。此等方法可適於鑑別及/或評估與其他對照抗體競爭之抗體。
亦可有利地使用簡單競爭分析，其中測試抗體以飽和濃度塗覆於上面固定PACAP38或PACAP27或兩者之表面。該簡單競爭分析中之表面較佳地具有適用於OCTET®及/或PROTEON®之介質。量測對照抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)與經PACAP塗佈之表面的結合。單獨對照抗體之此與含PACAP表面之結合與在測試抗體存在下該對照抗體之結合相比較。在測試抗體存在下該對照抗體與含PACAP表面之結合的顯著降低指示了該測試抗體實質上識別與該對照抗體相同之抗原決定基，以致該測試抗體與該對照抗體「競爭」。降低對照抗體(諸如Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)與PACAP38及PACAP27抗原之結合達至少約20%或更高、至少約40%、至少約50%、至少約70%或更高之任何測試抗體均可被視為實質上結合於與該對照抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)相同之抗原決定基或決定子的抗體。較佳地，該測試抗體將降低該對照抗體(例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H或Ab12.H)與PACAP抗原之結合達至少約50% (例如，至少約60%、至少約70%或更高)。應瞭解，對照及測試抗體之次序可顛倒；亦即，在競爭分析中，該對照抗體可首先結合於該表面且接著該測試抗體其後與該表面接觸。較佳地，對PACAP38及PACAP27具較高親和力之抗體首先結合於含PACAP表面，如應預期針對第二抗體可見之結合減少(假定該等抗體競爭)將具有較大量值。該等分析之進一步實例提供於例如Saunal及Regenmortel,J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1989)中，該文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。
抗體、其抗原結合片段或抗體衍生物是否在上文所定義之一抗原決定基區內結合的確定可以熟習此項技術者已知之方式進行。在該等定位/表徵方法之另一實例中，針對抗PACAP抗體之抗原決定基區可藉由抗原決定基「足跡法」使用PACAP38及PACAP27抗原中暴露之胺/羧基的化學修飾來確定。該足跡技術之一特定實例為使用藉由質譜法偵測之氫-氘交換(「HXMS」)，其中發生受體及配位體蛋白醯胺質子之氫/氘交換、結合、及逆交換，其中參與蛋白結合之骨架醯胺基團經保護免於逆交換且因此將保持氘化。相關區此時可藉由消化蛋白水解、快速微孔高效液相層析分離及/或電噴霧電離質譜法來鑑別(參見例如Ehring H.,Analytical Biochemistry , 267(2):252-259 (1999)及Engen, J. R.及Smith, D. L.,Anal. Chem ., 73:256A-265A (2001))。合適之抗原決定基鑑別技術之另一實例為核磁共振抗原決定基定位(「NMR」)，其中典型地比較在自由抗原及與抗原結合肽(諸如抗體)複合之抗原的兩維NMR光譜中信號的位置。抗原典型地經15 N選擇性地同位素標記，使得僅對應於該抗原之信號及無來自該抗原結合肽之信號在NMR光譜中可見。與該自由抗原之光譜相比，源於與該抗原結合肽之相互作用中所牽涉之胺基酸的抗原信號典型地將在複合物之光譜中移位，且結合中所牽涉之胺基酸可以彼方式經鑑別。參見例如Ernst Schering Res. Found. Workshop, (44):149-67 (2004)；Huang等人,J. Mol. Biol. , 281(1):61-67 (1998)；及Saito及Patterson,Methods, 9(3):516-24 (1996)。抗原決定基定位/表徵亦可使用質譜(「MS」)方法執行(參見例如Downard,J. Mass Spectrom. , 35(4):493-503 (2000)及Kiselar及Downard,Anal. Chem. , 71(9):1792-801 (1999))。
蛋白酶消化技術亦可適用於抗原決定基定位及鑑別之背景中。抗原決定子相關區/序列可藉由蛋白酶消化，例如藉由在37℃及pH 7-8下以與PACAP38或PACAP27之約1:50比率使用胰蛋白酶隔夜(「o/n」)消化，隨後針對肽鑑別進行質譜(「MS」)分析來確定。由該抗PACAP抗體保護免於胰蛋白酶裂解之肽可隨後藉由比較經受胰蛋白酶消化之樣品及用抗體培育且接著經受例如胰蛋白酶消化(由此顯露該抗體之足跡)之樣品來鑑別。如胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶之其他酶可用於類似抗原決定基表徵方法中。此外，酶消化可提供用於在PACAP結合多肽之背景下分析潛在抗原決定子序列是否在PACAP區內之快速方法。若該多肽未表面暴露，則其就免疫原性/抗原性而言最可能不相關(關於類似技術之論述，參見例如Manca,Ann. Ist. Super. Sanità., 27(1):15-9 (1991))。
定點突變誘發為適用於表徵結合抗原決定基之另一技術。例如，在「丙胺酸掃描」定點突變誘發(例如亦稱為丙胺酸掃描、丙胺酸掃描突變誘發、丙胺酸掃描突變、組合丙胺酸掃描或建立丙胺酸點突變)中，蛋白區段內之各殘基經由諸如直接肽或蛋白合成、定點突變誘發、GENEART™ Mutagenesis Service (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA U.S.A.)或獵槍突變誘發之方法用丙胺酸殘基(或諸如纈胺酸之另一殘基，其中丙胺酸存在於野生型序列中)置換。使用此技術由此產生該分子之一系列單一點突變體；所產生之突變體的數目等於該分子中之殘基數目，各殘基由單一丙胺酸殘基一次一個置換。丙胺酸一般地由於其非龐大、化學惰性甲基官能基而用於置換原生(野生型)殘基，該官能基可模擬多種其他胺基酸可具有之二級結構偏好。隨後，可使用諸如但不限於SPR結合實驗之方法來量測用丙胺酸置換原生殘基對於丙胺酸掃描突變體及其結合搭配物之結合親和力的影響。若突變導致結合親和力之顯著降低，則最有可能的是突變殘基牽涉於結合中。對結構抗原決定基具特異性之單株抗體(亦即，不結合未摺疊蛋白之抗體)可用作結合親和力實驗之陽性對照物以驗證丙胺酸置換不會影響該蛋白之總體三級結構(因為該蛋白之總體摺疊的改變可間接地影響結合且由此產生假陽性結果)。參見例如Clackson及Wells,Science , 267:383-386 (1995)；Weiss等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 97(16):8950-8954 (2000)；及Wells,Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:1-6 (1996)。在實例12中，使用丙胺酸掃描方法來鑑別PACAP中與本文所揭示之抗PACAP抗體特異性相互作用之特異性抗原決定基或殘基。
電子顯微術亦可用於抗原決定基「足跡法」。例如，Wang等人,Nature, 355:275-278 (1992)使用低溫電子顯微術、三維影像重建及X射線結晶學之協調應用來確定Fab片段在原生豇豆花葉病毒之衣殼表面上的物理足跡。
用於抗原決定基評估之「無標記」分析之其他形式包括SPR (在商業上作為BIACORE®系統, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA出售)及反射干涉光譜法(「RifS」) (參見例如Fagerstam等人,Journal of Molecular Recognition, 3:208-14 (1990)；Nice等人,J. Chromatogr ., 646:159-168 (1993)；Leipert等人,Angew. Chem. Int. Ed ., 37:3308-3311 (1998)；Kroger等人,Biosensors and Bioelectronics, 17:937-944 (2002))。
表述「構架區」或「FR」係指在抗體輕鏈及重鏈之可變區內的一或多個構架區(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第4版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987))。此等表述包括插入抗體輕鏈及重鏈之可變區內的CDR之間之彼等胺基酸序列區。
術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為原生序列Fc區或變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能變化，人類IgG重鏈Fc區通常經界定以自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。Fc區中殘基之編號為如Kabat中之EU指數的彼編號。Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域CH2及CH3。
術語「Fc受體」及「FcR」描述結合於抗體Fc區之受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包括此等受體之等位基因變異體及替代地剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「激活受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有類似胺基酸序列，該等序列之不同之處主要在於其細胞質域。FcR回顧於Ravetch及Kinet,Ann. Rev. Immunol ., 9:457-92 (1991)；Capel等人,Immunomethods, 4:25-34 (1994)；及de Haas等人,J. Lab. Clin. Med ., 126:330-41 (1995)中。「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J. Immunol ., 117:587 (1976)；及Kim等人,J. Immunol ., 24:249 (1994))，且其主要用於調節及/或延長抗體在循環中之半衰期。只要所揭示之抗PACAP抗體無糖基化，由於表現系統及/或序列，預期本發明抗體結合FcRn受體，但不結合(或以最低程度結合) Fcγ受體。
「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之至少一種效應子功能。例示性「效應子功能」包括C1q；補體依賴性細胞毒性(「CDC」)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(「ADCC」)；噬菌作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體(「BCR」))之下調等。該等效應子功能一般地需要該Fc區與結合域(例如，抗體可變域)組合且可使用此項技術中已知用於評估該等抗體效應子功能之多種分析來分析。
「原生序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異體Fc區」包含由於至少一種胺基酸修飾而不同於原生序列Fc區之胺基酸序列、但保持原生序列Fc區之至少一種效應子功能的胺基酸序列。較佳地，該變異體Fc區與原生序列Fc區相比或與親本多肽之Fc區相比具有原生序列Fc區中或親本多肽之Fc區中的至少一種胺基酸取代，例如約一種至約十種胺基酸取代，且較佳地約一種至約五種胺基酸取代。本文中該變異體Fc區將較佳地與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性，且最佳地與其具有至少約90%序列一致性，更佳地與其具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。 對 PACAP 具有結合活性之抗 PACAP 抗體及其結合片段
PACAP為經由中樞神經系統(「CNS」)及外周表現之多官能血管擴張肽。PACAP為分泌素/VIP/GRH家族之成員。PACAP以兩種α-醯胺化活性形式存在，PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)及PACAP27 (SEQ ID NO: 1242)。本文中，除非另外明確指示，否則術語「PACAP」包括PACAP38及PACAP27中任一者或兩者。PACAP在物種之間高度保守。
在人類中，PACAP源於176胺基酸前驅體蛋白(前PACAP原)且該基因位於染色體18p11上，其中PACAP38由外顯子5編碼(Vaudry等人,Pharmacol. Rev., 61:283-357 (2009))。前PACAP原含有N端24胺基酸信號蛋白、29胺基酸PACAP相關肽及在C端域中之PACAP。該前驅體藉由激素原轉化酶代謝為生物活性PACAP38及PACAP27。
VIP (SEQ ID NO: 1243)屬於與PACAP相同之蛋白家族且與PACAP共享高同源性(亦即，VIP及PACAP27在胺基酸層面上具有68%序列同源性)以及類似的總體二級結構(亦即，在C端之長α-螺旋結構)。
PACAP之作用經由三種不同G蛋白偶合受體介導：PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R。VPAC1-R可與所有受體締合膜蛋白(「RAMP」，Kaiser及Russo,Neuropeptides 47: 451-461 (2013))締合。PAC1-R對PACAP具選擇性，而VPAC1-R及VPAC2-R以高親和力結合VIP及PACAP。PAC1-R以比VIP高100-1000倍的親和力結合於PACAP，亦即，關於PACAP27/PACAP38約0.5 nM之KD 對關於VIP約500 nM之KD 。相反地，VPAC1-R及VPAC2-R對於PACAP及VIP具有相等親和力(KD 約1 nM) (參見Schytz等人(2010))。所有三種受體廣泛表現於外周組織中及CNS中，其中PAC1-R主要表現於CNS中，最豐富地表現於嗅球、丘腦、下丘腦、海馬齒狀回中及小腦顆粒細胞中(Hashimoto等人,J. Comp. Neurol., 371:567-577 (1996)；Shioda等人,Neurosci. Res., 28:345-354 (1997))。
PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R的激活導致增加之腺苷酸環化酶活性且因此導致增加之cAMP產生。然而，PACAP受體亦可經由PLC (導致增加之Ca2+ 水準)及PLD介導其效應。
PACAP具有多種生物效應，包括在神經發育、神經保護、神經調節、神經性發炎及傷害感受中之作用。亦據報道PACAP與黏多糖(「GAG」)相互作用。GAG為由諸如肝素、軟骨素、角蛋白及玻尿酸之重複二醣單元構成的長、無分支多醣。已顯示PACAP之細胞攝取取決於GAG蛋白之表現且PACAP結合於硫酸化GAG。特定言之，已確定結合於GAG之PACAP38能夠誘導PACAP38之受體獨立性細胞攝取。此研究進一步證明PACAP38中之無規捲曲-α-螺旋轉變為PACAP38之GAG依賴性攝取所必需，因為可能無法經歷該結構轉變之突變體PACAP38未如PACAP38之野生型形式般有效地由含GAG細胞株內化(Neree等人,FEBS Lett. , 588(24):4590-4596, 2014)。在追蹤研究中，已確定PACAP叢集GAG (亦即，肝素)之能力與其充當細胞穿透肽(「CPP」)之能力直接相關。假設此活性可歸因於在分泌素/升糖素/GHRH家族成員(諸如PACAP)中發現之肝素結合、或Cardin-Weintraub基序(Neree等人,Int. J. Mol. Sci. , 16:27391-27400, 2015)。有趣的是，Neree等人(2015)提供之資料證明了PACAP38能夠活體外叢集硫酸化GAG。此等資料表明所觀察到之叢集效應對於GAG介導之PACAP38細胞攝取至關重要，因為諸如升糖素之其他肽展示對硫酸化GAG (肝素)之較高結合親和力，但未如PACAP38般有效地由細胞內化。此外，據報道在其中細胞暴露於PACAP之活體外研究中，軟骨形成有所增加，包括富含於硫酸化GAG蛋白中之軟骨基質，這與在多種細胞應激反應期間表現之其推定保護作用一致(Juhász等人,PLoS ONE , 9(3):e91541, 2014)。使用在其質膜上缺乏PACAP特異性受體之細胞類型(諸如CHO-K1細胞)，Doan等人提供之資料證明了該等細胞參加經螢光標記之PACAP38及PACAP27的多種形式之受體獨立性細胞攝取之能力(Doan等人,Biochem. Biophys. Acta , 1823:940-949, 2012)。
本發明提供結合PACAP (包括人類PACAP)之例示性抗體或其抗原結合片段。結合PACAP之其他抗體或其抗原結合片段(包括具有不同CDR及抗原決定基特異性者)可使用本說明書之揭示內容，且使用此項技術中一般已知之方法來獲得。該等抗體及其抗原結合片段活體內拮抗PACAP之生物效應且因此適用於治療或預防PACAP相關病狀，包括例如頭痛、偏頭痛、疼痛、畏光、熱潮紅、PTSD及焦慮症。在較佳實施例中，根據本發明之抗體或其抗原結合片段包含本文所述之抗PACAP抗體及其抗原結合片段的一或多個CDR、VL 鏈及/或VH 鏈。
在一些實施例中，根據本發明之抗PACAP抗體或其抗原結合片段將干擾、阻斷、降低、或調節PACAP與其受體(例如，PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R)之間之相互作用。在一些情況下，根據本發明之抗PACAP抗體或其抗原結合片段為「中和的」，例如其完全地防止PACAP與PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R之特異性相互作用。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段例如藉由以防止PACAP特異性結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R之位置及/或方式保持結合於PACAP而中和PACAP。
在一些實施例中，根據本發明之抗體或其抗原結合片段能夠抑制PACAP介導之活性(包括結合於PAC1-R表現細胞)。在一些實施例中，根據本發明之抗體或其抗原結合片段經人類化，諸如針對PACAP之人類化兔抗體。
如所提及，根據本發明之抗PACAP抗體或其抗原結合片段具有多種用途。例如，本發明抗體及片段可適用於治療性應用，以及在診斷學上適用於結合分析。本發明抗PACAP抗體或其抗原結合片段適用於PACAP、詳言之人類PACAP或其配位體之親和力純化且適用於篩選分析以鑑別PACAP活性之其他拮抗劑。一些該等抗體或其抗原結合片段適用於抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R，或抑制PACAP介導之活性及/或生物效應。
如本文所用，術語「一或多種與PACAP有關之生物效應係指PACAP介導、誘導或在其他方面可歸因於PACAP之任何生物效應，例如結合特性、功能特性及具有生物顯著性之其他特性。PACAP之非限制性例示性生物效應包括PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R、GAG及/或VPAC2-R；PACAP激活PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R介導之信號傳導；PACAP介導之cAMP產生增加；PACAP介導之PLC活性增加；PACAP介導之PLD活性增加；PACAP介導之Ca2+ 水準增加；及PACAP介導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。本發明抗PACAP抗體能夠抑制此等例示性PACAP生物活性之一或其組合或全部。例如，本文所提供之抗PACAP抗體及其抗原結合片段能夠抑制PACAP誘導之血管擴張(參見實例7及實例8)。
根據本發明之抗體或其抗原結合片段可用於多種治療性應用。例如，在一些實施例中，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段適用於治療與PACAP有關之病狀，諸如但不限於偏頭痛(具有或不具有先兆)、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、緊張性頭痛、普通頭痛、熱潮紅、畏光、慢性陣發性半側顱痛、歸因於頭部或頸部潛在結構問題之繼發性頭痛、腦神經痛、竇性頭痛(例如，與竇炎有關之頭痛)、過敏誘導之頭痛或偏頭痛、疼痛、慢性疼痛、神經發炎或發炎疼痛、術後切口疼痛、術後疼痛、創傷相關疼痛、眼痛、牙痛、複雜性區域疼痛症候群、癌症疼痛(例如，原發性或轉移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、由燒傷引起之疼痛、痛風關節疼痛、與鐮狀細胞危象有關之疼痛、與顳頜關節病症有關之疼痛、硬化、肝炎、神經性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟疼痛、三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、痛經、卵巢痛、反射性交感神經失養症、骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛、下背痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、消化不良、腸易激症候群、發炎性腸病、克羅恩氏病、迴腸炎、潰瘍性結腸炎、腎絞痛、痛經、膀胱炎、間質性膀胱炎、月經期、分娩、停經、胰臟炎、精神分裂症、抑鬱症、PTSD、焦慮症、糖尿病、自體免疫糖尿病、內皮功能障礙、缺血、雷諾氏症候群、冠心病(「CHD」)、冠狀動脈疾病(「CAD」)、心臟衰竭、外周動脈疾病(「PAD」)、肺性高血壓(「PH」)、結締組織病症、中風、休格輪氏症候群、多發性硬化、枝氣管高反應性、氣喘、枝氣管炎、枝氣管擴張、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(「COPD」)、發炎性皮炎、腺組織腺癌、器官胚性組織胚細胞瘤、上皮組織癌瘤、形成血細胞之組織的白血病、淋巴組織淋巴瘤、骨髓之骨髓瘤、結締組織或支撐組織肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌腫瘤、子宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞減少症、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭部癌、頸部癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神經系統腫瘤、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、骨髓癌、多發性骨髓瘤、轉移至骨骼之腫瘤、浸潤神經及空腔臟器之腫瘤、在神經結構附近之腫瘤、尋常性痤瘡、異位性皮炎、蕁麻疹、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及紅斑痤瘡、過敏性皮炎、牛皮癬、瘙癢、神經性皮膚發紅、紅斑、體重減輕、厭食、類肉瘤病、休克、敗血症、鴉片劑戒斷症候群、嗎啡耐受性、癲癇、LUT病症(諸如泌尿道感染、異常排尿、尿急、夜尿症、尿失禁、膀胱過動症)，且適用於預防或緩解與該等LUT病狀有關之疼痛。
內臟疼痛(亦即，與身體之內臟、或內部器官有關的疼痛)之特定實例包括影響諸如心臟、肺、生殖器、膀胱、尿道、消化器、肝臟、胰臟、脾及腎之器官的疼痛。與其有關之病狀包括例如胰臟炎、分娩、與腸梗阻有關之腹部手術、膀胱炎、月經期或痛經。同樣，腎疼痛、上腹部疼痛、胸膜疼痛及膽絞痛、闌尾炎疼痛均可被視為內臟疼痛。源於早期心肌梗塞之胸骨下疼痛或壓力亦為內臟疼痛。胃、十二指腸或結腸疾病可引起內臟疼痛。通常遇到之可引起內臟疼痛的胃腸(「GI」)病症包括功能性腸病症(「FBD」)及發炎性腸病(「IBD」)。該等GI病症可進一步包括胃-食道反流、消化不良、腸易激症候群(「IBS」)及功能性腹部疼痛症候群(「FAPS」)，且關於IBD包括克羅恩氏病、迴腸炎及潰瘍性結腸炎。
本發明抗PACAP抗體及其抗原結合片段可單獨或與其他活性劑或藥物(包括其他生物製劑)聯合使用，以治療其中治療上可需要阻斷、抑制或中和PACAP之活體內效應或阻斷或抑制PACAP及其受體PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R之相互作用的任何個體。
根據本發明之例示性抗PACAP抗體及其抗原結合片段及其特異性CDR在此部分中經鑑別。為便利起見，各例示之抗體或其抗原結合片段及相應序列分別地由特定命名鑑別，亦即Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23。
構成本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段對PACAP具有結合親和力，其中該結合親和力包含特異性結合於PACAP38及PACAP27、但不結合VIP之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，及/或特異性結合於PACAP38、但不結合於PACAP27或VIP之抗體或其抗原結合片段，及/或特異性結合於PACAP38及/或PACAP27內之線性及/或構形抗原決定基之抗體或其抗原結合片段。更特定言之，PACAP38及/或PACAP27中與根據本發明之拮抗性抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合的抗原決定基將包括實例12中鑑別之彼等抗原決定基或其殘基(如藉由使用丙胺酸掃描所確定)及/或其他抗原決定基鑑別方法。 抗 PACAP 抗體多肽序列 抗體Ab3.H
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 1121之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1130之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 1122之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSDYMCWVRQAPGKGLEWIGCIDAGSSGDTYFASSAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARHLYGSITFAFGLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1122)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab3.H相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 1130)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1150之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 1142之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： AAQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGSDLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGTYYSSGWYTAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1142)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab3.H相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1150)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 1124；SEQ ID NO: 1126；及SEQ ID NO: 1128中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1121之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 1144；SEQ ID NO: 1146；及SEQ ID NO: 1148中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 1123；SEQ ID NO: 1125；SEQ ID NO: 1127；及SEQ ID NO: 1129中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1121之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122，及/或多肽序列SEQ ID NO: 1143；SEQ ID NO: 1145；SEQ ID NO: 1147；及SEQ ID NO: 1149中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1121或SEQ ID NO: 1122、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1141或SEQ ID NO: 1142、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1124；SEQ ID NO: 1126；及SEQ ID NO: 1128中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1121之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1144；SEQ ID NO: 1146；及SEQ ID NO: 1148中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1123；SEQ ID NO: 1125；SEQ ID NO: 1127；及SEQ ID NO: 1129中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1121之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1143；SEQ ID NO: 1145；SEQ ID NO: 1147；及SEQ ID NO: 1149中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1122之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1122之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1124；SEQ ID NO: 1126；及SEQ ID NO: 1128)；及SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1144；SEQ ID NO: 1146；及SEQ ID NO: 1148)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1122之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1122之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1123；SEQ ID NO: 1125；SEQ ID NO: 1127；及SEQ ID NO: 1129)；及SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1143；SEQ ID NO: 1145；SEQ ID NO: 1147；及SEQ ID NO: 1149)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab3.H，其包含SEQ ID NO: 1121及SEQ ID NO: 1141、或SEQ ID NO: 1122及SEQ ID NO: 1142，或替代地由該等序列組成，或包含Ab3.H之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab3.H競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab3.H之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab3.H相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab3.H，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 1122及/或SEQ ID NO: 1142之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab3.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab3.H之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab3.H之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。 抗體Ab4.H
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 1081之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1090之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 1082之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYDMSWVRQAPGKGLEWIGIINTNDDTWYASWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARISDAYVFDYAYYFTLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1082)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab4.H相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1090)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1110之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 1102之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCLASQNIYNSLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGAGADNIGNPFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1102)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab4.H相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1110)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 1084；SEQ ID NO: 1086；及SEQ ID NO: 1088中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1081之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 1104；SEQ ID NO: 1106；及SEQ ID NO: 1108中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 1083；SEQ ID NO: 1085；SEQ ID NO: 1087；及SEQ ID NO: 1089中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1081之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082，及/或多肽序列SEQ ID NO: 1103；SEQ ID NO: 1105；SEQ ID NO: 1107；及SEQ ID NO: 1109中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1081或SEQ ID NO: 1082、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1101或SEQ ID NO: 1102、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1084；SEQ ID NO: 1086；及SEQ ID NO: 1088中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1081之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1104；SEQ ID NO: 1106；及SEQ ID NO: 1108中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1083；SEQ ID NO: 1085；SEQ ID NO: 1087；及SEQ ID NO: 1089中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1081之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1103；SEQ ID NO: 1105；SEQ ID NO: 1107；及SEQ ID NO: 1109中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1082之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1082之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1084；SEQ ID NO: 1086；及SEQ ID NO: 1088)；及SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1104；SEQ ID NO: 1106；及SEQ ID NO: 1108)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1082之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1082之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1083；SEQ ID NO: 1085；SEQ ID NO: 1087；及SEQ ID NO: 1089)；及SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1103；SEQ ID NO: 1105；SEQ ID NO: 1107；及SEQ ID NO: 1109)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab4.H，其包含SEQ ID NO: 1081及SEQ ID NO: 1101、或SEQ ID NO: 1082及SEQ ID NO: 1102，或替代地由該等序列組成，或包含Ab4.H之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab4.H競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab4.H之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab4.H相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab4.H，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 1082及/或SEQ ID NO: 1102之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab4.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab4.H之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab4.H之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。 抗體Ab5.H
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 1001之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1010之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 1002之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEWVGIIYDNGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAREPGSTTQNDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1002)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab5.H相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1010)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1030之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 1022之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： DVQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASENIYNSLLWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNYYNIWTNGAAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1022)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab5.H相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1030)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 1004；SEQ ID NO: 1006；及SEQ ID NO: 1008中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1001之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 1024；SEQ ID NO: 1026；及SEQ ID NO: 1028中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 1003；SEQ ID NO: 1005；SEQ ID NO: 1007；及SEQ ID NO: 1009中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1001之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002，及/或多肽序列SEQ ID NO: 1023；SEQ ID NO: 1025；SEQ ID NO: 1027；及SEQ ID NO: 1029中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1001或SEQ ID NO: 1002、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1021或SEQ ID NO: 1022、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1004；SEQ ID NO: 1006；及SEQ ID NO: 1008中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1001之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1024；SEQ ID NO: 1026；及SEQ ID NO: 1028中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1003；SEQ ID NO: 1005；SEQ ID NO: 1007；及SEQ ID NO: 1009中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1001之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1023；SEQ ID NO: 1025；SEQ ID NO: 1027；及SEQ ID NO: 1029中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1002之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1002之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1004；SEQ ID NO: 1006；及SEQ ID NO: 1008)；及SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1024；SEQ ID NO: 1026；及SEQ ID NO: 1028)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1002之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1002之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1003；SEQ ID NO: 1005；SEQ ID NO: 1007；及SEQ ID NO: 1009)；及SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1023；SEQ ID NO: 1025；SEQ ID NO: 1027；及SEQ ID NO: 1029)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab5.H，其包含SEQ ID NO: 1001及SEQ ID NO: 1021、或SEQ ID NO: 1002及SEQ ID NO: 1022，或替代地由該等序列組成，或包含Ab5.H之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab5.H競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab5.H之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab5.H相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab5.H，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 1002及/或SEQ ID NO: 1022之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab5.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab5.H之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab5.H之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。 抗體Ab9
