JP2023516615A - ショックを患っている患者におけるｎｔ－ａｄｍ抗体治療法ガイダンス、モニタリング、及び層別化のためのｄｐｐ３ - Google Patents

ショックを患っている患者におけるｎｔ－ａｄｍ抗体治療法ガイダンス、モニタリング、及び層別化のためのｄｐｐ３ Download PDF

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Abstract

本願は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に向けられる。特に、その方法は、前記患者からのサンプルを提供し、前記サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定することを含み、そして、ここで、前記サンプル中のDPP3レベルが、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場による治療が必要であるかどうかを示唆している。本発明の好ましい実施形態において、その方法は、前記患者からのサンプル中のADM-NH2レベルを測定することを更に含む。

Description

本発明の分野
本発明は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関する。特に、その方法は、前記患者からのサンプルを提供し、前記サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定することを含み、そして、ここで、前記サンプル中のDPP3レベルが、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場による治療が必要であるかどうかを示唆している。本発明の好ましい実施形態において、その方法は、前記患者からのサンプル中のADM-NH2レベルを測定することを更に含む。更に、本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットにも関する。
ジペプチジルペプチダーゼ3(ジペプチジルアミノペプチダーゼIII、ジペプチジルアリールアミダーゼIII、ジペプチジルペプチダーゼIII、エンケファリナーゼB、又は赤血球細胞アンジオテンシナーゼとしても知られており、略号はDPP3、DPPIIIである)は、生理学的に活性なペプチド(エンケファリン、及びアンジオテンシンなど)からジペプチドを除去するメタロペプチダーゼである。DPP3は、精製したウシ脳下垂体前葉の抽出物からEllisとNuenkeによって1967年に初めて同定され、その活性が測定された。この酵素はEC 3.4.14.4として掲載されており、分子量は約83 kDaであり、真核生物と原核生物において高度に保存されている(Prajapati & Chauhan 2011)。ヒトバリアントのアミノ酸配列が配列番号1に示されている。ジペプチジルペプチダーゼIIIは、遍在的に発現する主にサイトゾルのペプチダーゼである。シグナル配列が欠落しているが、いくつかの研究で膜活性が報告された(Lee & Snyder 1982)。
DPP3は、ペプチダーゼファミリーM49に属する亜鉛依存性エキソペプチダーゼである。DPP3 は、さまざまな組成の3、4～10個のアミノ酸からなるオリゴペプチドに対する広い基質特異性を持ち、プロリンの後を切断することもできる。DPP3 は、その基質(アンジオテンシンII、III、及びIV；Leu-エンケファリン及びMet-エンケファリン；エンドモルフィン1及び2が含まれる)のN末端からジペプチドを加水分解することが知られている。メタロペプチダーゼDPP3はpHが8.0～9.0で最適の活性を持ち、2価の金属イオン(Co2+及びMg2+など)を添加することによって活性化させることができる。
DPP3の構造分析から、触媒モチーフHELLGH(hDPP3 450～455)とEECRAE(hDPP3 507～512)のほか、基質の結合と加水分解にとって重要なアミノ酸：Glu316、Tyr318、Asp366、Asn391、Asn394、His568、Arg572、Arg577、Lys666、及びArg669(Prajapati & Chauhan 2011；Kumar et al. 2016；数字はヒトDPP3の配列についてのものである；配列番号1を参照のこと)が明らかになった。基質の結合と加水分解に関与する既知のすべてのアミノ酸又は配列領域を考慮すると、ヒトDPP3の活性部位はアミノ酸316と669の間の領域に限定することができる。
DPP3の最も重要な基質は、レニン-アンジオテンシン系(RAS)の主要なエフェクタであるアンジオテンシンII(Ang II)である。RASは心血管疾患(Dostal et al. 1997. J Mol Cell Cardiol 29:2893-902; Roks et al. 1997. Heart Vessels. Suppl 12:119-24)と、敗血症及び敗血症性ショック(Correa et al. 2015. Crit Care 19:98)において活性化されている。特にAng IIは、多くの心血管機能(血圧の制御、心臓リモデリングが含まれる)を変化させることが示されている。
最近、ヒト体液(例えば血液、血漿、血清)中でDPP3を特に検出するため2つのアッセイが考案され、特徴づけられ、検証された。すなわち、DPP3タンパク質の濃度を測定する蛍光イムノアッセイ(LIA)と、特異的DPP3活性を検出する酵素捕捉活性アッセイ(ECA)である(Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953)。邪魔な物質を洗浄ステップですべて除去した後、DPP3活性が実際に検出される。どちらの方法も非常に特異的であるため、血液サンプル中でDPP3を再現性よく検出することができる。
血中DPP3レベルは、心原性ショック患者において上昇することが示され、かつ、早期死亡率と重度の臓器機能不全の高いリスクと関連した(Deaniau et al. 2020. Eur J Heart Fail. 22(2):290-299)。そのうえ、組み入れ時に計測されたDPP3は、非難治性ショックに対して難治性ショックを発症した心原性ショック患者を判別し、そして、DPP3濃度≧59.1ng/mLは、より高い死亡リスクに関連した(Takagi et al. 2020. Eur J Heart Fail. 22(2):279-286)。
アドレノメデュリン(ADM)というペプチドは、52個のアミノ酸を含む新規な血圧低下ペプチドとして1993年に初めて報告された(Kitamura et al., 1993. Biochem Biophys Res Comm 192 (2): 553-560)が、それ以前にヒト褐色細胞腫細胞系から単離されていた(配列番号20)。同年、185個のアミノ酸を含む前駆ペプチドをコードするcDNAと、この前駆ペプチドの完全なアミノ酸配列も報告された。この前駆ペプチドは、特にN末端に21個のアミノ酸からなるシグナル配列を含んでおり、「プレ-プロアドレノメデュリン」(プレ-プロADM)と呼ばれる。本明細書では、特定するすべてのアミノ酸位置が、通常は、185個のアミノ酸を含むプレ-プロADMに関係している。アドレノメデュリン(ADM)というペプチドは、52個のアミノ酸を含むペプチド(配列番号20)であり、プレ-プロADMのアミノ酸95～146を含んでいて、そこからタンパク質分解による切断でこのペプチドが形成される。現在、プレ-プロADMの切断によって形成されるペプチド断片のうちの実質的にいくつかの断片だけがより正確に調べられている。それは特に、生理学的に活性なペプチドADMと、プレ-プロADMの中のシグナルペプチドの21個のアミノ酸の後に続く20個のアミノ酸(22～41)を含む「PAMP」である。1993年にADMが発見されて特徴が明らかにされたことによって精力的な研究活動が開始され、その結果がさまざまな概説論文にまとめられている。本明細書の文脈では、特に「Peptides」のADM特集号に掲載された論文を参照する(Takahashi 2001. Peptides 22: 1691; Eto 2001. Peptides 22: 1693-1711)。さらに別の概説論文は、Hinsonら、2000年(Hinson et al. 2000. Endocrine Reviews 21(2):138-167)である。現在までの科学的研究において、ADMを多機能の調節ペプチドと見なせることが特にわかっている。ADMは、グリシンによって延長された不活性な形態で循環の中に放出される(Kitamura et al. 1998. Biochem Biophys Res Commun 244(2): 551-555)。ADMに対して特異的な結合タンパク質も存在しており(Pio et al. 2001. The Journal of Biological Chemistry 276(15): 12292-12300)、おそらく同様にADMの効果を調節している。現在までの研究において最も重要なADMとPAMPのこれら生理学的効果は、血圧に及ぼす効果であった。
したがってADMは効果的な血管拡張剤であるため、血圧低下効果をADMのC末端部分の中にある特定のペプチド区画と関連づけることができる。さらに、プレ-プロADMから形成される上記の生理学的に活性なペプチドPAMPは、ADMとは異なる作用機構を持つように見えるとはいえ、同様に血圧低下効果を示すことが見いだされている(上記の概説論文Eto et al. 2001 and Hinson et al. 2000に加えて、Kuwasaki et al. 1997. FEBS Lett 414(1): 105-110; Kuwasaki et al. 1999. Ann. Clin. Biochem. 36: 622-628; Tsuruda et al. 2001 Life Sci. 69(2): 239-245 and EP-A2 0 622 458も参照のこと)。さらに、循環の中や他の体液の中で測定することのできるADMの濃度は、多くの病的状態では、健常な対照対象で見られる濃度よりも有意に大きいことが見いだされている。したがって、うっ血性心不全、心筋梗塞、腎臓疾患、高血圧異常、糖尿病を患っている患者や、ショックの急性段階、敗血症、敗血症性ショックにおけるADMのレベルは、程度が異なるとはいえ有意に上昇している。PAMPの濃度は上記の病的状態のいくつかにおいても上昇しているが、血漿レベルはADMよりも低い(Eto 2001. Peptides 22: 1693-1711)。異常に高濃度のADMが敗血症で観察され、敗血性ショックにおいて最高濃度であることが報告された(Eto 2001. Peptides 22: 1693-1711; Hirata et al. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4): 1449- 1453; Ehlenz et al. 1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105: 156-162; Tomoda et al. 2001. Peptides 22: 1783-1794; Ueda et al. 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med.160: 132-136 and Wang et al. 2001. Peptides 22: 1835-1840)。
ADMの血漿濃度は心不全を患っている患者で上昇しており、疾患の重症度と相関している(Hirayama et al. 1999. J Endocrinol 160: 297-303; Yu et al. 2001. Heart 86: 155-160)。血漿ADMが高いことは、これら対象における独立な陰性の予後インジケータである(Poyner et al. 2002. Pharmacol Rev 54: 233-246)。
WO 2004/097423には、アドレノメデュリンに対する抗体を利用した心血管障害の診断、予後、治療が記載されている。ADM受容体を阻止することによる疾患の治療も本分野で報告されており(例えばWO 2006/027147、PCT/EP2005/012844)、その疾患として、敗血症、敗血症性ショック、心血管疾患、感染症、皮膚疾患、内分泌疾患、代謝疾患、胃腸疾患、がん、炎症、血液疾患、呼吸疾患、筋骨格疾患、神経疾患、泌尿器疾患が可能である。
敗血症の初期段階には、ADMが、心臓機能と、肝臓、脾臓、腎臓、小腸の中での血液供給を改善することが報告されている。抗ADM中和抗体は、敗血症の初期段階の間に上記の効果を中和する(Wang et al. 2001. Peptides 22: 1835-1840)。
他の疾患ではADMを阻止することがある程度有効である可能性がある。しかしADMが全面的に中和されると有害である可能性もある。というのも、いくつかの生理学的機能のためにはある程度の量のADMが必要とされるからである。多くの報告において、ADMの投与がいくつかの疾患に有効である可能性のあることが強調された。それとは逆に別の報告では、ADMは、ある条件で投与されるときには生命を脅かすことが報告された。
WO 2013/072510には、患者の重度の慢性疾患又は急性疾患又は急性状態の治療に非中和抗ADM抗体を用いてその患者が死亡するリスクを低下させることが記載されている。
WO 2013/072511には、臓器機能障害又は臓器不全の予防又は減少を目的として、患者の重度の慢性疾患又は急性疾患又は急性状態の治療に非中和抗ADM抗体を用いることが記載されている。
WO 2013/072512には、血清、血液、血漿の中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2；保持時間の1/2の値)を長くするADM安定化抗体である非中和抗ADM抗体が記載されている。このADM安定化抗体は、ADMの生物活性を阻止して80％未満にする。
WO 2013/072513には、患者の急性の疾患又は状態の治療に用いて循環を安定化させるための非中和抗ADM抗体が記載されている。
WO 2013/072514には、慢性疾患又は急性疾患又は急性状態を患っている患者で体液のバランスを調節するための非中和抗ADM抗体が記載されている。
WO2017/182561には、壊死プロセスに関連する疾患の診断のために患者のサンプル中の総量又は活性DPP3を測定する方法が記載されている。それにはDPP3に対する抗体による壊死関連疾患の治療方法が更に記載されている。
ショックを患っている患者及びショック状態にある患者では、体液サンプル中のDPP3レベルが、抗ADM抗体及び/又は抗ADM抗体フラグメント及び/又は抗ADM非Ig足場を用いた治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化に使用されることは、本発明の驚くべき知見である。そのうえ、本発明の結果は、体液サンプル中のDPP3レベルが閾値を下回っている場合に、ショックを患っている患者が抗ADM抗体を用いた治療法から最も恩恵を受けることを明確に示している。
本発明の主題は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
・前記サンプル中のDPP3レベルが、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を用いた治療が必要であるかどうかを示唆すること、
を含み、及び
ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法である。
抗体の形式の図解 - Fv及びscFv変異体。 抗体の形式の図解 - 異種融合体と二官能性抗体。 抗体の形式の図解 - 二価抗体と二重特異性抗体。 a：ヒトADMの用量-反応曲線。最大cAMP刺激を100％活性化に調整した。 5.63 nMのhADMの存在下におけるヒトADM 22-52(ADM受容体アンタゴニスト)の用量/阻害曲線。 5.63 nMのhADMの存在下におけるCT-Hの用量/阻害曲線。 5.63 nMのhADMの存在下におけるMR-Hの用量/阻害曲線。 5.63 nMのhADMの存在下におけるNT-Hの用量/阻害曲線。 マウスADMの用量-反応曲線。最大cAMP刺激を100％活性化とした。 0.67 nMのmADMの存在下におけるヒトADM 22-52(ADM受容体アンタゴニスト)の用量/阻害曲線。 0.67 nMのmADMの存在下におけるCT-Hの用量/阻害曲線。 0.67 nMのmADMの存在下におけるMR-Hの用量/阻害曲線。 0.67 nMのmADMの存在下におけるNT-Hの用量/阻害曲線。 F(ab)2 NT-MによるADMの阻害を示す。 Fab NT-MによるADMの阻害を示す。 この図面は、典型的なhADM用量/信号曲線と、100μg/mlの抗体NT-Hの存在下におけるhADM用量/信号曲線を示している。 この図面は、NT-H抗体の不在下と存在下におけるヒト血漿(クエン酸)中でのhADMの安定性を示している。 Fabと、相同なヒトフレームワーク配列のアラインメント。 NT-Mを異なる用量で適用してから60日目までの健常なヒト対象におけるADM濃度。 低い(＜40.5ng/mL)及び高い(≧40.5ng/mL)DPP3濃度と関連させた、カプラン-マイヤー生存プロット。(A) DPP3血漿中濃度と関連させた、敗血症を患っている患者の7日生存率。(B) DPP3血漿中濃度と関連させた、心原性ショックを患っている患者の7日生存率。(C) DPP3血漿中濃度と関連させた、敗血症性ショックを患っている患者の7日生存率。 すべての患者に関するカプラン-マイヤー生存プロット(プラセボ(Plac)又はN末端ADM抗体アドレシズマブ(Adz)を用いて治療した患者の14日死亡率)。 DPP3＜50ng/mLを有する患者に関するカプラン-マイヤー生存プロット(プラセボ(Plac)又はN末端ADM抗体アドレシズマブ(Adz)を用いて治療した患者の14日死亡率)。 DPP3＞50ng/mLを有する患者に関するカプラン-マイヤー生存プロット(プラセボ(Plac)又はN末端ADM抗体アドレシズマブ(Adz)を用いて治療した患者の14日死亡率)。
本発明の主題は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
・抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を前記患者に投与すること、ここで、前記測定したDPP3レベルが事前に定めた閾値を下回っている場合、前記患者は前記抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を用いて治療される、
を含み、及び
ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法である。
本願の主題は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
・抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を前記患者に投与すること、
を含み、
ここで、前記測定したDPP3レベルが事前に定めた閾値を下回っている場合、前記患者は治療され、及び
ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法である。
本願の一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記ショックは、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック及び血液分布異常性ショックを含む群から選択され、特に心原性ショック又は敗血症性ショックである。
本願の好ましい一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで：
・心原性ショックの場合には、前記患者は、急性冠状動脈症候群(例えば、急性心筋梗塞)に罹患している可能性があるか、又は前記患者は、心不全(例えば、急性非代償性心不全)、心筋炎、不整脈、心筋症、心臓弁膜症、急性大動脈弁狭窄症を伴った大動脈解離、外傷性腱索断裂又は広範肺塞栓症を患っているか、或いは
・循環血液量減少性ショックの場合には、前記患者は、胃腸出血、外傷、血管性病因(例えば、腹部大動脈瘤破裂、主要な血管内への腫瘍浸潤)及び抗凝血物質使用中の特発出血を含めた出血性疾患、又は嘔吐、下痢、腎臓からの喪失、皮膚からの喪失/不感性の喪失(例えば、熱傷、熱中症)、若しくは膵炎、肝硬変、腸閉塞及び外傷中のサードスペースへの喪失を含めた非出血性疾患に罹患している可能性があるか、或いは
・血管閉塞性ショックの場合には、前記患者は、心タンポナーデ、緊張性気胸、肺塞栓症又は大動脈弁狭窄症に罹患している可能性があるか、或いは
・血液分布異常性ショックの場合には、前記患者は、敗血症性ショック、神経原性ショック、アナフィラキシーショック又は副腎クリーゼによるショックを患っている可能性がある。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記対象の体液サンプル中の前記事前に定めたDPP3の閾値は20～120ng/mLであり、より好ましい前記閾値は30～80ng/mLであり、より一層好ましい前記閾値は40～60ng/mLであり、最も好ましい前記閾値は50ng/mLである。
本願の別の具体的な実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3タンパク質のレベル及び/又は活性DPP3のレベルのいずれかが測定され、そして、事前に定めた閾値と比較される。
本願の別の好ましい実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される。
本願の一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダは、抗体、抗体フラグメント、又は非IgG足場を含む群から選択され得る。
本願の更なる実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、ここで、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダは抗体である。
本願の一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、ここで、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダが表面に固定される。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、ここで、前記分離ステップは、捕捉されているDPP3から前記捕捉バインダに結合していないサンプルの構成要素を取り除く洗浄ステップである。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記対象の体液サンプル中のDPP3活性を測定する方法は、以下のステップ：
・前記サンプルを、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させ、
・前記捕捉バインダに結合しているDPP3を分離し、
・前記分離したDPP3にDPP3の基質を加え、
・DPP3の基質の変換を計測し、定量化することにより前記DPP3活性を定量化すること、
を含む。
