KR20130110169A - 담체 면역글로뷸린 및 이것의 용도 - Google Patents

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케네쓰 더블유. 워커
타루나 아로라
프레드릭 더블유. 제이콥센
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암젠 인크
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Abstract

분리된 면역글로뷸린이 개시된다. 또한 그것의 제조방법에 유용한 면역글로뷸린, 분리된 핵산, 그것을 암호화하는 핵산, 벡터, 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 의약이 개시된다. 일부 실시형태에서, 면역글로뷸린은 그것에 컨쥬게이트된 1 내지 24개의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티, 예컨대 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드를 포함한다.

Description

담체 면역글로뷸린 및 이것의 용도{CARRIER IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF}
본 출원은 2010년 9월 22일 출원된 미국 가특허출원 제61/385,460호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
본 출원은 2011년 9월 22일 상에 EFS-WEB을 통해 제출된 서열 목록에 따르는 ASCII "txt"를 포함하며, 이는 컴퓨터 판독가능한 형태(computer readable form, CRF)와 37 C.F.R. Section 1.821(c) 및 1.821(e)에 의해 필요한 서류사본으로서 작용하며, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다. 2011년 9월 22일 만들어진 "txt" 파일명은: A-1536-WO-PCTSeqList092211_ST25.txt이며, 용량은 501 kb이다.
본 출원을 통해 다양한 간행물이 삽입어구 또는 괄호 내에 언급된다. 전문에서 이들 간행물의 개시는 본 발명이 속하는 기술분야를 더 완전히 설명하기 위하여 본 출원에서 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 하나 이상의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티(chemical moiety)가 개선된 약력학적 특징을 위해 컨쥬게이트될 수 있는 면역글로뷸린에 관한 것이다.
"담체" 모이어티는 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티, 예컨대 비-펩타이드 유기 모이어티(즉, "소분자") 또는 폴리펩타이드제(예를 들어, 본 발명의 면역글로뷸린)가 공유적으로 컨쥬게이트되거나 또는 융합될 수 있는 약리학적으로 불활성인 분자를 지칭한다. 효과적인 담체는 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티의 단백질 분해 또는 다른 생체내 활성 감소 화학 변형에 의해 약리학적으로 활성인 모이어티의 생체내 분해를 방지하거나 또는 완화시키거나, 또는 신장 청소율(clearance)을 감소시키고, 약리학적으로 활성인 모이어티의 비컨쥬게이트된 형태와 비교하여 생체나 반감기 또는 치료제의 다른 약력학적 특성을 향상시키며, 예컨대 흡수율을 증가시키며, 독성 또는 면역원성을 감소시키고, 용해도를 개선시키며/시키거나 제조능력 또는 저장 안정성을 증가시키도록 추구되었다.
약제 산업에서 사용된 이러한 담체 모이어티의 예는 폴리에틸렌 글라이콜(예를 들어, Burg 등의 WO 01/02017 참조(발명의 명칭: Erythropoietin conjugates with polyethylene glycol)), 면역글로뷸린 Fc 도메인(예를 들어 Feige 등의 미국 특허 제6,660,843호를 참조(발명의 명칭: Modified peptides as therapeutic agents)), 인간 혈청 알부민(예를 들어, Rosen 등의 미국 특허 제6,926,898호 및 미국 특허 2005/0054051(발명의 명칭: Albumin fusion proteins) 및 Bridon 등의 미국 특허 제6,887,470호(발명의 명칭: Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components), 트랜스티레틴(예를 들어, Walker 등의 미국 특허 2003/0195154 A1; 2003/0191056 A1(발명의 명칭: Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins)) 또는, 예를 들어 Sullivan 등의 WO 2008/088422로서 공개된 PCT/US2007/022831(발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents)에 기재된 바와 같은 티록신-결합 글로뷸린, 또는 면역글로뷸린(경쇄+중쇄) 및 Fc 도메인("헤미바디(hemibody)"로 불리는 헤테로트라이머 조합)과 같은 조합을 포함한다. 약리학적으로 활성인 모이어티는 또한 긴 반감기의 혈청 단백질에 대해 친화도를 갖는 펩타이드 또는 소분자에 컨쥬게이트되었다. (예를 들어, Blaney 등의 미국 특허 제5,714,142호(발명의 명칭: Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands); Sato 등의 미국 특허 2003/0069395 A1(발명의 명칭: Serum albumin binding moieties); Jones 등의 미국 특허 제6,342,225호(발명의 명칭: Pharmaceutical active conjugates)).
Fischer 등은 펩타이드-면역글로뷸린-컨쥬게이트를 기재하며, 이때 면역글로뷸린은 2개의 중쇄 또는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어지고, 여기서 면역글로뷸린은 작용가능한 면역글로뷸린이 아니다(Fischer 등의 WO 2007/045463 A1(발명의 명칭: A peptide-immunoglobulin conjugate)).
본 발명은 예외적인 재조합 발현의 균일성 및 효율성, 시험관내 안정성 및 비응집, 광분해 및 산화에 대한 저항성, 인간 항원과 비-교차 반응성 및 양호한 약력학적 특성을 수득하는 면역글로뷸린을 제공한다.
본 발명은 담체 모이어티로서 유용한 면역글로뷸린에 관한 것이다. 항체 및 항체 단편을 포함하는 이들 면역글로뷸린은 안정하고 상대적으로 균일한 생성물을 야기하며, 래트 및 사이노몰구스 원숭이에서 뛰어난 약력학적(pharmacokinetic: PK) 특성을 가진다. 본 발명의 면역글로뷸린은 인간 단백질, 세포 또는 조직에 결합한 것이 검출되지 않았다. 이들 면역글로뷸린은 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항체-기반 약물에 대한 품질 대조군 또는 분석 표준을 포함하는 다수의 목적을 위해 및 생물학적으로 적절한 아이소타입-매치된 항체에 대한 대조군으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린을 포함하되,
중쇄 가변 영역은 서열번호 323[VH10]의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188[VL4] 또는 서열번호 190[VL5]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 321[VH9]의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188[VL4] 또는 서열번호 190[VL5]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 325[VH11]의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 182[VL1], 서열번호 188[VL4], 또는 서열번호 190[VL5]의 아미노산 서열을 포함한다.
예는 표 2C에 개시된 항체 # 16435, 16436, 16438, 16439, 16440, 16441 및16444을 포함한다. 전형적으로, 30 마이크로몰 농도의 본 발명의 면역글로뷸린은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션된 수용액 중 30 나노몰 농도의 가용성 인간 IL-17R(서열번호 89)에 유의하게 결합되지 않는다.
본 발명의 다른 실시형태는 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린을 포함하되,
경쇄 가변 영역은 서열번호 196[VL8]의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335[VH16], 서열번호 349[VH23], 서열번호 351[VH24], 서열번호 353[VH25], 서열번호 355[VH26], 또는 서열번호 359[VH28]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 204[VL12]의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 349[VH23] 또는 서열번호 355[VH26]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 202[VL11]의 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 349[VH23]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 192[VL6]의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 357[VH27], 서열번호 359[VH28], 또는 서열번호 369[VH33]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 194[VL7]의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335[VH16], 서열번호 349[VH23], 또는 서열번호 351[VH24]의 아미노산 서열을 포함한다.
예는 표 2C에 개시된 항체 #1961, 1962, 1963, 1964, 1965, 1966, 2323, 2324 2330, 4241, 4341, 10182, 10183, 10184 및 10188을 포함한다. 전형적으로, 10마이크로몰 농도의 본 발명의 면역글로뷸린은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션된 수용액 중 10 나노몰 농도의 가용성 인간 TR2(서열번호 82)에 유의하게 결합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 면역글로뷸린은 그것의 PK 특성을 향상시키기 위하여 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티, 예를 들어 소분자, 펩타이드 및/또는 단백질에 대한 담체로서 사용된다. 약리학적으로 활성인 모이어티는 컨쥬게이트될 수 있으며, 즉 화학적 컨쥬게이션 반응에 의해 또는 재조합 유전적 발현을 통해 본 발명의 면역글로뷸린에 공유적으로 결합될 수 있고, 그것들은 면역글로뷸린에 융합될 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 본 발명의 면역글로로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산, 벡터 및 분리된 숙주 세포를 포함하는 본 발명의 면역글로뷸린을 생성하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 또한 면역글로뷸린 중쇄 및/또는 경쇄 서열 및/또는 VH 및/또는 VL 서열 중 어떤 것을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 관련된 실시형태에서, 앞서 언급된 핵산 중 어떤 것을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 앞서 언급된 핵산 또는 발현 벡터 중 어떤 것을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 면역글로뷸린은 약제학적 조성물 또는 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 또는 의약은 약리학적 활성제와 컨쥬게이트된 면역글로뷸린 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다.
수많은 방법이 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 암호화된 면역글로뷸린이 발현되도록 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 앞서 언급된 숙주 세포를 배양시키는 단계를 수반하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 또한 숙주 세포 배양물로부터 면역글로뷸린을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 관련된 실시형태에서, 앞서 언급된 방법에 의해 생성된 분리된 면역글로뷸린이 제공된다.
앞서 언급한 개요는 본 발명의 모든 양태를 정의하는 것으로 의도되지 않으며, 추가적인 양태가 다른 부문, 예컨대, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 기재되어 있다. 전체 내용은 통일된 개시로서 관련되는 것으로 의도되며, 특징의 조합이 본 문헌의 동일 문장 또는 단락 또는 부문에서 함께 발견되지 않았다 해도, 본 명세서에 기재된 모든 특징의 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
앞서 언급한 것에 추가로, 본 발명은 추가적인 양태로서, 상기 구체적 단락에 의해 정의된 변형보다 임의의 방법의 범주에서 더 좁은 본 발명의 모든 실시형태를 포함한다. 예를 들어 속으로서 기재되는 본 발명의 특정 양태 및 속의 모든 구성원은 개별적으로 본 발명의 양태인 것이 이해되어야 한다. 또한 속으로서 기재되거나 또는 속의 구성원을 선택하는 양태는 해당 속의 2 이상의 구성원의 조합을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원인(들)은 본 명세서에 기재된 본 발명의 전체 범주를 발명하였지만, 본 출원인이 다른 선행기술 작업에 기재된 대상을 주장하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 특허청구범위 범주 내에서 법에 명시된 선행기술은 특허청 또는 다른 독립체 또는 개인에 의해 본 출원인의 의도로 이끄는 사건에서, 본 출원인(들)은 이러한 제정법에 따르는 선행기술 또는 이러한 특허청구범위의 범주로부터 제정법에 따르는 선행기술의 분명한 변형을 특이적으로 제외하는 이러한 특허청구범위의 대상을 다시 정하기 위하여 적용가능한 특허법 하에서 보정 권리를 행사하는 권리를 보유한다. 이러한 보정된 특허청구범위에 의해 정해진 본 발명의 변형은 또한 본 발명의 양태로서 의도된다.
도 1a 내지 도 1n은 제한되는 것은 아니지만, 면역글로뷸린의 하나 이상의 도메인과 함께 본 명세서에 기재된 L5 또는 L10과 같은 선택적 펩티딜 링커 모이어티를 통해 융합된 약리학적 활성 독소 펩타이드 유사체(구불구불한 선)의 하나 이상의 단위를 포함하는 본 발명의 조성물의 일부 실시형태의 개략도를 도시한 도면. 이들 개략도는 그것들이 IgG2에 대해서도 적용되는 것으로 의도되지만, 더 많은 전형적인 IgG1을 나타내는데, 이는 중쇄 및 경쇄, 및 IgG3 및 IgG4를 연결하는 이황화 결합의 힌지 및 상이한 배열에서 4개의 이황화 결합을 가질 것이다. 도 1a는 면역글로뷸린 Fc 도메인 모노머 중 하나의 C-말단에 융합된 독소 펩타이드 유사체와 1가의 헤테로다이머 Fc-독소 펩타이드 유사체 융합을 나타낸다. 도 1b는 면역글로뷸린 Fc 도메인 모노머 둘 다의 C-말단에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 2가의 호모다이머 Fc-독소 펩타이드를 나타낸다. 도 1c는 면역글로뷸린 Fc 도메인 모노머 중 하나의 N-말단에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 1가의 헤테로다이머 독소 펩타이드 유사체-Fc를 나타낸다. 도 1d는 면역글로뷸린 Fc 도메인 모노머 둘 다의 N-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 2가의 호모다이머 독소 펩타이드 유사체-Fc 융합을 나타낸다. 도 1e는 면역글로뷸린 중쇄(HC) + 면역글로뷸린 경쇄(LC) + C-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 면역글로뷸린 Fc 모노머를 포함하는 1가의 헤테로트라이머 Fc-독소 펩타이드 유사체/Ab를 나타낸다. 도 1f는 HC 모노머 중 하나의 C-말단에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 1가의 헤테로테트라머(HT) 항체 HC-독소 펩타이드 유사체 융합을 나타낸다. 도 1g는 HC 모노머 둘 다의 C-말단 단부 상에 독소 펩타이드 유사체를 갖는 2가의 HT 항체 Ab HC-독소 펩타이드 유사체를 나타낸다. 도 1h는 LC 모노머 중 하나의 N-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 1가의 HT 독소 펩타이드 유사체-LC Ab를 나타낸다. 도 1i는 HC 모노머 중 하나의 N-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 1가의 HT 독소 펩타이드 유사체-HC Ab를 나타낸다. 도 1j는 LC 모노머 중 하나의 C-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 1가의 HT Ab LC-독소 펩타이드 유사체 융합(즉, LC-독소 펩타이드 유사체 융합 + LC + 2(HC))을 나타낸다. 도 1k는 LC 모노머 둘 다의 C-말단 단부에 융합된 독소 펩타이드 유사체를 갖는 2가의 HT Ab LC-독소 펩타이드 유사체 융합(즉, 2(LC-독소 펩타이드 유사체 융합) + 2(HC))을 나타낸다. 도 1l은 LC 모노머 둘 다와 HC 모노머 중 하나의 C-말단에 융합된 독소 펩타이드 유사체와 함께 3가의 HT Ab LC-독소 펩타이드 유사체/HC-독소 펩타이드 유사체(즉, 2(LC-독소 펩타이드 유사체 융합) + HC-독소 펩타이드 유사체 융합 + HC)를 나타낸다. 도 1m은 각각의 HC 모노머의 면역글로뷸린 Fc 도메인의 내부 루프 내로 삽입된 독소 펩타이드 유사체 모이어티를 갖는 2가의 항체를 나타낸다. 도 1n은 HC 모노머 중 하나의 면역글로뷸린 Fc 도메인의 내부 루프 내로 삽입된 독소 펩타이드 유사체 모이어티를 갖는 1가의 항체를 나타낸다. 다이머 또는 트라이머는 단일 쇄를 암호화하는 데옥시리보핵산(DNA) 구성체의 발현 시 특정 숙주 세포에서 자발적으로 형성될 것이다. 다른 숙주 세포에서, 세포는 다이머/트라이머의 형성이 바람직한 조건에서 대체될 수 있거나 또는 다이머/트라이머가 시험관내에서 형성될 수 있다. 하나 이상의 HC 모노머, LC 모노머 또는 면역글로뷸린 Fc 도메인 모노머가 단일 실시형태의 부분이라면, 개개의 모노머는 원한다면 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
도 2a 내지 도 2b는 본 발명의 항체 실시형태에 의해 IL17R에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16429는 CM5 센서 칩에 고정되었으며, 항체의 부재에서 10nM의 IL-17R은 용액 내 항체 결합이 없는 IL-17의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용되었다. 도 2a에서, 10nM, 100nM 및 1000nM의 표시된 항체 샘플은 10nM IL-17R과 함께 인큐베이션되어 용액 내 항체 결합을 결정하였다. 도 2b에서, 30,000nM의 항체 샘플을 30nM IL-17R과 함께 인큐베이션시켜 용액 내 항체 결합을 결정하였다. 도 2a 내지 도 2b에서, 항체 인큐베이션 후 IL-17R의 감소된 결합 신호는 용액 내 IL-17R에 항체 결합을 표시한다.
도 3은 5 ng/㎖ IL-17 및 0.1μM, 1μM 및 10μM의 표시된 항체 샘플과 함께 인큐베이션시킨 인간 포피 섬유아세포에 의한 GRO-α의 상대적 생성을 도시한 도면. 그 다음에 GRO-α 샌드위치 ELISA를 사용하여 GRO-α 수준에 대해 조정 세포 배지가 평가되었다.
도 4a는 2개의 크기 배제 칼럼으로부터 연속해서(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541) 항체(상부 내지 하부 패널): 16435, 16436, 16439, 16440, 16441 및 16444의 0.5 ㎖/분에서 유동된 pH 6.8 이동상에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl에 의한 대표적인 용리를 도시한 도면.
도 4b는 항체(상부 내지 하부 패널): 16435, 16436, 16439, 16440, 16441 및 16444의 상기 도 4a에서 나타낸 크기 배제 분석의 줌 분석을 도시한 도면.
도 5는 비-환원 로딩 완충제 및 QuickBlue(Boston Biologicals)에 의한 염색을 사용하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4 내지 20% SDS-PAGE(Novex) 상의 항체 16435, 16436, 16437, 16438, 16439, 16440, 16429, 16430, 16433, 16434, 16441 및 16444의 2㎍의 비-환원 분석을 도시한 도면. 분자량 마커는 Novex SeeBlue(등록상표) 사전 염색 표준이다.
도 6은 비-환원 로딩 완충제 및 QuickBlue(Boston Biologicals)에 의한 염색을 사용하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4 내지 20% SDS-PAGE(Novex) 상의 항체 16435, 16436, 16437, 16438, 16439, 16440, 16429, 16430, 16433, 16434, 16441 및 16444의 2㎍의 환원 분석을 도시한 도면. 분자량 마커는 Novex SeeBlue(등록상표) 사전 염색 표준이다.
도 7a 내지 도 7b는 각각 항체 16435 및 16444에 대한 역가를 도시한 도면. 풀(pool)을 발현시키는 것은 대응하는 HC 및 LC 발현 플라스미드로 CHO DHFR(-) 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 만들어졌다. 소규모(5-㎖; 도 7a) 발현 실행을 CD 6-D 분석 배지 내 6-일 프런트 로드(front-loaded) 과정을 사용하여 수행한 한편, 대규모(3-ℓ; 도 7b) 실행을 펩톤 배지에 의한 11-일 공급-배치(batch) 과정을 사용하여 완료하였다. 단백질 A HPLC 기반 분석을 사용하여 역가 수준을 측정하였다.
도 8a 내지 도 8b는 300㎚에서 흡광도를 측정하여 7℃에서 50% S-완충제 B(20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0)로 20 칼럼 부피 구배를 사용하여 SP-HP 세파로스 칼럼(GE Life Sciences)으로부터 용리된 항체 16435 (도 8a) 및 16444(도 8b)의 크로마토그램을 도시한 도면.
도 9a 내지 도 9b는 QuickBlue(Boston Biologicals)로 220V 염색에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상의 16435(도 9a) 및 16444(도 9b) 항체의 분석을 도시한 도면. "비환원(NR)" 표시된 레인은 비-환원 샘플 완충제를 함유한 반면, "환원(Red.)" 표시된 레인은 환원성 샘플 완충제를 함유하였다.
도 10은 2개의 크기 배제 칼럼을 사용하여 연속해서(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541) 항체: 16435 및 16444의 0.5 ㎖/분에서 유동된 pH 6.8 이동상에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl에 의한 줌 크기 배제 분석을 도시한 도면.
도 11은 샘플이 분 당 1℃의 속도로 20℃ 내지 95℃로 가열된 경우 MicroCal VP-DSC을 사용하는 DSC에 의해 항체: IgG2 단클론성 항체 비교기, 16444, 및 16435의 분석을 도시한 도면. 단백질 농도는 10mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0에서 0.5㎎/㎖였다.
도 12A 내지 도 12D는 220㎚에서 흡광도의 검출과 함께 CE-SDS를 환원(도 12A 내지 도 12B) 및 비-환원(도 12C 내지 도 12D)시키는 것에 의해 16435(도 12A 내지 도 12B) 및 16444(도 12C 내지 도 12D) 항체의 분석을 도시한 도면. 분리 분석을 위해 용융 실리카 모세관 50㎛×30.2㎝를 사용하였다.
도 13은 2개의 크기 배제 칼럼으로부터 연속해서(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541) 0.5 ㎖/분에서 유동된 pH 6.8 이동 상에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl에 의해 용리된, 실온에서 알루미늄 호일로 덮인("암"(dark)) 또는 형광("명"(light))에 노출된 3일 후 항체 16435 및 16444의 크기 배제 분석을 도시한 도면.
도 14A 내지 도 14D는 2개의 Dionex ProPac HIC-10 칼럼을 연속해서 사용하여, 이동상 A가 1M 황산암모늄, 20mM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 되고, 이동상 B가 20mM 아세트산나트륨, 5% 아세토나이트릴, pH 5.0이 되는, 실온에서 알루미늄 호일로 덮인("암", 도 14A 및 도 14B) 또는 형광("명", 도 14C 및 도 14D)에 노출된 3일 후 16435(도 14A 및 도 14C) 및 16444(도 14B 및 도 14D) 항체의 HIC 분석을 도시한 도면. 샘플을 220㎚에서 흡광도를 측정하여 50분에 걸쳐 0 내지 100% 선형 구배로 0.8 ㎖/분에서 용리시켰다.
도 15는 TRAIL(huTR2)에 항체의 결합을 도시한 도면. 항체 16449를 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재하에 1nM의 TRAIL를 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL 의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여 항체 샘플의 7pM 내지 10nM를 1nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 16은 본 발명의 항체 실시형태에 의한 TRAIL(huTR2)에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16449를 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재에서 10nM의 TRAIL을 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 항체 샘플의 50 및 1000nM를 10nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 17은 본 발명의 항체 실시형태에 의한 TRAIL(huTR2)에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16449는 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재에서 10nM의 TRAIL을 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 1000nM의 항체 샘플을 10nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 18은 y-축 상에 열거된 본 발명의 항체 실시형태에 의한 TRAIL(huTR2)에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16449는 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재에서 10nM의 TRAIL을 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 항체 샘플의 1000 및 10000nM을 10nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 19는 x-축 상에 열거된 본 발명의 항체 실시형태에 의한 TRAIL(huTR2)에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16449를 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재에서 10nM의 TRAIL을 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 항체 샘플의 50000nM를 10nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 20a 내지 도 20b는 x-축 상에 열거된 본 발명의 항체 실시형태에 의한 TRAIL(huTR2)에 비-결합을 도시한 도면. 항체 16449를 CM5 센서 칩에 고정시켰고, 항체의 부재에서 10nM의 TRAIL을 용액 내 항체 결합이 없는 TRAIL의 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 항체 샘플의 1000, 10000 및 50000nM을 10nM TRAIL과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TRAIL의 감소된 결합 신호는 용액 내 TRAIL에 항체의 결합을 표시한다.
도 20c는 시험관내 세포-기반 TRAIL 활성 분석으로부터의 결과를 도시한 도면. 항체 4241 및 4341의 샘플을 양성 대조군 IgG1 항-TR2 mAb 16449과 비교하였다. 제조한 항체 샘플을 TRAIL-민감성 인간 복수 결장직장 선암 세포주 Colo205에 첨가하였다. 상대적 발광의 증가를 측정함으로써 TRAIL-매개 카스파제-3 활성화의 검출을 아포토시스(apoptosis)에 대한 양성 마커로서 사용하였다. 항체 4241 및 4341은 양성 대조군 항체 16449와 달리 카스파제-3을 활성화시키지 못하였다.
도 21a는 비-환원 로딩 완충제를 사용하고, QuickBlue(Boston Biologicals)로 염색하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4 내지 20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 항체 1870 [aka 16451], 16449, 16450, 10185, 10184, 4341, 10183 및 10182의 2㎍의 비-환원 분석을 도시한 도면. 분자량 마커는 Novex SeeBlue 사전-염색 표준이다. 분자량 마커는 Novex SeeBlue(등록상표) 사전-염색 표준이다.
도 21b는 비-환원 로딩 완충제를 사용하고, QuickBlue(Boston Biologicals)로 염색하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4 내지 20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 항체 1870[aka16451], 16449,16450, 10185, 10184, 4341, 10183 및 10182의 2㎍의 환원 분석을 도시한 도면. 분자량 마커는 Novex SeeBlue(등록상표) 사전 염색 표준이다.
도 22A 내지 도 22F는 280㎚에서 흡광도를 측정하여 1㎖/분에서 50mM NaH2PO4, 250mM NaCl 및 pH 6.9에서 Phenomenex BioSep SEC-3000 칼럼(7.8×300 ㎜)에 주입된 항체 4241(도 22A), 4341(도 22B), 10182(도 22C), 10183(도 22D), 10184(도 22E) 및 10185(도 22F)의 50㎍ 상의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 도면.
도 23A 내지 도 23B는 각각 항체 4241 및 4341에 대한 역가를 도시한 도면. 풀을 발현시키는 것은 대응하는 HC 및 LC 발현 플라스미드로 CHO DHFR(-) 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 만들어졌다. 소규모(5-㎖; 도 23A) 발현 실행을 CD 6-D 분석 배지에서 6-일 프런트-로드 과정을 사용하여 수행한 한편, 대규모(3-ℓ; 도 23B) 실행을 펩톤 배지에 의한 11-일 공급-배치 과정을 사용하여 완료하였다. 단백질 A HPLC 기반 분석을 사용하여 역가 수준을 측정하였다.
도 24a 내지 도 24b는 비환원 로딩 완충제를 사용하고 QuickBlue(Boston Biologicals)로 염색하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 항체 4241(도 24a) 및 4341(도 24b)에 대한 과정 샘플의 환원성 분석을 도시한 도면.
도 25는 300㎚에서 흡광도를 관찰하여 7℃에서 50% S-완충제 B(20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0)에 대해 20 칼럼 부피 구배를 사용하여 용리시킨 SP-HP 세파로스 칼럼(GE Life Sciences) 상의 항체 4341 및 4241의 크로마토그램의 오버레이를 도시한 도면.
도 26a 내지 도 26b는 QuickBlue(Boston Biologicals)로 염색하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상의 4241(도 26a) 및 4341(도 26b) 항체의 분석을 도시한 도면. "비환원(NR)" 표시한 레인은 비-환원 샘플 완충제를 함유한 반면, "환원(Red.)" 표시한 레인은 환원 샘플 완충제를 함유하였다.
도 27A 내지 도 27B는 항체 4241(상부 패널) 및 4341(하부 패널)의 0.5 ㎖/분에서 유동된 pH 6.8 이동상에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl과 함께 연속해서 2개의 크기 배제 칼럼(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541)을 사용하는 전체 규모(도 27A) 및 줌(도 27B)을 도시한 도면.
도 28은 MicroCal VP-DSC를 사용하여 DSC에 의해 항체 4341 및 4241의 분석을 도시한 도면, 샘플은 분 당 1℃의 속도로 20℃ 내지 95℃로 가열된다. 단백질 농도는 10mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0 중에서 0.5㎎/㎖였다.
도 29A 내지 도 29D는 220㎚에서 흡광도의 검출과 함께 환원(도 29A 및 도 29C) 및 비-환원(도 29B 및 도 29D)에 의한 4241(도 29A 내지 도 29B) 및 4341(도 29C 내지 도 29D) 항체의 분석을 도시한 도면. 분리 분석을 위해 용융 실리카 모세관 50㎛×30.2㎝를 사용하였다.
도 30은 완충제 A로서 20mM 아세트산, pH 5.0을 사용하고, 0 내지 40% 완충제 B로부터의 80분 선형 구배로 1 ㎖/분에서 유동된 완충제 B로서 20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0을 사용하여 이온 교환 HPLC(SP-5PW, 10㎛ 입자, 7.5㎜ ID×7.5㎝, TosohBioscience, 08541)를 사용하는 4241(상부 패널) 및 4341(하부 패널) 항체의 분석을 도시한 도면.
도 31a 내지 도 31b는 이동상 A는 1M 황산암모늄, 20mM 아세트산나트륨, pH 5.0이고 이동상 B는 20mM 아세트산나트륨, 5% 아세토나이트릴, pH 5.0인 연속으로 2개의 Dionex ProPac HIC-10 칼럼을 사용하여 광 노출 전 및 광 노출 후 4241(도 31a) 및 4341(도 31b) 항체의 HIC 분석을 도시한 도면. 샘플을 220㎚에서 흡광도를 관찰하여 50분에 걸쳐 0 내지 100% 선형 구배로 0.8 ㎖/분에서 용리시켰다.
도 32는 옆 꼬리 정맥으로부터 투약 후 0, 0.25, 1, 4, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504, 672, 840 및 1008 시간에 피하로 5㎎/㎏을 주사하고 혈액을 수집함으로써 성체 스프레그-돌리 래트(8주령 내지 12주령)에서 결정되는 바와 같은 16435, 16444, 4241 및 4341 항체의 대표적인 약력학적 프로파일을 도시한 도면.
도 33은 1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏ 중 하나로 1회 IV 용량을 사용하여 수컷 사이노몰구스 원숭이에서 결정한 바와 같은 16435 항체의 대표적인 약력학적 프로파일을 도시한 도면. 혈청 샘플을 투약 전 수집하였고, 투여 후 0.25, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 360, 408, 456, 504, 552, 600, 648 및 672시간에 수집하였다. 샘플을 항-IgG 샌드위치 ELISA를 사용하여 16435 항체 수준에 대해 분석하였다.
도 34는 하나의 면역글로뷸린을 갖는 선택적 펩티딜 링커 모이어티를 통해 융합된 약리학적으로 활성인 독소 펩타이드 유사체(구불구불한 선)의 하나의 단위를 포함하는 본 발명의 조성물의 하나의 실시형태의 개략적인 구조 표현을 도시한 도면.
도 35는 최종 1가 16435 IgG2-L10-Shk[1-35, Q16K] 생성물의 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색된 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 도면. 생성물은 4개의 상이한 발현 풀로부터 분리되었다. 레인 1 내지 10을 다음과 같이 로딩하였다: Novex Mark12 광범위한 단백질 표준(10 ㎕), 비-환원된 2㎍ 풀 1 생성물, 비-환원된 2㎍ 풀 2 생성물, 비-환원된 2㎍ 풀 3 생성물, 비-환원된 2㎍ 풀 4 생성물, Novex Mark12 광범위한 단백질 표준(10 ㎕), 환원된 2㎍ 풀 1 생성물, 환원된 2㎍ 풀 2 생성물, 환원된 2㎍ 풀 3 생성물, 환원된 2㎍ 풀 4 생성물.
도 36A 내지 도 36D는 280㎚에서 흡광도를 측정함으로써 1 ㎖/분에서 50mM NaH2PO4, 250mM NaCl, pH 6.9로 평형상태를 유지한 Phenomenex BioSep SEC-3000 칼럼(7.8×300 ㎜) 상에 주입한 3742 생성물의 최종 풀 1, 2, 3 및 4의 30㎍ 상의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 도면.
도 37A 내지 도 37D는 최종 3742 샘플의 환원된 경쇄 LC-MS 분석을 도시한 도면. 생성물은 Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 Waters MassPREP 마이크로 탈염 칼럼을 통해 크로마토그래피하였다. 칼럼을 80℃로 설정하였고, 단백질을 0.1 % 포름산에서 아세토나이트릴 농도를 증가시키는 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 칼럼 용출액은 질량 분석을 위해 Waters LCT Premier ESI-TOF 질량 분광기로 보냈다. 기기를 포지티브 V 모드에서 실행하였다. 모세관 전압을 3,200 V로 설정하였고, 콘 전압(cone voltage)을 80V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 800 내지 3000 m/z로 획득하였고, 기기 제조업자에 의해 제공되는 MaxEnt1 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션하였다(deconvolute).
도 38a 내지 도 38d는 최종 3742 샘플의 환원된 중쇄 LC-MS 분석을 도시한 도면. Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 Waters MassPREP 마이크로 탈염 칼럼을 통해 생성물을 크로마토그래피하였다. 칼럼을 80℃로 설정하였고, 0.1 % 포름산 내 아세토나이트릴 농도를 증가시키는 선형 구배를 사용하여 단백질을 용리시켰다. 칼럼 용출액은 질량 분석을 위해 Waters LCT Premier ESI-TOF 질량 분광기로 보냈다. 기기를 포지티브 V 모드에서 실행하였다. 모세관 전압을 3,200 V로 설정하였고, 콘 전압을 80V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 800 내지 3000 m/z로 획득하였고, 기기 제조업자에 의해 제공되는 MaxEnt1 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션하였다.
도 39a는 비-환원 로딩 완충제를 사용하여 QuickBlue(Boston Biologicals)로 염색하여 220V에서 발생된 1.0mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 모의(mock) 트랜스펙션으로부터 조정 배지와 함께 항체 융합 10162, 10163 및 10164의 조정 배지의 비-환원성 분석을 도시한 도면. 분자량 마커는 kDa으로 표시한다.
도 39b는 최종 10162, 10163 및 10164 생성물의 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 도면. 레인 1 및 5에서, Novex Mark 12 표준을 로딩시켰다. 레인 2 내지 4(비-환원성) 및 6 내지 8(환원성)에 대해, 2㎍의 생성물을 로딩시켰다.
도 40A 내지 도 40C는 280㎚에서 흡광도를 측정하여 1㎖/분에 50mM NaH2PO4, 250mM NaCl, 및 pH 6.9에서 Phenomenex BioSep SEC-3000 칼럼(7.8×300 ㎜) 상에 주입한 융합 항체 10162(도 40A), 10163(도 40B) 및 10164(도 40C)의 50㎍ 상의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 도면.
도 41a 내지 도 41c는 최종 4341-ShK(1-35, Q16K)(도 41a), 4341-FGF21(도 41b) 및 16435-FGF21(도 41c) 샘플의 환원된 경쇄 LC-MS 분석을 도시한 도면. 생성물을 Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 Waters MassPREP 마이크로 탈염 칼럼을 통해 크로마토그래피하였다. 칼럼을 80℃로 설정하였고, 단백질을 0.1% 포름산 중에서 증가하는 아세토나이트릴 농도의 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 칼럼 용출액은 질량 분석을 위해 Waters LCT Premier ESI-TOF 질량 분광기로 보냈다. 기기를 포지티브 V 모드에서 실행하였다. 모세관 전압을 3,200 V로 설정하였고, 콘 전압을 80V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 800 내지 3000 m/z로 획득하였고, 기기 제조업자에 의해 제공되는 MaxEnt1 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션하였다.
도 42a 내지 도 42c는 최종 4341-ShK(1-35, Q16K)(도 42a), 4341-FGF21(도 42b), 및 16435-FGF21(도 42c) 샘플의 환원된 중쇄 LC-MS 분석을 도시한 도면. 생성물을 Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 Waters MassPREP 마이크로 탈염 칼럼을 통해 크로마토그래피하였다. 칼럼을 80℃로 설정하였고, 단백질을 0.1% 포름산 중에서 증가하는 아세토나이트릴 농도의 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 칼럼 용출액은 질량 분석을 위해 Waters LCT Premier ESI-TOF 질량 분광기로 보냈다. 기기를 포지티브 V 모드에서 실행하였다. 모세관 전압을 3,200 V로 설정하였고, 콘 전압을 80V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 800 내지 3000 m/z로 획득하였고, 기기 제조업자에 의해 제공되는 MaxEnt1 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션하였다.
도 43은 SD 래트 내 항체 16435 및 4341(둘 다 5㎎/㎏ 용량에서)의 대표적인 PK 프로파일을 도시한 도면.
도 44는 사이노몰구스 원숭이에서 항체 16435 또는 4341의 순차적 용량(5㎎/㎏)을 위한 대표적인 PK 프로파일을 도시한 도면.
본 명세서에 사용된 머릿글 부문은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
정의
본 명세서에 달리 정의되지 않는다면, 본 출원과 함께 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 보통 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는다면, 단수 형태는 복수를 포함하며, 복수 형태는 단수를 포함한다. 따라서, 본 명세서 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는다면, 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, "단백질"은 다수의 단백질을 포함하며; "세포"에 대한 언급은 다수의 세포의 집단을 포함한다.
"폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 펩타이드 결합을 통해 공유적으로 연결된 2 이상의 아미노산의 분자 쇄를 포함한다. 용어는 생성물의 구체적 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 폴리펩타이드의 정의 내에 포함된다. 해당 용어는 폴리펩타이드의 번역 후 변형, 예를 들어 글라이코실화, 아세틸화, 인산화반응 등을 포함한다. 추가로, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이된 또는 변이체 단백질, 융합 단백질 등은 폴리펩타이드의 의미 내에 포함된다. 해당 용어는 또한 공지된 단백질 유전자조작 기법을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있는 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 비-정규 또는 비천연 아미노산이 포함된 분자를 포함한다. 추가로, 융합 단백질은 잘 공지된 유기 화학 기법에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 유도체화될 수 있다.
언급된 용어 "분리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 천연에서 보통 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질이 없고, (2) 동일 공급원, 예를 들어 동일 종으로부터 다른 단백질이 본질적으로 없으며, (3) 이종성 종 또는 종류의 세포에 의해 재조합적으로 발현되고, (4) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 천연에서 이것과 관련된 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되며, (5) 천연에서 결합되지 않은 폴리펩타이드와 (공유 또는 비공유적 상호작용에 의해) 작동가능하게 결합되고/되거나 (6) 천연에서 생기지 않는 것을 의미한다. 전형적으로, "분리된 단백질"은 주어진 샘플의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25% 또는 적어도 약 50%를 포함한다. 합성 기원 또는 이들의 임의의 조합의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA는 이러한 분리된 단백질을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 분리된 단백질은 그것의 치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 다른 용도와 상호작용하는 그것의 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다.
폴리펩타이드(예를 들어, 면역글로뷸린 또는 항체)의 "변이체"는 아미노산 서열을 포함하되, 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 폴리펩타이드 서열에 비해 아미노산 서열에 삽입되며, 아미노산 서열로부터 결실되고/되거나 아미노산 서열로 치환된다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "융합 단백질"은 단백질이 하나 이상의 모 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드 성분을 포함한다는 것을 나타낸다. 전형적으로, 융합 단백질은 하나의 단백질로부터 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 상이한 단백질로부터 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 프레임을 이루도록 덧붙여지고, 상이한 단백질로부터 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 링커에 의해 선택적으로 분리된 융합 유전자로부터 발현된다. 그 다음에 융합 유전자는 단일 단백질로서 재조합 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
"분리된" 단백질은 ER, 분비 소포, 또는 분비 신호 펩타이드 서열의 결과로서 세포밖 공간에 관련될 수 있는 해당 단백질뿐만 아니라 단일 서열을 필수적으로 함유하지 않고 세포 밖 공간으로 방출된 해당 단백질을 지칭한다. 분비된 단백질이 세포밖 공간으로 방출된다면, 분비된 단백질은 세포 밖 과정을 겪어서 "성숙" 단백질을 생성할 수 있다. 세포 밖 공간으로 방출은 엑소시토시스(exocytosis) 및 단백질 분해 절단을 포함하는 다수의 메커니즘에 의해 일어날 수 있다. 본 발명의 조성물의 일부 다른 실시형태에서, 독소 펩타이드 유사체는 분비된 단백질로서 숙주 세포에 의해 합성될 수 있는데, 이는 그 다음에 세포 밖 공간 및/또는 매질로부터 추가로 정제될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "가용성"은 숙주 세포에서 재조합 DNA 기법에 의해 생성된 단백질에 대한 것일 때 수용액 중에 존재하는 단백질이며; 단백질이 트윈-아르기닌(twin-arginine) 신호 아미노산 서열을 함유한다면, 가용성 단백질은 그램 음성 박테리아 숙주 내 주변세포질 공간에 전해지거나, 또는 분비가능한 진핵 숙주 세포에 의해, 또는 적절한 유전자(예를 들어, kil 유전자)를 소유하는 박테리아 숙주에 의해 배양 배지 내로 분비된다. 따라서, 가용성 단백질은 숙주 세포 내부의 봉입체에서 발견되지 않는 단백질이다. 대안적으로, 내용에 따라서, 가용성 단백질은 세포막에 통합된 것으로 발견되지 않은 단백질이며; 대조적으로, 불용성 단백질은 숙주 세포 내 세포질내 과립(봉입체로 불림) 내부의 변성 형태로 존재하는 것이며, 또는 다시 내용에 따라서, 불용성 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 세포질막, 미토콘드리아막, 엽록체막, 소포체막 등을 포함하는 세포막에 존재하는 것이다.
"가용성 인간 IL-17R"은 다음의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(huIL-17R-FpH)이다:
Figure pct00001
"가용성 인간 TR2"는 다음의 아미노산 서열을 갖는 모노머 또는 다이머 형태로 융합 폴리펩타이드(huTR2 긴-huFc (IgG1)이다:
Figure pct00002
인큐베이션 완충제 및 면역글로뷸린 또는 다른 결합 분석 시약에 대해 "생리적 조건 하에"는 비-공유 결합 반응과 같은 생화학 반응이 일어나도록 하는 온도, pH 및 이온 강도 하에 인큐베이션을 의미한다. 전형적으로, 온도는 실온 또는 주위 온도 내지 약 37℃이며, pH는 6.5 내지 7.5이다.
용어 "재조합체"는 물질(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩타이드)이 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로(즉, 비-천연적으로) 변경된 것을 나타낸다. 변경은 그것의 천연 환경 또는 상태에서 물질 상에 수행될 수 있거나 또는 천연 환경 또는 상태로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 클로닝, DNA 셔플링(shuffling) 또는 다른 잘 공지된 분자 생물학 과정에 의해 만들어지는 것이다. 이러한 분자 생물학적 과정의 예는 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y(1982)]에서 발견된다. "재조합 DNA 분자"는 이러한 분자 생물학적 기법에 의해 함께 결합된 DNA의 절편으로 구성된다. 본 명세서에 사용된 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩타이드"는 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현된 단백질 분자를 지칭한다. "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산을 함유하고/하거나 발현시키는 세포이다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 2 이상의 뉴클레오타이드 잔기를 함유하는 단일-가닥과 이중-가닥 뉴클레오타이드 폴리머를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 잔기는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 중 하나의 유형의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예컨대 브로모유리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예컨대 2',3'-다이데옥시리보스, 및 뉴크렐오타이드간 연결 변형, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 200개 이하의 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이로 10 내지 60개 염기이다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이로 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 돌연변이체 유전자의 구성에서 사용을 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 검출 분석을 위해 방사성표지, 형광 표지, 햅텐 또는 항원성 표지를 포함하는 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 PCR 프라이머로서, 클로닝 프라이머로서 또는 혼성 프로브로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상호호환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 내용에 따라서 올리고뉴클레오타이드, DNA 및 RNA, 핵산 또는 뉴클레오타이드 잔기의 1차 서열을 나타내는 문자열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 잔기의 1차 서열이다. 임의의 구체화된 폴리뉴클레오타이드 서열로부터, 주어진 핵산 또는 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나가 결정될 수 있다. 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA가 포함된다. 달리 특정되지 않는다면, 본 명세서에 논의된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 좌선성 말단은 5' 말단이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌선성 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 방향으로 첨가는 전사 방향으로서 지칭되며; RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되고; RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "분리된 핵산 분자" 또는 "분리된 핵산 서열"은 (1) 핵산의 천연 공급원과 보통 결합되는 적어도 하나의 오염 핵산으로부터 확인되고 분리되거나 또는 (2) 관심의 핵산 서열이 결정될 수 있도록 배경 핵산으로부터 클로닝되고, 증폭되며, 태그되거나 또는 달리 구별된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 그러나, 분리된 핵산 분자는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 있는 면역글로뷸린(예를 들어 항체)을 보통 발현시키는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "암호화하는 핵산 분자", "암호화하는 DNA 서열" 및 "암호화하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥에 따르는 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서는 mRNA 쇄에 따라 리보뉴클레오타이드의 순서를 결정하며, 또한 폴리펩타이드(단백질) 쇄에 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 DNA 서열은 RNA 서열에 대해 및 아미노산 서열에 대해 암호화한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하는 것으로 광범위하게 사용된다. 유전자는 전형적으로 암호 서열 및/또는 이러한 암호 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 용어 "유전자"는 특이적 게놈 또는 재조합 서열뿐만 아니라 해당 서열에 의해 암호화된 cDNA 또는 mRNA에 적용된다. "융합 유전자"는 독소 펩타이드 유사체를 암호화하는 암호 영역을 함유한다. 유전자는 또한 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비-발현 핵산 절편을 포함한다. 전사 인자와 같은 조절 단백질에 결합하는 전사 제어 요소를 포함하는 비-발현 조절 서열은 인접한 또는 근처 서열의 전사를 초래한다.
