DE19728697C1 - Humaner Antikörper gegen ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das einen Anteil von mindestens sechs Histidinen aufweist - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft humane Antikörper gegen ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das mindestens sechs aufeinanderfolgende Histidinreste aufweist, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Es ist bekannt, ein Polypeptid in Form eines Histidin-Fusionspolypeptids zu ex­ primieren. In einem solchen liegt ein Histidin-Anteil von z. B. 5-18 aufeinander folgenden Histidinresten, meist fusioniert am C- oder N-Terminus des Polypeptids, vor. Zum Nachweis solcher Histidin-Fusionspolypeptide werden inzwischen in Mäusen oder Kaninchen erzeugte polyklonale oder monoklonale Antikörper bereit­ gestellt (Deutsches Patent DE-C-195 07 166). Der Nachweis der Histidin-Fusions­ polypeptide erfolgt dabei unter Anwendung der Antikörper in Immunreaktionen, wie z. B. ELISAs, wobei Humanserum als Standard verwendet wird. Dies hat sich als problematisch erwiesen, da ELISA-Kits, die Humanserum als Standard anbieten, in verschiedenen Staaten, z. B. USA, nicht oder nur erschwert vertrieben werden können. Außerdem ist es häufig schwer, eine geeignete Serum-Probe in genügen­ der Menge und ausreichender Haltbarkeit herzustellen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, das anstelle von Humanserum in Immunreaktionen, die auf Histidin-Fu­ sionsproteinen aufgebaut sind, als Standard verwendet werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.

Insbesondere wird dies durch einen humanen Antikörper erreicht, der gegen ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das mindestens sechs aufeinanderfolgende Histidinreste aufweist, gerichtet ist.

Erfindungsgemäße Antikörper werden aus einer Antikörper-Bibliothek erhalten, die beispielsweise aus menschlicher Lymphozyten-cDNA hergestellt wurde. Sie wer­ den mit Hilfe der "Phage Display" Technik (Welschof et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 (1997), S. 1902-1907) isoliert. Unter Anwendung dieser Technik ist es den Erfindern jetzt erstmals gelungen, einen humanen anti-Histidin Antikörper herzustellen. Der Bedarf nach einem humanen Antikörper bestand schon lange, aber die bei Tieren angewendete Immunisierungstechnik durch Injektion des Histi­ din-Antigens und Booster nach einem bestimmten Zeitschema konnte beim Men­ schen aus ethischen und medizinischen Gründen natürlich nie durchgeführt wer­ den, so daß es bisher nicht möglich war, einen humanen Antikörper gegen Histidin- Fusionsproteine bereitzustellen.

Zum Erhalt eines erfindungsgemäßen humanen Antikörpers können beispielsweise die folgenden Schritte angewendet werden: 1) Screening einer IgM-Bibliothek mit einem Hexahistidinfragment, das an einen Träger (z. B. BSA) gebunden ist; 2) Auswahl von spezifischen Einzelklonen mittels Phagen-ELISA; 3) Charakterisierung ausgewählter Einzelklone durch Phagen-ELISA und Restriktionsverdau; 4) Um­ klonierung in einen Expressionsvektor (z. B. E. coli); 5) Sequenzierung und Se­ quenzanalyse von Klonen. Die Einzelschritte zum Erhalt eines erfindungsgemäßen Antikörpers sind nachfolgend in den Beispielen ausführlicher beschrieben.

Der erfindungsgemäße Antikörper ist vorzugsweise einzelkettig, d. h. er besteht nur aus der mit einem Peptidlinker verbundenen variablen Domäne.

Der Ausdruck "Fusions(poly)peptid bzw. -protein" umfaßt ein Peptid bzw. Protein jeglicher Art und Länge. Ein solches (Poly)peptid kann von jeglichen Zellen, z. B. Bakterien, Hefen, Insekten-, Pflanzen- und tierischen Zellen, sowie Organismen, z. B. transgenen Tieren, exprimiert sein. Ein vorstehender Histidin-Anteil umfaßt z. B. 6-18, vorzugsweise 6-10, aufeinander folgende Histidinreste und liegt fusio­ niert am N und/oder C-Terminus des Polypeptids vor oder aber befindet sich in einer Anhäufung in der Mitte des Peptids.

Ein bevorzugter Antikörper enthält die in Fig. 4 angegebene Aminosäuresequenz oder eine sich hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidende Sequenz. Weiter betrifft die Erfindung DNA kodierend für den erfindungsgemäßen Antikörper. Diese DNA umfaßt

• a) die DNA von Fig. 4 oder einen Teil davon,
• b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
• c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisiert.

