DE69519033T2

DE69519033T2 - Zielspezifische screens und ihre verwendung zur ermittelung von kleinen organischen molekularen pharmakophoren

Info

Publication number: DE69519033T2
Application number: DE69519033T
Authority: DE
Inventors: J. Blume
Original assignee: DGI BioTechnologies LLC
Current assignee: DGI BioTechnologies LLC
Priority date: 1994-08-03
Filing date: 1995-08-02
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2015-08-03
Also published as: US20040072271A1; EP1028315A2; DE69519033D1; CA2196679A1; EP0774118A2; ATE196802T1; EP0774118B1; WO1996004557A2; JPH10507517A; EP1028315A3; WO1996004557A3; US6010861A; US20030092057A1; AU3363195A

Description

Dies ist eine Teil-Weiterbehandlung der anhängigen US-Anmeldung 08/286,084, eingereicht am 3. August 1994, deren Offenbarung durch eine Referenz Teil dieser Anmeldung ist.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein allgemeines Verfahren, wodurch rekombinant abgeleitete Antikörper (rVab) verändert und selektiert werden, um einzigartige aktive Oberflächen pharmazeutischer Ziele zu identifizieren. Diese rekombinanten Antikörper sind als Reagenzien für die Identifizierung natürlicher oder synthetischer Entitäten verwendbar, die aktive Oberflächen pharmazeutischer Ziele besetzen und daher als Therapeutika verwendbar sein könnten. Die Erfindung betrifft auch die Aufklärung der dreidimensionalen Konformation der verschiedenen rVabs, die an das pharmazeutische Ziel binden und eine Regulation des Ziels bereitstellen und die Verwendung molekularer Modelle mit einer hohen Auflösung für die Identifizierung oder Synthese biologisch aktiver, kleiner organischer Moleküle, die als brauchbare Arzneistoff-Auffindungs-Leitverbindungen verwendbar sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Heutzutage gibt es viele Verfahren für die Identifizierung chemischer Entitäten, die eine gewünschte Wirkung auf ein pharmazeutisches Ziel besitzen und somit mögliche Arzneistoffe sind. All diesen Verfahren ist die sequenzielle Verwendung multipler Tests für die Identifizierung des zusammengesetzten Aktivitätsprofils einer Testverbindung gemeinsam. Dieses Aktivitätsprofil besteht gewöhnlich aus Information über vier grundsätzliche Eigenschaften: Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität. Die Selektivität zeigt die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen nahe verwandten Mitgliedern einer bestimmten Zielfamilie. Die Spezifität ist die Fähigkeit, zwischen nicht-verwandten Zielen zu unterscheiden. Nur zwei Test- Typen werden für die Entwicklung des Aktivitätsprofils eines möglichen Arzneimittels eingesetzt: einer ist ein Bindetest für die Messung der Affinität (d. h. der Wirksamkeit) der Verbindung; der zweite, ein Aktivitätstest, dient der Messung der Wirkung der Verbindung (d. h. agonistisch oder antagonistisch) auf das Ziel. Bindetests messen die Bildung des Komplexes zwischen Ziel (T) und Ligand (L). Ziele umfassen Rezeptoren, Enzyme oder strukturelle Komponenten. Liganden umfassen Signale wie Hormone, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren oder Testverbindungen.
Bis vor kurzem wurde L für die Identifizierung und Quantifizierung des L : T-Komplexes markiert (L*). In jüngster Zeit wurden Bindetests entwickelt, bei denen ein R mit einem Tag (R*) für die Bewertung der L-Affinität eingesetzt wird (vgl. nachstehend). Alle diese Verfahren einer Markierung und Isolierung und Quantifizierung des R : L-Komplexes sind bekannt und wurden in einer Übersicht dargestellt.
Bei dem Verfahren einer Suche nach kleinen organischen Molekülen mit geeigneter Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität in Bezug auf ein bestimmtes pharmazeutisches Ziel ist die Testreihenfolge am häufigsten Affinität, Aktivität, Selektivität und sodann Spezifität. Zusätzlich wird eine Form eines Binde- und/oder Aktivitätstests in chemische Synthesen zur Verbesserung der Eigenschaften der Verbindung eingestreut. Dies schafft sich wiederholende, zyklische Entdeckungsprozesse, bei denen verschiedene Tests und eine Synthese wiederholt werden, bis eine Verbindung mit allen gewünschten Eigenschaften erhalten wird. Der gegenwärtige, sich wiederholende Prozess ist trotz seines Erfolgs extrem zeitaufwendig und weist eine hohe Wahrscheinlichkeit für ein Versagen aus mehreren Gründen auf. Obwohl Binde- und Aktivitätstests nun automatisiert worden sind, braucht das Sceening viel Zeit, da es mit einzelnen Entitäten in chemischen Reihen mit mehr als 100 000 Entitäten erfolgt. Zusätzlich sind die Eigenschaften der Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität und Selektivität trennbar, so dass das Auftreten einer Eigenschaft in einer Verbindung keine Vorhersage für die Erzielung einer anderen erlaubt. Zum Beispiel ergeben Bindetests keine schlüssigen Daten über die Aktivität (d. h. eine Verbindung mit einer hohen Affinität kann ein Antagonist sein) und Aktivitätstests erlauben keine Vorhersage über die Selektivität oder Affinität. Somit ist die Modifizierung einer Verbindung, um eine ihrer Eigenschaften (d. h. die Agonisten-Aktivität) zu verändern, ohne dass eine andere (d. h. die Ziel-Affinität oder -Selektivität) modifiziert wird, nicht vorhersagbar, und eine beträchtliche Zeit kommt zum Entdeckungsprogramm dazu, falls sich ergibt, dass Verbindungen mit einer hohen Affinität, die früh in dem Entdeckungsprozess identifiziert wurden, eine unangemessene Aktivität oder Selektivität besitzen.
Die relativ große Zahl biologisch aktiver, kleiner organischer Liganden mit unterschiedlichen allgemeinen Strukturen, die zur Bindung an ein bestimmtes pharmazeutisches Ziel fähig sind, legt nahe, dass die Bindeoberfläche des Ziels nicht ungewöhnlich einzigartig ist. Außerdem werden Bindetests unter Verwendung eines endogenen Liganden oder nahestehenden Analogons davon inhärent auf Verbindungen begrenzt, die nur an einen Teil der verfügbaren Oberfläche des Ziels binden. Selbst wenn der markierte Ligand nicht endogen ist, bedeutet diese Beschränkung, dass die durch diesen Prozess identifizierte große Mehrzahl aktiver Verbindungen stark auf die Oberflächendomäne des Ziels beschränkt sein wird, die für die Interaktion mit dem endogenen Liganden verwendet wird.
Diese Begrenzung wird häufig als erwünscht betrachtet, da die Erkennungsdomänen für den endogenen Liganden diejenigen sind, von denen aus vorherigen Untersuchungen bekannt ist, dass sie die Fähigkeit besitzen, die Zielaktivität zu verändern. Jedoch schränkt die Untersuchung nur eines Zielbereichs ernsthaft die Fähigkeit für die Identifizierung wertvoller Liganden ein. Da endogene Liganden in den meisten Fällen Agonisten-Peptide sind, wie im Fall von Opiat-Rezeptoren, kann die Antagonisten-Entdeckung zu einem seltenen Ereignis werden. Zusätzlich wird es für aktive Verbindungen schwierig, unter Mitgliedern einer Zielfamilie zu unterscheiden, da endogene Bindedomänen häufig eine begrenzte Diversität unter Rezeptor-Mitgliedern einer einzigen Zielfamilie zeigen. Dies tritt häufig auf, falls das endogene Signal für die Familie eine einzige Entität und keine Gruppe nahe verwandter Entitäten ist. Acetylcholin (ACh)-Rezeptoren sind ein Beispiel einer Zielfamilie mit nur einer Signalentität. Die Catecholamin-Rezeptoren sind ein Beispiel einer Zielfamilie mit wenigen, jedoch stark verwandten endogenen Catechol-Signalen.
In vielen Fällen findet sich eine Zieldiversität in Zieldomänen, die von der spezifischen Bindestelle des endogenen Liganden verschieden sind. Manche dieser Domänen können mit den anderen Funktionen des Ziels assoziiert sein, d. h. der Signaltransmission, während andere stille Domänen sind, die nicht von der Erkennung oder Transmission irgendeines endogenen Signals verwendet werden. Ein Beispiel eines Dilemmas bei der Unterscheidung zwischen Mitgliedern einer Ziel familie ist das für die Muscarin-Rezeptor-Familie (AChRm), wo die Bindedomäne für Acetylcholin für die Aufzeichnung der Wirksamkeit einer Testverbindung verwendet wird, sich jedoch das Auffinden von AChRm-Agonisten, die zwischen den fünf AChRm-Subtypen unterscheiden, als Illusion bisher erwiesen hat.
Das Ziel für die Arzneistoffentdeckung ist die Entwicklung eines Screening-Verfahrens, das nachweisbare Liganden für die Verwendung zum Screenen von Verbindungen bereitstellt, die an das Ziel binden und Information in Bezug auf die Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität und Selektivität sowie die dreidimensionale (3D) Konformation von Verbindungen bereitstellen, die an dieser bestimmten Stelle auf dem pharmazeutischen Ziel aktiv sind.
Als Teil einer Lösung dieser Probleme ist es auch notwendig, Bindetests zu etablieren, die über die Interaktion von Testverbindungen mit allosterischen Modulationsstellen auf Zielen Auskunft geben. Eine allosterische Stelle ist eine Stelle, die die Bindestelle für den endogenen Liganden modifiziert, jedoch diskontinuierlich und nicht-überlappend mit dieser Stelle ist. Derartige Zielstellen besitzen wichtige physiologische und pharmazeutische Wirkungen und wurden beschrieben. Zum Beispiel bindet die allosterische Stelle auf dem Gaba A-Rezeptor Benzodiazepine (BDZ) und moduliert dadurch die Bindung des endogenen Neurotransmitters Gaba. Eine Besetzung der allosterischen BDZ-Stelle, die mit Chemikalien vieler nicht-verwandter struktureller Gruppen erfolgen kann, besitzt einen signifikanten und anerkannten therapeutischen Einfluss auf physiologische Prozesse, einschließlich Angst und Sedierung.
Es ist ebenfalls bekannt, dass aktive allosterische Stellen existieren, die modulatorisch für die Bindung eines endogenen Liganden wirken und selbst beobachtbare Wirkungen auf das Ziel aufweisen. Eine solche allosterische Stelle findet sich auf dem Gaba-Rezeptor [Garrett, Blume und Abel, 1986; Garrett, Abel und Blume, 1986].
Die momentanen Screening-Techniken, die eine direkte Bindung von Testverbindungen an allosterische Zielstellen erfassen, werden nicht routinemäßig eingesetzt, da a) markierte Liganden mit einer hohen Affinität, die an diese Stellen binden, zu Beginn eines Entdeckungsprogramms gewöhnlich nicht verfügbar sind, und b) die notwendige Überwachung einer Dissoziierung eines nachweisbaren endogenen Liganden oder von Bio-Assays zu zeitaufwendig bei den anfänglichen Screening- Protokollen sind. Ohne einen einfachen, schnellen und umfassenden Weg für die Beobachtung aller möglichen Zielstellen bleibt die Untersuchung der Oberfläche eines pharmazeutischen Ziels für mögliche Modulation auf einen kleinen Teil der Zieloberfläche begrenzt. Neue Verfahren sind für die Betrachtung der gesamten Zieloberfläche beim frühen Screening auf Entdeckungs-Leitverbindungen notwendig.
In jüngerer Zeit wurden Verfahren für die Identifizierung verschiedener Entitäten, die Zieloberflächen erkennen, beschrieben, die nicht von der Verfügbarkeit von Liganden mit einem Tag mit einer hohen Affinität für das Ziel abhängig sind [Delvin, J. J., Panganiban, L. C. und Devlin, P. E., 1990]. Diese Tests weisen die Oberflächen-Erkennungsaktivität einer Verbindung direkt über die Bildung eines identifizierbaren Ziel mit einem Tag (T*):Ligand-Komplexes nach. In einer Version wird die Testverbindung in identifizierbaren Kompartimenten mit einer festen Matrix einer verschiedenen Zusammensetzung bei Konzentrationen gekoppelt, die ein Binden von ausreichenden Mengen des markierten Ziels und eine Bildung von stabilen Ligand-markiertes Ziel-Komplexen für einen darauffolgenden Nachweis durch bekannte chemische, radioaktive oder biologische Verfahren erlauben. Die darauffolgende Isolierung (oder Identifizierung) der Testverbindung von den Kompartimenten mit dem markierten Ziel stellt aktive chemische Strukturen bereit. In einem solchen Fall, falls die Testverbindungen freie Oligonukleotide sind, werden die Oligonukleotide in Komplexen mit dem Ziel isoliert und durch PCR amplifiziert und sequenziell [Delvin, J. J., Panganiban, L. C. und Devlin, P. E., 1990].
Phage-Display ist ein besonders sensitives Verfahren einer Präsentierung von Peptid-Testverbindungen für ein Ziel. Ein Phage kann für die Expression des Gens, das das Testpeptid als Fusionsprotein mit einem seiner Oberflächenproteine kodiert, verändert werden. Auf Verfahren, die ein Phage-Display verwenden, wird in Winter et al., PCT-Anmeldung WO 92/20791; Huse, WO 92/06204 und Ladner et al., WO 90/02809 verwiesen.
Obwohl diese neueren Verfahren nun in zufällige Arzneistoff-Screening-Protokolle eingebaut wurden, lösen sie nicht die nachstehenden Probleme. Die Tests der kritischen Eigenschaften der Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität sind immer noch nicht miteinander verbunden. Aktive Zieloberflächen, einschließlich der Stelle für den endogenen Liganden und der allosterischen Stellen, wurden nicht identifiziert und die SD-Information über die Konformation des aktiven Agens wird nicht bereitgestellt. Was noch wichtiger ist, die meisten Stoffe, die für ein Screening verfügbar sind, d. h. Peptide, Nukleotide, Lipide und Kohlenhydrate, die in großen Bibliotheken verfügbar sind, sind nicht vollkommen befriedigend als Entdeckungs-Leitverbindungen, da von keinem angenommen wird, dass es oral aktiv ist oder Membranbarrieren passiert, um an intrazelluläre Ziele oder Ziele des zentralen Nervensystems zu gelangen. Zusätzlich sind diese Verbindungsklassen so flexibel, dass sie ihre aktive SD-Konfigurationen dermaßen unkenntlich machen, dass ihre Verwendung als Modelle für organische Syntheseleistungen vermieden oder stark begrenzt wird. Eine Verbesserung beim Screening würde eine Auflösung dieser Schwächen umfassen, so dass diese breiten Oberflächen-Erkennungsbibliotheken ihren vollständigen Nutzen erreichen könnten.
Bei der Abdeckung des Stands der Technik in Bezug auf Binde-Screens für Ziel- Modifizierer mit einem hohen Durchsatz ist es auch notwendig, zusammenzufassen, was über die endogenen Liganden-Signale und ihre Ziele bekannt ist. Beide machten zusätzliche Probleme und Begrenzungen deutlich, die bei Bindetests auftreten, die heutzutage für Entdeckungsverfahren verfügbar sind.
Endogene Liganden-Signale sind die Liganden, die direkt die Zielaktivität modifizieren. Die Größe von endogenen Liganden variiert stark, und reicht von 100 Dalton (z. B. für Glycin bei seiner regulatorischen Rolle als exzitatorischer Aminosäure- Neurotransmitter) bis über 100 kD (z. B. für manche extrazellulär aktiven Wachstumsfaktoren (GF)), wobei sich das Oberflächengebiet proportional erhöht. Die Zusammensetzung des endogenen Liganden variiert gleichermaßen und umfasst organische Stoffe wie Neurotransmitter, Peptide wie Somatostatin, LH, LHRH und TRH, Proteine wie Wachstumsfaktoren und Lipide, Kohlenhydrate und anorganische Stoffe wie Ionen.
Für Entdeckungszwecke ist allen der Wunsch gemeinsam, den endogenen Liganden durch ein kleines organisches Molekül zu ersetzen. Das Problem eines Screenings auf Austauschstoffe scheint für die meisten kleinen endogenen Liganden, d. h. Neurotransmitter und Neuropeptid-Modulatoren im Vergleich zu großen endogenen Liganden, d. h. Hormone, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, sehr unterschiedlich zu sein. Obwohl kleine organische Moleküle aufgefunden wurden, die an Zielen für kleine endogene Liganden aktiv sein können, wurden wenige, falls überhaupt, für die größeren Moleküle wie Proteine aufgefunden.
Der Diversität bei den endogenen Liganden entspricht die gleichermaßen ausgedehnte Diversität bei Zieldomänen, die für die Erkennung (d. h. Bindung) und Reaktion auf endogene Ligand-Signale verantwortlich sind. Es ist allgemein anerkannt, dass das Signal und das Ziel spezifische Domänen aufweisen, die an der Bildung der eigentlichen Kontaktpunkte beteiligt sind, die sich innerhalb des Komplexes aus endogenem Ligand und Ziel (EnL : T) finden. Jüngere Daten für das kristallisierte Wachstumshormon (GH) und seines Rezeptorkomplexes stellen eine detaillierte molekulare Information über Aminosäuren innerhalb des GH-Hormon- Liganden und seiner Ziel-GH-Rezeptor-interaktiven Domänen bereit.
Jüngere Daten über die Kristallstruktur von GH und seines Rezeptors zeigten, dass ein einziges GH-Molekül den gleichen Satz von Aminosäuren in einer jeden der zwei identischen GH-Rezeptor-Einheiten, die mit einem GH-Molekül komplexiert sind, kontaktiert [Cunningham und Wells, 1989; Cunningham et al., 1991; DeVos et al., 1992]. Jede der Rezeptor-Einheiten besitzt daher nur eine Zielstelle, die auf beiden Einheiten gleich ist. Jeder Rezeptor verwendet die gleichen 7 Aminosäuren für die Definierung der Bindestelle, die an der GH-Bindung und der für die Aktivität notwendigen Rezeptor-Dimerisierung beteiligt ist [Cunningham und Wells, 1989; Cunningham et al., 1991; DeVos et al., 1992].
Die Dimerisierung von wenigstens zwei Rezeptor-Untereinheiten durch monomere oder multimere Hormone ist für eine Rezeptor-Aktivierung in den meisten Fällen der bisher untersuchten Hormone erforderlich, wie Wachstumsfaktoren, einschließlich Nervenwachstumsfaktor (NGF), Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Interleukine (IL2, 4 und 6), Interferone und Insulin [DeFronzo, Bonadonna und Ferrannini, 1992; Bamborough, Hedgecock und Richards, 1994; Kishimoto et al., 1994; Claesson-Welsh, 1995]. In manchen Fällen sind die zwei Einheiten des Hormons sowie des Rezeptors genetisch nicht verwandt. In solchen Fällen stellt eine Untereinheit eine hoch-affine Hormonbindung und die andere eine intrazelluläre Signalweiterleitung bereit (z. B. Tyrosinkinase-Aktivität) [Ullrich et al., 1986; Kaplan, Martin-Zanco und Patrada, 1991; Kaplan et al., 1991; Klein et al., 1991; Argetsinger et al., 1993; Obermeier et al., 1993; Weiss, 1993]. In manchen Fällen kann der niedriger-affine Rezeptor bei einer Dimerisierung aktiviert werden [Ullrich und Schlessinger, 1990; Stahl und Yancopoulos, 1993; Claesson-Welsh, 1995].
Bei vielen Hormonen und Hormonrezeptoren ist nun bekannt, dass ein nicht- erwarteter und nicht-erahnter Grad an struktureller Homologie zwischen Untergruppen dieser Signale und Rezeptoren besteht, die homologe Familien bilden, die manchmal verschiedenen genetischen Evolutionslinien folgen. Andere funktionelle Ähnlichkeiten können als Ergebnis einer konvergenten Evolution herbeigeführt werden. In beiden Fällen scheinen die aktiven SD-Konformationen von Liganden und Rezeptoren manchen allgemeinen Prinzipien zu folgen. Jedoch waren für die Arzneistoffentdeckung die aus diesen Untersuchungen gesammelten Prinzipien nicht detailliert genug, um eine Kristallographie bestimmter Hormon/Rezeptor- Komplexe zu umgehen, damit genügend spezifische Information für die Ableitung der molekularen Gestalt von aktiven, kleinen organischen Molekülen gewonnen wird.
Die Entschlüsselung der bei einem Signal notwendigen Elemente, um einen Hormon-/Wachstumsfaktor-Rezeptor zu aktivieren, umfasste (1) Kristallbildung und -analyse bei < 3Å von Komplexen aus Rezeptor und endogenem Ligand, (2) den Einfluss auf die Funktion (d. h. Ligandbindung und Rezeptor-Aktivierung), verursacht durch molekularbiologische Mutagenese einzelner Aminosäuren oder durch Deletion/Austausch kurzer Peptide oder Chimärbildung der Hormon- und Rezeptor- Einheiten. Zusätzlich wurde die Bindung eines monoklonalen Antikörpers an die Oberflächendomänen, die verfügbar sind, falls der Ligand und der Rezeptor nicht- komplexiert sind oder sich in dem R : L-Komplex befinden, zusammen mit der Fähigkeit von Fab2 gegenüber Fab1, Rezeptor-Aktivierung zu aktivieren oder zu blockieren, in vitro, in situ oder in vivo untersucht.
Die vorstehend genannten Untersuchungen stellen in einer Zusammenschau Information bereit bezüglich (1) der Kontaktpunkte zwischen Hormon und Rezeptor, (2) der Menge an Bindeenergie bei diesen Kontaktpunkten, (3) der Aminosäuren außerhalb der Rezeptor : Ligand-Kontaktpunkte, die notwendig für eine globale Rezeptor/Ligand-Stabilität oder Dimer-Stabilität oder für eine Rezeptor-Signalisierungsaktivität sind (d. h. Tyrosinkinase, Bindung von anderen intrazellulären regulatorischen Faktoren, Internalisierung, Entkopplung für Effektorsystem).
Kritisch für die Identifizierung kleiner organischer Moleküle, die an Hormonrezeptoren aktiv sind, sind die Daten aus den vorstehenden Untersuchungen, die zeigen: (1) die Zahl an Einheiten/aktiver Komplex, (2) die Aminosäuren des Ziels, die spezifisch an der Bindedomäne mit dem endogenen Liganden beteiligt sind, und (3) die Aminosäuren des Liganden, die spezifisch an der Bindung und/oder Aktivierung des Ziels beteiligt sind. Von der gesamten vorstehenden Information ist das geschwindigkeitsbestimmende Ereignis heutzutage klar die Gewinnung ausreichend aufgelöster kristallographischer Daten von Hormon/Rezeptor-Komplexen. Jedoch sind Komplexe aus Rezeptor und Ligand häufig schwierig zu identifizieren und zu kristallisieren und verhindern so, dass Strukturinformation erhalten wird. Man weiß auch, dass die verschiedenen, vorstehend beschriebenen molekularen, biologischen, immunologischen, biochemischen und pharmakologischen Untersuchungen beträchtliche Zeit und Mühen erfordern. Dementsprechend sind Verfahren im Stand der Technik für die Identifizierung aktiver, kleiner organischer Moleküle langwierig und schwierig, wobei die Ergebnisse nicht vorhersagbar sind.
Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren ist es wichtig, dass strukturelle und biologische Daten erhalten werden, da jedes seine eigenen Grenzen und Artefakte aufweist. Auch Kontaktpunkte könnten spezifische Aspekte der Kristallbildung widerspiegeln, die nicht die Struktur des Proteins in situ wiedergeben oder der Kristall kann eine unangemessene Anzahl an Untereinheiten enthalten. Auf der anderen Seite schaffen die biologischen Daten Falsch-Positive und -Negative. Ferner können nicht alle Rezeptor- oder Ligandoberflächen immunogenetisch für einen Fab2- oder Fab1-Antikörper zugänglich sein, falls Antikörper für die Untersuchung der Bindestelle des Ziels eingesetzt werden. Ein weiteres Problem ist die Schwierigkeit der Untersuchung von allosterischen Stellen, die nicht direkt mit dem Signal-Liganden interagieren.
Trotz beträchtlicher Mühen war ein Hauptproblem bei der Arzneistoffentdeckung die Identifizierung kleiner organischer Moleküle, die zur Aktivierung von Peptidhormon-/Wachstumsfaktor-Rezeptoren fähig sind. Dies ist wahrscheinlich das Ergebnis der multivalenten Natur endogener Liganden für diese Rezeptoren und des Erfordernisses einer Dimerisierung oder gleichzeitigen Aktivierung vielfacher Bindungsstellen auf einem einzigen Rezeptor (Rezeptor-Untereinheiten) für eine Rezeptor-Aktivierung. Selbst für homodimere Rezeptoren wie dem GH-Rezeptor (GHR) ist die monovalente Bindung eines einzigen kleinen organischen Moleküls an die GHR-Stelle I nicht für eine Aktivierung ausreichend, noch für eine Verdrängung von Wachstumshormon aus seinem aktiven bivalenten Dimer-Rezeptor-Komplex.
Das Misslingen beim Auffinden einzelner kleiner organischer Moleküle in konventionellen Bindetests beruht auf der Tatsache, dass das markierte Hormon bivalent ist und dass seine Verdrängung aus zwei Rezeptor-Einheiten durch ein einziges monovalentes kleines organisches Molekül (d. h. Verbindungen, die zu einer bestimmten Zeit nur an ein Rezeptorziel binden) bei dem momentanen Bindetest thermodynamisch ungünstig ist. Ferner ist in einer großen Vielzahl aller Fälle der Rezeptor für ein bestimmtes Hormon ein Heterodimer. Somit können bei einem bestimmten Hormon- /Wachstumsfaktor-Rezeptor-Bindepaar wenigstens zwei verschiedene Bindestellen auf dem Ziel vorkommen, die auf der multimeren Natur des Ziels oder auf einem Ziel beruhen können, das aus allosterischen Stellen auf einer Monomer-Einheit besteht. In all diesen Fällen muss der endogene Ligand daher wenigstens eine ausreichende Anzahl an Bindestellen umfassen, die im richtigen Abstand liegen, um an die mehrfachen Stellen auf dem Ziel zu binden, die notwendig für eine Aktivierung sind. Offensichtlich wäre sodann ein multimeres oder multivalentes kleines organisches Molekül für eine Verdrängung dieser Hormone aus ihren Zielen erforderlich.
Unter Berücksichtigung der Komplexität, die für jedes kleine organische Molekül erforderlich ist, um mit dem Rezeptor an den vielfachen Stellen eine Bindung einzugehen, die notwendig für eine Aktivität sind, oder um den endogenen Liganden zu verdrängen, könnte man erwarten, dass das Auftreten eines einzelnen kleinen organischen Moleküls mit zwei zusammenhanglosen, jedoch aktiven Bindedomänen der Wahrscheinlichkeit eines Auffindens der einen, multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit eines unabhängigen Auffindens der anderen entsprechen würde. Da aktive kleine organische Moleküle durch zufällige automatisierte Tests mit einer Häufigkeit zwischen 1/1000 bis 1/10000 in den meisten Screens für Liganden aufgefunden werden, die nur eine Bindestelle auf dem Liganden erfordern und die entsprechend eine einzige Binde stelle auf dem Rezeptor besitzen, würde man annehmen, dass für die Identifizierung eines aktiven Moleküls organisch-chemische Bibliotheken mit 10&sup6; bis 10&sup8; Verbindungen gescreent werden müssen. Solche Bibliotheken übersteigen diejenigen, die in einem vernünftigen Test gescreent werden könnten und übertreffen sogar die meisten, die von selbst den größten pharmazeutischen Firmen hergestellt werden.
Daher ist ein anderes Verfahren für das Screening von kleinen organischen Molekülen erforderlich, die Hormonrezeptoren aktivieren können.
Es gibt nun eine Anzahl von Bibliotheken für das Screening derartig großer Zahlen. Zwei wurden bereits erwähnt, die Oligonukleotid- und Peptid-Bibliothek. Eine weitere derartige Reihe enthält natürliche Produkte.
Herkömmliche chemische Bibliotheken, bestehend aus synthetisch abgeleiteten kleinen organischen Molekülen, sind routinemäßig von gewerblichen Quellen verfügbar (z. B. Alldrich und Kodak) und bestehen aus mehr als 1-200 000 Entitäten. In jüngerer Zeit deckte eine Begutachtung der chemischen Entitäten in derartigen Bibliotheken etwa 100 000 chemische Strukturen als Kerne auf, auf denen die meisten der einzelnen Entitäten aufgesetzt waren. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Entität innerhalb derartiger Reihen beträgt zwischen 200 und 400 Dalton, was eine Erklärung für nicht mehr als eine solche Kontaktstelle pro Ziel sein würde.
Das Screening von Bibliotheken kleiner chemischer Verbindungen ist nur durch ihre Verfügbarkeit begrenzt, die am häufigsten < 100 000 beträgt.
Mit dem Aufkommen der Molekularbiologie und genetischen Klonierung und Sequenzierung fand man heraus, dass die meisten pharmazeutischen Ziele keine einzigartigen Entitäten zu sich selbst sind, jedoch in der Tat zu manchmal ziemlich großen und nahe verwandten Familien gehören. Die Erkennung dieses Umstands erforderte eine sehr viel nähere Betrachtung aller Mitglieder der Familie, zu der das untersuchte Ziel gehört, um Leitverbindungen zu identifizieren, die unter ihren Familienmitgliedern unterscheiden können. Falls man nur Bindetests als Primär- Screen für die Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität verwenden würde, wären affinitätsmarkierte Standards für ein jedes der Familienmitglieder erforderlich. Obwohl dies, falls die endogenen Ligand-Signale Proteine sind, aufgrund ihrer nativen Affinität und Einfachheit einer Markierung möglich wäre, ist es gegenwärtig nicht möglich, falls kleine organische Moleküle die einzig bekannten Signale sind. Dieses Verfahren ist auch für Ziele mit nicht-identifizierten Signal-Liganden ungeeignet. Eine Entdeckung dahingehend, wie derart breit gefächerte Spezifitätstests in primäre Binde-Screens aufgenommen werden können, würde stark die Wahrscheinlichkeit für einen Erfolg bei der Arzneistoffentdeckung erhöhen.
Die WO 91/10907 beschreibt ein Verfahren zum Screening auf Liganden mit einem niedrigen Molekulargewicht, die zur Bindung an einen natürlich vorkommenden Rezeptor fähig sind, und umfasst die Herstellung eines Sets aus einem oder mehre ren monoklonalen Antikörpern, die mit einem spezifischen Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten reagieren können, und das Screening für einen strukturellen Nachahmer mit einem niedrigen Molekulargewicht des Agonisten oder Antagonisten.
Die WO 91/19739 beschreibt ein multivalentes Antigen-bindendes Protein, umfassend ein erstes Fv-Fragment, das an wenigstens ein weiteres Fv-Fragment durch eine Verbindungsstruktur gebunden ist, die die Fv-Fragmente miteinander verknüpft, sie jedoch voneinander getrennt hält, so dass das Protein an benachbarte antigene Determinanten binden kann.
Die WO 92/01787 beschreibt eine einzelkettige variable Domäne, die ein synthetisches Analogen einer anderen einzelkettigen variablen Domäne eines Mitglieds einer Immunoglobulin-Familie oder -Superfamilie ist. In dem Analogon sind eine oder mehrere Grenzflächen-Aminosäurereste der Domäne im Vergleich zu der anderen Domäne verändert, wobei die geänderten Aminosäuren durch Reste ersetzt sind, die an analogen Positionen in einem Mitglied einer Immunoglobulin- Familie oder -Superfamilie auftreten, so dass das Analogon hydrophiler als die andere Domäne ist.
Die WO 92/06204 beschreibt Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Zellen mit unterschiedlichen Kombinationen von ersten und zweiten DNA-Sequenzen, kodierend für erste und zweite Polypeptide, die einen heteromeren Rezeptor bilden, wobei die heteromeren Rezeptoren auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert werden, vorzugsweise einer Zelle, die einen filamentösen Bakteriophagen wie M13 produziert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt Zusammensetzung und Verfahren für die Identifizierung aktiver Oberflächen biologisch aktiver Stellen von pharmazeutischen Zielen bereit. Die Identifizierung dieser Stellen ist für die Herstellung von Reagenzien einsetzbar, die für eine Verwendung in Screening-Tests auf kleine organische Moleküle geeignet sind, um diese als Kandidaten-Leitverbindungen zu identifizieren, die gewünschte Eigenschaften einer biologischen Aktivität, Spezifität, Selektivität und Affinität besitzen.
Erfindungsgemäß werden Reagenzien bereitgestellt, die für die Identifizierung aktiver Stellen auf pharmazeutischen Zielen geeignet sind. Die Reagenzien umfassen Bibliotheken aus variablen Regionen von Antikörpern, erhalten und modifiziert durch molekularbiologische Techniken, die für die Herstellung von rekombinanten Fab-Fragmenten (rVab) verwendet werden. Die Fab-Fragmente sind für das Abtasten der Oberfläche eines Ziels derart einsetzbar, dass die rVabs identifiziert werden, die eine gewünschte Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität und Selektivität besitzen. Die Eigenschaften der Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität und Selektivität werden zusammengefasst als "zusammengesetztes Aktivitätsprofil" (CAP) bezeichnet. Die rVabs, die hergestellt und erfindungsgemäß als die gewünschten GAP-Eigenschaften besitzend identifiziert werden, binden spezifisch an das Ziel (d. h. sind T&spplus;), sind selektiv für das Ziel (S&spplus;) und aktivieren das Ziel oder sind zur Aktivierung des Ziels in einer Kombination mit einem anderen Liganden (A&spplus;) fähig.
Durch Kombination von strukturellen Eigenschaften verschiedener Mitglieder der rekombinanten Antikörper-Bibliothek, die Aktivität an einem definierten pharmazeutischen Ziel besitzen, wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung einer Verbundstruktur bereitgestellt, die das gewünschte zusammengesetzte Aktivitätsprofil besitzt. Diese Verbundstruktur kann sodann für die Identifizierung kleiner organischer Moleküle eingesetzt werden, die zur Wirkung an der Zieloberfläche mit einer Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität mit der ausreichenden Spezifität und Selektivität fähig sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Liganden, die zur Bindung an aktive Stellen fähig sind und ein zusammengesetztes Aktivitätsprofil für ein bestimmtes pharmazeutisches Ziel besitzen, umfasst die Kombination von Mitgliedern einer rekombinanten Antikörper-Bibliothek mit einem an einen Reporter gekoppelten pharmazeutischen Ziel, wobei der Reporter zur Signalisierung der Aktivierung oder Hemmung des pharmazeutischen Ziels fähig ist. Reporter einer pharmazeutischen Aktivität umfassen in nicht begrenzender Weise Rezeptor- Kopplung an Modulatoren wie das G-Protein, die Oligomerisierung von Rezeptor- Untereinheiten, Veränderungen bei der enzymatischen Aktivität, wie der Kinase- Aktivität oder Veränderungen im Ionenfluss. Gemäß diesen Verfahren sind die einzelnen Mitglieder der Bibliothek, die eine gewünschte Aktivität, wie durch den Reporter gezeigt, besitzen, einzeln oder zusammen in darauffolgenden Tests für die Identifizierung kleiner organischer Moleküle verwendbar, die die gewünschte Aktivität an dem pharmazeutischen Ziel besitzen. Durch Kombination struktureller Merkmale, die vielfachen Mitgliedern der Bibliothek mit der gewünschten Aktivität gemeinsam sind, kann eine Verbundstruktur für eine Aktivität abgeleitet werden, die sodann für die Schaffung eines Modells für eine Verbindung eingesetzt werden kann, die die gewünschten Aktivitätseigenschaften besitzt.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Identifizierung kleiner organischer Moleküle bereitgestellt, die an den Zielstellen aktiv sind, umfassend das Screening möglicher Arzneistoffkandidaten in einem Bindetest auf ihre Fähigkeit, markierte, rVab-Mitglieder mit einem gewünschten zusammengesetzten Aktivitätsprofil, bestehend aus Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität für das pharmazeutische Ziel, zu verdrängen.
Kleine organische Moleküle als Kandidaten für Arzneistoffe können auch durch Analyse der Struktur des Modells, das von der Struktur von wenigstens zwei aktiven Mitgliedern der rVab-Bibliothek abgeleitet wurde, und Bestimmen der gemeinsamen Charakteristika, einschließlich in nicht begrenzender Weise Ladung und räumliche Orientierungen, die an der Bindung an die aktiven Stellen des pharmazeutischen Ziels teilhaben, identifiziert werden. Unter Verwendung des Modells können kleine organische Moleküle durch die Synthese von Verbindungen erhalten werden, die die gemeinsamen strukturellen Merkmale besitzen, die in dem Modell identifiziert wurden, oder sie können durch das Screening einer chemischen Dateien-Datenbank auf Mitglieder erhalten werden, die Merkmale besitzen, die auch das Modell aufweist.
Erfindungsgemäß werden auch Mittel zur Identifizierung struktureller Erfordernisse von Liganden bereitgestellt, die zur Bindung an pharmakologische Ziele fähig sind, umfassend vielfache Bindestellen auf einer oder mehreren molekularen Entitäten, die bei einer Bindung durch einen einzelnen Liganden fähig zur Aktivierung des pharmakologischen Ziels sind. In ähnlicher Weise werden erfindungsgemäß Mittel zur Identifizierung struktureller Erfordernisse von multivalenten Liganden bereitgestellt, fähig zur Aktivierung pharmakologischer Ziele, die Bindestellen umfassen, die zu groß für eine Besetzung durch ein monovalentes kleines organisches Molekül sind oder eine gleichzeitige Bindung eines multivalenten Liganden erfordern, um eine Oligomerisierung getrennter molekularer Entitäten für die Bildung eines aktiven pharmakologischen Ziels zu bewirken.
Erfindungsgemäß werden auch Reagenzien bereitgestellt, umfassend rekombinante Antikörper-Bibliotheken (rVabs), die für eine Kodierung von CSR- und CDR-Regionen mit spezifischen Variationen hergestellt wurden, wobei die CDR- und CSR- Regionen auf spezifischen identifizierbaren Gerüststrukturen exprimiert werden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Bibliotheken können in verschiedenen Formen verpackt werden, einschließlich Bakteriophagen, die die rekombinanten Antikörper auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Es ist daher eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren für die Identifizierung kleiner organischer molekularer Austauschstoffe bereitzustellen, die zur Modifizierung eines pharmazeutischen Ziels mit einem gewünschten zusammengesetzten Aktivitätsprofil fähig sind, umfassend eine ausreichende Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität und Selektivität für eine Abwägung als anfängliche Arzneistoffentdeckungs-Leitsubstanz.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Oberflächen eines pharmazeutischen Ziels, fähig zur Unterscheidung zwischen Mitgliedern einer Familie verwandter Ziele, die durch den gleichen oder ähnliche endogene Liganden aktiviert werden oder ähnliche Signal-Transduktionsmechanismen verwenden.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung aktiver oder regulatorischer Oberflächen eines pharmazeutischen Ziels, die von einem endogenen Liganden für das interessierende Ziel verwendet oder nicht verwendet werden können, und der nichtsdestotrotz fähig zur Modifizierung des pharmazeutischen Ziels in irgendeiner pharmazeutisch verwendbaren Weise ist.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung allosterischer Stellen auf dem pharmazeutischen Ziel, die nicht von endogenen Liganden verwendet werden und selbst keine Aktivität besitzen, sowie von allosterischen Stellen, die von endogenen Signalen verwendet werden, die zu dem pharmazeutischen Ziel-Aktivierungssignal verschieden sind und die selbst irgendeine Art von Aktivität aufweisen.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Bereitstellung eines Repertoires an Oberflächen-Erkennungsbibliotheken, die zusammen verschiedene pharmazeutische Zieloberflächen erkennen, wobei eine kleine Anzahl von kombinatorischen Antikörper-Bibliotheken hergestellt wird.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Umwandlung irgendeines nicht-markierten rekombinanten variablen Antikörperfragments (rVab), das aus einer Bibliothek isoliert wurde, durch ein einziges einfaches und schnelles Verfahren in ein markiertes Fragment, um als Reagenz zu füngieren, das zur Identifizierung kleiner organischer Moleküle fähig ist, die irgendeine oder eine Kombination der Eigenschaften einer Wirksamkeit, Aktivität, Spezifität oder Selektivität besitzen, zugleich beim Screenen von zufälligen chemischen Bibliotheken.
Ein Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung der spezifischen Binderegionen pharmazeutischer Ziele, die eine Bindung an Stellen in wenigstens zwei verschiedenen Bereichen für das Auslösen einer Reaktion des Ziels erfordern. Solche Bereiche können auf monomeren oder oligomeren pharmazeutischen Zielen vorkommen. Die endogenen Liganden für solche Stellen sind im allgemeinen multivalente monomere oder oligomere Proteine, die an die vielfachen Bereiche binden, die die aktive Oberfläche des pharmazeutischen Ziels definieren.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Identifizierung der strukturellen Erfordernisse für Liganden, um an die getrennten Bereiche zu binden, und für die Identifizierung solcher Liganden bereitgestellt. Durch die Kombination der Liganden, die zur einzelnen Bindung an die getrennten Bereiche in einem einzigen Molekül fähig sind, werden vollständig aktive Liganden bereitgestellt.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Identifizierung der monovalenten Determinanten, die die aktiven Oberflächen auf den Zielen für große Proteinsignale, wie Hormone und Wachstums- und Differenzierungsfaktoren aufbauen, die aus oligomeren Rezeptoren bestehen. Solche Rezeptoren können homologe oder heterologe Bestandteile enthalten, wobei eine oder mehrere dieser Einheiten einen Teil der Signalerkennungs-Determinante enthält.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Verwendung der chemischen Oligomerisierung kleiner organischer Moleküle für jede der vielfachen Bindestellen, um ein aktives Oligomer für große Proteine wie Wachstumsfaktoren und Hormone abzuleiten, die vielfache Bindestellen in ihren aktiven Bindedomänen enthalten.
Entsprechend ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe die Identifizierung kleiner organischer Molekül-Ersatzstoffe für große Proteinsignale wie Wachstumsfakto ren und Proteinhormone, wobei sie allosterische oder kompetitive Modifyer und monovalent oder multivalent sind.
Eine besondere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Identifizierung kleiner organischer Molekül-Austauschstoffe für pharmazeutische Ziele, die keine bioorganischen endogenen Liganden-Signale besitzen wie bestimmte Ionenkanäle, -pumpen und -austauscher.
Eine besondere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung von Bindetests mit einem großen Volumen, die zwischen agonistischen und antagonistischen kleinen organischen Molekül-Austauschstoffen unterscheiden.
Eine besondere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Befähigung, einzelne variable Regionen aus großen Antikörper-variable Region-Bibliotheken zu identifizieren, die sich gegenseitig in den Bindestellen unterscheiden, die eine Selektivität pharmazeutischer Ziele für spezifische Mitglieder einer Genfamilie verleihen.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Bereitstellung von markierten variablen Bereichen von Antikörpern, die mit der Aktivität von Zielen interagieren und diese verändern, die keinen identifizierten endogenen Liganden oder exogene natürliche Signale besitzen, wobei die markierten Liganden eine ausreichende Affinität für das pharmazeutische Ziel aufweisen, um in kompetitierenden Bindetests eingesetzt zu werden, bei denen kleine organische Moleküle um die Bindung mit den markierten Liganden kompetitieren können.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung einer Vielzahl verschiedener rekombinanter variabler Bereiche von Antikörpern, die wenigstens eine gemeinsame Bindestelle auf einem pharmazeutischen Ziel erkennen und gemeinsam strukturelle Information bereitstellen, die für die Schaffung aktiver kleiner organischer Moleküle verwendbar ist, die an dem pharmazeutischen Ziel aktiv sind.
Ein weiteres Ziel dieses Verfahrens ist die Bereitstellung eines allgemeinen Verfahrens für die rasche Gewinnung von Peptidstrukturen, die als SD-Modelle verwendbar sind, umfassend die Minimum-Charakteristika kleiner organischer Molekül- Austauschstoffe, die eine ausreichende Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität für eine Klassifizierung als brauchbare Entdeckungs-Leitsubstanzen besitzen.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Bereitstellung molekularer Modelle für aktive Liganden, wobei das für die Besetzung durch einen aktiven Liganden notwendige pharmazeutische Ziel eine oder mehrere Bindestellen auf einer oder mehreren molekularen Entitäten umfasst.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Befähigung, die kanonischen Strukturen des CDR VH3 von rekombinanten Antikörpern zu lösen, die dahingehend identifiziert wurden, dass sie die gewünschten Eigenschaften einer Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität besitzen.
Ein besonderes Ziel dieses Verfahrens ist die Befähigung, die zusammengesetzten strukturellen Charakteristika einsetzen zu können, um eine Syntheseleistung zu bestimmen, die zur direkten Synthese aktiver kleiner organischer Moleküle fähig ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1. Stufen des topographischen System-Tests (TSA). Fig. 1 zeigt die Aktivitäten und Produkte der drei Hauptstufen des TSA. Bei einer Kombination erlauben Stufe I und II oder Stufe I und III die Identifizierung kleiner organischer Moleküle (SOMERE), die an pharmakologischen Zielen (T) aktiv sind. Ein MULTIMER besteht wenigstens aus zwei SOMEREN, die kovalent miteinander für die Bildung eines aktiven Moleküls verbunden sind. Ein BEEP ist ein biologisch verstärktes, assembliertes Pharmakophor und Tn ist die Untereinheit n des pharmakologischen Ziels.
Fig. 2. Verwandte Antikörper-Strukturen und variable Region-Domänen. A. zeigt verschiedene Formen von Antikörper-Strukturen, einschließlich der variablen (V) und konstanten (C) Regionen von Immunglobulin (Ig)-schweren (H) und leichten (L) Ketten. Antikörper, die erfindungsgemäß durch molekularbiologische Verfahren hergestellt wurden, tragen das Präfix r. B. zeigt Details der Antigenerkennungsvariable Region (V)-Domänen von VL und VH. FW ist die "konstante" Gerüst- Region; "CDR" betrifft die komplementaritätsbestimmenden Regionen, wie definiert von Kabat (Kabat, 1991); CSR betrifft kanonische Strukturen, die sich in CDRs finden, wie ursprünglich definiert von Chothia (Chothia und Lesk, 1987); V (mit Leit sequenz), D (Diversität) und J (V/C-Verbindung) sind die Gene, die für die Schaffung der reifen VH- und VL-Gene kombiniert werden. V-Regionen werden über genetische Rekombination für VL mit einer kappa- oder lambda-konstanten Region verbunden. VH wird mit drei konstanten Regionen in einer Sequenz rekombiniert, wobei CH1 an VH gebunden wird. Die erfindungsgemäßen V-Regionen können ohne C-Regionen oder mit kappa oder lambda für CL und bis zu drei C-Regionen für CH verwendet werden.
Fig. 3. Mögliche planare, Hohlraum- und Gruben-Antikörper mit einer bekannten Kristallstruktur für die Herstellung der rVab-Bibliothek. Fig. 3 listet eine Reihe von Antikörpern auf, für die Daten betreffend ihre Kristallstruktur bekannt sind und die mögliche parentale Antikörper-Strukturen für die Herstellung der rVab-Bibliothek, wie erfindungsgemäß beschrieben, darstellen. Die Antikörper sind gemäß ihres Typs der Antikörper-Kombinationsstelle gruppiert: d. h. planare, Gruben- oder Hohlraum-Typ - Struktur.
Fig. 4. Vergleich der Diversifizierung von natürlichem Fab und der rVab-Bibliothek. A. Das Immun-Repertoire der Natur: V, D und J sind die Gene, die für die Erstellung des reifen V-Gens rekombiniert werden; rf* sind die Leserahmen des D- Gens, die für die Herstellung von Sinn-Proteinsequenzen bei Rekombination mit V und J verwendet werden können. CDR* bedeutet, dass es keine CSRs für die VH3- Region gibt. Die Anzahl an bekannten CSRs für jede CDR ist in Klammern angegeben. B. Das rVab-Repertoire: Eine Diversifizierung ergibt sich durch Verwendung aller Permutationen der bekannten CSRs, drei verschieden langer CDRH3 und durch Randomisierung von Aminosäuren an zwei Positionen innerhalb eines jeden CSR (oder CDRH3) in einer einzigen VH- und VL-parentalen Gerüststruktur. Primäre Randomisierungen erfolgen während der Herstellung von rVH und rVL (vgl. Fig. 7, 8) und erlauben, dass alle 20 essentiellen Aminosäuren an bestimmten Positionen in V-Regionen unter Mitgliedern der rVH- und rVL-Bibliotheken auftreten. CDRH3 sind drei bekannte CDRH3 mit einer unterschiedlichen Sequenz und drei verschiedenen Längen, die die VH-Aminosäurepositionen 95-120 abdecken (vgl. Text für Details). rVab wird durch ein rVHCH1- und ein rVLCL-Gen auf dem gleichen DNA-Stück kodiert. Die Gesamtheiten an CSR umfassen CSR und CDRH3-Kombinationen.
Fig. 5. Art und Diversifizierung von Aminosäuren an verschiedenen Positionen in der V-Region. Die Nummerierung der Aminosäure (AS)-Positionen erfolgte gemäß Kabat (Kabat, 1991). Die Bibliothek-Diversifizierung identifiziert die Kandidat-Aminosäureposition mit einer hohen Priorität für eine Primärbibliothek-Diversifizierung während der Herstellung von rVH.lib und rVL.lib, wie erfindungsgemäß beschrieben.
Fig. 6. CDR und kanonische Strukturen (CSR) von V-Regionen. Bestimmte Aminosäuren (Ein-Buchstaben-Code) an V-Gen-Positionen, die kritisch für bestimmte CSR sind, sind gemäß Chothia angegeben (Chothia und Lesk, 1987). * stellt Aminosäuren dar, die nicht innerhalb von CSR oder CDR liegen, die an der Definition des CSR teilhaben. Die Diversitätsposition ist die Aminosäureposition, die für eine Primär-Bibliotheks-Randomisierung verwendet wurde, wie erfindungsgemäß beschrieben.
Fig. 7. Herstellung der rVLCL-Bibliothek von diversifizierten kanonischen CSRs: rVLCL.Lib. A-F sind sequenzielle Schritte bei dem Verfahren für die Herstellung von rVL.lib. G ist der letzte Schritt in der Rekombination von rVL.Lib mit einem rCL für die Bildung von rVLCL.Lib. Aminosäurepositionen sind in Klammern angegeben; Nukleotidpositionen sind von links nach rechts als 5'-3' in runden Klammern angegeben; Restriktionsstellen (rs) erscheinen auch in Klammern und tragen ein "p"-Präfix, um zu kennzeichnen, falls sie in dem Plasmid und nicht in der V-Region liegen. Restriktionsstellen sind durch Kombinationen von Buchstaben und Zahlen angegeben. Die Primer-Richtung ist durch einen Pfeil dargestellt (links bedeutet Vorwärts (FWD)- und rechts bedeutet reverser (BCK) Primer. * bezeichnet mehr als eine Aminosäure an einer CSR-Position, die für einen bestimmten CSR kritisch ist; A bedeutet, dass eine Diversifizierung durch Randomisierung von Aminosäuren im CSR oder CDR eintrat. Lib-Suffixe deuten auf eine Bibliothek mit vielen einzelnen Mitgliedern hin. Eine fette Linie deutet an, dass das Produkt (einzelne Entität oder Bibliothek) in das Plasmid pCLONALL (pC) Moniert wurde.
Fig. 8. Herstellung der CSR- und CDRH3-diversifizierten rVHCH1.Lib. Herstellung von CSRH1 und H2 und drei CDRH3 mit unterschiedlichen Längen (d. h. 5, 7 oder 10 Aminosäure-Insertionen); Diversifizierung durch Aminosäure-Randomisierung und Kombination von CSR und CDRH3 bei allen möglichen Permutationen ist in einer Weise dargestellt, die zu der für rVLCL.Lib beschriebenen analog ist (vgl. Legende zu Fig. 7).
Fig. 9. Plasmide für eine allgemeine Verwendung. A. zeigt die Sequenz von Restriktionsstellen (rs), die in der Klonierungsstelle von pCLONALL auftreten. Die Verwendung einer jeden bei der Herstellung von rVH.Lib und rVL.Lib ist angemerkt, wobei "---" eine Restriktionsstelle bezeichnet, die von der parentalen AK- Sequenz verwendet und definiert wurde; X bezeichnet eine Restriktionsstelle, die nicht bei dieser bestimmten Herstellung von rV.lib verwendet wurde. Allgemeine Positionen von Restriktionsstellen in den rV- und rC-Regionen während der Herstellung sind gezeigt. JCH und JJCL sind die natürlichen J/C-Gen-Rekombinationsregionen, wobei umfasste Aminosäurepositionen in Klammern angegeben sind. JCLINK ist die Position der J/C-Rekombinations-Restriktionsstelle, die auch als rs3 bezeichnet wird. B. Herstellung der rC-Regionen tragenden Plasmide und letzter Schritt der Herstellung von rVab.Lib, wobei rV-Regionen an rC-Regionen angebracht werden. Die zwei dafür erforderlichen Plasmide sind als pVxACCEPTORs aufgelistet. C. Plasmide, die für die Herstellung von Expressionsvektoren für die rVHCH1- und rVLCL-Ketten des rVab ohne Bindung an das Phagen-Hüllprotein gpIII verwendet wurden. EK ist die Enterokinase-Spaltstelle. ISOTAG ist die zusätzliche Aminosäuresequenz, die für eine Isolierung und Markierung von rVab als rVab-Reporter-Konstrukte verwendbar ist.
Fig. 10. Allgemeine Primer-Tabelle. Die Primer sind in 5'-3' dargestellt. Die Zahlen und einzelnen Buchstaben bezeichnen einzelne Aminosäurepositionen, die in den Primern entsprechende Triplet-Kodon-Sequenzen für die Aminosäure an diesen Positionen wären. Der Buchstabe N in runden Klammern bezeichnet das zufällige Auftreten der Nukleotide A, T, U, C, die für eine Randomisierung der Aminosäure an dieser Position eingesetzt wurden. Buchstaben ohne runde Klammern werden für Sequenzen verwendet, die für eine gewünschte CSR- oder CDRH3-Struktur notwendig sind; Zahlen werden für Sequenzen verwendet, die für die CSR- oder CDRH3-Struktur nicht kritisch sind, rs ist eine Sequenz einer Restriktionsstelle. Sequenzen für alle FWD-Primer sind zu der Sinn-Sequenz komplementär. Ungefähre Primer-Größen in Nukleotiden sind als #mer aufgelistet. Die Säule auf der rechten Seite kennzeichnet die allgemeine Verwendung eines Primers bei der Aminosäure-Randomisierung; SEQ. bedeutet Sequenzierung.
Fig. 11. Konstrukte für CRE-LOX-rekombinatorische Bildung von rVab.lib: Teil I. Expression von rVab mit oder ohne gebundene zufällige Octamer-Peptid (Pep 8)- Bibliothek. Fig. 11 zeigt die Schritte bei der Herstellung der notwendigen Phagemid- und Plasmid-Konstrukte, um eine in vivo-Rekombination von einzelnen rVHCH1.lib- und rVLCL.lib-Mitgliedern durch die Cre-Rekombinase zu erlauben und zeigt die Herstellung eines einzelnen Phagemids mit einem rVHCH1- und rVLCL-Mitglied auf einem DNA-Stück (d. h. ein rVab). Dieses Verfahren wird für die Herstellung von rVab.lib verwendet, falls es bei dem TSA-Entdeckungsverfahren nicht notwendig ist, darauffolgend mehr als ein zufälliges Octamer-Peptid (Pep8.Lib) an rVab anzufügen. Wildtyp (wt)- und mutante (511) loxP-Stellen sind wie in der Legende zu Fig. 12 definiert. Lpe1B und LgpIII sind Leitsequenzen für pelB und gpIII.
Fig. 12. CRE-LOX-Plasmid- und Phagemid-Sequenzen, die für die Herstellung von rVab.lib verwendet wurden. Für die Verwendung bei der Herstellung von rVab.lib durch in vivo-CRE-Rekombinase-gerichtete Rekombination von rVHCH1 und rVLCL auf einzelne Phagemide, besteht das darauffolgende Erfordernis in dem TSA-Verfahren für das Anbringen von nicht mehr als einer zufälligen Peptid-Bibliothek an rVab.
Fig. 13. Konstrukte für CRE-LOX-rekombinatorische Bildung von rVab.lib: Teil II. Expression von rVab mit oder ohne einer oder zwei gebundenen zufälligen Octamer (Pep 8)-Peptid-Bibliotheken. Schritte bei der Hinzufügung von Pep8.lib; i) zeigt die Expression eines Peptids (PEP1at) am Amino-Terminus von VH (Pap81at); ii) zeigt die Expression eines Peptids am Carboxy-Terminus von CL (Pep1ct), und iii) zeigt die Expression eines Peptids am Amino-Terminus von VH (Pep81at) und eines Peptids am Carboxy-Terminus von VL (Pep82ct). Schritt E zeigt die Verwendung von zwei Primern, die für das Anbringen von Pep8.lib an VH oder CL erforderlich sind.
Fig. 14. In vivo-Herstellung und -Expression von rVab-lib-Mitgliedern. Die Herstellung von rVL und rVH-Genpaaren (rVab) als ein DNA-Molekül sowie die Expression und die Präsentation durch einen Phagen (Phage-Display) von rVab, das an Hüllproteine von fd gebunden ist, ist dargestellt. Die Synthese von rVHCH1- und rVLCL-Proteinen und ihre Komplexierung für die Bildung von an gpIII gebundenem rVab für einen Phage-Display ist dargestellt, wobei Zellen wie Bakterien, die Infektion von Bakterien mit einem rVLCL-tragenden Phagen und die Transformation mit das rVHCH1-Konstrukt tragenden DNA-Plasmiden und die in vivo-Rekombination von rVHCH1 und rVLCL in einen einzigen fd über die LOX-Sequenzen und die durch P1 bereitgestellte CRE-Rekombinase gezeigt ist. Nach einer Rekombination und Replikation wird ein kombiniertes, einzelnes exprimierbares Paar von rVab- Genen pro Phage verpackt. Bei einer Induktion wird rVLCL hergestellt und über seine Leitsequenz in den periplasmatischen Raum eingebracht, wo seine Komplexe unter reduzierten Bedingungen mit synthetisiertem rVHCH1-gpIII-Hüllprotein den gewünschten rVab-Komplex bilden, der an das gpIII-Phagen-Hüllprotein gebunden ist (vgl. Text für Details).
Fig. 15. Flussdiagramm der Diversifizierungs- und Vereinfachungswege des TSA. Schritte sind gezeigt für eine Optimierung der TSA+-Eigenschaften von rVabs für ein bestimmtes pharmakologisches Ziel. Die Bibliothek-Eigenschaften sind Wirksamkeit einer Bindung an das Ziel (T), Spezifität und Selektivität für das Ziel (S) und Regulation der Zielaktivität (A). "+" bezeichnet, dass die Eigenschaft in dem rVab-Mitglied auftritt.
Fig. 16. Isolierung von Ziel (T+)-spezifischem/selektivem (S+) rVab. A. Isolierung durch Panning für Zielerkennung (Bindung) (T+). B. Isolierung durch Panning für Zielspezifität und/oder Selektivität (S+). Isolierung von T+ und S+ rVab kann in irgendeiner Reihenfolge erfolgen und bei einer gemeinsamen Verwendung werden rVabTS+-Mitglieder isoliert. T bezeichnet das pharmakologische Ziel; φ-Phage präsentierte rVab; com-T-pep stellt die Entität, das Gesamtziel, die Untereinheit oder das Peptidfragment dar, das von dem Ziel unterschieden werden soll. Bindung an das com-T-pep verhindert die Bindung von rVabs&supmin; an Matrix gebundenes T.
Fig. 17. Selektion von rVab-Scannern für aktive Zieloberflächen, die von Signalen mit einzelnen Bindestellen verwendet werden. Fig. 17 zeigt ein Flussdiagramm des TSA-Verfahrens, wobei rVabTSA+-Mitglieder aus einer rVab-Bibliothek isoliert werden, die zuvor als T+S+ identifiziert wurde. T, S und A sind in der Legende zu Fig. 15 definiert. Das native Signal ist die endogene oder zuvor identifizierte Agonisten- Entität (z. B. Protein, Peptid, Neurotransmitter), die das Ziel durch Interaktion an einer einzelnen Bindestelle aktiviert (vgl. Text für Details). Der allosterische Effektor ist eine endogene oder zuvor identifizierte Entität, die an eine einzelne Bindestelle auf dem Ziel bindet, die eine Agonisten-Aktivität modifiziert, selbst jedoch keine Aktivität besitzt. rVabA+ werden durch Kompetition durch ein natives Signal oder eine allosterische Veränderung in T durch einen allosterischen Effektor isoliert, der eine normale Bindung von rVabTS+ an T verhindert. Die Bindung von rVabTS+A--Mitgliedern wird nicht durch die Gegenwart des allosterischen Effektors oder nativen Signals beeinträchtigt und wird daher nicht frei in dem Überstand während dieses Verfahrens isoliert.
Fig. 18. Entdeckung von SOMEREN für ein Ziel mit einer einzigen univalenten aktiven Stelle. Fig. 18 zeigt die Schritte des TSA-Verfahrens der rVab-Scanner zu Reporter-Konversion und die Verwendung des Reporters bei kompetitiven Bindetests für die Identifizierung von aktiven SOMEREN für das pharmakologische Ziel. Die kompetitiven und allosterisch aktiven SOMERE werden in diesem Verfahren identifiziert.
Fig. 19. Identifizierung und Isolierung von aktivem rVabTSA+ für den Muscarin- Acetylcholin-Rezeptor-Subtyp ml (AChRm1). (s) bezeichnet Matrix gebundenes Weizenkeim-Agglutinin; T, S und A entsprechen der Definition in der Legende zu Fig. 15; R bezeichnet das Rezeptorziel; G bezeichnet Guanin-Nukleotid-Bindeprotein; RG bezeichnet RG-nicht-kovalenter Komplex; φ bezeichnet einen Phagen, der rVab präsentiert. Das TSA-Verfahren für die Isolierung von rVab, basierend auf der Spezifität/Selektivität (vgl. Fig. 16), ist für die Isolierung von AChRm1 rVabSm1+ unter Verwendung von Agonist-ähnlichem rVabT+A+ (Typ 1 rVabTA+) gezeigt. Das gleiche Verfahren wird für die Isolierung von partieller Agonist-ähnlichem, allosterischer Agonist-ähnlichem und kompetitiver Agonist-ähnlichem S+ rVabTA+ eingesetzt (d. h. jeweils Typ 2, 3 und 4 rVabTA+).
Fig. 20. Isolierung von aktivem rVabTSA+ für komplexe aktive Stellen auf dimeren Rezeptorzielen (T1-2). Fig. 20 zeigt das TSA-Verfahren, durch das das rVab-Paar für jeden Teil der aktiven Stelle auf einem jeden der zwei Rezeptor-Ziel-Untereinheiten (T1 oder T2) isoliert wird. Das Verfahren ist vollständig für ein Mitglied des Paars gezeigt, das für die Region der aktiven Stelle auf T1, und ist für die Region der aktiven Stelle auf T2 dupliziert. m-T bezeichnet Matrix gebundenes Ziel; com-T-Rezeptor bezeichnet com-T-pep, wie in Fig. 16 beschrieben. φ bezeichnet durch einen Phagen präsentiert. Pep8.Lib ist die zufällige Octapeptid-Bibliothek, die als Fusionsprotein mit Phagen-Hüllprotein gpIII präsentiert wurde. Pep8T&sub2;+ ist die Bibliothek von Peptiden, die an T2 binden. rVabT1-Pep8T2.Lib ist die rVabT1S+.Lib, an die die Pep8T2+ Lib angefügt wurde (vgl. Fig. 12 und 13 für Details der Herstellung von rVab-Pep.Lib). Eine Vorauswahl von T2+ Pep8.Lib ist nicht erforderlich und eine zufällige Pep8 Lib kann in diesem Verfahren eingesetzt werden. Ein Testen für rVabS+ ist optional und kann an jedem Schritt in dem Verfahren erfolgen. Das verwandte rVabT2m+S+A+-Pep8T1+-Mitglied des aktiven Domänenpaars wird in einer parallelen, analogen Weise erhalten.
Fig. 21. Einsatz von aktivem bivalenten rVabT1-Pep8T2 für ein Screenen von Disomer-Verdrängern eines multivalenten Signals. Fig. 21 zeigt ein Flussdiagramm der Schritte des TSA, bei dem jedes rVab-Mitglied des aktiven Paars von rVab-Pep8 für beide Domänen der aktiven Stelle, die auf getrennten T-Untereinheiten auftreten, für ein Auffinden eines DISOMER-Ersatzes für das native Signal verwendet werden, das die Ziel-Aktivität reguliert. [A+] bezeichnet, dass die rVab-Pep-Entität bei der Regulation des T1-2 dimeren Ziels aktiv ist. A* bezeichnet, dass das rVabTS+-Mitglied von einer rVab-Pep-Entität, die [A+] ist, abgeleitet ist. DISO- MERmn bezeichnet kovalent gebundene SOMERE für das Paar von Domänen der aktiven Stelle, das durch die gepaarten rVabTSA*-Mitglieder identifiziert wurde.
Fig. 22. Zusammenfassung der Entdeckung von DISOMEREN für ein bivalentes Hormon.
Fig. 23. Flussdiagramm von TSA-Schritten bei der Schaffung und Verwendung eines biologisch verstärkten assemblierten Pharmakophors (BEEP).
Fig. 24. Das TSA-Verfahren für das Auffinden und In-Beziehung-Bringen von Sätzen an Oberflächeneigenschaften von rVabTSA+ für die Schaffung eines BEEP.
Fig. 25. Das TSA-Verfahren für die Auffindung der Oberfläche, die allen aktiven rVabTSA+-Scannern für eine aktive Stelle eines Ziels gemeinsam ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Identifizierung von Liganden bereitgestellt, die zur Identifizierung von aktiven Stellen auf pharmakologischen Zielen fähig sind. Erfindungsgemäß werden rekombinante Antikörper, die kombinierte Eigenschaften einer Wirksamkeit (Affinität), Selektivität, Spezifität und Aktivität besitzen, als Reagenzien verwendet, die für die Modellierung aktiver Liganden und für die Identifizierung kleiner organischer Moleküle verwendbar sind, die auch diese Eigenschaften und daher eine Verwendbarkeit als Arzneistoff-Leitverbindungen oder therapeutische Verbindungen aufweisen.

