ES2689372T3 - Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada - Google Patents

Abstract

Un polipeptido que comprende restos de armazones a base de fibronectina que comprenden un 10o dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) modificado, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende una secuencia de aminoacidos en donde el resto de aminoacido que se corresponde con el resto de treonina en la posicion 58 de la SEQ ID NO: 1 es un resto de acido glutamico (E); la solubilidad del dominio 10Fn3 modificado esta mejorada en relacion con la solubilidad de un dominio 10Fn3 que comprende la misma secuencia de aminoacidos que el dominio 10Fn3 modificado, excepto en que el resto de aminoacido que se corresponde con el resto de treonina en la posicion 58 de la SEQ ID NO: 1 no esta mutado; y el dominio 10Fn3 modificado se une especificamente a una diana que no esta unida mediante un dominio de Fn3 humana seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.

Description

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DESCRIPCION

Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada

La presente solicitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° 61/761.452.

Antecedentes

La fibronectina es una proteína grande que desempeña papeles esenciales en la formación de la matriz extracelular y en las interacciones célula-célula; consiste en muchas repeticiones de tres tipos (tipos I, II y III) de pequeños dominios. Los dominios de fibronectina tipo III (Fn3) se hallan frecuentemente como partes de moléculas de adhesión celular, receptores de hormonas y citocinas de superficie celular, chaperonas y dominios de unión a hidratos de carbono. Un dominio de Fn3 de tipo silvestre es pequeño, monomérico, soluble y estable. Carece de enlaces disulfuro y, por lo tanto, es estable en condiciones reductoras. Para revisiones véase Bork y Doolittle, 1992, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89(19):8990-4; Bork et al., 1994, J Mol Biol. 242(4):309-20; Campbell y Spitzfaden, Structure 2(5):333-7 (1994); Harpez y Chothia, 1994, J Mol Biol. 238(4):528-39.

Los armazones a base de fibronectina son una familia de proteínas que tienen un plegamiento de tipo inmunoglobulina. Estas proteínas, que generalmente hacen uso de un armazón que deriva de una fibronectina tipo III (Fn3) o un dominio de tipo Fn3, funciona de una forma característica de los anticuerpos naturales o diseñados genéticamente (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales o de cadena única) y contienen bucles que se localizan de forma análoga a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un dominio variable del anticuerpo. Además, los armazones a base de fibronectina poseen ventajas estructurales. Específicamente, las estructuras de estos miméticos de anticuerpos se han optimizado con frecuencia para el plegamiento, estabilidad y solubilidad óptimas, incluso en condiciones que normalmente llevan a la pérdida de la estructura y la función en anticuerpos. Un ejemplo de proteínas de armazón basadas en fibronectina son las adnectinas (por Adnexus, una subsidiaria de propiedad total de Bristol Myers Squibb), que son una clase de elementos biológicos dirigidos que derivan del décimo dominio de tipo III (10Fn3) de la fibronectina humana. Se ha demostrado que las regiones de bucle de tipo CDR de los armazones a base de fibronectina se pueden modificar para dar lugar a una proteína capaz de unirse a una diana de interés. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 7.115.396 describe proteínas de dominio de Fn3 en las que las alteraciones en los bucles BC, DE y FG da como resultado proteínas de unión a TNFa de alta afinidad. La Patente de Estados Unidos N.° 7.858.739 describe proteínas de dominio de Fn3 en las que las alteraciones en los bucles BC, DE y FG da como resultado proteínas de unión a VEGFR2 de alta afinidad. La primera adnectina ensayada en un ensayo clínico, CT-322, se dirige al receptor 2 de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2). Los estudios preclínicos (Mamluk, R. et al., 2010, mAbs 2, 199-208) y de fase I sobre CT-322 (Bloom, L. y Calabro, V., 2009, Drug Discov. Today 14, 949-955; Molckovsky, A. y Siu, L.L., 2008, J. Hematol. Oncol. 1, 20; Tolcher, A.W. et al., 2011, Clin. Cancer Res. 17, 363-371) demostraron que se toleraba bien y que producía efectos farmacológicos esperados de la inhibición de la vía de VEGFR-2. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un miembro proteico farmacológicamente activo y un miembro de dominio proteico farmacológicamente inactivo de origen humano, tal como un dominio 10Fn3 se describen en el documento WO 2008/153745. Los armazones proteicos basados en una secuencia consenso de la repetición del dominio 10Fn3 de la fibronectina humana se describen en el documento WO 2010/093627. El documento WO 2009/142773 se refiere a polipéptidos multivalentes que comprenden al menos dos dominios de armazón de fibronectina conectados a través de un enlazador de polipéptidos. Un estudio que explora los efectos de la elongación del bucle sobre la estabilidad del dominio 10Fn3 se describe en Batori et al. (Protein Engineering 2002, 15(12): 1015-1020).

