NL9101290A - Recombinant dna-molecuul voor de expressie van een fv-fragment van een antilichaam. - Google Patents

Description

RECOMBINANT DNA-MOLECUUL VOOR DE EXPRESSIE VAN EEN FV-FRAG-MENT VAN EEN ANTILICHAAM

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een recombinant DNA-molecuul voor de expressie van een functioneel Fv-fragment van een gewenst antilichaam, dat gericht is tegen interferon. De uitvinding betreft verder een recombi-nante E.coli-stam. welke het recombinant DNA-molecuul bevat, een werkwijze voor het produceren van het recombinant DNA-molecuul, en een werkwijze voor het produceren van een recombinant Fv-fragment van een gewenst anti-interferon-antilichaam. De uitvinding betreft in het bijzonder een recombinant DNA-molecuul voor de expressie van een functioneel Fv-fragment van een anti-humaan-interferon-Γ (anti-HuIFN-Γ) antilichaam.

Immunoglobulinen (antilichamen) zijn glycoproteïnen die aanwezig zijn in het bloed en de lichaamsvochten van hogere diersoorten. Zij herkennen en binden bepaalde catego-riën lichaamsvreemde stoffen (anti-genen) en induceren effector-functies die de eliminatie of neutralisatie van deze antigenen en hun dragers (virussen, bacteriën, kankercellen) bewerkstelligen. Een immunoglobuline bestaat uit twee identieke lichte en twee, eveneens identieke zware polypeptideketens, respectievelijk L- en H-ketens genoemd, welke met elkaar verbonden zijn door middel van disulfide-bruggen. De sequenties van de N-terminale uiteinden van de vier ketens zijn zeer variabel en tesamen verantwoordelijk voor de binding van het antigeen. De variabele gebieden bepalen derhalve de specificiteit van het antilichaam. Het C-terminale deel van de ketens heeft daarentegen een relatief constante structuur en bepaalt de aard van de effector-functies, zoals complement-aktivatie, antilichaam afhankelijke cellulaire cytotoxiteit en anderen.

Interferon-Γ (IFN-Γ) is een glycoproteïne dat geproduceerd wordt door T-cellen in antwoord op antigene of mitogene stimuli. Naast zijn antivirale aktiviteit kan interferon-Γ eveneens sterke immunoregulatoire effecten vertonen waardoor het een belangrijke factor is in het afweermechanisme tegen bacteriën, virussen en andere antige-nen, maar eveneens in auto-immuunziekten en kanker. De bijdrage van IFN-Γ in deze pathologische reakties kan echter ook schadelijk voor de gastheer zijn.

Diermodel-studies hebben duidelijk gemaakt dat monoclonale antilichamen die gericht zijn tegen interferon-T een positief effect hebben op endotoxische shock, lokale ontsteking, cerebrale malaria en auto-immuun arthritis. Dergelijke tegen interferon-Γ gerichte monoclonale antilichamen zouden derhalve eveneens gebruikt kunnen worden voor de behandeling van gerelateerde humane ziekten.

Door de verdergaande ontwikkelingen van hybridoma-technieken is een groot aantal monoclonale antilichamen beschikbaar gekomen welke toegepast kunnen worden voor de behandeling van ziekten. Uit tal van studies is echter gebleken dat toediening van xenogene antilichamen een anti-immunoglobuline respons opwekt in de ontvanger. Toediening van humane monoclonale antistoffen zou een dergelijke anti-immunoglobuline respons kunnen verminderen of voorkomen. De produktie van dergelijke humane monoclonale antistoffen stuit echter op zowel ethische als praktische bezwaren. Om bovengenoemde problemen te vermijden is recentelijk geprobeerd door middel van in vitro manipulatie van de immunoglo-buline-genen, zoals chimeriseren of humaniseren, de ongewenste anti-immunoglobuline respons sterk te verlagen. Hiermee zijn reeds belangrijke resultaten bereikt.

