JP2023518731A

JP2023518731A - コロナウイルスに感染した患者におけるｄｐｐ３

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Publication number: JP2023518731A
Application number: JP2022555783A
Authority: JP
Inventors: ベルクマンアンドレアス
Original assignee: ４ティーン４ファーマシューティカルズゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2023-05-08
Also published as: WO2021185786A1; CN115769076A; MX2022011583A; US20230213519A1; CA3171332A1; AU2021237689A1; EP4121763A1; BR112022017277A2

Abstract

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための方法であり、この方法は、前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3（DPP3）のレベルを測定すること、測定されたDPP3の前記レベルをあらかじめ決められた域値と比較すること、および測定されたDPP3の前記レベルを、生命を脅かす悪化または有害事象のリスクと相関させること、または測定されたDPP3の前記レベルを重症度と相関させること、または測定されたDPP3の前記レベルを療法または介入の成功と相関させること、または測定されたDPP3の前記レベルをある療法または介入と相関させること、または測定されたDPP3の前記レベルを前記患者の管理と相関させることを含む。本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、DPP3活性の阻害剤である。

Description

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための方法であり、この方法は、
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3（DPP3）のレベルを測定すること、
・測定されたDPP3の前記レベルをあらかじめ決められた域値と比較すること、および
・測定されたDPP3の前記レベルを、生命を脅かす悪化または有害事象のリスクと相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを重症度と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを療法または介入の成功と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルをある療法または介入と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを前記患者の管理と相関させることを含む。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、DPP3活性の阻害剤である。

ジペプチジルペプチダーゼ3は、ジペプチジルアミノペプチダーゼIII、ジペプチジルアリールアミダーゼIII、ジペプチジルペプチダーゼIII、エンケファリナーゼB、または赤血球アンジオテンシナーゼ；略号DPP3、DPPIIIとしても知られており、生理学的に活性なペプチド（エンケファリンやアンジオテンシンなど）からジペプチドを除去するメタロペプチダーゼである。DPP3は、EllisとNuenke 1967年により、精製されたウシ下垂体前葉の抽出液から初めて同定されてその活性が測定された。この酵素はEC 3.4.14.4として掲載されており、約83 kDaの分子量を持ち、原核生物と真核生物でよく保存されている（Prajapati & Chauhan 2011）。ヒトバリアントのアミノ酸配列が配列番号1に示されている。ジペプチジルペプチダーゼIIIは、普遍的に発現している主に細胞質ゾルのペプチダーゼである。シグナル配列が欠けているとはいえ、いくつかの研究が膜活性を報告した（Lee & Snyder 1982）。

DPP3は、ペプチダーゼファミリーM49に属する亜鉛依存性エキソペプチダーゼである。DPP3はさまざまな組成の3／4～10個のアミノ酸のオリゴペプチドに対する広い基質特異性を持ち、プロリンの後で切断することもできる。DPP3は、その基質（アンジオテンシンII、III、およびIV；LeuエンケファリンとMet-エンケファリン；エンドモルフィン1と2が含まれる）のN末端からジペプチドを加水分解することが知られている。メタロペプチダーゼDPP3は、pH 8.0～9.0でその活性が最適であり、2価金属イオン（Co²⁺やMg²⁺など）の添加によって活性化させることができる。DPP3の構造分析から、触媒モチーフHELLGH（ヒトDPP3［hDPP3］450～455）とEECRAE（hDPP3 507～512）のほか、基質の結合と加水分解にとって重要な以下のアミノ酸、すなわちGlu316、Tyr318、Asp366、Asn391、Asn394、His568、Arg572、Arg577、Lys666、およびArg699が明らかになった（Prajapati & Chauhan 2011; Kumar et al. 2016；番号づけはヒトDPP3の配列に関する；配列番号1参照）。基質の結合と加水分解に関与するあらゆる既知のアミノ酸または配列領域を考慮すると、ヒトDPP3の活性部位がアミノ酸316と669の間の領域であることを明確にできる。

DPP3の最も重要な基質は、レニン-アンジオテンシン系（RAS）の主要なエフェクタであるアンジオテンシンII（Ang II）である。RASが活性化されているのは、心血管疾患（Dostal et al. 1997. J Mol Cell Cardiol;29: 2893-902; Roks et al. 1997. Heart Vessels. Suppl 12:119-24）、敗血症、および敗血症性ショック（Correa et al. 2015. Crit Care 19: 98）においてである。特にAng IIは、多くの心血管機能（血圧の制御と心臓リモデリングが含まれる）を変化させることが示されている。

最近、ヒト体液（例えば血液、血漿、血清）中のDPP3を特異的に検出する2つのアッセイが生み出され、特徴づけられ、検証された。すなわち、DPP3タンパク質の濃度を検出するルミネセンス・イムノアッセイ（LIA）と、特異的DPP3活性を検出する酵素捕獲活性アッセイ（ECA）である（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）。洗浄工程で干渉するあらゆる基質が除去された後、DPP3活性が実際に検出される。どちらの方法も高度に特異的であるため、血液サンプル中のDPP3の再現可能な検出が可能である。

循環しているDPP3のレベルは心原性ショックの患者で上昇していることが示されており、早期死亡と重度の臓器障害のリスク増大と関係している（Deaniau et al. 2019. Eur J Heart Fail. 印刷中）。さらに、登録時に測定されたDPP3から、心原性ショックの患者が実際に難治性ショックとへと発展した患者と非難治性ショックの患者に識別され、DPP3の濃度が59.1 ng/mL以上であることが、死亡のより大きなリスクと関係していた（Takagi et al. 2020. Eur J Heart Fail. 22(2): 279-286）。

WO2017/182561には、壊死プロセスに関係する疾患を診断するため患者のサンプル中の活性なDPP3の総量を求める方法が記載されている。そこにはさらに、DPP3に対する抗体によって壊死関連疾患を治療する方法が記載されている。

WO2019/081595には、特定のDPP3エピトープに向けられてそれに結合するDPP3バインダと、酸化性ストレスと関係する疾患の予防または治療へのその利用が記載されている。

プロシズマブは循環しているDPP3に特異的に結合するヒト化モノクローナルIgG1抗体であり、心血管機能の不可欠な1つの調節因子であるDPP3活性を標的としてその活性を変化させる。その作用様式は、大量の細胞死と血流への細胞内DPP3の制御されない放出に関係する急性疾患において重要である。転座したDPP3は循環の中で活性なままであり、生物活性なペプチドを制御されないやり方で切断する。プロシズマブは循環しているDPP3を妨害することができるため、血流中の生物活性なペプチドの分解を阻害する。この妨害の結果、心血管機能と腎機能が安定し、早期死亡率が低下する。実施例の部分に示されているように、心血管不全の動物モデルにおけるプロシズマブの臨床前研究は、印象的かつ即時的な効果を示した。一例として、ショックによって誘導した心血管不全を持つラットにプロシズマブを注射すると、短縮がただちに正常化した。いくつかの臨床前心血管不全モデルにおいて、プロシズマブは臨床で重要なあらゆるエンドポイントを生体内で改善することが示された。プロシズマブは、駆出率と腎機能を正常化し、死亡率を低下させる。

コロナウイルスがヒトと他のいくつかの脊椎動物の間に広がっており、呼吸器、腸、肝臓、および神経の疾患を引き起こしている。注目すべきことに、2003年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）と2012年の中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）はヒトでエピデミックを引き起こした。SARS-CoVとの比較から、いくつかの有意な違いと類似性がわかる。MERS CoVとSARS-CoVの両方とも、はるかに高い致死率を持つ（それぞれ40％と10％）（de Wit et al. 2016. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nat Rev Microbiol 14(8):523-34; Zhou et al. 2020. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579 (7798): 270-273）。現在のSARS CoV-2はそのゲノムがSARS-CoVと79％共通するが、はるかに伝染しやすいように見える。両方のSARS-CoVがアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体を通じて細胞の中に入る（Wan et al. 2020. Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS. J Virol 94(7): e00127-20）。SARS-CoV2によって起こる疾患はコロナウイルス疾患2019（COVID-19）と呼ばれる。

SARS-CoV-2は最初に下部気道に優先的に感染し、肺胞上皮細胞の表面のACE2に結合する。両方のウイルスが炎症性サイトカインの強力な誘導因子である。「サイトカインストーム」または「サイトカインカスケード」は臓器損傷に関して仮定されている機構である。このウイルスは免疫細胞を活性化させ、炎症性サイトカインとケモカインの分泌を誘導して肺血管内皮細胞の中に入る。

SARS-CoV-2感染症の臨床スペクトルは広いように見え、非症状性感染、軽症上部呼吸管病、および重症ウイルス性肺炎で呼吸不全、さらには死さえ伴うものを包含し、多くの患者が肺炎で入院している（Huang et al. 2020 Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 395: 497-506; Wang et al. 2020 Clinical characteristics of 138 hospitalized patients with 2019 novel coronavirus-infected pneumonia in Wuhan, China. JAMA 323(11):1061-1069; Chen et al. 2020. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet 395: 507-13）。

ごく最近、高齢であること、d-二量体のレベルが上昇していること、および大きなSOFAスコアであることが、予後の悪いCOVID-19の患者を臨床医が初期段階で同定するのに役立つことが提案された（Zhou et al. 2020. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. The Lancet, 395 (10229): 1054-1062）。

コロナウイルス感染症の患者では、体液サンプル中のDPP3のレベルが、（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を予想するための、または（c）コロナウイルスに感染した患者で治療または介入の成功を予測またはモニタするための方法として利用されるべきである、というのが本発明の驚くべき発見である。さらに、本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入に利用するための、DPP3活性の阻害剤である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための方法であり、前記コロナウイルスは、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記有害事象は、死亡、臓器不全、およびショックを含むグループから選択される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、測定されたDPP3の前記レベルは、あらかじめ決められた域値よりも上である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記対象の体液サンプル中のDPP3の前記あらかじめ決められた域値は、20と120 ng/mLの間、より好ましくは30と80 ng/mLの間、より一層好ましくは40と60 ng/mLの間、最も好ましくは50 ng/mLである。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記患者は、3以上のSOFAスコア、好ましくは7以上のSOFAスコアを持つか、1以上、好ましくは2以上のquickSOFAスコアを持つ。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記患者は、0.5 μg/ml以上、好ましくは1.0 μg/ml以上のD-二量体のレベルを持つ。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させることによって測定される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記測定は、完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダは、抗体、抗体フラグメント、または非IgG足場のグループから選択することができる。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3タンパク質および／DPP3活性の量は前記対象の体液サンプル中で測定され、前記測定は完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダは抗体である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3タンパク質および／DPP3活性の量は前記対象の体液サンプル中で測定され、前記測定は完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダはある表面に固定化されている。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3タンパク質および／DPP3活性の量は前記対象の体液サンプル中で測定され、前記分離工程は、捕獲されたDPP3からサンプルの成分で前記捕獲バインダに結合していない成分を除去する洗浄工程である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、前記対象の体液サンプル中のDPP3活性を測定する方法は、
・前記サンプルを完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させる工程、
・前記捕獲バインダに結合したDPP3を分離する工程、
・DPP3の基質を前記分離されたDPP3に添加する工程、
・DPP3の基質の変換を測定して定量することにより前記DPP3活性を定量する工程を含む。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3活性は前記対象の体液サンプル中で測定され、DPP3基質の変換は、蛍光発生基質（例えばArg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC）の蛍光、発色基質の色彩変化、アミノルシフェリンにカップルした基質のルミネセンス、質量分析、HPLC/FPLC（逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ）、薄層クロマトグラフィ、キャピラリゾーン電気泳動、ゲル電気泳動とそれに続く活性染色（固定化された活性なDPP3）、またはウエスタンブロット（切断産物）を含むグループから選択される方法によって検出される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3活性は、前記対象の体液サンプルの中で求められ、前記基質は、アンジオテンシンII、III、およびIV、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1と2、バロルフィン、β-カソモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH、およびMSHを含むか、蛍光体、色素体、またはアミノルシフェリンにカップルしたジペプチドを含むグループから選択することができ、前記ジペプチドはArg-Argである。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明による方法であり、DPP3活性は前記対象の体液サンプルの中で測定され、前記基質は、蛍光体、色素体、またはアミノルシフェリンにカップルしたジペプチドを含むグループから選択することができ、前記ジペプチドはArg-Argである。

図1：低い（68.6 ng/ml未満）DPP3血漿濃度および高い（68.6 ng/ml以上）DPP3血漿濃度と関係するカプラン・マイヤー生存率プロット（A）DPP3血漿濃度（カットオフ68.6 ng/ml）と関係する敗血症／敗血症性ショックの患者の7日生存率；（B）DPP3血漿濃度（カットオフ68.6 ng/ml）と関係する心原性ショックの患者の7日生存率；（C）DPP3血漿濃度（カットオフ68.6 ng/ml）と関係する急性心筋梗塞の患者の7日生存率；（D）DPP3血漿濃度と関係する呼吸困難の患者の3ヶ月生存率；（E）DPP3血漿濃度と関係する火傷患者の4週間生存率。

図2：ヒト赤血球ライセートから精製した天然hDDP3の勾配ゲル（4～20％）上でのSDS-PAGE。分子量マーカーが矢印で示されている。

図3：実験設計 - 動物モデルにおける天然DPP3の効果。

図4：（A）DPP3の注射によって短縮率の減少が起こるため、心臓機能の悪化につながる。（B）低下した腎機能は、増加した腎血管抵抗指数を通じても観察される。

図5：Octetを用いたAK1967-DPP3結合分析の会合と解離の曲線。AK1967をロードしたバイオセンサーを組み換えGSTタグ付きヒトDPP3（100、33.3、11.1、3.7 nM）の希釈系列に浸し、会合と解離をモニタした。

図6：血液細胞ライセートの希釈液のウエスタンブロットと、一次抗体としてAK1967を用いたDPP3の検出。

図7：阻害性抗体AK1967による血液細胞からの天然DPP3の阻害曲線。特異的抗体によるDPP3の阻害は濃度に依存し、15 ng/mlのDPP3に対して分析するときIC₅₀は約15 ng/mlである

図8：実験の設定 - 敗血症によって誘導される心不全におけるプロシズマブの効果。

図9：プロシズマブは、敗血症によって誘導された心不全のマウスで短縮率（A）と死亡率（B）を劇的に改善する。

図10：実験設計 - マウスで心臓ストレスをイソプロテレノールによって誘導した後の、プロシズマブ治療（B）と対照（A）。

図11：イソプロテレノールによって誘導された心不全のマウスにおいて、プロシズマブは、投与からそれぞれ1時間以内と6時間以内に短縮率（A）を改善し、腎血管抵抗指数（B）を低下させた。

図12：実験の設定 - DPP3を注射された健康なマウスにおけるバルサルタンの効果。

図13：DPP3による短縮率の減少はバルサルタン治療によって回復する。

図14：敗血症患者の入院24時間後の高濃度のDPP3レベルは最悪のSOFAスコアと関係していた。

図15：高いcDPP3血漿レベルは敗血症患者における臓器障害と相関している。ICUに滞在している間のDPP3レベルの変化による、AdrenOSS-1でのSOFAスコアの棒グラフ。HH：入院時と24時間の時点で中央値をよりも上のDPP3；HL：入院時に中央値よりも上だが24時間の時点で中央値よりも下；LL：入院時と24時間の時点で中央値よりも下；LH：入院時に中央値よりも下だが24時間の時点で中央値よりも上。