I. Erfindungsgemäß identifizierte pharmakologische Ziele

Pharmakologische Ziele können Rezeptoren für endogene oder andere Liganden sein, die eine physiologische Reaktion durch die Zellen auslösen, auf denen die Rezeptoren vorkommen. Neben Rezeptoren können die pharmakologischen Ziele Ionenkanäle, Transportproteine, Adhäsionsproteine wie N-CAM oder irgendeine andere physiologische regulatorische Oberfläche sein, die für eine Identifikation durch die rekombinanten Antikörper zugänglich ist und durch einen spezifischen Liganden aktiviert wird. Eine nicht-erschöpfende Liste beispielhafter physiologischer Liganden für die aktive Oberflächen durch Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen identifiziert werden können, sind in Beispiel 4 aufgeführt.
Rezeptoren können diejenigen für Neurotransmitter, Hormone, Wachstums- oder trophische Faktoren, modulatorische Peptide, Ionen oder andere Reste, die als Signal-Liganden für das pharmakologische Ziel wirken, umfassen. Bevorzugte nicht- erschöpfende Beispiele von Neurotransmitter- und Peptid-Rezeptoren, für die aktive Oberflächen identifiziert werden können, umfassen die für Acetylcholin, d. h. nikotinisch, und die verschiedenen Formen der Muscarin-m1-5-Rezeptor-Subtypen, adrenerge Rezeptoren, einschließlich α&sub1;, α&sub2;, β&sub1;, β&sub2;, dopaminerge Rezeptoren, einschließlich D&sub1;, D2a, D2b, D&sub3;, D&sub4; und D&sub5;, Serotonin-Rezeptoren, einschließlich 5- HT1, 5-HT1A-D, 5-HT&sub2;, 5-HT&sub3; und 5-HT&sub4;, Benzodiazepin-Rezeptoren, Opioid-Rezeptoren, einschließlich δ, κ und u und andere. Ebenfalls bevorzugt sind Rezeptoren für Hormone und Wachstumsfaktoren, die z. B. die Rezeptoren für Insulin, Wachstumshormon, Erythropoietin, neurotrophische Faktoren, einschließlich in nicht- begrenzender Weise Nervenwachstumsfaktor, ziliärer neurotrophischer Faktor, vom Gehirn abgeleiteter neurotrophischer Faktor, NT-3 und NT-4 umfassen können. Rezeptoren für Cytokine wie Interferone und Interleukine sind ebenfalls bevorzugt, genauso wie Rezeptoren für Nicht-Peptid-Hormone wie Schilddrüsenhormon und Glukokortikoide. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, können in an sich bekannter Weise angepasst werden und allgemein für die Identifizierung der spezifischen Bindeoberflächen anderer pharmakologischer Ziele genauso eingesetzt werden.
Andere Zieloberflächen, für die aktive Liganden identifiziert werden können, umfassen extrazelluläre, intrazelluläre, nukleare oder mitochondriale lösliche oder Membran-assoziierte Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren oder Kom plexe davon, die eine Rolle bei einem physiologischen oder pathophysiologischen Prozess spielen, der eine vorhersagbare Indikation umfasst, für die man gerne eine auf einem Arzneistoff basierende Therapie hätte.
Die erfindungsgemäßen pharmakologischen Ziele sind physiologische Moleküle oder Kombinationen von Molekülen, assoziiert durch kovalente oder nicht-kovalente Kräfte, die allein oder in Kombination mit anderen Molekülen eine physiologische oder therapeutische Reaktion auslösen, falls sie durch einen Liganden, der an die "aktive Oberfläche" des pharmakologischen Ziels bindet, aktiviert werden. "Aktive Oberfläche" bedeutet die Region des pharmakologischen Ziels, die ungeachtet eines Vorkommens von nativen endogenen Liganden für diese Stellen einen Liganden binden kann und diese Bindung in eine physiologisch bedeutsame Reaktion übersetzen kann, die charakteristisch für das Ziel ist. Falls die Reaktion die Oligomerisierung von wenigstens zwei getrennten molekularen Entitäten durch einen Liganden erfordert, ist eine Bindung an die aktive Oberfläche auf nur einer der molekularen Entitäten für eine Auslösung der physiologischen Reaktion nicht ausreichend.
Die aktive Oberfläche besteht aus spezifischen Atomen oder anderen chemischen Resten, die an der Bindung des Liganden an das pharmakologische Ziel teilhaben, z. B. durch einen Beitrag zu Veränderungen an der Enthalpie oder Entropie. Die aktive Oberfläche des pharmakologischen Ziels kann klein sein, fähig, von einem einzigen monovalenten Liganden gebunden zu werden, der ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 Dalton besitzt, oder sie kann groß sein, wobei ein multivalenter Ligand für die Bindung an eine Vielzahl von Bindestellen erforderlich ist, die zu der aktiven Oberfläche beitragen. Vielfache Bindestellen können in einer größeren Bindedomäne in einer einzigen Region des pharmakologischen Ziels auftreten. Alternativ können vielfache Bindestellen als getrennte nicht-benachbarte Regionen auftreten, die von einem Liganden gebunden werden können, der zur Überbrückung des pharmakologischen Ziels fähig ist, um gleichzeitig an die verschiedenen Bindestellen des Ziels zu binden. Zusätzlich können Bindestellen auf zwei oder mehr molekularen Entitäten auftreten, die gleich oder verschieden sein können und eine Oligomerisierung durch Bindung an einen multivalenten Liganden erfordern.
Wachstumsfaktoren (GF), einschließlich NGF, EGF, FGF, Interleukine (z. B. IL2, 4, 6), Interferone, Insuline und viele andere extrazelluläre Biosignale enthalten offen bar gemeinsam mit ihren jeweiligen Rezeptorzielen vielfache Ziel-Binde stellen. Solche Proteinsignale sind 20-1000 kDalton groß und treten als Monomere, Homo- oder Heterodimere oder komplexere Multimere auf, die Oberflächenbereiche von Zehntausenden von Å² umfassen. Schätzungen des Oberflächenbereichs derartiger endogener Liganden und Rezeptoren, die durch ihre Assoziierung okkludiert sind, belaufen sich auf 500-1600 Å². Durch die vorstehend genannte Definition besitzt jeder Ligand ≥2 Bindestellen und jeder Rezeptor > 2 entsprechende Bindestellen, die gegenseitig diskontinuierlich und nicht-überlappend sind.

II. Verwendung von rekombinanten rVab-Antikörpern als Scanner für die Identifizierung aktiver Oberflächen

Erfindungsgemäß werden aktive Oberflächen durch Herstellung und Verwendung eines ausreichend großen Repertoires von diversen Liganden identifiziert und charakterisiert, die zur "Abtastung" der Oberfläche pharmakologischer Ziele und Bindung an ihre aktiven Oberflächen fähig sind. Eine Bestätigung der Bindung an aktive Oberflächen erfolgt erfindungsgemäß durch Aufzeichnung einer Veränderung der Funktion des pharmakologischen Ziels oder durch Aufzeichnung einer biochemischen oder biophysikalischen Veränderung, die die Bindung und/oder Aktivierung des pharmakologischen Ziels oder des Rezeptors auf dem Ziel beschreibt.
Antikörper besitzen die meisten der vorstehend genannten erforderlichen Eigenschaften und können rekombinant verändert werden, so dass sie einzigartige Eigenschaften erhalten, die für eine erfindungsgemäße Verwendung erforderlich sind. Man weiß, dass es Antikörper gibt, die neutralisierend und somit per Definition antagonistisch sind, dadurch, dass sie die Bindung des Signals an den Rezeptor oder die Rezeptor-Aktivität kompetitiv oder allosterisch verhindern.
Antikörper-Epitope in Proteinzielen sind von wenigen Aminosäuren bis etwa 20 Aminosäuren groß und decken Hunderte bis Tausende Å² an Zieloberfläche ab. Zusätzlich können Epitope sequenzielle oder nicht-benachbarte Gruppen von Aminosäuren umfassen. Jedoch ist es gleichermaßen bekannt, dass Antikörper organische Epitope erkennen können, die viel kleinere Volumina aufweisen (d. h. < 50-200 Å²), wie diejenigen, die am häufigsten mit kleinen organischen Haptenen (d. h. Dinitrophenol oder Morphin) assoziiert sind. Da die Antikörper-Affinität und -Selektivität bei großen und kleinen Epitopen gleich sein kann, vermutet man, dass anti-Ziel-rVab-Antikörper Erkennungsoberflächen haben werden, die all diese Dimensionen abdecken.

A. Verwendung von rVab-Bibliotheken

Das Repertoire verschiedener Liganden für das erfindungsgemäße Abtasten des pharmakologischen Ziels wird durch eine Antikörper-Bibliothek bereitgestellt, umfassend rekombinante Fab-Fragmente oder Teile davon, die für die Bereitstellung eines ausreichend großen Repertoires verschiedener, identifizierbarer Strukturen hergestellt wurden, von denen manche erwartungsgemäß an das pharmakologische Ziel binden und dieses abhängig davon, ob eine gleichzeitige Bindung an vielfache Stellen erforderlich ist, aktivieren. Diese aktiven Antikörper werden als spezifische Mitglieder einer Bibliothek identifiziert, von der man annehmen kann, dass sie die gesamte Oberfläche des pharmakologischen Ziels abtastet und das gewünschte zusammengesetzte Aktivitätsprofil für die Bindestelle besitzt. Erfindungsgemäß werden die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper als "rVab" bezeichnet, um anzudeuten, dass sie mit Hilfe rekombinanter Verfahren hergestellt werden und als Bibliotheken angefertigt werden, die verschiedenartige Aminosäuresequenzen in einer oder mehreren Regionen des Antikörpers einbauen, die mit einer Zielerkennung oder -bindung assoziiert sind.
Falls das pharmakologische Ziel vielfache Bindestellen auf einer molekularen Entität umfasst oder eine Oligomerisierung von wenigstens zwei Molekülen für die Bildung einer einzigen Bindestelle erfordert, wobei die einzelnen Untereinheiten dazu beitragen, oder eine Oligomerisierung von zwei oder mehr molekularen Entitäten erfordert, die jeweils an den Liganden an einer unterschiedlichen Stelle binden, wird eine Aktivität nur unter Verwendung von Antikörpern beobachtet werden, die erfindungsgemäß so modifiziert wurden, dass sie wenigstens eine zusätzliche, getrennte Binde-Entität enthalten. In dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die getrennte Binde-Entität wenigstens eine zufällige Sequenz von Aminosäuren mit einer Struktur, die dazu geeignet ist, um an eine Bindestelle zu binden, die nicht von der variablen Region des Antikörpers gebunden wird. In manchen Fällen wären zwei solche zufälligen Sequenzen von Aminosäuren erforderlich, obwohl vorgesehen ist, dass zusätzliche Sequenzen auch erforderlich sein könnten. Zusätzliche Bindestellen auf rVab können auch durch mehr oder weniger komplizierte, auf einem Protein basierende Strukturen bereitgestellt werden, einschließlich kleinere Peptide, größere Proteine, umfassend intakte Enzyme oder sogar einen anderen Antikörper, in Strukturen, die in der Literatur beschrieben sind, wie Diabodies (Winter et al., 1994). Zusätzliche Peptidsequenzen, die verwendet werden könnten, um zusätzliche Bindestellen anzufügen, sind vorzugsweise zwischen etwa 5 und 30 Aminosäuren lang. Insbesondere sind solche Sequenzen zwischen etwa 6 und 12 Aminosäuren lang. Am besten enthalten solche Sequenzen 8 Aminosäuren.
Ein Antikörper, der als Erkenner der Bindestelle identifiziert wurde, wird zugleich oder in einer Sequenz weiter durch Bestimmung seiner Selektivität und Aktivität für das pharmakologische Ziel charakterisiert. Um ein rVab-Selektionsverfahren für mehr als eine Zieleigenschaft rationell zu gestalten, können die Charakterisierung der Zielspezifität (T) und Tests der Aktivität (A) zugleich erfolgen.
Die Reihenfolge der Isolierung von Vab für A&spplus; und S&spplus; kann variiert werden, am häufigsten in Abhängigkeit davon, welche Eigenschaft für ein Auffinden unter den Entitäten, die das interessierende Ziel modifizieren, am schwierigsten ist. Zum Beispiel könnte, falls die Selektivität unter stark homogenen Zielmitgliedern einer einzigen Familie die entscheidende, fehlende Eigenschaft bestehender Stoffe ist, S+ zuerst bestimmt werden oder könnte nach Isolierung der Population, die A+ ist, isoliert werden.
Obwohl Antikörper, die die Gestalt des Ziels derart erkennen (d. h. binden), dass sie seine Funktion modifizieren, einen kleinen Prozentsatz derjenigen ausmachen, die zur passiven Erkennung des Ziels fähig sind (d. h. sie modifizieren seine Aktivität nicht), ist ihr Auftreten aufgrund der Größe und Diversität der erfindungsgemäßen rVab-Bibliothek wahrscheinlich. Zusätzlich würde man auch erwarten, dass aktive Antikörper vorkommen, die die zusätzliche erwünschte Eigenschaft einer Spezifität für das Ziel aufweisen. Ferner umfasst eine erfindungsgemäße Ausführungsform, dass die biologischen Koffer (d. h. Phagen oder Bakterien), die für die einzelne Packung eines jeden rVab-Bibliothek-Mitglieds eingesetzt werden, ihre Wiedergewinnbarkeit nach einem biologischen Replikationszyklus erlauben, selbst wenn sie in der ursprünglichen Bibliothek in seltenen Kopien vorkommen.
Die Erfindung nutzt jüngere Fortschritte in der Molekularbiologie, die die Schaffung und Manipulierung von ausreichend großen und diversen V (VH und/oder VL)-Region-Bibliotheken, zusammen mit einer Minimierung und direkten Sekundär-Diversifizierung ihrer CDRs und CSRs erlauben, um zu ermöglichen, dass aus gewählte rVabs bei einer Markierung als Reporter und Affinitäts-Selektoren in Tests, die mögliche aktive Liganden identifizieren, füngieren. Solche aktiven Liganden sind vorzugsweise kleine organische Moleküle, die als Arzneistoff-Leitverbindungen oder selbst als Therapeutika verwendbar sind.

B. Verwendung von rVab-Mitgliedern für die Identifizierung kleiner organischer Molekül-Austauscher (SOMERE)

Wenigstens zwei Verfahren werden für die Identifizierung von SOMEREN bereitgestellt, basierend auf der Identifizierung der rekombinanten Antikörper (rVabs), die die Eigenschaften von T (Spezifität/Wirksamkeit), S (Selektivität) und A (Aktivität) besitzen. Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese [rVab T+S+A+] Scanner (Abtaster) in Reagenzien für eine Widergabe des Auftretens anderer Liganden umgewandelt, die an die aktive Stelle auf dem pharmakologischen Ziel binden können. Eine Umwandlung zu Reportern erfolgt durch Markierung der aktiven Scanner mit einem nachweisbaren Marker. Die Reporter-rVab-Fragmente können sodann in klassischen Kompetitions-Bindetests für die Identifizierung von SOMEREN eingesetzt werden. Für einfache aktive Oberflächen stellen einzelne SOMERE aktive, kleine organische Moleküle dar, während für komplexe aktive Oberflächen mit mehr als einer Ligand-Bindestelle entsprechende Anzahlen von SOMEREN, die wie erfindungsgemäß beschrieben, aufgefunden werden, kovalent miteinander verbunden werden, um die aktiven kleinen organischen Moleküle darzustellen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden SOMERE identifiziert, basierend auf den kollektiven Eigenschaften eines Ensembles von aktiven rVab-Scannern, die als T+, S+ und A+ charakterisiert wurden. Man erwartet, dass durch Bereitstellung eines ausreichend großen Repertoires an Antikörpern vielfacher Antikörper mit diesen erwünschten Bindeeigenschaften identifiziert werden. Gemeinsame strukturelle Merkmale dieses Ensembles an Scannern mit den gewünschten CAP-Eigenschaften werden sodann für die Herstellung eines Modell- Liganden für die Bindung an die aktive Oberfläche eines pharmakologischen Ziels eingesetzt. Durch die Kombination struktureller Merkmale vielfacher Antikörper, die als aktiv für ein spezifisches pharmakologisches Ziel identifiziert wurden, können biologisch verstärkte Ensemble-Pharmakophore ("BEEPS"), d. h. Arzneistoff- Modelle abgeleitet werden, die sodann für die Identifizierung kleiner organischer Moleküle als Arzneistoff-Leitverbindungen oder Therapeutika verwendet werden können. Dieses molekulare Modell, BEEP, dient dann als Basis für das Screenen chemischer Datenbanken für eine Identifizierung von SOMEREN, z. B. durch elektronisches Screening verfügbarer chemischer Datenbanken, oder es dient als Basis für ein rationales Arneistoff-Design für eine Synthese von SOMEREN, die erwartungsgemäß die kombinierten Eigenschaften von Spezifität/Wirksamkeit, Selektivität und Aktivität besitzen. Dies löst das Problem im Stand der Technik eines Zugangs zu allen Verbindungen in einer chemischen Datenbank, verringert die für ein Screening notwendige Zeit und die Menge an notwendiger Arbeitskraft und könnte ein Screening beseitigen, falls es für die Steuerung einer chemischen Synthese für die Schaffung von SOMEREN eingesetzt würde.

III. Rekombinante Antikörper-Bibliotheken stellen ausreichend große Repertoires an verschiedenen Liganden für die Identifizierung aktiver Oberflächen bereit

A. Funktion der rekombinanten Bibliothek

Die erfindungsgemäßen Gegenstände werden durch ein Verfahren bereitgestellt, durch das kombinatorische Repertoire-Bibliotheken variabler Regionen (VH und/oder VL) rekombinanter Antikörper (rVab) für ein Abtasten der Oberfläche eines pharmakologischen Ziels erstellt und sodann getrennt und/oder in einem Batch-Verfahren verwendet werden, um diejenigen zu identifizieren und auszuwählen, die ein gewünschtes Wirksamkeits-, Spezifitäts-, Selektivitäts- und Aktivitätsprofil besitzen. Diese vier Eigenschaften werden hier zusammen als Verbindungs-Aktivitätsprofil (CAP) definiert. Mitglieder der Bibliothek mit den gewünschten Eigenschaften werden sodann gemäß der erkannten lokalen Oberflächendomäne gruppiert. Man erwartet durch Verwendung einer ausreichend großen und diversen Bibliothek, wie hier beschrieben, dass im wesentlichen die meisten, wenn nicht alle relevanten aktiven Oberflächen pharmakologischer Ziele unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierbar sein sollten. Zusätzlich sollte aufgrund der rekombinanten Herstellung der Bibliothek in einer zufälligen Art und Weise und aufgrund ihrer Auswahl in vitro eine Erkennung von Stellen, die anderweitig nicht als nicht-eigen oder antigen oder immunogen nachgewiesen würden, bei Verwendung der in dieser Erfindung beschriebenen rVab-Bibliothek auftreten.
Zusätzlich werden die erfindungsgemäßen Gegenstände, die eine Entdeckung der dreidimensionalen Form von Oberflächenbereichen betreffen, durch die Verwendung der erfindungsgemäßen aktiven rVabs als Reporter der Zielstruktur bereitgestellt. Wie nachstehend beschrieben, werden diese rVab-Reporter unter Verwendung von VH- und VL-Domänen hergestellt, wobei die CDR-Regionen, die diversifiziert werden können, in einem Gerüst eines Ig (oder Fab) mit einer dreidimensionalen Struktur enthalten sind, von der durch Kristallographie bestimmt wurde, dass sie CDR5 besitzt, die die bekannten kanonischen Strukturen (CSRs) enthalten. Eine solche strukturelle Information über rVabs für eine gegebene abgegrenzte aktive Ziel-Oberflächendomäne erlaubt die molekulare Auflösung und Ableitung der essentiellen Elemente der starren organischen Struktur der Konstellation von kritischen Aminosäuren, die die aktiven Zieloberflächen-Erkennungsteile des Ensembles an aktiven rVabs darstellen, und stellt so die essentiellen Elemente der starren organischen Struktur von aktiven SOMEREN bereit, die mit Spezifität an dieses Ziel binden können und es modifizieren können.
Die Herstellung des BEEP erfordert die Bestimmung durch PCR der Aminosäuresequenzen von rVab CDR, CSR und manchen Gerüst-Resten in diesen aktiven Oberflächen-Scannern durch ein Verfahren, das Computer und genetische Algorithmen verwendet. Es ist auch möglich, dass mit ausreichend großen genug aktiven rVabs die gemäß der vorstehenden Weise erhaltene Information die Auflösung der aktiven Oberfläche der Ziele erlauben wird. Dieses Verfahren stellt die erfindungsgemäßen Gegenstände bereit, die ein elektronisches Screening für SOMERE durch eine Kombination von gemeinsamen Strukturelementen in Computerpaketen betreffen, genannt biologisch verstärkte Ensemble-Pharmokophore (d. h. BEEPS).
Die erfindungsgemäß eingesetzten rekombinanten Antikörper bieten auch eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik von typischen markiertes Ziel- Reporter-Bindetest-Screens. Eine Verbesserung umfasst die Gewinnung mit Hilfe der rekombinanten Molekularbiologie von Antikörpervariablen Regionen (V) in ausreichenden Zahlen mit einer ausreichenden Affinität und gewünschten Aktivität für eine Identifizierung der Mitglieder der Bibliothek, die als Oberflächen-Reporter füngieren, fähig zur Erkennung aktiver Zieloberflächen, Modulation des Ziels durch diese Erkennungsstellen und Unterscheidung seines Ziels von nahe verwandten Zielen (Selektivität).

B. Größe der rekombinanten Bibliothek

Für eine ausreichende Wahrscheinlichkeit einer Identifizierung der aktiven Oberfläche eines pharmakologischen Ziels enthält die rekombinante Bibliothek vorzugsweise wenigstens zwischen etwa 100&sup9; und 10¹&sup4; Entitäten. Vorzugsweise enthält die Bibliothek zwischen etwa 10¹&sup0; und 10¹³ Entitäten. Am bestens enthält die Bibliothek etwa 1012 Entitäten. Die spezifische Größe der Bibliothek, die für die Bereitstellung einer vernünftigen Wahrscheinlichkeit für die Identifizierung der aktiven Stelle erforderlich ist, wird von dem Gesamt-Oberflächenbereich der Zieloberfläche und dem Oberflächenbereich der zu identifizierenden Bindedomänen abhängen. Die Oberfläche der meisten Ziele beträgt 50 000-100 000 Å², wobei jede Liganden- Bindedomäne etwa 100-200 Å² bis etwa 1000-2000 Å² umfasst. Da jeder rVab nur etwa 20-40 Å² des Oberflächenbereichs abdeckt, sind etwa 2000 rVabs notwendig, um das Ziel abzudecken, wobei wenigstens der zehnfache Wert davon (2 · 10&sup4;) überlappende Erkennungsdomänen erlaubt. Eine weitere Erhöhung von zwei Größenordnungen (2 · 10&sup6;) erlaubt geeignete Oberflächen-Interaktionen, die eine spezifische Agonisten- oder Antagonisten-Wirkung schaffen. Eine weitere 100-fache Erhöhung erlaubt eine Wiedergewinnung derartiger rVabs aus der Bibliothek bei einer Batch-Analyse. Eine weitere 10&sup4;-10&sup4;-fache Erhöhung erlaubt Nanomolar-Affinitäten und Agonisten-Aktivität. Dementsprechend besitzen die bevorzugten Oberflächen-Scanning-Bibliotheken etwa 10¹² Entitäten.
Man weiß, dass Antikörper die Fähigkeit besitzen, zwischen nahe verwandten Zielen zu unterscheiden. Dementsprechend werden rekombinante Bibliotheken mit einer ausreichenden Anzahl an Entitäten erfindungsgemäß durch Herstellung von rekombinanten Bibliotheken erreicht, umfassend variable Regionen von leichten (L) oder schweren (H) Ketten oder von beiden, die modifiziert oder nicht modifiziert sind und die gegebenenfalls in Kombination mit einer konstanten Region exprimiert werden können. Diese Bibliotheken können nicht nur während ihrer ursprünglichen Schaffung selektiv variiert werden, sondern auch nach der anfänglichen Selektionsrunde für irgendeine oder alle der drei zusammengesetzten Profilaktivitäten einer Zielbindung, Selektivität und Aktivität. Eine derartige zusätzliche Sekundär-Diversifizierung sowie Sekundär-Vereinfachung kann durch Kombinationen von auf Primern passierender PCR oder Oligonukleotid-Insertion an geeigneten Restriktionsstellen erfolgen. Ferner können die Sekundär-Veränderungen in einer jeden der 6 CDRs (d. h. die drei in VL und die drei in VH) oder in irgendeiner bestimmten Kombination davon oder an einem einzigen Ort liegen.
Variabilität wird in die CDRs durch Modifikation der CDRs eingebracht, um zufällige Aminosäuresubstitutionen an Positionen zu enthalten, die an einem Kontakt mit dem Ziel beteiligt sind. Die Positionen der Variation, einschließlich einer weiteren Diversifizierung oder Vereinfachung, sind vorzugsweise diejenigen innerhalb des CDR, die nicht die CSR-Struktur dieser Region verändern und die bekannt sind. Die Anzahl an zu diversifizierenden Aminosäurepositionen ist von der gewünschten Anzahl an aktiven rVab-Mitgliedern, die erhalten werden soll, abhängig. So kann, falls eine nicht-ausreichende Anzahl an Mitgliedern identifiziert wird, die Diversifizierung der Bibliothek durch Diversifizierung zusätzlicher Aminosäurepositionen in einem CDR, wie nachstehend beschrieben, erhöht werden.
Unter Berücksichtigung, dass es 20 natürlich vorkommende Aminosäuren gibt, führt eine Diversifizierung an einer einzigen Aminosäureposition zu etwa 20 unterschiedlichen möglichen Antigen-Binde (Berührungs)-stellen. Durch die Diversifizierung an zwei Aminosäurepositionen in einer jeden der drei VL CSR, 2 VH CSR und in dem einen VH CDRH3, die zufällig in VH : VL-Paare erfindungsgemäß kombiniert werden, erhält man eine Diversität in der rVab-Bibliothek von ≥10¹&sup8; Mitgliedern (vgl. Fig. 4). Da eine gegebene Phagen-Bibliothek etwa 1 · 10¹&sup4; Mitglieder verpacken kann, werden mehrere Bibliotheken vorzugsweise hergestellt und in Phagen verpackt, um die gesamte Population von diversifizierten Mitgliedern zu enthalten. Obwohl es bevorzugt ist, zwei Aminosäuren in jedem CDR, wie in Fig. 6 gezeigt, zu diversifizieren, sind andere Kombinationen möglich. Eine Randomisierung in nur manchen der CSRs und in einem CDR erlaubt Bibliothek-Größen von nahezu 1012, so dass eine Phagen-rVab-Bibliothek mehrfache Kopien eines jeden diversifizierten Mitglieds enthalten könnte. Zusätzlich können drei oder mehr nicht-essentielle Aminosäuren in einem bestimmten CDR diversifiziert werden (vgl. Fig. 5 in Bezug auf nicht-essentielle Aminosäuren), vorzugsweise mit einer entsprechenden Verringerung der Diversifizierung von Aminosäuren in anderen CDRs, um die Gesamtgröße der Bibliothek in einer erreichbaren Zahl zu halten. Man kann sich unter Verwendung von z. B. Bakteriophagen als Vektoren Bibliotheken mit 4 · 10¹² Mitgliedern nähern. Eine einzelne erfindungsgemäße rVab-Bibliothek mit wenigstens etwa 10¹² Mitgliedern, unabhängig davon, wie die Diversität erhalten wird, stellt genügend Oberflächen-Sonden mit dem Minimum-CAP am Ziel bereit, um eine Identifizierung der meist interessierenden aktiven Oberflächen zu erlauben.
Ein erfindungsgemäßer Vorteil gegenüber den Screening-Verfahren im Stand der Technik ist, dass die gesamte verfügbare Oberfläche des Ziels für aktive Oberflä chen abgetastet wird und aktive Oberflächen-Reporter bereitgestellt werden. Dies erlaubt die Identifizierung von aktiven Stellen und SOMEREN für Ziele ohne endogene Signale (endogener Ligand) und an Zieloberflächen, die nicht von natürlichen endogenen Liganden verwendet werden, jedoch zu einer Modulation dieses Ziels führen. Die letzteren Oberflächen, als allosterische Oberflächen bezeichnet, gehören zwei Typen an: denjenigen ohne Aktivität bei fehlender Bindung des endogenen Liganden an das Ziel (d. h. kryptische allosterische Stellen) und denjenigen, die selbst Aktivität besitzen und immer noch zur Modifizierung der Wirkung eines endogenen Liganden fähig sind (d. h. aktive allosterische Stellen). Es ist offensichtlich, dass mit der Größe der Zieloberfläche, die untersucht wird, die Wahrscheinlichkeit für ein Auffinden von geeigneten aktiven Oberflächen steigt. Da Kontaktoberflächen für einen endogenen Liganden möglicherweise etwa 10% des Gesamt- Ziel-Oberflächenbereichs darstellen, erhöht eine Einbindung allosterischer Oberflächen stark den zu untersuchenden Oberflächenbereich.
Die Verwendung rekombinanter Bibliotheken stellt auch ein Mittel für eine Verminderung oder Erhöhung der Anzahl an komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) in der variablen Domäne des rVab bereit, die notwendig dafür sind, dem rVab gewünschte GAP-Eigenschaften zu verleihen. So kann man ein minimales aktives CDR-Komplement erhalten. Alternativ dazu kann eine Randomisierung in einem großen Maßstab von bis zu den meisten der Aminosäuren in der rVab CDRHS-Domäne für eine Erhöhung der Population an aktiven rVab eingesetzt werden, aus der der beste rVab-Reporter identifiziert werden soll. Zum Beispiel kann, falls die anfänglich durchsuchte Bibliothek keine Mitglieder mit der ausreichenden Konstellation von GAP-Eigenschaften enthält, eine Sekundär-Diversifizierung der besten Kandidaten durch eine Reihe von Verfahren einschließlich PCR und bekannter verschiedener in vivo- und in vitro-Mutagenese-Systeme und ein darauffolgendes Recycling durch die ursprünglichen Identifizierungs- und Selektionsverfahren, die nachstehend beschrieben sind, erfolgen, um einen rVab gegen das Ziel mit einer vollständigen Zusammenstellung des gewünschten GAP zu finden, der zu selten gewesen sein könnte, um in der ursprünglichen rVab-Bibliothek gegen das Ziel aufgefunden zu werden. Zusätzlich kann man durch Identifikation und Sequenzierung aktiver rVab CDR-Komplemente auch eine genaue und detaillierte strukturelle Information erhalten, die für eine Modellierung der notwendigen Elemente aktiver SOMERE, d. h. z. B. bei BEEPS, verwendbar ist.