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 801之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 810之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 802之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： QQLEQSGGGAEGGLVKPGGSLKLSCKASGFTISRDYWICWVRQAPGKGLEWIGCISAGGGSTDYANWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTDADTAMYYCAGNLEIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 802)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab9相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 810)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 821之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 830之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 822之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSPSIYSGAFLSWFQQKPGQPPKFLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGFYDCSSVDCHAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 822)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab9相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 830)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 804；SEQ ID NO: 806；及SEQ ID NO: 808中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 801之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 802，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 824；SEQ ID NO: 826；及SEQ ID NO: 828中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 803；SEQ ID NO: 805；SEQ ID NO: 807；及SEQ ID NO: 809中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 801之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802，及/或多肽序列SEQ ID NO: 823；SEQ ID NO: 825；SEQ ID NO: 827；及SEQ ID NO: 829中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 801或SEQ ID NO: 802、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 821或SEQ ID NO: 822、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 804；SEQ ID NO: 806；及SEQ ID NO: 808中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 801之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 824；SEQ ID NO: 826；及SEQ ID NO: 828中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 803；SEQ ID NO: 805；SEQ ID NO: 807；及SEQ ID NO: 809中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 801之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 823；SEQ ID NO: 825；SEQ ID NO: 827；及SEQ ID NO: 829中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 802之可變重鏈區；SEQ ID NO: 822之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 802之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 804；SEQ ID NO: 806；及SEQ ID NO: 808)；及SEQ ID NO: 822之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 824；SEQ ID NO: 826；及SEQ ID NO: 828)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 802之可變重鏈區；SEQ ID NO: 822之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 802之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 803；SEQ ID NO: 805；SEQ ID NO: 807；及SEQ ID NO: 809)；及SEQ ID NO: 822之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 823；SEQ ID NO: 825；SEQ ID NO: 827；及SEQ ID NO: 829)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab9，其包含SEQ ID NO: 801及SEQ ID NO: 821、或SEQ ID NO: 802及SEQ ID NO: 822，或替代地由該等序列組成，或包含Ab9之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab9競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab9之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab9相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab9，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 802及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 802及/或SEQ ID NO: 822之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab9之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab9之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab9之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。 抗體Ab9.H
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 1161之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1170之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 1162之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSRDYWICWVRQAPGKGLEWIGCISAGGGSTDYANWVNGRFTISRDISKNTGYLQMNSLRAEDTAVYYCAGNLEIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1162)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab9.H相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1170)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1190之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 1182之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSPSIYSGAFLSWYQQKPGKAPKFLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGFYDCSSVDCHAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1182)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab9.H相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1190)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 1164；SEQ ID NO: 1166；及SEQ ID NO: 1168中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1161之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 1184；SEQ ID NO: 1186；及SEQ ID NO: 1188中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 1163；SEQ ID NO: 1165；SEQ ID NO: 1167；及SEQ ID NO: 1169中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1161之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162，及/或多肽序列SEQ ID NO: 1183；SEQ ID NO: 1185；SEQ ID NO: 1187；及SEQ ID NO: 1189中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1161或SEQ ID NO: 1162、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1181或SEQ ID NO: 1182、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1164；SEQ ID NO: 1166；及SEQ ID NO: 1168中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1161之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1184；SEQ ID NO: 1186；及SEQ ID NO: 1188中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1163；SEQ ID NO: 1165；SEQ ID NO: 1167；及SEQ ID NO: 1169中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1161之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1183；SEQ ID NO: 1185；SEQ ID NO: 1187；及SEQ ID NO: 1189中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1162之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1162之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1164；SEQ ID NO: 1166；及SEQ ID NO: 1168)；及SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1184；SEQ ID NO: 1186；及SEQ ID NO: 1188)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1162之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1162之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1163；SEQ ID NO: 1165；SEQ ID NO: 1167；及SEQ ID NO: 1169)；及SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1183；SEQ ID NO: 1185；SEQ ID NO: 1187；及SEQ ID NO: 1189)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab9.H，其包含SEQ ID NO: 1161及SEQ ID NO: 1181、或SEQ ID NO: 1162及SEQ ID NO: 1182，或替代地由該等序列組成，或包含Ab9.H之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab9.H競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab9.H之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab9.H相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab9.H，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 1162及/或SEQ ID NO: 1182之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab9.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab9.H之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab9.H之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。 抗體Ab12.H
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其具有包含序列SEQ ID NO: 1041之重鏈序列，該重鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1050之重鏈恆定區的SEQ ID NO: 1042之重鏈可變區組成。
在一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYAMGWVRQAPGKGLEWIGDISTYGTTDYASWVYGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARDYWLSLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1042)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab12.H相同之抗原決定基，且其含有包含SEQ ID NO: 1244、1245或1246之多肽、或包含下文所陳述之序列的恆定重鏈序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1050)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈序列，該輕鏈序列由連接至SEQ ID NO: 1070之輕鏈恆定區的SEQ ID NO: 1062之輕鏈可變區組成。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有包含下文所陳述之序列的可變輕鏈序列： AAQLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNALAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGGYYDPADNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1062)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其結合與Ab12.H相同之抗原決定基，且其含有包含下文所陳述之序列的恆定輕鏈序列： TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1070)。
在另一實施例中，本發明包括對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段，其含有多肽序列SEQ ID NO: 1044；SEQ ID NO: 1046；及SEQ ID NO: 1048中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1041之CDR (高變區)，或含有可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042，及/或進一步含有多肽序列SEQ ID NO: 1064；SEQ ID NO: 1066；及SEQ ID NO: 1068中之一者、兩者或三者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之CDR (高變區)，或含有可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或含有與其至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合之抗體或抗原結合片段。在本發明之另一實施例中，本發明抗體及抗原結合片段包含所例示之可變重鏈及可變輕鏈序列、或上文所陳述之重鏈及輕鏈序列、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明進一步涵蓋包含多肽序列SEQ ID NO: 1043；SEQ ID NO: 1045；SEQ ID NO: 1047；及SEQ ID NO: 1049中之一者、兩者、三者或四者之抗PACAP抗體及抗原結合片段，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1041之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042，及/或多肽序列SEQ ID NO: 1063；SEQ ID NO: 1065；SEQ ID NO: 1067；及SEQ ID NO: 1069中之一者、兩者、三者或四者，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或此等多肽序列、或與其至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的組合。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段或片段包含該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，本發明之抗PACAP抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1041或SEQ ID NO: 1042、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。在本發明之另一實施例中，本發明之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1061或SEQ ID NO: 1062、或與其至少90%或95%一致之多肽，或替代地由該等多肽組成。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1044；SEQ ID NO: 1046；及SEQ ID NO: 1048中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1041之CDR (高變區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1064；SEQ ID NO: 1066；及SEQ ID NO: 1068中之一者、兩者或三者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之CDR (高變區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1043；SEQ ID NO: 1045；SEQ ID NO: 1047；及SEQ ID NO: 1049中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於重鏈序列SEQ ID NO: 1041之FR (恆定區)，或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之本發明抗體及抗原結合片段包含多肽序列SEQ ID NO: 1063；SEQ ID NO: 1065；SEQ ID NO: 1067；及SEQ ID NO: 1069中之一者、兩者、三者或四者，或替代地由其組成，該等多肽序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之FR (恆定區)，或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或與其至少90%或95%一致之序列。
本發明亦涵蓋包括一或多種本文所述之抗體片段之抗PACAP抗體及抗原結合片段。在本發明之一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體及抗原結合片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1042之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1042之可變重鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1044；SEQ ID NO: 1046；及SEQ ID NO: 1048)；及SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈區的互補決定區(SEQ ID NO: 1064；SEQ ID NO: 1066；及SEQ ID NO: 1068)，或與其至少90%或95%一致之序列。在本發明之另一實施例中，對PACAP具有結合特異性之抗體的片段包含以下抗體片段之一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：SEQ ID NO: 1042之可變重鏈區；SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈區；SEQ ID NO: 1042之可變重鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1043；SEQ ID NO: 1045；SEQ ID NO: 1047；及SEQ ID NO: 1049)；及SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈區的構架區(SEQ ID NO: 1063；SEQ ID NO: 1065；SEQ ID NO: 1067；及SEQ ID NO: 1069)，或與其至少90%或95%一致之序列。
在本發明之另一實施例中，該抗PACAP抗體為Ab12.H，其包含SEQ ID NO: 1041及SEQ ID NO: 1061、或SEQ ID NO: 1042及SEQ ID NO: 1062，或替代地由該等序列組成，或包含Ab12.H之CDR且具有至少一種本文所陳述之生物活性的抗體或抗原結合片段，或為與Ab12.H競爭結合PACAP之抗PACAP抗體，較佳地含有與Ab12.H之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的序列者，或結合於PACAP上與Ab12.H相同或重疊之抗原決定基的抗體。
在本發明之另一實施例中，抗原結合片段包含對PACAP具有結合特異性之Fab片段，或替代地由該等Fab片段組成。關於抗體Ab12.H，該Fab片段較佳地包括可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042及可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或與其至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。本發明之此實施例進一步包括含有SEQ ID NO: 1042及/或SEQ ID NO: 1062之添加、缺失及變異體之Fab，該等Fab保持對PACAP之結合特異性。
在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可藉由Ab12.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab12.H之抗PACAP抗體及Fab片段可經由諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如單倍體或二倍體酵母，諸如單倍體或二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
在一額外實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸，該等抗體多肽包括Ab12.H之重鏈及/或輕鏈，以及片段、變異體、及該等FR、CDR、可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)、或與其至少90%或95%一致之序列中的一或多者之組合。
在另一實施例中，本發明涵蓋一種分離之抗PACAP抗體，其包含選自以下之VH 多肽序列：SEQ ID NO: 802；SEQ ID NO: 1122；SEQ ID NO: 1082；SEQ ID NO: 1002；SEQ ID NO: 1162；SEQ ID NO: 1042，或其變異體；且進一步包含選自以下之VL 多肽序列：SEQ ID NO: 822；SEQ ID NO: 1142；SEQ ID NO: 1102；SEQ ID NO: 1022；SEQ ID NO: 1182；SEQ ID NO: 1062，或其變異體，其中該VH 或VL 多肽中之構架區殘基(「FR殘基」)及/或CDR殘基中之一或多者視情況已經另一胺基酸殘基取代，從而產生特異性結合PACAP之抗PACAP抗體。本發明涵蓋一種分離之抗PACAP抗體，其包含選自以下之VH 多肽序列及VL 多肽序列：SEQ ID NO: 802及SEQ ID NO: 822；SEQ ID NO: 1122及SEQ ID NO: 1142；SEQ ID NO: 1082及SEQ ID NO: 1102；SEQ ID NO: 1002及SEQ ID NO: 1022；SEQ ID NO: 1162及SEQ ID NO: 1182；或SEQ ID NO: 1042及SEQ ID NO: 1062，或其變異體，其中該VH 或VL 多肽中之構架區殘基(「FR殘基」)及/或CDR殘基中之一或多者已經另一胺基酸殘基取代，從而產生特異性結合PACAP之抗PACAP抗體。本發明亦包括此等抗體之人類化及嵌合形式。該等嵌合及人類化抗體可包括源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區之Fc。
在本發明之一實施例中，該等嵌合或人類化抗體或片段或VH 或VL 多肽起源於或源於一或多種兔抗體，例如自純系兔B細胞群體分離之兔抗體。
在一些態樣中，本發明提供一種包含編碼如本文所揭示之抗PACAP抗體或其片段之核酸分子的載體。在一些實施例中，本發明提供一種包含編碼如本文所揭示之抗PACAP抗體或其片段之核酸分子的宿主細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種與本文所揭示之抗體或其抗原結合片段競爭結合於PACAP之分離抗體或其抗原結合片段。
在一些態樣中，本發明提供一種編碼如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段之核酸分子。
在一些態樣中，本發明提供一種包含至少一種如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段之醫藥或診斷組合物。
在一些態樣中，本發明提供一種用於治療或預防個體中與升高之PACAP水準有關之病狀的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的至少一種如本文所揭示之分離抗體或其抗原結合片段。
在一些態樣中，本發明提供一種抑制個體中PACAP與PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R之結合的方法，該方法包含投與有效量之至少一種如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。
在一些態樣中，本發明提供一種選擇性結合於PACAP之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於5 × 10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5 × 10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5 × 10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5 × 10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5 × 10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5 × 10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5 × 10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5 × 10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5 × 10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之KD ；較佳地，以小於或等於5 × 10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5 × 10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5 × 10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之KD ；更佳地，以小於約100 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約25 pM、小於約1 pM、在約10 pM與約100 pM之間、在約1 pM與約100 pM之間或在約1 pM與約10 pM之間之KD 結合於PACAP。較佳地，該抗PACAP抗體或其抗原結合片段與VIP無交叉反應性或具有最小交叉反應性。
本發明抗體及其抗原結合片段可經轉譯後修飾以添加效應子部分(諸如化學連接子)、可偵測部分(諸如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質及化學發光部分)或官能部分(諸如抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、生物素、細胞毒素、細胞毒性劑及放射性物質)。
抗體及其抗原結合片段亦可經化學修飾以提供額外優勢，諸如該多肽之增加之溶解度、穩定性及循環時間(活體內半衰期)、或減少之免疫原性(參見美國專利第4,179,337號)。用於衍生化之化學部分可選自水溶性聚合物，諸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧基甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇及其類似物。該等抗體及其片段可在分子內之無規位置處、或在分子內之預定位置處經修飾且可包括一種、兩種、三種、或更多種所連接之化學部分。
該聚合物可具有任何分子量，且可為分支或無分支的。關於聚乙二醇，為了處置及製造簡便性起見，較佳分子量在約1 kDa與約100 kDa之間(術語「約」指示在聚乙二醇之製備中，一些分子將比所陳述之分子量重一些、輕一些)。亦可使用其他大小，視所需治療型態(例如，所需持續釋放之持續時間、對生物活性之效應(若存在)、處置簡便性、抗原性之程度或缺乏及聚乙二醇對治療蛋白或類似物之其他已知效應)而定。例如，聚乙二醇可具有約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000 kDa之平均分子量。分支聚乙二醇描述於例如美國專利第5,643,575號；Morpurgo等人,Appl. Biochem. Biotechnol ., 56:59-72 (1996)；Vorobjev等人,Nucleosides and Nucleotides, 18:2745-2750 (1999)；及Caliceti等人,Bioconjug. Chem., 10:638-646 (1999)中，該等文獻中每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
熟習此項技術者可獲得多種連接方法(參見例如EP 0 401 384，以引用之方式併入本文中，揭示一種偶合PEG至G-CSF之方法；及Malik等人,Exp. Hematol ., 20:1028-1035 (1992) (報道使用三氟代乙烷磺醯氯使GM-CSF聚乙二醇化))。例如，聚乙二醇可經由諸如自由胺基或羧基之反應性基團經胺基酸殘基共價連接。反應性基團為可結合活化聚乙二醇分子之彼等基團。具有自由胺基之胺基酸殘基可包括離胺酸殘基及N端胺基酸殘基；具有自由羧基之彼等殘基可包括天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基及C端胺基酸殘基。巰基亦可用作用於連接聚乙二醇分子之反應性基團。關於治療性目的較佳的是在胺基處連接，諸如在N端或離胺酸基團處連接。
如上文所建議，聚乙二醇可經由與任何多種胺基酸殘基之連接而連接於蛋白。例如，聚乙二醇可經由與離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸殘基之共價鍵連接於多肽。一或多種反應化學可用於連接聚乙二醇至特異性胺基酸殘基(例如，離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸)或至超過一種類型之胺基酸殘基(例如，離胺酸、組胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺酸及其組合)。
或者，抗體或其抗原結合片段可經由與白蛋白(包括但不限於重組人類血清白蛋白或其片段或變異體(參見例如美國專利第5,876,969號、EP 0 413 622及美國專利第5,766,883號，以引用之方式整體併入本文中))、或其他循環血蛋白(諸如轉鐵蛋白或鐵蛋白)融合而具有增加之活體內半衰期。在一較佳實施例中，本發明之多肽及/或抗體(包括其片段或變異體)與成熟形式之人類血清白蛋白(亦即，如EP 0 322 094之圖1及2中所示之人類血清白蛋白的胺基酸1-585)融合，該文獻以引用之方式整體併入本文中。本發明亦涵蓋編碼本發明之融合蛋白之聚核苷酸。
關於可偵測部分，其他例示性酶包括但不限於辣根過氧化酶、乙醯膽鹼酯酶、鹼性磷酸酯酶、β -半乳糖苷酶及螢光素酶。其他例示性螢光物質包括但不限於玫瑰紅、螢光素、異硫氰酸螢光素、傘形酮、二氯三嗪胺、藻紅素及丹磺醯氯。其他例示性化學發光部分包括但不限於發光胺。其他例示性生物發光物質包括但不限於螢光素及水母素。其他例示性放射性物質包括但不限於碘125 (125 I)、碳14 (14 C)、硫35 (35 S)、氚(3 H)及磷32 (32 P)。
此項技術中已知用於結合抗體或其抗原結合片段至可偵測部分之方法及其類似方法，諸如由Hunter等人,Nature, 144:945 (1962)；David等人,Biochemistry, 13:1014 (1974)；Pain等人,J. Immunol. Meth ., 40:219 (1981)；及Nygren, J.,Histochem. and Cytochem ., 30:407 (1982)描述之彼等方法。
本文所述之實施例進一步包括實質上與本文陳述之抗體、抗體片段、雙功能抗體、SMIP、駱駝抗體、奈米抗體、IgNAR、多肽、可變區及CDR同源之變異體及相等物。其可含有例如保守性取代突變(亦即，由類似胺基酸取代一或多種胺基酸)。例如，保守性取代係指胺基酸用相同一般類別內之另一胺基酸取代，例如一種酸性胺基酸用另一酸性胺基酸取代、一種鹼性胺基酸用另一鹼性胺基酸取代、或一種中性胺基酸由另一中性胺基酸取代。此項技術中熟知保守性胺基酸取代意指什麼。
在另一實施例中，本發明涵蓋與本文所陳述之抗原結合片段、可變區及CDR之任何一或多種多肽序列具有至少90%或更大序列同源性之多肽序列。更佳地，本發明涵蓋與本文所陳述之抗原結合片段、可變區及CDR之任何一或多種多肽序列具有至少95%或更大序列同源性、甚至更佳地至少98%或更大序列同源性、且甚至更佳地至少99%或更大序列同源性之多肽序列。
一般技術者熟知用於確定核酸與胺基酸序列之間之同源性之方法。
在另一實施例中，本發明進一步涵蓋本文所陳述之抗原結合片段、可變區及CDR之上述多肽同系物，其進一步具有抗PACAP活性。抗PACAP活性之非限制性實例陳述於本文中，例如抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R之能力，由此導致降低之cAMP產生。
在另一實施例中，本發明進一步涵蓋結合任何前述序列之抗體之產生及用途，包括但不限於抗個體基因型抗體。在一例示性實施例中，該抗個體基因型抗體可能投與至已接受抗PACAP抗體之個體以調節、降低、或中和該抗PACAP抗體之效應。該等抗體亦可能適用於治療由抗PACAP抗體之存在表徵的自體免疫疾病。該等抗體(例如，抗個體基因型抗體)之另一例示性用途係用於偵測本發明之抗PACAP抗體，例如以監測存在於個體之血液或其他體液中的抗PACAP抗體之水準。例如，在一實施例中，本發明提供一種使用該抗個體基因型抗體來監測該抗PACAP抗體或其抗原結合片段在個體中之活體內水準或中和在正投與該抗PACAP抗體或其抗原結合片段之個體中的該抗PACAP抗體之方法。
本發明亦涵蓋包含任何本文所述之多肽或聚核苷酸序列之抗PACAP抗體，該等序列取代任何本文所述之其他聚核苷酸序列。例如(而不限於此)，本發明涵蓋包含任何本文所述之可變輕鏈及可變重鏈序列之組合的抗體，且進一步涵蓋由任何本文所述之CDR序列取代任何本文所述之其他CDR序列所產生的抗體。 編碼抗 PACAP 抗體多肽之例示性聚核苷酸
本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。 抗體Ab3.H
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1131，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1132及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1140組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1122： gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattctccttcagtagcagcgactacatgtgctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggatgcattgatgctggtagtagtggtgacacttacttcgcgagctctgcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatttctgtgctagacatctttatggtagtattactttcgcctttggcttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1132)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1130： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 1140)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1151，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1141且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1152及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1160組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1142： gcagcccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcaggccagtcagagcattggtagcgacttagcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctatgatgcatccactctggcatctggagtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtcaaggcacttattatagtagtggttggtacactgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1152)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1150： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1160)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1134；SEQ ID NO: 1136；及SEQ ID NO: 1138中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1154；SEQ ID NO: 1156；及SEQ ID NO: 1158中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1133；SEQ ID NO: 1135；SEQ ID NO: 1137；及SEQ ID NO: 1139中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1153；SEQ ID NO: 1155；SEQ ID NO: 1157；及SEQ ID NO: 1159中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之聚核苷酸SEQ ID NO: 1131；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122之聚核苷酸SEQ ID NO: 1132；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之聚核苷酸SEQ ID NO: 1151；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142之聚核苷酸SEQ ID NO: 1152；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之CDR (SEQ ID NO: 1134；SEQ ID NO: 1136；及SEQ ID NO: 1138)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之CDR (SEQ ID NO: 1154；SEQ ID NO: 1156；及SEQ ID NO: 1158)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之FR (SEQ ID NO: 1133；SEQ ID NO: 1135；SEQ ID NO: 1137；及SEQ ID NO: 1139)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1122的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之FR (SEQ ID NO: 1153；SEQ ID NO: 1155；SEQ ID NO: 1157；及SEQ ID NO: 1159)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1142的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab3.H，編碼全長Ab3.H抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1121之聚核苷酸SEQ ID NO: 1131，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1141之聚核苷酸SEQ ID NO: 1151，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab3.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab3.H之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab3.H聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。 抗體Ab4.H