図16：敗血症患者入院24時間後の高濃度のDPP3レベルは、臓器ごとの最悪のSOFAスコアと関係していた。入院時と24時間の時点の間に変動するcDPP3のレベルによる、（A）心臓系、（B）腎臓系、（C）呼吸系、（D）肝臓系、（E）凝血系、および（F）中枢神経系のSOFAスコアの値（HH：高／高、HL：高／低、LH：低／高、LL：低／低）。図16：敗血症患者入院24時間後の高濃度のDPP3レベルは、臓器ごとの最悪のSOFAスコアと関係していた。入院時と24時間の時点の間に変動するcDPP3のレベルによる、（A）心臓系、（B）腎臓系、（C）呼吸系、（D）肝臓系、（E）凝血系、および（F）中枢神経系のSOFAスコアの値（HH：高／高、HL：高／低、LH：低／高、LL：低／低）。図16：敗血症患者入院24時間後の高濃度のDPP3レベルは、臓器ごとの最悪のSOFAスコアと関係していた。入院時と24時間の時点の間に変動するcDPP3のレベルによる、（A）心臓系、（B）腎臓系、（C）呼吸系、（D）肝臓系、（E）凝血系、および（F）中枢神経系のSOFAスコアの値（HH：高／高、HL：高／低、LH：低／高、LL：低／低）。

図17：ICU入院時の高レベルのDPP3は、その後の48時間における腎機能の悪化と関係している。Y軸：1日目（ICU入院）の時点で測定したDPP3。X軸：KDIGOステージ0または1、またはステージ2または3（p＝0.002）。

図18：ICU滞在中のDPP3の逐次的測定はCOVID-19患者の疾患重症度と関係している。Aは、DPP3のレベルをICU入院から3日目に測定し（p＝0.002）、Bは、ICU入院から7日目に測定した（p＝0.013）。X軸：偽＝P/F比が150超；真＝P/F比が150未満。

図19：ICU滞在中の大きなDPP3値はCOVID-19患者の悪い転帰と関係している。Aは、DPP3のレベルをICU入院から3日目に測定し、Bは、ICU入院から7日目に測定した。X軸：0＝生存、1＝死亡。

図20：ICU入院時の高レベルのDPP3は、ICU滞在中の昇圧剤療法の必要性と関係している（3日目、p＝0.05）。Y軸：1日目（ICU入院）に測定したDPP3。X軸：なし：昇圧剤治療なし、またはあり：ICU滞在中に昇圧剤治療。

図21：ICU滞在中のDPP3の逐次的測定は臓器支援療法（特に静脈脱血-静脈送血ECMO）の必要性と関係している。DPP3のレベルの測定をAではICU入院から3日目に（p＝0.03）、BではICU入院から7日目に（p＝0.04）実施した。X軸：0＝ECMOなし；1＝ECMOあり。

本発明の特別な一実施形態では、DPP3の前記レベルは少なくとも2回測定される。

本発明の別の特別な一実施形態では、DPP3のレベルの前記少なくとも第2の測定は、2時間以内に、好ましくは4時間以内に、より好ましくは6時間以内に、より一層好ましくは12時間以内に、より一層好ましくは24時間以内に、最も好ましくは48時間以内になされる。

これは、「DPP3の以前に測定されたレベル」という表現が、本発明のすべての主題を通じ、前記以前に測定された量が2時間以内に、好ましくは4時間以内に、より好ましくは6時間以内に、より一層好ましくは12時間以内に、より一層好ましくは24時間以内に、最も好ましくは48時間以内に測定された量であると理解されることを意味する。1つの測定と以前の1つの測定の間の差は、前記患者から異なる時点に採取された異なるサンプル中のDPP3の前記レベルの間の相対差である。

本発明の別の特別な一実施形態では、DPP3の前記レベルは、前記患者から異なる時点に採取された異なるサンプル中で測定される。

本発明の別の特別な一実施形態では、前記患者から異なる時点に採取された異なるサンプル中のDPP3の前記レベルの間の差が求められる。その差は、絶対差または相対差として求められる。

本発明の別の特別な一実施形態では、療法は、前記患者から異なる時点に採取された異なるサンプル中のDPP3の前記レベルの間の前記相対差が100％以上、より好ましくは75％以上、より一層好ましくは50％以上、最も好ましくは25％以上であるときに開始される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための本発明の請求項による方法であり、前記患者はDPP3活性の阻害剤で治療される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、DPP3活性の阻害剤である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記コロナウイルスは、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記患者は、本発明のいずれかに従う方法によって測定したとき、その対象の体液サンプル中のDPP3のレベルがあらかじめ決められた域値よりも上である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記患者は、3以上、好ましくは7以上のSOFAスコア、または1以上、好ましくは2以上のquickSOFAスコアを持つ。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記患者は、0.5 μg/ml以上、好ましくは1.0 μg/ml以上のD二量体のレベルを持つ。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、DPP3活性の前記阻害剤は、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場を含むグループから選択される。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記阻害剤は、配列番号1に含まれる少なくとも4～5個の長さのアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記阻害剤は、配列番号2に含まれる少なくとも4～5個の長さのアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記阻害剤は、DPP3への最小結合親和性が10^-7 M以下を示す抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記阻害剤は、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場であり、DPP3の活性を少なくとも10％、または少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは70％超、より一層好ましくは80％超、より一層好ましくは90％超、より一層好ましくは95％超阻害する。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記抗体はモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、重鎖の中の相補性決定領域（CDR）は、配列番号7、配列番号8、および／または配列番号9の配列を含み、軽鎖の中の相補性決定領域（CDR）は、配列番号10、KVS、および／または配列番号11の配列を含む。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明によるDPP3活性の阻害剤であり、前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、ヒト化モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである。

本出願の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するためのDPP3活性の阻害剤であり、前記重鎖は配列番号12の配列を含み、前記軽鎖は配列番号13の配列を含む。

本発明の一実施形態では、DPP3タンパク質のレベルおよび／または活性なDPP3のレベルのいずれかが測定されて域値レベルと比較される。

本発明の特別な一実施形態では、前記患者の体液サンプル中のDPP3の域値は、20と120 ng/mLの間、より好ましくは30と80 ng/mLの間、より一層好ましくは40と60 ng/mLの間、最も好ましくは50 ng/mLである。

本発明の特別な一実施形態では、DPP3のレベルの域値は、正常で健康な集団の濃度中央値の5倍、好ましくは濃度中央値の4倍、より好ましくは濃度中央値の3倍、最も好ましくは濃度中央値の2倍である。

前記対象の体液サンプル中のDPP3タンパク質および／またはDPP3活性の量としてのDPP3のレベルは、異なる方法（例えばイムノアッセイ、活性アッセイ、質量分析法など）によって測定することができる。

DPP3活性は、DPP3特異的基質の切断産物の検出によって測定することができる。既知のペプチドホルモン基質に含まれるのは、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1と2、バロルフィン、β-カソモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH（副腎皮質刺激ホルモン）、およびMSH（メラノサイト刺激ホルモン；Abramic et al. 2000, Barsun et al. 2007, Dhanda et al. 2008）である。言及したペプチドホルモンのほか、他のタグなしオリゴペプチド（例えばAla-Ala-Ala-Ala、Dhanda et al. 2008）の切断は、それぞれの切断産物を検出することによってモニタすることができる。検出法の非限定的な例に含まれるのは、HPLC分析（例えばLee & Snyder 1982）、質量分析（例えばAbramic et al. 2000）、H1-NMR分析（例えばVandenberg et al. 1985）、キャピラリゾーン電気泳動（CE；例えばBarsun et al. 2007）、薄層クロマトグラフィ（例えばDhanda et al. 2008）、または逆相クロマトグラフィ（例えばMazocco et al. 2006）である。

DPP3による蛍光性基質の加水分解に起因する蛍光の検出は、DPP3活性をモニタするための標準的な手続きである。これら基質は、蛍光体にカップルした特異的ジペプチドまたはトリペプチド（Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe）である。蛍光体の非限定的な例に含まれるのは、β-ナフチルアミド（2-ナフチルアミド、βNA、2NA）、4-メトキシ-β-ナフチルアミド(4-メトキシ-2-ナフチルアミド)、および7-アミド-4-メチルクマリン（AMC、MCA；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999）である。これら蛍光発生基質の切断が、蛍光性のβ-ナフチルアミドまたは7-アミノ-4-メチルクマリンそれぞれの放出につながる。液相アッセイまたはでは、ECA基質とDPP3を例えば96ウエルのプレート形式でインキュベートし、蛍光検出器を用いて蛍光を検出する（Ellis & Nuenke 1967）。それに加え、DPP3を有するサンプルを固定化し、電気泳動によってゲル上で分割し、ゲルを蛍光発生基質（例えばArg-Arg-βNA）とFast Garnet GBCで染色し、蛍光タンパク質のバンドを蛍光リーダーによって検出することができる（Ohkubo et al. 1999）。同じペプチド（Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe）を色素体（二酢酸p-ニトロアニリドなど）にカップルさせることができる。発色基質の加水分解に起因する色彩変化の検出を利用してDPP3活性をモニタすることができる。

DPP3活性を検出する別の選択肢は、（Promegaから市販されている）Protease-Glo（商標）アッセイである。前記方法のこの実施形態では、DPP3特異的ジペプチドまたはトリペプチド（Arg-Arg、Ala-Ala、Ala-Arg、Ala-Phe、Asp-Arg、Gly-Ala、Gly-Arg、Gly-Phe、Leu-Ala、Leu-Gly、Lys-Ala、Phe-Arg、Suc-Ala-Ala-Phe）はアミノルシフェリンにカップルしている。アミノルシフェリンはDPP3によって切断されると放出され、カップルしたルシフェラーゼ反応のための基質として機能して検出可能なルミネセンスを放出する。

好ましい一実施形態では、DPP3活性は蛍光発生基質Arg-Arg-βNAの添加によって測定され、蛍光がリアルタイムでモニタされる。

対象の体液サンプル中の活性なDPP3を測定する前記方法の特別な一実施形態では、DPP3と反応する前記捕獲バインダは固相の表面に固定化される。

試験サンプルを動かないバインダの上を通過させると、DPP3が存在している場合にはバインダに結合してそれ自身が固定化され、検出される。その後基質を添加することができ、反応生成物を検出して試験サンプル中のDPP3の存在または量を示すことができる。本記述の目的では、「固相」という用語は、内部または表面でアッセイを実施することのできる任意の材料または容器を含めるために用いることができ、その非限定的な例に含まれるのは、多孔性材料、非孔性材料、試験管、ウエル、スライド、アガロース樹脂（例えばGE Healthcare Life SciencesからのSepharose）、磁性粒子（例えばThermo Fisher ScientificからのDynabeads（商標）またはPierce（商標）磁性ビーズ）などである。

本発明の別の一実施形態では、DPP3のレベルは、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させることによって測定される。

本発明の別の好ましい一実施形態では、DPP3のレベルを測定するための前記捕獲バインダは、抗体、抗体フラグメント、または非Ig足場のグループから選択することができる。

本発明の特別な一実施形態では、前記捕獲バインダは抗体である。

前記対象の体液サンプル中のDPP3タンパク質および／またはDPP3活性の量は、例えば以下の方法の1つによって測定することができる。

1．DPP3タンパク質の濃度を定量するためのルミネセンス・イムノアッセイ（LIA）（Rehfeld et al., 2019 JALM 3(6): 943-953）。

LIAは、固相として白色の高結合ポリスチレン製微量滴定プレートを用いる一工程の化学発光サンドイッチイムノアッセイである。これらプレートをモノクローナル抗DPP3抗体（捕獲抗体）で被覆する。トレーサ抗DPP3抗体AK2553にMA70-アクリジウム-NHS-エステルで標識し、ウエル1つにつき20 ngの濃度で使用する。20マイクロリットルのサンプル（例えば患者の血液に由来する血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿、またはEDTA-血漿）と較正物質を、被覆された白色微量滴定プレートにピペットで移す。トレーサ抗体AK2553の添加後、微量滴定プレートを室温で3時間にわたり、600 rpmでインキュベートする。その後結合しなかったトレーサを4回の洗浄工程（ウエル1つにつき350 μL）によって除去する。残った化学発光を、微量滴定プレート光度計を用いることによってウエル1つにつき1秒間測定する。DPP3の濃度を6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で走らせることが好ましい。

2．DPP3活性を定量するための酵素捕獲活性アッセイ（ECA）（Rehfeld et al., 2019 JALM 3(6): 943-953）。

ECAは、固相として黒色の高結合ポリスチレン製微量滴定プレートを用いるDPP3特異的活性アッセイである。これらプレートをモノクローナル抗DPP3抗体（捕獲抗体）で被覆する。20マイクロリットルのサンプル（例えば患者の血液に由来する血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿、EDTA-血漿、脳脊髄液、および尿）と較正物質を、被覆された黒色微量滴定プレートにピペットで移す。アッセイ用バッファ（200 μL）を添加した後、微量滴定プレートを22℃で2時間にわたり、600 rpmでインキュベートする。サンプル中に存在するDPP3を、捕獲抗体に結合させることによって固定化する。結合しなかったサンプル成分を4回の洗浄工程（ウエル1つにつき350 μL）によって除去する。反応バッファの中に蛍光発生基質であるArg-Arg-β-ナフチルアミド（Arg2-βNA）を添加した後、37℃で1時間インキュベートすることにより、固定化されたDPP3の比活性を測定する。DPP3はArg2-βNAを特異的に切断してArg-Argジペプチドと蛍光性β-ナフチルアミンにする。蛍光を蛍光光度計で340 nmの励起波長を用いて測定し、発光を410 nmで検出する。DPP3の濃度を6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で走らせることが好ましい。

3．DPP3活性を定量するための液相アッセイ（LAA）（Jones et al., Analytical Biochemistry, 1982から改変）。

LAAは、DPP3活性の測定に黒色の非結合ポリスチレン製微量滴定プレートを用いる液相アッセイである。20 μlのサンプル（例えば血清、ヘパリン-血漿、クエン酸塩-血漿）と較正物質をピペットで黒色の非結合微量滴定プレートに移す。アッセイ用バッファ（200 μL）の中に蛍光発生基質Arg2-βNAを添加した後、初期βNA蛍光（T＝0）を蛍光光度計で340 nmの励起波長を用いて測定し、発光を410 nmで検出する。次いでプレートを37℃で1時間インキュベートする。（T＝60）の最終蛍光を測定する。最終蛍光と初期蛍光の差を計算する。DPP3の活性を6点較正曲線を用いて求める。較正物質とサンプルは二連で走らせることが好ましい。

特別な一実施形態では、DPP3のレベルを測定するのに、アッセイ感度が健康な対象のDPP3を定量できて、それが20 ng/ml未満、好ましくは30 ng/ml未満、より好ましくは40 ng/ml未満であるアッセイを利用する。

特別な一実施形態では、前記バインダは、DPP3に対して少なくとも10⁷ M^-1、好ましくは10⁸ M^-1の結合親和性を示し、より好ましい親和性は10⁹ M^-1超であり、最も好ましくは10¹⁰ M^-1である。当業者は、より多い用量の化合物を適用することによってより低い親和性を補償することを考慮でき、この措置が本発明の範囲外にはならないであろうことを知っている。

本発明の別の一実施形態では、体液の前記サンプルは、全血、血漿、および血清のグループから選択される。

本発明による体液は、1つの特別な実施形態では血液サンプルである。血液サンプルは、全血、血清、および血漿を含むグループから選択することができる。方法の特別な一実施形態では、前記サンプルは、ヒトクエン酸塩血漿、ヘパリン血漿、およびEDTA血漿を含むグループから選択される。

DPP3に対する抗体の親和性を測定するため、固定化された抗体に対するDPP3の結合の動態を、Biacore 2000システム（GE Healthcare Europe GmbH、フライブルク、ドイツ国）を利用した無標識表面プラズモン共鳴によって明らかにした。抗体の可逆的固定化を、CM5センサーの表面に製造者の（マウス抗体捕獲キット；GE Healthcare）の指示に従って高密度で共有結合させた抗マウスFc抗体を用いて実施した、（Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1): 165-173）。

