DE60124678T2

DE60124678T2 - Proteingerüste für antikörper-mimetika und andere bindungsproteine

Info

Publication number: DE60124678T2
Application number: DE60124678T
Authority: DE
Inventors: Dasa Cambridge LIPOVSEK; W. Richard Concord WAGNER; G. Robert Brighton KUIMELIS
Original assignee: Adnexus Therapeutics Inc
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: US20050255548A1; ATE346160T1; JP4829457B2; JP2003525487A; WO2001064942A1; US6818418B1; EP1266025A4; PT1266025E; EP1266025B1; EP1266025A1; CA2400058A1; ES2276770T3; DK1266025T3; AU4185001A; DE60124678D1; AU2001241850B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Proteingerüste, die z.B. für die Herstellung von Produkten nützlich sind, die neue Bindungseigenschaften aufweisen.
Proteine mit relativ definierten dreidimensionalen Strukturen, üblicherweise als Proteingerüste bezeichnet, können als Reagenzien verwendet werden, um künstlich hergestellte Produkte zu entwickeln. Diese Gerüste umfassen typischerweise eine oder mehrere Regionen, welche für spezifische oder zufällig gewählte Sequenzänderung zur Verfügung stehen, und eine solche Randomisierung (zufällige Anordnung) von Sequenzen wird oft verwendet, um Proteinbibliotheken zu erstellen, aus welchen sich die erwünschten Produkte isolieren lassen. Ein bestimmtes Anwendungsgebiet, für das solche Gerüste nützlich sind, ist das Gebiet der Antikörperentwicklung.
Eine Reihe früherer Versuche wurde unternommen, um in das Säugetierimmunsystem einzugreifen, um damit Reagenzien oder Medikamente herzustellen. Diese umfassten die Injektion interessierender Antigene in Tiere, um daraus Gemische polyklonaler Antikörper, die gegen spezifische Antigene gerichtet sind, zu erhalten, die Produktion monoklonaler Antikörper in Hybridomzellkultur (Koehler und Milstein, Nature 256:495, 1975), die Modifizierung vorhandener monoklonaler Antikörper, um neue oder optimierte Erkennungsmerkmale zu erhalten, so wie die Herstellung neuer Antikörperfragmente mit erwünschten Bindungscharakteristiken und die Randomisierung (zufällige Anordnung) von Einzelkettenantikörpern (die durch die Verknüpfung der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Antikörpermolekülen mit einem flexiblen Peptidlinker erzeugt wurden) gefolgt von der Selektion auf Antikörperbindung durch Phagen-Display (Clackson et al., Nature 325:624, 1991).
Außerdem wurden mehrere Nicht-Immunoglobulinproteingerüste für die Gewinnung von Proteinen mit neuen Bindungscharakteristika vorgeschlagen. Zum Beispiel ein „Minikörper"-Gerüst, welches zu der Immunoglobulinstruktur verwandt ist, wurde durch die Entfernung von drei Betasträngen aus der variablen Domäne der schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers entwickelt (Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Dieses Protein umfasst 61 Aminosäurereste und kann verwendet werden, um zwei hypervariable Schleifen darzustellen. Diese zwei Schleifen wurden randomisiert (zufällig angeordnet) und die Produkte wurden auf Antikörperbindung hin selektiert, aber bisher erscheint dieses Gerüst auf Grund von Löslichkeitsproblemen nur von beschränktem Nutzen zu sein. Ein anderes Gerüst, welches benutzt wurde, um Schleifen darzustellen, ist Tendamistat, ein 74 Aminosäuren umfassendes Sechsstrang-Betafaltblattsandwich, welches durch zwei Disulfidbrücken zusammengehalten wird (McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Dieses Gerüst umfasst drei Schleifen, aber bis jetzt wurden nur zwei dieser Schleifen auf ihr Potential für Randomisierung (zufällige Anordnung) untersucht.
Andere Proteine wurden als Gerüste getestet und wurden verwendet, um randomisierte (zufällig angeordnete) Aminosäuren auf alpha-helikalen Oberflächen (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995), Schleifen zwischen Alpha-helices innerhalb von Alpha-helixbündeln (Ku und Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995) sowie Schleifen, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden, wie solche in kleinen Protease-Inhibitoren (Markland et al., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland et al., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen und Collins, Gene 164:243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995), darzustellen.
Die Fähigkeit der Fibronectin-Typ III-Domäne als Gerüst für die Entwicklung neuer Bindeproteine zu dienen, wurde auch demonstriert (Koide et al., J. Mol. Biol. 284:1141, 1998).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Proteinfamilie zur Verfügung, die dazu in der Lage ist, sich zu entwickeln, so dass sie eine beliebige interessierende Verbindung binden. Diese Proteine, die ein Fibronectin oder Fibronectin-ähnliches Gerüst nutzen, wirken in einer Art und Weise, die charakteristisch für natürliche oder künstlich hergestellte Antikörper (d.h. polyklonale, monoklonale oder Einzelkettenantikörper) ist und besitzen darüber hinaus auch strukturelle Vorteile. Die Struktur dieser Antikörpermimetika wurde im Speziellen dafür entwickelt, damit sie selbst unter Bedingungen, die normalerweise zu der Strukturauflösung und Funktionsverlust in Antikörpern führen, optimale Faltungseigenschaften, Stabilität und Löslichkeit aufweisen.
Diese Antikörpermimetika können dazu benutzt werden, Proteine zu entwickeln, welche dazu in der Lage sind, nahezu jede interessierende Verbindung (z.B. ein Protein) zu binden. Im Speziellen können die hier beschriebenen, auf Fibronectin beruhenden Moleküle, als Gerüste verwendet werden, welche direktionaler Evolution unterworfen werden, die darauf ausgerichtet ist, eine oder mehrere der drei Fibronectin-Schleifen, welche analog zu den Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) einer Antikörper-variablen Region sind, zu randomisieren (zufällig anzuordnen). Der Ansatz einer solchen gerichteten Evolution resultiert in der Herstellung von antikörperähnlichen Molekülen mit hoher Affinität für interessierende Antigene. Darüber hinaus können die hier beschriebenen Gerüste dazu benutzt werden, definiert exponierte Schleifen zu präsentieren (z.B. Schleifen, die zuvor randomisiert (zufällig angeordnet) und auf Grund der Antigenbindung selektiert wurden), um die evolutionäre Entwicklung von Molekülen zu steuern, welche an solche eingeführten Schleifen binden. Eine Selektierung dieser Art kann ausgeführt werden, um Erkennungsmoleküle für eine individuelle CDR-ähnliche Schleife oder alternativ dazu, für die Erkennung von zwei oder allen drei CDR-ähnlichen Schleifen, die in einem nicht-linearen Epitop zusammengefasst sind, zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend ein Protein zur Verfügung, welches eine Fibronectin-Typ III-Domäne mit mindestens einer randomisierten (zufällig angeordneten) Schleife umfasst, wobei dieses Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass es an eine Verbindung binden kann, welche durch entsprechendes natürlich vorkommendes Fibronectin nicht gebunden wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Fibronectin-Typ III-Domäne eine Säugetier- (z.B. menschliche) Fibronectin-Typ III-Domäne und das Protein umfasst das zehnte Modul der Fibronectin-Typ III-(¹⁰Fn3)-Domäne. In solchen Proteinen wird die Bindung an eine Verbindung vorzugsweise durch entweder ein, zwei oder drei ¹⁰Fn3-Schleifen vermittelt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann die zweite Schleife von ¹⁰Fn3 relativ zu dem natürlich auftretenden Modul verlängert werden, oder der ¹⁰Fn3 kann ein Integrin-Bindungsmotiv fehlen. In diesen Molekü len kann das Integrin-Bindungsmotiv durch eine Aminosäuresequenz ersetzt werden, in welcher eine basische Aminosäure-, neutrale Aminosäure-, saure Aminosäuresequenz (in der Richtung vom C-Terminus bis zum N-Terminus) das Integrin-Bindungsmotiv ersetzt. Eine bevorzugte Sequenz ist Serin-Glycin-Glutamat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzen die Fibronectin-Typ III-Domäne enthaltenden Proteine der Erfindung keine Disulfidbrücken.
Jedes der Fibronectin-Typ III-Domäne enthaltenden Proteine, die hier beschrieben werden, können als Bestandteile eines Fusionsproteins (z.B. ein Fusionsprotein, welches des Weiteren eine Immunoglobulin F_c-Domäne umfasst, ein Komplementprotein, ein Toxinprotein oder ein Albuminprotein) formuliert werden. Zusätzlich kann jedes der Fibronectin-Typ III-Domänproteine kovalent an eine Nukleinsäure gebunden sein (z.B. eine RNS) und die Nukleinsäure kann das Protein kodieren. Zusätzlich kann das Protein ein Multimer oder besonders, wenn ihm ein Integrin-Bindungsmotiv fehlt, kann es in einem physiologisch akzeptierbaren Träger formuliert sein.
Die vorliegende Erfindung stellt Proteine zur Verfügung, welche eine Fibronectin-Typ III-Domäne umfassen und mindestens eine Mutation in einer β-Faltblattsequenz aufweisen, welche die Gerüststruktur verändert. Nochmals, diese Proteine zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, Verbindungen zu binden, die nicht von einem entsprechenden natürlich auftretenden Fibronectin gebunden werden.
Darüber hinaus kann jedes der Fibronectin-Gerüste dieser Erfindung an einen Festträger (z.B. ein Kügelchen oder Chip) immobilisiert werden und diese Gerüste können in jeder beliebigen Reihenfolge auf dem Festträger inklusive einer Anordnung verteilt sein.
In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung des Weiteren Nukleinsäuren zur Verfügung, die beliebige Proteine dieser Erfindung kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure DNS oder RNS.
In einem anderen verwandten Aspekt stellt die Erfindung auch eine Verfahren zur Herstellung eines Proteins zur Verfügung, welches eine Fibronectin-Typ III-Domäne umfasst und welches für Säugetiere pharmazeutisch annehmbar ist, was die Entfernung der Integrin-bindenden Domäne aus der eben genannten Fibronectin-Typ III-Domäne umfasst. Dieses Verfahren kann auf jedes der oben beschriebenen, Fibronectin-Typ III-Domäne-enthaltenden Proteine, angewandt werden und ist besonders für die Herstellung von Protein für humantherapeutische Anwendungen nützlich. Die Erfindung beschreibt auch Fibronectin-Typ III-Domäne-enthaltende Proteine, welche die Integrin-bindenden Domänen nicht enthalten.
In noch einem anderen verwandten Aspekt stellt die Erfindung Sortierverfahren zur Verfügung, welche dazu benutzt werden können, um randomisierte (zufällig angeordnete) Fibronectin-Typ III-Proteine zu erhalten oder entstehen zu lassen, die dazu in der Lage sind interessierende Verbindungen zu binden oder Verbindungen (z.B. Proteine) zu erhalten oder entstehen zu lassen, die dazu in der Lage sind an ein bestimmtes Protein, welches ein randomisiertes (zufällig angeordnetes) Fibronectin-Typ III-Motiv enthält, zu binden. Zusätzlich beschreibt die Erfindung Selektionsverfahren, welche die zwei Verfahren in beliebiger Reihenfolge vereinen, um entweder interessierende Verbindungen oder Proteine darzustellen.
Insbesondere umfasst das erste Sortierverfahren, die für die Isolation oder Identifizierung randomisierter (zufällig angeordneter), interessierender Proteinen nützlich ist: (a) das In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem Kandidaten-Protein, wobei das Kandidaten-Protein eine Fibronectin-Typ III-Domäne umfasst, die mindestens eine randomisierte (zufällig angeordnete) Schleife aufweist, das In-Kontakt-Bringen wird unter Bedingungen ausgeführt, die die Bildung eines Verbindung-Protein-Komplexes ermöglichen, und (b) Identifizieren eines Proteins aus dem Komplex, welches an die Verbindung bindet.