Die DNA von Fig. 4 wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganis­ men und Zellkulturen) als Klon A6 unter DSM 11595 am 10. Juni 1997 hinterlegt.

Zur Herstellung von Variationen der erfindungsgemäßen Antikörper (synthetische Antikörper) kann von vorstehend erhaltenen Antikörpern ausgegangen werden. Hierzu bietet sich an, die Antigen-Bindungsregionen der Antikörper zu analysieren und die für vorstehende Erkennung notwendigen und nicht notwendigen Teile zu identifizieren. Die notwendigen Teile können dann modifiziert und die nicht not­ wendigen ganz oder teilweise eliminiert bzw. durch Teile ersetzt werden, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile au­ ßerhalb der Bindungsregionen der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maßnahmen insbesondere die DNA-Rekombinationstechnologie eignet. Diese ist ihm bestens vertraut. Dem Fachmann sind auch Techniken bekannt, einen erfindungsgemäßen einzelkettigen Antikörper durch Anhängen von leichter und schwerer Kette zu vervollständigen. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Antikörper ist, daß sie anstelle von Humanse­ rum universell in immunologischen Nachweisverfahren einsetzbar sind.

Erfindungsgemäße Antikörper zeichnen sich auch dadurch aus, daß sie ebenso wie die im Tier erzeugten anti-His-Antikörper beliebige Fusions(poly)peptide erkennen, die einen Histidin-Anteil aufweisen. Die Erkennung basiert auf dem Vorhandensein der Abfolge von mindestens sechs Histidinen und ist unabhängig vom Peptidanteil, d. h. der erfindungsgemäße Antikörper erkennt spezifisch den Histidin-Anteil eines Histidin-Fusions(poly)peptids bzw. -proteins. Die Antikörper eignen sich daher zum schnellen Nachweis der Expression solcher Fusionspolypeptide. Der Nachweis erfolgt insbesondere durch Western Blot, ELISA, Immunpräzipitation oder Immun­ fluoreszenz. Hierzu können die erfindungsgemäßen Antikörper, wenn es ange­ bracht ist, markiert sein oder in Kombination mit markierten gegen sie gerichteten Antikörpern eingesetzt werden.

Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Antikörper sind, daß sie eine alternative Methode für die Reinigung von rekombinanten Proteinen mit einer Abfolge von mindestens 6 Histidinen durch Affinitätschromatografie darstellen. Außerdem erleichtern sie die Identifikation der Proteine, wenn diese chromatografisch gerei­ nigt werden, z. B. mittels Metallchelatchromatografie.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der erfindungsgemäßen Antikörper ist, daß sie in keinem Tier erzeugt worden sind und daher auch keine Elemente umfassen, die im Menschen eine Immunreaktion bedingen würden. Sie eignen sich damit bestens für den in-vivo Einsatz, der sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Art sein kann. Weiter ist es möglich mit diesem Antikörper eine Vakzine herzustel­ len.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren weiter erläutert:

Fig. 1 zeigt das Klonierungsschema zum Erzeugen einer Antikörper-Expres­ sionsbibliothek

Fig. 2 zeigt die Anreicherung der Antigen-spezifischen Phagemide

Fig. 3 zeigt einen Phagen-ELISA zum Nachweis spezifischer Bindung der 6- Histidin-BSA Einzelklone. Die Platten wurden mit 6-Histidin-BSA bzw. BSA als Negativkontrolle beschichtet. Dargestellt sind die OD 655 nm-Werte der Einzelklone. Wenn ein Klon einen niedrigen Wert für die Erkennung von BSA und einen hohen Wert für die Erkennung von 6- Histidin-BSA besitzt, ist dies ein Indiz für die Produktion Antigen­ spezifischer Phagemidpartikel.

Fig. 4 zeigt die Sequenzanalyse des Klons A6, der für einen erfindungs­ gemäßen Antikörper kodiert.