一実施形態では、DPP3のレベルを測定するためのこのようなアッセイは、任意の種類の検出技術（その非限定的な例に含まれるのは、酵素標識、化学発光標識、電子化学発光標識である）を利用するサンドイッチイムノアッセイであり、完全に自動化されたアッセイであることが好ましい。診断法の一実施形態では、このようなアッセイは、酵素標識されたサンドイッチアッセイである。自動化または完全自動化されたアッセイの例に、以下の系：Roche Elecsys（登録商標）、Abbott Architect（登録商標）、Siemens Centauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、BiomerieuxVidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）の1つのために利用することのできるアッセイが含まれる。

多彩なイムノアッセイが知られており、それを本発明のアッセイと方法で利用できる。そうしたアッセイに含まれるのは、質量分析（MS）、ルミネセンス・イムノアッセイ（LIA）、ラジオイムノアッセイ（「RIA」）、ホモジニアス酵素多重化イムノアッセイ（「EMIT」）、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ELISA」）、アポ酵素再活性化イムノアッセイ（「ARIS」）、ルミネセンスに基づくビーズアッセイ、磁性ビーズに基づくアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速な試験形式（例えばディップスティックイムノアッセイ）、免疫クロマトグラフィストリップ試験、希クリプテートアッセイ、および自動化システム／分析装置などである。

本発明の一実施形態では、それは、完全自動化アッセイ系を必要とすることなく患者の近くで1時間以内に試験の実施を可能にする試験技術であるいわゆるPOC試験（臨床現場）が可能である。この技術の一例は、免疫クロマトグラフィ試験技術（例えば微量流体装置）である。

好ましい一実施形態では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含むグループから選択される。

アッセイとして、均一アッセイまたは不均一アッセイ、競合アッセイ、および非競合アッセイが可能である。一実施形態では、アッセイはサンドイッチアッセイの形態であり、それは非競合イムノアッセイで、検出および／または定量される分子が第1の抗体と第2の抗体に結合する。第1の抗体は固相（例えばビーズ、ウエルまたは他の容器の表面、チップ、またはストリップ）に結合させることができ、第2の抗体は、例えば染料、放射性同位体、または反応性か触媒活性のある部分で標識された抗体である。その後、分析物に結合した標識された抗体の量が適切な方法によって測定される。「サンドイッチアッセイ」に関係する一般的な組成物と手続きはよく確立されており、当業者に知られている（The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267；Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb;10(1):4-10. PMID: 16376134）。

別の一実施形態では、アッセイは2つの捕獲分子を含む。それらは両方とも液体反応混合物の中に分散液として存在する抗体であることが好ましく、第1の標識成分が第1の捕獲分子に付着していて、その第1の標識成分は、蛍光または化学発光のクエンチまたは増幅に基づく標識系の一部であり、その標識系の第2の標識成分は第2の捕獲分子に付着しているため、両方の捕獲分子が分析物に結合すると測定可能な信号が発生し、サンプルを含む溶液中に形成されたサンドイッチ複合体の検出が可能になる。

別の一実施形態では、前記標識系は、希土類クリプテートまたは希土類キレートを蛍光染料または化学発光染料（特にシアニン型の染料）と組み合わせて含む。

本発明の文脈では、蛍光に基づくアッセイは染料の使用を含む。染料の選択は、例えばFAM（5-または6-カルボキシフルオロセイン）、VIC、NED、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート（FITC）、IRD-700/800、シアニン染料（CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7のような）、キサンテン、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオロセイン（HEX）、TET、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、N,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5）、6-カルボキシローダミン-6G（RG6）、ローダミン、ローダミン・グリーン、ローダミン・レッド、ローダミン110、BODIPY染料（BODIPY TMRなど）、オレゴン・グリーン、クーマリン（ウンベリフェロンなど）、ベンズイミド（Hoechst 33258など）；フェナントリジン（テキサス・レッドなど）、ヤキマ・イエロー、Alexa Fluor、PET、臭化エチジウム、アクリジニウム染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、ポリメチン染料などを含むグループからなすことができる。

本発明の文脈では、化学発光に基づくアッセイは、（Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p. 518-562、551～562ページの引用を含め、参照によって本明細書に組み込まれている）に化学発光材料に関して記載されている物理的原理に基づく染料の使用を含む。好ましい化学発光染料はアクリジニウムエステルである。

本明細書では、「アッセイ」または「診断アッセイ」は、診断の分野に適用されている任意のタイプが可能である。そのようなアッセイは、検出する分析物がある親和性で1つ以上の捕獲プローブに結合することに基づくことができる。捕獲分子と標的分子または興味ある分子の間の相互作用に関し、親和性定数は10⁸ M^-1超であることが好ましい。

特別な一実施形態では、前記2つのバインダの少なくとも1つは、検出のため標識される。

本発明のDPP3レベルは実施例に概略が記載されているDPP3アッセイ（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）を測定されてきた。言及した域値は、他のアッセイでは、そのアッセイが本発明で用いたアッセイ系とは異なる較正がなされている場合には、異なる可能性がある。したがって言及したカットオフ値は、較正の違いを考慮し、そのように異なる較正をされたアッセイに合わせて適用される。較正の違いを定量する1つの可能性は、本発明で用いる各バイオマーカーアッセイと問題のアッセイの方法比較分析（相関）であり、サンプル中の各バイオマーカー（例えばDPP3）を両方の方法を用いて測定することによる。別の可能性は、問題のアッセイが十分な分析感度を持つのであれば、それを用いて代表的な正常な集団のバイオマーカーのレベルを測定し、結果を文献に記載されているバイオマーカーレベルの中央値と比較し、この比較によって得られた差に基づき較正を再計算するというものである。本発明で用いられる較正を利用し、5,400人の正常な（健康な）対象（スウェーデンの単一施設の前向き集団に基づく研究（MPP-RES））が測定され、血漿DPP3の中央値（四分位間の範囲）は24.5 ng/ml（11.3 ng/ml～19 ng/ml）であった。

域値レベルは例えばカプラン-マイヤー分析から得ることができる。この分析では、疾患の発生は集団内のバイオマーカーの四分位と相関している。この分析によれば、バイオマーカーのレベルが75パーセンタイル超の対象は、本発明によれば疾患になるリスクが有意に増大している。この結果は、古典的リスク因子に関して十分に調節したコックス回帰分析によってさらに支持される。最高四分位と他の全対象の比較は、本発明によれば疾患になるリスク増大と非常に有意に関係している。

他の好ましいカットオフ値は正常な集団の例えば90、95、または99パーセンタイルである。75パーセンタイルよりも上のパーセンタイルを用いることにより、同定される偽陽性対象の数が減るが、リスクがやはり増大している中程度の対象を同定し損なう可能性がある。したがって「偽陽性」も同定する犠牲を払ってリスクがある対象の大半を同定するのがより適切であると考えるか、中程度のリスクがある数人の対象を見逃す犠牲を払って高リスクの対象を主に同定するのがより適切であると考えるかに応じてカットオフ値を採用することになろう。

本発明の方法の1つの特別な利点は、コロナウイルスに感染した患者を必要とされる療法に関して層化できることであり、その療法は、DPP3活性の阻害剤と、アンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体の投与を含むグループから選択される。層化された患者群には、治療の開始を必要とする患者と、治療の開始を必要としない患者が含まれる可能性がある。

本発明の方法の別の特別な利点は、その方法で、前記治療からの利益を得ることがより確実な患者を、前記治療からの利益を得る可能性が小さい患者から識別できることである。

好ましい一実施形態では、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体を用いた治療は、サンプル中のDPP3のレベルを示すサンプル分析の結果の提供を受けてすぐに開始されるか変更される。さらなる実施形態では、治療は、サンプル分析の結果を受け取った後12時間以内に、好ましくは6、4、2、1、0.5、0.25時間以内に、またはただちに開始することができる

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、療法をガイドすること、および／またはモニタすること、および／または層化することを目的としていて、実質的に同じ時点で得られた単一のサンプルおよび／または複数のサンプル中の患者からのサンプル中のDPP3の単一回および／または複数回の測定を含むか、そのような測定からなり、前記療法は、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体の投与である。

一実施形態では、前記アンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体は、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンIVを含むグループから選択される。

好ましい一実施形態では、アンジオテンシンIIは酢酸アンジオテンシンIIである。酢酸アンジオテンシンIIは、L-アスパルチル-L-アルギニル-L-バリル-Lチロシル-L-イソロイシル-L-ヒスチジル-L-プロリル-L-フェニルアラニン酢酸塩である。対イオン酢酸塩が非化学量論的比率で存在する。酢酸アンジオテンシンIIの分子式はC₅₀H₇₁N₁₃O₁₂・(C₂H₄O₂)n；（n＝酢酸塩分子の数；理論値n＝3）であり、平均分子量は（遊離塩基として）1046.2である。

本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関するものであり、このキットは、患者からのサンプル中のDPP3のレベルを測定するための検出試薬を含む。

DPP3のレベルは、患者が医療スタッフと出会う場所（例えば救急部またはプライマリーケアユニットなど）で直接実施することのできる臨床現場アッセイとして測定することも好ましい可能性がある。さらに、の検出のためのアッセイとして、自動化または半自動化されたアッセイ、好ましくは二連アッセイおよび／または臨床現場アッセイが可能である。

好ましい一実施形態では、本発明は、患者からのサンプル中のDPP3のレベルと、場合によりさらなるバイオマーカーを測定するための方法とキットに関する。

前記さらなるバイオマーカーの選択は、D-二量体、プロカルシトニン（PCT）、C反応性タンパク質（CRP）、乳酸、bio-ADM、penKid、NT-proBNP、白血球細胞カウント数、リンパ球カウント数、好中球カウント数、ヘモグロビン、血小板カウント数、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、クレアチニン、血中尿素、乳酸デヒドロゲナーゼ、クレアチニンキザーゼ、心臓トロポニンI、プロトロンビン時間、血清フェリチン、インターロイキン-6（IL-6）、IL-10、IL-2、IL-7、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、IP-10、MCP-1、MIP-1αを含むグループからなすことができる。

本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関するものであり、このキットは、患者からのサンプル中のDPP3を測定するための検出試薬と、20と120 ng/mLの間、より好ましくは30と80 ng/mLの間、より一層好ましくは40と60 ng/mLの間、最も好ましくは50 ng/mLという前記サンプル中のDPP3のレベルに対応する参照データ（参照レベルおよび／または域値レベルなど）を含み、前記参照データは、求められたDPP3を前記参照データと比較するためコンピュータ可読媒体に保管されること、および／またはコンピュータが実行可能なコードの形態で使用されることが好ましい。

本明細書に記載されている方法の一実施形態では、方法は、コロナウイルスに感染した患者で測定されたDPP3のレベルを参照レベルおよび／または域値レベルと比較することを追加して含み、前記比較は、コンピュータが実行可能なコードを用いてコンピュータプロセッサの中で実施される。本発明の方法は一部をコンピュータで実現することができる。例えばマーカー（例えばDPP3）について検出されたレベルを参照レベルおよび／または域値レベルと比較する工程はコンピュータシステムで実施することができる。例えば測定された値は、（健康の専門家によって手作業で、または各マーカーのレベルを測定した装置から自動的に）コンピュータシステムに入力することができる。コンピュータシステムは、臨床現場（例えばプライマリーケアユニットまたは救急部）に直接存在すること、またはコンピュータネットワーク（例えばインターネット、または場合により他のITシステムまたはプラットフォーム（病院情報システム（HIS）など）と組み合わせることができる特殊化された医療クラウド-システム）を通じて接続された遠隔地に存在することができる。その代わりに、またはそれに加えて、付随する療法ガイダンスおよび／または療法層化が、ユーザー（典型的には健康の専門家（医師など））のために表示および／または印刷される。

本発明の特別な一実施形態では、前記患者はコロナウイルス感染症に罹患していると診断されている。

「コロナウイルス感染症」という用語は、エンベロープ付きポジティブセンス一本鎖RNAウイルスの1つの科であるコロナウイルス（コロナウイルス科）の感染症と定義される。ウイルスのゲノムは長さが26～32キロ塩基である。粒子は典型的には大きな（約20 nm）棍棒形または花弁形の表面突起（「ペプロマー」または「スパイク」）で装飾されており、それが球形粒子の電子顕微鏡写真において太陽コロナを想起させるイメージを創出する。コロナウイルスは哺乳類と鳥類で疾患を引き起こす。ヒトでは、これらウイルスは呼吸器感染症を引き起こし、その中には普通の風邪が含まれていて典型的には軽いが、より稀な形態（SARS、MERS、およびCOVID-19など）は致死的である可能性がある。ヒトコロナウイルス株に最も最近追加されたのはSARS-CoV-2である。

特別な一実施形態では、コロナウイルスの前記感染症は、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVの感染症を含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2の感染症である。

WHOによると、重症急性呼吸器感染症（SARI）は現在、発熱歴または測定された体温が38℃以上と咳を伴い、最近約10日以内に発症していて入院を必要とする急性呼吸器感染症（ARI）と定義されている。しかし発熱がないことでウイルス感染から除外されることはない。

SARS-CoV感染症は、軽症、中等症、または重症の病気として現われる可能性がある；最後のケースには、重い肺炎、急性呼吸逼迫症候群（ARDS）、敗血症、および敗血症ショックが含まれる。重い症状（表1参照）を伴うこの病気を初期に同定することで、即時の最適な支持療法治療と、施設または国のプロトコルに従う集中治療室への安全で迅速な入院（または委託）が可能になる。軽症の病気を持つ人にとって、入院は必要ない可能性があるが、急速な悪化の懸念がある場合は別である。退院したすべての患者は、病気の何らかの悪化が進行する場合には病院に戻るよう指示されねばならない。

敗血症性ショックは潜在的に致命的な医学的状態であり、感染症に応答した臓器の損傷またはダメージである敗血症から危険なほどの低血圧と細胞代謝における異常に至るときに起こる。The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock（Sepsis-3）は、敗血症性ショックを、特に深刻な循環、細胞、および代謝の異常が敗血症だけの場合よりも大きな死亡のリスクと関係している敗血症の一分症と定義している。敗血症性ショックの患者は、65 mm Hg以上の平均動脈圧を維持するため昇圧剤を必要とすることと、循環血液量の減少なしに血清乳酸レベルが2 mmol超/L（18 mg超/dL）であることによって臨床的に同定することができる。この組み合わせは、院内死亡率が40％超であることと関係している（Singer et al. 2016. JAMA. 315 (8): 801-10）。一次感染は最も一般には細菌によって起こるが、真菌、ウイルス、または寄生虫による可能性もある。それは身体の任意の部分に局在する可能性があるが、最も一般には肺、脳、尿管、皮膚、または腹部臓器に局在する。それは多臓器障害症候群（以前は多臓器不全として知られていた）と死を引き起こす可能性がある。敗血症性ショックの人は集中治療室で治療されることが頻繁にある。それは最も一般的には子ども、免疫不全の個人、および老齢者に影響を与える。というのも彼らの免疫系は健康な成人の免疫系と同じくらい効果的に感染症に対処することができないからである。敗血症性ショックによる死亡率はほぼ25～50％である。

本明細書では、臓器障害は、ある臓器がその予想される機能を果たさない健康の状態または様子を意味する。「臓器不全」は、外部からの臨床的介入なしには正常なホメオスタシスを維持できない程度の臓器障害を意味する。前記臓器不全は、腎臓、肝臓、心臓、肺、神経系を含むグループから選択される臓器に関係する可能性がある。逆に、臓器機能は、各臓器の予想される機能が生理学的範囲内であることを表わす。当業者は、医学的検査の間のある臓器の各機能を認識している。