"유전자의 발현" 또는 "핵산의 발현"은 내용에 의해 표시되는 바와 같이, RNA로 DNA의 전사(선택적으로, RNA 예를 들어 스플라이싱의 변형을 포함), 폴리펩타이드로 RNA의 번역(가능하게는 폴리펩타이드의 이후의 번역 후 변형을 포함) 또는 전사와 번역 둘 다를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "암호 영역" 또는 "암호 서열"은 구조적 유전자에 대해 사용될 때, mRNA 분자 번역의 결과로서 초기 폴리펩타이드에서 발견되는 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 암호 영역은, 진핵생물에서 개시자 메티오닌을 암호화하는 뉴클레오타이드 트리플렛 "ATG"에 의해 5' 측면 상에 및 정지 코돈을 구체화하는 3개의 트리플렛(즉, TAA, TAG, TGA) 중 하나에 의해 3' 측면 상에 결합된다.
용어 "제어 서열" 또는 "제어 신호"는 특히 숙주 세포에서 결찰된 암호 서열의 발현 및 처리에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 특성은 숙주 유기체에 의존할 수 있다. 특정 실시형태에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열 또는 구성요소에 대한 하나 또는 다수의 인식 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 제어 서열은 리더 서열 및/또는 융합 상대 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 수반된 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA의 짧은 배열로 이루어진다(Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)). 프로모터 및 인핸서 구성요소는 효모, 곤충 및 포유류 세포 및 바이러스 내 유전자를 포함하는 다양한 진핵생물 공급원으로부터 분리되었다(유사한 제어 구성요소, 즉 프로모터는 원핵생물에서 발견된다). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 세포 유형이 관심의 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 것이 의존한다. 일부 진핵 프로모터 및 인핸서는 광범위한 숙주 범위를 가지는 반면, 다른 것들은 세포 유형의 제한된 부분집합에서 기능성이다(검토를 위해, 문헌[Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) 및 Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)] 참조).
용어 "벡터"는 숙주 세포 내로 단백질 암호 정보를 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 또는 독립체(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성체"는 바람직한 암호 서열 및 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 제어 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 발현 벡터는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 전사, 번역에 영향을 미치거나 또는 제어하고, 인트론이 존재한다면, 그것에 작동가능하게 연결된 암호 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있다. 원핵생물 내 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능하게는 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 분비 신호 펩타이드 서열은 또한, 선택적으로 관심의 암호 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터에 의해 암호화될 수 있고, 따라서 발현된 폴리펩타이드는, 원한다면 세포로부터 관심의 폴리펩타이드의 분리를 더 용이하게 하기 위하여 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있다. 이러한 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences], 미국 특허 제5,302,697호; Weiner 등, 발명의 명칭: Compositions and methods for protein secretion, 미국 특허 제6,022,952호 및 미국 특허 제6,335,178호; Uemura 등, 발명의 명칭: Protein expression vector and utilization thereof, 미국 특허 제7,029,909호; Ruben 등, 발명의 명칭: 27 human secreted proteins, 미국 특허 2003/0104400 A1).
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동가능한 조합에서", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"은 원하는 단백질 분자의 주어진 유전자 및/또는 합성의 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자가 생성되는 방식에서 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 용어는 또한 기능적 단백질이 생성되는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 암호 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터 내 제어 서열은 그것에 결찰되고, 따라서 단백질 암호 서열의 발현은 제어 서열의 전사 활성과 양립가능한 조건 하에 달성된다.
용어 "숙주 세포"는 핵산에 의해 형질전환되거나 또는 형질전환될 수 있고, 이에 의해 관심의 유전자를 발현시키는 세포를 의미한다. 용어는, 자손이 본래의 모 세포에 대해 형태에서 또는 유전적 구성에서 동일하든 아니든, 관심의 유전자가 존재한다면, 모 세포의 자손을 포함한다. 다수의 이용가능하고 잘 알려진 숙주 세포 중 어떤 것이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 당업계에 인식된 다수의 인자에 의존한다. 이들은, 예를 들어 선택된 발현 벡터와 양립가능성, DNA 분자에 의해 암호화된 펩타이드의 독성, 형질전환율, 펩타이드 회수의 용이함, 발현 특징, 생체-안전성 및 비용을 포함한다. 이들 인자의 균형은 숙주가 특정 DNA 서열의 발현을 위해 반드시 동일하게 효과적일 수는 없다는 이해와 충돌한다. 이들 일반적 가이드라인에서, 배양물 내 유용한 미생물 숙주 세포는 박테리아(예컨대 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli ) 속), 효모(예컨대, 사카로마이세스( Saccharomyces ) 속) 및 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유류(인간을 포함) 세포, 예를 들어 CHO 세포 및 HEK-293 세포를 포함한다. 변형은 DNA 수준에서도 만들어질 수 있다. 펩타이드-암호화 DNA 서열은 선택된 숙주 세포와 더 양립가능한 코돈으로 변화될 수 있다. 이콜라이( E. coli )에 대해, 최적화된 코돈은 당업계에 공지되어 있다. 코돈은 제한 부위를 제거하기 위해 또는 침묵 제한 부위를 포함하기 위해 치환될 수 있는데, 이는 선택된 숙주 세포 내 DNA의 처리를 도울 수 있다. 다음에, 형질전환된 숙주는 배양되고 정제된다. 숙주 세포는 통상적인 발효 조건 하에 배양될 수 있으며, 따라서 원하는 화합물이 발현된다. 이러한 발현 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다.
용어 "트랜스펙션"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하며, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입될 때, "트랜스펙션"되었다. 다수의 트랜스펙션 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 명세서에서 개시된다. 예를 들어, 문헌[Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 참조; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기법은 적합한 숙주 세포 내로 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 도입하기 위하여 사용될 수 있다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특징의 변화를 지칭하며, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형될 때 형질전환되었다. 예를 들어, 세포는 트랜스펙션, 형질도입 또는 다른 기법을 통해 새로운 유전적 물질을 도입함으로써 그것의 본래의 상태로부터 유전적으로 변형된 경우 형질전환된다. 트랜스펙션 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합됨으로써 세포의 DNA와 재조합될 수 있고, 또는 복제되지 않고 에피손 구성요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는 형질전환 DNA가 세포 분화에 의해 복제될 때 "안정하게 형질전환"된 것으로 고려된다.
물질의 조성물의 "생리적으로 허용가능한 염", 예를 들어 항체와 같은 면역글로뷸린의 염은 약제학적으로 허용가능한 것으로 공지되거나 또는 이후에 발견된 임의의 염 또는 염들을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 일부 비제한적 예는: 아세테이트; 트라이플루오로아세테이트; 수소화 할로겐화물, 예컨대 염화수소 및 브롬화수소; 설페이트; 시트레이트; 말레이트; 타르트레이트; 글라이콜레이트; 글루코네이트; 숙시네이트; 메실레이트; 베실레이트; 갈산 에스터의 염(갈산은 또한 3,4,5 트라이하이드록시벤조산으로 알려짐) 예컨대 펜타갈로일글루코스(PentaGalloylGlucose: PGG) 및 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG), 콜레스테릴 설페이트의 염, 파모에이트, 탄네이트 및 옥살레이트 염이다.
단백질의 "도메인" 또는 "영역"(본 명세서에서 상호호환적으로 사용됨)은 완전한 단백질만큼 및 완전한 단백질을 포함하는 전체 단백질의 임의의 부분이지만, 전형적으로 완전한 단백질 미만을 포함한다. 도메인은, 필요한 것은 아니지만, 단백질 쇄의 나머지와 독립적으로 폴딩될 수 있고/있거나 특정 생물학적, 생화학적 또는 구조적 작용 또는 위치(예를 들어, 리간드 결합 도메인 또는 사이토졸, 막관통 또는 세포밖 도메인)와 상호관련될 수 있다.
"처치" 또는 "처치하는"은 개발을 방지하거나 또는 장애의 병적측면을 변경하는 본 발명에 의해 수행된 개입이다. 따라서, "처치"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지를 위한 조치 둘 다를 지칭한다. 처치의 필요가 있는 대상은 이미 장애가 있는 대상뿐만 아니라 장애가 예방될 필요가 있는 대상을 포함한다. "처치"는 증상의 경감; 완화; 절감과 같은 객관적 또는 주관적 변수를 포함하거나 또는 손상, 병적측면 또는 질환을 환자에게 더 견딜만하게 만들고; 퇴보 또는 감소 속도를 늦추며; 퇴보의 최종 지점을 덜 쇠약하게 만들고; 환자의 생리적 또는 정신적 웰빙을 개선시키는, 손상, 병적 측면 또는 질환의 개선에서 임의의 성공 징후를 포함한다. 증상의 처치 또는 개선은 생리적 시험 결과, 환자에 의한 자기 보고, 신경 정신병적 시험 및/또는 정신 의학적 평가를 포함하는 객관적 또는 주관적 변수를 기반으로 할 수 있다.
"유효량"은 일반적으로 증상 및/또는 증상의 빈도를 감소시키고, 증상 및/또는 근본적인 원인을 제거하며, 증상 및/또는 그것의 근본적인 원인의 발생을 방지하고/하거나 편두통으로부터 초래되거나 편두통과 관련된 손상을 개선시키거나 또는 교정하기에 충분한 양이다. 일부 실시형태에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질병 상태(예를 들어 이식 거부 또는 GVHD, 염증, 다발성 경화증, 암, 당뇨병, 신경병증, 통증) 또는 증상(들) 특히 질병 상태와 관련된 상태 또는 증상(들)을 교정하거나 또는 질병 상태의 진행 또는 무엇이든지 바람직하지 않은 임의의 다른 증상을 달리 방지하고, 방해하며, 지연시키거나 또는 반전시키기 위한(즉, "치료적 효능"을 제공하는) 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 피험체에게 투여될 때, 예를 들어 편두통 또는 다발성 경화증 증상의 개시(또는 재발)를 방지하거나 또는 지연시키거나, 또는 편두통, 편두통 증상, 또는 다발성 경화증 증상의 개시(또는 재발)의 가능성을 감소시키는 의도된 예방적 효과를 가질 약제학적 조성물의 양이다. 전체 치료적 또는 예방적 효과는 반드시 1 용량의 투여에 의해 생기지 않으며, 단지 일련의 용량의 투여 후에 일어날 수 있다. 따라서, 치료적 또는 예방적 유효량은 1 이상의 투여로 투여될 수 있다.
치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 래트, 마우스, 원숭이 등을 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
생물학적 물질, 예컨대 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포 등과 관련하여 본 명세서 내내 사용되는 용어 "자연적으로 발생하는"은 천연에서 발견되는 물질을 지칭한다.
용어 "항체" 또는 상호호환적으로 "Ab"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 완전히 조립된 항체, 단클론성 항체(인간, 인간화된 또는 키메라 항체를 포함), 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 앞서 언급한 상보적 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함하는 항원과 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 쇄 항체, 다이아바디)을 포함한다. 화학적으로 유도체화된 항체를 포함하는 무결함 분자 및/또는 단편의 멀티머 또는 응집이 고려된다. IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 또는 임의의 알로타입(allotype)을 포함하는 임의의 아이소타입 분류 또는 하위분류의 항체가 고려된다. 상이한 아이소타입은 상이한 효과기 기능을 가진다; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 아이소타입은 항체-의존적 세포의 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 활성을 가진다.
용어 "항원 결합 단백질"(antigen binding protein: ABP)은 상기 정의한 바와 같은 항체 또는 항체 단편 및 원하는 항원-결합 특성을 갖는 CDR로부터 유래된 서열을 함유하는 재조합 펩타이드 또는 다른 화합물을 포함하므로, 그것들은 관심의 표적 항원에 특이적으로 결합된다.
일반적으로, 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 항체 단편은, 그것이 유사한 결합 분석 조건 하에 다른 관련없는 단백질에 대한 친화도와 비교하여 해당 항원에 대해 상당히 더 높은 결합 친화도를 가지고 결과적으로 해당 항원을 구별할 수 있을 때, 관심 항원(예를 들어, IL-17R 또는 TR2)에 "특이적으로 결합한다". 전형적으로, 항원 결합 단백질은 해리 상수(KD)가 ≤10-8M일 때, 그것의 표적 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. 항체는 KD가 ≤5×10-9M일 때 "높은 친화도"이며, KD가 ≤5×10-10M일 때 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시형태에서, 항체는 약 10-8M 내지 10-10M 사이의 KD로 관심의 항원에 결합할 것이며, 또 다른 실시형태에서, 항체는 KD ≤5×10-9로 결합할 것이다.
"항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는 구체화된 항원, 예를 들어 IL-17R 또는 TR2에 특이적으로 결합하는 단백질의 부분을 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호작용하고 항원 결합 단백질에 항원에 대한 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원 결합 단백질의 해당 부분은 "항원 결합 영역"으로서 언급된다. 항원 결합 영역은 전형적으로 하나 이상의 "상보적 결합 영역"("CDR")을 포함한다. 특정 항원 결합 영역은 또한 하나 이상의 "프레임워크 영역(FR)"을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화도에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역은 항원 결합 영역과 항원 사이의 결합을 촉진하는 CDR의 적절한 형태를 유지하는 것을 도울 수 있다. 전통적인 항체에서, CDR은 그것들이 항원 결합 및 인식을 초래해는 영역을 구성하는 경우, 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 프레임워크 내에 포매된다. 면역글로뷸린 항원 결합 단백질의 가변 영역은 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을, 예를 들어 상기 참조(문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD]; 또한 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol . Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883] 참조), 프레임 영역 내에서(지정된 프레임워크 영역 1 내지 4, FR1, FR2, FR3 및 FR4, 문헌[Kabat et al ., 1991, 상기 참조]; 또한 문헌[Chothia and Lesk, 1987, 상기 참조] 참조) 포함한다.
"분리된" 면역글로뷸린, 예를 들어 항체 또는 항체 단편은 그것의 천연 환경의 또는 그것이 생성 세포에 의해 분비된 배양 배지의 하나 이상의 성분으로부터 확인되고 분비된 것이다. 그것의 천연 환경 또는 배지의 "오염" 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 (1) 항체의 95중량% 초과, 및 가장 바람직하게는 99중량% 초과로, 또는 (2) 선택적으로 염색, 예를 들어 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 분리된 자연적으로 발생하는 항체는 재조합 세포 내에서 인시츄로 항체를 포함하는데, 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 전형적으로 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 즉 부수적 양으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고, 집단을 포함하는 개개의 항체는 동일하다. 항원 결합 단백질인 단클론성 항체는 고도로 특이적인 결합제이며, 상이한 에피토프에 관해 전형적으로 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와 대조적으로 개개의 항원성 부위 또는 에피토프에 관한 것이다. 단클론성 항체의 비제한적 예는 뮤린, 토끼, 래트, 닭, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체, 완전히 조립됨 항체, 다중특이성 항체(이중특이성 항체를 포함), 항체와 결합할 수 있는 항체 단편(Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 쇄 항체, 다이아바디), 맥시바디, 나노바디 및 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 앞서 언급한 CDR을 포함하는 재조합 펩타이드 또는 이들의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻게되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성에 필요한 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495[1975]]에 의해 처음으로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단클론성 항체"는 또한, 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature,352:624-628[1991] 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
"다중특이성" 결합제 또는 항원 결합 단백질 또는 항체는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다.
"이중특이성", "이중-특이성" 또는 "2작용성" 결합제 또는 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 혼성체이다. 2항원 결합 단백질, 항원 결합 단백질 및 항체는 다중항원 결합 단백질, 항원 결합 단백질 또는 다중특이성 항체의 종이며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어 문헌[Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]을 참조한다. 이중특이성 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 2개의 상이한 에피토프에 결합될 수 있는데, 이는 동일 또는 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있다.
용어 "면역글로뷸린"은 각각 경쇄(LC)에 공유적으로 연결된 2개의 다이머화된 중쇄(HC)를 포함하는 전체 항체; 단일의 다이머화되지 않은 면역글로뷸린 중쇄 및 공유적으로 연결된 경쇄(HC + LC), 또는 키메라 면역글로뷸린(경쇄 + 중쇄)-Fc 헤테로트라이머(소위 "헤미바디")를 포함한다. "면역글로뷸린"은 단백질이지만, 반드시 항원 결합 단백질인 것은 아니다.
"항체"에서, 각 테트라머는 각각 약 220개 아미노산의 하나의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 약 440개 아미노산의 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 갖는, 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 초래하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 "가변"("V") 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 효과기 기능을 주로 초래하는 일정한 영역을 정한다. 가변 영역은 상이한 항체 중에서 다르다. 불변 영역은 상이한 항ㅇ체 중에서 동일하다. 각 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에서, 항체 결합 단백질인 항체의 경우에 항원에 대한 항체의 특이성을 결정하도록 하는 3개의 초가변 하위영역이 있다. 그러나, 본 발명의 범주 내에서, 면역글로뷸린, 예를 들어 항체의 실시형태는 항원 결합 단백질을 필요로 하지 않으며, 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있지 않다. 초가변 영역 사이의 가변 도메인 잔기는 프레임워크 잔기로 불리며, 일반적으로 상이한 항체 중에서 다소 상동성이다. 면역글로뷸린은 그것의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여 상이한 분류로 지정될 수 있다. 인간 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄로서 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 본 발명의 범주 내에서, "항체"는 또한 재조합적으로 만들어진 항체 및 글라이코실화되거나 또는 글라이코실화가 결여된 항체를 포함한다.
용어 "경쇄" 또는 "면역글로뷸린 경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 가지는 전장 경쇄 및 이것의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL 및 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 포함한다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로뷸린 중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이것의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH 및 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있으며, CH 도메인은 카복시-말단에 있고, CH3은 폴리펩타이드의 카복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 뮤(μ), 델타(Δ), 감마(γ), 알파(α) 및 엡실론(ε)으로서 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정한다. 본 발명의 별개의 실시형태에서, 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입을 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입을 포함), IgM 및 IgE를 포함하는 임의의 아이소타입을 가질 수 있다. 이들 중 몇몇은 하위분류 또는 아이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 IgG 아이소타입은 상이한 효과기 기능(Fc 영역에 의해 매개됨), 예컨대 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)을 가질 수 있다. ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 표적화된 세포의 식세포작용 또는 용균을 야기하는, 자연 살해 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포의 표면 상에서 Fc 수용체(FcγR)에 결합한다. CDC에서, 항체는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발함으로써 표적화된 세포를 사멸시킨다.
"Fc 영역", 또는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되는, "Fc 도메인" 또는 "면역글로뷸린 Fc 도메인"은 2개의 중쇄 단편을 함유하는데, 여기서 전체 항체는 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2 이상의 이황화 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 보유된다.
용어 "샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기의 증가를 초래하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
"알로타입"은 종종 불변 영역에서 면역원성일 수 있고 인간에서 특이적 대립유전자에 의해 암호화하는 항체 서열 내 변형이다. 알로타입은 5가지의 인간 IGHC 유전자, 즉, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2 및 IGHE 유전자에 대해 확인되었고, 각각 G1m, G2m, G3m, A2m, 및 Em 알로타입으로 지정된다. 적어도 18가지 Gm 알로타입이 공지되어 있다: nG1m(1), nG1m(2), G1m(1, 2, 3, 17) 또는 G1m(a, x, f, z), G2m(23) 또는 G2m(n), G3m(5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m(b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5). 2개의 A2m 알로타입 A2m(1) 및 A2m(2)이 있다.
항체의 구조 및 생성의 상세한 설명에 대해, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998)]을 참조한다. 간략하게, 중쇄 및 경쇄 면역글로뷸린 서열을 암호화하는 DNA를 생성하기 위한 과정은 발생하는 B-세포에서 주로 생긴다. 다양한 면역글로뷸린 유전자 절편의 재배열 및 결합 전, V, D, J 및 불변(C) 유전자 절편은 일반적으로 단일 염색체 상에서 상대적으로 가깝게 발견된다. B-세포-분화 동안, V, D, J(또는 경쇄 유전자의 경우에 단지 V 및 J) 유전자 절편의 각각의 적절한 패밀리 구성원 중 하나는 재조합되어 중 및 경 면역글로뷸린 유전자의 기능적으로 재배열된 가변 영역을 형성한다. 이 유전자 절편 재배열 과정은 순차적으로 되는 것으로 나타난다. 우선, 중쇄 D-내지-J 결합이 만들어진 후, 중쇄 V-내지-DJ 결합 및 경쇄 V-내지-J 결합이 만들어진다. V, D 및 J 절편의 재배열에 더하여, 추가적인 다양성이 위치에서 다양한 재조합의 방법에 의해 면역글로뷸린 중쇄 및 경쇄의 주요 레퍼토리에서 만들어지며, 여기서 경쇄의 V 및 J 절편이 결합되고, 중쇄의 D 및 J 절편이 결합된다. 경쇄의 이러한 변화는 전형적으로 V 유전자 절편의 마지막 코돈 및 J 절편의 첫번째 코돈 내에서 일어난다. 결합에서 유사한 불명확함은 D와 JH 절편 사이의 중쇄 염색체 상에서 일어나며, 10개의 뉴클레오타이드 만큼에 걸쳐 연장될 수 있다. 더 나아가, 몇몇 뉴클레오타이드는 D와 JH 사이에 및 게놈 DNA에 의해 암호화되지 않는 VH와 D 유전자 절편 사이에 삽입될 수 있다. 이들 뉴클레오타이드의 첨가는 N-영역 다양성으로 알려져 있다. 이러한 결합이 일어날 수 있는 가변 영역 유전자 절편 및 가변 재조합의 이러한 재배열의 순효과는 주요 항체 레퍼토리의 생성이다.
용어 "초가변" 영역은 항원-결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 상보적 결정 영역 또는 CDR로부터 아미노산 잔기를 포함한다[즉, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 의해 기재되는 바와 같이 경쇄 가변 도메인 내 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)을 포함]. CDR의 모두를 함유하는 전체 항원 결합 부위보다 더 낮은 친화도를 갖지만, 단일 CDR이 항원조차도 항원을 인식하고 결합할 수 있다.
초가변 "루프"로부터 잔기의 대안의 정의는 경쇄 가변 도메인 내 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)로서 문헌[Chothia et al., J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987)]로서 기재된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 해당 가변 영역 잔기이다.
"항체 단편"은 무결함 전장 항체의 부분, 바람직하게는 무결함 항체의 항체 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각은 단일 항원-결합 부위 및 불변 영역을 함유하는 잔기 "Fc" 단편을 가진다. Fab 단편은 가변 도메인의 모두뿐만 아니라 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fc 단편은 탄수화물을 나타내며, 다수의 항체 효과기 기능(예컨대 결합 보체 및 세포 수용체)을 초래하는데, 이는 항체의 한 분류를 다른 것과 구별 짓는다.
펩신 처리로 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2개의 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 수득하되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 추가적인 잔기의 포함에 의해 Fab' 단편과 다르다. 바람직하게는, Fv 폴리펩타이드는 Fv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하도록 할 수 있는 VH과 VL 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 CH1 및 하나의 중쇄의 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 중쇄 부분을 함유하므로, 쇄간 이황화 결합은 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하므로, 쇄간 이황화 결합은 2개의 중쇄 사이에 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 보유된 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비-공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머로 이루어진다. 각 가변 도메인 중 3개의 CDR은 상호작용하여 VH VL 다이머의 표면 상에서 항원 결합 부위를 정하는 입체배치로 존재한다. 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도일지라도, 항원을 인식하고 항원에 결합하는 능력을 가진다.
"단일-쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩타이드 쇄를 형성하고, 항원-결합 영역을 형성하는 Fv 분자이다. 단일 쇄 항체는 국제특허출원 공개번호 WO 88/01649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에서 상세하게 논의되며, 이것의 개시는 전문이 참조로서 포함된다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 존재하고, 선택적으로 Fv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 포함한다(Bird et al., Science 242:423-426, 1988, 및 Huston et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 85:5879-5883, 1988). "Fd" 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진다.
용어 "다이아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩타이드 쇄(VH VL) 내 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 이루기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루게 되며, 2개의 항원-결합 부위를 만든다. 다이아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에서 더욱 완전하게 기재된다.
"도메인 항체"는 단지 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역을 함유하는 면역학적으로 기능적인 면역글로뷸린 단편이다. 일부 예에서, 2 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커와 공유적으로 결합되어 2가의 도메인 항체를 만든다. 2가의 도메인 항체의 2개 VH 영역은 동일 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 단백질과 결합하는 중화 항원 또는 중화항체)의 내용에서 사용될 때, 용어 "경쟁하다"는 시험 하의 항원 결합 단백질(예를 들어 항체 또는 이것의 면역학적으로 기능성인 단편)이 보통의 항원(예를 들어, IL-17R 또는 이것의 단편, 또는 TR2 또는 이것의 단편)에 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 기준 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 또는 억제하는 분석에 의해 항원 결합 단백질 사이의 경쟁이 결정되는 것을 의미한다. 경쟁적 결합 분석의 수많은 유형, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사성면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역 분석법(enzyme immunoassay: EIA), 샌드위치 경쟁 분석법(예를 들어, 문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조) 고체상 직접 표지 분석법, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석법(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고체산 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82); 및 표면 플라즈몬 공명(바이아코어(BIAcore)(등록상표); 예를 들어 Fischer 등의 발명의 명칭: A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, 실시예 10, 이것은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨), 또는 KinExA이 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 이들, 미표지 시험 면역글로뷸린 또는 항원 결합 단백질 및 표지된 기준 항원 결합 단백질 중 하나를 함유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 시험 면역글로뷸린 또는 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인되는 항원 결합 단백질(경쟁적 항원 결합 단백질)은 기준 항원 결합 단백질에 결합하는 항원 결합 단백질 및 입체 장애에 대한 기준 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프 대한 항원 결합이 일어나는 항원 결합 단백질을 포함한다. 상보적 결합을 결정하기 위한 방법에 대한 추가적인 상세한 설명은 본 명세서의 실시예에서 제공된다. 보통, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%로써 보통의 항원에 대한 기준 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 억제할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상으로써 억제된다.
면역글로뷸린(예를 들어 항체 또는 항체 단편)이 항원에 "유의하게 결합하지 않을 때"는, 특정 면역글로뷸린이 과량으로, > 39% 또는 > 30% 또는 >20% 또는 > 10%만큼 표적 항원에 그것의 결합을 억제하기 위하여 기준 항원 결합 단백질, 예를 들어 양성 대조군 항원과 경쟁하지 않는 것을 의미한다. 가용성 인간 IL-17R에 대한 특이적 결합에 관해서는, 양성 대조군 항체는 본 명세서에 기재된 항체 16429이다. 가용성 인간 TR2에 대한 특이적 결합에 관해서는, 양성 대조군 항체는 본 명세서에 기재된 항체 16449이다.
항체-항원 상호작용은 M-1s-1(ka)의 결합속도상수, 또는 s-1(kd)의 해리 속도 상수, 또는 대안적으로 M(KD)의 해리 평형상수를 특징으로 할 수 있다. 결합 속도 상수, 해리 속도 상수 또는 해리 평형 상수는 역학 분석 기법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(바이아코어(BIAcore)(등록상표); 예를 들어, Fischer 등의 발명의 명칭: A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, 실시예 10, 이는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨), 또는 제조업자에 의해 서술된 일반적 과정을 사용하여 KinExA 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 바이아코어(BIAcore)(등록상표) 또는 KinExA에 의해 얻은 역학 데이터는 제조업자에 의해 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다.
시험 면역글로뷸린이 "유의하게 결합하지 않는지" 여부를 결정하는 것에 대해 "표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된"은 표면 플라즈몬 공명을 기반으로 면역글로뷸린의 결합 활성을 평가하기 위하여 본 명세서에 기재된 용액 평형상태 결합 분석으로 측정된 바를 의미한다. 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 인간 IL-17R에 대해 항체 16429 또는 인간 TR2에 대해 항체 16449)은 제조업자의 설명서에 따라 연구 등륵 센서 칩 CM5인 바이아코어(BIACore)(등록상표) 2000(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 BIACore, Inc.)에 고정된다. 센서 칩 표면 상에서 카복실 기는 0.2M N-에틸-N'-(다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(EDC) 및 0.05M N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 함유하는 혼합물의 60㎕를 주입함으로써 활성화된다. 기준 항원 결합 단백질은 10mM 아세트산나트륨, pH 4.0 중에서 희석되고 6분 동안 30 ㎕/분으로 활성화된 칩 표면을 거쳐서 주입된다. 표면 상의 과량의 반응기는 60 ㎕의 1M 에탄올아민을 주입함으로써 불활성화된다. 최종 고정 수준은 전형적으로 대략 6600 공명 단위(resonance unit, RU)이다. 가용성 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 부재에서 가용성 표적 항원(예를 들어, 10nM의 가용성 인간 IL-17R 또는 30nM의 가용성 인간 TR2)은 고정된 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 양성 대조군 항원)에 100% 결합 신호를 확립하기 위하여 사용된다. 시험 면역글로뷸린의 인큐베이션 후 표적 항원의 감소된 결합 신호는 용액 중에서 표적 항원에 대한 결합 수준을 표시한다.
용어 "항원"은 선택적 결합제, 예컨대 항원 결합 단백질(예를 들어 항체 또는 이것의 면역학적 작용 단편을 포함)에 의해 결합될 수 있고 추가적으로 해당 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위하여 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 소유할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)에 의해 결합된 분자의 부분이다. 해당 용어는 항원 결합 단백질에, 예컨대 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정소를 포함한다. 에피토프는 인접 또는 비-인접일 수 있다(예를 들어, 단일-쇄 폴리펩타이드에서, 폴리펩타이드 서열에서 서로 인접하지 않지만 분자의 문맥에 있는 아미노산 잔기는 항원 결합 단백질에 의해 결합된다). 특정 실시형태에서, 에피토프는 모방체일 수 있으며, 즉, 그것들은 항원 결합 단백질을 만들기 위해 사용되는 에피토프와 유사한 3차원 구조를 포함하고, 또한 항원 결합 단백질을 만들기 위해 사용되는 해당 에피토프 내에서 발견된 아미노산 잔기가 전혀 없거나 또는 단지 일부를 포함한다. 가장 흔하게는, 단백질 상의 에피토프 잔기는, 일부 예에서 핵산과 같은 다른 종류의 분자 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정소는 화학적으로 활성인 분자의 표면 그룹, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기를 포함할 수 있고, 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로 특정 표적 항원에 대해 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물 내 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "동일성"은 서열의 정렬과 비교에 의해 결정되는 바와 같은 2 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 지칭한다. "동일성%"는 비교되는 분자 내 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하며, 비교되는 분자 중 가장 작은 것의 크기를 기준으로 계산된다. 이들 계산을 위해, 정렬 내 갭(만약에 있다면)은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리되어야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하기 위하여 사용될 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 서열 동일성은 두 폴리펩타이드의 아미노산 위치에서 유사성을 비교하기 위하여 보통 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 폴리펩타이드 또는 두 폴리뉴클레오타이드 서열은 (서열 중 하나 또는 둘 다의 전장을 따라 또는 서열 중 하나 또는 둘 다의 사전결정된 부분을 따라) 그것의 각 잔기의 최적의 매치를 위해 정렬된다. 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티 및 디폴트 갭 페널티를 제공하고, 스코어링 매트릭스, 예컨대 PAM 250[표준 스코어링 매트릭스; 문헌[Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] 참조]은 컴퓨터 프로그램과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 다음에 동일성%는 다음과 같이 계산될 수 있다: 동일한 매치의 전체 수에 100을 곱한 다음, 매치된 범위 내에서 더 긴 서열 길이와 두 서열을 정렬시키기 위하여 더 긴 서열 내로 도입된 갭 수의 합으로 나눈다. 동일성%를 계산하는데, 비교되는 서열은 서열 간 가장 큰 매치를 제공하는 방법으로 정렬된다.
GCG 프로그램 패키지는 동일성%를 결정하기 위하여 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램인데, 이 패키지는 GAP(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 위스콘신주 매디슨에 소재한 University of Wisconsin의 Genetics Computer Group)을 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성%가 결정되는 것에 대해 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드를 정렬시키기 위하여 사용된다. 서열은 그것의 각 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적의 매칭을 위해 정렬된다(알고리즘에 의해 결정되는 바와 같은 "매칭된 범위"). 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)(이는 3× 평균 대각선으로서 계산되되, "평균 대각선"은 사용되는 비교 행렬의 대각선의 평균이며; "대각선"은 특정 비교 행렬에 의해 각각의 완벽한 아미노산 매치로 지정된 스코어 또는 숫자임) 및 갭 확장 페널티(gap extension penalty)(이는 보통 갭 오프닝 페널티의 1/10배임)뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 행렬이 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 실시형태에서, 표준 비교 행렬(PAM 250 비교 행렬에 대해 문헌[Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]을 참조; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해 문헌[Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)이 또한 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 동일성%를 결정하기 위하여 추천된 변수는 다음을 포함한다:
알고리즘: 문헌[Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];
비교 행렬: 문헌[Henikoff et al., 1992, 상기 참조]으로부터의 BLOSUM 62;
갭 페널티: 12(말단 갭에 대해 페널티 없음)
갭 길이 페널티: 4
유사성 역치: 0
2개 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 두 서열의 단지 짧은 영역의 매칭을 야기할 수 있으며, 심지어 두 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없다고 해도, 이 작은 정렬 영역은 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은, 원한다면 표적 폴리펩티드의 적어도 50개의 인접 아미노산에 걸쳐지는 정렬을 야기하도록 조정될 수 있다.
용어 "변형"은 본 발명의 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역글로뷸린과 함께 사용될 때, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 아미노산 변화(치환, 삽입 또는 결실을 포함); 화학적 변형; 치료제 또는 진단제에 컨쥬게이션에 의한 공유적 변형; 표지(예를 들어, 방사성핵종 또는 다양한 효소); 페길화와 같은 공유적 폴리머 부착(폴리에틸렌 글라이콜에 의한 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환을 포함한다. 본 발명의 변형된 면역글로뷸린은 본 발명의 미변형 분자의 결합(또는 비-결합) 특성을 보유할 것이다.
본 발명의 면역글로뷸린(항체 및 항체 단편을 포함)과 연관하여 사용될 때 용어 "유도체"는 치료제 또는 진단제에 컨쥬게이션에 의한 공유적 변형, 표지(예를 들어, 방사성핵종 또는 다양한 효소), 공유적 폴리머 부착, 예컨대 페길화(폴리에틸렌 글라이콜에 의한 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환된 면역글로뷸린을 지칭한다. 본 발명의 유도체는 본 발명의 비유도체화된 분자의 결합 특성을 보유할 것이다.
면역글로뷸린의 실시형태
전장 면역글로뷸린 경쇄 및 중쇄에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press(본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참조로서 포함됨)]을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
인간 IgG2 중쇄(HC) 불변 도메인의 한 예는 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00003
다른 IgG 아이소타입의 불변 영역 서열은 원한다면 IgG1, IgG2, IgG3n 또는 IgG4 면역글로뷸린 아이소타임을 갖는 본 발명의 면역글로뷸린의 재조합 형태의 제조에 대해 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간 IgG2는 효과기 기능이 바람직하지 않은 경우 표적에 대해 사용될 수 있으며, 이러한 효과기 기능(예를 들어 항체-의존적 세포독성(ADCC))이 바람직한 상황에서 인간 IgG1에 대해 사용될 수 있다. 인간 IgG3은 상대적으로 짧은 반감기를 가지며, 인간 IgG4는 항체 "반-분자"를 형성한다. 인간 IgG1의 4가지 공지된 알로타입이 있다. 바람직한 알로타입은 "hIgG1z"로서 언급되며, 또한 "KEEM" 알로타입으로서 알려져 있다. 인간 IgG1 알로타입 "hIgG1za"(KDEL), "hIgG1f"(REEM) 및 "hIgG1fa"가 또한 유용하며; 모두 ADCC 효과기 기능을 가지는 것으로 나타난다.
인간 hIgG1z 중쇄(HC) 불변 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00004
인간 hIgG1za 중쇄(HC) 불변 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00005
인간 hIgG1f 중쇄(HC) 불변 도메인 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00006
인간 hIgG1fa 중쇄(HC) 불변 도메인 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00007
인간 면역글로뷸린 경쇄(LC) 불변 영역 서열의 한 예는 다음과 같다("CL-1"으로 명명):
Figure pct00008
CL-1은 항체의 pH를 증가시키는데 유용하며 편리하다. "CL-2", "CL-3" 및 "CL-7"으로 명명된 3가지의 다른 인간 면역글로뷸린 경쇄 불변 영역이 있으며, 이들은 또한 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다. CL-2 및 CL-3은 인간 집단에서 더 흔하다.
CL-2 인간 경쇄(LC) 불변 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00009
CL-3 인간 LC 불변 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00010
CL-7 인간 LC 불변 도메인은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00011
인간 LC 카파 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00012
면역글로뷸린 쇄의 가변 영역은 일반적으로 동일한 전반적 구조를 나타내며, "상보적 결정 영역" 또는 CDR로 더 흔히 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 상기 언급된 각 중쇄/경쇄 쌍의 2가 쇄로부터 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 표적(예를 들어, 인간 17R 또는 인간 TR2) 상의 특이적 에피토프 또는 도메인과 특이적으로 결합하는 구조를 형성하지만, 본 발명의 범주 내에서, 본래 CDR 서열은 인간 IL-17R 또는 TR2 표적에 유의하게 결합하지 않기 위하여 신중하게 변형되었다. N-말단으로부터 C-말단까지, 자연적으로-발생하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 둘 다 전형적으로 다음의 이들 구성요소의 순서에 따른다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 넘버링 시스템은 각각의 이들 도메인 내 위치를 점유하는 아미노산에 대해 숫자를 지정하기 위해 고안되었다. 이 넘버링 시스템은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), 또는 Chothia & Lesk, 1987, J. Mol . Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883]에서 정의된다.
제공된 전장 경쇄 및 중쇄의 일부 및 그것의 대응하는 아미노산 서열의 구체적 예는 이하의 표 1A 및 표 1B에서 요약된다. 표 1A는 대표적인 경쇄 서열을 나타낸다. 표 1B는 대표적인 중쇄 서열을 나타내며, 이중 일부는 불변 영역 인간 IgG2(서열번호 86)를 포함하고, 일중 일부는 불변 영역 인간 IgG1f(서열번호 127)를 포함한다. 그러나, 표 1A 및/또는 표 1B(예를 들어, IgG4 대 IgG2, CL2 대 CL1)에 열거된 것의 불변 또는 프레임워크 영역 내 서열 변화를 갖는 면역글로뷸린이 본 발명 내에 포함된다. 또한, 표 1A 및 표 1B 내 모든 서열에 대한 신호 펩타이드(SP) 서열은, 예컨대 VK-1 SP 신호 펩타이드:
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(서열번호 103),
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열번호 104),
MEWTWRVLFLVAAATGAHS(서열번호 105),
METPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열번호 106),
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(서열번호 107)를 포함하지만, 임의의 다른 적합한 신호 펩타이드 서열이 본 발명의 범주 내에 사용될 수 있다. 유용한 신호 펩타이드 서열의 다른 예는 VH21 SP MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(서열번호 95)이다. 다른 대표적인 신호 펩타이드 서열은 표 1A 내지 표 1B에 나타낸다.
(표 1A)
Figure pct00013
Figure pct00014
(표 1B)
Figure pct00015
I
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
항체 또는 항체 단편을 포함하는 분리된 면역글로뷸린의 일부 유용한 실시형태는 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(b) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(c) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(d) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄.
일부 예에서, 이러한 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 예에서, 변이체 형태는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 함유한다. 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)가, 예를 들어 번역 후 변형에 기인하여 표 1A 및 표 1B에서 제시된 중쇄 및 경쇄 중 임의의 하나에 관해 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다로부터 결여된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, CHO 세포는 전형적으로 C-말단의 리신을 절단한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티, 예컨대 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드와 컨쥬게이트를 포함하는 특정 실시형태는 도 1f 내지 도 1n에서 개략적으로 도시되는 바와 같은 헤테로멀티머, 예컨대 1가의 헤테로다이머, 헤테로트라이머 또는 헤테로테트라머를 포함할 수 있다(또한 표 2D 참조).
면역글로뷸린 , 예를 들어 항체의 가변 도메인
본 명세서에 제공된 다양한 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 표 2A 내지 표 2B에 도시된다. 각각의 이들 가변 영역은 상기 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 부착되어 완전한 항체 중쇄 및 경쇄를 각각 형성할 수 있다. 추가로, 각각의 이렇게 만들어진 중쇄 및 경쇄 서열은 조합되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 또한 상기 열거된 대표적인 서열 이외의 상이한 서열을 갖는 다른 불변 도메인에 부착될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
이하의 표 2A에 나타내는 바와 같은 VL2, VL3, VL4 및 VL5로부터 선택된 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역 및 이하의 표 2B에 나타내는 바와 같은 VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10 및 VH11로부터 선택된 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 이들 경쇄 및 중쇄 가면 영역의 면역학적으로 작용성인 단편, 유도체, 돌연변이 단백질 및 변이체를 함유하거나 또는 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역글로뷸린이 또한 제공된다. 이러한 실시형태의 예는 이하의 표 2C 및 표 2D에서 발견된다.
이하의 표 2A에 나타내는 바와 같은 VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15 및 VL16로부터 선택된 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역 및 이하의 표 2B에 나타내는 바와 같은 VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, VH32, VH33, VH34, VH35 및 VH36로부터 선택된 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 이들 경쇄 및 중쇄 가면 영역의 면역학적으로 작용성인 단편, 유도체, 돌연변이 단백질 및 변이체를 함유하거나 또는 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역글로뷸린이 또한 제공된다. 이러한 실시형태의 예는 이하의 표 2C 및 표 2D에서 발견된다.
본 발명의 면역글로뷸린의 대표적인 실시형태는 하기를 포함하며, 이때:
중쇄 가변 영역은 서열번호 323[VH10]의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 188[VL4]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 196[VL8]의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 353[VH25]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
경쇄 가변 영역은 서열번호 202 [VL11]의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 349[VH23]의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
중쇄 가변 영역은 서열번호 325[VH11]의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 190[VL5]의 아미노산 서열을 포함한다.
이 유형의 면역글로뷸린은 일반적으로 식 " VHx/ VLy"로 정해질 수 있으며, 여기서 "x"는 면역글로뷸린 내 포함된 중쇄 가변 영역의 수에 대응하고, "y"는 면역글로뷸린에 포함된 경쇄 가변 영역의 수에 대응한다(일반적으로, x 및 y는 각각 1 또는 2이다).
(표 2A)
Figure pct00019
Figure pct00020
(표 2B)
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
(표 2C)
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
(표 2D)
Figure pct00029
일부 실시형태에서, 면역글로불린(항체 및 항체 단편을 포함)은 단독으로 사용되거나 다른 치료제와 조합되어 사용되어 원하는 효과를 달성할 수 있는 치료적 분자로서 유용할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 본 발명의 면역글로뷸린(항체 및 항체 단편을 포함)은 소분자이든 또는 폴리펩타이드이든, 그것에 컨쥬게이트된 1 내지 24, 1 내지 16, 1 내지 8 또는 1 내지 4개의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 약리학적으로 활성인 소분자 또는 폴리펩타이드 화학적 모이어티는 면역글로뷸린 면역글로뷸린 모노머(예를 들어, LC 또는 HC 모노머)의 N-말단 또는 C-말단 잔기에서 또는 이들을 통해, 당업계에 공지되고 본 명세서에 추가로 기재된 화학적 반응으로 또는 이들을 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 본 발명의 면역글로뷸린의 주쇄 내에서 아미노산 잔기(들)의 하나 이상의 측쇄 상의 작용기에서 또는 작용기를 통해 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티 또는 모이어티들의 컨쥬게이션이 본 발명에 의해 대안적으로 포함된다. 면역글로뷸린 쇄 내에서 유용한 방법 및 내부 컨쥬게이션 부위(예를 들어, 특정 시스테인 잔기)는 당업계에 공지된다(예를 들어, WO 2007/022070 및 미국 특허 20070269369에서 공개된 Gegg 등의 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨).
본 발명의 다른 실시형태에서, 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티는 폴리펩타이드이며, 재조합 융합 단백질은 본 명세서의 실시예 및 당업계에서 추가로 기재되는 바와 같은 N- 및/또는 C-말단 대신 면역글로뷸린 중쇄의 Fc 도메인의 내부 루프 내에서 면역글로뷸린 중쇄의 주요 아미노산 서열에 삽입된 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Gegg et al., 미국 특허 제 7,442,778호; 미국 특허 제7,655,765호; 미국 특허 제7,655,764; 미국 특허 제7,662,931호; 미국 특허 제7,645,861호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0281286호 및 제2009/0286964호, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨).