Gevonden is nu dat het Fv-fragment van een antili-chaam dat gericht is tegen humaan interferon-Γ een affiniteit heeft voor IFN-Γ en in staat is de biologische activiteit daarvan te neutraliseren. Verwacht wordt dat met het gebruik van een dergelijk Fv-fragment eveneens de anti-immunoglobuline respons verminderd kan worden. Dit wordt veroorzaakt door het feit dat de immunogene C-regio's uit het antilichaam verwijderd zijn, terwijl toch de antigeenbinden-de eigenschappen van de V-regio's behouden blijven.

De onderhavige uitvinding verschaft een recombinant DNA-molecuul waarmee een functioneel Fv-fragment van een gewenst antilichaam gericht tegen humaan interferon-Γ tot expressie gebracht kan worden. Het recombinant DNA-molecuul bevat daartoe een homologe promotor sequentie, een homologe terminator sequentie, en een dicistrone heterologe DNA-sequentie, waarvan de cistrons respectievelijk coderen voor het variabele deel van een zware keten (VH)van het gewenst antilichaam en het variabele deel van een lichte keten (VK) van het gewenst antilichaam. Een dergelijk recombinant DNA-molecuul verschaft de vereiste gelijktijdige produktie van de genen van de variabele gebieden van de lichte en zware ketens.

Bij voorkeur worden de beiden variabele genen onder de controle van de lac-promotor geplaatst. Deze promotor kan al naar gelang de behoefte geinhibeerd of geactiveerd worden. Daarmee kan voorkomen worden dat op een ongewenst moment het toxische Fv-fragment geproduceerd wordt. Het is natuurlijk eveneens mogelijk andere induceerbare promotoren te gebruiken.

Bij voorkeur worden de beiden variabele genen vooraf gegaan door een signaalpeptide-sequentie van pelB. waardoor beide v-gebieden in het periplasma worden uitgescheiden.

Het is eveneens mogelijk de beide variabele gebieden aan elkaar te koppelen door middel van een linker. Bij voorkeur heeft de linker de sequentie volgens formule Ic. In dit geval bevindt de signaalpeptide-sequentie zich slechts stroomopwaarts van het cistron voor de zware keten.

Bij voorkeur bevindt zich stroomafwaarts van het cistron voor de lichte keten een klein polypeptide, bijvoorbeeld het TAGl-polypeptide. Dit polypeptide wordt gebruikt voor het detecteren van het Fv-fragment door middel van een antilichaam dat gericht is tegen het TAGl-polypeptide

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van een aantal voorbeelden, welke niet beperkend bedoeld zijn voor de omvang van de uitvinding.

VOORBEELD 1

Isolatie en vermeerdering van de V^- en V|(-fragmenten van anti-HuIFN-Γ.

De nucleotidesequentie van zowel de 5'- als de 3'-uiteinden van V-gebieden van immunoglobulinen is sterk geconserveerd. Daardoor is het mogelijk oligonucleotiden te definiëren, die in staat zijn de VH en VK-gebieden van nagenoeg ieder muize-antilichaam te amplificeren (zie Orlandi et al. (1989). Proc. Natl. Acad. SCI. ÜSA 86: 3833-3837).

De primers voor de amplificatie van de VH-gebieden zijn: VH1BACK: 5' AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3»

PstI

waarbij: s = c of G

Η = A of C R = A of G W = A Of T

VH1F0R: 5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC 3'

BstEII

De primers voor de amplificatie van VK gebieden zijn: VK2BACK: 5' GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCA 3'

SacI

VK2F0R: 5' GTTTGATCTCGAGCTTGGTGCC 3*

Xhol

Door de introductie van restrictieknipplaatsen in het geam-plificeerde DNA-fragment wordt de klonering van de fragmenten belangrijk vereenvoudigd.