臓器障害は、経時的臓器不全評価スコア（SOFAスコア）またはその成分によって定義することができる。SOFAスコアは以前は敗血症関連臓器不全評価スコア（Singer et al. 2016. JAMA 315(8):801-10）として知られており、集中治療室（ICU）の滞在中の患者の状態を追跡し、ある人の臓器機能の程度または不全の割合を明らかにするのに使用される。スコアは6つの異なるスコアに基づいており、その1つずつが、呼吸系、心血管系、肝臓系、凝血系、腎臓系、および神経系に関係しており、それぞれ、臓器不全の悪化を反映するスコアの増加に伴い0～4点を与えられる。SOFAスコアを評価するための基準は例えばLamdenら（概説に関してはLambden et al. 2019. Critical Care 23:374を参照されたい）に記載されている。SOFAスコアは、伝統的に、ICU入院時とその後の24時間の期間ごとに計算することができる。特に、前記臓器障害は、腎機能低下、心臓障害、肝臓障害、または呼吸器障害を含むグループから選択される。

quick SOFAスコア（quickSOFAまたはqSOFA）は、感染症の転帰が悪いリスクが高い患者を同定するための最初の方法として、SOFAスコアスコアの簡易バージョンとして2016年2月にSepsis-3グループによって導入された（Angus et al. 2016. Critical Care Medicine. 44 (3): e113-e121）。qSOFAはSOFAスコアを劇的に簡素化しており、それは、その3つの臨床基準だけを含めることと、GCS＜15を要求する代わりに「あらゆる意識障害」を含めることによっている。qSOFAは患者で逐次的に容易かつ迅速に繰り返すことができる。スコアは0～3点の範囲である。1点は、低血圧（SBP≦100 mmHg）、多い呼吸数（（≧22 呼吸／分）、および意識障害（GCS≦15）に与えられる。感染症の発症近くにqSOFAが2以上であることは、死亡のより大きなリスク、または集中治療室の滞在延長と関係していた。これらは、合併症のない感染症の患者よりも敗血症の可能性がある感染した患者において一般的な転帰である。これらの知見に基づき、The Third International Consensus Definitions for Sepsisは、敗血症になる可能性が大きい感染患者をICUの外で同定するための手軽な手段としてqSOFAを推奨している（Seymour et al. 2016. JAMA 315(8):762-774）。

生命を脅かす悪化は、重要な臓器系の不全（中枢神経系不全、腎不全、肝不全、代謝不全、または呼吸不全が含まれる）が関与する死亡のリスクが高い患者の状態と定義される。

有害事象は、死亡、臓器不全またはショック、ARDS、腎損傷、ALI（急性肺損傷）、または血管不全と定義される。

本発明では、「予後」または「予後予想」という用語は、対象（例えば患者）の医学的状態がどのように進行するかの予測を意味する。そこには、前記対象の回復の可能性または不利な転帰の評価を含めることができる。

死亡を含む有害事象の前記予後予想は、決められた期間、例えば1年まで、好ましくは6ヶ月まで、より好ましくは3ヶ月まで、より好ましくは90日まで、より好ましくは60日まで、より好ましくは28日まで、より好ましくは14日まで、より好ましくは7日まで、より好ましくは3日までの期間にわたってなすことができる。

特別な一実施形態では、死亡を含む有害事象の前記予後の予想は28日までの期間にわたってなされる。

「療法モニタリング」という用語は、本発明の文脈では、前記対象の治療的治療のモニタリングおよび／または調節を例えばその療法の効果に関するフィードバックを得ることによって行なうことを意味する。

本明細書では、「療法ガイダンス」という用語は、1つ以上のバイオマーカーおよび／または臨床パラメータおよび／または臨床スコアに基づいてある療法または医学的介入を適用することを意味する。

前記臨床パラメータまたは臨床スコアは、低血圧、昇圧剤の必要性、挿管、機械的換気、ホロウィッツ指数、SOFAスコア、quick SOFAスコアを含むグループから選択される。

「療法層化」という用語は、特に、患者を異なる群（患者の分類に応じて治療的措置を受ける治療群または受けない治療群など）にグループ分けまたは分類することに関係する。

前記療法または介入は、薬物療法、非侵襲的換気、機械的換気、または体外式膜型人工肺（ECMO）を含むグループから選択することができる。

非侵襲的換気は、顔面マスク、鼻マスク、またはヘルメットを通じた呼吸サポートの使用である。空気は、通常は酸素を添加して、陽圧下でマスクを通じて与えられる。

機械的換気または支援型換気は人工的換気に関する医学用語であり、機械的手段を用いて自発的呼吸を支援または置換する。これには換気装置と呼ばれる機械が関与すること、または呼吸は適切な資格のある専門家（麻酔医、呼吸療法士（RT）、登録看護士、または救急医療隊員など）がバッグバルブマスク装置を圧縮することによって手作業で支援することができる。機械的換気は、口（気管内チューブなど）または皮膚（気管切開チューブ）を通じて気管の内部になんらかの装置が関与する場合に「侵襲的」と呼ばれる。顔面マスクまたは鼻マスクは、意識のある適切に選択された患者で非侵襲的換気のために使用される。

体外式膜型人工肺（ECMO）は体外生命支援（ECLS）としても知られ、心臓と肺が生命を維持するのに十分な量のガスの交換または灌流を提供することのできない人の心臓と呼吸を長期間支援する体外技術である。ECMOのための技術は、多くが、停止した自然な循環の短期間の支援を提供する心肺バイパスに由来する。ECMOはその人の身体から血液を取り出し、人工的に二酸化炭素除去し、その患者の赤血球細胞に酸素を添加することによって機能する。一般にECMOは、心肺バイパス後、または重い心不全および／または肺不全がある人の後期段階の治療のいずれかで使用されるが、ある施設では心停止のための治療としての使用が今は見られ、循環と酸素化を支援しつつ停止の裏にある原因を治療することを可能にしている。ECMOは、COVID-19に付随する急性の重症肺炎がある患者で人工的換気が血液酸素化レベルを維持するのに十分でないケースを支援するのにも用いられる。

前記薬物療法の選択は、抗ウイルス薬、COVID-19肺炎が治癒した患者からの免疫グロブリン、コロナウイルスを標的とする中和抗体、免疫増強剤、メシル酸カモスタット、コロナウイルスプロテアーゼ阻害剤（例えばキモトリプシン様阻害剤、パパイン様プロテアーゼ阻害剤）、スパイク（S）タンパク質-アンジオテンシン変換酵素-2（ACE2）ブロッカー（例えばクロロキン、ヒドロキシクロロキン、エモジン、プロマジン）、DPP3活性の阻害剤、およびアンジオテンシン受容体アゴニスト、および／またはこれらの前駆体を含むグループからなすことができる。

SARS-CoVとMERS-CoVを標的とする前記中和モノクローナル抗体は、Shanmugarajら（Shanmugaraj et al. 2020. Asian Pac J. allergy Immunol 38: 10-18）にまとめられているグループから選択することができる。

前記抗ウイルス薬の選択は、ロピナビル、リトナビル、レムデシビル、ナファモスタット、リバビリン、オセルタミビル、ペンシクロビル、アシクロビル、ガンシクロビル、ファビピラビル、ニタゾキサニド、ネルフィナビル、アルビドールを含むグループからなすことができる。

前記免疫増強剤の選択は、インターフェロン、静脈内ガンマグロブリン、チモシンα-1、レバミゾール、シクロスポリン-Aの非免疫抑制誘導体を含むグループからなすことができる。

特別な一実施形態では、前記アンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体は、DPP3の前記あらかじめ決められたレベルが域値よりも上である場合に前記患者に投与される。

ホロウィッツ指数（同義語：ホロウィッツによる酸素化、ホロウィッツ商、P/F比）は、患者、特に換気装置を使用している患者の肺機能を評価するのに用いられる比である。それは、肺へのダメージの程度を評価するのに有用である。ホロウィッツ指数は、血中酸素分圧（PaO2）（単位はミリメートル水銀）と吸入した空気に含まれる酸素の割合（FIO2）の比、すなわちPaO2/FiO2比と定義される。健康な肺ではホロウィッツ指数は年齢に依存し、通常は350と450の間に入る。300未満の値は軽症の肺損傷の域値であり、200は中等症の肺損傷を示す。重症の損傷の基準としての100未満の値。ホロウィッツ指数は急性呼吸逼迫症候群（ARDS）の診断で主要な役割を果たす。ARDSの3つの重症度は、ベルリン定義に従い、ホロウィッツ指数を用いた低酸素血症の程度に基づいて分類される（Matthay et al. 2012. J Clin Invest. 122(8): 2731-2740）。

急性呼吸逼迫症候群（ARDS）は呼吸不全の一種であり、肺に広がる炎症の急な発症を特徴とする。症状には、息切れ、速い呼吸、および青みがかった皮膚の色が含まれる。生き延びた人には生活の質の低下が共通する。原因に含めることができるのは、敗血症、膵臓炎、外傷、肺炎、および吸気である。裏にある機構には、肺の微視的気嚢の障壁を形成する細胞へのびまん性損傷、界面活性剤障害、免疫系の活性化、および身体による凝血調節の障害が関与する。実際、ARDSは肺が酸素と二酸化炭素を交換する能力を損なう。診断は、呼気終末陽圧（PEEP）が5 cm H₂O超であるのにPaO₂/FiO₂比（吸気酸素の割合に対する動脈酸素部分圧の比）は300 mm Hg未満であることに基づく。一次治療には機械的換気とともに裏にある原因に向けた治療が含まれる。換気戦略には、低体積かつ低圧を用いることが含まれる。酸素化が不十分なままである場合、肺リクルートメント手技と神経筋ブロッカーが使用される可能性がある。これが不十分である場合には、体外式膜型人工肺（ECMO）が1つの選択肢として可能である。この症候群には35～50％の死亡率が伴う。

「疾患重症度」という用語は、患者に対する疾患の影響の程度と関係する。疾患の重症度は患者の症状に応じて例えば無症状、軽症、重症、および危機的に分けることができる。

疾患重症度によるCoVID-19の分類は以下の通りである（https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/overview/clinical-spectrum/）：
・無症状感染または発症前感染：ウイルス学的検査（すなわち核酸増幅検査または抗原検査）を利用するとSARS-CoV-2陽性になるが、COVID-19に合致する症状がない個人。
・軽症：COVID-19のさまざまな徴候と症状（例えば発熱、咳、喉の痛み、倦怠感、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、下痢、味覚と嗅覚の喪失）のいずれかがあるが、息切れ、呼吸困難、または胸部画像の異常はない個人。
・中等症：臨床評価または画像撮影の間に下気道疾患の証拠を示すとともに、海抜ゼロでの室内空気で酸素の飽和（SpO2）が94％以上である個人。
・重症：海抜ゼロでの室内空気でSpO2が94％未満、吸気酸素の割合に対する動脈酸素分圧の比（PaO2/FiO2）が300 mm Hg未満、呼吸頻度が30回超/分、または肺浸潤が50％超である個人。
・危機的病気：呼吸不全、敗血症性ショック、および／または多臓器障害がある個人。

「患者」という用語は、本明細書では、疾患を理由として医療的ケアを受けているか、医療的ケアを受けるべき、生存中のヒトまたは非ヒト生物を意味する。その中には、病状の徴候を調べられているのに明確な病気がない人が含まれる。したがって本明細書に記載されている方法とアッセイはヒトと動物の両方の疾患に適用可能である。

本発明の文脈における「患者管理」という用語は、
・病院または集中治療室への入院の判断、
・特別な病院または特別な病院部門への患者の転送の判断、
・集中治療室または病院からの早期退院の評価、
・資源（例えば医師および／看護スタッフ、診断、治療）の割り当て、
・治療的治療に関する判断
を意味する。

本発明の一実施形態では、前記患者は、その患者の体液サンプルを採取した時点でコロナウイルスに感染していた危機的病気の患者である。

阻害剤は、DPP3活性を好ましくは有意に阻害する分子である。これら分子として、ペプチドと、小分子、抗体、抗体フラグメント、または非Ig足場が可能である。

有意に阻害するは、DPP3の活性を60％超、好ましくは70％超、より好ましくは80％超、好ましくは90％超、より好ましくはほぼ、または実際に100％の阻害を阻害することを意味する。

DPP3の活性は、さまざまな一般的なプロテアーゼ阻害剤（例えばPMSF、TPCK）、スルフヒドリル試薬（例えばpHMB、DTNB）、および金属キレータ（EDTA、o-フェナントロリン）によって非特異的に阻害することができる（Abramic et al. 2000. Biological Chemistry, 381: 1233-1243; EP 2949332）。

DPP3活性はさらに、さまざまな種類の化合物によって特異的に阻害することもできる：内在性DPP3阻害剤はスピノルフィンというペプチドである。スピノルフィンのいくつかの合成誘導体（例えばチノルフィン）が製造されており、DPP3活性をさまざまな程度で阻害することが示されている（Yamamoto et al. 2000. Life sciences 62 (19): 1767-1773）。DPP3の他の公開されているペプチド阻害剤は、プロピオキサチンAとB（アメリカ合衆国特許第4804676号）およびA類似体（Inaoka et al. 1988. J. Biochem 104 (5): 706-711）である。

DPP3は小分子（フルオスタチンやベンズイミダゾール誘導体など）によって阻害することもできる。フルオスタチンAとBはストレプトミセス属の種TA-3391の中で産生される抗生剤であり、非毒性であって強力にDPP3活性を阻害する。これまでベンズイミダゾールの異なる20種類の誘導体が合成されて公開されてきており（Agic et al. 2007. Bioorganic Chemistry 35 (2): 153-169; Rastija et al. 2015. Acta Chimica Slovenica 62: 867-878）、そのうちの2つの化合物1’と4’は最強の阻害効果を示す（Agic et al. 2007. Bioorganic Chemistry 35 (2): 153-169）。いくつかのジペプチジルヒドロキサム酸もDPP3活性を阻害することが示されている（Cvitesic et al., 2016. J Enzyme Inhib Med Chem 31(sup2):40-45）。

本発明の特別な一実施形態では、DPP3活性の前記阻害剤は、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である。

本明細書全体を通じ、本発明による「抗体」または「抗体フラグメント」または「非Ig足場」はDPP3に結合することができ、したがってDPP3に向かうため、「抗DPP3抗体」、「抗DPP3抗体フラグメント」、または「抗DPP3非Ig足場」と呼ぶことができる。

「抗体」という用語には一般に、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とその結合フラグメント（特にFcフラグメント）のほか、いわゆる「一本鎖抗体」（Bird et al. 1988）、キメラ抗体、ヒト化抗体、特にCDR移植抗体、およびディアボディまたはテトラボディ（Holliger et al. 1993）が含まれる。例えばサンプルに含まれる興味ある分子に特異的に結合するためのファージ提示を含む技術を通じて選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。この文脈では、「特異的な結合」という用語は、興味ある分子またはそのフラグメントに対して生じる抗体に関する。抗体は、興味ある分子または上記のそのフラグメントに対する親和性が、その興味ある分子を含有するサンプルに含まれる他の分子に対するよりも少なくとも好ましくは50倍大きい、より好ましくは100倍大きい、より好ましくは少なくとも1000倍大きい場合に特異的であると見なされる。本分野では、抗体を作製して所与の特異性を持つ抗体を選択する方法は周知である。