"컨쥬게이트된"은 적어도 2개의 화학적 모이어티가 모이어티 둘 다에 그 자체가 공유적으로 연결된 펩티딜 또는 비-펩티딜 링커 모이어티를 통해 직접적으로 또는 선택적으로 공유적으로 결합되거나 또는 서로 결합된 것을 의미한다. 예를 들어, 공유 결합은 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 잔기를 통해, 예를 들어 알파 아미노기, 알파 카복실기를 통해 또는 측쇄를 통할 수 있다. 공유 결합이 달성되는 방법, 예를 들어 "컨쥬게이션"이 화학적 합성 수단에 의하는지 또는 융합 단백질 내 융합된(즉, 컨쥬게이트된) 상대의 재조합 발현에 의하는지 여부는 중요하지 않다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 조성물의 일부 실시형태는 본 발명의 약리학적으로 불활성인 면역글로뷸린에 컨쥬게이트된 적어도 하나의 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드 모이어티와 관련되며, 예를 들어 본 발명의 약리학적으로 불활성인 면역글로뷸린에 컨쥬게이트된 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드 모이어티의 재조합 융합 단백질을 구성한다. 용어 "약리학적으로 활성인"은 이렇게 기재된 물질이, 물질의 단순한 면역원성이 존재한다면 이를 제외하고, 의학적 변수(예를 들어 혈압, 혈액 세포수, 콜레스테롤 수치, 통증 지각) 또는 질병 상태(예를 들어, 암, 자가면역 장애, 만성 통증에 영향을 미치는 활성을 갖는 것으로 결정되는 것을 의미한다. 대조적으로, 용어 "약리학적으로 불활성"은, 물질의 단순한 면역원성이 존재한다면 이를 제외하고, 의학적 변수 또는 질병 상태에 영향을 미치는 활성이 해당 물질에 대해 결정될 수 없다는 것을 의미한다. 따라서, 약리학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질은 이하에 정의하는 바와 같이 작용물질의(agonistic) 또는 모방체의 및 길항물질의 펩타이드를 포함한다. 본 발명은 임의의 약리학적으로 활성인 단백질의 사용을 포함하는데, 이는 길이로 약 5 내지 약 80개의 아미노산 잔기의 범위에 있는 아미노산 서열을 가지며, 재조합 발현될 수 있다. 본 발명의 일부 유용한 실시형태에서, 약리학적으로 활성인 단백질은, 필요한 생활성이 유지된다면, 관심의 본래 서열에 대해 아미노산 첨가 또는 삽입, 아미노산 결실, 펩타이드 절단, 아미노산 치환 또는 아미노산 잔기의 화학적 유도체화(공지된 화학적 기법에 의해 수행됨)를 포함하는, 하나 이상의 방법으로 변형된다.
용어 "-모방체 펩타이드", "펩타이드 모방체" 및 "-작용물질 펩타이드"는 관심의 자연적으로 발생하는 단백질과 유사한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 독성 펩타이드 분자, 예를 들어 ShK 또는 OSK1 독소 펩타이드, 또는 이들의 펩타이드 유사체를 지칭한다. 이들 용어는 예컨대 자연적으로 발생하는 분자의 효과를 강력하게 함으로써, 자연적으로 발생하는 펩타이드 분자의 활성을 간접적으로 모방하는 펩타이드를 추가로 포함한다.
용어 "-길항물질 펩타이드", "펩타이드 길항물질" 및 "억제제 펩타이드"는 관심의 수용체의 생물학적 활성을 차단하거나 또는 일부 방법에서 방해하는 펩타이드를 지칭하며, 또는 관심의 수용체의 공지된 길항물질 또는 억제제(예컨대, 이에 제한되는 것은 아니지만, 이온 채널 또는 G-단백질 커플링된 수용체(G-Protein Coupled Receptor, GPCR))와 유사한 생물학적 활성을 가진다.
본 발명 내에서 사용될 수 있는 약리학적으로 활성인 단백질의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 독소 펩타이드(예를 들어, OSK1 또는 OSK1 펩타이드 유사체; ShK 또는 ShK 펩타이드 유사체), IL-6 결합 펩타이드, CGRP 펩타이드 길항물질, 브래디키닌(bradykinin) B1 수용체 펩타이드 길항물질, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH) 작용물질 펩타이드, 부갑상선 호르몬(PTH) 길항물질 펩타이드, ang-1 결합 펩타이드, ang-2 결합 펩타이드, 마이오스타틴 결합 펩타이드, 에리트로포이에틴-모방체(EPO-모방체) 펩타이드, FGF21 펩타이드, 트롬보포이에틴-모방체(TPO-모방체) 펩타이드(예를 들어, AMP2 또는 AMP5), 신경 성장 인자(nerve growth factor: NGF) 결합 펩타이드, B 세포 활성화 인자(B cell activating factor: BAFF) 결합 펩타이드 및 글루카곤-유사 펩타이드(glucagon-like peptide: GLP)-1 또는 이들의 펩타이드 모방체 또는 GLP-2 또는 이들의 펩타이드 모방체를 포함한다.
글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1) 및 관련된 펩타이드 글루카곤은 프로글루카곤의 차별적인 처리를 통해 생성되며, 정반대의 생물학적 활성을 가진다. 프로글루카곤 그 자체는 췌장의 α-세포에서 생성되며, L형 장내분비세포에서, 이는 원위의 소장 및 결장에 주로 위치된다. 췌장에서, 글루카곤은 프로글루카곤으로부터 선택적으로 절단된다. 대조적으로, 장에서 글루카곤은 GLP-1 및 글루카곤-유사 펩타이드 2(GLP-2)를 형성하도록 처리되는데, 이들은 각각 프로글루카곤의 아미노산 잔기 78-107 및 126-158에 대응한다(예를 들어, 문헌[Irwin and Wong, 1995, Mol . Endocrinol. 9:267-277 및 Bell et al ., 1983, Nature 304:368-371] 참조). 통상적으로, GLP-1의 아미노산의 넘버링은 프로글루카곤의 절단으로부터 형성된 GLP-1(1-37)을 기준으로 한다. 생물학적으로 활성인 형태는 이 펩타이드의 추가 처리로부터 만들어지는데, 이 넘버링 관례에서, GLP-1(7-37)-OH 및 GLP-1(7-36)-NH2를 수득한다. GLP-1(7-37)-OH(또는 간단하게 GLP-1(7-37))와 GLP-1(7-36)-NH2는 둘 다 동일한 활성을 가진다. 편의를 위해, 용어 "GLP-1"는 이들 형태 둘 다를 지칭하기 위하여 사용된다. 이들 처리된 펩타이드의 제1 아미노산은 이 넘버링 관례에서 His7이다. 그러나 당업계에 인식된 다른 넘버링 관례는 처리된 펩타이드의 넘버링이 위치 7보다는 위치 1로서 시작된다는 것을 추정한다. 따라서, 이 넘버링 계획에서, GLP-1(1-31)은 GLP 1(7 내지 37)과 동일하며, GLP-1(1 내지 30)은 GLP-1(7 내지 36)과 동일하다. GLP-1 모방체 폴리펩타이드 서열의 예는 하기를 포함한다:
HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG// (서열번호 290);
HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG// (서열번호 291);
HGEGTFTSDVSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRG// (서열번호 292);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLVKGRG// (서열번호 293);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLQKGRG// (서열번호 294);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG// (서열번호 295);
HNETTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG// (서열번호 296)
HGEGTFTSDVSSYLENQTAKEFIAWLVKGRG// (서열번호 297);
HGEGTFTSDVSSYLEGNATKEFIAWLVKGRG// (서열번호 298);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVNGTG// (서열번호 299);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKNRT// (서열번호 300);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNGT// (서열번호 301);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGTGNGT// (서열번호 302); 및
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGNGT// (서열번호 303).
인간 GLP-2 및 GLP-2-모방체 유사체는 또한 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Prasad et al., Glucagonlike peptide-2 analogue enhances intestinal mucosal mass after ischemia and reperfusion, J. Pediatr. Surg. 2000 Feb;35(2):357-59 (2000); Yusta et al., Glucagon-like peptide-2 receptor activation engages bad and glycogen synthase kinase-3 in a protein kinase A-dependent manner and prevents apoptosis following inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase, J. Biol. Chem. 277(28):24896-906 (2002)] 참조).
"독소 펩타이드"는 독액(venom)으로부터 분리될 수 있는 자연적으로 발생하는 약리학적으로 활성인 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 동일 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하며, 또한 이러한 자연적으로 발생하는 분자의 변형된 펩타이드 유사체를 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kalman et al., ShK-Dap22, a potent Kv1.3-specific immunosuppressive polypeptide, J. Biol. Chem. 273(49):32697-707 (1998)]; Kem 등의 미국 특허 제6,077,680호; Mouhat 등의 발명의 명칭: OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2; Chandy 등의 발명의 명칭: Analogs of SHK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3 potassium channels, WO 2006/042151; Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide therapeutic agentsts, WO 2006/116156 A2를 참조하며, 이들 모두는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다). 뱀, 전갈, 거미, 벌, 고둥 및 말미잘은 이온 채널 및 수용체를 잠재적으로 및 선택적으로 표적화하는 작은 생활성 독소 펩타이드 또는 "독소"의 풍부한 공급원으로 작용할 수 있는 독액을 생성하는 유기체의 몇몇 예이다. 독소 펩타이드의 예는 OSK1(또한 OsK1로서 알려짐), 오쏘키루스 스크로비큘로서스( Orthochirus scrobiculosus ) 전갈 독액으로부터 분리된 독소 펩타이드이다. (예를 들어, 문헌[Mouhat et al., K+ channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. J. 385:95-104 (2005); Mouhat et al., Pharmacological profiling of Orthochirus scrobiculosus toxin 1 analogs with a trimmed N-terminal domain, Molec. Pharmacol. 69:354-62 (2006)]; Mouhat 등의 발명의 명칭: OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2). 다른 예는 말미잘 스티코닥틸라 헬리안투스( Stichodactyla helianthus )의 독액으로부터 분리된 ShK이다. (예를 들어, 문헌[Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999)]; Kem 등의 발명의 명칭: ShK toxin compositions and methods of use, 미국 특허 제6,077,680호; Lebrun 등의 발명의 명칭: Neuropeptides originating in scorpion, 미국 특허 제6,689,749호; Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channnels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005)).
독소 펩타이드는 보통 길이로 약 20 내지 약 80개의 아미노산이며, 2 내지 5개의 이황화 결합을 함유하고 매우 밀집한 구조를 형성한다. 독소 펩타이드(예를 들어, 전갈, 말미잘 및 청자고둥의 독액으로부터 유래)가 분리되었고, 이온 채널 상에서 그것의 영향을 특징으로 하였다. 이러한 펩타이드는 효능 및 안정성의 중요한 문제를 처리하는데 특히 적합한 상대적으로 적은 수의 구조적 프레임워크로부터 진화된 것으로 나타난다. 대다수의 전갈 및 청자고둥과(Conus) 독소 펩타이드는, 예를 들어 10 내지 40개의 아미노산 및 5개까지의 이황화 결합을 함유하며, 종종 단백질 분해에 저항성인 극도로 밀집하고, 부자연스러운 구조(마이크로단백질)를 형성한다. 코노톡신(conotoxin) 및 전갈 독소 펩타이드는 그것의 이황화 연결 및 펩타이드 폴딩을 기반으로 다수의 슈퍼패밀리로 나누어질 수 있다. 이들 중 다수의 용액 구조는 NMR 분광법에 의해 결정되었는데, 이는 그것의 밀집한 구조를 설명하고 그것의 패밀리 폴딩의 보존을 확인한다. (예를 들어, 문헌[Tudor et al., Ionisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251(1-2):133-41(1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6):1223-32 (1997); del Rio-Portillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004); Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15 subfamily, Biochem. 45(6):1795-1804 (2006)]). 본 발명의 실행에 대해 유용한 약리학적으로 활성인 독소 펩타이드의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 아미노산 잔기에서 본래의 서열로부터 변형된 ShK, OSK1, 카리브도톡신(ChTx), 칼리오톡신1(KTX1) 또는 마우로톡신 또는 이들 중 어떤 것의 독소 펩타이드 유사체를 포함한다. 다른 예는 당업계에 공지되어 있으며, 또는 Sullivan 등의 WO06116156 A2 또는 미국 특허 출원 제11/406,454호(발명의 명칭: 독소 펩타이드 Therapeutic Agents, 미국 특허 제2007/0071764호로서 공개됨); Mouhat 등의 발명의 명칭: OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2; Sullivan 등의 미국 특허 출원 제11/978,076호(발명의 명칭: Conjugated 독소 펩타이드 Therapeutic Agents, 2007년 10월 25일 출원됨, 및 2009년 11월 26일에 미국 특허 제20090291885호 로서 공개됨), Sullivan 등의 WO 2008/088422; Lebrun 등의 미국 특허 제6,689,749호 및 Sullivan 등의 발명의 명칭: Selective and Potent Peptide Inhibitors of Kv1.3, 2009년 3월 20일 출원된 미국 가특허출원 제61/210,594호에서 발견될 수 있으며, 이들은 각각 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
용어 "펩타이드 유사체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 내부 첨가, 또는 적어도 하나의 아미노산의 내부 결실, 및/또는 아미노- 또는 카복시- 말단 단부 절단 또는 첨가에 의해 천연에서 존재하는 펩타이드 서열과 상이한 서열을 갖는 펩타이드를 지칭한다. "내부 결실"은 N- 또는 C-말단 이외의 위치에서 천연에서 존재하는 서열로부터 아미노산의 부재를 지칭한다. 마찬가지로, "내부 첨가"는 N- 또는 C-말단 이외의 위치에서 자연에서 존재하는 서열 내 아미노산의 존재를 지칭한다. "독소 펩타이드 유사체", 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, OSK1 펩타이드 유사체, ShK 펩타이드 유사체, 또는 ChTx 펩타이드 유사체는 관심의 본래 독소 펩타이드에 대해 관심의 본래 독소 펩타이드 서열의 변형(예를 들어, 아미노산 잔기 치환, 내부 첨가 또는 삽입, 내부 결실 및/또는 아미노- 또는 카복시-말단 단부 절단 또는 앞서 상기 기재한 바와 같은 첨가)을 함유한다.
"CGRP 펩타이드 길항물질"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, CGRP 펩타이드 유사체와 같은 CGRP1 수용체와 우선적으로 결합하고, 온도, pH 및 이온 강도의 생리적 조건 하에 전장 본래 인간 αCGRP 또는 βCGRP에 의해 CGRP1 수용체 활성화를 길항하고, 차단하며, 저감시키고, 감소시키며, 지연시키거나 또는 억제하는 펩타이드이다. CGRP 펩타이드 길항물질은 전체 및 부분적 길항물질을 포함한다. 이러한 길항물질 활성은 공지된 시험관내 방법 또는 생체내 기능적 분석 방법에 의해 검출될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Smith et al., Modifications to the N-terminus but not the C-terminus of calcitonin gene-related peptide(8-37) produce antagonists with increased affinity, J. Med. Chem., 46:2427-2435 (2003)] 참조). 유용한 CGRP 펩타이드 길항물질의 예는 Gegg 등의 발명의 명칭: CGRP peptide antagonists and conjugates, WO 2007/048026 A2 및 2006년 10월 19일 출원된 미국 가특허출원 제11/584,177호(미국 특허 제2008/0020978 A1호로서 공개됨)에 개시되며, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
용어 "부갑상선 호르몬(PTH) 작용물질" 및 "PTH 작용물질"은 PTH-1 또는 PTH-2 수용체에 결합하고, 전장 본래의 인간 부갑상선 호르몬과 같이 하나 이상의 PTH 활성 분석 변수를 증가시키거나 또는 감소시키는 분자를 지칭한다. 유용한 PTH 작용물질 펩타이드의 예는 미국 특허 제6,756,480호(발명의 명칭: Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein)의 표 1에 개시되며, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 대표적인 PTH 활성 분석은 미국 특허 제 6,756,480호의 실시예 1에 개시된다.
용어 "부갑상선 호르몬(PTH) 길항물질"은 PTH-1 또는 PTH-2 수용체에 결합하고, 전장 본래 인간 부갑상선 호르몬에 의해 해당 변수 상에서 정상 효과를 차단하거나 또는 방지하는 분자를 지칭한다. 유용한 PTH 길할물질 펩타이드의 예는 미국 특허 제6,756,480호의 표 2에 개시되며, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 대표적인 PTH 활성 분석은 미국 특허 제6,756,480호의 실시예 2에 개시된다.
용어 "브래디키닌 B1 수용체 길항물질 펩타이드" 및 "브래디키닌 B1 수용체 펩타이드 길항물질"은 인간 브래디키닌 B1 수용체(hB1)에 대해 길항물질 활성을 갖는 펩타이드로 만들어진다. 유용한 브래디키닌 B1 수용체 길항물질 펩타이드는 Ng 등의 발명의 명칭: Antagonist of the bradykinin B1 receptor, 2005년 9월 29일 공개된 미국 특허 제2005/0215470 A1호, 이는 미국 특허 제7,605,120호로서 발행됨; 미국 특허 제5,834,431호 또는 제5,849,863호에 기재된 바와 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있다. 대표적인 B1 수용체 활성 분석은 미국 특허 제2005/0215470 A1호의 실시예 6 내지 8에 개시된다.
용어 "트롬보포이에틴(TPO)-모방체 펩타이드" 및 "TPO-모방체 펩타이드"는 문헌[Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9], 미국 특허 제5,869,451호 및 제5,932,946호(이들은 그것의 전문이 참조로서 포함됨); 2003년 9월 18일 공개된 미국 특허 제2003/0176352호(이는 그것의 전문이 참조로서 포함됨); 2003년 4월 17일 공개된 WO 03/031589; 2000년 5월 4일 공개된 WO 00/24770; 및 미국 특허 공개 제2006/0140934호(2005년 9월 23일 출원된 미국 가특허 출원 제11/234,731호, 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)의 표 5에서 나타내는 임의의 펩타이드에 기재된 바와 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드를 지칭한다. 당업자는, 상이한 펩타이드 라이브러리를 갖는 다음의 개시된 과정에 의해 각각의 이들 기준이 그것에 사실상 개시된 것과 상이한 펩타이드를 선택하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "EPO-모방체 펩타이드" 및 "에리트로포이에틴-모방체 펩타이드"는 문헌[Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63, 및 Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7569-74]에 기재된 것과 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드를 지칭하며, 이들 둘 다 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 유용한 EPO-모방체 펩타이드는 공개된 미국 특허 제2007/0269369 A1 및 미국 특허 제6,660,843호의 표 5에 열거된 EPO-모방체 펩타이드를 포함하며, 이들 둘 다 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
용어 "ang-2-결합 펩타이드"는 2003년 12월 11일 공개된 미국 특허 제2003/0229023호; 2003년 7월 17일 공개된 WO 03/057134; 2003년 12월 25일 공개된 미국 특허 제2003/0236193호(이들 각각은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨); 및 공개된 미국 특허 제2006/0140934호의 표 6에 나타내는 임의의 펩타이드(2005년 9월 23일 출원된 미국 가특허출원 제11/234,731호, 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)에서 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드를 포함한다. 당업자는, 상이한 펩타이드 라이브러리를 갖는 다음의 개시된 과정에 의해 각각의 이들 기준이 그것에 사실상 개시된 것과 상이한 펩타이드를 선택하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "신경 성장 인자(NGF) 결합 펩타이드" 및 "NGF-결합 펩타이드"는 2004년 4월 1일 공개된 WO 04/026329에 기재된 바와 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드 및 공개된 미국 특허 제2006/0140934호의 표 7에서 확인되는 임의의 펩타이드를 포함한다(2005년 9월 23일 출원된 미국 가특허출원 11/234,731, 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에서 그것의 전문이 참조로서 포함됨). 당업자는, 상이한 펩타이드 라이브러리를 갖는 다음의 개시된 과정에 의해 각각의 이들 기준이 그것에 사실상 개시된 것과 상이한 펩타이드를 선택하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "마이오스타틴-결합 펩타이드"는 2003년 12월 19일 출원된 미국 가특허 출원 제10/742,379호(이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드 및 공개된 미국 특허 US 2006/0140934의 표 8에서 나타내는 펩타이드(2005년 9월 23일 출원된 미국 가특허출원 제11/234,731호, 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)를 포함한다. 당업자는, 상이한 펩타이드 라이브러리를 갖는 다음의 개시된 과정에 의해 각각의 이들 기준이 그것에 사실상 개시된 것과 상이한 펩타이드를 선택하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "BAFF-길항물질 펩타이드" 및 "BAFF 결합 펩타이드"는 미국 특허 출원 제2003/0195156 A1호(이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이 확인되거나 또는 유도될 수 있는 펩타이드 및 공개된 미국 특허 US 2006/0140934의 표 9에서 나타내는 펩타이드(2005년 9월 23일 출원된 미국 가특허출원 제11/234,731호, 발명의 명칭: Modified Fc Molecules, 이는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨)를 포함한다. 당업자는, 상이한 펩타이드 라이브러리를 갖는 다음의 개시된 과정에 의해 각각의 이들 기준이 그것에 사실상 개시된 것과 상이한 펩타이드를 선택하게 할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
앞의 언급은 단지 본 발명의 면역글로뷸린(항체 및 항체 단편을 포함)에 유용하게 컨쥬게이션되거나 또는 융합될 수 있는 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드의 비-제한적 예로서 의도된다. 어떤 것은 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있는 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드 모이어티를 포함하며, 소위 아비머(avimer) 구조를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(예를 들어, Kolkman 등의 발명의 명칭: Novel Proteins with Targeted Binding, 미국 특허 제2005/0089932호; Baker 등의 발명의 명칭: IL-6 Binding Proteins, 미국 특허 제2008/0281076호; Stemmer등의 발명의 명칭: Protein Scaffolds and Uses Thereof, 미국 특허 제2006/0223114호 및 미국 특허 제2006/0234299호).
유용한 임상전 동물 모델은 관심의 치료적 징후에서 약물을 승인하는 용도를 위해 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Valverde et al., J. Bone Mineral Res. 19:155 (2004)]에 의한 치주 질환의 입양-전달(adoptive-transfer) 모델; 문헌[Gruner et al., Blood 105:1492-99 (2005)]에서 동맥혈전의 초음파 혈관주위 도플러 유속계-기반 동물 모델; Braun 등의 WO 2009/115609 A1에서 폐 색전증 모델, 대동맥 폐색 모델 및 뮤린 뇌졸중 모델). 예를 들어, 다발성 경화증의 입양 전달 실험의 자가면역 뇌척수염(adoptive transfer experimental autoimmune encephalomyelitis, AT-EAE) 모델은 면역질병, 예컨대 다발성 경화증에 관한 조사를 위해 기재되었다(Beeton et al., J. Immunol. 166:936 (2001); Beeton et al., PNAS 98:13942 (2001); Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2의 실시예 45, 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함됨). AT-EAE 모델에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량으로 처리된 동물에 대해 유의하게 감소된 질병 중증도 및 증가된 생존이 기대되는 반면, 미처리 동물은 중증의 질병 및/또는 사망률을 발생시키는 것으로 예상된다. AT-EAE 모델을 실행하기 위하여, 수초염기성 단백질(myelin-basic protein, MBP)에 특이적인 뇌척수염의 CD4+ 래트 T 세포주인 PAS는 Dr. Evelyne Beraud로부터 유래되었다. 시험관내 이들 세포의 유지 및 AT-EAE 모델에서 그것의 사용은 더 일찍 기재되었다[Beeton et al. (2001) PNAS 98, 13942]. PAS T 세포는 MBP 및 방사선 조사된 흉선 세포(제2일)에 의한 항원 자극 또는 활성화 및 T 세포 성장 인자에 의한 증식(제5일)의 라운드를 변경시킴으로써 시험관내에서 유지된다. PAS T 세포(3×105/㎖)의 활성화는 10㎍/㎖ MBP 및 15×106/㎖ 공통 유전자 방사선 조사된(3500 ㎭) 흉선 세포와 함께 2일 동안 세포를 인큐베이션시키는 것을 수반한다. 시험관 내 활성화 후 제2일에, 10 내지 15×106 생존 가능한 PAS T 세포는 6 내지 12주령의 암컷 루이스 래트(Charles River Laboratories)에 꼬리 IV에 의해 주사된다. 비히클(PBS 중의 2% 루이스 래트 혈청) 또는 시험 약제학적 조성물의 매일의 피하 주사는 -1일 내지 3일에 주어지며, 여기서 -1일은 PAS T 세포의 주사(제0일) 전 1일을 나타낸다. 비히클 처리된 래트에서, 급성 EAE는 PAS T 세포의 주사 후 4 내지 5일에 발생할 것으로 예상된다. 전형적으로 혈청은 억제제의 수준 분석을 위해 제4일에 꼬리 정맥 출혈에 의해, 제8일(연구의 마지막 날)에 심장천자에 의해 수집된다. 래트는 전형적으로 제-1일, 제4일, 제6일 및 제8일에 무게를 잰다. 동물은 세포 전달일(제0일)로부터 제3일까지 1일 1회, 및 제4일 내지 제8일에 1일 2회 블라인드로 스코어링될 수 있다. 임상적 징후는 각 사지 및 꼬리의 부전마비 정도의 전체 스코어로서 평가된다. 임상적 스코어링: 0 = 징후 없음, 0.5 = 말단의 축 처진 꼬리, 1.0 = 축 처진 꼬리, 2.0 = 경증의 마비, 운동실조증, 3.0 = 보통의 마비, 3.5 = 하나의 뒷다리 마비, 4.0 = 완전한 뒷다리 마비, 5.0 = 완전한 뒷다리 마비 및 실금, 5.5 = 사지마비, 6.0 = 빈사상태 또는 죽음. 5.0의 스코어에 도달한 래트는 전형적으로 안락사시킨다.
면역글로뷸린의 항체 전형의 생성
다클론성 항체. 다클론성 항체는 적절한 항원 및 애주번트(adjuvant)의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 상승된다. 대안적으로, 항원은 동물의 림프절 내로 직접적으로 주사될 수 있다(문헌[Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997] 참조). 개선된 항체 반응은 면역화된 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로뷸린(thyroglobulin) 또는 대두 트립신 억제제에 2작용성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 숙신 알데하이드 또는 당업계에 공지된 다른 작용제를 사용하여 적절한 항원을 컨쥬게이트 함으로써 얻어질 수 있다.
3 부피의 프로인트 완전 애주번트와 함께 100㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트(마우스에 대해)를 조합하고, 다양한 부위에서 피부 내로 용액을 주사함으로써 동물은 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 동물은 다수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 애주번트 내 펩타이드 또는 컨쥬게이트의 본래 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅된다. 부스터 주사 후 7 내지 14일에, 동물을 출혈시켰고, 항체 역가에 대해 혈청을 분석한다. 역가 안정기까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 동물을 동일 항원의 컨쥬게이트로 부스팅하지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 컨쥬게이트된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양물에서 만들어질 수 있다. 또한, 알륨과 같은 응집제가 적합하게 사용되어 면역 반응을 향상시킨다.
단클론성 항체. 제공되는 본 발명의 면역글로뷸린은 단클론성 항체를 포함한다. 단클론성 항체는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예를 들어 면역화 스케줄의 완료 후 유전자이식 동물로부터 채취한 비장 세포를 불멸하게 함으로써 생성될 수 있다. 비장 세포는, 예를 들어 그것들을 골수종세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성함으로써 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 불멸화될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 우선 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들어질 수 있거나, 또는 일반적으로 등몰의 경쇄 및 중쇄의 생성을 용이하게 하는 "분할 DHFR" 방법과 같은 방법을 포함하고, 선택적으로 항체를 글라이코실화시킬 수 있는 포유류 세포주(예를 들어, CHO 세포)를 사용하여(예를 들어 유럽특허 제0481790 A2호 및 미국 특허 제5,545,403호의 Antibody production 페이지), 본 발명에 유용한 것으로(예를 들어 Cabilly 등의 발명의 명칭, Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein, 미국 특허 제6,331,415) 사전 결정된 서열로부터 재조합 DNA에 의해 만들어질 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 면역글로뷸린의 생성에 유용하지 않지만, 항원 결합 단백질을 생성하는데 유용한 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙조 포유류, 예컨대 래트, 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발하기 위하여 본 명세서 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그 다음에 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜을 사용하여 골수중 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
일부 예에서, 하이브리도마 세포주는 면역원과 함께 인간 면역글로뷸린 서열을 갖는 유전자이식 동물을 면역화하고; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 채취하며; 골수종 세포주에 채취한 비장 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 생성하고; 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하고, 관심의 항원에 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인함으로써 생성된다. 이러한 하이브리도마 세포주 및 그것에 의해 생성된 단클론성 항체는 본 발명의 양태이다.
일단 제조되면, 하이브리도마 세포는 씨딩되고, 바람직하게는 비융합된 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양배지 중에서 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT 또는 HPRT)가 없다면, 하이브리도마에 대한 배양배지는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생성을 지원하며, 배지에 민감한 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종성골수종 세포주는 또한 인간 단클론성 항체의 생성에 대해 기재되었다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 하이브리도마-생성 융합 과정에서 사용을 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생성이며, 효율적으로 고도의 융합 및 단지 원하는 융합 세포(하이브리도마)의 성장을 지원하는 특정 선택적 배지에서 성장할 수 있도록 만드는 효소 결핍증을 가진다. 마우스 융합을 위한 적합한 세포주의 예는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul을 포함하며; 래트 융합에서 사용된 세포주의 예는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 포함한다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 관련된 단클론성 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사선면역분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다. 단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 바이아코어(BIAcore)(등록상표) 또는 스캐차드(Scatchard) 분석(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Fischer 등의 발명의 명칭: A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, 실시예 10, 이들은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다)에 의해 결정될 수 있다.
하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 것이 확인된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 게다가, 혼성 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
하이브리도마 또는 mAbs는 특정 특성, 예컨대 Kv1.x 채널을 통한 K1 + 유동을 억제하는 능력을 갖는 mAbs를 확인하기 위해 추가로 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크린의 예는 이하의 실시예에 제공된다. 서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는 배양 배지, 복수 유체 또는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화도 크로마토그래피 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 정제 기법과 같은 통상적인 면역글로뷸린 정제 과정에 의한 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
항체의 재조합 생성. 본 발명은 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체 단편을 포함하는 항체 중 어떤 것(다클론성 및 단클론성)을 암호화하고, 선택적으로 숙주 세포에 의해 인식된 제어 서열, 벡터 및 핵산을 포함하는 숙주 세포에 작동가능하게 연결된 분리된 핵산 및 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 핵산이 발현되고, 선택적으로 숙주 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는, 항체의 생성을 위한 재조합 기법을 제공한다. 유사한 물질 및 방법은 폴리펩타이드계 면역글로뷸린의 생성에 적용된다.
관심의 면역글로뷸린 또는 폴리펩타이드로부터 적절한 아미노산 서열은 직접 단백질 시퀀싱에 의해 결정될 수 있고, 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 보편적인 코돈 표에 따라 설계될 수 있다. 대안적으로, 단클론성 항체를 암호화하는 게놈 또는 cDNA는 통상적인 과정을 사용하여 이러한 항체를 생성하는 세포로부터 분리되고 시퀀싱될 수 있다(예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써).
DNA의 클로닝은 표준 기법을 사용하여 수행된다(예를 들어, 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press] 참조). 예를 들어, cDNA 라이브러리는 폴리A+ mRNA의 역 전사, 바람직하게는 막-결합 mRNA 및 인간 면역글로뷸린 폴리펩타이드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 스크리닝된 라이브러리에 의해 구성될 수 있다. 그러나 한 실시형태에서, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 관심의 면역글로뷸린 유전자 절편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 가변 절편)을 암호화하는 cDNA(또는 전장 cDNA의 부분)을 증폭시키기 위해 사용된다. 증폭된 서열은 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 꼬마유전자(minigene) 벡터 또는 파지 디스플레이 벡터 내로 용이하게 클로닝될 수 있다. 관심의 면역글로뷸린 폴리펩타이드의 일부 서열을 결정하는 것이 가능하다면, 특정의 사용된 클로닝 방법은 중요하지 않다는 것이 인식될 것이다.
항체 핵산에 대한 한 공급원은 관심의 항원에 의해 면역화된 동물로부터 B 세포를 얻고 불멸 세포에 그것을 융합시킴으로써 생성된 하이브리도마이다. 대안적으로, 핵산은 면역화된 동물의 B 세포(또는 전체 비장)로부터 분리될 수 있다. 항체를 암호화하는 핵산의 또 다른 공급원은, 예를 들어 파지 디스플레이 기법을 통해 이러한 만들어진 핵산의 라이브러리이다. 관심의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 원하는 결합 특징을 갖는 가변 영역 펩타이드는 패닝(panning)과 같은 표준 기법에 의해 확인될 수 있다.
면역글로뷸린 폴리펩타이드의 전체 가변 영역을 암호화하는 서열은 결정될 수 있지만; 때때로 가변 영역의 단지 일부, 예를 들어 CDR-암호화 부분을 시퀀싱하기에 적합할 것이다. 시퀀싱은 표준 기법을 사용하여 수행된다(예를 들어, 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 및 Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467] 참조). 인간 면역글로뷸린 유전자 및 cDNA의 공개된 서열과 클로닝된 핵산 서열을 비교함으로써, 당업자는 시퀀싱된 영역에 따라서 (i) 하이브리도마 면역글로뷸린 폴리펩타이드(중쇄의 아이소타입을 포함)의 생식세포계열 절편 사용량 및 (ii) N-영역 첨가로부터 초래되는 서열을 포함하는 중쇄 경쇄 가변 영역의 서열 및 체세포돌연변이 과정을 용이하게 결정할 것이다. 면역글로뷸린 유전자 서열 정보의 한 공급원은 메릴랜드주 베데스다에 소재한 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information), 국립 의학 도서관(National Library of Medicine), 미국국립보건원(National Institutes of Health)이다.
분리된 DNA는 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 발현 벡터 내로 위치될 수 있는데, 이는 그 다음에 면역글로뷸린 단백질을 달리 생성하지 않는 숙주 세포 내로 트랜스펙션되어 재조합 숙주 세포 내 단클론성 항체의 합성을 지시한다. 항체의 재조합 생성은 당업계에 잘 공지되어 있다.
다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치될 때 핵산은 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는, 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전 단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드에 대해 DNA에 작동가능하게 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면, 암호 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된은, 연결된 DNA서열이 분비 리더 서열에 관하여 인접하고, 리딩 상에 인접한 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하지 않는다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실행에 따라서 사용된다.
다수의 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 벡터 성분은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있으며: 신호 서열(예를 들어, 항체의 분비를 지시할 수 있음; 예를 들어, ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT// 서열번호 102, 이는 VK-1 신호 펩타이드 서열 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC// 서열번호 103을 암호화함), 복제원점, 하나 이상의 선택적 마커 유전자(이는 예를 들어 항생물질 또는 다른 약물 저항성, 상보적 영양요구성 결핍증을 부여할 수 있거나, 또는 배지 내에서 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급할 수 있음), 인핸서 구성요소, 프로모터 및 전사 종결 서열, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다.
세포, 세포주 및 세포 배양물은 종종 상호호환적으로 사용되며, 본 명세서에서 모든 이러한 명명은 자손을 포함한다. 형질전환체 및 형질전환된 세포는 주요 대상 세포 및 그것으로부터 유래된 배양물을 포함하며, 이동된 수는 무시한다. 또한 모든 자손은 고의적인 또는 우연한 돌연변이에 기인하여 DNA 함량에서 정확하게 동일할 수는 없다는 것이 이해된다. 본래 형질전환된 세포 내에서 스크리닝한 바와 같이 동일 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손은 배양된다.
대표적인 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 더 고등의 진핵생물 세포를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포는 그램-음성 또는 그램-양성 유기체와 같은 진정세균, 예를 들어 에스케리키아와 같은 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이콜 라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아( Erwinia ), 클렙시엘라( Klebsiella ), 프로테우스( Proteus ), 살모넬라( Salmonella ), 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium ), 세라티아( Serratia ), 예를 들어, 세라티아 마르세센스( Serratia marcescans ) 및 쉬겔라(Shigella)뿐만 아니라 바실러스( Bacillus ), 예컨대 바실러스 서브틸리스( B. subtilis ) 및 바실러스 리체니포미스( B. licheniformis ), 슈도모나스( Pseudomonas ) 및 스트렙토마이세스( Streptomyces )를 포함한다. 진핵 미생물, 예컨대 곰팡이 또는 효모는 재조합 폴리펩타이드 또는 항체에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae ) 또는 보통의 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물유기체 중에서 가장 흔히 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 피키아( Pichia ), 예를 들어 피키아 파스토리스( P. pastoris ), 쉬조사카로마이세스 폼베( Schizosaccharomyces pombe ); 클루이베로마이세스( Kluyveromyces ), 야로이야( Yarrowia ); 칸디다( Candida ); 트리코더마 레시아( Trichoderma reesia ); 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa ); 쉬바니오마이세스( Schwanniomyces ), 예컨대 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스( Schwanniomyces occidentalis ); 및 곰팡이( filamentous fungi ), 예를 들어 뉴로스포라( Neurospora ), 페니실리움( Penicillium ), 톨리포클라디움( Tolypocladium ) 및 아스퍼질러스( Aspergillus ) 숙주, 예컨대 아스퍼질러스 니듈란스( A. nidulans ) 및 아스퍼질러스 니거( A. niger )가 흔히 이용가능하며, 본 명세서에서 유용하다.
항체를 포함하는 글라이코실화된 면역글로뷸린의 발현을 위한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포, 예컨대 도둑나방( Spodoptera frugiperda )(털애벌레), 이집트숲모기( Aedes aegypti )(모기), 흰줄숲모기( Aedes albopictus )(모기), 노랑초파리( Drosophila melanogaster )(광대파리류), 및 누에나방( Bombyx mori )이 확인되었다. 이러한 세포의 트랜스펙션을 위한 다양한 바이러스 균주는 공공연하게 입수가능한, 예를 들어 오토그래파 캘리포니카( Autographa californica ) NPV의 L-1 변이체 및 누에나방 NPV의 Bm-5 균주이다.
척추동물 숙주 세포는 또한 적합한 숙주이며, 이러한 세포로부터 항원 결합 단백질(항체를 포함)의 재조합 생성은 일상적인 과정이 된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 CHOK1 세포(ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소 세포; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포(현탁 배양물 중에서 성장을 위해 서브클로닝시킨 293 또는 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 셀포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 또는 포유류 골수종 세포이다.
숙주 세포는 생성 면역글로뷸린에 대해 상기 기재된 핵산 또는 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 트랜스펙션되고, 프로모터의 유발, 형질전환체의 선택 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적절한 변형된 통상적인 영양소 배지 내에서 배양된다. 추가로, 선택 마커에 의해 분리된 전사 단위의 다양한 복제물을 갖는 신규 벡터 및 트랜스펙션된 세포주는 면역글로뷸린의 발현에 특히 유용하다.
본 발명의 면역글로뷸린을 생성하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium(MEM), Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Sigma)와 같은 상업적으로 입수가능한 배지는 숙주 세포의 배양에 적합하다. 추가로, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO90103430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. No. 30,985에 기재된 배지 중 어떤 것은 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어떤 것은 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 상피세포 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생물질(예컨대 Gentamycin(상표명) 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도에서 보통 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등몰의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포의 배양 시, 면역글로뷸린은 주변세포질 공간에서 세포 내로 생성되거나 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 면역글로뷸린이 제1 단계로서 세포 내로 생성된다면, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 초미세여과에 의해 제거된다.
면역글로뷸린(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)은 친화도 리간드로서 관심의 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하여 하이드록실아파타이드 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기반한 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입에 대해 및 인간 γ3에 대해 추천된다(Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 유동 속도를 더 빠르게 하며 처리 시간을 더 짧게 한다. 단백질이 CH 3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX(상표명) 수지(뉴저지주 필립스버그에 소재한 J. T. Baker)는 정제에 유용하다. 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기법이 또한 회수되는 항체에 따라서 가능하다.
Chimeric, Humanized and Human Engineered(상표명) 단클론성 항체. 설치류 단클론성 항체의 가변성 Ig 도메인이 인간 불변 Ig 도메인에 융합된 키메라 단클론성 항체는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 만들어질 수 있다(문헌[Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; 및, Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646. (1984)] 참조). 예를 들어, (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에 비-인간 상보적 결정 영역(CDR)을 접합함으로써(당업계에서 "CDR 접합"을 통해 인간화로서 언급되는 과정) 또는 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 표면으로 그것들을 "클로킹(cloaking)" 함으로써 또는 (3) 항원-결합 또는 항원 구조에서 각 잔기의 참여 가능성 및 면역원성에 대한 그것의 가능성을 기반으로, 선택된 비-인간 아미노산 잔기가 더 인간이 되도록 변형시킴으로써, 인간화 또는 변형 항체 서열이 더 인간-유사가 되도록 하기 위한 다수의 기법이 기재되었다. 예를 들어 문헌[Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); 및 Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)]을 참조하며; 이들 각각은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
예를 들어 (1) 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에 비-인간 상보적 결정 영역(CDR)을 접합함으로써(당업계에서 "CDR 접합"을 통해 인간화로서 언급되는 과정) 또는 (2) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 표면으로 그것들을 "클로킹"함으로써(당업계에서 "버니어링(veneering)"으로서 언급되는 과정) 또는 (3) 항원-결합 또는 항원 구조에서 각 잔기의 참여 가능성 및 면역원성에 대한 그것의 가능성을 기반으로, 선택된 비-인간 아미노산 잔기가 더 인간이 되도록 변형시킴으로써, 인간화 또는 변형 항체 서열이 더 인간-유사가 되도록 하기 위한 다수의 기법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); 및 Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994)]을 참조하며; 이들 각각은 본 명세서에 그들의 전문이 참조로서 포함된다.
본 발명의 한 양태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역(표 2A 내지 표 2B)은 동일 또는 상이한 계통 발생 종으로부터 프레임워크 영역(FR)에 접합된다. 공통 인간 FR을 만들기 위하여, 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR은 정렬되어 공통 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 중쇄 또는 경쇄의 FR은 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터 FR로 대체된다. 한 양태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR에서 희귀 아미노산은 대체되지 않는 반면, FR 아미노산의 나머지는 대체된다. "희귀 아미노산"은 위치에서 특이적 아미노산인데, 이때 이 특정 아미노산은 FR에서 보통 발견되지 않는다. 대안적으로, 하나의 중쇄 및 경쇄로부터 접합된 가변 영역은 본 명세서에 개시된 해당 특정 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역과 상이한 불변 영역과 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 접합된 가변 영역은 단일 쇄 Fv 항체의 부분이다.
항체는 또한 내인성 면역글로뷸린 생성을 갖지 않고, 인간 면역글로뷸린 좌위를 함유하도록 유전자조작된 유전자이식 동물을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, WO 98/24893은 인간 Ig 좌위를 갖는 유전자이식 동물을 개시하되, 해당 동물은 내인성 중쇄 및 경쇄 좌위의 불활성화에 기인하여 기능적 내인성 면역글로뷸린을 생성하지 않는다. WO 91/10741은 면역원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 유전자이식 비-영장류 포유류 숙주를 개시하되, 항체는 영장류 불변 및/또는 가변 영역을 가지며, 좌위를 암호화하는 내인성 면역글로뷸린은 치환되거나 또는 불활성화된다. WO 96/30498은 포유류 내 면역글로뷸린 좌위를 변형시키기 위한, 예컨대 불변 또는 가변 영역의 모두 또는 일부를 대체하여 변형된 항체 분자를 형성하기 위한 Cre/Lox 시스템의 용도를 개시한다. WO 94/02602는 불활성화된 내인성 Ig 좌위 및 기능성 인간 Ig 좌위를 갖는 비-인간 포유류 숙주를 개시한다. 미국 특허 제 5,939,598호는 유전자이식 마우스의 제조방법을 개시하는데, 이때 마우스는 내인성 중쇄를 결여하며, 하나 이상의 이종이식 불변 영역을 포함하는 외인성 면역글로뷸린 좌위를 발현시킨다.
상기 기재한 유전자이식 동물을 사용하여, 면역 반응은 선택된 항원성 분자에 대해 생성될 수 있고, 항원 생성 세포는 동물로부터 제거되고, 인간-유래 단클론성 항체를 분비시키는 하이브리도마를 생성하도록 사용될 수 있다. 면역화 프로토콜, 애주번트 등은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 96/33735에 기재된 바와 같은 유전자이식 마우스의 면역화에서 사용된다. 단클론성 항체는 대응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리적 효과를 억제하거나 또는 중화하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 또한 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Mendez et al., Nat . Genet. 15:146-156 (1997)]; 및 미국 특허 제5,591,669호, 미국 특허 제 5,589,369호, 미국 특허 제5,545,807호; 및 미국 특허 제20020199213호를 참조한다. 미국 특허 제20030092125호는 원하는 에피토프에 대해 동물의 면역 반응을 편향시키기 위한 방법을 기재한다. 인간 항체는 또한 시험관내 불활성화된 B 세포에 의해 만들어질 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
파지 디스플레이 기법에 의한 항체 생성
재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 제조하기 위한 기법의 개발 및 섬질 박테리오파지의 표면 상에서 암호화된 항체 단편의 디스플레이는 인간-유래 항체을 만들기 위한 다른 수단을 제공하였다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 Dower 등의 WO 91/17271, McCafferty 등의 WO 92/01047, 및 문헌[Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)]에 기재되며, 이들 각각은 그것의 전문이 참조로서 본 명세서에 포함된다. 파지 기법에 의해 생성된 항체는 보통 박테리아에서 항원 결합 단편, 예를 들어 Fv 또는 Fab 단편으로서 생성되고, 따라서 효과기 기능을 결여한다. 효과기 기능은 하기 2가지 전략 중 하나에 의해 도입된다: 단편은 포유류 세포 내 발현을 위해 완전한 항체 내로 또는 효과기 기능을 촉발시킬 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이성 항체 단편 내로 유전자 조작될 수 있다.