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1091，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1092及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1100組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1082： gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattctccctcagtagctacgacatgagctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggaatcattaatactaatgatgacacatggtacgcgagctgggtgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccctgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtattactgtgctagaatatccgatgcttatgtttttgattatgcgtattactttactttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1092)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1090： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 1100)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1111，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1101且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1112及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1120組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1102： gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtctggccagtcagaacatttacaattctttagcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccactctggcatctggagtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtcaacagggtgctggtgctgataatattggtaatcctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1112)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1110： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1120)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1094；SEQ ID NO: 1096；及SEQ ID NO: 1098中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1114；SEQ ID NO: 1116；及SEQ ID NO: 1118中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1093；SEQ ID NO: 1095；SEQ ID NO: 1097；及SEQ ID NO: 1099中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1113；SEQ ID NO: 1115；SEQ ID NO: 1117；及SEQ ID NO: 1119中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之聚核苷酸SEQ ID NO: 1091；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082之聚核苷酸SEQ ID NO: 1092；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之聚核苷酸SEQ ID NO: 1111；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102之聚核苷酸SEQ ID NO: 1112；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之CDR (SEQ ID NO: 1094；SEQ ID NO: 1096；及SEQ ID NO: 1098)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之CDR (SEQ ID NO: 1114；SEQ ID NO: 1116；及SEQ ID NO: 1118)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之FR (SEQ ID NO: 1093；SEQ ID NO: 1095；SEQ ID NO: 1097；及SEQ ID NO: 1099)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1082的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之FR (SEQ ID NO: 1113；SEQ ID NO: 1115；SEQ ID NO: 1117；及SEQ ID NO: 1119)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1102的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab4.H，編碼全長Ab4.H抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1081之聚核苷酸SEQ ID NO: 1091，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1101之聚核苷酸SEQ ID NO: 1111，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK-293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab4.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab4.H之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab4.H聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。 抗體Ab5.H
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1011，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1012及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1020組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1002： gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattctccctcagtagctatgcgatgatctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcggaatcatttatgataatggtgacacatactacgcgagctctgcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatttctgtgctagagagcctggtagtactactcagaatgacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1012)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1010： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 1020)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1031，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1021且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1032及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1040組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1022： gacgttcagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcaggccagtgagaacatttacaactctttactctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctatagggcatccactctggcatctggagtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtcaaaactattataatatatggactaatggtgctgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1032)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1030： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1040)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1014；SEQ ID NO: 1016；及SEQ ID NO: 1018中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1034；SEQ ID NO: 1036；及SEQ ID NO: 1038中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1013；SEQ ID NO: 1015；SEQ ID NO: 1017；及SEQ ID NO: 1019中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1033；SEQ ID NO: 1035；SEQ ID NO: 1037；及SEQ ID NO: 1039中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之聚核苷酸SEQ ID NO: 1011；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002之聚核苷酸SEQ ID NO: 1012；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之聚核苷酸SEQ ID NO: 1031；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022之聚核苷酸SEQ ID NO: 1032；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之CDR (SEQ ID NO: 1014；SEQ ID NO: 1016；及SEQ ID NO: 1018)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之CDR (SEQ ID NO: 1034；SEQ ID NO: 1036；及SEQ ID NO: 1038)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之FR (SEQ ID NO: 1013；SEQ ID NO: 1015；SEQ ID NO: 1017；及SEQ ID NO: 1019)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1002的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之FR (SEQ ID NO: 1033；SEQ ID NO: 1035；SEQ ID NO: 1037；及SEQ ID NO: 1039)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1022的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab5.H，編碼全長Ab5.H抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1001之聚核苷酸SEQ ID NO: 1011，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1021之聚核苷酸SEQ ID NO: 1031，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK-293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab5.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab5.H之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab5.H聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。 抗體Ab9
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 811，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 812及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 820組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 802： cagcagctggagcagtccggaggaggagccgaaggaggcctggtcaagcctgggggatccctgaaactctcctgcaaagcctctggattcaccatcagtagggactactggatatgttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggattggatgcattagtgctggtggtggtagcacagactacgcgaactgggtgaatggccgattcactctctccagagacatcgaccagagcacaggttgccttcaactgaacagtctgacagacgcggacacggccatgtattactgtgcgggaaatctagagatctggggccaagggaccctggtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 812)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 810： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacgcgagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 820)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 831，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 821且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 832及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 840組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 822： gcccaagtgctgacccagactccatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccagtccagtccgagtatttatagtggcgcctttttatcctggtttcagcagaaaccagggcagcctcccaagttcctgatctacgaagcctccaaactggcatctggggtcccatcgcggttcagtggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacgtacagtgtgacgatgctgccacttactactgtctaggcttttatgattgtagcagtgttgattgccatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgt (SEQ ID NO: 832)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 830： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 840)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 814；SEQ ID NO: 816；及SEQ ID NO: 818中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 834；SEQ ID NO: 836；及SEQ ID NO: 838中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 813；SEQ ID NO: 815；SEQ ID NO: 817；及SEQ ID NO: 819中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 833；SEQ ID NO: 835；SEQ ID NO: 837；及SEQ ID NO: 839中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 821之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之聚核苷酸SEQ ID NO: 811；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 802之聚核苷酸SEQ ID NO: 812；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 821之聚核苷酸SEQ ID NO: 831；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822之聚核苷酸SEQ ID NO: 832；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之CDR (SEQ ID NO: 814；SEQ ID NO: 816；及SEQ ID NO: 818)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 821之CDR (SEQ ID NO: 834；SEQ ID NO: 836；及SEQ ID NO: 838)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之FR (SEQ ID NO: 813；SEQ ID NO: 815；SEQ ID NO: 817；及SEQ ID NO: 819)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 802的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 821之FR (SEQ ID NO: 833；SEQ ID NO: 835；SEQ ID NO: 837；及SEQ ID NO: 839)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 822的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab9，編碼全長Ab9抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 801之聚核苷酸SEQ ID NO: 811，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 821之聚核苷酸SEQ ID NO: 831，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK-293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab9之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab9之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab9聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。 抗體Ab9.H
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1171，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1172及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1180組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1162： gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccgtcagtagggactactggatatgttgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggattggatgcattagtgctggtggtggtagcacagactacgcgaactgggtgaatggccgattcaccatctccagagacatctccaagaacaccggttatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtattactgtgcgggaaatctagagatctggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1172)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1170： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 1180)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1191，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1181且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1192及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1200組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1182： gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtccgagtatctatagtggcgccttcttatcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagttcctgatctatgaagcctccaaactggcatctggagtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtctaggcttctatgattgtagcagtgttgattgccatgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1192)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1190： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1200)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1174；SEQ ID NO: 1176；及SEQ ID NO: 1178中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1194；SEQ ID NO: 1196；及SEQ ID NO: 1198中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1173；SEQ ID NO: 1175；SEQ ID NO: 1177；及SEQ ID NO: 1179中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1193；SEQ ID NO: 1195；SEQ ID NO: 1197；及SEQ ID NO: 1199中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之聚核苷酸SEQ ID NO: 1171；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162之聚核苷酸SEQ ID NO: 1172；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之聚核苷酸SEQ ID NO: 1191；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182之聚核苷酸SEQ ID NO: 1192；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之CDR (SEQ ID NO: 1174；SEQ ID NO: 1176；及SEQ ID NO: 1178)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之CDR (SEQ ID NO: 1194；SEQ ID NO: 1196；及SEQ ID NO: 1198)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之FR (SEQ ID NO: 1173；SEQ ID NO: 1175；SEQ ID NO: 1177；及SEQ ID NO: 1179)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1162的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之FR (SEQ ID NO: 1193；SEQ ID NO: 1195；SEQ ID NO: 1197；及SEQ ID NO: 1199)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1182的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab9.H，編碼全長Ab9.H抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1161之聚核苷酸SEQ ID NO: 1171，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1181之聚核苷酸SEQ ID NO: 1191，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK-293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab9.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab9.H之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab9.H聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。 抗體Ab12.H
在一實施例中，本發明進一步係有關編碼對PACAP具有結合特異性之抗體多肽之聚核苷酸。在本發明之一實施例中，本發明聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1051，或替代地由該序列組成，該序列編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041且由重鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1052及重鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1060組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1042： gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattctccctcagtagctatgcaatgggctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggagacattagtacttatggtaccacagactacgcgagctgggtgtatggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgaggacactgctgtgtatttctgtgctagagactattggttgagcttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1052)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定重鏈多肽序列SEQ ID NO: 1050： gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 1060)。
在本發明之另一實施例中，聚核苷酸包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1071，或替代地由該序列組成，該序列編碼輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1061且由輕鏈可變區編碼序列SEQ ID NO: 1072及輕鏈恆定區編碼序列SEQ ID NO: 1080組成。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼可變輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1062： gcagcccagctgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtcagagtgtttatgataacaatgctttagcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactctggcatctggagtcccatcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtctaggcggttattatgatcctgctgataatgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1072)。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含以下聚核苷酸序列，或替代地由該序列組成，該序列編碼恆定輕鏈多肽序列SEQ ID NO: 1070： acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1080)。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1054；SEQ ID NO: 1056；及SEQ ID NO: 1058中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之CDR (高變區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1074；SEQ ID NO: 1076；及SEQ ID NO: 1078中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之CDR (高變區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸包含編碼該等CDR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之聚核苷酸的組合，或替代地由該等組合組成。
在本發明之另一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下，或替代地由其組成：聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1053；SEQ ID NO: 1055；SEQ ID NO: 1057；及SEQ ID NO: 1059中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之FR (恆定區)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042之聚核苷酸，及/或聚核苷酸序列SEQ ID NO: 1073；SEQ ID NO: 1075；SEQ ID NO: 1077；及SEQ ID NO: 1079中之一或多者，該等聚核苷酸序列對應於輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之FR (恆定區)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062，或此等聚核苷酸序列之組合。在本發明之另一實施例中，編碼本發明抗體或其片段之聚核苷酸包含該等FR、該等可變重鏈及可變輕鏈序列、及上文所陳述之重鏈及輕鏈序列(包括其中全部)中之一或多者之組合，或替代地由該等組合組成。
本發明亦涵蓋包括一或多種編碼本文所述之抗原結合片段之聚核苷酸序列的聚核苷酸序列。在本發明之一實施例中，編碼對PACAP具有結合特異性之抗原結合片段之聚核苷酸包含以下編碼抗原結合片段之聚核苷酸中的一者、兩者、三者或更多者(包括全部)，或替代地由其組成：編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之聚核苷酸SEQ ID NO: 1051；編碼可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042之聚核苷酸SEQ ID NO: 1052；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之聚核苷酸SEQ ID NO: 1071；編碼可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062之聚核苷酸SEQ ID NO: 1072；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之CDR (SEQ ID NO: 1054；SEQ ID NO: 1056；及SEQ ID NO: 1058)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042的聚核苷酸；編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之CDR (SEQ ID NO: 1074；SEQ ID NO: 1076；及SEQ ID NO: 1078)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062的聚核苷酸；編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之FR (SEQ ID NO: 1053；SEQ ID NO: 1055；SEQ ID NO: 1057；及SEQ ID NO: 1059)、或可變重鏈序列SEQ ID NO: 1042的聚核苷酸；及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之FR (SEQ ID NO: 1073；SEQ ID NO: 1075；SEQ ID NO: 1077；及SEQ ID NO: 1079)、或可變輕鏈序列SEQ ID NO: 1062的聚核苷酸。
在本發明之另一實施例中，本發明聚核苷酸包含編碼對PACAP具有結合特異性之Fab片段之聚核苷酸，或替代地由該等聚核苷酸組成。關於抗體Ab12.H，編碼全長Ab12.H抗體之聚核苷酸包含編碼重鏈序列SEQ ID NO: 1041之聚核苷酸SEQ ID NO: 1051，及編碼輕鏈序列SEQ ID NO: 1061之聚核苷酸SEQ ID NO: 1071，或替代地由該等聚核苷酸組成。
本發明之另一實施例涵蓋併入至表現載體中以在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞中、或在真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(諸如畢赤酵母)之微生物系統中表現之此等聚核苷酸。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。在本文所述之發明之一實施例中，Fab片段可在該等全長聚核苷酸在合適宿主中表現之後藉由Ab12.H之酶消化(例如，木瓜蛋白酶)產生。在本發明之另一實施例中，諸如Ab12.H之抗PACAP抗體或其Fab片段可經由Ab12.H聚核苷酸在諸如CHO、NSO或HEK 293細胞之哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、或諸如酵母細胞(例如二倍體酵母，諸如二倍體畢赤酵母)及其他酵母菌株之微生物系統中的表現產生。合適之畢赤酵母物種包括但不限於巴斯德畢赤酵母。
亦涵蓋包含該等聚核苷酸之宿主細胞及載體。
本發明進一步涵蓋包含編碼該等可變重鏈及輕鏈多肽序列以及如本文所陳述之個別CDR (高變區)之聚核苷酸序列的載體，以及包含該等載體序列之宿主細胞。在本發明之實施例中，該等宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在本發明之實施例中，該等宿主細胞為酵母細胞，諸如畢赤酵母屬之酵母細胞。 B 細胞篩選及分離
在一實施例中，本發明涵蓋抗原特異性B細胞之純系群體之製備及分離，其可用於分離至少一種PACAP抗原特異性細胞，該等細胞可用於產生對所需PACAP抗原具特異性之針對PACAP之單株抗體，或對應於該抗體之核酸序列。製備及分離該抗原特異性B細胞之純系群體之方法教示於例如Carvalho-Jensen等人之美國專利公開案第US2007/0269868號，該案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。製備及分離該抗原特異性B細胞之純系群體之方法亦教示於本文實例中。此項技術中已知藉由大小或密度使細胞群體「增濃」之方法。參見例如美國專利第5,627,052號。此等步驟可另外用於藉由抗原特異性使細胞群體增濃。 人類化抗體之方法
在另一實施例中，本發明涵蓋用於人類化抗體重鏈及輕鏈之方法。用於人類化可應用於抗PACAP抗體之抗體重鏈及輕鏈之方法教示於例如Olson等人之美國專利公開案第US2009/0022659號及Garcia-Martinez等人之美國專利第7,935,340號中，該等文獻中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。 產生抗體及其片段之方法
在另一實施例中，本發明涵蓋用於產生抗PACAP抗體及其片段之方法。用於產生自交配勝任酵母之多倍體、較佳地二倍體或四倍體菌株分泌的抗PACAP抗體及其片段之方法教示於例如Olson等人之美國專利公開案第US2009/0022659號及Garcia-Martinez等人之美國專利第7,935,340號中，該等文獻中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
一般技術者熟知產生抗體之其他方法。例如，此項技術中現熟知產生嵌合抗體之方法(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號；Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 81:8651-55 (1984)；Neuberger等人,Nature, 314:268-270 (1985)；Boulianne, G.L.等人,Nature, 312:643-46 (1984)，該等文獻中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中)。
同樣，此項技術中現熟知產生人類化抗體之方法(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號；Winter之美國專利第5,225,539號及第6,548,640號；Carter等人之美國專利第6,054,297號、第6,407,213號及第6,639,055號；Adair之美國專利第6,632,927號；Jones, P.T.等人,Nature, 321:522-525 (1986)；Reichmann, L.等人,Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen, M.等人,Science, 239:1534-36 (1988)，該等文獻中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中)。
具有PACAP結合特異性之本發明抗體多肽亦可藉由使用一般技術者熟知之習知技術構築含有啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及編碼抗體重鏈之DNA序列的表現載體而產生，在該抗體重鏈中編碼抗體特異性所需之CDR的DNA序列源於非人類細胞來源，較佳地兔B細胞來源，而編碼該抗體鏈之剩餘部分的DNA序列源於人類細胞來源。
第二表現載體使用一般技術者熟知之相同習知方式產生，該表現載體含有啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及編碼抗體輕鏈之DNA序列，在該抗體輕鏈中編碼抗體特異性所需之CDR的DNA序列源於非人類細胞來源，較佳地兔B細胞來源，而編碼該抗體鏈之剩餘部分的DNA序列源於人類細胞來源。
該等表現載體藉由一般技術者熟知之習知技術轉染至宿主細胞中以產生經轉染宿主細胞，該經轉染宿主細胞藉由一般技術者熟知之習知技術培養以產生該等抗體多肽。
該宿主細胞可用上文所述之兩種表現載體共轉染，該第一表現載體含有編碼啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及輕鏈源性多肽之DNA且該第二載體含有編碼啟動子(視情況作為真核或原核操縱子之組分)及重鏈源性多肽之DNA。該兩種載體含有不同可選擇標記物，但較佳地實現該等重鏈及輕鏈多肽之實質上相等表現。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼該等重鏈及輕鏈多肽之DNA。用於該等重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA、基因組DNA或兩者。
用於表現該等抗體多肽之宿主細胞可為細菌細胞(諸如大腸桿菌)或真核細胞(諸如巴斯德畢赤酵母)。在本發明之一實施例中，可使用用於此目的之充分確定類型之哺乳動物細胞，諸如骨髓瘤細胞、CHO細胞株、NSO細胞株或HEK293細胞株。
可構築該等載體之一般方法、產生宿主細胞所需之轉染方法及由該等宿主細胞產生抗體多肽所需之培養方法均包括習知技術。儘管用於產生該抗體之細胞株較佳地為哺乳動物細胞株，但可替代地使用任何其他合適細胞株，諸如細菌細胞株(諸如大腸桿菌源性細菌菌株)或酵母細胞株。
同樣，一旦產生，該等抗體多肽可根據此項技術中之標準程序純化，諸如交叉流過濾、硫酸銨沈澱、親和力管柱層析、疏水性相互作用層析(「HIC」)及其類似程序。