C. Affinität rekombinanter Antikörper

Die erfindungsgemäßen rVab werden für den Nachweis und die Charakterisierung aktiver Stellen durch Bereitstellung von Information bezüglich ihrer Struktur und/oder für eine Funktion als Reporter in Kompetitionstests für eine Identifizierung von SOMEREN eingesetzt. Dementsprechend sollte die Affinität der erfindungsgemäß verwendbaren rVabs eine oder beide Funktionen ermöglichen. Falls der rVab nur für den Nachweis und die Charakterisierung der aktiven Bindestelle oder für die Entwicklung eines BEEP eingesetzt wird, kann seine Affinität hoch sein und eine niedrige Dissoziationsrate (d. h. Halbwertszeit der Dissoziierung, vorzugsweise zwischen etwa 5 und 30) wäre geeignet. Jedoch sollte die Affinität der für die Identifizierung von SOMEREN für ein pharmakologisches Ziel verwendbaren rVabs nicht so hoch sein, dass sie eine Dissoziation und Kompetition in Kompetitionstests verhindert. Vorzugsweise beträgt diese Affinität etwa 0,01 bis etwa 100 nM. Insbesondere beträgt die Affinität etwa 0,1 bis etwa 30 nM. Noch besser beträgt die Affinität etwa 0,5-10 nM. Am besten beträgt die Affinität etwa 1-5 nM.

D. Charakterisierung von Ligand- und Ziel-Bindestellen

Bindedomänen auf einem Signal werden als Ligand-Bindestellen (LIGATTS) bezeichnet und diejenigen auf dem Ziel als Ziel-Bindestellen (TARGATTS). Falls beide in der Natur ein Protein sind, können beide als der Oberflächenbereich der Entität definiert werden, der aus benachbarten (z. B. Aminosäuren n und n±1) oder nicht-benachbarten (z. B. Aminosäuren n und i, wobei i nicht n±1 ist) Elementen besteht, die räumlich so begrenzt sind, dass sie zugänglich sind und sich zur gleichen Zeit mit der Oberfläche des anderen Partners in dem Komplex in Kontakt befinden, um zu der Bindeenergie dieser Interaktion beizusteuern. Bei vielfachen Bindestellen, gemäß unserer Definition, bildet jede TARGATT-Domäne Kontaktpunkte mit Aminosäuren auf dem Signal und man würde nicht annehmen, dass ein SOMER zwei LIGATTS umfasst. Falls die endogenen Liganden keine Proteine sind, würden andere Verbindungs-Bildungsblöcke die Aminosäure als Einheit- Entität ersetzen.
Die Größen von LIGATTS und TARGATTS sind ziemlich variabel. Wir haben TARGATTS zufälligerweise auf das Volumen begrenzt, das von einem kleinen synthetischen organischen Molekül-Austauscher (d. h. SOMER) mit weniger als etwa 1 kD umfasst sein kann. Diese TARGATT-Größe ist von praktischer Bedeutung und wird von der Bindestelle des Opiat-Rezeptors für seinen 30 Aminosäuren-endogenen Liganden, Endorphin, gebildet, die leicht an Morphin (< 600 D) und alle pharmazeutisch bekannten Opiat-Analgetika mit nM-Affinität bindet und durch deren Bindung vollständig aktiviert wird. Die Identifizierung und Charakterisierung größerer TARGATTS ist erfindungsgemäß umfasst, da solche Stellen von Mitgliedern der erfindungsgemäßen rVab-Bibliotheken erkannt werden sollten.

E. Assoziierung der Aktivität A&spplus; mit der Bindung von rVab

Ein wichtiges erfindungsgemäßes Merkmal ist, dass die rVabs, die dahingehend identifiziert wurden, dass sie die gewünschten CAP-Eigenschaften und insbesondere Aktivität an einem Ziel besitzen, für die Schaffung einer Verbindung zwischen Bindung an ein Ziel und Aktivität an diesem Ziel füngieren. Entsprechend kann, sobald ein rVab identifiziert wurde, der T&spplus; und A&spplus; ist, dieser rVab sodann für die Identifizierung anderer Liganden, basierend nur auf Kompetitions-Bindetests, eingesetzt werden, die auch T&spplus; und A&spplus; sind.
Mehrere Verfahren sind für die anfängliche Bereitstellung einer Verknüpfung zwischen Bindung und Aktivität eines rVab verfügbar. In einem bevorzugten Verfahren ist eine aktive Oberfläche für ein Ziel mit einer sekundären biochemischen Reaktion assoziiert, die bei der Bindung eines aktiven Liganden an die aktive Oberfläche nachgewiesen werden kann. Derartige biochemische Reaktionen umfassen Veränderungen in der Affinität des Liganden oder der allosterischen Liganden, Oligomerisierung mit anderen Untereinheiten, den Phosphorylierungszustand, Ionenfluss, usw. Zum Beispiel können, wie nachstehend genauer beschrieben, die Veränderungen der Agonisten-Affinität eines an ein G-Protein gekoppelten Rezeptors, basierend auf dem Auftreten eines Guanin-Nukleotids, die notwendige Verknüpfung zwischen Bindung und Aktivität bereitstellen.
Rezeptoren können auch, wie in der US-PS 4,859,609 beschrieben, als Fusionsproteine exprimiert werden, umfassend die Ligand-Bindedomäne des Rezeptors in Fusion mit einem "Reporter"-Polypeptid, das eine messbare Veränderung der Konformation oder der Funktion durchläuft, falls die aktive Ligand-Bindedomäne des Rezeptors an einen Agonisten oder Antagonisten bindet.

IV. Verfahren zur Identifizierung von SOMEREN

Das Verfahren zur Gewinnung kleiner organischer Moleküle (SOMERE), die an pharmakologischen Zielen aktiv sind, umfasst zusammenfassend die nachstehenden Schritte (vgl. Fig. 1):
Stufe I (a): Herstellung der Scanning-rVab-Bibliothek.
Stufe I (b, c): Identifizierung von rVabs, die an das Ziel binden und dieses aktivieren. Falls das Ziel eine multivalente Stelle ist, die eine Bindung an zwei Stellen erfordert, werden unter Verwendung von rVab-Peptid-Scannern für einen Nachweis der Aktivität rVab-Paare identifiziert.
Stufe II: Verwendung markierter rVabs als Reporter für einen Nachweis von SOMEREN oder MULTIMEREN (d. h. DISOMERE).
Stufe III: Schaffung von BEEPS aus der Zusammenstellung der Strukturinformation, die von rVabTSA+ abgeleitet wurde, für ein Screening oder für die Synthese von SOMEREN oder MULTIMEREN.

A. Herstellung der Scanning-rVab-Bibliothek (Stufe 1a)

Molekularbiologische Verfahren werden für die Herstellung einer begrenzten Anzahl von großen kombinatorischen Bibliotheken aus rekombinanten Antikörpern (rVab-Bibliotheken) eingesetzt, wobei die CSRs und CDRH3 von VL und VH in jeder Bibliothek in einem einzigen Ig-VH- bzw. VL-Gerüst auftreten, gegebenenfalls gebunden an ihre jeweilige konstante Region (CH1 und CL). Ein Antikörper, dessen Struktur durch Kristallographie bestimmt wurde, wird vorzugsweise für die Bereitstellung des Gerüsts für die Herstellung dieser rVab-Bibliotheken verwendet. Antikörper mit einer nicht-bestimmten Struktur können auch für die Herstellung der Bibliothek und die Identifizierung von aktiven rVabs (d. h. Stufe 1 a, b, c, Fig. 1) eingesetzt werden, die als Reporter-rVabs für einen Nachweis von SOMEREN und anderen MULTIMEREN (Stufe II, Fig. 1) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind. Jedoch können nur Antikörper mit einer bestimmten Struktur für die Herstellung von BEEPS (Stufe III, Fig. 1) verwendet werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Antikörper mit einer aufgelösten Struktur für die Schaffung der ursprünglichen rVab-Bibliothek verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden ein oder zwei der isolierten aktiven rVabs für ein bestimmtes Ziel sodann kristallisiert und die Struktur bestimmt, um ihre Verwendung in Stufe III zu erlauben. Das Letztere ist hilfreich, da es die Verwendung der neu publizierten Sequenzen der menschlichen VH- und VL-Gene für die Arbeit in Stufe III ermöglicht [Tomlinson et al., 1992; Williams und Winter, 1993; Cox, Tomlinson und Winter, 1994; Nissim et al., 1994; Tomlinson et al., 1994].
In allen Fällen besitzen die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten rVab-Bibliotheken eine ausreichende Anzahl an diversen Mitgliedern, um ein immunologisches antigenes Repertoire zu umfassen, das sich dem natürlichen im Mensch annähert, oder sie werden aus menschlichen VH- und VL-Genen [Roitt, 1991; Nossal, 1993; Griffiths et al., 1994] hergestellt, die eine enorme Diversität von Oberflächen erkennen können, einschließlich in nicht begrenzender Weise Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide und organische Haptene.
Es gibt grundsätzlich drei Quellen für Gene für eine Verwendung als Startmaterial für eine Herstellung der rVab-Bibliotheken.
a) die publizierten Daten über klonierte und sequenzierte Antikörper;
b) die Antikörper-Klone selbst, die von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hybridomen, Milzzellen, bakteriellen und Pflanzenzellen, Hefen und Viren, auf verschiedenen DNAs, einschließlich Plasmiden, Phagmiden, Chromosomen getragen werden; und seit jüngster Zeit
c) die veröffentlichten Sequenzen eines menschlichen Repertoires von VH- und VL-Genen [Roitt, 1991; Tomlinson et al., 1992; Nossal, 1993; Williams und Winter, 1993; Cox, Tomlinson und Winter, 1994; Griffiths et al., 1994; Nissim et al., 1994; Tomlinson et al., 1994].
Die meiste Sequenzinformation ist in wenigstens zwei Datenbanken verfügbar, d. h. der Brookhaven-Protein-Datenbank und der Datenbank von Kabat am NIH (die auch in einer Textform verfügbar ist [Kabat et al., 1991]. Die Struktur der Mehrzahl der kristallisierten Antikörper ist auch von der Brookhaven-Protein-Datenbank verfügbar. Listen derartiger kristallisierter Antikörper sind in Beispiel 1 aufgeführt. Ein Beispiel eines Antikörpers, der für die Bestimmung seiner Struktur kristallisiert wurde, ist in Tulip et al. beschrieben (Tulip et al., J. Mol. Bio. (1992), 227 : 149- 150).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Antikörpersequenz zuerst erhalten und ist die Startstelle für die Herstellung der rVab-Bibliothek, wobei die nachstehenden Schritte für die Herstellung der rVab-Bibliothek eingesetzt werden. Die Reihenfolge der Schritte kann für eine Anpassung an bestimmte Umstände variiert werden.
I. Selektion parentaler Fabs mit einer bekannten Kristallstruktur als rVab- Bibliothek-Gerüst-Matrizen
II. Herstellung der Nukleinsäuren, die für die schweren und leichten Ketten (rVHCH1 und rVLCL) von ABXXX rVab.lib kodieren
Schritt 1 (a): Herstellung des 5'-VL-Bereichs
Schritt 2: Diversifizierung durch PCR
Schritt 1 (b): Herstellung des MIDVL-Abschnitts
Schritt 1 (c): Herstellung des 3'-VL-Abschnitts von rVL
Schritt 3: Ligation
III. Herstellung der konstanten Regionen von ABxxx
IV. Herstellung von rVHCH1.lib (Fig. 8)
Herstellung der 5'-Hälfte der VH-Region
Herstellung der 3'-Hälfte der VH-Region
V. VH- und VL-Bibliothek-Größen:
VI. Herstellung der rVab.lib (die VHCH1lib · VLCLlib-kombinatorische Bibliothek) (Fig. 11, 12, 14)
Schritt 4: In vivo-Rekombination von VHCH1- und VLCL-Genen
Details für die einzelnen Schritte für eine Expression der rVLCL. 1.6 und rVHCH1.L.b durch CRE-LOX-rekombinatorische Bildung
VI. Schritt 5: Phagen-Bildung und Display der rVab.lib auf den Phagen-Oberflächen (Fig. 14)
Die entscheidenden Schritte sind in den Fig. 7, 8, 11 und 14 gezeigt, die jeweils die Herstellung von rVLCL- und rVHCH1-Bibliotheken, ihre Paarung zu der rVab-Bibliothek und schließlich ihre Expression in einer Bindung an die Oberfläche von Phagen als funktionelle Komplexe beschreiben.
Die Herstellung der rVLCL- und rVHCH1-Bibliotheken folgt einem ähnlichen Schema:
a. eine begrenzte Anzahl von Oligonukleotiden mit passenden Restriktionsstellen wird synthetisiert, die beide Enden und in einem Fall die mittlere Domäne der V-Region abdecken.
b. die Oligonukleotide werden ligiert.
c. PCR wird für das Anhängen fehlender und verbindender Regionen und für die Bereitstellung der Mittel einer Randomisierung von Aminosäuren an definierten Positionen eingesetzt.
d. die vollständigen rVH- und rVL-Bibliotheken werden an geeignete konstante Domänen ligiert, wobei eine Bibliothek in ein Plasmid und die andere in ein Phagmid gesetzt wird.
e. die rVH- und rVL-Bibliotheken werden in vivo durch die CRE-LOX-Rekombinase rekombiniert, die durch Co-Infektion mit P1 bereitgestellt wird.
Gemäß diesem Schema werden rVab-Bibliotheken mit etwa 10¹² Mitgliedern hergestellt.
In anderen Ausführungsformen:
a. die VH- und VL-Gene ohne konstante Regionen, die für einen Antikörper mit einer bekannten Struktur kodieren, werden durch PCR kloniert, um die Sequenzen zu erhalten, die für die VHCH1- und VLCL-Bereiche der Igs kodieren, wobei bekannte Verfahren eingesetzt werden.
b. die Vs können sodann durch PCR verändert werden, um ungewollte Restriktionsstellen zu entfernen und um günstige Restriktionsstellen zu schaffen, die die CSR- und CDR-Domänen eingrenzen.
c. selektiv randomisierte Oligonukleotide mit geeigneten End-positionierten Restriktionsstellen können für einen Austausch jeder der 6 CDR-Regionen eingesetzt werden, die geeignete passende Restriktionsstellen in dem V-Grundgerüst besitzen, um eine direktionale Klonierung zu ermöglichen. Diese Oligonukleotide variieren in der Länge (d. h. n, n+1 und n+2), um mit dem bekannten CSR und manchen Längenänderungen in CDRH3 übereinzustimmen, und enthalten alle Aminosäuren an einer oder zwei Positionen innerhalb eines jeden CDR, die am häufigsten an einem Antigen-Kontakt beteiligt sind.
In der bevorzugten und in einer anderen Ausführungsform, wobei zwei Aminosäure -Randomisierungen in einem jedem CSR und CDRH3 und drei verschiedenen Längen von CDRH3 eingesetzt werden, erreichen die Zahlen von unterschiedlichen Mitgliedern in der abschließenden rVab-Bibliothek (d. h. rVHCH1 · rVLCL) 10¹&sup8; (vgl. Fig. 4 für Details).

1. Quellen der Gerüste

Gerüste, in die die optimal diversifizierten CSRs und CDRH3 Moniert werden, können von Antikörpern mit einer bekannten Struktur abgeleitet sein.
Die Gerüste können aus Antikörpern gewählt werden, die die kanonischen Regionen in verschiedenen Orientierungen in Bezug auf die C-Region darbieten. Somit kann die Herstellung mehrfacher rVab-Bibliotheken auf verschiedenen Gerüsten gewünscht sein, um verschiedene spezielle Orientierungen der CDRs zu maximieren.
Es können Gerüste ausgewählt werden, die eine Bindung über kleine bis große Oberflächenbereiche favorisieren. Wie vorstehend beschrieben, würde ein kleiner Oberflächenbereich eine Fläche von etwa 200 Å², ein mittlerer Oberflächenbereich etwa 750 Å² und ein großer Oberflächenbereich etwa 1500 Å² abdecken. Beispiele von Antikörpern, die Gerüste für diese drei unterschiedlichen Größenziele bereitstellen können, finden sich unter planaren, Hohlraum- und Gruben-Typ-Antigen- Erkennungsdomänen, die in verschiedenen Antikörpern in einer bekannten Struktur auftreten (Fig. 3). Gerüste können einfach basierend auf der Gestalt der Antigen-Erkennungsdomäne oder in Kombination mit anderen strukturellen Faktoren ausgewählt werden.

2. Das exprimierbare Vab-Region-Konstrukt

Vorzugsweise erfolgt eine Herstellung in einem der allgemeinen Vektoren.
a. fd und M13 (Pharmacia, USA [Smith, 1985; Scott und Smith, 1988; Parmley und Smith, 1988; Cwirla et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Winter und Milstein, 1991; Waterhouse et al., 1993], Anleitung für das Recombinant Phage Antibody System, Pharmacia P-L Biochemicals, USA).
i. dem inserierten V (H und L) mit CH1 am Carboxy-Terminus geht der lac-Promotor und eine Ribosomen-Bindestelle [RBS], eine Export-Leitsequenz vor dem gpIII-Phagen-Hüllprotein oder PelB, eine Klonierungsstelle voran, und wird von einem Linker im Raster und sodann gpIII oder einem doppelten Satz an supprimierbaren Terminationskodons gefolgt.
ii. dem VH oder VL ohne CH1 oder CL oder mit partiellen NH2-terminalen konstante Region-Aminosäuren kann lac-Promotor-RBS-PelB mit internen Klonierungsstellen vorangehen, die eine Ligation von VH im Raster an den 5'- und 3'- Enden erlauben, und kann von -C (H oder L) und entweder einer Bindung an gpIII im Raster oder von zwei supprimierbaren Terminationskodons gefolgt werden.
b. immunozapII (lambda), Stratacyte, CA [Skerra und Pluckthun, 1988; Mulinax et al., 1990; ImmunoZap Cloning Kit, Anleitung, Stratacyte Corp., CA, USA; Kang et al., 1991 und Barbas et al., 1991].
i. wie vorstehend für die V-Region, mit und ohne intaktem CH1.
ii. wie vorstehend für die V-Region, mit und ohne intaktem CH1.
Expression von einzelnen V (H, L) -C (H oder L).
Expression von einzelnen V (H oder L) -C-Peptiden kann für die Bestätigung einer richtigen Herstellung der V-Regionen oder rVHCH- und rVLCL-Bibliotheken, vor Expression als reifes VC (rVHCH oder rVLCL) oder CRE-LOX-Rekombination und Phagen-Expression, eingesetzt werden, fd (M13)- oder lambda-Expression wird wie in den Pharmacia (USA)-Kits oder dem Stratacyte (CA)-System beschrieben, mit Glucose induziert. Das Produkt kann mit einem CH1-Antikörper (bekannte Standard-ELISA-Technologie) identifiziert werden, entweder mit fd als von Phagen präsentierte Moleküle oder mit lambda nach Induktion von Expression und Schaffung von periplasmatischen Molekülen. Bei Verwendung eines Phagen kann die Induktion des lytischen Zyklus ebenfalls eingesetzt werden, um das Verhältnis von lambda zu intaktem rV als Indiz der Größe der Bibliothek zu bestimmen. Mit fd kann man den Antibiotikum (z. B. Ampicillin)-Resistenz-koloniebildende Einheiten (cpu)-Transfer des fd-Genoms gegenüber der Phagenzahl mit an der viralen Oberfläche gebundenem rV messen. Mit viralem oder rV-Antigen beschichtete Kulturschalen können für die Bereitstellung von Information über die Größe der rV-Bibliothek verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform werden nur die rVH und rVL-Domänen exprimiert und durch einen flexiblen Linker für die Bildung eines einzelkettigen V- Region-Antikörpers verknüpft (bezeichnet als scPv von Winter [Huston et al., 1988; Bird et al., 1988; McCafferty et al., 1990; Hoggenboom et al., 1991; Barbas et al., 1991; Garrard et al., 1991; Breitling et al., 1991]), der unter Verwendung von Phagen-Display exprimiert werden kann. Die exprimierten V-Antikörper werden auf M13 unter Verwendung von Recombinant Phage Antibody System-Kits (Pharmacia, USA) gemäß den Herstelleranleitungen für eine Konstruktion, Expression und einen Nachweis mit gIII fusioniert.

c. Allgemeine Information über die Verwendung von Primern und PCR.

Um die Herstellung der Bibliothek verschiedener Domänen von rVH und rVL und CH und CL zu ermöglichen, enthält jeder Primer eine Sequenz, die für eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle kodiert. Die Primer-Sequenz, die die Restriktionsstelle enthält, kann innerhalb oder teilweise innerhalb des Bereichs des Primers, der mit der Ziel-Vab-Sequenz hybridisiert, liegen und geht diesem manchmal voraus. Wenn er als Verlängerung zu der Sequenz vorliegt, die zu dem herzustellenden rV-Bereich homolog ist, wird er nicht an einer Hybridisierung während einer Vorwärts-Synthese des ersten Strangs und einer reversen Synthese des zweiten Strangs teilhaben, wird jedoch in darauffolgenden PCR-Amplifikationszyklen hybridisieren. Obwohl es nicht notwendig ist, sind die Restriktionsstellen (an einem oder beiden Enden) derart gestaltet, dass sie 3'- oder 5'-Überhänge schaffen, die bei einer darauffolgenden Ligation unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die die geeigneten Leserahmen aufrechterhalten, unterstützen. PCR- Produkte können aus den Reaktionsgemischen durch eine Vielzahl von bekannten Verfahren isoliert werden. Eine Reihe von Restriktionsstellen, die von rVH- und rVL-Genkonstrukten für eine Insertion in die verfügbaren Expressionsvektoren kodiert wurden, sind bekannt und von Herstellern von Ig-Expressionssystemen und Ig-Primern verfügbar, wie Pharmacia (USA), Stratacyte (CA) und 5'-3'-Prime (USA).
Eine Insertion im Raster kann in Vektoren erfolgen, die Sequenzen enthalten, die für andere Proteine kodieren, um Fusionsproteine zu schaffen, die nicht nur eine oder mehrere C-konstante Regionen, sondern auch das Hüllprotein gpIII und VIII des fd-filamentösen Phagen oder Transmembran-Proteine enthalten, um eine Verankerung von rVHCH oder rCLVL für einen geeigneten extrazellulären oder Phagen-Display bereitzustellen.

3. Herstellung von rVabs mit vielfachen Bindestellen

Die Gruppierung aktiver rVabs, basierend auf der Erkennung verschiedener Ziel- Oberflächendomänen wird durch die Verwendung kleiner Peptide vereinfacht, die in einer überlappenden Weise die lineare Aminosäuresequenz des Ziels abdecken. Eine derartige Gruppierung vereinfacht die Paarung von aktiven rVab für ein MULTIMER (z. B. DISOMER oder TRISOMER), das aus multivalenten rVab-PEP- Bibliotheken (Beispiel 3 und 4) erhalten wird, und bildet die Basis für eine Selektion von aktiven rVab für eine Umwandlung in Reporter für eine einfache SOMER- Identifizierung.
In Anbetracht der Tatsache, dass viele antigenen Stellen weniger als 12 Aminosäuren groß sind, würden Peptide mit 10-20 Aminosäuren, die in einer überlappenden Weise hergestellt werden (d. h. Aminosäuren 1-15, 5-20, 10-25, usw.), die meisten der sequenziellen Ziel-Epitope bereitstellen. Dies würde bedeuten, dass für ein durchschnittliches Protein von 50 000 kD etwa 90 gebraucht würden, um die gesamte Oberfläche abzudecken. Für viele pharmazeutische Ziele stellte eine Mutagenese und ein Alanin-Scanning Information über bestimmte Aminosäuren und kleine Gruppen von Aminosäuren bereit, die an der Signalbindung und Rezeptoraktivierung beteiligt sind. Eine solche Information wird hier eingesetzt, um die Peptide, die für die Bereitstellung der meisten gewünschten Oberflächen-Epitop-Information erforderlich sind, auf eine viel kleinere Zahl zu verringern. Eine weitere Möglichkeit der Ziel-Fragmentierung ist die Verwendung synthetischer Polypeptide, die käuflich erworben oder durch die Biotechnologie hergestellt werden, wobei käuflich verfügbare Expressionsvektoren verwendet werden, die spezifische Stellen für eine Klonierung und Expression von Peptiden in Fusion mit leicht und quantitativ gewinnbaren Proteinen aufweisen.

4. CSR- und CDR-Diversifizierung und Reduktion

CSR- und CDR-Randomisierung: Eine bevorzugte Ausführungsform wird die Verwendung synthetischer Oligonukleotide sein, die an einer steigenden Anzahl von Aminosäurepositionen in einem jeden CSR und CDRH3 variieren, jedoch nicht den CSR verändern. Eine Minimum-Randomisierung von Aminosäuren wäre ein Auffüllen von nur einer Position in jedem CDR mit allen 20 Aminosäuren. Man könnte bis zu etwa 24 Aminosäurepositionen im CDRH3 einbeziehen. Mit der Erhöhung der Anzahl an randomisierten Positionen überschreitet die Gesamtzahl möglicher unterschiedlicher rVH und rVL rasch die praktische Begrenzung von 10¹²&supmin;¹&sup4; einer Phagen-Bibliothek-Größe und man muss die Anzahl derart begrenzen, dass sie in die verfügbare Bibliothek-Größe passt. Eine erhöhte Randomisierung an einer größeren Anzahl von Positionen kann dadurch erfolgen, dass Aminosäuren in Klassen (d. h. basisch, sauer, hydrophob, hydrophil, usw.) eingeordnet werden und sodann nur eine oder zwei Aminosäuren einer jeden Gruppe an jeder "randomisierten" Position verwendet werden. Zum anderen kann man, da nicht jede Aminosäure in einem CDR an einem Kontakt beteiligt ist, diejenigen identifizieren, die am häufigsten an einem Kontakt beteiligt sind, und eine Aminosäure-Randomisierung auf diese Positionen konzentrieren. Außerdem ist es nicht notwendig, den gleichen Typ oder Grad der Randomisierung für alle CSR und CDRH3 zu verwenden. In einer Ausführungsform könnte man nur CSRH1, H2 und H3 für eine Randomisierung verwenden, da VHs alleine gemäß der Literatur eine nM-Antigen-Affinität besitzen [Ward, E. S. et al., 1989].
In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Randomisierung während der Herstellung der rVab-Bibliothek erfolgen. Zusätzlich kann auch eine Sekundär- Randomisierung nach Isolierung der anfänglich aktiven rVabs, falls gewünscht, eingesetzt werden. Sekundär-Randomisierung kann eingesetzt werden, um eine einzige oder Paare von fehlenden Eigenschaften des gewünschten TSA CAP zu erhalten oder um eine oder mehrere vorhandene CAP-Eigenschaften zu erhöhen oder zu verringern.
CDR-Reduktion: Für die Bestimmung der kleinsten Ziel-Bindedomäne kann es gewünscht sein, die Größe der möglichen rVab-Ziel-Bindedomäne zu verringern. Für CSR- und CDR-Reduktion besteht die Möglichkeit einer Verwendung von nur einem VH oder nur einem VL, der Erstellung von PCR-Kopien, der Klonierung mit Primern, die nur das erste, die ersten zwei oder das letzte oder die letzten zwei CSR und CDRs innerhalb des rVH und rVL umfassen, und der darauffolgenden Ligation des Konstrukts in parentale Gerüste, in denen das fehlende CSR oder CDR durch einen Strang aus Glycinen ersetzt wurde (Winter, EP-A-0 368 684). Nach Veränderung kann jede Bibliothek auf ihren neuen CAP erneut getestet werden. Bei einem anderen Verfahren kann man mit einem bevorzugten rVH : rVL-Paar starten und zerstören (wiederum durch Austausch eines jeden mit einem Glycin-Heximer): a) ein CSR oder CDRH3 (es gibt 5 solche Möglichkeiten), b) zwei zugleich (es gibt 14 solche Möglichkeiten), c) drei zugleich (es gibt 9 davon) und d) vier zugleich (es gibt 6 davon). Bei einer Reduktion der CSR und/oder CDRs kann eine Wirksamkeit des veränderten rVab bis zu 30 nM toleriert werden (diese ist für die Verwendung des rVab in darauffolgenden Binde-Screens für organische Austauscher erforderlich). Jedoch ist eine Affinität von 100 nM in der Minimum-CSR/CDR-Kombination tolerierbar, falls sie später einer Mutagenese für Wirksamkeitsverbesserungen unterzogen wird, da man gezeigt hat, dass solche Verfahren Erhöhungen der Bindeaffinität von bis zu zwei Größenordnungen schaffen [Bass, Greene und Wells, 1990; Marks et al., 1991]. Die Verringerung der Zahl stellt alle entscheidenden Kontaktatome unter die kleinste Anzahl an semifixierten Domänen, was ein 3D-Modelling entscheidender räumlich-atomarer Beziehungen durch bekannte Mittel erleichtert.

5. Expression von rVabs

a. Expression von rVab als Phagen-Bibliothek

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die rVab-Bibliothek auf einem Phagen präsentiert. Dieses Verfahren ist am besten in Griffiths et al., 1994, beschrieben. Verfahren für die Verwendung von Phage-Display für Antikörper wurden in jüngerer Zeit veröffentlicht (vgl. Ladner et al., internationale Patentanmeldung WO 90/02809; Winter et al., WO 92/20791 und Huse et al., WO 92/06204) und manche Reagenzien sind in Kits käuflich verfügbar.
In einer weiteren Ausführungsform wird nur das rVLCL in eine Bibliothek für eine Expression als bakterielles Plasmidkonstrukt (VLCL.bact) mit einer Leitsequenz gesetzt, die die Freisetzung des Produkts in den periplasmatischen Raum ermöglicht. Diese Bibliothek wird sodann exprimiert und das Produkt wird mit einer rVHCHL- oder rVLCL-Phagen-Display-Bibliothek kombiniert, um die zwei Phagen- und eine lösliche Protein-Bibliothek abzuleiten. Ein an eine feste Matrix gebundener anti-CL-Antikörper kann für das Ernten der VLCL-Protein-Bibliothek verwendet werden.
Für die Identifizierung von Mitgliedern der rVHCH1-Phagen-Bibliothek mit einer oder mehreren GAP-Eigenschaften wird die lösliche rVLCL-Protein-Bibliothek zu der vorstehend genannten Phagen-Bibliothek hinzugegeben und durch Panning auf Ziel-Oberflächenerkennung mit an eine Matrix (Plastik-, chromatographische oder magnetische Partikel) gebundenem Zielprotein bei Fehlen oder in Gegenwart kompetitierender Proteine (vgl. Beispiel 2) gewaschen, um rVHCH1 : rVLCL-Protein T+ (S+)-Mitglieder abzuleiten. Der das rVHCH1-Gen enthaltende Phage wird nach Multiplizierung mit einem Helfer-Phagen geerntet (unter Verwendung käuflich verfügbarer Kits). Isolierungs- und Anreicherungsschritte können wie erforderlich wiederholt werden. Diese Bibliothek kann als T+S+rVHCHhalfLIB bezeichnet werden. Tests für A+ können sodann erfolgen, um TSA+rVHCHhalfLIB zu erhalten.
Die T+ (gegebenenfalls S+A+) rVHCHhalfLIB kann sodann z. B. in lambda Moniert und als lösliche periplasmatische Entitäten exprimiert werden. Die Bibliothek kann sodann mit der Phagen-Display-rVLCL. LIB gemischt werden und die vorstehend genannten Isolierungsschritte wiederholt werden, um eine T+ (S+A+) rVLCLhalfLIB zu erhalten. Die spezifische Verfahrensweise dafür wurde von Lerner und seiner Gruppe veröffentlicht [Cabilly et al., 1984; Burton et al., 1988; Huse et al., 1989; Mullinax et al., 1990; Zebedee et al., 1992; ImmunoZap Cloning Kit Stratacyte Corp., CA und SurfZap Cloning Kit (Anleitung), Stratagene Corp., CA]. Details finden sich im nachstehenden Abschnitt über funktionelle VH- und VL-Kombinationen. Die aktive rVHCHhalf-Bibliothek wird in pVHACCEPTOR (vgl. Fig. 11) kloniert und die aktive rVLCHhalf-Bibliothek in pVLACCEPTOR. Das CRE-LOX-Rekombinationssystem kann sodann für die Ableitung einer rVab LIB-kombinatorischen Bibliothek eingesetzt werden, die für das TSA+CAP getestet werden kann.

b. Isolierung der rVab-Bibliothek von Ziel-Bindern und Phagen- Display

Bei diesem Schritt werden alle rVab in der ursprünglichen Bibliothek isoliert, die irgendeinen Teil der Oberfläche des Ziels erkennen und einen Komplex mit einer ausreichenden Stabilität für eine Isolierung bilden (d. h. Zielaffinität < 30 nM). Diejenigen mit dieser Erkennungsfähigkeit werden als T+ bezeichnet. In dem bevorzugten Verfahren werden die rVab-Gene gemischt und in einen Phagen verpackt und funktionell auf der Phagen-Oberfläche präsentiert. Entsprechend werden rVab auf der Oberfläche eines Phagen präsentiert und die Phagen werden mit Zieloberflächen inkubiert. In weiteren Ausführungsformen kann die Bibliothekzahl durch Vorselektion aktiver rVHCHhalfLIB und rVLCLhalfLIB vermindert werden, was eine Verpackung und Expression in Bakterien erlaubt, entweder als lösliche oder membranverankerte rVabs durch bekannte Verfahren unter Verwendung käuflich verfügbarer Kits (z. B. Stratacyte, USA) gemäß den Herstelleranleitungen.
Wie vorstehend beschrieben, kann das Ziel eine jegliche Oberfläche sein, die man für eine Erkennung durch Mitglieder der rVab-Phagen-Bibliothek abtasten möchte. Permissive Inkubationsbedingungen, von denen es viele bekannte gibt, würden diejenigen umfassen, die nicht den Träger zerstören, der den rVab verpackt, oder die eine rVab-Erkennung des Ziels nicht inaktivieren oder einen Display seiner Ziel-Epitope verhindern. Zusätzlich ist in allen Fällen der rVab : Ziel-Komplex vorzugsweise quantitativ von freien Tr-rVab-Phagen-Verpackungen trennbar.
Nach Inkubation des Ziels mit den rVab-Phagen gibt es viele bekannte Verfahren für eine Trennung von Komplexen, die alle auf dem Prinzip basieren, dass das Ziel einen Tag besitzt (bezeichnet als Trtagg), das in einer solchen Form seine einfache quantitative Trennung von allen anderen gelösten Stoffen in der Reaktion erlaubt. Vorzugsweise sind solche Tags nicht trennbar oder wirken als Marker, um den Ziel : rVab-Komplexen in den Trennungsverfahren zu folgen. Zu solchen bevorzugten Tags gehören Matrizes wie Agarose, magnetische Teilchen und die Oberfläche von Kulturschalen. In diesen Fällen wäre eine Bindung des Ziels an den Tag vor einer Inkubation mit der rVab-Bibliothek erfolgt. Es gibt auch Nicht-Matrix-Ziel-Tags, die eine Trennung des Ziel : rVab-Komplexes von gelösten Stoffen und nicht-gebundenen rVab erlauben. Zu solchen Tags gehören fluoreszente Verbindungen (für eine Verwendung bei der fluoreszenzgesteuerten Sortierung), Biotin (für Avidin-gesteu erte Sortierung) und Polyhistidin mit 6 Resten [His 6] (für eine Metallchelat-Säulenchromatographie) und sehr kleine Antikörper-Epitope, die bekannt sind.
Inkubationsbedingungen können stark variiert werden. Variationen bei der Temperatur, der Zeit, dem pH, dem Puffer und den Medien-Zusätzen sollen als diejenigen Eigenschaften betrachtet werden, die eine Bildung und Stabilität des Ziel : rVab- Komplexes in einer bekannten Art und Weise beeinflussen. Die bevorzugten Bedingungen sind hier Phosphat-, MOPS-, HEPES- oder Tris-Puffer bei etwa neutralem pH (6,8-7,2) mit 1% BSA bei Raumtemperatur für etwa 4-6 bis zu 6-12 Stunden.
Nach Bildung des Ziel : rVab-Komplexes wird ein jeglicher Matrix gebundener rVab von nicht gebundenem freien rVab getrennt. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Ziel an die Oberfläche von Plastik-Kulturschalen gebunden und ein schnelles Verfahren wie Panning wird für die Trennung von freiem und Ziel-komplexiertem rVab eingesetzt. Das allgemeine Verfahren des Panning bei verschiedenen Temperaturen, pH und Gegenwart des Antigens erlaubt eine Isolierung von rVab mit einer kontrollierten Affinität.
Nach Loslösen von der Matrix oder dem affinitätsgebundenen Tag durch Verfahren wie einem niedrigen pH oder andere bekannte Verfahren kann der wiedergewonnene rVabT+ durch das Selektionsverfahren oder irgendeine Variante davon beliebig häufig recycliert werden. Veröffentlichte Panning- und affinitätschromatographische Verfahren zeigten Anreicherungen in einem einzigen Schritt von 5 · 10²- 10³ pro Zyklus. Obwohl die Anzahl an Zyklen variiert werden kann, abhängig von der Anreicherung pro Zyklus, der Häufigkeit eines bestimmten rVabT+, der Gesamtgröße und Diversität des wiedergewonnenen rVabT&spplus;, sind drei Zyklen bevorzugt. Andere Zykluszahlen können basierend auf den Charakteristika des wiedergewonnenen rVabT&spplus;, wie S oder A, gewählt werden.
Eine Isolierung von rVabT&spplus;-Mitgliedern kann mit verschiedenen Typen verpackter rVab, die funktionelles rVab exprimieren, erfolgen, einschließlich Phagen-Packungen oder löslichen Entitäten wie vorstehend erörtert.
Bei diesem bevorzugten Isolierungsschritt kann der rVab eine der nachstehenden funktionellen Formen, Fv (rVCvh oder nur v1), Fab oder scFv, wie nachstehend beschrieben, besitzen:
a. einzelne funktionelle VH oder VL ohne (Fv) oder mit gebundenen konstanten Regionen (Fvc) für die V-schweren (CHn)- und V-leichten (CL oder k)-Gene oder Teile davon. Beide F-Typen können Ziele unter Verwendung von nur drei der sechs V-Region-CDRs, die in einem natürlichen Fab auftreten, erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Fvc-Gene zuerst in einen fd-Phagen verpackt und mit der im Raster gebundenen C-Region (oder einem Teil davon) exprimiert, die eine CHn, CL-kappa oder CL-lambda ist, wobei in allen Fällen den konstanten Regionen das C-terminale Cystein fehlt. Es gibt eine Reihe von verfügbaren CH-Regionen, einschließlich CH-gamma oder -delta, die basierend auf der erforderlichen Löslichkeit ausgewählt werden. Diese V (oder VC)-Gene können als lösliche Entitäten mit oder ohne Tags oder in einer bevorzugten Ausführungsform in Fusion im Raster mit einem der Hüllproteine des Phagen (d. h. gpIII) für ein funktionelles Display exprimiert werden. Diese Bibliotheken, umfassend nur V-Regionen, werden als rFv bezeichnet und können in einem Phagen verpackt für ein Phagen- Display exprimiert werden. rFv-Phagen-Bibliotheken können für Mitglieder gescreent werden, die GAP-Eigenschaften von T, S und A besitzen und können weiter wie vorstehend beschrieben diversifiziert werden. Solche Bibliotheken mit Entitäten, die eine verringerte Anzahl von CDR und CSRs enthalten, können als Teil des Sekundär-Vereinfachungsverfahrens abgeleitet werden, falls es eine sehr große Zahl aktiver rVabs gibt oder falls eine Vereinfachung für die Förderung der Entwicklung eines genaueren BEEP gewünscht ist.

c. Funktionelle VH- und VL-Kombinationen (rVab):

Diese Kombinationen besitzen zwei V-Gene mit oder ohne partielle oder intakte konstante Gene. Obwohl sie ähnliche Mitglieder enthalten können, ist die bevorzugte Kombination ein VH (oder VHCH) und ein VL (oder VLCL). In einem bevorzugten Verfahren werden rVabT+ mit dem bestimmten VH- und VL-Paar in einem einzigen Phagen, auf einem einzigen DNA-Stück als zwei einzelne Genprodukte zusammen verpackt. Für jeden Phagen kann VH oder VL lösliches Protein und das andere in Bindung an gpIII für die Erzeugung eines Oberflächen-Phagen-Displays des Fab exprimiert werden. Diese Kopplung und Expression von VH und VL kann mit oder ohne getrennte Identifizierung der VH-Phagen-Bibliothek und VL-Phagen- Bibliothek erfolgen, die das Ziel in Gegenwart einer Bibliothek von löslichen VLCL- Protein bzw. VHCH1-Protein erkennen können (vgl. supra).
In einer Ausführungsform ist das sequenzielle Verfahren für die Herstellung funktioneller rVabs wie folgt: Drei einzelne Bibliotheken werden hergestellt. Zwei davon enthalten ≥ 10&sup7; Phagen-Packungen, wobei jede nur ein V-Gen (VHCH oder VLCL) in Bindung an einen Phagen für ein Oberflächen-Display exprimiert und enthält. Die andere ist genauso groß, besteht jedoch aus in lambda als lösliche VL-Proteine exprimierten VL-Genen, wobei die Proteine aus dem Periplasma von Bakterien abgeerntet werden können, die die lösliche VL-Bibliothek exprimieren. Erste rVabs werden sodann durch Mischen der löslichen Protein-Bibliothek mit der VH-Phagen- Bibliothek in einer Lösung vor einem Testen für eine Zielerkennung hergestellt. Dieses Mischen erlaubt allen vorkommenden VL-Proteinen einen Komplex mit irgendeinem auf einem einzelnen Phagen-Oberflächen-Paket exprimierten VH einzugehen, um einen nicht-kovalent an einen Phagen gebundenen (Disulfid-Brücken sind ausgenommen) funktioneilen rVab zu bilden. Dies ermöglicht die Bildung aller möglicher rVab-Kombinationen. Zu diesem Gemisch wird sodann das untersuchte Matrix-gebundene Ziel hinzugegeben und nach einer Inkubation und Komplexbildung werden alle Phagen, die ein Matrix gebundenes Ziel tragen, das als Teil des auf der Oberfläche des Phagen präsentierten rVab gezeigt wird, vorzugsweise durch eines der vorstehend beschriebenen Panning-Verfahren isoliert. Eine darauffolgende Isolierung von Phagen-DNA ergibt eine exprimierbare Bibliothek funktioneller rVHCH1-Phagen, die T&spplus; sein können (d. h. T&spplus;rVHCHhalfLIB).
Alle VH-Phagen-Bibliothek-Inserts werden vor oder nach Phagen-Vermehrung, wie erforderlich, sodann durch einen einfachen Endonuklease-Restriktionsverdau herausgeschnitten und direktional in einen lambda kloniert, der zur Expression der Inserts als lösliche periplasmatische Proteine fähig ist. Nach Induktion, wie vorstehend beschrieben, wird das Protein aus der T&spplus;rVHCHhalfLIB aus dem periplasmatischen Raum abgeerntet, um eine Protein-Bibliothek mit der Möglichkeit zu ergeben, Komplexe mit den Entitäten in der anderen ursprünglichen Phagen-Bibliothek, d. h. der rVLCL-Bibliothek, zu bilden. Nach Mischen der löslichen Protein- Bibliothek und dieser Phagen-Bibliothek, wie vorstehend, wird der T&spplus;rVLCLhalfLIB isoliert, wie vorstehend beschrieben.
Im letzten Schritt dieser Ausführungsform wird eine kombinatorische Bibliothek verpackter Paare von T&spplus;rVab hergestellt, bei der einzelne Verpackungen ein VH- und ein VL-Paar von als getrennte Entitäten co-exprimierten Genen enthalten, die jedoch miteinander zu funktionellen rVab-Komplexen verbunden sind. In der bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden diese zwei Gene mitein ander durch das CRE-LOX-Rekombinase- System kombiniert, das ursprünglich von Hoess beschrieben wurde [Hoess et al., 1982; Hoess und Abremski, 1985; Hoess et al., 1986] und das kürzlich von Griffiths et al., 1994, beschrieben wurde. In einer anderen Ausführungsform ist die Verpackung auch ein Phage und die Expression ist ähnlich zu der bevorzugten Ausführungsform. In diesem Verfahren werden die Kombinationen von rVHCH und rVLCL jedoch durch Herausschneiden und Ligation in vitro der DNA in einer Weise hergestellt, die eine Randomisierung von VH- und VL-Paaren erlaubt, jedoch nur von einem Paar pro DNA-Konstrukt. Diese Konstrakte können Phagmide oder Phagen sein, um eine bakterielle oder Phagen- Expression des rVab zu erlauben. In Bakterien werden die rVab isoliert und durch Protein-Lifts getestet, während in Phagen das rVab an ein Oberflächen-Protein für ein Display und einen Test gebunden wird. Beide Verfahren wurden veröffentlicht [Hoogenboom et al., 1991; Kang et al., 1991; Waterhouse et al., 1993; Figini et al., 1994; Jespers et al., 1994] und sind käuflich in Form eines Kits verfügbar (z. B. Stratacyte, CA). Das bevorzugte Verfahren ist ein Phagen-Display von rVab.
Der Vorteil der Ausführungsform, bei der aktive rVxhalfLIB vor einer Kombination in rVabs identifiziert werden, ist, dass die unabhängige Vorselektion aktiver VHCH T&spplus;- und VLT&spplus;-Gene wahrscheinlich die Anzahl aktiver rVhalfLIB-Mitglieder auf weniger als 10&sup5;&supmin;&sup6; vermindert hat, falls Kombinationen aus VH und VL zufällig aus einer vorselektierten T&spplus;-aktiven rVhalf-Bibliothek hergestellt werden. Diese Verminderung in der Anzahl erhöht stark die Wahrscheinlichkeit einer Ableitung aller möglicher aktiver rVabs in einer einzigen Phagen-Bibliothek von 1012 Mitgliedern, die mit der hier beschriebenen Vorgehensweise erreichbar ist.
Das Verfahren, das für die Isolierung einzelner VH und einzelner VL und Paare von VH/VL eingesetzt wird, die das Ziel erkennen, besitzt weiterhin den Vorteil, dass es schnell ist und in Bezug auf die Stärke und Art der gewünschten Vab-Ziel-Bindung steuerbar ist. Durch die beschriebenen Verfahren kann ein gepaarter rVabT&spplus; (mit ≤10¹&sup0; Entitäten) hergestellt werden.
Die vorstehend erörterten Verfahren führen zur Isolierung von a) rVH oder rVL, die alleine nicht den anderen für eine Erkennung des Ziels erfordern, und b) den rekombinant abgeleiteten Kombinationen von rVH und rVL, bezeichnet als rVabs und scFv, bei denen in dem letzteren Fall rVH und rVL durch eine kurze Peptidkette verknüpft ist und die als gpIII-Phagen-Proteinfusionsprodukte oder sogar als lösliche Entitäten exprimiert werden. Zusätzlich sind rVab, bei denen beide V- Domänen einem Typ angehören, d. h. VH² oder VL², erfindungsgemäß möglich. VHVH Fab mit erhöhter Löslichkeit wurden beschrieben. Eine Änderung von CH1 zu CH delta-Regionen oder eine Veränderung spezifischer und identifizierbarer C- Aminosäuren könnte auch eine Expression neuer rVabs ermöglichen.
Die grundsätzlichen und bevorzugten Verfahren für eine Klonierung einzelner schwere und leichte Kette-variabler Regionen, entweder alleine oder in Bindung an ihrem N-Terminus an Leitsequenzen oder Teile davon oder an ihrem C-Terminus an eine konstante Region oder Teile davon und ein Einsetzen in geeignete Expressionsvektoren, die Transformation und Expression in einer kompatiblen Wirtszelle in einer aktiven Form durch rekombinante DNA-Technologie sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. Huse, WO 92/06204; Ladner, WO 90/02809; Winter, WO 92/20791.
Um eine zuverlässige Klonierung eines jeden aktiven IgG mit einer hohen Ausbeute zu erreichen, ist eine Sekretion von Protein als lösliches extrazelluläres Protein oder in den periplasmatischen Raum geeignet. Zusätzlich kann Protein als ein extrazelluläres (oder auf der Oberfläche eines Phagen) transmembran- oder membranverankertes funktionelles Protein exprimiert werden, das eine spontane Dimerisierung von schweren und leichten Ketten-intakten IgG- oder V-Domänen ermöglicht.
Verfahren zur Klonierung gesamter Milz-Repertoires von Vab-schweren (Vabh) und Vab-leichten (VAB1)-Ketten aus unbehandelten oder immunisierten Tieren in ihrer natürlichen oder zufälligen Paarung für ein Ableiten von außerordentlich diversen kombinatorischen Repertoire-Bibliotheken sind bekannt [Huse et al., 1989; Sastry et al., 1989; Milstein, 1990; Clackson et al., 1991; Marks et al., 1991; Winter und Milstein, 1991; Hawkins und Winter, 1992; Hoogenboom et al., 1992; Lerner et al., 1992; Marks et al., 1992; Winter et al., 1994].