本願の別の具体的な実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、及びここで、DPP3基質変換は、以下の：蛍光発生基質(例えば、Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに連結された基質の発光(Promega Protease-Glo(商標) Assay)、質量スペクトロメトリー、HPLC/FPLC(逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー)、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、活性染色後のゲル電気泳動(固定された、活性DPP3)又はウエスタンブロット法(切断産物)、を含む群から選択される方法によって検出される。
本願の別の好ましい実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、及びここで、前記基質は：アンギオテンシンII、III及びIV、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1及び2、バロルフィン、β-カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH及びMSH、又はフルオロフォア、発色団若しくはアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドはArg-Argである。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、及びここで、前記基質は：フルオロフォア、発色団又はアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドはArg-Argである。
本願の一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記患者は、閾値を超えるADM-NH2レベルを有することを更に特徴とする。
本願の具体的な実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記患者の体液サンプル中のADM-NH2の前記閾値は40～100pg/mLであり、より好ましい前記閾値は50～90pg/mLであり、より一層好ましい前記閾値は60～80pg/mLであり、最も好ましい前記閾値は70pg/mLである。
本願の好ましい一実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、ADM-NH2のレベルは、前記体液サンプルをADM-NH2に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記患者の体液サンプルは、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液(CSF)、及び唾液の群から選択される。
本願の別の具体的な実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3のレベルとADM-NH2のレベルは組み合わせて測定される。
本願の別の好ましい実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3のレベルとADM-NH2のレベルは同時に測定される。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、DPP3のレベルとADM-NH2のレベルは、ポイント・オブ・ケア・デバイスを使用して測定される。
本願の別の好ましい実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記ポイント・オブ・ケア・デバイスは、マイクロ流体デバイスである。
本明細書中に使用される場合、マイクロ流体デバイスとは、並列に接続され、かつ、別々の駆動源を使用することなく、その中に定量の流体が効率的に分配され得る、異なった位置に配置された複数のチャンバーを有し、ここで、前記デバイスは、回転中心を有するプラットフォームを含み、かつ、少なくとも1つのマイクロ流体構造を含む。マイクロ流体デバイスは、少量の流体を操作することによって生物学的又は化学的反応を実施するために使用される。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場は、ADMのN末端末端(第1アミノ酸)を認識し、結合する。
本願の更なる実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場は、ADMの第43～52配列アミノ酸を有するADMのC末端の一部：PRSKISPQGY-NH2(配列番号24)には結合しない。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記抗体又はフラグメントは、ADM若しくはその抗体フラグメントに結合するモノクローナル抗体若しくはフラグメントであり、ここで、その重鎖は、以下の配列：
CDR1：配列番号1
GYTFSRYW
CDR2：配列番号2
ILPGSGST
CDR3：配列番号3
TEGYEYDGFDY
を含み、かつ、ここで、その軽鎖は、以下の配列：
CDR1：配列番号4
QSIVYSNGNTY
CDR2：
RVS
CDR3：配列番号5
FQGSHIPYT
を含む。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記抗体又はフラグメントは、VH領域として以下の：
配列番号6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号8(AM-VH2E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号9(AM-VH3-T26E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号10(AM-VH4-T26E40E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
を含む群から選択される配列を含み、かつ、VL領域として以下の配列：
配列番号11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む群から選択される配列を含む。
本願の別の実施形態は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法に関し、ここで、前記抗体又はフラグメントは、重鎖として以下の配列：
配列番号32
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
又はそれと＞95%同一である配列を含み、かつ、軽鎖として以下の配列：
配列番号33
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
又はそれと＞95%同一である配列を含む。
本発明の一実施形態において、DPP3タンパク質のレベル及び/又は活性DPP3のレベルのいずれかが、測定され、そして、閾値レベルと比較される。
本発明の具体的な実施形態において、前記患者の体液サンプル中のDPP3の閾値は20～120ng/mLであり、より好ましい前記閾値は30～80ng/mLであり、より一層好ましい前記閾値は40～60ng/mLであり、最も好ましい前記閾値は50ng/mLである。
本発明の具体的な実施形態において、DPP3のレベルの閾値は、正常健常集団の濃度の中央値の5倍であり、好ましくは濃度の中央値の4倍であり、より好ましくは濃度の中央値の3倍、最も好ましいものは濃度の中央値の2倍である。
前記対象の体液サンプル中のDPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性としてのDPP3のレベルは、様々な方法、例えば、免疫学的アッセイ、活性アッセイ、質量分光学法など、によって測定され得る。
DPP3活性は、DPP3特異的基質の切断産物を検出することによって測定できる。既知のペプチドホルモン基質に含まれるのは、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1と2、バロルフィン、β-カソモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH(副腎皮質刺激ホルモン)、及びMSH(メラニン細胞刺激ホルモン；Abramic et al. 2000, Barsun et al. 2007, Dhanda et al. 2008)である。言及したペプチドホルモンの切断のほか、タグなしの他のオリゴペプチド(例えばAla-Ala-Ala-Ala、Dhanda et al. 2008)の切断は、それぞれの切断産物を検出することによってモニターすることができる。検出法の非限定的な例に含まれるのは、HPLC分析(例えばLee & Snyder 1982)、質量分析(例えばAbramic et al. 2000)、H1-NMR分析(例えばVandenberg et al. 1985)、キャピラリーゾーン電気泳動(CE；例えばBarsun et al. 2007)、薄層クロマトグラフィー(例えばDhanda et al. 2008)、又は逆相クロマトグラフィー(例えばMazocco et al. 2006)である。
DPP3による蛍光基質の加水分解に起因する蛍光の検出は、DPP3活性をモニターするための標準的な手続きである。これらの基質は、蛍光団にカップルする特別なジペプチド又はトリペプチド(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)である。蛍光団の非限定的な例に含まれるのは、β-ナフチルアミド(2-ナフチルアミド、βNA、2NA)、4-メトキシ-β-ナフチルアミド(4-メトキシ-2-ナフチルアミド)、及び7-アミド-4-メチルクマリン(AMC、MCA；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999)である。これら蛍光基質が切断されると蛍光性のβ-ナフチルアミド又は7-アミド-4-メチルクマリンがそれぞれ放出される。液相アッセイ又はECAでは、基質とDPP3を例えば96ウェルのプレートの形式でインキュベートし、蛍光検出器を用いて蛍光を測定する(Ellis & Nuenke 1967)。それに加え、DPP3を含むサンプルをゲルの表面に固定化して電気泳動によって分割し、蛍光基質(例えばArg-Arg-βNA)とFast Garnet GBCを用いてゲルを染色し、蛍光タンパク質のバンドを蛍光リーダーによって検出することができる(Ohkubo et al. 1999)。同じペプチド(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)を発色団(p-ニトロアニリド二酢酸など)とカップリングさせることができる。発色基質の加水分解に起因する色変化の検出を利用してDPP3活性をモニターすることができる。
DPP3活性を検出するための別の選択肢は、(Promegaから市販されている)Protease-Glo(商標)アッセイである。前記方法のこの実施形態において、DPP3特異的なジペプチド又はトリペプチド(Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe)をアミノルシフェリンにカップルさせる。DPP3によって切断されるとアミノルシフェリンが放出されて、結合したルシフェラーゼが反応するための基質として機能し、検出可能なルミネセンスを放出する。
好ましい一実施形態において、DPP3活性は、蛍光基質Arg-Arg-βNAを添加し、蛍光をリアルタイムでモニターすることによって測定される。
対象の体液サンプル中の活性なDPP3を求める前記方法の特別な一実施形態において、DPP3と反応する前記捕捉バインダが固相の表面に固定化される。
試験サンプルを動かないバインダの上を通過させると、DPP3が存在している場合にはバインダに結合し、DPP3そのものが固定化されて検出される。そこで基質を添加すると反応生成物を検出することができ、その反応生成物が、試験サンプルの中にDPP3が存在すること、又はDPP3の量を示している。本明細書の目的では、「固相」という用語に、内部又は表面でアッセイを実施することができる任意の材料又は容器を含めることができ、その非限定的な例に含まれるのは、多孔性材料、無孔性材料、試験管、ウェル、スライド、アガロース樹脂(例えばGE Healthcare Life Sciences製のSepharose)、磁性粒子(particals)(例えばThermo Fisher Scientific製のDynabeads(商標)又はPierce(商標)という磁性ビーズ)などである。
本発明の別の実施形態において、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される。
本発明の別の好ましい実施形態において、DPP3のレベルを測定するための前記捕捉バインダは、抗体、抗体フラグメント又は非IgG足場の群から選択され得る。
本発明の具体的な実施形態において、前記捕捉バインダは抗体である。
前記対象の体液サンプル中のDPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、例えば以下の方法のうちの1つによって求めることができる。
1. DPP3タンパク質の濃度を定量するための蛍光イムノアッセイ(LIA)( Rehfeld et al., 2019 JALM 3(6): 943-953)
LIAは、固相として高結合ポリスチレン微量滴定プレートを用いる単ステップ化学発光サンドイッチイムノアッセイである。これらのプレートをモノクローナル抗DPP3抗体AK2555(捕捉抗体)で覆う。トレーサーである抗DPP3抗体AK2553は、MA70-アクリジニウム-NHSエステルで標識してウェル1つにつき20 ngの濃度で使用する。20μlのサンプル(例えば患者の血液に由来する血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿、又はEDTA-血漿)と較正物質を、被覆された白色の微量滴定プレートにピペットで入れる。トレーサー抗体AK2553を添加した後、微量滴定プレートを室温にて600 rpmで3時間インキュベートする。その後、結合しなかったトレーサーを4回の洗浄ステップ(ウエル1つにつき350μl)によって除去する。微量滴定プレート発光測定装置を使用し、残留している化学発光をウェルごとに1秒間測定する。DPP3の濃度を、6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で測定することが好ましい。
2. DPP3活性を定量するための酵素捕捉活性アッセイ(ECA)( Rehfeld et al., 2019 JALM 3(6): 943-953)
ECAは、固相として黒色の高結合ポリスチレン微量滴定プレートを用いるDPP3特異的活性アッセイである。これらのプレートをモノクローナル抗DPP3抗体AK2555(捕捉抗体)で覆う。20μlのサンプル(例えば患者の血液に由来する血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿、EDTA-血漿、脳脊髄液、及び尿)と較正物質を、被覆された黒色の微量滴定プレートにピペットで入れる。アッセイバッファ(200μl)を添加した後、微量滴定プレートを22℃にて600 rpmで2時間インキュベートする。サンプル中に存在するDPP3を捕捉抗体に結合させることによって固定化する。サンプル中の結合しなかった成分を4回の洗浄ステップ(ウエル1つにつき350μl)によって除去する。反応バッファーに蛍光基質Arg-Arg-β-ナフチルアミド(Arg2-βNA)を添加した後、37℃で1時間インキュベートすることにより、固定化されたDPP3の比活性を測定する。DPP3はArg2-βNAを特異的に切断してArg-Argジペプチドと蛍光性β-ナフチルアミンにする。蛍光は、蛍光光度計を励起波長340 nmで用い、発光を410 nmで検出することによって測定する。DPP3の活性を、6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で測定することが好ましい。
3. DPP3の活性を定量するための液相アッセイ(LAA)(Jones et al., Analytical Biochemistry, 1982から改変)
LAAは、黒色の非結合ポリスチレン微量滴定プレートを用いてDPP3活性を測定する液相アッセイである。20μlのサンプル(例えば血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿)と較正物質を、被覆された黒色の非結合微量滴定プレートにピペットで入れる。蛍光基質Arg2-βNAをアッセイバッファ(200μl)に添加した後、初期βNA蛍光(T＝0)を、蛍光光度計を励起波長340 nmで用い、発光を410 nmで検出することによって測定する。その後、プレートを37℃で1時間インキュベートする。最終的な蛍光(T＝60)を測定する。初期の蛍光と最終的な蛍光の差を計算する。DPP3の活性を、6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で測定することが好ましい。
具体的な実施形態において、アッセイは、DPP3のレベルを測定するために使用され、ここで、前記アッセイのアッセイ感度は、健常対象のDPP3を定量化でき、かつ、＜20ng/ml、好ましくは＜30ng/ml、より好ましくは＜40ng/mlである。
具体的な実施形態において、前記バインダは、少なくとも107M-1のDPP3に対する結合親和性を示し、好ましい親和性は108M-1であり、より好ましい親和性は109M-1超であり、最も好ましい親和性は1010M-1超である。当業者は、より高い用量の化合物を適用することによってより低い親和性を補うので、この測定が本発明の範囲外に至らないであろうと判断されることを知っている。
本発明の別の実施形態において、前記体液サンプルは、全血、血漿、及び血清の群から選択される。
成熟ADM、bio-ADM及びADM-NH2は、本出願中を通じて同義的に使用され、かつ、配列番号20による分子である。
本発明による体液は、特定の一実施形態において、血液サンプルである。血液サンプルは、全血、血清及び血漿を含む群から選択され得る。その方法の具体的な実施形態において、前記サンプルは、ヒトクエン酸血漿、ヘパリン血漿及びEDTA血漿を含む群から選択される。
具体的な実施形態において、アッセイは、ADM-NH2のレベルを測定するために使用され、ここで、前記アッセイのアッセイ感度は、健常対象の成熟ADM-NH2を定量化でき、かつ、＜70pg/ml、好ましくは＜40pg/ml、及びより好ましくは＜10pg/mlである。
本発明の具体的な実施形態において、ADM-NH2の閾値は40～100pg/mLであり、より好ましい閾値は50～90pg/mLであり、より一層好ましい閾値は60～80であり、70pg/mlの最も好ましい閾値が適用される。
本発明の具体的な実施形態において、血漿ADM-NH2の閾値は、正常健常集団の濃度の中央値の5倍、好ましくは濃度の中央値の4倍、より好ましくは濃度の中央値の3倍、最も好ましくは濃度の中央値の2倍である。
具体的な実施形態において、バインダは、ADM-NH2に対して少なくとも107 M-1、好ましくは108 M-1の結合親和性を示し、好ましい親和性は、109 M-1超、最も好ましくは1010 M-1超である。当業者は、より多い用量の化合物を適用することによってより小さな親和性が補償されると見なせることと、この測定が本発明の範囲を外れることなないと考えられることを知っている。
アドレノメデュリンに対する抗体の親和性を求めるため、固定化された抗体に対するアドレノメデュリンの結合速度を、Biacore 2000システム(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)を利用して標識なしの表面プラズモン共鳴によって求めた。高密度でCM5センサー表面に共有結合した抗マウスFc抗体(マウス抗体捕捉キット；GE Healthcare)を製造者の指示に従って用いて抗体を可逆的に固定化した(Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1): 165-173)。
具体的な実施形態において、バインダは、ADM-NH2に結合する抗体、又は抗体フラグメント、又は非Ig足場を含む群から選択される。
具体的な実施形態において、アッセイを利用して、ADM-NH2のレベルを測定するために使用され、ここで、斯かるアッセイは、サンドイッチアッセイ、好ましくは完全自動化アッセイである。
一実施形態において、バイオマーカー(DPP3及び/又はADM-NH2)のレベルを測定するための斯かるアッセイは、任意の種類の検出技術(その非限定的な例に含まれるのは、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識である)を利用したサンドイッチイムノアッセイであり、完全自動化アッセイが好ましい。診断法の一実施形態において、斯かるアッセイは、酵素で標識したサンドイッチアッセイである。自動化アッセイ又は完全自動化アッセイの例に含まれるのは、Roche Elecsys（登録商標）、Abbott Architect（登録商標）、Siemens Centauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、BiomerieuxVidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）というシステムのうちの1つで利用できるアッセイである。
多彩なイムノアッセイが知られており、本発明のアッセイと方法で利用することができる。イムノアッセイに含まれるのは：質量分析法(MS)、発光イムノアッセイ(LIA)、ラジオイムノアッセイ(「RIA」)、ホモジニアス酵素多重化イムノアッセイ(「EMIT」)、酵素結合免疫吸着アッセイ(「ELISA」)、アポ酵素再活性化イムノアッセイ(「ARIS」)、発光に基づくビーズアレイ、磁性ビーズに基づくアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速なアッセイ形式、例えば、ディップスティックイムノアッセイ、免疫クロマトグラフィストリップ試験、レアクリプテートアッセイ、及び自動化されたシステム/分析装置など、である。
本発明の一実施形態において、このようなアッセイは、任意の種類の検出技術(その非限定的な例に含まれるのは、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識である)を利用したサンドイッチイムノアッセイであり、完全に自動化されたアッセイであることが好ましい。本発明の一実施形態において、このようなアッセイは、酵素で標識されたサンドイッチアッセイである。自動化されたアッセイ、又は完全に自動化されたアッセイの例に含まれるのは、以下のシステム、すなわちRoche Elecsys（登録商標）、Abbott Architect（登録商標）、Siemens Centauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、Biomerieux Vidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）の1つのために利用できるアッセイである。
