JPH09509835A

JPH09509835A - アラニン走査型突然変異誘発によるｉｎｖｉｔｒｏ抗体アフィニティー成熟

Info

Publication number: JPH09509835A
Application number: JP7522980A
Authority: JP
Inventors: ルイス，クレイグ・エム; ラドメアー，ステイーブン・ダブリユ; ホリス，グレゴリー・エフ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1995-02-27
Publication date: 1997-10-07
Also published as: CA2183550A1; WO1995023813A1; EP0748338A4; EP0748338A1

Abstract

(57)【要約】抗体を突然変異誘発して修飾抗体を作製する方法、修飾抗体、修飾抗体をコードするＤＮＡならびに該抗体またはＤＮＡを含む診断キットおよび医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アラニン走査型突然変異誘発による in vitro抗体アフィニティー成熟発明の簡単な説明抗体を突然変異誘発して修飾抗体を作る方法、修飾抗体、修飾抗体をコードするＤＮＡならびに該抗体またはＤＮＡを含む診断キットおよび医薬組成物を提供する。本発明方法は、in vitro 抗体成熟を達成するための系統的方法であり、アラニン走査型突然変異誘発を使用する。本発明は特に、この方法によって得られる一組の一本鎖 Fv(scFv)抗体を例として説明される。得られる抗体は、HIV g p120 の V3 ループに対して特異的であり、出発抗体と比較して抗原に対する of f-rate が変化している。特に興味深いのは、抗原に対する off-rate が改善された（より遅くなる）変異抗体である。野生株に対して11倍も高い改善が認められた。発明の要旨抗体を突然変異誘発して修飾抗体を作る方法、修飾抗体、修飾抗体をコードするＤＮＡならびに該抗体またはＤＮＡを含む診断キットおよび医薬組成物を提供する。図面の簡単な説明図１は、アラニン走査型突然変異誘発を示す。scFv P5Q のVH CDR3 における 27 個のアミノ酸の各々を、部位特異的突然変異誘発によってアラニンに変換した。大腸菌クローンを誘発して、ＩＰＴＧにより scFv を発現した。fd ファージ遺伝子３シグナル配列によって細胞周辺腔が標的となる一本鎖 Fv をＥＤＴＡで抽出した。細胞周辺抽出物を、表面プラスモン共鳴（Fagerstam，1991）によって抗体−抗原アフィニティーを測定する BIAcore^TMにより分析し、off-rate を HIV gp120 V3 ループペプチドに対して測定した。P5Q に対するアラニン走査の結果は４つに分類される。すなわち、i）off-rateが遅くなる、ii）off-rate が速くなる、iii）結合しない、およびiv）off-rate変化が小さいかゼロの４分類である。標準偏差は、±25％である。図２は、ポジション 107でのアミノ酸の無作為化を示す。ポジション 107のアルギニンを、部位特異的突然変異誘発によって全アミノ酸に変異した。一本鎖 F v 抽出物を BIAcoreによって分析した。off-rate の変化(%)を P5Qに対して示す。図３は、ポジション 111でのアミノ酸の無作為化を示す。ポジション 111のグルタミン酸を、部位特異的突然変異誘発によって全アミノ酸に変異した。一本鎖 Fv 抽出物を BIAcoreによって分析した。off-rateの変化(%) を P5Qに対して示す。図４は、ポジション 112でのアミノ酸の無作為化を示す。ポジション 112のアスパラギン酸を、部位特異的突然変異誘発によって全アミノ酸に変異した。一本鎖 Fv 抽出物を BlAcoreによって分析した。off-rateの変化(%)を P5Qに対して示す。図５は、最適化残基を結合することの付加的効果を示す。最適化残基を含む二重変異体を構成し、BIAcoreによって分析した。off-rateの変化(%)を P5Qに対して示す。図６は、c-myc尾部を有する scFv P5Q のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の gp120 V3 ドメインは、約30個のアミノ酸のジスルフィド結合閉鎖ループである。そのループは、天然でも合成でも、抗−ＨＩＶ−１抗体に結合してそれを誘い出す。本発明は、修飾抗体および修飾法に関する。本発明は、修飾ＨＩＶ−１免疫グロブリンおよびこれらの修飾ＨＩＶ−１免疫グロブリンを作る方法を例示して説明する。本発明の修飾免疫グロブリンは、ＨＩＶ−１中和抗体の変形した相補性決定部位３（ＣＤＲ３）を含む。本発明はまた、適する宿主に変異抗体を投与することによる感染症の治療または予防法を含む。本発明の一態様では、修飾ＨＩＶ−１免疫グロブリンの投与によるＨＩＶ感染の治療または予防を記載する。本発明はまた、抗原の検出または解析に有用な診断キットを含む。キット用試薬は、修飾抗体をコードするＤＮＡ分子もしくは修飾抗体またはそれらの組み合わせを含むことができる。