本発明の一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、単一特異性である。

単一特異性抗DPP3抗体、または単一特異性抗DPP3抗体フラグメント、または単一特異性抗DPP3非Ig足場は、前記抗体または抗体フラグメントまたは非Ig足場が標的DPP3（配列番号1）内の少なくとも5個のアミノ酸を含む1つの特定の領域に結合することを意味する。単一特異性抗DPP3抗体または単一特異性抗DPP3抗体フラグメントまたは単一特異性抗DPP3非Ig足場は、すべてが同じ抗原に対する親和性を持つ抗DPP3抗体または抗DPP3抗体フラグメントまたは抗DPP3非Ig足場である。モノクローナル抗体は単一特異性だが、単一特異性抗体は、共通の生殖細胞から生成させる以外の手段によって生成させることもできる。

特別な一実施形態では、前記抗DPP3抗体、抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、阻害性の抗体、フラグメント、または非Ig足場である。前記抗DPP3抗体、抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、DPP3の活性を60％超、好ましくは70％超、より好ましくは80％超、好ましくは90％超、より好ましくはほぼ、または実際に100％阻害している。

本発明による抗体またはそのフラグメントは、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子に含まれるのは、カッパ、ラムダ、アルファ（IgA）、ガンマ（IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄）、デルタ（IgD）、イプシロン（IgE）、およびミュー（IgM）定常領域遺伝子のほか、多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子である。完全長免疫グロブリン軽鎖は一般に約25 Kdまたは長さが214個のアミノ酸である。

完全長免疫グロブリン重鎖は一般に50 Kdまたは長さが446個のアミノ酸である。軽鎖は、NH₂末端の位置で可変領域遺伝子によってコードされ（長さが約110個のアミノ酸）、COOH末端の位置でカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。重鎖は同様に、1つの可変領域遺伝子（長さが約116個のアミノ酸）と、他の定常領域遺伝子の1つによってコードされる。

抗体の基本構造は一般に、2つの同じ免疫グロブリン鎖のペアからなり、各ペアが1つの軽鎖と1つの重鎖を持つ四量体である。それぞれのペアでは、軽鎖と重鎖の可変領域が抗原に結合し、定常領域がエフェクタ機能を媒介する。免疫グロブリンは他の多彩な形態でも存在しており、その中に含まれるのは、例えばFv、Fab、および(Fab')₂のほか、二機能性ハイブリッド抗体と一本鎖である（例えばLanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17: 105; Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883; Bird et al. 1988. Science 242: 423-426; Hood et al. 1984, Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed.; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323:15-16）。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、3つの超可変領域（相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる）によって中断されたフレームワーク領域を含む（Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al. 1983, U.S. Department of Health and Human Services参照）。上に指摘したように、CDRは主にエピトープへの抗原の結合に責任がある。免疫複合体は、抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体、または機能的抗体フラグメントなど）である。

キメラ抗体は、軽鎖遺伝子と重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作により、異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域と定常領域の遺伝子から構成された抗体である。例えばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変区画をヒト定常区画（カッパと、ガンマ1またはガンマ3など）に接合することができる。一例では、治療用キメラ抗体はしたがって、マウス抗体からの可変ドメインまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常ドメインまたはエフェクタドメインで構成されるハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳類の種を使用すること、または可変領域を分子技術によって生成させることができる。キメラ抗体を作製する方法は本分野で周知であり、例えばアメリカ合衆国特許第5,807,715号を参照されたい。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（マウス、ラット、または合成など）免疫グロブリンからの1つ以上のCDRを含む免疫グロブリンである。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と名づけられており、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプタ」と名づけられている。一実施形態では、全CDRがヒト化免疫グロブリン内のドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同じでなければならない、すなわち少なくとも約85～90％（約95％以上など）一致せねばならない。したがってヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、おそらくCDRを除き、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に一致する。「ヒト化抗体」はヒト化軽鎖とヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化された免疫グロブリンまたは抗体のアクセプタフレームワークはドナーフレームワークから取られたアミノ酸による限定された数の置換を持つことができる。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合や他の免疫グロブリン機能に対する効果を実質的に持たない追加の保存されたアミノ酸置換を持つことができる。代表的な保存された置換は、gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；およびphe、tyrなどの置換である。ヒト化免疫グロブリンは遺伝子工学の手段によって構成することができる（例えばアメリカ合衆国特許第5,585,089号参照）。ヒト抗体は、軽鎖と重鎖の遺伝子がヒト起源である抗体である。ヒト抗体は本分野で知られている方法を用いて作製することができる。ヒト抗体は興味ある抗体を分泌するヒトB細胞を不死化することによって作製できる。不死化は、例えばEBV感染によって、またはヒトB細胞を骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞と融合させてトリオーマ細胞を作ることによって実現できる。ヒト抗体は、ファージ提示法によって作製すること（例えばWO91/17271; WO92/001047; WO92/20791参照）、またはヒトコンビナトリアルモノクローナル抗体ライブラリから選択すること（Morphosysのウェブサイト参照）もできる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニック動物を用いて調製することもできる（例えばWO93/12227; WO 91/10741参照）。

したがって抗DPP3抗体は本分野で知られる形式を持つことができる。実例は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体である。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、組み換えで作製された抗体（例えば典型的な完全長免疫グロブリンであるIgG）、または重鎖および／または軽鎖の少なくともF可変ドメインを含有する抗体フラグメント（例えば化学的にカップルした抗体（フラグメント抗原結合）であり、その非限定的な例に含まれるのは、Fabフラグメント（Fabミニボディが含まれる）、一本鎖Fab抗体、エピトープタグを持つ1価Fab抗体（例えばFab-V5Sx2）；CH3ドメインとの二量体にされた2価Fab（ミニ抗体）；2価Fabまたは多価Fab（例えば異種ドメインの助けを借りた多量体化により（例えばdHLXドメインの二量体化により）形成されるもの）（例えばFab-dHLX-FSx2）；F(ab‘)₂フラグメント、scFvフラグメント、多量体化された多価または／および多重特異性scFvフラグメント、2価および／または二重特異性ディアボディ、BITE（登録商標）（二重特異性T細胞エンゲージャ）、三機能性抗体、多価抗体（例えばGとは異なるクラスからのもの）；単一ドメイン抗体（例えばラクダまたは魚類の免疫グロブリンに由来するナノボディ）、および多数ある他のものである）。

好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体の形式は、Fvフラグメント、scFvフラグメント、Fabフラグメント、scFabフラグメント、F(ab)₂フラグメント、およびscFv-Fc融合タンパク質を含むグループから選択される。別の好ましい一実施形態では、抗体の形式は、scFabフラグメント、Fabフラグメント、scFvフラグメント、および生物学的利用能が最適化されたその複合体（PEG化されたフラグメントなど）を含むグループから選択される。最も好ましい形式の1つはscFab形式である。

非Ig足場はタンパク質足場が可能であり、リガンドまたは抗原に結合できるため抗体模倣体として用いることができる。非Ig足場の選択は、テトラネクチンに基づく非Ig足場（例えばUS 2010/0028995に記載）、フィブロネクチン足場（例えばEP 1 266 025に記載；リポカリンに基づく足場（例えばWO 2011/154420に記載）；ユビキチン足場（例えばWO 2011/073214に記載）、トランスフェリン足場（例えばUS 2004/0023334に記載）、プロテインA足場（例えばEP 2 231 860に記載）、アンキリン反復に基づく足場（例えばWO 2010/060748に記載）、マイクロプロテイン、好ましくはシステインノットを形成するマイクロプロテイン）足場（例えばEP 2314308に記載）、Fyn SH3ドメインに基づく足場（例えばWO 2011/023685に記載）EGFR-Aドメインに基づく足場（例えばWO 2005/040229に記載）、およびKunitzドメインに基づく足場（例えばEP 1 941 867に記載）を含むグループからなすことができる。

本発明の一実施形態では、本発明の抗DPP3抗体は、実施例1に概略が記載されているように、抗原としてのDPP3のフラグメント、または完全長DPP3を合成することによって作製することができる。その後、前記フラグメントへのバインダが下記の方法または本分野で知られている他の方法によって同定される。

マウス抗体のヒト化は以下の手続きに従って実施することができる：マウス起源の抗体をヒト化するため、抗体配列を分析して相補性決定領域（CDR）および抗原とフレームワーク領域（FR）の構造的相互作用を探す。構造モデリングに基づき、ヒト起源の適切なFRを選択する、マウスCDR配列をヒトFRに移植する。CDRまたはFRのアミノ酸配列の中にバリエーションを導入すると、FR配列に関する種スイッチによって失われた構造相互作用を再獲得することができる。構造相互作用のこの回復は、ファージ提示ライブラリを用いたランダムアプローチによって、または分子モデリングによってガイドされる指向性アプローチを通じて実現することができる（Almagro and Fransson 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33）。

別の好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、完全長抗体、抗体フラグメント、または非Ug足場である。

好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、DPP3（配列番号1）に含まれる長さが好ましくは少なくとも4個または少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに向けられてそれに結合することができる。

好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、長さが好ましくは少なくとも4個または少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに向けられてそれに結合することができ、前記抗体またはフラグメントまたは非Ig足場は、配列番号2に含まれるエピトープに向けられてそれに結合することができる。そのエピトープは配列番号1で示されるDPP3に含まれている。

好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、長さが好ましくは少なくとも4個または少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに向けられてそれに結合することができ、前記抗体またはフラグメントまたは非Ig足場は、配列番号3に含まれるエピトープに向けられてそれに結合することができる。そのエピトープは配列番号1で示されるDPP3に含まれている。

好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、長さが好ましくは少なくとも4個または少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに向けられてそれに結合することができ、前記抗体またはフラグメントまたは非Ig足場は、配列番号4に含まれるエピトープに向けられてそれに結合することができる。そのエピトープは配列番号1で示されるDPP3に含まれている。

本発明の特別な一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、コロナウイルスに感染した患者での療法または介入に用いるために提供され、前記抗体またはフラグメントまたは足場は、DPP3の配列配列番号1内の好ましくは少なくとも4個または少なくとも5個のアミノ酸の領域に結合する。

本発明の好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、配列番号2の中に位置するDPP3の1つの領域またはエピトープに結合する。

本発明の別の好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、配列番号3の中に位置するDPP3の1つの領域またはエピトープに結合する。

本発明の別の好ましい一実施形態では、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、配列番号4の中に位置するDPP3の1つの領域またはエピトープに結合する。

エピトープは抗原決定基としても知られており、抗原のうちで免疫系によって（特に抗体によって）認識される部分である。例えばエピトープは抗原の特別な断片であり、そこに抗体が結合する。抗体のうちでエピトープに結合する部分はパラトープと呼ばれる。タンパク質抗原のエピトープは、その構造と、パラトープとの相互作用とに基づき2つのカテゴリー、すなわち立体的エピトープと直線状エピトープに分けられる。立体的エピトープと直線状エピトープは、エピトープが採用している3D配置に基づいてパラトープと相互作用する。その3D配置は、関与するエピトープ残基の表面の特徴と、抗原の他の区画の形または三次構造とによって決まる。立体的エピトープは、不連続なアミノ酸残基の相互作用によって採用される3D配置によって形成される。直線状または連続的エピトープは、その直線状アミノ酸配列、すなわち一次構造により抗体によって認識されるエピトープであり、連続したアミノ酸残基の相互作用によって採用される3D配置によって形成される。

本発明の特別な一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。本発明の一実施形態では、抗DPP3抗体または抗DPP3抗体フラグメントは、ヒト抗体またはヒト化抗体であるか、それに由来する。特別な一実施形態では、1つ以上の（マウス）CDRがヒト抗体または抗体フラグメントに移植される。

1つの側面における本発明の主題は、DPP3に結合するヒトまたはヒト化CDR移植抗体またはその抗体フラグメントであり、そのヒトまたはヒト化CDR移植抗体またはその抗体フラグメントは、
GFSLSTSGMS（配列番号7）、
IWWNDNK（配列番号8）、
ARNYSYDY（配列番号9）を含む抗体重鎖（H鎖）を含む、
および／または
RSLVHSIGSTY（配列番号10）、
KVS（配列リストの一部ではない）、
SQSTHVPWT（配列番号11）を含む抗体軽鎖（L鎖）をさらに含む。

本発明の特別な一実施形態では、本発明の主題は、DPP3に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、またはDPP3に結合するその抗体フラグメントであり、重鎖は、
GFSLSTSGMS（配列番号7）、
IWWNDNK（配列番号8）、
ARNYSYDY（配列番号9）
を含むグループから選択される少なくとも1つのCDRを含み、軽鎖は、
RSLVHSIGSTY（配列番号10）、
KVS（配列リストの一部ではない）、
SQSTHVPWT（配列番号11）を含むグループから選択される少なくとも1つのCDRを含む。

本発明の抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場は、ヒトDPP3に対して親和性を示し、親和定数は10^-7 M超、好ましくは10^-8 M超であり、好ましい親和性は10^-9 M超、最も好ましくは10^-10 M超である。当業者は、より多い用量の化合物を適用することによってより低い親和性を補償することが考えられ、この措置は本発明の範囲外にならないであろうことを知っている。親和定数は実施例1に記載されている方法に従って求めることができる。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入に用いるための、ADMに結合するモノクローナル抗体またはフラグメント、またはその抗体フラグメントであり、前記抗体またはフラグメントは、可変重鎖として以下の配列：配列番号5
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTISRDTSNNQVFLKIASVVTADTGTYFCARNYSYDYWGQGTTLTVSSを含み、可変軽鎖として以下の配列：配列番号6
DVVVTQTPLSLSVSLGDPASISCRSSRSLVHSIGSTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKを含む

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入に用いるための、ADMに結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体またはフラグメント、またはその抗体フラグメントであり、前記抗体またはフラグメントは、重鎖として以下の配列：配列番号12
MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCARNYSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGを含み、軽鎖として以下の配列：配列番号13
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSRSLVHSIGSTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECを含む

本発明の特別な一実施形態では、抗体は、重鎖として以下の配列、すなわち配列番号12、またはそれと95％超、好ましくは98％超、好ましくは99％超一致する配列を含み、軽鎖として以下の配列、すなわち配列番号13、またはそれと95％超、好ましくは98％超、好ましくは99％超一致する配列を含む。

2つのアミノ酸配列の間の一致を評価するため、対にしたアラインメントを実施する。一致は、アラインメントにおいて直接一致するアミノ酸の割合と定義される。

「医薬製剤」という用語は、医薬として許容可能な少なくとも1つの賦形剤と組み合わされた医薬成分を意味し、その賦形剤は、中に含まれている医薬成分の生物活性が有効であるような形態であり、製剤が投与されることになる対象にとって許容できない毒性がある追加成分を含有していない。「医薬成分」という用語は、医薬製剤または剤型を提供するため、場合により、医薬として許容可能な賦形剤と組み合わせることのできる治療組成物を意味する。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、本発明の抗体またはフラグメントまたは足場を含む医薬製剤である。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は、溶液、好ましくはすぐに使用できる溶液である。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は凍結乾燥状態である。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は筋肉内投与される。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は静脈内投与される。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は輸液によって投与される。

本発明の主題は、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための本発明による医薬製剤であり、この医薬製剤は全身投与される。

上記の文脈を踏まえ、以下の連続番号を付けた実施形態が本発明のさらなる具体的な側面を提供する：

実施形態

1．コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための方法であって、
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3（DPP3）のレベルを測定すること、
・測定されたDPP3の前記レベルをあらかじめ決められた域値と比較すること、および
・測定されたDPP3の前記レベルを、生命を脅かす悪化または有害事象のリスクと相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを重症度と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを療法または介入の成功と相関させること、
・測定されたDPP3の前記レベルをある療法または介入と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを前記患者の管理と相関させることを含む方法。

2．前記コロナウイルスが、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1による方法。

3．前記有害事象が、死亡、臓器障害、ショック、ARDS、腎臓損傷、ALI（急性肺損傷）、または心血管不全を含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1または2による方法。