La agregación de proteínas puede ser un reto para los agentes terapéuticos basados en proteínas, tales como los armazones a base de fibronectina, en particular cuando se desean formulaciones de alta concentración de proteínas para la administración del fármaco. Además, la agregación puede suponer retos para la producción y la fabricación, llevar a actividades indeseables tales como agonismo no intencionado del receptor, y posiblemente afectar a la seguridad del fármaco por la inducción de una respuesta inmunológica. Véase Shire, S.J. et al., 2004, J Pharm Sci. 93; 1390-402; Vázquez-Rey, M. y Lang, D.A., 2011, Biotechnol Bioeng 108; 1494-508; y Barker, M.P. et al., 2010, Self Nonself 1; 314-322. Por consiguiente, es deseable generar y/o seleccionar agentes terapéuticos proteicos, tales como los armazones a base de fibronectina, que tienen una solubilidad potenciada o una propensión a la agregación reducida.

Sumario

En el presente documento se proporcionan polipéptidos que comprenden restos de armazones a base de fibronectina que comprenden un dominio de fibronectina tipo III (Fn3) modificado, en el que el dominio de Fn3 modificado comprende una secuencia de aminoácidos en donde el aminoácido correspondiente al resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E) y en donde la solubilidad del dominio de Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio de Fn3 que comprende el mismo aminoácido que el dominio 10Fn3 modificado, excepto en que el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no está mutado, y el dominio 10Fn3 modificado se une específicamente a una diana a la que no se une mediante un dominio de Fn3 humana seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO:1-16, 65 y 66.

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También se proporcionan en el presente documento bibliotecas que comprenden una pluralidad de los polipéptidos descritos en el presente documento, métodos para identificar un polipéptido que se une a una diana que comprenden el cribado de una biblioteca descrita en el presente documento, y polipéptidos aislados identificados mediante tal método.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una alineación de los dominios 7Fn3, 10Fn3 y 14Fn3. Las cadenas beta se muestran en negrita y subrayadas. Los restos de Thr que se corresponden con la T58 del 10Fn3 humano de tipo silvestre están recuadrados.

La Figura 2 muestra un ejemplo de curva de precipitación salina para 1 mg/ml de adnectina IGFR1. Los datos se ajustan a una función de curva sigmoidal a partir de la que se determina el punto medio de la transición de la precipitación salina (ASm).

La Figura 3 muestra los datos de precipitación salina en sulfato de amonio para las adnectinas. A) Adnectinas EGFR1-7 y IGFR1. B) Adnectinas El-tándem. C) Adnectinas El-tándem PEGiladas (EI-tándem-PEG), en donde el recuadro muestra los datos con un eje x expandido. Los símbolos se corresponden con la identidad del dominio de adnectina anti-EGFR en cada molécula como sigue: EGFR1 (triángulo blanco hacia arriba A), EGFR2 (triángulo negro hacia arriba A), EGFR3 (cuadrado blanco □), EGFR4 (cuadrado negro ■), EGFR5 (círculo negro •), EGFR6 (triángulo negro hacia abajo ▼), EGFR7 (círculo blanco o). IGF1R1 se indica mediante (aspa x) en el panel A). D) Correlación entre los valores de ASm para monoadnectinas y El-tándems anti-EGFR (triángulos negros Acon ajuste de línea sólida) o con adnectinas de El-tándem PEGiladas (círculos negros con ajuste de línea punteada). Figura 4. Efecto de la PEGilación sobre precipitación salina de un anticuerpo de dominio. A) Curva de precipitación salina para molécula de anticuerpo de dominio dAbl (cuadrados negros ■) o dAbl PEGilado sobre un resto de cisteína libre con PEG lineal de 30 kDa (círculos blancos) o con PEG de ramificación única de 40 kDa (triángulos blancos hacia arriba A).