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

BEISPIEL 1: Herstellung erfindungsgemäßer Antikörper

Zur Herstellung einer IgM Phagen-Oberflächen-Expressionsbibliothek wurde Ge­ samt-RNA aus menschlichen peripheren Lymphozyten (erhalten aus Spenderblut) eingesetzt. (Dübel, Meth. Mol. Cell Biol. 3 (1992), S. 47-52). Messenger-RNA wurde unter Verwendung des Optiprep. 2-Kits der Firma Biometra (Göttingen) hergestellt und in cDNA unter Verwendung eines entsprechenden Kits (Amersham, Braunschweig) unter Beachtung der Herstellerhinweise umgeschrieben. Aus der cDNA wurde mittels PCR (Bedingungen gemäß Welschof et al., J. Immunol. Methods 179 (1995), S. 203-414) mit einem Primersatz, der auf der Grundlage von Aminosäuren-Konsensus-Sequenzen entwickelt wurde, eine Bibliothek kon­ struiert. Dieser PCR-Primersatz beinhaltete 12 Primer zur Amplifikation der varia­ blen Bereiche der Immunglobulinketten, sowie je einen Primer für die Amplifikation der konstanten Bereiche der schweren und der beiden leichten Ketten (Welschof et al., s. oben). Das Leichtketten-Repertoire wurde in den Phagemid-Oberflächen­ expressionsvektor pSEX 81 (Welschof et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 (1997), S. 1902-1907) kloniert. Nach Kombinieren mit dem v_H DNA-Repertoire (s. Fig. 1) wurde der gesamte Vektor in das Expressionssystem E. coli XL1 blue (Stratage­ ne) transformiert. Die mit dem Vektor transformierten Bakterien wurden mit dem Helferphagen M13KO7 infiziert, wodurch Phagen-Partikel mit auf der Oberfläche exprimierenden einzelkettigen Fv entstanden. Nach der Phagenisolierung aus dem Kulturüberstand ließ sich die Phagenbibliothek, die 4 × 10⁷ unabhängige Klone enthielt, zum Screening benutzen.

10¹¹ bis 10¹² rekombinante Phagen aus der obigen Bibliothek mit einer Komplexität von 4 × 10⁷ wurden in PBS enthaltend 2% Milchpulver 2 Stunden präabsorbiert. Ein "Maxisorb Immunotube"-Röhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurde mit 125 µg Hexahistidinfragment konjugiert an BSA (= Antigen) beschichtet. Ein zweites "Maxisorb Immunotube"-Röhrchen wurde mit 125 µg BSA beschichtet. In diese Röhrchen wurden die präadsorbierten Phagen gefüllt und eine Stunde inkubiert. Die Röhrchen wurden 20 mal mit PBS-0,1% Tween und 20 mal mit PBS gewaschen. Zur Elution der Phagen wurde 1 ml 100 mmol Triethylamin in die Röhrchen hinzu­ gefügt, 5 Min. inbubiert und mit 1 ml Tris-HCl neutralisiert. Die nun neutrale Phagenlösung wurden aus den Röhrchen entfernt und zu Bakterien (E. coli XL1 blue), die sich in der log-Phase befinden, gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurden die Bakterien abzentrifugiert, die sedimentierten Bakterien in 1 ml LB-Kulturmedium aufgenommen und auf LB-Amp-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Kolonien geerntet. Die erhaltenen Phagemide aus den Kolonien wurden mit Helferp­ hagen (M13KO7) mit einer MOI von 20 infiziert und als Phagen verpackt. Von den entstandenen neuen infektiösen Phagen wurde der Titer bestimmt. Die obige Prozedur der Präinkubation und anschließende Gabe in beschichtete "Maxisorb Immunotubes" sowie Infektion von E. coli XL1 blue-Bakterien und Verpacken mit Helferphagen M13KO7 wurde zur Anreicherung spezifisch bindender Phagen zwei- bis dreimal wiederholt. Mit zunehmender Anreicherung sollte die Anzahl an eluier­ ten Phagemidpartikeln zunehmen, da von Runde zu Runde immer mehr Antigen­ spezifische Phagemidpartikel eluiert werden. Somit ist ein steigender Elutionstiter ein gutes Maß für eine Anreicherung. Dieser Anreicherungseffekt ist in Fig. 2 gezeigt.