本文所述之抗體多肽亦可用於將適用於與本發明抗體多肽相同之治療性應用的肽或非肽模擬物之設計及合成(參見例如Saragobi等人,Science, 253:792-795 (1991)，其內容以引用之方式整體併入本文中)。 篩選分析
此處所述之篩選分析經設計以鑑別可適用於展現PACAP相關疾病或病症之症狀的個體中與PACAP有關之疾病及病症之治療的高親和力抗PACAP Ab。
在一些實施例中，該抗體用作診斷工具。該抗體可用於分析樣品及/或個體中存在之PACAP的量。如熟習此項技術者應瞭解，該等抗體無需為中和抗體。在一些實施例中，該診斷抗體不為中和抗體。在一些實施例中，該診斷抗體結合於與中和抗體所結合不同之抗原決定基。在一些實施例中，該兩種抗體不會彼此競爭。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體在用於偵測哺乳動物組織或細胞中之PACAP之分析套組及/或方法中使用或提供以便篩選/診斷與PACAP水準之變化有關的疾病或病症。該套組包含結合PACAP之抗體及用於指示該抗體與PACAP (若存在)之結合及視情況PACAP蛋白水準之構件。可使用用於指示抗體存在之多種構件。例如，螢光團、其他分子探針或酶可連接至該抗體且該抗體之存在可以多種方式觀察到。用於篩選該等病症之方法可涉及該套組之使用、或簡單地一種所揭示抗體之使用及該抗體是否結合於樣品中之PACAP的確定。如熟習此項技術者應瞭解，高或升高水準之PACAP將導致更大量之該抗體結合於樣品中之PACAP。因此，抗體結合程度可用於確定多少PACAP在樣品中。PACAP之量大於預定量(例如，不具有PACAP相關病症之人將具有的量或範圍)之個體或樣品可表徵為具有PACAP介導之病症，例如偏頭痛、頭痛、疼痛或其他病狀。
本發明進一步提供一種用於偵測本發明之抗PACAP抗體與PACAP之結合的套組。詳言之，該套組可用於偵測可與本發明之抗PACAP抗體或其免疫反應性片段特異性反應之PACAP的存在。該套組亦可包括結合於受質之抗體、可與該抗原反應之二次抗體及用於偵測該二次抗體與該抗原之反應的試劑。該套組可為ELISA套組且可包含該受質、第一及第二抗體(適當時)、及任何其他必需試劑(諸如可偵測部分、酶受質、及顯色試劑，例如如本文所述)。該診斷套組亦可呈免疫印跡套組之形式。該診斷套組亦可呈化學發光套組(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)之形式。該診斷套組亦可為基於鑭系元素之偵測套組(PerkinElmer, San Jose, CA)。
熟練臨床醫師應理解，生物樣品包括但不限於血清、血漿、尿液、唾液、黏液、胸膜液、滑液及脊髓液。 改善或降低與 PACAP 有關之疾病及病症之症狀、或治療或預防該等疾病及病症之方法
在本發明之另一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其抗原結合片段適用於改善或降低與PACAP有關之疾病及病症之症狀、或治療或預防該等疾病及病症。本文所述之抗PACAP抗體或其抗原結合片段以及組合亦可呈如下文更詳細描述之醫藥組合物形式以治療有效量投與至需要治療與PACAP有關之疾病及病症之患者。
在本發明之另一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其抗原結合片段適用於(單獨或與另一試劑組合)改善或降低與PACAP有關之疾病或病狀之症狀、或治療或預防該等疾病或病狀。
在本發明之另一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其抗原結合片段(具有或不具有第二試劑)適用於改善或降低以下非限制性疾病及病症清單之症狀、或治療或預防以下非限制性疾病及病症清單：偏頭痛(具有或不具有先兆)、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、緊張性頭痛、普通頭痛、熱潮紅、畏光、慢性陣發性半側顱痛、歸因於頭部或頸部潛在結構問題之繼發性頭痛、腦神經痛、竇性頭痛(例如，與竇炎有關之頭痛)、過敏誘導之頭痛或偏頭痛、疼痛、慢性疼痛、神經發炎或發炎疼痛、術後切口疼痛、術後疼痛、創傷相關疼痛、眼痛、牙痛、複雜性區域疼痛症候群、癌症疼痛(例如，原發性或轉移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、由燒傷引起之疼痛、痛風關節疼痛、與鐮狀細胞危象有關之疼痛、與顳頜關節病症有關之疼痛、硬化、肝炎、神經性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟疼痛、三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、痛經、卵巢痛、反射性交感神經失養症、骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛、下背痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、消化不良、腸易激症候群、發炎性腸病、克羅恩氏病、迴腸炎、潰瘍性結腸炎、腎絞痛、痛經、膀胱炎、間質性膀胱炎、月經期、分娩、停經、胰臟炎、精神分裂症、抑鬱症、創傷後壓力病症、焦慮症、糖尿病、自體免疫糖尿病、內皮功能障礙、缺血、雷諾氏症候群、冠心病(「CHD」)、冠狀動脈疾病(「CAD」)、心臟衰竭、外周動脈疾病(「PAD」)、肺性高血壓(「PH」)、結締組織病症、中風、休格輪氏症候群、多發性硬化、枝氣管高反應性、氣喘、枝氣管炎、枝氣管擴張、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(「COPD」)、發炎性皮炎、腺組織腺癌、器官胚性組織胚細胞瘤、上皮組織癌瘤、形成血細胞之組織的白血病、淋巴組織淋巴瘤、骨髓之骨髓瘤、結締組織或支撐組織肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌腫瘤、子宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞減少症、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭部癌、頸部癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神經系統腫瘤、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、骨髓癌、多發性骨髓瘤、轉移至骨骼之腫瘤、浸潤神經及空腔臟器之腫瘤、在神經結構附近之腫瘤、尋常性痤瘡、異位性皮炎、蕁麻疹、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及紅斑痤瘡、過敏性皮炎、牛皮癬、瘙癢、神經性皮膚發紅、紅斑、體重減輕、厭食、類肉瘤病、休克、敗血症、鴉片劑戒斷症候群、嗎啡耐受性、癲癇、下泌尿道(「LUT」)病症(諸如泌尿道感染、異常排尿、尿急、夜尿症、尿失禁、膀胱過動症)，且適用於預防或緩解與該等LUT病狀有關之疼痛。較佳地，本文所述之本發明抗PACAP抗體及抗原結合片段適用於改善或降低偏頭痛、頭痛及疼痛相關疾病或病狀之症狀、治療或預防偏頭痛、頭痛及疼痛相關疾病或病狀。
詳言之，本發明抗PACAP抗體及抗原結合片段亦可適用於改善或降低畏光(與頭痛及/或偏頭痛一起存在以及獨立於頭痛及/或偏頭痛存在)之症狀、治療或預防畏光(與頭痛及/或偏頭痛一起存在以及獨立於頭痛及/或偏頭痛存在)。
偏頭痛患者當暴露於光時典型地發展惡化之疼痛及偏頭痛症狀(稱作畏光之現象)。畏光亦為眼部病症(諸如虹膜炎及葡萄膜炎)及顱內病症(諸如腦膜炎)中常見的。在經典視覺路徑中，光激活視網膜中之視桿細胞及視錐細胞，該等視桿細胞及視錐細胞激活視網膜神經節細胞經由視神經投射至外側膝狀體、上丘及接著視皮層。此路徑包括圖像形成及非圖像形成資料。新的路徑(非圖像形成資訊)允許經由視交叉上核維持正常晝夜節律且藉由固有光敏性視網膜神經節細胞(ipRGC)調節。此等ipRGC獨立於視桿細胞及視錐細胞且含有黑素蛋白(感光色素)。
Noseda, R.等人,Nat. Neurosci., 13:239–245 (2010)研究了具有偏頭痛之盲個體且使此等發現與兔模型相關，該等兔模型涉及追蹤ipRGC投射至感知硬腦膜疼痛之區域。在具有偏頭痛之盲患者中，6名歸因於嚴重視神經損壞或雙側摘除而不具有光感知。此等個體經歷異常睡眠模式及不良瞳孔光反應。其偏頭痛不會隨光暴露而惡化。相比之下，能夠偵測光但以最低程度感知圖像之14名盲個體具有正常睡眠模式及正常瞳孔光反射。儘管存在廣泛視桿細胞及視錐細胞退化，此等患者在偏頭痛發作期間在光暴露下具有惡化之偏頭痛症狀，表明ipRGC在畏光中至關重要，而非視桿細胞及視錐細胞。
非圖像形成腦區域之此等視網膜投射投射至後丘腦之對側背尾端區，如藉由大鼠中之順行性追蹤所證明。ipRGC輸入至此區域會調節硬腦膜敏感性疼痛神經元，該等神經元亦投射至此區。丘腦神經元(對硬腦膜疼痛及光輸入雙重敏感)廣泛地投射至多個皮質區，包括主要軀體感覺皮質、主要及次要運動皮質、頂葉聯合皮質、及主要及次要視覺皮質。此等皮質投射可幫助解釋除畏光以外之其他常見偏頭痛症狀，諸如運動軟弱或不協調、視力障礙、及注意力不集中。
畏光亦伴隨其他不太頻繁但同樣失能病狀，諸如叢集性頭痛及其他三叉神經自主性頭痛及臉痙攣。引起畏光之機制涉及三叉神經系統。盲患者中之畏光表明非視覺路徑之作用。另外，三叉神經自主性頭痛(一組不太常見之原發性頭痛病症)之特徵在於單側三叉神經介導之疼痛，其與身體同側畏光頻繁相關。
畏光之常見原因包括偏頭痛性頭痛、白內障、或嚴重眼科疾病(諸如葡萄膜炎或角膜擦破)。與畏光有關之病症之更廣泛清單包括眼相關原因，諸如色盲、無虹膜、抗膽鹼藥物(可藉由麻痹虹膜括約肌而引起畏光)、無晶狀體(缺乏眼睛的晶狀體)、牛眼症(角膜與虹膜之間異常窄的角)、白內障、視錐細胞營養不良、眼睛先天異常、病毒性結膜炎(「火眼」)、角膜擦破、角膜營養不良、角膜潰瘍、角膜上皮破裂(諸如由角膜異物或角膜炎引起之破裂)、晶狀體異位、眼內炎、由疾病、損傷或感染引起之眼睛創傷(諸如瞼板腺囊腫、鞏膜外層炎、青光眼、圓錐形角膜或視神經發育不全、水眼、或先天性青光眼虹膜炎、視神經炎、色素分散症候群、瞳孔擴大(天然或以化學方式誘導)、視網膜脫落、角膜或鞏膜瘢痕形成及葡萄膜炎)。
另外，畏光具有神經系統相關或神經學原因，包括：泛自閉症障礙、希阿里畸形、誦讀困難、包括肌痛性腦脊髓炎(亦稱作慢性疲勞症候群)在內之腦炎、腦膜炎、蛛網膜下出血、後面顱窩腫瘤，以及其他原因，諸如僵直性脊椎炎、白化病、核黃素缺乏病、苯二氮平類(長期使用或戒斷苯二氮平類)、化學療法、屈公病、胱胺酸病、艾登二氏症候群、宿醉、流行性感冒、傳染性單核白血球增多症、缺鎂症、汞中毒、偏頭痛、狂犬病及II型酪胺酸血症(亦稱作「Richner-Hanhart症候群」)。
另外，已知畏光在抑鬱症、躁鬱症及曠野恐怖中提高。
本文所述之本發明抗PACAP抗體及抗原結合片段可有效用於治療或預防此等病狀中之任一者中的畏光，較佳地在具有創傷後壓力病症(「PTSD」)之個體中或在具有創傷性腦損傷之個體中。
頭痛可由原因分類，如下文所論述。
原發性頭痛。原發性頭痛由頭部中疼痛敏感性結構之問題或過度活性引起。原發性頭痛一般不被視為潛在疾病之症狀。反而，腦中之化學活性、頭骨外部之頭部神經或血管、或頭部及頸部肌肉、或此等因素之一些組合可在原發性頭痛中起作用。一些人可攜帶使其更可能發展該等頭痛之基因。例示性常見原發性頭痛包括但不限於叢集性頭痛；緊張性頭痛(或緊張型頭痛)；及三叉神經自主性頭痛(「TAC」)，包括陣發性半側顱痛。存在其他頭痛模式，其可被視為原發性頭痛之類型，例如慢性每日頭痛、咳嗽頭痛、運動頭痛、及性頭痛。此等頭痛不太常見且具有不同特徵，諸如與某一活性有關之不常見持續時間或疼痛。儘管此等頭痛一般被視為原發性的，但其中每一者均可能為潛在疾病之症狀。另外，一些原發性頭痛可由生活方式因素觸發，包括：酒精；某些食物(例如，含有硝酸鹽之經加工肉類)；睡眠改變或睡眠缺乏；不良姿勢；略餐；及壓力。
繼發性頭痛。繼發性頭痛為可激活頭部之疼痛敏感性神經之疾病的症狀。嚴重程度可極大地變化之多種病狀可引起繼發性頭痛。繼發性頭痛之例示性來源包括但不限於急性竇炎；動脈剝離(頸動脈或椎骨破裂)；腦中靜脈血栓形成；腦動脈瘤；腦動靜脈畸形；一氧化碳中毒；希阿里畸形；腦震盪；脫水；牙科問題；耳朵感染(中耳)；腦炎；巨細胞性動脈炎；青光眼；宿醉；流行性感冒(流感)；顱內血腫；治療其他病症之藥物；腦膜炎；麩胺酸一鈉(「MSG」)；止痛藥之過度使用；恐慌發作；腦震盪後症候群；來自緊密貼合之頭飾(例如，頭盔或護目鏡)的壓力；假性腦瘤；弓形體病；及三叉神經痛。特定類型之繼發性頭痛包括但不限於外源壓擠性頭痛(引起壓力之頭飾的結果)；冰激淩頭痛(通常稱作「腦凍結」)；反彈性頭痛(由止痛藥之過度使用引起)；竇性頭痛(由竇腔中之發炎及充血引起)；脊椎性頭痛(由低水準之腦脊髓液引起，可能為創傷、脊椎穿刺或脊椎麻醉之結果)；及雷擊頭痛(一組涉及突然、嚴重頭痛之病症)。
可藉由投與本發明抗PACAP抗體治療及/或預防之例示性、非限制性疼痛相關疾病及病症包括由與神經性、神經病變性、發炎或傷害感受性疼痛有關之任何病狀引起的疼痛。較佳地，該疼痛相關病症將與疼痛位點處增加之PACAP有關。
在某些實施例中，欲治療之疼痛相關病症為由惡性腫瘤或由癌症引起之癌症疼痛，該癌症選自以下一或多者：腺組織腺癌、器官胚性組織胚細胞瘤、上皮組織癌瘤、形成血細胞之組織的白血病、淋巴組織淋巴瘤、骨髓之骨髓瘤、結締組織或支撐組織肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌腫瘤、子宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞減少症、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭部癌、頸部癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、神經系統腫瘤、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、骨髓癌、多發性骨髓瘤、轉移至骨骼之腫瘤、浸潤神經及空腔臟器之腫瘤、在神經結構附近之腫瘤。進一步較佳地，該癌症疼痛包含內臟疼痛，較佳地由腹部中之胰臟癌及/或轉移引起之內臟疼痛。進一步較佳地，該癌症疼痛包含軀體性疼痛，較佳地歸因於骨中之轉移、術後疼痛、結締組織肉瘤癌、骨組織癌症、骨髓造血細胞癌症、多發性骨髓瘤、白血病、原發性或繼發性骨癌中之一或多者的軀體性疼痛。
在其他實施例中，欲治療之疼痛相關病狀與神經病變性疼痛有關且包括例如三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、及反射性交感神經失養症較佳地經治療。
其他例示性疼痛相關疾病或病狀包括但不限於一般疼痛、慢性疼痛、發炎疼痛、術後切口疼痛、術後疼痛、創傷相關疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、複雜性區域疼痛症候群、癌症疼痛(例如，原發性或轉移性骨癌疼痛)、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、由燒傷引起之疼痛、痛風關節疼痛、與鐮狀細胞危象有關之疼痛、與顳頜關節病症有關之疼痛、硬化、肝炎、神經性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟疼痛、三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、痛經、卵巢痛、反射性交感神經失養症、骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛、下背痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、消化不良、腸易激症候群、發炎性腸病、克羅恩氏病、迴腸炎、潰瘍性結腸炎、腎絞痛、痛經、膀胱炎、間質性膀胱炎、月經期、分娩、停經、胰臟炎、精神分裂症、抑鬱症、創傷後壓力病症、焦慮症、糖尿病、自體免疫糖尿病、內皮功能障礙、缺血、雷諾氏症候群、冠心病(「CHD」)、冠狀動脈疾病(「CAD」)、心臟衰竭、外周動脈疾病(「PAD」)、肺性高血壓(「PH」)、結締組織病症、中風、休格輪氏症候群、多發性硬化、膀胱過動症、枝氣管高反應性、氣喘、枝氣管炎、枝氣管擴張、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(「COPD」)、發炎性皮炎、尋常性痤瘡、異位性皮炎、蕁麻疹、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及紅斑痤瘡、過敏性皮炎、牛皮癬、瘙癢、神經性皮膚發紅、紅斑、類肉瘤病、休克、敗血症及鴉片劑戒斷症候群。
因此，本發明包括經由使用本發明抗體及抗原結合片段治療、預防、及/或改善與PACAP活性或PACAP上調有關之任何疾病或病症(包括任何上文所提及之例示性疼痛相關疾病、病症及病狀)的方法。
又，本發明抗PACAP抗體及抗原結合片段可單獨或聯合其他活性劑(例如，類阿片及非類阿片止痛劑，諸如NSAID)使用以引起痛覺喪失或加強另一止痛劑之功效。
本發明抗體潛在地可與任何類阿片止痛劑或NSAID或另一止痛劑(潛在地另一抗體或另一生物製劑，諸如抗NGF或抗CGRP或抗CGRP-R抗體或抗體片段或NGF、CGRP或CGRP-R多肽片段或結合物)組合，以便增加或增強疼痛管理。此可允許該等止痛劑化合物持續較長持續時間或以降低之劑量投與，由此潛在地緩解與其有關之不利副作用。
尤其關注本發明抗PACAP抗體及抗體片段與抗CGRP抗體(例如，ALD403)或抗CGRP-R抗體或抗體片段之共投與及此外，本發明抗PACAP抗體及抗體片段治療先前接受抗CGRP或抗CGRP-R抗體或抗體片段之個體的用途。例如，先前經治療之個體(其先前接受至少一種抗CGRP或抗CGRP-R抗體或抗體片段投與)可為未適當地回應於抗CGRP或抗CGRP-R抗體治療(「不良回應者」)及/或已引起對抗CGRP或抗CGRP-R抗體或抗體片段之免疫反應之偏頭痛患者。
同樣，本發明抗PACAP抗體及抗體片段與BOTOX®(肉毒桿菌毒素)之共投與亦尤其引起關注，例如用於治療偏頭痛患者。在一些情況下，該偏頭痛患者可未適當地回應於先前治療(「不良回應者」)及/或已引起對先前治療之免疫反應。
在一些實施例中，阿司匹靈(aspirin)及/或乙醯胺酚可聯合本發明抗PACAP抗體或抗原結合片段服用。阿司匹靈為另一類型之非類固醇消炎化合物。
投與該醫藥調配物之個體可為例如任何人類或非人類動物，其需要該治療、預防及/或改善，或其將在其他方面受益於PACAP介導之活性的抑制或減弱。例如，該個體可為經診斷患有任何上述疾病或病症或被認為處於罹患任何上述疾病或病症之風險中的個體。本發明進一步包括任何本文所揭示之醫藥調配物用於製造用於治療、預防及/或改善與PACAP活性有關之任何疾病或病症(包括任何上文所提及之例示性疾病、病症及病狀)的藥物之用途。 投與
在本發明之一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其PACAP結合片段以及該等抗體或其抗原結合片段之組合以0.1 mg/ml與約0.5、1、5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/ml (+/-10%誤差)中任一者之間之濃度投與至個體。
在本發明之另一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體及其片段以約0.01與100.0或200.0 mg/kg接受個體體重之間之劑量投與至個體。在某些實施例中，視PACAP相關疾病之類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至50 mg/kg (例如0.1-20 mg/kg)之抗體為投與至患者的初始候選劑量，無論例如藉由一或多次獨立投與、或藉由連續輸注均如此。在另一實施例中，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之抗體為用於投與至患者之初始候選劑量。典型每日劑量可能介於約1 µg/kg至100 mg/kg或更高範圍內，視數種因素而定，例如所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症原因、試劑之遞送位點、投與方法、投與時程安排、及醫學從業者已知之其他因素。然而，其它給藥方案亦可適用。
例如，除了本文所論述之相對劑量(mg/kg)以外，本發明抗PACAP抗體及其抗原結合片段可以絕對劑量(mg)投與至個體。相應地，在本發明之一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體及其抗原結合片段以約1微克與約1000毫克之間之劑量投與至個體(與投與途徑無關)。
在本發明之一較佳實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其抗PACAP抗原結合片段以及該等抗體或其抗原結合片段之組合以每二十六週一次或更少，諸如每十六週一次或更少、每八週一次或更少、每四週一次或更少、每兩週一次或更少、每週一次或更少、或每日一次或更少之頻率投與至接受個體。
根據較佳實施例，該含抗體藥物或醫藥組合物經由選自以下一或多者之途徑經外周投與至個體：經口、經舌下、經頰、經表面、經直腸、經由吸入、經皮、皮下、靜脈內、動脈內、或肌肉內、經由心臟內投與、骨內、皮內、腹膜內、經黏膜、經陰道、玻璃體內、皮上、關節內、關節周、或經局部。
Fab片段可每兩週或更少、每週或更少、每日一次或更少、每日多次及/或每數小時投與。在本發明之一實施例中，患者每日接受0.1 mg/kg至40 mg/kg之Fab片段，該等片段以一日1至6次之分次給藥給予，或以連續灌注形式有效給予以獲得所需結果。
應瞭解投與至既定患者之該抗體或Fab之濃度可高於或低於上文所陳述之例示性投與濃度。
熟習此項技術者應能夠經由常規實驗確定投與之有效劑量及頻率，該常規實驗例如藉由本文揭示內容及Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , Brunton, L.L.等人編輯, 第11版, New York, New York: McGraw-Hill (2006)；Howland, R. D.等人,Pharmacology ,第 864 卷 , Lippincott's illustrated reviews ., Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2006)；及Golan, D. E.,Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy , Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2007)中之教示所指導。
在本發明之另一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其PACAP結合片段以及該等抗體或其抗原結合片段之組合以醫藥調配物形式投與至個體。在一較佳實施例中，該個體為人類。
「醫藥組合物」或「藥物」係指適於投與至個體、較佳地哺乳動物、更佳地人類之化學或生物組合物。該等組合物可特定地調配用於經由多種途徑中之一或多者投與，該等途徑包括但不限於頰、皮上、硬膜外、吸入、動脈內、心臟內、腦室內、皮內、肌肉內、鼻內、眼內、腹膜內、脊椎內、鞘內、靜脈內、經口、非經腸、經由灌腸器或栓劑經直腸、皮下、真皮下、舌下、經皮、及經黏膜。另外，投與可藉助於注射、粉末、液體、凝膠、滴劑、或其他投與方式發生。
在本發明之一實施例中，本文所述之抗PACAP抗體或其PACAP結合片段以及該等抗體或其抗原結合片段之組合可視情況與一或多種活性劑組合投與。該等活性劑包括止痛劑、抗組織胺、退熱劑、消炎劑、抗生素、抗病毒劑、及抗細胞因子劑。活性劑包括激動劑、拮抗劑、及TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、肝細胞生長因子(「HGF」)、鐵調素(Hepcidin)、NGF、CGRP之調節劑，包括對任何前述各物具反應性之抗體、及對任何其受體具反應性之抗體。活性劑亦包括但不限於2-芳基丙酸、乙醯氯芬酸(aceclofenac)、阿西美辛(acemetacin)、乙醯基水楊酸(阿司匹靈)、阿氯芬酸(alclofenac)、阿明洛芬(alminoprofen)、阿莫比林(amoxiprin)、安替比林(ampyrone)、芳基烷酸、阿紮丙酮(azapropazone)、貝諾酯(benorylate/benorilate)、苯噁洛芬(benoxaprofen)、溴芬酸(bromfenac)、卡洛芬(carprofen)、塞來昔布(celecoxib)、三水楊酸膽鹼鎂、氯非宗(clofezone)、COX-2抑制劑、右布洛芬(dexibuprofen)、右酮洛芬(dexketoprofen)、雙氯芬酸、二氟尼柳、屈噁昔康(droxicam)、鄰乙氧苯甲酸胺(ethenzamide)、依託度酸(etodolac)、依託昔布(etoricoxib)、鄰乙氧苯甲酸胺(faislamine)、芬那酸類、芬布芬(fenbufen)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟芬那酸、氟諾洛芬(flunoxaprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、伊布洛芬、異丁普生(ibuproxam)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚洛芬(indoprofen)、凱布宗(kebuzone)、酮洛芬、酮洛酸(ketorolac)、氯諾昔康(lornoxicam)、洛索洛芬(loxoprofen)、魯米昔布(lumiracoxib)、水楊酸鎂、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康(meloxicam)、安乃近(metamizole)、水楊酸甲酯、莫非布宗(mofebutazone)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生、N-芳基鄰胺基苯甲酸、NGF、奧沙美辛(oxametacin)、奧沙普秦(oxaprozin)、昔康類、羥基保泰松(oxyphenbutazone)、催產素、帕瑞昔布(parecoxib)、非那宗(phenazone)、保泰松(phenylbutazone)、保泰松、吡羅昔康(piroxicam)、吡洛芬(pirprofen)、洛芬類(profens)、丙谷美辛(proglumetacin)、吡唑啶衍生物、羅非昔布(rofecoxib)、水楊酸水楊酯、水楊醯胺、水楊酸酯、P物質、苯磺唑酮(sulfinpyrazone)、舒林酸、舒洛芬(suprofen)、替諾昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、托芬那酸(tolfenamic acid)、妥美丁及伐地考昔(valdecoxib)。例如，所選抗PACAP抗體或其PACAP結合片段以及該等抗體或抗原結合片段之組合可視情況與催產素組合投與，例如以鼻調配物形式投與，用於鼻內遞送。
抗組織胺可為對抗組織胺之作用或其自細胞(例如，肥大細胞)釋放之任何化合物。抗組織胺包括但不限於阿伐斯汀(acrivastine)、阿司咪唑(astemizole)、阿紮他定(azatadine)、氮卓斯汀(azelastine)、貝他斯汀(betatastine)、溴苯那敏(brompheniramine)、布克力嗪(buclizine)、西替利嗪(cetirizine)、西替利嗪類似物、氯菲安明(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、CS 560、賽庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、非索非那定(fexofenadine)、HSR 609、羥嗪、左卡巴斯汀(levocabastine)、氯雷他定(loratadine)、甲東莨菪鹼(methscopolamine)、咪唑斯汀(mizolastine)、去甲阿斯咪唑(norastemizole)、苯茚胺(phenindamine)、異丙嗪(promethazine)、吡拉明(pyrilamine)、特非那定(terfenadine)及曲尼司特(tranilast)。
抗生素包括但不限於阿米卡星(amikacin)、胺基糖苷、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、安沙黴素類(ansamycins)、砷凡納明(arsphenamine)、亞藥索黴素(azithromycin)、阿洛西林(azlocillin)、胺曲南(aztreonam)、桿菌肽(bacitracin)、碳頭孢烯(carbacephem)、碳青黴烯類(carbapenems)、羧苄青黴素(carbenicillin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢胺苄(cefalexin)、頭孢噻吩(cefalothin)、頭孢西丁 (cefalotin)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢托侖(cefditoren)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢布烯(ceftibuten)、頭孢噻肟(ceftizoxime)、頭孢吡普(ceftobiprole)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢菌素類(cephalosporins)、氯黴素(chloramphenicol)、西司他丁(cilastatin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克拉黴素(clarithromycin)、氯林可黴素(clindamycin)、氯唑西林(cloxacillin)、黏菌素、複方新諾明(co-trimoxazole)、達福普定(dalfopristin)、地美環素(demeclocycline)、雙氯青黴素(dicloxacillin)、地紅黴素(dirithromycin)、多尼培南(doripenem)、多西環素(doxycycline)、依諾沙星(enoxacin)、厄他培南(ertapenem)、紅黴素(erythromycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、氟氯西林(flucloxacillin)、磷黴素(fosfomycin)、呋喃唑酮(furazolidone)、夫西地酸(fusidic acid)、加替沙星(gatifloxacin)、格爾德黴素(geldanamycin)、慶大黴素(gentamicin)、醣肽、除莠菌素(herbimycin)、亞胺培南(imipenem)、異煙肼(isoniazid)、卡那黴素(kanamycin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、林肯黴素(lincomycin)、利奈唑胺(linezolid)、洛美沙星(lomefloxacin)、氯碳頭孢(loracarbef)、大環內酯類、磺胺米隆(mafenide)、美羅培南(meropenem)、甲氧西林(methicillin)、甲硝唑(metronidazole)、美洛西林(mezlocillin)、米諾環素(minocycline)、單環內醯胺類、莫西沙星(moxifloxacin)、莫匹羅星(mupirocin)、萘夫西林(nafcillin)、新黴素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、苯唑西林(oxacillin)、氧四環素(oxytetracycline)、巴龍黴素(paromomycin)、青黴素(penicillin)、青黴素類、哌拉西林(piperacillin)、平板黴素(platensimycin)、多黏菌素B、多肽、普隆托西(prontosil)、吡嗪醯胺、喹啉酮類(quinolones)、奎奴普丁(quinupristin)、利福平(rifampicin)、利福平(rifampin)、羅紅黴素(roxithromycin)、壯觀黴素(spectinomycin)、鏈黴素、乙醯磺胺、磺胺甲噻二唑、胺苯磺醯胺、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺異噁唑、磺醯胺類、替考拉寧(teicoplanin)、泰利黴素(telithromycin)、四環素(tetracycline)、四環素類、替卡西林(ticarcillin)、替硝唑(tinidazole)、妥布黴素(tobramycin)、曲美普林(trimethoprim)、曲美普林-美唑磺胺(trimethoprim-sulfamethoxazole)、醋竹桃黴素、曲伐沙星(trovafloxacin)及萬古黴素(vancomycin)。
活性劑亦包括醛固酮、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、皮質類固醇、皮質醇、乙酸可的松(cortisone acetate)、乙酸去氧皮質酮、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氟氫可的松(fludrocortisone acetate)、糖皮質激素、氫化可的松(hydrocortisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、類固醇、及去炎松(triamcinolone)。亦涵蓋此等活性劑之任何合適組合。
「醫藥賦形劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」為其中調配活性治療劑之載劑，通常為液體。在本發明之一實施例中，該活性治療劑為本文所述之人類化抗體，或一或多種其片段。該賦形劑一般不向該調配物提供任何藥理學活性，不過其可提供化學及/或生物穩定性、及釋放特徵。例示性調配物可發現於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences , Gennaro, A.編輯, 第19版, Philadelphia, PA: Williams and Wilkins (1995)中，該文獻以引用之方式併入。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」或「賦形劑」包括生理學上可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、及吸收延遲劑。在一實施例中，該載劑適用於非經腸投與。或者，該載劑可適用於靜脈內、腹膜內、肌肉內、或舌下投與。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於無菌可注射溶液或分散液之臨時製備之無菌粉末。該等介質及試劑用於醫藥學活性物質之用途為此項技術中熟知的。除非任何習知介質或試劑與該活性化合物不相容，否則涵蓋其用於本發明醫藥組合物之用途。補充活性化合物亦可併入至該等組合物中。
醫藥組合物典型地必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。本發明預期該醫藥組合物以凍乾形式存在。該組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體、或其他適合高藥物濃度之有序結構。該載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇)、及其合適混合物之溶劑或分散介質。本發明進一步預期該醫藥組合物中包括穩定劑。適當流動性可例如藉由在分散液之情況下維持所需粒徑且藉由使用界面活性劑來維持。
在多種情況下，在該組合物中包括例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇及山梨糖醇)或氯化鈉之等張劑將為較佳的。可注射組合物之吸收可藉由包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)來延長。此外，鹼性多肽可調配於延時釋放調配物中，例如包括緩釋聚合物之組合物中。該等活性化合物可用將保護該化合物免於快速釋放之載劑製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸、聚乳酸及聚乙醇酸共聚物(「PLG」)。熟習此項技術者已知多種用於製備該等調配物之方法。
關於每一個所陳述之實施例，該等化合物可藉由多種劑型投與。預期一般技術者已知之任何生物學上可接受之劑型，及其組合。該等劑型之實例包括而不限於可復原粉末、酏劑、液體、溶液、懸浮液、乳液、散劑、顆粒、粒子、微粒、可分散顆粒、藥囊、吸入劑、氣霧劑吸入劑、貼片、粒子吸入劑、植入物、儲庫植入物、可注射劑(包括皮下、肌肉內、靜脈內、及皮內)、輸注液、及其組合物。
本發明之多個所說明實施例之以上描述不意欲為詳盡的或限制本發明至所揭示之精確形式。雖然本發明之特定實施例及實例在本文中出於說明性目的加以描述，但多種相等修改可能在本發明之範圍內，如熟習相關技術者將認識到的。除了上文所述之實例，本發明之本文所提供教示可用於其他目的。
可根據上文詳細描述對本發明進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍內，所用術語不應解釋為限制本發明至該說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例。相應地，本發明不受該揭示內容限制，反而本發明之範圍欲完全由以下申請專利範圍確定。
本發明可以除了上文描述及實例中特定描述之彼等方式以外之方式實踐。根據上文教示可能進行本發明之多種修改及變化且因此，該等修改及變化在隨附申請專利範圍之範圍內。
關於用於獲得抗原特異性B細胞之純系群體之方法的某些教示揭示於美國專利公開案第US2013/0316353號中，該案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
關於兔源性單株抗體之人類化及進行較佳序列修飾以維持抗原結合親和力之某些教示揭示於2008年5月21日申請之標題為新穎兔抗體人類化方法及人類化兔抗體 (Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies )的國際公開案第WO 2008/144757號中，該案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
關於使用交配勝任酵母及相應方法產生抗體或其片段之某些教示揭示於美國專利公開案第US2006/0270045號中，該案之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
關於在畢赤酵母中產生抗體或其片段及用於獲得及純化抗體之較佳方法之某些教示亦揭示於公開、共同受讓之美國專利公開案第US20140288272號；第US20140287952號；第US20130055888號；及第US20120277408號中，該等公開案中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
關於在CHO細胞中產生抗體或其片段及用於獲得及純化抗體之較佳方法之某些教示亦揭示於公開、共同受讓之美國專利公開案第US7932087B2號；第US20090285795A1號；第US9090672 B2號；及第US20100221781 A1號中，該等公開案中每一者之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
某些抗PACAP抗體聚核苷酸及多肽揭示於伴隨此專利申請案歸檔之序列表中，且該序列表之揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
在先前技術、實施方式及實例中所引用之各文獻(包括專利、專利申請案、期刊文章、摘要、手冊、書籍、或其他揭示內容)之完整揭示內容以引用之方式整體併入本文中。
提出以下實例以便向一般技術者提供如何製造及使用本發明之完全揭示內容及描述，且不意欲限制被視為本發明者之範圍。已儘力確保關於所用數字(例如，量、溫度、濃度等)之精確度，但應容許一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度以攝氏度表示；且壓力處於大氣壓下或接近大氣壓。 實例 實例 1 ： 製備選擇性結合 PACAP 之抗體
藉由使用實質上如本文所述之抗體選擇方案，產生對PACAP38及PACAP27具特異性之抗體組、及僅對PACAP38具特異性之抗體組。 免疫策略
兔用PACAP38 (American Peptide, Vista, CA) (SEQ ID NO: 1241)免疫。如下製備用於免疫之肽。0.15 ml體積之溶解於補充至1M NaCl之杜氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(「DPBS」)中的10 mg/ml鑰孔戚血藍蛋白(「KLH」)與1.0 ml 1 mg/ml肽(溶解於去離子水中)組合。接著添加1.0 ml 40 mM碳化二亞胺，之後在輕輕混合下在室溫下培育12小時。藉由透析至DPBS來移除過量碳化二亞胺及未結合肽，之後無菌過濾。添加等於KLH之初始質量之下一未結合肽，之後準備用於注射至兔中。或者，相等質量之無菌KLH及肽在無碳化二亞胺化學情形下混合。
藉由用DPBS稀釋200 μg抗原至0.5 ml且與相等體積之完全弗氏佐劑混合以在第1日進行皮下1 ml注射來執行免疫。
在第21日及第42日用不完全弗氏佐劑執行100 µg之加強注射。 抗體選擇功能效價分析
為了鑑別經由PAC1-R中和PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)誘導之信號傳導之抗體，首先經由蛋白A純化多株抗體溶液且透析至中性緩衝液中。簡言之，抗體溶液用PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)以4倍之最終濃度(100 pM)培育1 h。在培育抗體/抗原複合物時，表現PAC1-R之PC-12細胞(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)經洗滌且以2 × 106 個細胞/ml再懸浮於細胞培養基中。細胞(10 µl)及抗原/抗體複合物(40 µl)轉移至均相時間解析螢光(「HTRF」)板中且在室溫下震盪30 min。在培育之後，添加在溶解緩衝液中之20 µl (1:20稀釋) Eu3+ 穴狀化合物標記之mAb抗cAMP及20 µl (1:20稀釋) d2標記之cAMP，且該板在震盪下培育1 h。在培育之後，對板讀數(激發330 nm，發射620/665 nm)，且確定620:665信號比率。 組織收集
一旦建立可接受之效價，該(等)兔即處死。收集脾、淋巴結、及全血且加工如下： 脾及淋巴結藉由使組織分離且用20 cc注射器之插塞推動通過70 µm無菌金屬絲網(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)而經加工成單細胞懸浮液。細胞收集於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(「PBS」)中。細胞接著藉由離心洗滌兩次。在最後一次洗滌之後，藉由錐蟲藍確定細胞密度。細胞在1500 RPM下離心10分鐘；接著棄去上清液。細胞在適當體積之10%二甲亞碸(「DMSO」，Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)中再懸浮於胎牛血清(「FBS」 HYCLONE™, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)中且以1 ml/小瓶分配。小瓶在-70℃下儲存於緩慢冷凍腔室中持續24小時且儲存於液氮中。
藉由混合全血與相等部分之PBS分離外周血單核細胞(「PBMC」)。35 ml該全血混合物小心地分層至45 ml錐形管(Corning, Corning, NY)中之8 ml LYMPHOLYTE® Rabbit (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario)上且在室溫下在無制動器下以2500 RPM離心30分鐘。在離心之後，使用玻璃巴斯德移液管(VWR International, Radnor, PA)小心地移出PBMC層，組合，且置於清潔50 ml小瓶中。細胞藉由在室溫下在1500 RPM下離心10分鐘而用PBS洗滌兩次，且藉由錐蟲藍染色確定細胞密度。在最後一次洗滌之後，細胞再懸浮於適當體積之10% DMSO/FBS培養基中且如上文所述進行冷凍。 B細胞選擇、增濃、及培養條件
在建立B細胞培養物當日，PBMC、脾細胞或淋巴結小瓶解凍供使用。小瓶自液氮槽中移出且置於37℃水浴中直至解凍。小瓶之內含物轉移至15 ml錐形離心管(Corning, Inc., Corning, NY)中且10 ml改良RPMI緩慢地添加至該管中。細胞在2000 RPM下離心5分鐘，且棄去上清液。細胞再懸浮於10 ml新鮮培養基中。藉由錐蟲藍確定細胞密度及生存力。
關於產生抗PACAP38之B細胞之陽性選擇，生物素化PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)如下預裝載至抗生蛋白鏈菌素珠粒上。75 μl抗生蛋白鏈菌素珠粒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)與N端生物素化PACAP38 (10 μg/ml最終濃度)及300 µl補充有0.5%無生物素牛血清白蛋白(「BSA」)及2 mM EDTA (「PBF」)之PBS混合。此混合物在4℃下培育30分鐘，且使用具有1 ml沖洗液以移除未結合物質之MACS®分離管柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)移除未結合生物素化PACAP38 (AnaSpec, Fremont, CA)。該未結合物質藉由自磁體脫落經甩出且用於使來自上方之細胞以每1 × 107 個細胞/100 μl再懸浮。該混合物接著在4℃下培育30分鐘且用10 ml PBF洗滌一次。在洗滌之後，該等細胞再懸浮於500 μl PBF中且留出。MACS® MS管柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)在磁性台架(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)上用500 µl PBF預沖洗。細胞懸浮液經由預濾器應用於該管柱，且收集未結合部分。該管柱用2.5 ml PBF緩衝液洗滌。該管柱自該磁性台架移出且置於清潔、無菌1.5 ml EPPENDORF™管上。1 ml PBF緩衝液添加至該管之頂部，且收集陽性選擇細胞。藉由錐蟲藍染色確定陽性細胞部分之產率及生存力。陽性選擇產生1%平均值之開始細胞濃度。
建立先導性細胞篩選以提供關於該培養物之接種水準之資訊。板以5、10、25、50、100或200個增濃B細胞/孔接種。另外，各孔含有在最終體積為250 μl/孔之高葡萄糖改良RPMI培養基中的25-50K個細胞/孔之經照射EL-4.B5細胞(5,000拉德)及適當水準之經激活兔T細胞上清液(參見美國專利申請公開案第20070269868號) (介於1-5%範圍內，視製備而定)。培養物在37℃下在4% CO2 中培育5至7日。 藉由抗原識別(ELISA)進行B細胞培養物篩選
為了鑑別產生抗PACAP38抗體之孔，藉由抗原識別(ELISA)測試B細胞上清液。簡言之，NEUTRAVIDIN™塗佈之板(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)用在ELISA緩衝液(PBS pH 7.4中之0.5%魚皮明膠)中稀釋之N端或C端生物素化PACAP38 (AnaSpec Inc., Fremont, CA) (每孔50 ml；1 mg/ml)塗佈，在室溫下持續大約1小時或替代地在4℃下持續隔夜。該等板接著進一步在室溫下用ELISA緩衝液阻斷一小時且使用具有0.05% Tween 20之PBS (「洗滌緩衝液」)洗滌。B細胞上清液樣品(50 ml)轉移至該等孔中且在室溫下培育一小時。在此培育之後，該板用洗滌緩衝液洗滌。關於顯色，抗兔特異性Fc-辣根過氧化酶(「Fc-HRP」) (1:5000稀釋於ELISA緩衝液中)添加至該等孔中且在室溫下培育45分鐘。在用洗滌溶液洗滌3次之步驟之後，該板在室溫下使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(「TMB」)受質顯色兩分鐘，且該反應使用0.5M HCl淬滅。在450 nm下對孔吸光度讀數。