4．測定されたDPP3の前記レベルがあらかじめ決められた域値よりも上である、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～3による方法。

5．前記対象の体液サンプル中のDPP3の前記あらかじめ決められた域値が20と120 ng/mLの間、より好ましくは30と80 ng/mLの間、より一層好ましくは40と60 ng/mLの間であり、最も好ましくは前記域値が50 ng/mLである、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～4による方法。

6．前記患者が、3以上、好ましくは7以上のSOFAスコアを持つか、1以上、好ましくは2以上のquickSOFAスコアを持つ、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～5による方法。

7．前記患者が、0.5 μg/ml以上、好ましくは1 μg/ml以上のD-二量体のレベルを持つ、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～6による方法。

8．DPP3のレベルが、前記体液サンプルをDPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させることによって測定される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～7による方法。

9．前記測定が完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダは、抗体、抗体フラグメント、または非IgG足場のグループから選択することができる、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～8による方法。

10．DPP3タンパク質および／またはDPP3活性の量が前記対象の体液サンプルの中で測定され、前記測定が完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダが抗体である、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～9による方法。

11．DPP3タンパク質および／またはDPP3活性の量が前記対象の体液サンプルの中で測定され、前記測定が完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダがある表面に固定化されている、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～10による方法。

12．DPP3タンパク質および／またはDPP3活性の量が前記対象の体液サンプルの中で測定され、前記分離工程が、捕獲されたDPP3から前記サンプルの成分のうちで前記捕獲バインダに結合しない成分を除去する洗浄工程である、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～11による方法。

13．前記対象の体液サンプル中のDPP3活性を測定する方法が、
・前記サンプルを完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させる工程、
・前記捕獲バインダに結合したDPP3を分離する工程、
・DPP3の基質を前記分離されたDPP3に添加する工程、
・DPP3の基質の変換を測定して定量することにより前記DPP3活性を定量する工程を含む、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～12による方法。

14．前記DPP3活性が前記対象の体液サンプル中で測定され、DPP3基質の変換が、蛍光発生基質（例えばArg-Arg-βNA、Arg-Arg-AMC）の蛍光、発色基質の色彩変化、アミノルシフェリンにカップルした基質のルミネセンス、質量分析、HPLC/FPLC（逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ）、薄層クロマトグラフィ、キャピラリゾーン電気泳動、ゲル電気泳動とそれに続く活性染色（固定化された活性なDPP3）、またはウエスタンブロット（切断産物）を含むグループから選択される方法によって検出される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～13による方法。

15．前記DPP3活性が前記対象の体液サンプル中で測定され、前記基質は、アンジオテンシンII、III、およびIV、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、エンドモルフィン1と2、バロルフィン、β-カソモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ACTH、およびMSHを含むか、蛍光体、色素体、またはアミノルシフェリンにカップルしたジペプチドを含むグループから選択することができ、前記ジペプチドはArg-Argである、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～14による方法。

16．前記DPP3活性が前記対象の体液サンプル中で測定され、前記基質は、蛍光体、色素体、またはアミノルシフェリンにカップルしたジペプチドを含むグループから選択することができ、前記ジペプチドはArg-Argである、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～15による方法。

17．前記患者が、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体を用いて治療される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための実施形態1～16による方法。

18．コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

19．前記コロナウイルスが、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態18によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

20．前記患者が、実施形態1～17のいずれかによる方法によって測定したとき、前記患者の体液サンプル中であらかじめ決められた域値よりも上のDPP3のレベルを持つ、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態18または19によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

21．3以上、好ましくは7以上のSOFAスコアを持つか、1以上、好ましくは2以上のquickSOFAスコアを持つ、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態18～20によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

22．前記患者が、0.5 μg/ml以上、好ましくは1 μg/ml以上のD-二量体のレベルを持つ、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態18～21によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

23．DPP3活性の前記阻害剤が、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非IgG足場を含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～22によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

24．前記阻害剤が、配列番号1に含まれる長さが少なくとも4～5個のアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非IgG足場である、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～23によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

25．前記阻害剤が、配列番号2に含まれる長さが少なくとも4～5個のアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非IgG足場である、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～24によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

26．前記阻害剤が、10^-7 M以下のDPP3への最小結合親和性を示す抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非IgG足場である、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～25によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

27．前記阻害剤が、抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非IgG足場であり、DPP3の活性を少なくとも10％、または少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは70％超、より一層好ましくは80％超、より一層好ましくは90％超、より一層好ましくは95％超阻害する、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～26によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

28．前記抗体がモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態20～27によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。

29．重鎖の中の相補性決定領域（CDR）が、
配列番号7、配列番号8、および／または配列番号9の配列を含み、
軽鎖の中の相補性決定領域（CDR）が、
配列番号10、KVS、および／または配列番号11の配列を含む、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態28によるDPP3活性の阻害剤。

30．前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ヒト化モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態29によるDPP3活性の阻害剤。

31．重鎖が配列番号12の配列を含み、軽鎖が配列番号13の配列を含む、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態30によるDPP3活性の阻害剤。

32．アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンIVを含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者における療法または介入で使用するための、実施形態17～22によるアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／またはその前駆体。

実施例1 - DPP3タンパク質とDPP3活性を測定する方法

抗体の作製とDPP結合能力の測定：いくつかのマウス抗体を作製し、特異的結合アッセイにおいてそれがヒトDPP3に結合する能力によってスクリーニングした（表2参照）。

免疫化のためのペプチド／複合体

免疫化のためのDPP3ペプチド（表2参照）を、このペプチドをウシ血清アルブミン（BSA）との複合体にするための追加のN末端システイン（選択されたDPP3配列の中にシステインが存在しない場合）残基付きで合成した（JPT Technologies、ベルリン、ドイツ国）。Sulfolinkカップリングゲル（Perbio-science、ボン、ドイツ国）を用いることによりこのペプチドをBSAに共有結合させた。カップリング手続きはPerbioのマニュアルに従って実施した。組み換えGST-hDPP3をUSBio（United States Biological、サーレム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）によって生成させた。

マウスの免疫化、免疫細胞融合、およびスクリーニング：

Balb/cマウスの腹腔内（i.p.）に、（TiterMax Goldアジュバントの中で乳化した）84 μgのGST-hDPP3または100 μgのDPP3-ペプチド-BSA複合体を0日目に、（完全フロイントアジュバントの中で乳化した）84 μgまたは100 μgを14日目に、そして42 μgまたは50 μg（を含む不完全フロイントアジュバント）を21日目と28日目に注射した。49日目、マウスに、生理食塩水に溶かした42 μgのGST-hDPP3または50 μgのDPP3-ペプチド-BSA複合体を静脈内（i.v.）注射した。3日後にマウスを安楽死させ、免疫細胞融合を実施した。

1 mlの50％ポリエチレングリコールを37℃で30秒間用い、免疫化したマウスからの脾臓細胞と骨髄腫細胞系SP2/0の細胞を融合させた。洗浄後、細胞を96ウエルの細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンを、HAT培地［20％ウシ胎仔血清とHAT-Supplementを補足したRPMI 1640培地］の中で増殖させることによって選択した。1週間後、HAT培地をHT培地で置き換えて3継代した後、通常の細胞培地に戻した。

融合の2週間後、細胞培養物の上清を最初にスクリーニングして組み換えDPP3に結合するIgG抗体を探した。したがって組み換えGSTタグ付きhDPP3（USBiologicals、サーレム、アメリカ合衆国）を96ウエルのプレートの中に固定化し（100 ng/ウエル）、ウエル1つにつき50 μlの細胞培養物上清とともに室温で2時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、50 μl/ウエルのPOD-ウサギ抗マウスIgGを添加して室温で1時間インキュベートした。次の洗浄工程の後、50 μlの色原体溶液（3,7 mMのo-フェニレン-ジアミンを含むクエン酸塩／リン酸水素塩バッファ、0.012％H₂O₂）を各ウエルに添加し、室温で15分間インキュベートした後、50 μlの4N硫酸を添加して発色反応を停止させた。吸収を490 mmで検出した。

試験で陽性であったマイクロ培養物を増殖のため24ウエルのプレートに移した。再試験の後、選択された培養物を限界希釈技術を利用してクローニングし、再クローニングしてアイソタイプを明らかにした。

マウスモノクローナル抗体生成

GSTタグ付きヒトDPP3またはDPP3-ペプチドに対して生じる抗体を標準的な抗体作製法（Marx et al. 1997）によって生成させ、プロテインAによって精製した。抗体の純度は、SDSゲル電気泳動分析に基づくと90％以上であった。

抗体の特徴づけ - hDPP3および／または免疫化ペプチドへの結合

異なる抗体と抗体クローンによるDPP3／免疫化ペプチド結合の能力を分析するため、結合アッセイを実施した：

a）固相

組み換えGSTタグ付きhDPP3（配列番号1）またはDPP3ペプチド（免疫化ペプチド、配列番号2）を高結合微量滴定プレートの表面に固定化した（96ウエルのポリスチレン製マイクロプレート、Greiner Bio-One international AG、オーストリア国、カップリングバッファ［50 mMのトリス、100 mMのNaCl、pH7,8］の中の1 μg/ウエル、室温で1時間）。5％ウシ血清アルブミンでブロックした後、マイクロプレートを真空乾燥させた。

b）標識手続き（トレーサ）

100 μg（100 μl）の異なる抗DPP3抗体（検出抗体、PBS、pH 7.4の中に1 mg/ ml）を10 μlのアクリジニウムNHS-エステル（アセトニトリルの中に1 mg/ml、InVent GmbH、ドイツ国；EP 0 353 971）と混合し、室温で30分間インキュベートした。標識付き抗DPP3抗体をShodex Protein 5 μm KW-803（昭和電工、日本国）上のゲル濾過HPLCによって精製した。精製した標識付き抗体をアッセイ用バッファ（50 mmol/lのリン酸カリウム、100 mmol/lのNaCl、10 mmol/lのNa₂-EDTA、5 g/lのウシ血清アルブミン、1 g/lのマウスIgG、1 g/lのウシIgG、50 μmol/lのアマスタチン、100 μmol/lのロイペプチン、pH 7.4）の中で希釈した。最終濃度は200 μl当たり約5～7×10⁶相対光単位（RLU）の標識付き化合物（約20 ngの標識付き抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光をCentro LB 960 光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）を用いて測定した。

c）hDPP3結合アッセイ

200 μlの標識して希釈した検出抗体（トレーサ）をプレートに満たし、2～8℃で2～4時間インキュベートした。結合しなかったトレーサを350 μlの洗浄溶液（20 mMのPBS、pH 7.4、0.1％のTriton X-100）で4回洗浄することによって除去した。よく結合した化学発光をCentro LB 960光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）を用いて測定した。

抗体の特徴づけ - hDPP3阻害分析

異なる抗体と抗体クローンによるDPP3阻害の能力を分析するため、DPP3活性アッセイを既知の手続き（Jones et al., 1982）で実施した。組み換えGSTタグ付きhDPP3をアッセイ用バッファ（50 mMのトリス-HCl、pH7,5と100 μMのZnCl₂の中に25 ng/ mlのGST-DPP3）の中で希釈し、この溶液200 μlを10 μgの各抗体とともに室温でインキュベートした。あらかじめ1時間インキュベートした後、蛍光発生基質 Arg-Arg-βNA（20 μl、2mM）を溶液に添加し、時間経過に伴う遊離βNAの生成をTwinkle LB 970マイクロプレート蛍光計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）を37℃で用いてモニタした。βNAの蛍光は、340 nmで励起させ、410 nmの発光を測定することによって検出した。異なるサンプルの増加していく蛍光の傾斜（単位はRFU/分）を計算する。バッファ対照を用いたGST-hDPP3の傾斜を100％活性とする。可能な捕獲バインダの阻害能力は、前記捕獲バインダとともにインキュベートすることによるGST-hDPP3活性の減少（単位は％）と定義される。

以下の表は、得られた抗体の選択と、相対光単位（RLU）で表わしたその結合率のほか、その相対阻害能力（％；表1）を示す。下に示すDPP3領域に対して生じたモノクローナル抗体を、それが組み換えDPP3および／または免疫化ペプチドに結合する能力のほか、その阻害能力によって選択した。

組み換えhDPP3のGSTタグ付き完全長形態に対して生じたすべての抗体が、固定化されたGSTタグ付きhDPP3への強い結合を示す。配列番号2のペプチドに対して生じた抗体はGST-hDPP3にも結合する。配列番号2の抗体も免疫化ペプチドに強く結合する。

DPP3タンパク質の濃度を定量するためのルミネセンス・イムノアッセイ（DPP3-LIA）のほか、DPP3活性を定量するための酵素捕獲活性アッセイ（DPP3-ECA）の開発が最近記載されており（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

実施例2 - 早期死亡を予想するためのDPP3

多彩な疾患の患者の血漿中のDPP3濃度をhDPP3アッセイ（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）を利用して測定し、患者の早期死亡と関連づけた。

研究コホート - 敗血症と敗血症性ショック

重症の敗血症と敗血症性ショックにおけるアドレノモジュリンと転帰（AdrenOSS-1）研究からの574人の患者に由来する血漿サンプルをスクリーニングしてDPP3を探した。AdrenOSS-1は、敗血症または敗血症性ショックで集中治療室に入院した583人の患者を含む前向き観察的国際研究である（Hollinger et al., 2018）。292人の患者が敗血症性ショックと診断された。

研究コホート - 心原性ショック

心原性ショックと診断された108人の患者からの血漿サンプルをスクリーニングしてDPP3を探した。血液は心原性ショックの検出から6時間以内に採取した。死亡を7日間にわたって追跡した。

研究コホート - 急性冠症候群

急性冠症候群の720人の患者からの血漿サンプルをスクリーニングしてDPP3を探した。血液は胸部痛を発症してから24時間後に採取した。死亡を7日間にわたって追跡した。

研究コホート - 呼吸困難：

呼吸困難（息切れ）を示す1440人の患者から、Skane大学病院の救急部に入った直後に血漿サンプルを回収した。呼吸困難の患者は特に急性冠症候群またはうっ血性心不全を患っている可能性があり、臓器不全と早期死亡のリスクが高い。死亡は救急部に来た後の3ヶ月間にわたって追跡した。

研究コホート - 火傷患者：

重症の火傷（体表面積全体の15％超）がある107人の患者からの血漿サンプルをスクリーニングしてDPP3を探した。血液は入院した時点で採取した。死亡を4週間にわたって追跡した。

hDPP3イムノアッセイ：

ヒトDPP3の量（LIA）、またはヒトDPP3の活性（ECA）をそれぞれ検出する免疫アッセイ（LIA）または活性アッセイ（ECA）を利用して患者血漿中のDPP3のレベルを測定した。抗体固定化、標識、およびインキュベーションは、Rehfeldら（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）に記載されているようにして実施した。

結果

敗血症／敗血症性ショックにおける患者の短期生存率は、入院時のDPP3血漿濃度と関係していた。DPP3血漿濃度が68.6 ng/mL（第3四分位）よりも上の患者は、DPP3血漿濃度がこの域値未満の患者と比べて死亡のリスクが増大していた（図1A）。同じ関係が、このコホートの敗血症性ショックの患者だけについて彼らの短期転帰をDPP3血漿濃度との関係で分析したときに見られた（図1F）。DPP3血漿濃度が上昇していた患者は、DPP3血漿濃度が低い患者と比べて死亡のリスクが上昇していた。同じカットオフを心原性ショックの患者に適用するとき、7日以内の早期死亡のリスク上昇が、DPP3が高い患者でやはり観察される（図1B）。