Danach wurden die eluierten Phagemide mit E. coli XL1 blue infiziert und auf LB_Amp-Agarplatten ausplattiert. Von diesem Platten wurden 95 Einzelklone gepickt, in LB-Medium aufgenommen und mit Helferphagen M13KO7 mit einer MOI von 20 infiziert. Von jedem einzelnen Klon wurden nach Kultivieren über Nacht bei 37°C 100 µl Kulturüberstand abgenommen, welcher in jeweils eine Vertiefung einer ELISA-Platte, die mit an BSA gekoppeltem Hexahistidinfragment (6-His-BSA; 1 µg/ml) beschichtet worden war, eingebracht wurde. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C schlossen sich 3 kurze Waschschritte mit PBS an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen des polymeren Trägers durch einstündige Inkubation mit 2% Milchpulver in PBS bei Raumtemperatur. Dazu wurde ein gegen das Phagen-Hauptcodeprotein pVIII gerichteter monoklonaler Antikörper aus Maus sowie ein Peroxidase-gekoppelte Ziege-anti-Maus Antikörper (Verdünnung nach Angabe der Hersteller) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten 8 Waschschritte und anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit Entwick­ lerlösung (50 mM Natriumacetat, 0,4 mM 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin-dihydro­ chlorid, 4,4 mM H₂O₂) bei Raumtemperatur. Die OD bei 655 nm wurde bestimmt. Zur Kontrolle wurden statt der mit BSA-Histidinfragment beschichteten ELISA- Platte eine nur mit BSA beschichtete ELISA-Platte eingesetzt. Das Ergebnis des Phagen-ELISA's ist in Fig. 3 gezeigt.

Aus den 95 Einzelklonen wurden 10 Klone, die ein signifikantes Signal für das jeweilige Screening-Antigen (6-His-BSA) zeigten, ausgewählt und in einem zweiten Phagen-ELISA auf ihre Reaktivität gegenüber 6-His-BSA und andere 5- bzw. 6-His- getaggte Antikörper, die als Kontroll-Antigene eingesetzt wurden, getestet.

Ein Restriktionsverdau und die Sequenzanalyse der 10 Einzelklone ergab, daß diese sich nicht voneinander unterscheiden, sondern von einem Urklon abstammen. Die Sequenzanalyse erfolgte unter Verwendung der Didesoxy-Terminationsmethode mit dem Vektor pSEX-81 (Welschof et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), S. 1902-1907). Die Sequenzierung des Klons A6 ergab die in Fig. 4 gezeigte Sequenz.

BEISPIEL 2: ELISA-Nachweis von His-Fusionspolypeptiden durch erfindungsgemä­ ße Antikörper

In eine 96-Loch-Platte wurden pro Loch je 100 µl mit 1 µg Histidin-BSA-Fusions­ polypeptid bzw. als Kontrolle BSA einpipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C schlossen sich 3 kurze Waschschritte mit PBS an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen des polymeren Trägers durch einstündige Inkubation mit 1% BSA + 2% Milchpulver in PBS bei 37°C. 10⁹ Phagen in Phagenverdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 20 mM NaCl; 2 mM EDTA) wurden hinzugefügt. Die Phagen wurden mit 1 : 5000 verdünntem gegen das Phagen-Hauptcodeprotein pVIII gerichtetem monoklonalem Antikörper aus Maus sowie mit Peroxidase-gekoppeltem Ziege-anti-Maus Antikörper (Verdünnung nach Angabe der Hersteller) inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten 8 Waschschritte und anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit Entwick­ lerlösung (50 mM Natriumacetat, 0,4 mM 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin-dihydro­ chlorid, 4,4 mM H₂O₂) bei Raumtemperatur. Die OD bei 655 nm wurde bestimmt.

Es zeigte sich, daß der Phage den erfindungsgemäßen Antikörper auf der Ober­ fläche exprimiert und spezifisch ein Histidin-BSA-Fusionspolypeptid, nicht aber BSA ohne Histidin-Anteil, erkannt wird.

Claims (8)

1. Humaner Antikörper gegen ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das einen Anteil von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Histidinen aufweist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er die in Fig. 4 gezeigte Aminosäuresequenz oder sich hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidet, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

3. DNA kodierend für einen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 umfaßend

• a) die DNA von Fig. 4 oder einen Teil davon, wobei Fig. 4 Bestandteil dieses Anspruchs ist,
• b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
• c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

4. DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 11595 am 10. Juni 1997 hinterlegt worden ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2, da­ durch gekennzeichnet, daß er aus einer IgM scFv-Phagen-Oberflächen- Expressionsbibliothek, die aus menschlichen peripheren Lymphozyten herge­ stellt worden ist, unter Anwendung von Screeningschritten gewonnen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein an BSA gebundenes Hexahistidin-Fragment zum Screening der Bibliothek eingesetzt wird.

7. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2 in einem Nachweis­ verfahren für ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das einen Anteil von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Histidinen aufweist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Nachweisverfahren ein Western- Blot, ein ELISA, eine Immunfluoreszenz oder eine Immunpräzipitation ist.