本発明の一実施形態において、そのアッセイとして、いわゆるPOC(ポイント・オブ・ケア)アッセイが可能である。これは、完全に自動化されたアッセイシステムの必要がなく、患者の近くで1時間以内にアッセイを実施することを可能にするアッセイ技術である。この技術の一例は、免疫クロマトグラフィアッセイ技術、例えば、マイクロ流体デバイス、である。
好ましい一実施形態において、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
アッセイとして、ホモジニアスアッセイ又はヘテロジニアスアッセイ、競合アッセイと非競合アッセイが可能である。一実施形態において、アッセイは、非競合イムノアッセイであるサンドイッチアッセイの形式であり、検出される分子及び/又は定量される分子が第1の抗体と第2の抗体に結合する。第1の抗体は固相(例えばビーズ、ウェル又は他の容器の表面、チップ、又はストリップ)に結合することができ、第2の抗体は、例えば染料で、放射性同位体、又は反応性又は触媒性活性部分で標識された抗体である。その後、分析物に結合する標識された抗体の量を適切な方法で測定する。「サンドイッチアッセイ」に関係する一般的な構成と手続きは明確にされており、当業者に知られている(The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb;10(1):4-10. PMID: 16376134)。
別の一実施形態において、アッセイは2つの捕捉分子(抗体であることが好ましい)を含んでおり、その両方とも液体反応混合物の中に分散液として存在する。この混合物の中では、第1の標識成分は、蛍光-又は化学発光-クエンチング又は増幅に基づく標識システムの一部であって第1の捕捉分子に付着し、前記標識システムの第2の標識成分は、第2の捕捉分子に付着するため、両方の捕捉分子が分析物に結合したときに測定可能な信号が発生することで、サンプルを含む溶液の中に形成されたサンドイッチ複合体の検出が可能になる。
別の一実施形態において、前記標識システムは、希土類クリプテート又は希土類キレートを蛍光染料又は化学発光染料、特にシアニンタイプの染料と組み合わせて含んでいる。
本発明の文脈では、蛍光に基づくアッセイは染料の使用を含んでおり、染料は、FAM(5-カルボキシフルオレセイン又は6-カルボキシフルオレセイン)、VIC、NED、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)、IRD-700/800、シアニン染料(CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7など)、キサンテン、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、TET、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトジフルオレセイン(JOE)、N,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、5-カルボキシローダミン-6G(R6G5)、6-カルボキシローダミン-6G(RG6)、ローダミン、ローダミン・グリーン、ローダミン・レッド、ローダミン110、BODIPY染料(BODIPY TMRなど)、オレゴン・グリーン、クマリン(ウンベリフェロンなど)、ベンズイミド(Hoechst 33258など)；フェナントリジン(Texas Redなど)、Yakima Yellow、Alexa Fluor、PET、臭化エチジウム、アクリジニウム染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、ポリメチン染料などを含む群から例えば選択することができる。
本発明の文脈では、化学発光に基づくアッセイは、物理的な原理に基づいて染料を使用することを含んでいる。化学発光材料に関する物理的な原理ついては、Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p. 518-562に記載されている(551～562ページの引用を含め、参照によって本明細書に援用される)。好ましい化学発光染料はアクリジニウムエステルである。
本明細書では、「アッセイ」又は「診断アッセイ」として、診断の分野で利用される任意のタイプのものが可能である。このようなアッセイは、検出される分析物が1つ以上の捕捉プローブに所定の親和性で結合することに基づくことができる。捕捉分子と標的分子又は興味ある分子の間の相互作用に関し、親和定数は108 M-1よりも大きいことが好ましい。
具体的な実施形態において、前記2種類のバインダのうちの少なくとも1つは、検出されるように標識される。
本発明のADM-NH2レベルは、記載の、ADM-NH2アッセイ(Weber et al. 2017. JALM 2(2):1-4)を用いて測定された。本発明のDPP3レベルは、実施例に概説されている記載の、DPP3アッセイを用いて測定した(Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953)。上記閾値は、本発明で利用するアッセイ系とは異なるやり方で較正されているのであれば、他のアッセイでは異なる可能性がある。したがって上記のカットオフ値は、較正の違いを考慮して、そのように異なるやり方で較正されたアッセイに合わせて適用することになる。較正の差を定量する1つの可能性は、問題のアッセイと本発明で利用するそれぞれのバイオマーカーアッセイの方法比較分析(相関)を、両方の方法で用いるサンプル中の各バイオマーカー(例えば、bio-ADM、DPP3)を測定することによって実施するというものである。別の1つの可能性は、問題のアッセイ(この試験が十分な分析感度を持つと仮定する)を利用してそれぞれの正常な集団のバイオマーカーレベルの中央値を求め、結果を文献に記載されているバイオマーカーレベルの中央値と比較し、この比較によって得られた差に基づき較正値を再計算するというものである。本発明で利用する較正値を用い、正常(健康)な対象からのサンプルを測定したところ：血漿bio-ADMの中央値(成熟ADM-NH2)は24.7pg/ml、最低値11pg/ml及び99パーセンタイル43pg/mlであった(Marino et al. 2014. Critical Care 18:R34)。本発明に使用される較正では、5,400の正常な(健常な)対象(スウェーデンの単一施設における候補集団ベースの試験(MPP-RES))からのサンプルが計測された：血漿DPP3の中央値(四分位範囲)は14.5ng/ml(11.3ng/ml～19ng/ml)であった。
本明細書中に使用される場合、「治療法ガイダンス」という用語は、1若しくは複数のバイオマーカー、臨床パラメータ及び/又は臨床スコアの値に基づく特定の治療法又は医学的介入の適用を指す。
「治療法モニタリング」という用語は、本発明との関連において、例えば、治療法の有効性のフィードバックを得ることによる、前記患者の治療的処置のモニタリング及び/又は調節を指す。
「治療法層別化」という用語は、特に、患者を、例えば、それらの分類法により治療的処置を受けるか、又は受けない治療集団などの様々な群にグループ分け又は分類することに関する。
本発明の方法の特定の利点は、ショックを患っている患者又はショック状態にある患者が、必要な治療法に関して層別化される点であり、ここで、前記治療法は、ADMのN末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場の投与である。層別化された患者群は、治療開始が必要とされる患者と治療開始を必要としない患者を含み得る。
本発明の別の特定の利点は、その方法が、前記治療法の利益を得そうにない患者と、前記治療法の利益をより得そうな患者とを区別する点である。
好ましい実施形態において、治療は、サンプル中のDPP3及び/又はADM-NH2のレベルを示すサンプル分析の結果の提供によりすぐに開始されるか又は変更される。更なる実施形態において、治療は、サンプル分析の結果を受けた12時間以内、好ましくは6、4、2、1、0.5、0.25時間又はその直後に開始され得る。
いくつかの実施形態において、その方法は、治療法をガイド、モニター及び/又は層別化するために、実質的に同じ時点で得られた単一のサンプル及び/又は複数のサンプルにおいて患者からのサンプル中のDPP3及び/又はADM-NH2の単回及び/又は複数回の計測を含むか又はそれらから成り、ここで、前記治療法は、ADMのN末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場の投与である。
本発明の方法との関連においてADM-NH2のレベルとして同じサンプル中のDPP3のレベルを測定することが特に望ましい。この実施形態において、バイオマーカーDPP3とADM-NH2の両方が、同時に複数のアッセイ形式で、又は様々な時点で複数のアッセイ形式若しくは単一のアッセイ形式で、同じサンプルにおいて測定され得る。複数回のアッセイは、両方のマーカーを測定するための二連のアッセイであり得、ここで、該アッセイは、患者が直面したその場所でサンプル分離直後に実施され得るポイント・オブ・ケアアッセイであってもよい。
本発明は更に、患者からのサンプル中のDPP3のレベルを測定するため、及び更にADM-NH2のレベルを測定するための検出試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
それもまた、例えば、救急診療部又は初期治療部などの患者が医療関係者に遭遇する場所で直接実施され得るポイント・オブ・ケアアッセイとして好ましくは決定されてもよい。そのうえ、DPP3及び更にADM-NH2の検出のためのアッセイは、単回アッセイ、好ましくは二連のアッセイ、及び/又は自動化又は半自動化されたポイント・オブ・ケアアッセイであってもよい。
好ましい実施形態において、本発明は、患者からのサンプル中のDPP3のレベルを測定するため、そして更にADM-NH2及び任意選択で更なるバイオマーカーのレベルを測定するための方法及びキットに関する。
前記更なるバイオマーカーは、プロカルシトニン(PCT)、C反応性タンパク質(CRP)、乳酸を含む群から選択され得る。
本発明は更に、患者からのサンプル中のDPP3を測定するため、及び更にADM-NH2のレベルを測定するための検出試薬、並びに20～120ng/mL、より好ましくは30～80ng/mL、より一層好ましくは40～60ng/mL、最も好ましくは50ng/mLの前記サンプル中のDPP3のレベルに対応する、基準及び/又は閾値レベルなどの基準データを含む、本発明の方法を実施するためのキットに関し、ここで、前記基準データは、好ましくはコンピューター可読媒体に保存され、及び/又は測定したDPP3及び更にADM-NH2のレベルを前記基準データと比較するために構成されたコンピューター実行可能コードの形態で利用される。
本明細書中に記載した方法の一実施形態において、その方法は、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者の測定したDPP3及び更にADM-NH2のレベルを、基準及び/又は閾値レベルと比較することを更に含み、ここで、前記比較は、コンピューター実行可能コードを使用してコンピュータープロセッサで実施される。
本発明の方法は、コンピューターによって一部実装され得る。例えば、基準及び/又は閾値レベルと、マーカー、例えば、DPP3及び/又はADM-NH2の検出されたレベルを比較するステップは、コンピュータシステムによって実施され得る。例えば、測定された値は、(医療従事者によって手作業によるか、又は(単数若しくは複数の)それぞれのマーカーレベルを測定したデバイスから自動的に)コンピュータシステムに入力されてもよい。コンピュータシステムは、臨床現場(例えば、初期治療部又はED)のその場にあるか、又はそれはコンピュータネットワークを介して(例えば、インターネット、又は任意選択で病院情報システム(HIS)などの他のITシステム又はプラットフォームと接続可能な専門化された医療用クラウドシステムを介して)接続された遠隔地にある。或いは又は加えて、関連治療法ガイダンス及び/又は治療法層別化が、使用者 (典型的には、医師などの医療従事者)のために提示及び/又は印刷される。
本発明の具体的な実施形態において、前記ショックは、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック、及び血液分布異常性ショックを含む群から選択される。
本発明の別の具体的な実施形態において、前記ショックは、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック及び血液分布異常性ショックを含む群から選択され、特に心臓性又は敗血症性ショックである。
本発明の具体的な実施形態において、前記ショックは、以下の：
・心原性ショックの場合には、前記患者は、急性冠状動脈症候群(例えば、急性心筋梗塞)に罹患しているか、又は心不全(例えば、急性非代償性心不全)、心筋炎、不整脈、心筋症、心臓弁膜症、急性大動脈弁狭窄症を伴った大動脈解離、外傷性腱索断裂又は広範肺塞栓症を患っているか、或いは
・循環血液量減少性ショックの場合には、前記患者は、胃腸出血、外傷、血管性病因(例えば、腹部大動脈瘤破裂、主要な血管内への腫瘍浸潤)及び抗凝血物質使用中の特発出血を含めた出血性疾患、又は嘔吐、下痢、腎臓からの喪失、皮膚からの喪失/不感性の喪失(例えば、熱傷、熱中症)、若しくは膵炎、肝硬変、腸閉塞及び外傷中のサードスペースへの喪失を含めた非出血性疾患に罹患している可能性があるか、或いは
・血管閉塞性ショックの場合には、前記患者は、心タンポナーデ、緊張性気胸、肺塞栓症又は大動脈弁狭窄症に罹患している可能性があるか、或いは
・血液分布異常性ショックの場合には、前記患者は、敗血症性ショック、神経原性ショック、アナフィラキシーショック又は副腎クリーゼによるショックを患っている、
を含む群から選択される。
ショックは、酸素供給の減少及び/又は酸素消費の増加、又は不十分な酸素利用によって細胞と組織が低酸素症になることを特徴とする。ショックは循環不全の致命的な状態であり、最も一般的には低血圧(収縮期血圧が90 mm Hg未満、又はMAPが65 mmHg未満)として現われる。ショックは、背後にある原因に基づき、血液量減少性、心原性、血管閉塞性、及び血液分布異常性という4つのタイプに分けられる(Vincent and De Backer 2014. N. Engl. J. Med. 370(6): 583)。
血液量減少性ショックは血管内体積の減少を特徴としており、2つの広いサブタイプに分けることができる。すなわち出血性と非出血性である。出血性血液量減少性ショックの一般的な原因には、胃腸出血、外傷、血管性病因(例えば破裂性腹部大動脈瘤、主要な血管への腫瘍の浸潤)、及び抗凝固剤の使用という設定における自発的出血が含まれる。非出血性血液量減少性ショックの一般的な原因には、嘔吐、下痢、腎臓からの喪失、皮膚からの喪失/不感性の喪失(例えば熱傷、熱射病)、又は膵臓炎、肝硬変、腸閉塞、外傷の設定における間質への喪失が含まれる。概説に関しては、Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls［インターネット］、Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27を参照のこと。
心原性ショック(CS)は、心拍出量の低下が原因の危機的な末端器官低灌流状態と定義される。特に、CSは軽度の低灌流から重大なショックにわたるスペクトルを形成する。CSの診断に関して確立されている基準は、(i)収縮期血圧が30分超にわたって≦90 mmHgであるか、90 mmHg以上の血圧を実現するのに昇圧剤を必要とする；(ii)肺鬱血、又は左心室充満圧の上昇；(iii)臓器灌流が損なわれている徴候があり、以下の基準、すなわち(a)変化した精神状態；(b)冷たくてベトベトした皮膚；(c)乏尿(＜0.5mL/kg/時又は＜30ml/時)；(d)血清乳酸塩の増加のうちの少なくとも1つを伴う(Reynolds and Hochman 2008. Circulation 117: 686-697)というものである。急性心筋梗塞(AMI)とその後の心室機能不全はCSの最も多い原因であり、原因の約80％を説明する。機械的合併症(心室中隔(4％)や自由壁破裂(2％)など)と急性重症僧帽弁逆流(7％)は、AMIの後のCSの原因である頻度はより少ない(Hochman et al. 2000. J Am Coll Cardiol 36: 1063-1070)。非AMI関連CSは、非代償性心臓弁膜症、急性心筋症、不整脈などによって起こる可能性があり、複合的な治療の選択肢がある。これは、米国において年間40 000～50 000人の患者及び欧州において60 000～70 000人の患者につながる。その後の死亡率の低下を伴う、早期血管再生による主な治療における進歩にもかかわらず、CSはAMIにおける主な死亡原因のままであり、最近のレジストリ及び無作為化試験によりまだ40～50%に達する死亡率がある(Goldberg et al. 2009. Circulation 119: 1211-1219)。
血管閉塞性ショックは、大きな血管又は心臓そのものが物理的に閉塞することによる。いくつかの状態からこの形態のショックが生じる可能性がある(例えば心タンポナーデ、緊張性気胸、肺塞栓症、大動脈弁狭窄症)。概説に関しては、Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls［インターネット］、Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27を参照のこと。
原因に応じて4通りの血液分布異常性ショックが存在している。すなわち神経原性ショック(交感神経刺激が減少して血管緊張が減少する)、アナフィラキシーショック、敗血症性ショック、及び副腎クリーゼによるショックである。血液分布異常性ショックは、敗血症に加え、感染症以外が原因(膵臓炎、熱傷、外傷など)の全身性炎症反応症候群(SIRS)によって起こる可能性がある。それ以外の原因に含まれるのは、毒素性ショック症候群(TSS)、アナフィラキシー(突然の重症アレルギー反応)、副腎不全(慢性副腎不全の急性の悪化、副腎の破壊又は除去、外来性ステロイドに起因する副腎の機能抑制、下垂体機能低下症、及び産生されるホルモンの代謝不全)、薬物又は毒素に対する反応、重金属中毒、肝不全、及び神経系へのダメージである。概説に関しては、Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls［インターネット］、Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27を参照のこと。
難治性ショックは、適切な体積蘇生法にもかかわらず、＞0.5μg/kg/分のノルアドレナリン輸液の要件と定義された。これらの患者の死亡率は、94%くらい高くなる可能性があり、これらの患者の評価及びマネジメントは、生存のためのより攻撃的なアプローチが必要とされる。「難治性ショック」という用語は、組織潅流時に使用され、初期是正措置(例えば、昇圧薬)を用いて復元できず、そのため、「高い昇圧薬依存性」又は「昇圧薬抵抗性」ショックとも称される(Udupa and Shetty 2018. Indian J Respir Care 7: 67-72)。難治性ショックを患っている患者は、低酸素症及び酸血症による、例えば、低血圧(＜65mmHgの動脈圧を意味する)、頻脈、低温末梢、毛細血管再充満時間、及び頻呼吸などの不十分な潅流の特徴を有し得る。発熱病は、敗血症性ショックでも見られる可能性がある。例えば、知覚異常、高乳酸塩血症、及び乏尿などの低潅流の他の兆候もまた見られる可能性がある。これらのよく知られるショックの兆候は、問題がポンプ(心臓)にあるか又は回路(血管及び組織)にあるかを同定するために有用でない。異なったタイプのショックは共存でき、そして、ショックのすべての形態が、高投与量昇圧薬に対する不応答性によって証明される場合、難治性であり得る(Udupa and Shetty 2018. Indian J Respir Care 7: 67-72)。
敗血症性ショックは、臓器の損傷又は感染に応じた損傷である敗血症が危険な低血圧及び細胞代謝の異常につながるときに発生する潜在的に致命的な病状である。敗血症及び敗血症性ショックに関する第三の国際コンセンサス定義(Sepsis-3)は、敗血症性ショックを敗血症のサブセットとして定義し、特に深刻な循環器、細胞、及び代謝の異常は、敗血症のみの場合よりも死亡のリスクが高くなる。敗血症性ショックの患者は、平均動脈圧を65 mm Hg以上に維持するために昇圧剤を必要とし、血液量減少がない場合に血清乳酸値が2mmol/L(＞18mg/dL)を超えることで臨床的に特定できる。この組み合わせは、40％を超える病院死亡率に関連する(Singer et al. 2016. JAMA. 315 (8): 801-10)。一次感染は、最も一般的には細菌によって引き起こされるが、真菌、ウイルス、又は寄生虫によっても引き起こされる可能性がある。体のどの部分にも存在する可能性があるが、最も一般的には、肺、脳、尿路、皮膚、又は腹部の臓器に存在する。多臓器不全症候群(以前は多臓器不全と呼ばれていました)や死亡を引き起こす可能性がある。多くの場合、敗血症性ショックの人々は集中治療室で治療を受ける。彼らの免疫システムは健康な成人の免疫システムほど効果的に感染に対処することができないので、それは最も一般的に子供、免疫不全の個人、そして高齢者に影響を及ぼす。敗血症性ショックによる死亡率は約25～50％である。
本発明の一実施形態において、前記患者は、前記患者の体液サンプルを採取する時点で、ショックを患っている又はショック状態にある重症患者である。
「ショック状態にある患者」とは、前記患者から体液を採取する時点で、ショックを患っていないが、ショックを発症する高いリスクを有する重症患者と定義される。
具体的な実施形態において、前記ショックは、敗血症性ショック又は心原性ショックである。
ADMのN末端に対して標的化された非中和性抗体の有効性は、マウスのCLP誘発敗血症における生存研究で調査された。非中和性抗体を用いた前処理は、低いカテコールアミン注入速度、腎機能障害、及び著しく改善された生存をもたらした(Struck et al. 2013. Intensive Care Med Exp 1(1):22; Wagner et al. 2013. Intensive Care Med Exp 1(1):21)。
これらの肯定的な結果のため、アドレシズマブと称されるN末端抗ADM抗体のヒト化バージョンは、更なる臨床開発のために開発された。血管障壁機能と生存に対するアドレシズマブの有益効果は最近、全身性炎症と敗血症の前臨床モデルで実証された(Geven et al. 2018. Shock 50(6):648-654)。この試験では、アドレシズマブを用いた前処理が、内毒素血症ラットとCLP誘発敗血症を患っているマウスにおいて腎血管の漏洩を低減し、そしてそれが、保護ペプチドAng-1の増強された腎臓発現と有害なペプチドである血管内皮増殖因子の発現減少とを同時に引き起こした。また、アドレシズマブを用いた前処理は、単回に関して10～50%及び反復用量投与に関して0～40%の、マウスのCLP誘発敗血症における7日間生存を改善した。そのうえ、第一相試験では、良好な安全性及び耐容性が実証された(実施例6を参照のこと)：重篤な有害事象は観察されず、アドレシズマブ処理対象でより頻繁に起こる有害事象のシグナルは検出されず、及び他の安全パラメータの関連変化は見られなかった(Geven et al. 2017. Intensive Care Med Exp 5 (Suppl 2): 0427)。特に興味深いのは、提案されたアドレシズマブの作用機序である。動物及びヒトのデータは両方とも、この抗体投与後の循環ADMの強力な用量依存的増大を明らかにする。薬物動力学データとMR-proADM(ADMと同じ前ホルモン由来の不活性なペプチドフラグメント)の増大の不足に基づいて、より高い循環ADMレベルは、産生促進によって説明できない。