Das zweite Sortierverfahren für die Isolierung oder Identifizierung einer Verbindung, welche an ein Protein bindet, das eine randomisierte (zufällig angeordnete) Fibronectin-Typ III-Domäne aufweist, umfasst: (a) das In-Kontakt-Bringen dieses Proteins mit einer Kandidatenverbindung, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Bildung eines Verbindung-Protein-Komplexes ermöglichen, und (b) die Identifizierung einer Verbindung aus dem Komplex, welche an das Protein bindet.
In der bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren des Weiteren entweder die Randomisierung (zufällige Anordnung) von mindestens einer Schleife der Fibronectin-Typ III-Domäne des Proteins, welches in Schritt (b) erhalten wurde, und die Wiederholung von Schritten (a) und (b) unter Verwendung des Proteins, welches weiter randomisiert (zufällig angeordnet) wurde, oder die Modifizierung der Verbindung, welche in Schritt (b) erhalten wurde, und die Wiederholung von Schritten (a) und (b) unter Verwendung der weiterhin modifizierten Verbindung. Zusätzlich ist die Verbindung bevorzugterweise ein Protein und die Fibronectin-Typ III-Domäne ist bevorzugterweise eine Säugetier- (z.B. eine menschliche) Fibronectin-Typ III-Domäne. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Protein das zehnte Modul der Fibronectin-Typ III-Domäne (¹⁰Fn3), und die Bindung wird durch eine, zwei oder drei ¹⁰Fn3-Schleifen vermittelt. Zusätzlich kann die zweite Schleife von ¹⁰Fn3 in ihrer Länge relativ zu dem natürlich vorkommenden Modul erweitert werden oder ¹⁰Fn3 kann ein Integrin-bindendes Motiv nicht enthalten. Wiederum kann, wie oben beschrieben, das Integrin-bindende Motiv durch eine Aminosäuresequenz ersetzt werden, in welcher eine basische Aminosäure-, neutrale Aminosäure-saure Aminosäuresequenz (in der Richtung vom C-Terminus bis zum N-Terminus), das Integrin-bindende Motiv ersetzt; eine bevorzugte Sequenz ist Serin-Glycin-Glutamat.
Die hier beschriebenen Selektionsverfahren können unter Verwendung eines jeden Fibronectin-Typ III-Domäne-enthaltenden Proteins durchgeführt werden. Zum Beispiel können dem Fibronectin-Typ III-Domäne-enthaltende Protein auch Disulfidbrücken fehlen oder es kann als Teil eines Fusionsproteins formuliert sein (z.B. ein Fusionsprotein, welches des Weiteren eine Immunoglobulin-F_c-Domäne umfasst, ein Komplementprotein, ein Toxinprotein oder ein Albuminprotein). Zusätzlich können die Selektionen unter Verwendung des Fibronectin-Typ III-Domänenproteins ausgeführt werden, welches kovalent an Nukleinsäuren gebunden ist (z.B. RNSs oder jede Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert). Des Weiteren können die Selektionen unter Verwendung von Fibronectin-Domänenenthaltenden Proteinmultimeren ausgeführt werden.
Bevorzugterweise beinhalten die Selektionen die Immobilisierung der bindenden Zielverbindung auf einem Festträger. Bevorzugte Festträger umfassen Säulen (z.B. Affinitätssäulen wie z.B. Agarosesäulen) oder Mikrochips.
Zusätzlich beschreibt die Erfindung diagnostische Verfahren, welche die Fibronectin-Gerüstproteine dieser Erfindung verwenden. Solche Diagnoseverfahren können an einer Probe ausgeführt werden (z.B. eine biologische Probe), um einen Analyt nachzuweisen oder um gleichzeitig mehrere verschiedene Analyte in der Probe nachzuweisen. Das Verfahre kann jedes der hier beschriebenen Gerüstmoleküle verwenden. Bevorzugtenweise umfasst das Verfahre (a) das In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem Protein, welches an das Verbindungsanalyt bindet und welches eine Fibronectin-Typ III-Domäne umfasst, die mindestens eine randomisierte (zufällig angeordnete) Schleife aufweist, das In-Kontakt-Bringen wird dabei unter Bedingungen ausgeführt, die die Bildung eines Verbindung-Protein-Komplexes erlauben und (b) den Komplex und damit die Verbindung in der Probe nachzuweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Protein an einem Festträger (z.B. ein Chip oder Kügelchen) immobilisiert und kann als Teil einer Anordnung immobilisiert sein. Das Protein kann kovalent an eine Nukleinsäure, bevorzugterweise eine Nukleinsäure, wie z.B. RNS, die für ein Protein kodiert, gebunden sein. Zusätzlich ist die Verbindung oftmals ein Protein, kann aber auch irgendein anderer Analyt in einer Probe sein. Der Nachweis kann durch jede Standardtechnik, ohne Einschränkung umfassend, Radiographie, Fluoreszenznachweis, Massenspektroskopie oder Oberflächenplasmonresonanz erreicht werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet „Fibronectin-Typ III-Domäne" eine Domäne, welche sieben oder acht Betastränge aufweist, welche zwischen zwei Betafaltblättern, die sich selbst gegenseitig tragen, um den Kern des Proteins zu bilden, verteilt sind und des weiteren Schleifen beinhaltet, welche die Betastränge miteinander verbinden und welche Lösungsmittel-exponiert sind. Es gibt mindestens drei solcher Schleifen an jeder Kante des Betafaltblattsandwiches, wobei die Kante die Grenze des Proteins im rechten Winkel zu der Richtung der Betastränge ist. Bevorzugterweise umfasst eine Fibronectin-Typ III-Domäne eine Sequenz, welche mindestens 30% Aminosäurenidentität und bevorzugterweise mindestens 50% Aminosäureidentität in Bezug auf die Sequenz aufweist, welche die Struktur der ¹⁰Fn3-Domäne, die von der Proteindatenbank erhältlich ist, auch „1ttg" (ID = „1ttg" (ein ttg)) genannt, kodiert. Die Sequenzidentität, auf die in dieser Definition Bezug genommen wird, wird durch das Homologieprogramm ermittelt, welches von Molecular Simulations (San Diego, CA) erhältlich ist. Die Erfindung umfasst des Weiteren Polymere ¹⁰Fn3-verwandter Moleküle, welche eine Erweiterung der Verwendung der Monomerstruktur sind, unabhängig davon ob die Untereinheiten des Polyproteins eine identische oder unterschiedliche Sequenz aufweisen.
Mit „natürlich vorkommendes Fibronectin" ist jedes Fibronectinprotein gemeint, welches durch einen lebenden Organismus kodiert wird.
Mit „randomisiert" („zufällig angeordnet") ist das Miteinbeziehen eines oder mehrerer Aminosäurenaustauschen in Relation zu der Ursprungssequenz gemeint.
Mit „Protein" ist jede Sequenz von zwei oder mehr Aminosäuren, egal von welcher Länge, posttranslationalen Modifikationen oder Funktion, gemeint. „Protein" und „Peptid" werden hierin als Synonym benutzt.
Mit „RNS" ist eine Sequenz von zwei oder mehr kovalent verbundenen natürlich vorkommenden oder modifizierten Ribonukleotiden gemeint. Ein Beispiel für eine modifizierte RNS, die in diesem Begriff mit eingeschlossen ist, ist Phosphorthioat-RNS.
Mit „DNS" ist eine Sequenz mit zwei oder mehr kovalent verbundenen natürlich vorkommenden oder modifizierten Desoxyribonukleotiden gemeint.
Mit „Nukleinsäure" sind jede zwei oder mehr kovalent verbundenen Nukleotide oder Nukleotid-Analoga oder Derivate gemeint. Dieser Ausdruck, der hier benutzt wird, umfasst ohne Einschränkung DNS, RNS und PNS.
Mit „pharmazeutisch annehmbar" ist eine Verbindung oder ein Protein, welches ohne signifikante schädliche medizinische Konsequenzen einem Tier (z.B. ein Säugetier) verabreicht werden kann, gemeint.
Mit „physiologisch annehmbarem Träger" ist ein Träger gemeint, welcher keine signifikante nachteilige Auswirkung auf den behandelten Wirt aufweist und welcher die therapeutischen Eigenschaften der Verbindung aufrechterhält, mit welcher er verabreicht wird. Ein beispielhafter physiologisch annehmbarer Träger ist physiologische Saline. Andere physiologisch annehmbare Träger und deren Formulierungen sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, (18. Ausgabe), Hrsg. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben.
Mit „Selektieren" ist eine substantielle Auftrennung eines Moleküls von anderen Molekülen in einer Menge gemeint. Wie hierin benutzt stellt ein „Selektions"-Schritt mindestens eine zweifache, vorzugsweise eine 30-fache, noch besser eine 100-fache, und am meisten bevorzugt eine 1000-fache Anreicherung eines gewünschten Moleküls im Vergleich zu unerwünschten Molekülen in einer Menge nach dem Selektionsschritt zur Verfügung. Ein Selektionsschritt kann beliebig oft wiederholt wer den und es können verschiedene Arten von Selektionsschritten in einem gegebenen Ansatz kombiniert werden.
Mit „Bindungspartner", wie hier verwendet, ist ein Molekül, welches eine spezifische kovalente oder nicht-kovalente Affinität für einen Teil einer erwünschten interessierenden Verbindung (z.B. Protein) besitzt, gemeint. Beispiele für Bindungspartner umfassen ohne Einschränkungen Mitglieder von Antigen/Antikörper-Paaren, Protein/Inhibitor-Paaren, Rezeptor/Ligand-Paaren (z.B. Zelloberflächenrezeptor/Ligand-Paare wie z.B. Hormonrezeptor/Peptid-Hormonpaare), Enzym/Substrat-Paaren (z.B. Kinase/Substrat-Paare), Lectin/Carbohydrat-Paaren, oligomeren oder heterooligomeren Proteinaggregaten, DNS-bindenden Protein/DNS-Bindungsstellen-Paaren, RNS/Protein-Paaren und Nukleinsäureduplexe, Heteroduplexe oder ligierte Stränge, sowie irgendein Molekül, welches ein oder mehrere kovalente oder nicht-kovalente Bindungen (z.B. Disulfidbrücken) mit einem Teil eines anderen Moleküls (z.B. eine Verbindung oder ein Protein) bilden kann.
Mit einem „Festträger" ist ohne Einschränkung jede Säule (oder Säulenmaterial), Kügelchen, Testgefäß, Mikrotiterplatte oder festes Partikel (z.B. Agarose oder Sepharose), Mikrochip (z.B. Silikon, Silikon-Glas oder Goldchip) oder Membran (z.B. die Membran eines Liposoms oder Vesikels) gemeint, an welche ein Fibronectingerüst oder ein Affinitätskomplex entweder direkt oder indirekt gebunden werden kann (z.B. durch andere Bindungspartnerintermediate wie z.B. andere Antikörper oder Protein A), oder in welches ein Fibronectingerüst oder ein Affinitätskomplex eingebettet werden kann (z.B. durch einen Rezeptor oder einen Kanal).
Die vorliegende Erfindung stellt eine Anzahl von Vorteilen zur Verfügung. Zum Beispiel weisen, wie weiter unten in größerem Detail beschrieben wird, die vorliegenden Antikörpermimetika verbesserte physiologische Eigenschaften auf, wie z.B. die Stabilität unter reduzierenden Bedingungen und Löslichkeit bei hohen Konzentrationen. Zusätzlich können diese Moleküle einfach in prokaryontischen Systemen wie E. coli, in eukaryontischen Systemen wie Hefe und auch in in vitro-Translationssystemen wie dem Hasenretikulozytenlysatsystem exprimiert und gefaltet werden. Darüber hinaus sind die Moleküle extrem an Affinitätsreifungstechniken, anpassbar, die mehrere Selektionszyklen inklusive in vitro-Selektion mit RNS-Proteinfusionstechnologie (Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297; Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700), Phagendisplay (siehe z.B. Smith und Petrenko, Chem. Rev. 97:317, 1997) und Hefedisplaysysteme (siehe z.B. Boder und Wittrup, Nature Biotech. 15:553, 1997) umfassen.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der unten detaillierten Beschreibung und in den Ansprüchen offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Fotografie, die einen Vergleich zwischen den Strukturen der variablen Regionen der schweren Antikörperkette vom Kamel (dunkelblau) und Lama (hellblau) in jeden von zwei Orientierungen zeigt.
2 ist eine Fotografie, welche einen Vergleich zwischen den Strukturen der variablen Regionen der schweren Antikörperkette des Kamels (dunkelblau), den variablen Regionen der Lama-schweren Antikörperkette (hellblau) und einem Fibronectin-Typ III-Modul Nr. 10 (¹⁰Fn3) (gelb) zeigt.
3 ist eine Fotografie, welche ein Fibronectin-Typ III-Modul Nr. 10 (¹⁰Fn3) zeigt, wobei die Schleifen, die den Antikörper-bindenden Schleifen in den IgG-schweren Ketten entsprechen, in Rot hervorgehoben sind.
4 ist ein Diagramm, das einen Sequenzabgleich zwischen einer Fibronectin-Typ III-Proteindomäne und verwandten Proteindomänen illustriert.