전형적으로, 항체의 Fd 단편(VH-CH1) 및 경쇄(VL-CL)는 PCR에 의해 별도로 클로닝되고, 조합적 파지 디스플레이 라이브러리 내에서 무작위로 재조합되는데, 이는 그 다음에 특정 항원에 결합을 위해 선택될 수 있다. 항체 단편은 파지 표면 상에서 발현되고, 항원 결합에 의한 Fv 또는 Fab(및 따라서 항원 단편을 암호화하는 DNA를 함유하는 파지)의 선택은 항원 결합 및 재-증폭, 패닝으로 칭해지는 과정의 몇몇 라운드를 통해 수행된다. 항원에 특이적인 항원 단편은 풍부하게 되고, 최종적으로 분리된다.
파지 디스플레이 기법은 또한 "유도된(guided) 선택"으로 불리는 설치류 단클론성 항체의 인간화를 위한 접근에서 사용될 수 있다(문헌[Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)] 참조). 이를 위해, 마우스 단클론성 항체의 Fd 단편은 인간 경쇄 라이브러리와 조합되어 디스플레이될 수 있고, 그 다음에 얻어진 혼성 Fab 라이브러리는 항원과 함께 선택될 수 있다. 이에 의해 마우스 Fd 단편은 선택을 유도하기 위한 주형을 제공한다. 이후에, 선택된 인간 경쇄는 인간 Fd 단편 라이브러리와 조합된다. 얻어진 라이브러리의 선택은 완전한 인간 Fab를 수득한다.
파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하기 위한 다양한 과정이 기재되었다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)]; 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호; 문헌[Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)] 참조). 특히, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 항체의 시험관내 선택 및 진화는 강력한 도구가 되었다(문헌[Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); 및 Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994)]; 미국 특허 제20020004215호 및 WO92/01047; 2003년 10월 9일 공개된 미국 특허 제20030190317호 및 미국 특허 제 6,054,287호; 미국 특허 제5,877,293호 참조).
문헌[Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193] 및 2003년 3월 6일 공개된 미국 특허 공개 제20030044772호는 파지-발현된 항체 라이브러리 또는 포획 리프트에 의한 다른 결합 분자를 스크리닝하기 위한 방법, 고체 지지체 상에서 후보 결합 분자의 고정을 수반하는 방법을 기재한다.
면역글로뷸린의 다른 실시형태: 항체 단편
상기 주목한 바와 같이, 항체 단편은 완전한 전장 항체의 일부, 바람직하게는 무결함 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하며, 항체 단편으로부터 형성된 선형 항체 및 다중특이성 항체를 포함한다. 항체 단편의 비제한적 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 도메인 항체(dAb), 상보적 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 단일 쇄 항체 단편, 맥시바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체, 킬레이팅 재조합 항체, 트라이아바디 또는 바이바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역약제(small modular immunopharmaceutical: SMIP), 항원-결합-도메인 면역글로뷸린 융합 단백질, 카멜화된(camelized) 항체, VHH 함유 항체 또는 이들의 돌연변이 단백질 또는 유도체, 항체가 원하는 생물학적 활성을 보유한다면 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로뷸린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드, 예컨대 CDR 서열을 포함한다. 이러한 항원 단편은 전체 항체의 변형에 의해 생성될 수 있고 또는 재조합 DNA 기법 또는 펩타이드 합성을 사용하여 데노보(de novo) 합성될 수 있다.
추가적인 항체 단편은 VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)을 포함한다.
"선형 항체"는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤(tandem) Fd 절편(VH -CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다(Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).
펩타이드 링커(힌지 없음)를 통해 또는 IgG 힌지를 통해 CH3에 융합된 scFv로 이루어진 "미니바디"는 문헌[Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23]에 기재되었다.
용어 "맥시바디"는 면역글로뷸린의 Fc 영역에 공유적으로 부착된 2가의 scFv를 지칭하며, 예를 들어 문헌[Fredericks et al, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) 및 Powers et al., Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001)]을 참조한다.
경쇄가 없는 기능성 중쇄 항체는 특정 동물 종, 예컨대 수염상어, 워베공 상어 및 낙타과(Camelidae), 예컨대 낙타, 단봉낙타, 알파카 및 라마에서 자연적으로 발생한다. 항원-결합 부위는 이들 동물에서 단일 도메인, VHH 도메인으로 환원된다. 이들 항체는 단지 중쇄 가변 영역을 사용하여 항원-결합 영역을 형성하며, 즉 이들 기능적 항체는 단지 구조 H2L2("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로서 언급됨)를 갖는 호모다이머이다. 알려진 바에 의하면 카멜화된 VHH는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하고 CH1 도메인을 결여하는 IgG2 및 IgG3 불변 영역과 재조합된다. 고전적인 VH-단독 단편은 가용성 형태를 생성하기가 어렵지만, 프레임워크 잔기가 더 VHH-유사가 되도록 변경될 때 용해도 및 특이적 결합의 개선이 얻어질 수 있다. (예를 들어, 문헌[Reichman, etal., J Immunol Methods 1999, 231:25-38] 참조). 카멜화된 VHH 도메인은 고 친화도를 갖는 항체와 결합하며(Desmyter et al., J. Biol . Chem . 276:26285-90, 2001) 용액 중에서 높은 안정성을 소유하는 것이 발견되었다(Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). 카멜화된 중쇄를 갖는 항체를 만들기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 공개 제2005/0136049호 및 제2005/0037421호에 기재된다. 대안적인 스캐폴드는 상어 V-NAR 스캐폴드와 더 가깝게 매치되는 인간 가변-유사 도메인으로부터 만들어질 수 있으며, 긴 침투 루프 구조를 위한 프레임워크를 제공할 수 있다.
중쇄 항체의 가변 도메인이 단지 15 kDa의 분자량을 갖는 가장 작은 완전히 기능성인 항원-결합 단편이기 때문에, 이 독립체는 나노바디로서 언급된다(Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). 나노바디 라이브러리는 Conrath 등의 (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001)에 기재된 바와 같은 면역화된 단봉낙타로부터 만들어질 수 있다.
인트라바디는 세포내 발현을 증명하고 세포내 단백질 기능을 조작할 수 있는 단일 쇄 항체이다(Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004). 세포내 영역에서 항체 구성체를 보유하는 세포 신호 서열을 포함하는 인트라바디는 Mhashilkar 등의 (EMBO J 14:1542-51, 1995) 및 Wheeler 등의 (FASEB J. 17:1733-5. 2003)에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 트랜스바디는 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain: PTD)이 단일 쇄 가변 단편(scFv) 항체에 융합된 세포-침투성 항체이다(Heng et al. Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).
표적 단백질에 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 면역글로뷸린 융합 단백질인 항체가 본 발명에 의해 추가로 포함된다. 이들 구성체는 항체 효과기 기능을 수행하기 위해 필요한 면역글로뷸린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단일-쇄 폴리펩타이드이다. 예를 들어, WO03/041600, 미국 특허 공개 제20030133939호 및 미국 특허 공개 제20030118592호를 참조한다.
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무결함 항체의 단백질분해를 통해 유래되었지만, 또한 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988); Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]을 참조한다.
면역글로뷸린의 다른 실시형태: 다가 항체
일부 실시형태에서, 다가의 또는 심지어 다중특이성(예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성 등) 단클론성 항체를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체는 표적 항원의 적어도 2가지 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가질 수 있으며, 또는 대안적으로 2개의 상이한 분자에, 예를 들어 표적 항원에 및 세포 표면 단백질 또는 수용체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 표적에 결합하는 암(arm) 및 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3)에 결합하는 다른 암, 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)을 포함하여, 표적-발현 세포에 대한 세포 방어 메커니즘을 집중시킬 수 있다. 다른 예로서, 이중 특이성 항체는 표적 항원을 발현시키는 세포에 세포독성제를 국소화하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 항체는 표적-결합 암 및 세포독성제에 결합하는 암(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-60, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성활성 동위원소 햅텐)을 소유한다. 다중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 면역글로뷸린(예를 들어, 항체 및 항체 단편) 및 컨쥬게이트는 또한 다가의 형태로 폴딩되도록 구성될 수 있는데, 이는 혈액 내 반감기를 개선시킬 수 있다. 다가의 형태는 당업계에 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다.
이중특이성 또는 다중특이성 항체는 가교된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 나머지는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 공지되어 있으며, 다수의 가교 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시된다. 다른 방법은 scFv의 C-말단에서 스트렙타비딘-암호 서열을 첨가함으로써 테트라머를 만들도록 설계된다. 스트렙타비딘은 4개의 서브유닛으로 구성되며, 따라서 scFv-스트렙타비딘이 폴딩될 때, 4개의 서브유닛은 결합되어 테트라머를 형성한다(Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995), 이것의 개시는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다).
이중특이성 항체의 제조를 위한 다른 접근에 따라서, 항체 분자 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수된 헤테로다이머의 백분율을 최대화하도록 유전자조작될 수 있다. 한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 또는 유사한 크기의 상보적 "구멍"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 만들어진다. 이는 호모다이머와 같은 다른 원치않는 최종 생성물 이상으로 헤테로다이머 수율을 증가시키기기 위한 메커니즘을 제공한다. 1996년 9월 6일 공개된 WO 96/27011을 참조한다.
항체 단편으로부터 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 만들기 위한 기법은 또한 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 이중특이성 또는 삼중특이성 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 과정을 기재하며, 여기서 무결함 항체는 단백질 분해로 절단되어 F(ab')2 단편을 만든다. 이들 단편은 이웃자리(vicinal) 다이티올을 안정화시키고 분자간 이황화 결합 형성을 방지하기 위하여 다이티올 착화제 아비산나트륨의 존재에서 환원된다. 그 다음에 만들어진 Fab' 단편은 티오나이트로벤조에이트(TNB) 유도체로 변환된다. 그 다음에 Fab'-TNB 유도체의 하나는 머캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재변환되고, 다른 Fab'-TNB 유도체의 등몰량과 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다. 생성된 이중특이성 항체는 효소의 선택적 면역화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 문헌[Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)]은 박테리아로부터 기능적 항체 단편의 분비를 개시한다(예를 들어, 문헌[Better et al., Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988)] 참조). 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이콜라이로부터 직접적으로 회수될 수 있으며, 화학적으로 커플링되어 이중특이성 항체를 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).
문헌[Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이성 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 이콜라이로부터 별개로 분비되었고, 시험관내 화학적 커플링이 실시되어 이중특이성 항체를 형성한다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이성 또는 다중특이성 항체 단편을 제조하고 분리하기 위한 다양한 기법이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼, 예를 들어 GCN4를 사용하여 생성되었다. (일반적으로 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참조). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모다이머는 힌지 영역에서 환원되어 모노머를 형성한 다음, 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성한다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머의 생성을 위해 이용될 수 있다.
상기 기재한 다이아바디는 이중특이성 항체의 한 예이다. 예를 들어, 문헌[ Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]을 참조한다. 2가의 다이아바디는 이황화결합에 의해 안정화될 수 있다.
안정한 단일특이성 또는 이중특이성 Fv 테트라머가 또한 (scFv2)2 입체배치에서 또는 비스-테트라바디로서 비공유 결합에 의해 만들어질 수 있다. 대안적으로, 2개의 상이한 scFv는 탠덤으로 결합되어 비스-scFv를 형성할 수 있다.
단일-쇄 Fv(sFv)의 사용에 의해 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)]을 참조한다. 한 접근은 2개의 scFv 항체를 링커 또는 이황화 결합과 연결하였다(Mallender and Voss, J. Biol. Chem. 269:199-2061994, WO 94/13806 및 미국 특허 제5,989,830호, 이들의 개시는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다).
대안적으로, 이중특이성 항체는 문헌[Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 바와 같이 생성된 "선형 항체"일 수 있다. 간략하게, 이들 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 절편의 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
2 이상의 원자가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항ㅇ체가 제조될 수 있다. (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
"킬레이팅 재조합 항체"는 표적 항원의 인접한 비-중첩 에피토프를 인식하는 이중특이성 항체이며, 에피토프 둘 다에 자발적으로 결합될 만큼 충분히 가용성이다(Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).
이중특이성 Fab-scFv("바이바디") 및 삼중특이성 Fab-(scFv)(2)("트라이바디")의 생성은 Schoonjans 등의 (J Immunol. 165:7050-57, 2000) 및 Willems 등의(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)에 기재된다. 바이바디 또는 트라이바디에 대해, scFv 분자는 VL-CL(L) 및 VH-CH1(Fd) 쇄 중 하나 또는 둘 다에 융합되어, 예를 들어 트라이바이를 생성하며, 2개의 scFv는 Fab의 C-말단에 융합되는 한편, 바이바디에서 하나의 scFv는 Fab의 C-말단에 융합된다.
또 다른 방법에서, 다이머, 트라이머 및 테트라머는 유리 시스테인이 모 단백질에 도입된 후 생성된다. 다양한 수(2 내지 4)의 말레이미드 기를 갖는 펩타이드계 가교제가 사용되어 유리 시스테인에 관심의 단백질을 가교하며(Cochran et al., Immunity 12(3): 241-50 (2000), 이것의 개시는 본 명세서에 전문이 포함된다).
면역글로뷸린의 다른 실시형태
본 발명의 면역글로뷸린은 또한 펩티바디를 포함한다. 용어 "펩티바디"는 적어도 하나의 펩타이드에 부착된 항체 Fc 도메인을 포함하는 분자를 지칭한다. 펩티바디의 생성은 일반적으로 2000년 5월 4일 공개된 국제특허출원 WO 00/24782에 기재되어 있다. 이들 펩타이드 중 어떤 것은 링커에 의해 또는 링커 없이 탠덤으로(즉, 연속적으로) 연결될 수 있다. 시스테이닐 잔기를 함유하는 펩타이드는 다른 Cys-함유 펩타이드에 의해 가교될 수 있으며, 이중 하나 또는 둘 다는 비히클에 연결될 수 있다. 하나 이상의 Cys 잔기를 갖는 임의의 펩타이드는 펩타이드내 이황화 결합도 형성할 수 있다. 이들 펩타이드 중 어떤 것은 유도체화될 수 있고, 예를 들어 카복실 말단은 아미노기로 캡핑될 수 있으며, 시스테인은 캡핑될 수 있거나, 또는 아미노산 잔기는 모이어티에 의해 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다(예를 들어 문헌[Bhatnagar et al., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), 및 Cuthbertson et al., J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997)]을 참조하며, 이들은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다). 펩타이드 서열은 항체에 대한 친화도 성숙과 유사하게 최적화될 수 있으며, 다르게는 알라닌 스캐닝에 의해 또는 무작위로 또는 지정 돌연변이 다음에 스크리닝에 의해 변경되어 최상의 바인더를 확인할 수 있다. 문헌[Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997)]. 다양한 분자가, 예를 들어 펩타이드 부분 그 자체 내에서 또는 면역글로뷸린의 펩타이드와 비히클 부분 사이에서 면역글로뷸린 구조 내로 삽입될 수 있는 한편, 면역글로뷸린의 원하는 활성을 보유할 수 있다. 당업자는, 예를 들어 Fc 도메인 또는 이것의 단편과 같은 분자, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 다른 관련된 분자, 예컨대 덱스트란, 지방산, 지질, 콜레스테롤 기, 작은 탄수화물, 펩타이드, 본 명세서에 기재된 것과 같은 검출가능한 모이어티(형광제, 방사성 동위원소와 같은 방사성 표지를 포함), 올리고당, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴틀레오타이드, 간섭(또는 다른) RNA, 효소, 호르몬 등을 용이하게 삽입할 수 있다. 이 방식으로 삽입에 적합한 다른 분자는 당업자에 의해 인식될 것이며, 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이는 예를 들어 선택적으로 적합한 링커에 의해 결합된, 2개의 연속되는 아미노산 사이에서 원하는 분자의 삽입을 포함한다.
링커. 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되는 바와 같은 "링커" 또는 "링커 모이어티"는 본 발명의 조성물에 함유된 폴리펩타이드 쇄의 아미노산 잔기에 공유적으로 결합된 생물학적으로 허용가능한 펩티딜 또는 비-펩티딜 유기기(예를 들어, 면역글로뷸린 HC 또는 면역글로뷸린 LC 또는 면역글로뷸린 Fc 도메인)를 지칭하며, 이 링커 모이어티는 분자 내 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드 쇄에 또는 치료적 모이어티, 예컨대 생물학적으로 활성인 소분자 또는 올리고펩타이드에, 또는 반감기 연장 모이어티에 폴리펩타이드 쇄를 공유적으로 결합시키거나 또는 컨쥬게이트시킨다, 예를 들어 Sullivan 등의 발명의 명칭: 독소 펩타이드 Therapeutic Agents, 미국 특허 제2007/0071764호; Sullivan 등의 발명의 명칭 독소 펩타이드 Therapeutic Agents, WO 2008/088422로서 공개된 PCT/US2007/022831; 및 2009년 3월 20일 출원된 미국 가특허출원 제61/210,594호를 참조하며, 이들은 모두 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
본 발명의 면역글로뷸린 내 임의의 링커 모이어티의 존재는 선택적이다. 존재한다면, 링커의 화학적 구조는 중요하지 않은데, 이것이 본 발명의 면역글로뷸린 분자의 하나 이상의 다른 작용 모이어티에 대해 하나의 작용 모이어티의 제시 또는 위치를 배치하고, 결합하며, 연결하거나 또는 최적화하기 위한 스페이서로서 주로 작용하기 때문이다. 링커 모이어티의 존재는 본 발명의 면역글로뷸린(항체 및 항체 단편을 포함)의 일부 실시형태의 약제학적 활성을 최적화하는데 유용할 수 있다. 링커는 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 구성된다. 존재한다면, 링커 모이어티는 독립적으로 본 발명의 면역글로뷸린에 존재할 수 있는 임의의 다른 링커 또는 링커들과 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 존재한다면(면역글로뷸린의 주요 아미노산 서열 내에 있든 또는 치료적 모이어티를 부착하기 위한 링커로서 또는 본 발명의 면역글로뷸린에 대한 반감기 연장 모이어티로서이든) 링커 모이어티는 천연에서 "펩티딜"일 수 있고(즉, 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 구성됨), 길이로, 바람직하게는 1 내지 약 40개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 1 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는 1 내지 약 10개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 필수적이지는 않지만, 링커 내 아미노산 잔기는 20개의 정규 아미노산, 더 바람직하게는 시스테인, 글라이신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및/또는 세린 중에서 유래된다. 훨씬 더 바람직하게는, 펩티딜 링커는 입체적으로 방해되지 않은 대다수의 아미노산, 예컨대 펩타이드 결합에 의해 연결된 글라이신, 세린 및 알라닌으로 구성된다. 또한 존재한다면, 펩티딜 링커는 생체내 순환에서 빠른 단백질분해 전환을 회피하도록 선택되는 것이 바람직하다. 이들 아미노산 중 일부는 당업자에 의해 잘 이해되는 바와 같이 글라이코실화될 수 있다. 예를 들어, 시알화 부위를 구성하는 유용한 링커 서열은 X1X2NX4X5G(서열번호 148)이되, X1, X2, X4 및 X5는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다.
다른 실시형태에서, 펩티딜 링커 모이어티의 1 내지 40개의 아미노산은 글라이신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신으로부터 선택된다. 바람직하게는, 링커는 입체적으로 방해되지 않은 대다수의 아미노산, 예컨대 글라이신 및 알라닌으로 구성된다. 따라서, 바람직한 링커는 폴리글리신, 폴리세린 및 폴리알라닌 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 대표적인 펩티딜 링커는 폴리(Gly)1 -8, 특히 (Gly)3, (Gly)4(서열번호 149), (Gly)5(서열번호 150) 및 (Gly)7(서열번호 151)뿐만 아니라 폴리(Gly)4Ser(서열번호 152), 폴리(Gly-Ala)2 -4 및 폴리(Ala)1 -8이다. 펩티딜 링커의 다른 특이적 예는 (Gly)5Lys(서열번호 154) 및 (Gly)5LysArg(서열번호 155)를 포함한다. 유용한 펩티딜 링커의 다른 예는:
(Gly)3Lys(Gly)4(서열번호 159);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(서열번호 156);
(Gly)3Cys(Gly)4(서열번호 157); 및
GlyProAsnGlyGly(서열번호 158)이다.
상기 명명법을 설명하기 위하여, 예를 들어 (Gly)3Lys(Gly)4는 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 159)을 의미한다. Gly 및 Ala의 다른 조합이 또한 유용하다.
보통 사용되는 링커는 "L5"(GGGGS; 또는 "G4S"; 서열번호 152), "L10"(GGGGSGGGGS; 서열번호 153), "L25"(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; 서열번호 146) 및 본 명세서의 이후의 실시예에서 사용되는 임의의 링커로서 확인될 수 있는 것을 포함한다.
펩타이드 링커 모이어티를 포함하는 본 발명의 조성물의 일부 실시형태에서, 산성 잔기, 예를 들어 글루타메이트 또는 아스팔테이트 잔기는 링커 모이어티의 아미노산 서열 내에 위치된다. 예는 다음의 펩타이드 링커 서열을 포함한다:
GGEGGG(서열번호 160);
GGEEEGGG(서열번호 161);
GEEEG(서열번호 162);
GEEE(서열번호 163);
GGDGGG(서열번호 164);
GGDDDGG(서열번호 165);
GDDDG(서열번호 166);
GDDD(서열번호 167);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(서열번호 168);
WEWEW(서열번호 169);
FEFEF(서열번호 170);
EEEWWW(서열번호 171);
EEEFFF(서열번호 172);
WWEEEWW(서열번호 173); 또는
FFEEEFF(서열번호 174).
다른 실시형태에서, 링커는 포스포릴화 부위, 예를 들어 X1X2YX4X5G(서열번호 175)(X1, X2, X4 및 X5는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기임); X1X2SX4X5G(서열번호 176)(X1, X2, X4 및 X5는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기임); 또는 X1X2TX4X5G(서열번호 177)(X1, X2, X4 및 X5는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기임)을 구성한다.
본 명세서에 나타낸 링커는 대표적이며; 본 발명의 범주 내에서 펩티딜 링커는 훨씬 더 길 수 있고, 다른 잔기를 포함할 수 있다. 펩티딜 링커는, 예를 들어 시스테인, 다른 티올 또는 반감기 연장 모이어티와 컨쥬게이션을 위한 친핵체를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 시스테인 또는 호모시스테인 잔기, 또는 말레이미드에 컨쥬게이션을 위한 다른 2-아미노-에탄티올 또는 3-아미노-프로판티올 모이어티, 요오도아세타아마이드 또는 티오에스터, 기능화된 반감기 연장 모이어티를 함유한다.
다른 유용한 펩티딜 링커는 무작위 Gly/Ser/Thr 서열, 예를 들어: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH(서열번호 178) 또는 HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT(서열번호 179)을 포함하는 거대한 가용성 링커이며, 즉 대략 1 kDa PEG 분자의 크기가 되는 것으로 추정된다. 대안적으로, 유용한 펩티딜 링커는 당업계에 공지된 아미노산 서열을 포함하여 강성의 나선형 구조를 형성할 수 있다(예를 들어, 강성의 링커: -AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-)(서열번호 180). 추가적으로, 펩티딜 링커는 또한 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-의 6개 탄소 지방족 분자와 같은 비-펩티딜 절편을 포함할 수 있다. 펩티딜 링커는 본 명세서에 기재된 것과 같은 유도체를 형성하도록 변경될 수 있다.
선택적으로, 비-펩티딜 링커 모이어티는 또한 반감기 연장 모이어티-컨쥬게이트된 독성 펩타이드 유사체의 펩타이드 일부에 반감기 연장 모이어티를 컨쥬게이트하는 것에 유용하다. 예를 들어, 알킬 링커, 예컨대 -NH-(CH2)s-C(O)-(s = 2 내지 20임)가 사용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 임의의 비-입체적 방해 기, 예컨대 저급 알킬(예를 들어, C1-C6) 저급 아실, 할로겐(예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등에 의해 추가로 치환될 수 있다. 대표적인 비-펩티딜 링커는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 링커(예를 들어, 이하에 표시)이다:
[화학식 I]
Figure pct00030
상기 식에서 n은 링커가 약 100 내지 약 5000 달톤(Da), 바람직하게는 약 100 내지 약 500 Da의 분자량을 갖도록 한다.
한 실시형태에서, 비-펩티딜 링커는 아릴이다. 링커는 당업계, 예를 들어 Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764; Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, WO 2008/088422로서 공개된 PCT/US2007/022831; 및 2009년 3월 20일 출원된 미국 가특허출원 제61/210,594호에 기재된 바와 같은 동일한 방법으로 유도체를 형성하도록 변경될 수 있다.
추가로, PEG 모이어티는 PEG 알데하이드를 사용하는 환원성 알킬화 또는 PEG의 하이드록시숙신이미도 또는 카보네이트를 사용하는 아실화에 의해 또는 티올 컨쥬게이션에 의해 N-말단 아민 또는 선택된 측쇄 아민에 부착될 수 있다.
"아릴"은 페닐 또는 포화된, 부분적으로 포화된 또는 불포화된 3-, 4- 또는 5원 탄소 브릿지를 갖는 이웃자리-융합된 페닐이며, 페닐 또는 브릿지는 C1 -8 알킬, C1 -4 할로알킬 또는 할로로부터 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환체에 의해 치환된 페닐 또는 브릿지이다.
"헤테로아릴"은 불포화된 5-, 6 또는 7 원 모노사이클릭 또는 부분적으로-포화되너가 또는 불포화된 6-, 7-, 8-, 9-, 10- 또는 11 원 바이사이클릭 고리이되, 적어도 하나의 고리는 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 원자를 함유하는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 고리이며, 고리는 C1 -8 알킬, C1 -4 할로알킬 및 할로로부터 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환체로 치환된다.
본 발명의 대상 조성물의 비-펩타이드 부분, 예컨대 비-펩티딜 링커 또는 비-펩타이드 반감기 연장 모이어티는 통상적인 유기 화학 반응에 의해 합성될 수 있다.
상기 한 것은 단지 예시적이며, 본 발명에 따라 선택적으로 사용될 수 있는 링커 종류의 철저한 처리는 아니다.
면역글로뷸린 변이체의 생성. 상기 주목한 바와 같이, 재조합 DNA- 및/또는 RNA-매개 단백질 발현 및 단백질 유전자조작 기법, 또는 임의의 다른 펩타이드 제조 방법은 본 발명의 조성물의 제조에 응용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 형질전환된 숙주 세포에서 만들어질 수 있다. 간략하게, 펩타이드를 암호화하는 재조합 DNA 분자 또는 구성체가 제조된다. 이러한 분자의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 펩타이드를 암호화하는 서열은 적합한 제조 효소를 사용하여 DNA로부터 절단될 수 있다. 다수의 이용가능하고 잘-공지된 숙주 세포 중 어떤 것은 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 당업계에 인식된 다수의 인자에 의존한다. 이들은, 예를 들어 선택된 발현 벡터와 양립가능성, DNA 분자에 의해 암호화된 펩타이드의 독성, 형질전환 속도, 펩타이드 회수의 용이성, 발현 특징, 생체-안전성 및 비용을 포함한다. 이들 인자의 균형은 반드시 모든 숙주가 특정 DNA 서열의 발현에 동일하게 효과적일 수 없다는 이해와 상충되지 않아야 한다. 이들 일반적 가이드라인 내에서, 배지 내 유용한 미생물 숙주 세포는 박테리아(예컨대 에스케리키아 콜라이 속), 효모(예컨대 사카로마이세스 속) 및 다른 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유류(인간을 포함) 세포, 예를 들어 CHO 세포 및 HEK-293 세포, 및 본 명세서에서 주목된 것 또는 당업계에 공지된 다른 것을 포함한다. 변형은 DNA수준에서도 만들어질 수 있다. 펩타이드-암호화 DNA서열은 선택된 숙주 세포와 더 양립가능한 코돈으로 변경될 수 있다. 이콜라이에 대해, 최적화된 코돈은 당업계에 공지되어 있다. 코돈은 제한 부위를 제거하거나 또는 침묵 제한 부위를 포함하도록 치환될 수 있는데, 이는 선택된 숙주 세포 내 DNA의 처리에 도움을 줄 수 있다. 다음에, 형질전환된 숙주는 배양되고 정제된다. 숙주 세포는 통상적인 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 따라서 원하는 화합물이 발현된다. 이러한 발효 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다. 추가로, DNA는 선택적으로 융합 백질의 암호 영역에 대한 5', 발현된 면역글로뷸린에 작동가능하게 연결된 신호 펩타이드 서열(예를 들어 분비 신호 펩타이드)를 추가로 암호화한다. 본 발명의 특이적 결합제에 컨쥬게이트된 다이머 Fc 융합 단백질("펩티바디") 또는 키메라 면역글로뷸린(경쇄 + 중쇄)-Fc 헤테로트라이머("헤미바디")를 포함하는, 포유류 세포에 의한 본 발명의 조성물의 재조합 발현에 유용한 적절한 재조합 방법 및 대표적인 DNA 구성체의 추가적인 예에 대해, 예를 들어 Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764; Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, WO 2008/088422로서 공개된 PCT/US2007/022831; 및 2009년 3월 20일 출원된 미국 가특허출원 제61/210,594호를 참조하며, 이들은 모두 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
원하는 면역글로뷸린의 아미노산 서열 변이체는 암호화 DNA 내로 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변이체는, 면역글로뷸린 또는 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구성체에 도달하도록 만들어지며, 단, 최종 구성체는 원하는 특징을 소유한다. 아미노산 변화는 또한 글라이코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 면역글로뷸린의 번역후 처리를 변경시킬 수 있다. 특정 예에서, 면역글로뷸린 변이체는 에피토프 결합에 직접적으로 관련된 해당 아미노산 잔기를 변화시키기 위한 의도로 제조된다. 다른 실시형태에서, 에피토프 결합에 직접적으로 관련되지 않은 잔기 또는 임의의 방법으로 에피토프 결합에 관련되지 않은 잔기의 변형은 본 명세서에 논의된 목적을 위해 바람직하다. 임의의 CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역 내에서 돌연변이유발이 고려된다. 공분산 분석 기법은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역글로뷸린의 아미노산 서열 내 유용한 변형을 설계하기 위하여 당업자에 의해 사용될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Choulier, et al., Covariance Analysis of Protein Families: The Case of the Variable Domains of Antibodies, Proteins: Structure, Function, and Genetics 41:475-484 (2000); Demarest et al., Optimization of the Antibody CH3 Domain by Residue Frequency Analysis of IgG Sequences, J. Mol. Biol. 335:41-48 (2004); Hugo et al., VL position 34 is a key determinant for the engineering of stable antibodies with fast dissociation rates, Protein Engineering 16(5):381-86 (2003)]; Aurora 등의 발명의 명칭: Sequence covariance ne2rks, methods and uses thereof, 미국 특허 2008/0318207 A1; Glaser 등의 발명의 명칭: Stabilized polypeptide compositions, 미국 특허 2009/0048122 A1; Urech 등의 발명의 명칭: Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies, WO 2008/110348 A1; Borras 등의 발명의 명칭: Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties, WO 2009/000099 A2). 공분산 분석에 의해 결정된 이러한 변형은 면역글로뷸린의 효능, 약력학적, 약동학적 및/또는 제조가능성을 개선시킬 수 있다.
면역글로뷸린 또는 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 면역글로뷸린의 조기 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이유발을 포함한다.
초가변 또는 CDR 영역 또는 프레임워크 영역 중 어떤 것 내에서 치환적 돌연변이유발이 고려된다. 돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 면역글로뷸린의 특정 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 의해 기재되는 "알라닌 스캐닌 돌연변이유발"로 불린다. 본 명세서에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기가 확인되며(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu) 중성의 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 대한 기능적 민감도를 증명하는 해당 아미노산 위치는 이어서 추가적인 또는 다른 변이체를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 도입함으로써 다듬어진다. 따라서 아미노산 서열 변형을 도입하기 위한 부위가 사전결정되지만, 돌연변이 그 자체의 특성은 사전 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 실행을 분석하기 위하여, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발은 표적 코돈 도는 영역에서 수행되고, 발현된 변이체는 원하는 활성에 대해 스크리닝된다.
본 발명의 면역글로뷸린의 일부 실시형태는 또한 합성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 고체상 합성은 개개 펩타이드의 바람직한 제조 기법인데, 이는 가장 비용 효과적인 작은 펩타이드의 제조 방법이기 때문이다. 예를 들어, 잘 공지된 고체상 합성 기법은 보호기, 링커 및 고체상 지지체의 사용뿐만 아니라 특이적 보호 및 탈보호 반응 조건, 링커 절단 조건, 스캐빈저(scavenger)의 사용 및 고체상 펩타이드 합성의 다른 양태를 포함한다. 적합한 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; 및 Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan and P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183]). 본 발명의 대상 조성물의 제조에 응용가능한 당업계에 공지된 합성 및 정제 방법의 추가적인 예에 대해, 예를 들어 Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, 미국 특허 제2007/0071764호 및 Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, WO 2008/088422 A2로서 공개된 PCT/US2007/022831을 참조하며, 이들은 둘 다 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
본 명세서의 어떤 면역글로뷸린뿐만 아니라 변이체의 추가적인 기재에서, 1-글자 약어 시스템이 빈번하게 적용되어 자연적으로 발생하는 펩타이드 및 단백질 내로 일반적으로 포함되는 20가지 "정규" 아미노산 잔기의 존재를 지정한다(표 3). 이러한 1글자 약어는 3-글자 약어 또는 비-약칭 아미노산 명칭에 의한 의미와 완전하게 상호호환적이다. 본 명세서에 사용된 1-글자 약어 시스템 내에서, 대문자는 L-아미노산을 표시하며, 소문자는 D-아미노산을 표시한다. 예를 들어, 약어 "R"은 L-아르기닌을 지정하며, 약어 "r"은 D-아르기닌을 지정한다.
Figure pct00031
아미노산 서열 내 아미노산 치환은 전형적으로 특정 위치에서 아미노산 잔기에 대한 1-글자 약어가 있고, 그 뒤에 관심의 본래 서열에 대한 수치적 아미노산 위치가 있으며, 이어서 그 뒤에 치환되는 아미노산 잔기에 대한 1-글자 기호가 있다. 예를 들어, "T30D"는 관심의 본래 서열에 대해 아미노산 위치 30에서 트레오닌 잔기의 아스팔테이트 잔기에 의한 치환을 상징한다. 다른 예에서, "W101F"는 관심의 본래 서열에 대해 아미노산 위치 101에서 트립토판 잔기의 페닐알라닌 잔기에 의한 치환을 상징한다.
비-정규 아미노산 잔기는 재조합적으로 발현되는 세포를 사용하는 단백질 유전자조작의 공지된 기법을 사용함으로써 본 발명의 범주 내에서 폴리펩타이드 내에 포함될 수 있다. (예를 들어 문헌[Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)] 참조). 용어 "비-정규 아미노산 잔기"는 자연적으로 발생되는 단백질, 예를 들어 β-아미노산, 호모아미노산, 사이클릭 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 갖는 아미노산 내로 일반적으로 포함된 20가지 정규 아미노산 중에 있지 않은 D- 또는 L-형태의 아민노산 잔기를 지칭한다. 예는 (L-형태 또는 D-형태로) β-알라닌, β-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프리온산, 아미노헵탄산, 아미노피멜린산, 데스모신, 다이아미노피멜린산, Nα-에틸글라이신, Nα-에틸아스파라긴, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 아이소데스모신, 알로-아이소류신, ω-메틸아르기닌, Nα-메틸글라이신, Nα-메틸아이소류신, Nα-메틸발린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, Nα-아세틸세린, Nα-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신 및 다른 유사한 아미노산, 및 이하의 표 4에 열거된 것, 및 본 명세서에 기재된 것과 같은 이들 중 어떤 것의 유도체화된 형태를 포함한다. 표 4는 상이한 약어 및 명명법이 동일 물질에 적용될 수 있고 본 명세서에서 상호호환적으로 나타날 수 있지만, 본 발명에 따라서 유용하고, 본 명세서에서 전형적으로 사용되는 바와 같은 약어와 관련된 일부 대표적인 비-정유 아미노산 잔기를 함유한다.
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
생화학 명명법에 대한 UPAC-IUB 공동 위원회(JCBN)에 의한 아미노산 및 펩타이드에 대한 명명법 및 기호는 다음의 문헌에서 공개되었다: 문헌[Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, 페이지 39 내지 69].
본 발명의 면역글로뷸린의 펩타이드 도메인에 대한 하나 이상의 유용한 변형은 공지된 화학 기법에 의해 수행되는 아미노산 첨가 또는 삽입, 아미노산 결실, 펩타이드 절단, 아미노산 치환 및/또는 아미노산 잔기의 화학적 유도체화를 포함한다. 예를 들어, 이렇게 변형된 아미노산 서열은 관심의 본래 서열의 아미노산 서열에 대해 그것에 삽입되거나 또는 치환된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때 삽입되거나 또는 치환된 아미노산 잔기는 펩타이드가 링커 및/또는 반감기 연장 모이어티에 컨쥬게이트됨으로써 친핵성 또는 친전자성 반응의 작용기를 포함하는 측쇄를 가진다. 본 발명에 따라서, 이러한 친핵성 또는 친전자성 반응 작용기의 유용한 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 티올, 1차 아민, 셀레노, 하이드라자이드, 알데하이드, 카복실산, 케톤, 아미노옥시, 가리움된(보호된) 알데하이드 또는 가리움된(보호된) 케토 작용기를 포함한다. 친핵성 반응 작용기를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 리신 잔기, 호모리신, α,β-다이아미노프로피온산 잔기, α,β-다이아미노뷰티르산 잔기, 오르니틴 잔기, 시스테인, 호모시스테인, 글루탐산 잔기, 아스팔트산 잔기 또는 셀레노시스테인 잔기를 포함한다.
아미노산 잔기는 보통 상이한 화학적 및/또는 물리적 특징에 따라 범주화된다. 용어 "산성 아미노산 잔기"는 산성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 산성 잔기는 아스팔트산 및 글루탐산 잔기를 포함한다. 용어 "알킬 아미노 잔기"는 프롤린에서와 같이 아미노산 아민을 포함하는 선형의, 분지되거나 또는 고리화될 수 있는 C1 - 6알킬 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기; 또는 이들의 임의의 양성자화된 형태, 예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스팔테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 메티오닌, 하이드록시프롤린을 지칭하지만, 이 잔기는 아릴 또는 방향족 기를 함유하지 않으며, 여기서 C1 - 6알킬은 C1 - 4할로알킬, 할로, 시아노, 나이트로, -C(=O)Rb, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRa, -C(=NRa)NRaRa, -NRaC(=NRa)NRaRa, -ORa, -OC(=O)Rb, -OC(=O)NRaRa, -OC2 -6알킬NRaRa, -OC2 - 6알킬ORa, -SRa, -S(=O)Rb, -S(=O)2Rb, -S(=O)2NRaRa, NRaRa, -N(Ra)C(=O)Rb, -N(Ra)C(=O)ORb, -N(Ra)C(=O)NRaRa, -N(Ra)C(=NRa)NRaRa, -N(Ra)S(=O)2Rb, -N(Ra)S(=O)2NRaRa, NRaC2 - 6알킬NRaRa 및 -NRaC2 - 6알킬ORa로부터 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환체로 치환되며; Ra는 독립적으로 각 경우에 H 또는 Rb이고; Rb는 독립적으로 각 경우에 할로, C1 - 4알크, C1 - 3할로알크, -OC1-4알크, -NH2, NHC1 - 4알크 및 -N(C1 - 4알크)C1- 4알크로부터 선택된 0, 1, 2 또는 3개의 치환체로 치환된 C1 - 6알킬이다. 용어 "방향족 아미노산 잔기"는 방향족 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 방향족 잔기는 트립토판, 티로신, 3-(1-나프틸)알라닌 또는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 용어 "염기성 아미노산 잔기"는 염기성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 염기성 아미노산 잔기는 히스티딘, 리신, 호모리신, 오르니틴, 아르기닌, N-메틸-아르기닌, ω-아미노아르기닌, ω-메틸-아르기닌, 1-메틸-히스티딘, 3-메틸-히스티딘 및 호모아르기닌(hR) 잔기를 포함한다. 용어 "친수성 아미노산 잔기"는 극성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 친수성 잔기는 시스테인, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 아스팔테이트, 글루타메이트, 글루타민 및 시트룰린(Cit) 잔기를 포함한다. 용어 "친수성 아미노산 잔기"는 비하전, 지방족 또는 방향족 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 친유성 측쇄는 페닐알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 발린, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 알라닌(A)은 양친매성이며- 이는 친수성 또는 친유성 장기로서 작용할 수 있다. 따라서 알라닌은 "친유성 잔기"와 "친수성 잔기" 둘 다의 정의 내에 포함된다. 용어 "비작용성 아미노산 잔기"는 산성, 염기성 또는 방향족 기가 없는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 대표적인 중성 아미노산 잔기는 메티오닌, 글라이신, 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신 및 노르류신(Nle) 잔기를 포함한다.
추가적인 유용한 실시형태는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 보존적 변형으로부터 초래될 수 있다. 보존적 변형은 이러한 변형이 만들어지는 컨쥬게이트된(예를 들어, PEG-컨쥬게이트된) 펩타이드의 특징과 유사한 기능적, 생리적 및 화학적 특징을 갖는 반감기 연장 모이어티-컨쥬게이트된 펩타이드를 생성할 것이다. 본 명세서에 개시된 컨쥬게이트된 폴리펩타이드의 이러한 보존적으로 변형된 형태는 또한 본 발명의 실시형태가 되는 것으로 생각된다.
대조적으로, 펩타이드의 기능적 및/또는 화학적 특징에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 α-나선형 입체구조로서, 치환 영역에서 분자 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 분자의 크기를 유지하는 그것의 효과가 상당히 다른 아미노산 서열의 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 본래의 아미노산이 본래부터 있지 않은 잔기로 치환을 수반할 수 있으므로, 해당 위치에서 아미노산의 극성 또는 전하 상의 효과가 거의 없거나 전혀 없다. 더 나아가, 폴리펩타이드 내 임의의 본래 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, "알라닌 스캐닌 돌연변이유발"에 대해 이미 기재된 것과 같다(예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 논의하는 문헌[MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl., 643:55-67 (1998); Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24 (1998)]을 참조한다).
원하는 아미노산 치환(보존적이든 비-보존적이든)은 이러한 치환이 요망될 때 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 펩타이드 서열의 중요한 잔기를 확인하기 위하여, 또는 펩타이드의 친화도 또는 본 명세서에 기재된 비히클-컨쥬게이트된 펩타이드 분자를 증가시키거나 또는 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
자연적으로 발생하는 잔기는 보통의 측쇄 특성에 기반한 분류로 나누어질 수 있다:
1) 소수성: 노르류신(Nor 또는 Nle), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존적 아미노산 치환은 이들 분류 중 하나의 구성원을 동일 분류의 다른 구성원으로 교환을 수반할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있는데, 이는 전형적으로 생물학적 시스템에서 합성에 의한 것보다 화학적 펩타이드 합성에 의해 전형적으로 도입된다. 이들은 펩티도모방체 및 아미노산 모이어티의 다른 역전된 또는 전환된 형태를 포함한다.
비-보존적 치환은 이들 분류 중 하나의 구성원을 다른 분류의 구성원으로 교환을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 독소 펩타이드 유사체의 영역 내로 포함될 수 있다.
특정 실시형태에 따라 이러한 변화를 만드는 것에서, 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 그것의 소수성 및 하전 특징을 기반으로 수치료 지수를 할당하였다. 그것들은: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스팔테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
단백질 상의 상호적인 생물학적 작용을 부여하는 수치료 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해된다(예를 들어, 문헌[Kyte et al ., 1982, J. Mol . Biol . 157:105-131] 참조). 특정 아미노산은 유사한 수치료 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것은 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 수치료 지수에 기반한 변화를 만드는 것에서, 수치료 지수가 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 실시형태에서, ±1 내에 있는 것이 포함되며, 특정 실시형태에서, ±0.5 내에 있는 것이 포함된다.
특히 이에 의해 만들어진 생물학적으로 기능성인 단백질 또는 펩타이드가 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역학적 실시형태에서 사용을 위해 의도되는 경우, 유사 아미노산의 치환이 친수성을 기반으로 효과적으로 만들어질 수 있다는 것이 또한 이해된다. 특정 실시형태에서, 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 것과 같은 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그것의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상호관련된다.
다음의 친수성 값은 이들 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 특정 실시형태에서, 유사한 친수성 값을 기반으로 변화를 만드는 것에서, 친수성 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함되며, 특정 실시형태에서, ±1 내에 있는 것이 포함되고, 특정 실시형태에서, ±0.5 내에 있는 것이 포함된다. 당업자는 또한 친수성을 기반으로 주요 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로서 지칭된다.