この増大の機構上の説明は、ADMが内皮障壁を横切ることができるくらい小さく、それに対して、抗体はそうでないので、循環中の抗体の過剰量が間質から循環にADMを排出し得るという可能性がある(Geven et al. 2018. Shock. 50(2):132-140)。加えて、ADMへの抗体の結合は、ADMの半減期の延長につながる。NT-ADM抗体はADM媒介性シグナル伝達を部分的に阻害するが、循環ADMの大きな増大は、血液コンパートメント中のADM活性の総合的な「正味の量」の増大をもたらし、ここで、それは内皮細胞の有益効果(EC；優性バリア安定化)を発揮するが、その一方で、間質における血管平滑筋細胞に対するADMの有害効果(VSMC；血管拡張応答)は低減された。
明細書中を通して、本発明による「抗体」、「抗体フラグメント」又は「非Ig足場」は、ADMに結合することができ、これにより、ADMに対して向けられて、かつ、これにより、「抗ADM抗体」、「抗ADM抗体フラグメント」、又は「抗ADM非Ig足場」と呼ぶことができる。
「抗体」という用語には一般に、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とその結合フラグメント(特にFcフラグメント)のほか、いわゆる「一本鎖抗体」(Bird et al. 1988)、キメラ抗体、ヒト化抗体(特にCDRがグラフトされた抗体)、及びジボディ又はテトラボディ(Holliger et al. 1993)が含まれる。例えばファージ提示を含む技術を通じて選択されて、サンプルの中に含まれる興味ある分子に特異的に結合する免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。この文脈では、「特異的に結合する」という表現は、興味ある分子又はそのフラグメントに対して生じる抗体を意味する。抗体が特異的であると見なされるのは、興味ある分子又は上記のそのフラグメントに対する親和性が、興味ある分子を含有するサンプルの中に含まれる他の分子に対するよりも好ましくは少なくとも50倍大きい、より好ましくは100倍大きい、最も好ましくは少なくとも1000倍大きい場合である。本分野では、抗体を作製する方法と所定の特異性を持つ抗体を選択する方法は周知である。
さらに、本発明の一実施形態において、抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、単特異性である。
単特異性抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、又は単特異性抗アドレノメデュリン抗体フラグメント、又は単特異性抗ADM非Ig足場とは、その抗体、又は抗体フラグメント、又は非Ig足場が、標的ADMの中にあって少なくとも5個のアミノ酸を含む1つの特定の領域に結合することを意味する。単特異性抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、又は単特異性抗アドレノメデュリン抗体フラグメント、又は単特異性抗ADM非Ig足場は、すべてが同じ抗原に対する親和性を有する抗アドレノメデュリン(ADM)抗体、又は抗アドレノメデュリン抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場である。モノクローナル抗体は単特異性だが、単特異性抗体は、共通の生殖細胞から生成させる以外の手段によって生成させることもできる。
前記のADMに結合する抗ADM抗体又は抗体フラグメント、又はADMに結合する非Ig足場として、ADMに結合する非中和抗ADM抗体又は非中和抗体フラグメント、又はADMに結合する非中和非Ig足場が可能である。
具体的な実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、非中和抗体、又は非中和フラグメント、又は非中和非Ig足場である。中和抗ADM抗体、又は中和抗ADM抗体フラグメント、又は中和抗ADM非Ig足場は、ADMの生物活性をほぼ100％、少なくとも90％超、好ましくは少なくとも95％超阻止すると考えられる。
それとは逆に、非中和抗ADM抗体、又は非中和抗ADM抗体フラグメント、又は非中和抗ADM非Ig足場は、ADMの生物活性を阻止して100％未満に、好ましくは95％未満に、好ましくは90％未満に、好ましくは80％未満に、より一層好ましくは50％未満にする。これは、ADMの生物活性が100％未満に低下すること、95％まで低下すること、90％まで低下すること、80％まで低下すること、50％まで低下することを意味する。これは、非中和抗ADM抗体、又は非中和抗ADM抗体フラグメント、又は非中和抗ADM非Ig足場に結合するADMの残留生物活性が、0％超であること、好ましくは5％超であること、好ましくは10％超であること、より好ましくは20％超であること、より好ましくは50％超であることを意味する。
この文脈では、(a)分子は、「非中和抗ADM活性」を有する抗体、又は抗体フラグメント、又は非Ig足場であり、本明細書では簡単化のためまとめて「非中和」抗ADM抗体、又は「非中和」抗体フラグメント、又は「非中和」非Ig足場と呼び、例えばADMの生物活性を阻止して80％未満にする。この分子の定義は、
- ADMに結合する1個又は複数の分子であって、CRLR(カルシトニン受容体様受容体)とRAMP3(受容体-活性調節タンパク質3)からなる機能的ヒト組み換えADM受容体を発現する真核細胞系の培養物に添加されると、その細胞系によって産生されるcAMPの量を、並行して添加されるヒト合成ADMペプチド(ただし添加されるこのヒト合成ADMペプチドは、分析する非中和抗体が存在していないときに半数で有効なcAMP合成の刺激となる量で添加される)の作用を通じて減らす分子であり、ADMに結合するこの分子によるcAMPの減少の程度は、分析するADMに結合するこの非中和分子が、分析するこの非中和抗体を用いてcAMPの合成を最大限減らすのに必要な量の10倍超の量で添加されるときでさえ、80％を超えることがない。
同じ定義が、95％、90％、50％などの他の範囲にも当てはまる。
本発明の抗体又はフラグメントは、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている1つ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子に含まれるのは、κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)、μ(IgM)の定常領域遺伝子と、莫大な数の免疫グロブリン可変領域遺伝子である。完全長免疫グロブリン軽鎖は、一般に、約25 kD、すなわち長さが214個のアミノ酸である。
完全長免疫グロブリン重鎖は、一般に、約50 kD、すなわち長さが446個のアミノ酸である。軽鎖は、NH2末端にある可変領域遺伝子(長さが約110個のアミノ酸)と、COOH末端にあるκ定常領域遺伝子又はλ定常領域遺伝子によってコードされている。重鎖は、同様に、可変領域遺伝子(長さが約116個のアミノ酸)と、他の定常領域遺伝子のうちの1つによってコードされている。
抗体の基本的な構造単位は、一般に、免疫グロブリン鎖の同じペア2つからなる4量体であり、それぞれのペアは、1本の軽鎖と1本の重鎖を有する。各ペアの中で、軽鎖可変領域と重鎖可変領域は抗原に結合し、定常領域はエフェクタ機能を媒介する。免疫グロブリンは他のさまざまな形態でも存在しており、その例に含まれるのは、例えばFv、Fab、(Fab')2のほか、2機能性ハイブリッド抗体と単鎖である(例えばLanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17:105; Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883; Bird et al. 1988. Science 242:423-426; Hood et al. 1984, Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed.; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323:15-16)。免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の可変領域は、3つの超可変領域(相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる)によって中断されたフレームワーク領域を含んでいる(Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al. 1983, U.S. Department of Health and Human Servicesを参照のこと)。上に指摘したように、CDRは主に抗原のエピトープに結合する役割を担っている。免疫複合体は、抗体(モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体など)又は機能的抗体フラグメントであり、抗原に特異的に結合する。
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作により、異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域遺伝子と定常領域遺伝子から構成された抗体である。例えばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変区画をヒト定常区画(κ、γ1、γ3)に接合することができる。一例では、治療用キメラ抗体はしたがって、マウス抗体からの可変ドメイン又は抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常ドメイン又はエフェクタドメインからなるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種を用いることや、可変領域を分子技術によって作り出すこともできる。キメラ抗体を作製する方法は本分野で周知であり、例えば米国特許第5,807,715号を参照のこと。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト(マウス、ラット、合成物など)免疫グロブリンからの1つ以上のCDRとを含む免疫グロブリンである。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプタ」と呼ばれる。一実施形態において、すべてのCDRが、ヒト化免疫グロブリンの中のドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同じであること、すなわち少なくとも約85～90％、例えば約95％以上が一致していることが必要とされる。したがってヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、おそらくCDRを除いて天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同じである。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンとヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又はヒト化抗体のアクセプタフレームワークには、ドナーフレームワークから取られたアミノ酸による限定された数の置換が含まれていてもよい。ヒト化モノクローナル抗体又はそれ以外のモノクローナル抗体は、抗原への結合や他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を与えない追加の保存的アミノ酸置換を含むことができる。保存的置換の例は、gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；phe、tyrなどである。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作によって構成することができる(例えば米国特許第5,585,089号を参照のこと)。ヒト抗体は、軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子がヒト起源である抗体である。ヒト抗体は、本分野で知られている方法を利用して作製することができる。ヒト抗体は、興味ある抗体を分泌するヒトB細胞の不死化によって作製することができる。不死化は、例えばEBV感染によって、又はヒトB細胞を骨髄腫細胞又はハイブリドーマ細胞と融合してトリオーマ細胞を生み出すことによって実現できる。ヒト抗体は、ファージ提示法(例えばWO 91/17271；WO 92/001047；WO 92/20791を参照のこと)によって作製することや、ヒトコンビナトリアルモノクローナル抗体ライブラリ(MorphoSys社のウェブサイトを参照のこと)から選択することもできる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物を用いて調製することもできる(例えばWO 93/12227；WO 91/10741を参照のこと)。
したがって抗ADM抗体は、本分野で知られている形式を持つことができる。その例は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体である。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、組み換えによって作製した抗体(例えば典型的な完全長免疫グロブリンであるIgG)、又は少なくとも重鎖及び/又は軽鎖のF可変ドメインを含有する抗体フラグメント(例えば化学的にカップルさせた抗体(フラグメント抗原結合)であり、その非限定的な例に含まれるのは、Fabフラグメント(Fabミニボディ、一本鎖Fab抗体、エピトープタグを有する1価Fab抗体(例えばFab-V5Sx2))；CH3ドメインとの2量体になった2価Fab(ミニ抗体)；2価Fab又は多価Fab(例えば異種ドメインの助けを借りて多量体化によって形成されたもの(例えばdHLXドメインの2量体化によるFab- dHLX-FSx2)が含まれる)；F(ab')2フラグメント、scFvフラグメント、多量体化された多価又は/及び多特異性scFvフラグメント、2価及び/又は二重特異性二量体、BITE（登録商標）(二重特異性T細胞エンゲージャ)、3機能性抗体、多価抗体(例えばG以外のクラスからのもの)；単ドメイン抗体(例えばラクダ又は魚の免疫グロブリンに由来するナノボディ)や、多数存在する他の抗体である。
抗ADM抗体に加え、他のバイオポリマー足場が標的分子と複合体を形成することが本分野でよく知られており、高度に標的特異的なバイオポリマーの作製に使用されてきた。その例は、アプタマー、シュピーゲルマー、アンチカリン、コノトキシンである。抗体形式の図解に関しては、図1a、図1b、図1cを参照のこと。
好ましい一実施形態において、抗ADM抗体形式の選択は、Fvフラグメント、scFvフラグメント、Fabフラグメント、scFabフラグメント、F(ab)2フラグメント、scFv-Fc融合タンパク質を含む群からなされる。別の好ましい一実施形態において、抗体形式は、scFabフラグメント、Fabフラグメント、scFvフラグメント、及び生物学的利用能が最適化されたそれらの複合体(例えばPEG化されたフラグメント)を含む群からなされる。最も好ましい形式の1つはscFab形式である。
非Ig足場としてタンパク質足場が可能であり、リガンド又は抗原に結合することができるため抗体模倣体として用いることができる。非Ig足場は、テトラネクチンをベースとした非Ig足場(例えば米国特許出願公開第2010/0028995号に記載)、フィブロネクチン足場(例えばEP 1266025に記載)、リポカインをベースとした非Ig足場(例えばWO 2011/154420に記載)、ユビキチン足場(例えばWO 2011/073214に記載)、トランスフェリン足場(例えば米国特許出願公開第2004/0023334号に記載)、プロテインA足場(例えばEP 2231860に記載)、アンキリン反復をベースとした足場(例えばWO 2010/060748に記載)、ミクロタンパク質(システインノットを形成するミクロタンパク質が好ましい)足場(例えばEP 2314308に記載)、Fyn SH3ドメインをベースとした足場(例えばWO 2011/023685に記載)、EGFR-Aドメインをベースとした足場(例えばWO 2005/040229に記載)、クニッツドメインをベースとした足場(例えばEP 1941867に記載)を含む群から選択され得る。
本発明の一実施形態において、本発明の抗ADM抗体は、実施例1に概略を示したように、抗原としてADMのフラグメントを合成することによって作製することができる。その後、下記の方法又は本分野で知られている他の方法を利用してそのフラグメントに対するバインダを同定する。
マウス抗体のヒト化は、以下の手続きに従って実施することができる：マウス起源の抗体をヒト化するため、抗体配列を分析し、相補性決定領域(CDR)を有するフレームワーク領域(FR)と抗原の構造相互作用を求める。構造モデリングに基づき、ヒト起源の適切なFRを選択し、マウスCDR配列をヒトFRの中に移植する。CDR又はFRのアミノ酸配列のバリエーションを導入することで、FR配列に関して種スイッチによって失われていた構造相互作用を再度獲得することができる。構造相互作用のこの回復は、ファージ提示ライブラリを用いたランダムアプローチによって、又は分子モデリングにガイドされた直接的なアプローチによって実現できる(Almagro and Fransson 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33)。
好ましい一実施形態において、抗ADM抗体形式の選択は、Fvフラグメント、scFvフラグメント、Fabフラグメント、scFabフラグメント、F(ab)2フラグメント、scFv-Fc融合タンパク質を含む群からなされる。別の好ましい一実施形態において、抗体形式の選択は、scFabフラグメント、Fabフラグメント、scFvフラグメントと、生物学的利用能が最適化されたこれらのものの複合体(PEG化されたフラグメントなど)を含む群からなされる。最も好ましい形式の1つはscFab形式である。
別の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、抗ADM抗体フラグメント、抗ADM非Ig足場は、完全長の抗体、抗体フラグメント、非Ig足場のいずれかである。
好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ADMの中に含まれていて長さが少なくとも5個のアミノ酸からなるエピトープに向かい、そのエピトープに結合することができる。
より好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ADMの中に含まれていて長さが少なくとも4個のアミノ酸からなるエピトープに向かい、そのエピトープに結合することができる。
本発明の具体的な実施形態において、アドレノメデュリンに結合する抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント、又はアドレノメデュリンに結合する抗ADM非Ig足場は、患者のショックの治療又は予防に用いるために提供され、ここで、前記抗体又はフラグメント又は足場は、ADM結合タンパク質-1(補体因子H)ではない。
本発明の具体的な実施形態において、アドレノメデュリンに結合する抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント、又はアドレノメデュリンに結合する抗ADM非Ig足場は、患者のショックの治療又は予防に用いるために提供され、ここで、前記抗体又はフラグメント又は足場は、成熟ヒトADMの第1～21アミノ酸の配列：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC 配列番号14、の範囲内にある好ましくは少なくとも4又は少なくとも5アミノ酸の領域に結合する。
本発明の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンのN末端部分(第1～21アミノ酸)の中に位置する領域又はエピトープに結合する。
別の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンの第1～14アミノ酸：YRQSMNNFQGLRSF(配列番号25)、すなわちアドレノメデュリンのN末端部分(第1～14アミノ酸)の中に位置する領域又はエピトープを認識してそこに結合する。
別の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンの第1～10アミノ酸：YRQSMNNFQG (配列番号26)、すなわちアドレノメデュリンのN末端部分(第1～10アミノ酸)の中に位置する領域又はエピトープを認識してそこに結合する。
別の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンの第1～6アミノ酸：YRQSMN(配列番号27)、すなわちアドレノメデュリンのN末端部分(第1～6アミノ酸)の中に位置するADMの領域又はエピトープを認識してそこに結合する。上述のように、この領域又はエピトープは、長さが好ましくは少なくとも4個又は5個のアミノ酸を含んでいる。
別の好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、アドレノメデュリンのN末端(アミノ酸1)を認識してそこに結合する。アドレノメデュリンのN末端(アミノ酸1)は、アミノ酸1、すなわち配列番号20、14、23の「Y」が、抗体の結合のために必須であることを意味する。この抗体又はフラグメント又は足場は、N末端が延長したアドレノメデュリンにも、N末端が改変されたアドレノメデュリンにも、N末端が分解されたアドレノメデュリンにも結合しないと考えられる。これは、別の好ましい一実施形態において、ADMのN末端が自由な状態である場合には、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場が、成熟ADMの配列内の領域にだけ結合することを意味している。この実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、成熟ADMの配列が例えばプロADMの中に含まれている場合には、その配列内の領域に結合しないと考えられる。
明確にするため記載しておくが、「N末端部分(第1～21アミノ酸)」など、ADMの特定の領域に関する括弧の中の数字は、当業者により、ADMのN末端部分が成熟ADM配列の第1～21アミノ酸からなると理解される。