5 ist eine Fotografie, die die Strukturähnlichkeiten zwischen einer ¹⁰Fn3-Domäne und 15 verwandten Proteinen, die Fibronectine, Tenaszine, Collagene und Undulin umfassen, zeigt. In dieser Fotografie werden die Regionen wie folgt gekennzeichnet: konstant, dunkelblau; konserviert, hellblau; neutral, weiß; variabel, rot; und RGD-Integrin-bindendes Motiv (variabel), gelb.
6 ist eine Fotografie, die in zwei verschiedenen Orientierungen raumfüllende Modelle eines Fibronectin III-Moduls 9 und 10 zeigt. Die zwei Module und die Integrin-bindende Schleife (RGD) sind gekennzeichnet. In dieser Figur deutet Blau auf positiv geladene Aminosäuren, Rot auf negativ geladene Aminosäuren und Weiß auf ungeladene Aminosäuren hin.
7 ist eine Fotografie, die raumfüllende Modelle der Fibronectin III-Module 7-10 zeigt, jedes in drei verschiedenen Orientierungen. Die vier Module sind gekennzeichnet. In dieser Figur deutet Blau auf positiv geladene Aminosäuren, Rot auf negativ geladene Aminosäuren und Weiß auf ungeladene Aminosäuren hin.
8 ist eine Fotografie, die die Ausbildung von RNS-Proteinfusionen, welche die Fibronectin-Typ III-Domänen umfassen, unter verschiedenen Salzbedingungen zeigt.
9 ist eine Serie von Fotografien, die die Selektion von Fibronectin-Typ III-Domäne-enthaltenden RNS-Proteinfusionen, welche durch PCR-Signalanalyse gemessen wurden, illustrieren.
10 ist ein Diagramm, welches den Zuwachs an TNF-α-Bindung unter den hier beschriebenen Selektionsverfahren sowie ein Vergleich zwischen RNS-Protein-Fusion und freier Proteinselektion wiedergibt.
11 ist eine Serie schematischer Figuren, die die IgG, ¹⁰Fn3, Fn-CH₁-CH₂-CH₃ und Fn-CH₂-CH₃ (im Uhrzeigersinn von oben links) zeigen.
12 ist eine Fotografie, die ein Molekularmodell von Fn-CH₁-CH₂-CH₃ beruhend auf bekannten dreidimensionalen Strukturen von IgG (Röntgenstrukturanalyse) und ¹⁰Fn3 (NMR und Röntgenstrukturanalyse) zeigt.
13 ist ein Diagramm, welches den zeitlichen Verlauf einer beispielhaften auf ¹⁰Fn3 beruhenden Nukleinsäure-Protein-Fusionsselektion von TNF-α-Bindungspartnern zeigt. Das Verhältnis von Nukleinsäure-Protein-Fusionsmenge (offene Diamanten) und freier Proteinmenge (offene Kreise), welche an TNF-α-Sepharose binden, und das Verhältnis von freier Proteinmenge (gefüllte Kreise), die an unveränderter Sepharose bindet, werden gezeigt.
14 und 15 sind Diagramme, die die Bindung von TNF-α durch TNF-α-Fn-Bindungspartnern zeigen. Insbesondere zeigen diese Figuren Massenspektradaten, die von einem ¹⁰Fn3-Fusionschip beziehungsweise einem Nichtfusionschip erhalten wurden.
16 und 17 sind das Phosphorbild beziehungsweise Fluoreszenzabtastung einer ¹⁰Fn3-Anordnung, welche TNF-α-Bindung illustrieren.
Detaillierte Beschreibung
Die neuen Antikörpermimetika, welche hierin beschrieben sind, wurden entworfen, um sowohl gegenüber Antikörper-bezogenen Fragmenten als auch Nichtantikörpergerüsten, wie solche Gerüste, wie sie z.B. oben beschrieben sind, besser zu sein.
Der Hauptvorteil dieser Antikörpermimetika gegenüber Antikörperfragmenten ist strukturell. Diese Gerüste wurden von ganzen, stabilen und löslichen Strukturmodulen, so wie sie in Proteinen in menschlichen Körperflüssigkeiten gefunden werden, abgeleitet. Aus diesem Grund weisen sie bessere Faltungs- und Thermostabilitätseigenschaften als Antikörperfragmente auf, deren Herstellung die Entfernung von Teilen der nativen Antikörperfaltstruktur umfasst, was oft dazu führt, dass Aminosäurereste exponiert liegen, die in einem intakten Antikörper normalerweise in einer hydrophoben Umgebung, wie z.B. einer Schnittstelle zwischen variablen und konstanten Domänen, begraben lägen. Die Aussetzung solcher hydrophober Reste gegen ein Lösungsmittel verstärkt die Wahrscheinlichkeit für Aggregatbildung.
Zusätzlich weisen die hier beschriebenen Antikörpermimetika keine Disulfidbrücken auf, welche beschrieben worden sind, die richtige Faltung von Antikörperfragmenten unter bestimmten Bedingungen verlangsamen oder verhindern zu können. Da die vorliegenden Gerüste für ihre native Faltungsstabilität nicht von Disulfidbrücken abhängig sind, sind sie unter reduzierenden Bedingungen im Gegensatz zu Antikörpern und deren Fragmenten, welche sich nach Disulfidbrückenauflösung entfalten, stabil.
Darüber hinaus bieten die auf Fibronectin beruhenden Gerüste die funktionellen Vorteile von Antikörpermolekülen. Insbesondere, trotz der Tatsache, dass das ¹⁰Fn3-Modul kein Immunoglobulin darstellt, ist seine generelle Faltung ähnlich der variablen Region der IgG-schweren Kette (2), was es ermöglicht, die drei Fibronectinschleifen analog zu CDRs in relativer Ausrichtung und ähnlich zu denen von nativen Antikörpern zu präsentieren. Aufgrund dieser Struktur besitzen die vorliegenden Antikörpermimetika Antigenbindungseigenschaften, welche in ihrer Natur und Affinität denen von Antikörpern ähnlich sind, und es kann in vitro eine Strategie für die Randomisierung (zufällige Anordnung) und Durchmischung von Schleifen eingesetzt werden, die zu dem Prozess, welcher in vivo bei der Affinitätsreifung von Antikörpern auftritt, ähnlich ist.
Nun werden untenstehend beispielhaft auf Fibronectin beruhende Gerüste sowie deren Einsatz für die Identifizierung, Selektion und Entwicklung neuer Bindungsproteine sowie deren Zielliganden beschrieben. Die Beispiele werden zum Zweck der Illustration und nicht zur Beschränkung der Erfindung zur Verfügung gestellt.
¹⁰Fn3-Strukturmotiv
Die Antikörpermimetika der vorliegenden Erfindung basieren auf der Struktur eines Fibronectin-Typ III (Fn3)-Moduls, einer verbreiteten Domäne, welche in Säugetierblut und in Strukturproteinen gefunden wird. Diese Domäne tritt mehr als 400 mal in der Proteinsequenzdatenbank auf und wird geschätzt, in 2% aller bis heute sequenzierten Proteine, umfassend Fibronectin, Tenaszin, intrazelluläre cytoskelettale Proteine und prokaryontische Enzyme (Bork und Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8990, 1992; Bork et al., Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659, 1990) aufzutreten. Insbesondere umfassen diese Gerüste als Vorlagen das zehnte Modul von menschlichem Fn3 (¹⁰Fn3), welches 94 Aminosäurereste enthält.
Die generelle Faltung dieser Domäne ist nahe mit dem kleinsten funktionellen Antikörperfragment, der variablen Region der schweren Kette, welche die gesamte Antigenerkennungseinheit in Kamel und Lama IgG (1, 2) enthält, verwandt. Die größten Unterschiede zwischen Kamel- und Lamadomänen und der ¹⁰Fn3-Domäne sind, dass (i) ¹⁰Fn3 weniger Beta-Stränge (sieben vs. neun) aufweist und (ii) die zwei Beta-Faltblätter, welche sich selbst gegenseitig tragen, in den Kamel- und in Lamadomänen, nicht aber in ¹⁰Fn3 durch Disulfidbrücken verbunden werden.
Die drei Schleifen der ¹⁰Fn3, welche den Antigenbindungsschleifen der IgG-schweren Kette entsprechen, verlaufen zwischen Aminosäureresten 21-31, 51-56 und 76-88 (3). Bei der Länge der ersten und der dritten Schleife fallen 11 beziehungsweise 12 Reste in den Rahmen der entsprechenden Antikörpererkennungsschleifen, welche in Antikörper-schweren Ketten gefunden werden, nämlich 10-12 beziehungsweise 3-25 Reste. Dementsprechend bilden diese zwei Schleifen, sobald sie randomisiert (zufällig angeordnet) und auf hohe Antigenaffinität hin selektiert worden sind, mit den Antigenen Kontakte aus, die äquivalent zu den Kontakten der korrespondierenden Schleifen in Antikörpern sind.
Im Gegensatz dazu ist die zweite Schleife des ¹⁰Fn3 nur 6 Reste lang, wobei die entsprechende Schleife in Antikörper-schweren Ketten zwischen 16 und 19 Resten variiert. Um Antigenbindung zu optimieren, wird demzufolge die zweite Schleife von ¹⁰Fn3 vorzugsweise auf 10 bis 13 Reste verlängert (zusätzlich zu der Randomisierung (zufälligen Anordnung)), um eine größtmöglichste Flexibilität und Affinität mit Bezug auf Antikörperbindung zu erzielen. In der Tat können im Allgemeinen die Längen sowie auch die Sequenzen der CDR-ähnlichen Schleifen der Antikörpermimetika im Verlauf der in vitro- oder in vivo-Affinitätsreifung (wie in mehr Details unten beschrieben) randomisiert (zufällig angeordnet) werden.
Die zehnte humane Fibronectin-Typ III-Domäne, ¹⁰Fn3, faltet sich selbst bei niedrigen Temperaturen schnell wieder; ihre Rückgratkonformation wurde innerhalb einer Sekunde bei 5°C wiederhergestellt. Die thermodynamische Stabilität von ¹⁰Fn3 ist hoch (ΔG_U = 24 kj/mol = 5,7 kcal/mol), was mit ihrer hohen Schmelztemperatur von 110°C einhergeht.
Einer der physiologischen Rollen des ¹⁰Fn3 ist seine Rolle als Untereinheit von Fibronectin, einem Glycoprotein, welches in einer löslichen Form in Körperflüssigkeiten und auch in unlöslicher Form in der extrazellulären Matrix vorkommt (Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236:1079, 1994). Ein Fibronectin-Monomer von 220-250 kD enthält 12 Typ I-Module, zwei Typ II-Module, und 17 Fibronectin Typ III-Module (Potts und Campbell, Curr. Opin. Cell Biol. 6:648, 1994). Verschiedene Typ III-Module sind in der Bindung des Fibronectins an Integrine, Heparin und Chondroitinsulfat beteiligt. Für ¹⁰Fn3 wurde auch gezeigt, Zelladhäsion durch ein Integrin-bindendes Arg-Gly-Asp (RGD)-Motiv auf einem seiner exponierten Schleifen zu vermitteln. Für ähnliche RGD-Motive wurde gezeigt, dass sie bei der Integrinbindung durch andere Proteine wie Fibrinogen, von Wellebrand-Faktor und Vitronectin eine Rolle spielen (Hypes et al., Cell 69:11, 1992). Für ¹⁰Fn3 wurden keine weiteren Matrix- oder Zellbindungsaufgaben beschrieben.
Die Beobachtung, dass ¹⁰Fn3 nur wenig mehr Adhäsionsaktivität aufweist, als ein RGD-enthaltendes kurzes Peptid ist mit der Schlussfolgerung stimmig, dass die Zellbindungsaktivität von ¹⁰Fn3 in dem RGD-Peptid liegt und nicht über die ¹⁰Fn3-Struktur verteilt ist (Baron et al., Biochemistry 31:2068, 1992). Die Tatsache, dass ¹⁰Fn3 ohne das RGD-Motiv sehr wahrscheinlich keine anderen Plasmaproteine oder extrazelluläre Matrixproteine bindet, macht ¹⁰Fn3 zu einem nützlichen Gerüst, um Antikörper zu ersetzen. Zusätzlich weist die Anwesenheit von ¹⁰Fn3 in natürlichem Fibrinogen im Blutstrom daraufhin, dass ¹⁰Fn3 selbst sehr wahrscheinlich nicht in dem Ursprungsorganismus immunogen ist.
Zusätzlich haben wir festgestellt, dass die ¹⁰Fn3-Rahmenstruktur eine exponierte Schleife besitzt, deren Sequenzen Randomisierung (zufällige Anordnung) tolerieren, was die Herstellung diverser Reservoire an Antikörpermimetika erleichtert. Zu dieser Einsicht gelangte man durch die Untersuchung der Flexibilität der ¹⁰Fn3-Sequenz. Insbesondere wurde die humane ¹⁰Fn3-Sequenz mit den Sequenzen von Fibronectin aus anderen Quellen sowie Sequenzen von verwandten Proteinen abgeglichen (4) und die Ergebnisse dieses Abgleichs wurden auf die dreidimensionale Struktur der humanen ¹⁰Fn3-Domäne aufgetragen (5). Dieser Abgleich offenbarte, dass die Mehrheit konservierter Reste in dem Kern des Betafaltblattsandwiches lag, wobei die hoch variablen Reste, inklusive der N- und C-Termini, entlang den Rändern der Betafaltblätter, den Lösungsmittel-zugänglichen Seiten beider Betafaltblätter und an drei Lösungsmittel-zugänglichen Schleifen, welche als hypervariable Schleifen für die Affinitätsreifung von Antikörpermimetika dienen, zu liegen kamen. Angesichts dieser Ergebnisse ist es unwahrscheinlich, dass die Randomisierung (zufällige Anordnung) dieser drei Schleifen einen schädlichen Effekt auf die generelle Faltung oder Stabilität der ¹⁰Fn3-Rahmenstruktur selbst ausübt.