B. Identifizierung von rVabs, die an Ziele binden und diese aktivieren (Stufe Ib)

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Paare von VH- und VL-Antikörper-Domänen (rVab) als biologische Scanner spezifischer Zieloberflächen und Informations-Reporter einer Aktivität, die in Beziehung zu der molekularen SD-Struktur der an Oberflächen-Interaktionen beteiligten Antikörper- Stelle steht, sowie der molekularen SD-Struktur der aktiven Elemente der Binde stelle ausgewählt. Diese strukturelle Information ist relevant für die Identifizierung der Minimum-Struktur des LIGATT, die in ein SOMER oder DISOMER eingebaut werden müsste, um das CAP des aktiven rVab wiederherzustellen und das Ziel in der gewünschten Weise zu regulieren. Erfindungsgemäß wird bei einer Verwendung als Bibliotheken mit wenigstens etwa 10¹&sup0; Mitgliedern die einzigartige Fähigkeit von rVab identifiziert, die Teile einer Oberfläche eines Ziels zu identifizieren, die mit der Funktion verbunden sind, so dass unmittelbar die Werkzeuge bereitgestellt werden, die für ein Screening von organischen Austauschern an dem Ziel mit einem gewünschten CAP notwendig und ausreichend sind.
Zusätzlich werden in einer Ausführungsform dieses Verfahrens genetische Algorithmen für die Herstellung von 3D-Hochauflösungs-Molekularmodellen der Gestalt organischer Moleküle verwendet, die in das aktive Ziel passen können und die Aktivität regulieren können, so dass elektronisch SOMERE oder DISOMERE gescreent oder durch Computerprogramme synthetisiert werden.
Aktive Ziel-Landschaften sind diejenigen Oberflächen, die mit einer Zielfunktion verbunden sind und sie sind als diejenigen definiert, die bei einer Besetzung durch einen Liganden zur Beeinflussung der Zielaktivität fähig sind. Man weiß, dass Antikörper in einer großen Formenvielfalt, z. B. Ig, Fabg, Fab oder sFv (d. h. VH oder VL alleine) eine außergewöhnliche Selektivität, sowie eine hohe Affinität für ihre Ziele aufweisen. Erfindungsgemäß werden rVab verwendet, die dahingehend auf zwei Wegen identifiziert werden, dass sie die gewünschten CAP-Eigenschaften besitzen. Strukturelle Charakteristika vielfacher rVabs, die die gewünschten CAP- Eigenschaften besitzen, werden für die Herstellung einer zusammengesetzten Strukturkarte kombiniert, die für die Definition eines BEEP verwendet wird.
Zusätzlich können einzelne rVabs, die das gewünschte CAP aufweisen, markiert werden, so dass sie als Reporter in kompetitiven Bindetests für die Identifizierung von SOMEREN, DISOMEREN oder anderen Liganden, die an dem pharmakologischen Ziel aktiv sind, verwendet werden können.

1. Identifizierung von rVabs mit TSA+ für Ziele mit endogenen Liganden

Die Verfahren für eine Isolierung und Identifizierung von Vab für Ziele mit endogenen Liganden und rVab, die alle TSA+-Eigenschaften besitzen, werden basierend auf zwei grundsätzlichen Punkten eingeteilt: zum einen, ob die rVab-induzierte Ziel-Modifikation allosterisch (alloA) oder kompetitiv (compA) mit dem nativen Sig nal (endogenen Signal) ist und zweitens, ob die aktive Oberfläche eine einfache oder komplexe Landschaft ist, die auf einer oder mehreren verschiedenen Untereinheiten des Ziels vorgefunden wird. Als Ziel-Modifikation wird all das betrachtet, das eine Ziel-Aktivierung auf irgendeine Art und Weise verändert, einschließlich native Signalerkennung (d. h. Signalbindung) und/oder der Signal-Transduktionsprozess, der durch das aktive Ziel gesteuert wird. Ein Beispiel ist die Bindung von ACh an den Muscarin-artigen Subtyp 1-Rezeptor und die Interaktion bzw. Aktivierung des Gi-Proteins. In beiden Fällen werden in dem Verfahren Bibliotheken eingesetzt, die bereits für eine Zielerkennung selektiert wurden, vorzugsweise durch Selektion im Batch-Verfahren, d. h. rVabT+. Eine Selektion im Batch-Verfahren wird vorzugsweise sodann für die Identifizierung und Trennung von rVabT+A+ von denjenigen eingesetzt, die unter bestimmten Bedingungen inaktiv sind. Bibliotheken mit 106-1012 einzelnen Mitgliedern werden verwendet und das Verfahren ist daher auf rVab-Bibliotheken mit VH- und VL-Ketten, die nicht-kovalent (als Fab) oder kovalent gebunden sind (als scFv [Hoston et al. 1988; Bird et al., 1988; Mc- Cafferty et al., 1990; Hoogenboom et al., 1991; Barbas et al., 1991; Garrard et al., 1991; Breitling et al., 1991] oder Diabodies [Holliger, Prespero und Winter, 1993], sowie diejenigen mit nur einer V-Kette anwendbar. Durch bekannte Verfahren können einzelne rVabTSA+ in einer aktiven rVabA+-Bibliothek (LIB) einfach und schnell isoliert, getestet, mit einem Tag versehen und für ein Screening verschiedener chemischer Bibliotheken für SOMERE eingesetzt werden, die mit rVabA+ für eine Bindung an das Ziel kompetitieren.
Für allosterische Vab-Modulatoren wird das Auftreten einer allosterischen Aktivität in einer rVabT+-Bibliothek durch das Auftreten einer Veränderung der Assoziierung zwischen rVabT+ und dem Ziel angezeigt, induziert durch die Bindung einer anderen Entität an das Ziel. Diese Entität könnte das native Signal oder irgendeine bekannte Ziel-Effektor-Entität sein. Beispiele allosterischer Entitäten umfassen Nukleotide wie ATP für Rezeptor-enthaltende Kinasen oder GTP für G-Proteinassoziierte Ziele oder ein Protein, das an das Ziel während einer Signaltransduktion koppelt, wie G-Proteine oder sogar andere Rezeptor-Untereinheiten.

a. Identifizierung von rVabTSA+ aus rVabT+ mit Hilfe allosterischer Modifizierer

Die Isolierung von rVabTA+ aus rVabT+ ist direkt mit der Wirkung des Signals auf das Ziel verankert. In dem bevorzugten Verfahren wird das Matrix-gebundene Ziel (m-Tr) mit dem rVabT+ gemischt und inkubiert, um eine Bildung von m-Tr:rVabT+- Komplexen zu erlauben. Im allgemeinen sind dies die gleichen Bedingungen, die für die Isolierung von rVabT+ in Schritt I (b) eingesetzt wurden. Nach einer ausreichenden Zeit, um eine merkliche Komplexbildung zu erlauben, die für die Bildung eines Gleichgewichts der Interaktion ausreichend oder nicht ausreichend sein kann, wird die Temperatur auf etwa 4ºC gesenkt, um gebundenes rVab in dem m- Tr : rVab-Komplex durch Verlangsamung seiner Dissoziationsrate einzufangen. Bei einer Temperatur von 4ºC wird freies rVab schnell weggewaschen und der Komplex in dem ursprünglichen Puffer resuspendiert. Dieser Vorgang erfolgt schnell und verwendet eine Matrix wie z. B. Partikel oder Plastikoberflächen und er dauert < 1 min. Für diesen Vorgang bestimmt man vorzugsweise zuerst die normale Dissoziationsrate von rVabT+ von dem Ziel oder schätzt sie ab. Dies kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Zum Beispiel werden in parallelen Reaktionen die Dissoziationskonstante (k-1) für das Ziel (Tr) und das Signal bestimmt, wobei entweder ein markiertes Ziel (T*) und die Überwachung der Dissoziation von T*-rVabT+ -Matrix-Komplexen oder nicht-markiertes Ziel und eine Verfolgung seiner Freisetzung aus den rVabT+-Matrix-Komplexen mit Hilfe von anti-rVab-konstante Region-Antikörpern (oder anti-Phagen-Antikörpern) eingesetzt werden oder einfach der Phage in dem Überstand getestet wird, falls eine rVab-Phagen-Bibliothek verwendet wird. Die Halbwertszeit (t1/2) für k-&sub1; bei 4ºC für die rVabT+-Bibliothek von dem Ziel wird sodann für die ganze Population bestimmt.
Bei bekanntem t1/2 für k-&sub1; wird eine neue Population gewaschener rVabT+-Matrix- Komplexe der gesamten rVab-Bibliothek bei 4ºC gebildet und allosterische Effektoren werden in sättigenden Konzentrationen hinzugegeben. Die Hälfte der Population wird für eine Isolierung der freien rVabT+-Mitglieder aus der Bibliothek zentrifugiert, die in dem Überstand innerhalb etwa der ersten Minute (oder ≤l1/30stel der t1/2 für die Dissoziation der Population) verbleiben. Die verbleibende Hälfte wird etwa 10 · t1/2 dissoziieren gelassen, zentrifugiert und der Niederschlag resuspendiert und etwa weitere 10 · t1/2 dissoziieren gelassen, um die zweite Population von freien rVabT+ zu isolieren. In beiden Fällen wird Zentrifugation für die schnelle Isolierung der freien rVabT+ eingesetzt. Im ersten Fall wird die freie rVabT+-Bibliothek für die rVab-Mitglieder angereichert, die für eine schnelle Dissoziation induziert werden (sie werden als rVabT+A+ allofast bezeichnet), während im zweiten Fall für diejenigen angereichert wird, die für eine langsame Dissoziation induziert wurden (sie werden als rVabT+A+ alloslow) bezeichnet. Jede wird sorgfältig gewaschen und sodann ein zweites Mal durch das vorstehende Isolationsverfahren recycliert. Solche Anreicherungszyklen werden fortgesetzt, bis eine deutliche Veränderung des t1/2 für eine Dissoziation in der gesamten Population beobachtet wird. Zu diesem Zeitpunkt wird die Population als rVabT+A+ bezeichnet (schnell oder langsam). Ihre Anzahl wird sodann bestimmt, falls es nach der Amplifikation notwendig ist. Falls diese Populationen klein sind, können einzelne rVabT+A+ (schnell oder langsam) zu diesem Zeitpunkt isoliert und direkt in darauffolgenden Verfahren getestet werden. Falls große Populationen erhalten werden, können diese in darauffolgenden Schritten untersucht werden, um Subpopulationen zu isolieren, die andere gewünschte Ziel-Eigenschaften, z. B. Spezifität (S+) unter einer großen Anzahl an Ziel-Familienmitgliedern aufweisen.

b. Identifizierung von rVabT+A+ aus einer rVab-Bibliothek mit Hilfe von Kompetitionstests

Das zweite Verfahren für eine Isolierung von rVab, die zur Ziel-Modifikation fähig sind, wird für die Isolierung von rVabT+ eingesetzt, egal, ob die S-Eigenschaften bisher bestimmt wurden, die Ziel-Regulatoren sind, die an Ziele an der gleichen Domäne oder an einer Domäne binden, die mit der überlappt, die von dem natürlichen endogenen Signal (nS)-Liganden verwendet wird. Diese werden als Kompetitoren für nS für eine Bindung an die nS-Bindedomäne betrachtet und sind daher kompetitive Modulatoren, keine allosterischen Modulatoren. Agonisten- und Antagonisten-Austauscher für einen endogenen Liganden werden in dieser Population aufgefunden werden.
Dieses Verfahren erfordert die Verwendung eines hoch-affinen nS, der markiert (nS*) und zu einer schnellen und quantitativen Isolierung fähig ist. Es gibt viele derartige Marker, z. B. Biotin und kleine Antikörper-Epitope, für die hoch-affine Seren (oder monoklonale Antikörper) käuflich verfügbar sind. Verfahren zur Herstellung eines derartig markierten nS und die verfügbare Epitop/Antikörper-Kombination für Proteinsignale und organische Moleküle sind bekannt. Die Markierung ist ein ziemlich einfaches Verfahren für das Protein nS. Für organische Moleküle ist es viel schwieriger, jedoch werden in den bevorzugten Fällen, wo eine Markierung bisher nicht erfolgte, nicht-neutralisierende monoklonale Antikörper oder Biotin in bekannten Verfahren verwendet werden.
Das bevorzugte Verfahren einer Identifizierung und Isolierung von kompetitivem rVabT+ (S ist bestimmt oder nicht bestimmt), das hier beschrieben ist, verwendet Biotin als den nS-Marker ("Tag"). Das Verfahren erfolgt ähnlich zu denjenigen, die andere Markierungs-Tags verwenden, wie Iodierung mit ¹²&sup5;I oder [³²P]ATP-Phosphorylierung.
Das biotinylierte hoch-affine Signal, nStag und die zu testende rVabT+-Bibliothek (zuvor isoliert und als T+ identifiziert) werden mit einer löslichen aktiven Form des Ziels (Tr) kombiniert und inkubiert, um eine Bildung einer signifikanten Anzahl von nStag : Tr sowie rVab : Tr-Komplexen zu erlauben. Die Inkubationsbedingungen, die hier verwendet werden, sind zu den zuvor verwendeten identisch, die eine Bindung der rVab-Bibliothek an m-Tr erlauben, sofern diese Bedingungen auch eine nStag-Bindung an Tr erlauben. Die Temperatur wird sodann auf 4ºC gesenkt und alle nStag und nStag; Tr-Komplexe werden aus der Lösung mit Streptavidin (oder einem anderen Tag-Erkenner, der an irgendeine Matrix gekoppelt ist) entfernt. Der Überstand mit T : rVabT+-Komplexen und freiem rVabT+ wird Affinitäts-getrennt, um nur Tr : rVabT+ durch Panning über anti-Tr-Antikörper-beschichtete Kulturschalen zu isolieren, oder wird durch Agarose geschickt, die mit anti-Tr-Antikörpern gekoppelt ist. Die anti-Tr-Antikörper, die in diesem Schritt eingesetzt werden, verändern nicht die Bindung von rVabT+ an Tr. Solche Antikörper sind bekanntlich häufig diejenigen, die Epitope am Amino- oder Carboxy-Terminus des zu untersuchenden Tr oder irgendeine andere nicht-modulatorische (d. h. nicht-aktive) Zieldomäne aufweisen. Die Population von an Tr gebundenen rVabT+ in Lösung, die durch Assoziation mit anti-Tr-Antikörper auf ihrer eigenen Matrix erhalten wurde, kann isoliert und gemäß dem vorstehenden Verfahren beliebig häufig für eine Anreicherung und Vermehrung recycliert werden. Diese Population enthält alle rVabT+-Bibliothek-Mitglieder, die an Tr an der Bindestelle binden, die von dem nS des Ziels verwendet wird. Diese Population besteht daher aus rVab, die an die nS- Bindestelle binden und sie werden als rVabT+comp bezeichnet. Obwohl zu diesem Zeitpunkt diese aktiven rVabs in Bezug auf Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität nicht charakterisiert sind, beruht ihre Klassifizierung als aktive rVab geeigneterweise auf den Definitionen und auf der Offenbarung der Erfindung.
Einzelne Entitäten in diesen Populationen können isoliert, für eine Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität mit Hilfe von bekannten Standard-in vitro-, zellulären oder in vivo-Tests getestet und/oder durch bekannte Verfahren markiert und für ein Screening für Agonisten- und/oder Antagonisten-SOMERE eingesetzt werden. Ferner werden, falls ein markierter nStag für Tr besteht, einzelne rVabT+A+compt für eine kompetitive Modifizierung der nStag-Bindung an T durch bekannte Verfahren getestet werden.

c. Isolierung von A+-rVabT+ durch allosterische Modifizierung von Zielen

Das nächste Verfahren beschreibt die Isolierung von rVabT+, die Tr (d. h. sie sind A+) durch Bindung an Stellen allosterisch modifizieren, die eine Bindung von nS nicht verändern, jedoch die Fähigkeit des Ziels verändern, aktiv zu sein, selbst für Ziele ohne native Signale. In diesen Fällen wird aktiver rVab aufgrund seiner Fähigkeit isoliert, die Assoziierung von T und irgendeiner Komponente des Signal- Transduktionssystems, die von dem Ziel verwendet wird, zu verändern. Im Fall von G-gekoppelten Rezeptoren wäre dies der GTP-G-Protein-Komplex. Im Fall von Zielen mit einer katalytischen oder stöchiometrischen enzymatischen Aktivität wären dies nicht-hydrolysierbare Substrat-Analoga und für Kanäle oder Transporter wären dies Ionen, transportierte Moleküle, elektrochemische Gradienten oder andere Kanal-Untereinheiten. In diesen Fällen würde die Isolierung dieses rVabT+A+-Typs erfolgen durch a) Testen in einem Batch-Verfahren von Bibliotheken mit einer begrenzten Größe, d. h. rVabT+A+, für eine Agonisten- oder Antagonisten-Wirkung in vitro oder b) Isolierung in einem Batch-Verfahren derjenigen, die eine Tr-Aktivierung veränderten, d. h. Phosphorylierung, Bindung von ATP oder GTP oder Bindung anderer Proteine, die an der Signal-Transduktion, wie vorstehend beschrieben, beteiligt sind. Bibliothek-Mitglieder, die T+A+ sind, können verdünnt werden und liegengelassen werden, bis einzelne Entitäten identifiziert werden.

d. Identifizierung von rVabT+A+-Paaren, falls einzelne rVabT+A+ nicht identisch sind

Falls in Fällen, in denen ein nS existiert, kein einzelner allosterischer oder kompetitiver rVab durch eines der vorstehenden Verfahren aufgefunden wird, sind die nachstehenden Verfahren zur Identifizierung von Paaren aus Entitäten fähig, die beide zugleich als notwendiger Bestandteil für eine Modifizierung des Ziels erforderlich sind. Bei diesen Verfahren werden die Paare von getesteten Entitäten von zwei unterschiedlich identifizierbaren rVab-Bibliotheken oder vorzugsweise von einer rVab-Bibliothek und einer anderen großen und stark diversen Bibliothek mit identifizierbaren Molekülen bereitgestellt. Für Ziele mit großen Proteinsignalen wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, usw. (d. h. > 10 000 D), von denen erwartet werden kann, dass sie mehr als ein LIGATT besitzen, wird dieser duale Modifyer-Test der bevorzugte Weg in einer der zwei allgemeinen alternativen Formen sein.
Das grundsätzliche Verfahren wird zuerst beschrieben, wobei zwei unterschiedlich markierte rVab-Bibliotheken als Quellen der zwei gepaarten modulatorischen Entitäten verwendet werden. Zusätzlich zu den rVab-Bibliotheken gibt es ein markiertes Tr (Tr*) und ein markiertes hoch-affines Signal (haS), die ebenfalls unabhängig und trennbar voneinander und von dem rVab durch hoch-affine Sonden erkennbar sind. In jedem Fall tritt eine Erkennung des Ziels auf, egal, ob diese Entitäten Teil irgendeines Typs eines Tr-Komplexes sind, stört jedoch nicht die Fähigkeit des Ziels, an haS* oder rVab zu binden. Zum Beispiel könnte das Markierungs-Epitop in dem Tr* von einem hoch-affinen Ig an Stellen erkannt werden, die im allgemeinen als nicht-neutralisierende Epitope bekannt sind. Große Proteinziele umfassen bekanntlich solche Stellen in internen Peptidsequenzen, am N- oder C- Terminus oder in nicht-modifizierten oder modifizierten Aminosäuren. Diese Epitope müssen nur während der Komplexbildung exponiert werden und müssen nicht aktiv sein, d. h. nicht fähig zur Modulation einer Ziel-Bindung von nS, falls von einem Erkennungs-Antikörper besetzt, der leicht in jedem Fall hergestellt werden kann.
Biotin oder ein integrales Ig-Epitop sind die bevorzugten Marker für Signal-Marker und erlauben, dass Avidin- bzw. Ig-Agarose die quantitative Wiedergewinnungssonde ist, sofern die Marker nicht signifikant die Affinität für das Ziel verringern. Andere mögliche Marker umfassen identifizierbare Peptide oder Proteinsequenzen wie Substanz P, partielle virale Hüllproteinsequenzen aus HSV und Enkephalin. Die Antikörper für solche kleinen Epitope oder Peptide könnten polyklonales oder monoklonales Ig sein, käuflich erhältlich oder rVab, wie hergestellt durch die rekombinanten Verfahren, auf die für die hier beschriebenen Ziele verwiesen wird. Eine Biotinylierung verschiedener Signale und ein Testen für eine Nicht-Interferenz mit nativer Zielsignal-Bindung an Tr ist durch viele bekannte Verfahren verfügbar.
Unter Verwendung eines Ig-Epitop-markierten oder -getagten Tr (Tr*) und eines Biotin-markierten hoch-affinen Signals (haS) wird die Identifizierung und Isolierung eines Paars von modulatorischen Entitäten (in diesem Beispiel sind beide rVab) durch Kombination einer ausreichenden Anzahl an zwei zuvor isolierten großen rVabT+-Populationen, jede mit einem spezifischen Ig-Epitop (Epitop 1 für rVab1 und Epitop 2 für rVab2), mit dem haSbiotin und dem Epitop-getaggtem Ziel (Tr*) eingeleitet, um eine Bildung des trimeren rVab1 : T:rVab2-Komplèxes zu erlauben, der nicht an haSbiotin bindet.
rVab1 und rVab2 können anfänglich in einer Vielzahl von etwa gleichen Konzentrationen von 10 · 1¹ bis zu 10&sup4; M hinzugegeben werden. Die niedrigste Konzentration, bei der eine Ziel-Aktivierung auftritt, wird für die darauffolgenden Manipulationen eingesetzt werden. Die obere Zahl ist zufällig, sollte jedoch theoretisch um einen Faktor von etwa 30 die Konzentration überschreiten, die für eine Bindung von rVab1 oder rVab2 an Tr notwendig ist, um die Stelle abzusättigen und eine Bindung von haS* zu verhindern. Das Gemisch wird sodann für wenigstens etwa 6 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht inkubiert und sodann werden sättigende Mengen von Avidin-Agarose hinzugegeben und das Gemisch zentrifugiert und der Überstand ohne freies haS+biotin oder Tr : haSbiot-Komplexe für eine darauffolgende Verwendung entfernt. Der Überstand mit Dimeren aus Tr : VAB1 und Tr : VAB2 und den gewünschten Trimeren aus Vab1 : Tr : Vab2 wird sodann durch ein Panning über anti-T-Ig gewaschen, das an eine feste Matrix oder einen Träger gebunden ist wie Plastik-Kulturschalen oder Agarose-Säulen-Matrix.
Eine Identifizierung und Isolierung von Tr-Komplexen mit gleichzeitig gebundenem rVab1 und rVab2 kann durch sukzessives Panning über eine Matrix erfolgen, die mit anti-rVab1- und sodann anti-rVab2-Igs beschichtet ist. Von Phagen präsentierte rVabs, die gemäß diesem Verfahren isoliert werden, können getrennt, vermehrt und sodann für eine Sekundär-Zyklisierung durch das vorstehende Isolationsverfahren verwendet werden. Schließlich werden einzeln gereinigte Phagen in identifizierten Kombinationen für eine Kompetition der haStag-Bindung getestet.
In dem vorstehenden Fall können die zwei rVabT-Bibliotheken (d. h. rVabT1, 2&spplus;) leicht z. B. durch Verwendung der CH1-Domäne aus Mensch auf der einen und der CH1-Domäne aus Maus auf der anderen unterschieden werden. Für Mensch- und Maus-CH1 spezifisches Ig ist käuflich verfügbar. Eine Verwendung anderer konstanter Regionen aus einer Spezies ist auch möglich.

e. Verwendung von rVab-Peptid-Bibliotheken und anderer Sonden für die Identifizierung vielfacher LIGATT-Ziele

i. Identifizierung eines ersten Liganden für ein vielfaches LIGATT-Ziel

Es gibt eine Reihe von Varianten zu den vorstehenden Verfahren, bei denen die zweite Entität des für eine Kompetition für haStag-Bindung notwendigen Paars kein weiterer rVab, sondern anstelle dessen ein Mitglied einer anderen Bibliothek mit diversen kleinen organischen Molekülen, Peptiden, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten oder sogar natürlichen Produkten wäre. Unter Ausschluss der Möglichkeit einer sterischen Behinderung sollte die Häufigkeit in der rVab-Bibliothek von Entitäten, die an ein Ziel in einer modifizierenden Weise binden (mit der Maßgabe, dass ihre gepaarte Entität auch vorhanden ist) nicht zu der von rVab unterschiedlich sein, die selbst zu einer Bindung an Tr-Oberflächen und zu einer Modifizierung der Signalbindung fähig sind. Dementsprechend können rVab-Bibliotheken einer Größe, die erfindungsgemäß hergestellt wird, für die Identifizierung beider rVab- Mitglieder eines Paares eingesetzt werden. Alle der vorstehend beschriebenen Bibliotheken mit mehr als 10¹¹ Mitgliedern/ml sollten für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sein, mit der Maßgabe, dass die Häufigkeit für jedes Binde- Ereignis nicht geringer als 10&supmin;&sup5; ist. Eine nützliche Bibliothek oder ein Paar von Bibliotheken sollte ausreichende Mitglieder enthalten, so dass zwei Binde-Ereignisse zugleich auf dem gleichen Tr, der für eine Hemmung der haS*-Bindung notwendige Zustand, zu weniger als etwa ICH1 auftreten werden und somit wenigstens einmal pro Reaktion auftreten. Falls die Häufigkeit eines jeden Ereignisses höher ist, d. h. 10&supmin;&sup4; oder 10&supmin;³, werden diese modulatorischen Komplexe bei einer Häufigkeit von 10-100 pro Test auftreten. Da die Reinigung eines aktiven, von einem Phagen präsentierten rVab pro Zyklus 10&supmin;² bis 10&supmin;³ beträgt, können bis zu vier Zyklen für eine Reinigung der aktiven Entität notwendig sein. Um ein Mitglied des Paars zu erhalten, muss man nur eine der zwei rVab-Entitäten aus dem letzten Schritt aufreinigen. Falls andere Bibliotheken als Quelle des zweiten Paar-Mitglieds verwendet werden, müssen sie überhaupt nicht isoliert werden.

ii. Identifizierung zweiter oder darauffolgender Liganden für Sekundär- LIGATTS eines mehrfachen LIGATT-Ziels

Sobald ein Mitglied (Primärmitglied) des Paars identifiziert wurde, das in dem vorstehend genannten Fall ein rVab wäre, verläuft die Isolierung des zweiten durch Verwendung des ersten Mitglieds bei einer sättigenden Konzentration in allen Reaktionen geradlinig. Dies vereinfacht die Suche für eine einzige Entität, was für einen rVab wie vorstehend erfolgen würde. Jedoch kann man, falls ein rVab eines Paars zu Händen ist, eine chemische sowie eine rVab-Bibliothek für das zweite Mitglied des Paars von Tr-Bindern durchsuchen, die eine Tr-Aktivität bei gleichzeitiger Bindung an das Ziel regulieren. Jedes Mitglied des Paars, insbesondere diejenigen, die als Mitglieder einer chemischen Bibliothek identifiziert werden, sind mögliche Kandidaten für eine Hälfte eines Paars kleiner organischer Moleküle, wobei eines für jede aktive Oberflächendomäne für eine Ziel-Regulation erforderlich ist, die bei einer kovalenten Verknüpfung ein einzelnes aktives organisches Molekül bereitstellen würden, das als DISOMER bezeichnet wird. Solche DISOMERE wären wertvolle Arzneistoff-Entdeckungs-Leitverbindungen.
Ein weiteres Verfahren für eine Identifizierung eines aktiven Paars, d. h. eines Paars, das für die Bindung an Tr in einer Weise, dass haStag verdrängt wird, notwendig und ausreichend ist, ist die Durchführung der ursprünglichen Inkubierung von dem Ziel mit einem Tag (Tr*), hoch-affinem Ziel-Signal (haS) und Ziel-bindendem rVab (rVabTr1 oder Tr2+) in Gegenwart eines Überschusses an markiertem Tr* für eine Verminderung des Auftretens an nicht gebundenem rVabTr1 oder Tr2+ zu einem Minimum. Falls diese Inkubationen in Gegenwart von haS bei etwa einem 100-fachen Überschuss der Tr-sättigenden Dosis erfolgen, werden die einzigen rVab in Lösung diejenigen sein, die von einer Bindung durch haS verdrängt wurden. Dementsprechend sollten die rVab, deren Bindung an Tr durch haS verhindert wurde, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit eine haS-Bindung an Tr verhindern können und sie besitzen erwartungsgemäß die gewünschte Aktivität. Da gebundener rVab von freiem rVab durch Panning über anti-Tr-Ig (oder Avidin mit einem biotinylierten Tr) getrennt werden kann, werden bei einer derartigen Entfernung aller rVab : Tr*-Komplexe die einzigen in der Lösung verbleibenden rVab die Paare sein, die bei einer gemeinsamen Bindung und möglicherweise alleine eine haS-Bindung verhindern. Ein Recycling des Überstands für weitere Male durch ein derartiges Paradigma wird möglicherweise zur Identifizierung des rVab-Paars oder wenigstens eines seiner Mitglieder führen, falls ein anderer Liganden-Typ als Quelle der anderen Hälfte des aktiven Paars verwendet wird.

iii. Verwendung von rVab-Peptid als Oberflächen-Scanner

Für Signale wie Protein-Hormone und Wachstumsfaktoren, wo eine Dimerisierung oder Trimerisierung identischer (d. h. homooligomerer) oder verschiedener (d. h. heterooligomerer) Rezeptor-Einheiten für eine Rezeptor-Aktivierung erforderlich ist, löst die Erfindung das Problem in einer Ausführungsform durch Schaffung bivalenter rVabs, die eine Isolierung bivalenter aktiver rVab-Oberflächen-Reporter erlauben, die zur Identifizierung jeder Rezeptor-Untereinheit-endogener Ligand- TARGATT-Bindestelle fähig sind. Bei diesen Verfahren erfolgt eine Identifizierung bifunktioneller aktiver Oberflächen-Reporter durch Einsatz einer Vielzahl von rVabs, die, wie zuvor identifiziert, eine bestimmte begrenzte Oberfläche einer der Untereinheiten des Ziels (d. h. sie sind T+) oder eine größere Anzahl von einer oder zwei ausgewählten Gruppen von Aminosäuren erkennen, die bekanntlich an einer Bindung von endogenem Ligand beteiligt sind. Die Gene, die für diese rVabT&spplus;- Liganden kodieren, werden modifiziert, um für eine flexible Aminosäure zu kodieren, die im Raster an ein Ende entweder des schwere oder leichte Kette-Konstrukts eine Bibliothek von kleinen zufälligen Peptiden für die Schaffung eines bifunktionellen Scanners (rVabPEP) anfügt. In einer Ausführungsform wird das Peptid von einer DNA kodiert, die an diejenige, die für die schweren oder leichten konstanten Domänen kodiert, fusioniert ist. In einer weiteren Ausführungsform wird ein rVab mit wenigstens zwei Peptiden für eine Identifizierung trimerer Rezeptoren exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek aus bifunktionellen Scannern, bestehend aus rVLCL und einem rVHCHl, für die Identifizierung von rVab-PEPs hergestellt, die eine aktive Oberfläche, bestehend aus zwei TARGATTS auf der Oberfläche des Ziels erkennen. rVab-PEP werden sodann in einem Batch- Verfahren isoliert und einzelne Mitglieder werden darauf als aktive Kompetitoren für die Bindung von endogenem Ligand identifiziert. Solche rVab-PEPs binden nicht signifikant an das Ziel in Gegenwart eines Überschusses an endogenem Ligand. Diese bivalenten rVab-PEPs werden in einer Bindung an das Ziel die Bindung des endogenen Liganden für das Ziel verhindern, der auf einer festen Matrix immobilisiert wurde. Für homodimere Rezeptoren, bei denen jede Ziel-Untereinheit ein TARGATT besitzt, das an den Liganden bindet (wie bei Wachstumshormon- Rezeptor, GHR) würde rVab-PEP isoliert werden. Der rVab-Teil eines ersten aktiven rVab-PEP wird sodann für die Verwendung als Reporter für die Identifizierung von SOMER-Austauschern für das LIGATT markiert, das in dem rVab-Teil der aktiven rVab-PEP-Entität liegt und ein TARGATT auf der Oberfläche des Rezeptors erkennt. Für die Identifizierung eines zweiten SOMER-Austauschers für das zweite LIGATT der rVab-PEP-Entität, die in dem PEP-Teil der rVab-PEP-Entität liegt, wird ein zweiter rVab ohne Peptid aus der Bibliothek von aktivem rVab-PEP identifiziert, der für eine Bindung mit dem Peptid-Teil des ersten rVab-PEP kompetitiert. Das Verfahren des Auffindens der zwei rVab, die den zwei LIGATT enstprechen, die in einer aktiven rVab-PEP-Entität liegen, wird als rVab-Paarung bezeichnet. Der zweite rVab wird sodann für eine Umwandlung in einen Reporter für eine Identifizierung von SOMEREN für die zweite LIGATT-Stelle umgewandelt.
Falls die Ziele Heterodimere sind, ist das bevorzugte Verfahren wie folgt. Die rVabT&spplus; für eine Rezeptor-Untereinheit-Oberfläche I werden basierend auf der Erkennung bekannter Domänen und/oder Oberflächen gruppiert, die Aminosäuren enthalten, die bekanntlich die Bindung von endogenem Ligand beeinträchtigen. Diese rVabs werden sodann als rVab-PEP wie vorstehend beschrieben exprimiert, um eine Serie von bivalenten Liganden zu schaffen. Mitglieder dieser rVab-PEP-Bibliothek, die von dem Ziel durch einen endogenen Liganden verdrängt werden und die auch einen endogenen Liganden von dem Ziel verdrängen, werden wie vorstehend für Homodimer-Rezeptoren selektiert. Eine begrenzte Anzahl (< etwa 10) von rVab- PEPs mit einer Verdrängungs-Aktivität von endogenem Ligand an dem Ziel werden sodann für eine Identifizierung eines Liganden für die zweite (II) Bindestelle selektiert. Ein alternatives Selektionsverfahren für die Identifizierung der Stelle I-Liganden ist die Selektion von rVab-PEPs, basierend auf ihrer Fähigkeit, das Ziel zu aktiveren. Eine Aktivierung kann wie vorstehend beschrieben nachgewiesen werden, basierend auf der Modifikation eines allosterischen Effektors oder auf einer anderen nachweisbaren Veränderung, die mit einer Rezeptor-Aktivierung assoziiert ist. Zum Beispiel kann eine Aktivierung mit einer Eigen-Phosphorylierung oder -Dimerisierung assoziiert sein. rVabs für die zweite TARGATT-Stelle auf der zweiten Rezeptor-Untereinheit des Heterodimers werden in einer Ausführungsform durch Expression von rVabs als eine rVab-PEP-Bibliothek identifiziert, wobei rVabs verwendet werden, die zuvor als kompetitiv für den endogenen Liganden an der Stelle II identifiziert wurden. Die resultierende rVab-PEP-Bibliothek für die Stelle II wird sodann für eine Aktivität wie vorstehend beschrieben getestet und aktive Mitglieder werden isoliert.

V. Identifizierung von rVab, die selektiv sind (S&spplus;)

Für die Isolierung derjenigen rVab, die selektiv für nahe verwandte Mitglieder einer Zielfamilie oder irgendeines interessierenden Ziels sind und die zwischen diesen unterscheiden (d. h. sie sind selektiv), kann das nachstehende Batch-Selektionsverfahren eingesetzt werden. Der untersuchte rVabT&spplus; wird mit Matrix-immobilisiertem Ziel (m-T) gemischt und es wird erlaubt, Komplexe in Gegenwart löslicher Peptide, rekombinant erhaltener Proteinfragmente oder intakter Ziele zu bilden, deren identische (oder verwandte) Sequenzen oder Konformationen in Zielen vorgefunden werden, an die die rVab nicht binden sollen. Diese Sequenzen sind typischerweise zwischen etwa 6 bis 12 Aminosäuren lang und treten in den Zielen für andere endogene Liganden der gleichen Genfamilie auf. Nach einer ausreichenden Zeit für eine Komplexbildung werden die rVabT&spplus;, die immer noch an die Matrix gebunden sind, durch Panning isoliert und vorzugsweise zwei- bis dreimal für eine Anreicherung, wie vorstehend beschrieben, angereichert, um rVabT&spplus;S&spplus; abzuleiten. Dieses Verfahren kann vor oder nach irgendeinem der vorstehenden Verfahren erfolgen, die eine Isolierung von aktiven (A&spplus;) oder Ziel-erkennungspositiven (T&spplus;) Bibliotheksmitgliedern betreffen.
Falls alle Screens für T, S und A erfolgt sind, wäre die endgültige Bibliothek rVabT&spplus;A&spplus;S&spplus;, falls es nur ein LIGATT und ein TARGATT gab, die für eine Regulation des Ziels erforderlich waren, und repräsentiert daher einzelne Entitäten, die Zielstellen beschreiben und die für ein Screening von SOMEREN mit allen drei Eigenschaften eines CAP geeignet sind. Falls mehr als ein LIGATT und ein TARGATT für eine Zielregulation erforderlich sind, d. h. falls das Ziel ein Multimer oder sogar ein Monomer, jedoch mit mehrfachen TARGATT-Domänen ist, kann das vollständige CAP, einschließlich Aktivität (A&spplus;) nur mit einem bivalenten rVab beobachtet werden, wie in einem aktiven rVab-PEP aufgefunden würde. In solchen Fällen wäre der rVab-Teil des aktiven bivalenten rVab alleine nicht aktiv. Nichtsdestotrotz wird er als A* bezeichnet, da er immer noch SOMERE identifizieren kann.
Eine hoch-affine (weniger als oder gleich etwa 30 nM) und eine selektive Zielerkennung erfordern nicht, dass die Antigen-Tasche des Vab aus zwei V-Domänen besteht, wie bei nativen Ig-Molekülen, sondern sie kann aus einer einzigen VH- Domäne mit nur 3 CDRs bestehen. Basierend auf der Information im Stand der Technik werden Verbesserungen bei der Herstellung nützlicher Einzelketten (rVvx; d. h. vh oder vl) mit T&spplus;-, S&spplus;- und A&spplus;-Eigenschaften zur Verwendung konstanter Domänen, die zu CH1 unterschiedlich sind, d. h. unter Verwendung von gamma 2 oder 3 oder delta, erwartet. Erfindungsgemäß wird das Erfordernis für eine Löslichkeit der rekombinanten Proteine erkannt, die für die Herstellung der Mitglieder der rVab-, rVvx- und rVab-PEP-Bibliotheken verwendet werden. Um einvernehmlich sein, würden Veränderungen in der Löslichkeit VH- und VL-Strukturen in einem rVab nicht gegenteilig beeinflussen.
Bei Verwendung von Einzelketten-Bibliotheken werden die rVvx-Entitäten selektiert, die die Aktivität des pharmakologischen Ziels durch Bindung an seine Oberfläche modifizieren. Diese werden als aktive rVvxT&spplus;A&spplus;-Bibliotheken (LIB) bezeichnet. Aktive werden isoliert, basierend auf:
i. denjenigen, deren Bindung durch die Gegenwart des endogenen Liganden modifiziert wird.
ii. denjenigen, deren Bindung durch irgendeinen allosterischen Regulator des Ziels modifiziert wird.
iii. denjenigen, deren Bindung das Ziel verändert (d. h. Ziel- Phosphorylierung oder Assoziierung mit G-Proteinen).
Im Fall von i und ii werden Aktive als lösliche Entitäten isoliert und in iii durch anti-PO&sub4;-Protein- oder -G-Protein-Antikörper gefällt. In i wird der endogene Ligand bei 300 · Kd eingesetzt. In allen Fällen werden Positive geerntet, vermehrt und erneut isoliert.
Eine Gruppierung erfolgt gemäß der gemeinsamen Oberflächendomäne, die durch Re-Sreening einer aktiven rVvxT&spplus;A&spplus;.LIB gegen ein Ziel in Gegenwart kleiner Peptide (10-12 Aminosäuren) oder großer, rekombinant hergestellter Peptide (20-50 Aminosäuren), die die Zieldomäne definieren, erkannt wird. In diesem Test werden diejenigen, die in Gegenwart von Peptid löslich sind, zusammen gruppiert und alle Daten werden für die Herstellung einer Antikörper-Oberflächenkarte verwendet.
Die Mitglieder der rVab-Bibliothek, die bei automatisierten Bindetests und Screens für SOMERE an voridentifizierten Zielstellen besonders nützlich sind, besitzen vorzugsweise die nachstehenden Charakteristika.
a. ≤30 nM Affinität für das Ziel.
b. erkannte Zielstellen sind kleiner als diejenigen, die von den endogenen Ligand-Signalen verwendet werden.
c. Besitz einer Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität bei einer Bindung an eine aktive Landschaft, entweder die, die von dem endogenen Ligand verwendet wird oder allosterische Stellen.
d. Spezifität für eine Bindung an nur eines unter vielen verwandten Mitgliedern einer Zielfamilie.
e. kleine nicht-spezifische Bindung an nicht-verwandte Ziele und Substanzen, die mit Test selbst in Bezug stehen.
f. leichtes, homogenes und einzelnes Tagging mit einem Marker.
g. Markierung, die eine schnelle und sensitive Quantifizierung der Ziel- Bindung erlaubt.
h. ein Gerüst mit einer bekannten Struktur, die die räumliche Lage der Kontaktpunkte des Reporters mit seinem Ziel skizziert.
Die letztere Eigenschaft ist entscheidend für die Auflösung der SD-Struktur von aktiven SOMEREN, da es eine Lösung des Problems erlaubt, die SD-Gestalt des LIGATT auf den Ziel-Oberflächen-Scannern, die aktiv sind und sich in Kontakt mit dem Ziel befinden, abzuleiten, nachdem die eindimensionale lineare Aminosäure- Sequenz des Reporters erhalten wird, wobei genetische Algorithmen eingesetzt werden. Die SD-Landschaft des LIGATT auf dem aktiven rVab ist direkt in eine SD- Landschaft in der Suche nach SOMEREN transformierbar.

VI. Identifizierung biologisch verstärkter Ensemble-Pharmakophore (BEEP)

A. Kombination der Strukturinformation aus identifizierten Mitgliedern einer Bibliothek, die gewünschte Eigenschaften einer Wirksamkeit, Aktivität, Selektivität und Spezifität besitzen

Bei einem Versuch der Identifizierung nützlicher rVabs und der Ableitung der Struktur des BEEP ist die Fähigkeit zur genetischen Vereinfachung (z. B. Verringerung der Anzahl oder Größe) oder der weiteren Diversifizierung (z. B. Erhöhung der Zahl an randomisierten Aminosäurepositionen oder erhöhte Größe) von CDRs und CSRs in aktiven rVab-Bibliotheken oder in einem rVab von entscheidender Bedeutung. Dies beruht darauf, dass nicht alle Kontakt-Aminosäuren die gleiche Energie zur Antikörper-Bindung und manchmal eine Aminosäure > 99% der Bindeenergie ausmacht. Nur die 3 CDRs eines VH können 10-100 nM an Ig-Ziel-Affinität bereitstellen. rVab-Phagen-Bibliotheken mit etwa 1012 Mitgliedern mit Sekundär- Diversifizierungen in irgendeiner Anzahl von Regionen können von einer kleinen Anzahl an aktiven rVabs abgeleitet werden, die anfänglich durch zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren aufgefunden wurden, wobei PCR wie für die Herstellung der rVab-Bibliothek verwendet (vgl. nachstehend) und/oder bekannte Oligonukleotid-Insertion eingesetzt wird, um eine annehmbar große Quelle von Ziel-Oberflächen-Scannern und -Reportern bereitzustellen, wie von dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform vorgesehen. Weiterhin ist klar, dass aktive Oberflächen-Scanner-rVab erforderlich sein werden, die verschiedene lokale Oberflächen auf dem Ziel erkennen, um ausreichend große Mengen an eindimensionaler Aminosäuresequenz-Information für die genaue Ableitung eines BEEP bereitzustellen, das nicht nur für die Vorhersage der Struktur eines SOMERS genau ist, sondern das Ensemble von aktiven SOMEREN vorhersagen kann, die an diese Stelle binden können.
Ein besonderer neuer erfindungsgemäßer Aspekt ist, dass ein Weg für eine Reduktion der CDR-Regionen eines VH oder VL alleine oder in einem Komplex miteinander als rVab zu einer Minimum-Struktur bereitgestellt wird, die die Zielstellen besetzt, die von dem rVab erkannt werden, und ein gewünschtes CAP besitzt. Ein Vorteil der Identifizierung einer derartigen Minimum-Struktur ist die mögliche Verringerung der Ziel-Affinität auf einen Grad, der in Standard-Bindetests durch endogenen Liganden und mögliche SOMERE kompetitierbar ist, und der Anzahl an entscheidenden Atomen, die an einem Zielkontakt teilhaben. Je geringer die Anzahl an Kontaktpunkten, desto einfacher ist die Auflösung des BEEP.

B. Schaffung von BEEPs für jede aktive rVab-Untergruppe

Erfindungsgemäß werden BEEPs geschaffen, die die Koordinaten und Eigenschaften der aktiven Elemente der SD-Oberfläche aktiver SOMERE für eine bestimmte Oberflächen-Domäne auf bestimmten pharmakologischen Zielen enthalten. Der Startpunkt dafür ist die Gruppierung von rVabT&spplus;S&spplus;A&spplus;-Mitgliedern der rVab-Bibliothek gemäß einer gemeinsam erkannten Ziel-Oberflächen-Domäne, die in dem ersten Fall diejenige sein wird, die mit dem endogenen Ligand überlappt oder identisch ist.