보존적 치환의 예는 하나의 비-극성(소수성) 아미노산 잔기, 예컨대 아이소류신, 발린, 류신 노르류신, 알라닌 또는 메티오닌의 다른 것으로 치환, 하나의 극성(친수성) 아미노산 잔기의 다른 것으로 치환, 예컨대 아르기닌과 리신 간, 글루타민과 아스파라긴 간, 글라이신과 세린 간, 하나의 염기성 아미노산 잔기, 예컨대 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 다른 것으로 치환, 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 다른 것으로 치환을 포함한다. 어구 "보존적 아미노산 치환"은 비-유도체화된 잔기 대신에 화학적으로 유도체화된 잔기의 사용을 포함하며, 단, 이러한 폴리펩타이드는 필수적인 생활성을 나타낸다. 본 발명에 따라 유용할 수 있는 다른 대표적인 아미노산 치환은 이하의 표 5에 제시한다.
일부 유용한 아미노산 치환
본래의 잔기 대표적인 치환
Ala Val, Leu, Ile
Arg Lys, Gln, Asn
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser, Ala
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro, Ala
His Asn, Gln, Lys, Arg
Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노류신
Leu 노류신, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys Arg, 1,4-다이아미노-뷰티르산, Gln, Asn
Met Leu, Phe, Ile
Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Pro Ala
Ser Thr, Ala, Cys
Thr Ser
Trp Tyr, Phe
Tyr Trp, Phe, Thr, Ser
Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신
선택적으로, 면역글로뷸린의 아미노산 서열 변이체는 본래의 면역글로뷸린 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 하나의 항체와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75% 또는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 가지며, 예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함하는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대해서 동일성 또는 상동성은, 필요하다면 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위하여 서열 정렬 및 갭 도입 후, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 본래의 서열과 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 백분율로서 본 명세서에서 정의된다. 면역글로뷸린 또는 항체 서열 내로 N-말단의, C-말단의 또는 내부의 연장, 결실 또는 삽입 중 어떤 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않는다.
아미노산 서열 삽입은 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 하나의 잔기로부터 길이의 범위에서 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 면역글로뷸린 또는 에피토프 태그 또는 샐비지 수용체 결합 에피토프에 융합된 면역글로뷸린(항체 또는 항체 단편을 포함)을 포함한다. 면역글로뷸린 또는 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에서 면역글로뷸린의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 융합을 포함한다.
에피토프 태그의 예는 flu HA 태그 폴리펩타이드 및 그것의 항체는 12CA5[Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 그것에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체[Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; 및 단순포진 바이러스 글라이코단백질 D(gD) 태그 및 그것의 항체[Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 대표적인 태그는 일반적으로 대략 6개의 히스티딘 잔기인 폴리-히스티딘 서열이며, 이는 니켈 킬레이트화를 사용하여 이렇게 표지된 화합물을 분리시킨다. 다른 표지 및 태그, 예컨대 FLAG(등록상표) 태그(뉴욕주 로체스터에 소재한 Eastman Kodak)은 잘 공지되어 있으며 당업계에서 일상적으로 사용된다.
항체 및 항체 단편을 포함하는 본 발명의 면역글로뷸린의 아미노산 치환 변이체의 일부 특정 비제한적 실시형태는 이하에 예시된다.
또한 면역글로뷸린의 적절한 입체구조를 유지하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적 가교를 방지할 수 있다. 정반대로, 시스테인 결합(들)은 그것의 안정성을 개선시키기 위하여 면역글로뷸린에 첨가될 수 있다(특히 면역글로뷸린이 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
특정 예에서, 면역글로뷸린 변이체는 시작 서열 내 에피토프 결합에 직접적으로 수반된 해당 아미노산 잔기를 변형시키는 의도로 제조된다. 일부 실시형태에서, 에피토프 결합 또는 잔기에 직접적으로 수반되지 않는 잔기의 변형은 임의의 방법으로 에피토프 결합에 관련되지 않으며, 본 명세서에서 논의되는 목적을 위하여 바람직하다. 임의의 CDR 영역 및/또는 프레임워크 영역 내 돌연변이유발이 고려된다.
항원 결합 단백질 아미노산 잔기가 에피토프 인식 및 결합에 중요한지를 결정하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행되어 치환 변이체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989)]을 참조하며, 이것의 개시는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 본 방법에서, 개개의 아미노산 잔기는 알라닌 잔기로 차례로 대체되며, 얻어진 항체는 그것의 능력에 대해 스크리닝되어 비변형된 폴리펩타이드에 대해 그것의 특이적인 에피토프를 결합한다. 감소된 결합 능력을 갖는 변형된 항원 결합 단백질은 시퀀싱되어 잔기가 변화되는지를 결정하는데, 이는 결합 또는 생물학적 특성에서 그것의 중요성을 표시한다.
항원 결합 단백질의 치환 변이체는 친화도 성숙에 의해 제조될 수 있되, 무작위 아미노산 변화는 모 폴리펩타이드 서열 내로 포함된다. 예를 들어, 문헌[Ouwehand et al., Vox Sang 74 (Suppl 2):223-232, 1998; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915, 1998; Dall'Acqua et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 8:443-450, 1998]을 참조하며, 이것의 개시는 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 친화도 성숙은 항원 결합 단백질 또는 이들의 변이체를 제조하고 스크리닝하는 단계 및 얻어진 변이체로부터 변형된 생물학적 특성, 예컨대 모 항원 결합 단백질에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 것을 선택하는 단계를 수반한다. 치환 변이체를 만들기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위는 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 만들도록 돌연변이된다. 이렇게 만들어진 변이체는 각 입자 내에서 포장된 M13의 유전자 III 생성물에 유합으로서 섬질 파지 입자의 표면 상에 1가 형식으로 발현된다. 파지-디스플레이된 변이체는 그 다음에 그것의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 및 WO 93/19172을 참조한다.
현존하는 항체 친화도 성숙 방법은 2가지의 돌연변이유발 범주에 속한다: 확률적 및 비확률적. 오류유발(error prone) PCR, 뮤테이터(mutator) 박테리아 균주(Low et al., J. Mol . Biol . 260, 359-68, 1996), 및 포화 돌연변이유발(Nishimiya et al., J. Biol . Chem. 275:12813-20, 2000; Chowdhury, P. S. Methods Mol . Biol . 178, 269-85, 2002)은 확률적 돌연변이유발 방법의 전형적 예이다(Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71, 2005). 비확률적 기법은 종종 알라닌-스캐닝 또는 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 특이적 돌연변이 단백질의 제한된 수집을 만든다. 일부 방법은 이하에서 더욱 상세하게 기재된다.
패닝 방법을 통한 친화도 성숙-재조합 항체의 친화도 성숙은 항원의 양을 감소시키는 존재에서 후보 항원 패닝의 몇몇 라운드를 통해 보통 수행된다. 라운드 당 항원의 양을 감소시키는 것은 항원에 대해 가장 큰 친화도를 갖는 항체를 선택하며, 이에 의해 출발 물질의 거대 풀로부터 큰 친화도의 항체를 수득한다. 패닝을 통한 친화도 성숙은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001)]에 기재되어 있다. 파지 디스플레이 기법을 사용하는 친화도 성숙 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97:2029-34, 2000] 참조).
돌연변이유발을 통한 조사-돌연변이유발을 통한 조사(Look-through mutagenesis, LTM)(Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71, 2005)는 항체-결합 부위를 빠르게 맵핑하기 위한 방법을 제공한다. LTM, 20개의 천연 아미노산에 의해 제공되는 주요 측쇄 화학의 대표적인 9개의 아미노산은 항체의 모든 6개 CDR 내 모든 위치에서 결합에 대한 기능적 측쇄 기여를 나누도록 선택된다. LTM은 각 "야생형" 잔기가 9개의 선택된 아미노산 중 하나에 의해 대칭적으로 치환되는 CDR 내 단일 돌연변이의 위치상의 연속을 만든다. 돌연변이된 CDR은 모든 돌연변이단백질의 정량적 디스플레이를 금지하지 않고 증가하는 복잡도 및 크기의 조합적 단일-쇄 가변 단편(scFv) 라이브러리를 만들도록 조합된다. 양성 선택 후, 개선된 결합을 갖는 클론은 시퀀싱되며, 유리한 돌연변이가 맵핑된다.
오류유발 PCR-오류유발 PCR은 상이한 선택 라운드 간의 핵산의 무작위화를 수반한다. 무작위화는 사용된 중합효소의 고유한 오류 비율에 의해 낮은 비율로 일어나지만, 전사 동안 높은 고유의 오류 비율을 갖는 중합효소를 사용하여(Hawkins et al., J Mol Biol. 226:889-96, 1992) 오류유발 PCR에 의해 향상될 수 있다(Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999). 돌연변이 주기 후, 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 클론은 당업계에서 일상적인 방법을 사용하여 선택된다.
유전자 셔플링 및 관련된 진화를 이용하는 기법이 또한 사용되어 원하는 활성에 대해 항원 결합 단백질 또는 이것의 변이체를 제조하고 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jermutus et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 98(1):75-80 (2001)]은 리보솜 디스플레이에 기반한 맞춤 시험관내 선택 전략은 DNA 셔플링에 의한 시험관내 다양화와 조합되어 scFvs의 오프률(off-rate) 또는 열역학적 안정성 중 하나를 진화시키는 것을 나타내며; 문헌[Fermer et al., Tumour Biol. 2004 Jan-Apr;25(1-2):7-13]는 DNA 셔플링과 조합된 파지 디스플레이의 사용이 거의 103 만큼 친화도가 상승된 것을 보고하였다. 문헌[Dougherty et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Feb. 29; 97(5):2029-2034]는 (i) 기능적 클론이 초돌연변이된 라이브러리에서 예상치 못하게 높은 빈도로 일어나고, (ii) 기능강화(gain-of-function) 돌연변이는 이러한 라이브러리에서 잘 표현되며, (iii) 더 높은 친화도를 야기하는 scFv 돌연변이의 대다수는 결합 부위로부터 원위 잔기와 대응한다는 것을 보고하였다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접점을 확인하거나 또는 이러한 접점을 모델링하는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하기 위하여 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본 명세서에서 자세히 설명되는 기법에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 만들어지면, 그것들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝이 실시되며, 하나 이상의 적절한 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가 연구를 위해 선택될 수 있다.
변형된 탄수화물을 갖는 면역글로뷸린
면역글로뷸린 변이체는 또한, 예를 들어 면역글로뷸린에 결합된 탄수화물 모이어티 중 하나 이상을 첨가하거나 또는 결실시킴으로써 및/또는 면역글로뷸린 내 하나 이상의 글라이코실화 부위를 첨가하거나 또는 결실시킴으로써 모 폴리펩타이드에 대해 변형된 글라이코실화 패턴을 가지도록 생성될 수 있다.
항체를 포함하는 폴리펩타이드의 글라이코실화는 전형적으로 N-연결되거나 또는 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드는 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌을 시퀀싱하며(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임), 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 폴리펩타이드 내 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글라이코실화 부위를 만든다. 따라서, N-연결된 글라이코실화 부위는 아미노산 서열을 변경함으로써 면역글로뷸린에 첨가될 수 있으므로, 이는 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유한다. O-연결된 글라이코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다. O-연결된 글라이코실화 부위는 본래의 면역글로뷸린 또는 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 삽입하거나 또는 치환함으로써 면역글로뷸린에 첨가될 수 있다.
변경된 효과기 기능
시스테인 잔기(들)은 항체 또는 Fc-함유 폴리펩타이드의 Fc 영역 내에서 제거되거나 또는 도입될 수 있고, 이에 의해 이 영역 내 쇄간 이황화 결합을 제거하거나 또는 증가시킨다. 이렇게 만들어진 호모다이머 면역글로뷸린은 개선된 내재화(internalization) 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]을 참조한다. 호모다이머 면역글로뷸린 또는 항체는 또한 문헌[Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 헤테로2작용성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 면역글로뷸린은 이중 Fc 영역을 가지도록 유전자조작될 수 있고, 이에 의해 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-CancerDrug Design 3: 219-230 (1989)]을 참조한다.
또한 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 20가지 아미노산 잔기 중 하나 이상(예를 들어, 신호 서열)은 제거된다는 것이 고려된다.
혈청 반감기를 증가시키기 위한 변형은 또한, 예를 들어 샐비지 수용체 결합 에피토프의 포함 또는 첨가에 의해(예를 들어 적절한 영역의 돌연변이에 의해 또는 말단 또는 중간에서, 예를 들어 DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 이후에 면역글로뷸린에 융합되는 펩타이드 태그 내로 에피토프를 포함시킴으로써)(예를 들어, WO96/32478) 또는 PEG 또는 다당류 폴리머를 포함하는 다른 수용성 폴리머와 같은 분자를 첨가하는 것이 바람직하다.
샐비지 수용체 결합 에피토프는 바람직하게는 영역을 구성하되, Fc 도메인 중 1 또는 2개의 루프로부터의 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기는 면역글로뷸린 또는 단편의 유사한 위치로 전달된다. 훨씬 더 바람직하게는, Fc 도메인의 1 또는 2개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 전달된다. 훨씬 더 바람직하게는, 에피토프는 Fc 영역의(예를 들어 IgG의) CH2 도메인으로부터 취해지며, 면역글로뷸린 또는 항체의 CH1, CH3, 또는 VH 영역 또는 하나 이상의 이러한 영역에 전달된다. 대안적으로, 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 취해지며, 면역글로뷸린 단편의 CL 영역 또는 VL 영역 또는 둘 다에 전달된다. 또한 Fc 변이체 및 샐비지 수용체와 그것의 상호작용을 기재하는 국제특허출원 WO 97/34631 및 WO 96/32478을 참조한다.
불변 영역의 다른 부위 및 아미노산 잔기(들)는 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC), 예컨대 C1q 결합 부위, 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 초래하는 것으로 확인되었다[예를 들어, 특정 위치에서 돌연변이 효과를 기재한 문헌[Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992); Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001); Lazar et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 103(11): 4005 (2006)]을 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다]. Fc 수용체 결합 부위 내 잔기의 돌연변이는 변경된(즉, 증가되거나 또는 감소된) 효과기 기능, 예컨대 Fc 수용체에 대해 변경된 친화도, 변경된 ADCC 또는 CDC 활성, 또는 변경된 반감기를 초래할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 잠재적 돌연변이는 알라닌에 의한 치환, 보존적 치환, 비-보존적 치환 또는 상이한 하위분류로부터 동일 위치에서 대응하는 아미노산 잔기에 의한 치환(예를 들어 IgG1 잔기를 해당 위치에서 대응하는 IgG2 잔기로 대체)을 포함하는, 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 개선된 ADCC 활성을 나타내는 푸코실화(fucosylation)가 없거나 감소된 항체 분자를 포함하는 변경된 효과기 활성을 초래하는 변경된 탄수화물 구조를 갖는 항체 및 항체 단편을 포함하는, 면역글로뷸린 분자의 생성을 포함한다. 이것을 달성하기 위하여 당업계에 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, ADCC 효과기 활성은 FcγRIII 수용체에 항체 분자의 결합에 의해 매개되는데, 이는 CH2 도메인의 Asn-297에서 N-연결된 글라이코실화의 탄수화물 구조에 의존하는 것으로 나타났다. 비-퓨코실화된 항체는 증가된 친화도로 이 수용체에 결합하며 본래의 퓨코실화된 항체보다 더 효율적으로 FcγRIII-매개 효과기 기능을 촉발한다. 예를 들어, CHO 세포에서 비-퓨코실화된 항체의 재조합 생성은 100-배 증가된 ADCC 활성을 갖는 항체를 초래하며, 이때 알파-1,6-퓨코실 트랜스퍼라제 효소는 녹아웃되었다(Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22). 유사한 효과는 퓨코실화 경로에서 이것 또는 다른 효소의 활성을 감소시키는 것, 효소(들)를 녹아웃 시키도록 세포주를 유전자조작 하는 것 또는 선택적 글라이코실화 억제제와 함께 배양시키는 것을 통해 수행될 수 있다(Rothman et al., Mol Immunol. 1989 Dec;26(12):1113-23). 일부 숙주 세포 균주, 예를 들어 Lec13 또는 래트 하이브리도마 YB2/0 세포주는 더 낮은 퓨코실화 수준을 갖는 항체를 자연적으로 생성한다. 문헌[Shields et al., J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):26733-40; Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 Jan 31;278(5):3466-73]. 예를 들어 GnTIII 효소를 과발현시키는 세포 내 항체를 재조합 적으로 생성하는 것을 통해 이등분된 탄수화물 수준의 증가는 ADCC 활성을 증가시키도록 결정되었다. 문헌[Umana et al., Nat Biotechnol. 1999 Feb;17(2):176-80]. 이는 2개의 퓨코스 잔기 중 단지 하나의 결여가 ADCC 활성을 증가시키기에 충분할 수 있다는 것으로 예측된다. (Ferrara et al., J Biol Chem. 2005 Dec 5).
면역글로뷸린의 다른 공유적 변형
면역글로뷸린의 다른 특정 공유적 변형이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 그것들은 화학적 합성에 의해 또는, 적용가능하다면, 면역글로뷸린 또는 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어질 수 있다. 공유적 변형의 다른 유형은 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단의 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체화제와 표적화된 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 도입될 수 있다.
가장 흔하게는 시스테이닐 잔기가 α-할로아세테이트(및 대응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아마이드와 반응되어 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트라이플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일) 프로피온산, 클로로아세틸포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-나이트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀, 또는 클로로-7-나이트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 다이에틸파이로카보네이트와 반응에 의해 유도체화되는데, 이 작용제는 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드가 또한 유용하며; 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 카코딜산나트륨 중에서 수행된다.
리시닐 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응된다. 이들 작용제에 의한 유도체화는 리시닐 잔기의 변화를 반전시키는 효과를 가진다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스터, 예컨대 메틸 피콜리니미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트라이나이트로벤젠설폰산, O-메틸아이소유레아, 2,4-펜탄다이온 및 글라이옥실레이트에 의한 트랜스아미나제-촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 이상의 몇몇 통상적인 시약, 특히 페닐글라이옥살, 2,3-뷰탄다이온, 1,2-사이클로헥산다이온 및 닌하이드린과 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 반응이 알칼린 조건에서 수행되는 것을 필요로 한다. 더 나아가, 이들 시약은 리신의 기뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라나이트로메탄과 반응에 의해 티로실 잔기 내로 분광학적 표지를 도입하는 것에서 특정 관심이 있도록 만들어질 수 있다. 가장 흔하게는, N-아세틸이미디졸 및 테트라나이트로메탄이 사용되어 O-아세틸 티로실 종 및 3-나이트로 유도체를 각각 형성한다. 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화되어 방사성면역분석에서 사용을 위한 표지된 단백질을 제조한다.
카복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀)는 카보다이이미드(R-N.dbd.C.dbd.N-R')와 반응에 의해 선택적으로 변형되며, 여기서 R 및 R'은 상이한 알킬 기, 예컨대 1-사이클로헥실-3-(2-몰폴리닐-4-에틸) 카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸) 카보다이이미드이다. 더 나아가, 아스팔틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게 각각 대응하는 글루타밀 및 아스팔틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범주 내에 속한다.
다른 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
공유 변형의 다른 유형은 면역글로뷸린(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링된 글라이코사이드를 수반한다. 이들 과정은 그것들이 N- 또는 O-연결된 글라이코실화에 대해 글라이코실화 능력을 갖는 숙주 세포 내 면역글로뷸린의 생성을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방식에 의존하여, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 유리 설프하이드릴 기, 예컨대 시스테인의 설프하이드릴 기, (d) 유리 하이드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 하이드록실 기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아마이드에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일 공개된 WO87/05330에서 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
면역글로뷸린 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 비글라이코실화는 화합물 트라이플루오로메탄설폰산 또는 동등한 화합물에 면역글로뷸린의 노출을 필요로 한다. 이 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래하는 한편, 면역글로뷸린 무결함을 이탈시킨다. 화학적 비글라이코실화는 문헌[Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)] 및 Edge 등에 의한 문헌[Anal. Biochem., 118: 131 (1981)]에 의해 기재된다. 면역글로뷸린 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)]에 의해 기재되는 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글라이코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 면역글로뷸린(항체 및 항체 단편을 포함)의 공유적 변형의 다른 유형은 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 솔비톨, 폴리옥시에틸화된 글루코스, 폴리옥시에틸화된 글라이세롤, 폴리옥시알킬렌 또는 덱스트란과 같은 다당류 폴리머 중 하나에 면역글로뷸린을 연결하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호, 제4,179,337호, 제4,766,106호, 제4,179,337호, 제4,495,285호, 제4,609,546호 또는 EP 315 456호를 참조한다.
분리된 핵산
본 발명의 다른 양태는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 분리된 핵산과 같은 본 발명의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산이다. 이러한 핵산은 당업계에 공지된 재조합 기법에 의해 만들어지며/지거나 본 명세서에 개시된다.
다른 실시형태에서, 분리된 핵산은 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로뷸린을 암호화하되,
(a) 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 중쇄 가변 영역은 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 182, 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분리된 핵산은 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로뷸린을 암호화하되,
(a) 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349, 서열번호 351, 서열번호 353, 서열번호 355 또는 서열번호 359의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 349 또는 서열번호 355의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(d) 경쇄 가변 영역은 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 357, 서열번호 359 또는 서열번호 369의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(e) 경쇄 가변 영역은 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349 또는 서열번호 351의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 예에서, 분리된 핵산은 면역글로뷸린 중쇄 및 면역글로뷸린 경쇄를 포함하는 면역글로뷸린을 암호화하되,
(a) 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 353의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(d) 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함한다.
또는 일부 실시형태에서, 분리된 핵산은 하기를 포함하는 면역글로뷸린을 암호화한다:
서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 앞서 언급한 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 핵산 중 어떤 것을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 발현 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포는 또한 본 발명에 의해 포함되는데, 이는 당업계에 공지된/되거나 본 명세서에 개시된 분자 생물학 기법에 의해 만들어진다.
본 발명은 또한 하기를 수반하는 방법에 관한 것이다:
발현 벡터에 의해 암호화된 면역글로뷸린을 발현시키는 조건 하에 배양 배지 내 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및
배양 배지로부터 면역글로뷸린을 회수하는 단계. 면역글로뷸린을 회수하는 단계는 공지된 항체 정제 방법, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 명세서의 실시예 1 및 다른 곳에 개시된 항체 정제 기법에 의해 수행된다.
유전자 치료
적절한 세포에 치료적 면역글로뷸린의 전달은 생체밖 유전자 치료를 통해 인시츄로, 또는 생체내에서 당업계에 공지된 임의의 적합한 접근의 사용에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 치료를 위해, 원하는 면역글로뷸린 또는 항체를 암호화하는 핵산은, 단독으로 또는 벡터, 리포좀 또는 침전물과 함께 피험체 내로 직접적으로 주사될 수 있고, 일부 실시형태에서, 면역글로뷸린 화합물의 발현이 요망되는 부위에 주사될 수 있다. 생체밖 처리에 대해, 피험체의 세포는 제거되며, 핵산은 이들 세포 내로 도입되고, 변형된 세포는 직접적으로 피험체에 되돌아가거나 또는 예를 들어 환자에게 이식된 다공성 막 내에서 캡슐화된다. 예를 들어 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호를 참조.
살아있는 세포 내로 핵산을 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기법이 있다. 기법은 핵산이 시험관내 배양 세포에 또는 의도된 숙주의 생체내 세포에 전달되는지 여부에 의존하여 다를 것이다. 시험관내 포유류 세포에 핵산의 전달을 위한 적합한 기법은 리포좀의 사용, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합, 화학적 처리, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전물을 포함한다. 다른 생체내 핵산 전달 기법은 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 I형, 아데노-연관 바이러스 또는 레트로바이러스) 및 지질계 시스템에 의한 트랜스펙션을 포함한다. 핵산 및 트랜스펙션제는 선택적으로 마이크로입자와 결합된다. 대표적인 트랜스펙션제는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전물, DEAE-덱스트런-매개 트랜스펙션, 4차 암모늄 양친매성 DOTMA((다이올레오일옥시프로필) 트라이메틸암모늄 브로마이드, GIBCO-BRL에 의한 Lipofectin으로서 상업화됨))(Felgner et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 6077-6081); 현수된 트라이메틸암모늄 헤드를 갖는 친유성 글루타메이트 다이에스터(Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); 양이온성 지질 다이옥타데실아미도 글라이실스퍼민(dioctadecylamido glycylspermine(DOGS), Transfectam, Promega)과 같은 대사가능한 모 지질 및 다이팔미토일포스파티딜 에탄올아밀스퍼민(DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); 대사가능한 4차 암모늄 염(DOTB, N-(1-[2,3-다이올레오일옥시]프로필)-N,N,N-트라이메틸 암모늄 설페이트(DOTAP)(Boehringer Mannheim), 폴리에틸렌이민(PEI), 다이올레오일 에스터, ChoTB, ChoSC, DOSC)(Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3베타[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 다이올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)/3베타[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤DC-Chol의 1 대 1 혼합물(Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), 스퍼민, 스퍼미딘, 리포폴리아민(Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), 친유성 폴리리신(LPLL)(Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 과량의 포스파티딜콜린/콜레스테롤과 함께 [[(1,1,3,3-테트라메틸뷰틸)크레속시]에톡시]에틸]다이메틸벤질암모늄 하이드록사이드(DEBDA 하이드록사이드)(Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB)/DOPE 혼합물(Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), DOPE, CTAB, DEBDA, 다이도데실암모늄 브로마이드(DDAB)와 함께 글루탐산(TMAG)의 친유성 다이에스터, 및 포스파티딜에탄올아민과 혼합된 스테아릴아민(Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE(TransfectACE, GIBCO BRL), 및 올리고갈락토스 함유 지질을 포함한다. 전달 효율을 증가시키는 대표적인 트랜스펙션 향상제는, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 리소좀-파괴 펩타이드(Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), 콘드로이탄계 프로테오글라이칸, 설페이트화된 프로테오글라이칸, 폴리에틸렌이민, 폴리리신(Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), 인테그린-결합 펩타이드 CYGGRGDTP(서열번호 235), 선형 덱스트란 9당류, 글라이세롤, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 뉴클레오타이드 간 연결에서 테터링된 콜레스테릴 기(Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6), 리소포스파타이드, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 1-올레오일 리소포스파티딜콜린을 포함한다.
일부 상황에서, 표적 세포에 핵산-함유 벡터를 보내는 작용제와 함께 핵산을 전달하기는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 "표적화" 분자는 표적 세포 상의 세포 표면막 단백질에 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드에 특이적인 항원 결합 단백질을 포함한다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔도시토시스와 관련된 세포-표면막 단백질에 결합되는 단백질은 표적화를 위하여 및/또는 흡수를 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 특정 세포 유형에 굴성이 있는 캡사이드 단백질 및 이것의 단편, 주기의 내재화를 겪는 단백질에 대한 항원 결합 단백질 및 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 수용체-매개 엔도사이토시스가 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌[Wu et al., 1987 또는 Wagner et al., 1990]에 기재된다. 현재 공지된 표시 및 유전자 치료 프로토콜의 검토를 위해, 문헌[Anderson 1992]을 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 그것에 인용된 참고문헌을 참조한다. 유전자 치료 기법의 추가적인 검토를 위해, 문헌[Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); 및erson, Nature, supplement to vol. 392, no 6679, pp. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); 및 Miller, Nature, 357: 455460 (1992)]을 참조한다.
약제학적 조제물의 투여 및 제조
본 발명의 방법의 실행에서 사용된 면역글로뷸린 또는 항체는 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 의약으로 조제될 수 있다. 적합한 담체는, 면역글로뷸린 또는 항체와 조합될 때, 피험체의 면역 반응과 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 멸균 인산 완충 식염수 용액과 같은 다수의 표준 약제학적 담체 중 어떤 것을 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신 등이 사용될 수 있고, 알부민, 리포단백질, 글로뷸린 등과 같이 향상된 안정성을 위한 다른 단백질이 포함될 수 있으며, 약한 화학적 변형 등이 실시될 수 있다.
조제물 내 대표적인 면역글로뷸린 농도는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 180㎎/㎖ 또는 약 0.1 mg/㎖ 내지 약 50 mg/㎖, 또는 약 0.5 mg/㎖ 내지 약 25 mg/㎖, 또는 대안적으로 약 2 mg/㎖ 내지 약 10 mg/㎖의 범위에 있을 수 있다. 면역글로뷸린의 수성 조제물은, 예를 들어 4.5 내지 약 6.5, 또는 약 4.8 내지 약 5.5, 또는 대안적으로 약 5.0 범위에 있는 pH에서 pH-완충 용액으로 제조될 수 있다. 이 범위 내의 pH에 대해 적합한 완충제의 예는 아세테이트(예를 들어, 아세트산나트륨), 숙시네이트(예컨대 숙신산 나트륨), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는 완충제 및 조제물의 원하는 등장성에 의존하여 약 1mM 내지 약 200㎜ 또는 약 10mM 내지 약 60㎜일 수 있다.
또한 면역글로뷸린을 안정화할 수 있는 등장제가 조제물 중에 포함될 수 있다. 대표적인 등장제는 폴리올, 예컨대 만니톨, 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 바람직하게는 수성 조제물은 등장성이며, 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수 있다. 조제물 내 폴리올의 대표적인 농도는 약 1% 내지 약 15% w/v의 범위에 있을 수 있다.
계면활성제는 또한 조제된 면역글로뷸린의 응집을 감소시키고/시키거나 조제물 내 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시키기 위하여 면역글로뷸린 조제물에 첨가될 수 있다. 대표적인 계면활성제는 폴리솔베이트(예를 들어, 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80) 또는 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 계면활성제의 대표적인 농도는 약 0.001% 내지 약 0.5% 또는 약 0.005% 내지 약 0.2%, 또는 대안적으로 약 0.004% 내지 약 0.01% w/v의 범위에 있을 수 있다.
한 실시형태에서, 조제물은 상기-확인한 작용제(즉, 면역글로뷸린, 완충제, 폴리올 및 계면활성제)를 함유하며, 본질적으로 하나 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로뷰탄올 및 벤제토늄 Cl이 없다. 다른 실시형태에서, 보존제는, 예를 들어 약 0.1% 내지 약 2%, 또는 대안적으로 약 0.5% 내지 약 1% 범위의 농도에서 조제물에 포함될 수 있다. 하나 이상의 다른 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것은 조제물에 포함될 수 있으며, 단 그것들은 조제물의 원하는 특징에 해롭게 영향을 미치지 않는다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용인에게 비독성이며 추가적인 완충제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 생분해성 폴리머, 예컨대 폴리에스터; 및/또는 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨을 포함한다.
면역글로뷸린의 치료적 조제물은 동결건조된 조제물 또는 수용액의 형태로 원하는 정도의 순도를 갖는 면역글로뷸린을 선택적인 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용인에게 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로뷸린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스, 말토스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN(상표명), PLURONICS(상표명) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명의 적합한 조제물은 등장성 완충제, 예컨대 포스페이트, 아세테이트 또는 Tris 완충제를 긴장시키고 안정화시키는 긴장제, 예컨대 폴리올, 솔비톨, 수크로스 또는 염화나트륨과 조합하여 함유한다. 이러한 긴장제의 한 예는 5% 솔비톨 또는 수크로스이다. 추가로, 조제물은 예컨대 응집을 방지하고 0.01 내지 0.02% wt/vol에서 안정화를 위하여 선택적으로 계면활성제를 포함할 수 있다. 조제물의 pH는 4.5 내지 6.5 또는 4.5 내지 5.5의 범위에 있을 수 있다. 항체에 대한 약제학적 조세물의 다른 대표적인 기재는 미국 특허 2003/0113316호 및 미국 특허 제6,171,586호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다.
본 명세서의 조제물은 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요하다면 바람직하게는 서로 해로운 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것인 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 추가로 면역억제제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적을 위해 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 거대에멀젼에서, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법에 의해 또는 계면 폴리머화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 각각 넣을 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
면역글로뷸린의 현탁액 및 결정 형태가 또한 고려된다. 현탁액 및 결정 형태를 만들기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
생체내 투여를 위하 사용되는 조제물은 멸균이어야 한다. 본 발명의 조성물은 통상적인, 잘 알려진 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들어, 멸균화는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다. 얻어진 용액은 사용을 위해 포장되거나 또는 무균성 조건 하에 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전 멸균 용액과 합쳐진다.
냉동 건조 과정은 특히 폴리펩타이드가 액체 조성물 내에서 상대적으로 불안정할 때, 종종 장기간 저장을 위해 폴리펩타이드를 안정화시키기 위하여 사용된다. 동결건조 주기는 보통 3 단계: 냉동, 1차 건조 및 2차 건조로 구성된다; 문헌[Williams and Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Number 2, pages 48-59 (1984)]. 냉동 단계에서, 용액은 그것이 적절하게 냉동될 때까지 냉각된다. 이 용액 내 덩어리 물(Bulk water)은 이 단계에서 얼음을 형성한다. 1차 건조 단계에서 얼음 승화물은 진공을 사용하여 얼음 증기압 미만의 챔버 압력을 감소시킴으로써 수행된다. 최종적으로, 흡수되거나 또는 결합된 물은 감압된 챔버 압력 및 상승된 저장 온도하에 2차적 건조 단계에서 제거된다. 이 과정은 동결건조된 케이크로서 알려진 물질을 생성한다. 그 이후에 케이크는 사용전 재구성될 수 있다.
동결건조된 물질에 대한 표준 재구성 실행은, 항박테리아 작용제의 희석 용액 때때로 비경구 투여를 위한 약제의 생성에서 사용되지만, 순수(pure water)의 용적(전형적으로 동결건조 동안 제거된 용적과 동일)을 다시 첨가하는 것이다; 문헌[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 18, Numbers 11 and 12, pages 1311-1354 (1992)].
부형제는 냉동-건조된 생성물에 대해 안정제로서 작용하는 일부 경우에 주목되었다; 문헌[Carpenter et al., Developments in Biological Standardization, Volume 74, pages 225-239 (1991)]. 예를 들어, 공지된 부형제는 폴리올(만니톨, 솔비톨 및 글라이세롤을 포함); 당(글루코스 및 수크로스를 포함); 및 아미노산(알라닌, 글라이신 및 글루탐산을 포함)을 포함한다.
추가로, 폴리올 및 당은 또한 냉동 및 건조-유발된 손상으로부터 폴리펩타이드를 보호하고, 건조된 상태에서 저장동안 안정성을 향상시키기 위하여 종종 사용된다. 일반적으로, 특정 이당류에서 당은 냉동-건조 과정과 저장 동안에 효과적이다. 단당류 및 이당류 및 PVP와 같은 폴리머를 포함하는 다른 유형의 분자가 또한 동결걸조된 생성물의 안정제로서 보고되었다.
주사를 위해, 약제학적 조제물 및/또는 의약은 상기 기재한 바와 같은 적절한 용액에 의한 재구성에 적합한 분말일 수 있다. 이것의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 동결건조되고, 회전건조되거나 또는 분무건조된 분말, 무정형 분말, 과립, 침전물 또는 미립자를 포함한다. 주사를 위해, 조제물은 안정제, pH 변형제, 계면활성제, 생체이용가능성 변형제 및 이들의 조합을 선택적으로 함유할 수 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 면역글로뷸린을 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 y 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예컨대 Lupron Depot(상표명)(락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다. 폴리머, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산은 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있지만, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 폴리펩타이드가 장기간 동안 신체 내에 남아있을 때, 그것들은 37℃에서 수분에 노출 결과로서 변성되거나 또는 응집될 수 있고, 이는 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래한다. 수반된 메커니즘에 따라서 합리적 전략이 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-다이설파이드 교환을 통해 분자간 S--S 결합 형성이 되는 것이 발견된다면, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하며, 구체적 폴리머 매트릭스 조성물을 발생시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 조제물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단시간 작용, 속방출, 장시간 작용 또는 서방출이 되도록 설계될 수 있다. 따라서, 약제학적 조제물은 또한 제어방출 또는 지효성일 수 있다.
구체적 투약량은 질병의 상태, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 피험체의 식이요법, 투약 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 약물의 조합에 의존하여 조절될 수 있다. 유효량을 함유하는 상기 제형 중 어떤 것은 일상적인 실험의 범위 내에서 용이하며, 따라서 본 발명의 범주 내에 있다.
면역글로뷸린은 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해, 원한다면 국소 처치, 병변내 투여를 위해 투여된다. 비경구 주입은 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 면역글로뷸린은 특히 면역글로뷸린 또는 항체의 용량을 감쇠시키면서 펄스 주입에 의해 투여된다. 바람직하게는 용량은 주사에 의해, 가장 바람직하게는 투여가 잠시 동안인지 또는 만성적인지 여부에 부분적으로 의존하여 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 국소, 구체적으로 경피, 경점막, 직장, 경구 또는, 예를 들어 원하는 부위에 가깝게 위치된 카테터를 통한 지역적 투여를 포함하는 다른 투여 방법이 고려된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 면역글로뷸린은 매일 내지 매주 내지 매달(예를 들어, 매일, 격일마다, 3일마다 또는 1주일에 2, 3, 4, 5 또는 6회)의 범위에 있는 빈도로 0.01㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏ 범위의 용량에서, 바람직하게는 1주일에 2 또는 3회의 빈도로 0.1 내지 45㎎/㎏, 0.1 내지 15㎎/㎏ 또는 0.1 내지 10㎎/㎏ 범위의 용량에서, 또는 1개월에 1회 45㎎/㎏까지의 용량에서 생리적 용액 내에 정맥내로 투여된다
본 발명의 실시형태 또는 양태는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함할 수 있다:
1. 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린으로서,
(a) 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 중쇄 가변 영역은 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 182, 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
2. 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린으로서,
(a) 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349, 서열번호 351, 서열번호 353, 서열번호 355 또는 서열번호 359의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(b) 경쇄 가변 영역은 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 349 또는 서열번호 355의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(c) 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(d) 경쇄 가변 영역은 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 357, 서열번호 359 또는 서열번호 369의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(e) 경쇄 가변 영역은 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349 또는 서열번호 351의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
3. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
4. 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 353의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
5. 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고; 중쇄 가변 영역은 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
6. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분리된 면역글로뷸린은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론성 항체를 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체를 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
11. 제10항에 있어서, 하기를 포함하는 분리된 면역글로뷸린:
(a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(b) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(c) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
(d) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 그것에 컨쥬게이트된 1 내지 24개의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티를 더 포함하는 분리된 면역글로뷸린.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티는 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드인 분리된 면역글로뷸린.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로뷸린은 재조합적으로 생성된 분리된 면역글로뷸린.
15. 제14항에 있어서, 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 면역글로뷸린 중쇄의 Fc 도메인의 내부 루프 내에서 면역글로뷸린 중쇄의 1차 아미노산 서열에 삽입된 분리된 면역글로뷸린.
16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 면역글로뷸린 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 컨쥬게이트된 분리된 면역글로뷸린.
17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 면역글로뷸린 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 컨쥬게이트된 분리된 면역글로뷸린.
18. 제13항 또는 제14항에 있어서, 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 독소 펩타이드, IL-6 결합 펩타이드, CGRP 펩타이드 길항물질, 브래디키닌 B1 수용체 펩타이드 길항물질, PTH 작용물질 펩타이드, PTH 길항물질 펩타이드, ang-1 결합 펩타이드, ang-2 결합 펩타이드, 마이오스타틴 결합 펩타이드, EPO-모방체 펩타이드, FGF21 펩타이드, TPO-모방체 펩타이드, NGF 결합 펩타이드, BAFF 길항물질 펩타이드, GLP-1 또는 이것의 펩타이드 모방체, 또는 GLP-2 또는 이것의 펩타이드 모방체인 분리된 면역글로뷸린.
19. 제18항에 있어서, 독소 펩타이드는 ShK 또는 ShK 펩타이드 유사체인 분리된 면역글로뷸린.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린; 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
22. 제3항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
23. 제4항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
24. 제5항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
25. 제6항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
26. 제11항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
27. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린을 암호화하는 분리된 핵산.
28. 제21항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
29. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
30. 제27항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
31. 제28항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
32. 제29항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
33. 제30항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
35. (a) 발현 벡터에 의해 암호화된 면역글로뷸린을 발현시키는 조건 하에 배양 배지에서 제34항의 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및
(b) 배양 배지로부터 면역글로뷸린을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
36. 제1항에 있어서, 30 마이크로몰 농도의 면역글로뷸린은, 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션시킨 수용액 중 30 나노몰 농도의 가용성 인간 IL-17R(서열번호 89)에 유의하게 결합되지 않은 면역글로뷸린.
37. 제2항에 있어서, 10 마이크로몰 농도의 면역글로뷸린은, 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션시킨 수용액 중 10 나노몰 농도의 가용성 인간 TR2(서열번호 82)에 유의하게 결합되지 않은 면역글로뷸린.
본 발명은 다음의 추가 실시예에 의해 예시되며, 이는 어떤 방법으로 제한하고자 하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
인간 IL -17R 및 스크리닝에 대한 항체의 생성
클로닝 및 유전자 조작. 항-huIL-17R 항체에 대해 면역글로뷸린 중쇄(VH1을 포함) 및 경쇄(VL1을 포함) 서브유닛을 암호화하는 항체 16429 DNA 서열을 Tocker 등(WO 2008/054603 A2)으로부터 얻었고, 표준 재조합 기법을 사용하여 클로닝시켰다. 이들 항체의 결합 능력을 제거하기 위하여, 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭을 사용하여 일련의 부위 지정 돌연변이유발 클론을 만들었다. 변화된 아미노산을 상보적 결정 영역(CDR) 내 위치를 기준으로 선택하였고, 생식계열 서열로부터 변화시켰으며, 용매 노출 및 방향성 및 전하 성질을 측정하였다. 돌연변이체의 초기 설정은 생식세포계열 및 알라닌 스캐닝 돌연변이체이었다. 후속하여, 돌연변이를 조합하였고, 몇몇 경우에 알라닌 스캐닝 돌연변이체를 돌연변이시켜 알라닌을 글루탐산으로 대체함으로써 음전하를 도입하고, 알라닌을 아르기닌으로 대체함으로써 양전하를 도입하였다.
PCR 부위 지정 돌연변이 생성의 대표적인 예는 항-IL17 경쇄의 CDR3에서 트립토판 대신에 알라닌의 도입이다.
PCR 증폭은 돌연변이를 도입하기 위하여 사용된 5' 및 3' PCR 및 돌연변이된 항-IL17R 경쇄의 2개의 단부를 결합시키기 위한 최종 중첩 PCR에 의한 3단계 과정으로서 행해진다. 5' PCR은 전방 프라이머인 5'- AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAA GCC CCA GCG CAG -3'(서열번호 31) 및 후방 프라이머인 5'- GAA AGT GAG CGG AGC GTT ATC ATA CTG CTG ACA -3'(서열번호 32)을 사용한다. 3' PCR은 전방 프라이머인 5'- TGT CAG CAG TAT GAT AAC GCT CCG CTC ACT TTC -3'(서열번호 33) 및 후방 프라이머인 5'- AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA -3'(서열번호 34)을 사용한다. 중첩 PCR은 전방 프라이머인 5'- AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAA GCC CCA GCG CAG -3'(서열번호 31) 및 후방 프라이머인 5'- AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA -3'(서열번호 34)을 사용한다.
Phusion HF DNA 중합효소(Finnzyme)에 의해 PCR을 수행하였다. 5' 및 3' PCR에 대한 PCR 반응 주기는 94℃에서 항-IL-17R 경쇄 DNA의 20초 변성으로 이루어진 다음, 각 주기에 의한 3주기의 증폭은 94℃에서 20초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초로 이루어지고, 이에 더하여 추가적인 27 주기는 94℃에서 20초; 60℃에서 30초; 및 72℃에서 30초로 이루어진다. 그 다음에 반응물을 72℃에서 7분 동안 인큐베이션시킨 후 최종 PCR 주기는 완전한 연장을 보장하였다. 중첩 PCR에 대한 PCR 반응 주기는 94℃에서 5' 및 3' PCR DNA의 20초 변성으로 이루어진 다음, 각 주기에 의한 3주기의 증폭은 94℃에서 20초; 55℃에서 60초; 및 72℃에서 40초로 이루어지고, 이에 더하여 추가적인 27 주기는 94℃에서 20초; 60℃에서 30초; 및 72℃에서 40초로 이루어진다. 그 다음에 반응은 72℃에서 7분 동안 인큐베이션된 후, 최종 PCR 주기에 의해 완전한 연장을 보장한다. 중첩 PCR 생성물을 pTT5 발현 벡터(NRCC)로 클로닝시켰고, 그것의 서열을 ABI DNA 시퀀싱 기기(Perkin Elmer)를 사용하여 결정하였다. 구성체 발생에 대한 더 상세한 설명은 본 명세서의 실시예 5 및 실시예 6에서 발견된다. 표 6(이하)은 본 단락에 기재한 동일 PCR 주기 조건을 기반으로 본 발명의 면역글로뷸린 및 컨쥬게이트의 다양한 실시형태의 성분 서브유닛을 클로닝하는데 사용된 프라이머 및 주형에 대한 상세한 설명을 포함한다.