Für die humane ¹⁰Fn3-Sequenz deutet diese Analyse daraufhin, dass mindestens Aminosäuren 1-9, 44-50, 61-54, 82-94 (die Ränder der Betafaltblätter); 19, 21, 30-46 (gerade), 79-65 (ungerade) (Lösungsmittel-zugängliche Seiten beider β-Faltblätter); 21-31, 51-56, 76-88 (CDR-ähnliche, Lösungsmittel-exponierte Schleifen); und 14-16 und 36-45 (andere Lösungsmittel-zugänglichen Schleifen und Betawendungen) randomisiert (zufällig angeordnet) werden können, um neue oder verbesserte verbindungsbindende Proteine zu entwickeln. Zusätzlich, wie oben beschrieben, können Veränderungen in der Länge einer oder mehrerer lösungsmittelexponierter Schleifen auch in solche gezielten Evolutionsverfahren mit eingeschlossen werden. Alternativ dazu können Veränderungen in den β-Faltblatt-Sequenzen auch dazu verwendet werden, neue Proteine entstehen zu lassen. Diese Mutationen ver ändern das Gerüst und erzielen dabei indirekt eine Veränderung der Schleifenstruktur(en). Wird dieser Ansatz gewählt, sollten die Mutationen nicht die Sequenz saturieren, sondern es sollten eher wenige Mutationen eingeführt werden. In die β-Faltblattsequenzen sollten vorzugsweise bei diesem Ansatz nicht mehr als zehn Aminosäureveränderungen und noch bevorzugter nicht mehr als drei Aminosäureveränderungen eingeführt werden.
Fibronectin-Fusionen
Die hier beschriebenen Antikörpermimetika können mit anderen Proteindomänen fusioniert werden. Z.B. können diese Mimetika in die humane Immunantwort integriert werden, indem die konstante Region eines IgG (F_c) mit einem ¹⁰Fn3-Modul fusioniert wird, vorzugsweise durch den C-Terminus von ¹⁰Fn3. Das F_c in solch einem ¹⁰Fn3-F_c-Fusionsmolekül aktiviert das Komplementsystem der Immunantwort und erhöht den therapeutischen Wert des Antikörpermimetikas. Auf ähnliche Weise kann eine Fusion zwischen ¹⁰Fn3 und einem Komplementprotein wie Clq dazu benutzt werden, auf Zellen zu zielen und eine Fusion zwischen ¹⁰Fn3 und einem Toxin könnte dazu benutzt werden, spezifisch solche Zellen zu zerstören, welche ein bestimmtes Antigen tragen. Zusätzlich kann ¹⁰Fn3 in beliebiger Form mit Albumin fusioniert werden, um seine Halbwertszeit im Blutstrom und seine Gewebedurchdringung zu erhöhen. Jede dieser Fusionen kann durch Standardtechniken erzeugt werden, z.B. durch die Expression eines Fusionsproteins von einem rekombinanten Fusionsgen, welches anhand öffentlich zugänglichen Gensequenzen konstruiert wurde.
Fibronectin-Gerüstmultimere
Zusätzlich zu Fibronectin-Monomeren kann jedes der hier beschriebenen Fibronectin-Konstrukte als Dimere oder Multimere von auf ¹⁰Fn3-beruhenden Antikörpermimetika hergestellt werden, als Mittel, die Valenz und dadurch auch die Avidität der Antigenbindung zu verbessern. Solche Multimere können durch eine kovalente Bindung zwischen individuellen ¹⁰Fn3-Modulen erzeugt werden, z.B. durch die Nachahmung der natürlichen ⁸Fn3-⁹Fn3-¹⁰Fn3 C-bis-N-Terminus-Bindung oder durch die Nachahmung von Antikörperdimeren, welche durch ihre konstanten Regionen zusammengehalten werden. Ein ¹⁰Fn3-Fc-Konstrukt kann dazu verwendet werden, Dimere des generellen Schemas ¹⁰Fn3-Fc::Fc-¹⁰Fn3 zu entwickeln. Die Bindungen, welche in Fc::Fc-Schnittstellen eingefügt werden, können kovalenter oder nicht-ko valenter Natur sein. Darüber hinaus können in ¹⁰Fn3-Hybriden andere dimerisierende oder multimerisierende Partner als Fc benutzt werden, um solche Strukturen höherer Ordnung zu kreieren.
In bestimmten Beispielen können kovalent verknüpfte Multimere, durch die Herstellung von Fusionsgenen, welche das Multimer kodieren oder alternativ dazu durch die Einführung von Codons für Cysteinreste in die Monomersequenzen, was es erlaubt, dass sich Disulfidbrücken zwischen den Expressionsprodukten bilden können, erzeugt werden. Nicht-kovalent gebundene Multimere können auch durch verschiedene Techniken erzeugt werden. Diese umfassen die Einführung von Codons, welche positiv und/oder negativ geladenen Resten entsprechen, in die Monomersequenz und ermöglichen Interaktionen zwischen diesen Resten in den Expressionsprodukten (und somit zwischen den Monomeren) aufzutreten. Diese Vorgehensweise kann dadurch vereinfacht werden, dass man auf natürliche Weise in einer Monomeruntereinheit vorkommende geladene Reste, z.B. die negativ geladenen Reste von Fibronectin, benutzt. Ein weiteres Mittel, um nicht-kovalent verknüpfte Antikörpermimetika herzustellen, ist es, eine kodierende Sequenz für Proteine oder Proteindomänen in das Monomer-Gen einzuführen (z.B. an Amino- oder Carboxy-Termini), von denen bekannt ist, dass sie interagieren. Solche Proteine oder Proteindomänen umfassen Kneul-Kneul (Coil-Coil)-Motive, Leucinreißverschluss (Leucinzipper)-Motive, und jede Anzahl von Proteinuntereinheiten (oder Fragmenten davon), von welchen bekannt ist, dass sie die Ausbildung von Dimeren oder Multimeren höherer Ordnung einleiten.
Fibronectin-ähnliche Moleküle
Obwohl ¹⁰Fn3 ein bevorzugtes Gerüst darstellt, um Antikörpermimetika herzustellen, können auch andere Moleküle für ¹⁰Fn3 in die hier beschriebenen Moleküle substituiert werden. Diese umfassen, ohne Einschränkung, humane Fibronectin-Module ¹⁰Fn3-⁹Fn3 und ¹¹Fn3-¹⁷Fn3 sowie verwandte Fn3-Module aus nichtmenschlichen Tieren und Prokaryonten. Zusätzlich können Fn3-Module aus anderen Proteinen mit Sequenzhomologie zu ¹⁰Fn3 wie Tenaszine oder Unduline benutzt werden. Für die verschiedenen Applikationen können Module aus verschiedenen Organismen und Vorgängerproteinen sehr geeignet sein; z.B. kann es bei dem Entwurf eines Antikörpermimetikas sehr wünschenswert sein, dieses Protein von einem Fibronectin oder Fibronectin-ähnlichen Molekül zu erzeugen, welches auf natürliche Weise in dem Organismus vorkommt, für den ein therapeutisches oder diagnostisches Molekül beabsichtigt ist.
Gezielte Evolution von auf Gerüst-beruhenden Bindungsproteinen
Die hier beschriebenen Antikörpermimetika können in einer Technik eingesetzt werden, um neue oder verbesserte Bindungsproteine zu entwickeln. In einem bestimmten Beispiel wird das Bindungsziel auf einem Festträger immobilisiert, wie z.B. ein Säulenharz oder die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, und das Ziel wird mit einer Bibliothek von auf einem Gerüst beruhenden Bindungskandidatenproteinen in Verbindung gebracht. Solch eine Bibliothek kann aus den ¹⁰Fn3-HIonen bestehen, welche aus dem Wildtyp ¹⁰Fn3-Gerüst konstruiert wurden, in dem die Sequenz und/oder die Länge der ¹⁰Fn3 CDR-ähnlichen Schleifen randomisiert (zufällig angeordnet) wurde. Wenn erwünscht, kann diese Bibliothek eine RNS-Protein-Fusionsbibliothek sein, welche mit den Techniken erzeugt wurde, welche beispielsweise in Szostak et al. beschrieben wurden (WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700; und Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Band 94, S. 12297-12302). Alternativ dazu kann sie auch (z.B. wie beschrieben in Lohse, DNA-Protein Fusions and Uses Thereof, U.S.S.N. 60/110,549, U.S.S.N. 09/459,190, und US 99/28472) eine DNA-Protein-Bibliothek sein. Die Fusionsbibliothek wird mit dem immobilisierten Ziel inkubiert, danach wird, um nicht-spezifische Bindungspartner zu entfernen, der Träger gewaschen und die stärksten Bindungspartner werden unter stringenten Bedingungen eluiert und einer PCR-Reaktion unterworfen, um Sequenzinformation zu gewinnen oder um eine neue Bibliothek von Bindungspartnern zu erzeugen, welche dazu benutzt werden kann, den Selektionsprozess wiederholt mit oder ohne weiterer Mutagenese der Sequenz zu durchlaufen. Eine Anzahl an Selektionsrunden kann erforderlich sein, bis Bindungspartner von ausreichender Affinität zu dem Antigen gewonnen werden können.
In einem bestimmten Beispiel kann das ¹⁰Fn3-Gerüst als Selektionsziel benutzt werden. Zum Beispiel, wenn ein Protein gebraucht wird, das eine bestimmte Peptidsequenz innerhalb einer 10-Reste-Schleife bindet, wird ein einzelner ¹⁰Fn3-Klon hergestellt, in welchem eine seiner Schleifen auf die Länge von zehn und zu der erwünschten Sequenz gesetzt wurde. Der neue Klon wird in vivo exprimiert und aufgereinigt, und anschließend an einen Festträger immobilisiert. Es wird dann einer RNS-Protein-Fusionsbibliothek, welche auf einem geeigneten Gerüst basiert, er laubt, mit dem Träger zu interagieren, welcher anschließend gewaschen wird und die erwünschten Moleküle werden, wie oben beschrieben, eluiert und reselektiert.
In einer ähnlichen Weise kann das ¹⁰Fn3-Gerüst dazu verwendet werden, um natürliche Proteine zu finden, die mit der Peptidsequenz, welche in einer ¹⁰Fn3-Schleife gezeigt ist, interagieren. Wie oben beschrieben ist das ¹⁰Fn3-Protein immobilisiert und eine RNS-Protein-Fusionsbibliothek wird nach Bindungspartnern für die gezeigte Schleife durchsucht. Die Bindungspartner werden in mehreren Selektionsrunden angereichert und durch DNS-Sequenzierung identifiziert.
Zusätzlich kann in den oben genannten Ansätzen, obwohl RNS-Protein-Bibliotheken beispielhafte Bibliotheken für gerichtete Evolution sind, jede Art einer auf einem Gerüst beruhenden Bibliothek in den Selektionsverfahren dieser Erfindung eingesetzt werden.
Verwendung
Die hier beschriebenen Antikörpermimetika können entwickelt werden, um jedes interessierende Antigen zu binden. Diese Proteine weisen thermodynamische Eigenschaften auf, welche besser als die der natürlichen Antikörper sind und können sehr schnell in vitro entwickelt werden. Dementsprechend können anstelle von Antikörpern diese Antikörpermimetika in allen Bereichen, wo Antikörper benutzt werden, einschließlich in Forschung, Therapie und diagnostischen Bereichen, eingesetzt werden. Zusätzlich können die hier beschriebenen Antikörpermimetika, da diese Gerüste bessere Löslichkeiten oder Löslichkeitseigenschaften besitzen als Antikörper, unter Bedingungen verwendet werden, welche Antikörpermoleküle zerstören oder inaktivieren würden. Schlussendlich stellen diese Moleküle, da die Gerüste der vorliegenden Erfindung dazu entwickelt werden können, nahezu jede Verbindung zu binden, komplett neue Bindungsproteine dar, welche auch in der Forschung, und in diagnostischen und therapeutischen Gebieten Nutzen finden.
Experimentelle Ergebnisse
Oben beschriebene, beispielhafte Gerüstmoleküle wurden z.B. in folgenden Selektionsprotokollen erzeugt und getestet.
Bibliotheksherstellung
Eine komplexe Bibliothek wurde aus drei Fragmenten erzeugt, von welchen jedes einen randomisierten (zufällig angeordneten) Bereich entsprechend einer CDR-ähnlichen Schleife enthielt. Beruhend auf den Namen der CDR-H-ähnlichen Schleifen, die sie enthalten, wurden die Fragmente BC, DE und FG genannt; zusätzlich zu ¹⁰Fn3 und einer randomisierten (zufällig angeordneten) Sequenz umfasste jedes dieser Fragmente Bereiche, welche eine N-terminale His₆-Domäne oder einen C-terminalen FLAG-Peptidanhang kodieren. Bei jeder Verbindung zwischen zwei Fragmenten (d.h. zwischen den BC- und DE-Fragmenten oder zwischen den DE- und FG-Fragmenten) enthielt jedes DNS-Fragment Erkennungssequenzen für die EarI-Typ IIS-Restriktionsendonuklease. Dieses Restriktionsenzym erlaubte das Zusammenfügen benachbarter Fragmente sowie die Entfernung aller fremden Nicht-¹⁰Fn3-Sequenzen. Es erlaubt auch ein rekombinationsähnliches Durchmischen der drei ¹⁰Fn3-Fragmente zwischen den Zyklen der Mutagenese und der Selektion.
Jedes Fragment wurde aus zwei überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt, welche zuerst angelagert und dann verlängert wurden, um die doppelsträngige DNS-Struktur des Fragmentes zu bilden. Die Oligonukleotide, welche für die Herstellung und Bearbeitung der drei Fragmente benutzt wurden, sind unten aufgeführt; die „oben" und „unten" Spezimen für jedes Fragment sind die Oligonukleotide, welche die gesamte ¹⁰Fn3-kodierende Sequenz enthielten. Innerhalb dieser Oligonukleotidbezeichnung bedeutet „N" gleich A, T, C oder G und „S" bedeutet C oder G.
HfnLBCTop(His): („oben")