Voor de amplificatie van l/xg mRNA van D9D10 werd eerst op bekende wijze het eerste-streng cDNA gesynthetiseerd. Hiervoor werd 100 pmol random hexanucleotide als primer gebruikt (Amersham, Buckinghamshire, GB) omdat daardoor, na de PCR, een specifieker DNA-fragment verkregen werd dan wanneer het PCR-oligonucleotide voor de eerste-streng synthese gebruikt werd. Op het reactieproduct van de eerste-streng cDNA synthese gebeurde de amplificatie van het gewenste fragment met de twee specifieke primers in een 50 μΐ reactiemengsel bestaande uit lOmM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,1 mg/ml gelatine, 0,25mM dNTP, 25 pmol per oligonucleotide primer en 2,5U Taq-polymerase (Cetus, Nor-walk, Connecticut). Het reactiemengsel werd bedekt met 2 druppels paraffine-olie en onderworpen aan 30 a 35 cycli van 30 sec. 95 °C (denaturatie), 35 sec. 61°C (annealing) en 25 sec. 72°C (invulreactie) met een laatste invulreactie van 5 min. bij 72°C. Voor het doorvoeren van de PCR werd gebruik gemaakt van een programmeerbaar thermisch blok (PCH-2; Techne, Cambridge, GB). Electroforese van 5 μΐ van het reactiemengsel op een 2% agarosegel gaf de mate van zuiverheid en de opbrengst van het geamplificeerde DNA-fragment aan. De overige 45 μΐ werd onderworpen aan een chloroform-extractie (400 μΐ) waarna het DNA met NaAc/ethanol werd geprecipiteerd. Hierop werden vervolgens de gewenste reacties met de restrictie-enzymen uitgevoerd.

VOORBEELD 2

Constructie van een expressievector voor Fv-fragmenten van anti-HuIFN-Γ antilichaam.

Voor de constructie van een expressie vector voor de Fv-fragmenten van anti-HuIFN-Γ wordt uitgegaan van de vector pSWl-VHDl.3-VKD1.3-TAG1, zoals beschreven door Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546. Het VH-domein van het antilichaam Dl.3 werd uit deze vector verwijderd door digestie met PstI en BstEII en vervangen door het VH-fragment van een anti-humaan-interferon-Γ van de myelomacellijn D9D10, volgens formule Ia. Het fragment werd in voldoende hoeveelheden verkregen op de manier zoals beschreven in voorbeeld 1. Het VK-domein van het antilichaam Dl.3 werd vervolgens vervangen door, een SacI-XhoI-fragment volgens figuur Ib dat het VK-gebied van anti-HuIFN-Γ bevat. De resterende expressievector werd pSWl-Fv-anti-HuIFN-Γ genoemd.

De nucleotidesequenties van respectievelijk de VH-en VK-gebieden (resp. formule Ia en Ib) van het D9D10-anti- lichaam worden weergeven in figuur 1. De vetgedrukte delen geven de plaats van de bij de PCR gebruikte primers weer. De onderstreepte delen geven de restrictieknipplaatsen aan.

De constructiestrategie wordt schematisch weergegeven in figuur 1.

VOORBEELD 3

Transformatie van E.coli (DH5a)

Plasmide-DNA werd in E.coli-cellen gebracht volgens de CaCl2-methode van Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159-162 met dit verschil dat er slechts 1 hitte-shock werd toegediend (i.p.v. 5) nl. 20 sec. bij 37°C voor een 50 μΐ-reactie, 45 sec. bij 37°C voor een 100 μΐ reactie.

E.coli DH5a-cellen (supE44, hsdR17(r^-,mi.+), recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl, del(argF-laczya)U169, <p80dlacZdelM15) werden na transformatie uitgeplateerd in LB-medium (1% Bacto-trypton; 0,5% gistextract en 0,8% softagar) op een vaste LB-bodem (1,5% agar) waaraan 100 jLig/ml ampicilline, 0,02% X-gal en 0,25 mM IPTG was toegevoegd. Er werd overnacht geïncubeerd bij 37°C. Op deze wijze werd kloon P330 verkregen.

VOORBEELD 4

Expressie van het Fv-fragment van anti-HuIFN-r

De bacteriekloon, die de expressievector voor de productie van het Fv van het anti-HuIFN-Γ antilichaam bevatte werd gedurende 16 uur opgegroeid bij 37 °C in LB-medium in aanwezigheid van 100μΜ ampicilline en 1% glucose. Glucose onderdrukt de lac-promotor waardoor geen antistof-fragment geproduceerd kan worden. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen in 50mM NaCl en geresuspendeerd in LB-medium met 100 μΜ ampicilline en ImM IPTG voor inductie van de promotor. Deze suspensie werd gedurende 20 uur in een schudincubator bij 37°C geïncubeerd. De cellen werden vervolgens geïsoleerd door centrifugatie (7.000 rpm, 4°C) en de cultuurvloeistof getest in een ELISA (zie voorbeeld 5) of bewaard bij 4°C.