本発明による別の具体的な実施形態において、本明細書に提示する抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ADMのC末端、すなわちADMの第43～52アミノ酸：PRSKISPQGY-NH2(配列番号24)に結合しない。
抗原決定基としても知られているエピトープは、抗体によって特異的に、免疫系によって認識される抗原の一部である。例えば、エピトープは、抗体が結合する抗原の特定のピースである。エピトープに結合する抗体の部分はパラトープと呼ばれる。タンパク質抗原のエピトープは、それらの構造とパラトープとの相互作用に基づいて2つのカテゴリ、配座エピトープ及び直鎖エピトープ、に分けられる。
立体構造及び直鎖エピトープは、エピトープによって採用された3-D構造に基づくパラトープと相互作用し、そしてそれは、関与するエピトープ残基に関する表面特徴と形状又は抗原の他のセグメントの三次構造によって決定される。配座エピトープは、接触しないアミノ酸残基の相互作用によって採用された3-D構造によって形成される。直鎖又は連続エピトープは、アミノ酸のその直線配列又は一次構造によって抗体に認識され、そして、隣接のアミノ酸残基の相互作用によって採用された3-D構造によって形成されるエピトープである。
具体的な実施形態において、本発明の抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場を用いることが好ましく、この抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、血清、血液、血漿の中のADMのレベル又はADMの免疫活性を少なくとも10％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは＞50％、最も好ましくは＞100％増大させる。
具体的な実施形態において、本発明の抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場を用いることが好ましく、この抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、血清、血液、血漿の中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2；半減滞留時間)を少なくとも10％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは＞50％、最も好ましくは＞100％増加させるADM安定化抗体、又はADM安定化抗体フラグメント、又はADM安定化非Ig足場である。
ADMの半減期(半減滞留時間)は、ヒトの血清、血液、血漿の中で、それぞれADM安定化抗体、又はADM安定化抗体フラグメント、又はADM安定化非Ig足場の不在下と存在下にて、ADMを定量するためのイムノアッセイを利用して求めることができる。
以下のステップを実施することができる：
- ヒトクエン酸血漿の中で、ADM安定化抗体又はADM安定化抗体フラグメント又はADM安定化非Ig足場それぞれの不在下と存在下にてADMを希釈し、24℃でインキュベートすることができる。
- 選択した時点(例えば24時間以内)にアリコートを採取して-20℃に冷凍することにより、そのアリコートの中でADMが分解するのを停止させることができる。
- 選択したhADMイムノアッセイが安定化抗体による影響を受けないのであれば、そのアッセイによってADMの量を直接求めることができる。或いは、アリコートを変性剤(HClなど)で処理し、(例えば遠心分離によって)サンプルからゴミを除去した後、pHを中和し、ADMイムノアッセイによってADMを定量することができる。或いは、イムノアッセイではない技術(例えばRP-HPLC)を利用してADMを定量することができる。
- ADM安定化抗体、又はADM安定化抗体フラグメント、又はADM安定化非Ig足場それぞれの不在下と存在下でインキュベートしたADMについて半減期を計算する。
- 安定化されたADM では、ADM安定化抗体、又はADM安定化抗体フラグメント、又はADM安定化非Ig足場の不在下でインキュベートしたADMと比べて半減期が増大することを計算する。
ADMの半減期の2倍の増加は、半減期の100％の増大である。
半減期(半減滞留時間)は、特定の体液又は血液の中で特定の化学物質又は薬の濃度がベースライン濃度の半分に低下する期間と定義される。
血清、血液、血漿の中のアドレノメデュリンの半減期(半減滞留時間)を求めるのに使用できるアッセイは、実施例3に記載してある。
好ましい一実施形態において、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、非中和抗体又は非中和フラグメント又は非中和足場である。中和抗ADM抗体、又は中和抗ADM抗体フラグメント、又は中和抗ADM非Ig足場は、ADMの生物活性をほぼ100％、少なくとも90％超、好ましくは少なくとも95％超阻止すると考えられる。言い換えると、これは、非中和抗ADM抗体、又は非中和抗ADM抗体フラグメント、又は非中和抗ADM非Ig足場が、ADMの生物活性を阻止して100％未満に、好ましくは95％未満に、好ましくは90％未満にすることを意味する。非中和抗ADM抗体、又は非中和抗ADM抗体フラグメント、又は非中和抗ADM非Ig足場がADMの生物活性を阻止して95％未満にする一実施形態において、ADMの生物活性を阻止して95％超にすると考えられる抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、この実施形態の範囲外であると考えられる。これは、一実施形態において、生物活性が95％まで低下すること、好ましくは90％まで低下すること、より好ましくは80％まで低下すること、より好ましくは50％まで低下することを意味する。
本発明の一実施形態において、非中和抗体は、成熟ヒトADMの第1～21アミノ酸の配列(配列番号14)の中の少なくとも5個のアミノ酸の領域に結合する抗体、又は成熟マウスADMの第1～19アミノ酸の配列(配列番号17)の中の少なくとも5個のアミノ酸の領域に結合する抗体である。
本発明の別の好ましい一実施形態において、非中和抗体は、成熟ヒトADMの第1～21アミノ酸の配列(配列番号14)の中の少なくとも4個のアミノ酸の領域に結合する抗体、又は成熟マウスADMの第1～19アミノ酸の配列(配列番号17)の中の少なくとも4個のアミノ酸の領域に結合する抗体である。
本発明の具体的な実施形態において、ADMの生物活性を阻止して(ベースライン値の)80％未満に、好ましくは50％未満にする非中和抗ADM抗体、又は非中和抗ADM抗体フラグメント、又は非中和抗ADM非Ig足場を用いる。ADMの生物活性の阻止(生物活性の低下を意味する)のこの制限は、抗体又はフラグメント又は足場が過剰な濃度のときでさえ起こることを理解すべきである(抗体又はフラグメント又は足場の過剰はADMに対してである)。阻止のこの制限は、この特別な実施形態におけるADMバインダそのものの固有の特性である。これは、その抗体又はフラグメント又は足場の最大阻害がそれぞれ80％又は50％であることを意味する。好ましい一実施形態において、この抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、抗ADMの生物活性を少なくとも5％阻止する/低下させると考えられる。上に述べたことは、約20％、又は50％、それどころか95%の残留ADM活性がそれぞれ残ったままであることを意味する。
したがって本発明によれば、提供される抗ADM抗体、抗ADM抗体フラグメント、抗ADM抗体非Ig足場は、それぞれのADM生物活性を中和しない。
生物活性は、ある物質が相互作用の後に生体内又はインビトロ(例えばアッセイ)で生物又は組織又は臓器又は機能単位に及ぼす効果と定義される。ADM生物活性の場合には、生物活性として、ヒト組み換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイにおけるADMの効果が可能である。したがって、本発明によれば、生物活性は、アドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイを通じて定義される。斯かるアッセイでADMの生物活性を求めるには以下のステップを実施することができる：
- そのアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイにおいてADMを用いて用量-反応曲線を求める。
- cAMP刺激の半数効果ADM濃度を計算することができる。
- cAMP刺激の半数効果ADM濃度を一定にして、ADM安定化抗体、又はADM安定化抗体フラグメント、又はADM安定化非Ig足場のそれぞれにより(最終濃度100μg/mlまで)用量-反応曲線を求める。
ADMバイオアッセイにおける最大阻害が50％とは、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場のそれぞれがADMの生物活性を阻止してベースライン値の50％にすることを意味する。ADMバイオアッセイにおける最大阻害が80％とは、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場のそれぞれがADMの生物活性を阻止してベースライン値の80％にすることを意味する。これは、ADM生物活性を阻止して80％以下にすることはないという意味である。これは、約20％の残留ADM生物活性が存在したままであることを意味する。
しかし本明細書によれば、そして上記の文脈では、本明細書に開示した抗ADM抗体、抗ADM抗体フラグメント、抗ADM抗体非Ig足場に関係する「ADMの生物活性を阻止する」という表現は、単純に、ADMの生物活性を100％から最大で20％残留ADM生物活性へ、好ましくはADMの生物活性を100％から50％残留ADM生物活性へと低下させることと理解すべきだが、どの場合でも、上に詳述したようにして求めることができるADM生物活性が残る。
ADMの生物活性は、実施例2に従ってヒト組み換えアドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイ(アドレノメデュリンバイオアッセイ)で求めることができる。
好ましい一実施形態において、調節抗体又は調節抗ADM抗体フラグメント、又は調節抗ADM非Ig足場を、患者のショックの治療又は予防に用いられる。
「調節」抗ADM抗体を、又は調節抗ADM抗体フラグメント、又は調節抗ADM非Ig足場は、血清、血液、血漿の中のアドレノメデュリンの半減期(t1/2；半減滞留時間)を少なくとも10％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは50％超、最も好ましくは100％超増大させるとともに、ADMの生物活性を阻止して80％未満に、好ましくは50％未満にする抗体、又は抗体フラグメント、又は非Ig足場であり、この抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ADMの生物活性を少なくとも5％阻止すると考えられる。半減期と生物活性の阻止に関するこれらの値は、これらの値を求めるための上記アッセイに関係すると理解すべきである。これは、それぞれADMの生物活性を阻止して80％以下、又は50％以下にすることはないという意味である。
このような調節抗ADM抗体、又は調節抗ADM抗体フラグメント、又は調節抗ADM非Ig足場は、投与を容易にするという利点を提供する。アドレノメデュリンの生物活性を部分的に阻止すること、又は部分的に低下させることと、生体内半減期を延長させること(アドレノメデュリンの生物活性を増大させること)を組み合わせると、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場が単純になるという利点がある。内在アドレノメデュリンが過剰な状況(最大刺激、敗血症後期、ショック、衰弱段階)では、活性を低下させる効果が、その抗体又はフラグメント又は足場の主な影響力であり、ADMの(マイナスの)効果が制限される。内在ADMの濃度が低いか正常である場合には、抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場の生物学的効果は、(部分的に阻止することによる)低下と、ADMの半減期を長くすることによる増加の組み合わせである。したがって非中和かつ調節性の抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ADM生物活性緩衝剤のように作用してADMの生物活性をある生理学的範囲に維持する。
本発明の具体的な実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである。本発明の一実施形態において、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメントは、ヒト抗体又はヒト化抗体であるか、それら抗体から誘導される。具体的な実施形態において、1つ以上の(マウス)CDRをヒト抗体又はヒト抗体フラグメントの中にグラフトする。
1つの側面における本発明の主題は、ADMに結合するヒト又はヒト化CDRグラフト抗体又はその抗体フラグメントである。このヒト又はヒト化CDRグラフト抗体又はその抗体フラグメントは、以下の：
GYTFSRYW(配列番号1)、
ILPGSGST(配列番号2)及び/又は
TEGYEYDGFDY (配列番号3)
を含む抗体重鎖(H鎖)を含み、及び/又は
QSIVYSNGNTY(配列番号4)、
RVS(配列表の一部ではない)及び/又は
FQGSHIPYT(配列番号5)、
を含む抗体軽鎖(L鎖)をさらに含む。
本発明の具体的な実施形態において、本発明の主題は、ADMに結合するヒトモノクローナル抗体、又はADMに結合するその抗体フラグメントであり、その中の重鎖は、以下の：
GYTFSRYW (配列番号1)、
ILPGSGST (配列番号2)、
TEGYEYDGFDY (配列番号3)、
を含む群から選択される少なくとも1つのCDRを含み、軽鎖は、以下の：
QSIVYSNGNTY (配列番号4)、
RVS(配列表の一部ではない)、
FQGSHIPYT (配列番号5)、
を含む群から選択される少なくとも1つのCDRを含む。
本発明のより具体的な実施形態において、本発明の主題は、ADMに結合するヒトモノクローナル抗体、又はADMに結合するその抗体フラグメントであり、その中の重鎖は、以下の配列：
GYTFSRYW (配列番号1)、
ILPGSGST (配列番号2)、
TEGYEYDGFDY (配列番号3)、
を含み、かつ、軽鎖は、以下の配列：
QSIVYSNGNTY (配列番号4)、
RVS(配列表の一部ではない)、
FQGSHIPYT (配列番号5)、
を含んでいる。
非常に具体的な実施形態において、抗ADM抗体は、配列番号6、7、8、9、10、11、12、13、32及び33を含む群から選択される配列を有する。
本発明の抗ADM抗体、又は抗ADM抗体フラグメント、又は抗ADM非Ig足場は、ヒトADMに対する親和性を示し、親和性定数は、10-7 M超、好ましくは10-8 Mであり、好ましい親和性は10-9 M超、最も好ましくは10-10 M超である。当業者は、化合物の用量をより多くすることによってより低い親和性が補償されると考えられることを知っており、この指標が本発明の範囲を外れることはないと考えられる。親和性定数は、実施例1に記載した方法に従って求めることができる。
本発明の主題は、本発明に従って患者でショックの治療法又は予防に用いるための、ADMに結合するヒト又はヒト化モノクローナル抗体又はフラグメント、又はその抗体フラグメントであり、この抗体又はフラグメントは、以下の：
配列番号6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号7(AM-H1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号8(AM-H2E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号9(AM-VH3-26E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号10(AM-VH4-26E40E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号11(AM-VL-)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12(AM-L1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号13(AM-VL2-40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む群から選択される配列を含んでいる。
本発明の別の実施形態は、患者でショックの治療法又は予防に用いるための、ADM又はその抗体フラグメントに結合するヒト又はヒト化モノクローナル抗体又はフラグメントに関し、ここで、前記抗体又はフラグメントは、重鎖として以下の配列：
配列番号32
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFScSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
を含み、かつ、軽鎖として以下の配列：
配列番号33
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む。
本発明の具体的な実施形態において、抗体は、重鎖として以下の配列：
配列番号32
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
又はそれと＞95%、好ましくは＞98%、好ましくは＞99%同一である配列を含み、かつ、軽鎖として以下の配列：
配列番号33
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
又はそれと＞95%、好ましくは＞98%、好ましくは＞99%同一である配列を含み、ここで、その重鎖は、以下の配列：
CDR1：配列番号1
GYTFSRYW
CDR2：配列番号2
ILPGSGST
CDR3：配列番号3
TEGYEYDGFDY
を含み、かつ、ここで、その軽鎖は、以下の配列：
CDR1：配列番号4
QSIVYSNGNTY
CDR2：RVS
CDR3：配列番号5
FQGSHIPYT
を含む。
これは、本発明の一実施形態において、CDRの配列がいずれの配列バリエーションも示さないことを意味している。上記配列のあらゆるバリエーションが前記実施形態におけるCDR配列の範囲外にある。
2つのアミノ酸配列間の同一性を評価するために、ペアワイズ・アラインメントが実施される。同一性とは、アラインメントにおいて直接合致するアミノ酸のパーセンテージを定義する。
本発明の実施形態において、患者でショックの治療又は予防において用いるための、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメントは、少なくとも0.5mg/kg体重、特に少なくとも1.0mg/kg体重、より特に1.0～20.0mg/kg体重、例えば2.0～10mg/kg体重、2.0～8.0mg/kg体重、又は2.0～5.0mg/kg体重、の用量で投与され得る。
「医薬製剤」という用語は、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わせた医薬成分を意味し、そしてそれは、その中に含まれた医薬成分の生物学的活性が有効であることを許容するような形態であり、かつ、それは、製剤が投与されるであろう対象に容認できない毒性である追加成分を含有しない。「医薬成分」という用語は、任意選択で医薬的に許容される賦形剤と組み合わせられて、医薬製剤又は剤形を提供し得る治療用組成物を意味する。
本発明の主題は、患者のショックの治療法又は予防における使用のための、本発明による抗体又はフラグメント又は足場を含む医薬製剤である。
本発明の主題は、患者のショックの治療法又は予防における使用のための、本発明による抗体又はフラグメント又は足場を含む医薬製剤であって、ここで、前記ショックは、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック及び血液分布異常性ショックを含む群から選択され、特に心原性ショック又は敗血症性ショックである。
本発明の主題は、本発明による患者のショックの治療法又は予防における使用のための、医薬製剤であり、ここで、前記医薬製剤は、溶液、好ましくはすぐに使用できる溶液である。
本発明の主題は、本発明による患者のショックの治療法又は予防における使用のための医薬製剤であって、ここで、前記医薬製剤が凍結乾燥された状態にある。
本発明の主題は、本発明による患者のショックの治療法又は予防における使用のための医薬製剤であって、ここで、前記医薬製剤は筋肉内に投与される。
本発明の主題は、本発明による患者のうっ血の治療介入と治療法における使用のための医薬製剤であって、ここで、前記医薬製剤は血管内に投与される。
本発明の主題は、本発明による患者のうっ血の治療介入と治療法における使用のための医薬製剤であって、ここで、前記医薬製剤は輸液によって投与される。
本発明の主題は、本発明による患者のショックの治療法又は予防における使用のための医薬製剤であって、ここで、前記医薬製剤は、全身投与される。
上記の関係によると、連続して付番された以下の実施形態が、本発明の更なる具体的な態様を提供する：
1. ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
・抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を前記患者に投与すること、
を含み、
ここで、前記測定したDPP3レベルが事前に定めた閾値を下回っている場合、前記患者は治療され、及び
ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法。
2. 実施形態1に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ショックが、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック及び血液分布異常性ショックを含む群から選択され、特に心原性ショック又は敗血症性ショックである、方法。
3. 実施形態1又は2に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
・心原性ショックの場合には、前記患者は、急性冠状動脈症候群(例えば、急性心筋梗塞)に罹患している可能性があるか、又は前記患者は、心不全(例えば、急性非代償性心不全)、心筋炎、不整脈、心筋症、心臓弁膜症、急性大動脈弁狭窄症を伴った大動脈解離、外傷性腱索断裂又は広範肺塞栓症を患っているか、或いは
・循環血液量減少性ショックの場合には、前記患者は、胃腸出血、外傷、血管性病因(例えば、腹部大動脈瘤破裂、主要な血管内への腫瘍浸潤)及び抗凝血物質使用中の特発出血を含めた出血性疾患、又は嘔吐、下痢、腎臓からの喪失、皮膚からの喪失/不感性の喪失(例えば、熱傷、熱中症)、若しくは膵炎、肝硬変、腸閉塞及び外傷中のサードスペースへの喪失を含めた非出血性疾患に罹患している可能性があるか、或いは