5'-GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC-3' (SEQ ID NO: 1)

HfnLBCTop (ein alternativer N-Terminus): („oben")

5'-GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC-3' (SEQ ID NO: 2)

HFnLBCBot-flag8: („unten")

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT (SNN)7 CCA GCT GAT CAG TAG GCT GGT GGG GGT CGC AGC-3' (SEQ ID NO: 3)

HFnBC3'-flag8:

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CCC TGT TTC TCC GTA AGT GAT CC-3' (SEQ ID NO: 4)

HFnLDETop: („oben")

5'-GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTC TTC ACA GGA GGA AAT AGC CCT GTC C-3' (SEQ ID NO: 5)

HFnLDEBot-flag8: („unten")

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT (SNN)4 AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCC TGT-3' (SEQ ID NO: 6)

HFnDE3'-flag8:

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC GCT CTT CGT ATA ATC AAC TCC AGG TTT AAG G-3' (SEQ ID NO: 7)

HFnLFGTop: („oben")

5'-GG AAT TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTC TTC TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC-3' (SEQ ID NO: 8)

HFnLFGBot-flag8: („unten")

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT TCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG (SNN)10 AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA-3' (SEQ ID NO: 9)

HFnFG3'-flag8:

5'-ACC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT TCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG-3' (SEQ ID NO:10)

T7TMV (führt T7-Promoter und TMV-untranslatierte Region ein, die für in vitro-Translation benötigt wird):

5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA-3' (SEQ ID NO: 11)

ASAflag8:

5'-AGC GGA TGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC-3' (SEQ ID NO: 12)

Unispl-s (Schienenoligonukleotid, das benutzt wird, um die Messenger-RNS an den Puromycin-enthaltenden Linker zu ligieren, beschrieben in Roberts et al., 1997, supra):

5'-TTTTTTTTTNAGCGGATGC-3' (SEQ ID NO: 13)

A18-2PEG (DNS-Puromycin-Linker):

5'-(A)18(PEG)2CCPur (SEQ ID NO: 14)

Oligonukleotidpaare (500 pmol von jedem) wurden für 10 Minuten bei 85°C in 100 μl von 10 mM Tris 7,5, 50 mM NaCl aneinandergelagert, gefolgt von einem langsamen (0,5-1 Stunde) Abkühlen auf Raumtemperatur. Die aneinandergelagerten Fragmente mit Einzelstrangüberhängen wurden dann verlängert, indem 100 U Klenow (New England Biolabs, Beverly, MA) für jedes 100 μl Aliquot von aneinandergelagerten Oligos eingesetzt wurde, und der Puffer bestand aus 838,5 μl H₂O, 9 μl 1 M Tris 7,5, 5 μl 1 M MgCl₂, 20 μl 10 mM dNTPs und 7,5 μl 1 M DTT. Die Verlängerungsreaktionen wurden für eine Stunde bei 25°C ausgeführt.
Als nächstes wurde mit Hilfe der von Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700 und Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Band 94, S. 12297-12302, entwickelten Technik jedes der Doppelstrang-DNS-Fragmente in eine RNS-Proteinfusion transformiert. In Kürze: die Fragmente wurden mit Hilfe eines Ambion in vitro-Transkriptionskits, MEGAshortscript (Ambion, Austin, TX) transkribiert und die resultierende mRNS-DNS-Puromycin-Proteinfusion wurde unter Verwendung von Oligo(dT)-Cellulose aufgereinigt, und ein komplementärer DNS-Strang wurde mit Hilfe reverser Transkriptase und den RT-Primern, wie oben beschrieben (Unisplint-S oder flagASA), gemäß den Herstellerinstruktionen synthetisiert.
Die RNS-Proteinfusion, welche für jedes Fragment enthalten wurde, wurde anschließend über ein Harz entsprechend seines Peptidaufreinigungsanhanges, d.h. mit Ni-NTA-Agarose für den His₆-tag und M2-Agarose für den FLAG-tag, gemäß der vom Hersteller empfohlen Prozedur, aufgereinigt. Die cDNS-Komponente der tagbindenden RNS-Proteinfusionen wurde unter Verwendung von PCR mit Pharmacia Ready-to-Go-PCR-Beads, 10 pmol von 5'- und 3'-PCR-Primern und dem folgenden PCR-Programm (Pharmacia, Piscataway, NJ) amplifiziert: Schritt 1: 95°C für 3 Minuten; Schritt 2: 95°C für 30 Sekunden, 58/62°C für 30 Sekunden, 72°C für eine Minute, 20/25/30 Zyklen, wie benötigt; Schritt 3: 72°C für 5 Minuten; Schritt 4: 4°C bis zum Ende.
Die resultierende amplifizierte DNS wurde durch 5 U EarI (New England Biolabs) pro 1 μg DNS geschnitten; die Reaktion fand bei 37°C in T4-DNS-Ligase-Puffer (New England Biolabs) für eine Stunde statt und anschließend wurde EarI durch eine Inkubation bei 70°C für 15 Minuten inaktiviert. Gleiche Mengen der BC-, DE- und FG-DNS-Fragmente wurden kombiniert und ligiert, um ein Volllängen-¹⁰Fn3-Gen mit randomisierten (zufällig angeordneten) Schleifen zu bilden. Die Ligation erfordert 10 U von frischem EarI (New England Biolabs) und 20 U von T4-DNS-Ligase (Promega, Madison, WI) und brauchte 1 Stunde bei 37°C.
Drei verschiedene Bibliotheken wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Jede enthielt die Form der FG-Schleife mit 10 randomisierten (zufällig angeordneten) Resten. Die BC- und die DE-Schleifen der ersten Bibliothek betrugen die Wildtyp-¹⁰Fn3-Sequenz; eine BC-Schleife mit 7 randomisierten (zufällig angeordneten) Resten und einer Wildtyp-DE-Schleife umfasste die zweite Bibliothek; und eine BC-Schleife mit 7 randomisierten (zufällig angeordneten) Resten und einer DE-Schleife mit 4 randomisierten (zufällig angeordneten) Resten umfasste die dritte Bibliothek. Die Komplexität der FG-Schleife in jeder dieser drei Bibliotheken war 1013; die des Weiteren zwei randomisierten (zufällig angeordneten) Schleifen boten das Potential für eine Komplexität, zu groß, um in einem Labor getestet zu werden.
Um den Selektionsprozess zu vereinfachen, wurden die drei hergestellten Bibliotheken in einer Masterbibliothek vereint; es war erwartet, dass die Zielbindung selbst die am besten geeignetste Bibliothek für eine bestimmte Herausforderung auswählen würde. RNS-Proteinfusionen wurden aus der Masterbibliothek erhalten, indem die allgemeine Prozedur, die in Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al. WO 98/31700 und Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Band 94, S. 12297-12302 (8) beschrieben wurde, befolgt wurde.
Fusionsselektionen
Die Masterbibliothek in der RNS-Proteinfusionsform wurde einer Selektion für TNF-α-Bindung unterworfen. Zwei Protokolle wurden dafür eingesetzt: eines, in welchem das Ziel an einer Agarosesäule immobilisiert war und eines, in welchem das Ziel an einem BIACORE-Chip immobilisiert war. Zuerst, um Hintergrundbindung an die Agarosesäule zu minimieren, ergab eine ausführliche Optimierung der Bedingungen die günstigen Pufferbedingungen von 50 mM HEPES pH 7,4, 0,02% Triton, 100 μg/ml zerkleinerte Lachssperma-DNS. In diesem Puffer betrug die nicht-spezifische Bindung der ¹⁰Fn3-RNS-Fusion an TNF-α-Sepharose 0,3%. Der nicht-spezifische Bindungshintergrund der ¹⁰Fn3-RNS-DNS an TNF-α-Sepharose betrug 0,1%. In jeder Selektionsrunde an der TNF-α-Sepharose wurde die Profusion^TM-Bibliothek zunächst für eine Stunde mit unveränderter Sepharose präinkubiert, um alle verbleibenden nicht-spezifischen Bindungspartner zu entfernen; der Durchfluss dieser Vorwaschung wurde eine weitere Stunde mit TNF-α-Sepharose inkubiert.
Um alle verbleibenden nicht-spezifischen Bindungspartner zu entfernen wurde zunächst in jeder Selektionsrunde an der TNF-α-Sepharose die RNS-Protein-Fusionsbibliothek für eine Stunde mit unveränderter Sepharose präinkubiert; der Durchfluss dieser Vorwaschung wurde eine weitere Stunde mit TNF-α-Sepharose inkubiert.
Die TNF-α-Sepharose wurde für 3-30 Minuten gewaschen.
Nach jeder Selektion wurde die cDNS aus der RNS-Proteinfusion, welche von dem Festträger mit 0,3 M NaOH oder 0,1 M KOH eluiert wurde, mit Hilfe von PCR amplifiziert; eine DNS-Bande der erwarteten Größe persistierte über mehrere Runden der Selektion (9); ähnliche Ergebnisse wurden in zwei alternativen Selektionsprotokollen beobachtet und nur die Daten der Agarosesäuleselektion sind in 9 gezeigt. In den ersten sieben Runden verblieb die Bindung von Bibliotheks-RNS-Proteinfusionen an das Ziel gering; im Gegensatz dazu vermehrte sich signifikant zwischen einzelnen Runden der Anteil, der an die Säule band, wenn freies Protein von DNS-Pools zu verschiedenen Stadien der Selektion translatiert wurde (10). Ähnliche Selektionen können mit jeden anderen Bindungspartnern als Ziel durchgeführt werden (z.B. IL-1 und IL-13).
Tierstudien
Wildtyp-¹⁰Fn3 umfasst ein Integrin-bindendes Tripeptidmotiv, Arginin 78 – Glycin 79 – Aspartat 80 (das „RGD-Motiv") an der Spitze der FG-Schleife. Um zu verhin dern, dass dieses Tripeptid Integrin bindet und in vivo eine potentielle Entzündungsreaktion hervorruft, wurde eine Mutante der ¹⁰Fn3 erzeugt, die eine inerte Sequenz, Serin 78 – Glycin 79 – Glutamat 80 (die „SGE-Mutante") enthielt, eine Sequenz, welche in der nahe verwandten Wildtyp-¹¹Fn3-Domäne gefunden wird. Diese SGE-Mutante wurde in E. coli als ein N-terminales His₆-gekoppeltes, freies Protein hergestellt und zur Homogenität an einer Metallchelatsäule, gefolgt von einer Größenausschlusssäule, aufgereinigt.
Im Besonderen wurde die DNS-Sequenz, welche His₆-¹⁰Fn3 (SGE) kodiert, in den pET9a-Expressionsvektor kloniert und in BL21-DE3-pLysS-Zellen transformiert. Die Kultur wurde dann in LB-Medium, welches 50 μg/ml Kanamycin enthält, bei 37°C unter Schütteln bis A₅₆₀=1,0 wachsen gelassen und wurde dann mit 0,4 mM IPTG induziert. Die induzierte Kultur wurde des Weiteren unter denselben Bedingungen über Nacht (14-18 Stunden) inkubiert; die Bakterien wurden durch eine gewöhnliche Niedriggeschwindigkeitszentrifugation isoliert. Das Zell-Pellet wurde in 1/50 des Ausgangskulturvolumens in Lyse-Puffer resuspendiert (50 mM Tris 8,0, 0,5 M NaCl, 5% Glycerol, 0,05% Triton X-100 und 1 mM PMSF) und die Zellen wurden lysiert, indem die resultierende Paste dreimal durch ein Microfluidics Corporation Microfluidizer M 110-EH, durchgeführt wurde. Das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt und der Überstand wurde durch ein 0,45 μm Filter gefiltert, gefolgt von einer Filtrierung durch einen 0,2 μm-Filter. 100 ml des geklärten Lysats wurde auf eine 5 ml Talon-Kobaltsäule (Clontech, Palo Alto, CA) aufgetragen, mit 70 ml Lyse-Puffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten aus 0-30 mM Imidazol in Lyse-Puffer eluiert. Die Flussrate durch die Säule in all diesen Schritten betrug 1 ml/Minute. Das eluierte Protein wurde durch Dialyse (MW Ausschluss = 3,500) gegen 15000-20000 PEG 10-fach aufkonzentriert. Die resultierende Probe wurde in Puffer 1 dialysiert (Lyse-Puffer ohne Glycerol) und, immer 5 ml gleichzeitig, auf eine in Puffer 1 äquilibrierte, 16 × 60 mm Sephacryl 100 Größenausschlusssäule geladen. Die Säule wurde bei 0,8 ml/Minute in Puffer 1 laufen gelassen; alle Fraktionen, die ein Protein der erwarteten MW enthielten, wurden vereint, wie oben beschrieben 10-fach aufkonzentriert und danach in PBS dialysiert. Toxikon (MA) war beteiligt, um die Endotoxinüberprüfungen und Tierversuche mit der entsprechenden Probe auszuführen.
In diesen Tierversuchen waren die Endotoxinmengen der bis heute untersuchten Proben unterhalb der Nachweisgrenze der Untersuchung. In einer vorläufigen Toxikologieprüfung wurde dieses Protein in zwei Mäuse mit der 100 X geschätzten therapeutischen Dosis von 2,6 mg/Maus injiziert. Die Tiere überlebten die zwei Wochen des Experiments ohne offensichtliche Krankheitseffekte. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass ¹⁰Fn3 sicher in einem IV-Medikament inkorporiert werden kann.
Alternative Konstrukte für in vivo-Verwendung
Um die Halbwertszeit der 8 kD ¹⁰Fn3-Domäne heraufzusetzen, wurden auch größere Moleküle konstruiert, welche natürlichen Antikörpern ähneln. Dieses ¹⁰Fn3-F_c-Molekül umfasst die -CH₁-CH₂-CH₃- (11) oder -CH₂-CH₃-Domänen der IgG-konstanten Region des Wirtes; in diesen Konstrukten ist die ¹⁰Fn3-Domäne an den N-Terminus anstatt der IgG V_H-Domäne befestigt (11 und 12). Von solchen Antikörper-ähnlichen Konstrukten wird erwartet, dass sie die Pharmakokinetik des Proteins, sowie seine Möglichkeit, sich die natürliche Immunantwort zunutze zu machen, verbessern.
Um die Mausform des ¹⁰Fn3-CH₁-CH₂-CH₃-Konstruktes zu klonieren, wurde die -CH₁-CH₂-CH₃-Region zuerst aus einer Maus-Leber-Milz-cDNS-Bibliothek (Clontech) vervielfältigt und dann in den pET25b-Vektor ligiert. Die Primer, die für dieses Klonieren benötigt waren, waren 5' Fc Nest und 3' 5 Fc Nest, und die Primer, die benutzt wurden, um die adäquaten Restriktionsstellen an die Enden des isolierten Inserts anzufügen, waren 5' Fc HIII und 3' Fc Nhe:
5' Fc Nest 5'GCG GCA GGG TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG 3' (SEQ ID NO: 15);
3' Fc Nest 5'GGG AGG GGT GGA GGT AGG TCA CAG TCC 3' (SEQ ID NO: 16);
3' Fc Nhe 5' TTT GCT AGC TTT ACC AGG AGA GTG GGA GGC 3' (SEQ ID NO: 17); und
5' Fc HIII 5' AAA AAG CTT GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 3' (SEQ ID NO: 18).
Weitere PCR ist nötig, um die CH₁-Region aus diesem Klon zu entfernen und den Fc-Teil des kleineren ¹⁰Fn3-CH₂-CH₃-Klons zu kreieren. Die Sequenz, welche ¹⁰Fn3 kodiert, ist an das 5'-Ende jedes Klones angefügt; entweder kann die Wildtyp-¹⁰Fn3, die aus derselben Mausmilz-cDNS-Bibliothek kloniert wurde, oder eine modifizierte ¹⁰Fn3, die durch Mutagenese oder Randomisierung (zufällige Anordnung) der Moleküle erhalten wurde, verwendet werden. Die Oligonukleotide, die in der Klonierung von Maus-Wildtyp-¹⁰Fn3 benutzt wurden, waren:
Mo 5PCR-NdeI:

5'CATATGGTTTCTGATATTCCGAGAGATCTGGAG 3' (SEQ ID NO: 19);

Mo5PCR-His-NdeI (für einen alternativen N-Terminus mit dem His₆-Aufreinigungsanhang)

5' CAT ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GTT TCT GAT ATT CCG AGA G 3'(SEQ ID NO: 20); und

Mo3PCR-EcoRI: 5'

GAATTCCTATGTTTTATAATTGATGGAAAC3'(SEQ ID NO: 21).

Die humanen Äquivalente der Klone wurden nach derselben Strategie mit humanen Oligonukleotidsequenzen konstruiert.
¹⁰Fn3-Gerüste in Proteinchipanwendungen
Die Eignung des ¹⁰Fn3-Gerüsts für Proteinchipanwendungen ist die Folge von (1) seiner Fähigkeit, mehrere Bindungsfunktionen, welche schnell am Labortisch oder in einem automatischen Verfahren selektiert werden können, zu unterstützen und (2) seinen besseren biophysikalischen Eigenschaften.
Die vielfältigen Bindungseigenschaften der ¹⁰Fn3 sind eine Funktion der Schleifen, die durch die Fn3-Immunoglobulin-ähnliche Betasandwichstruktur gezeigt werden. Wie oben erörtert, sind diese Schleifen ähnlich zu den Komplementaritätsbestimmenden Bereichen der Antikörper-variablen Domänen und können in ähnlicher Weise wie diese Antikörperschleifen kooperieren, um Antigene zu binden. In unserem System sind ¹⁰Fn3-Schleifen BC (Reste 21-30), DE (Reste 51-56) und FG (Reste 76-78) entweder in der Sequenz, der Länge oder in sowohl der Sequenz als auch der Länge randomisiert (zufällig angeordnet), um verschiedene Bibliotheken von mRNS-¹⁰Fn3-Fusionen zu erzeugen. Die Bindungspartner in solchen Bibliotheken werden dann anhand ihrer Affinität zu einem immobilisierten oder markierten Ziel angereichert, bis eine kleine Population von hochaffinen Bindungspartnern erzeugt wurde. Außerdem können fehleranfällige PCR und Rekombination verwendet werden, um die Affinitätsreifung selektierter Bindungspartner zu vereinfachen. Wegen der rapiden und effizienten Selektions- und Affinitätsreifung können Bindungspartner in kurzer Zeit für eine große Anzahl an Zielverbindungen selektiert werden.
Die ¹⁰Fn3-Domäne bietet als ein Gerüst für Bindungspartner, welche an einem Proteinchip immobilisiert werden, gegenüber Antikörperfragmenten und Einzelkettenantikörper den Vorteil, dass sie kleiner und leichter zu handhaben ist. Zum Beispiel ist ¹⁰Fn3, im Gegensatz zu Einzelkettengerüsten oder isolierten variablen Domänen von Antikörpern, die stark in ihrer Stabilität und Löslichkeit variieren und die ein oxidierendes Umfeld benötigen, um Ihre strukturell essentiellen Disulfidbrücken zu bewahren, mit einer Schmelztemperatur von 110°C und einer Löslichkeit bei einer Konzentration von > 16 mg/ml extrem stabil. Das ¹⁰Fn3-Gerüst umfasst auch keine Disulfidbrücken oder freie Cysteine, deswegen ist es unanfällig in Bezug auf das Redoxpotential seiner Umgebung. Ein weiterer Vorteil der ¹⁰Fn3 besteht darin, dass seine Antigen-bindenden Schleifen und N-Terminus an dem Rand des Betasandwiches gegenüber dem C-Terminus zu liegen kommen; deshalb richtet die Anbringung eines ¹⁰Fn3-Gerüsts an einen Chip durch seinen C-Terminus die Antigen-bindenden Schleifen aus, so dass ihre größte Zugänglichkeit zu der Lösung, die untersucht wird, gewährleistet ist. Da ¹⁰Fn3 eine einzelne Domäne von nur 94 Aminosäureresten ist, ist es auch möglich, sie auf einer Chipoberfläche mit einer höheren Dichte zu immobilisieren, als sie für Einzelkettenantikörper mit ihren ungefähr 250 Resten benutzt wird. Zusätzlich führt die Hydrophilität des ¹⁰Fn3-Gerüsts, welche sich in der hohen Löslichkeit dieser Domäne äußert, zu einer Hintergrundbindung von ¹⁰Fn3 auf einer Chipoberfläche, die, im Vergleich zum Durchschnitt, niedriger ist.
Die Stabilität des ¹⁰Fn3-Gerüstes sowie seine Eignung für die Erstellung von Bibliotheken und die Selektion für Bindungspartner wird wahrscheinlich von der großen Fn3-ähnlichen Klasse an Proteindomänen mit einer Immunoglobulin-ähnlichen Faltung geteilt, wie z.B. die Domänen von Tenascin, N-Cadherin, E-Cadherin, ICAM, Titin, GCSF-R, Cytokinrezeptor, Glycosidaseinhibitor, und antibiotischem Chromoprotein. Die Hauptmerkmale, die solche Domänen gemeinsam aufweisen, sind ein stabiles Gerüst, welches durch zwei Betafaltblätter, die sich selbst gegenseitig tragen, bereitgestellt wird, und welche durch mindestens drei Lösungsmittel-zugäng liche Schleifen pro Rand des Faltblattes verbunden sind; solche Schleifen können randomisiert (zufällig angeordnet) werden, um eine Bibliothek von möglichen Bindungspartnern zu erzeugen, ohne die Struktur des Gerüsts (wie oben beschrieben) zu zerstören.
Immobilisierung von Fibronectingerüst-Bindungspartnern (Fn-Bindungspartnern)
Um Fn-Bindungspartner auf einer Chipoberfläche zu immobilisieren, können eine Anzahl von beispielhaften Techniken benutzt werden. Zum Beispiel können Fn-Bindungspartner durch Watson-Crick-Hybridisierung des RNS-Rests der Fusion an eine basenkomplementäre DNS, welche auf der Chipoberfläche immobilisiert ist, als RNS-Proteinfusionen immobilisiert werden (wie zum Beispiel in „Addressable Protein Arrays", U.S.S.N. 60/080,686; U.S.S.N. 09/282,734 und WO 99/51773 beschrieben). Als Alternative können Fn-Bindungspartner als freie Proteine direkt auf einer Chipoberfläche immobilisiert werden. Manuelle sowie robotergestützte Geräte können für die Ablagerung von Fn-Bindungspartnern auf der Chipoberfläche benutzt werden. Punktabscheidungsroboter (spotting robots) können für die Ablagerung von Fn-Bindungspartnern mit einer hohen Dichte in einem Anordnungsformat (z.B. durch das Verfahren von Lueking et al., Anal Biochem. 1999 Mai 15; 270(1):103-11) benutzt werden. Auch können verschiedene Verfahren dazu benutzt werden, die Fn-Bindungspartner auf der Chipoberfläche zu verankern. Eine Anzahl von Standardimmobilisierungsverfahren kann benutzt werden, inklusive solche, die in Methods in Enzymology beschrieben wurden (K. Mosbach und B. Danielsson, Hrsg.), Bände 135 und 136, Academic Press, Orlando, Florida, 1987; Nilsson et al., Protein Expr. Purif. 1997 Okt; 11(1):1-16 und darin enthaltene Referenzen. Ausgerichtete Immobilisierung von Fn-Bindungspartnern können dabei helfen, die Bindungskapazität von Chip-gebundenen Fn-Bindungspartnern zu erhöhen. Beispielhafte Vorgehensweisen für die Erzielung von ausgerichteten Verknüpfungen werden in Lu et al., The Analyst (1996), Band. 121, S. 29R-32R und Turkova, J Chromatogr B Biomed Sci App. 1999 Feb 5; 722(1-2):11-31 beschrieben. Zusätzlich kann jedes der hier beschriebenen Verfahren Fn-Bindungspartner an Chipoberflächen zu verankern, auch dazu angewendet werden, die Fn-Bindungspartner auf Kügelchen oder anderen Festträgern zu immobilisieren.
Einfanden und Nachweis eines Zielproteins
Ausgewählte Populationen von Fn-Bindungspartnern können für den Nachweis und/oder für die Quantifizierung von Analytzielen benutzt werden, z.B. in Proben wie biologischen Proben. Um solch eine Art diagnostischer Untersuchungen durchzuführen, werden ausgewählte Fn-Bindungspartner für interessierende Ziele an einem geeigneten Träger immobilisiert, um Proteinchips mit mehreren Eigenschaften herzustellen. Als nächstes wird eine Probe auf den Chip aufgebracht und die Komponenten der Probe, welche mit den Fn-Bindungspartnern wechselwirken, werden aufgrund ihrer Zielspezifität zu den immobilisierten Bindungspartnern identifiziert. In einer Probe können, indem man diese Technik verwendet, eine oder mehrere Komponenten gleichzeitig identifiziert oder quantifiziert werden (z.B. als Verfahren, um ein Probenprofil zu erstellen).
Die Verfahren für den Zielnachweis ermöglichen das Messen der Level gebundener Proteinziele und umfassen, ohne Einschränkung, Radiographie, Fluoreszenzabtastung, Massenspektroskopie (MS) und Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Autoradiographie unter Verwendung eines Phosphorbildaufnahmesystems (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) kann für den Nachweis und Quantifizierung eines Zielproteins, welches radioaktiv, z.B. durch ³⁵S-Methionin, markiert wurde, verwendet werden. Fluoreszenzabtastung unter Verwendung eines Laserscanners (siehe unten) kann für den Nachweis und Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Ziele verwendet werden. Alternativ dazu kann Fluoreszenzabtastung für den Nachweis Fluoreszenz-markierter Liganden verwendet werden, welche selbst an das Zielprotein binden (z.B. Fluoreszenz-markierte zielspezifische Antikörper oder Fluoreszenz-markierte Streptavidinbindung an Ziel-Biotin wie unten beschrieben).
Massenspektroskopie kann verwendet werden, um gebundene Zielmoleküle anhand ihrer molekularen Masse nachzuweisen und zu identifizieren. Die Desorption von gebundenem Zielprotein kann, wie unten beschrieben, mit Laserassistenz direkt von der Chipoberfläche erzielt werden. Die Massendetektion erlaubt auch, aufgrund von molekularer Masse, Bestimmungen von Zielmodifikationen einschließlich posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder Glykosylierung. Die Oberflächenplasmonresonanz kann für die Quantifizierung gebundener Proteinziele benutzt werden, wobei der oder die Fn-Bindungspartner an einer geeigneten Goldoberfläche immobilisiert sind (erhältlich z.B. von Biacore, Schweden).
Unten aufgeführt sind beispielhafte Schemata, um Fn-Bindungspartner zu selektieren (in diesem Fall Fn-Bindungspartner spezifisch für das Protein TNF-α) und die Verwendung solcher selektierten Populationen für den Nachweis auf Chips. Dieses Beispiel wird zur Verdeutlichung des Zwecks der Erfindung aufgeführt und sollte nicht beschränkend ausgelegt werden.
Selektion von TNF-α-Bindungspartnern beruhend auf einem ¹⁰Fn3-Gerüst
In einer beispielhaften Verwendung einer Fibronectingerüstauswahl auf Chips wurde, unter Verwendung einer Bibliothek von humanen ¹⁰Fn3-Varianten mit randomisierten (zufällig angeordneten) Schleifen BC, DE und FG, eine auf ¹⁰Fn3 beruhende Selektion gegen TNF-α ausgeführt. Die Bibliothek wurde aus drei DNS-Fragmenten hergestellt, wobei jede davon Nukleotidsequenzen, die ungefähr für ein Drittel des humanen ¹⁰Fn3 inklusive einer der randomisierten (zufällig angeordneten) Schleifen kodierten, umfasst. Die DNS-Sequenzen, die für die oben aufgelisteten Schleifenreste kodierten, wurden durch Oligonukleotidsynthese neu erstellt, so dass die Codons für die interessierenden Reste durch (NNS)n ersetzt wurden, wobei N jede der vier Desoxyribonukleotide (A, C, G oder T) repräsentiert und S entweder C oder G repräsentiert. Der C-Terminus eines jeden Fragmentes enthielt die Sequenz für den FLAG-Aufreinigungsanhang.