Het periplasma werd geïsoleerd zoals beschreven door Skerra et al. (1988) Science 240: 1038-1041. De cellen werden na inductie met IPTG geprecipiteerd door centrifuga-tie, geresuspendeerd in TES-buffer (0,2M Tris-HCl pH 8,0; 0,5mM EDTA; 0,5M sucrose; 10 ml/1 cultuur) en onderworpen aan een lichte osmotische schok door toevoeging van een 1/4 verdunning van TES-buffer in water (15 ml/1 cultuur). Na 30 minuten op ijs werd de suspensie gecentrifugeerd bij 8.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4°C. Het supernatant werd opnieuw gecentrifugeerd bij 20.000 rpm gedurende 30 minuten om het resterende celdebris te verwijderen. De bovenstaande vloeistof werd direkt getest, bewaard bij 4°C of ingevroren bij -20°C.

VOORBEELD 5

Detectie van het Fv-fragment van anti-HuIFN-Γ

De binding van het Fv-fragment aan het humane IFN-Γ molecuul werd getest in een ELISA. De cupjes van en 96-well "MaxiSorp Nunc-Immuno Plate" werden overnacht bij 4°C ge-incubeerd met 2 jug/ml recombinant HuIFN-Γ (Bioferon, Laup-heim, Duitsland) in 100 μΐ van een 50mM Tris-HCl pH 8,5 en lOmM NaCl buffer. De stockoplossing van recombinant HuIFN-Γ was opgelost in 50mM natriumfosfaat en lOOmM ammoniumacetaat buffer met 12,5 mg/ml sucrose, tot een concentratie van 0,7 mg/ml zuiver eiwit.

De cultuurplaat werd af gegoten en in elk cup je werd 250 μΐ blokker (PBS met 0,5% caseïne en 0,01% merthiolaat pH 7,5) toegevoegd. Na incubatie gedurende 1 uur bij 37®C werden de cellen gewassen met 0,05% Tween-20 in PBS met 0,01% merthiolaat (wasbuffer), waarna de Fv-fragmentmonsters werden opgebracht (eventuele verdunningen in blokker). Na 2 uur schudden bij 37°C werd het niet-gebonden materiaal weggewassen en 100 μΐ van een 1 μg/ml anti-TAGl antistof in blokker aan elk cupje toegediend. Vervolgens werd opnieuw gedurende 2 uur geschud en 3 maal gewassen. Daarna werd gebiotinyleerde schaap anti-muis-Ig antistof toegevoegd (Amersham, Buckinghamshire, GB, 100 μΐ van een 1/1000 verdunning) . Na 1 uur schudden bij 37°C en 3 maal wassen, werd afgewerkt met het gebiotinyleerde peroxidase-streptavidine complex, H202 en ABTS.

Omdat geen anti-idiotype antistof voorhanden was gebeurde de detectie d.m.v. het TAGl-polypeptide dat aan het VK-gebied is gekoppeld.

De hoogste expressie van Fv in de bovenstaande, vloeistof van een 18 uur geïnduceerde celcultuur bedroeg 30 bindende eenheden. Dit betekent dat een 1/30 verdunning van de vloeistof nog juist positief was (groene kleur) in de ELISA voor HuIFN-r-binding. Voor eenzelfde inductie werd bijna geen Fv aangetoond in het periplasma. Dit wordt veroorzaakt door het feit dat de Fv-concentratie in het periplasma zijn maximale waarde na een inductie van 2 uur bereikt waarna het langzaam in de cultuurvloeistof lekt en na 18 uur in hoofdzaak daarin aanwezig is. Deze "lek" uit de cellen zou te wijten kunnen zijn aan een stresssituatie in de bacteriën veroorzaakt door een hoge productie van een vreemd eiwit. In de vloeistof van niet-geïnduceerde cellen (afwezigheid van IPTG) was steeds een basale hoeveelheid Fv aanwezig terwijl de vloeistof van cellen, waarvan de promotor onderdrukt was door de aanwezigheid van glucose, geen detecteerbaar Fv-materiaal bevatte.