・血管閉塞性ショックの場合には、前記患者は、心タンポナーデ、緊張性気胸、肺塞栓症又は大動脈弁狭窄症に罹患している可能性があるか、或いは
・血液分布異常性ショックの場合には、前記患者は、敗血症性ショック、神経原性ショック、アナフィラキシーショック又は副腎クリーゼによるショックを患っている可能性がある、方法。
4. 実施形態1～3のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記対象の体液サンプル中の前記事前に定めたDPP3の閾値は20～120ng/mLであり、より好ましい前記閾値は30～80ng/mLであり、より一層好ましい前記閾値は40～60ng/mLであり、最も好ましい前記閾値は50ng/mLである、方法。
5. 実施形態1～4のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、DPP3タンパク質のレベル及び/又は活性DPP3のレベルのいずれかが測定され、そして、事前に定めた閾値と比較される、方法。
6. 実施形態1～5のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される、方法。
7. 実施形態1～6のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダは、抗体、抗体フラグメント、又は非IgG足場を含む群から選択され得る、方法。
8. 実施形態1～7のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダが抗体である、方法。
9. 実施形態1～8のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダが表面に固定される、方法。
10. 実施形態1～9のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記分離ステップは、捕捉されているDPP3から前記捕捉バインダに結合していないサンプルの構成要素を取り除く洗浄ステップである、方法。
11. 実施形態1～10のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記対象の体液サンプル中のDPP3活性を測定する方法が、以下のステップ：
・前記サンプルを、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させ、
・前記捕捉バインダに結合しているDPP3を分離し、
・前記分離したDPP3にDPP3の基質を加え、
・DPP3の基質の変換を計測し、定量化することにより前記DPP3活性を定量化すること、
を含む、方法。
12. 実施形態1～11のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記DPP3基質変換は、以下の：蛍光発生基質(例えば、Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに連結された基質の発光(Promega Protease-Glo(商標) Assay)、質量スペクトロメトリー、HPLC/FPLC(逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー)、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、活性染色後のゲル電気泳動(固定された、活性DPP3)又はウエスタンブロット法(切断産物)、を含む群から選択される方法によって検出される、方法。
13. 実施形態1～12のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記基質は：アンギオテンシンII、III及びIV、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1及び2、バロルフィン、β-カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH及びMSH、又はフルオロフォア、発色団若しくはアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドがArg-Argである、方法。
14. 実施形態1～13のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記基質は：フルオロフォア、発色団又はアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドがArg-Argである、方法。
15. 実施形態1～14のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者が、閾値を超えるADM-NH2レベルを有することを更なる特徴とする、方法。
16. 実施形態15に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者の体液サンプル中のADM-NH2の前記閾値は40～100pg/mLであり、より好ましい前記閾値は50～90pg/mLであり、より一層好ましい前記閾値は60～80pg/mLであり、最も好ましい前記閾値は70pg/mLである、方法。
17. 実施形態15又は16に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ADM-NH2のレベルが、前記体液サンプルをADM-NH2に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される、方法。
18. 実施形態1～17のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者の体液サンプルは、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液(CSF)、及び唾液の群から選択される、方法。
19. 実施形態1～18のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが組み合わせて測定される、方法。
20. 実施形態19に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが同時に測定される、方法。
21. 実施形態19又は20に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが、ポイント・オブ・ケア・デバイスを使用して測定される、方法。
22. 実施形態21に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ポイント・オブ・ケア・デバイスが、マイクロ流体デバイスである、方法。
23. 実施形態1～22のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場は、ADMのN末端末端(第1アミノ酸)を認識し、そして結合する、方法。
24. 実施形態1～23のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場が、ADMの第43～52配列アミノ酸を有するADMのC末端の一部：PRSKISPQGY-NH2(配列番号24)には結合しない、方法。
25. 実施形態1～24のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントは、ADM若しくはその抗体フラグメントに結合するモノクローナル抗体若しくはフラグメントであり、ここで、その重鎖が、以下の配列：
CDR1：配列番号1
GYTFSRYW
CDR2：配列番号2
ILPGSGST
CDR3：配列番号3
TEGYEYDGFDY
を含み、かつ、ここで、その軽鎖が、以下の配列：
CDR1：配列番号4
QSIVYSNGNTY
CDR2：
RVS
CDR3：配列番号5
FQGSHIPYT
を含む、方法。
26. 実施形態1～25のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントが、VH領域として以下の：
配列番号6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号8(AM-VH2E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号9(AM-VH3-T26E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号10(AM-VH4-T26E40E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
を含む群から選択される配列を含み、かつ、VL領域として以下の配列：
配列番号11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む群から選択される配列を含む、方法。
27. 実施形態1～25のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントが、重鎖として以下の配列：
配列番号32
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
又はそれと＞95%同一である配列を含み、かつ、軽鎖として以下の配列：
配列番号33
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
又はそれと＞95%同一である配列を含む、方法。
実施例1 - 抗体の作製とそれらの親和定数の測定
いくつかのヒト及びマウスの抗体を作り出し、そして、それらの親和定数を測定した(表1及び2を参照のこと)。本発明による実施例部分の抗体、抗体フラグメント、及び非Ig足場が、ADMに結合しており、これにより、抗ADM非抗体/抗体フラグメント/Ig足場とみなされるはずであることを強調すべきである。
免疫化のためのペプチド/コンジュゲート：
そのペプチドのウシ血清アルブミン(BSA)へのコンジュゲーションのための(選択されたADM配列内にシステインが存在していなければ)追加のN末端システイン残基を伴う、免疫化のためのペプチドを合成した、表1を参照のこと、(JPT Technologies, Berlin, Germany)。そのペプチドを、Sulfolinkカップリングゲル(Perbio-science, Bonn, Germany)を使用することによってBSAに共有結合により連結した。カップリング手順を、Perbioのマニュアルに従って実施した。
マウスモノクローナル抗体の製造：
Balb/cマウスを、0日目と14日目に100μgのペプチド-BSA-コンジュゲート(100μlの完全フロイントアジュバント中に乳化させた)を用いて、そして、21日目と28日目に(100μlの不完全フロイントアジュバンド中の)50μgを用いて免疫した。融合実験を実施する3日前に、動物に、1回の腹腔内注射及び1回の静脈内注射として投与される、100μlの生理食塩水中に溶解した50μgの前記コンジュゲートを与えた。免疫されたマウスからの脾細胞及び骨髄腫細胞株SP2/0の細胞を、50％のポリエチレングリコール1mlを用いて37℃にて30秒間、融合させた。洗浄後に、その細胞を96ウェル細胞培養プレート内に播種した。ハイブリッドクローンを、HAT培地［20％のウシ胎仔血清及びHATサプリメントを補ったRPMI1640培地］中で培養することによって選択した。2週間後に、3回の継代の間に、HAT培地をHT培地に置き換え、それに続いて、正常細胞培地に戻した。細胞培養上清を、融合3週間後に、まず抗原特異的なIgG抗体についてスクリーニングした。陽性の試験された微量の培養物を、繁殖のために24ウェルプレートに移した。再テストした後に、選択された培養物を、クローン化し、限界希釈を使用することで再度クローン化し、そして、アイソタイプを決定した(Lane, R.D. 1985. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler et al. 1996. Horm. Metab. Res. 28: 11-15もまた参照のこと)。
抗体を、標準的な抗体製造法(Marx et al, 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121)によって作製し、そして、プロテインAを介して精製した。抗体純度は、SDSゲル電気泳動分析に基づき、＞95％であった。
ヒト抗体
ヒト抗体を、以下の手順に従ってファージディスプレイによって作製した：ヒトネイティブ抗体遺伝子ライブラリHAL7/8を、アドレノメデュリンペプチドに対する、遺伝子組み換え一本鎖F可変ドメイン(scFv)の分離に使用する。抗体遺伝子ライブラリを、2個の異なったスペーサーを介してアドレノメデュリンペプチド配列に連結されたビオチンタグを含むペプチドの使用を含むパンニングストラテジーを用いてスクリーニングした。非特異性結合抗原とストレプトアビジン結合抗原とを使用したパンニング段階の混合を、非特異的バインダのバックグラウンドを最小にするのに使用した。パンニングの第三段階からの溶解ファージを、モノクローナルscFv発現性E. コリ(E. coli)株の作製に使用した。これらのクローン株の培養からの上清を、抗原ELISA試験にそのまま使用した(Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schutte et al. 2009. PLoS One 4, e6625もまた参照のこと)。陽性クローンを、抗原に対する陽性ELISAシグナル及びストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレートに対する陰性シグナルに基づいて選択した。更なる特徴づけのために、scFvオープンリーディングフレームを、発現プラスミドpOPE107(Hust et al., J. Biotechn. 2011)内にクローン化し、固定した金属イオン親和性クロマトグラフィーによって培養上清から捕捉し、そして、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
親和定数：ADMに対する抗体の親和性を測定するために、固定化抗体へのADMの結合に関する動態を、Biacore2000システム(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)を使用した無標識表面プラズモン共鳴法によって測定した。抗体の可逆的固定化を、製造業者の取扱説明書に従って高密度でCM5センサー表面に共有結合させた抗マウスFc抗体を使用して実施した(マウス抗体捕捉キット；GE Healthcare)( Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55(1): 165-173)。
モノクローナル抗体を、それぞれ、以下に示したヒト及びマウスのADMのADM領域に対して産生させた。以下の表は、更なる実験において使用される、得られた抗体の一群を表している。選択は、標的領域に基づいた：
表1：免疫化ペプチド
Figure 2023516615000001
以下のものは、更に得られたモノクローナル抗体のリストである。
表2：
Figure 2023516615000002
Figure 2023516615000003
Figure 2023516615000004
酵素分解による抗体フラグメントの作製：Fab及びF(ab)2フラグメントの作製を、マウス完全長抗体NT-Mの酵素分解によっておこなった。抗体NT-Mを、a)ペプシンベースのF(ab)2調製キット(Pierce44988)及びb)パパインベースのFab調製キット(Pierce44985)を使用して消化した。フラグメント化手順を、供給業者によって提供された取扱説明書に従って実施した。消化は、F(ab)2フラグメント化の場合、37℃にて8時間実施した。Fabフラグメント化消化を、それぞれ16時間実施した。
Fab作製及び精製の手順：固定化パパインを、0.5mlの消化バッファーで樹脂を洗浄し、そして、5000xgにて1分間、カラムを遠心分離することによって平衡化した。そのバッファーをその後、捨てた。脱塩カラムを、保管溶液を除去し、消化バッファーでそれを洗浄し、その都度その後に1000xgにて2分間それを遠心分離することによって調製した。0.5mlの調製IgGサンプルを、平衡化した固定化パパインの入ったスピンカラムチューブに加えた。消化反応のインキュベーション時間は、37℃の卓上ロッカーにより16時間おこなった。カラムを、5000×gにて1分間遠心分離して、固定化パパインと消化産物を分離した。その後、樹脂を、0.5mlのPBSで洗浄し、そして、5000×gにて1分間遠心分離した。洗浄画分を、総サンプル体積が1.0mlである消化抗体に加えた。NAb Protein A Columnを、室温にてPBS及びIgG溶出バッファーで平衡化した。カラムを、1分間遠心分離して、保管溶液(0.02％のアジ化ナトリウム含有)を除去し、2mlのPBSを加えることによって平衡化し、1分間再び遠心分離し、そして流し出して捨てた。サンプルは、カラムに適用し、転倒によって再懸濁させた。インキュベーションを、転倒混合しながら室温にて10分間おこなった。カラムを1分間遠心分離して、Fabフラグメントが流れ出るのを防いだ。(引用文献：Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner et al. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann et al. 2010. PNAS. 107, 18950-5.; Chen et al. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal et al. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas et al. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong et al. 2009 J. Cell Biol. 185, 1275-840)。
F(ab’)2作製及び精製の手順：固定化ペプシンを、0.5mlの消化バッファーで樹脂を洗浄し、そして、5000xgにて1分間、カラムを遠心分離することによって平衡化した。そのバッファーをその後、捨てた。脱塩カラムを、保管溶液を除去し、消化バッファーでそれを洗浄し、その都度その後に1000xgにて2分間それを遠心分離することによって調製した。0.5mlの調製IgGサンプルを、平衡化した固定化ペプシンの入ったスピンカラムチューブに加えた。消化反応のインキュベーション時間は、37℃の卓上ロッカーにより16時間おこなった。カラムを、5000×gにて1分間遠心分離して、固定化パパインと消化産物を分離した。その後、樹脂を、0.5mLのPBSで洗浄し、そして、5000×gにて1分間遠心分離した。洗浄画分を、総サンプル体積が1.0mlである消化抗体に加えた。NAb Protein A Columnを、室温にてPBS及びIgG溶出バッファーで平衡化した。カラムを、1分間遠心分離して、保管溶液(0.02％のアジ化ナトリウム含有)を除去し、2mLのPBSを加えることによって平衡化し、1分間再び遠心分離し、そして流し出して捨てた。サンプルは、カラムに適用し、転倒によって再懸濁させた。インキュベーションを、転倒混合しながら室温にて10分間おこなった。カラムを1分間遠心分離して、Fabフラグメントが流れ出るのを防いだ。(引用文献：Mariani et al. 1991. Mol. Immunol. 28: 69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11:287-96; Ellerson et al. 1972. FEBS Letters 24(3):318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93:113-147; Kulkarni et al. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4; Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121:652-663; Parham et al. 1982. J Immunol Meth 53:133-73; Raychaudhuri et al. 1985. Mol Immunol 22(9):1009-19; Rousseaux et al. 1980. Mol Immunol 17:469-82; Rousseaux et al. 1983. J Immunol Meth 64:141-6; Wilson et al. 1991. J Immunol Meth 138:111-9)。
NT-H抗体フラグメントのヒト化：抗体フラグメントを、CDRグラフト法(Jones et al. 1986. Nature 321, 522-525)によってヒト化した。
以下のステップをおこない、ヒト化配列を得た：
全RNA抽出：全RNAを、Qiagenキットを使用してNT-Hハイブリドーマから抽出した。第一段階のRT-PCR：QIAGEN（登録商標）OneStep RT-PCR Kit(Cat No.210210)を使用した。RT-PCRを、重鎖及び軽鎖に特異的なプライマーセットを用いて実施した。それぞれのRNAのサンプルに関して、可変領域のリーダー配列を網羅した縮重順方向プライマー混合物を使用して、12種類の個別の重鎖及び11種類の軽鎖のRT-PCR反応を設定した。逆方向プライマーは、重鎖及び軽鎖の定常領域に位置している。プライマー内には制限部位を設計しなかった。
反応物の準備：5xQIAGEN（登録商標）OneStep RT-PCRバッファー5.0μl、dNTP Mix(それぞれのdNTP10mMを含んでいる)0.8μl、プライマーセット0.5μl、QIAGEN（登録商標）OneStep RT-PCR Enzyme Mix0.8μl、鋳型RNA2.0μl、無RNase不含水20.0μlまで、全容積20.0μl。PCR条件：逆転写：50℃、30分；最初のPCR活性化：95℃、15分間。サイクル：94℃、25秒間；54℃、30秒間；72℃、30秒間を20サイクル；最終伸長：72℃、10分間。第二段階の準ネスト化PCR：第一段階反応からのRT-PCR産物を第二段階のPCRで更に増幅した。12種類の個別の重鎖及び11種類の軽鎖のRT-PCR反応を、抗体可変領域に対して特異的な準ネスト化プライマーセットを使用して準備した。
反応物の準備：2xPCRミックス10μl；プライマーセット2μl；第一段階のPCR産物8μl；全容積20μl；Hybridoma Antibody Cloning Report。PCR条件：95℃にて5分間の最初の変性；95℃にて25秒間、57℃にて30秒間、68℃にて30秒間を25サイクル；最終伸長を68℃にて10分間。
PCRが終わった後に、PCR反応サンプルをアガロースゲルで泳動して、増幅したDNAフラグメントを可視化する。ネスト化RT-PCRによって増幅した15個超のクローンDNAフラグメントの配列決定後に、数個のマウス抗体重鎖及び軽鎖を、クローン化したが、正しいように思われる。タンパク質配列アラインメント及びCDR分析で、1本の重鎖と1本の軽鎖を同定する。相同ヒトフレームワーク配列とのアラインメント後に、得られた可変重鎖のヒト化配列は、次のものであった：図5を参照のこと(可変重鎖内の26、40、及び55位のアミノ酸及び可変軽鎖内の40位のアミノ酸が結合特性に重要なので、それらはマウス起源に先祖返りし得る。得られた候補を以下に示す)( Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris and Bajorath.1995. Protein Sci. 4, 306-310)。