抗体を突然変異誘発して修飾抗体を作製する方法、修飾抗体、修飾抗体をコードするＤＮＡならびに該抗体またはＤＮＡを含む診断キットおよび医薬組成物を提供する。本発明方法は、in vitro抗体成熟を達成するための系統的方法であり、アラニン走査型突然変異誘発を使用する。本発明は特に、この方法によって得られる一組の一本鎖 Fv(scFv)抗体を例として説明される。得られる抗体は、HIV gp120 の V3 ループに対して特異的であり、出発抗体と比較して抗原に対する off-rate が変化している。特に興味深いのは、抗原に対する off-rate が改善された（より遅くなる）変異抗体である。野生株に対して11倍も高い改善が認められた。成熟は、相補性決定部位３（ＣＤＲ３）のアラニン走査によって行い、抗原結合に重要な位置を同定した。次いで、重要な位置を無作為化して、最も遅い off -rate を与えるアミノ酸を同定した。最後に、突然変異の組み合わせによりクローンを最適化した。方法の基礎的原理は、アラニンが物理的・化学的に中性であることによる。アラニンを一連のアミノ酸に置換し、結合に対するその影響（off-rateおよび on- rateなど）を常法により評価する。このようにして同定できそうな位置の数は比較的少ない。同定されると、これらの重要な位置を全アミノ酸に対して無作為化し、その位置における最良のアミノ酸を同定することができる。全ての操作および評価は in vitro で行なわれるので、生理的な偏りは限定される。 in vitro抗体成熟の現在の方法は、本質的に無作為方法であり、研究者がアミノ酸置換によりクローンを生成して、それらの評価を行なう。問題は、完全な評価に必要な置換数が極めて大きいということである。例えば、典型的長さが25残基であるＣＤＲ３における全ての無作為置換を評価しようとするならば、 9・10²⁷の可能性を調べなければならないだろう。これは、現在の技術能力を越えている。アラニン走査型成熟は、結合において最も重要でありそうな残基を迅速に同定することができる。上記で引用した25残基の長さを例にとると、25回の置換だけでよい。この最初のスクリーニングから、結合に重要であると考えられるアミノ酸の位置を同定することができる。次いで、その重要な残基を無作為化して、結合を最適化するアミノ酸を同定することができる。この方法を使用すると、元の scFv の10倍以上遅い解離速度を有する scFv 抗体が得られた。 in vitroでの抗体成熟における以前の研究は、一般的な二つの方法の一つを使用した。一つの方法では、ＰＣＲ組換えを使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子の全部または一部を置換し、scFvクローンのライブラリーに入れる。第二の方法では、無作為突然変異を、縮重オリゴヌクレオチドの使用により、scFv クローンのＣＤＲ領域全体にわたって行なう。どちらの場合も、クローンは、ファージ fd 遺伝子３融合表面タンパク質として発現された。親和性のより高いクローンを、パンニングアッセイを使用して同定し、次いでファージのクローナル精製を行なった。各方法には欠点がある。ＰＣＲ法は煩雑であってＢ細胞集団の配列に限定され、本質的に無作為であり、ＰＣＲ組換え工程中に所望しない突然変異が導入される可能性がある。無作為化法は、可能なＣＤＲ変化のごく一部をもたらすのみである。どちらの方法も、パンニングによって適切なクローンの濃厚な集団を最初に生じさせる必要があるので、結合親和性における変化を直接測定することはできない。どちらの方法も、改善された結合を生じる変化のみを検出し、結合を弱める変化の位置を同定するものではない。後者の変化は、適切なアミノ酸によって改善がもたらされる重要な結合残基を含むと考えられる。ここに開示する方法は、系統的で完全であり、予期しない、または望ましくない突然変異は導入されそうにない。全ての操作は in vitro で行なわれ、選択工程による偏りは最少になる。クローンの評価は定量的である。いくつかの場合、重要なアミノ酸の位置は、アラニンとのより弱い結合を示す可能性があるが、続く無作為化は、改善された結合を可能にするアミノ酸を与えると考えられる。そのような突然変異は、以前の方法によっては検出されない。本発明方法は、パンニングのためのファージの発現を必要としないので、scFv、Fab および全長の抗体に対して使用することができる。使用は、ファージ発現のための scFv に限定されない。本発明方法を使用すると、抗−ＨＩＶＶ３ループ抗体が約11倍改善された。抗体のアラニン走査型成熟は、抗体と同種抗原との結合の改善に使用することができる一般的方法である。その方法は、MAb447に導入することができる scFv 447 中の重要な残基の同定に使用されている。そのような変化は、多種類のＨＩＶ gp120単離物に対する MAb447 の結合親和性の重要な改善をもたらすと考えられる。この改善は、抗体の中和能力を増加させ、有効な用量をかなり低下させることができる。本発明の方法および抗体は scFv 抗体を例として説明するが、その方法は他の種類の抗体または異なるエピトープもしくは抗原を標的とする抗体に対しても使用することができることは、当業者であれば容易に理解されよう。