Bevorzugte Ausführungsform:

a. Jede Oberflächengruppe wird partitioniert und ein rVabT&spplus;S&spplus;A&spplus; für diese Gruppe wird isoliert. Das VHCH-Gen wird sodann kloniert und für die Ableitung einer neuen kombinatorischen Bibliothek eingesetzt. Für die Ableitung dieser neuen kombinatorischen Bibliothek wird das Monierte rVHCHn mit allen rVLCL für rVab-Mitglieder gepaart, die an die gemeinsame Oberfläche binden.
b. Alle neuen kombinatorischen rVab-Mitglieder (d. h. rVHCHn : rVLCLn....rVab), die T&spplus;S&spplus;A&spplus; für die ursprüngliche gemeinsame Ziel-Oberflächen-Domäne sind, werden durch Panning (wie für die ursprüngliche Bibliothek erfolgt) isoliert. Diese Bibliothek wird rVabvHn genannt. Dies wird für jedes VHCH in den ursprünglichen rVab wiederholt, wodurch ein rVabvHn+1,n+2,n+...-Satz abgeleitet wird, der alle verwandten VH und VL für eine bestimmte Oberflächendomäne identifiziert. Diese Bibliotheken werden vielfache Kombinationen definierter VH-Gene mit allen VLs für eine bestimmte Oberfläche bereitstellen. Alternativ können diese verschiedenen Bibliotheken durch Identifizierung spezieller VL-Gene und deren Klonierung in Bibliotheken mit allen für ein bestimmtes Oberflächenziel identifizierten VH-Genen hergestellt werden.
c. Bestimmung der Aminosäuresequenz aller VL in dem Satz mit Hilfe von PCR, die an alle VHs in der Bibliothek binden können.
d. Wiederholung von a-c für alle aktiven VH unter Verwendung von [VL]n,n = 1n = 2n+....
e. Die räumlichen Koordinaten für das Gerüst des parentalen Antikörpers, in den alle randomisierten CDRs gesetzt wurden, zusammen mit den Koordinaten der verschiedenen CSR und CDRH3 für die aktiven VH und VL derjenigen Entitäten, die in der bestimmten lokalen Ziel-Oberflächen-Domäne-rVab-Bibliothek, die untersucht wird, aufgefunden werden, zusammen mit den in diesen CSRs und CDRs identifizierten Aminosäuren werden in einem genetischen Algorithmus für die Bestimmung der 3D-Konformation der Landschaft des pharmakologischen Ziels gelöst, die von allen aktiven rVab-Mitgliedern besetzt wird, die die gleiche Oberflächendomäne erkennen. Diese Lösung ist ein biologisch verstärktes, zusammengefügtes Pharmakophor (d. h. ein BEEP).
f. Wiederholung für eine rVab-Bibliothek für andere lokale aktive Ziel-Oberflächen-Domänen.
g. Falls irgendeine Datenbank nicht ausreichend ist, wird der entsprechende Satz an VH-Genen genommen und ihre CDRH3-Domäne herausgeschnitten und durch ein zufälliges Oligonukleotid ersetzt, das für eine Peptid-Bibliothek mit vorzugsweise 8-10 Aminosäuren kodiert. Die mögliche Größe dieser Bibliothek beträgt etwa 8²&sup0;-10²&sup0; Mitglieder. Die Selektionen werden wiederholt, um eine neue Diversität-verstärkte Bibliothek zu erhalten.

C. Verwendung genetischer Algorithmen für die Herstellung von BEEPS

Die Herstellung des BEEP beginnt nach Isolierung eines Satzes an aktiven rVabs {Vi}i = N, der Mitglieder (Vi) enthält, von denen bestätigt wurde, dass sie die gewünschten Eigenschaften einer Affinität, Selektivität und Aktivität an dem Ziel besitzen, wobei N = die Anzahl an solchen Mitgliedern innerhalb des Satzes. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jeder aktive rVab alle drei vorstehend genannten Eigenschaften aufweisen, jedoch ist auch möglich, dass nur zwei oder nur eine der Eigenschaften gewünscht sein werden und daher vorhanden sein werden. Für diese Beschreibung verweist TSA+ auf den aktiven rVab, unabhängig davon, welche Eigenschaften vorhanden sind. Jedes TSA+ rVab-Mitglied wird sodann isoliert und seine Aminosäuresequenz in an sich bekannter Weise bestimmt. Zum Beispiel werden häufig käuflich verfügbare Kits und ein automatisches Sequenziergerät (ABI, USA) eingesetzt.
Gemäß diesem Modell vermutet man, dass eine aktive Ziel-Oberfläche an verschiedene rVabs durch die gleiche Stelle der Ziel-Oberfläche bindet und entsprechend erwartet man, dass wenigstens eine Untergruppe dieser rVab ähnliche Oberflächen besitzen. Somit zeigt das Auffinden eines wiederkehrenden, d. h. gemeinsamen Oberflächenmotivs (das wir als BEEP bezeichnen) in verschiedenen rVabs: a) dass die gemeinsame rVab-Oberfläche eine Rolle bei Ziel:rVab-Interaktionen spielt und b) dass diese Interaktion von anderen Molekülen mit ähnlichen Oberflächen dupliziert werden könnte. Darin ist es eine gemeinsame Oberfläche, die für den gemeinsamen Phänotyp von wenigstens einer Untergruppe der Li-Mitglieder des ursprünglichen Satzes von TSA+ rVabs verantwortlich ist. Es kann eine oder mehrere gemeinsame Oberflächen in dem ursprünglichen Satz von TSA+ rVabs geben. Diese Duplikation nimmt zuerst die Form des BEEP und sodann kleiner organischer Moleküle an.
In Anbetracht einer derartigen Sammlung von TSA+ rVabs und ihrer Aminosäuresequenzen wird ein vorläufiger Satz von Oberflächen-Scannern {Li}i = N, wobei jedes Li ein Modell eines Antikörper-Moleküls ist, erfindungsgemäß unter Einsatz der kanonischen Strukturprinzipien von Chothia (Chothia und Lesk, 1987; Chothia, 1989 und Chothia, 1992) und der Information über die Kristallform des parentalen Antikörpers, der als Gerüst für die Herstellung der rVab-Bibliothek, wie erfindungsgemäß beschrieben, eingesetzt wurde, hergestellt. N ist die Anzahl an solchen TSA+ rVab-Oberflächen-Scannern, die die grundsätzliche Geometrie definieren, welche die Position von Oberflächenatomen in verträglichen Entfernungen voneinander in einer allgemein bekannten Struktur ist. Deskriptoren der Gestalt beruhen auf bekannten Gestalten von CSR und CDRH3 und der Aminosäuresequenz in diesen Domänen. Sodann werden bekannte chemische Charakteristika betrachtet wie Ladung, hydrophobe Interaktionen, exponierte /verborgene Oberflächenbereiche, Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen, usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jeder TSA+ rVab eine VH- und eine VL- Kette mit 6 komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), wobei drei (CDRVL1, 2, 3) sich innerhalb des VL befinden und drei (CDRH1, 2, 3) sich innerhalb des VH befinden. Ferner gibt es in der bevorzugten Ausführungsform die 5, 1 und 6 verschiedenen kanonischen Strukturen, die aus verschiedenen bekannten kanonischen Schleifen- Strukturen bestehen, die für jedes CDRVL1, 2 bzw. 3 möglich sind, und es gibt 3 und 4 verschiedene kanonische Strukturen, bestehend aus bekannten kanonischen Schleifen- Strukturen, die für jedes erfindungsgemäße CDRH1 und 2 möglich sind. Die CDR für H3, obwohl nicht kanonisch, wird in der parentalen Bibliothek eine von drei definierten Strukturen besitzen, bevor die Aminosäurepositionen in einer jeden randomisiert werden. Ferner stellt die zuvorige Kenntnis des rVab-Gerüsts und der Beziehung der 6 CDR-Domänen in dem Gerüst zusätzliche Strukturinformation für die Herstellung eines Li und möglicherweise eines BEEP bereit. Zusätzlich werden, da die Anzahl bekannter Antikörper- Strukturen steigt, neue kanonische Strukturen bekannt und können in die rVab-Bibliotheken eingebaut werden, um eine Isolierung von TSA+ rVabs zu ermöglichen, die solche Struktur-Schleifen enthalten.
Jeder Li kann für die erfindungsgemäßen Zwecke durch die Atom-Koordinaten der beteiligten Atome des rVab, der ein Mitglied des TSA+-Satzes ist, wiedergegeben werden. Die Oberfläche (S.) des vorläufigen Modell-Li kann durch seine CSRs und CDRs definiert werden, wobei
Si &sim; [(CSR1)i, (CSR2)i, (CSR3)i, (CSR4)i, (CSRs)i, (CDR6)i]
worin 1 bis 5 CSRVL1, 2 und 3 und CSRH1, 2 bzw. 6 CDRH3 bezeichnet und worin es bei jedem (CSR)i für Li eine bestimmte Sequenz gibt.
Die Oberfläche (Sij) kann im Raum durch Transformation der Atom-Koordinaten des Li repositioniert und reorientiert werden, gemäß: Sy = Gij * Li, worin Li ein Modell eines Oberflächen-Scanners i ist, definiert durch die Koordinaten seiner Atome und Gij eine Matrix ist, die Li transformiert. Ferner wird Gij durch die Translation und die Rotationsparameter (Ψi, χi, ωi, xi, yi, zi)j parameterisiert. Somit werden mit einer Rotation und Bewegung des Scanners i in eine neue Position j die CDR von ihm mitgetragen.
Der erfindungsgemäße genetische Algorithmus, hier als DIOGAM bezeichnet, nimmt den anfänglichen Satz von {Liº}, wobei das hochgestellte Symbol (º) "vorläufiges Modell" bedeutet, als Eingabedaten für die Schaffung aus diesen Daten der theoretischen gemeinsamen Oberfläche (d. h. das BEEP) als Ausgabe, die die beste Überlappung in Bezug auf die Chemie und Geometrie für Mitglieder des Satzes darstellt.
Im allgemeinen arbeitet ein genetischer Algorithmus (Holland, J. H., 1992 und Goldberg, D. E., 1989) auf "Genen" für die Schaffung einer Variation, die durch eine Selektion "Überlebende" ergibt. Die Gene von Überlebenden (bewertet durch die "Fitness") werden sodann mutiert, um neuere Nachkommen für eine weitere Fitness-Selektion herzustellen. So werden mutierte Gene gemäß dem erfindungsgemäßen genetischen Algorithmus DIOGAM hergestellt und kodieren veränderte Oberflächen, die wiederum veränderte Phänotypen sind.
Die Definition eines "Gens" für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Modell sind spezifische Sätze von Werten für die Parameter von Gi: (Ψi, χi, ωi, xi, yi, zi)j. Eine Variation dieser Parameter verändert die Position der Oberfläche Sij, die erfindungsgemäß als der Phänotyp des gegebenen Gens definiert ist.
Hier ist [{Giº}j = 1, M ist eine Population von M-Variationen des Modells Li, die alle möglichen Arten für eine Variation der Oberfläche des Modells auf jedem Mitglied des TSA+ rVab-Satzes umfasst, was darauffolgende Modelle ergibt (erste Nachkommen-Generation, zweite Nachkommen-Generation, n-te Nachkommen-Generation-Modelle [1-n]), wobei n = Anzahl der Generation.
Die anfängliche Schaffung vorläufiger Modelle folgt in einer Ausführungsform dem Computer Vision-Algorithmus für einen Struktur- und Oberflächen-Vergleich von Proteinen (Fisher et al., 1994), wobei eine kleine Anzahl von Punkten, rotational und translational in der Art für eine einzigartige Definition verwendet werden. Dieses Verfahren basiert auf dem vorhergehenden Verfahren des Geometrie Hashing- Paradigma (Lamdan und Wolfson, 1988 und Lamdon Schwärzt und Wolfson, 1990). Dieses Verfahren findet SD-Motive in verschiedenen Segmenten oder durch isolierte einzelne Aminosäuren, unabhängig von irgendeiner linearen Sequenz von Aminosäuren. Das Letztere sieht den Einbau aller wichtigen Aminosäuren oder Gruppen davon vor, die in den 5 CSRs und 1 CDRH3 liegen, und selbst nicht in einer einzigen linearen Sequenz in irgendeinem rVab auftreten.
Unter Verwendung von nur Distanz-Invariablen erhält dieses Programm Daten aus einer Oberflächen-Superpositionierung, was dann für die Auflösung von Teilen des rVab eingesetzt wird, die analoge Teile von Oberflächen von Liganden darstellen, die direkt an Ligand-Ziel-Bindeerfordernissen beteiligt sind, d. h. dem "Docking- Problem". Verschiedene Typen einer Oberflächen-Superpositionierung können eingesetzt werden und umfassen Docking von rVabs, einem rVab und einem Ziel und einem rVab und einem Zielverwandten Liganden. DIOGAM verwendet eine wirksame automatisierte Computer Vision-basierende Technik für einen Nachweis von dreidimensionalen strukturellen Motiven (Fisher, D. et al., 1992; Bachar, O. et al., 1993). Bei diesem Verfahren werden Seed-Matches zuerst gefunden, basierend auf dem geometrischen Hashing-Paradigma, wobei die düster von Seed-Matches mit Hilfe von Rotations- und Translations-Parametern für eine Fixierung der 3D-Bewegung aufgefunden werden. Hier werden die Seed-Matches mit Bällen einer spezifischen Größe erfolgen, wobei verschiedene Paare von Bällen verwendet werden und das darauffolgende Clustering durch eine bekannte CSR-Struktur und CSR- und CDR-Beziehungen in jedem rVab hinzugefügt wird. Erweiterungen werden umfangreich sein und werden möglicherweise alle Aminosäuren in jedem CSR und CDR unter Verwendung reiterativer wachsender Zyklen umfassen.
Ein solches Clustering und Erweiterung (hier als Mutationen eines zusätzlichen Grads bezeichnet (vgl. nachstehend)) können für die Chemie- und Energieanalysen eingesetzt werden. Ein Modelling wird anfänglich getrennt erfolgen, sodann in einer aggregierten Weise.
Darin gibt uns für jede Nachkommen-Generation die Summe von {Sijn}, worin j = j'tes Mitglied des i'ten Scanners, wie er in der n'ten Generation erscheint, eine Ziel- Fitness-Landschaft (Ti): dies ist ein Satz von Zahlen, die chemische und geometrische Eigenschaften des maximal-überlappten Satzes von Sij darstellen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke ist Tn ein Vektor, dessen Komponenten, tj, in nicht begrenzender Weise skalierte elektrostatische Energie, verborgene Oberflächenbereiche, Wasserstoff-Bindungen und lokale Krümmung umfassen.
Mit dem Fortschreiten des Algorithmus berechnet er auf jeder Stufe die Ziel-Fitness-Landschaft (T) und ermittelt eine Mutationsstrategie für die nächste Stufe. So werden in Abhängigkeit von der Strategie alle N-Gene mutiert, was neue Phänotypen schafft, für die ein neuer Wert von T berechnet wird. Der Prozess ist vollständig, wenn T nicht mehr weiter maximiert werden kann.
So verändert DIOGAM den Satz von (Ψi, χi, ωi, xi, yi, zi), um die besten Überlappungen im allgemeinen Sinn (Geometrie, Energie und Chemie) zu erreichen und das Ergebnis sind neue Ziel-Fitness-Landschaften (d. h. T), die als Minimum definiert sind, falls eine Maximum-verallgemeinerte Überlappung erzielt wurde.
Die nächsten oder die zwischenliegenden Phasen von DIOGAM erlauben eine Variation (d. h. Mutation) in den Li selbst und so umfasst der genetische Algorithmus eine genetische Variation von CSRs und CDRs. Für DIOGAM ist das mutierte Gen (d. h. das vergrößerte oder variierte Gen) die Sammlung von Rotamer-Winkeln der Seitenketten selbst in den CSRs und CDRs. Derartige Änderungen würden z. B. eine Veränderung der Rotation um eine Cα-Cβ-Bindung (C = Kohlenstoff) umfassen, die im Fall eines Valins dieses im Ergebnis in drei verschiedene Positionen stellen. Für ein Arginin gibt es bis zu 27 Rotomere der Guanidiniumgruppe. In der bevorzugten Ausführungsform werden strukturelle Variationen schon frühzeitig erfolgen. Unter Betrachtung der Mutationsereignisse könnte ein anderer Grad der Variation eine Schwingung der Modelle sein. Weitere Mutation (d. h. Variation) wären Veränderungen in dem Winkel zwischen VH und VL von 0-15 Grad, was die Wirkung hat, dass die Zielreste in den Genen über eine große Distanz verschoben werden, was als Verschieben von Cα-Positionen betrachtet werden kann. Diese Mutationen werden "katastrophale Ereignisse" umfassen, die globale Bedeutungen für die Position der Aminosäure in dem CSR oder CDRH3 haben. Diese Mutationen ermöglichen, dass das Einschließen von lokalen Minima vermieden wird. Obwohl die vorstehenden Mutationsereignisse die ersten zwei bevorzugten sind, wird die Reihenfolge der Veränderungen während des gesamten DIOGAM-Programms modifiziert werden.
Anzumerken ist, dass VH CDRH3 ein spezieller Fall ist. Dies ist so, da es zum einen keine kanonischen Strukturen für CDRH3 gibt und zum anderen es die größte CDR-Region mit Insertionsgrößen von nahezu bis 24 Aminosäuren ist. Des weiteren kann sie den Winkel zwischen VH und VL beeinflussen. Daher ist diese Region diejenige mit den meisten Variationen und den geringsten strukturellen Einschränkungen.
Gemäß dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform gibt es zwei Positionen in jedem CSR-Gen, die nicht seine kanonische Struktur verändern und die in der rVab-Bibliothek in Bezug auf die Aminosäure randomisiert werden. Dies ergibt die Möglichkeit eines Auftretens irgendeiner von 20 Aminosäuren an diesen zwei Positionen in jedem CSR und CDRH3 in irgendeinem der analysierten Li-Mitgliederselektierten TSA+ rVab-Sets. Darin gibt es in der Variationsphase der ersten Stufe von DIOGAM eine zufällige "Mutation", was hier Rotation bedeutet, des Gens, was eine Präsentation der verschiedenen möglichen Rotamere für diese zwei bestimmten Aminosäuren erlaubt, die in einem TSA+ rVab an jeder der zwei randomisierten Positionen in dem Gen gefunden werden. Solche Mutationsereignisse werden auch später bei VH CDRH3 an seinen zwei randomisierten Aminosäurepositionen verwendet.
Diese Mutanten werden sodann durch DIOGAM analysiert werden, um andere Sätze von T1-n in der vorstehend beschriebenen Weise abzuleiten.
Zusätzliche Mutationsereignisse können auch für die Herstellung einer weiteren Diversität eingesetzt werden, um vollständiger die Minimum-Strukturerfordernisse für eine Definition der gemeinsamen Überlappung (d. h. BEEP) zu definieren, die den besten TSA+-Phänotyp für die aktive Stelle des Ziels besitzt. Mutationsereignisse, die eine Fitness bewirken, werden in nicht begrenzender Weise hydrophobe, elektrostatische und konformationelle Entropie-Effekte, Oberflächenrauhheit, Oberflächenkrümmung, Vermeidung ungepaarter Ladungen, günstige und ungünstige sterische Interaktion funktioneller Gruppen umfassen und werden durch verfügbare Programme wie COGEN (Bruccoleri, R. E. und Karplus, M., 1987; Novotny, J., Bruccoleri, R. E. und Saul, F. A., 1989 und Tulip, W. R. et al., 1994) und das mehrfache Kopie-gleichzeitige Suche-Verfahren von CHARMM charakterisiert werden (Miranker, A. und Karplus, M., 1991; Patai, S., 1989 und Brooks, B. R. et al., 1993), wobei Funktionalitäts-Deskriptoren mit weniger Atomen (Andrews, P. R., Craik, D. J. und Martin, J. L., 1984) oder eine sphärische Approximierung auf eine Multi-Atom-Gruppe (Goodford, P. J., 1985 und Goodsell, D. S. und Olson, A. J., 1990), basierend auf der zeitabhängigen Tartree-Approximierung oder -Minimierung (Eiber, R. und Karplus, M., 1990) eingesetzt werden.
Sobald diese Mutationsstufen (1º-nº Stufen-Mutationen) einmal für jedes Liº durchschritten wurden, gibt es neue Abkömmlinge (vielleicht hundert bis tausend) der unsprünglichen parentalen rVabs. Struktur-Parameter der zweiten werden sodann durch den "Nussinov-Computer Vision"-Algorithmus (Fisher et al., 1994) geschickt, um das beste Alignment zu erhalten. Details dieses Verfahrens und manche Applikationen des Programms (Fisher, D. et al., 1992 und Bachar, O. et al., 1993) sind durch eine Referenz erfindungsgemäß einbezogen. Die niedrigsten Werte der Zielfunktionen für jeden Tn werden unterschiedlich sein. Die Werte werden in nicht begrenzender Weise rms (für geometrische Überlappung), AG (Gibbs freie Energie) und Chemie umfassen. Die Mutationsereignisse werden Nachkommen schaffen, die dahingehend selektiert werden, dass sie < rms-, < Energie- und < negative Chemie- Werte als die der parentalen Ziele besitzen. Zusammen definiert die Summe dieser Werte eine Gesamt-Ziel-Fitness-Landschaft für jeden Tn.
Bei dieser Stufe wird DIOGAM käuflich verfügbare Algorithmen verwenden, wie bekannt und von den Versorgern beschrieben (vgl. Goldberg, 1990), um die Ergebnisse jedes Fitnesstests zu verzeichnen und zu registrieren. Bei dieser Stufe wird es sodann eine Liste von φi, χi, ωi, xi, yi, zi für jeden Lin und eine laufende Fitnessbewertung (Tijn) geben. DIOGAM geht sodann zu dem nächsten Zyklus genetischer Variationen zurück, wobei diese Iterationen für abertausende von Generationen zugleich oder in einer geordneten Weise durchgeführt werden, was bei seiner Beendigung eine Liste von besten Minima bereitstellen wird, die das BEEP der ersten Stufe sein werden, d. h. die beste Überlappung der Oberflächen, die in dem Satz von aktiven TSA+ rVab enthalten sind.
Wir haben dies manuell in dem Fall von zwei Antikörpern (NC10 und NC41) gegen die gleiche Stelle (Epitop) auf der Oberfläche von Neuraminidase (Tulip, W. L. et al., 1994 und Malbi, R. L. et al., 1994) durchgeführt, die kristallographisch definiert wurden, was uns eine Population bereitstellt, die hier nur zwei Mitglieder enthält, die sich der TSA+ rVab-Population nähert, die erfindungsgemäß isoliert wurde. Eine Analyse dieser Population zeigte eine Überlappung von Antikörper-CSR und -CDR-Oberflächen, die an das gleiche Epitop gebunden sind. Daher kann eine Sij- Oberfläche, wie erfindungsgemäß vorgesehen, hergestellt werden.
Bei dieser Stufe geht DIOGAM nun zu der Mutationsstufe zurück und wiederholt, d. h. ändert zufällig die Rotamer-Position, die den Satz überlappt, und schafft dabei einen etwas anderen Satz an φi, χi, ωi, xi, yi, zi, findet jedoch, was wichtiger ist, Ts, die von ihren Vorgängern abweichen (höher oder niedriger). So wird jede Eigenschaft eines jeden Gens erneuert, um die Tatsache widerzuspiegeln, dass es in einer steigenden Weise (unterschiedlich) zu einem robusteren Phänotyp beitrug (Ziel-Fitness-Landschaft).
DIOGAM steuert den Algorithmus, um in seine nächste Stufe einzutreten, die nach vielen derartigen Mutations-Wiederholungen gestartet wird, seine Crossover- oder seine Rekombinationsstufe, wo es neue Kombinationen von Genen schafft, selbst, ohne zu wissen, was in Bezug auf bestehende Gen-Mutationen gut ist (bessere Fitness). Diese Kombinationen, d. h. eine Paarung von Genotypen (oder Isogenotypen) basieren auf T-Wertungen, einer gleichen Phänotyp-Selektion für bessere Fitness, wobei Fitness definiert wird als Beitrag zu der maximalen Gesamt-Überlappung.
Es soll angemerkt werden, dass eine Überlappung nicht auf die physikalische Besetzung des identischen Raums begrenzt ist, sondern auch eine Überlappung umfasst, die z. B. als Ladungs-Neutralisierung definiert ist, wobei z. B. zwei negativ geladene Reste als "überlappend" bewertet werden können, falls sie sich innerhalb eines Abstands einer positiven Ladung befinden könnten.
In diesem gesamten Prozess ist es wichtig, dass die Auswahl des Teströhrchens von TSA+ rVab aus den großen rVab-Bibliotheken die richtige Kombination von Genen auswählt, die gegenwärtig in keiner Weise im voraus erraten werden kann. Per Definition ist die Kombination, die bei dem aktiven TSA+ rVab auftritt, "korrekt", wenn er die Oberfläche enthält, die für das gewünschte Aktivitätsprofil notwendig ist, d. h. bestehend aus einer oder mehr der gewünschten Eigenschaften einer Affinität, Selektivität und/oder Aktivität auf das Ziel.
Zusammenfassend ist in unserem genetischen Algorithmus, DIOGAM, das Gen der Gegenstand, die Mutation ist die Veränderung und die frühe Auswahl ist der Test durch Wiederholung, um eine bessere Anzahl von einzelnen Genen zu erhalten. Dies wird dann durch einen Crossover unter Verwendung einer genetischen Logik von Stücken von Genen gefolgt, die für diese Fitness verantwortlich sind. Dieses Crossing over und eine Rekombination in der bevorzugten Ausführungsform umfassen Deletionen und Hinzufügungen einzelner Aminosäuren oder Gruppen (als Seed-Clustering oder Erweiterung oder Vereinfachung bezeichnet). Im Hinblick auf Hinzufügungen umfasst dies diejenigen Aminosäuren in den CSRs, CDR und Gerüst-Domänen des rVab, die nicht randomisiert wurden, und umfasst diejenigen in den CSRs, die für die kanonische Schleifen-Struktur selbst entscheidend sind. Die Deletionen und Zufügungen an Genen als spätere Mutationsereignisse sind wichtig, da publizierte Daten (Malbi et al., 1994) zeigen, dass für zwei Antikörper, die an das gleiche Antigen-Epitop binden, eines der CSR in dem Paar keinen Kontakt mit der Ziel-Oberfläche eingeht und dass die großen Zielerkennungs-Domänen selbst viel kleinere Domänen enthalten können, die für die meiste Energie der Ziel- Interaktion verantwortlich sind (Clackson und Wells, 1995). Für den erfindungsgemäßen Zweck steht der T1 der besten gemeinsamen Überlappung, d. h. der BEEP, in Beziehung zu dem Auftreten einer kleinen Untergruppe von Hoch-Energie- Dichtepunkten in der Ziel-Oberfläche der Atome (Clackson, T. und Wells, J. A., 1995, und Tulip, W. R. et al., 1994), die beträchtlich geringer ist als alle Kontaktreste. Dies vereinfacht erwartungsgemäß das Alignment (d. h. die Überlappung) des Li, z. B. falls die Zieldomäne, die für den TSA+-Phänotyp des Satzes an ausgewählten rVabs verantwortlich ist, vermutlich nur zwei heiße Stellen besitzt. Dann gibt es eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten, wie ein bestimmter Antikörper, der bekanntlich mit der Stelle interagiert, um einen TSA+-Phänotyp zu besitzen, an diese Stelle binden kann.

D. Identifizierung kleiner organischer Moleküle, die an Zielstellen aktiv sind

1. Verwendung von BEEP als großvolumiges Screening-Reagenz

Das erfindungsgemäß bereitgestellte BEEP kann wie folgt für die Identifizierung von SOMEREN oder Arzneistoff-Leitverbindungen verwendet werden.
a. BEEP wird für das elektronische Screening von CHEMFILE verwendet, um SOMERE als Entdeckungs-Leitverbindungen zu identifizieren, wobei Computer- Strukturprogramme verwendet werden, die käuflich verfügbar und bekannt sind.
b. Verwendung der Koordinaten des BEEP für ein Screening durch vorhandene Computer-Technologie gesamter chemischer Datenbanken für passende SOMERE.
c. Auswahl weniger SOMERE und Testen in vitro und in vivo, für die Bestätigung einer Entdeckungs-Leitverbindung.
d. Verwendung von BEEP für die Steuerung einer Synthese von aktiven SOMEREN durch bekannte Verfahren.

2. Identifizierung von SOMEREN unter Verwendung von rVab-Reportern

a. Auswahl von 1-2 Repräsentanten jeder Oberflächen-Domänen-Gruppe in der aktiven-selektiven rVabTSA+-Bibliothek und enzymatische Markierung mit z. B. einem Radionuklid.
b. Etablieren von Kompetitions-Bindetests unter Verwendung von endogenem Ligand und bekannten allosterischen Ziel-Regulatoren als Verdränger von markiertem rVabTS A-Reporter.
c. Screening chemischer Bibliotheken durch automatisierte Standard-Bindetests für SOMERE, die einen markierten rVab von seinem Ziel verdrängen. Identifizierung aller nahen Analoga aktiver SOMERE und Durchführung von SAR für eine Zielbindung.
3. In einer bevorzugten Ausführungsform werden DISOMERE wie folgt identifiziert (vgl. Fig. 21 und 22):
a. Es wird mit allen rVab begonnen, die eine Oberfläche auf pharmakologischen Zielen erkennen. Diese können gemäß den vorstehend beschriebenen Schritten selektiert werden.
b. Modifizieren der Phagen-rVab-, rVvx-Bibliothek, um eine oder zwei große, zufällige Peptid-Bibliotheken zu enthalten, die ausreichend sind, um den anderen oder die anderen zwei TARGATTs zu besetzen, die zusammen die aktive Oberfläche des Ziels ausmachen. Nach Identifizierung eines Scanner-rVab für eine Identifizierung eines TARGATT erfolgt eine Identifizierung der anderen, was ebenfalls in Gegenwart des ersten entdeckten SOMER erfolgen kann. Ein begrenzter SAR auf jedes SOMER wird für eine Identifizierung der inaktiven Elemente durchgeführt, die zwei oder drei SOMERE werden durch eine Bindung über ihre inaktiven Oberflächen kovalent oligomerisiert, um ein DISOMER oder TRISOMER herzustellen. Es wird in vivo und in vitro getestet, um die beste Entdeckungs-Leitverbindung zu identifizieren.
c. Die stärksten SOMERE werden für eine Aktivität mit Hilfe eines in vitro-Ziel- Tests getestet.
d. In yitro-aktive SOMERE mit dem besten CAP werden in vivo getestet (durch den I. P.-Weg für die Identifizierung von Entdeckungs-Leitsubstanzen).
Falls keine Analoga von ursprünglich entdeckten SOMEREN existieren, wird eine begrenzte Synthese durchgeführt, es werden A*rVabs oder rVvx für eine begrenzte SAR-Bindeuntersuchung verwendet und sodann die besten ausgewählt und in vitro und in vivo für das gesamte CAP getestet.
Falls der Marker-Reporter A*rVab oder rVvx für eine bestimmte Ziel-Domäne keine SOMERE auffindet oder keiner durch einen endogenen Liganden ersetzt wird, wird eine Sekundär-Vereinfachung oder -Diversifizierung von CSRs und CDRs durchgeführt, erneut für TSA+ selektiert und 3A erneut durchgeführt.
Ein Screening für kleine organische Molekül-Austauscher (SOMERE) wird durch bekannte Verfahren erfolgen, wobei automatisierte Tests mit markiertem n[*]rVab mit einem spezifischen CAP eingesetzt werden und nach Verbindungen gesucht wird, die [*]rVabT&spplus; verdrängen, der an die Ziele bindet.
e. Es werden alle rVHCH-Domänen aus rVHCHT&spplus;.LIB herausgeschnitten, in ein Plasmid für eine periplasmatische Expression in Bakterien gesetzt und eine Bibliothek mit löslichen VHCHT&spplus; hergestellt. Diese Bibliothek mit löslichen rVHCHT&spplus;- Entitäten und eine Phagen-Bibliothek mit rVLCL, die in Bindung an das Phagen- Hüllprotein durch ihre CL-Region präsentiert werden (rVLCL. LIB), werden für die Herstellung einer kombinatorischen Bibliothek gemischt, wobei nur ein Mitglied in den isolierten Phagen verpackt wird und es wird gegen Zielprotein wie in 2Aa gewaschen. Nach einer Anreicherung (2-4 Zyklen einer Selektion für eine oder mehrere der drei gewünschten Eigenschaften) werden die Gene für die aktiven rVLCL-Entitäten erhalten. Die Gene für die aktiven rVHCHT&spplus;-Entitäten können sodann in einer Weise erhalten werden, die ähnlich zu der für die Gewinnung der rVLVL-Gene ist. Nach Herausschneiden der rVLCH- und rVHCH-Gene kann das CRE-LOX- Rekombinationssystem (vgl. nachstehend) für die Herstellung eines einzelnen Phagen, der beide Ketten enthält, und für die Expression der rVab.LIB als ein von Phagen präsentierter funktioneller Komplex eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform können die Bibliotheken als einzelkettige Versionen mit durch einen Linker gekoppelte VH und VL exprimiert werden, wobei käuflich verfügbare Kits gemäß den Herstelleranleitungen verwendet werden, wie die von Cambridge.
Schließlich können eine Anreicherung und eine Selektion von VH: VL-Kombinationen, die die gewünschten Zieleigenschaften besitzen, z. B. durch Panning erhalten werden.

BEISPIEL 1

Herstellung einer rekombinanten Oberflächen-Scanner-rVab-Bibliothek (rVab.lib)

VII. Auswahl parentaler Fabs mit einer bekannten Kristallstruktur als rVab-Bibliothek-Gerüst-Matrizen

Die Aminosäuresequenzen und Kristallstruktur der leichten und schweren Ketten des Antikörpers ABXXX, der als parentaler Fab für die Herstellung der rVab-Bibliothek verwendet wird, werden von der Brookhaven Datenbank, der Kabat-Datenbank, GENEBANK (email: NCBI. NIH. GOV.) oder von Kabat, E. A. et al. (Kabat, Wu, T. T. et al., 1991) erhalten. Die V-Regionen der leichten und schweren Ketten werden in Domänen wie folgt unterteilt: die hoch-variable komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), die kanonische Struktur-Region (CSR) in jedem CDR und die dazwischenliegenden Gerüst-Regionen (FWR) (Fig. 2, 5, 6). Einzelne Aminosäuren, die nicht in einem CSR oder CDR liegen, jedoch nichtsdestotrotz notwendig für die kanonische Struktur sind (Chothia und Lesk, 1987; Chothia, Lesk et al., 1989; Kabat, E. A., Wu, T. T. et al., 1991; Chothia, Lesk et al., 1992) sind ebenfalls aufgeführt (Fig. 5, 6).
ABxxx wird als parentale Gerüst-Matrize für die Herstellung der ABxxx rVab.lib für die Erkennung von Zieloberflächen durch einen Antikörper mit einer Antigen-Kombinationsstelle des planaren Typs ausgewählt. Diese Auswahl basiert auf dem Folgenden: 1) Verfügbarkeit der Kristallstruktur des Antikörpers (gebunden oder frei von dem entsprechenden Bindepartner, d. h. Antigen), 2) der Antikörper ist ein Mitglied der Gruppe von Fabs mit einer Kombinationsstelle des planaren Typs (Webster, Henry et al., 1994), die Protein-Oberflächen erkennen, 3) der Antikörper besitzt kanonische Strukturen für CSRH1-2 und L1-3, 4) die CDRH3-Größe des Antikörpers befindet sich in einem mittleren Größenbereich von CDRH3-Größen (und begünstigt so eine gleiche Verwendung aller 6 CDRs des rVab bei der Zielerkennung (Wu, Johnson et al., 1993)) und 5) das Antigen des Antikörpers ist ein Protein (Fig. 3). Parentale Antikörper-Gerüste, die bei Antikörpern mit einer Kombinationsstelle des Hohlraum- und Gruben-Typs gefunden werden (Klassifizierung wie zusammengefasst von Webster [Webster, Henry et al., 1994]) werden auch verwendet werden, um zwei zusätzliche rVab-Bibliotheken in einer Weise, die ähnlich zu der nachstehend für die rVab.lib beschriebenen ist, die auf ABXXX basiert, herzustellen. Zusammen schaffen diese drei Bibliotheken eine ausreichend große Anzahl an Sonden für eine Oberflächenerkennung von relevanten Bindestellen.
Bei der ABxxx rVab.lib wird die natürliche Diversifizierung von Antikörpern dadurch bereitgestellt, dass in die Bibliothek verschiedene Kombinationen von VH- und VL-Domänen gesetzt werden, die selbst verschiedenartige Kombinationen der bekannten kanonischen CSRs, verschieden lange CDRH3s und randomisierte Aminosäuren (eine von 20 essentiellen Aminosäuren) an einer oder mehreren Aminosäurepositionen in den CSRs oder CDRs einer jeden V-Region in einem jeden rVab aufweisen (Fig. 4).

VIII. Herstellung der Nukleinsäuren, die für die schweren und leichten Ketten (rVHCHl und rVLCL) der ABXXX rVab.lib kodieren

Die Nukleotidsequenz von ABxxx ist von Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage (Kabat, E. A., T. T. Wu et al., 1991), der Kabat-Datenbank (NCBI. NIH. GOV) oder GENEBANK verfügbar. Die Identifizierung und Analyse aller Restriktionsstellen in diesen Sequenzen kann mit Hilfe eines käuflich verfügbaren Programms erfolgen (GCG [Univ. Wisconsin, USA], MacVector [IBI, Kodak, New Haven, CT], DNAStrider (C. Marck, Gif-Sur-Yvette Cedex, Frankreich, Service de Biochemie, Inst. Res. Fundamental, Aloric Energy Commission of France) und SeqEd [Applied BioSystems]).
In ABxxx endogene Restriktionsstellen, die bei einer Herstellung der rVab.lib wie nachstehend beschrieben stören, werden entfernt und durch andere Nukleotide ersetzt, die nicht für die störenden Restriktionsstellen kodieren. Dies erfolgt unter Verwendung von Sequenzen, die die Identität der parentalen Aminosäure(n) unverändert lassen.
Die Sequenzen werden sodann erneut auf Veränderungen analysiert, die für ein Einsetzen der günstigen und einzelnen Restriktionsstellen in den V- und C-Genen notwendig sind, die für die Herstellung der Bibliothek wie nachstehend beschrieben erforderlich sind.
Die ABXXX rVab.lib wird erfindungsgemäß aus getrennten rVLCL (Fig. 7)- und rVHCHl (Fig. 8)-Ketten, die zufällig in einem in vivo-Verfahren kombiniert werden, hergestellt (Fig. 14). Die Herstellung der rVLCL- und rVHCH-Nukleinsäure-Bibliotheken, die für die rVLCL- und rVHCHl-Ketten kodieren, erfolgt in den folgenden Schritten: Schritt 1) Oligonukleotidsynthese: Herstellung a) des amino-terminalen Endes (5'V), b) einer mittleren Region (MIDV), nur für VL und c) eines carboxy-terminalen Endes (3'V) der V-Region; Schritt 2) Diversifizierung mancher CSRs durch PCR; Schritt 3) Ligation der Abschnitte; Schritt 4) Diversifizierung der verbleibenden CSRs und Schritt S) Ligation der geeigneten konstanten (CH1 oder CL) Region, abgeleitet durch PCR oder Oligonukleotid-Herstellung, für die Schaffung der vollständigen rekombinanten schwere und leichte Kette-Bibliotheken (rVHCHl.lib und rVLCL.lib).

Schritt 1: Herstellung von rVLCL.lib (Fig. 7)

In der Oligonukleotid-Phase (Schritt A, Fig. 7) werden bei der Herstellung a) des 5' (5'VL)-Endes, b) des mittleren Abschnitts (MIDVL) und c) des 3' (3'VL)-Endes der VL-Region acht synthetische Oligonukleotide verwendet, umfassend vier komplementäre Paare. Jedes Oligonukleotid (x) besitzt ein komplementäres passendes markiertes x'. Zwei Oligonukleotid-Paare, a/a' und b/b' werden für die Herstellung des 5'-Endes verwendet. Die MIDVL (c/ci)- und die 3'VL (d/d')-Abschnitte werden jeweils ausgehend von einem Oligonukleotid-Paar synthetisiert. Die Aminosäure- und Nukleinsäurepositionen, die von den spezifischen Oligonukleotiden kodiert werden, sind in Fig. 7 gezeigt.
Die Varianz in den Aminosäuren in Position 2 (in a/a') und 71 (angehängt an c/c'), die für eine Herstellung aller gewünschter VL1 CSRs notwendig ist, wird während späterer Schritte wie nachstehend beschrieben eingebracht. Alle Oligonukleotide werden derart synthetisiert, dass sie wenigstens ein komplementäres überlappendes Ende und keine Haarnadelschleifen-bildenden Enden besitzen und dass sie nicht-komplementär zu Sequenzen außer denen des gewünschten Oligonukleotid- Verbindungspartners sind, basierend auf der Analyse durch ein käuflich verfügbares Oligonukleotid-Primer-Analyse-Softwareprogramm.

Schritt 1 (a): Herstellung des 5'VL-Abschnitts

Für die Herstellung des 5'VL-Endabschnitts in Schritt 1 (a) werden die Oligonukleotide zuerst phosphoryliert, sodann in einem Reaktionsgemisch miteinander vermischt, erhitzt, hybridisiert und miteinander mit Hilfe bekannter molekularbiologischer Verfahren ligiert (Sambrook, Fritsch et al. 1990). Das Produkt wird sodann isoliert und in 60 ul Reaktionen mit Hilfe von 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit 5 ug pCLONALL ligiert (vgl. Fig. 9, die alle Plasmide für eine allgemeine Verwendung aufführt), der an den Restriktionsstellen (rs) prs0 und rs4 gespalten war ("p" bezeichnet, dass die Lage der Restriktionsstelle in dem Plasmid und außerhalb der rVab-Sequenz liegt) (Sambrook, Fritsch et al., 1990).
DNA wird aus dem Ligationsgemisch mit Hilfe von Geneclean II (Bio101) gereinigt, in Wasser resuspendiert und für eine Transfektion durch Elektroporation (Dower, Miller et al., 1988) von E. coli TG1 (Gibson, 1984) verwendet, in Medium mit 1% Glucose für 1 Stunde vermehrt und sodann auf Antibiotikum-enthaltende Medien in Schalen ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden einzelne Kolonien gepickt. Die Kolonien werden als rVL3-24.bact zuerst durch diagnostische PCR unter Verwendung der Primer pCFWD und pCBCK (vgl. Primer-Tabelle, Fig. 10) identifiziert und sodann durch Sequenzanalyse mit Hilfe eines automatischen ABI-Sequenziergeräts und käuflich verfügbarer Kits (ABI, USA) gemäß den Herstelleranleitungen bestätigt. Eine Lagerung positiver Klone bei -70ºC erfolgt in Medium (Miller, 1972) mit 15% (v/v) Glycerin.

Schritt 2: Diversifizierung durch PCR

Mit einem Zahnstocher entnommene gefrorene Glycerin-Stämme von rVL3-24 werden in PCR-Reaktionen eingesetzt, um Primer anzuhängen, die dem rVL-Abschnitt eine Diversität verleihen. Einer der fünf verschiedenen CSRL1, diversifiziert mit zufälligen Aminosäuren an zwei Positionen, wird als Vorwärts-Primer am 3'-Ende des parentalen ab/a'b'-5'VL-Abschnitts eingesetzt. Der Rückwärts-Primer für das 5'-Ende umfasst Nukleinsäuren, die für eine der drei verschiedenen Aminosäuren I, V oder S an der Position VL2 und die Aminosäure des parentalen ABXXX an der Position VL1 kodieren. Diese Anhängungen erfolgen in 5 primären PCR-Reaktionen, von denen jede einen Vorwärts-Primer (d. h. L1.1FWD, L1.2FWD, L1.3FWD, L1.4FWD oder L1.5FWD) und einen der drei verschiedenen Rückwärts-Primer in den folgenden Kombinationen enthält: L1.1-3BCK-Primer, gemischt mit den drei Reaktionen, die L1.1, L1.2 und L1.3-FWD-Primer enthalten, und L1.4BCK und L1.5BCK, entsprechend gemischt mit einem der zwei verbleibenden L1-FWD-Primern. Sodann werden die Aminosäuren VL34-44 an die Primär-PCR-Produkte in Sekundär-PCR-Reaktionen dadurch angehängt, dass ein Teil der Primär-Reaktion entnommen wird und eine Sekundär-PCR mit den Primern L1ALLFWD und L1ALLBCK erfolgt. Die Produkte der Sekundär-Reaktionen werden getrennt gehalten und als rVL1-44CSR1.1-5.lib.pcr markiert. Diese Konstrukte erlauben die darauffolgende Herstellung von allen 5 bekannten kanonischen CSRL1 in der rVL.lib nach einer Klonierung, falls diese Produkte mit dem geeigneten MIDVL-Ab schnitt verbunden werden, der eine der drei verschiedenen Aminosäuren an der Position VL71 aufweist. Jede der Primär-PCRs verwendet Taq-Polymer äse, Vorwärts- und Rückwärts-Primer wie vorstehend beschrieben, in 50 ul Reaktionsgemischen und wird einem 25-fachen Zyklus unterzogen (1 min bei 94ºC, 1 min bei 60ºC und 1 min bei 72ºC). Die Sekundär-PCR-Reaktionen (25 ul) verwenden frische Taq-Polymerase und 1 ul des amplifizierten angehängten diversifizierten Primär-PCR-Reaktionsprodukts, Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Paare und die Reaktion wird einem 30-fachen Zyklus unterzogen (94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min). Eine Liste der Sequenzen aller Primer findet sich in der Primer-Tabelle (Fig. 10).
In Schritt C werden die fünf Produkte der Sekundär-Amplifizierungsreaktion mit einer richtigen Größe als rVL1-44CSR1.1-5 bezeichnet, und werden aus niedrigprozentigen Acrylamid-Gelen isoliert, wiedergewonnen, gespalten und in pCLO- NALL ligiert, der mit prs4 und rs2 gespalten war, und durch Elektroporation (Dower, Miller et al., 1988) in E. coli wie beschrieben kloniert (Schritt B, Fig. 7). Diese fünf 5'VL-Abschnitt-Produkte werden als rVL1-44CSR1.1-5.lib.bact bezeichnet. 20 Klone jeder Bibliothek werden zuerst durch diagnostische PCR untersucht und sodann werden fünf (5) Klone auf eine Diversifizierung von CSR1 durch automatische Sequenzierung, wie vorstehend beschrieben, untersucht, wobei pCFWD und pCBCK-Sequenzier-Primer und käuflich verfügbare Kits (ABI, USA) eingesetzt werden. Durch dieses Verfahren werden mehr als 10&sup4; Transformanten für jeden der 5 VL1 CSRs geschaffen.