抗体フラグメント配列に対する注釈(配列番号6～13；32及び33)：ボールド体及び下線は、年代順に配置されたCDR1、2、3であり；斜体は、定常領域であり；ヒンジ部は、ボールド体文字で強調表示され；フレームワーク点突然変異は、灰色の文字背景である。
配列番号6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号8(AM-VH2E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号9(AM-VH3-T26E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号10(AM-VH4-T26E40E55)
VQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号32(アドレシズマブ重鎖)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号33(アドレシズマブ軽鎖)
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
実施例2 - 抗ADM生理活性に対する選択抗ADM抗体の効果
ADM生理活性に対する選択ADM抗体の効果を、ヒト組換型アドレノメデュリン受容体cAMP機能アッセイ(Adrenomedullin Bioassay)で試験した。
ヒト組換型アドレノメデュリン受容体cAMP機能性アッセイ(Adrenomedullin Bioassay)におけるヒト又はマウスアドレノメデュリン標的抗体の試験
材料：細胞株：CHO-K1、受容体：アドレノメデュリン(CRLR＋RAMP3)、受容体の細胞株受入番号：CRLR：U17473；RAMP3：AJ001016
試験に先立ち、抗生物質不含培地で培養した、ヒト組換型アドレノメズリン受容体を発現するCHO-K1細胞(FAST-027C)を、PBS-EDTA(5mMのEDTA)でのゆるやかなフラッシングによって剥がし、遠心分離によって回収し、そして、アッセイバッファー(KRH：5mMのKCl、1.25mMのMgSO4、124mMのNaCl、25mMのHEPES、13.3mMのグルコース、1.25mMのKH2PO4、1. 45mMのCaCl2、0.5g/lのBSA)中に再懸濁した。
用量反応曲線を、標準作動物質(hADM又はmADM)と平行して実施した。
拮抗物質試験(96ウェル)：拮抗物質試験のために、6μlの標準作動物質(ヒト(5.63nM)又はマウス(0.67nM)アドレノメデュリン)を、異なった拮抗物質希釈率にて6μlの試験サンプル；又は6μlのバッファーと混合した。室温にて60分間のインキュベーション後に、12μlの細胞(2，500細胞/ウェル)を加えた。そのプレートを室温にて30分間インキュベートした。溶解バッファー添加後に、製造業者の明細書に従って、Cis-Bio International製のHTRFキット(cat n°62AM2 PEB)を用いて、DeltaFのパーセンテージを推測する。hADM22-52を、標準拮抗物質として使用した。
抗体を試験するcAMP-HTRFアッセイ
抗h-ADM抗体(NT-H、MR-H、CT-H)を、以下の最終抗体濃度：100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/mlにて、5.63nMのヒトADM1-52の存在下、ヒト組換型アドレノメズリン受容体(FAST-027C)cAMP機能性アッセイで拮抗物質活性について試験した。
抗m-ADM抗体(NT-M、MR-M、CT-M)を、以下の最終抗体濃度：100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/mlにて、0.67nMのマウスADM1-50の存在下、ヒト組換型アドレノメズリン受容体(FAST-027C)cAMP機能性アッセイで拮抗物質活性について試験した。データを、相対的阻害対拮抗物質濃度でプロットした(図3a～3lを参照のこと)。個々の抗体による最大阻害を表3に示す。
表3：bio-ADM活性の最大阻害
Figure 2023516615000005
実施例3 - 抗ADM抗体によるhADMの安定化
ヒトADM抗体によるヒトADMの安定化効果を、hADM免疫学的アッセイを使用して試験した。
ヒトアドレノメデュリンの定量化のための免疫学的アッセイ
使用される技術は、アクリジニウムエステル標識化に基づいたサンドイッチコートチューブ発光イムノアッセイであった。
標識化合物(トレーサー)：100μg(100μl)のCT-H(PBS、pH7.4中に1mg/ml、AdrenoMed AG Germany)を、10μlのアクリジニウムNHS-エステル(アセトニトリル中に1mg/ml、InVent GmbH, Germany)(EP0353971)と混合し、そして、室温にて20分間インキュベートした。標識したCT-Hを、Bio-Sil（登録商標）SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)によるゲル濾過HPLCによって精製した。精製したCT-Hを、(300mmol/Lのリン酸カリウム、100mmol/LのNaCl、10mmol/LのNa-EDTA、5g/Lのウシ血清アルブミン、pH7.0)中に希釈した。終濃度は、200μLあたり約800，000相対光度単位(RLU)の標識化合物(約20ng標識抗体)であった。アクリジニウムエステル化学発光を、AutoLumat LB953(Berthold Technologies GmbH&Co. KG)を使用して計測した。
固相：ポリスチレンチューブ(Greiner Bio-1International AG、Austria)を、MR-H(AdrenoMed AG、Germany)(1.5μgのMR-H/0.3mL、100mmol/LのNaCl、50mmol/LのTRIS/HCl、pH7.8)でコートした(室温にて18時間)。5％のウシ血清アルブミンでブロッキングした後に、そのチューブをPBS、pH7.4で洗浄し、そして、真空乾燥した。
較正：250mmol/LのNaCl、2g/LのTriton X-100、50g/Lのウシ血清アルブミン、20タブ/Lのプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics AG、Switzerland)中のhADM(BACHEM AG、Switzerland)の希釈物を使用して、アッセイを較正した。
hADMイムノアッセイ：標識CT-H(200μl)を加えた後に、50μlのサンプル(又は較正物質)をコートチューブ内にピペットで計り入れ、そのチューブを4℃にて4時間インキュベートした。非結合トレーサーを、洗浄液(20mMのPBS、pH7.4、0.1％のTriton X-100)で5回(各1ml)洗浄することによって除去した。
チューブに結合した化学発光を、LB953を使用して計測した：図3は、典型的なhADM用量/シグナル曲線、及び100μg/mLの抗体NT-Hの存在下でのhADM用量シグナル曲線を示す。NT-Hは、記載したhADM免疫学的アッセイに影響しなかった。
ヒトアドレノメデュリンの安定性：ヒトADMを、ヒトクエン酸血漿中に希釈し(終濃度10nM)、24℃にてインキュベートした。選択した時点にて、-20℃にて冷凍することによって、hADMの分解を止めた。インキュベーションを、NT-H(100μg/ml)の不存在及び存在下で実施した。残存しているhADMを、先に記載したhADM免疫学的アッセイを使用して定量化した。
図4は、NT-H抗体の不存在と存在下、ヒト血漿(クエン酸)中でのhADMの安定性を示している。hADMだけの半減期は、7.8hであり、そして、NT-Hの存在下で、半減期は18.3hであった(2.3倍高い安定性)。
実施例4 - 敗血症の死亡率
a) 敗血症の早期処置
動物モデル：12～15週齢の雄C57Bl/6マウス(Charles River Laboratories, Germany)を試験に使用した。腹膜炎を、軽いイソフルラン麻酔下で外科的に引き起こした。切開を、腹腔の左上象限(盲腸の正常な位置)に作った。盲腸を露出させ、そして、きつい結紮を小腸の付着点の遠位に縫合して盲腸の周りに配置した。24ゲージの針で1カ所の刺創を盲腸に作り、そして、少量の盲腸内容物をその損傷から絞り出した。盲腸を腹腔内に戻し、そして、腹壁切除部位を閉じた。最後に、動物を、食物と水が自由摂取できるケージに戻した。500μlの生理的食塩水を、水分補給として皮下に与えた。
化合物(NT-M、MR-M、CT-M)の適用と投薬量：マウスを、CLP直後に処置した(早期治療)。CLPとは、盲腸結紮及び穿刺(CLP)の略語である。
調査群：3つの化合物を、ビヒクルに対して、及び対照化合物処置に対して試験した。各群には、BUN(血清血中尿素窒素試験)測定のために1日後の採血のための5匹のマウスを含む。各群あたり更なに10匹のマウスを、4日間の期間にわたって経過観察した。
群 処置(10μl/g体重) 投与量/経過観察：
1 NT-M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
2 MR-M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
3 CT-M、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
4 非特異的マウスIgG、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
5 対照-PBS、10μl/g体重 4日間にわたり生存
臨床化学：腎機能に関する血中尿素窒素(BUN)濃度を、ベースラインとCLP後1日目に計測した。血液サンプルを、軽いエーテル麻酔下で毛細管を用いて海綿静脈洞から採取した。測定を、AU 400 Olympus Multianalyserを使用して実施した。4日死亡率を、表4中に示した。平均BUN濃度を、表4に示した。
表4：4日死亡率とBUN濃度
Figure 2023516615000006
NT-M抗体が死亡率を大きく低減したことが、表4からわかる。4日後に、NT-M抗体で処置したマウスの70％が生き残った。4日後、MR-M抗体で処置した場合には、30％の動物が生き残り、そして、CT-M抗体で処置した場合には、10％の動物が生き残った。それとは対照的に、非特異的マウスIgGで処置した場合には、すべてのマウスが4日後に死亡した。同じ結果を、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)をマウスに投与した対照群で得た。血中尿素窒素又はBUN試験は、腎臓機能を計測するため、腎臓病を診断する助けにするため、及び急性若しくは慢性の腎機能障害若しくは不全症の患者を観察するために使用される。S-BUN Testの結果は、NT-M抗体が腎臓を保護するのに最も効果的であることを明らかにした。
b) 敗血症の後期処置
動物モデル：12～15週齢の雄C57Bl/6マウス(Charles River Laboratories, Germany)を試験に使用した。腹膜炎を、軽いイソフルラン麻酔下で外科的に引き起こした。切開を、腹腔の左上象限(盲腸の正常な位置)に作った。盲腸を露出させ、そして、きつい結紮を小腸の付着点の遠位に縫合して盲腸の周りに配置した。24ゲージの針で1カ所の刺創を盲腸に作り、そして、少量の盲腸内容物をその損傷から絞り出した。盲腸を腹腔内に戻し、そして、腹壁切除部位を閉じた。最後に、動物を、食物と水が自由摂取できるケージに戻した。500μlの生理的食塩水を、水分補給として皮下に与えた。
化合物(NT-M FAB2)の適用と投薬量：NT-M FAB2を、ビヒクルに対して、及び対照化合物処置に対して試験した。処置を、敗血症の完全な発生後、すなわち、CLPの6時間後に実施した(後期処置)。各群には、4匹のマウスが含まれ、4日間の期間にわたって経過観察した。
群 処置(10μl/g体重) 投与量/経過観察：
1 NT-M、FAB2 0.2mg/ml 4日間にわたり生存
2 対照：非特異的マウスIgG、0.2mg/ml 4日間にわたり生存
3 ビヒクル：-PBS 10μl/g体重 4日間にわたり生存
表5：4日死亡率
Figure 2023516615000007
NT-M FAB2抗体が死亡率を大きく低減したことが、表5からわかる。4日後に、NT-M FAB2抗体で処置したマウスの75％が生き残った。それとは対照的に、非特異的マウスIgGで処置した場合には、すべてのマウスが4日後に死亡した。同じ結果を、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)をマウスに投与した対照群で得た。
実施例5 - 健常なヒトへのNT-Hの投与
この試験は、無作為化二重盲検プラセボ対照試験として健常な男性対象で実施し、3つの順次群(それぞれが8人の健常な男性対象からなる)でNT-H抗体の用量を単純に増やしながら静脈内(i.v.)輸液として投与した(第1の群は0.5 mg/kg、第2の群は2 mg/kg、第3の群は8 mg/kg)(各群でn＝6が活性剤、n＝2がプラセボ)。主な包含基準は、書面によるインフォームドコンセントと、年齢が18～35歳であることと、避妊を信頼できるやり方で実施することの同意と、BMIが18～30 kg/m2であることであった。対象は、研究室の中で1時間かけたゆっくりとした輸液によってNT-H抗体(0.5 mg/kg；2 mg/kg；8 mg/kg)又はプラセボを静脈内に1回投与された。4つの群のADMのベースライン値に違いはなかった。ADMの中央値は、プラセボ群で7.1 pg/ml、第1の処置群(0.5 mg/kg)で6.8 pg/ml、第2の処置群(2 mg/kg)で5.5 pg/ml、第3の処置群(8 mg/kg)で7.1 pg/mlであった。結果は、健常な個人にNT-H抗体を投与してから最初の1.5時間以内にADM値が急速に増加した後、プラトーに到達し、ゆっくりと低下したことを示している(図6)。
実施例6 - DPP3タンパク質とDPP3活性を測定する方法
抗体の作製とDPP3結合能力の測定：いくつかのマウス抗体を作製し、特殊な結合アッセイでヒトDPP3への結合能力をスクリーニングした(表6を参照のこと)。
免疫化のためのペプチド/コンジュゲート：ウシ血清アルブミン(BSA)とのコンジュゲートにするため、(選択されたDPP3配列の中にシステインが存在していない場合には)追加のN末端システイン残基を持つ免疫化用DPP3ペプチドを合成した、表6を参照のこと(JPT Technologies, Berlin, Germany)。Sulfolinkカップリングゲル(Perbio-science, Bonn, Germany)を用いてこのペプチドをBSAに共有結合させた。カップリング手続きはPerbio社のマニュアルに従って実施した。組み換えGST-hDPP3をUSBio(United States Biological, Salem, MA, USA)によって作製した。
マウスの免疫化、免疫細胞の融合とスクリーニング：Balb/cマウスの腹腔内(i.p.)に、(TiterMax Goldアジュバントの中で乳化した)84μgのGT-hDDP3又は100μgのDPP3-ペプチド-BSA-コンジュゲートを0日目に、(完全フロイントアジュバントの中で乳化した)84μg又は100μgを14日目に、(不完全フロイントアジュバントの中で乳化した)42μg又は50μgを21日目と28日目に注射した。49日目、マウスの静脈内(i.v.)に、生理食塩水に溶かした42μgのGT-hDDP3又は50μgのDPP3-ペプチド-BSA-コンジュゲートを注射した。3日後、マウスを安楽死させ、免疫細胞を融合させた。
1 mlの50％ポリエチレングリコールを37℃で30秒間用い、免疫化されたマウスからの脾臓細胞と骨髄腫細胞系SP2/0からの細胞を融合させた。洗浄後、細胞を96ウェルの細胞培養プレートに播種した。HAT培地［20％ウシ胎仔血清とHATサプリメントを補足したRPMI 1640培地］の中でハイブリッドクローンを選択した。1週間後、このHAT培地をHT培地で置き換えて3継代した後、通常の細胞培地に戻した。融合の2週間後、細胞培養物の上清で組み換えDPP3に結合するIgG抗体に関するスクリーニングを最初に実施した。したがってGSTタグ付き組み換えhDPP3(USBiologicals, Salem, USA)を96ウェルのプレートに固定化し(100 ng/ウェル)、ウェル1つ当たり50μlの細胞培養物上清とともに室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、50μl/ウェルのPOD-ウサギ抗マウスIgGを添加し、室温で1時間インキュベートした。次の洗浄ステップの後、50μlの発色団溶液(3.7 mMのo-フェニレンジアミンを含むクエン酸塩/リン酸水素塩バッファー、0.012％のH2O2)を各ウェルに添加し、室温で15分間インキュベートした後、50μlの4N硫酸を添加することによって発色反応を停止させた。吸収を490 nmで検出した。
検査で陽性のマイクロ培養物を24ウェルのプレートに移して増殖させた。再検査の後、選択された培養物のクローニングと再クローニングを限界希釈技術を利用して実行し、アイソタイプを明らかにした。
マウスモノクローナル抗体の作製
GSTタグ付きヒトDPP3又はDPP3ペプチドに対する抗体を標準的な抗体作製法(Marx et al. 1997)に従って作製し、プロテインAを通じて精製した。抗体の純度は、SDSゲル電気泳動分析に基づくと≧90％であった。
抗体の特徴づけ - hDPP3及び/又は免疫化ペプチドへの結合
さまざまな抗体と抗体クローンがDPP3/免疫化ペプチドに結合する能力を分析するため、結合アッセイを実施した。
固相：GSTタグ付き組み換えhDPP3(配列番号34)又はDPP3ペプチド(免疫化ペプチド、配列番号35)を高結合微量滴定プレート(96ウェルのポリスチレン製マイクロプレート、Greiner Bio-One international AG, Austria、ウェル1つ当たり1μgを含むカップリングバッファ［50 mMのトリス、100 mMのNaCl、pH7.8］、室温で1時間)の表面に固定化した。5％ウシ血清アルブミンを用いてブロックした後、マイクロプレートを真空乾燥させた。
標識手法(トレーサ)：100μg(100μl)のさまざまな抗DPP3抗体(PBSの中に1 mg/mlの検出抗体、pH 7.4)を10μlのアクリジニウムNHSエステル(アセトニトリルの中に1 mg/ml、InVent GmbH, Germany；EP 0 353 971)と混合し、室温で30分間インキュベートした。標識した抗DPP3抗体をShodex Protein 5μm KW-803(Showa Denko, Japan)上でゲル濾過HPLCによって精製した。精製された標識付き抗体をアッセイバッファー(50mmol/lのリン酸カリウム、100mmol/lのNaCl、10mmol/lのNa2-EDTA、5 g/lのウシ血清アルブミン、1 g/lのマウスIgG、1 g/lのウシIgG、50μmol/lのアマスタチン、100μmol/lのロイペプチン、pH 7.4)の中で希釈した。最終濃度は、標識された化合物(約20 ngの標識された抗体)が200μl当たり約5～7×106相対光単位(RLU)であった。アクリジニウムエステルの化学発光は、Centro LB 960発光測定装置(Berthold Technologies GmbH & Co. KG)を用いて測定した。
hDPP3結合アッセイ：標識して希釈した検出抗体(トレーサ)をプレートに200μl満たし、2～8℃で2～4時間インキュベートした。350μlの洗浄溶液(20 mM PBS、pH 7.4、0.1％トリトン X-100)を用いて4回洗浄することにより、結合しなかったトレーサーを除去した。よく結合した抗体の化学発光を、Centro LB 960発光測定装置(Berthold Technologies GmbH & Co. KG)を用いて測定した。
抗体の特徴づけ - hDPP3阻害分析
さまざまな抗体と抗体クローンによるDPP3阻害能力を分析するため、既知の手続き(Jones他、1982年)でDPP3活性アッセイを実施した。GSTタグ付き組み換えhDPP3をアッセイバッファー(50 mMのトリス-HCl、pH 7.5と100μMのZnCl2の中に25 ng/mlのGST-DPP3)の中で希釈し、この溶液200μlを10μgの各抗体とともに室温でインキュベートした。予備インキュベーションの1時間後、蛍光基質Arg-Arg-βNA(20μl、2 mM)をこの溶液に添加し、Twinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計(Berthold Technologies GmbH & Co. KG)を用いて遊離βNAの生成を37℃でモニターした。βNAの蛍光は、340 nmで励起させ、410 nmで発光を測定することによって検出する。異なるサンプルについて増加していく蛍光の勾配(単位はRFU/分)を計算する。バッファー対照による天然のヒトDPP3の勾配を100％活性とする。可能な捕捉バインダの阻害活性は、前記捕捉バインダとともにインキュベートすることによるGST-hDPP3活性の低下(単位は％)と定義する。
下記の表は、得られた一連の抗体とその結合率(単位は相対光単位(RLU))のほか、相対阻害能力(％；表6)を表わしている。下記のDPP3領域に対するモノクローナル抗体を、組み換えDPP3及び/又は免疫化ペプチドに結合する能力と、その阻害能力によって選択した。
組み換えhDPP3のGSTタグ付き完全長形態に対するすべての抗体が、固定化されたGSTタグ付きhDPP3への強い結合を示した。配列番号35のペプチドに対する抗体もGST-hDPP3に結合する。配列番号35の抗体も免疫化ペプチドに強く結合する。
表6：完全長hDPP3又はhDPP3の配列に対する抗体と、hDPP3(配列番号34)又は免疫化ペプチド(配列番号35)への結合能力(単位はRLU)のほか、組み換えGST- hDPP3の最大阻害率のリスト
Figure 2023516615000008
DPP3タンパク質の濃度を定量するための蛍光イムノアッセイ(DPP3-LIA)と、DPP3活性を定量するための酵素捕捉活性アッセイ(DPP3-ECA)の開発が最近報告された(Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953)。この論文は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
実施例7 - ショックにおけるDPP3
敗血症/敗血症性ショック及び心原性ショックを患っている患者の血漿中のDPP3濃度を測定し、患者の早期死亡率と関連づけた。
a) 研究コホート - 敗血症/敗血症性ショック
アドレノメデュリンと、重症敗血症及び敗血症性ショックにおける転帰(AdrenOSS)の研究の患者からの574の血漿サンプルを、DPP3に関して計測した。AdrenOSSは、敗血症又は敗血症性ショックで集中治療ユニットに収容された583人の患者を含む前向き観察多国試験である(Hollinger et al., 2018)。292人の患者が敗血症性ショックと診断された。