他の種類の抗体としては、それらに限定されないが、抗体断片および全長の抗体が挙げられる。本発明の分子生物学および免疫学的方法は、その分野で周知の標準的方法によって行なうことができる。例えば、Maniatis，T.，Fritsch，E . F., Sambrook, J., Molecular Cloning; A Laboratory Manual(Cold Spring H arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982)参照。遺伝子コードは縮重しているので、２種以上のコドンが特定のアミノ酸をコードすることができ、従って、アミノ酸配列は、一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドによってコードすることができる。得られるクローン化されたＤＮＡ分子は、変異抗体をコードする遺伝子をクローン化することにより、適切なプロモーターおよび他の適切な転写調節因子を含む発現ベクターに入れて発現し、原核または真核宿主細胞に組み込んで組換え変異抗体を作製することができる。そのような操作に対する技術は、その分野において周知である。下記実施例および詳細な説明を簡単にするために、用語の定義を行なう。発現ベクターは、適切な宿主でのクローン化された遺伝子コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義する。そのようなベクターは、細菌、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの種々の宿主において、真核遺伝子の発現に使用することができる。発現ベクターとしては、それらに限定されないが、クローニングベクター、変異クローニングベクター、特定的に設計されたプラスミドまたはウイルスが挙げられる。特定的に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞などの宿主間のＤＮＡの移動を可能にする。抗体をコードするＤＮＡはまた、宿主細胞での発現用発現ベクターに入れてクローン化することができる。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、それらに限定されないが、細菌、酵母、哺乳類および昆虫細胞ならびに細胞系が挙げられる。発現ベクターは、それらに限定されないが、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法および電気穿孔法などの多数の技術のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。クローン化ＤＮＡの発現はまた、in vitroで調製した合成ｍＲＮＡを使用して行なうこともできる。合成ｍＲＮＡは、それらに限定されないが、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物などの種々の無細胞系で効率的に翻訳することができ、また、それらに限定されないが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなどの細胞をベースとする系でも効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。また、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分なものがかなりの量存在することが周知である。従って、本発明はまた、最終的に同一のアミノ酸に翻訳される別のコードを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書の場合、１個以上の置換コドンを有する配列は、縮重変種として定義される。本発明をさらに規定するために下記に実施例を示すが、本発明は、これらの実施例の詳細事項に限定されるものではない。実施例１突然変異の構成プラスミド pP5Q が全突然変異研究の出発ベクターであった。プラスミド pP5 Q は、p5H7（Cambridge Antibodies）の誘導体である。プラスミド pP5Q は、一本鎖断片可変領域（scFv）としてクローン化したMAb447（Gorneyら）から最初に誘導されたＶＨおよびＶＬ領域を含む。表１に、MAb447 の相補性決定部位３（ＣＤＲ３）の部位特異的突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドプライマーのいくつかを列挙する。プライマーは、モデル 381A ＤＮＡ合成機(Applied Biosystems，Foster Ci ty，CA)または Cyclone^TM Plus ＤＮＡ合成機（MilliGen/Biosearch，Marlborou gh，MA）のいずれかで合成した。突然変異誘発は、Transformer^TM突然変異誘発キット（CLONTECH，Palo Alto，CA）を用いて、製造者の使用説明書に従って行なった。全ての突然変異は、Sequensase V2.0 ＤＮＡシークエンスキット（Unit ed States Biochemical，Cleveland，OH）によって確認した。