Schritt 1(b): Herstellung des MIDVL-Abschnitts

In einer parallelen Weise wird durch einen zweiten Satz von Reaktionsschritten A-C der MIDVL-Abschnitt von rVLlib hergestellt. Der MIDVL-Abschnitt enthält ursprünglich die Aminosäuren rVL53-68. Die Oligonukleotide für diese Reaktion sind in dem Paar c/c' enthalten.
In Schritt A wird jedes Oligonukleotid phosphoryliert, das Paar unter Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und der c/c'-doppelsträngige DNA-Komplex gereinigt und in einem 60 ul Volumen mit Hilfe von 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit etwa 5 ug rs2- und prs5-gespaltenem pCLONALL ligiert (Sambrook, Fritsch et al., 1990). Das Ligationsprodukt wird aus dem Gemisch mit Geneclean II (Bio101) isoliert, in Wasser resuspendiert und für die Transformation von E. coli durch Elektroporation eingesetzt (Dower, Miller et al., 1988). Nach 1 Stunde in Medium mit 1% Glucose werden die Zellen auf Antibiotikum-enthaltende Medien in Platten gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden einzelne Kolonien gepickt und die MIDVL-Abschnitt-Transformanten aus 30 Transformanten durch diagnostische PCR identifiziert. Eine Bestätigung von Sequenzen erfolgt durch automatische Sequenzierung mit Hilfe eines ABI-automatischen Sequenziergeräts unter Verwendung der Primer pCFWD und pCBCK (ABI, USA). Positive werden als rVL53-68.bact markiert und gefrorene Glycerin-Stämme hergestellt.
In Schritt B, Diversifizierung, wird eine PCR für das Anhängen diversifizierter CSRL2 an das 5'-Ende von MIDVL eingesetzt. Drei verschiedene Aminosäuren an VL71 (d. h. Y, F und A), gefolgt von der Restriktionsstelle rsC zwischen VL72 und VL76, gefolgt von einer rs4-Restriktionsstelle, werden mit Primern an das 3'-Ende von MIDVL angehängt. Diese Anfügungen erfolgen in drei getrennten Reaktionsgemischen, von denen eines jeweils die Vorwärts-Primer L2.71YFWD, L2.71FWD und L2.71FWD enhält. Alle drei Vorwärts-Primer enthalten die rsC-Stelle, die eine Bindung von MIDVL an die 5'VL-Abschnitte erlauben wird. Für alle diese Reaktionen ist der Rückwärts-Primer L2ALLBCK, der eine rsB-Stelle sowie ein an den Aminosäuren VL50 und 51 diversifiziertes DCSRL2 enthält. Jedes Gemisch enthält eine mit einem Zahnstocher gepickte gefrorene Glycerin-Kultur von rVL53-68 (vgl. Primer-Tabelle, Fig. 10), Taq-Polymerase in 50 ul Gemischen und wird über 25 Runden einem Zyklus unterzogen (94ºC 1 min. 60ºC 1 min. 72ºC 2 min).
In dem darauffolgenden Schritt C wird etwa 1 ug der amplifizierten, diversifizierten angehängten MIDVL-Produkte mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) isoliert, mit prs1 und rs4 geschnitten, erneut isoliert und mit 5 ug pCLONALL, der mit prs1 und rs4 geschnitten wurde, in einem 60 ul Volumen mit Hilfe von 1200 U T4-DNA- Ligase ligiert (New England Biolabs) (Sambrook, Fritsch et al., 1990). Die ligierten Plasmid-DNA-Produkte werden mit Hilfe von Geneclean II (Bio101) isoliert, in Wässer resuspendiert und für die Elektroporation von E. coli verwendet, um, wie vorstehend beschrieben, eine Bibliothek von Transformanten herzustellen (Dower, Miller et al., 1988). Die drei getrennten Gruppen erfolgreicher Transformanten (eine für jeden Typ von VL71) werden durch diagnostische PCR identifiziert und im Hinblick auf die Diversifizierung von VL CSR2 durch automatische Sequenzierung von 10 Klonen jeder Gruppe bestätigt. Diese Transformanten werden als rVL38- 73CSR2:71 (Y, F, A) lib.bact bezeichnet. Dieses Verfahren ergibt ≥10&sup4; Transformanten für jede Gruppe.

Schritt 1(c): Herstellung des 3'VL-Abschnitts von rVL

In dem dritten Satz von parallelen Schritten A-C wird der 3'VL-Abschnitt von rVL.lib hergestellt. Dieser Abschnitt wurde ursprünglich hergestellt, um die Aminosäuren VL72-90 zu enthalten und verwendet das Oligonukleotid-Paar d/d'. In Schritt A wird dieses Paar phosphoryliert und die zwei Oligonukleotide hybridisiert. Der doppelsträngige Komplex wird sodann isoliert und mit dem pCLONALL, der mit prs0 und rs4' geschnitten wurde, ligiert. Ligiertes Produkt wird isoliert und für die Transformation von B. coli durch Elektroporation (Dower, Miller et al., 1988), wie vorstehend beschrieben eingesetzt. 3'VL-Abschnitt-Transformanten werden aus den Transformanten isoliert und eine diagnostische PCR mit 20 von ihnen durchgeführt, wobei die Positiven durch automatische Sequenzierung bestätigt und als rVL76-90.bact bezeichnet werden. Gefrorene Glycerin-Kulturen werden hergestellt.
Im nächsten Schritt, Diversifizierung (Schritt B), werden die 6 diversifizierten CSRL3, gefolgt von einer neuen prs5-Stelle, sowie die Aminosäuren 72-75, die eine günstige Restriktion s stelle (rsC) enthalten, an VL76-90 angehängt, um das folgende 5'VL-PCR-Produkt herzustellen: rVL72-100CSR3.1-6.pcr. Eine Diversifizierung von CSR3.1-6 erfolgt an den Positionen VL92 und 93. Diese Verfahren erfolgen in sechs (6) getrennten 50 ul PCR-Reaktionen, von denen jede einen L3.1- 6FWD-Primer enthält und alle L3ALLBCK (vgl. Primer-Tabelle, Fig. 10) und Taq- Polymerase in 50 ul-Gemischen enthalten. Die Reaktionen werden 25-fach zyklisiert (94ºC 1 min, 60ºC 1 min und 72ºC 2 min).
In Schritt C werden die amplifizierten diversifizierten angehängten Produkte mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) isoliert, mit prs2 und rs5 geschnitten, erneut isoliert und in pCLONALL ligiert, der mit prs1 und prs5 geschnitten wurde. Die ligierten Plasmid-DNA-Produkte werden isoliert und für eine Elektroporation von E. coli eingesetzt, um eine Bibliothek von Transformanten wie vorstehend beschrieben zu schaffen, die als rVL72-100CSR3.1-6.lib.bact bezeichnet wurde. Dieses Verfahren ergibt mehr als 104 Transformanten, die durch diagnostische PCR und Sequenzierung identifiziert werden, um geeigneterweise randomisierte Aminosäuren an den diversifizierten Positionen in VLCD3 für jedes der sechs (6) VLCSRSs zu enthalten.

Schritt 3: Ligation

In Schritt 3 werden die 5'VL- und MIDVL-Abschnitte miteinander verbunden (Fig. 7). 5 ug DNA jeder der fünf rVL1-44.libs (d. h. CSR1.1-5) werden mit rsB und rs5 gespalten und mit 1 ug Insert, das aus den drei rVL38-70CDRL2:71* isoliert worden war, mit Hilfe von 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert (Sambrook, Fritsch et al., 1990). In diesen Reaktionen erfolgt eine Ligation von 5'VL[rVL1-44CSRs] mit MIDVL[rVL38-76CSR2:71*] als: 5'VL1.1-3 x MIDVL2:71Y; 5'VL1.4 x MIDVL2:71F und 5'VL1.5 x MIDVL2:71A, für die Schaffung der fünf rVL1-76CSRD1&2.DNAs. Jede dieser DNAs wird für die Elektroporation von E. coli eingesetzt (Dower, Miller et al., 1988).
Die Bakterien werden sodann in Medium mit 1% Glucose 1 Stunde vermehrt und auf Antibiotikum-enthaltende Medien in Platten ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden einzelnen Kolonien gepickt und zuerst durch diagnostische PCR und sodann durch automatische Sequenzierung charakterisiert. Etwa 100 Kolonien werden durch diagnostische PCR und 20-30 durch Sequenzierung analysiert, um das zufällige Auftreten verschiedener CSR-Paarungen und diversifizierter Aminosäuren in den verschiedenen CSRs zu bestätigen. Gefrorene Kulturen der fünf Gruppen werden sodann hergestellt und als rVL1-76CSR12.lib.bact bezeichnet.
In Schritt F werden die verlängerten 5'VL-Hälften, bestehend aus den fünf rVL-1- 76CSR1&2.libs in 30 getrennten PCR-Reaktionen in einer kombinatorischen Weise mit den sechs 3'VL-Halbabschnitten, bestehend aus den sechs (6) rVL72- 100CSR3.1-6.lib, verbunden. Durch dieses Verfahren werden 30 vollständige rVL1- 100CSR1&2&3.lib hergestellt (wie in Fig. 7 dargestellt). Bei jeder dieser Bibliothek- Konstruktionen werden etwa 5 ug DNA jeder der fünf rVL1-71CSR1&2.libs (d. h. CSR1.1-5) mit rsC und prs5 gespalten und mit 1 ug jedes der aus den sechs mit rsC und prs5 gespaltenen rVL72-100CSR3.1-6 isolierten Inserts unter Verwendung von 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert (Sambrook, Fritsch et al., 1990), um die 30 rVL1-100CSRD1&2&3.dna-Präparationen herzustellen. Gleiche Mengen jedes Ligationsgemisches werden gepoolt und die gepoolte DNA mit Hilfe von Geneclean II (Bio101) gereinigt und in 30 ul Wasser resuspendiert, um die vollständige rVLCL.lib.dna herzustellen. PCR wird sodann verwendet, um an das 3'- Ende dieser DNA-Bibliothek die Nukleotide anzufügen, die für die verbleibenden Aminosäuren von VL (d. h. rVL101-107), Aminosäuren am 5'-Ende von CL (d. h. Aminosäuren CL108-110) kodieren und in dieser Sequenz die günstige rs3-Stelle anzufügen. Die rs3-Stelle, auch bezeichnet als rsCHLNK-Stelle (Fig. 9), erlaubt sodann die Bindung von rVL.lib an seinen klonierten rCL-Ab schnitt.
Diese Anfügungsreaktionen erfolgen durch eine PCR-Reaktion mit einer kleinen Menge von gereinigter rVL1-100CSR1862853.lib.dna, den Primern LJCHLNKFWK und L1ALLBCK und Taq-Polymerase in einem 50 ul-Volumen. Die PCR-Reaktion erfolgt über 25 Zyklen (94ºC für 1 min. 60ºC für 1 min und 72ºC für 2 min).
Amplifizierte DNA wird sodann mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) gereinigt. Nach Suspension in Wasser wird 1 ug der gereinigten DNA mit rs2 und prs5 gespalten und in 5 ug pCLONALL-DNA, die mit rs2 und prs5 gespalten wurde, mit Hilfe von 1200 U T4-DNA-Ligase ligiert (Sambrook, Fritsch et al., 1990) und für eine Elektroporation von B. coli verwendet (Dower, Miller et al., 1988). Die in Medium mit 1% Glucose für 1 Stunde vermehrten Bakterien werden sodann auf Antibiotikum-enthaltende Medien in Platten ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden einzelne Kolonien gepickt und zuerst durch diagnostische PCR und sodann durch automatische Sequenzierung charakterisiert. Etwa 100 Kolonien werden durch diagnostische PCR und manche (etwa 5-10) durch Sequenzierung untersucht, um das Auftreten der Aminosäuren VL1-110 und das zufällige Auftreten der verschiedenen CSR-Paarungen und der Diversifikation von Aminosäuren in den verschiedenen CSRs zu bestätigen. Mehr als 10&sup8; Transformanten werden bei diesem Verfahren hergestellt und eine gefrorene Kultur der Bibliothek wird sodann hergestellt und als rVL.lib.bact bezeichnet.
Im letzten Schritt (Schritt G) der Herstellung von rVL.lib wird DNA aus rVLlib mit prs1 und rsJCLNK gespalten und 1 ug mit 5 ug pVLACCEPTOR ligiert (Fig. 9), der mit prs1 und rsJCLNK geschnitten wurde, wobei 1200 U T4-Ligase verwendet werden (Sambrook, Fritsch et al., 1990). Das Produkt wird sodann aus dem Ligati onsgemisch mit Geneclean II (Bio101) gereinigt und in Wasser resuspendiert. Öiéses Material wird für die Elektroporation von E. coli (Dower, Miller et al., 1988) eingesetzt und die Bakterien nach 1 Stunde in Medium, supplementiert mit 1% Glucose, über Nacht bei 37ºC auf Antibiotikumenthaltenden Medien in Platten vermehrt. Einzelne Kolonien werden gepickt und durch diagnostische PCR und automatische Sequenzierung charakterisiert, um das Auftreten von CL in der Bibliothek zu bestätigen. Gefrorene Glycerin-Kulturen von rVL1-110ACSR1-3lib werden hergestellt und als rVLCL.lib.bact bezeichnet (Fig. 7).
Die vorstehenden detaillierten Reaktionen, bei denen eine doppelte Aminosäure- Randomisierung in jedem CSR erfolgt, erlaubt theoretisch die Herstellung von 2000, 400 und 2400 verschiedenen CSRL1, 2 bzw. 3 und eine rVHlib-Größe von 1,92 · 10&sup9;. Dies übertrifft die größte veröffentlichte rekombinante VL-Bibliothek, die durch ähnliche Verfahren hergestellt wurde (Griffiths, Williams et al., 1994) etwa 2-fach.

IX. Herstellung der konstanten Regionen von ABxxx

Die konstante Region (C) der leichten (CL) und schweren Kette (CH1)-Region für den ausgewählten parentalen Fab ABxxx (Fig. 9) wird entweder durch Hybridisierung und Ligation einer Serie von synthetischen überlappenden Oligonukleotiden wie für die V-Regionen oder durch Standard-PCR der C-Regionen von ABxxx oder irgendeiner anderen Antikörper-mRNA oder -DNA mit identischen C-Regionen erhalten. Nukleinsäuren, die für spezielle Antikörper kodieren, können aus Hybridomen von verschiedenen Quellen, einschließlich der ATCC, erhalten werden. In allen Fällen umfasst die Konstruktion die Entfernung der endogenen Restriktionsstellen, die eine Herstellung der Bibliothek stören und die Schaffung einer Reihe von günstigen Restriktionsstellen an den und um die 5'- und 3'-Enden der C-Regionen, um eine einfache Klonierung in pCLONAL, pEXPRESSION und pV (H oder L) ACCEPTOR (Fig. 9) zu erlauben. Bei den CH1- und CL-Regionen findet sich in den C-Genen eine rs3-Stelle für eine spezifische Bindung der V- und C-Abschnitte von rVL an oder um die natürliche V/J-Gen-Verbindung (junction) für schwere und leichte Ketten. Diese Stellen werden als rsJCHLNK bzw. rsJCHLNK bezeichnet. Für eine Herstellung der C-Abschnitte werden diese beiden verbindenden Restriktionsstellen durch Standard-PCR mit Rückwärts-Primern CLBCK und CHECK und den Vorwärts-Primern CLFWD und CHFWD angehängt (vgl. Primer-Tabelle für Sequenz-Details (Fig. 10)).
Die parentale C-Nukleinsäuresequenz von ABXXX wird durch PCR mit Taq-Polymerase unter Verwendung der Primer CLFWD und CLBCK, die die rs3-Restriktionsstelle in das JC-Segment des parentalen Fab am 5'-Ende der C-Sequenz und zwei Stopp-Kodons (TAA) und die rs4'-Stelle (AscI), gerade außerhalb des 3'-Endes der C-Region einbringt, amplifiziert. Das Reaktionsgemisch (50 ul) wird 25 Zyklen unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min und 72ºC für 1 min) und die amplifizierte verlängerte C-Sequenz mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) gereinigt und in 50 ul Wasser resuspendiert.
Die Reaktion, bei der das parentale Fab CH1-Gen von ABXXX amplifiziert wird, ist identisch, mit der folgenden Ausnahme: die Primer für die PCR-Reaktion sind verschieden, und zwar CHFWD und JCHBCK, und der CHFWD-Primer enthält eine NotI-Stelle am 3'-Terminus der CH1-Region.
Für eine Vervollständigung der Herstellung des VLCL werden die amplifizierten und J-verlängerten rekombinanten VL-diversifizierten CSR1 und 2 und 3 (rVLCSR1&2&3)-Gene mit dem amplifizierten CL-Gen gemäß der vorstehend verwendeten herkömmlichen Ligation oder mit Hilfe von PCR verbunden (Horton, Hunt et al., 1989). Zusammenbau-PCR-Reaktionen (25 ul) verwenden Taq-Polymerase, 1 ul amplifiziertes parentales JC und 0,8 ul des vorstehenden rVL.lib-Gens. Der geeignete VLBCK-Primer wird zusammen mit dem CLFWD-Primer verwendet und die Reaktion 30 Zyklen unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min und 72ºC für 2 min).

X. Herstellung von rVHCH1.lib (Fig. 8)

Bei der Oligonukleotid-Phase (Schritt A) erfolgt eine Herstellung einer 5'- und 3'- Hälfte der VH-Region unter Verwendung 16 synthetischer Oligonukleotide, umfassend 8 komplementäre Paare. 6 Oligonukleotide sind für die 5'-Hälfte. Sie werden als VHa-c und die komplementären Partner als VHa'-c1 bezeichnet. In der 5'VH- Hälfte besitzt das Oligonukleotid-Paar b/b' die rsB-Restriktionsstelle zwischen den Aminosäuren rVH 22-26. 10 Oligonukleotide sind für die 3'-Hälfte und werden als VHd-f und d'-f' bezeichnet. Die Herstellung der 3'-Hälfte der VH-Region erfolgt in einer ähnlichen Weise, jedoch mit drei Formen des "e"-komplementären Paars, die wie folgt bezeichnet werden: VH e/e', VH e2/e2' und VH e3/e3'. Diese entsprechen den "e"-Oligonukleotiden mit einem Valin (V), Alanin (A) bzw. einem Arginin (R) an der Aminosäureposition VH71.
Bei dem Hybridisierungsschritt werden die drei Typen der 3'VH-Hälfte hergestellt: 3'VHdef/d'e'f, 3'VHde2f/d'e2'f' und 3'VHde3f/d'e3'f. Die Varianz in den "e"-Oligonukleotiden in der 3'VH-Hälfte ist notwendig, um eine darauffolgende Herstellung aller vier bekannter CSRH2 in der rVHlib zu ermöglichen, wie nachstehend beschrieben. Alle Oligonukleotide werden so synthetisiert, dass sie wenigstens ein überlappendes komplementäres Ende, keine Haarnadelschleife-bildenden Enden und keine komplementären Sequenzen besitzen, außer denjenigen des gewünschten Oligonukleotid-Verbindungspartners, basierend auf einer Analyse durch eine käuflich verfügbare Oligonukleotid-Primer-Analysesoftware.

Herstellung der 5'-Hälfte der VH-Region

Für die Herstellung der 5'-Hälfte der VH-Region werden die geeigneten Oligonukleotide phosphoryliert und miteinander in einem Reaktionsgemisch vermischt, worauf sie erhitzt und hybridisiert und miteinander gemäß bekannten molekularbiologischen Verfahren ligiert werden (Sambrook, Fritsch et al., 1990). Wie dargestellt, erlaubt die erste Phase, Hybridisierung und Ligation (Schritt A, Fig. 8), die Bildung des 5'VHabc/a'b'c'-Paars. Beim nächsten Schritt (Schritt B) wird das korrekte Konstrukt von 5'VH mit einer günstigen rsB in seinem b/b'-Segment mit den Primern 5'VHFWD und 5'VHBCK amplifiziert (eine Liste der Bezeichnungen und Sequenzen der für die Herstellung von VHCH1.lib verwendeten Primer findet sich in der Primer-Tabelle, Fig. 10), wobei eine PCR mit einer kleinen Menge des ligierten und isolierten abc-DNA-Duplex-Produkts aus Schritt A durchgeführt wird. In diesem Schritt wird eine kleine Menge der Reaktion aus Schritt A mit Hilfe der vorstehend erwähnten Primer und Taq-Polymerase in 50 ul-Reaktionen amplifiziert und 25 Runden einem Zyklus unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min, 72ºC für 2 min). Die amplifizierte DNA wird mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) gereinigt und in 5 ul Wasser suspendiert.
Sodann wird das Produkt der Amplifikationsreaktion mit der richtigen Größe, das als rVH1-51 bezeichnet wird, bei rs4 (NotI) und prs1 gespalten. Das gespaltene Fragment wird durch Magie PCR Preps (Promega) gereinigt und 1 ug wird in einem Volumen von 60 ul mit Hilfe von 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit 5 ug rs4- und psr1-gespaltenem pCLONALL ligiert (Sambrook, Fritsch et al., 1990).
DNA wird aus dem Ligationsgemisch mit Geneclean II (Bio101) gereinigt, in 30 ul Wasser resuspendiert und in E. coli elektroporiert (Dower, Miller et al., 1988), die sodann in Medium mit 1% Glucose für 1 Stunde vermehrt und auf Antibiotikumenthaltenden Medien ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden einzelne Kolonien gepickt und identifiziert. Transformanten mit der rekombinanten parentalen 5'VH-Hälfte, rVH1-51, werden durch diagnostische PCR für geeignete Größe identifiziert (mit Plasmid-Primern pCFWD und pCBCK). Die Transformanten, die vermutlich das rVH1-51 enthalten, werden vermehrt. Die durch PCR mit Hilfe von pCFWD und pCBCK amplifizierte Nukleinsäure wird durch automatische ABI-Sequenzierung mit käuflich verfügbaren Kits gemäß den Herstelleranleitungen (ABI, USA) sequenziert, um die Identität des rVH1-51-Fragments zu bestätigten. Die Kulturen werden sodann vermehrt und als gefrorene Glycerin (15% v/v)-Kulturen aufbewahrt und als rVH1-51bact bezeichnet.
Im nächsten Schritt, Schritt C (Fig. 8) wird eine diversifizierte Version eines jeden der vier bekannten CSRH2 an rVH1-51 angehängt. Dies erfolgt in vier getrennten Standard-PCR-Reaktionsgemischen (vgl. vorstehend). Jedes Reaktionsgemisch umfasst das rVH1-51-Fragment (erhalten aus mit einem Zahnstocher gepickten gefrorenen Glycerin-Bakterienkulturen), einen von vier Vorwärts-Primern (H2.1FWD, H2.2FWD, H2.3FWD und H.24FWD) und den Rückwärts-Primer H&sub2;ALLBCK. Die vier Vorwärts-Primer werden so hergestellt, dass sie sich von Aminosäure 47-59 von CSR2&sub1;&submin;&sub4; erstrecken und eine Aminosäure-Diversifizierung an Position 53 enthalten. Die vier Bibliothek-Produkte werden isoliert und an rsB und prs5 gespalten. Dann wird 1 ug jedes gereinigten DNA-Produkts unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit 5 ug pCLONALL ligiert, der an rsB und prs5 gespalten wurde.
Wie vorstehend beschrieben, wird die ligierte DNA gereinigt und in Schritt D für die Transformation von E. coli durch Elektroporation verwendet. Transformanten werden isoliert und zuerst durch diagnostische PCR und sodann durch automatische Sequenzierung charakterisiert, um geeignete Proben der randomisierten diversifizierten Versionen aller vier CSRH1 zu enthalten. Gefrorenen Kulturen werden jeweils hergestellt und als rVHrsB-59CSR2.1-4lib.bact bezeichnet.

Herstellung der 3'-Hälfte der VH-Region

In einer parallelen Reaktion erfolgt ein weiterer Satz von Reaktionsschritten A-C für die Herstellung der 3'-Hälfte der VH-Region, die eine Nukleinsäure umfasst, die für die Aminosäuren 57-95 der variablen schweren (VH) Kette (Fig. 8) kodiert. Die Oligonukleotide für diese Reaktion enthalten die drei Paare von VH-Oligonukleotiden, e/e', e2/e2' und e3/e3', bei denen die Aminosäure VH71 Valin, Alanin bzw. Arginin ist. Ein geeignetes Gemisch (wie vorstehend beschrieben) ermöglicht die Hybridisierung und Ligation der drei verschiedenen rVH57-95 doppelsträngigen komplementären Oligonukleotide, 3'VHdef/def (d. h. VH57-95[71V]), 3'VHde2f/d'e2'f (d. h. VH57-95[71A]) und 3'VHde3f/d'e3'f (d. h. VH57-95[71R]). Kleine Mengen dieser drei Reaktionen werden sodann amplifiziert und rsD- und prs5-Stellen in Schritt B durch PCR unter Verwendung von 3'VHFWD und 3'VHBCK angefügt. Diese Reaktionen enthalten Taq-Polymerase, wie vorstehend beschrieben, und werden 25 Zyklen unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min, 72ºC für 2 min). Die richtigen Produkte werden mit Magie PCR Preps (Promega) gereinigt, in 50 ul Wasser suspendiert und sodann an prs2 und prs5 gespalten und isoliert. Etwa 1 ug des isolierten rVH56-95-Genfragments wird in 5 ug pCLONALL ligiert, der mit prs1 und prs5 gespalten wurde. Das Plasmid pCLONALL mit dem rVH56-95-Insert wird isoliert und mit Hilfe von Geneclean II (Bio101) gereinigt und in Schritt C für eine Transformation von E. coli durch Elektroporation verwendet (Dower, Miller et al., 1988). Transformanten werden selektiert und die richtigen drei Produkte, rVH56- 95: 71V; A; R durch diagnostische PCR identifiziert und durch automatische ABI- Sequenzierung bestätigt. Gefrorene Kulturen werden jeweils hergestellt und als rVH56-95[71V; A; R].bact bezeichnet.
Eine Vervollständigung der Nukleinsäuren, die für die vier bekannten CSRH2-Regionen kodieren, erfolgt in den Schritten D und E. Die drei rVHrsD-56-71*-95-prs5- Inserts, die durch Spaltung von Plasmid-DNA befreit wurden, werden mit den vier rVHrsB-59CSR2.1-4.lib ligiert, die an rsD und prs5 geschnitten wurden. Die resultierende rVHrsB-95CSR2.1-4-Bibliothek wird unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Standard-Reinigungs-, -Ligations- und -Elektroporationsverfahren in E. coli kloniert. Transformanten werden isoliert und etwa 50 werden durch diagnostische PCR und 20 durch automatische Sequenzierung charakterisiert, um zu bestätigen, dass sie die erwarteten diversifizierten Versionen der vier bekannten CSRH enthalten. Die Ligationskombinationen von rVHrsB-59CSR2 und rVH56-71*- 95, die für eine Herstellung der vollständig diversifizierten rVHCSR2-Bibliothek notwendig sind, sind rVHrsB-59CSR2.1lib mit rVH56-95 : 71 V, rVHrsB-59CSR2.2lib mit rVH56-95 : 71A und rVHrsB-59CSR2.3 und 2.4lib mit rVH56-95 : 71R in den Schritten D und E.
Schritt F umfasst sequenzielle PCR-Reaktionen, um diversifizierte CDRH3 mit einer unterschiedlichen Länge und die günstigen JCH1LNK-Restriktionsstellen (d. h. rs3) an das 3'-Ende der vier diversifizierten CSRH2-Konstrukte rVHrsB-95CSR2.1-4 anzufügen und an ihren 5'-Enden das parentale CSRH1 zu diversifizieren und Nukleinsäuren, die für VH17-rsB-24 kodieren, anzufügen. Die endgültigen PCR- Produkte dieser Reaktionen werden als rVH17-118CSR1&2&3.lib bezeichnet und enthalten alle Kombinationen der diversifizierten bekannten CSRH1&2 und ein diversifiziertes CDRH3 mit drei verschiedenen Längen.
Diese Schritte erfolgen in den nachstehenden 36 PCR-Reaktionen. Neun kleine Mengen eines jeden der vier unterschiedlichen, mit einem Zahnstocher gepickten gefrorenen Glycerin-Kulturen von rVHrsB-95ACSR2.1-4lib.bact werden in getrennte Primär-PCR-Reaktionsgemische von 50 ul mit Taq-Polymerase gegeben. Die Vorwärts-Primer H3.5FWD, H3.7FWD und H3.10FWD werden zu drei der neun Röhrchen gegeben, die jeden der vier CSR2.bact enthalten. Zu jedem dreifachen Satz von einzigartigen Vorwärts-Primern wird einer der nachstehenden Rückwärts- Primer hinzugegeben: H1.1BCK, H1.2BCK oder H1.3BCK. Diese Primär-PCR-Reaktionen werden 25 Zyklen unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min und 72ºC für 2 min). Nach Vervollständigung der Primär-PCR werden kleine Mengen einer jeden der 36 Reaktionen für eine Sekundär-PCR-Reaktion mit neuer Taq-Polymerase und den Primern H31FWD und H31BCK entnommen. Die Sekundär-Reaktionen hängen VH100-rs3-118-rs4 und VH17-rsB-24 an die 3'- bzw. 5'-Enden an. Die Produkte werden als rVH17-118CSR123.lib bezeichnet, gefolgt von einer Kombinationsnummer (z. B. 1.1 · 2.2 · 3.5), die die kombinatorische Anordnung der drei CDRH in diesen Produkten bezeichnet. Jedes der 36 Bibliotheks-Produkte wird durch diagnostische PCR und Sequenzanalyse charakterisiert. Kleine Mengen der 36 Bibliotheken werden gepoolt, um rVH17-118CSR1&2&3.lib herzustellen.
In Schritt G wird DNA aus der rVH17-118CSR1&2&3-Bibliothek mit rsB und rs4 gespalten. Die gespaltene DNA wird mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) gereinigt, in pCLONAL ligiert, der mit rsB und rs4 gespalten wurde, gereinigt und für die Transformation von E. coli, wir vorstehend detailliert beschrieben, verwen det. Die Transformanten werden isoliert, charakterisiert und als rVHrsB- 118CSR1862863.lib.bact bezeichnet.
In Schritt H werden die rVHrsB-rs3-Inserts aus der DNA der rVHrsB- 118CSR18&28&3.lib mit für rsB und rs3 spezifischen Restriktionsenzyrne entfernt, um Fragmente zu bilden, die als rVHrsB-114CDR18s28&31.3 bezeichnet werden. Diese Fragmente werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit 5 ug rsB- und rs3-gespaltener rVH1-51-rs3.bact-DNA ligiert. Das Produkt wird sodann isoliert, gereinigt und für die Transformation von E. coli für die Herstellung von rVH1-JCHLNK-ΔCSR1862853lib.bact eingesetzt. Einzelne Klone aus der Bibliothek werden sodann isoliert und ihre Sequenz durch diagnostische PCR und Sequenzierung bestätigt. Die Bibliothek wird sodann als gefrorene Glycerin- Kulturen aufbewahrt. Die Bakterientransformanten mit dieser Bibliothek enthalten die kanonischen CSRH1 und H2-Regionen, die in mehr als einer Aminosäureposition diversifiziert wurden, und CDRH3 mit drei verschiedenen Längen, das in mehr als einer Aminosäureposition diversifiziert wurde. Dieses Verfahren ergibt wenigstens 105 Transformanten, die durch diagnostische PCR und Sequenzierung dahingehend identifiziert werden, dass sie geeigneterweise randomisierte Aminosäuren an den diversifizierten Positionen in den CSRH2- und H3-Regionen für die rVH1- 114CDR2-3-Bibliothek enthalten.
In Schritt I werden 5 ug der rs2- und rs3-gespaltenen pVLACCEPTOR-DNA (auch bezeichnet als pVH-CH, Fig. 9) mit der rs2- und rs3-freigesetzten Insert-rVH1- JCHLNKDCSR1&2853.lib-DNA (auch als rVHlib bezeichnet, Fig. 8) ligiert und das gewonnene gereinigte Produkt wird als rVHCH1.lib bezeichnet. Dieses rVHCH1.lib- Produkt wird für die Transformation von E. coli eingesetzt, um eine gefrorene Kultur von Bakterien zu schaffen, die rVHCH1.lib enthalten. Mehr als 106 Gesamt-Mitglieder werden erhalten.

XI. VH- und VL-Bibliothek-Größen:

Die vorstehenden, detaillierten Reaktionen, bei denen zwei Aminosäure-Randomisierungen in jedem CSR auftreten, erlauben theoretisch die Herstellung von 1200, 1600 und 1200 verschiedenen CSRH1, 2 bzw. 3 und eine Größe der rVH-Bibliothek von 2,3 · 10&sup9;. Dies überschreitet die größte veröffentlichte rekombinante VHCH1- Bibliothek, die in ähnlicher Art und Weise hergestellt wurde (Griffiths, Williams et al., 1994) nur etwa 2-fach. Eine kleinere rVH-Bibliothek kann mit Hilfe von nur zwei Randomisierungen in dem CSRH1 und H2 und einer Randomisierung in jeder der drei verschieden großen CDRH3 hergestellt werden. Dieses Verfahren erlaubt theoretisch die Konstruktion von 1200, 1600 und 60 verschiedenen CSRH1, 2 bzw. 3 und eine Größe der rVH-Bibliothek von 1,152 · 10&sup8;. Dies ist ähnlich zu der größten beschriebenen rVHCH1-Bibliothek. Das nachstehend beschriebene Verfahren ermöglicht die darauffolgende Paarung einzelner Mitglieder derartig großer rVHCH1-Bibliotheken mit einzelnen Mitgliedern gleichgroßer rVLCL-Bibliotheken (d. h. mit 10&sup9;, wie vorstehend erwähnt; Fig. 4) auf einem DNA-Stück in einzelnen Bakterien. Basierend auf der Größe der rVHCH1-Bibliothek und rVLCL-Bibliothek, die vorstehend hergestellt wurden, ist die mögliche Größe der kombinatorischen rVab.lib (d. h. VHCH1.lib x VLCL.lib) größer als 1018 Mitglieder (Fig. 4).

XII. Herstellung der rVab.lib (die VHCH1.lib · VLCL.lib-kombinatorische Bibliothek] (Fig. 11. 12. 14)

In diesem Abschnitt wird das Phagmid (fdφ), das die rVHCH1.lib trägt, bezeichnet als lox-Receiver (LoxREC) (fdφRECEIVER, Fig. 11) und das Plasmid (p), das die rVLCL-Bibliothek trägt, bezeichnet als Lox-Provider (LoxPro) (pUC19PROVIDER, Fig. 11) hergestellt und sodann in vivo in einzelnen Bakterien auf einen einzelnen Phagen-Vektor (fdφCARRIER) zufällig rekombiniert, der die rCHCH1- und rVLCL- Gene von rVab exprimiert und auf der Oberfläche der Phagen funktionelle Versionen der rVab-rVHCL1 : rVLCL-Proteine produziert. Die Herstellung der rVab-Bibliothek ist in den Fig. 11 und 12 gezeigt.
Die Herstellung beginnt mit einer erneuten Amplifizierung der rVHCH1-Bibliothek, die in dem pVLACCEPTOR.lib.bact gehalten wird, mit Hilfe von PCR, wie vorstehend beschrieben, mit den Primern pCFWD und pCBCK. Das DNA-Produkt wird isoliert und mit VHrs2 (Ncol) und VHrs4 (NotI) gespalten und mit Hilfe von T4- Ligase und Standardverfahren in LoxPRO ligiert, der mit Ncol und NotI gespalten wurde. Der in diesem Beispiel verwendete LoxPRO ist gemäß dem fdDOG1- 2loxVkdel gestaltet, wie beschrieben von Griffiths, A. D. et al., 1994, und enthält ein endogenes VHCH1, das durch Sfil und NotI-Restriktionsstellen umrahmt wird, dem eine Ribosomen-Bindestelle (rbs) und eine LpelB-Leitsequenz (LpelB) im Raster vorangeht und das von einer Wildtyp-loxP-Sequenz im Raster (Hoess et al., 1982) und sodann von einer gpIII-Sequenz im Raster gefolgt wird. In LoxPRO befindet sich stromaufwärts von dem endogenen VHCH-Gen ein endogenes CL-Gen, das durch das hereinkommende rVLCL.lib ersetzt werden soll und dem eine Leitse quenz vorausgeht, die mit einer ApaL1-Sequenz im Raster endet, der zwei Terminations-Kodon-Triplets folgen. Das endogene CL-Gen wird von zwei Terminations- Triplet-Kodons, einer AscI- und einer HindIII-Restriktionsstelle und einer mutanten 511 loxP-Stelle gefolgt (Hoess et al., 1986). DNA aus dem Ligationsgemisch wird gereinigt und in E. coli TG 1 (Gibson, 1984) elektroporiert (Dower, Miller et al., 1988), um die auf pUC-basierende Bibliothek LoxPRO.rVHCH1lib herzustellen (d. h. pUCLoxPROVIDER-rVHCH1lib). Mehr als 108 Klone werden erhalten und die Diversität wird durch Sequenzierung unabhängiger Klone bestätigt.
Parallel dazu wird DNA aus rVLCLlib.bact gereinigt (Fig. 8) und durch PCR mit den Primern pCFWD und pCBCK amplifiziert. Das PCR-Produkt wird isoliert, mit VLrs2 (ApaLI) und VLrs4' (AscI) gespalten und durch Standardverfahren in den auf fdbasierenden LoxREC (d. h. fdfDOGRECEIVER) ligiert. Durch PCR amplifizierte DNA wird mit Hilfe von Magie PCR Prep gereinigt. Die DNA wird sodann mit ApaLI und AscI gespalten und die gespaltene DNA (etwa 6 ug) auf einem 1,5% niedrig-schmelzenden Agarosegel unter Verwendung von Magie PCR Prep (Promega) gereinigt. Etwa 1 ug der gereinigten und gespaltenen rVLCL.lib-DNA (Fig. 7) wird mit etwa 5 ug gespaltenem fdDOG-2loxVkdel (Sambrook, Fritsch et al., 1990) in einem 60 ul- Volumen mit 1200 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert (Fig. 11). Die ligierte DNA wird aus dem Ligationsgemisch mit Hilfe von Geneclean II (Bio101) gereinigt, in 30 ul Wasser resuspendiert und in vier 50 ul-Mengen von E. co/iTGl- Zellen elektroporiert, die in 1 ml 2 · TY-Medium mit 1% Glucose für 1 Stunde vermehrt werden (Dower, Miller et al., 1988). Die Zellen werden sodann auf TYE (Miller, 1972)-Medium mit 12,5 ug/ml Tetracyclin (TYE-TET) auf Platten (Nung) ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC werden Kolonien von den Platten in 7 ml 2 · TY-Medium (Miller, 1972) mit 15% (v/v) Glycerin für eine Lagerung bei -70ºC abgekratzt.
Die Häufigkeit von Inserts wird durch PCR für jeden Pool bestimmt. Eine Sequenz- Diversität wird durch Sequenzierung von 8 Klonen für jeden Pool bestätigt. Die Pools werden sodann kombiniert, um die vorstehend beschriebene rVLCL.lib fdDOG-2lox rVdLlib herzustellen. DNA aus dem Ligationsgemisch wird gereinigt und in E. coli TG1 (Gibson, 1984) elektroporiert (Dower, Miller et al., 1988), um die Bibliothek LoxRECrVHCH1lib (d. h. pUC19-loxrVHCH1lib) mit mehr als 5 · 10&sup8; Klonen herzustellen. Eine Diversität wird durch Sequenzierung von 30 unabhängigen Klonen bestätigt.

Schritt 4: In vivo-Rekombination von VHCH1- und VLCL-Genen

In diesem Schritt, zusammengefasst in Fig. 14, werden VHCH1- und VLCL-Gene in Paaren auf einzelnen DNA-Stücken rekombiniert, um die rVab-Bibliothek herzustellen. Einzelne Mitglieder der VLCL- und rVHCH1-Bibliothek werden in ein einzelnes Bakterium durch sequenziellen Einbau in dieses Bakterium des rVLCL-Mitglieds durch Phagen-vermittelte Infektion und des rVHCH1-Mitglieds durch DNAvermittelte Plasmid-Transformation gebracht. Sobald sie sich in den Bakterien befinden, werden die zwei Ketten auf das gleiche Stück einer replizierenden DNA (fdφCARRIER) in dem Bakterium durch die CRE-Rekombinase von P1 kombiniert, die durch Pl-Phagen-Infektion bereitgestellt wird. Die CRE-Rekombinase katalysiert die Rekombination an der loxP-Stelle in einem Verfahren, das als "rekombinatorische Infektion" bezeichnet wird (Waterhouse, Griffiths et al., 1993). Das Verfahren der rekombinatorischen Infektion für die Expression rekombinanter Proteine wurde ursprünglich von Sternberg und Hamilton (Sternberg und Hamilton, 1981) und Hoess et al. (Hoess, Ziese et al., 1982; Hoess, Wierzbicki et al., 1986) beschrieben, die erfindungsgemäß umfasst sind, und es ist in Fig. 14 gezeigt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren überleben nur die Bakterien, die mit einer Kombination von rVHCH1/rVLCL (d. h. ein rVab-Mitglied) transformiert wurden. Unter Berücksichtigung der Größe der rVHCH1-Bibliothek (größer als 108, vgl. oben) und der rVLCL-Bibliothek (größer als 108, vgl. oben), könnte dieser Typ einer Kombination bei nicht begrenzenden Bakterien eine rVab.lib von mehr als 1017 Mitgliedern ergeben.
Erfindungsgemäß wird die diversifizierte rVLCL.lib in einen TetracyclinR-fd-Phagen Moniert (erste Antibiotikum-Resistenz), der irgendeine VH-Kette enthält, die leicht erkannt wird und in dem Verfahren später durch rVH.lib-Ketten ersetzt werden wird. Die diversifizierten rVHCH1-Ketten werden in Ampicillin-resistente Provider- Plasmide (zweite Antibiotikum-Resistenz) kloniert. Die zwei Bibliotheken werden sodann in E. coli vereinigt. Dabei werden Bakterien, die zuvor mit Plasmid-DNA mit Provider-VHCH1-Ketten transformiert worden waren, mit einem fd-Phagen, der die Receiver-VLCL-Ketten (die rVLCL.lib) enthält, infiziert. Eine l Liter-Kultur dieser Bakterien wird sodann mit fP1 co-infiziert, der Chloramphenicol-resistent ist (dritte Antibiotikum-Resistenz) und die Cre-Rekombinase trägt. fd-Phagen, die aus vermehrten Kolonien gewonnen werden, die gegenüber den Antibiotika resistent sind, werden für die Infektion von E. coli verwendet. Der Prozentsatz an Rezeptor-Phagen mit hinzugekommenen rVHCH1-Genen aus dem Provider-Vektor ist erwartungs gemäß größer als 5%, basierend auf der Vermutung, dass jedes Bakterium 60 Phagen in einer über Nacht-Kultur produziert (Griffiths, Williams et al., 1994). Es wird auch geschätzt, dass die Anzahl verschiedener Phagen in der rVab-Bibliothek in der Nähe der Anzahl überlebender Bakterien liegen wird, sofern dieser Prozentsatz der ursprünglichen gegenüber drei Antibiotika-resistenten gewonnenen Zellen eine rVHCH1-Kette aus dem Provider-Vektor übernimmt.

Details der einzelnen Schritte für eine Expression von rVLCL. 1.6 und rVHCH1.L.b durch CRE-LOX-rekombinatorische Bildung

Phagen-P1-Lysate werden durch thermale Induktion hergestellt (Rosner, 1972). E. coli C600 Su- (Appleyard, 1954) mit dem Phagen P1Cm c1.100r-m- (Yarmolinski, Hansen et al., 1989) werden in 2 l-Baffle-Flaschen mit 1 l 2 · TY, 25 ug/ml Chloramphenicol, 10 mM MgSO&sub4; unter starkem Schütteln bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bei 600 nM vermehrt. Die Temperatur wird sodann rasch auf 42ºC durch Schütteln in einem 70ºC-Wasserbad erhöht. Ein Schütteln wird für weitere 35 min fortgesetzt und sodann bei 37ºC, bis eine Lyse erkennbar ist. Die Kulturen werden zentrifugiert, um den Niederschlag und intakte Zellen zu entfernen. Chloroform (100 ul) wird zu dem Überstand hinzugegeben und P1-Phagen nach 30 min Infektion bei 30ºC einer mittel-logarithmischen E. coli TG1-Kultur (Gibson, 1984) in 2 · TY-Medium mit 5 mM CaCl&sub2; vermehrt. Phagen-infizierte E. coli werden durch Ausplattieren von E. coli auf TYE-Medium (Miller, 1972) mit 30 ug/ml Chloramphenicol titriert. Resistente Kolonien werden nach 24 Stunden Inkubation bei 30ºC gezählt und bei einer Expression von transduzierenden Einheiten (t.u.) sind sie mehr als 109/ml.
1 l 2 · TY-Medium mit 12,5 ug/ml Tetracyclin (2 · TY-TET) wird mit 10&sup9; E. coli beimpft, die die in LoxREC Monierte rVLCL.lib (d. h. fdDOG-2loxVkldel) tragen (Griffiths, A. D. et al., 1994). Die Kultur wird 12 Stunden bei 30ºC in zwei 500 ml- Mengen in 2 l-Baffle-Erlmeyer-Flaschen inkubiert. Polyethylenglykol wird für die Fällung der Phagen hinzugegeben (McCafferty, Griffiths et al., 1990), die sodann in PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung: 25 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 125 mM NaCl, pH 7,0) suspendiert und durch einen 0,45 um sterilen Filter filtriert werden (Minisart, Sartorius). Die resultierenden Phagen werden auf E. coli TG 1 der mittel-logarithmischen Phase titriert (30 min. 37ºC) und auf TYE-TET ausplattiert (Griffiths, A. D. et al., 1994) erreichen sie ~10¹&sup0; t.u./ml.
Die Rekombination wird durch Entnahme von kleinen Mengen der Phagen-infizierten Bakterien und durch serielle Verdünnung der Bakterien auf TYE-Platten, die mit 1% Glucose und den drei Antibiotika, Ampicillin (100 ug/ml), Tetracyclin (15 ug/ml) und Chloramphenicol (30 ug/ml) supplementiert wurden, und Berechnen der Bibliothek-Größe überwacht. Die in LoxPRO klonierte rVHCH1-Bibliothek (d. h. pUC19-21loxVHdel) (Griffiths A. D. et al., 1994 (vgl. oben)), die in etwa 10» E. coli enthalten ist, wird in 100 ml 2 · TY-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin und 1% (w/v) Glucose (2 · TY : AMP : GLU) geimpft. Eine kleine Menge wird für cfu-Titrierung entnommen und der Rest der Kultur über Nacht bei 30ºC vermehrt. Eine zweite Menge wird sodann für eine cfu-Titrierung entnommen und eine 5 ml-Menge für die Beimpfung von 500 ml 2 · TY : AMP : GLU in einer 2 l-Erlmeyer-Flasche verwendet und die Kultur bei 37ºC bis zu einer ÖD von 0,5 (600 nm) vermehrt. Zu dieser Kultur werden 2 · 10¹² t.u. von rVLCL.lib in LoxREC gegeben und die Kultur sodann in 5 · 100 ml-Mengen aufgeteilt. Jede Menge wird mit 1 l 2 · TY : AMP : GLU auf 37ºC angewärmt, gemischt und bei 37ºC ohne Schütteln für 30 min inkubiert und sodann unter Schütteln inkubiert, bis ein OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,4 erreicht wird (etwa 30 min). Kleine Mengen werden sodann für eine cfu-Titrierung entnommen. 200 ml des Phagen-P1Cmc1.100r-m-Lysats (etwa 6 · 10¹¹ t.u.) werden zu jeder Flasche (bei einem m.o.i. von etwa 1) nach Zugabe von CaCla in einer Endkonzentration von 5 mM CaCl&sub2; hinzugefügt. Es wird weiter für 1 Stunde bei 30ºC inkubiert, wobei alle 15 min kurz geschüttelt wird, gefolgt von der Zentrifugation bei 5000 · g für 15 min. Die Niederschläge werden in 5 l 2 · TYB (das ursprüngliche Volumen) mit 100 ug/ml Ampicillin (100 A), 12,5 ug/ml Tetracyclin (12,5 T) und 25 ug/ml Chloramphenicol (25 C) und 1% Glucose (1 G) suspendiert. Eine kleine Menge wird für eine cfu-Titrierung entommen und die Größe der Bibliothek (Anzahl ATC-resistenter cfu) als größer als 10¹&sup0; bestätigt. Eine kleine Menge wird bei 12 000 · g 5 min zentrifugiert, der Überstand durch einen 0,45 um-Sterilfilter filtriert und der fd-Phagen- Titer durch Infektion von E. coli TG 1 in der logarithmischen Phase (30 min. 37ºC) und Ausplattieren auf TYE-TET bestimmt.
Die Kultur wird in 5 · 1 l-Mengen über Nacht bei 30ºC (die Kultivierung erfolgte unter Schütteln, es sei denn, es ist anders erwähnt) 24 Stunden in 2 l-Baffle-Flaschen inkubiert. Kleine Mengen werden für eine Titrierung des bakteriellen cfu und der fd-Phagen (unter Verwendung von E. coli TG 1 in der logarithmischen Phase) entnommen, wobei bestimmt wird, dass die Gesamtausbeute von fd-Phagen größer als 1013 t.u. ist. Die Kultur wird bei 5000 · g 15 min bei 4ºC zentrifugiert und die fd-Phagen mit Hilfe von PEP gefällt (McCafferty et al., 1990) und in einem Endvolumen von 10 ml PBS resuspendiert.
Fünf 2 l-Flaschen, jeweils mit 1 l 2 · TYB, werden mit E. coli TG 1 beimpft und bei 37ºC bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,4 (etwa 4 · 10¹² Bakterien) vermehrt. Etwa 1-2 · 10¹² t.u. rVab werden sodann zu den 5 l E. coli hinzugegeben und die Kulturen ohne Schütteln bei 37ºC 30 min inkubiert. Die Anzahl an mit den fd-Phagen infizierten E. coli wird durch Ausplattieren der Bakterien auf TYE-TET-Platten auf mehr als 1012 bestimmt. Tetracyclin (12,5 ug/ml) wird sodann hinzugegeben und die Kultur 16 Stunden bei 30ºC vermehrt. Die Kultur wird sodann bei 5000 · g 10 min zentrifugiert und der Niederschlag, umfassen die Bibliothek, in 250 ml 2 · TYB mit 15% Glycerin suspendiert und in 15 ml-Mengen bei -70ºC aufbewahrt.
Die Wirksamkeit eines Austausches des endogenen VH in dem Phagemid-Receiver- Vektor LoxREC durch rVHCH1-Ketten aus dem Provider-Vektor LoxPRO (d. h. pU19-2loxVHlib) (Griffiths, A. D. et al., 1994) wird auf weniger als etwa 20% durch Analyse von 200-300 einzelner Kolonien aus rVablib bestimmt. Kolonien werden auf TYE-TET-Platten überführt und über Nacht bei 30ºC vermehrt. Eine Identifizierung von Kolonien, die die rekombinanten VH-Gene aufweisen, erfolgt mit Hilfe von Kolonie-Hybridisierung (Tomlinson et al., 1992) mit einem Primer, der zu der CD3- Region des austauschbaren VH von LoxREC komplementär ist. Zwischen 40-50 Klone ohne das endogenen VH-Gen (d. h. das antiTNF VH, wie von Griffiths, A. D. et al., 1994, in fdDOG-2lox Vdel verwendet) werden durch PCR (Gussow und Clackson, 1989) auf schwere Ketten mit zu PELBBCK (5'GAA ATA CCT ATT GCC TAG GG) und CH1.LIBSEQFWD (d. h. 5'GGT GCT CTT GGA GGA GGG TGC) ähnlichen Primern und auf leichte Ketten mit Primern wie fdBCK (5'GCG ATG GTT GTT GTC ATT GTC GGC) und CL. (oder CL) LIBSEQFWD (5'CAA CTRG CTC ATC AGA TGG CG bzw. 5'GTG GCC TTG TTG GCTTGA AGC) (Griffiths, A. D. et al., 1994) gescreent. Beide Ketten treten erwartungsgemäß in den Klonen bei einer Häufigkeit von etwa 20-30% auf.
Kleine Mengen werden sodann auf TYE-TET in Platten (Nung) ausgebracht und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Außerdem wird durch serielle Verdünnung auf kleinen TYE-TET-Platten titriert, um eine Bestimmung der Anzahl an Kolonien auf den großen Platten zu erlauben. Die Platten, die die für die Herstellung von 10&sup7; Klonen notwendigen Bakterien enthalten, werden gesammelt und die Bakterien in 10 ml 2 · TYB mit 15% Glycerin abgekratzt, um Kulturen von rVab-Bibliotheken mit mehr als 10&sup7; Klonen herzustellen.