재조합 단클론성 항체를 만들기 위한 일시적 발현
다음과 같이 HEK 293-6E 세포 내에서 일시적 트랜스펙션을 수행하였다. 엡스타인 바르 바이러스 핵 항원-1(293-6E 세포)를 안정하게 발현시키는 인간 배아 신장 293 세포주를 국립 연구회(캐나다 몬트리올에 소재)로부터 얻었다. 6mM L-글루타민(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen), 1.1% F-68 Pluronic(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 및 250㎍/㎕ 제네티신(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)으로 보충한 F17 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)를 사용하여 세포를 무혈청 현택 배양물로서 유지시켰다. 현탁 세포 배양물을 엘렌마이어(Erlenmeyer) 진탕 플라스크 배양물 내에서 유지시켰다. 배양 플라스크를 37℃에서 축축한 5% CO2 분위기로 65 rpm에서 진탕시켰다. 25-kDa 선형 PEI(펜실베니아주 워링턴에 소재한 Polysciences)의 저장액(1㎎/㎖)을 수중에서 제조하였고, 용해될 때까지 HCl에 의해 pH 2.0으로 산성화시켰으며, NaOH로 중화시키고, 멸균여과(0.2㎛)시켰으며, 알리쿼팅하고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 트립톤 N1을 OrganoTechni S.A.(캐나다 퀘벡주에 소재한 TekniScience)로부터 얻었다. 저장액(20%, w/v)을 Freestyle 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogem)로부터 제조하였고, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과시켰으며, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 전형적으로, 1ℓ 규모에서 트랜스펙션을 수행하였다. 세포(293-6E)를 1.1×106 세포/㎖의 생존 세포 밀도로 성장시킨 다음, 트랜스펙션 복합체를 최종 배양물 용적의 1/10 용적으로 제조하였다. 1-ℓ 트랜스펙션 배양물에 대해, 트랜스펙션 복합체를 100 ㎖ F17 기본 배지에서 제조하였고, 500㎍ 플라스미드 DNA(중쇄 및 경쇄 DNA, 1:1 비)를 우선 100 ㎖ F17 배지 내에서 희석시켰다. 실온에서 5-분 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 PEI 용액을 첨가하였다. 복합체를 약하게 교반시킨 다음, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 진탕 플라스크 배양물 내 세포에 트랜스펙션 복합체 혼합물을 첨가함으로써 세포를 트랜스펙션시켰다. 24 시간 트랜스펙션 후, 트립톤 N1을 0.5%의 최종 농도로 트랜스펙션시킨 배양물에 첨가하였고, 트랜스펙션시킨 배양물을 그것들을 채취한 후 다른 5일 동안 37℃에서 습한 5% CO2 분위기로 65 rpm에서 진탕기 상에서 유지시켰다. 조건 배지를 4000 rpm에서 원심분리에 의해 채취한 다음, 0.2㎛ 필터(Corning Inc.)를 통해 멸균여과시켰다.
항체의 정제. 7℃에서 5 ㎖/분으로 칼럼 상에서 조건 배지를 직접 로딩한 재조합 단백질 A 세파로스(GE Healthcare)를 사용하여 일시적으로 발현된 항체를 정제하였다. 그 다음에 칼럼을 2가 양이온 없이 둘베코 PBS의 10 칼럼 용적으로 세척한 다음, pH 3.5의 100mM 아세트산으로 용리시켰다. 용리시킨 항체를 크로마토그래피 프로파일을 기반으로 풀링(pool)시켰고, 2M Tris 염기를 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다. 그 다음에 풀을 0.8/0.22㎛ 실린지 필터를 통해 여과시킨 다음, 10mM 아세트산, 9% 수크로스, pH 5.0에 대해 투석시켰다. 그 다음에 완충제 교환된 항체를 Vivaspin 30 kDa 원심분리 농축기(Sartorius)를 사용하여 농축시켰고, 농축 생성물을 0.22㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰다.
바이아코어(BIAcore)(등록상표) 결합 분석. 그 다음에 바이아코어(BIAcore) 분석에 의해 결정되는 바와 같은 IL-17R 세포밖 도메인에 결합의 결여에 기반하여 선두 후보를 선택하였다. 항체 16429는 huIL-17R에 특이적으로 결합하는 인간 항체이다. 용액 평형 결합 분석을 진행시켜 huIL-17R에 항체 세트의 결합 활성을 평가하였다. 제조업자의 설명서(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 BIACore, Inc.)에 따라 항체 16429를 바이아코어(BIAcore)(등록상표) 2000, 연구 등급 센서 칩 CM5 표면에 고정시켰다. 간략하게, 0.2M N-에틸-N'-(다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(EDC) 및 0.05M N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 함유하는 혼합물의 60 ㎕를 주입함으로써 센서 칩 표면 상의 카복실 기를 활성화시켰다. 항체 16429를 10mM 아세트산나트륨, pH 4.0 중에서 희석시켰고, 30 ㎕/분에서 6분 동안 활성화된 칩 표면에 걸쳐 주입하였다. 표면 상에서 과량의 반응기를 60 ㎕의 1M의 에탄올아민을 주입함으로써 불활성화시켰다. 최종 고정 수준은 대략 6600 공명 단위(RU)이었다. 도 2A에서 표시되는 바와 같이, 가용성 항체의 부재에서 10nM의 IL-17R을 사용하여 고정된 16429 항체에 대한 IL-17R의 100% 결합 신호를 확립하였다. 용액 중에서 항체 결합을 결정하기 위하여, 10nM, 100nM 및 1000nM의 항체 샘플을 10nM IL-17R과 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 IL-17R의 감소된 결합 신호는 용액 중에서 IL-17R에 대한 항체의 결합을 나타낸다. 이 분석을 기반으로, 16435, 16438, 16439, 16440, 16441 및 16444 항체는 IL-17R 결합 능력에서 실질적인 감소를 증명하였다. 도 2B에서 나타내는 바와 같이, 30nM IL-17R 및 30μM 항체 샘플을 사용하여 선택된 항체가 그것의 IL-17R 결합 활성을 상실하였음을 추가로 증명한다. 이 분석을 기반으로, 시험한 모두 6개의 항체(16435, 16438, 16439, 16440, 16441 및 16444)는 30μM까지의 항체에서 유의한 IL-17R 결합 활성을 나타내지 않았다.
세포 기반 활성 분석. 세포 상에서 IL-17과 IL-17R의 상호작용은 이들 세포로부터 성장-관련 발암유전자 알파(growth-related oncogene alpha, GRO-α)를 포함하는 다양한 인자의 생성을 유발한다. 세포-기반 특징 분석을 진행하여 샌드위치 ELISA에 의해 방출된 GRO-α를 측정하였다. 이 ELISA에서, GRO-α 포획 항체를 이용하여 GRO-α에 결합시킨 다음, 바이오틴화된 GRO-α 검출 항체를 사용하여 포획 단백질을 검출한다. 그 다음에 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)에 컨쥬게이션한 스트렙타비딘을 첨가하여 결합된 바이오틴화 GRO-α 검출 항체의 양을 검출한다. 결합된 HRP의 양을 450㎚에서 흡광도의 평가에 의해 측정한다. 450㎚에서 흡광도의 증가는 생성된 GRO-α 양의 증가를 표시한다. 이 분석에서, 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblast, HFF)를 5ng/㎖ IL-17으로 0.1μM, 1μM 및 10μM의 항체 샘플과 함께 인큐베이션시킨다. 그 다음에 조건 세포 배지를 채취하고, GRO-α 샌드위치 ELISA를 사용하여 GRO-α 수준의 평가를 위해 처리한다. 모두 6개의 실험 담체 항체(16435, 16438, 16439, 16440, 16441 및 16444)는 10μM까지의 항체에서 이 분석에서 유의한 차단 활성을 나타내지 않았다(도 3).
균질성의 분석. 일시적 발현에 의해 생성한 항체를 연속해서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 이동상 flowed at 0.5㎖/분(도 4A 내지 도 4B)에서 유동되는 이동상으로 2개의 크기 배제 칼럼(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541)을 사용하여 균질성에 대해 분석하였다. 모든 항체가 상대적으로 낮은 수준의 고분자량종을 나타내었지만, 16439 및 16435는 최소인 반면, 16440는 최대였다. 환원성(도 6) 및 비-환원성(도 5) 로딩 완충제를 사용하여 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 생성물 양에 대해 선두 항체를 추가로 분석하였다. 모든 후보는 비환원성과 환원성 SDS-PAGE에 의해 상당히 유사함을 나타냈지만; 16433은 환원성 SDS-PAGE 상의 일부 추가적인 고분자량 물질을 나타내었다. SEC 거동, SDS-PAGE 균일성, 바이아코어(BIAcore) 결합 분석을 기반으로 선두 후보를 추가로 선택하였다. 이들 기준을 기반으로, 추가 평가를 위해 16435 및 16444를 선택하였다.
항체의 안정한 발현. 항체 16435 및 16444 발현 풀을 대응하는 HC로 CHO DHFR(-) 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 만들었고, 표준 전기천공법 과정을 사용하여 LC 발현 플라스미드를 설정하였다. 각 항체 분자마다, 3 내지 4개의 상이한 트랜스펙션을 수행하여 다수의 풀을 만들었다. 트랜스펙션 후, 세포를 무혈청, (-) GHT(플라스미드를 선택하고 회수하도록 하는 선택적 성장 배지) 내 풀로서 성장시켰다. (-) GHT 선택적 배지에서 성장시킨 세포 풀을 그것이 85% 초과의 생존율에 도달할 때까지 배양시켰다. 선택한 세포 풀을 150㎚ MTX로 증폭시켰다. 증폭시킨 MTX 풀의 생존율이 85% 초과의 생존율에 도달하였을 때, 풍부한 생성 배지와 함께 단축한 6일 배치 생성 분석을 사용하여 풀을 스크리닝하여서 발현을 평가하였다. 6일 분석 역가 및 보정 질량 확인을 기반으로 최고의 풀을 선택하였다. 후속하여, 항체 생성을 위하여 11-일 공급-배치 과정을 사용하여 정률증가 생성을 수행한 후, 채취하고 정제하였다.
Poros A 칼럼, 20㎛, 2.1×30㎜(Applied Biosystems, 부분 #1-5024-12)을 사용하여 HPLC 분석에 의해 역가를 결정하였다(도 7A 내지 도 7B). 간략하게, 조건 배지 내 항체를 HPLC에 의한 분석 전 Spin-X 칼럼(Corning, part #8160)을 사용하여 여과시켰고, 시험 항체의 주입 전 및 각 분석 실행 후 1X PBS(Invitrogen, 부분 #14190-144)의 블랭크 주입을 수행하였다. 추가로, 칼럼을 조건화하는 분석 전 항체가 없는 조건 배지를 주사하였고, 100㎍의 대조군 항체의 3회 주입에 의해 새로운 칼럼을 조건화하였다. 0.6 ㎖/분에서 PBS로 9-분 세척 후, 항체를 ImmunoPure IgG 용리 완충제(Pierce, part #21009)로 용리시켰고, 280㎚에서 흡광도를 관찰하였다. 항체 역가를 피크 면적에 대한 대조군 항체 농도의 표준 플롯에 대해 정량화시켰다. 대조군 항체 저장액을 4㎎/㎖의 농도로 제조하였고, PBS의 용적(0.1㎍/㎕ 내지 1.6㎍/㎕) 내 항체 대조군 저장액의 희석에 의해 5개의 표준 항체 농도를 제조하였다. 표준 곡선을 연장시킴으로써, 검출의 하한은 0.02㎍/㎕의 항체이고, 정량화의 상한은 4㎍/㎕이다. 시험 항체가 대조군과 유사한 흡광도 특징을 가진다는 가정을 만들었지만; 시험 항체의 흡광계수에 대한 대조군 항체의 흡광계수 비에 역가를 곱함으로써 조절할 수 있다. 역가 분석 결과는 공급 배치 과정에 대한 정률 증가 후, 16435 항체가 16444 담체 항체보다 미미하게 더 양호한 발현을 보여준다는 것을 나타낸다.
안정하게 발현된 항체의 정제. 세척 완충제로서 2가 양이온이 없는 둘베코 PBS의 8칼럼 용적 및 용리 완충제로서 7℃에서 100mM 아세트산, pH 3.5를 사용하여 Mab Select Sure 크로마토그래피(GE Life Sciences)에 의해 안정하게 발현된 항체를 정제하였다. 크로마토그램을 기반으로 용리 피크를 풀링시켰고, 2M Tris 염기를 사용하여 pH를 약 5.0까지 상승시켰다. 그 다음에 풀을 적어도 3 용적의 물로 희석시켰고, 0.22-㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시킨 다음, SP-HP 세파로스 칼럼(GE Life Sciences) 상에 로딩하였고, S-완충제 A(20mM 아세트산, pH 5.0)의 10 칼럼 용적으로 세척한 후, 7 ℃에서 50% S-완충제 B(20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0)에 대한 20 칼럼 용적 구배를 사용하여 용리시켰다. 크로마토그램 및 SDS-PAGE 분석을 기반으로 풀을 만든 다음, 물질을 약 6-배로 농축시키고, 30 kDa 막을 갖는 VivaFlow TFF 카세트를 사용하여 10mM 아세트산, 9% 수크로스, pH 5.0의 약 5 용적에 대해 정용여과시켰다. 그 다음에 투석한 물질을 0.8/0.2-㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰고, 280㎚에서 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. 16435 및 16444 변이체의 이온 교환 크로마토그래피 칼럼의 비교는 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 8a 내지 도 8b).
안정하게 발현된 항체의 분석. 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex)를 사용하여 환원성 및 비-환원성 로딩 완충제에 의한 분석은 변이체 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 9a-b). 그러나 연속해서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 0.5 ㎖/분에서 유동된 이동상을 갖는 2개의 크기 배제 칼럼(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541)을 사용하는 분석은 16444이 더 큰 분자량 종을 소유하고, 16435는 더 현저한 사전-피크를 가진다는 것을 나타낸다(도 10).
MicroCal VP-DSC를 사용하여 DSC에 의한 열저항성에 대해 항체를 분석하였고, 샘플을 분당 1℃의 속도로 20℃ 내지 95℃로 가열하였다. DSC는 온도에서 제어된 증가 또는 감소 동안 생체분자에서 생기는 열 변화를 직접 측정하는데, 이는 그것의 본래 상태로 물질을 연구하는 것을 가능하게 한다.
DSC는 열 변성에 기인하는 펼쳐짐의 엔탈피(ΔH)를 측정한다. 용액 내 생체분자는 본래(접힌) 입체구조와 그것의 변성된(펼쳐진) 상태 사이의 평형상태이다. 생체분자의 50%가 펼쳐질 때, 열 전이 중간점(Tm)은 더 높으며, 분자는 더 안정하게 된다. 또한 DSC를 사용하여 변성의 열 용량(ΔCp) 변화를 결정한다(도 11을 참조). 단백질을 10mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0(도 11) 중의 0.5㎎/㎖에서 인큐베이션시켰다. 16435 항체는 2차적 전이에 대해 더 높은 온도를 갖는 가장 바람직한 용융 프로파일을 만들었다.
환원성 및 비-환원성 CE-SDS에 의해 항체를 분석하였다(도 12A 또는 도 12D). 221㎚ 및 220㎚ 파장을 사용하는 UV 다이오드 검출기를 구비한 Beckman PA800 CE 시스템(캘리포니아주 풀러턴에 소재)을 사용하여 모든 CE SDS 실험을 수행하였다. 분리 분석을 위해 베어(bare)-용융 실리카 모세관 50㎛×30.2㎝를 사용하였다. 완충제 바이알 제조 및 로딩뿐만 아니라 모세관 카트리지 설치를 문헌[Beckman Coulter manual for IgG Purity/Heterogeneity]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 환원된 및 비-환원된 CE-SDS에 대한 실행 조건은 이하에 간략하게 기재하는 일부 변형과 함께 문헌[Beckman Coulter manual for IgG Purity/Heterogeneity]에 기재된 것과 유사하다. 비-환원성 조건에 대해, 항체 샘플(150㎍)을 20 ㎕의 SDS 반응 완충제 및 5 ㎕의 70mM N-에틸말레이미드에 첨가하였다. 그 다음에 물을 첨가하여 최종 용적 35 ㎕를 만들었고, 단백질 농도를 4.3㎎/㎖로 이끌었다. 4% SDS, 0.01M 시트레이트 포스페이트 완충(Sigma) 및 0.036M 2염기성 인산나트륨으로 SDS 반응 완충제를 만들었다. 제제를 철저하게 교반시켰고, 5분 동안 45℃에서 가열하였다. 그 다음에 제제를 추가 115 ㎕의 4% SDS와 합하였다. 교반시키고, 원심분리한 후, 제제를 200 ㎕ PCR에 둔 다음 PA800 기기 상에 로딩시켰다. 30초 동안 -10 kV를 사용하여 역극성을 갖는 애노드(anode)에서 샘플을 주입한 다음, 35분 분리 동안 모세관의 양 단부에서 20 psi 압력에 의해 -15 kV에서 분리시켰다. 환원성 조건을 위해, 정제된 H2O를 첨가함으로써 항체 샘플을 2.1㎎/㎖로 희석시켰고, 95㎕의 항체를 5.6% 베타 머캅토에탄올과 함께 105㎕의 SDS 샘플 완충제(Beckman)에 첨가하였다. 그 다음에 제제를 철저하게 교반시킨 다음, 70℃에서 10분 동안 가열시켰다. 원심분리시킨 후, 상청액을 200 ㎕ PCR 바이알에 두었고, 그 다음에 PA800 기기 상에 로딩하였다. 샘플을 -5 kV를 사용하여 20초 동안 역극성을 갖는 애노드에서 주입한 다음, -15 kV에서 20 psi 압력으로 30분 분리 동안 모세관의 양 단부에서 분리시켰다. 16435와 16444 항체는 둘 다 환원성과 비-환원성 CE-SDS와 매우 유사한 프로파일을 만들었다(도 12A-D).
항체의 광 민감도를 측정하기 위하여, 그것들을 주위 연구실 형광등에서 인큐베이션하거나 또는 실온에서 3일 동안 알루미늄 호일로 덮어 두었다. 그 다음에 광 노출된 항체와 암실 대조군 항체를 연속해서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 0.5 ㎖/분에서 유동된 이동상을 갖는 2개의 크기 배제 칼럼(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541)을 사용하여 분석하였다. SEC 크로마토그램을 기반으로, 16444는 16435보다 유의하게 더 광 민감성을 나타내었다(도 13). 그 다음에 연속해서 1M 황산암모늄, 20mM 아세트산나트륨, pH 5.0인 이동상 A 및 20mM 아세트산나트륨, 5% 아세토나이트릴, pH 5.0인 이동상 B를 갖는 2개의 Dionex ProPac HIC-10 칼럼을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 항체를 분석하였다. 샘플을 220㎚에서 흡광도를 관찰하면서 50분에 걸쳐 0 내지 100% 선형 구배로 0.8 ㎖/분에서 용리시켰다. HIC 크로마토그램을 기반으로, 16435는 더 좁은 주요 피크를 가졌으며, 이는 생성물이 더 균일함을 나타낸다(도 14). 더 낮은 광 민감도, 더 양호한 정제 수율(1219㎎/ℓ 대 1008㎎/ℓ), 더 양호한 DSC 프로파일, 더 양호한 SEC 프로파일 및 모 항체로부터 거의 없는 돌연변이를 기반으로, 16435를 이 항체 패밀리에 대한 주요 선두로서 선택하였다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
실시예 2
인간 TRAIL R2 및 스크리닝에 대한 항체의 생성
클로닝 및 유전자조작. 항-huTR2 항체에 대해 면역글로뷸린 중쇄(VH12를 포함) 및 경쇄(VL6를 포함) 서브유닛을 암호화하는 항체 16449 DNA 서열을 Gliniak 등(미국 특허 제7,521,048호)으로부터 얻었고, 표준 재조합 기법을 사용하여 클로닝하였다. 이들 항체의 결합 능력을 제거하기 위하여, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 사용하여 일련의 부위 지정 돌연변이유발 클론을 만들었다. 변화된 아미노산을 상보적 결정 영역(CDR) 내 위치, 생식세포계열 서열로부터의 변화, 추정된 용매 노출 및 방향성 및 하전 특성을 기준으로 선택하였다. 돌연변이체의 초기 설정은 생식세포계열 및 알라닌 스캐닝 돌연변이체이었다. 후속하여, 돌연변이가 얻어지며, 몇몇 경우에 알라닌 스캐닝 돌연변이체는 돌연변이되어 알라닌을 글루탐산으로 대체함으로써 음전하를 도입하거나 또는 알라닌을 아르기닌으로 대체함으로써 양전하를 도입한다. 구성체 발생에 대한 추가적인 설명은 본 명세서의 실시예 5 및 표 6에서 발견된다.
재조합 단클론성 항체를 만들기 위한 일시적인 발현. 다음과 같이 HEK 293-6E 세포 내에서 일시적인 트랜스펙션을 수행하였다. 엡스타인 바르 바이러스 핵 항원-1을 안정하게 발현시키는 인간 배아 신장 293 세포주(293-6E 세포)를 국립연구회(캐나다 몬트리올에 소재)로부터 얻었다. 6mM L-글루타민(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen), 1.1% F-68 Pluronic(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 및 250㎍/㎕ 제네티신(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrigen)으로 보충한 F17 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)를 사용하여 무혈청 현탁액으로서 세포를 유지하였다. 현탁 세포 배양물을 엘렌마이어 진탕 플라스크 배양물 중에서 유지하였다. 배양 플라스크를 습한 5% CO2 분위기에서 37℃로 65 rpm에서 진탕시켰다. 저장액(1㎎/㎖)의 25-kDa 선형 PEI(펜실베니아주 워링턴에 소재한 Polysciences)를 수 중에서 제조하였고, 용해될 때까지 HCl로 pH 2.0까지 산성화시킨 다음, NaOH로 중화시키고, 멸균여과시켰으며(0.2㎛), 알리쿼트하였고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 트립톤 N1을 OrganoTechni S.A.(캐나다 퀘벡주에 소재한 TekniScience)로부터 얻었다. 저장액(20%, w/v)을 Freestyle 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogem) 내에서 제조하였고, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과시켰으며, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 전형적으로, 트랜스펙션을 1ℓ 스케일에서 수행하였다. 세포(293-6E)를 1.1×106 세포/㎖의 생존 세포 밀도로 성장시킨 다음, 트랜스펙션 복합체를 최종 배양물 용적의 1/10 용적으로 제조하였다. 1-ℓ 트랜스펙션 배양물에 대해, 트랜스펙션 복합체를 100 ㎖ F17 기본 배지에서 제조하였고, 500㎍ 플라스미드 DNA(중쇄 및 경쇄 DNA, 1:1 비)를 우선 100 ㎖ F17 배지 내에서 희석시켰다. 실온에서 5-분 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 PEI 용액을 첨가하였다. 복합체를 약하게 교반시킨 다음, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 진탕 플라스크 배양물 내 세포에 트랜스펙션 복합체 혼합물을 첨가함으로써 세포를 트랜스펙션시켰다. 24 시간 트랜스펙션 후, 트립톤 N1을 0.5%의 최종 농도로 트랜스펙션시킨 배양물에 첨가하였고, 트랜스펙션시킨 배양물을 그것들을 채취한 후 다른 5일 동안 37℃에서 습한 5% CO2 분위기로 65 rpm에서 진탕기 상에서 유지시켰다. 조건 배지를 4000 rpm에서 원심분리에 의해 채취한 다음, 0.2㎛ 필터(Corning Inc.)를 통해 멸균여과시켰다.
항체의 정제. 7℃에서 5 ㎖/분으로 칼럼 상에서 조건 배지를 직접 로딩한 재조합 단백질 A 세파로스(GE Healthcare)를 사용하여 일시적으로 발현된 항체를 정제하였다. 그 다음에 칼럼을 2가 양이온 없이 둘베코 PBS의 10 칼럼 용적으로 세척한 다음, pH 3.5의 100mM 아세트산으로 용리시켰다. 용리시킨 항체를 크로마토그래피 프로파일을 기반으로 풀링시켰고, 2M Tris 염기를 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다. 그 다음에 풀을 0.8/0.22㎛ 실린지 필터를 통해 여과시킨 다음, 10mM 아세트산, 9% 수크로스, pH 5.0에 대해 투석시켰다. 그 다음에 완충제 교환된 항체를 Vivaspin 30 kDa 원심분리 농축기(Sartorius)를 사용하여 농축시켰고, 농축 생성물을 0.22㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰다.
바이아코어(BIAcore)(등록상표) 결합 분석. 항체 16449는 트레일 수용체 2(Trail Receptor 2, TR2)에 특이적으로 결합하는 인간 항체이다. 용액 평형 결합 분석을 진행시켜 TR2에 항체 세트의 결합 활성을 평가하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 항체 16449를 CM5 센서 칩 표면에 고정시켰다. 최종 고정 수준은 대략 8000 공명 단위(RU)이었다. 항체의 부재에서 TR2(1nM)를 사용하여 용액 내 항체 결합이 없는 TR2의 100% 결합 신호를 확립하였다. 용액 내 항체 결합을 결정하기 위하여, 7pM 내지 10nM의 범위에서 단계 희석시킨 항체 샘플을 1nM TR2와 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후 TR2의 감소된 결합 신호는 용액 내 TR2에 항체의 결합을 표시한다. 도 15에서 결과는 모두 3개의 새로운 항체 구성체(16449, 1869 및 1870)가 본래 구성체의 결합 활성과 유사한 TR2 결합 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.
다른 실험에서, 상기 기재한 바와 같은 분석에서 10nM TR2를 50nM 및 1μM 항체 샘플과 함께 인큐베이션시켰다. 10nM TR2를 사용하여 100% 결합 신호를 정하였다. 몇몇 항체는 50nM(16613, 1919, 1913, 1910, 1920 및 1922)에서 결합의 유의한 결여를 나타내었지만, 어떤 것도 1000nM에서 완전한 결합의 결여를 나타내지 않았다(도 16에서 나타낸 결과). 추가적인 점 돌연변이유발로 TR2에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 항체를 수득하였다(도 17). 2개의 부위(중쇄 Y125 및 경쇄 Y53)는 특히 위치 Y125에서 하전된 치환에 의해 돌연변이유발에 대해 예외적인 민감도를 나타내었다. 이중 알라닌 치환은 TR2에 대해 훨씬 더 감소된 결합 친화도를 갖는 변이체를 생성하였다(도 18). 알라닌 돌연변이를 하전된 돌연변이와 쌍으로 또는 큰 순서, 방식으로 합하는 것은 10μM 항체에서 조차 TR2에 유의한 결합을 나타내지 않는 몇몇 분자를 생성하였다(도 19). 이들 데이터로부터, 5가지 최종 변이체(10186, 10184, 4341, 10183 및 4241)를 50μM 항체에서 결합 연구를 위해 진행시켰다(도 20a-b). 10186 이외의 모두는 50μM에서조차 TR2에 유의한 결합을 나타내지 않았다.
세포 기반 활성 분석. Colo205는 TRAIL의 존재에 민감한 인간 결장암 세포주이다. Colo205의 표면 상에서 TR2에 양성 대조군 IgG1 항-TR2 mAb 분자(항체 16449)의 결합은 세포 아포토시스를 야기한다. 항체의 세포 사멸 효능을 확인하기 위하여 Colo205 기반 세포 분석을 진행하였다. 인간 복수 결장직장 선암종 세포주 Colo205 내 아포토시스를 유발하는 그것의 능력에 의해 항체 16449(항-TRAIL-R2 항체)의 시험관내 생물학적 활성을 분석한다. 제조업자의 설명서에 따라 Apo-One(상표명) Homogeneous caspase(상표명)-3/7 분석 키트(위스콘신주 매디슨에 소재한 PromegaCorporation)를 사용하여 카스파제-3 활성화의 검출을 양성 마커로서 사용한다. (문헌[Niles et al., The Apo-OneTM.homogeneous Caspase(상표명)-3/7 assay: a simplified "solution" for apoptosis detection, Cell Notes 2:2-3 (2001)] 참조). 이 방법에서, 발광성 카스파제-3/7 시약은 Colo205 세포에서 항-TRAIL-R2 유발된 카스파제 활성화의 민감하고 강한 모니터링을 제공한다. 생성된 발광성은 존재하는 카스파제 활성의 양에 비례한다. 각 샘플의 발광성을 플레이트-판독 광도계에서 측정한다. 시험 샘플 반응을 기준 표준 반응과 비교함으로써 시험 샘플의 생물학적 활성을 결정한다. 샘플을 표준 대조군 항체와 비교하기 위하여, 200nM 및 10μM의 항체 샘플을 단백질 G의 1 또는 100㎍/㎖와 함께 사전 인큐베이션시켰다. 그 다음에 혼합물을 Colo205 배양물에 첨가하였다. 도 20C는 대조군 항-TR2 mAb 분자와 달리, 항체 샘플이 매우 높은 농도(예를 들어, 30㎍/㎖의 항체)에서 조차 세포를 사멸시키는 능력을 가지지 않는다는 것을 나타낸다.
균질성 분석. 환원성(도 21B) 및 비환원성 로딩 완충제(도 21A)를 사용하여 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 생성물 품질에 대해 선두 항체를 분석하였다. 모든 후보는 비환원성과 환원성 SDS-PAGE 둘 다와 상당히 유사하게 나타났다. 50mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 1.0 ㎖/에서 유동된 이동상을 갖는 하나의 크기 배제 칼럼(Phenomenex SEC3000, 7.8×300 mm)을 사용하여 균질성에 대해 항체를 추가로 분석하였다(대표적인 결과를 도 22에 나타낸다). 모든 항체가 고분자량 종의 상대적으로 낮은 수준을 나타내었지만, 10185 및 10184는 약간 더 높은 분자량 물질을 나타내었다. SEC 거동, 바이아코어(BIAcore) 결합 분석, 세포 기반 분석 결과, 추정된 단백질 분해 취약성 및 계산된 등전점에서 더 낮은 이동을 기반으로 선두 후보를 선택하였다. 이들 기준을 기반으로, 추가 평가를 위해 4241 및 4341을 선택하였다.
안정한 발현을 위한 구성체 발현. 표준 전기천공법 과정을 사용하여 CHO DHFR(-) 숙주 세포를 대응하는 HC 및 LC 발현 플라스미드 세트로 트랜스펙션시킴으로써 안정하게 발현된 항체 4241 및 4341의 풀을 만들었다. 각 항체 분자마다, 3 내지 4개의 상이한 트랜스펙션을 수행하여 다양한 풀을 만들었다. 트랜스펙션 후, 세포를 플라스미드 함유 세포를 선택하고 회수하도록 하는 무혈청 (-) GHT 선택적 성장 배지 내 풀로서 성장시켰다. (-) GHT 선택적 배지에서 성장시킨 세포 풀을 그것이 85% 초과의 생존율에 도달할 때까지 배양시켰다. 선택한 세포 풀을 150㎚ 메토트렉세이트(MTX)로 증폭시켰다. MTX-증폭 풀의 생존율이 85% 초과의 생존율에 도달하였을 때, 풍부한 생성 배지와 함께 단축한 6일 배치 생성 분석을 사용하여 풀을 스크리닝하여서 발현을 평가하였다. 6일 분석 역가 및 보정 질량 확인을 기반으로 최고의 풀을 선택하였다. 후속하여, 항체 생성을 위하여 11-일 공급-배치 과정을 사용하여 정률증가 생성을 수행한 후, 채취하고 정제하였다.
Poros A 칼럼, 20㎛, 2.1×30㎜(Applied Biosystems, 부분 #1-5024-12)을 사용하여 HPLC 분석에 의해 역가를 결정하였다. 간략하게, 조건 배지 내 항체를 HPLC에 의한 분석 전 Spin-X 칼럼(Corning, part #8160)을 사용하여 여과시켰고, 시험 항체의 주입 전 및 각 분석 실행 후 1X PBS(Invitrogen, 부분 #14190-144)의 블랭크 주입을 수행하였다. 추가로, 칼럼을 조건화하는 분석 전 항체가 없는 조건 배지를 주사하였고, 100㎍의 대조군 항체의 3회 주입에 의해 새로운 칼럼을 조건화하였다. 0.6 ㎖/분에서 PBS로 9-분 세척 후, 항체를 ImmunoPure IgG 용리 완충제(Pierce, part #21009)로 용리시켰고, 280㎚에서 흡광도를 관찰하였다.
항체 역가를 피크 면적에 대한 대조군 항체 농도의 표준 플롯에 대해 정량화시켰다. 대조군 항체 저장액을 4㎎/㎖의 농도로 제조하였고, PBS의 용적(0.1㎍/㎕ 내지 1.6㎍/㎕) 내 항체 대조군 저장액의 희석에 의해 5개의 표준 항체 농도를 제조하였다. 표준 곡선을 연장시킴으로써, 검출의 하한은 0.02㎍/㎕의 항체이고, 정량화의 상한은 4㎍/㎕이다. 시험 항체가 대조군과 유사한 흡광도 특징을 가진다는 가정을 만들었지만; 시험 항체의 흡광계수에 대한 대조군 항체의 흡광계수 비에 역가를 곱함으로써 조절할 수 있다. 역가 분석 결과는 공급 배치 과정에 대한 정률 증가 후, 4241 항체가 4341 항체보다 미미하게 더 양호한 발현을 보여준다는 것을 나타낸다(도 23A-B).
안정하게 발현된 항체의 분석. 세척 완충제로서 2가 양이온이 없는 둘베코 PBS의 8칼럼 용적 및 용리 완충제로서 7℃에서 100mM 아세트산, pH 3.5를 사용하여 Mab Select Sure 크로마토그래피(GE Life Sciences)에 의해 안정하게 발현된 항체를 정제하였다. 크로마토그램을 기반으로 용리 피크를 풀링시켰고, 2M Tris 염기를 사용하여 pH를 약 5.0까지 상승시켰다. 그 다음에 풀을 적어도 3 용적의 물로 희석시켰고, 0.22-㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시킨 다음, SP-HP 세파로스 칼럼(GE Life Sciences) 상에 로딩하였고, S-완충제 A(20mM 아세트산, pH 5.0)의 10 칼럼 용적으로 세척한 후, 7 ℃에서 50% S-완충제 B(20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0)에 대한 20 칼럼 용적 구배를 사용하여 용리시켰다. 크로마토그램 및 SDS-PAGE 분석을 기반으로 풀을 만든 다음, 물질을 약 6-배로 농축시키고, 30 kDa 막을 갖는 VivaFlow TFF 카세트를 사용하여 10mM 아세트산, 9% 수크로스, pH 5.0의 약 5 용적에 대해 정용여과시켰다. 그 다음에 투석한 물질을 0.8/0.2-㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰고, 280㎚에서 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 환원성 로딩 완충제를 사용하여 정제 처리한 샘플을 분석하였다(도 24a 및 도 24b). 이들 데이터는 예상치 못한 샘플 손실을 만드는 단계 없이 4241과 4341 항체가 둘 다 유사한 정제 특징을 가진다는 것을 나타내었다.
안정하게 발현된 항체의 분석. 4241 및 4341 변이체의 이온 교환 크로마토그래피 프로파일의 비교(도 25)는 4341이 4241보다 덜 이종성임을 나타내는 더 좁은 주요 피크를 가진다는 것을 나타내었다. 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex)를 사용하여 환원성 및 비-환원성 로딩 완충제에 의한 분석은 변이체 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 26a 및 도 26b). 연속해서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 0.5 ㎖/분에서 유동된 이동상을 갖는 2개의 크기 배제 칼럼(TSK-GEL G3000SWXL, 5㎜ 입자크기, 7.8×300㎜, TosohBioscience, 08541)을 사용하는 분석은 또한 4241과 4341 변이체 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 27A 내지 도 27B). MicroCal VP-DSC를 사용하여 DSC에 의한 열저항성에 대해 항체를 분석하였고, 샘플을 분당 1℃의 속도로 20℃ 내지 95℃로 가열하였다. 단백질은 10mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0 중에서 0.5㎎/㎖였다(도 28). 4241 항체는 항체 4341에 비하여 2차적 전이에 대해 더 높은 온도를 갖는 가장 바람직한 용융 프로파일을 만들었다.
환원성 및 비-환원성 CE-SDS에 의해 4241 및 4341 항체를 분석하였다(도 29A 내지 도 29D). 221㎚ 및 220㎚ 파장을 사용하는 UV 다이오드 검출기를 구비한 Beckman PA800 CE 시스템(캘리포니아주 풀러턴에 소재)을 사용하여 모든 CE SDS 실험을 수행하였다. 분리 분석을 위해 베어-용융 실리카 모세관 50㎛×30.2㎝를 사용하였다. 완충제 바이알 제조 및 로딩뿐만 아니라 모세관 카트리지 설치를 문헌[Beckman Coulter manual for IgG Purity/Heterogeneity]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 환원된 및 비-환원된 CE-SDS에 대한 실행 조건은 이하에 간략하게 기재하는 일부 변형과 함께 문헌[Beckman Coulter manual for IgG Purity/Heterogeneity]에 기재된 것과 유사하다. 비-환원성 조건에 대해, 항체 샘플(150㎍)을 20 ㎕의 SDS 반응 완충제 및 5 ㎕의 70mM N-에틸말레이미드에 첨가하였다. 그 다음에 물을 첨가하여 최종 용적 35 ㎕를 만들었고, 단백질 농도를 4.3㎎/㎖로 이끌었다. 4% SDS, 0.01M 시트레이트 포스페이트 완충(Sigma) 및 0.036M 2염기성 인산나트륨으로 SDS 반응 완충제를 만들었다. 제제를 철저하게 교반시켰고, 5분 동안 45℃에서 가열하였다. 그 다음에 제제를 추가 115 ㎕의 4% SDS와 합하였다. 교반시키고, 원심분리한 후, 제제를 200 ㎕ PCR에 둔 다음 PA800 기기 상에 로딩시켰다. 30초 동안 -10 kV를 사용하여 역극성을 갖는 애노드(anode)에서 샘플을 주입한 다음, 35분 분리 동안 모세관의 양 단부에서 20 psi 압력에 의해 -15 kV에서 분리시켰다. 환원성 조건을 위해, 정제된 H2O를 첨가함으로써 항체 샘플을 2.1㎎/㎖로 희석시켰고, 95㎕의 항체를 5.6% 베타 머캅토에탄올과 함께 105㎕의 SDS 샘플 완충제(Beckman)에 첨가하였다. 그 다음에 제제를 철저하게 교반시킨 다음, 70℃에서 10분 동안 가열시켰다. 원심분리시킨 후, 상청액을 200 ㎕ PCR 바이알에 두었고, 그 다음에 PA800 기기 상에 로딩하였다. 샘플을 -5 kV를 사용하여 20초 동안 역극성을 갖는 애노드에서 주입한 다음, -15 kV에서 20 psi 압력으로 30분 분리 동안 모세관의 양 단부에서 분리시켰다. 항체 중 어떤 것도 CE-SDS 분석에 의해 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 29A-D).
또한 완충제 A로서 20mM 아세트산, pH 5.0을 사용하고, 0 내지 40% 완충제 B로부터의 80분 선형 구배로 1 ㎖/분에서 유동된 완충제 B로서 20mM 아세트산, 1M NaCl, pH 5.0을 사용하는 고성능 이온 교환 크로마토그래피(SP-5PW, 10㎛ 입자, 7.5㎜ ID×7.5㎝, TosohBioscience, 08541)를 사용하여 항체를 균질성에 대해 분석하였다. 정제된 4241 또는 4341 항체 중 어떤 것도 이 방법에 의해 고성능 이온 교환 프로파일에서 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 30). 항체의 광 민감도를 측정하기 위하여, 그것들을 주위 연구실 형광등에서 인큐베이션하거나 또는 실온에서 3일 동안 알루미늄 호일로 덮어 두었다. 그 다음에 연속해서 1M 황산암모늄, 20mM 아세트산나트륨, pH 5.0인 이동상 A 및 20mM 아세트산나트륨, 5% 아세토나이트릴, pH 5.0인 이동상 B를 갖는 2개의 Dionex ProPac HIC-10 칼럼을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 항체를 분석하였다. 샘플을 220㎚에서 흡광도를 관찰하면서 50분에 걸쳐 0 내지 100% 선형 구배로 0.8 ㎖/분에서 용리시켰다. 광 노출이 있고, 광 노출이 없는 HIC 크로마토그램 둘 다를 기반으로, 어떤 항체도 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 31a 및 도 31b). 정제 동안 더 균일한 이온 교환 크로마토그래피 피크에 주로 기반하여, 4341을 이 패밀리의 항체에 대한 주요 선두로서 선택하였다.
실시예 3
인간 조직 교차-반응성 평가
일반적으로 인간 용도를 위한 단클론성 항체 생성물의 제조 및 시험에서 고려사항을 정리한 지침서(U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administraton, Center for Biologics Evaluation and Research (1997))에 따라서, 예비 비-GLP 연구를 수행하여 본 발명 항체와 다양한 인간 조직의 교차 반응성을 결정하였다. 항체가 약물 개발을 위한 것으로 의도된다면, GLP 조건 하에서 더 광범위한 시험이 필요하다. 시험 항목의 Alexa Fluor 488 표지 형태를 사용하여 선택한 인간 조직의 동결절편에 의해 항체 16435 및 4341의 조직 교차반응성을 평가하였다(네바다주 리노시에 소재한 Charles River Laboratories, Preclinical Services). 2개의 독특한 개체로부터 정상 인간 조직(달리 표시되지 않는다면)을 국립 질병 연구 교환소(펜실베니아주 필라델피아에 소재한 National Disease Research Interchange, NDRI), Cureline, Inc.(캘리포니아주 벌링게임에 소재), Cybrdi(메릴랜드주 락빌에 소재) 또는 Rocky Mountain Lions Eye Bank(콜로라도주 오로라에 소재)에 의해 수집한 Special Pathology Services Human Tissue Bank로부터 얻었다. 시험한 조직은 인간 소뇌, 폐, 대뇌피질, 난소(성숙한 여성으로부터), 눈, 태반, 위장관(소장), 피부(1 개체), 심장, 비장, 신장(1 개체), 갑상선, 간, 고환을 포함하였다. 갓 냉동시킨 인간 조직의 절편 및 대조군 비드 블록(인간 혈청 알부민[HSA] 비드)을 크라이오스탯(cryostat) 상에서 절단시켰고, 해동물을 모세관 갭 슬라이드 상에 고정시켰다. 조직 및 대조군 비드 슬라이드를 -10℃ 내지 -25℃에서 대략 10분 동안 차가운 아세톤 중에서 고정시켰다. 고정시킨 슬라이드를 적어도 한 시간 동안(내지 밤새) 건조시켰다. 냉동저장시켰다면, 고정된 슬라이드를 실험 전날 냉동기로부터 제거하였고, 사용 전 밤새 해동시켰다. 달리 특정되지 않는다면 모든 다음 단계를 수행하였다. 슬라이드를 대략 15분 동안 1X Morphosave(상표명)와 함께 인큐베이션시켜 조직 형태를 보존한 다음 1X 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중에서 각각 대략 5분 동안 2회 세척하였다. 내인성 페록시다제를 차단하기 위하여, 슬라이드를 대략 37℃에서 대략 1시간 동안 글루코스 옥시다제 용액 중에서 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 각각 대략 5분 동안 1X PBS로 2회 세척하였다. 내인성 바이오틴을 아비딘 및 바이오틴 용액 중에서 순차적 인큐베이션에 의해(각각 대략 15분) 차단하였다. 바이오틴에서 인큐베이션 후, 조직 절편을 대략 25분 동안 차단 항체 용액으로 차단시켰다. Alexa Fluor 488-Ab 16435 및 Alexa Fluor 488 항-Ab 4341를 최적의 농도(2.0㎍/㎖)에서 또는 대략 25분 동안 최적의 농도(10.0㎍/㎖에서 5회 절편에 적용하였다. 슬라이드를 세척 완충제로 3회 세척한 다음, 대략 25분 동안 2차 항체(토끼 항-Alexa Fluor 488)와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체로 인큐베이션 후, 슬라이드를 세척 완충제로 4회 세척하였고, 그 다음에 3차 항체(호스래디쉬 페록시다제 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG 항체)와 함께 대략 25분 동안 인큐베이션시키고, 결합을 다이아미노벤지딘(DAB) 발색체 기질로 시각화하였다. 음성 대조군으로서 HSA 비드를 사용하였다. 조직을 CD31에 대한 항체(항-CD31), 즉, 혈소판 내피 세포 접착 분자(platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1)에 의한 염색을 통해 면역조직화학에 적합하게 정량화하였다. 시험 항체 중 어떤 것에 대해 2.0 또는 10.0㎍/㎖ 농도에서 임의의 인간 조직 내 특이적 염색은 없었다.