Nach der Verlängerung durch Klenow wurde jedes DNS-Fragment transkribiert und das Transkript wurde an ein Puromycin-enthaltenden DNS-Linker ligiert und, wie von Szostak et al. beschrieben (Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297, 1997; Szostak et al., WO 00/47775; Szostak et al., WO 98/31700), in vitro translatiert, um eine mRNS-Peptid-Fusion zu erzeugen, welche dann in eine DNS-mRNS-Peptid-Fusion revers transkribiert wurde. Die Bindung des FLAG-Anhangpeptids an M2-Agarose trennte Volllängenfusionsmoleküle von solchen, die Leserasterverschiebungen oder überflüssige Stoppcodons beinhalteten; die DNS, welche mit dem aufgereinigten Volllängenmolekül assoziiert war, wurde durch PCR amplifiziert, dann wurden, um die Volllängenvorlage zu bilden, die beiden DNS-Fragmente mit Ear I-Restriktionsendonuklease geschnitten und ligiert. Die Vorlage wurde transkribiert und das Transkript an Puromycin-enthaltende DNS-Linker ligiert und translatiert, um eine ¹⁰Fn3-RNS-Proteinfusionsbibliothek zu erzeugen, welche dann reverstranskribiert wurde, um die DNS-mRNS-Peptidfusionsbibliothek zu bilden, die anschließend in der Selektion eingesetzt wurde.
Die Selektion für TNF-α-Bindungspartner fand in 50 mM HEPES, pH 7,4, 0,02% Triton-X, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNS statt. Die RNS-Proteinfusionsbibliothek wurde mit Sepharose-immobilisiertem TNF-α inkubiert; nach einem Waschschritt wurde die DNS, welche mit den stärksten Bindungspartner assoziiert war, mit 0,1 M KOH eluiert, durch PCR amplifiziert und transkribiert und das Transkript wurde ligiert, translatiert und revers transkribiert, um als Ausgangsmaterial für die nächste Selektionsrunde zu dienen.
Zehn solcher Selektionsrunden wurden (wie in 13 gezeigt) ausgeführt; sie resultierten in einem RNS-Proteinfusionsreservoir, welches an TNF-α-Sepharose mit einer scheinbaren durchschnittlichen Kd von 120 nM band. Spezifische, klonale Komponenten dieses Reservoirs, die charakterisiert wurden, zeigten TNF-α-Bindung in dem Bereich von 50-500 nM.
Fn-Bindungspartner-Immobilisierung, Zielproteinfang und MALDI-TOF-Detektion
Als erster Schritt zur Immobilisierung der Fn-Bindungspartner an eine Chipoberfläche wurde eine Oligonukleotidfangprobe mit einem automatischen DNS-Synthesizer (PE BioSystems Expedite 8909) unter Verwendung des Festträgerphosphoramiditansatzes hergestellt. Alle Reagenzien wurden von Glen Research erhalten. Die Synthese wurde mit einem Festträger initiiert, welcher eine Disulfidbrücke enthielt, um schließlich eine 3'-terminale Thiolfunktionalität zu bieten. Die ersten vier Monomere, die hinzugefügt wurden, waren Hexaethylenoxideinheiten, gefolgt von 20 T Monomeren. Die 5'-terminale DMT-Gruppe wurde nicht entfernt. Die Fangprobe wurde von dem Festträger abgespalten und mit Ammoniumhydroxid entschützt, in einer Vakuumzentrifuge zur Trockenheit aufkonzentriert und mit Hilfe von Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in Triethylammoniumacetatpuffer aufgereinigt. Geeignete Fraktionen wurden von der HPLC gesammelt, bis zur Trockenheit in einer Vakuumzentrifuge evaporiert und die 5'-terminale DMT-Gruppe wurde unter Behandlung mit 80% AcOH für 30 Minuten entfernt. Die Säure wurde durch Evaporation entfernt und das Oligonukleotid wurde dann für 30 Minuten mit 100 mM DTT behandelt, um die Disulfidbrücke zu spalten. Das DTT wurde durch mehrfache Extraktion mit EtOAc entfernt. Die Oligonukleotide wurden in Ethanol aus der übrig bleibenden wässrigen Phase gefällt und ihre Reinheit wurde durch Umkehrphasen-HPLC überprüft.
Die 3'-Thiolfangprobe wurde mit entgastem 1X PBS-Puffer auf 250 μM adjustiert und als einzelner Tropfen (75 μl) auf ein 9×9 mm Gold-beschichteten Chip (Biacore) in einer Argon-gespülten Kammer, welche eine kleine Wassermenge enthielt, aufgebracht. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Fangprobenlösung entfernt und der funktionalisierte Chip wurde mit 50 ml 1X PBS-Puffer (2× für jeweils 15 Minuten) unter sanfter Bewegung gewaschen und anschließend mit 50 ml Wasser (2× für jeweils 15 Minuten) in derselben Art und Weise gespült. Übrig gebliebene Flüssigkeit wurde vorsichtig entfernt und die funktionalisierten Chips wurden entweder gleich benutzt oder bei 4°C unter Argon aufbewahrt.
Ungefähr 1 pmol des ¹⁰Fn3-Fusionsreservoirs der Runde 10 der TNF-α-Selektion (oben) wurde für mehrere Stunden mit RNAse A behandelt, auf 5X SSC in 70 μl angepasst und auf einen funktionalisierten Goldchip von oben als einzelner Tropfen aufgebracht. Ein 50 μl Dichtungsbehälter wurde dafür benutzt, die Fusionsmischung mit dem funktionalisierten Chip zu versiegeln und der Apparat wurde kontinuierlich bei 4°C rotiert. Nach 18 Stunden wurde der Apparat auseinander genommen und der Goldchip wurde unter sanfter Bewegung für 10 Minuten mit 50 ml 5X SSC gewaschen. Überschussflüssigkeit wurde vorsichtig von der Chipoberfläche entfernt und der Chip wurde mit einer Blockierlösung (1X TBS + 0,02% Tween-20 + 0,25% BSA) für 10 Minuten bei 4°C passiviert. Überschüssige Flüssigkeit wurde vorsichtig entfernt und eine Lösung aus 500 μg/ml TNF-α einer Blockierlösung der gleichen Zusammensetzung wurde als einzelner Tropfen auf den Chip gebracht und bei 4°C für zwei Stunden bei gelegentlicher Durchmischung des Tropfens mit einem Pipetman inkubiert. Nach der Entfernung der Bindungslösung wurde der Chip für 5 Minuten bei 4°C unter sanfter Bewegung gewaschen (50 ml 1X TBS + 0,02% Tween-20) und dann bei Raumtemperatur getrocknet. Ein zweiter Chip wurde genau wie oben beschrieben präpariert, aber die Fusion wurde dem Hybridisierungsmix nicht zugegeben.
Als nächstes wurde mit einem Hochpräzisions-3-Achsenroboter (MicroGrid, BioRobotics) eine MALDI-TOF-Matrize (15 mg/ml 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimmtsäure in 1:1 Ethanol/10% Ameisensäure in Wasser) gleichmäßig auf die Goldchips gebracht. Ein 16-Nadelwerkzeug wurde dafür verwendet, die Matrize von einer 384-Vertiefungsmikrotiterplatte auf die Chips zu transferieren, was 200 Mikron Durchmesser-Merkmale mit einer 600 Mikron Schrittweite erzeugte. Die MALDI-TOF-Massenspektrometer- (Voyager DE, PerSeptive, Biosystems) Instrumenteneinstellungen waren wie folgt: Beschleunigungsspannung = 25k, Gitterspannung = 92%, Lenkdrahtspannung = 0,05%, Verzögerung = 200 an, Laserpower = 2400, Niedrigmassengatter = 1500, negative Ionen = aus. Die Goldchips wurden individuell auf eine MALDI-Probenhalterung, welche modifiziert war, um die Ebene des Chips und die Ebene der Halterung gleich zu halten und damit eine gute Flugdistanz zu erlauben, platziert. Der Videoschirm des Instruments und das Bewegungskontrollsystem wurden dazu benutzt, den Laserstrahl zu individuellen Matrizenmerkmalen zu führen.
Die 14 und 15 zeigen die Massenspektra des ¹⁰Fn3-Fusionschips beziehungsweise des Nichtfusionschips. Um die Spektren zu sammeln wurde in beiden Fällen eine kleine Anzahl von 200 Mikron Merkmalen analysiert; aber 15 verlangte signifikant mehr Messungen. Das Signal bei 17,5 kDa entspricht dem TNF-α-Monomer.
Fn-Bindungspartner-Immobilisierung, Zielproteinfang und Fluoreszenznachweis
Vorgereinigte 1×3 Inch Glasmikroskopieträger (Goldseal, #3010) wurden für 15 Minuten mit Nanostrip (Cyantek), für 3 Minuten bei 70°C mit 10% wässrigem NaOH und für eine Minute mit 1% wässrigem HCl behandelt und dabei nach jedem Reagenz gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die Träger wurden dann in einem Vakuumdesikkator über wasserfreiem Calciumsulfat für mehrere Stunden getrocknet. Eine 1%ige Lösung aus Aminopropyltrimethoxysilan in 95% Aceton/5% Wasser wurde hergestellt und es wurde ihr erlaubt, für 20 Minuten zu hydrolysieren. Die Glasträger wurden unter sanfter Bewegung für 5 Minuten in die hydrolysierte Silanlösung getaucht. Überschüssiges Silan wurde entfernt, indem die Träger zehn 5-minütigen Waschschritten ausgesetzt wurden, indem für jeden Waschschritt frische Mengen von 95% Aceton/5% Wasser unter sanfter Bewegung eingesetzt wurden. Die Träger wurden dann bei 110°C für 20 Minuten durch Erhitzung ausgehärtet. Die Silan-behandelten Träger wurden für zwei Stunden in einer frisch hergestellten 0,2%igen Lösung von Phenylen-1,4-diisothiocyanat unter sanfter Bewegung in 90% DMF/10% Pyridin getaucht. Die Träger wurden sequenziell mit 90% DMF/10% Pyridin, Methanol und Aceton gewaschen. Nach Lufttrocknung wurden die funktionalisierten Träger bei 0°C in einem Vakuumdesikkator über entwässertem Calciumsulfat aufbewahrt. Ähnliche Resultate wurden mit kommerziell erhältlichen, aminreaktiven Trägern (3-D-Link, Surmodics) erhalten.
Oligonukleotidfangproben wurden mit einem automatischen DNS-Synthesizer (PE Biosystems Expedite 8909) mit Hilfe konventioneller Phosphoramiditchemie hergestellt. Alle Reagenzien waren von Glen Research. Die Synthese wurde mit einem Festträger initiiert, welcher eine orthogenal geschützte Aminofunktionalität trug, wobei das 3'-terminale Amin bis zum endgültigen Entschützungsschritt nicht entmaskiert wurde. Die ersten vier Monomere, welche hinzugefügt wurden, waren Hexaethylenoxideinheiten gefolgt von gewöhnlichen A, G, C und T Monomeren. Alle Fangoligosequenzen wurden von der Festphase abgespalten und mit Ammoniumhydroxid entschützt, anschließend zu Trockenheit konzentriert, in Ethanol präzipitiert und durch eine Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Acetonitrilgradientes in Triethylammoniumacetatpuffer aufgereinigt. Von der HPLC wurden Adäquate Fraktionen gesammelt, in einer Vakuumzentrifuge zur Trockenheit evaporiert und dann mit einer Portion Wasser co-evaporiert. Die aufgereinigten aminomarkierten Fangoligos wurden auf eine Konzentration von 250 μM in 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,0), welcher 10% Glycerol enthielt, eingestellt. Die Proben wurden mit einem 3-Achsenroboter zu definierten Positionen auf die aminoreaktive Glasoberfläche in einem 5×5×6 Anordnungsmuster (MicroGrid, BioRobotics) getupft. Ein 16-Nadelwerkzeug wurde dazu benutzt, die Flüssigkeit von 384-Vertiefung Mikrotiterplatten zu transferieren, was 200 Mikron Merkmale mit einer 600 Mikron Schrittweite erzeugte. Jedes Untergitter mit 24 Merkmalen repräsentiert eine einzelne Fangprobe (d.h. 24 doppelte Punkte). Die Anordnungen wurden bei Raumtemperatur für 12-18 Stunden in einer feuchtigkeitssaturierten Umgebung inkubiert. Die Anschlussreaktion wurde durch Tauchen der Chips in 2% wässriges Ammoniumhydroxid für 5 Minuten bei sanfter Bewegung terminiert, gefolgt von einer Spülung mit destilliertem Wasser (3× für jeweils 5 Minuten). Die Anordnung wurde schlussendlich für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 10X PBS-Lösung eingeweicht und dann noch mal für 5 Minuten in destilliertem Wasser gespült.
Spezifische und thermodynamische isoenergetische Sequenzen entlang der ¹⁰Fn3-mRNS wurden identifiziert, um als Fangpunkte zu dienen, um das ¹⁰Fn3-Protein selbst zusammenzubauen und zu verankern. Das Softwareprogramm HybSimulator v4.0 (Advanced Gene Computing Technology, Inc.) ermöglichte die Identifizierung und Analyse potentieller Fangproben. Sechs einzigartige Fangproben wurden ausgewählt und auf den Chip gedruckt, von welchen drei komplementär zu gemeinsamen Regionen der mRNS des ¹⁰Fn3-Fusionsreservoirs (CP3', CP5' und CPflag) sind. Die verbleibenden drei Sequenzen (CPneg1, CPneg2 und CPneg3) sind nicht komplementär und wirken zum Teil als Negativkontrollen. Jede der Fangproben besitzt ein 3'-Aminoterminus und, wie oben beschrieben, vier Hexaethylenoxidabstandshaltereinheiten. Das Folgende ist eine Liste der Fangprobensequenzen, die eingesetzt wurden (5'→3'):