De periplasmabereidingsmethode zorgde reeds voor een aanzienlijke aanrijking van het geproduceerde Fv omdat het volume veel kleiner was in vergelijking met dit van de bovenstaande vloeistof. De periplasmatische fractie van een 1 liter cultuur bedroeg 12 ml (83 maal geconcentreerder) en van een 1 tot 3 ml cultuur bedroeg dit 75μ1 (13 tot 40 maal geconcentreerder). Na een inductie van 2 uur met O.lmM IPTG, de combinatie die de hoogste inductie gaf in het periplasma, werden zowel de vloeistof als de periplasmatische fractie getest in de ELISA. Het periplasma had een titer van 200 bindende eenheden; in de bovenstaande vloeistof werd geen Fv gedetecteerd.

Uit deze proeven blijkt dat E. coli. waarin het Fv-gen geïntroduceerd werd, inderdaad Fv produceren en dat het Fv in staat is HuIFN-Γ te binden. Dit betekent dat noch de aminozuurwijzigingen in de 5'- en 3'-uiteinden van de V- gebieden, noch de koppeling van TAG1 aan VK, een belangrijke negatieve invloed hebben op de binding van het Fv van D9D10 aan het HuIFN-r-molecule.

VOORBEELD 6

Inhibitie van de antivirale activiteit van HuIFN-Γ

Om na te gaan of het door E.coli geproduceerde Fv-fragment de activiteit van HuIFN-Γ kan inhiberen of neutraliseren, werden in vitro neutralisatietesten uitgevoerd. Hiervoor werden A549-cellen gebruikt, een humane carcinoma cellijn. Deze cellijn werd gekweekt in MEM met 10% "Newborn Calf Serum" (NCS) en is gevoelig voor de antivirale werking van HulFN-Γ.

Een humaan-IFN-r concentratie, welke nog net antivi-raal actief was (167ng HuIFN-Γ met een specifieke activiteit van 2,8 x 104 U^g op Wishcellen; Biogen, Gent) werd gemengd met seriële 1/2 logaritmische verdunningen van de te testen monsters. Deze werden gedurende 4 uur bij 37°C geïncubeerd waarna de mengsels 6 min. onder UV werden gedesinfecteerd. Aan alle cupjes werden dan 50.000 A549-cellen toegevoegd en het geheel werd gedurende 20 uur geïncubeerd in een C02-incubator totdat de cellen een monolaag hadden gevormd. De infectie gebeurde met een 1/300 verdunning van het Encefalo-Myocarditis Virus (EMCV). Na 48 uur, toen de viruscontrole volledig was aangetast, wérden de levende cellen gekleurd met 100μ1 van een neutraalroodoplossing (1/30 verdunning neutraalrood in PBS met Ca2+ en Mg2+) en 2 a 4 uur in het donker bewaard. Vervolgens werd gewassen met PBS (met Ca2+ en Mg2+) en ΙΟΟμΙ zure alcohol aan ieder cultuurputje toegevoegd. Na 20 minuten werden de platen af gelezen in een Multiscan Titertek bij 542nm.

Als controles werden steeds de monsters, in afwezigheid van HuIFN-Γ, en IFN-Γ, in afwezigheid van het monster meegenomen. Cel- en viruscontroles werden eveneens meegenomen.

Een 1/3 verdunning van deze fractie bleek in staat om antivirale activiteit volledig te blokkeren. Wanneer een combinatie van de 1/3 verdunning samen met een lage IFN-Γ dosis op de cellen werd gebracht, kon het EMC virus de cellen infecteren en doden, dit in tegenstelling tot een monster met de lage IFN-Γ concentratie alleen, waarbij bescherming optrad. Dit remmend effect was niet te wijten aan een mogelijke toxiciteit van een component uit het periplas-ma omdat in afwezigheid van virus de cellen niet geaffecteerd werden, noch aan een stimulatie van de virusgroei, omdat het virus de cellen niet sneller aantastte in aanwezigheid van de periplasmatische fractie dan in de afwezigheid daarvan. In een 1/6 verdunning van de periplasmatische fractie werd net geen inhibitie van de antivirale werking meer waargenomen. Het op een affiniteitskolom gezuiverde Fv-fragment vertoonde dezelfde neutraliserende effecten. Dit wijst erop dat het geen andere component uit het periplasma is dat de antivirale activiteit van HuIFN-Γ blokkeert.