実施例２抽出物の調製および scFv 抽出物の BIAcore分析突然変異誘発プラスミドを電気穿孔法によって発現用の大腸菌株 TG1に導入した。単一コロニーを、2% グルコースを補充した 10 mlの 2X-YT（水 11 につき、16 gのトリプトン、10 gの酵母エキスおよび 5 gの塩化ナトリウムを含む）に接種した。激しく振とうしながら細胞を 30 ℃で一夜増殖させ、Beckman GPR(25 00 rpm)での遠心分離により集め、１ mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充した10 mlの新しい 2X-YTに再懸濁して発現を誘発した。細胞をさらに５〜６時間、激しく振とうしながら 30 ℃でインキュベートし、遠心分離によって集め、１ mlのリン酸緩衝食塩水：エチレンジアミン四酢酸（ＰＢＳ：ＥＤＴＡ；10 mMのリン酸ナトリウム pH 7.0、150 mMの塩化ナトリウム、１ mMのＥＤＴＡ）に再懸濁し、氷上で30分インキュベートしてペリプラスミドタンパク質を放出した。抽出物から遠心分離によって不純物を取り除き、使用するまで 4℃で保管した。実施例３ scFv抗体の off-rate 値を、BIAcore システム（Pharmacia Biosenser）を使用して測定した。HIV gp120 V3ループペプチド、Al-1変種（Ala -１ペプチド）を第一アミノ基によってカルボキシル化デキストラン／金マトリックス上に共有的に固定した。カルボキシル−デキストランマトリックスを最初にＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させた。Ala-１ペプチドなどのHIV gp120 V3ループペプチドをＮ−末端においたシステインの遊離チオールによって共有的に固定化した。これらのペプチドを、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミンと反応させておいたＥＤＣ−ＮＨＳ活性化マトリックスと反応させた。残りの未反応ＮＨＳ−エステル基をエタノールアミンの付加により置き換えた。ＥＤＴＡ抽出物を固定化抗原上を通過する流出液に添加した。屈折率の変化を、scFvの結合および続く解離によって生じる表面プラスモン共鳴の形で連続的にモニターした。off-rateを、Pharmacis Kinetics Evaluation ソフトウェアを使用して自動的に収集したデータから計算した。実施例４ＣＤＲ３のアラニン走査による scFv−抗原結合を調節する残基の同定アラニン走査型突然変異誘発を使用して、結合に対して重要な scFv クローン P5Qの VH CDR3領域内残基を同定した。アラニン置換による結合に対する影響は、４種類に大別されると仮定した。すなわち、i）off-rate が遅くなる、ii）of f- rateが速くなる、iii）結合しない、およびiv）off-rateの変化が小さいか無変化の４種類である。分類 i）およびii）は操作上重要であると規定した。分類 iii）は obligatory であり、iv）は重要でないとした。 scFvクローン P5Qの VH CDR3を含む27個の位置を部位特異的突然変異誘発によって、個々にアラニンに変えた。ペリプラスミド抽出物をアラニン置換クローンから調製し、AL-1 gp120V3ループペプチドに対する off-rate 測定のためのアッセイを行なった（図１）。ポジション 107および111 のアラニン置換により、of f-rateが各々 1.7および 2.7倍改善された。これらのポジション（分類１）は重要であると判定し、次いで、無作為化により最適残基の同定を行なった。ポジション 102、112、 113、114 および 118のアラニン置換は off-rate をより速くし（分類ii）、これらのポジションのうちの二つを選択してさらに評価を行なった。ポジション98 、101、115、116、117および 121のアラニン置換は結合をもたらさなかった（分類iii）。残りの 14個のポジションのアラニン置換はoff-rateに対する影響がごく僅かであった（分類iv）。分類 iiiおよびivのポジションについては、これ以上の評価は行なわなかった。実施例５重要なポジションでの無作為化による最適アミノ酸の同定分類 i）の二つの重要なポジション（107 および 111）を全てのアミノ酸に対して個々に無作為化し、AL-1ペプチドに対する off-rate を測定した。さらに、分類ii）二つのポジション（112 および 118）も無作為化の研究用に選択した。ポジション 107に対する結果を図２に示す。最も遅い off-rateは負に帯電したグルタミン酸で認められ、解離は 2.5倍減少した。他の極性および帯電アミノ酸の置換は解離に対してあまり影響がなかった。アラニンを除くと、疎水性アミノ酸による置換は、結合の完全な欠失を生じた。これらの結果は、優位にある表面リガンド接触残基が親水性であることと一致する。ポジション 111の無作為化（図３）は、芳香族残基のチロシンおよびトリプトファンが最も遅い off-rate を生じることを示した（解離速度は各々 4,2および 4,7倍減少した）。