CP3': TGTAAATAGTAATTGTCCC (SEQ ID NO: 22)
CP5': (SEQ ID NO: 23)
CPneg1: CCTGTAGGTGTCCAT (SEQ ID NO: 24)
CPflag: CATCGTCCTTGTAGTC (SEQ ID NO: 25)
CPneg2: CGTCGTAGGGGTA (SEQ ID NO: 26)
CPneg3: CAGGTCTTCTTCAGAGA (SEQ ID NO: 27)
Ungefähr 1 pmol des ¹⁰Fn3-Fusionsreservoirs der Runde 10 TNF-α-Selektion wurde zu 5X SSC mit 0,02% Tween-20 und 2 mM Vanadylribonukleotidkomplex zu einem Gesamtvolumen von 350 μl eingestellt. Das gesamte Volumen wurde auf die Mikroanordnung unter einem 400 μl Dichtungsapparat gebracht und dieser Aufbau wurde kontinuierlich für 18 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Nach der Hybridisierung wurde der Träger sequenziell mit gerührten 500 ml Portionen von 5X SSC, 2,5X SSC und 1X SSC für jeweils 5 Minuten gewaschen. Flüssigkeitsspuren wurden unter Zentrifugation entfernt und der Träger durfte lufttrocknen.
Rekombinantes, humanes TNF-α (500 μg, lyophilisiertes, von PreproTech) wurde in 230 μl 1X PBS aufgenommen und bei 4°C für 18 Stunden in einer Mikrodialyseeinheit (3,500 MWCO, Pierce) gegen 700 ml gerührtem 1X PBS dialysiert. Das dialysierte TNF-α wurde für zwei Stunden bei 0°C mit EZ-Link NHS-LC-LC-Biotinylierungsreagenz (20 μg, Pierce) behandelt und anschließend für 18 Stunden in einer Mikrodialyseeinheit (3500 MWCO, Pierce) gegen 700 ml 1X PBS bei 4°C dialysiert. Das entstehende Konjugat wurde durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert und es wurde gefunden, dass es fast gänzlich mit einem einzelnen Biotinrest funktionalisiert war.
Jeder der folgenden Prozesse wurde bei 4°C unter ständiger Rotation oder Durchmischung ausgeführt. Die Proteinmikroanordnungsoberfläche wurde für 60 Minuten durch Behandlung mit 1X TBS, das 0,02% Tween-20 und 0,2% BSA (200 μl) enthielt, passiviert. Biotinyliertes TNF-α (100 nM Konzentration in dem Passivierungspuffer) wurde für 120 Minuten mit der Mikroanordnung in Kontakt gebracht. Die Mikroanordnung wurde mit 1X TBS, das 0,02% Tween-20 enthielt (3X 50 ml, 5 Minuten jede Waschung), gewaschen. Fluoreszenzmarkiertes Streptavidin (2,5 μg/ml Alexa 546-Streptavidinkonjugat von Molecular Probes zubereitet in dem Passivie rungspuffer) wurde für 60 Minuten mit der Mikroanordnung in Verbindung gebracht. Die Mikroanordnung wurde mit 1X TBS, das 0,02% Tween-20 enthielt (2X 50 ml, 5 Minuten jede Waschung), gewaschen, gefolgt von einer 3-minütigen Spülung mit 1X TBS. Flüssigkeitsspuren wurden durch Zentrifugation entfernt und es wurde dem Träger erlaubt, bei Raumtemperatur luftzutrocknen.
Fluoreszenzlaserabtastung wurde mit einem GSI-Lumonics-ScanArray 500 System unter Verwendung einer 10 μm Pixelauflösung unter voreingestellten Anregungs- und Emissionswellenlängen für Alexa 546 Farbe durchgeführt. Die Phosphorbildanalyse wurde mit einem Molecular Dynamics Storm System durchgeführt. Die Entwicklungszeit betrug 48 Stunden unter direktem Kontakt der Mikroanordnung mit dem Phosphorspeicherschirm. Phosphorbildabtastung wurde mit der 50 μm-Auflösungseinstellung durchgeführt und die Daten wurden mit ImageQuant v4.3-Software extrahiert.
Die 16 und 17 sind die Phosphorbild- beziehungsweise Fluoreszenzabtastungen der selben Anordnung. Das Phosphorbild zeigt anhand des ³⁵S-Methioninsignals, wo die ¹⁰Fn3-Fusion hybridisiert hat. Die Fluoreszenzabtastung zeigt, wo das markierte TNF-α gebunden hat.
Andere Ausführungsformen
Andere Ausführungsformen sind innerhalb der Ansprüche enthalten.
Was beansprucht wird ist: SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Anordnung von auf einem Festträger immobilisierten Proteinen, wobei ein jedes der Proteine eine Fibronectin Typ III-Domäne mit mindestens einer zufällig angeordneten Schleife, mindestens einem zufällig angeordneten β-Faltblatt oder einer Kombination davon umfasst, und sich durch seine Fähigkeit auszeichnet, an eine Verbindung zu binden, die nicht von einem entsprechenden natürlich auftretenden Fibronectin gebunden wird.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei die Fibronectin Typ III-Domäne eine Fibronectin Typ III-Domäne aus Säugern ist.
Anordnung nach Anspruch 2, wobei die Fibronectin Typ III-Domäne eine humane Fibronectin Typ III-Domäne ist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei ein jedes der Proteine das zehnte Modul der Fibronectin Typ III-Domäne (¹⁰Fn3) umfasst.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei die zufällige Anordnung der einen, zwei oder drei Schleifen zu einer Bindung des Proteins an die Verbindung führt.
Anordnung nach Anspruch 5, wobei die zufällige Anordnung der zwei Schleifen zu der Bindung des Proteins an die Verbindung führt.
Anordnung nach Anspruch 6, wobei die zufällige Anordnung der drei Schleifen zu der Bindung des Proteins an die Verbindung führt.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei ¹⁰Fn3 kein Integrin-bindendes Motiv aufweist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei ein jedes der Proteine keine Disulfidbindungen aufweist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei ein jedes der Proteine ein Monomer oder ein Dimer ist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei ein jedes der Proteine kovalent an eine Nukleinsäure gebunden ist.
Anordnung nach Anspruch 11, wobei die Nukleinsäure für das kovalent gebundene Protein kodiert.
Anordnung nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure RNA ist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei der Festträger ein Chip ist.
Verfahren zur Identifizierung eines Proteins, das an eine Verbindung bindet, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einer Anordnung von Kandidaten-Proteinen, die auf einem Festträger immobilisiert sind, wobei ein jedes der Kandidatenproteine eine Fibronectin Typ III-Domäne mit mindestens einer zufällig angeordneten Schleife, einem zufällig angeordneten β-Faltblatt oder einer Kombination davon umfasst, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen erfolgt, die eine Bildung eines Verbindung-Protein-Komplexes ermöglichen, und (b) Identifizieren aus dem Komplex eines Proteins, das an die Verbindung bindet.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an ein Protein bindet, wobei das Protein eine Fibronectin Typ III-Domäne mit mindestens einer zufällig angeordneten Schleife, mindestens einem zufällig angeordneten β-Faltblatt oder einer Kombination davon umfasst, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Anordnung von Proteinen, die auf einem Festträger immobilisiert sind, mit einer Kandidaten-Verbindung, wobei ein jedes der Proteine eine Fibronectin Typ III-Domäne mit mindestens einer zufällig angeordneten Schleife, einem zufällig an geordneten β-Faltblatt oder einer Kombination davon umfasst, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen erfolgt, die eine Bildung des Verbindung-Protein-Komplexes ermöglichen, und (b) Identifizieren aus dem Komplex einer Verbindung, die an ein Protein der Anordnung bindet.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren ferner die Schritte umfasst: (c) weiteres zufälliges Anordnen eines Proteins, das an die Verbindung in Schritt (b) bindet, (d) Bilden einer Anordnung auf einem Festträger mit den weiter zufällig angeordneten Proteinen aus Schritt (c) und (e) Wiederholung der Schritte (a) und (b) unter Verwendung in Schritt (a) der Anordnung an weiter zufällig angeordneten Proteinen als die Anordnung von Kandidaten-Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Verfahren ferner die Schritte umfasst: (c) Modifizieren der Verbindung, die an das Protein in Schritt (b) bindet, und (d) Wiederholung der Schritte (a) und (b) unter Verwendung in Schritt (a) der weiter modifizierten Verbindung als die Kandidaten-Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Festträger ein Chip ist.
Verfahren zum Nachweis einer Verbindung in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Protein, das an die Verbindung bindet, und eine Fibronectin Typ III-Domäne mit mindestens drei zufällig angeordneten Schleifen umfasst, wobei das In-Kontakt-Bringen unter Bedingungen erfolgt, die eine Bildung eines Verbindung-Protein-Komplexes ermöglichen, und (b) Nachweis des Komplexes, wodurch die Verbindung in der Probe nachgewiesen wird, wobei das Protein auf einem Festträger immobilisiert ist und das Protein auf dem Festträger als Teil einer Anordnung immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Festträger ein Partikel oder Chip ist.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 20, wobei die Verbindung ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 20, wobei die Fibronectin Typ III-Domäne eine Fibronectin Typ III-Domäne aus Säugern ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Fibronectin Typ III-Domäne eine humane Fibronectin Typ III-Domäne ist.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 20, wobei ein jedes der Proteine das zehnte Modul der Fibronectin Typ III-Domäne (¹⁰Fn3) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die zufällige Anordnung der drei Schleifen zu der Bindung des Proteins an die Verbindung führt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei ¹⁰Fn3 kein Integrin-bindendes Motiv aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 20, wobei ein jedes der Proteine kovalent an eine Nukleinsäure gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nukleinsäure für das kovalent gebundene Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Nukleinsäure RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 20, wobei der Komplex oder die Verbindung durch Radiographie, Fluoreszenznachweis, Massenspektroskopie oder Oberflächenplasmonresonanz nachgewiesen wird.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei das Protein, das die Fibronectin Typ III-Domäne enthält, mindestens eine Mutation in dem β-Faltblatt aufweist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei das Protein, das die Fibronectin Typ III-Domäne enthält, mindestens eine zufällig angeordnete Schleife aufweist.
Anordnung nach Anspruch 1, wobei das Protein, das die Fibronectin Typ III-Domäne enthält, mindestens drei veränderte Schleifen aufweist.
Anordnung nach Anspruch 34 oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die drei Schleifen die BC-, DE-, FG-Schleifen der Fibronectin Typ III-Domäne sind.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Protein, das die Fibronectin Typ III-Domäne enthält, mindestens eine Mutation in dem β-Faltblatt aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Protein, das die Fibronectin Typ III-Domäne enthält, mindestens eine zufällig angeordnete Schleife aufweist.