為了鑑別產生不識別VIP (SEQ ID NO: 1243)之抗PACAP38抗體之孔，藉由ELISA針對與VIP之結合測試來自藉由ELISA發現對PACAP38結合呈陽性之孔的上清液。簡言之，生物素化VIP (AnaSpec Inc., Fremont, CA)結合於NEUTRAVIDIN™塗佈之板上(每孔50 µg，1 µg/ml各肽)。在無先前稀釋之情況下測試B細胞上清液樣品(50 µl)。此分析中之識別可指示與密切相關肽VIP之交叉反應性。 使用一或多種分析鑑別B細胞上清液中之功能活性
為了鑑別產生阻斷經由PAC1-R之PACAP38信號傳導之抗PACAP38抗體之孔，在cAMP HTRF分析(Cisbio US, Bedford, MA)中測試來自藉由ELISA發現對PACAP38結合呈陽性之孔的上清液。上清液(78 µl)在37℃下用2 µl 5 nM PACAP38 (American Peptide Company, Sunnyvale, CA)預培育1小時。在培育期間，如關於效價分析所述製備PC-12細胞。細胞(10 µl)及抗原/抗體複合物(40 µl)轉移至HTRF板中且在室溫下震盪30分鐘。在培育之後，添加在溶解緩衝液中之20 µl (1:20稀釋) Eu3+ 穴狀化合物標記之mAb抗cAMP及20 µl (1:20稀釋) d2標記之cAMP，且該板在震盪下培育1小時。在培育之後，對板讀數(激發330 nm，發射620/665 nm)，且確定620:665信號比率。 分離抗原特異性B細胞
分離抗原特異性B細胞(關於一般方法，參見分別共有之公開案第WO 2014/146074號，其特此以引用之方式整體併入)。含有目標孔的板自-70℃移出，且使用每孔200 µl培養基(10% RPMI完全、55 μM β-巰基乙醇(「BME」))之五次洗滌回收來自各孔之細胞。所回收之細胞藉由離心集結成粒且小心地移除上清液。來自各孔之細胞接著再懸浮於100 µl培養基中且轉移至96孔板中。細胞在37℃下培育90分鐘。在培育之後，細胞藉由離心集結成粒，用螢光素異硫氰酸酯標記(「FITC標記」)之抗兔IgG (最終濃度6.25 µg/ml) (Creative Diagnostics, Shirley, NY)染色，且用多達2 ml螢光激活之細胞分選緩衝液(「FACS緩衝液」) (具有2% FBS之杜氏PBS)洗滌且再懸浮於250 µl FACS緩衝液中。
組成與彙集之目標孔類似的來自相同培養物集合之對照孔解凍且沿著靶標細胞染色。此等樣品最初在FACS (BD INFLUX™, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)上運行，且針對IgG、生存力及區分B細胞與鼠類EL4細胞之物理參數(前向散射(「FSC」)/側向散射(「SSC」))建立圈選範圍。建立圈選範圍後，運行目標樣品，且屬於一致物理(FSC/SSC)群體之IgG陽性活細胞個別地分選至預負載RT-PCR主混合液之96孔板的孔中。每孔分選超過8個細胞。經分選之板自分選器移出且直接轉移至用於PCR之熱循環儀中。 來自FACS分選B細胞之抗體序列的擴增及序列確定
使用組合型基於RT-PCR之方法由單細胞分選之B細胞回收抗體序列。含有限制酶之引子經設計以在靶標免疫球蛋白基因(重及輕)之保守及恆定區、諸如兔免疫球蛋白序列中退火，且使用兩步巢式PCR回收來擴增該抗體序列。對來自各孔之擴增子測序且進行分析。來自所得序列叢集之代表性抗體經選擇用於重組蛋白表現。自兔細胞擴增之初始重及輕可變區經由限制酶消化及接合，及經由Gibson方法選殖至人類重鏈及輕鏈恆定區表現載體中。含有次選殖DNA片段之載體經擴增且純化。該等次選殖之重鏈及輕鏈的序列在表現之前經驗證。 具有所需抗原特異性及/或功能特性之單株抗體之重組產生
為了確定自特定B細胞回收之抗體的抗原特異性及功能特性，重鏈及輕鏈質體經共轉染以產生用於測試之兔/人類嵌合抗體。簡言之，重及輕嵌合質體短暫轉染至HEK-293細胞中。轉染允許培育5-7日，且在收集時，細胞藉由離心集結成粒。上清液經提交用於經由蛋白A純化。所得經純化嵌合抗體接著以多種分析進行評估以確認特異性及效能。
使用上述方法，鑑別多種結合PACAP38及PACAP27、或僅結合PACAP38但未或未可觀地結合於VIP之功能性(拮抗性)抗體。例示性拮抗性抗PACAP抗體之多肽及例示性編碼序列含於所包括之生物序列表中。
用於此等實例中之全長抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H表現為分別具有序列SEQ ID NO: 1；41；81；121；161；201；241；281；321；361；481；521；561；601；641；681；721；761；801；881；921；1121；1081；1001；1161；及1041之重鏈多肽，及分別具有SEQ ID NO: 21；61；101；141；181；221；261；301；341；381；501；541；581；621；661；701；741；781；821；901；941；1141；1101；1021；1181；及1061之輕鏈多肽。抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H之重鏈多肽由分別具有SEQ ID NO: 11；51；91；131；171；211；251；291；331；371；491；531；571；611；651；691；731；771；811；891；931；1131；1091；1011；1171；及1051之聚核苷酸表現。抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H之輕鏈多肽由分別具有SEQ ID NO: 31；71；111；151；191；231；271；311；351 391；511；551；591；631；671；711；751；791；831；911；951；1151；1111；1031；1191；及1071之聚核苷酸表現。該等抗體之額外特徵由圖 1A-12 中之SEQ ID NO鑑別。 藉由競爭性HTRF結合分析獲得之抗體之抗原結合特異性
下文進一步描述根據本發明產生之例示性抗PACAP38及抗PACAP27抗體之結合及功能特性。
為了鑑別優先結合PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)及PACAP27 (SEQ ID NO: 1242)但不結合VIP (SEQ ID NO: 1243)之抗體，或為了鑑別特異性結合PACAP38但未可觀地結合PACAP27、或未可觀地結合VIP等之抗體，執行競爭HTRF結合分析。
平行地，10 µl抗體稀釋系列(100 nM之最高最終濃度)在HTRF板中用單獨10 µl N端或C端生物素化PACAP38 (35 nM最終)或與PACAP27 (350 nM最終)或VIP (350 nM最終) (亦即，分別為10x PACAP27或10x VIP)組合培育。20 µl Eu3+ 穴狀化合物標記之抗hu Fc供體及20 µl d2標記之抗生蛋白鏈菌素受體添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在620及665 nm下以300 µsec之延遲量測螢光。
圖 13A-T 提供Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19及Ab1.H與PACAP38及與PACAP27之代表性結合資料，及VIP無能力與PACAP38結合競爭。圖 13U 及圖 13V 提供抗PACAP抗體Ab22及Ab23與PACAP38之代表性結合資料，及PACAP27或VIP無能力與PACAP38結合競爭。VIP對結合於PACAP38缺乏影響指示其無能力與PACAP38結合競爭。此等結果證明Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19及Ab1.H結合於PACAP38及PACAP27，但未結合(或未可觀地結合) VIP。此等結果亦證明Ab22及Ab23結合於PACAP38，但未結合(或未可觀地結合) PACAP27或VIP。
EC50 值(亦即，抗體在規定時期內產生在基線與最大值之間中段的反應之濃度)針對各抗體基於其結合曲線加以計算且在下表1中示出。結果證明Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23及Ab1.H以高親和力結合於且識別人類PACAP38。產生抗體Ab1之人類化形式且藉由隨附「.H」鑑別(亦即，Ab1.H)，且其亦以高親和力結合PACAP38。 表1 抗PACAP抗體對PACAP38之結合(EC50 ) 抗PACAP抗體中和PACAP38誘導及PACAP27誘導之cAMP產生的能力
在基於細胞之分析中測試抗PACAP抗體中和PACAP38誘導及PACAP27誘導之PAC1-R信號傳導的能力。
關於Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab10.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H，為了鑑別中和PACAP38誘導及PACAP27誘導之經由PAC1-R之信號傳導的抗體，抗體溶液用PACAP38或用PACAP27以4x最終濃度(100 pM)培育1小時。在培育抗體/抗原複合物時，表現PAC1-R之PC-12細胞(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)經洗滌且以2 × 106 個細胞/ml再懸浮於細胞培養基中。細胞(10 µl)及抗原/抗體複合物(40 µl)轉移至HTRF板中且在室溫下震盪30分鐘。在培育之後，添加在溶解緩衝液中之20 µl (1:20稀釋) Eu3+ 穴狀化合物標記之mAb抗cAMP及20 µl (1:20稀釋) d2標記之cAMP，且該板在震盪下培育1小時。在培育之後，對板讀數(激發330 nm，發射620/665 nm)，且確定620:665信號比率。各孔中PACAP38及PACAP27之最終濃度為0.1 nM。
圖 16A-BB (PACAP38)及圖 17A-BB (PACAP27)顯示抑制曲線(關於Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H)，其代表用所測試之抗體獲得之抑制曲線。針對各抗體定量抑制結果以產生IC50 值，該等值概述於下表2中。此等結果證明抗PACAP抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22、Ab23、Ab1.H、Ab10.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H在表現PAC1-R之細胞中抑制PACAP38誘導之cAMP增加(參見圖 16A-BB )。另外，此等結果證明抗PACAP抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H (但非Ab22或Ab23)在表現PAC1-R之細胞中抑制PACAP27誘導之cAMP增加(參見圖 17A-BB )。 表2 抗PACAP抗體在表現PAC1-R之細胞中對PACAP38誘導及PACAP27誘導之cAMP增加的抑制(IC50 ) * n/a：無活性，因為此等Ab為PACAP38特異性的 實例 2 ： 抗 PACAP 抗體之結合親和力
使用SPR在PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA)上估算單株抗體對人類PACAP之結合親和力。抗體固定至一般胺偶合(「GLC」或「GLM」)晶片(Bio-Rad, Hercules, CA)之表面上。在購自Teknova (目錄號P1192, Teknova, Hollister, CA)且補充有0.25 M精胺酸(來自J.T. BAKER®)、0.2 mg/ml BSA (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA)及0.005%疊氮化鈉(VWR International, Radnor, PA)且pH經調節至7之1 x PBST緩衝液(4.3 mM磷酸鈉、1.4 mM磷酸鉀、135 mM NaCl、2.7 mM KCl 0.05%聚山梨醇酯-20)中製備的人類PACAP38 (SEQ ID NO: 1241)之稀釋系列用於查詢該等抗體。抗原(介於1.23 nM至100 nM範圍內)典型地以用PROTEON™管理軟體(v3.1.0.6 (Bio-Rad, Hercules, CA))分組之2-4分鐘締合時間及3-120分鐘解離時間依序運行且使用1:1 Langmuir結合模型進行擬合。表面使用0.85%磷酸在分析物查詢之間再生。針對各抗體以限制於擴散速率(1.0 × 106 )附近之締合時間及限制於1.5 × 10﹣ 5 (其中未觀察到可辨別解離)之解離時間計算單一KD 。
使用相同程序來確定抗體對人類VIP (SEQ ID NO: 1243)及PACAP27 (SEQ ID NO: 1242)之結合親和力，不過肽濃度介於1.23 nM至1000 nM範圍內，且締合時間為200秒且解離時間為3-120分鐘。
關於PACAP38所量測之抗體親和力列於表3中。 表3 關於PACAP38之抗體親和力常數
關於VIP之抗體親和力常數之實例列於表4中。 表4 關於VIP之抗體親和力常數
關於PACAP27之抗體親和力常數之實例列於表5中。 表5 關於PACAP27之抗體親和力常數
表3及5之結合親和力結果提供的資料證明了如與其對於PACAP38之結合親和力相比，Ab23微弱地結合於PACAP27。表3及5另外提供之資料證明了Ab22未特異性識別PACAP27，但Ab22特異性結合於PACAP38。 實例 3 ： PACAP38 誘導之經由 VPAC1-R 之信號傳導的抑制
為了鑑別中和PACAP38誘導之經由人類VPAC1-R之信號傳導的抗體，在cAMP HTRF基於細胞之分析中使用表現人類VPAC1-R之CHO-K1細胞。抗體稀釋液用PACAP38以4x最終濃度(5 nM)培育1小時。當抗體/抗原複合物培育1小時之時，表現VPAC1-R之CHO-K1細胞(在Alder Biopharmaceuticals藉由用人類VPAC1-R cDNA穩定轉染CHO-K1細胞(ATCC, 目錄號CCL-61)而產生；所選純系1用於活體外基於細胞之分析)用0.25%胰蛋白酶剝離持續4分鐘。該等細胞經洗滌且以1 × 106 個細胞/ml培養基再懸浮。20 µl Ab/抗原混合物與20 µl細胞在HTRF板中混合且在震盪下培育30分鐘。在溶解緩衝液中之20 µl Eu3+ 穴狀化合物標記之抗cAMP mAb (1:20稀釋)及20 µl (1:20稀釋) d2標記之cAMP添加至各孔中且在震盪下培育1小時。各孔中PACAP38之最終濃度為5 nM。在培育之後，對板讀數(激發330 nm，發射620/665 nm)，且確定620:665信號比率。
圖 18A-BB 代表藉由此方法獲得之抑制曲線(分別顯示關於Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H之結果)。下文在表6中顯示之關於各抗體所計算之IC50 值證明Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H在表現人類VPAC1-R之細胞中抑制PACAP38誘導之cAMP增加。 表6 抗PACAP抗體在表現人類VPAC1-R之細胞中對PACAP38誘導之cAMP增加的抑制(IC50 ) 實例 4 ： PACAP38 誘導之經由 VPAC2-R 之信號傳導的抑制
為了鑑別中和PACAP38誘導之經由人類VPAC2-R之信號傳導的抗體，在cAMP HTRF基於細胞之分析中使用表現人類VPAC2-R之CHO-K1細胞。抗體稀釋液用PACAP38以4x最終濃度(1 nM)培育1 h。當抗體/抗原複合物培育1小時之時，表現VPAC2-R之CHO-K1細胞(在Alder Biopharmaceuticals藉由用人類VPAC2-R cDNA穩定轉染CHO-K1細胞(ATCC, 目錄號CCL-61)而產生；所選純系8用於活體外基於細胞之分析)用0.25%胰蛋白酶剝離持續4分鐘。該等細胞經洗滌且以1 × 106 個細胞/ml培養基再懸浮。20 µl Ab/抗原混合物與20 µl細胞在HTRF板中混合且在震盪下培育30分鐘。在溶解緩衝液中之20 µl Eu3+ 穴狀化合物標記之抗cAMP mAb (1:20稀釋)及20 µl (1:20稀釋) d2標記之cAMP添加至各孔中且在震盪下培育1小時。該等孔中PACAP38之最終濃度為1 nM。在培育之後，對板讀數(激發330 nm，發射620/665 nm)，且確定620:665信號比率。
圖 19A-BB 代表藉由此方法獲得之抑制曲線(分別顯示關於Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H之結果)。下文在表7中顯示之關於各抗體所計算之IC50 值證明Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H在表現人類VPAC2-R之細胞中抑制PACAP38誘導之cAMP增加。 表7 抗PACAP抗體在表現人類VPAC2-R之細胞中對PACAP38誘導之cAMP增加的抑制(IC50 ) 實例 5 ： 結合於表現 PAC1-R 之細胞的 PACAP38 之抑制
為了鑑別阻斷PACAP38結合於PAC1-R表現細胞之抗體，在基於銪之PAC1-R表現細胞結合分析中使用表現PAC1-R之黏附PC-12細胞(ATCC, Manassas, VA)。
抗體溶液用N端生物素化PACAP38以10x最終濃度(100 nM或30 nM)培育1 h，接著添加至預先在黑色透明底部96孔板(COSTAR™, Corning Incorporated, Corning, NY)中接種24 h之PC-12細胞中且進一步在室溫下培育1 h。在三次洗滌之後，該等細胞在室溫下用20 µl銪標記之抗生蛋白鏈菌素(PerkinElmer, Waltham, MA)培育1 h。細胞洗滌三次，接著20 µl DELFIA®增強溶液(PerkinElmer, Waltham, MA)添加至各孔中且在輕微震盪下培育15分鐘。板在SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)板式讀取器上讀數(時間解析螢光(「TRF」))。
圖 14A-BB 代表藉由此方法獲得之抑制曲線(分別顯示關於Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H之結果)，其中該等PAC1-R表現細胞為PC-12細胞。下文在表8中顯示之關於各抗體所計算之IC50 值證明Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab1.H、Ab10.H、Ab22、Ab23、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H抑制PACAP38結合於PAC1-R表現細胞。 表8 抗PACAP抗體對PACAP38結合於表現PAC1-R之PC-12細胞的抑制(IC50 )。 實例 6 ： PACAP38 介導之抗 PACAP 抗體與 PAC1-R 表現細胞之細胞表面的結合
為了鑑別經由PACAP38結合於PAC1-R表現細胞之細胞表面的抗PACAP抗體，在基於細胞表面結合之分析中使用表現PAC1-R之黏附PC-12細胞(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)。為了執行該結合實驗，表現PAC1-R之PC-12細胞首先接種於Corning 96孔白色固體底部板(Corning, Corning, NY)中。細胞最初在完全RPMI (「cRPMI」：補充有10%無菌熱不活化FBS及1%無菌抗生素/抗真菌劑之RPMI培養基) + 10% FBS之溶液中以1 × 105 個細胞/孔接種，且使該等板在37℃下培育隔夜。在該結合分析當日，初始濃度為15 µg/ml之抗體以1:3比率稀釋於DELFIA®結合緩衝液(50 mM Tris、150 mM NaCl、0.1%疊氮化物、2%馬血清) (Perkin-Elmer, Waltham, MA)中至獨立96孔圓底板中60 µL之總體積。PACAP38藉由稀釋於DELFIA®結合緩衝液中至200 nM濃度而準備用於該結合分析，且接著60 µl經稀釋PACAP38添加至各含抗體孔中以形成抗體:抗原複合物。在添加PACAP38之後，該等抗體:抗原複合物在室溫下在震盪器上培育1小時。分別地，該等PC-12細胞藉由用DELFIA®洗滌緩衝液(50 mM Tris、150 mM NaCl、0.1%疊氮化物) (Perkin-Elmer, Waltham, MA)洗滌該等細胞兩次而準備用於抗體:抗原複合物之添加。在洗滌該等細胞兩次之後且在該等抗體:抗原複合物之1小時室溫培育之後，50 µl抗體:抗原複合物添加至含有細胞之各孔中。細胞及抗體:抗原複合物之混合物接著在室溫下培育30分鐘。在此30分鐘培育之後，各混合物用DELFIA®洗滌緩衝液(Perkin-Elmer, Waltham, MA)洗滌兩次。
DELFIA®銪標記之抗人類IgG偵測試劑(目錄號1244-330, Perkin-Elmer, Waltham, MA)在DELFIA®結合緩衝液中稀釋至300 ng/ml之濃度。在稀釋之後，50 µl該抗人類IgG偵測試劑添加至含有細胞之各孔中，且在IgG偵測試劑之此添加之後在室溫下進行30分鐘培育。在該30分鐘室溫培育完成之後，該等細胞接著用DELFIA®洗滌緩衝液洗滌兩次。接著，50 µl DELFIA®增強溶液(目錄號1244-105, Perkin-Elmer, Waltham, MA)添加至含有細胞之各孔中用於在震盪下進行最終15分鐘室溫培育。該等板接著在SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)板式讀取器上讀數(TRF，激發330 nm，發射620 nm)。
圖 15A-J 代表藉由此方法獲得之結合曲線(分別顯示關於Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H、Ab12.H、Ab10、Ab10.H、Ab22及Ab23之結果)，其中該等PAC1-R表現細胞為PC-12細胞。使用此分析，Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H證明在PACAP38存在下結合於PAC1-R表現細胞之表面，而Ab10、Ab10.H、Ab22及Ab23看來未可觀地結合於PAC1-R表現細胞之表面。Ab1.H、Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9.H及Ab12.H與PAC1-R細胞之細胞表面的結合僅在PACAP38存在下觀察到。不意欲受理論束縛，假設該等抗體與細胞表面之結合藉由使PACAP38結合於存在於細胞表面上之GAG而介導，因為GAG對PACAP38之結合先前已經證明為PACAP38結合及由PC-12細胞內化之PAC1-R受體獨立機制(參見Doan等人(2012)，Juhász等人(2014)，及Neree等人(2015))。 實例 7 ： 抗 PACAP 抗體 Ab1.H 對兔中 PACAP38 誘導之真皮血管擴張的抑制
PACAP38之皮內注射已顯示在兔及人類中引起局部血管擴張(Warren等人,J. Cardio. Pharmacol. , 29(1): 83-87 (1992)；Seelinger等人,Am. J. Path. , 177(5):2563-2575 (2010))。在雄性新西蘭白兔中進行活體內功效研究以確定Ab1.H抑制藉由PACAP38之皮內注射誘導之局部真皮血管擴張的活性。
每組4隻兔用90 mg/kg Ab1.H或用陰性對照媒劑(25 mM組胺酸、250 mM山梨糖醇，pH 6.0)給藥。在第0日藉由IV (耳靜脈)推注投與來執行注射。在各兔PACAP38攻擊之前，各動物之肩胛區剪去毛髮且用水中之20% (v/v)醇擦拭。在第2日，該等動物用鹽酸氯胺酮預麻醉且用異氟烷氣體維持在深度麻醉下。使用SHARPIE®永久標記物在各動物之背部鑑別用於注射之四個位點(感興趣區(「ROI」))。在皮內PACAP38攻擊之前(基線)及在皮內PACAP38攻擊之後持續35分鐘，使用用於雷射光斑對比分析(「LASCA」)成像之PeriCam PSI NR系統(Perimed, Järfälla, Sweden)監測真皮血管擴張及血液灌注。皮內PACAP38攻擊如下執行：各動物接受媒劑(一個位點或ROI)之單一皮內投與(100 µl/位點)及以30 pmol/位點(3個位點或3個ROI)接受PACAP38。針對各ROI之血液灌注速率由PeriCam PSI NR系統以灌注單位(「PU」)報告且使用PIMSoft (1.5版本(Perimed, Järfälla, Sweden))進行分析。
關於各處理組，針對各ROI計算與基線相比在Ab1.H或陰性對照物投與之後的相對%PU改變(針對各PACAP38攻擊位點之%PU改變-針對媒劑位點之%PU改變)。藉由使用GraphPad Prism (5.0d版本, GraphPad Software, La Jolla, CA)軟體執行雙尾未配對t檢驗統計學評估對Ab1.H組中之相對%PU改變與陰性對照組中之相對%PU改變進行比較。
圖 20 證明Ab1.H在兔中抑制PACAP38誘導之真皮血管擴張，指示該抗體活體內中和PACAP38活性之有效性。 實例 8 ： 抗 PACAP 抗體 Ab10 對兔中 PACAP38 誘導之真皮血管擴張的抑制
PACAP38之皮內注射已顯示在兔及人類中引起局部血管擴張(Warren等人(1992)；Seelinger等人(2010))。在雄性新西蘭白兔中進行活體內功效研究以確定Ab10抑制藉由PACAP38之皮內注射誘導之局部真皮血管擴張的活性。
每組4隻兔用72 mg/kg Ab10或用同型抗體對照物給藥。在第0日藉由(耳靜脈)推注靜脈內投與來執行注射。在各兔PACAP38攻擊之前，各動物之肩胛區剪去毛髮且用水中之20% (v/v)醇擦拭。在第2日，該等動物用鹽酸氯胺酮預麻醉且用異氟烷氣體維持在深度麻醉下。使用SHARPIE®永久標記物在各動物之背部鑑別用於注射之四個位點(ROI)。在皮內PACAP38攻擊之前(基線)及在皮內PACAP38攻擊之後持續35分鐘，使用用於LASCA成像之PeriCam PSI NR系統(Perimed, Järfälla, Sweden)監測真皮血管擴張及血液灌注。皮內PACAP38攻擊如下執行：各動物接受媒劑(一個位點或ROI)之單一皮內投與(100 µl/位點)且以30 pmol/位點(3個位點或3個ROI)接受PACAP38。針對各ROI之血液灌注速率由PeriCam PSI NR系統以PU報告且使用PIMSoft (1.5版本(Perimed, Järfälla, Sweden))進行分析。
關於各處理組，針對各ROI計算與基線相比在Ab10或同型Ab對照物投與之後的相對%PU改變(針對各PACAP38攻擊位點之%PU改變-針對媒劑位點之%PU改變)。藉由使用GraphPad Prism (5.0d版本, GraphPad Software, La Jolla, CA)軟體執行雙尾未配對t檢驗統計學評估對Ab10組中之相對%PU改變與同型Ab對照組中之相對%PU改變進行比較。
圖 21 證明Ab10在兔中抑制PACAP38誘導之真皮血管擴張，指示該抗體活體內中和PACAP38活性之有效性。 實例 9 ： 抗 PACAP 抗體 Ab1 及 Ab10 之抗原決定基建倉
Ab1根據製造商準則以10:1莫耳比率用生物素(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)生物素化。如下執行5步生物層干涉術實驗：在步驟1中，抗生蛋白鏈菌素生物感測器(Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA)在1x動力學緩衝液(DBS中之1:10稀釋液，Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA, 目錄號18-5032)中平衡50秒。在步驟2中，生物素化抗體Ab1在1x動力學緩衝液中之2 µg/ml稀釋液固定至抗生蛋白鏈菌素生物感測器上持續500秒。在步驟3中，該等抗體官能化生物感測器在2 µM未標記PACAP肽(American Peptide Company, Sunnyvale, CA, 目錄號34-0-20)於1x動力學緩衝液中之溶液中培育200秒。在步驟4中，該等感測器置於未標記抗體Ab10 (圖 22A )或作為對照物之未標記抗體Ab1 (圖 22B )於1x動力學緩衝液中之67 nM溶液中用於1000秒締合步驟。在步驟5期間針對1x動力學緩衝液中之1000秒締合監測結合穩定性。在圖 22A 中，經由Ab1捕捉之PACAP實現的Ab10之「夾心型」捕捉指示此兩種抗體與PACAP之同時及非競爭性結合。圖 22B 中之對照實驗顯示經由Ab1捕捉之PACAP實現的Ab1之最低程度「夾心型」捕捉。在ForteBio OCTET® QK儀器(Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA)上在30℃及1000 RPM下進行該實驗。 實例 10 ： 抗 PACAP 抗體對 PACAP27 結合於人類 PAC1-R 之抑制
為了鑑別阻斷PACAP27結合於PAC1-R之抗體，初始濃度為30 nM之抗體稀釋於培育緩衝液(50 mM Hepes pH 7.4、1 mM CaCl2 、5 mM MgCl2 、0.2% BSA)中且執行連續1:3稀釋。抗體稀釋液(30 nM、10 nM、3 nM、1 nM、0.3 nM、0.1 nM、0.03 nM、0.01 nM、0.003 nM及0.001 nM)接著在25℃下與培育緩衝液中之0.1 nM125 I標記之PACAP27混合且預培育30分鐘。抗體:125 I標記之PACAP27混合物接著添加至源於表現人類重組PAC1-R長同功異型物之Chem-1細胞的細胞膜於培育緩衝液中之0.5 μg等分試樣中。該混合物接著在25℃下培育1小時。在培育之後，該等樣品經過濾且洗滌。之後，對過濾器計數以定量125 I標記之PACAP27。作為實驗對照組，使用0.1 μM經標記之PACAP27估算與細胞膜之非特異性結合。結果指示Ab1.H、Ab10.H及Ab12.H能夠阻斷PACAP27結合於PAC1-R，由此證明表9中提供之所測試抗體對配位體-受體結合之抑制。 表9 抗PACAP抗體對0.1 nM125 I-PACAP27結合於PAC1-R之抑制(IC50 ) 實例 11 ： 抗 PACAP 抗體對厭光之影響
為了檢查抗PACAP抗體對畏光之影響，使用小鼠模型，其中小鼠經投與PACAP以觸發畏光。使用厭光分析使用如Kaiser等人,J. Neurosci ., 32(44):15439-15449, 2012中所述之光暗盒偵測畏光。小鼠接著經投與抗PACAP抗體Ab1.H或Ab10.H或無關對照抗體且定量其厭光。結果在圖 23-25 中有所反映。 厭光分析
如Kaiser等人所述，測試腔室為樹脂玻璃開放場(27 cm寬× 27 cm深× 20.3 cm高)，其含有16個光束紅外陣列之三個集合(正交光束之兩個集合在1.0 cm高度處交叉以偵測小鼠位置及運動，且第三光束在7.3 cm高度處跨過該腔室之寬度以偵測垂直活性)。該場由暗插入物分成兩個相等大小的區域，該插入物為具有頂部但無地板之五個側面、黑色樹脂玻璃盒。紅外光束之使用允許在兩個區域中進行追蹤。該暗插入物中之開口(5.2 cm × 6.8 cm)允許在區域之間自由移動。雖然該暗插入物阻斷直射光，但一些光可能仍經由該開口進入。各測試腔室位於消音室(56 cm寬× 38 cm深× 36 cm高)內部，該消音室具有風扇用於通風(Med Associates, Inc.®, St. Albans, VT)。使用Activity Monitor v6.02 (Med Associated Inc.)之電腦用於記錄來自六個腔室之資料。
關於各腔室，LED面板連接於該消音室之天花板。該LED面板含有36個準直1瓦特LED (5500k日光白) (LEDwholesalers.com, Burlingame, CA)。為了控制光強度，各LED面板連接至可調光LED驅動器(LINEARdrive®; eldoLED America Inc., San Jose, CA)，導致3.0×102 至2.7×104 lx之潛在光強度範圍。使用位於該等LED下方之透明樹脂玻璃托盤上之蠟紙將能級進一步減弱至5.5×101 lx。用位於該測試腔室之地板上的Traceable雙顯示器光度計(Control Company, Friendswood, TX)量測光強度。在2.7×104 lx下，LED光在消音腔室中產生一些熱量，其中暗區在大約25℃下且光區在大約27℃下。
在實驗當日，從動物圈舍運送小鼠且使其適應測試室(大約22℃)持續至少30至60分鐘，其中具有標準頂射螢光照明(在圈舍籠內部大約200 lx)。除非另外註明，否則室內燈保持打開。另外，所有音生成設備均在適應期間打開且保持打開直至測試完成。在適應期間在室內存在最少的人。在0800 CST與1400 CST之間執行行為測試。注意任何異常身體條件(例如，失明)。
十週齡雄性及雌性CD1小鼠用於該研究中(品系#022, Charles River, Wilmington, MA, US)。在測試之前使小鼠自運輸恢復一至兩週。 適應
所有小鼠均在置於光/暗腔室中之前在測試室中適應至少30至60分鐘。該腔室中之光強度最初設定至2.7 x 103 lx。該等小鼠每天在該腔室中測試三十分鐘，其暴露於該光/暗腔室。藉由使該等小鼠暴露於該光/暗腔室兩次來獲得每一隻小鼠在光中之基線時間，在基線量測之間具有三天之休息期(圖 23 及25 ，分別為「基線1」及「基線2」或「基線」)。 處理
該等小鼠藉由i.p.注射投與30 mg/kg之抗PACAP抗體或對照IgG抗體(具有與測試抗體相同之框架且識別長葉毛地黃配質之陰性對照抗體)。該等小鼠接著返回其圈舍籠以在測試之前休息一天(24小時)。該等小鼠接著藉由i.p.注射投與0.6 mg/kg PACAP或媒劑且休息30分鐘。該等小鼠接著置於該光/暗腔室中持續30分鐘(圖 23 及圖 25 ，「處理」)。在每一隻小鼠暴露於該光/暗腔室之後，該光/暗腔室及組件用殺菌拭紙清潔且乾燥。在小鼠置於該光/暗腔室中之後約5至7分鐘，下一隻欲測試之小鼠注射PACAP或媒劑，如上文所述。此時間間隔大約為在實驗之間清潔該光/暗腔室所需之時間量。 運動性量測
如Kaiser等人,J. Neurosci ., 2012中所述以5分鐘時間間隔經30分鐘測試期量測運動性。簡言之，藉由光束量測垂直移動(諸如後腿直立)之次數、走動距離(cm，在走動移動狀態期間行進之總距離)、穿梭次數、及休息(未破壞新光束時所度過之時間的百分率)。所有運動性參數均針對各區域中度過之時間標準化以說明彼區域中度過之不同時間量；因此，針對各參數之原始值除以在5 min時間間隔期間在彼區域中度過之時間。在各腔室中度過之時間使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, San Diego, CA)進行分析，且報告為平均值±平均值之標準誤差(「SEM」)。藉由雙因素重複量測ANOVA計算比較，其中Bonferroni氏多重比較測試用於事後分析。
小鼠基於三種準則被排除在外：(1)在最初兩次暴露於該盒之後，在光中之基線時間經分析且度過在基線處在光中之平均時間的+/- 1標準偏差之任何小鼠均自實驗中移出且未給予藥物處理，(2)若小鼠經鑑別為統計學離群值(盒形圖，10-90%)，則其自分析中排除在外，及(3)若小鼠移動不足該時間(組合之光及暗)之10%，則其被排除在外。
在兩個比較經投與抗體Ab1.H或Ab10.H與對照IgG之小鼠的反應之實驗中，結果指示經投與PACAP抗體Ab1.H或Ab10.H之小鼠如與IgG對照小鼠相比在光中度過更多時間。圖 23 顯示小鼠在兩次基線量測中行為正常且相似。另一方面，圖 23 中提供之資料顯示用對照IgG抗體及接著PACAP處理之小鼠(正方形)在統計學上在光中度過比經投與抗PACAP抗體Ab1.H及接著PACAP之小鼠(圓形)少之時間。(參見圖 23 ，「處理」)。圖 25 中提供之資料亦顯示小鼠在基線量測中行為正常且相似。另一方面，圖 25 中提供之資料顯示用對照IgG抗體及接著PACAP處理之小鼠(三角形)在統計學上在光中度過比經投與抗PACAP抗體Ab10.H及接著PACAP之小鼠(倒三角形)少之時間。(參見圖 25 ，「處理」)。各量測之間之時間為三天。針對各5分鐘時間間隔提供平均值± SEM。僅投與媒劑之小鼠如正常對照組般行為。圖 24 中提供之資料顯示抗PACAP抗體Ab1.H或對照IgG及媒劑(分別為「媒劑+ PAC Ab」及「媒劑+對照Ab」)之投與不會顯著改變小鼠行為。圖 24 亦顯示當投與PACAP及對照IgG (「PACAP +對照Ab」)時，小鼠在光中之平均時間降低，而經投與抗PACAP抗體Ab1.H及PACAP之小鼠展現正常、非光敏性行為(「PACAP + PAC Ab」)。 實例 12 ： 抗 PACAP 抗體之抗原決定基定位
為了確定含於與本發明之抗PACAP抗體及其抗原結合片段結合之PACAP內的抗原決定基，使用丙胺酸掃描實驗。為了執行此等實驗，用單一點突變在各位置中用丙胺酸(「Ala」)置換原生胺基酸來合成PACAP肽，且當單一點突變與PACAP及抗體之結合親和力有關時，量測單一點突變之結果。
由於丙胺酸殘基已經佔據野生型PACAP之位置18、24及25，根據慣例，此等Ala殘基用纈胺酸(「Val」)置換以確定在此等位置處移除丙胺酸對本發明抗PACAP抗體與PACAP之結合的可能影響。根據通常慣例，此等Ala突變體根據PACAP 1-38中之位置經標記，隨後為經取代胺基酸之字母代碼，例如10A指示在胺基酸位置10處經丙胺酸取代之PACAP 1-38。使用SPR在PROTEON™ XRP36 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)上偵測單株抗體對人類PACAP及各突變型肽之結合。樣品及樣品對照物使用標準胺偶合以單一密度固定至PROTEON™ GLC感測器晶片(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)上。用於固定之電泳緩衝液為DPBS/經改良(HYCLONE™, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA)且固定在25℃下進行。該PROTEON™ GLC感測器晶片(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)根據製造商之方案(0.5% SDS、50 mM NaOH、100 mM HCl之雙向注射)經初始化且預調節。
逐步執行該固定過程以確保該PROTEON™晶片(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)之斑點上的獨特抗體。該晶片之表面用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺/N-羥基丁二醯亞胺(「EDAC/NHS」)之1:1混合物及30 µL/min之流動速率持續5分鐘激活。抗體樣品先前經透析或交換至10 mM HEPES 150 mM NaCl pH 7.2，且使用NANODROP™2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)定量抗體濃度。該固定靶向2000-3000反應單位(「RU」)。10 mM乙酸鈉(pH 5.5)中之抗體樣品(5 µg/ml)以30 µL/min流動4分鐘。與下一次激活相伴，使用0.3 M乙醇胺以30 µL/min之流動速率持續5分鐘實現減活。
在固定之後，該電泳緩衝液改變為具有0.2 M精胺酸HCl (以降低非特異性結合)、BSA (0.2 mg/ml，作為載劑)及PROCLIN300® (0.005%，作為防腐劑，Sigma Aldrich, St. Louis, MO)之1x PBST (4.3 mM磷酸鈉、1.4 mM磷酸鉀、135 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.05% TWEEN®)且藉由注射新的電泳緩衝液使晶片表面再平衡。濃度為1 mg/ml之人類PACAP肽(1-38)及丙胺酸/纈胺酸突變型肽(分子量：4.5 kD)之儲備溶液添加至該電泳緩衝液中至0.45 μg/ml (100 nM)之最終濃度。此等混合物接著以100 µL/min之流動速率持續2分鐘用於查詢晶片表面上之個別斑點且使其解離持續600秒。藉由添加0.85%磷酸使晶片表面在分析物之間再生。
在與本文所述相同之條件下檢查各抗體Ab1、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22及Ab23。
使用多種參數分析表示結合於抗體組之突變型肽的親和力資料之感應圖。首先對各感應圖執行視覺檢查以分析相對於野生型PACAP肽(1-38)之表觀最大反應(「Rmax」)。其次，執行解離相之視覺檢查，重點在於相對於野生型PACAP肽之曲線形狀。計算野生型PACAP肽之解離速率(off-rate/dissociation rate)及各突變型肽與抗體組之結合。最後，作為對照實驗以確認各肽變異體(野生型或突變體)之完整性，個別地確定肽文庫之各成員對已知結合野生型PACAP之抗體之組中的各成員之結合親和力，以確保各Ala突變型PACAP肽展現類似於野生型PACAP肽之結合親和力的結合親和力。所有所述參數之集體分析鑑別了對於PACAP/抗體結合至關重要之PACAP胺基酸殘基。
圖 26A-45B 中顯示關於抗體Ab1、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22及Ab23與野生型PACAP及PACAP突變體之結合的結合及解離資料。各圖中之上部圖含有關於PACAP中看來對於抗體結合至關重要之殘基的結合資料(在該圖之右端標記，例如，「10A」指示關於含有丙胺酸之突變體的在PACAP之位置10處之結合資料)。下部圖提供表示剩餘PACAP丙胺酸突變體(亦即，結合於所測試抗體之類似於野生型PACAP的PACAP丙胺酸突變體)之結合程度的資料點。基於此，該殘基經確定可能對於抗體結合不重要。作為陽性對照組，各圖之上部及下部圖亦揭示使用野生型PACAP (經標記huPACAP(1-38))獲得之結合資料。
圖 46A-47B 概述了基於此等丙胺酸掃描研究中獲得之資料經確定有助於抗體結合親和力之PACAP殘基位置。各行中列出之位置鑑別了突變導致PACAP/抗體結合親和力降低之PACAP丙胺酸掃描突變體。殘基位置根據殘基沿著PACAP一級序列(胺基酸殘基1-38)之空間排列列於圖 46A-47B 之第3行中。對抗體結合最有用之PACAP殘基位置經解釋共同地包含由各抗體結合之抗原決定基。基於此等丙胺酸掃描研究中獲得之資料，推斷由各抗體結合之抗原決定基包含以下殘基： (i) Ab1：人類PACAP之殘基5、6、8、10及13； (ii) Ab2：人類PACAP之殘基5、6、8、9、10、13及14； (iii) Ab13：人類PACAP之殘基6、8、9、10及13； (iv) Ab14：人類PACAP之殘基5、6、8、9、10及13； (v) Ab15：人類PACAP之殘基5、6、8、9、10、12、13及14； (vi) Ab16：人類PACAP之殘基5、6、8、10及13； (vii) Ab17：人類PACAP之殘基5、6、8、10及13； (viii) Ab18：人類PACAP之殘基5、6、8、9、10、12及13； (ix) Ab19：人類PACAP之殘基4、5、6、8、9、10、12、13、14及17； (x) Ab5：人類PACAP之殘基3、4、5、6、7、10、13及14； (xi) Ab7：人類PACAP之殘基6、8、10、11、13、14及18； (xii) Ab11：人類PACAP之殘基6、8、10、11、13、14、18及22； (xiii) Ab12：人類PACAP之殘基6、8、10、11、13、14及18； (xiv) Ab4：人類PACAP之殘基8、9、10、13、14、17及18； (xv) Ab3：人類PACAP之殘基8、9、10、11、12、13、14、17及21； (xvi) Ab6：人類PACAP之殘基5、6、9、10、12、13、14及17； (xvii) Ab8：人類PACAP之殘基7、10、13及14； (xviii) Ab9：人類PACAP之殘基7、10、12、13、14及17； (xix) Ab22：人類PACAP之殘基22、23、27、28及31；及 (xx) Ab23：人類PACAP之殘基12、20、23、24、26、27及28。
基於丙胺酸掃描實驗結果進一步注意，各抗體Ab1、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8及Ab9對PACAP之親和力涉及或取決於人類PACAP之殘基10及/或13，且在一些情況下涉及或進一步取決於殘基8及/或14。
另外，觀察到各抗體Ab22及Ab23與PACAP之親和力涉及或需要存在於人類野生型PACAP38中、但不存在於人類野生型PACAP27中之特定胺基酸殘基，例如PACAP38之殘基28或31。
關於前述丙胺酸掃描結果，本發明抗PACAP抗體之人類化變異體應與人類PACAP之一致或實質上一致殘基相互作用，因為與親本(非人類化)抗體相比，人類化不應可觀地影響該人類化抗PACAP抗體與人類PACAP之結合特異性。特定言之，Ab3.H應與人類PACAP上與Ab3相同之殘基相互作用，Ab4.H應與人類PACAP上與Ab4相同之殘基相互作用，Ab5.H應與人類PACAP上與Ab5相同之殘基相互作用，Ab9.H應與人類PACAP上與Ab9相同之殘基相互作用，且Ab12.H應與人類PACAP上與Ab12相同之殘基相互作用。
結合於人類PACAP上與本發明抗體相同或重疊之抗原決定基之抗體可使用本文所述之方法產生且經鑑別。有理由預期結合於與任何本文所鑑別之抗體相同或重疊之抗原決定基之抗體將可能具有類似生物活性，在結合動力學方面不存在有意義之差異。特定言之，該等抗體應類似於結合此等抗原決定基之所例示抗PACAP抗體拮抗由PACAP引起之一或多種生物效應。另外，預期結合於此等相同或重疊之抗原決定基或其殘基之子集的抗體模擬本發明抗體之結合特徵。例如，預期該等抗體選擇性結合於PACAP且不結合或以小得多之親和力(較弱)結合於VIP或此神經肽家族內之其他肽。
已充分描述且使得實現本發明，本發明由以下申請專利範圍進一步描述。
圖 1A-1B 提供藉由其FR及CDR比對之抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之可變重鏈的多肽序列(分別為SEQ ID NO: 2；42；82；682；1122；642；1082；482；1002；722；522；762；802；1162；562；602；1042；122；162；202；242；282；322；362；882；及922)。
圖 2A-2B 提供藉由其FR及CDR比對之抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之可變輕鏈的多肽序列(分別為SEQ ID NO: 22；62；102；702；1142；662；1102；502；1022；742；542；782；822；1182；582；622；1062；142；182；222；262；302；342；382；902；及942)。
圖 3A-3F 提供藉由其FR及CDR比對之編碼抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之可變重鏈的聚核苷酸序列(分別為SEQ ID NO: 12；52；92；692；1132；652；1092；492；1012；732；532；772；812；1172；572；612；1052；132；172；212；252；292；332；372；892；及932)。