それに加え、DPP3に関係する急性冠症候群の患者の28日生存率もDPP3が高いときに増加し、68.6 ng/mLというそれぞれのカットオフが適用される（図1C）。

68.6 ng/mLというこのカットオフを呼吸困難に苦しむ患者に適用すると、DPP3が高い患者の死亡リスクの有意な上昇が3ヶ月の追跡期間内に検出される（図1D）。

さらに、それぞれのカットオフ68.6 ng/mLよりも上の高いDPP3濃度を持つ重症の火傷患者では4週間で死亡するリスクが増大していた（図1E）。

実施例3 - ヒト天然DPP3の精製

ヒト赤血球ライセートを合計100 mlのSepahrose 4B樹脂（Sigma-Aldrich）に適用し、フロースルーを回収した。樹脂を合計370 mLのPBSバッファ、pH 7.4で洗浄し、洗浄画分を回収したフロースルーと組み合わせると、全体積が2370 mLになった。

免疫アフィニティ精製工程のため、110 mgのモノクローナル抗hDPP3 mAb AK2552を25.5 mLのUltraLinkヒドラジド樹脂（Thermo Fisher Scientific）に製造者のプロトコル（GlycoLink固定化キット、Thermo Fisher Scientific）に従ってカップルさせた。カップリング効率は、カップルしなかった抗体のBradford技術による定量によって求めると、98％であった。樹脂-抗体複合体を10床体積の洗浄-結合バッファ（PBS、0.1％TritonX-100、pH 7.4）で平衡させ、2370 mLの透明な赤血球細胞ライセートと組み合わせ、連続的に撹拌しながら4℃で2時間インキュベートした。その結果、100 mLのインキュベーション混合物を10個の15 mLのポリプロピレンカラムに広げ、1000×gで30秒間遠心分離することによってフルースルーを回収した。この工程を数回繰り返すと、DPP3がロードされた樹脂がカラム1つにつき2.5 mL得られた。各カラムを重力白熱アプローチを利用して10 mLの洗浄-結合バッファで5回洗浄した。2 mLの中和バッファ（1Mのトリス-HCl、pH 8.0）を収容した15-mLのファルコンチューブの中に各カラムを置くことによってDPP3を溶離させた後、カラム1つにつき10 mLの溶離バッファ（100 mMのグリシン-HCl、0.1％TritonX-100、pH 3.5）を添加し、ただちに1000×gで30秒間遠心分離した。溶離工程を3回繰り返すと、組み合わせた溶離液が合計で360 mL得られた。中和された溶離液のpHは8.0であった。

組み合わせた溶離液を、IEXバッファA1（100 mMのグリシン、150 mMのトリス、pH 8.0）で平衡させた5 mLのHiTrap Q-sephare HPカラム（GE Healthcare）にAkta Start系（GE Healthcare）のサンプルポンプを用いてロードした。サンプルをロードした後、カラムを5カラム体積のIEXバッファA2（12 mMのNaH₂PO₄、pH 7.4）で洗浄して結合しなかったタンパク質を除去した。DPP3の溶離は、10カラムの体積（50 mL）にIEX-バッファB（12 mMのNaH₂PO₄、1 MのNaCl、pH 7.4）を用いて0～1 MのNaClの範囲の塩化ナトリウム勾配を適用することによって実現した。溶離液を2 mLの画分の中に回収した。イオン交換クロマトグラフィに使用したバッファを、0.22 μMのボトル-トップフィルタを用いて殺菌濾過した。

各精製工程のそれぞれの収率と活性が掲載された精製表が表3に与えられている。図2は、ヒト赤血球ライセートから精製した天然hDPP3の勾配ゲル（4～20％）上のSDS-PAGEを示す。

実施例4 - 動物モデルにおける天然DPP3の効果

健康なマウスへの天然hDPP3注射の効果を、短縮率と腎血管抵抗指数をモニタすることによって調べた。

野生型Black 6マウス（8～12週齢、群のサイズについては表4を参照されたい）を2週間馴化させ、ベースライン心エコー検査を実施した。マウスを2つの群の1つに無作為に割り当てた後、天然DPP3タンパク質またはPBSを、DPP3タンパク質については600 μg/kgの用量を後眼窩注射することによって静脈内注射した。

DPP3またはPBSを注射した後、15分、60分、および120分の時点で心機能を心エコー検査によって評価し（Gao et al. 2011）、腎機能を腎血管抵抗指数によって評価した（Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012）（図3）。

結果

天然DPP3タンパク質で治療したマウスは、PBSを注射した対照群と比べて有意に減少した短縮率を示す（図4A）。WT＋DPP3群も、腎血管抵抗指数の増加によって観察されるように、腎機能の悪化を示す（図4B）。

実施例5 - プロシズマブの開発

配列番号2に対して生じた抗体をより詳細に特徴づけた（エピトープマッピング、結合親和性、特異性、阻害能力）。ここには、配列番号2（AK1967；「プロシズマブ」）のクローン1967の結果を一例として示す。

DPP3上のAK1967エピトープの特定

AK1967のエピトープマッピングのため、N末端またはC末端がビオチニル化された多数のペプチドを合成した（peptides & elephants GmbH、Hennigsdorf、ドイツ国）。これらペプチドには、C末端またはN末端のいずれかから1個のアミノ酸が段階的に除去された免疫化ペプチド全体の配列（配列番号2）またはそのフラグメントが含まれる（ペプチドの完全なリストについては表6参照）。

高結合96ウエルのプレートを、ウエル1つにつき2 μgのアビジン（Greiner Bio-One international AG、オーストリア国）を含むカップリングバッファ（500 mMのトリス-HCl、pH 7.8、100 mMのNaCl）で被覆した。その後プレートを洗浄し、ビオチニル化されたペプチドの特別な溶液（10 ng/ウエル；バッファ - 0.5％のBSAを含む1×PBS）を満たした。

抗DPP3抗体AK1967に、実施例1に従って化学発光標識を標識した。

200 μlの標識して希釈した検出抗体（トレーサ）をプレートに満たし、室温で4時間インキュベートした。結合しなかったトレーサを350 μlの洗浄溶液（20 mMのPBS、pH 7.4、0.1％Triton X-100）で4回洗浄することによって除去した。よく結合した化学発光をCentro LB 960蛍光計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）を用いることによって測定した。各ペプチドへのAK1967の結合を相対光単位（RLU）を評価することによって明らかにする。AK1967の非特異的結合よりも有意に大きいRLUシグナルを示すあらゆるペプチドをAK1967バインダと定義する。結合するペプチドと結合しないペプチドの組み合わせ分析からAK1967の特異的DPP3エピトープが明らかになる。

Octetを用いた結合親和性の測定：

Octet Red96（ForteBio）を用いて実験を実施した。AK1967をキネティックグレードの抗ヒトFc（AHC）バイオセンサーに捕獲した。次に、ロードされたそのバイオセンサーを組み換えGSTタグ付きヒトDPP3の一連の希釈液（100、33.3、11.1、3.7 nM）に浸した。会合を120秒間にわたって観察した後、解離を180秒間にわたって観察した。実験に使用したバッファを表5に示す。動態分析を、1：1結合モデルと全体フィッティングを利用して実施した。

AK1967の結合特異性のウエスタンブロット分析

ヒトEDTA-血液からの血液細胞を（PBSの中で3回）洗浄し、PBSの中で希釈し、凍結-解凍サイクルを繰り返すことによって溶解させた。血液細胞ライセートは、全タンパク質濃度が250 μg/ml、DPP3濃度が10 μg/mlであった。血液細胞ライセートの希釈液（1：40、1：80、1：160、および1：320）と精製した組み換えヒトHis-DPP3の希釈液（31.25～500 ng/ml）についてSDS-PAGEとウエスタンブロットを実施した。ブロットを1.）ブロッキングバッファ（5％スキムミルク粉末を含む1×PBS-T）、2.）一次抗体溶液（AK1967 1：2.000を含むブロッキンブバッファ）、および3.）HRPで標識した二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：1.000を含むブロッキンブバッファ）の中でインキュベートした。結合した二次抗体をAmersham ECLウエスタンブロッティング検出試薬とAmersham Imager 600 UV（両方ともGE Healthcareから）を用いて検出した。

DPP3阻害アッセイ：

AK1967によるDPP3阻害の能力を分析するため、既知の手続き（Jones et al., 1982）を利用し、DPP3活性アッセイを実施例1に記載されているようにして実施した。阻害能力AK1967は、前記抗体とともにインキュベートすることによるGST-hDPP3活性の低下として定義される（単位は％）。得られた低下したDPP3活性が図7の阻害曲線に示されている。

エピトープマッピング：

AK1967が結合するペプチドと結合しないペプチドの分析から、AK1967結合に必要なエピトープとしてのDPP3配列INPETG（配列番号3）が明らかになった（表6参照）。

結合親和性：

AK1967は組み換えGST-hDPP3に2.2×10^-9 Mの親和性で結合する（動態曲線図5参照）。

特異性と阻害能力：

血液細胞のライセートの中で一次抗体としてAK1967を用いて検出された唯一のタンパク質は80 kDaのDPP3であった（図6）。ライセートの全タンパク質濃度は250 μg/mlであったのに対し、推定DPP3濃度は約10 μg/mlである。ライセートの中には25倍多い非特異的タンパク質が存在するが、AK1967はDPP3に特異的に結合してそれを検出し、他の非特異的結合は起こらない。

AK1967は特異的DPP3活性アッセイにおいて15 ng/mlのDPP3を阻害し、IC50は約15 ng/mlである（図7）。

キメラ化／ヒト化：

DPP3活性を70％阻害する能力を持つモノクローナル抗体AK1967（「プロシズマブ」）を可能な治療用抗体として選択し、キメラ化とヒト化のための鋳型としても使用した。

マウス抗体のヒト化は以下の手続きに従って実施することができる：

マウス起源の抗体をヒト化するため、抗体配列を分析し、相補性決定領域（CDR）および抗原とフレームワーク領域（FR）の構造的相互作用を探した。構造モデリングに基づいてヒト起源の適切なFRを選択し、マウスCDR配列をヒトFRに移植する。CDRまたはFRのアミノ酸配列の中にバリエーションを導入すると、FR配列に関する種スイッチによって失われた構造的相互作用を再獲得することができる。構造相互作用のこの回復は、ファージ提示ライブラリを用いたランダムアプローチによって、または分子モデリングによってガイドされる指向性アプローチを通じて実現することができる（Almagro and Fransson, 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 13:1619-33）。

上記の文脈を踏まえると、可変領域は、任意のサブクラス（IgG、IgM、IgE、IgA）の定常領域、または足場、Fabフラグメント、Fv、Fab、およびF(ab)2だけに接続することができる。下記の実施例6と7では、IgG2a骨格を持つマウス抗体バリアントを使用した。キメラ化とヒト化のため、ヒトIgG1κ骨格を使用した。

エピトープの結合にとって、相補性決定領域（CDR）だけが重要である。マウス抗DPP3抗体（AK1967；「プロシズマブ」）の重鎖と軽鎖に関するCDRが、重鎖については配列番号7、配列番号8、および配列番号9に、軽鎖については配列番号10、配列KVS、および配列番号11にそれぞれ示されている。

抗DPP3抗体（AK1967；「プロシズマブ」）のシークエンシングから、配列番号12に従う抗体重鎖可変領域（H鎖）と、配列番号13に従う抗体軽鎖可変領域（L鎖）が明らかになった。

実施例6 - 敗血症によって誘導される心不全におけるプロシズマブの効果

この実験では、敗血症によって誘導される心不全のラット（Rittirsch et al. 2009）におけるプロシズマブ注射の効果を短縮率をモニタすることによって研究した。

敗血症性ショックのCLPモデル：

Centre d'elevage Janvier（フランス国）からの雄のWisterラット（2～3ヶ月齢、300～400 g、群のサイズについては表7を参照されたい）を無作為に3つの群の1つに割り当てた。ケタミン塩酸塩（90 mg/kg）とキシラジン（9 mg/kg）を腹腔内（i.p.）で用いてすべてのラットを麻酔した。多微生物性敗血症を誘導するため、わずかに改変したRittirschのプロトコルを利用して盲腸結紮穿刺（CLP）を実施した。腹側正中切開（1.5 cm）をして盲腸を露出させた。次いで盲腸を回腸弁の直下で結紮し、18ゲージの針で1回穿刺した。次いで腹腔を2層にして閉じた後に輸液蘇生し（体重100 g当たり3 mlの生理食塩水を皮下注射）、動物を自らのケージに戻した。シャム動物は盲腸穿刺なしの手術をした。CLP動物をプラセボと治療抗体の間で無作為化した。

研究設計

研究の流れが図8に示されている。CLP手術またはシャム手術の後、動物を水と餌に自由にアクセスできるようにして20時間休養させた。その後、動物を麻酔し、気管切開し、動脈と静脈のラインを並べた。CLP手術の24時間後の時点でAK1967またはビヒクル（生理食塩水）のいずれかをボーラス注射として5 mg/kgで投与した後、7.5 mg/kgで3時間輸液した。安全措置として、血行動態を侵襲的かつ連続的にt＝0から3時間までモニタした。

t＝0（ベースライン）の時点ですべてのCLP動物が敗血症性ショックの状態であり、心機能が低下していた（低血圧、低い短縮率）。この時点でプロシズマブまたはビヒクル（PBS）を注射（i.v.）し、生理食塩水の輸液を開始した。1つの対照群と2つのCLP群が存在しており、下記の表にまとめられている（表7）。実験の終了時、動物を安楽死させ、臓器をその後の分析のため回収した。

侵襲性血圧：

AcqKnowledgeシステム（BIOPAC Systems, Inc.、アメリカ合衆国）を用いて血行動態変数を取得した。これは全自動血液分析システムを提供する。カテーテルは圧力センサーを通じてBIOPAC系に接続される。

この手続きのため、ラットに麻酔した（ケタミンとキシラジン）。望む体温を37～37.5℃にするためラットを加熱パッドに移動させた。体温フィードバックプローブを直腸に挿入した。ラットを手術台で仰臥位にした。外部人工呼吸器用に頸動脈と迷走神経を損傷させることなく気管を開き、カテーテル（16G）を挿入した。動脈カテーテルを右頸動脈に挿入した。頸動脈を迷走神経から分離した後に結紮した。

左頸静脈を通じて中心静脈カテーテルを挿入してPCZまたはPBSを投与できるようにした。

手術後、血行動態測定の前に動物を安定な状態で休ませた。次いでベースラインの血圧（BP）を記録した。データ収集の間、動脈ラインを通じた生理食塩水輸液を停止した。

心エコー検査

ケタミン塩酸塩を用いてラットを麻酔した。胸部を剃毛した後、ラットを臥位にした。

経胸壁心エコー（TTE）検査のため、高周波数（14-MHz）リニア型プローブと10-MHz心臓プローブを備える市販のGE Healthcare Vivid 7超音波システムを使用した。すべての検査をディジタルで記録し、その後のオフライン分析のために保管した。

灰色スケールの画像を2 cmの深度で記録した。大動脈弁輪径と肺動脈径を測定するため、二次元検査を傍胸骨長軸像で開始した。Mモードも用いて左心室（LV）径を測定し、短縮率（FS％）を評価した。LVFSは、LV拡張末期径- LV収縮末期径／LV拡張末期径として計算し、％単位で表わした。したがって拡張末期の時間はLVの最大直径の位置で定義した。したがって収縮末期は、同じ心周期における最小直径として定義した。全パラメータを手作業で測定した。各測定について3回の心周期を平均した。