Daarenboven was periplasma van niet-geïnduceerde cellen niet in staat om te neutraliseren. Dit betekent dat het Fv van de anti-HuIFN-Γ antistof van D9D10 ook in staat is om de antivirale activiteit van HuIFN-Γ te neutraliseren, ondanks lichte wijzigingen aan de 5'- en 3'-uiteinden van de V-gebieden, en de koppeling van TAG1 aan V«.

Uit de bovenstaande voorbeelden blijkt dat de introductie van de VH- en VL-PCR-fragmenten achter de lacZ-promotor ervoor zorgt dat er een dicistronisch mRNA gevormd wordt dat de VH- en VL-eiwitten afzonderlijk, maar waarschijnlijk in gelijke hoeveelheden produceert. Voor elk V-gen is een ribosoom-bindingsplaats aanwezig. Daar het pelB-signaalpeptide instaat voor het transport van het pectaat lyase enzym van het cytoplasma naar het periplasma, zullen beide V-proteïnen ook naar het periplasma worden getransporteerd. Dit betekent dat het Fv-fragment gemakkelijk geïsoleerd en in een geconcentreerde vorm verkregen kan worden. Ook wordt het dan niet blootgesteld aan de afbraak door cytoplasmatische proteasen.

Zoals bleek uit ELISA- en neutralisatietests werd het functionele HuIFN-r-bindend Fv-fragment in het periplasma gesecreteerd. Het Fv-fragment, dat het HuIFN-r-molekuul bindt en zijn antivirale activiteit neutraliseert, en enkel bestaat uit beide variabele regio's en een klein polypeptide (TAG1), zal waarschijnlijk een verminderde HAMA-respons hebben in vergelijking met de parentale antistof. De afwezigheid van de C-gebieden heeft geen verdere invloed op een goede immuunrespons omdat er geen effectorfunctie voor deze antistof noodzakelijk is.

De stabiliteit van het Fv-fragment kan verhoogd worden door chemische cross-linking van de V-gebieden, door introductie van een intermoleculaire disulfidebrug of door koppeling van de V-gebieden met een proteïne-linker. Koppeling van een toxine, cytotoxische stof of radioisotoop aan het Fv-fragment kan uitgevoerd worden wanneer men het als "magie bullet" wil gebruiken. Door deze koppeling stijgt de halfwaardetijd in het serum ook.

Claims (20)

1. Recombinant DNA-molekuul voor de expressie van een functioneel Fv-fragment van een gewenst antilichaam, dat gericht is tegen interferon, omvattende een homologe promotor sequentie, een homologe terminatorsequentie en een dicis-trone heterologe DNA-sequentie, waarvan de cistrons respectievelijk coderen voor het variabele deel van een zware keten (VH) van het gewenste anti-interferon antilichaam en het variabele deel van een lichte keten (VK) van het gewenste anti-interferon antilichaam.

2. Recombinant DNA-molekuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de cistrons van de heterologe DNA-sequentie coderen voor de variabele delen van de zware keten, respectievelijk lichte keten van een antilichaam gericht tegen humaan interferon-Γ.

3. Recombinant DNA-molekuul volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de cistrons afgeleid zijn van een sequentie welke codeert voor het monoclonale anti-humaan-interferon-Γ antilichaam dat wordt uitgescheiden door de hybridoma-cel-lijn D9D10.

4. Recombinant DNA-molekuul volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het cistron dat codeert voor het variabele deel van de lichte keten wordt weergegeven door de formule Ia en het cistron dat codeert voor de zware keten wordt weergegeven door formule Ib, of door zodanig gemuteerde versies daarvan dat de functionaliteit van het Fv-fragment daardoor niet negatief beïnvloed wordt.