b) 研究コホート - 心原性ショック
心原性ショックと診断された108人の患者からの血漿サンプルをDPP3に関してスクリーニングした。心原性ショックの検出から6時間以内に血液を採取した。死亡を7日間にわたって追跡した。
hDPP3イムノアッセイ：ヒトDPP3の量を検出するイムノアッセイ(LIA)又はヒトDPP3の活性を検出する活性アッセイ(ECA)を利用して患者の血漿に含まれるDPP3のレベルを求めた。抗体の固定化、標識化、インキュベーションは、Rehfeldら(Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953)が記載しているようにして実施した。
結果
敗血症患者における早期患者生存率は、入院時のDPP3血漿濃度と関係していた。DPP3血漿濃度が40.5 ng/ml(第3四分位数)を超える患者は、DPP3血漿濃度がこの閾値よりも低い患者と比べて死亡するリスクが増大していた(図7A)。敗血症性ショック患者のサブコホートに同じカットオフ値を適用すると、高いDPP3血漿濃度に関連した早期死亡のより一層顕著なリスクを明らかになった(図7B)。同じカットオフ値を心原性ショックの患者に適用するとき、DPP3が高い患者で7日以内の早期死亡に関するリスクが増大していることがやはり観察される(図7C)。
実施例8 - 敗血症性ショックを患っている患者のNT-ADM抗体(AdrenOSS-2)
AdrenOSS-2は、敗血症性ショック及び高アドレノメデュリンを患っている患者における、アドレシズマブと称されるN末端ADM抗体の安全性、耐容性及び有効性を調査するための、二重盲検、プラセボ対照、無作為化、マルチセンター、概念実証及び用量設定II相臨床試験である(Geven et al. BMJ Open 2019;9:e024475)。合計で、敗血症性ショックを患っており、かつ、bio-ADM濃度＞70pg/mLを有する301人の患者を、プラセボ(n=152)、アドレシズマブ2ng/kg(n=72)又はアドレシズマブ4ng/kg(n=77)のいずれかを用いて約1時間にわたる単回の静脈内注入により治療するために無作為化した(2：1：1)。組み込み後28(90)日以内のあらゆる原因による死亡率は25.8%(34.8%)であった。平均年齢は68.4歳であり、そして、61%は男性であった。プロトコールに従った分析に関して、n=294人の患者は、適格なままであり、そして14日の原因を問わない死亡率は18.5%であった。
(両方の用量を合わせて、プロトコール集団単位で)アドレシズマブを用いて治療した患者において、プラセボと比較して、早期死亡率(入院後14日間)を下げる傾向が観察された(危険率(HR)0.701 [0.408-1.21]、p=0.100)(図8)。驚いたことに、入院時に50ng/mL未満のDPP3濃度を有する患者では、処置効果はより明白であったが(n=244、HR 0.426、p=0.007)(図9)、高いDPP3(50ng/mL超、n=44)を有する患者では、転帰はアドレシズマブとプラセボの間で匹敵していた(HR1.69、p=0.209)(図10)。様々なDPP3閾値の治療効果(14日死亡率)を表7にまとめる。
表7. 様々なDPP3濃度を用いた14日死亡率の危険率(HR)
Figure 2023516615000009
配列
配列番号1
GYTFSRYW
配列番号2
ILPGSGST
配列番号3
TEGYEYDGFDY
配列番号4
QSIVYSNGNTY
配列「RVS」(配列表の一部でない)：
RVS
配列番号5
FQGSHIPYT
配列番号6(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号7(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号8(AM-VH2E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号9(AM-VH3-T26E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号10(AM-VH4-T26E40E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
配列番号11(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号12(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号13(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号14(ヒトADMの1～21位)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
配列番号15(ヒトADMの21～32位)
CTVQKLAHQIYQ
配列番号16(ヒトADM C-42～52位)
CAPRSKISPQGY-CONH2
配列番号17(マウスADMの1～19位)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
配列番号18(マウスADMの19～31位)
CTFQKLAHQIYQ
配列番号19(マウスADM C-40～50位)
CAPRNKISPQGY-CONH2
配列番号20(成熟ヒトアドレノメデュリン(成熟ADM)；アミド化ADM；bio-ADM)：pro-ADMの第1～52アミノ酸又は第95～146アミノ酸
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH2
配列番号21(マウスADMの1～50位)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGY-CONH2
配列番号22 (ヒトADMの1～21位)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
配列番号23 (ヒトADMの1～42位)：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
配列番号24(ヒトADMのaa43～52)
PRSKISPQGY-NH2
配列番号25(ヒトADMのaa1～14)
YRQSMNNFQGLRSF
配列番号26(ヒトADMのaa1～10)
YRQSMNNFQG
配列番号27(ヒトADMのaa1～6)
YRQSMN
配列番号28(ヒトADMのaa1～32)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ
配列番号29(マウスADMのaa1～40)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA
配列番号30(マウスADMのaa1～31)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL
配列番号31(proADM：164個のアミノ酸(preproADMの22～185位)
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
配列番号32(アドレシズマブ重鎖)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号33(アドレシズマブ軽鎖)
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号34 - ヒトDPP3(第1～737アミノ酸)
MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLE YEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA
配列番号35 - ヒトDPP3(第474～493アミノ酸(N-Cys)) - 追加のN-末端Cysteinを有する免疫化ペプチド
CETVINPETGEQIQSWYRSGE
配列番号36 - IGHV1-69*11
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
配列番号37 - HB3
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSS

Claims (28)

  1. ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記方法は、
    ・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
    ・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
    ・前記サンプル中のDPP3レベルが、抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を用いた治療が必要であるかどうかを示唆すること、
    を含み、及び
    ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法。
  2. 請求項1に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記方法は、
    ・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3(DPP3)のレベルを測定し、
    ・前記測定したDPP3レベルを事前に定めた閾値と比較し、そして
    ・抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を前記患者に投与することであって、ここで、前記測定したDPP3レベルが事前に定めた閾値を下回っている場合、前記患者は、前記抗アドレノメデュリン(ADM)抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場を用いて治療されること、
    を含み、及び
    ここで、前記抗ADM抗体又は抗ADMフラグメント又は抗ADM非Ig足場が、ADMのN-末端部(第1～21アミノ酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC(配列番号14)に結合する、方法。
  3. 請求項1又は2に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ショックが、血液量減少によるショック、心原性ショック、血管閉塞性ショック及び血液分布異常性ショックを含む群から選択され、特に心原性ショック又は敗血症性ショックである、方法。
  4. 請求項1～3のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、以下の：
    ・心原性ショックの場合には、前記患者は、急性冠状動脈症候群(例えば、急性心筋梗塞)に罹患している可能性があるか、又は前記患者は、心不全(例えば、急性非代償性心不全)、心筋炎、不整脈、心筋症、心臓弁膜症、急性大動脈弁狭窄症を伴った大動脈解離、外傷性腱索断裂又は広範肺塞栓症を患っているか、或いは
    ・循環血液量減少性ショックの場合には、前記患者は、胃腸出血、外傷、血管性病因(例えば、腹部大動脈瘤破裂、主要な血管内への腫瘍浸潤)及び抗凝血物質使用中の特発出血を含めた出血性疾患、又は嘔吐、下痢、腎臓からの喪失、皮膚からの喪失/不感性の喪失(例えば、熱傷、熱中症)、若しくは膵炎、肝硬変、腸閉塞及び外傷中のサードスペースへの喪失を含めた非出血性疾患に罹患している可能性があるか、或いは
    ・血管閉塞性ショックの場合には、前記患者は、心タンポナーデ、緊張性気胸、肺塞栓症又は大動脈弁狭窄症に罹患している可能性があるか、或いは
    ・血液分布異常性ショックの場合には、前記患者は、敗血症性ショック、神経原性ショック、アナフィラキシーショック又は副腎クリーゼによるショックを患っている可能性がある、方法。
  5. 請求項1～4のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記対象の体液サンプル中の前記事前に定めたDPP3の閾値は20～120ng/mLであり、より好ましい前記閾値は30～80ng/mLであり、より一層好ましい前記閾値は40～60ng/mLであり、最も好ましい前記閾値は50ng/mLである、方法。
  6. 請求項1～5のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、DPP3タンパク質のレベル及び/又は活性DPP3のレベルのいずれかが測定され、そして、事前に定めた閾値と比較される、方法。
  7. 請求項1～6のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される、方法。
  8. 請求項1～7のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダは、抗体、抗体フラグメント、又は非IgG足場を含む群から選択され得る、方法。
  9. 請求項1～8のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダが抗体である、方法。
  10. 請求項1～9のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記測定は、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダの使用を含み、ここで、前記捕捉バインダが表面に固定される、方法。
  11. 請求項1～10のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3タンパク質の量及び/又はDPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記分離ステップは、捕捉されているDPP3から前記捕捉バインダに結合していないサンプルの構成要素を取り除く洗浄ステップである、方法。
  12. 請求項1～11のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記対象の体液サンプル中のDPP3活性を測定する方法が、以下のステップ：
    ・前記サンプルを、完全長のDPP3に特異的に結合する捕捉バインダと接触させ、
    ・前記捕捉バインダに結合しているDPP3を分離し、
    ・前記分離したDPP3にDPP3の基質を加え、
    ・DPP3の基質の変換を計測し、定量化することにより前記DPP3活性を定量化すること、
    を含む、方法。
  13. 請求項1～12のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記DPP3基質変換は、以下の：蛍光発生基質(例えば、Arg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC)の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに連結された基質の発光(Promega Protease-Glo(商標) Assay)、質量スペクトロメトリー、HPLC/FPLC(逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー)、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、活性染色後のゲル電気泳動(固定された、活性DPP3)又はウエスタンブロット法(切断産物)、を含む群から選択される方法によって検出される、方法。
  14. 請求項1～13のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記基質は：アンギオテンシンII、III及びIV、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1及び2、バロルフィン、β-カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH及びMSH、又はフルオロフォア、発色団若しくはアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドがArg-Argである、方法。
  15. 請求項1～14のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3活性は、前記対象の体液サンプルで測定され、かつ、前記基質は：フルオロフォア、発色団又はアミノルシフェリンに連結されたジペプチド、を含む群から選択され得、ここで、該ジペプチドがArg-Argである、方法。
  16. 請求項1～15のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者が、閾値を超えるADM-NH2レベルを有することを更なる特徴とする、方法。
  17. 請求項16に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者の体液サンプル中のADM-NH2の前記閾値は40～100pg/mLであり、より好ましい前記閾値は50～90pg/mLであり、より一層好ましい前記閾値は60～80pg/mLであり、最も好ましい前記閾値は70pg/mLである、方法。
  18. 請求項16又は17に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ADM-NH2のレベルが、前記体液サンプルをADM-NH2に特異的に結合する捕捉バインダと接触させることによって測定される、方法。
  19. 請求項1～18のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記患者の体液サンプルは、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液(CSF)、及び唾液の群から選択される、方法。
  20. 請求項1～19のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが組み合わせて測定される、方法。
  21. 請求項20に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが同時に測定される、方法。
  22. 請求項20又は21に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記DPP3のレベルとADM-NH2のレベルが、ポイント・オブ・ケア・デバイスを使用して測定される、方法。
  23. 請求項22に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記ポイント・オブ・ケア・デバイスが、マイクロ流体デバイスである、方法。
  24. 請求項1～23のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗ADM抗体又は抗ADM抗体フラグメント又は抗ADM非Ig足場は、ADMのN末端末端(第1アミノ酸)を認識し、そして結合する、方法。
  25. 請求項1～24のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体、抗体フラグメント又は非Ig足場が、ADMの第43～52配列アミノ酸を有するADMのC末端の一部：PRSKISPQGY-NH2(配列番号24)には結合しない、方法。
  26. 請求項1～25のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントは、ADM若しくはその抗体フラグメントに結合するモノクローナル抗体若しくはフラグメントであり、ここで、その重鎖が、以下の配列：
    CDR1：配列番号1
    GYTFSRYW
    CDR2：配列番号2
    ILPGSGST
    CDR3：配列番号3
    TEGYEYDGFDY
    を含み、かつ、ここで、その軽鎖が、以下の配列：
    CDR1：配列番号4
    QSIVYSNGNTY
    CDR2：
    RVS
    CDR3：配列番号5
    FQGSHIPYT
    を含む、方法。
  27. 請求項1～26のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントが、VH領域として以下の：
    配列番号6(AM-VH-C)
    QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
    配列番号7(AM-VH1)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
    配列番号8(AM-VH2E40)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
    配列番号9(AM-VH3-T26E55)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
    配列番号10(AM-VH4-T26E40E55)
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
    を含む群から選択される配列を含み、かつ、VL領域として以下の配列：
    配列番号11(AM-VL-C)
    DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    配列番号12(AM-VL1)
    DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    配列番号13(AM-VL2-E40)
    DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    を含む群から選択される配列を含む、方法。
  28. 請求項1～26のいずれか一項に記載の、ショックを患っている患者及び/又はショック状態にある患者における治療法ガイダンス及び/又は治療法モニタリング及び/又は治療法層別化の方法であって、前記抗体又はフラグメントが、重鎖として以下の配列：
    配列番号32
    QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
    又はそれと＞95%同一である配列を含み、かつ、軽鎖として以下の配列：
    配列番号33
    DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
    又はそれと＞95%同一である配列を含み、
    ここで、その重鎖が、以下の配列：
    CDR1：配列番号1
    GYTFSRYW
    CDR2：配列番号2
    ILPGSGST
    CDR3：配列番号3
    TEGYEYDGFDY
    を含み、かつ、ここで、その軽鎖が、以下の配列：
    CDR1：配列番号4
    QSIVYSNGNTY
    CDR2：
    RVS
    CDR3：配列番号5
    FQGSHIPYT
    を含む、方法。
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