XII. Schritt 5 - Herstellung von Phagen und Präsentation der rVab.lib auf den Phagen-Oberflächen (Fig. 14)

Jedes vorstehend hergestellte Phagemid trägt und exprimiert ein einzelnes Mitglied aus rVab.lib. Wie in Fig. 14 gezeigt, wird das VHCH1-Protein als Fusionsprotein, gekoppelt in einem offenen Leserahmen mit dem NH2-Terminus des fd-gpIII-Hüllproteins exprimiert und daher auf der Oberfläche eines reifen Phagen als gebundenes Oberflächenprotein präsentiert (Display). Das VLCL-Protein exprimiert durch eine geeignete Leitsequenz und doppelte Terminations-Kodons als lösliches Protein, wird in den periplasmatischen Raum der Bakterien freigesetzt, wo es unter reduzierenden Bedingungen spontan aktive Disulfid-verknüpfte Dimere mit VHCH bildet und so den gewünschten funktionellen rekombinanten rVab auf der Oberfläche des reifen Phagen schafft. Phagen-Lysate, die die gesamte kombinatorische rVab-Bibliothek exprimieren (ein rVHCH- und ein rVLCL-Gen pro Phage) werden mit Hilfe von Helfer-Phagen hergestellt.
Phagen, Helfer-Phagen, Plasmid-Konstruktion und Titrierung sind wie allgemein in der Literatur beschrieben und Phagen und Helfer-Phagen sind von gewerblichen Quellen verfügbar (Stratacyte, CA oder Cambridge Antibodies Technologies, UK). Die Lysate werden im allgemeinen wie folgt hergestellt: 5 l 2 · TY-TET werden mit 15 (5-20) ml der rVab-Phagen-Bibliothek (mehr als 2 · 10¹&sup0; cfu) beimpft, die Kulturen über Nacht bei 30ºC in Baffle-Flaschen (1 l Medium/Flasche) vermehrt, bei 5000 · g 15 min bei 4ºC zentrifugiert und die fd-Phagen mit PEP gefällt (McCafferty et al., 1990). Die Phagen werden sodann in einem Endvolumen von 10 ml PBS resuspendiert.
Diese Lysate werden als rVab.lib.F bezeichnet und weisen eine Gesamtausbeute von rVab-exprimierenden Phagen von 10¹³-10¹&sup4; t.u. auf.

BEISPIEL 2

Herstellung von SOMEREN für den menschlichen Typ 1-Muscarin-Acetylcholin- Rezeptor

In diesem Beispiel werden gemäß den Stufen I und II des TSA-Verfahrens (Fig. 1) rVabs aus der rVab.lib identifiziert, isoliert und für die Etablierung eines Tests für kleine organische Moleküle (SOMERE) eingesetzt, die an nur einen Subtyp des menschlichen Muscarin-cholinergen Rezeptors (huAChRm) binden und seine Aktivität regulieren. Solche SOMERE sind als neue Auffindungs-Leitverbindungen für Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit und andere Gedächtnis- und Lern- Defizienzen verwendbar. Die nachstehend beschriebenen Schritte entsprechen den Stufen I-II (vgl. Fig. 1) des erfindungsgemäßen Verfahrens und sind diejenigen, die für die Isolierung der rVab-Mitglieder aus rVab.lib notwendig sind, die an Typ l von AChRm-Subtypen binden (T+), seine Aktivität regulieren (A+) und für Subtyp l des menschlichen Muscarin-Rezeptors (huAChRm1) spezifisch und selektiv (S+) sind. Die erfindungsgemäße Stufe III, bei der diese TSA+-rVabs für die Schaffung von SD-Modellen AChRm1-spezifischer Pharmakophore (BEEPS, vgl. nachstehend) und für die Gewinnung von SOMEREN eingesetzt werden, ist kurz am Ende beschrieben.
Die Stufen I-II stellen die Schritte detailliert dar, die für eine Gewinnung und Verwendung des spezifischen AChRm1 rVab notwendig sind, um einfache und schnelle Radiorezeptor-Tests für kleine organische Moleküle (SOMERE) zu etabilieren, die spezifisch an huAChRm1 binden und diesen regulieren. Wie hier beschrieben und in Fig. 18 und 19 gezeigt, werden diese rVabs für die Entdeckung aktiver Oberflächen auf dem huAChRm1 eingesetzt, die nicht auf den anderen huACh- Rm2-5-Subtypen vorkommen. Zusätzlich können die rVabs Agonisten oder Antagonisten an selektierten hu AChRm-Subtypen (d. h. m&sub1;&submin;&sub5;) sein und können eine Spezifität (S+) der Wirkung zwischen einem m-Subtyp und den anderen vier zeigen.
Phase I dieses Verfahrens stellt funktioneilen huAChRm her, das Ziel dieses Tests. Phase II identifiziert zuerst die rVabs, die in der rVab.lib enthalten sind, die an hu- AChRm1 binden (d. h. sie sind T+) und die unter den 5 hu AChRm-Subtypen selektiv (Andre, Marullo et al., 1987), sowie für huAChRm gegenüber nicht-cholinergen Neurotränsmitter-Rezeptoren spezifisch sind. In diesem Beispiel werden diese zwei Eigenschaften gemeinsam als S+ bezeichnet. Sodann wird in Phase II die Subpo pulation von TS+ huAChRm rVab identifiziert und isoliert, die die Aktivität des hu- AChRm1 (A+) mit ähnlichen TS+-Eigenschaften reguliert. Die rVabs mit all diesen Eigenschaften werden als TSA+ rVabs bezeichnet. In Phase III werden die TSA+ rVabs in Reporter umgewandelt (d. h. rVab-Reporter) und es werden gültige automatisierte schnelle Rezeptor-Binde-Screens für kleine organische Moleküle (SOMERE) etabliert, die kompetitiv aktive rVab-Reporter von aktiven Oberflächen auf huAChRm1 verdrängen. Unter diesen SOMEREN befinden sich die mit dem gewünschten Aktivitätsprofil einer pharmazeutischen Entdeckungs-Leitverbindung, d. h. einer selektiven spezifischen Regulation von AChRm1.

Phase I-A: Gewinnung von AChRm

Kortikale, an huAChRm angereicherte Membranen werden aus Gehirnen (frisch oder gefroren, aus Mensch, Schwein oder Rind) wie in Haga und Haga beschrieben, hergestellt (Haga und Haga, 1983). Membranen werden durch Homogenisierung gemäß Standardverfahren (d. h. mit Protease-Inhibitoren) hergestellt und AChRm durch Behandlung mit 1% Digitonin, 0,1% NaCholat in 50 mM NaCl/Puffer solubilisiert. Der lösliche Rezeptor wird über eine 3-(2'-Aminobenzhydryloxy)-tropan (ABT)-Affinitätssäule gereinigt und aus der ABT-Säule durch Atropin eluiert. Löslicher Rezeptor wird sodann auf eine Hydroxylapatit-Säule gegeben, um freies Atropin zu entfernen. Der Rezeptor wird sodann mit stark konzentriertem Kaliumphosphat und 0,1% Digitonin eluiert und weiter durch eine zweite Runde einer ABT- Reinigung, wie vorstehend beschrieben, gereinigt. Zwei Runden einer HPLC-Reinigung über in Serie geschaltete TSK4000SW- und TSKSOOOSW-Säulen ermöglicht die letzte Reinigung und der Rezeptor wird in 0,1 M Kaliumphosphat mit 0,1% Digitonin suspendiert.
Als Sekundärquelle werden die 5 huAChRm1-5, exprimiert als rekombinante Proteine (rhuAChRm1-5) in Sf9-Zellen mit einem Expressionsvektor-Baculovirus-Konstrukt, das eines der huAChRm trägt, wie ursprünglich von Vasudevan (Vasudevan, Reilander et al., 1991) beschrieben, von gewerblichen Quellen erhalten (Bio- Signal, Inc., Montreal, Kanada). Andere alternative Quellen für huAChRm sind verschiedene transfizierte Gewebekultur-Zelllinien, die Monierten huAChRm exprimieren (Kubo, Fukuda et al., 1986; Shapiro, Scherer et al., 1988; Buckley, Bonner et al., 1989; Buckley, Hulme et al., 1990; Tietje, Goldman et al., 1990; von Koppen und Nathanson, 1990; Kashihara, Varga et al., 1992; Beeth, 1993; Lazareno, Farries et al., 1993; von Koppen und Lenz et al., 1993).

Phase I-B: Gewinnung von G-Proteinen (GP)

Go, Gi und Gn (als G-Protein [GP] im Text und als G in den Figuren bezeichnet) werden wie beschrieben gereinigt (Sternweis, 1984; Haga, 1986 und Haga, Uchiyama et al., 1989). Gehirne (150 g) aus Schwein, Rind oder Mensch (erhalten von gewerblichen oder nicht-gewerblichen Quellen) werden homogenisiert, die Membranen gefällt und sodann mit 1% Na-Cholat in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT (1% Cho-TED) mit 0,1 mM Benzamidin (2 l Vol.) solubilisiert. Nach Zentrifugation wird der Überstand auf DAE-Sephacel gegeben und die Fraktionen, die [35S]GTPS binden, mit einem linearen Gradienten von NaCl in 1% Cho- TED eluiert, einkonzentriert, auf Ultrogel AcA 34 gegeben und mit 0,1 M NaCl in Cho-TED eluiert. Die Fraktionen mit einer [35S]GTPS-Bindeaktivität werden mit TED + 0,1 M NaCl (450 ml) gepoolt und auf Heptylamin-Sepharose gegeben, gewaschen und schließlich mit einem linearen Gradienten von 0,25% NaCho-TED + 0,2 M NaCl gegenüber 1,3% NaCho-TED + 0,05 M NaCl eluiert. Dieses Material (ein Gemisch von Gi und Go) wird auf DEAE-Toyopearl gegeben, das mit TED + 0,6% Lubrol PX (0,6% LPX-TED) vorgewaschen wurde, und wird mit einem linearen Gradienten von NaCl in 0,6% LPX-TED eluiert. Die Gi-Fraktionen eluieren zuerst und sodann die Go-Fraktionen. Jede wird getrennt gesammelt und bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert. Vor einer Verwendung wird das Lubrol gegen 0,8% NaCholat in TED + 0,5 M K-Phosphat-Puffer, pH 7, 0,1 M NaCl auf einer kleinen Hydroxylapatit-Säule ausgetauscht.

Phase I-C: Herstellung eines aktiven AChRm : GP-Komplexes

Die Herstellung erfolgt gemäß Florio und Sternweis (Florio, 1985). Gesamt-Lipid aus Schweine- [oder menschlichem] Gehirn: vgl. Folch, J., Lees, M. und Stanley, G. H. S. (Folch, Lees et al., 1957). Das Lipid-Gemisch wird aus Gehirn-Extrakt (Folch, Fraktion I) (jeweils 1,5 mg) hergestellt (Haga, 1986) und Gesamt-Lipid (jeweils 1,5 mg) in 1 ml HEN (20 mM Hepes-KOH-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA und 160 mM NaCl) mit 0,18% Desoxycholat und 0,04% Natriumcholat suspendiert. rhuAChRm (0,2-0,4 nmol/ml [3H]QNB-Bindestellen in PD (0,5 M Kaliumphosphat- Puffer, pH 7,0 und 0,1% Digitonin (10-40 ul))) werden mit 0,1 mM Oxotremorin in HEN gemischt und sodann mit 100 ul Lipid-Gemisch (Endvolumen 200 ul) gemischt, um den QNB : R-Komplex zu ergeben. Der Komplex wird sodann über eine Sephadex G50-Säule geschickt und das Porenvolumen (1-8 umol [³H]QNB-Binde stellen, 400 ul) gesammelt. Der huAChRm : QNB-Komplex wird mit G-Protein (Gemische oder getrennte G-Proteine, 0-200 umol [³&sup5;S]GTPgS-Bindestellen in 40 ul Cholat-Lösung), CN-TED und HEN (50 ul) mit MgCl&sub2; und DTT (Endkonzentration von 10 bzw. 5 nM) gemischt und bei 0ºC 1 Stunde inkubiert. Dieses huAChRm1 : GP- Gemisch wird vor einer Verwendung mit 3-5 Vol. HEN verdünnt.

Phase I-D: Bindung von aktivem huAChRm an Matrizen (Fig. 19)

huAChRm (im Text als AR abgekürzt und als R oder T in den Figuren) wird alleine oder im Komplex mit GP an eine Sepharose (oder Agarose)-Typ-Matrix gebunden. Dafür werden 5 ml Matrix (WGA-Sepharose, mmolWGA/ml Sepharose, 50% v/v, gewaschen und suspendiert in Puffer A (25 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, 0,8 mM EDTA, 10 mM MgCl&sub2;, 230 mM NaCl, 0,06% BSA und 4 mM HEPES-KOH- Puffer, pH 8,0) mit weniger als 1 ml rekonstituierter AR : GP-Komplexe (100 umol AR/ml) gemischt. Das Gemisch wird sodann bei Raumtemperatur (rt) 30 min inkubiert, mit Puffer A auf 20 ml verdünnt und die Sepharose sich setzen gelassen (oder bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert [5000 · g, 1-2 min]). Die Sepharose wird sodann in 20 ml Puffer A resuspendiert und die Waschschritte zweimal wiederholt, um gereinigte AR-komplexierte WGA-Sepharose [sWGA : ARGP] bereitzustellen. Rekombinant abgeleitete oder native AR : GP-Komplexe, die durch geeignete Zuckerreste an WGA gebunden sind, bleiben bei diesem Verfahren als Matrix-gebundene Rezeptoren in Übereinstimmung mit den veröffentlichten Daten aktiv, die zeigen, dass eine Glycosylierung für eine AChRm-Aktivität nicht erforderlich ist (Habecker, Tietje et al., 1993). Eine Quantifizierung des an sWGA gebundenen AR : GP erfolgt durch die Bindung von [³H]QNB ± 10 uM Atropin und [³&sup5;S]GTPS oder [³H]GppNHp ± 0,1 mM GTPS oder GppNHp unter Verwendung von Standard-Bindetests (Berrie, Birdsall et al., 1985; Haga et al., 1986; Wheatley, Hulme et al., 1986; Poyner, Birdsall et al., 1989).
In parallelen Reaktionen wird natürliches oder rekombinant exprimiertes AChRm (oder GP) durch Standardverfahren direkt oder sekundär über Matrix-gebundene Antikörper, die natürlich abgeleitet sind oder dem rVab-Typ angehören und Epitope auf dem Rezeptor-Glykoprotein, G-Protein oder kleine Peptid-Tags (d. h. c-myc und andere amino- oder carboxy-terminale Tag-Peptide, die in verschiedenen käuflich verfügbaren Expressionsvektoren erhältlich sind) erkennen, an Plastik gebunden. Nach Bindung von AR werden die besetzten reaktiven Matrix-Oberflächen durch Applikation verschiedener Standard-Blockierungsstoffe (d. h. BSA, Milch, usw.) blockiert.

Phase II: Panning auf TSA+ rVab

Bei dieser Stufe werden rVabs identifiziert, die TSA+-Eigenschaften besitzen, dadurch, dass sie an AChR binden, das direkt oder indirekt an die Matrix, mit oder ohne G, gebunden ist. Die Puffer-Bedingungen sind ähnlich zu den für die AChKrn- Radiorezeptor-Bindestudien verwendeten. Diese Bedingungen begünstigen eine Rezeptor-Aktivität. In allen Fällen wird Plastik und nicht Glas für direkte Bindungs-Matrix-Oberflächen und als Reaktionsgefäße verwendet, um eine nicht-spezifische Adsorption von rVab an Glas zu minimieren. In diesen Reaktionen wird ein 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,0), 0,8 mM EDTA, 10 mM MgCl&sub2;, 0,230 mM NaCl, 0,06% BSA, 4 mM HEPES-KOH (pH 8,0)-Puffer verwendet, der gegebenenfalls Guanin-Nukleotide (GTP) und/oder Muscarin-Agonisten oder -Antagonisten, wie nachstehend beschrieben, umfasst. Bei dieser Stufe werden vier Typen von A+ TSA+ rVab-Antikörpern isoliert: Agonisten-ähnliche (Ago+), partielle Agonisten-ähnliche (partAgo+), allosterische Agonisten-ähnliche (Alloago+) und Antagonisten (Antago+) (gezeigt in Fig. 19).

Phase II-A: Panning für Rezeptor [Ziel (T&spplus;)]-Erkennung

Die allgemeine Vorgehensweise ist in Fig. 16 und speziell in Fig. 19 zusammengefasst: 5 ml rVab.lib (1011-12 PFU/5 ml, suspendiert in Puffer) werden mit 1,0 ml abgesetztem sWGA : GAR in Puffer A gemischt und bei 30ºC unter gelindem Schütteln 60 min inkubiert. Das Gemisch wird sodann bei niedriger Geschwindigkeit (LSS) von 500 · g 15 min zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und mit Puffer A auf 10 ml verdünnt. Diese Waschschritte werden dreimal schnell hintereinander wiederholt und der rVab in dem endgültigen Niederschlag in Puffer A resuspendiert und als T+rVab.lib bezeichnet (Fig. 19). Phagen werden durch Elution mit 100 mM Triethylamin freigesetzt (Marks, Hoogenboom et al., 1991). Kleine Mengen werden entnommen und für Phagen titriert. Die Population isolierter Phagen wird sodann durch Infektion und Induktion neuer Lysate amplifiziert und erneut 2-4 mal durch Panning gewaschen, um die endgültige T+rVab-Population von Phagen für eine darauffolgende Isolierung der 4 Typen von A+rVabs herzustellen.

Phase II-B: Panning für aktive rVabs (A+rVab) (Phase IIB)

In diesem Verfahren (allgemeine Übersicht in Fig. 17, spezifische Darstellung in Fig. 19) wird die Untergruppe von rVab aus der amplifizierten T+rVab-Population, die möglicherweise Agonisten sind, durch die Zugabe von Guanin-Nukleotiden induziert, um von dem Matrix-gebundenen R : G-Komplex zu dissoziieren und als freie TA+rVab in dem Überstand isoliert zu werden. Bei diesem Verfahren bleiben die rVab, die binden und als Antagonisten wirken oder die an nicht-aktive Oberflächen binden, an den Matrix-Rezeptor nach Zugabe von Guanin-Nukleotid gebunden. Der negative Einfluss von GTP auf T+rVab-Bindung ist ein Indiz der möglichen Agonisten-Wirkung des gebundenen rVab, basierend auf der Beobachtung, dass es bei funktionell gekoppelten AR : GP-Komplexen eine negativ-reziproke Interaktion zwischen der Bindung von GTP oder GDP an das G-Protein und der Bindung des Agonisten an den Rezeptor gibt, was als sofortige Dissoziierung eines der beiden aus dem Komplex beobachtet werden kann (Smith, Perry et al., 1987; Poyner, Birdsall et al., 1989; Lazareno, Farries et al., 1993). Zwischen Antagonisten und Guanin-Nukleotiden besteht keine derartige reziproke Interaktion (Buckley, Bonner et al., 1989).
Der in dem Überstand freigesetzte TA+ rVab wird weiter getrennt und als einer der drei Typen von Agonisten in getrennten Panning-Schritten isoliert (vgl. die nachstehenden Phasen IIB-i, ii, iii). Die spezifische Muscarin-artige Aktivität des rVab wird am Ende aller Isolierungsschritte bestätigt, wobei AChRm1-Aktivitätstests, bei denen mögliche TSA+rVabs (a) mit radiomarkierten Antagonisten (oder Agonisten) kompetitieren, (b) vorgebundenes [³&sup5;S]GTPS oder [³H]GppNHp aus Matrix-gebundenen AChRm : GP-Komplexen dissoziieren, (c) GTPase und/oder GTP-Austausch stimulieren und (d) die Aktivität anderer Effektor-Systeme, die mit AChRm1 gekoppelt sind (d. h. Adenylatcyclase, Phospholipase, K-Kanäle), in verschiedenen veröffentlichten in yitro-zellularen oder tierischen Testsystemen regulieren (Yatani, Mattera et al., 1988; Fräser, Wang et al., 1989; Shapiro und Nathanson, 1989; Kobayashi, Shibasaki et al., 1990; von Koppen und Nathanson, 1990; Weiss, Bonner et al., 1990; Yatani, Okabe et al., 1990).
In Phase IIB kann auch die Zugabe von ACh selbst zu gebundenem T+rVab durch den gleichen Typ einer Induktion der Dissoziierung von rVab von AChR eingesetzt werden, um die rVab zu isolieren, die nicht an die ACh-Bindetasche, sondern an GP an aktiven Nukleotid-Bindeoberflächen oder an andere Oberflächen auf AR oder GP binden, die aktiv und allosterisch mit den cholinergen Bindeoberflächen des AChRm1 verbunden sind.
Insbesondere wird bei Beginn der Phase IIB die amplifizierte T+rVab.lib, die in Phase IIA isoliert wurde, mit Matrix-gebundenem AChRm1 : G-Komplex in 10 Volumina Puffer A wie vorstehend 30 min bei 37ºC gemischt. Das Pellet wird nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit in 10 Vol. kaltem Puffer A resuspendiert und sofort erneut zentrifugiert. Das gewaschene Pellet wird in 10 Vol. kaltem Puffer A mit 100 uM GTP resuspendiert. Nach weniger als oder nach etwa 1 min wird der Matrix : AR : GP-Komplex bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand von dem Niederschlag für eine Isolierung drei verschiedener Typen agonistischer rVab in Phase IIB-i, ii, iii verwendet. Die Pellets werden in ähnlicher Weise mit Puffer A drei (3) mal gewaschen und in Phase IIB-iv auf Muscarin-artige Antagonisten (Antago+)-Aktivität, wie nachstehend detailliert beschrieben, analysiert. Während dieser Phagen werden kleine Mengen des Überstands für eine Titrierung der Phagen entnommen und bei weniger als 10&sup6;/ml werden die Phagen amplifiziert und 2-3 weitere Male, wie vorstehend beschrieben, recycliert. Zu dem endgültigen Überstand, der rVab enthält, die durch Zugabe von GTP dissoziierten, wird GTPase und GDPase hinzugegeben und der Überstand 30 min bei 30ºC inkubiert. Die Lösung wird sodann abgekühlt und über eine Sephadex G50-Feinsäule unter Verwendung von Puffer A geschickt. Das Porenvolumen, frei von verbleibenden Nukleotiden, wird als TA+(GTP+)rVab.lib bezeichnet.

Identifizierung einer Antagonisten-Aktivität

Die T+rVab.lib, bei der eine Bindung durch Zugabe von GTP nicht verändert wird und die in Gegenwart von GTP an die Matrix gebunden gewonnen wird, wird von der Matrix freigesetzt und die Phagen durch PEP-Präzipitation in Phase IIB-iv geerntet. Die Phagen werden sodann resuspendiert und mit sWGA : RG in 2 ml Puffer A mit sättigenden Mengen an Antagonisten (Atropin 10 uM, Perenzepin 1 uM, Scopolamin, 1 uM) gemischt. Nach Inkubation für 60 min bei 30ºC werden die Phagen und sWGA : RG bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Die freien Phagen werden isoliert, amplifiziert (wie vorstehend beschrieben) und die Population weitere 2-3 Male durch Kombination mit sWGA : RG recycliert, um aus dem Überstand Phagen zu entfernen, die in Gegenwart eines Antagonisten nicht an sWGA : AR binden. Die Phagen in dem endgültigen Überstand enthalten die exprimierten A+rVab-Mitglieder, die Muscarin-artigen Antagonisten ähnlich sind (Antago+) und am Ende der Phase IIB-iv als TAntago+ huAChRm1 rVab.lib bezeichnet werden [vgl. Fig. 19, rVab-4].
Das Pellet aus der Inkubation mit Muscarin-artigen Antagonisten in der vorstehenden Phase IIB-iv enthält eine T+rVab-Unterbibliothek mit Mitgliedern, die direkt mit Oberflächen auf dem G-Protein des AR : GP-Komplexes interagieren und Guanin-Nukleotid-ähnliche Regulatoren des AChRm1 : G-Komplexes sind. Phagen werden von der Matrix befreit, amplifiziert und mit Matrix-gebundenem G-Protein in Puffer A inkubiert. Die Matrix und gebundenes rVab werden sodann zentrifugiert, gewaschen und die gebundenen Phagen isoliert. Bestätigung einer G-ähnlichen Aktivität unter diesen isolierten rVabs erfolgt mit Standard-Radiorezeptor-Bindetests, die eine Kompetition mit radiomarkiertem GppNHp oder GTPγS für eine Bindung an GP bereitstellen.

Phase IIB-i, ii, iii: Trennung von GTP-sensitiven A+rVab in Ago+(GTP+CCh-sensitiv) und alloAgo+(GTP+CCh-insensitiv) AChRm1-rVab (Fig. 19)

1-10 ml der TA+(GTP+)rVab.lib wird mit 1 ml sWGA-GR gemischt, 60 min bei 30ºC in Puffer A mit 300 uM des stabilen Muscarin-artigen Agonisten Carbachol (CCh) inkubiert und sodann bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. In Phase IIB-iii wird das Pellet mit Puffer A drei (3) mal gewaschen, in Puffer A resuspendiert und die Phagen in herkömmlicher Weise isoliert. Diese Phagen-Population, bezeichnet als TA+(GTP+CCh-)rVab.lib, enthalten die allosterisch wirkenden Muscarin-artigen Agonisten (alloAgo+) rVab-Mitglieder (Fig. 19, rVab-3).
Der Überstand aus der Inkubation in der vorstehenden Phase IIB mit CCh wird in Phase IIB-i, ii über Sephadex G50 (fein) passagiert und die Phagen in dem Leervolumen der Säule (wie vorstehend beschrieben) gewonnen, um CCh-freie rVab zu erhalten, die durch CCh vor einer Bindung an AChRm gehindert werden. Diese Phagen werden als TA+(GTP+CCh+)rVab.lib bezeichnet und enthalten die rVab.lib-Mitglieder der Phase IIB-i und ii, die kompetitiv-ACh Muscarin-artige vollständige (i)- oder partielle (ii)-Agonisten-ähnliche (Ago+)-Antikörper sind (d. h. rVab-1 und 2 in Fig. 19).

Phase II-C: Trennung selektiver (S+) von nicht-selektiven (S-) TA* rVabs

Alle vier Typen von AChRm A+T+rVab-Phagen, die in Phase IIB isoliert wurden (als rVab-1, 2, 3 und 4 bezeichnet; Fig. 19) werden getrennt mit 1 ml sWGA : GR ml in Puffer A mit löslichen Komplexen aus GP und AChR der Subtypen 2-5 (d. h. G : AChRm2-5-Komplexe) gemischt. Diese Komplexe werden als kompetitierendes Ziel-Peptid (analog zu comp-T-pep in Fig. 16) hinzugegeben, die einen mehr als 10- fachen Überschuss an Oberflächen-Epitopen enthalten, die von m1-spezifischen A+rVabs nicht erkannt werden sollen. Es wird bei 30ºC 60 min inkubiert und sodann bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert (Fig. 19). Die Niederschläge enthalten die S+rVab.lib-Mitglieder und diese werden in 10 Vol. Puffer A resuspendiert und sofort gewaschen. Die Phagen werden in herkömmlicher Weise gewonnen, amplifiziert und 2-4 weitere Male durch die Phase IIC cyclisiert. Gefrorene Bakterienkulturen und Phagen-Lysate werden für jeden der vier A+-Typen mit einer AChRm1-Spezifität (S+) hergestellt und als TS (Ago; partAgo; alloAgo oder antAgo) +rVab.lib bezeichnet. In einer alternativen Ausführungsform erfolgt eine Isolierung der AChRm1-spezifischen rVab-Bibliothek mit der T+rVab.lib vor einer Selektion für die A+rVab.lib (Fig. 16) und die Population wird für eine darauffolgende A+- Selektion wie vorstehend beschrieben amplifiziert.

Stufe IIE: Bestätigung der A+-Aktivität von einzelnen Mitgliedern der TSA+ rVab AChm1-Bibliothek

Einzelne Mitglieder (10-20) jeder der vier A+-Typ TSA+ rVab AChRm1-Bibliotheken, die vorstehend identifiziert wurden, werden erhalten und Phagen-Lysate für jedes in herkömmlicher Weise hergestellt. Das A+-Profil für einzelne Phagen-Mitglieder jeder der vorstehend genannten vier A+-Bibliotheken wird bestätigt und durch einen nM-EDso-Wert in einem oder mehreren der nachstehenden Standard-Radiorezeptor- und Rezeptor-gekoppelten Aktivitätstests quantifiziert. Die Radiorezeptor- Tests verwenden 1) aktive lösliche Ziele (d. h. AChRm, AChRnr.G und G-Protein- Komplexe), 2) radiomarkierten AChRm-[³H]Agonist oder Antagonist oder [³H oder ³²P]GTP oder GMPPNP oder [³&sup5;S]GTPS in Puffern, die für eine rVab-Isolierung eingesetzt wurden, und 3) verschiedene Verdünnungen einzelner zu testender rVab-Mitglieder. Das Reaktionsgemisch wird bei 30ºC 30 min inkubiert und die Ziele frei von löslichem Radioliganden durch Standard-Filtration oder PEG-Fällung gewonnen. Die Verminderung des spezifisch gebundenen Radiomarkers wird sodann quantifiziert.
Der Grad einer Agonisten-Aktivität für Ago+, partAgo+ und alloAgo+ -rVab-Mitglieder wird durch Dosis-Reaktionsveränderungen irgendeines einer Reihe von AChRm1-gekoppelten Effektorsystemen gezeigt. Ein einzelner Antagonismus (Antago+) wird durch Dosis-Reaktionsblockierung der ACh-Agonisten-Wirkung auf das spezielle Rezeptor-gekoppelte System gezeigt.

Phase III: Umwandlung ausgewählter A+rVab zu rVab-Reportern

A. Herstellung von Reportern und kompetitive Bindetests für die Identifizierung von SOMEREN (Fig. 18, 19)

DNA wird aus Phagen-Lysaten isoliert, die mit Bakterien hergestellt wurden, die aus 2-5 einzelnen TSA+rVab.bact-Kulturen aus jeder der vier Klassen von A+ -Bibliotheken vermehrt wurden, von denen vorstehend gezeigt wurde, dass sie A+ -Aktivitäten mit EDso-Werten von 1-30 nM besitzen. Die DNA wird mit ApaLI und NotI gespalten, um das rVLCL-rVHCH1 rVab-Konstrukt aus dem fdφCarrier freizusetzen, 1 ug des Inserts wird isoliert und mit 5 ug DNA aus pEXPRESSOKrVab (pEXPRES- SOKrVab-1, vgl. Fig. 9), der mit ApaLI und NotI gespalten wurde, und 1200 U T4- Ligase gemischt (Sambrook, Fritsch et al., 1990). Die Ligationsprodukte werden gereinigt und in E. coli elektroporiert (Dower, Miller et al., 1988). Transformanten werden vermehrt und durch diagnostische PCR charakterisiert und sodann sequenziert. Richtige Konstrukte werden jeweils vermehrt, der rekombinante rVab (d. h. VHCH1 : VLCL-Dimer-Ketten) induziert und die rVab-Produkte aus dem Überstand durch Fällung mit an Sepharose gekoppelte VH- oder VL-Ketten-Antikörper oder Antikörper gegen die Peptidsequenzen (ISOTAGS), die in pEXPRESSOKrVab-I (Fig. 9C) enthalten und im Raster an den Carboxy-Terminus von CH1 fusioniert sind, gefällt. Die rVab werden sodann aus dem fällenden Antikörper freigesetzt. Die VHCH1-Kette des rVab wird sodann in einer C-terminalen Domäne der konstanten Region phosphoryliert, die bei einer Ligation von rVab an pEXPRESSrVab im Raster angebracht wird (Lee et al., 1989). Bei der Phosphorylierungsreaktion wird Protein - kinase und [32P]ATP gemäß bekannten Verfahren eingesetzt und das radiomarkierte Produkt mit dem Porenvolumen einer G50-Säule isoliert. Der radiomarkierte rVab wird mit BSA gemischt und bei -4ºC bis zu einer Verwendung gelagert.
Für die Bereitstellung einer Sättigungs-isotherme und von EDso für den markierten rVab mit seinem aktiven Ziel (löslich oder membran-gebunden; GP; AChRm1 oder AChRm1 : GP-Komplexe) wird die Bindung von rVab anhand von Reaktionsgemischen (50 ul) bestimmt, die 1000-1 Mio. cpm radiomarkierten rVab mit und ohne einen 1000-fachen Überschuss an nicht-markierten rVab in Puffer B umfassen. Identische Kontrolltests werden mit AChRm2-5, AChRnicotinisch oder anderen nicht-cholinergen G-Protein-gekoppelten Neurotransmitter-Rezeptoren durchgeführt (z. B. beta- und alpha-adrenerge und Opiat-Rezeptoren). Diese Tests werden 30 min bei 30ºC inkubiert. Der [³²P]rVab : Zielkomplex wird mit PEG gefällt (oder mit membran-gebundenem Ziel filtriert) und die Radioaktivität ausgezählt.
Die induzierte Dissoziierung von rVab aus seinem Ziel durch einen allosterischen Effektor (d. h. die Ago+rVabs mit GTP) definiert die Klasse der allosterischen rVab- Agonisten. Serien von Kompetitions-Bindetests erfolgen sodann unter Verwendung von weniger als oder entsprechend der EDso-Menge von [³²P]rVab mit steigenden Konzentrationen der nicht-markierten Form des gleichen rVab, anderer rVab, Standard-Muscarin-artiger spezifischer Liganden (Agonisten und Antagonisten) und einer Reihe von nicht-cholinergen Liganden als Kontrollen für eine weitere Charakterisierung dieser rVabs.
Diese Tests begründen ein Sättigungsbindung-Isotherm, einen apparenten Kd für rVab und die Assoziierung an das Ziel und IC&sub5;&sub0;-Werte für verschiedene Liganden und andere rVabs. Die Reaktionen, die in Gegenwart steigender Konzentrationen anderer Mitglieder der gleichen TSA+ rVab-Gruppe erfolgen, definieren den rVab mit dem niedrigsten IC&sub5;&sub0;-Wert. Dieser rVab wird sodann in eine radiomarkierte Form für die Gewinnung von Sättigungs-isothermen und verschiedenen Kompetitionskurven umgewandelt. Zusätzlich zu dem radiomarkierten rVab können diese Tests ferner 1) einen Ziel-Agonisten, 2) einen Antagonisten, 3) GTP und 4) Kombinationen aller drei enthalten. Standards wie Nicotin, Muscarin, ATP, GMP und die verschiedenen kleinen organischen Moleküle, von denen früher in der Literatur berichtet wurde, dass sie eine Affinität für eine Regulation des AChRm-Rezeptors des m1-5-Typs besitzen, können auch umfasst sein, ungeachtet der Affinität oder Selektivität. Sättigungs-isotherme erfolgen im allgemeinen über einen Konzentrationsbereich von 4-6 Größenordnungen.
Die rVabs mit einer Affinität für AChRm1 von weniger als etwa 10 nM, einer Selektivität für AChRm1 gegenüber AChR-Typen m2-5 von > 100-fach und einer Spezifität betreffend nicht-cholinerge lösliche Rezeptoren von 1000-fach sind als rVab- Reporter für A+-Aktivität für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen Stufen II und III geeignet, wobei SOMERE in CHEMFILES (chemische Dateien) identifiziert oder basierend auf BEEP-Modellen synthetisiert werden (vgl. nachstehend).

Phasen IV-VI

In den letzten drei erfindungsgemäßen Phasen, die Teil der TSA-Stufe III sind, werden die TSA+ rVabs gemäß gemeinsamer Epitope und Eigenschaften gruppiert (Phase IV), SD-Modelle aktiver Pharmakophore (BEEPs) abgeleitet (Phase V) und die Pharmakophore für das Auffinden von SOMEREN in bestehenden CHEMFILES oder durch Synthese eingesetzt (Phase VI). Die Gruppierung von TSA+rhuAChRm1 in Phase IV erfolgt gemäß a) der gemeinsamen Oberfläche, die durch den rVab erkannt wird (definiert durch Kompetition von Peptidfragmenten des AChR), b) des Typs der Aktivität, den der rVab zeigt (partieller oder vollständiger Agonist, Antagonist, kompetitiv oder allosterisch mit ACh oder GTP) und c) der diversifizierten Aminosäuren der V-Regionen in dem rVab.
Die Analyse in Stufe III der TSA+rVabs, wodurch ein 3D-Modell-Pharmakophor hergestellt wird (Fig. 23-25), erfolgt basierend auf einem durch einen genetischen Algorithmus gesteuerten Vergleich der Anordnungen und Positionen der Aminosäuren in den V-Regionen der aktiven rVabs, einschließlich CSR-, CDR- und Gerüstreste. Das SD-Atommodell, das durch dieses Verfahren geschaffen wird, wird als "biologisch verstärktes, zusammengesetztes Pharmakophor" (BEEP) bezeichnet. Das BEEP enthält eine ausreichende Information für die Beschreibung der Elemente eines SOMERS, die für das Aktivitätsprofil der aktiven rVabs in dieser speziellen Gruppe notwendig sind.
In Phase VI wird das BEEP in einer Vielzahl verfügbarer Programme (HOOK, LOOK und DOCK) für ein Computer-Screening (Phase Via) von verfügbaren CHEMFILES für huAChRm1-SOMERE und in einem rationalen Arzneistoff-Design für die Steuerung der eigentlichen Synthese von huAChRm1-SOMEREN verwendet (Phase Vlb). SOMERE, die durch eines der Verfahren erhalten werden, werden sodann als TSA+ AChRm1-Agonisten oder Antagonisten in in vitro-zellulären Tests und Tierversuchen eingesetzt, die bekannt sind.
Eine weitere Diversifizierung von TSA+ rVabs in CSR5 und CDRH3 erfolgt durch PCR (wie bei der Herstellung der usprünglichen rVab.lib detailliert beschrieben) in Phase IVb immer dann, wenn die Anzahl von rVab in einer Gruppe weniger als 10 ist oder falls keine ausreichende Information aus der Anzahl von A+ rVabs erhältlich ist, die für die Entwicklung von BEEPS mit der gewünschten Verwendbarkeit für eine Identifizierung von SOMEREN entwickelt wurden. Eine Vereinfachung der TSA+-Population erfolgt, falls die Anzahl von rVab in einer Gruppe > 100 ist (Fig. 15).

BEISPIEL 3

In diesem Beispiel wird der TSA-Prozess beschrieben, durch den einfache kompetitive Bindetests für multimere kleine organische Moleküle, in diesem Beispiel DISOMERE, etabliert werden, die die Aktivität eines Wachstumshormon-Rezeptors regulieren können. Hier basiert die Entdeckung eines DISOMERS auf der Entdeckung von rVab-Paaren, die aktive Oberflächen auf einem Wachstumshormon- Rezeptor identifizieren und ihre Umwandlung zu rVab-Reportern gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Diese Methodik etabliert ein allgemeines Verfahren für die Entdeckung von Arzneistoffen, die an oligomeren Rezeptor-Zielen oder Zielen, die eine Aktivierung an vielfachen Stellen einer monomeren Einheit erfordern, aktiv sind. In solchen Systemen wird der "Rezeptor" durch vielfache Oberflächen definiert, die sich in Kontakt mit dem Signal für eine Aktivierung befinden müssen.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Mittel zur Identifizierung aktiver Liganden für Rezeptoren mit vielfachen Stellen bereit, die a) mehr als eine aktive Oberfläche, b) mehr als eine Untereinheit pro aktiver Rezeptor-Komplex oder c) verschiedene Untereinheiten und aktive Oberflächen besitzen. Dieses Verfahren ist auch geeignet, falls mehr als eine Untereinheit einen Teil einer aktiven Oberfläche enthält, die für eine Aktivierung erforderliche Oberfläche für eine Besetzung durch ein einziges kleines organisches Molekül, das in einem CHEMFILE vorkommt, zu groß ist und eine Aktivierung oligomerer Rezeptoren innig mit der Hormoninduzierten Bildung von Komplexen aus wenigstens zwei Rezeptor-Untereinheiten assoziiert ist (Cunningham, 1991; Kelly, 1991; DeVos, 1992 und Wells, 1993).
Im Gegensatz zu Standard-Screens für die Identifizierung einer einzelnen chemischen Entität für einen Austausch eines großen Multi-Stellen-Bindehormons identifiziert das erfindungsgemäße Verfahren Paare von aktiven Oberflächen, findet SOMERE für jede einzelne aktive Oberfläche und verknüpft sodann die SOMERE für die Schaffung multimerer Einheiten (z. B. DISOMERE), die groß genug für einen Austausch der multivalenten Hormone, z. B. Wachstumshormon (GH), sind. In dem beigefügten Beispiel ist der oligomere Ziel-Rezeptor der Homo-dimere Wachstumshormon-Rezeptor (GHR) und die identifizierten aktiven Oberflächen sind die zwei Oberflächen, die von GH für eine aktive GHR-Dimerisierung verwendet werden. Im Fall von GHR gibt es nur einen Typ von Rezeptor-Untereinheit, die hier als T1 bezeichnet wird. Aktivierung des Rezeptors erfordert, dass GH zwei Rezeptor- Untereinheiten (T1²) durch Bindung aktiver Oberflächen auf zwei T1 dimerisiert.

1. Identifizierung und Isolierung von rVabs, die für GHR spezifisch sind

Schritt 1a: Identifizierung von GHRT+rVab.lib für die T1-GHR-Untereinheiten

Aus rVab.lib wird die Subpopulation isoliert, die an die Oberfläche der T1-GHR- Untereinheit bindet. Diese rVabs werden als GHR. T+rVab.lib bezeichnet. Bibliothek-Oberflächen-Scanner werden durch die rVab.lib bereitgestellt, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde. Diese rVab.lib, d. h. rVHCH : VLCL-Komplexe, wird gebunden an das Phagen-Hüllprotein gpIII auf Phagen-Oberflächen exprimiert. Eine Menge von 1 ml Phagen-Lysat (> 10¹² t.u.) wird mit GHR-Rezeptor- Untereinheiten (T1) gemischt, die an einen immobilisierten Festträger, d. h. Agarosepartikel-typische Isolierungsmatrix, gebunden sind (mat-T1). In diesem Beispiel umfasst die grundsätzlich verwendete GHR-Untereinheit (T1) nur die extrazelluläre Domäne von hGHR, einschließlich der hGHR-Aminosäuren 1 bis 238 (Leung, 1987; Fuh, 1990) mit einem ungepaarten vorletzten Cystein (Bass, Greene et al., 1990). Diese Form wird als sGHR bezeichnet und wird in E. coli als extrazellulär freigesetztes lösliches Protein exprimiert (Fuh, Mulkerrin et al., 1990). Dieses lösliche Protein wird sodann gereinigt (Fuh, Mulkerrin et al., 1990) und an Partikel oder Plastik durch sein ungepaartes Cystein (Bass, Greene et al., 1990) oder an Plastik durch einen Antikörper gebunden, der das sGHR erkennt, jedoch nicht mit der GH- Bindung oder aktiven GHR-Dimerisierung interferiert (Fuh, Mulkerrin et al., 1990; Cunningham, Ultsch et al., 1991). Alle Formen von sGHR binden GH, genauso wie das endogene Membran-assoziierte intakte GHR (Leung, 1987; Fuh, 1990). Ein Überschuss von löslichem Prolactin-Rezeptor (PRLR) als kompetitierendes Peptid (comp-T-Peptid) (vgl. Fig. 16) oder verschiedene mutante hGHR oder PRLR mit fehlender H-Bindestelle I oder II (Cunningham, 1991; DeVos, 1992 und Rozakis- Adcock, 1992) werden routinemäßig zu dem Gemisch hinzugefügt, um mit der Bin dung von nicht-spezifischen rVab-Bindern zu kompetitieren, die keine Selektivität für GHR-Bindung besitzen, und um rVab-Spezifität zu definieren. Falls sGHR an 0,2 mg Oxiran-Polyacrylamid-Partikel (Sigma) gebunden ist, können die Reaktionsgemische nur 50 ul klein sein. Der Überschuss von löslichem Prolactin-Rezeptor kompetitiert für die Bindung von nicht-spezifischen rVab-Bindern, die nicht selektiv für GHR sind. Das Gemisch wird wenigstens 3 Stunden bei 30ºC in Puffer A inkubiert, der eine normale GHg- und GHR-Assoziierung mit einer Entität unterstützt, die in Bindung an ein Phagen-Hüllprotein präsentiert wird (Bass, Greene et al., 1990). Das Gemisch besteht aus < 50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg/ml BSA und 0,02% Tween 20. Es wird drei (3) mal mit 30 C Puffer A gewaschen. Der in Gegenwart des Überschusses von kompetitierendem löslichen nicht-GHR-verwandten Peptid (d. h. das comp-T-pep) an den Matrix-assoziierten GHR gebundene rVab wird als GHRTS+ rVab.lib bezeichnet. Die Phagen werden durch Waschen (2 x), entweder mit Puffer A mit 20 nM hGH oder mit 0,2 M Glycin (pH 2,1), gewonnen (Bass, Greene et al., 1990) und titriert.
Die Phagen-Bibliotheken werden mit E. coli (bei einer Multiplizität einer Infektion von etwa eins (1)) gemischt, ohne Schütteln 30 min inkubiert und sodann auf Medien mit Antibiotikum ausplattiert und über Nacht vermehrt und titriert. Die Überlebenden werden gepoolt und über Nacht vermehrt und als Bakterienkulturen in 15% Glycerin eingefroren. Eine kleine Menge der Kultur wird vermehrt und neue Phagen-Lysate hergestellt und titriert. Diese Phagen-Population, GHR.TS+rVab, erkennt alle Oberflächen auf der T1-Untereinheit von GHR. Die Definition von S+ in dieser Population zu dieser Zeit ist nicht verbindlich und kann weggelassen werden, d. h. Prolactin-Rezeptor (oder irgendein anderes comp-T-pep) wird nicht zu dem ursprünglichen vorstehenden Reaktionsgemisch hinzugegeben, falls die Anzahl von in Schritt 1 erhaltenen GHR.TS+rVab-Mitgliedern, die durch GH kompetitiert werden (vgl. nachstehend), niedriger als 100 ist.
Eine weitere Phase einer V-Region-Aminosäure-Diversifizierung in CSRs und/oder CDRH3, wie in Beispiel 1 beschrieben und in Fig. 15 zusammengefasst, erfolgt, falls größere Anzahlen von GHR.T+ oder TS+rVab gewünscht sind.