圖 4A-4E 提供藉由其FR及CDR比對之編碼抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之可變輕鏈的聚核苷酸序列(分別為SEQ ID NO: 32；72；112；712；1152；672；1112；512；1032；752；552；792；832；1192；592；632；1072；152；192；232；272；312；352；392；912；及952)。
圖 5 提供關於某些抗體重鏈蛋白序列特徵的多肽序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之重鏈的可變區及CDR。
圖 6 提供關於某些抗體重鏈蛋白序列特徵的多肽序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之重鏈的恆定區及框架區FR。
圖 7 提供關於某些抗體輕鏈蛋白序列特徵的多肽序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之輕鏈的可變區及CDR。
圖 8 提供關於某些抗體輕鏈蛋白序列特徵的多肽序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之輕鏈的恆定區及框架區FR。
圖 9 提供關於某些抗體重鏈DNA序列特徵的聚核苷酸序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之重鏈的可變區及CDR。
圖 10 提供關於某些抗體重鏈DNA序列特徵的聚核苷酸序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之重鏈的恆定區及FR。
圖 11 提供關於某些抗體輕鏈DNA序列特徵的聚核苷酸序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之輕鏈的可變區及CDR。
圖 12 提供關於某些抗體輕鏈DNA序列特徵的聚核苷酸序列座標，該等特徵包括抗體Ab1、Ab1.H、Ab2、Ab3、Ab3.H、Ab4、Ab4.H、Ab5、Ab5.H、Ab6、Ab7、Ab8、Ab9、Ab9.H、Ab11、Ab12、Ab12.H、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab22及Ab23之輕鏈的恆定區及FR。
圖 13A-V 提供根據下文實例1中之方案獲得的分別關於Ab1 (圖 13A )、Ab2 (圖 13B )、Ab3 (圖 13C )、Ab4 (圖 13D )、Ab5 (圖 13E )、Ab6 (圖 13F )、Ab7 (圖 13G )、Ab8 (圖 13H )、Ab9 (圖 13I )、Ab10 (圖 13J )、Ab11 (圖 13K )、Ab12 (圖 13L )、Ab13 (圖 13M )、Ab14 (圖 13N )、Ab15 (圖 13O )、Ab16 (圖 13P )、Ab17 (圖 13Q )、Ab18 (圖 13R )、Ab19 (圖 13S )、Ab1.H (圖 13T )、Ab22 (圖 13U )及Ab23 (圖 13V )之代表性競爭結合資料。
圖 14A-BB 提供根據下文實例5中之方案獲得的代表性資料，其顯示PACAP38結合於表現PAC1-R之PC-12細胞的Ab1介導(圖 14A )、Ab2介導(圖 14B )、Ab3介導(圖 14C )、Ab4介導(圖 14D )、Ab5介導(圖 14E )、Ab6介導(圖 14F )、Ab7介導(圖 14G )、Ab8介導(圖 14H )、Ab9介導(圖 14I )、Ab10介導(圖 14J )、Ab11介導(圖 14K )、Ab12介導(圖 14L )、Ab13介導(圖 14M )、Ab14介導(圖 14N )、Ab15介導(圖 14O )、Ab16介導(圖 14P )、Ab17介導(圖 14Q )、Ab18介導(圖 14R )、Ab19介導(圖 14S )、Ab1.H介導(圖 14T) 、 Ab10.H介導(圖 14U )、Ab22介導(圖 14V )、Ab23介導(圖 14W )、Ab3.H介導(圖 14X )、Ab4.H介導(圖 14Y )、Ab5.H介導(圖 14Z )、Ab9.H介導(圖 14AA )及Ab12.H介導(圖 14BB )之抑制。
圖 15A-J 提供根據下文實例6中之方案獲得的代表性資料，其顯示在PACAP38存在下Ab1.H (圖 15A )、Ab3.H (圖 15B )、Ab4.H (圖 15C )、Ab5.H (圖 15D )、Ab9.H (圖 15E )、Ab12.H (圖 15F )、Ab10 (圖 15G )、Ab10.H (圖 15H )、Ab22 (圖 15I )及Ab23 (圖 15J )結合於表現PAC1-R之PC-12細胞。
圖 16A-BB 提供根據下文實例1中之方案獲得的代表性資料，其顯示經由表現PAC1-R之PC-12細胞實現之PACAP38驅動的cAMP產生之Ab1介導(圖 16A )、Ab2介導(圖 16B )、Ab3介導(圖 16C )、Ab4介導(圖 16D )、Ab5介導(圖 16E )、Ab6介導(圖 16F )、Ab7介導(圖 16G )、Ab8介導(圖 16H )、Ab9介導(圖 16I )、Ab10介導(圖 16J )、Ab11介導(圖 16K )、Ab12介導(圖 16L )、Ab13介導(圖 16M )、Ab14介導(圖 16N )、Ab15介導(圖 16O )、Ab16介導(圖 16P )、Ab17介導(圖 16Q )、Ab18介導(圖 16R )、Ab19介導(圖 16S )、Ab1.H介導(圖 16T) 、 Ab10.H介導(圖 16U )、Ab22介導(圖 16V )、Ab23介導(圖 16W )、Ab3.H介導(圖 16X )、Ab4.H介導(圖 16Y )、Ab5.H介導(圖 16Z )、Ab9.H介導(圖 16AA )及Ab12.H介導(圖 16BB )之抑制。
圖 17A-BB 提供根據下文實例1中之方案獲得的代表性資料，其顯示經由表現PAC1-R之PC-12細胞實現之PACAP27驅動的cAMP產生之Ab1介導(圖 17A )、Ab2介導(圖 17B )、Ab3介導(圖 17C )、Ab4介導(圖 17D )、Ab5介導(圖 17E )、Ab6介導(圖 17F )、Ab7介導(圖 17G )、Ab8介導(圖 17H )、Ab9介導(圖 17I )、Ab10介導(圖 17J )、Ab11介導(圖 17K )、Ab12介導(圖 17L )、Ab13介導(圖 17M )、Ab14介導(圖 17N )、Ab15介導(圖 17O )、Ab16介導(圖 17P )、Ab17介導(圖 17Q )、Ab18介導(圖 17R )、Ab19介導(圖 17S )、Ab1.H介導(圖 17T) 、 Ab10.H介導(圖 17U )、Ab22介導(圖 17V )、Ab23介導(圖 17W )、Ab3.H介導(圖 17X )、Ab4.H介導(圖 17Y )、Ab5.H介導(圖 17Z )、Ab9.H介導(圖 17AA )及Ab12.H介導(圖 17BB )之抑制。
圖 18A-BB 提供根據下文實例3中之方案獲得的代表性資料，其顯示經由表現VPAC1-R之CHO-K1細胞實現之PACAP38驅動的cAMP產生之Ab1介導(圖 18A )、Ab2介導(圖 18B )、Ab3介導(圖 18C )、Ab4介導(圖 18D )、Ab5介導(圖 18E )、Ab6介導(圖 18F )、Ab7介導(圖 18G )、Ab8介導(圖 18H )、Ab9介導(圖 18I )、Ab10介導(圖 18J )、Ab11介導(圖 18K )、Ab12介導(圖 18L )、Ab13介導(圖 18M )、Ab14介導(圖 18N )、Ab15介導(圖 18O )、Ab16介導(圖 18P )、Ab17介導(圖 18Q )、Ab18介導(圖 18R )、Ab19介導(圖 18S )、Ab1.H介導(圖 18T) 、 Ab10.H介導(圖 18U )、Ab22介導(圖 18V )、Ab23介導(圖 18W )、Ab3.H介導(圖 18X )、Ab4.H介導(圖 18Y )、Ab5.H介導(圖 18Z )、Ab9.H介導(圖 18AA )及Ab12.H介導(圖 18BB )之抑制。
圖 19A-BB 提供根據下文實例4中之方案獲得的代表性資料，其顯示經由表現VPAC2-R之CHO-K1細胞實現之PACAP38驅動的cAMP產生之Ab1介導(圖 19A )、Ab2介導(圖 19B )、Ab3介導(圖 19C )、Ab4介導(圖 19D )、Ab5介導(圖 19E )、Ab6介導(圖 19F )、Ab7介導(圖 19G )、Ab8介導(圖 19H )、Ab9介導(圖 19I )、Ab10介導(圖 19J )、Ab11介導(圖 19K )、Ab12介導(圖 19L )、Ab13介導(圖 19M )、Ab14介導(圖 19N )、Ab15介導(圖 19O )、Ab16介導(圖 19P )、Ab17介導(圖 19Q )、Ab18介導(圖 19R )、Ab19介導(圖 19S )、Ab1.H介導(圖 19T) 、 Ab10.H介導(圖 19U )、Ab22介導(圖 19V )、Ab23介導(圖 19W )、Ab3.H介導(圖 19X )、Ab4.H介導(圖 19Y )、Ab5.H介導(圖 19Z )、Ab9.H介導(圖 19AA )及Ab12.H介導(圖 19BB )之抑制。
圖 20 提供根據下文實例7中之方案獲得的代表性資料，其顯示相對於媒劑對照組藉由在兔模型中在PACAP38投與之後投與Ab1.H獲得之血管擴張的減少。
圖 21 提供根據下文實例8中之方案獲得的代表性資料，其顯示相對於同型抗體對照組藉由在兔模型中在PACAP38投與之後投與Ab10獲得之血管擴張的減少。
圖 22A 提供根據下文實例9中之方案獲得的關於經標記Ab1及未標記Ab10之抗原決定基建倉資料。
圖 22B 提供根據下文實例9中之方案獲得的關於未標記Ab1及經標記Ab10之抗原決定基建倉資料。
圖 23 提供根據下文實例11中之方案獲得的代表性資料，其顯示在囓齒動物畏光模型中投與PACAP及抗PACAP抗體Ab1.H之活體內效應，該模型偵測與適當對照動物相比每5分鐘時間間隔經處理動物(小鼠)在光中度過之時間量。
圖 24 提供根據下文實例11中之方案獲得的代表性資料，其顯示在囓齒動物畏光動物模型中投與PACAP及抗PACAP抗體Ab1.H之活體內效應，該模型偵測與適當對照動物相比經處理動物(小鼠)在光中度過之平均時間量。
圖 25 提供根據下文實例11中之方案獲得的代表性資料，其顯示在囓齒動物畏光模型中投與PACAP及抗PACAP抗體Ab10.H之活體內效應，該模型偵測與適當對照動物相比經處理動物(小鼠)在光中度過之時間量。
圖 26A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab1結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、10A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 26B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab1結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、9A、11A、12A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 27A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab2結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、9A、10A、13A及14A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 27B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab2結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、11A、12A及15A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 28A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab13結合於PACAP丙胺酸掃描突變體6A、8A、9A、10A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 28B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab13結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-5A、7A、11A、12A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的結合動力學量測結果。
圖 29A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab14結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、9A、10A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 29B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab14結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、11A、12A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 30A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab15結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、9A、10A、12A、13A及14A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 30B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab15結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、11A及15A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 31A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab16結合於PACAP丙胺酸掃描突變體6A、8A、10A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 31B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab16結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-5A、7A、9A、11A、12A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 32A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab17結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、10A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 32B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab17結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、9A、11A、12A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 33A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab18結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、8A、9A、10A、12A及13A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 33B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab18結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、11A及14A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 34A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab19結合於PACAP丙胺酸掃描突變體4A、5A、6A、8A、9A、10A、12A、13A、14A及17A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 34B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab19結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-3A、7A、11A、15A、16A及18V-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 35A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab5結合於PACAP丙胺酸掃描突變體3A、4A、5A、6A、7A、10A、13A及14A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 35B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab5結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A、2A、8A、9A、11A、12A及15A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 36A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab7結合於PACAP丙胺酸掃描突變體6A、8A、10A、11A、13A、14A及18V連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 36B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab7結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-5A、7A、9A、12A、15A-17A及19A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 37A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab11結合於PACAP丙胺酸掃描突變體6A、8A、10A、11A、13A、14A、18V及22A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 37B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab11結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-5A、7A、9A、12A、15A-17A、19A-21A及23A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 38A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab12結合於PACAP丙胺酸掃描突變體6A、8A、10A、11A、13A、14A及18V連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 38B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab12結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-5A、7A、9A、12A、15A-17A及19A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 39A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab4結合於PACAP丙胺酸掃描突變體8A、9A、10A、13A、14A、17A及18V連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 39B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab4結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-7A、11A、12A、15A、16A及19A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 40A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab3結合於PACAP丙胺酸掃描突變體8A、9A、10A、11A、12A、13A、14A、17A及21A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 40B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab3結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-7A、15A、16A、18A-20A及22A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 41A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab6結合於PACAP丙胺酸掃描突變體5A、6A、9A、10A、12A、13A、14A及17A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 41B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab6結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-4A、7A、8A、11A、15A、16A及18V-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 42A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab8結合於PACAP丙胺酸掃描突變體7A、10A、13A及14A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 42B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab8結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-6A、8A、9A、11A、12A及15A-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 43A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab9結合於PACAP丙胺酸掃描突變體7A、10A、12A、13A、14A及17A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 43B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab9結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-6A、8A、9A、11A、15A、16A及18V-38A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 44A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab22結合於PACAP丙胺酸掃描突變體22A、23A、27A、28A及31A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 44B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab22結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-21A、24V-26A、29A及30A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 45A 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab23結合於PACAP丙胺酸掃描突變體12A、20A、23A、24V、26A、27A及28A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 45B 提供根據下文實例12中之方案獲得的關於抗PACAP抗體Ab23結合於PACAP丙胺酸掃描突變體1A-11A、13A-19A、21A、22A、25V及29A-31A連同包括野生型PACAP (經標記huPACAP (1-38)) (陽性對照組)及1x電泳緩衝液(陰性對照組)在內之對照組的基於表面電漿共振之結合動力學量測結果。
圖 46A 提供PACAP丙胺酸掃描突變體對抗體結合之影響的概述。在圖 46A 之第1行中，VIP殘基依其沿著VIP一級序列自胺基酸殘基1-27的空間排列順序列出。在圖 46A 之第2行中，PACAP殘基依其沿著PACAP一級序列自胺基酸殘基1-27的空間排列順序列出。圖 46A 之第3行提供對應於VIP及PACAP自1-27的各殘基之編號，如沿著其一級多肽序列空間排列。在圖 46A 之第4-12行中，列出在丙胺酸掃描研究期間測試之抗體Ab1、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18及Ab19，及經確定促進PACAP/抗體結合之PACAP殘基(諸如5A、6A)。
圖 46B 提供PACAP丙胺酸掃描突變體對抗體結合之影響的概述。在圖 46B 之第1行中，列出VIP殘基28。在圖 46B 之第2行中，PACAP殘基依其沿著PACAP一級序列自胺基酸殘基28-38的空間排列順序列出。圖 46B 之第3行提供對應於VIP之殘基28及PACAP之殘基28-38中每一者的編號，如沿著其一級多肽序列空間排列。在圖 46B 之第4-12行中，列出在丙胺酸掃描研究期間測試之抗體Ab1、Ab2、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18及Ab19，及經確定促進PACAP/抗體結合之PACAP殘基(諸如5A、6A)。
圖 47A 提供PACAP丙胺酸掃描突變體對抗體結合之影響的概述。在圖 47A 之第1行中，VIP殘基依其沿著VIP一級序列自胺基酸殘基1-27的空間排列順序列出。在圖 47A 之第2行中，PACAP殘基依其沿著PACAP一級序列自胺基酸殘基1-27的空間排列順序列出。圖 47A 之第3行提供對應於VIP及PACAP自1-27的各殘基之編號，如沿著其一級多肽序列空間排列。在圖 47A 之第4-12行中，列出在丙胺酸掃描研究期間測試之抗體Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22及Ab23，及經確定促進PACAP/抗體結合之PACAP殘基(諸如5A、6A)。
圖 47B 提供PACAP丙胺酸掃描突變體對抗體結合之影響的概述。在圖 47B 之第1行中，列出VIP殘基28。在圖 47B 之第2行中，PACAP殘基依其沿著PACAP一級序列自胺基酸殘基28-38的空間排列順序列出。圖 47B 之第3行提供對應於VIP之殘基28及PACAP之28-38中每一者的編號，如沿著其一級多肽序列空間排列。在圖 47B 之第4-12行中，列出在丙胺酸掃描研究期間測試之抗體Ab5、Ab7、Ab11、Ab12、Ab4、Ab3、Ab6、Ab8、Ab9、Ab22及Ab23，及經確定促進PACAP/抗體結合之PACAP殘基(諸如5A、6A)。
<110> 艾爾德生物製藥股份有限公司 <120> 抗PACAP抗體及其用途<130> 43257.6274<140> TBD<141> 2017-04-14<150> 62/322,939 <151> 2016-04-15<150> 62/322,957 <151> 2016-04-15<150> 62/323,495 <151> 2016-04-15<150> 62/323,573 <151> 2016-04-15<150> 62/366,902 <151> 2016-07-26<150> 62/408,347 <151> 2016-10-14<160> 1246<170> PatentIn 3.5版本<210> 1<211> 443<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ala Val 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Ile Val Ala Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Gly Glu Phe Phe Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 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acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 420ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 480agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 540gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 600aagcccagca acaccaaggt ggacgcgaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 660acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacgcca gcacgtaccg tgtggtcagc 900gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa 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180agctctgcta acggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac cctgtatctt 240caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt actgtgctag agggggaggg 300gaatttttca tctggggcca agggaccctc gtcaccgtct cgagc 345<210> 53<211> 90<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 53gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt 90<210> 54<211> 15<212> DNA<213> 穴兔<400> 54agcgctgtaa tgaat 15<210> 55<211> 42<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 55tgggtccgtc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg ga 42<210> 56<211> 48<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 56agtattgttg ctagtggtac cacatactac gctagctctg ctaacggc 48<210> 57<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 57cgattcacca tctccagaga caattccaag aacaccctgt atcttcaaat gaacagcctg 60agagctgagg acactgctgt gtattactgt gctaga 96<210> 58<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 58gggggagggg aatttttcat c 21<210> 59<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 59tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 33<210> 60<211> 990<212> 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600cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648<210> 72<211> 330<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 72gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc agtccagtga gagtgtttat agtaactact tatcctggta tcagcagaaa 120ccaggaaaag cccctaagtt cctgatctat caggcatcca atttggcatc tggagtccca 180tcaaggttca gcggcagtgg atctggaaca gaattcactc tcaccatcag cagcctgcag 240cctgatgatt ttgcaactta ctactgtgca ggcggttata gtgaaaacat tgttggtttc 300ggcggaggaa ccaaggtgga aatcaaacgt 330<210> 73<211> 69<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 73gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgt 69<210> 74<211> 36<212> DNA<213> 穴兔<400> 74cagtccagtg agagtgttta tagtaactac ttatcc 36<210> 75<211> 45<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 75tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct aagttcctga tctat 45<210> 76<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 76caggcatcca atttggcatc t 21<210> 77<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 77ggagtcccat caaggttcag cggcagtgga tctggaacag aattcactct caccatcagc 60agcctgcagc ctgatgattt tgcaacttac tactgt 96<210> 78<211> 30<212> DNA<213> 穴兔<400> 78gcaggcggtt atagtgaaaa cattgttggt 30<210> 79<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 79ttcggcggag gaaccaaggt ggaaatcaaa cgt 33<210> 80<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 80acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 81<211> 443<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 81Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Gly Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 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caagcccagc aacaccaagg tggacgcgag agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 101<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 101Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile 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tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240gagtgtgacg atgccgccac ttattactgt gcaggcggtt atagtactta tatgtctggt 300ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 333<210> 113<211> 69<212> DNA<213> 穴兔<400> 113gcccaagtgc tgacccagac tccatcccca gtgtctgcag ctgtgggagg caccgtcacc 60atcaattgc 69<210> 114<211> 39<212> DNA<213> 穴兔<400> 114cagtccagtg agagtgttta taagaacaac tacttatcc 39<210> 115<211> 45<212> DNA<213> 穴兔<400> 115tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagttcctga tctac 45<210> 116<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 116caggcatcca atttggcaga t 21<210> 117<211> 96<212> DNA<213> 穴兔<400> 117ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60gacctggagt gtgacgatgc cgccacttat tactgt 96<210> 118<211> 30<212> DNA<213> 穴兔<400> 118gcaggcggtt atagtactta tatgtctggt 30<210> 119<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 119ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 120<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 120acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 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agagtgttca tgatggcagc tacttatcc 39<210> 155<211> 45<212> DNA<213> 穴兔<400> 155tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aacttcctga tctac 45<210> 156<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 156caggcatcca atttggcatc t 21<210> 157<211> 96<212> DNA<213> 穴兔<400> 157ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60gacctggagt gtgacgatgc cgccacttat tactgt 96<210> 158<211> 30<212> DNA<213> 穴兔<400> 158gcaggcggtt atagtagtaa tatttgtggt 30<210> 159<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 159ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 160<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 160acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 161<211> 443<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 161Gln Ser Val Glu Ala Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Glu Tyr Ser Lys Asn Ile Val Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Val Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Gly Glu Phe Phe Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 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cgccacttat tactgt 96<210> 198<211> 30<212> DNA<213> 穴兔<400> 198gcaggtgcct atagtaatag tatttatagt 30<210> 199<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 199ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 200<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 200acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 201<211> 443<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 201Gln Ser Val Glu Ala Ser Gly Gly His Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ser Val Asp Glu Arg Gln Asn Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Asn Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Gly Glu Phe Phe Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val 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cctcagtagc gctgcaatga actgggtccg ccaggctcca 120gggaaggggc tggaatggat cggatcggtt gatgagcgtc agaataaata ttacgcgtcc 180tgggcgaaag gccgattcac catctccaga acctcgtcga ccacggtgaa tctgaaaatg 240accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggggg aggggaattt 300ttcatctggg gccagggcac cctcgtcacc gtctcgagcg cctccaccaa gggcccatcg 360gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 420ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 480agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 540gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 600aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 660acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacgcca gcacgtaccg tgtggtcagc 900gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg 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360ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651<210> 272<211> 333<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 272gaccctgtgc tgacccagac tccatcgtcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgcc agtccagtca gagtgtttat aataacaagt ggttatcctg gtatcagcag 120aaaccaggac agtctcccaa gttcctgatt taccaggcat ccaatttggc atctggggtc 180ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 240gagtgtgacg atggcgccac ttattactgt gcaggcggct accgtggtaa tgtttgtggt 300ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 333<210> 273<211> 69<212> DNA<213> 穴兔<400> 273gaccctgtgc tgacccagac tccatcgtcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgc 69<210> 274<211> 39<212> DNA<213> 穴兔<400> 274cagtccagtc agagtgttta taataacaag tggttatcc 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ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacgcca gcacgtaccg tgtggtcagc 900gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1320ccgggtaaa 1329<210> 292<211> 339<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 292cagtcagtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct aacactcacc 60tgcaccgtct ctggattctc cctcagtagc gctgcaatga actgggtccg ccaggctcca 120gggaaggggc tggaatggat cggtattttt gatccttata gtagtacata ctacgcgtcc 180tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatg 240accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggggg aggggaattt 300ttcatctggg gcccaggcac cctcgtcacc gtctcgagc 339<210> 293<211> 87<212> DNA<213> 穴兔<400> 293cagtcagtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct aacactcacc 60tgcaccgtct ctggattctc cctcagt 87<210> 294<211> 15<212> DNA<213> 穴兔<400> 294agcgctgcaa tgaac 15<210> 295<211> 42<212> DNA<213> 穴兔<400> 295tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg gt 42<210> 296<211> 48<212> DNA<213> 穴兔<400> 296atttttgatc cttatagtag tacatactac gcgtcctggg cgaaaggc 48<210> 297<211> 93<212> DNA<213> 穴兔<400> 297cgattcacca tctccaaaac ctcgtcgacc acggtggatc tgaaaatgac cagtccgaca 60accgaggaca cggccaccta tttctgtgcc aga 93<210> 298<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 298gggggagggg aatttttcat c 21<210> 299<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 299tggggcccag gcaccctcgt caccgtctcg agc 33<210> 300<211> 990<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 300gcctccacca agggcccatc 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gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 301<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 301Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn 20 25 30 Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Val Gly Gln Pro Pro Lys Phe 35 40 45 Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Gly 85 90 95 Asn Met Val Asp Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 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318gcaggcggtt atagtggtaa tatggttgat 30<210> 319<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 319ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 320<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 320acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 321<211> 443<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 321Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asp Lys Gly Val Met Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Val 65 70 75 80 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agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctac 45<210> 396<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 396gaagcatcca agctggcatc t 21<210> 397<211> 96<212> DNA<213> 穴兔<400> 397ggggtcccac cgcggttcag cggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60gacctggagt gtgacgatgc cgccacttat tactgt 96<210> 398<211> 30<212> DNA<213> 穴兔<400> 398gcaggcgctt atagtactag tatccatggt 30<210> 399<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 399ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 400<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 400acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 401<400> 401000<210> 402<400> 402000<210> 403<400> 403000<210> 404<400> 404000<210> 405<400> 405000<210> 406<400> 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aacaccaagg tggacgcgag agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 501<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 501Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln 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cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga cgcgagagtt 660gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900tacgccagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356<210> 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caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 701<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 701Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly 85 90 95 Trp Tyr Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr 100 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cacagtcacc 60atcaattgcc agtccagtcc gagtgtttat agtagctact tatcctggtt tcagcagaaa 120ccagggcagc ctcccaagtt cctgatctac gaagcatcca aactggcatc tggggtccca 180tcgcggttca gcggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 240tgtagcgatg ctgccactta ctactgtctt ggcgcgtatg attgtggtcg tactgattgt 300catgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaacgt 339<210> 793<211> 69<212> DNA<213> 穴兔<400> 793gcccaagtgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgc 69<210> 794<211> 36<212> DNA<213> 穴兔<400> 794cagtccagtc cgagtgttta tagtagctac ttatcc 36<210> 795<211> 45<212> DNA<213> 穴兔<400> 795tggtttcagc agaaaccagg gcagcctccc aagttcctga tctac 45<210> 796<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 796gaagcatcca aactggcatc t 21<210> 797<211> 96<212> DNA<213> 穴兔<400> 797ggggtcccat cgcggttcag cggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60ggcgtgcagt gtagcgatgc tgccacttac tactgt 96<210> 798<211> 39<212> DNA<213> 穴兔<400> 798cttggcgcgt atgattgtgg tcgtactgat tgtcatgct 39<210> 799<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 799ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa cgt 33<210> 800<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 800acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300ttcaacaggg gagagtgt 318<210> 801<211> 447<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 801Gln Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Ala Glu Gly Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Ile 20 25 30 Ser Arg Asp Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr 50 55 60 Ala Asn Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ile Asp Gln 65 70 75 80 Ser Thr Gly Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Asp Ala Asp Thr Ala 85 90 95 Met Tyr Tyr 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人類化抗體序列<400> 892caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc 60acctgcacag cctctggatt cgacttcagt agcaatgcaa tgtgctgggt ccgccaggct 120ccagggaagg gcctggagtg gatcggatcc atttataatg ctgatggtaa gaattattac 180gcgatttggg cgaaaggccg attcaccatc tccagaacct cgtcgaccac ggtgactctg 240caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agactttgac 300ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc tcgagc 336<210> 893<211> 90<212> DNA<213> 穴兔<400> 893caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc 60acctgcacag cctctggatt cgacttcagt 90<210> 894<211> 15<212> DNA<213> 穴兔<400> 894agcaatgcaa tgtgc 15<210> 895<211> 42<212> DNA<213> 穴兔<400> 895tgggtccgcc aggctccagg gaagggcctg gagtggatcg ga 42<210> 896<211> 51<212> DNA<213> 穴兔<400> 896tccatttata atgctgatgg taagaattat tacgcgattt gggcgaaagg c 51<210> 897<211> 93<212> DNA<213> 穴兔<400> 897cgattcacca tctccagaac ctcgtcgacc acggtgactc tgcaaatgac cagtctgaca 60gccgcggaca cggccaccta tttctgtgcg aga 93<210> 898<211> 12<212> DNA<213> 穴兔<400> 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caaggagtac 960aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320agcctctccc tgtctccggg taaa 1344<210> 1012<211> 354<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1012gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagt agctatgcga tgatctgggt ccgtcaggct 120ccagggaagg ggctggagtg ggtcggaatc atttatgata atggtgacac atactacgcg 180agctctgcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac cgtgtatctt 240caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag agagcctggt 300agtactactc agaatgactt gtggggccaa gggaccctcg tcaccgtctc gagc 354<210> 1013<211> 90<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 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cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 1021<211> 217<212> PRT<213> 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ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc agtccagtca gagtgtttat gataacaatg ctttagcctg gtatcagcag 120aaaccaggaa aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactctggc atctggagtc 180ccatcaaggt tcagcggcag tggatctgga acagaattca ctctcaccat cagcagcctg 240cagcctgatg attttgcaac ttactactgt ctaggcggtt attatgatcc tgctgataat 300gctttcggcg gaggaaccaa ggtggaaatc aaacgt 336<210> 1073<211> 69<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1073gcagcccagc tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgt 69<210> 1074<211> 39<212> DNA<213> 穴兔<400> 1074cagtccagtc agagtgttta tgataacaat gctttagcc 39<210> 1075<211> 45<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1075tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct aagctcctga tctat 45<210> 1076<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 1076gctgcatcca ctctggcatc t 21<210> 1077<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1077ggagtcccat caaggttcag cggcagtgga tctggaacag aattcactct caccatcagc 60agcctgcagc ctgatgattt tgcaacttac tactgt 96<210> 1078<211> 33<212> DNA<213> 穴兔<400> 1078ctaggcggtt 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gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900cagtacgcca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1359<210> 1092<211> 369<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1092gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagt agctacgaca tgagctgggt ccgtcaggct 120ccagggaagg ggctggagtg gatcggaatc attaatacta atgatgacac atggtacgcg 180agctgggtga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac cctgtatctt 240caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt actgtgctag aatatccgat 300gcttatgttt ttgattatgc gtattacttt actttgtggg gccaagggac cctcgtcacc 360gtctcgagc 369<210> 1093<211> 90<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1093gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagt 90<210> 1094<211> 15<212> DNA<213> 穴兔<400> 1094agctacgaca tgagc 15<210> 1095<211> 42<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1095tgggtccgtc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg ga 42<210> 1096<211> 48<212> DNA<213> 穴兔<400> 1096atcattaata ctaatgatga cacatggtac gcgagctggg tgaaaggc 48<210> 1097<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1097cgattcacca tctccagaga caattccaag aacaccctgt atcttcaaat gaacagcctg 60agagctgagg acactgctgt gtattactgt gctaga 96<210> 1098<211> 45<212> DNA<213> 穴兔<400> 1098atatccgatg cttatgtttt tgattatgcg tattacttta ctttg 45<210> 1099<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1099tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 33<210> 1100<211> 990<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1100gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 1101<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1101Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Asn Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Gly Ala Asp Asn 85 90 95 Ile Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val 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acaccaaggt ggacaagaaa 660gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900cagtacgcca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1356<210> 1132<211> 369<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1132gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt agcagcgact acatgtgctg ggtccgtcag 120gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcattgatg ctggtagtag tggtgacact 180tacttcgcga gctctgcgaa aggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacc 240gtgtatcttc aaatgaacag cctgagagct gaggacactg ctgtgtattt ctgtgctaga 300catctttatg gtagtattac tttcgccttt ggcttgtggg gccaagggac cctcgtcacc 360gtctcgagc 369<210> 1133<211> 90<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1133gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt 90<210> 1134<211> 18<212> DNA<213> 穴兔<400> 1134agcagcgact acatgtgc 18<210> 1135<211> 42<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1135tgggtccgtc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg ga 42<210> 1136<211> 54<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1136tgcattgatg ctggtagtag tggtgacact tacttcgcga gctctgcgaa aggc 54<210> 1137<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1137cgattcacca tctccagaga caattccaag aacaccgtgt atcttcaaat gaacagcctg 60agagctgagg acactgctgt gtatttctgt gctaga 96<210> 1138<211> 36<212> DNA<213> 穴兔<400> 1138catctttatg gtagtattac tttcgccttt ggcttg 36<210> 1139<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1139tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agc 33<210> 1140<211> 987<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1140gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987<210> 1141<211> 217<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1141Ala Ala Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Gly 85 90 95 Trp Tyr Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 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ctgttgtgtg cctgctgaat 420aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651<210> 1152<211> 333<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1152gcagcccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc aggccagtca gagcattggt agcgacttag cctggtatca gcagaaacca 120ggaaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccactc tggcatctgg agtcccatca 180aggttcagcg gcagtggatc tggaacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240gatgattttg caacttacta ctgtcaaggc acttattata gtagtggttg gtacactgct 300ttcggcggag gaaccaaggt ggaaatcaaa cgt 333<210> 1153<211> 69<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1153gcagcccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgt 69<210> 1154<211> 33<212> DNA<213> 穴兔<400> 1154caggccagtc agagcattgg tagcgactta gcc 33<210> 1155<211> 45<212> DNA<213> 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Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 1171<211> 1332<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1171gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agggactact ggatatgttg ggtccgtcag 120gctccaggga aggggctgga gtggattgga tgcattagtg ctggtggtgg tagcacagac 180tacgcgaact gggtgaatgg ccgattcacc atctccagag acatctccaa gaacaccggt 240tatcttcaaa tgaacagcct gagagctgag gacactgctg tgtattactg tgcgggaaat 300ctagagatct ggggccaagg gaccctcgtc accgtctcga gcgcctccac caagggccca 360tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 660cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 720cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 780gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtacg ccagcacgta ccgtgtggtc 900agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320tctccgggta aa 1332<210> 1172<211> 342<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1172gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt agggactact ggatatgttg ggtccgtcag 120gctccaggga aggggctgga gtggattgga tgcattagtg ctggtggtgg tagcacagac 180tacgcgaact gggtgaatgg ccgattcacc atctccagag acatctccaa gaacaccggt 240tatcttcaaa tgaacagcct gagagctgag gacactgctg tgtattactg tgcgggaaat 300ctagagatct ggggccaagg gaccctcgtc accgtctcga gc 342<210> 1173<211> 90<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1173gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt 90<210> 1174<211> 18<212> DNA<213> 穴兔<400> 1174agggactact ggatatgt 18<210> 1175<211> 42<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1175tgggtccgtc aggctccagg gaaggggctg gagtggattg ga 42<210> 1176<211> 51<212> DNA<213> 穴兔<400> 1176tgcattagtg ctggtggtgg tagcacagac tacgcgaact gggtgaatgg c 51<210> 1177<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1177cgattcacca tctccagaga catctccaag aacaccggtt atcttcaaat gaacagcctg 60agagctgagg acactgctgt gtattactgt gcggga 96<210> 1178<211> 12<212> DNA<213> 穴兔<400> 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ccgggaggag 720atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990<210> 1181<211> 220<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1181Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ala Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe 35 40 45 Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Phe Tyr Asp Cys 85 90 95 Ser Ser Val Asp Cys His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys 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Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 1191<211> 660<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1191gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60atcacttgtc agtccagtcc gagtatctat agtggcgcct tcttatcctg gtatcagcag 120aaaccaggaa aagcccctaa gttcctgatc tatgaagcct ccaaactggc atctggagtc 180ccatcaaggt tcagcggcag tggatctgga acagaattca ctctcaccat cagcagcctg 240cagcctgatg attttgcaac ttactactgt ctaggcttct atgattgtag cagtgttgat 300tgccatgctt tcggcggagg aaccaaggtg gaaatcaaac gtacggtagc ggccccatct 360gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 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tagtggcgcc ttcttatcc 39<210> 1195<211> 45<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1195tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct aagttcctga tctat 45<210> 1196<211> 21<212> DNA<213> 穴兔<400> 1196gaagcctcca aactggcatc t 21<210> 1197<211> 96<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1197ggagtcccat caaggttcag cggcagtgga tctggaacag aattcactct caccatcagc 60agcctgcagc ctgatgattt tgcaacttac tactgt 96<210> 1198<211> 39<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1198ctaggcttct atgattgtag cagtgttgat tgccatgct 39<210> 1199<211> 33<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1199ttcggcggag gaaccaaggt ggaaatcaaa cgt 33<210> 1200<211> 318<212> DNA<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1200acggtagcgg ccccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 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135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 1246<211> 330<212> PRT<213> 人工<220><223> 人類化抗體序列<400> 1246Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
： (無)

Claims (52)

  1. 一種人類化抗PACAP抗體或抗原結合片段，其特異性結合於人類PACAP上與選自Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9、Ab9.H及Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基。
  2. 一種抗PACAP抗體或抗原結合片段，其特異性結合於人類PACAP上與Ab9或Ab9.H相同或重疊之線性或構形抗原決定基。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其實質上不與血管活性腸肽(「VIP」)相互作用(結合)。
  4. 如申請專利範圍第1項、第2項或第3項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其包含或引起以下效應之一：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或(k)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
  5. 如申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其適用於治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體。
  6. 如申請專利範圍第1項、第2項、第3項、第4項或第5項之人類化、嵌合或人類抗PACAP抗體或抗原結合片段，其特異性結合於人類PACAP上與Ab9.H相同或重疊之線性或構形抗原決定基。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其與人類PACAP之殘基7、10、12、13、14及17中的至少1者、2者、3者、4者、5者或全部6者相互作用。
  8. 一種人類化抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含Ab3.H之重鏈CDR2。
  9. 如申請專利範圍第8項之人類化抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含Ab3.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
  10. 一種人類化抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含Ab5.H之重鏈CDR2。
  11. 如申請專利範圍第10項之人類化抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含Ab5.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
  12. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之人類、人類化或嵌合抗人類PACAP抗體或抗體片段，其包含：可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 804組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 806組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 808組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 824組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 826組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 828組成之CDR3序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之人類、人類化或嵌合抗人類PACAP抗體或抗體片段，其包含： a.) 包含與SEQ ID NO: 802具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或包含與SEQ ID NO: 822具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) 具有胺基酸序列SEQ ID NO: 802之可變重鏈，及/或具有胺基酸序列SEQ ID NO: 822之可變輕鏈； c.) 包含與SEQ ID NO: 801具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或包含與SEQ ID NO: 821具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) 具有胺基酸序列SEQ ID NO: 801之重鏈，及/或具有胺基酸序列SEQ ID NO: 821之輕鏈。
  14. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之人類化抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1124組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1126組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1128組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1144組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1146組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1148組成之CDR3序列。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1122具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1142具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1122之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1121具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1141具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1121之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈。