실시예 4
래트 및 사이노몰구스 원숭이에서 본 발명의 항체 실시형태의 약력학적 ( PK ) 연구
5㎎/㎏ 피하로 주사하고, 투약 후 0, 0.25, 1, 4, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504, 672, 840 및 1008 시간에 옆 꼬리 정맥으로부터 대략 250 ㎕의 혈액을 Microtainer(등록상표) 혈청 세퍼레이터 튜브에 수집함으로써 성체 스프레그-돌리 래트(8 내지 12주령)에서 16435, 16444, 4241 및 4341 담체 항체의 약력학적 프로파일을 결정하였다. 각 샘플을 수집 후 실온에서 유지시켰고, 30 내지 40분 응고 기간 후, 샘플을 캘리브레이션된(calibrated) 에펜도르프 5417R 원심분리 시스템(뉴욕주 웨스터버리에 소재한 Brinkmann Instruments, Inc.)을 사용하여 2-8℃에서 11,500 rpm으로 약 10분 동안 원심분리시켰다. 그 다음에 수집한 혈청을 사전-표지한(각 래트에 대해), 극저온 저장 튜브에 옮겼고, 장래의 분석을 위해 -60℃ 내지 -80℃에서 저장하였다. PK 연구 샘플로부터 혈청 샘플 농도를 측정하기 위하여 다음의 방법을 사용하였다: ½ 면적 흑판(Corning 3694)을 PBS 중에서 2㎍/㎖의 항-hu Fc, 항체 1.35.1로 코팅한 다음 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음에 플레이트를 세척하였고, 4℃에서 밤새 I-Block(상표명)(Applied Biosystems)로 차단하였다. 샘플을 희석시킬 필요가 있다면, 그것들은 래트 SD 대조군 혈청에서 희석시켰다. 표준 및 샘플을 I-Block(상표명) + 5% BSA 중에서 380 ㎕의 희석 완충제 내에 1:20으로 희석시켰다. 플레이트를 세척하였고, 50-㎕ 샘플의 사전처리 표준 및 샘플을 항체 1.35.1 코팅 플레이트에 옮겼고, 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 다음, I-Block(상표명) +5% BSA 중에서 50 ㎕로 100ng/㎖의 항-hu Fc 항체 21.1-HRP 컨쥬게이트를 첨가하였고, 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 다음, 이 플레이트를 광도계로 바로 분석한 후, 50㎕의 Pico 기질을 첨가하였다. 약동학적 프로파일은 항체 16435, 16444, 4241 및 4341 각각에 대해 18,492 ±2,104; 21,021 ±2,832; 24,045 ±2,480 및 24,513 ±972㎍/h/㎖의 AUC0 -t ±SD로 4개의 항체(도 32) 중 어떤 것에 대해 유의한 차이가 없었다.
16435 항체의 약력학적 프로파일을 사이노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서 결정하여 생체내 변수를 평가하였다. 간략하게, 1㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏ 중 하나의 16435의 1회 IV 볼루스 용량을 성숙 수컷 사이노몰구스 원숭이(그룹 당 n=2)에 투여하였다. 혈청 샘플을 투약 전 및 항체 투여 후 시점 0.25, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 360, 408, 456, 504, 552, 600, 648 및 672 시간에 수집하였다. 항-IgG 샌드위치 ELISA를 사용함으로써 16435 항체 수준에 대해 샘플을 분석하였다. WinNonLin(등록상표)(Enterprise version 5.1.1, 2006, 캘리포니아주 마운틴뷰에 소재한 Pharsight(등록상표) Corp.)에 의한 비-구획적 방법을 사용하여 시간 농도 데이터를 분석하였다. 얻어진 약력학적 프로파일은 임의의 유효한 비정상을 나타내지 않았다(도 33).
실시예 5
항체 16435- ShK [1-35, Q16K ] 융합 클로닝 , 정제 및 분석
클로닝 및 발현. 1가 16435-ShK 융합의 성분(항체 3742)은 하기를 포함한다:
(a) 16435 카파 LC(서열번호 109);
(b) 16435 IgG2 HC(서열번호 112); 및
(c) 16435 IgG2-ShK[1-35, Q16K](서열번호 377):
Figure pct00039
.
원하는 생성물 항체 융합(3742)은 하나의 중쇄의 C-말단에 융합된 ShK[1-35, Q16K] 펩타이드(서열번호 76)를 갖는 전체 항체이다(도 34에서 개략적으로 표시). 한 종류의 경쇄를 공유하는 2개의 상이한 중쇄에 의해, 중쇄:경쇄:중쇄-ShK[1-35, Q16K]의 비는 1:2:1이었다. 예상된 발현 생성물은 16435 IgG2, 1가의 16435 IgG2-ShK[1-35, Q16K] 및 2가의 16435 IgG2-ShK[1-35, Q16K]이다. 1가의 16435 IgG2-Shk 융합 단백질을 본 명세서에 기재한 것과 같은 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 혼합물로부터 분리시켰다.
ShK[1-35, Q16K] 단편을 구성체 pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K]를 사용하여 만들었고, 주형으로서 암호화하고(서열번호 389), 이를 StuI 및 NotI로 분해시켰으며, PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하였다. 동시에, pDC324(서열번호 111)를 StuI 및 NotI로 분해시켰고, 송아지 장 포스파타제(Calf Intestine Phosphatase, CIP)로 처리하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 없앴다. 더 큰 단편을 절단하고, 겔을 Qiagen의 겔 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 Shk[1-35, Q16K] 단편을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, 시퀀싱을 위해 제출하였다.몇몇 클론의 서열 분석은 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 거대 규모 플라스미드 정제를 위해 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pDC324-16435-IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 구성체는 IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 융합 폴리펩타이드(서열번호 377)를 암호화하였다.
정제. 단백질 A 세파로스(GE Healthcare)를 사용하는 Fc 영역의 친화도 FPLC 포획 다음에 2가의 양이온이 없는 둘베코 PBS(Invitrogen)로 칼럼 세척하며, 100mM 아세트산, pH 3.5로 단계 용리로 3742 조건 배지의 초기 정제를 행하였다. 단백질 함유 분획을 풀링시키고, 10 N NaOH에 의해 pH 5.0으로 중화시켰으며, 물에 의해 5-배 용적으로 희석시켰다. 0.45㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터(Corning)를 통해 물질을 여과시켰고, 양이온 교환 FPLC에 의해 추가로 정제하였다(SP Sepharose High Performance; GE Healthcare). 100% 완충제 A(50mM 아세트산, pH 5.0)로 평형상태로 만든 칼럼 상에 샘플을 로딩하였고, 30 칼럼 용적에 걸쳐 0 내지 800mM NaCl의 구배로 용리시켰다. 피크 함유 1가 종을 풀링시키고, 10mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.0으로 조제하였다.
분석. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 분석을 2㎍의 단백질과 함께 4-12% 트리스-글라이신 겔(Invitrogen)을 사용하여 3742 풀 상에서 행하였고, QuickBlue(Boston Biologicals)으로 염색하였다. SDS-PAGE에 기반하여, 풀 간에 유의한 차이는 없었다(도 35). 1 ㎖/분에서 이동상으로서 50mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.9를 사용하는 등용매 용리에 의해 Biosep SEC-S3000 칼럼(Phenomenex)을 사용하여 분석학적 SEC를 행하였다(도 36A 내지 도 36D). 모두 4개의 풀은 SEC 데이터를 기반으로 상대적으로 낮은 응집 수준을 나타내었지만; 풀 1은 다른 풀보다 다소 높은 수준을 나타내었다.
최종 3742 샘플은 환원된 중쇄(도 38a 내지 도 38d) 및 경쇄(도 37A 내지 도 37D)의 LS-MS 분석을 특징으로 한다. Waters ACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 Waters MassPREP 마이크로 탈염 칼럼을 통해 생성물을 크로마토그래피하였다. 칼럼을 80℃로 설정하였고, 0.1 % 포름산 중에서 아세토나이트릴 농도를 증가시키는 선형 구배를 사용하여 단백질을 용리시켰다. 질량 분석을 위해 칼럼 용출액을 Waters LCT Premier ESI-TOF 질량 분석기에 보냈다. 포지티브 V 방식으로 기기를 실행시켰다. 모세관 전압을 3,200 V으로 설정하였고, 콘 접압을 80 V로 설정하였다. 800 내지 3000 m/z로부터 질량 스펙트럼을 얻었고, 기기 제조업자에 의해 제공된 MaxEnt1 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션시켰다(deconvolute). 모두 4개의 풀은 기기의 오차 내에서 예상 질량을 얻었고, 이는 모든 풀이 예상 생성물을 생성하였다는 것을 나타낸다(도 37A 내지 도 37D 및 도 38a 내지 도 38d).
전혈 분석. 생체밖 분석을 사용하여 IL-2 및 IFN-γ의 분리 상에서 독소 펩타이드 유사체 Kv1.3 억제제의 영향을 시험하였다. 인간 전혈에서 T 세포 염증을 차단하는 ShK 유사체 및 컨쥬게이트의 효능을 앞서 기재한 생체밖 분석을 사용하여 시험하였다(본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 WO 2008/088422 A2의 실시예 46). 간략하게, 50% 인간 전혈을 탑시가르긴으로 자극하여 저장 고갈, 칼슘 동원(mobilization) 및 사이토카인 분비를 유발하였다. T 세포 사이토카인 분비를 차단하는 것에서 분자 효능을 평가하기 위하여, Kv1.3 차단 펩타이드 및 펩타이드-컨쥬게이트의 다양한 농도를 탑시가르긴 자극의 첨가 전 30분 내지 60분 동안 인간 전혈 샘플과 함께 사전-인큐베이션시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 후, 조건 배지를 수집하였고, 사이토카인 분비 수준을 MesoScale Discovery제의 4-스팟 전기화학발광(electrochemiluminescent) 면역분석을 사용하여 결정하였다. 탑시가르긴 자극을 사용하여, 사이토카인 IL-2 및 IFN-g을 다수 공여체로부터 분리된 혈액으로부터 강하게 분비시켰다. 탑시가르긴 자극 후 인간 전혈에서 생성된 IL-2 및 IFN-g은, 세포내 사이토카인 여색 및 형광-활성화 세포분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석에 의해 나타내는 바와 같이 T 세포를 생성하였다. Kv1.3은 T 세포 상에서 존재하는 주요 전압-개폐 칼슘 통로(voltage-gated potassium channel)이다. K+를 유출시키기 위하여, Kv1.3은 효율적인 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비에 필요한 세포내 칼슘에서 지속된 상승이 필요한 계속적인 Ca2 + 유입을 위한 구동력을 제공한다. Kv1.3 억제제는 TCR 결찰에 의해 유발된 이 칼슘 유입을 억제하는 것으로 더 조기에 나타났다(G.C. Koo et al., 1999, Cell. Immunol. 197, 99-107). 탑시가르긴-유발 저장-고갈 및 TCR 결찰은 분리된 T 세포에서 유사한 패턴의 Ca2 + 동원을 유발하였지만(E. Donnadieu et al., 1991, J. Biol. Chem. 267, 25864-25872), 본 발명자들은 탑시가르긴이 전혈에서 더 강한 반응을 제공한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 생체 분석을 사용하며, 이에 의해 인간 전혈 내 T 세포로부터 탑시가르긴-유발 사이토카인 분비를 차단하는 그것의 능력을 시험함으로써 Kv1.3 억제제의 생체활성을 평가한다. 전혈이 높은 단백질 수준을 함유하는 복합체 유체이기 때문에, 이 전혈 분석에서 펩타이드 및 펩타이드 컨쥬게이트의 활성은 생물학적으로 적절한 유체 중에서 48시간에 걸쳐 분자 안정성을 평가하기에 추가적인 이점을 가진다. 전혈 분석은 전기생리학(ePhys)에 의해 결정된 분자 Kv1.3 효능의 중요한 확인인데, ePhys 분석이 일반적으로 짧은 지속기간(1 내지 2 시간 미만)이며, 단백질을 함유하지 않는 생리 식염수를 사용하기 때문이다. 전혈 분석의 더 긴 지속기간은 짧은 지속 기간의 ePhys 연구에 대해 평형상태 결합 반응속도를 더 효과적으로 결정하게 할 수 있다. 표 7A(이하)에서 알 수 있는 바와 같이, 모두 4개의 풀의 3742-ShK(1-35, Q16K)는 인간 전혈 분석에서 양호한 효능을 나타내며, 이는 분리된 분자가 적절한 3차 구조를 얻었고, 48시간 동안 혈청에서 합리적으로 안정하다는 것을 나타낸다. 표 7B(이하)는 효능이 다른 ShK-컨쥬게이트된 분자와 비슷하다는 것을 나타낸다.
(표 7A)
Figure pct00040
(표 7B)
Figure pct00041
Figure pct00042
실시예 6
Ab 4341- ShK (1-35, Q16K ), 4341- FGF21 및 16435- FGF21 융합 구성체 생성
항체 16435- huFGF21 융합( Ab 10162). 16435-huFGF21 융합의 성분은 하기를 포함한다:
(a) 16435 카파 LC(서열번호 109);
(b) 16435 HC(R118A; 서열번호 112); 및
(c) 16435 IgG2-HC-huFGF21[1-181](서열번호 384):
Figure pct00043
주형으로서 구성체 pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181](서열번호 130)을 사용하여 16435 huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 단편을 만들었으며, 이를BsmBI 및 NotI으로 분해시키고, Qiagen 겔 정제 키트로 정제하였다. 동시에, pTT5-16435 IgG2 HC를 BsmBI 및 NotI으로 분해시켰고, 1% 아가로스 겔 상에서 없앴다. 16435 중쇄 가변 영역을 함유한 벡터 단편을 절단하였고, Qiagen 겔 정제 키트로 정제하였다. 정제한 huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 단편을 16435 중쇄 가변 영역을 함유하는 벡터 단편에 결찰시켰고, DH10b 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아로부터의 DNA를 분리하였고, 시퀀싱을 위해 제출하였다. 몇몇 클로닝 서열 분석은 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위해 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT5-16435-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 구성체는 IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 융합 폴리펩타이드(서열번호 384)를 암호화하였다.
항체 4341- huFGF21 융합( Ab 10163). 4341-ShK[1-35, Q16K] 융합(Ab 10163) 성분은 하기를 포함한다:
(a) 4341 카파 LC(서열번호 115);
(b) 4341 HC(Y125A; 서열번호 118); 및
(c) 4341 IgG2-HC-huFGF21[1-181](서열번호 386):
Figure pct00044
주형으로서 구성체 pTT5-aKLH120.6-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181]를 사용하여 The huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 단편을 만들었으며, 이를 BsmBI 및 NotI으로 분해시키고, Qiagen 겔 정제 키트로 정제하였다. 동시에, pTT5-4341 IgG2 HC를 BsmBI 및 NotI으로 분해시켰고, 1% 아가로스 겔 상에서 없앴다. 4341 중쇄 가변 영역을 함유하는 더 큰 단편을 절단하였고, Qiagen 겔 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 huIgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 단편을 4341 중쇄 가변 영역을 함유하는 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, DH10b 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시키고, 시퀀싱을 위해 제출하였다. 몇몇 클론 서열의 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위해 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT5-4341-IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 구성체는 IgG2-HC-L15-huFGF21[1-181] 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다(서열번호 386).
4341- ShK [1-35, Q16K ] 융합(항체 10164). 4341-ShK[1-35, Q16K] 융합(Ab 10164)의 성분은 하기를 포함한다:
(a) 4341 카파 LC(서열번호 115);
(b) 4341 HC(Y125A; 서열번호 118); 및
(c) 4341 IgG2-HC-ShK[1-35, Q16K](서열번호 388):
Figure pct00045
주형으로서 구성체 pDC324-16435-HC-L10-IgG2-ShK[1-35, Q16K](서열번호 376)를 사용하여 huIgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 단편을 만들었고, 이를 BsmBI 및 NotI으로 분해시키고, Qiagen 겔 정제 키트로 정제하였다. 동시에, pTT5-4341 IgG2 HC를 BsmBI 및 NotI으로 분해시켰고, 1% 아가로스 겔 상에서 없앴다. 4341 중쇄 가변 영역을 함유한 더 큰 단편을 절단하였고, Qiagen 겔 정제 키트에 의해 겔을 정제하였다. 정제한 huIgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 단편을 4341 중쇄 가변 영역을 함유하는 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, DH10b 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, 시퀀싱을 위해 제출하였다. 몇몇 클론 서열의 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위해 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT5-4341-IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 구성체는 IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다(서열번호 388).
실시예 7
Ab 4341- ShK , 4341- FGF21 및 16435- FGF21 융합 발현, 정제 및 분석
다음과 같이 HEK 293-6E 세포에서 일시적 트랜스펙션을 수행하였다. 엡스타인 바르 바이러스 핵 항원-1을 발현시키는 인간 배아 신장 293 세포주(293-6E 세포)를 국립 연구회(캐나다 몬트리올에 소재)로부터 얻었다. 6mM L-글루타민(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen), 1.1% F-68 Pluronic(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 및 250㎍/㎕ 제네티신(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)으로 보충한 F17 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)를 사용하여 세포를 무혈청 현택 배양물로서 유지시켰다. 현탁 세포 배양물을 엘렌마이어 진탕 플라스크 배양물 내에서 유지시켰다. 배양 플라스크를 37℃에서 축축한 5% CO2 분위기로 65 rpm에서 진탕시켰다. 25-kDa 선형 PEI(펜실베니아주 워링턴에 소재한 Polysciences)의 저장액(1㎎/㎖)을 수중에서 제조하였고, 용해될 때까지 HCl에 의해 pH 2.0으로 산성화시켰으며, NaOH로 중화시키고, 멸균여과(0.2㎛)시켰으며, 알리쿼팅하고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 트립톤 N1을 OrganoTechni S.A.(캐나다 퀘벡주에 소재한 TekniScience)로부터 얻었다. 저장액(20%, w/v)을 F17 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogem)로부터 제조하였고, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과시켰으며, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 전형적으로, 1ℓ 규모에서 트랜스펙션을 수행하였다. 세포(293-6E)를 1.1×106 세포/㎖의 생존 세포 밀도로 성장시킨 다음, 트랜스펙션 복합체를 최종 배양물 용적의 1/10 용적으로 제조하였다. 1-ℓ 트랜스펙션 배양물에 대해, 트랜스펙션 복합체를 100 ㎖ F17 기본 배지에서 제조하였고, 500㎍ 플라스미드 DNA(중쇄 및 경쇄 DNA, 1:1 비)를 우선 100 ㎖ F17 배지 내에서 희석시켰다. 실온에서 5-분 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 PEI 용액을 첨가하였다. 복합체를 약하게 교반시킨 다음, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 진탕 플라스크 배양물 내 세포에 트랜스펙션 복합체 혼합물을 첨가함으로써 세포를 트랜스펙션시켰다. 24 시간 트랜스펙션 후, 트립톤 N1을 0.5%의 최종 농도로 트랜스펙션시킨 배양물에 첨가하였고, 트랜스펙션시킨 배양물을 그것들을 채취한 후 다른 5일 동안 37℃에서 습한 5% CO2 분위기로 65 rpm에서 진탕기 상에서 유지시켰다. 조건 배지를 4000 rpm에서 원심분리에 의해 채취한 다음, 0.2㎛ 필터(Corning Inc.)를 통해 멸균여과시켰다.
7℃에서 5 ㎖/분으로 칼럼 상에서 조건 배지를 직접 로딩한 재조합 단백질 A 세파로스(GE Healthcare)를 사용하여 일시적으로 발현된 항체를 정제하였다. 그 다음에 칼럼을 2가 양이온 없이 둘베코 PBS의 10 칼럼 용적으로 세척한 다음, pH 3.5의 100mM 아세트산으로 용리시켰다. 용리시킨 항체를 크로마토그래피 프로파일을 기반으로 풀링시켰고, 2M Tris 염기를 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다. 그 다음에 풀을 0.8/0.22㎛ 실린지 필터를 통해 여과시킨 다음, 10mM 아세트산, 9% 수크로스, pH 5.0에 대해 투석시켰다. 그 다음에 완충제 교환된 항체를 Vivaspin 30 kDa 원심분리 농축기(Sartorius)를 사용하여 농축시켰고, 농축 생성물을 0.22㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과시켰다. 10 ㎕ 조건 배지를 로딩하는 모든 조건 배지를 55분 동안 35 mA/1000V/250W에서(도 39a) 1.0mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE 실행을 사용하여 모의 트랜스펙션을 포함하는 모든 조건 배지를 분석하였다. 모의 트랜스펙션 샘플에서 관찰되지 않은 250 분자량 마커 이상의 밴드가 발현된 생성물일 수 있다. 모두 3회의 실험적 트랜스펙션은 SDS-PAGE 상에서 유의한 양의 예상된 생성물을 나타내었다.
환원성 및 비-환원성 로딩 완충제를 사용하여 1.0-mm 트리스-글라이신 4-20% SDS-PAGE(Novex) 상에서 생성물 품질에 대해 항체 융합을 분석하였다(도 39b). 모든 후보는 비환원성과 환원성 SDS-PAGE에 의해 예상한 바와 같이 전기천공되었지만, 10162 및 10163는 예상한 밴드보다 약간 더 느리게 이동하는 것을 나타내고, 이는 아마도 부분적 글라이코실화를 표시한다. 50mM 인산나트륨, 250mM NaCl, pH 6.8, 1.0 ㎖/분에서 유동된 이동상을 갖는 하나의 크리 배제 칼럼(Phenomenex SEC3000, 7.8×300 mm)을 사용하여 항체를 균질성에 대해 추가로 분석하였다(도 40). 10162 및 10163 융합체를 예상한 바와 같이 용리시켰고, 이는 상대적으로 높은 수준의 고분자량 종을 나타내었지만; 10164 융합은 예상보다 더 일찍 용리되었는데, 이는 아미도 응집을 나타낸다.
LC-MS 분석을 최종 4341-ShK, 4341-FGF21 및 16435-FGF21 샘플의 환원된 경쇄(도 41a 내지 도 41c) 및 중쇄(도 42a 도 42c)로 각각 구성하였다. 기질 대 효소 비가 1 ㎕ 효소에 대해 10㎍ 기질인 것을 제외하고, 제조업자(캘리포니아주 팜 데저트에 소재한 QA Bio, LLC)에 의해 기재된 바와 같이 PNGase F 기법을 사용하는 환원 전 FGF21 융합 샘플을 비글라이코실화시켰다. Agilent 1100 모세관 HPLC 시스템을 사용하여 Zorbax SB300 C8 50x1㎜ 3 마이크론을 통해 생성물을 크로마토그래피하였다. 칼럼을 75℃로 설정하였고, 0.1 % 트라이플루오로아세트산 내 n-프로판올을 증가시키는 구배를 사용하여 단백질을 용리시켰다. 질량 분석을 위해 칼럼 용출액을 Agilent-TOF 질량 분석기에 보냈다. 모세관 전압을 3,200 V로 설정하였고, 단편화기(fragmentor) 전압을 225 V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 800 내지 3000 m/z로부터 얻었고, 기기 제조업자에 의해 제공된 MassHunter 소프트웨어를 사용하여 데콘볼루션시켰다. 모든 샘플은 기기의 오차 내에서 예상한 질량을 소유하였는데, 이는 모든 풀이 예상한 생성물을 함유한다는 것을 나타낸다.
실시예 8
1가 또는 다가 면역글로뷸린 - 및/또는 Fc 도메인-독소 펩타이드 유사체 융합의 발현 및 정제
1가, 2가 및 3가 구조 조합을 발현시켰고, 실시예 5의 표 7B에서 예시하는 바와 같이 본 발명의 대표적인 실시예를 포함하는 비교를 위해 정제하였다. 이들은 항체 IgG2- 또는 IgG1-ShK 융합 변이체(도 1f 내지 도 1l을 참조)를 포함하였다. 예를 들어, 2가 Fc-L10-ShK[1-35], 1가 면역글로뷸린 중쇄-[Lys16]ShK 융합 항체; 도 1f 참조). 또한 비교를 위해 전문이 참조로서 포함된 Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2, 및 특히 그것의 실시예 1, 2 및 56에 기재된 바와 같은 또는 본 명세서에서 변형된 바와 같은 재조합 방법에 의해 IgG2 Fc/Fc-ShK 변이체(도 1a 참조), 2가 Fc-L10-ShK[2-35], 1가 Fc/Fc-L10-ShK[2-35]를 만들었다.
일시적 발현 시스템을 사용하여 독소 펩타이드 유사체-Fc 융합("펩티바디") 또는 다른 면역글로뷸린 융합 실시형태를 만들었다. 37℃, 5% CO2에서 L-글루타민(6mM) 및 제네티신(25㎍/㎖)으로 보충한 F17 배지 내 HEK 293-6E 세포를 3ℓ Fernbach 엘렌마이어 플라스크 내에서 2e5 내지 1.2e6 세포/㎖로 유지하였고, 65 RPM에서 진탕시켰다. 트랜스펙션 시, 90%의 최종 배양물 용적에서 상기 언급한 F17 배지 내 1.1×106 세포/㎖로 세포를 희석시켰다. 10%의 최종 배양물 용적으로 Freestyle293 배지에서 DNA 복합체를 제조하였다. DNA 복합체는 배양물의 리터 당 500㎍의 총 DNA 및 배양물의 리터 당 1.5㎖ PEImax를 포함한다. 일단 성분이 첨가되면, DNA 복합체를 간단하게 진탕시켰고, 실온에서 10 내지 20분 동안 인큐베이션시킨 후 세포 배양물에 첨가하였고, 인큐베이터에 다시 넣었다. 트랜스펙션 다음 날, 트립톤 N1(5g/ℓ)을 액체 20% 저장액으로부터 배양물에 첨가하였다. 트랜스펙션 후 제6일에, 배양물을 4,000 RPM에서 40분 동안 원심분리시켜 세포를 펠렛화하였고, 배양 배지를 0.45㎛ 필터를 통해 채취하였다.
DNA 복합체 제조에서, 플라스미드 비는 의도된 생성물을 만들기 위해 필요한 펩타이드의 원하는 몰비에 비례하였다. IgG2 Fc/Fc-ShK의 성분은 1:1 비에서 IgG2 Fc 및 IgG2 Fc-ShK을 포함한다. 발현 동안, 이들은 IgG2 Fc 호모다이머, IgG2 Fc/Fc-ShK 헤테로다이머 및 IgG2 Fc-ShK 호모다이머에 조립된다. 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IgG2 Fc/Fc-ShK 헤테로다이머(1가 형태)를 분리시켰다.
IgG2 Fc-ShK[2-35]; IgG2 Fc Shk[2-35, Q16K]; IgG2 Fc-Shk[1-35]; IgG2 Fc-ShK[1-35, Q16K] 포유류 발현. Kv1.3 억제제 펩타이드 ShK[2-35] 또는 돌연변이된 ShK[2-35, Q16K]의 모노머에 대해 프레임 내에 융합된 인간 IgG2의 면역글로뷸린 Fc 도메인에 대한 하기 DNA 서열 암호화를 표준 PCR 기법을 사용하여 수행하였다:
Figure pct00046
주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi에서 본래 Fc-2xL-ShK[2-35]를 사용하는 PCR 반응에서 ShK[2-35] 또는 ShK[2-35, Q16K] 및 분자의 10개 아미노산 링커 부분을 만들었다(Sullivan 등의, WO 2008/088422 A2, 그것의 실시예 2, 도 15A-B 참조). 주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi에서 본래 Fc-2xL-ShK[1-35]를 사용하는 PCR 반응에서 ShK[1-35]를 생성하였다(Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2, 그것의 실시예 1, 도 14A-B). 이들 ShK 구성체는 다음의 올리고와 함께 pSelexis-Vh21-hIgG2-Fc 주형으로부터 만들어진 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS// 서열번호 2의 다음의 변형된 VH21 신호 펩타이드 아미노산 서열을 가진다:
5'- CAT GAA TTC CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG -3'(서열번호 3); 및
5'- CA CGG TGG GCA CTC GAC TTT GCG CTC GGA GTG GAC ACC -3'(서열번호 4).
N-말단 링커 연장(아미노산 서열 GGGGSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC// 서열번호 6)을 갖는 야생형 ShK[2-35]를 이하의 DNA 서열에 의해 암호화하였다: GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGAAGCAGCTGCATCGACACCATCCCCAAGAGCCGCTGCACCGCCTTCCAGTGCAAGCACAGCATGAAGTACCGCCTGAGCTTCTGCCGCAAGACCTGCGGCACCTGC// 서열번호 5. 이 암호 서열(서열번호 5)을 함유하는 단편을 이하의 올리고(서열번호 7 및 서열번호 8) 및 주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi에서 본래 Fc-L10-ShK[2-35]를 사용하여 만들었다(참조로서 포함된 Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2, 그것의 실시예 2, 도 15A-B):
5'-GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C-3'(서열번호 7); 및
5'- TCC TCC TCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG -3'//(서열번호 8).
제조업자 설명서에 따라 Stratagene's QuikChange 다수 부위-지정 돌연변이유발 키트 cat# 200531에 의한 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이체 ShK[2-35, Q16K]를 만들었다. 돌연변이유발을 만들기 위하여 사용한 올리고는:
5'-GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC 3'(서열번호 9); 및
5'- GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC -3'(서열번호 10)이고; 주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi 내 본래 Fc-L10-ShK[2-35]를 사용하여(Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2, 그것의 실시예 2, 도 15A-B) 하기 DNA 암호 서열을 초래하며,
Figure pct00047
이는 하기 N-말단 링커 연장에 의해 아미노산 서열 Shk(2-35, K16)를 암호화한다:
ggggsggggsscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtc// 서열번호 12).
주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi 내 본래 Fc-2xL-ShK[1-35](Sullivan 등의 WO 2008/088422 A2, 그것의 실시예 1, 도 14A 내지 도 14B) 및 하기 올리고:
5'-GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C-3'(서열번호 7); 및
5'- TCC TCC TCC TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG -3'(서열번호 8)를 사용하여 ShK[1-35]WT 단편을 만들었다.
하기 올리고:
5'-CCG GGT AAA GGA GGA GGA GGA TCC GGA G-3'(서열번호 13); 및
5'- CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG -3'(서열번호 14), 및 다음의 DNA 암호 서열을 함유하는 단편을 초래하는 pSelexis Vh21-hIgG2-Fc 주형을 사용하여 IgG2Fc 영역을 만들었으며:
Figure pct00048
이는 다음의 아미노산 서열
Figure pct00049
을 암호화한다.
PCR 단편을 만들었고, 생성물을 겔 상에서 없앴다. 겔 정제 후, DNA 단편을 PCR 튜브에서 합하였고, 바깥쪽 프라이머:
5'- CAT GAA TTC CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG -3'(서열번호 3); 및
5'- CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG -3'(서열번호 14)와 함께 봉합하였다.
PCR 생성물을 EcoRI 및 NotI(Roche) 제한효소로 분해시켰고, 아가로스 겔을 겔 정제 키트로 정제하였다. 동시에, pTT14 벡터(CMV 프로모터, 폴리 A 꼬리 및 퓨로마이신 저항성 유전자를 함유하는 Amgen 벡터)를 EcoRI 및 NotI 제한 효소로 분해시켰고, 거대 단편을 겔 정제 키트에 의해 정제하였다. 각각의 정제 PCR 생성물을 거대 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, EcoRI 및 NotI 제한효소 분해를 실시하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위하여 예상한 패턴을 초래하는 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열의 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 각 구성체의 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT14-VH1SP-IgG2-Fc 구성체는 다음의 서열을 갖는 IgG2-Fc-L10-ShK(2-35) 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다:
Figure pct00050
pTT14-VH21SP-IgG2-Fc-L10-ShK(2-35,Q16K) 구성체는 다음의 IgG2-Fc L10-ShK(2-35, Q16K) 융합 폴리펩타이드 서열:
Figure pct00051
을 암호화하였고;
pTT14-VH21SP-IgG2-Fc ShK1-35 구성체는 다음의 서열:
Figure pct00052
을 갖는 IgG2 Fc-L10-ShK(1-35) 융합 폴리펩타이드에 대한 암호 서열을 함유하였다.
pYD16(CMV 프로모터, 폴리 A 꼬리 및 하이그로마이신 저항성 유전자를 함유하는 Amgen 벡터) 내 VH21SP-IgG2-Fc-유일 구성체를 만드는 것은 다음과 같이 일어난다: VH21 신호 펩타이드를 다음의 올리고:
5'-CAT AAG CTT CCC ACC ATG GAA TGG AGC TGG-3'(서열번호 20); 및
5'- CA CGG TGG GCA CTC GAC TTT GCG CTC GGA GTG GAC ACC -3'(서열번호 4)를 사용하고, 상기 주목한 바와 같은 pSelexis 주형을 사용하여 만들었다.
상기 기재한 pSelexis 주형 및 다음의 올리고:
5'-GTC CAC TCC GAG CGC AAA GTC GAG TGC CCA CCG TGC C-3'(서열번호 7); 및
5'- CAT GGA TCC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G -3'(서열번호 21)를 사용하여 Fc 영역을 만들었다.
PCR 단편을 겔 정제하였고, 바깥쪽 프라이머 GGT TGA GAG GTG CCA GAT GTC AGG GCT GCA GCA GCG GC// 서열번호 391 및 CAG CTG CAC CTG ACC ACC ACC TCC ACC GCT ATG CTG AGC GCG// 서열번호 392을 사용하는 단일 PCR 반응에서 함께 봉합하였다. 얻어진 PCR 단편을 겔 정제하였고, HindIII 및 BamHI에 의해 분해하였다. 동시에, pYD16 벡터(CMV 프로모터, 폴리 A 꼬리 및 하이그로마이신 저항성 유전자를 함유하는 Amgen 벡터)를 또한 HindIII 및 BamHI에 의해 절단하였고, 거대 벡터 단편을 Qiagen's 겔 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 거대 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, HindIII 및 BamHI 제한효소 분해를 실시하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위하여 예상한 형태를 초래하는 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pYD16-VH21SP-IgG2-Fc 구성체는 인간 IgG2-Fc(상기 서열번호 1)를 암호화하였다.
IgG2 - Fc ShK [1-35, Q16K ] 포유류 발현. DNA pTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 구성체를 사용하여, 하기 DNA 암호 서열
Figure pct00053
을 함유하는 단편을
BamHI/BamHI으로 절단하였다. 이 암호 서열(서열번호 23)은 N-말단 링커 서열: GSGGGGSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC// (서열번호 23)을 갖는 ShK(1-35, Q16K)를 암호화한다.
동시에, pTT14-hIgG2-Fc-ShK[1-35]WT 구성체를 또한 BamHI/BamHI에 의해 분해함으로써, Shk[1-35] 암호 영역을 제거하여 하기 암호 서열을 수득하였고,
이는 아미노산 서열
Figure pct00055
을 암호화한다.
제거된 ShK를 갖는 pTT14-hIgG2-Fc 벡터를 송앙지 장 포스파타제(CIP)로 처리하여 5' 포스페이트 기를 제거하였고, 페놀/클로로포름으로 추출하여 그 자체에서 벡터의 재결찰을 방지하였다. 삽입 ShK[1-35, Q16K] 단편을 그것의 벡터로부터 겔 정제시켰고, Qiagen 겔 정제 키트로 정화시켰다. 정제한 삽입물을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시키고, BamHI 제한효소 분해를 실시해였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위하여 예상한 형태를 초래하는 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT14-IgG2-Fc-ShK[1-35, Q16K] 구성체는 다음의 IgG2 Fc-L10-ShK(1-35, Q16K) 융합 단백질 서열:
Figure pct00056
을 암호화하였다.
IgG2 Fc-L10-ShK(1-35)에 대한 아미노산 서열은:
Figure pct00057
이다.
원하는 aKLH IgG2/Fc-ShK 생성물은 바로 위의 각 성분 (a) 내지 (c)의 각각의 하나의 복제물을 함유하였고, 도 1E에서 구성한다. 이 때문에, 비는 1:1:1이었다. 이 생성물을 절반 항체 및 절반 Fc 융합("헤미바디")로서 기재하며, Fc 도메인에서 함께 결합된다. 배양물로부터 제거된 추가적인 펩타이드 조립체는 aKLH Ab 및 Fc-ShK 호모다이머였다.
주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi 내 본래 Fc-L10-ShK[1-35](Sullivan 등의 발명의 명칭: Toxin Peptide Therapeutic Agents, WO 2008/088422로서 공개된 PCT/US2007/022831의 실시예 1, 도 14A-14B에 기재, 이는 본 명세서에서 전문이 참조로서 포함됨) 및 하기 올리고:
5'-TCC CTG TCT CCG GGT GGA GGA GGA GGA TCC GGA G-3'(서열번호 47); 및 5'- CAT GCG GCC GCT CAT TAG CAG GTG -3'(서열번호 14)를 사용하여 ShK[1-35]WT 단편을 만들었다.
PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에 부었다. 아가로스 플러그에 대해 밴드를 펀칭하였고, 플러그를 신선한 PCR 반응 튜브에 넣었다. 그 다음에 바깥의 프라이머 서열번호 357 및 서열번호 330 을 사용하여 PCR에 의해 아가로스 플러그를 증폭시켰다. 그 다음에 PCR 생성물을 XbaI 및 NotI에 의해 분해시켰고, PCR 정화 키트(Qiagen)를 정제하였다. 동시에, pTT5 벡터(CMV 프로모터 및 폴리 A 꼬리를 함유하는 Amgen 벡터)를 XbaI 및 NotI에 의해 절단하였다. pTT5 벡터를 1% 아가로스 겔 상에서 없앴고, 더 큰 단편을 절단하였으며, 겔을 Qiagen's 겔 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, XbaI 및 NotI 제한효소 분해를 실시하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위하여 예상한 형태를 초래한 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 pTT5-aKLH 120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35] 구성체는 하기 아미노산 서열:
Figure pct00058
을 갖는 IgG2-HC-L10-ShK[1-35] 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다.
이 구성체의 ShK[1-35, Q16K] 돌연변이체 형태를 만들기 위하여, 제조업자의 설명서에 따라 Stratagene Quikchange 다수 부위 지정 돌연변이유발 키트(Cat#200531) 및 하기 올리고:
5'-GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC 3'(서열번호 9); 및
5'- GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC -3'(서열번호 10)를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발을 수행하였다. 최종 구성체 pTT5-aKLH120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K]는 다음의 아미노산 서열:
Figure pct00059
을 갖는 IgG2-HC-L10-ShK[1-35, Q16K] 융합 폴리펩타이드를 암호화한다.
aKLH - IgG2 중쇄 - L10 - ShK [2-35, Q16K ] 포유류 발현. 벡터로서 DNA 구성체 pTT5-aKLH 120.6-VK1SP-IgG2-HC-L10-ShK[1-35]를 사용하여, ShK[1-35]를 BamHI/BamHI에 의해 절단하였다. ShK[1-35]이 없는 pTT5-aKLH 120.6-VK1SP-IgG2-HC로부터의 벡터 단편은 하기 암호 서열:
Figure pct00060
을 함유하였고,
이는 하기 아미노산 서열
Figure pct00061
을 암호화한다.
그 다음에 벡터 단편을 송아지 장 포스파타제(CIP)로 처리하여 5' 포스페이트 기를 제거하였고, 페놀/클로로포름으로 추출하여 그 자체에 벡터의 재결찰을 방지하였다. 삽입물은 IgG2 Fc-L10-ShK(2-35, Q16K)를 암호화하는 pTT14-VH21SP-IgG2-Fc-ShK[2-35, Q16K]으로부터 나오며:
Figure pct00062
,
삽입물을 또한 BamHI/BamHI을 사용하여 분해시켰다. 삽입물 ShK[2-35, Q16K] 단편은 그것의 벡터로부터 정제한 겔이었고, Qiagen 겔 정제 키트로 정화하였다. 하기 암호 서열
Figure pct00063
을 함유하며,
아미노산 서열 GSGGGGSSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC(서열번호 53)을 암호화하는 정제된 DNA 삽입물을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, BamHI 제한효소 분해를 실시하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위해 예상한 형태를 초래하는 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 단지 하나의 클론을 선택하였다. 최종 구성체 pTT5-aKLH-IgG2 HC-L10-ShK[2-35,Q16K]는 IgG2 HC-L10-ShK[2-35,Q16K] 융합 폴리펩타이드:
Figure pct00064
를 암호화하였다.
VH21SP -N-말단 ShK [1-35] 야생형- IgG1 - Fc 포유류 발현. 인간 IgG1의 N-말단 Fc 영역에 대해 프레임에 융합된 Kv1.3 억제제 펩타이드 ShK[1-35]의 모노머에 대한 DNA 서열 암호화를 이하에 기재하는 바와 같이 구성하였다.
VH21 SP-ShK(1-35)-L10-IgG1 Fc 발현 벡터의 구성을 위하여, PCR 전략을 사용하여 HindIII 및 BamHI 제한 부위 옆에 있는 4개의 글라이신 및 하나의 세린 아미노산에 연결된 VH21 단일 펩타이드 ShK(1-35) 유전자를 만들었고, BamHI 및 NotI 제한 부위 옆에 있는 IgG1 Fc 단편에 연결된 4개의 글라이신 및 하나의 세린 아미노산을 주형으로서 Fc-L10-OSK1in pcDNA3.1(+)CMVi를 사용하여 PCR 반응에서 만들었다(본 명세서에 참조로서 포함된 Sullivan 등의 WO 2008/088422A2의 실시예 41 및 도 42a 내지 도 42b에 기재됨).
VH21 SP-ShK(1-35)-G4S를 만들기 위하여, 95℃-30초, 55℃-30초, 75℃-45초에서 35주기 동안 PfuTurbo HotStart DNA 중합효소(Stratagene)에 의한 PCR 반응에서 이하에 도시하는 바와 같은 서열을 갖는 2개의 올리고를 사용하였고; HindIII(aagctt) 및 BamHI(ggatcc) 제한 부위는 밑줄 표시한다:
전방 프라이머:
Figure pct00065
; 및
후방 프라이머:
Figure pct00066
.
얻어진 PCR 생성물 2% 아가로스 겔 상에서 202bp 밴드로서 분해하였다. 202bp PCR 생성물을 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 다음, HindIII 및 BamHI(Roche) 제한효소로 분해하였고, 아가로스 겔을 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 정제하였다.
G4S-IgG1 Fc를 만들기 위하여, 이하에 도시하는 바와 같은 서열을 갖는 2개의 올리고를 30주기 동안 95℃-30초, 55℃-30초, 75℃-1분에 PfuTurbo HotStart DNA 폴리머라제(Stratagene)에 의한 PCR 반응에서 사용하였고; BamHI(ggatcc) 및 NotI(gcggccgc) 제한 부위는 밑줄 표시한다:
전방 프라이머:
Figure pct00067
; 및
후방 프라이머:
Figure pct00068
.
얻어진 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 721-bp 밴드로서 분해하였다. 721-bp PCR 생성물을 PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 다음, BamHI 및 NotI(Roche) 제한효소로 분해하였고, 아가로스 겔을 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 정제하였다.
pcDNA3.1(+)CMVi-Fc-L10-OSK1 벡터를 BamHI 및 NotI 제한효소로 분해하였고, 거대 단편을 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 겔 정제된 4GS-IgG1 Fc 단편을 정제된 거대 단편에 결찰시켰고, One Shot(등록상표) Top10(Invitrogen)으로 형질전환하여 pCMVi-Fc-L10-IgG1 Fc 벡터를 만들었다. 후속하여, pCMVi-Fc-L10-IgG1 Fc 벡터를 HindIII 및 BamHI 제한효소로 분해하였고, 거대 단편을 겔 추출 키트에 의해 정제하였다. 겔 정제된 VH21 SP-ShK(1-35)-4GS 단편을 정제된 거대 단편에 결찰시켰고, One Shot(등록상표) Top10(Invitrogen)으로 형질전환시켜, pCMVi-VH21 SP-ShK(1-35)-L10-IgG1 Fc 구성체를 초래하였다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시켰고, BamHI 및 NotI 제한효소로 분해하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해시켰다. 시퀀싱을 위하여 예상한 형태를 초래한 DNA를 제출하였다. 몇몇 클론 서열 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위하여 단지 하나의 클론을 선택하였다. pCMVi 벡터 내 VH21 SP-ShK(1-35)-L10-IgG1 Fc로부터의 DNA를 재시퀀싱하여 Fc 및 링커 영역을 확인하였고, 서열은 상기 서열과 100% 동일하였다. 단편 VH21 SP-ShK(1-35)-L10-IgG1 Fc는 하기 암호 서열
Figure pct00069
을 함유하였고,
이는 VH21 SP-ShK(1-35)-L10-IgG1 Fc 아미노산 서열
Figure pct00070
을 암호화한다.
N-말단 ShK [1-35, Q16K ]- aKLH HC ; 및 N-말단 ShK [1-35 Q16K ]- aKLH LC 의 포유류 발현. N-말단 ShK[1-35]야생형-L10-IgG1-Fc를 암호화하는 구성체를 사용하여, 아듬의 올리고에 의한 부위 지정 돌연변이유발을 수행하여서 ShK 영역 내 Q16K 돌연변이를 생성하였다:
5'-GCT GCA CCG CCT TCA AGT GCA AGC ACA GC-3'// (서열번호 9); 및
5'-GCT GTG CTT GCA CTT GAA GGC GGT GCA GC-3'(서열번호 10).