しかし、疎水性のアミノ酸による置換は、野生型クローン P 5Qに対する親和性を増加させた。分類ii）のポジション 112および 118（アラニン置換に対して off-rate がより速い）も、アミノ酸の無作為化のために選択した。ポジション 112（図４）および118 のどちらの場合も、最初の scFv P5Q に存在する残基であるアスパラギン酸およびアスパラギンが最良であった。実施例６ポジション 107および 111での改善は付加的であるポジション 107(E)および 111(W)で最適化した残基を結合した二重突然変異体を構成して、個々の改善が付加的であるか否かを調べた。図５は、二重突然変異体が野生型クローン P5Qより 9倍遅い off-rate を有することを示す。この off -rate 値は、最適化した個々の残基で認められた改善（107Eに対する 2.5および 111W に対する 4.7）の積にほぼ等しい。この結果の一つの解釈は、これら二つのポジションの場合、scFv−抗原アフィニティーに対する寄与が独立しており、付加的であるということである。実施例７修飾抗体の製造法抗体をアラニン走査型突然変異誘発によって突然変異誘発し、修飾抗体を作る。修飾抗体の抗原に対する結合を測定する。結合の測定は常法によって行なうことができ、off-rateの測定が挙げられる。所望の特性を有する修飾抗体を選択し、保持する。実施例８修飾抗体の使用法修飾抗体またはその医薬組成物を、それらの抗原によって引き起こされる病気の予防または治療に使用する。治療法としては、それらに限定されないが、修飾抗体の静脈内注射または腹腔内注射が挙げられる。実施例９修飾抗体を使用する診断キット実施例７の修飾抗体を診断キットの試薬として使用する。修飾抗体試薬は、放射性標識または酵素標識などの周知の方法によってさらに変形することができる。診断キットは、抗原の検出または解析に使用することができる。実施例１０修飾抗体をコードするＤＮＡ実施例７の修飾抗体をコードするＤＮＡを、修飾抗体産生のための試薬として使用する。ＤＮＡは、発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターを使用すると、宿主細胞を形質転換することができる。発現に適した条件下での宿主細胞の培養の結果、修飾抗体が産生される。実施例１１修飾抗体をコードするＤＮＡ実施例７の修飾抗体をコードするＤＮＡを、テストサンプル中の抗原をコードするＤＮＡの検出に使用する。検出法は、それらに限定されないが、選択条件下でのハイブリッド形成が挙げられる。テストサンプルは、それらに限定されないが、血液サンプル、細胞および組織が挙げられる。実施例１２修飾Ｌ鎖免疫グロブリンの調製免疫グロブリンのＬ鎖をアラニン走査型突然変異誘発により突然変異誘発して、結合特性が変わった変異免疫グロブリンを作製する。修飾免疫グロブリンは、診断キット用試薬または治療薬として使用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラドメアー，ステイーブン・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ホリス，グレゴリー・エフアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．アラニン走査型突然変異誘発によって天然抗体から誘導され、天然抗体の結合特性とは異なる結合特性を有する変異抗体をコードするＤＮＡ分子。２．天然抗体が MAb447 であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子。３．ＤＮＡ分子が P5Q、図１、２、３、４、５の修飾抗体をコードするＤＮＡ、それらの組み合わせ、それらの誘導体およびそれらの縮重変種から成る群から選択されることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ分子。４．抗体の少なくとも１個のアミノ酸をアラニンで置き換えて修飾抗体を作ることを含む、抗体を変形して修飾抗体を作製する方法。５．修飾抗体が改善された結合特性を有することを特徴とする請求項４に記載の方法。６．請求項４に記載の方法によって作製した修飾抗体またはその同族体。７．抗体が MAb447 であることを特徴とする請求項４に記載の方法。８．アラニンで置き換えたアミノ酸が MAb447 の相補性決定領域１、相補性決定領域２または相補性決定領域３に位置することを特徴とする請求項７に記載の方法。９．P5Q、図１、２、３、４、５の抗体、それらの組み合わせ、それらの誘導体およびそれらの同族体から成る群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の変異抗体。１０．請求項６に記載の方法によって作製した修飾抗体を含む診断キット。１１．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む診断キット。１２．請求項６に記載の少なくとも１個の修飾抗体、請求項６に記載の少なくとも１個の修飾抗体をコードするＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含む医薬組成物。