5. Recombinant DNA-molekuul volgens één der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de homologe promotorsequentie de lac-promotor is.

6. Recombinant DNA-molekuul volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het recombinante DNA-molekuul stroomopwaarts van elk van de cistrons een signaalpeptidesequentie bevat en stroomafwaarts van het tweede cistron een sequentie welke codeert voor het TAG1-polypeptide.

7. Recombinant DNA-molekuul volgens één der conclusies 1 tot 5, met het kenmerk, dat de cistrons voor de zware, resp. lichte keten met elkaar verbonden zijn door middel van een linker-sequentie volgens formule Ic, dat stroomopwaarts van het ciston dat codeert voor de zware keten een signaalpeptide-sequentie is opgenomen en dat stroomafwaarts van het cistron dat codeert voor de lichte keten een sequentie welke codeert voor het TAGl-polypeptide is opgenomen.

8. Recombinant DNA-molekuul volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat de signaalpeptide-sequentie afkomstig is van pelB.

9. E. coli-stam omvattende een recombinant DNA-molekuul volgens één der voorgaande conclusies.

10. E.coli-stam volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de stam het Fv-fragment van een antilichaam gericht tegen humaan interferon-Γ tot expressie brengt.

11. E.coli-stam volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de stam het Fv-fragment van het monclonale anti-humaan-interferon-Γ antilichaam dat gesecreteerd wordt door de hybridoma-cellijn D9D10, of gemuteerde versies daarvan, tot expressie brengt.

12. Werkwijze voor het produceren van een recombinant DNA-molekuul volgens één der voorgaande conclusies omvattende de stappen : a) het lineariseren van een DNA-molekuul dat de homologe promotor- en terminatorgebieden bevat teneinde een lineair DNA-molekuul te verkrijgen; b) het isoleren en verveelvoudigen van een variabel deel van de zware keten (VH-fragment) van een gewenst antilichaam. / c) het ligeren van het lineaire DNA-molekuul en het VH-fragment teneinde een eerste recombinant DNA-molekuul te verkrijgen; d) het lineariseren van het eerste recombinante DNA-molekuul teneinde een eerste lineair DNA-molekuul te verkrijgen; e) het isoleren en vermeerderen van een variabel deel van een lichte keten (VK-fragment) van een gewenst antilichaam; en f) het ligeren van het gelineariseerde eerste DNA-molekuul en het VK-fragment voor het verkrijgen van een tweede recombinante DNA-molekuul.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de gewenste DNA-fragmenten worden vermeerderd door middel van Polymerase Chain Reactie.

14. Werkwijze volgens conclusie 12 of 13, met het kenmerk, dat het VK-fragment een DNA-sequentie heeft volgens de formule Ia.

15. Werkwijze volgens één der conclusies 12-14, met het kenmerk, dat het VH-fragment een DNA-sequentie heeft volgens formule Ib.

16. Werkwijze volgens één der conclusies 12-15, met het kenmerk, dat tussen de sequenties voor de zware, resp. lichte keten een linker-sequentie volgens formule Ic gekloneerd wordt.

17. Werkwijze voor het produceren van een recombinant Fv-fragment van een gewenst antilichaam, omvattende : a) het produceren van een recombinant DNA-molekuul volgens één der conclusies 1-8; b) het transformeren van een gastheercel cultuur met het recombinante DNA-molekuul teneinde een recombinante gastheercel te verkrijgen; c) het kweken van de gastheercel cultuur onder zodanige condities dat de DNA-sequentie welke codeert voor het recombinante Fv-fragment tot expressie gebracht wordt; en d) het isoleren van het recombinante Fv-fragment.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het recombinante Fv-fragment het Fv-fragment is van een anti-humaan-interferon-Γ antilichaam dat gesecreteerd wordt door de hybridoma cellijn D9D10, of gemuteerde versies daarvan.

19. Werkwijze volgens één der conclusies 17 of 18, met het kenmerk, dat de gastheercel E.coli (DH5a) is.

20. Recombinant Fv-fragment van een antilichaam gericht tegen humaan interferon-Γ, geproduceerd volgens de werkwijze volgens één der conclusies 17-19.