Stratagene QuikChange 다수 부위 지정 돌연변이유발 키트를 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다. pCMVi-N-말단-ShK[1-35Q16K]-L10-IgG1-Fc에 대한 최종 구성체는 다음의 신호 펩타이드(VH21 SP)-ShK[1-35, Q16K]-L10-IgG1-Fc 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다:
Figure pct00071
.
N-말단 ShK[1-35, Q16K]-aKLH HC 구성체를 만들기 위하여,
다음의 올리고:
5'-CAT TCT AGA CCA CCA TGG AAT GG-3'(서열번호 62);
5'-CAG CTG CAC CTG GCT TCC TCC TCC TCC GG-3'(서열번호 63);
및 주형 pCMVi-N-말단-ShK[1-35, Q16K]-L10-IgG1-Fc를 사용하여 신호 펩타이드-ShK[1-35Q16K]-L10 링커를 함유하는 PCR 생성물을 생성하였고,
암호 서열
Figure pct00072
을 함유하는 단편을 초래하였으며, 이는
VH21 SP-ShK(1-35, Q16K)-L10 아미노산 서열 MEWSWVFLFFLSVTTGVHSRSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTCGGGGSGGGGS//(서열번호 65)를 암호화한다
aKLH-HC 단편을 만들기 위하여, 하기 올리고:
5'-GGA GGA GGA AGC CAG GTG CAG CTG GTG CAG-3'(서열번호 66);
5'-CAT GCG GCC GCT CAT TTA CCC-3'(서열번호 67);
및 주형 pTT5-aKLH 120.6-HC을 사용하여 PCR 생성물을 만들었고, 이는 하기 암호 서열
Figure pct00073
을 함유하는 DNA 단편을 야기하였으며,
하기 아미노산 서열
Figure pct00074
을 암호화한다.
2개의 PCR 생성물을 겔 상에서 실행하였고, 적절한 크기의 밴드를 아가로스 플러그에 대해 펀칭하였다. 아가로스 플러그를 단일 새로운 PCR 반응에 넣었고, 단편을 바깥쪽 가장 바깥쪽 프라이머(서열번호 62) 및 (서열번호 67)을 사용하여 함께 봉합하였다. PCR 단편을 XbaI 및 NotI을 사용하여 절단하였고, PCR 정화 키트로 정화시켰다. 동시에, pTT5 벡터를 또한 XbaI 및 NotI에 의해 절단하였고, 겔을 정제하였다. 정제된 삽입물을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시키고, XbaI 및 NotI 제한효소 분해를 실시하였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 예상한 형태를 초래하는 DNA를 시퀀싱을 위해 제출하였다. 몇몇 클론 서열의 분석이 상기 서열과 100% 매치를 얻었지만, 대규모 플라스미드 정제를 위해 단지 하나의 클론이 선택되었다. 최종 구성체 pTT5-N-말단 ShK[1-35Q16K]-L10-aKLH120.6-HC는 VH21 SP-ShK[1-35, Q16K]-L10-aKLH120.6-HC 융합 폴리펩타이드를 암호화하였다:
Figure pct00075
.
마지막으로, N-말단-ShK[1-35, Q16K]-L10-aKLH120.6 경쇄(LC)를 상기와 동일한 방법으로 만들었다. 신호 펩타이드-ShK[1-35, Q16K]-L10을 함유하는 PCR 생성물을 올리고:
5'-CAT TCT AGA CCA CCA TGG AAT GG-3'(서열번호 62); 및
5'- CAT CTG GAT GTC GCT TCC TCC TCC TCC GG -3'(서열번호 71);
및 주형 pCMVi-N-말단-ShK[1-35Q16K]-L10-IgG1-Fc을 사용하여 만들었고, 이는 암호 서열
Figure pct00076
를 함유하는 DNA 단편을 초래하였으며,
신호 펩타이드 (VH21 SP)-ShK(1-35, Q16K)-L10 링커에 대한 아미노산 서열을 암호화한다:
mewswvflfflsvttgvhsrscidtipksrctafkckhsmkyrlsfcrktcgtcggggsggggs// (서열번호 65).
주형 및 올리고
5'-GGA GGA GGA AGC GAC ATC CAG ATG ACC CAG TC-3'(서열번호 72); 및
5'- CAT CTC GAG CGG CCG CTC AAC -3'(서열번호 73)를 사용한다.
하기 암호 서열을 함유하는 얻어진 클로닝된 PCR 단편을 만들었으며:
Figure pct00077
, 이는 N-말단 신호 펩타이드를 갖는 N-말단 VH21 SP-ShK[1-35, Q16K]-L10-aKLH120.6 경쇄(LC)에 대한 아미노산 서열을 암호화한다:
Figure pct00078
.
PCR 단편 둘 다(암호 서열(서열번호 64)을 함유하는 DNA 단편 및 암호 서열(서열번호 74)을 함유하는 aKLH 120.6 경쇄 LC 단편)를 겔 상에서 없앴고, 적절한 크기의 밴드를 아가로스 플러그에 대해 펀칭하였다. 아가로스 플러그를 단일 새로운 PCR 반응에 위치시켰고, 단편을 가장 바깥쪽 프라이머(서열번호 62) 및 (서열번호 73)를 사용하여 봉합하였다. XbaI 및 NotI을 사용하여 얻어진 PCR 단편을 절단하였고, Qiagen PCR 정화 키트로 정화시켰다.
동시에, pTT14 벡터(CMV 프로모터, 폴리 A 꼬리 및 퓨로마이신 저항성 유전자를 함유하는 Amgen 벡터)를 또한 XbaI 및 NotI로 절단하였고, 겔을 정제하였다. 정제한 삽입물을 거대 벡터 단편에 결찰시켰고, OneShot Top10 박테리아로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 박테리아 콜로니로부터의 DNA를 분리시키고, BamHI 제한효소 분해를 실시해였으며, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 시퀀싱을 위하여 예상한 형태를 초래하는 DNA를 제출하였다. 신호 펩타이드-ShK[1-35, Q16K]-L10- aKLH120.6-LC 융합 폴리펩타이드 서열(즉, 서열번호 75)을 암호화하는 최종 구성체 pTT14-N-말단 ShK[1-35Q16K]-L10-aKLH120.6-LC.
실시예 9
컴퓨터 분자의 정제 및 평가: 1가의 Fc / Fc - L10 - ShK [2-35] 헤테로다이머 및 1가 또는 2가의 Fc / Fc -ShK(1-35 Q16K )( IgG2 ) 헤테로다이머 및 다른 폴리펩타이드 분자
1가 또는 2가의 Fc-L10-ShK[2-35], 1가 또는 2가의 Fc-L10-ShK[1-35], 1가 또는 2가의 Fc-L10-ShK(1-35, Q16K), 및 다른 ShK-관련 폴리펩타이드 분자, 표 7B(본 명세서의 실시예 5)에 열거한 분자를 본 명세서에 기재된 방법에 의해 발현시켰고, 분리하였으며 정제하였다. 표 7B의 페길화되고 비페길화된 독소 펩타이드를 다음과 같이 합성으로 제조하였다:
펩타이드 합성. Nα-Fmoc, 측쇄 보호된 아미노산 및 H-Cys(Trt)-2Cl-Trt 수지를 Novabiochem, Bachem 또는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 다음의 측쇄 보호 전략을 사용하였다: Asp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Nε-Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu) 및 Tyr(OtBu). ShK(RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC// 서열번호 378), [Lys16]ShK(RSCIDTIPKSRCTAFKCKHSMKYRLSFCRKTCGTC// 서열번호 76) 또는 다른 독소 펩타이드 유사체 아미노산 서열을 H-Cys(Trt)-2Cl-Trt 수지(0.2 m㏖, 0.32 m㏖/g 로딩)를 사용하는 0.2 m㏖ 당량 규모로 DIC/HOBt 커플링 화학을 사용하는 SPPS에 의해 CS Bio 펩타이드 신시사이저 상에서 단계적 방식으로 합성하였다. 각 커플링 주기에 대해, 1m㏖ Nα-Fmoc-아미노산을 N,N-다이메틸포름아마이드(DMF) 중의 2.5 ㎖의 0.4M 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt)에서 용해시켰다. 용액에 DMF 중의 1.0 ㎖의 1.0M N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드(DIC)를 첨가하였다. 용액을 15분 동안 질소 버블링과 함께 교반시켜 사전 활성화를 수행한 다음, 수지에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 진탕시켰다. 수지를 여과하였고, DMF로 3회, 다이클로로메탄(DCM)으로 2회, DMF로 3회 세척하였다. DMF(5㎖, 2 × 15 분) 중에서 20% 피페리딘으로 처리에 의해 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 상기 기재한 Fmoc-아미노산 커플링 및 Fmoc 제거 단계의 반복을 통해 처음 23개 잔기를 단일 커플링시켰다. Fmoc-제거로 진행하기 전 커플링 단계를 2회 수행함으로써 남아있는 잔기를 이중 커플링시켰다.
합성 후, 그 다음에 수지를 탈수시켰고, DCM, DMF, DCM로 순차적으로 세척한 다음 진공에서 건조시켰다. 펩타이드-수지를 250-㎖ 플라스틱 둥근 바닥 플라스크에 옮겼다. 펩타이드를 탈보호하였고, 트라이아이소프로필실란(1.5㎖), 3,6-다이옥사-1,8-옥탄-다이티올(DODT, 1.5㎖), 물(1.5㎖), 트라이플루오로아세트산(TFA, 20㎖) 및 교반 바로 처리에 의해 수지로부터 방출시켰고, 혼합물을 3시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 150-㎖ 신터드 유리 깔때기를 통해 250-㎖ 플라스틱 둥근 바닥 플라스크 내로 여과시켰다. 혼합물을 250-㎖ 플라스틱 둥근 바닥 플라스크 내로 150-㎖ 신터드 유리 깔때기를 통해 여과시켰고, 여액을 진공에서 농축시켰다. 조질의 펩타이드를 차가운 다이에틸 에터의 첨가로 침전시켰고, 원심분리에 의해 수집하였으며, 진공 하에 건조시켰다.
펩타이드 폴딩. 건조시킨 조질의 선형 펩타이드(약 600㎎), 예를 들어 [Lys16]ShK 펩타이드(서열번호 76) 또는 [Lys16]ShK-Ala(또한 [Lys16, Ala36]-ShK; 서열번호 379로서 알려짐) 펩타이드를 16 ㎖ 아세트산, 64 ㎖ 물, 및 40 ㎖ 아세토나이트릴 중에 용해시켰다. 혼합물을 15분 동안 완전하게 용해될 때까지 빠르게 교반하였다. 펩타이드 용액을 1700 ㎖의 물 및 큰 교반 바를 함유한 2-ℓ 플라스틱 보틀에 첨가하였다. 이렇게 희석시킨 용액에 20 ㎖의 진한 수산화나트륨을 첨가하여 용액의 pH를 9.5로 상승시켰다. 필요하다면 소량의 아세트산 또는 NH4OH로 pH를 조절하였다. 용액을 80 rpm 밤새 교반시켰고, LC-MS로 모니터링하였다. 폴딩은 보통 24 내지 48시간에 완료된 것으로 판단하였고, 아세트산 및 TFA(pH = 2.5)의 첨가에 의해 용액을 퀀칭시켰다. 수용액을 여과시켰다(0.45㎛ 셀룰로스막).
역상 HPLC 정제. 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 분석(C18, 5㎛, 0.46㎝ × 25㎝) 또는 분취(C18, 10㎛, 2.2㎝ × 25㎝) 칼럼 상에서 수행하였다. 전형적으로 분석적 분석 동안 1 ㎖/분의 유속으로 35분에 걸쳐 5 내지 95% 및 분취 분리 동안 20 ㎖/분에서 90분에 걸쳐 5-65%으로 완충제 A 중의 완충제 B(A = 0.1% 수성 TFA; B = 0.09% TFA를 함유하는 90% 수성 ACN)의 선형 구배를 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 분석적 및 분취 HPLC 분획은 ESMS 및 광 다이오드 어레이(PDA) HPLC를 특징으로 하였고, 합하고, 동결건조시켰다.
질량 분석법. 이온분무 기압 이온화 공급원을 구비한 단일 사중극 질량 분석기 상에서 질량 스펙트럼을 획득하였다. 융합된 실리카 모세관 계면(50㎛ i.d.)을 통해 이온화 공급원에 직접 커플링된 이동 용매(10㎕/분; 0.05% TFA를 함유하는 30:50:20 ACN/MeOH)에 샘플(25㎕)을 주입하였다. 5 kV의 양전위에서 샘플 방울을 이온화시켰고, 계면 플레이트를 통한 다음 후속하여 60 V의 퍼텐셜에서 오리피스(orifice)(100-120㎛ 직경)를 통해 분석기에 유입시켰다. 0.1 Da의 스캔 단계 크기로 질량 범위 400 내지 2200 Da에 걸쳐 전체 스캔 질량 스펙트럼을 획득하였다. 획득한 m/z 값으로부터 분자량을 얻었다.
페길화 , 정제 및 분석. 펩타이드, 예를 들어, [Lys16]ShK(서열번호 76) 또는 [Lys16]ShK-Ala(서열번호 379)을 활성화된 선형 또는 분지된 PEG를 사용하여 그것의 N-말단에서 환원적 알킬화에 의해 선택적으로 페길화시켰다. 20mM 시아노보로하이드라이드 나트륨 및 2몰 과량의 20 kDa 모노메톡시-PEG-알데하이드(NOF, 일본)을 함유하는 50mM NaH2PO4, pH 4.5 반응 완충제 중의 2㎎/㎖에서 컨쥬게이션을 수행하였다. 컨쥬게이션 반응물을 대략 5시간 동안 실온에서 교반시켰고, RP-HPLC에 의해 그것의 진행을 모니터링하였다. 20mM NaOAc, pH 4로 4-배 희석에 의해 완료된 반응을 퀀칭시키고, 4℃로 냉각시켰다. 그 다음에 20mM NaOAc, pH 4.0 중의 선형 0-1M NaCl 구배로 용리시킨 SP 세파로스 HP 칼럼(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 GE Healthcare)을 사용하여 PEG-펩타이드를 40℃에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용리시킨 피크 분획을 SDS-PAGE 및 RP-HPLC에 의해 분석하였고, 97% 초과로써 풀링을 결정하였다. 관찰한 주요 오염물은 다이-페길화된 독소 펩타이드 유사체였다. 선택한 풀링을 3 kDa MWCO 막에 대해 원심분리 여과에 의해 2-5㎎/㎖로 농축시켰고, 5% 솔비톨에 의해 10mM NaOAc, pH 4로 투석시켰다. 그 다음에 투석시킨 풀을 0.2 마이크론 필터를 통해 여과시키고, SDS-PAGE에 의해 97% 초과가 되도록 순도를 결정하였다(데이터 미제시). 1 ㎖/분에 0.1% TFA/H2O 중에서 Zorbax(등록상표) 5㎛ 300SB-C8 4.6×50㎜ 칼럼(Agilent)을 실행하는 Agilent 1100 모델 HPLC상에서 역상 HPLC를 수행하였고, 칼럼 온도를 40℃에서 유지하였다. PEG-펩타이드(20㎍)의 샘플을 주입하였고, 선형 6-60% 구배로 용리시킨 한편 파장 215㎚에서 모니터링하였다.
융합 단백질. 일반적으로, 도 1A 및 도 1B는 각각 1가 및 2가의 Fc-독소 펩타이드(또는 독소 펩타이드 유사체) 융합 단백질(또는 "펩티바디")의 개략적 표현을 나타낸다. 2가 Fc-ShK 분자는 2개의 Fc-ShK 쇄를 함유하는 호모다이머이다. 1가의 Fc-ShK 독소 펩타이드(또는 독소 펩타이드 유사체) 분자는 하나의 Fc 쇄 및 하나의 Fc-ShK(또는 유사체) 쇄를 함유하는 헤테로다이머이다. 1가의 Fc-ShK 분자가 다이머마다 딱 하나의 ShK 펩타이드를 함유하기 때문에, 이는 1가로 고려된다. 구성체 또는 쇄는 Fc-(독소 펩타이드 유사체)로서 지칭되며, N-말단 Fc 영역 및 독소 펩타이드 또는 독소 펩타이드 유사체에 공유적으로 부착된 선택적 가용성 링커 서열(예를 들어, L10 펩티딜 링커 GGGGSGGGGS; 서열번호 153)을 함유하므로, N- 내지 C-말단으로부터의 배향은 Fc-링커-독소 펩타이드 또는 독소 펩타이드 유사체이다.
Sullivan 등의 WO 2008/088422A2의 실시예 1 및 2에서, 2가 Fc-ShK 펩티바디, Fc-L10-ShK(1-35) 및 포유류 세포로부터 발현된 Fc-L10-ShK(2-35)를 기재하였다. WO 2008/088422A2의 실시예 1에서, 발현 동안 작은 부산물로서 형성된 1가 Fc-L10-ShK(1-35) 분자의 분리가 또한 기재되었다. 1가 항체 #3742-ShK(1-35, Q16K) 컨쥬게이트는 인간 전혈에서 T 세포 사이토카인 분비의 강력한 차단을 제공하였다(본 명세서의 실시예 5에서 표 7A-B 참조).
실시예 10
래트 및 사이노몰구스 원숭이에서 약력학적 ( PK ) 연구.
래트 PK. 옆 꼬리 정맥으로부터 투약 후 0, 0.25, 1, 4, 24, 48, 72, 168, 336, 504, 672, 840 및 1008 시간에 피하에 5㎎/㎏을 주사하고 Microtainer(등록상표) 혈청 세퍼레이터 튜브 내로 대략 250㎕의 혈액을 수집함으로써 성체 스프레그-돌리(SD) 래트(그룹 당 n=3)에서 16435 및 4341 항체의 약력학적 프로파일을 결정하였다. 각 샘플을 수집 후 및 30분 내지 40분 응고 기간 후 실온에서 유지시켰고, 샘플을 캘리브레이션시킨 에펜도르프 5417R 원심분리 시스템(뉴욕주 웨스터버리에 소재한 Brinkmann Instruments, Inc.) 2 내지 8℃에 11,500 rpm에서 약 10분 동안 원심분리시켰다. 그 다음에 수집한 혈청을 사전 표지한(각 래트에 대해) 극저온 저장 튜브에 옮겼고, 장래의 분석을 위해 -60℃ 내지 -80℃에서 저장하였다. PK 연구 샘플로부터 혈청 샘플 농도를 측정하기 위하여 다음의 방법을 사용하였다: ½ 면적 흑판(Corning 3694)을 PBS 중에서 2㎍/㎖의 항-hu Fc, 항체 1.35.1로 코팅한 다음 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음에 플레이트를 세척하였고, 4℃에서 밤새 I-Block(상표명)(Applied Biosystems)으로 차단하였다. 샘플을 희석시킬 필요가 있다면, 그것들은 래트 SD 대조군 혈청에서 희석시켰다. 표준 및 샘플을 1X PBS + 1M NaCl + 0.5% Tween 20 및 1% BSA의 1:20으로 희석시켰다. 플레이트를 세척하였고, 50-㎕ 샘플의 희석 표준 및 샘플을 항체 1.35.1 코팅 플레이트에 옮겼으며, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 다음, I-Block(상표명) +5% BSA 중에서 50㎕로 100ng/㎖의 항-hu Fc 항체 21.1-HRP 컨쥬게이트를 첨가하였고, 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 다음, 이 플레이트를 광도계로 바로 분석한 후, 50㎕의 Pico 기질을 첨가하였다. WinNonLin(등록상표)(Enterprise version 5.1.1, 2006, 캘리포니아주 마운틴뷰에 소재한 Pharsight(등록상표) Corp.)(도 34.0)에 의한 비-구획 방법을 사용하여 시간 농도 데이터를 분석하였다. 스프레그-돌리 래트 내 이들 2개 항체의 약동학적 프로파일을 도 43에 나타낸다. SD 래트 내 16435 및 4341 항체의 PK 변수를 표 8(이하)에 요약한다. 분자는 둘 다 10일 이상의 반감기를 갖는 래트에서 양호한 PK 프로파일을 가진다.
Figure pct00079
사이노몰구스 PK. 제0일에 1㎎/㎏ 및 제57일에 5㎎/㎏의 2회 후속적 피하 용량을 주사함으로써 사이노몰구스 원숭이(그룹 당 n=2) 16435 및 4341 항체의 약력학적 프로파일을 또한 결정하였다. 1㎎/㎏에서 1번째 투약 후 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344(제2 투약 전) 시간 및 5㎎/㎏에서 2번째 투약 후 및 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 360, 384, 432, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344 시간에 혈청 혈액을 수집하였다. 상기 기재한 항-IgG 샌드위치 ELISA를 사용함으로써 16435 및 4341 항체 수준에 대해 샘플을 분석하였다. WinNonLin(등록상표)에 의한 비-구획 방법을 사용하여 시간 농도 데이터를 분석하였다. 사이노몰구스 원숭이에서 이들 2가지 항체의 약동학적 프로파일을 도 44에 나타낸다. 사이노몰구스 원숭이에서 16435 및 4341의 PK 변수를 표 9(이하)에 요약한다. 두 분자는 모두 각각 16435 및 4341에 대해 약 12일 및 21일의 반감기로 사이노몰구스 원숭이에서 양호한 PK 프로파일을 나타내었다. 4341 항체는 16435보다 더 양호한 PK 특성을 가지고, FcRn 결합을 기반으로 원숭이에서 임의의 표적 매개 약물 성향(target mediated drug disposition, TMDD) 청소율 메커니즘이 없는 정상 hu IgG 청소율를 가진다. 추가로, 도 44의 결과는 사이노몰구스 원숭이에서 다회 용량 조치, 항체 16435 및 4341이 사노몰구스 원숭이에서 면역 반응에 의해 매개된 청소율의 유의한 변화 징후가 없다는 것을 나타낸다. 비정상 항체 청소율를 야기하는 유의한 면역 반응이 있었다면, 제1 투약에 의한 면역 반응 프라이밍에 기인하여 제2 투약 후에 예상되었다.
Figure pct00080
약어
본 명세서를 통해 사용한 약어는 구체적 상황에서 달리 정의되지 않는다면, 이하에 정의되는 바와 같다.
Ac 아세틸(아세틸화된 잔기를 지칭하기 위하여 사용)
AcBpa 아세틸화된 p-벤조일-L-페닐알라닌
ACN 아세토나이트릴
AcOH 아세트산
ADCC 항체-의존적 세포의 세포독성
Aib 아미노아이소뷰티르산
bA 베타-알라닌
Bpa p-벤조일-L-페닐알라닌
BrAc 브로모아세틸(BrCH2C(O)
BSA 소 혈청 알부민
Bzl 벤질
Cap 카프로산
CBC 전혈구 계산치
COPD 만성 폐쇄성 폐질환
CTL 세포독성 T 림프구
DCC 다이사이클로헥실카보다이이미드
Dde 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소-사이클로헥실리덴)에틸
DNP 2,4-다이나이트로페놀
DOPC 1,2-다이올레오일-sn-글라이세로-3-포스코콜린
DOPE 1,2-다이올레오일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민
DPPC 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-포스코콜린
DSPC 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스코콜린
DTT 다이티오트레이톨
EAE 실험적 자가면역성 뇌척수염
ECL 향상된 화학발광
ESI-MS 전자분무 이온화 질량 분석법
FACS 형광-활성화 세포 선별
Fmoc 플루오레닐메톡시카보닐
GHT 글라이신, 하이포잔틴, 티미딘
HOBt 1-하이드록시벤조트라이아졸
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HSL 호모세린 락톤
IB 봉입체
KCa 칼슘-활성화 칼륨 채널(IKCa, BKCa, SKCa를 포함)
KLH 키홀 림펫 헤모시아닌
Kv 전압-개폐 칼륨 채널
Lau 라우르산
LPS 지질다당류
LYMPH 림프구
MALDI-MS 매트릭스-지원 레이저 이탈 이온화 질량 분석법
Me 메틸
MeO 메톡시
MeOH 메탄올
MHC 주조직적합성복합체
MMP 매트릭스 메탈로프로테이나제
MW 분자량
MWCO 분획 분자량
1-Nap 1-나프틸알라닌
NEUT 호중구
Nle 노르류신
NMP N-메틸-2-피롤리디논
OAc 아세테이트
PAGE 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동
PBMC 말초혈액 단핵구 세포
PBS 인산염-완충 식염수
Pbf 2,2,4,6,7-펜다메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐
PCR 중합효소 연쇄반응
PD 약물학적
Pec 피페콜산
PEG 폴리(에틸렌 글라이콜)
pGlu 파이로글루탐산
Pic 피콜린산
PK 약력학적
pY 포스포티로신
RBS 리보솜 결합 부위
RT 실온(약 25℃)
Sar 살코신
SDS 도데실 황산나트륨
STK 세린-트레오닌 키나제
t-Boc tert-뷰톡시카보닐
tBu tert-뷰틸
TCR T 세포 수용체
TFA 트라이플루오로아세트산
THF 흉선 체액성 인자
Trt 트라이틸
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> CARRIER IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF <130> A-1536-WO-PCT <140> PCT/US2011/052841 <141> 2011-09-22 <150> 61/385,460 <151> 2010-09-22 <160> 392 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Immunoglobulin Fc domain of human IgG2 <400> 1 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Arg Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> modifed VH21 signal peptide <400> 2 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 3 catgaattcc ccaccatgga atggagctgg 30 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 4 cacggtgggc actcgacttt gcgctcggag tggacacc 38 <210> 5 <211> 132 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> ShK[2-35] with N-terminal linker extension <400> 5 ggaggaggag gatccggagg aggaggaagc agctgcatcg acaccatccc caagagccgc 60 tgcaccgcct tccagtgcaa gcacagcatg aagtaccgcc tgagcttctg ccgcaagacc 120 tgcggcacct gc 132 <210> 6 <211> 44 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> ShK[2-35] with N-terminal linker extension <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Ile Asp Thr Ile 1 5 10 15 Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr 20 25 30 Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 7 gtccactccg agcgcaaagt cgagtgccca ccgtgcc 37 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 8 tcctcctcct ttacccggag acagggagag 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 9 gctgcaccgc cttcaagtgc aagcacagc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 10 gctgtgcttg cacttgaagg cggtgcagc 29 <210> 11 <211> 132 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> ShK[2-35, K16] with N-terminal linker extension <400> 11 ggaggaggag gatccggagg aggaggaagc agctgcatcg acaccatccc caagagccgc 60 tgcaccgcct tcaagtgcaa gcacagcatg aagtaccgcc tgagcttctg ccgcaagacc 120 tgcggcacct gc 132 <210> 12 <211> 44 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> ShK[2-35, Q16K] with N-terminal linker extension <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Ile Asp Thr Ile 1 5 10 15 Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr 20 25 30 Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 13 ccgggtaaag gaggaggagg atccggag 28 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 14 catgcggccg ctcattagca ggtg 24 <210> 15 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Coding sequence of fragment of immunoglobulin Fc domain of human IgG2 <220> <221> CDS <222> (1)..(648) <400> 15 gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 48 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg 96 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg 144 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag 192 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag 240 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc 288 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc 336 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc 384 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc 432 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 480 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 aag acc aca cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 528 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 576 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 624 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 648 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 16 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 17 <211> 289 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH21SP-IgG2-Fc-L10-ShK(2-35, Q16K) Fusion polypeptide <400> 17 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Arg Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 245 250 255 Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys 260 265 270 His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr 275 280 285 Cys <210> 18 <211> 289 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH21SP-IgG2-Fc-L10-ShK(2-35, Q16K) Fusion polypeptide <400> 18 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Arg Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 245 250 255 Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys 260 265 270 His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr 275 280 285 Cys <210> 19 <211> 290 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH21SP-IgG2-Fc-L10-ShK(1-35, Q16K) Fusion polypeptide <400> 19 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Arg Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg 245 250 255 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 260 265 270 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 275 280 285 Thr Cys 290 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 20 cataagcttc ccaccatgga atggagctgg 30 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 21 catggatcct catttacccg gagacaggga g 31 <210> 22 <211> 163 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Coding sequence ShK{1-35, Q16K) with an N-terminal linker <220> <221> CDS <222> (1)..(126) <400> 22 gga tcc gga gga gga gga agc cgc agc tgc atc gac acc atc ccc aag 48 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys 1 5 10 15 agc cgc tgc acc gcc ttc aag tgc aag cac agc atg aag tac cgc ctg 96 Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 agc ttc tgc cgc aag acc tgc ggc acc tgc taatgagcgg ccgctcgagg 146 Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 ccggcaaggc cggatcc 163 <210> 23 <211> 42 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys 1 5 10 15 Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 24 <211> 744 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Coding sequence - IgG2 fragment <220> <221> CDS <222> (1)..(744) <400> 24 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gag cgc aaa gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct 96 Val His Ser Glu Arg Lys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 20 25 30 gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 144 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg 192 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 agc cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 240 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 gag gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc 288 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg 336 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc 384 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 115 120 125 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 432 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag 480 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc 528 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca 576 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 624 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 195 200 205 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 672 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 720 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 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tac gtg gac ggc gtg gag gtg 912 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc 960 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 305 310 315 320 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc 1008 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc 1056 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1104 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc 1152 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag 1200 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc 1248 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1296 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1344 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 1392 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 ccg ggt gga gga gga 1407 Pro Gly Gly Gly Gly 465 <210> 51 <211> 469 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 20 25 30 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 50 55 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cct gaa ctc ctg ggg 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 65 70 75 80 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 288 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 85 90 95 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 336 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 100 105 110 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 384 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 115 120 125 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 432 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 130 135 140 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 480 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 145 150 155 160 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 528 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 165 170 175 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 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<220> <223> Synthetic Construct <400> 65 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr 20 25 30 Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg 35 40 45 Lys Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 66 ggaggaggaa gccaggtgca gctggtgcag 30 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Primer sequence <400> 67 catgcggccg ctcatttacc c 21 <210> 68 <211> 1338 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aKLH 120.6-HC coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1338) <400> 68 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc acc ggc tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 cac atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tgg atc aac cct aac agt ggt ggc aca aac tat gca cag aag ttt 192 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac acg tcc atc agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gat cgt ggg agc tac tac tgg ttc gac ccc tgg ggc cag gga 336 Ala Arg Asp Arg Gly Ser Tyr Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc 384 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg 432 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg 480 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta 528 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 576 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc 624 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt tgt gtc gag 672 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc 720 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag 816 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc 912 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag 960 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca 720 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 768 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc 816 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 864 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc 912 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac 960 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1008 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1056 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1104 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1152 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg gac 1200 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1248 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1296 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt gga 1344 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 435 440 445 gga gga gga tcc gga gga gga gga agc cgc agc tgc atc gac acc atc 1392 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile 450 455 460 ccc aag agc cgc tgc acc gcc ttc aag tgc aag cac agc atg aag tac 1440 Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr 465 470 475 480 cgc ctg agc ttc tgc cgc aag acc tgc ggc acc tgc 1476 Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 485 490 <210> 75 <211> 492 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr 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Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg 65 70 75 80 cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tgg tat gat 288 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp 85 90 95 gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc act atc 336 Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 100 105 110 tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg 384 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 115 120 125 aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg agg tat aac ttc aac 432 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asn Phe Asn 130 135 140 tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tct agt 480 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 145 150 155 160 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 528 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 165 170 175 agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 576 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 180 185 190 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gct ctg acc agc 624 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 195 200 205 ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 672 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 210 215 220 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc 720 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 225 230 235 240 tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 768 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 245 250 255 aca gtt gag cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca 816 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 260 265 270 cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 864 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg 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20 25 30 ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly 35 40 45 att agt aga agc gct tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct 192 Ile Ser Arg Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 ccc agc ctc ctc atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca 240 Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 gac agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc 288 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 agc aga ctg gag cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt 336 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe 100 105 110 ggt agt tca ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 384 Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 432 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 cag ttg aaa tct gga act gct agc gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 480 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 528 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 576 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 624 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 672 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 705 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 97 <211> 235 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 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Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 99 <211> 1413 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> 4241 (HC: Y125E) coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 99 atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct tca cag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc 144 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 agc agt ggt gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag 192 Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys 50 55 60 ggc ctg gag tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr 65 70 75 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180 185 190 acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 100 <211> 471 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 100 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr 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gcc tgg ttc cag cag aaa cct ggc cag gct ccc 192 Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc acc agg gcc act ggt gtc cca gcc 240 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat gat 336 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp 100 105 110 aac tgg ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt 384 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 432 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 528 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 576 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 702 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 109 <211> 234 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Leu Ala 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aga tct gac gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gcg aga gct cag ctt tac ttt gac tac tgg ggc cag gga 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 acc ctg gtc acc gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc 432 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg 480 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg 528 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta 576 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 624 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc 672 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt tgt gtc gag 720 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca gtc ttc ctc 768 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 816 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag 864 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 912 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc 960 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag 1008 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1056 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1104 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1152 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1200 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc 1248 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1296 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 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Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys 50 55 60 ggc ctg gag tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 aat ccg tcc ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aag cag ttc tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc 336 Lys Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gta tat tac tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac gct tat ggt atg 384 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met 115 120 125 gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc 432 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca tcc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 672 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag 1152 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 1200 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc 1296 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 1344 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 1392 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1413 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 118 <211> 471 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr 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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu 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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 576 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 702 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 121 <211> 234 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala 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sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1383) <400> 123 atg gag tgg acc tgg agg gtc ctt ttc ttg gtg gca gca gca aca ggt 48 Met Glu Trp Thr Trp Arg Val Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 gcc cac tcc cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc aga tat ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192 Thr Arg Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg gga tgg atc agc act tac agt ggt aac aca aac tat gca 240 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 cag aag ctc cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc 288 Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser 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ctg cac aac 1344 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1383 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 124 <211> 461 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 Met Glu Trp Thr Trp Arg Val Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gln Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro 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Construct <400> 188 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 189 <211> 321 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL5 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 189 gaa ata gtg atg acg cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cct ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 tta gcc tgg ttc cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc acc agg gcc act ggt gtc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat gat aac gct ccg ctc 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Ala Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 190 <211> 107 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 190 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 191 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL6 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 191 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 192 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 192 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 193 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL7 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 193 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa gct ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 194 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 194 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 195 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL8 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 195 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 gct tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 196 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 196 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 197 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL9 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 197 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 gct acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 198 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 198 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 199 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL10 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 199 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa tat ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 200 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 200 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 201 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL11 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 201 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 gaa tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 202 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 202 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 203 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL12 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 203 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 aga tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa ttt ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 204 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 204 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 205 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL13 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 205 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa gaa ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 206 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 206 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 207 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL14 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 207 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt caa caa aga ggt agt tca ccg 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 208 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 208 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 209 <211> 324 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VL15 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 209 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag ggt att agt aga agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 gct tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agc ctc ctc 144 Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt gca tcc agc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 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Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 324 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 212 <211> 108 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 212 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 213 <211> 42 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> 5152-98 primer sequence <400> 213 gaaagtgagc ggccagttat cagcctgctg acagtaataa ac 42 <210> 214 <211> 42 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> 5152-97 primer sequence <400> 214 gtttattact gtcagcaggc 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<220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 320 cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc aga tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tgg atc agc act tac agt ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc 192 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga cgg cag cag tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 321 <211> 116 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 321 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 322 <211> 348 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH10 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 322 cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc aga tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tgg atc agc act tac agt ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc 192 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gct cag ctt tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 323 <211> 116 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 323 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 324 <211> 348 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH11 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 324 cag gtt cag ctg gtg cag tct gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc aga tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tgg atc agc act tac agt ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc 192 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gct cag cag tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Ala Gln Gln Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 325 <211> 116 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 325 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp 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55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 327 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 327 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 328 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH13 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 328 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gct tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 329 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 329 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 330 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH14 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 330 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac gct tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 331 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 331 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 332 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL 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Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 333 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 333 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Ala Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 334 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH16 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 334 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac gct tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 335 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 335 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 336 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH17 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 336 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac gaa tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Glu Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 337 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 337 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Glu Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 338 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH18 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 338 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac tac tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 339 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 339 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 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Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 341 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 341 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Arg Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 345 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 345 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg 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gag 144 Asp Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac gct tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 357 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 357 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Ala 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acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac gct ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 359 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 359 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 360 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH29 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 360 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac gaa ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Glu Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 361 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 361 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr 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80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac aga ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Arg Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 363 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 363 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Arg Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly 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Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac gct gct ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 365 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 365 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 366 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH32 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Gly Ala Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 367 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 367 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Ala Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 368 <211> 366 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> VH33 coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 368 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tca cag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac gct gct ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val 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ggc tcc atc agc agt ggt 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 gat tac ttc tgg agc tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac gct gct gct ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Ala Ala Ala Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 371 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 371 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tgg atc cgc cag ctc cca ggg aag ggc ctg gag 144 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg att ggg tac atc tat tac agt ggg tcc acc tac tac aat ccg tcc 192 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctc aag agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc 240 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac 288 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 tgt gcg aga gat cga ggg ggt gac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 373 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 373 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 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45 ggg cac atc cat aac agt ggg acc acc tac tac aat ccg tcc ctc aag 192 Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga gtt acc ata tca gta gac acg tct aag aag cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 agg ctg agt tct gtg act gcc gcg gac acg gcc gta tat tac tgt gcg 288 Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga gat tat ggg gac tac tat tac tac tac tat ggt atg gac gtc tgg 336 Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 375 <211> 122 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 375 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile His 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Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gct cag ctt tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Ala Gln Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg 384 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg 432 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc 480 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca gct gtc cta cag tcc tca 528 Ala Leu Thr 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tcc ttc ttc 1200 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1248 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1296 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt gga gga gga gga tcc gga gga 1344 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 435 440 445 gga gga agc cgc agc tgc atc gac acc atc ccc aag agc cgc tgc acc 1392 Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr 450 455 460 gcc ttc aag tgc aag cac agc atg aag tac cgc ctg agc ttc tgc cgc 1440 Ala Phe Lys Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg 465 470 475 480 aag acc tgc ggc acc tgc 1458 Lys Thr Cys Gly Thr Cys 485 <210> 377 <211> 486 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 377 Gln Val Gln Leu Val 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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg 816 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag 864 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtt gtg 912 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 290 295 300 cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 960 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg 1008 Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 1056 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac 1104 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 1152 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1200 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 1248 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 1296 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt ggt gga ggt ggt ggt tct ggt 1344 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 435 440 445 ggt ggt agc gga ggc ggc ggt tcc cac ccc atc cct gac tcc tct cca 1392 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro 450 455 460 ctc ctg caa ttc ggg ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat 1440 Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp 465 470 475 480 gat gcc cag cag aca gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg 1488 Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr 485 490 495 gtg ggg ggc gct gct gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa 1536 Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys 500 505 510 gcc ttg aag ccg gga gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg 1584 Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg 515 520 525 ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt 1632 Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe 530 535 540 gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac 1680 Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr 545 550 555 560 aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg 1728 Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly 565 570 575 aac aag tcc cca cac cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc 1776 Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe 580 585 590 ctg cca cta cca ggc ctg cca ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc 1824 Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile 595 600 605 ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg 1872 Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met 610 615 620 gtg gga cct tcc cag ggc cga agc ccc agc tac gct tcc 1911 Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 625 630 635 <210> 384 <211> 637 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Synthetic Construct <400> 384 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu 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tcc gag agc aca 432 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg 480 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 gtg tcg tgg aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca 528 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc 576 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat 624 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt 672 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga ccg tca 720 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 225 230 235 240 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 768 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc 816 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 864 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc 912 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 agc gtc ctc acc gtt gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac 960 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1008 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1056 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1104 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 1152 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg ctg gac 1200 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 1248 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1296 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt ggt 1344 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 435 440 445 gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc gga ggc ggc ggt tcc cac ccc 1392 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro 450 455 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agc acc aag ggc cca 384 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc gag agc aca 432 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg 480 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 gtg tcg tgg aac tca ggc gct ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc cca 528 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc 576 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 gtg ccc tcc agc aac ttc ggc acc cag acc tac acc tgc aac gta gat 624 Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aca gtt gag cgc aaa tgt 672 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys 210 215 220 tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca 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Thr Cys 210 215 220 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 225 230 235 240 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile 465 470 475 480 Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Lys Cys Lys His Ser 485 490 495 Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 500 505 510 <210> 390 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human FGF21 <400> 390 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 391 <211> 38 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Forward primer sequence <400> 391 ggttgagagg tgccagatgt cagggctgca gcagcggc 38 <210> 392 <211> 42 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Reverse primer sequence <400> 392 cagctgcacc tgaccaccac ctccaccgct atgctgagcg cg 42

Claims (37)

  1. 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린으로서,
    (a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 182, 서열번호 188 또는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  2. 면역글로뷸린 중쇄 가변 영역 및 면역글로뷸린 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 면역글로뷸린으로서,
    (a) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349, 서열번호 351, 서열번호 353, 서열번호 355 또는 서열번호 359의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 204의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 349 또는 서열번호 355의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 357, 서열번호 359 또는 서열번호 369의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 335, 서열번호 349 또는 서열번호 351의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  4. 제2항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 196의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 353의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  5. 제2항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  6. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리된 면역글로뷸린은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 분리된 면역글로뷸린.
  8. 제7항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하는, 분리된 면역글로뷸린.
  9. 제7항에 있어서, 단클론성 항체를 포함하는, 분리된 면역글로뷸린.
  10. 제9항에 있어서, 인간 항체를 포함하는, 분리된 면역글로뷸린.
  11. 제10항에 있어서, 하기를 포함하는 분리된 면역글로뷸린:
    (a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상기 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
    (b) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
    (c) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄; 또는
    (d) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 중쇄; 및 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기가 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다로부터 결여된 상기 서열을 포함하는 면역글로뷸린 경쇄.
  12. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트된 1 내지 24개의 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티(chemical moiety)를 더 포함하는, 분리된 면역글로뷸린.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약리학적으로 활성인 화학적 모이어티는 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드인 것인 분리된 면역글로뷸린.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역글로뷸린은 재조합적으로 생성된 것인 분리된 면역글로뷸린.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 상기 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 상기 면역글로뷸린 중쇄의 상기 Fc 도메인의 내부 루프 내에서 상기 면역글로뷸린 중쇄의 1차 아미노산 서열에 삽입된 것인 분리된 면역글로뷸린.
  16. 제13항에 있어서, 상기 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 상기 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 상기 면역글로뷸린 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 컨쥬게이트된 분리된 면역글로뷸린.
  17. 제13항에 있어서, 상기 면역글로뷸린은 적어도 하나의 면역글로뷸린 중쇄 및 적어도 하나의 면역글로뷸린 경쇄를 포함하며, 상기 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 상기 면역글로뷸린 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 컨쥬게이트된 것인 분리된 면역글로뷸린.
  18. 제13항에 있어서, 상기 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 독소 펩타이드, IL-6 결합 펩타이드, CGRP 펩타이드 길항물질, 브래디키닌(bradykinin) B1 수용체 펩타이드 길항물질, PTH 작용물질 펩타이드, PTH 길항물질 펩타이드, ang-1 결합 펩타이드, ang-2 결합 펩타이드, 마이오스타틴 결합 펩타이드, EPO-모방체 펩타이드, FGF21 펩타이드, TPO-모방체 펩타이드, NGF 결합 펩타이드, BAFF 길항물질 펩타이드, GLP-1 또는 이것의 펩타이드 모방체, 또는 GLP-2 또는 이것의 펩타이드 모방체인 것인 분리된 면역글로뷸린.
  19. 제18항에 있어서, 상기 독소 펩타이드는 ShK 또는 ShK 펩타이드 유사체인 것인 분리된 면역글로뷸린.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린; 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  22. 제3항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  23. 제4항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  24. 제5항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  25. 제6항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  26. 제11항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  27. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역글로뷸린을 암호화하는, 분리된 핵산.
  28. 제21항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  30. 제27항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  31. 제28항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
  32. 제29항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
  33. 제30항에 있어서, 발현 벡터를 포함하는 벡터.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  35. (a) 발현 벡터에 의해 암호화된 면역글로뷸린을 발현시키는 조건 하에 배양 배지에서 제34항의 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및
    (b) 상기 배양 배지로부터 상기 면역글로뷸린을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 30 마이크로몰 농도의 상기 면역글로뷸린은, 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션시킨 수용액 중 30 나노몰 농도의 가용성 인간 IL-17R(서열번호 89)에 유의하게 결합되지 않은 것인 면역글로뷸린.
  37. 제2항에 있어서, 10 마이크로몰 농도의 상기 면역글로뷸린은, 표면 플라즈몬 공명 결합 분석에 의해 측정된 바와 같이, 생리적 조건 하에 인큐베이션시킨 수용액 중 10 나노몰 농도의 가용성 인간 TR2(서열번호 82)에 유의하게 결합되지 않은 것인 면역글로뷸린.
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