  16. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1084組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1086組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1088組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1104組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1106組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1108組成之CDR3序列。
  17. 如申請專利範圍第16項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含： a.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1082之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈； b.) (i)包含與SEQ ID NO: 1081具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1101具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 c.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1081之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈。
  18. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1004組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1006組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1008組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1024組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1026組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1028組成之CDR3序列。
  19. 如申請專利範圍第18項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1002具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1022具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1002之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1001具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1021具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 e.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1001之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈。
  20. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1164組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1166組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1168組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1184組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1186組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1188組成之CDR3序列。
  21. 如申請專利範圍第20項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1162具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1182具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1162之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1161具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1181具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1161之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈。
  22. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1044組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1046組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1048組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1064組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1066組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1068組成之CDR3序列。
  23. 如申請專利範圍第22項之抗PACAP抗體或其抗原結合片段，其包含： a.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1042之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈； b.) (i)包含與SEQ ID NO: 1041具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1061具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 c.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1041之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈。
  24. 如前述申請專利範圍中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其中由該抗體結合之抗原決定基藉由丙胺酸掃描來鑑別，例如如本文中實例12所揭示。
  25. 如前述申請專利範圍中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其中： a.) 該抗體或抗原結合片段選自由scFv、駱駝抗體、奈米抗體、免疫球蛋白新抗原受體(「IgNAR」)、片段抗原結合(「Fab」)片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、單價抗原結合片段及F(ab’)2 片段組成之群； b.) 該抗體或抗原結合片段實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化；及/或 c.) 該抗體或抗原結合片段包含人類恆定域，視情況其中該抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
  26. 如前述申請專利範圍中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含已經修飾以改變效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區，及/或該Fc區包含SEQ ID NO:1244、1245或1246中任一者之序列，視情況其中該Fc區含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變。
  27. 如前述申請專利範圍中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段，其中： a.) 該抗體或抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之結合親和力(K D )結合於PACAP，例如，如藉由ELISA、生物層干涉術(「BLI」)、KINEXA或表面電漿共振在25℃或37℃下所測定； b.) 該抗體或抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之結合親和力(KD )結合於PACAP； c.) 該抗體或抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(kd )結合於PACAP； d.) 該抗體或抗原結合片段直接地或間接地連接於可偵測標記或治療劑； e.) 該抗體或抗原結合片段以小於約100 nM、40 nM、50 pM、25 pM、或在約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP； f.) 該抗體或抗原結合片段如與VIP相比對PACAP具有較強親和力及/或不結合於VIP； g.) 該抗體或抗原結合片段與PACAP之結合親和力(KD )為該抗體或抗原結合片段與VIP之結合親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更強；及/或 h.) 該抗體或抗原結合片段連接於至少一種效應子或官能部分及/或一或多種可偵測部分，例如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物。
  28. 一種針對如前述申請專利範圍中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段產生之抗個體基因型抗體，其視情況中和其所結合之該抗PACAP抗體的一或多種生物效應。
  29. 一種使用如申請專利範圍第28項之抗個體基因型抗體來監測個體中該抗PACAP抗體或抗原結合片段之活體內水準或中和個體中該抗PACAP抗體之活體內效應的方法。
  30. 一種適用於治療、預防或診斷用途之組合物，其包含治療、預防或診斷有效量的至少一種如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段或抗個體基因型抗體，其中該組合物： a.) 適用於皮下投與；或 b.) 適用於靜脈內或肌肉內投與。
  31. 如申請專利範圍第30項之組合物，其中該組合物： a.) 經凍乾、穩定化、及/或經調配以藉由注射投與；或 b.) 進一步包含醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑或其混合物及/或另一活性劑，其中視情況該另一活性劑選自由化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑、止吐劑及細胞毒素組成之群。
  32. 一種編碼如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段或抗個體基因型抗體之分離核酸序列，或一種含有該或該等分離核酸序列之載體。
  33. 一種包含如申請專利範圍第32項之分離核酸序列或載體之宿主細胞，其中：視情況該宿主細胞為哺乳動物、細菌、真菌、酵母、禽、兩棲動物、植物、CHO或昆蟲細胞；且視情況該宿主細胞為絲狀真菌或酵母，例如選自以下屬：阿克斯酵母屬(Arxiozyma )；埃克波眉酵母屬(Ascobotryozyma )；固囊酵母屬(Citeromyces )；德巴利酵母屬(Debaryomyces )；德克酵母屬(Dekkera )；假囊酵母屬(Eremothecium )；伊薩酵母屬(Issatchenkia )；哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )；柯達酵母屬(Kodamaea )；洛德酵母屬(Lodderomyces )；管囊酵母屬(Pachysolen )；畢赤酵母屬(Pichia )；酵母菌屬(Saccharomyces )；土星形酵母屬(Saturnispora )；特派斯酵母屬(Tetra pisi spora )；孢圓酵母屬(Torulaspora )；擬威爾酵母屬(Williopsis )；及接合酵母屬(Zygosaccharomyces )，較佳地畢赤酵母屬且更佳地巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica )或多形漢森酵母(Hansenula polymorpha ) (安格斯畢赤酵母(Pichia angusta ))。
  34. 一種表現抗PACAP抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含在提供該抗體或抗原結合片段之表現的條件下培養如申請專利範圍第33項之宿主細胞，其中視情況該宿主細胞為穩定地表現且分泌至少10-25 mg/公升之該抗體或抗原結合片段至培養基中的多倍體酵母培養物或CHO細胞，進一步其中視情況其中該多倍體酵母、較佳地畢赤酵母屬酵母藉由如下方法製得，該方法包含：(i)將至少一種含有一或多種可操作地連接至啟動子及信號序列之編碼該抗體的異源聚核苷酸之表現載體引入至單倍體酵母細胞中；(ii)藉由交配或球形質體融合由該第一及/或第二單倍體酵母細胞產生多倍體酵母；(iii)選擇穩定地表現該抗體之多倍體酵母細胞；及(iv)由穩定地表現該抗體至該培養基中之該等多倍體酵母細胞產生穩定多倍體酵母培養物。
  35. 一種用於阻斷、抑制或中和個體中與垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)有關之一或多種生物效應之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗PACAP抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物，視情況進一步其中 a.) 該抗體或抗原結合片段或組合物拮抗、抑制、中和或阻斷至少一種與人類PACAP有關之生物效應且實質上不與血管活性腸肽(「VIP」)相互作用(結合)；或 b.) 該抗體或抗原結合片段或組合物引起或包含以下一或多者：(i)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(ii)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(iii)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(iv)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(v)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(vi)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(vii)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(viii)能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(ix)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(x)抑制PACAP誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生；及/或(xi)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活。
  36. 一種用於治療或預防個體中之頭痛或偏頭痛的發作、頻率、嚴重程度或持續時間之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之人類、人類化或嵌合抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物，其引起或包含以下一或多者：(a)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(b)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(c)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(d)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(e)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(f)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(g)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(h)能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由黏多糖(「GAG」)；(i)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(j)抑制PACAP誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生；及/或(k)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活，其中視情況該頭痛或偏頭痛選自具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、慢性偏頭痛、藥物過度使用頭痛及緊張性頭痛。
  37. 一種治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及神經元激活中至少一者或前述任一者之組合有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  38. 一種用於阻斷、抑制或中和與垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)有關之一或多種生物效應的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的特異性結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  39. 一種用於中和垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)誘導之PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)信號傳導之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的特異性結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  40. 一種用於抑制垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)誘導之環狀單磷酸腺苷(「cAMP」)產生的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的特異性結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  41. 一種用於抑制垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)誘導之血管擴張的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的特異性結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  42. 一種用於治療或預防個體中與升高之抗人類垂體腺苷酸環化酶激活肽(「PACAP」)水準有關之病狀的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量的特異性結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基及/或競爭結合於人類PACAP上與包含Ab9或Ab9.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基之抗PACAP抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第1項至第27項中任一項之抗垂體腺苷酸環化酶激活多肽(「PACAP」)抗體或抗原結合片段或如申請專利範圍第30項或第31項之組合物。
  43. 如申請專利範圍第35項至第42項中任一項之方法，其中： a.) 該抗體或抗原結合片段為人類化抗PACAP抗體或抗原結合片段片段，其特異性結合於人類PACAP上與選自Ab3.H、Ab4.H、Ab5.H、Ab9、Ab9.H及Ab12.H之抗PACAP抗體相同或重疊的線性或構形抗原決定基； b.) 該抗PACAP抗體或抗原結合實質上不與血管活性腸肽(「VIP」)相互作用(結合)； c.) 該抗體或抗原結合片段包含或引起以下效應之一：(i)抑制或中和由PACAP引起之至少一種生物效應；(ii)中和或抑制PAC1受體(「PAC1-R」)、血管活性腸肽1型受體(「VPAC1-R」)及/或血管活性腸肽2型受體(「VPAC2-R」)中至少一者之PACAP激活；(iii)中和或抑制PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者之PACAP激活；(iv)中和或抑制PAC1-R之PACAP激活；(v)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中至少一者；(vi)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R中每一者；(vii)能夠抑制PACAP結合於PAC1-R表現細胞；(viii)能夠抑制PACAP結合於細胞表面，例如經由GAG；(ix)不抑制PACAP介導之該抗體結合於細胞表面，例如經由GAG；(x)抑制PACAP誘導之cAMP產生；及/或(xi)當投與個體時減少PACAP誘導之血管擴張； d.) 該抗體或抗原結合片段適用於治療具有與增加之血管擴張、畏光、肥大細胞去顆粒及/或神經元激活有關之急性、偶爾發生或慢性病狀的人類個體； e.) 該抗PACAP抗體為人類抗體或其抗原結合片段；或該抗PACAP抗體為人類化抗體或其抗原結合片段；或該抗PACAP抗體為嵌合抗體或其抗原結合片段； f.) 該抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及/或VPAC2-R； g.) 該抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R、VPAC1-R及VPAC2-R中每一者； h.) 該抗PACAP抗體或其抗原結合片段結合於PACAP27及/或PACAP38且阻斷PACAP27及/或PACAP38結合於PAC1-R表現細胞； i.) 該抗體或其抗原結合片段與PACAP之親和力為該抗體或其抗原結合片段與VIP之親和力的至少10倍、30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍、10000倍、30000倍、100000倍、300000倍、1000000倍、3000000倍、10000000倍、30000000倍或更強； j.) 該個體具有選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、慢性偏頭痛、藥物過度使用頭痛、緊張性頭痛、普通頭痛、熱潮紅、畏光、慢性陣發性半側顱痛、歸因於頭部潛在結構問題之繼發性頭痛、歸因於頸部潛在結構問題之繼發性頭痛、腦神經痛、竇性頭痛、與竇炎有關之頭痛、過敏誘導之頭痛、過敏誘導之偏頭痛、三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、幻肢痛、纖維肌痛、反射性交感神經失養症、疼痛、慢性疼痛、發炎疼痛、術後切口疼痛、術後疼痛、創傷相關疼痛、下背痛、眼痛、牙痛、複雜性區域疼痛症候群、癌症疼痛、原發性或轉移性骨癌疼痛、骨折疼痛、骨質疏鬆性骨折疼痛、由燒傷引起之疼痛、痛風關節疼痛、與鐮狀細胞危象有關之疼痛、與顳頜關節病症有關之疼痛、硬化、肝炎、神經性疼痛、神經病變性疼痛、傷害感受性疼痛、內臟疼痛、痛經、卵巢痛、骨關節炎疼痛、類風濕性關節炎疼痛、糖尿病性神經病變、坐骨神經痛、消化不良、腸易激症候群、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、迴腸炎、潰瘍性結腸炎、腎絞痛、痛經、膀胱炎、間質性膀胱炎、月經期、分娩、停經、胰臟炎、精神分裂症、抑鬱症、創傷後壓力病症(「PTSD」)、焦慮症、自體免疫糖尿病、休格輪氏症候群(Sjögren’s syndrome)、多發性硬化、膀胱過動症、枝氣管高反應性、氣喘、中風、枝氣管炎、枝氣管擴張、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(「COPD」)、發炎性皮炎、腺組織腺癌、器官胚性組織胚細胞瘤、上皮組織癌瘤、形成血細胞之組織的白血病、淋巴組織淋巴瘤、骨髓之骨髓瘤、結締組織或支撐組織肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、類癌腫瘤、子宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞減少症、子宮內膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、頭部癌、頸部癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病、神經系統腫瘤、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌(stomach cancer)、睪丸癌、甲狀腺癌、尿道癌、骨髓癌、多發性骨髓瘤、轉移至骨骼之腫瘤、浸潤神經及空腔臟器之腫瘤、在神經結構附近之腫瘤、尋常性痤瘡、異位性皮炎、蕁麻疹、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及紅斑痤瘡、內皮功能障礙、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、冠心病(「CHD」)、冠狀動脈疾病(「CAD」)、心臟衰竭、外周動脈疾病(「PAD」)、糖尿病、肺性高血壓(「PH」)、結締組織病症、過敏性皮炎、牛皮癬、瘙癢、神經性皮膚發紅、紅斑、類肉瘤病、休克、敗血症、鴉片劑戒斷症候群、嗎啡耐受性及癲癇組成之群的病狀； k.) 該個體具有選自由偏頭痛、頭痛及疼痛相關疾病或病狀組成之群的病狀，視情況其中該頭痛或偏頭痛選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經痛、慢性頭痛、慢性偏頭痛、藥物過度使用頭痛及緊張性頭痛組成之群； l.) 該個體具有與畏光有關之眼部病症，其選自由色盲、無虹膜畸形、由抗膽鹼藥物引起之畏光、無晶狀體、牛眼症、白內障、視錐細胞營養不良、眼睛先天異常、病毒性結膜炎、角膜擦破、角膜營養不良、角膜潰瘍、角膜上皮破裂、晶狀體異位、眼內炎、由疾病引起之眼睛創傷、由損傷引起之眼睛創傷、由感染引起之眼睛創傷、瞼板腺囊腫、鞏膜外層炎、青光眼、圓錐形角膜、視神經發育不全、水眼、先天性青光眼虹膜炎、視神經炎、色素分散症候群、瞳孔擴大、視網膜脫落、角膜、鞏膜瘢痕形成及葡萄膜炎組成之群； m.) 該個體具有與畏光有關之神經系統相關或神經病狀，其選自由泛自閉症障礙、希阿里畸形(Chiari malformation)、誦讀困難、腦炎、腦膜炎、蛛網膜下出血、後面顱窩腫瘤、僵直性脊椎炎、白化病、核黃素缺乏病、苯二氮平類、化學療法、屈公病(chikungunya)、胱胺酸病、艾登二氏症候群(Ehlers-Danlos syndrome)、宿醉、流行性感冒、傳染性單核白血球增多症、缺鎂症、汞中毒、偏頭痛、狂犬病及II型酪胺酸血症組成之群； n.) 該個體具有畏光相關病症，其選自由具有先兆之偏頭痛、不具有先兆之偏頭痛、虹膜炎、葡萄膜炎、腦膜炎、抑鬱症、躁鬱症、叢集性頭痛或另一種三叉自律神經性頭痛(「TAC」)或瞼痙攣、抑鬱症、曠野恐怖及躁鬱症組成之群；及/或 o.) 該抗體為人類、人類化或嵌合抗PACAP抗體或其抗原結合片段。
  44. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中： a.) 該抗體或抗原結合片段特異性結合於人類PACAP上與Ab9或Ab9.H相同或重疊之線性或構形抗原決定基，視情況其中該抗體或抗原結合片段與人類PACAP之殘基7、10、12、13、14及17中的至少1者、2者、3者、4者、5者或全部6者相互作用； b.) 該抗體或抗原結合片段包含Ab3.H之重鏈CDR2，視情況其中該抗體或抗原結合片段包含Ab3.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR； c.) 該抗體或抗原結合片段包含Ab5.H之重鏈CDR2，視情況其中該抗體或抗原結合片段包含Ab5.H之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或全部6個CDR。
  45. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗體為人類、人類化或嵌合抗人類PACAP抗體或抗體片段，其包含：可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 804組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 806組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 808組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 824組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 826組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 828組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 802具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 822具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 802之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 822之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 801具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 821具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 801之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 821之輕鏈。
  46. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1124組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1126組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1128組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1144組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1146組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1148組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1122具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1142具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1122之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1142之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1121具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1141具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1121之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1141之輕鏈。
  47. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 1082具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1084組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1086組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1088組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 1102具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1104組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1106組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1108組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1082之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1102之可變輕鏈； b.) (i)包含與SEQ ID NO: 1081具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1101具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 c.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1081之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1101之輕鏈。
  48. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1004組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1006組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1008組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1024組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1026組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1028組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1002具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1022具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1002之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1022之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1001具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1021具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1001之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1021之輕鏈。
  49. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含由SEQ ID NO: 1164組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1166組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1168組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含由SEQ ID NO: 1184組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1186組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1188組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)包含與SEQ ID NO: 1162具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1182具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的可變輕鏈； b.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1162之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1182之可變輕鏈； c.) (i)包含與SEQ ID NO: 1161具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(ii)包含與SEQ ID NO: 1181具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 d.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1161之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1181之輕鏈。
  50. 如申請專利範圍第35項至第43項中任一項之方法，其中該抗PACAP抗體或其抗原結合片段包含：(a)可變重鏈，該可變重鏈包含與SEQ ID NO: 1042具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1044組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1046組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1048組成之CDR3序列；及/或(b)可變輕鏈，該可變輕鏈包含與SEQ ID NO: 1062具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列且包含由SEQ ID NO: 1064組成之CDR1序列；由SEQ ID NO: 1066組成之CDR2序列；及由SEQ ID NO: 1068組成之CDR3序列，視情況其中該抗體包含： a.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1042之可變重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1062之可變輕鏈； b.) (i)包含與SEQ ID NO: 1041具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈，及/或(b)包含與SEQ ID NO: 1061具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈；或 c.) (i)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1041之重鏈，及/或(ii)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1061之輕鏈。
  51. 如申請專利範圍第35項至第50項中任一項之方法，其中由該抗體結合之抗原決定基藉由丙胺酸掃描來鑑別，例如如本文中實例12所揭示。
  52. 如申請專利範圍第35項至第51項中任一項之方法，其中： a.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段選自由scFv、駱駝抗體、奈米抗體、免疫球蛋白新抗原受體(「IgNAR」)、片段抗原結合(「Fab」)片段、Fab'片段、MetMab樣抗體、單價抗原結合片段及F(ab’)2 片段組成之群； b.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段實質上或完全缺乏N-糖基化及/或O-糖基化； c.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段包含人類恆定域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體； d.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段包含已經修飾以改變效應子功能、半衰期、蛋白水解或糖基化中至少一者之Fc區，及/或該Fc區包含SEQ ID NO:1244、1245或1246中任一者之序列，視情況其中該Fc區含有一或多種改變或消除N-及/或O-糖基化之突變； e.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 5 M、10﹣ 5 M、5×10﹣ 6 M、10﹣ 6 M、5×10﹣ 7 M、10﹣ 7 M、5×10﹣ 8 M、10﹣ 8 M、5×10﹣ 9 M、10﹣ 9 M、5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M、10﹣ 12 M、5×10﹣ 13 M或10﹣ 13 M之結合親和力(KD )結合於PACAP，例如，如藉由ELISA、生物層干涉術(「BLI」)、KINEXA或表面電漿共振在25℃或37℃下所測定； f.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段以小於或等於5×10﹣ 10 M、10﹣ 10 M、5×10﹣ 11 M、10﹣ 11 M、5×10﹣ 12 M或10﹣ 12 M之結合親和力(KD )結合於PACAP及/或以小於或等於5×10﹣ 4 s﹣ 1 、10﹣ 4 s﹣ 1 、5×10﹣ 5 s﹣ 1 或10﹣ 5 s﹣ 1 之解離速率(kd )結合於PACAP； g.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段直接地或間接地連接於可偵測標記或治療劑； h.) 該抗PACAP抗體或抗原結合片段以小於約100 nM、小於約40 nM、小於約1 nM、小於約100 pM、小於約50 pM或小於約25 pM之KD 或在約10 pM與約100 pM之間之KD 結合於PACAP； i.) 該方法進一步包含分別地投與或共投與另一試劑，例如化學治療劑、止痛劑、消炎劑、免疫抑制劑、細胞因子、抗增殖劑、止吐劑、細胞毒素、止痛劑，視情況其中該止痛劑為非類固醇消炎藥(「NSAID」)、類阿片止痛劑、另一抗體或非抗體生物製劑，例如抗NGF抗體或抗原結合片段或抗抑鈣素基因相關肽(「CGRP」)抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段，且進一步視情況其中該NSAID為環加氧酶1及/或環加氧酶2抑制劑或選自由(1)丙酸衍生物，包括伊布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen/naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)及酮洛芬(ketoprofen)；(2)乙酸衍生物，包括妥美丁(tolmetin)及舒林酸(sulindac)；(3)芬那酸衍生物，包括甲芬那酸(mefenamic acid)及甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；(4)聯苯基甲酸衍生物，包括二氟尼柳(diflunisal)及氟苯柳(flufenisal)；及(5)昔康類，包括吡羅昔康(piroxim)、舒多昔康(sudoxicam)及伊索昔康(isoxicam)組成之群或為選自由可待因(codeine)、二氫可待因、二乙醯基嗎啡、氫可酮(hydrocodone)、氫嗎啡酮(hydromorphone)、左啡諾(levorphanol)、氧化嗎啡酮(oxymorphone)、阿芬太尼(alfentanil)、布諾啡(buprenorphine)、布托啡諾(butorphanol)、芬太奴(fentanyl)、舒芬太尼(sufentanil)、得美樂(meperidine)、美沙酮(methadone)、納布啡(nalbuphine)、丙氧芬(propoxyphene)、鎮痛新(pentazocine)及其醫藥學上可接受之鹽組成之群的類阿片止痛劑，較佳地嗎啡或嗎啡衍生物或其醫藥學上可接受之鹽，或其中該類阿片止痛劑及該PACAP抗體或抗原結合片段之組合投與如與單獨投與之該類阿片止痛劑或該PACAP抗體或抗原結合片段相比增加止痛效應； j.) 該抗體或抗原結合片段連接於至少一種效應子或官能部分及/或一或多種可偵測部分，例如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質、化學發光部分或其混合物；及/或 k.) 該個體先前已接受抗CGRP抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段及/或為未適當地回應於抗CGRP抗體及/或抗CGRP受體抗體治療之偏頭痛患者及/或已引起對先前投與之抗CGRP抗體或抗體片段及/或抗CGRP受體抗體或抗體片段之免疫反應。
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