Schritt 1b: Unterteilung von T5+rVab, basierend auf dem erkannten GHR-Oberflächen-Epitop

1b) Bibliothek-Mitglieder werden gemäß gemeinsam erkannter Rezeptor-Oberflächen gruppiert. Die Gruppen werden als GHR(x-y).T+rVab.lib bezeichnet, wobei x-y die Aminosäure-Domäne der T1-Einheit ist, die das gemeinsame Gruppen-Epitop enthält (Fig. 16).
Eine Trennung gemäß der erkannten Rezeptor-Oberfläche erfolgt durch Zugabe von kleinen Mengen von T5+rVab zu Plastikschalen, an die zuvor Peptide (gekauft) mit 10-20 Aminosäuren-überlappenden Aminosäuresequenzen von GHR adsorbiert wurden, wobei diese Domänen Aminosäuresequenzen enthalten, die bekanntlich die Bindung von GH beeinflussen (d. h. hGHR-Aminosäuren 54-68, 171-185, 9 [GHR-Stelle I] und 116-119 und 8-14 [GHR-Stelle II], wie beschrieben von Cunningham, Henner et al., 1990). T5+rVab werden mit voradsorbierten Peptiden in Puffer A (20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% Rinderserumalbumin) 3 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die Schalen werden gewaschen, um nicht-gebundene rVabs zu entfernen. Gebundene rVabs werden von der Matrix freigesetzt, titriert und erneut durch Infektion in E. coli amplifiziert. Bindung an diese überlappenden GHR-Peptide schafft eine Gruppierung gemäß der Primär-Rezeptor- Aminosäuresequenz und der Hormonbindung. Jede der getrennten Gruppen wird sodann mit löslichen Matrix-GHR (vgl. Schritt 1 a) in Puffer A mit mehr als einem 100-fachen Überschuss an GH gemischt und 3 Stunden bei 30ºC inkubiert und zentrifugiert. Die Phagen in dem Überstand werden titriert, amplifiziert und durch weiteres 2-3-faches Panning für T5+rVabs weiter angereichert, die nicht an GHR in Gegenwart von GH binden. Dieser erneute Zyklus schafft eine Population von GHR.TS+rVab, die an eine Oberfläche des GHR bindet, die normalerweise von gebundenem GH besetzt ist. Obwohl diese Schritte nicht alle mit dem GHR-Hormon verwandten Epitope identifizieren und/oder unterteilen, teilen sie die ursprüngliche GHRTS+rVab.lib in Untergruppen mit einer arbeitsfähigen Größe auf, basierend auf der Bindung an verschiedene Aminosäuresequenzen und Domänen, die an der GHR-Erkennung beteiligt sind. Jede Gruppe wird titriert, amplifiziert, in E. coli infiziert und Bakterienkulturen und sodann neue Phagen- Lysate hergestellt. Jede Gruppe wird gemäß ihrer erkannten Rezeptor-Aminosäuresequenz oder Domäne bezeichnet (z. B. Aminosäure x-y): GHR. T(x-y)S+rVab.lib. Eine Kompetition durch diese rVab für eine Bindung von I125hGH an sGHR erfolgt in Standard-Bindetests (Spencer, Hammonds et al., 1988) in Puffer A, wobei durch Fällung mit Polyethylenglykol 8000 bei 4ºC in Phosphat-gepufferter Salzlösung wie beschrieben terminiert wird (Leung, 1987). Kompetitionsbindung an Membranassoziiertes GHR erfolgt unter identischen Bedingungen und die Reaktionen werden durch Filtration und Waschen terminiert.

2. Bildung und Identifizierung bifunktioneller aktiver rVabs mit zufälligen Aminosäuresequenzen

Schritt 2a: Herstellung und Expression einer rVab-Pep-Bibliothek

2a) Eine zufällige 8 Aminosäuren-Peptid-Bibliothek (Pep8) wird im Raster an die leichte Kette (VLCL) aller Mitglieder einer rVab-Bibliothek gebunden, die eine gemeinsame GHR-Oberfläche erkennen (Fig. 11 und 20). Diese bifunktionellen Oberflächen-Binder-Bibliotheken werden als GHR(xy).T+rVab-pep.lib bezeichnet.
Jede der Gruppen-Bibliotheken wird für eine Expression mit einem kurzen zufälligen Peptid aus 8 Aminosäuren (Pep8) genetisch verändert, das durch einen kurzen Linker (LNKR) an eine Kette des rVab gebunden wird (Fig. 11). Eine Bindung kann an verschiedenen Positionen auf verschiedenen Ketten erfolgen, abhängig von dem Cre-Lox-Rekombinationssystem, das für die Kombination der rVHCHl.lib und rVLCL.lib auf dem gleichen DNA-Stück bei der Herstellung von rVab.lib verwendet wird (vgl. Fig. 11 und 13). In diesem Beispiel wird die rVab.lib gemäß Beispiel 1 (Fig. 11) hergestellt und eine Bindung von Pep8 erfolgt an den Amino-Terminus der VL-Region von rVLCL.lib (Fig. 11 und 20). In dem nachstehenden Beispiel 4 wird die Herstellung einer anderen rVab.lib beschrieben, wo eine Bindung an ein einziges Pep8 an den Carboxy-Terminus der konstanten Domäne (CL) von rVLCL oder an die amino-terminale Domäne der VH von rVHCHl erfolgen könnte (vgl. auch Fig. 13).
In diesem Beispiel erfolgt eine Bindung durch Verwendung von PCR, um die Pep8- Bibliothek an das 5'-Ende der VL-Region in den rVLCL-Mitgliedern der GHR.TS+rVab.lib anzufügen. Bei dieser Reaktion wird der Vorwärts-Primer CH&sub2;O9- 216-NotI1FWD und der Rückwärts-Primer APAPEP8LNKRBCK (d. h. Leitsequenz- ApaI-(NNN)&sub8;(GGGGS)&sub1;VL1-7) (vgl. Primer-Tabelle, Fig. 10) verwendet. Diese Reaktionen enthalten ein Aliquot von Bakterien aus jeder GHRT(x-y)S+rVab.lib, Taq- Polymerase und Vorwärts- und Rückwärts-Primer und sie werden einem Zyklus über 25 Runden unterzogen (94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min und 72ºC für 2 min).
Die amplifizierte, angefügte DNA wird mit Hilfe von Magie PCR Preps (Promega) gereinigt und nach Suspendieren in Wasser wird 1 ug der gereinigten DNA mit Notl und Apal gespalten und mit Hilfe von 1200 U T4-Ligase (Sambrook, Fritsch et al., 1990) an den mit Notl und Apal gespaltenen fdrVabpCARRIER (vgl. Fig. 11) ligiert. Das Ligationsprodukt, bezeichnet als fdrVabPEPpCARRIER wird mit GeneClean isoliert und in B. coli elektroporiert. Transformanten werden vermehrt, titriert und gefrorene Kulturen hergestellt. Eine ausreichende Anzahl an Kolonien wird gepickt und sequenziert, um das Auftreten der zufälligen Pep8-Bibliothek zu bestätigen. Die Bakterien, bezeichnet als GHRT(x-y).rVab-Pep.lib.bact werden sodann vermehrt und Phagen für eine Expression mit Helfer-Phagen induziert, so dass die GHRT(x- y)rVab-pep-Konstrukte auf der Phagen-Oberfläche in einer Bindung an gpIII präsentiert werden (vgl. Fig. 20).
Da die Aminosäuren des Octapeptids an jeder Position zufällig sind, gibt es mehr als 10¹&sup0; Peptid-Kombinationen für jede Bibliothek. Dementsprechend ist die kombinatorische rVab-pep.lib-Anzahl bei weniger als etwa 100 GHR.TS+rVab in jeder Gruppe geringer als 10¹² und wird daher in einem normalen Phagen-Lysat untergebracht. Falls die Anzahl von GHR.TS+rVab größer als etwa 100 ist, wird die zufällige Octapeptid-Bibliothek alleine als Fusionsprotein mit gpIII durch den gleichen Linker ([GGGGS]2) auf der Oberfläche von fd-Phagen exprimiert und die Octapeptide, die GHR-Oberflächen erkennen, werden zuerst durch Panning über Matrix-gebundene GHR-Komplexe isoliert. Diejenigen Phagen, die an die Matrix binden, werden isoliert, amplifiziert und die Oligonukleotid-Unterbibliothek, die für die Pep8-Octapeptide kodiert, die an GHR binden, wird herausgeschnitten und mit Primern amplifiziert, die eine Leitsequenz-Restriktionsstelle (in dem Rückwärts- Primer) und eine ApaLI-Restriktionsstelle (in dem Vorwärts-Primer) enthalten. Diese kleinere Pep8-Oligonukleotid-Unterbibliothek, die T+ ist (pepT+), wird sodann in die gruppierte GHR.TS+rVab.lib, die an der rs1-Stelle in der VL LgpIII-Leitsequenz und an der Apal geschnitten wurde (vgl. Figur HD), ligiert, um eine GHR.TS+rVab-pep(T+)-Bibliothek herzustellen. In solchen Fällen werden die Mitglieder dieser kombinatorischen Bibliothek, die weniger als 10¹&sup4; betragen, vermehrt, die Phagen induziert und die Bibliothek von Oberflächen-gebundenen GHR.TS+rVab-pep(T+) geerntet und titriert.

Schritt 2b: Identifizierung aktiver bivalenter rVab-pep-Mitglieder

2b) GHR(x-y)T+.rVab-pep-Mitglieder werden isoliert, die aktiv (A+) den Rezeptor wie GH dimerisieren. Diese werden als GHR(x-y)TA+rVab-pep bezeichnet.
Die bivalenten rVab-PEP werden als von Phagen präsentierte Bibliothek exprimiert und für kombinatorische Mitglieder, die aktiv GHR dimerisieren, gewaschen. Die Positiven werden als GHR.rVabT(x-y)SA+-pepT1+.lib bezeichnet. Bei diesem Schritt wird eine Aktivierung durch das Auftreten eines oder mehrerer der folgenden beobachtbaren Ereignisse erkannt: 1) Dimerisierung der zwei GHR-T1-Untereiheiten, 2) Dimerisierung von zwei T1-Untereinheiten, die einen Fluoreszenz-Transfer zwischen der gleichen oder verschiedenen modifizierten Aminosäuren in den zwei Untereinheiten erlauben, wie beschrieben von Cunningham (Cunningham, Ultsch et al., 1991), 3) Dimer-Bildung, die ein durch einen Antikörper erkanntes Epitop schafft, das Aminosäuren aus zwei T1-Untereinheiten enthält, die nur in aktivierten Dimeren TP-Strukturen auftreten (Taga, Narazaki et al., 1992), 3) GHR-GH- GHR-Matrix-Komplexe, die durch Wildtyp-hGH dissoziiert werden oder nur durch ein mutantes hGH mit nur einer Bindefähigkeit für die Stelle I oder II (Cunningham, Ultsch et al., 1991) oder 4) Antikörper-erkennbare Phosphorylierung einer der Rezeptor-Untereinheiten, die mit aktiver Rezeptor-Dimerisierung assoziiert ist. In dem letzteren Fall erfolgt eine Inkubation von GHR.rVabT(x-y)S+pep.lib mit ATP und PKC vor einem Panning und ATP und PKC sind während des Pannings vorhanden. Auch eine Aufzeichnung der in vitro-aktiven Dimerisierung durch die gleichzeitige Anwesenheit irgendeines dritten GHR-assoziierten Proteins in dem aktiven Komplex ist möglich (Taga, Narazaki et al., 1992).
2c) Die Aktivität wird durch Testen einer Aktivierung eines Zell-assoziierten GHR bestätigt. Diejenigen GHR. TSA+rVab-pepT, die in vitro aktiv erscheinen, werden in einem Testsystem mit intakten Zellen, wie GH-induziertes Wachstum der myeloiden Leukämie-Zelllinie FDCP1, die einen hybriden Rezeptor mit der extrazellulären Domäne von GHR und der intrazellulären Domäne des Granulozyten- Kolonie-stimulierenden Faktors (GCSFR) (Füh, Cunningham et al., 1992) oder von IM-9-Zellen (Suva, Weber et al., 1993) getestet, um das agonistische Verhalten des rVab-pep-Komplexes zu bestätigen.

3. Identifizierung aktiver GH-rVab-Paare für eine Verwendung als Reporter

Schritt 3a: Expression löslicher rVabs

3a) Unter den Mitgliedern verschiedener A+ rVabA+-pep-Gruppen werden diejenigen identifiziert, die einen rVab besitzen, der selbst mit dem Peptid-Mitglied der gleichen oder einer anderen rVabA+-pep-Gruppe kompetitiert. Dies erfolgt durch Kompetitions-Bindetests für eine Identifizierung derjenigen rVabs und Peptide, die gegenseitig um eine Bindung an den GHR kompetitieren. Der Peptid-Teü eines aktiven rVab-pep wird für eine Durchführung dieser Bindetests getrennt ohne den entsprechenden rVab exprimiert. Dadurch werden rVabs identifiziert, die den Pep8- Teil eines aktiven rVab-pep-Mitglieds nachahmen und ersetzen können. Der rVab eines ersten A+rVab-pep-Mitglieds und der rVab eines zweiten A+ rVab-pep-Mitglieds, der mit dem Peptid-Teü des ersten Mitglieds kompetitiert, werden als aktives Paar von GH-rVabs bezeichnet.
Insbesondere werden nach Bestätigung einer Aktivierung die aktiven rVab-pep durch geeignete Spaltung des Konstrukts modifiziert, um eine Expression von löslichen rVab ohne Bindung an das Phagen-Hüllprotein gpIII und an das Octapeptid erlauben. Derartig vereinfachte Entitäten werden als rVabTS+A* bezeichnet. Für die Herstellung der modifizierten Konstrukte, die eine Expression freier löslicher rVab erlauben, wird DNA von rVab-pep mit Apal und Notl gespalten und isoliert, 1 ug der isolierten DNA wird sodann mit 5 ug pEXPRESSIONrVab-DNA, die mit ApaLI und Notl gespalten wurde, durch Inkubation mit T4-Ligase ligiert. Die Ligationsprodukte werden durch GeneClean II isoliert und in E. coli elektroporiert und Transformanten durch diagnostische PCR und Sequenzierung bestätigt. Gefrorene Kulturen werden hergestellt. Diese Kulturen werden als GHR.rVabTS+A* und nicht A+ bezeichnet, da sie selbst nicht den GHR aktivieren können, jedoch Mitglieder aktiver Paare (rVabs und Pep8) sind, die den Rezeptor aktivieren. Eine Expression des Octapeptid-Mitglieds des aktiven rVab-pep erfolgt durch Herausschneiden und Ligation der Oligonukleotid-Teile, die für Pep8 kodieren, und Transfer in Expressionsvektoren, in denen Pep8 als lösliche extrazelluläre Entität in Fusion mit einem leicht reinigbaren Trägerprotein mit einem Tag exprimiert wird (unter Verwendung einer Vielzahl käuflich verfügbarer Expressionsvektoren) oder es wird gebunden durch einen GGGGS-Linker an gpIII-Hüllprotein exprimiert und als Phagen-Oberflächen-Entität präsentiert. Diese Entitäten werden als Pep8A* bezeichnet und werden wie nachstehend beschrieben für die Identifizierung von rVab für den ande ren Teil der aktiven Oberfläche des GHR eingesetzt, die von der aktiven rVab-pep- Entität verwendet wird.
3b) rVab- und Pep8-Mitglieder aktiver Paare werden gemäß gemeinsam erkannter GHR-Oberflächen gruppiert (wie vorstehend beschrieben).

4. Herstellung von GH-rVab-Reportern

Ein rVab-Repräsentant mit wenigstens einem aktiven Paar von GH-rVabs wird in einen GH.rVab-Reporter umgewandelt.
Die CH-Domäne der schweren Kette des rVab wird markiert (wie in Beispiel 2 beschrieben) und die markierte Entität, als GH.rVab-REPORTER bezeichnet, wird für die Bereitstellung von Sättigungs- und Kompetitions-Bindetests wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet.
Die isolierten und exprimierten getrennten Pep8-Mitglieder aus aktiven rVabA+- pep-Konstrukten werden in Standard-Binde-Kompetitionstests für eine Identifizierung (vgl. Fig. 11) derjenigen GHKrVabT+ eingesetzt, die an die gleiche GHR- Domäne wie die Pep8-Entitäten binden. Diejenigen, die kompetitieren, sind das zweite Mitglied des aktiven Paars von rVab für die zwei aktiven GHR-Oberflächen, die für eine Rezeptor-Aktivierung erforderlich sind. Dieses zweite Mitglied wird sodann in einen rVab-Reporter (vgl. vorstehend) umgewandelt. Das rVab-Mitglied des rVabA+-pep-Konstrukts, aus dem das Pep8 erhalten wurde, ist das zweite Mitglied des aktiven Paars.

Schritt 5: SOMER-Screening

Es werden Bindetests mit jedem Mitglied eines aktiven Paars von GH.rVab-Reportern für ein Paar von SOMEREN bereitgestellt, die jeweils zur Bindung an wenigstens eine der zwei Domänen eines aktiven Paars von Rezeptor-Oberflächen fähig sind, die an einer aktien GHR-Dimerisierung beteiligt sind. Der GH.rVab-Reporter wird unter standardisierten und automatisierten Bedingungen in dem Bindetest eingesetzt, um SOMERE in einer chemischen Datenbank (d. h. CHEMFILE) zu identifizieren, die an einer aktiven (A*) Oberfläche auf der T1-Untereinheit des GH- Rezeptors kompetitieren werden. Diese SOMERE werden als SOMER-T1 bezeichnet. In einer parallelen Weise werden unter Verwendung des anderen rVab-Repor ter-Mitglieds des aktiven rVab-Paars (wie vorstehend definiert) SOMERE für die zweite aktive Oberfläche auf GHR isoliert, die für seine Aktivierung erforderlich ist (Fig. 21 und 22). Die SOMERE, die die zweite Stelle erkennen, werden als SOMER- T1 bezeichnet.
Eine Identifizierung einer spezifischen Interaktion mit der Stelle I (d. h. T1) oder der Stelle II (d. h. T1') von huGHR erfolgt in Bindetests, die die Fähigkeit dieser Entitäten für eine Kompetitierung mit mutantem 125I-GH messen, das nur an die Stelle I oder II wie beschrieben binden kann (Cunningham, Ultsch et al., 1991).

Schritt 6: Herstellung des DISOMER und Identifizierung von Arzneistoff-Leitverbindungen

Im letzten Schritt dieses Verfahrens werden SOMER-T1 und SOMER-T1' kovalent verbunden, um ein bivalentes SOMER (d. h. ein DISOMER) herzustellen, das die zwei Stellen des aktiven Oberflächen-Paars erkennen kann, d. h. die aktiven Oberflächen der T1- und T1'-Dimer-Untereinheiten. Dieses DISOMER kann aktiv die GH-Rezeptor-Untereinheiten dimerisieren, genauso wie das native Hormon. Eine Bestätigung der DISOMER-GH-Aktivität erfolgt in Standard-Radiorezeptor-Bindetests (kompetitiv mit intaktem markierten GH) für eine GHR-Bindung und durch Standard-Aktivitätstests (in vitro und/oder GHR-zelluläre Aktivierungssysteme). Zusätzliche Testsysteme für aktive Hormonrezeptor-Untereinheit-Oligomerisierungen, bei denen ein freier extrazellulärer Rezeptor:Hormon-Komplex mit anderen Membranproteinen in intakten Zellen assoziiert, um aktive oligomere Komplexe zu bilden, die eine Auto- und Substrat-Phopshorylierung und andere stromabwärts gelegene Aktivierungsreaktionen steuern, sind bekannt (Taga, Narazaki et al., 1992).
Die Schritte 1-4 des Verfahrens, die aktive Oberflächen-Landschaften auffinden, die bei einer aktiven Dimerisierung von zwei T1-Untereinheiten von GHR beteiligt sind, sind in den Fig. 20, 21 und 22 gezeigt. Fig. 20 ist ein Flussdiagramm für die Herstellung von rVab-pep-Bibliotheken und die Isolierung von rVab-Peptiden für die zwei aktiven GHR-Oberflächen. In dem hier aufgeführten Beispiel von oligomeren Rezeptor-Zielen gibt es nur einen Untereinheiten-Typ (T1) in dem aktiven GHR- Dimer-Komplex und daher ist die Untereinheit T2 die gleiche wie T1. Die Fig. 21, 22 zeigen die Identifizierung eines GHT1- und GHT1'-SOMERS und eines GH- DISOMERS (d. h. GHT1-GHT1').

BEISPIEL 4

Beispiel 4 ist eine Variation von Beispiel 3, das der Tatsache Genüge leistet, dass viele Hormon-Rezeptoren aus verschiedenen Rezeptor-Untereinheiten bestehen. Häufig sind wenigstens zwei oder drei Untereinheiten, die alle voneinander verschieden sein können, für eine Aktivität erforderlich. In diesen Fällen erfordert eine Hormoninduzierte Rezeptor-Oligomerisierung, die mit Rezeptor-Aktivierung assoziiert ist, die Interaktion des Hormons mit wenigstens drei aktiven Oberflächen, wobei jede auf einer anderen Rezeptor-Untereinheit liegt. Beispiele heterodimerer (alpha/beta oder alpha/gamma)-Rezeptoren umfassen die Gruppe von Interleukin (IL) IL3, IL4, IL5, IL7, IL9-Rezeptoren und den GMCSF-Rezeptor und die Gruppe von Wachstumsfaktor FGF, PDGF, CSF und NGF-Rezeptoren, während ein Beispiel eines heterotrimeren Rezeptors (alpha, beta und gamma) der IL2-Rezeptor ist (vgl. Pierce, 1989; Boulay, 1993; Cosman, 1993; Kishimoto, 1994; Kaushansky, 1993; Kondo, 1994; Noguchi, 1993; Russell, 1993 und Bamborough, 1994).
Die Verwendung von rVab für die Identifizierung aktiver Oberflächen, die zwei oder mehrere Stellen umfassen, die auf vielfachen Untereinheiten verteilt sind, beteiligt bestimmte Anpassungen in dem Verfahren, das verwendet wird, falls eine Aktivierung nur eine Stelle erfordert. Zum einen wird bei den heterooligomeren Rezeptoren eine andere rVabT(x)S+-Bibliothek für jede Untereinheit (x) unter Verwendung der löslichen Rezeptor-Untereinheiten als anfängliche Ziele identifiziert (z. B. Tavernier, 1991), und zum anderen werden für trimere Rezeptoren zwei zufällige Peptid 8-Bibliotheken an jede rVabT(x)S+-Bibliothek gebunden. Des weiteren werden, falls der rVab T+ für die alpha-Rezeptor-Untereinheit ist (d. h. rVabT+S) die anderen zwei Mitglieder des aktiven Trios (d. h. diejenigen, die an jede der anderen zwei Untereinheit-Oberflächen binden, die für eine aktive Rezeptor-Trimerisierung notwendig sind), bezeichnet als rVabT+ und rVabT+, als diejenigen identifiziert, die um eine Bindung mit einem der zwei Octapeptid-Mitglieder eines aktiven rVabTSA+-pep2 kompetitieren. Für solche trimere Rezeptoren werden die einzelnen in Beispiel 1 hergestellten rVHCH.lib und rVLCL.lib in verschiedenen fdRECEIVERs und pUC19PROVIDERs, wie detailliert in Fig. 13 beschrieben, kombiniert.
Bei dieser Anwendung wird rVHCH.lib in einen fdRECEIVER gesetzt, der die Expression von rVHCH in Fusion an gpIII-Hüllprotein mit oder ohne die Bindung eines Peptids (vorzugsweise 8 Aminosäuren) an seinen Amino-Terminus erlaubt.
Die rVLCL.lib wird in einen pUCPROVIDER gesetzt, der die Expression von rVLCL als lösliche Entitäten mit oder ohne an seine CL-Domäne gebundenes Peptid (vorzugsweise 8 Aminosäuren) erlaubt. Nach einer Cre-Lox-Rekombination in vivo dieser zwei Bibliotheken, wie in Beispiel 1 detailliert beschrieben (vgl. auch Fig. 13), wird das rVab.lib-Produkt als einzelne fd-DNA kloniert, die als fdrVabPEPCARRIER bezeichnet wird. Die rVab-Mitglieder, die an jede der Rezeptor-Untereinheiten binden (d. h. Tx+rVab) werden sodann isoliert und wie in Beispiel 3 beschrieben gruppiert. Sodann erfolgt ein Anfügen von einer oder zwei zufälligen Octapeptid- Bibliotheken (Pep8n) durch PCR, die in manchen Fällen vorher gescreent und für eine Bindung an eine identifizierte Rezeptor-Untereinheit selektiert worden waren. Wie vorstehend und in Fig. 13 beschrieben, werden Oligonukleotide, die für die Peptide kodieren, an die DNA angefügt, die für die rVab-Bibliothek kodiert, wobei der Vorwärts-Primer CHLNKPEPFWD (Asc1-(NNN)8(GGGGS)3CHL208-216) und VHLNKPEPBCK (rsPELB-(NNN)8(GGGGS)VH1-8) zusammen oder in Kombination mit Primern, die keine Pep8- oder Linker-anhängenden Sequenzen besitzen, verwendet werden. Einer dieser Primer mit einem Primer ohne eine Pep8-Bibliothek könnte für die Herstellung eines rVab mit einem gebundene Pep8 (d. h. rVab-PepS1) verwendet werden, wie vorstehend in Beispiel 2 für die einzelne Pep8-Bibliothek beschrieben, die durch einen Linker an den Amino-Terminus des rVHCHl-Mitglieds oder den Carboxy-Terminus des rVLCL-Mitglieds angefügt wurde (Fig. 13).
Gemäß diesem Verfahren binden jeweils alle angefügten Peptide und der rVab-Teil des rVab-PEP2 an eine spezifische Zielstelle. Bindung an alle drei Stellen ist für eine Aktivität des Rezeptors erforderlich. Daher definiert die trimere rVab-PEP2- Einheit drei Bindedomänen: eine, die durch den rVab-Teil definiert ist (T(x)) und jeweils eine, die durch jedes der pep8 (d. h. pep8¹ und pep8²) definiert wird, die in dem Konstrukt auftreten.
Eine Isolierung aktiver rVab-Pep2-Mitglieder verwendet Anreicherungszyklen, bei denen alle drei Rezeptor-Einheiten miteinander in aktiven trimeren Strukturen komplexiert werden. Solche Strukturen, komplexiert mit ihren Phagen-exprimierten rVab-Pep2-Entitäten, werden durch die Verwendung von Matrix-gebundenen aktiven Untereinheiten, Antikörper gegen jede der drei Untereinheiten, Antikörper gegen Modifikationen von Rezeptor-Einheiten, die bei einer aktiven Oligomerisierung auftreten wie Phosphorylierung oder Assoziierung mit zusätzlichen Nicht- Rezeptor-Membrankomponenten angereichert (Argetsinger, Campbell et al., 1993; Süvennoinen, Witthuhn et al., 1993 und Witthuhn, 1993). Eine Bestätigung einer Agonisten- und Antagonisten-Aktivität erfolgt mit Hilfe von Standard-Hormon: Rezeptor-Bindetests für die Bereitstellung einer kompetitiven Bindung von Hormon an seinen Rezeptor (Kitamura, Sato et al., 1991; Imler und Zurawski, 1992; Pietzho, Zohlnhofer et al., 1993) und zelluläre Rezeptor-abhängige Aktivitätstests, die Wachstum, DNA-Synthese, Protein-Phosphorylierung, usw. messen (Yokota, Otsuki et al., 1986; Pierce, Ruggiero et al., 1988; Solari et al., 1989; Anklesaria, Teixido et al., 1990; Heidaran, Pierce et al., 1990; Pierce, Di et al., 1990; Heidaran, Pierce et al., 1991; Keegan, Pierce et al., 1991; Murakami, Narazaki et al., 1991; Kruse, Tony et al., 1992; Otani, Siegel et al., 1992; Taga, Narazaki et al., 1992; und Wang, Ogorochi et al., 1992).
Für einen bestimmten rVab-Pep8² identifizieren wir rVabA*s, die in anderen rVab- Pep8²A+ enthalten sind, die an jede der Zielstellen binden, die von den Peptiden des ursprünglichen aktiven rVab-Pep8² (trimere rVabA*-Einheit) gebunden werden, gefolgt von dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Bei Verwendung dieses Verfahrens werden Mitglieder der trimeren Einheit identifiziert als a) irgendein rVabT+ aus einem anderen aktiven Konstrukt (d. h. rVabTSA+-Pep8²), das mit einer der zwei PEP-Bibliotheken auf dem ursprünglichen aktiven rVabTSA+-PEP² kompetitiert, b) irgendein rVabT+ aus einem dritten aktiven Konstrukt (d. h. rVabTSA+- Pep8²), das mit dem anderen PEP auf dem ursprünglichen aktiven rVabTSA+-PEP² kompetitiert und c) der rVabTS+ des ursprünglichen aktiven rVabTS+-PEP². Eine Kompetition um eine Bindung an GHR wird durch Testen auf eine Kompetition von PEP8-Einheiten, die in Bindung an das gpIII-Hüllprotein und präsentiert von Phagen oder als lösliche Fusionsproteine exprimiert werden, mit markierten rVabTx+- Reportern getestet, die wie vorstehend in den Beispielen 2 und 3 beschrieben hergestellt werden. Nach einer Identifizierung aller drei aktiver Trimer-Mitglieder wird jedes rVab-Mitglied der aktiven trimeren Einheit sodann ohne sein(e) Pep8-Bibliothek-Mitglied(er) Moniert, exprimiert, isoliert und in einen rVab-REPORTER, wie in Beispiel 1 detailliert beschrieben, umgewandelt und für die Bereitstellung von kompetitiven Bindetests eingesetzt, wodurch sodann kompetitierende SOMERE aufgefunden werden (d. h. SOMER-T&sub1;, T&sub2; oder T&sub5;). Bei der letzten Stufe erfolgt eine kovalente Bindung der drei SOMER-T5 für eine Herstellung des aktiven Multimers, in diesem Fall ein TRISOMER (d. h. T&sub1;-T&sub2;-T&sub3;)-Ersatzstoff für das native Hormon. In diesen Systemen ist ein zusätzliches Rezeptor-Aktivierungs-Testsystem für heterooligomere Rezeptor-Aktivierung verfügbar, das die Induktion von identifizierbaren Holorezeptor-induzierten zellulären Reaktionen durch vorgebildete lösliche Komplexe von Hormon- und einer der Rezeptor-Untereinheiten in Reaktion auf die Bin dung dieser Komplexe an intakte Zellen, die die andere(n) Untereinheit(en) des aktiven Rezeptor-Komplexes exprimieren, und die Bildung von aktiven Holorezeptor-Komplexen überwacht (Taga, Hibi et al., 1989).
In diesen Systemen kann ein zusätzliches Rezeptor-Aktivierungs-Testsystem für die Bestätigung einer heterooligomeren Rezeptor-Aktivierung verwendet werden. Solche Systeme überwachen die Induktion identifizierbarer zellulärer Reaktionen, die durch die Kombination vorgeformter löslicher Komplexe, umfassend Hormon und eine der Rezeptor-Untereinheiten, und intakte Zellen, die die andere (n) Untereinheit(en) des aktiven Rezeptor-Komplexes exprimieren, und die darauffolgende Bildung aktiver vollständiger Holorezeptor-Komplexe induziert werden (Taga, Hibi et al., 1989).
Die nachstehende Tabelle führt beispielhafte Liganden und heterooligomere Rezeptor-Systeme auf, für die erfindungsgemäß Mittel zur Identifizierung ihrer pharmakologischen Zielstellen, sowie von SOMEREN oder DISOMEREN bereitgestellt werden.

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Obwohl vorstehend eine Reihe erfindungsgemäßer Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass die grundlegenden Konstruktionen zur Bereitstellungen anderer Ausführungsformen verändert werden können, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzung nutzen. Daher ist der Umfang der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die vorstehend als Beispiele aufgeführt wurden.

Claims

1. Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der zur Bindung an wenigstens eine Determinante einer biologisch aktiven Stelle auf einem Ziel fähig ist, wobei die Determinante bei der Verleihung von biologischer Aktivität dieses Ziels teil hat, umfassend:

a) Bereitstellen von wenigstens einem Reporter-Antikörper für eine Verwendung als Reporter der Bindung des Liganden an die biologisch aktive Stelle, wobei der Antikörper aus einer Antikörper-Bibliothek mit einer ausreichenden Diversität ausgewählt ist, um wenigstens ein Antikörper-Mitglied zu besitzen, das zur Bindung an wenigstens eine Determinante in der biologisch aktiven Stelle fähig ist, wie bestimmt durch die Fähigkeit des Antikörper-Mitglieds, entweder alleine oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Liganden Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität zu besitzen;

b) Identifikation der Liganden als mögliche Liganden für eine Aktivität am Ziel, die zur Kompetition um eine Bindung an das Ziel mit dem Reporter-Antikörper fähig sind.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Reporter-Antikörper Mitglieder einer rekombinanten Bibliothek sind, wobei jedes Antikörper-Mitglied (rVab) der rekombinanten Bibliothek wenigstens eine variable Region umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus VH- und VL-Regionen, und gegebenenfalls eine konstante Domäne umfasst, die durch ihren Aminoterminus mit der variablen Region verbunden ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die rVab-Einheit auf der Oberfläche eines Trägers liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die rVab-Einheit löslich ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Träger ein Bakterium ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Träger ein Bakteriophage ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei eine parentale VL-Region, umfassend wenigstens eine CDR, verwendet wird, um die VL-Region des rVab durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einem CDR abzuleiten.

8. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei eine parentale VH-Region, umfassend wenigstens eine CDR, verwendet wird, um die VH-Region des rVab durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einer CDR abzuleiten.

9. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei parentale VL- und VH-Regionen, umfassend wenigstens eine CDR, verwendet werden, um ein Paar von VL- und VH-Regionen eines rVab durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einem CDR einer jeden variablen Region abzuleiten.

10. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei wenigstens eine der parentalen V-Regionen, die zur Ableitung von rVab verwendet werden, nicht modifiziert ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei wenigstens zwei V-Regionen durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einer CDR nach Isolation als rVab modifiziert werden, der an eine biologisch aktive Stelle auf dem Ziel bindet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Ziel ein Polypeptid, ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Oligosaccharid, ein Kohlenhydrat oder ein Lipid ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Aktivität des Ziels mit einer messbaren biochemischen Reaktion am Ziel gekoppelt ist, wobei die biochemische Reaktion als Signal der Zielaktivierung füngiert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der rekombinante Antikörper eine einzige Polypeptidkette umfasst, die eine funktionell mit einer VL gekoppelte VH umfasst, um eine Bindestelle zu schaffen.

15. Verfahren zur Identifikation von Liganden, die zur Bindung an wenigstens zwei Determinanten fähig sind, die zusammen für die biologische Aktivität eines pharmakologischen Ziels erforderlich sind, umfassend:

a) Screening und Isolierung von rVab-Mitgliedern aus einer rVab-Bibliothek, die wenigstens eine VH- und VL-Region umfassen, und gegebenenfalls eine konstante Domäne umfassen, die durch ihren Aminoterminus mit der V-Region verbunden ist, und die zur Bindung an wenigstens eine Determinante des pharmakologischen Ziels fähig sind;

b) Herstellen und Expression einer rVab-Peptid (rVab-PEP)-Bibliothek, umfassend die isolierten rVab-Mitglieder, die mit wenigstens einem Peptid gekoppelt sind, das eine zufällige Sequenz von Aminosäuren umfasst;

c) Screening der rVab-PEP-Bibliothek für erste rVab-Pep-Mitglieder, die an das pharmakologische Ziel binden und es aktivieren, wobei die rVab-Komponente an eine erste Determinante des pharmakologischen Ziels bindet und die Peptid-Komponente an eine zweite Determinante des pharmakologischen Ziels bindet;

d) Screening der rVab-Pep-Bibliothek und Identifikation eines zweiten rVab-Pep- Mitglieds, das zur aktiven Bindung an das pharmakologische Ziel fähig ist, wobei die rVab- Komponente an eine dritte Determinante des pharmakologischen Ziels bindet und die Peptid-Komponente an eine vierte Determinante des pharmakologischen Ziels bindet.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die rVab-Komponente des zweiten rVab-Pep- Mitglieds mit der Peptid-Komponente des ersten rVab-Pep-Mitglieds um Bindung an eine Determinante auf dem pharmakologischen Ziel kompetitiert.

17. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die rVab-Komponente des ersten rVab-Pep- Mitglieds mit der Peptid-Komponente des zweiten rVab-Pep-Mitglieds um Bindung an eine Determinante auf dem pharmakologischen Ziel kompetitiert.

18. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die erste Determinante des pharmakologischen Ziels die gleiche wie die vierte Determinante ist und die zweite Determinante des pharmakologischen Ziels die gleiche wie die dritte Determinante ist.

19. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die rVab-Komponente, die für die Konstruktion des rVab-Pep verwendet wurde, wenigstens eine weitere Eigenschaft eines aktiven Liganden neben einer Affinität für das Ziel besitzt und die Eigenschaft ausgewählt ist aus Selektivität und biologischer Aktivität.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei rVabs, die an Determinanten von aktiven Stellen binden, durch ihre Fähigkeit, kompetitiv oder allosterisch die Bindung auf einem endogenen Liganden zu verändern, identifiziert werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das aktive rVab-Pep Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität besitzt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Aktivität des Ziels mit einer messbaren biochemischen Reaktion am Ziel gekoppelt ist, wobei die biochemische Reaktion als ein Signal der Ziel-Aktivierung füngiert.

23. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 22, wobei die biochemische Reaktion als Änderung eines Charakteristikums eines Proteins oder Polypeptids nachweisbar ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 22, wobei die biochemische Reaktion mit einem organometallischen Rest, einem Metall oder einem anderen Nicht-Protein verbunden ist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 22, wobei die biochemische Reaktion ein nachweisbares, freies Radikal, eine fluoreszente oder chemilumineszente Gruppe, ein radioaktives Isotop umfasst oder Oligomerisierung einbezieht.

26. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 22, wobei die biochemische Reaktion Phosphorylierung ist und das Signal eine Änderung des Phosphorylierungszustands des Ziels ist.

27. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 23, wobei das Signalprotein ein G-Protein und das Signal eine Änderung des Auftretens eines G-Protein-regulatorischen Stoffs oder der Bindung von rVab aufgrund des Auftretens eines G-Protein-regulatorischen Stoffs ist.

28. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 22, wobei das Signal eine Änderung der Bindung von rVab an seine Bindestelle ist.

29. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Peptid-Komponente der rVab-Pep- Mitglieder, umfassend VH- und CL-Regionen, an den Aminoterminus von VH oder den Carboxyterminus von CL oder an beide gebunden, exprimiert wird.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Peptid-Komponente an den Aminoterminus der VH-Region gebunden ist.

31. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Peptid-Komponente an den Carboxyterminus der CL-Region gebunden ist.

32. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei zwei Peptide für die Bildung von rVab-Pep2 an die rVab-Komponente gebunden sind.

33. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei das Peptid etwa 5 bis 50 Aminosäuren umfasst.

34. Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei das Peptid etwa 7 bis 25 Aminosäuren umfasst.

35. Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das Peptid etwa 8 Aminosäuren umfasst.

36. Reporter der Bindung eines Liganden an eine Determinante eines pharmakologischen Ziels, wobei das Ziel die Bindung eines Liganden an wenigstens zwei Determinanten des Ziels für die Produktion einer biologischen Reaktion erfordert, der Reporter einen rVab-Teil eines aktiven rVab-Pep umfasst und die rVab-Komponente des rVab-Pep an eine erste Determinante des Ziels bindet und die Peptid-Komponente an eine zweiter Determinante des Ziels bindet.

37. Reporter gemäß Anspruch 36, wobei das rVab VH- und CL-Regionen umfasst und das Peptid an den Aminoterminus des VH oder an den Carboxyterminus des CL oder an beide gebunden exprimiert wird.

38. Reporter gemäß Anspruch 37, wobei die Peptid-Komponente an den Aminoterminus der VH-Region gebunden ist.

39. Reporter gemäß Anspruch 36, wobei die Peptid-Komponente an den Carboxyterminus der CL-Region gebunden ist.

40. Reporter gemäß Anspruch 36, wobei zwei Peptide an die rVab-Komponente für die Bildung von rVab-Pep2 gebunden sind.

41. Reporter gemäß Anspruch 36, wobei das Peptid etwa 5 bis 50 Aminosäuren umfasst.

42. Reporter gemäß Anspruch 41, wobei das Peptid etwa 7 bis 25 Aminosäuren umfasst.

43. Reporter gemäß Anspruch 42, wobei das Peptid etwa 8 Aminosäuren umfasst.

44. Verfahren zur Identifikation eines Liganden, der zur Bindung an wenigstens eine Determinante einer biologisch aktiven Stelle auf einem Ziel fähig ist, wobei das Ziel für die Expression von biologischer Aktivität eine Aktivierung von wenigstens zwei Determinanten erfordert, umfassend:

a) Bereitstellen von wenigstens einem rVab-Reporter-Antikörper gemäß Anspruch 36 für die Verwendung als Reporter der Bindung des Liganden an die biologisch aktive Stelle, wobei der Antikörper aus einer Antikörper-Bibliothek mit einer ausreichenden Diversität ausgewählt ist, um wenigstens ein Antikörper-Mitglied zu besitzen, das zur Bindung an wenigstens eine Determinante in der biologisch aktiven Stelle fähig ist, wie bestimmt durch die Fähigkeit des Antikörper-Mitglieds, entweder alleine oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Liganden Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität zu besitzen.

b) Identifikation von Liganden als mögliche Liganden für eine Aktivität am Ziel, die zur Kompetition mit dem Reporter-Antikörper um eine Bindung an das Ziel fähig sind.

45. Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei viele Liganden identifiziert werden, die, falls sie zusammen kovalent verbunden sind, zu einer Bindung an die Determinanten fähig sind, was für das Auslösen einer biologischen Reaktion des Ziels nötig ist, umfassend:

a) Bereitstellen von Reporter-rVab-Antikörpern für jede der Determinanten, für die Liganden identifiziert werden sollen;

b) Identifikation für jeden der rVab-Reporter-Antikörper die Liganden als mögliche Liganden für eine Aktivität an jeder der Determinanten des Ziels, die zur Kompetition mit jedem der rVab-Reporter-Antikörper um eine Bindung an das Ziel fähig sind;

c) kovalente Verknüpfung der identifizierten Liganden für eine Bildung aktiver, multivalenter Liganden, die zur Aktivierung des pharmakologischen Ziels fähig sind.

46. Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die identifizierten Liganden Nicht-Protein, organische Moleküle sind.

47. Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die zwei rVab-Reporter-Antikörper für die Identifizierung von zwei Liganden verwendet werden, die zur Bildung des multivalenten, aktiven Liganden kombiniert werden.

48. Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei das pharmakologische Ziel ein Polypeptid- Rezeptor ist.

49. Eine rekombinante rVab-Antikörper-Bibliothek, die wenigstens 1009 bis 1014 Einheiten enthält und rVab-Mitglieder umfasst, die wenigstens eine VL- oder VH-Region besitzen, die aus einer parentalen variablen Region mit wenigstens einer CDR abgeleitet ist, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einer CDR diversifiziert ist, um verschiedene rVab-Mitglieder zu bilden.

50. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 49, wobei eine parentale VH- Region, umfassend wenigstens eine CDR, für die Ableitung der VH-Region der rVab- Mitglieder durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einer CDR verwendet wird.

51. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 49, wobei parentale VL- und VH-Regionen, umfassend wenigstens eine CDR, für die Ableitung eines Paares von VL- und VH-Regionen von rVab-Mitgliedern durch Deletion, Insertion oder Substitution von wenigstens einer Aminosäure in wenigstens einer CDR einer jeden variablen Region verwendet werden.

52. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 49 bis 51, wobei die Kristallstrukturen der parentalen V-Regionen, die für die Ableitung von rVab-Mitgliedern verwendet werden, bekannt sind.

53. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 49, wobei wenigstens eine der parentalen V-Regionen, die für die Ableitung von rVab verwendet werden, nichtmodifiziert ist.

54. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 49, wobei die CDR-Regionen eines spezifischen Antikörpers auf einer Vielzahl von Gerüsten exprimiert werden, was für eine variable geometrische Orientierung der CDR-Regionen sorgt.

55. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 49, wobei die rVab-Mitglieder weiterhin eine Peptidsequenz umfassen, die mit den rVab-Mitgliedern für die Bildung von rVab-Pep-Mitglieder kovalent verbunden ist.

56. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 55, wobei die Peptid- Komponente der rVab-Pep-Mitglieder, umfassend VH- und CL-Regionen, an den Aminoterminus von VH oder den Carboxyterminus von CL oder beide gebunden exprimiert wird.

57. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 56, wobei die Peptid- Komponente an den Aminoterminus der VH-Region gebunden ist.

58. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 56, wobei die Peptid- Komponente an den Carboxyterminus der CL-Region gebunden ist.

59. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 56, wobei zwei Peptide an die rVab-Komponente für eine Bildung von rVab-Pep2 gebunden sind.

60. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 56, wobei das Peptid etwa 5 bis 50 Aminosäuren umfasst.

61. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 60, wobei das Peptid etwa 7 bis 25 Aminosäuren umfasst.

62. Rekombinante Antikörper-Bibliothek gemäß Anspruch 61, wobei das Peptid etwa 8 Aminosäuren umfasst.