同じ傍胸骨長軸像から、パルスドプラ法を利用して肺動脈流を記録した。肺動脈流出の速度時間積分を測定した。

心尖部五腔像から、僧帽弁の先端のレベルでパルスドプラ法を利用して僧帽弁血流を記録した。

結果：

敗血症によって誘導された心不全をPBS（CLP＋PBS）で処置したラットでは、シャム動物と比べて短縮率が減少するのが見られる（図9A）。CLP＋PBS群は高い死亡率も示す（図9B）。逆に、敗血症によって誘導された心不全ラットにプロシズマブを適用すると短縮率が改善し（図9A）、死亡率が劇的に低下する（図9B）。

実施例7 - 心機能と腎機能に対するプロシズマブの効果

マウスでイソプロテレノールによって誘導される心不全に対するプロシズマブの効果を、短縮率と腎血管抵抗指数をモニタすることによって調べた。

マウスでイソプロテレノールによって誘導される心臓ストレス：

非選択的β-アドレナリンアゴニストであるイソプロテレノール（DL-イソプロテレノール塩酸塩、Sigma Chemical Co）（ISO）を300 mg/kgで1日に2回、2日間にわたって皮下注射することにより、3ヶ月齢の雄のマウスで急性心不全を誘導した（Vergaro et al, 2016）。ISOの希釈はNaCl 0.9％の中で実施した。イソプロテレノールで処置したマウスを無作為に2つの群に割り当て（表8）、ベースライン心エコー検査の後にPBSまたはプロシズマブ（10 mg/kg）を静脈内注射し（Gao et al., 2011）、3日目に腎血管抵抗指数測定（Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012）を実施した（図10AとB）。

心機能を1時間、6時間、および24時間の時点で心エコー検査（Gao et al., 2011）と腎血管抵抗指数（Lubas et al., 2014, Dewitte et al, 2012）によって評価した（図10 AとB）。イソプロテレノールの代わりにビヒクル（PBS）を注射したマウスの群にさらなる薬物治療をせず対照群とした（表8）。

結果：

イソプロテレノールによって誘導された心不全のマウスにプロシズマブを適用すると、投与後の最初の1時間以内に心機能が回復する（図11A）。病気のマウスの腎機能はPCZを注射してから6時間後の時点で有意な改善を示し、24時間後の時点でシャム動物の腎機能と同等である（図11B）。

実施例8 - バルサルタンの効果

DPP3を注射された健康なマウスにおけるI型アンジオテンシンII受容体（ATR1）のアンタゴニストであるバルサルタンの効果を、短縮率をモニタすることによって調べた。

この実験では、健康なBlack 6マウス（8-12週齢、群のサイズについては表9を参照されたい）は、1日につき水と50 mg/kgのバルサルタン、または水だけ（表9）を2週間の期間にわたって消費した。その後、両方の群に天然DPP3（600 μg/kg）を静脈内注射し、短縮率をGaoら、2011年に従って15分、60分、および120分の時点で評価した（図12）。

結果：

健康なマウスにDPP3を注入すると短縮率が有意に減少した（図13）。逆に、アンジオテンシンII受容体アンタゴニストであるバルサルタンで処置した後にDPP3を注射した健康なマウスは、短縮率による評価で心臓障害の徴候を示さなかった。したがって心機能はバルサルタン処置によって回復するため、DPP3を媒介とする心機能障害はアンジオテンシンIIを媒介とする。

バルサルタンで2週間処置した動物を、I型アンジオテンシンII受容体の阻止、その後のアンジオテンシンIIを媒介とするシグナル伝達の阻害、およびAngIIを媒介とする心機能の活性の阻害に適合させた。明らかに、バルサルタン処置のもとではこのアンジオテンシンシグナル伝達系がバルサルタンによって阻害されたため、この生物は、I型アンジオテンシンII受容体シグナル伝達とは独立に心機能を活性化させる他のやり方に切り換えた。

DPP3がAng IIを切断し、したがって心機能のアンジオテンシンIIを媒介とする活性を阻害するとき、下方調節されたアンジオテンシン系に適応するこれら動物（バルサルタンで処置した動物）は、短縮率によって評価したとき心障害の徴候を示さなかった。それとは逆に、アンジオテンシンII受容体アンタゴニストであるバルサルタンで処置せず、阻害されたAng IIを媒介とするシグナル伝達に適合させなかった動物は、DPP3の注射とその後のAngIIの切断と不活性化に応答して短縮率の有意な減少を示した。

この実験はDPP3とアンジオテンシンIIの間の関係を明確に示しており、DPP3によって誘導される心障害がアンジオテンシンIIを媒介としていることを意味する。

実施例9 - DPP3と、敗血症における臓器障害

実施例2（AdrenOSS-1）に記載されているのと同じ実験を利用して、循環しているDPP3（cDPP3）、敗血症と敗血症性ショックで入院した患者の臓器（例えば心血管障害と腎障害）の間の関係を評価した。AdrenOSS-1は、敗血症または敗血症性ショックでICUに入院した583人の患者を含む欧州前向き観察的国際研究（ClinicalTrials.gov NCT02393781）である。主要転帰（実施例2に記載されているように）は28日死亡率であった。副次的転帰には、SOFAスコアによって定義される臓器不全、昇圧剤の使用に焦点を当てた臓器支持、および腎臓置換療法の必要性が含まれていた。中央検査室のための血液は、ICU入院後24時間以内と2日目に採取した。

DPP3タンパク質の濃度を定量するのに最近記載されたアッセイ（DPP3-LIA）を利用した（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）。

すべてのAdrenOSS-1患者で入院時に測定したcDPP3の中央値は45.1 ng/mLであった（四分位間の範囲27.5～68.6）。入院時に測定された高いDPP3レベルは、より悪い代謝パラメータ、腎機能と心機能、およびSOFAスコアと関係しており：DPP3のレベルが中間値よりも下の患者は、DPP3のレベルが中央値である45.1 ng/mLよりも上の患者でSOFAスコアの中間値が8（IQR 5～11）であったのと比べてSOFAスコア（点）の中間値が6（IQR 4～9）であった（図14）。

入院時のcDPP3のレベルに関係なく、24時間後の高濃度のcDPP3レベルは、全体的な図15であれ、臓器ごとであれ（図16 A～F）、最悪のSOFAスコアと関係していた。

まとめると、これらのデータは、cDPP3の高いレベルが、大きな国際コホートの敗血症と敗血症性ショックの患者において生存および臓器障害の程度と関係していることを示した。本研究では、入院時にcDPP3が45.1 ng/ml未満であることと、短期生存のほか、敗血症と敗血症性ショックの両方における45.1 pg/mlという予後カットオフ値との間に顕著な関係が見いだされた。臓器障害に関し、ICU入院時のcDPP3とSOFAスコアの間にプラスの関係が存在した。より重要なのは、ICU入院時に見られたcPDPP3レベルと臓器障害の程度の間の関係が回復相の間にも当てはまったことである。実際、入院時に高いcDPP3レベルで2日目に正常なcDPP3値に向かう低下を示した患者は、全臓器（心血管、腎臓、肺、肝臓が含まれる）の機能が回復する可能性がより大きかった。

実施例10 - コロナウイルス（SARS-CoV-2）に感染した患者におけるDPP3

コロナウイルス（SARS-CoV-2）に感染していると診断された12人の患者からの血漿サンプルをスクリーニングしてDPP3と他のバイオマーカーを探した。最近記載されたようにして（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）、ヒトDPP3の量（LIA）またはヒトDPP3の活性（ECA）をそれぞれ検出するイムノアッセイ（LIA）または活性アッセイ（ECA）を利用して患者の血漿中のDPP3レベルを測定した。

Weberら2017年（Weber et al. 2017. JALM 2(2): 222-233）に記載されているイムノアッセイを利用してBio-ADMのレベルを測定した。

個々のサンプル中のDPP3とbio-ADMそれぞれの濃度が表10にまとめられている。

DPP3の濃度は27～975 ng/mlの範囲であり、中央値（IQR）は156（59.5～322.3）ng/mlであった。Bio-ADMの濃度は35～437 pg/mlの範囲であり、中央値（IQR）は109（56～210）pg/mlであった。DPP3の濃度は健康な対象と比べて有意に上昇している。5,400人の正常な（健康な）対象（スウェーデン単一施設前向き集団に基づく研究（MPP-RES））からのサンプルを測定した：血漿DPP3の中央値（四分位間の範囲）は14.5 ng/ml（11.3 ng/ml～19 ng/ml）であった。（健康な）対象からのサンプル中の血漿bio-ADM（成熟ADM-NH₂）の中央値は24.7 pg/ml、最小値は11 pg/ml、99パーセンタイルは43 pg/mlであった（Marino et al. 2014. Critical Care 18: R34）。

実施例11 - 予後予想、療法層化、および追跡のための、COVID-19の患者におけるDPP3

コホートの記述：

SARS-CoV-2 PCR陽性結果とICU入院の21人の患者が本研究に含まれた。患者の特徴に含まれていたのは、年齢中央値が63歳、76％が男性、ボディ・マス指数（BMI）の中央値が28.6、および入院シーケンシャル臓器不全評価（SOFA）スコアが5であったことである。除外基準は年齢18歳未満と妊娠であった。リアルタイム逆転写PCR（RT-PCR）を利用して分析を実施した。患者の治療はわれわれのICUにおける治療の基準に従い、必要な場合には機械的換気、静脈脱血-静脈送血ECMO、およびRRTを含めた。

DPP3と標準的な検査パラメータを分析するため血液を入院日に採取するとともに、7日目までは毎日採取した。EDTA血漿の中のDPP3を、最近記載されたように1工程ルミネセンスサンドイッチイムノアッセイ（LIA）を利用して測定した（Rehfeld et al. 2019. JALM 3(6): 943-953）。

結果：

a）ベースライン測定と逐次的測定のDPP3は疾患重症度と関連している

ICU入院時に測定されたDPP3は、KDIGO基準（0～1ステージは腎機能障害なし～わずかな障害ありで低リスクであることを示し、2～3ステージは腎損傷と腎不全を示す）によって定義される腎機能のICU滞在中の悪化と関係しており、ステージ2～3におけるDPP3値は、ステージ0～1におけるDPP値と比べて有意に大きかった（図17；p＝0.005）。ベースラインでの高いDPP3値は、他の臨床パラメータと組み合わせて腎臓置換療法の開始のガイドとして用いることができよう。

COVID-19陽性患者はICUに平均で21日間滞在する傾向があるため、ICU滞在中のDPP3レベルの測定（3日目と7日目）も低いPaO2/FiO2比（150未満）と関係し、したがって重症急性呼吸逼迫症候群（ARDS）（偽＝P/F比が150超；真＝P/F比が150未満）と関係していた。

さらに、3日目（図19A、p＝0.03）と7日目（図19B、p＝0.01）に測定された高DPP3値は、ICU滞在中の高い死亡率と関係している状態である。

b）ベースライン測定と逐次的測定のDPP3は臓器支援療法の必要性と関連している

ICU入院時と滞在中の高DPP3値は、臓器支援療法、特に昇圧剤療法（3日目；図20）および体外式膜型人工肺（ECMO）（3日目と7日目；それぞれ図21AとB）の必要性と有意に関係していた。

配列

配列番号1 - hDPP3のアミノ酸1～737
MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA

配列番号2 - hDPP3のアミノ酸474～493（N-Cys）- 追加のN末端システインを有する免疫化ペプチド
CETVINPETGEQIQSWYRSGE

配列番号3 - hDPP3のアミノ酸477～482 - AK1967のエピトープ
INPETG

配列番号4 - hDPP3のアミノ酸480～483
ETGE

配列番号5 - 重鎖の中のマウスAK1967の可変領域
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTISRDTSNNQVFLKIASVVTADTGTYFCARNYSYDYWGQGTTLTVSS

配列番号6 - 軽鎖の中のマウスAK1967の可変領域
DVVVTQTPLSLSVSLGDPASISCRSSRSLVHSIGSTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK

配列番号7 - 重鎖の中のマウスAK1967のCDR1
GFSLSTSGMS

配列番号8 - 重鎖の中のマウスAK1967のCDR2
IWWNDNK

配列番号9 - 重鎖の中のマウスAK1967のCDR3
ARNYSYDY

配列番号10 - 軽鎖の中のマウスAK1967のCDR1
RSLVHSIGSTY

軽鎖の中のマウスAK1967のCDR2
KVS

配列番号11 - 軽鎖の中のマウスAK1967のCDR3
SQSTHVPWT

配列番号12 - ヒト化AK1967 - 重鎖配列（IgG1κ骨格）
MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCARNYSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

配列番号13 - ヒト化AK1967 - 軽鎖配列（IgG1κ骨格）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSRSLVHSIGSTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims

コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための方法であって、
・前記患者の体液サンプル中のジペプチジルペプチダーゼ3（DPP3）のレベルを測定すること、
・測定されたDPP3の前記レベルをあらかじめ決められた域値と比較すること、および
・測定されたDPP3の前記レベルを、生命を脅かす悪化または有害事象のリスクと相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを重症度と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを療法または介入の成功と相関させること、
・測定されたDPP3の前記レベルをある療法または介入と相関させること、または
・測定されたDPP3の前記レベルを前記患者の管理と相関させることを含む方法。
前記コロナウイルスが、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1による方法。
前記有害事象が、死亡、臓器障害、ショック、ARDS、腎臓損傷、ALI（急性肺損傷）、または心血管不全を含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1または2による方法。
測定されたDPP3の前記レベルがあらかじめ決められた域値よりも上である、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1～3による方法。
DPP3のレベルが、体液の前記サンプルをDPP3に特異的に結合する捕獲バインダと接触させることによって測定される、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1～4による方法。
前記測定が、完全長DPP3に特異的に結合する捕獲バインダの使用を含み、前記捕獲バインダは、抗体、抗体フラグメント、または非IgG足場のグループから選択することができる、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1～5による方法。
前記患者を、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体で治療する、コロナウイルスに感染した患者で（a）生命を脅かす悪化または有害事象のリスクを診断または予測するための、または（b）重症度を診断または予想するための、または（c）療法または介入の成功を予測またはモニタするための、または（d）療法のガイダンスまたは療法の層化のための、または（e）患者管理のための請求項1～6による方法。
コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、DPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。
前記コロナウイルスが、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoVを含むグループから選択され、特にSARS-CoV-2が選択される、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。
請求項1～7のいずれか1項による方法によって測定するとき、前記患者が、前記対象の体液サンプル中にあるレベルのDPP3を持つ、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項18または19によるDPP3活性の阻害剤および／またはアンジオテンシン受容体アゴニストおよび／または前記アンジオテンシン受容体アゴニストの前駆体。
抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場を含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8～10によるDPP3活性の阻害剤。
配列番号1に含まれる少なくとも4～5個の長さのアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8～11によるDPP3活性の阻害剤。
配列番号2に含まれる少なくとも4～5個の長さのアミノ酸のエピトープに結合する抗DPP3抗体、または抗DPP3抗体フラグメント、または抗DPP3非Ig足場である、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8～12によるDPP3活性の阻害剤。
前記抗体がモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8～13によるDPP3活性の阻害剤。
重鎖の中の相補性決定領域（CDR）が、配列番号7、配列番号8、および／または配列番号9の配列を含み、
軽鎖の中の相補性決定領域（CDR）が、配列番号10、KVS、および／または配列番号11の配列を含む、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項14によるDPP3活性の阻害剤。
前記モノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ヒト化モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項15によるDPP3活性の阻害剤。
前記重鎖が配列番号12の配列を含み、前記軽鎖が配列番号13の配列を含む、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項16によるDPP3活性の阻害剤。
アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、アンジオテンシンIII、アンジオテンシンIVを含むグループから選択される、コロナウイルスに感染した患者における治療または介入で使用するための、請求項8～17によるアンジオテンシン受容体アゴニスト、および／またはその前駆体。