La Figura 5 muestra datos de precipitación salina en sulfato de amonio para moléculas de fusión a Fc usando el método automático. A) La reproducibilidad del ensayo se demuestra con 3-4 experimentos replicados para Adn- Fc-A (círculo blanco o), Adn-Fc-B (cuadrado blanco □) y Adn-Fc-K (triángulo blanco hacia arriba A). B) Datos de precipitación salina en sulfato de amonio para 2,1, 1,5, 0,9, 0,45, 0,3, 0,15 y 0,075 mg/ml de Adn-Fc-K tal como se detecta mediante A280 o mediante C) fluorescencia intrínseca. D) Dependencia logarítmica de valores de ASm en la concentración de proteína ensayada, tal como se demuestra para Adn-Fc-K (círculo negro •), dAb3-l-IgG1* (triángulo blanco hacia arriba A) y dAb5-4-IgG1* (cuadrado blanco □).

Figura 6. Datos de solubilidad y de estabilidad para Adn-Fc. A) Cambio en las especies de alto peso molecular (% de APM) durante el tiempo para 1 mg/ml de moléculas de Adn-Fc tras la exposición a un estrés térmico de 30-37 °C, tal como se mide mediante SEC. B) % de APM para moléculas de Adn-Fc a elevadas concentraciones de proteína tal como se determina mediante SEC. C) Ejemplos de datos de precipitación salina para proteínas Adn- Fc. Los símbolos en los paneles A-C son tal como sigue: Adn-Fc-a (estrella blanca Adn-Fc-A (estrella negra *.), Adn-Fc-B (círculo blanco o), Adn-Fc-b (círculo negro •), Adn-Fc-C (cuadrado blanco □), Adn-Fc-D (cuadrado negro ■), Adn-Fc-E (diamante negro ♦), Adn-Fc-F (aspa x), Adn-Fc-G (cruz +), Adn-Fc-H (triángulo blanco hacia abajo V), Adn-Fc-I (triángulo blanco hacia arriba A), Adn-Fc-J (triángulo negro hacia arriba A), Adn-Fc-K (triángulo negro hacia abajo ▼), Adn-Fc-F (diamante blanco O). D) Valores de ASm para moléculas Adn-Fc, ordenados de izquierda a derecha por valores de ASm en aumento a 0,45 mg/ml de [proteína]. Las barras de error representan la desviación estándar de 3-4 experimentos diferentes.

Figura 7. Solubilidad y estado oligomérico de moléculas dAb-Fc. C) Ejemplo de datos de precipitación salina para proteínas dAb-Fc. B) Dependencia de concentración de Rh para dAb-Fc seleccionados tal como se mide mediante DFS. Los símbolos en los paneles A y B son tal como sigue: dAb2-2-IgG1** (triángulo blanco hacia abajo V), dAb2- 3-IgG1** (círculo negro •), dAb3-l-IgG1* (triángulo blanco hacia arriba a), dAb5-4-IgG1*-CHO (triángulo negro hacia abajo ▼), dAb6-2-IgG1* (triángulo negro hacia arriba A), dAb8-l-IgG1* (diamante negro ♦), dAb8-3-IgG1* (círculo blanco o), dAb8-2-IgG4 (cuadrado negro ■), dAb9-l-IgG1* (cuadrado blanco □). Las barras de error en el panel B representan la desviación estándar de 3-4 mediciones. C) Superposición de los valores de ASm (triángulo negro hacia arriba A) y de los valores de radio hidrodinámico (o) para todas las moléculas dAb-Fc ensayadas. Figura 8. % de APM para dAb-5-5-IgG1* a elevadas concentraciones de proteína tal como se determina mediante SEC analítico.

Figura 9. Ejemplo de datos de precipitación salina para mAb con diferentes dominios Fc o diferentes dominios Fab.

Figura 10. Ejemplo de datos de precipitación salina de mutantes de adnectina anti-EGFR. Los símbolos representan los datos para EGFR8 de tipo silvestre, ASm = 2,11 M (círculo blanco o), y los mutantes V54^A, ASm = 2,25 M (cuadrado blanco □), T58^E, ASm = 2,17 M (triángulo blanco hacia arriba A) y D77^A, ASm = 1,96 M (triángulo blanco hacia abajo V).

Figura 11. Solubilidad medida y predicha de mutantes de adnectina EGFR8. A) Solubilidad de proteínas EGFR8 de tipo silvestre y mutante en AS 2,0 M (barras en gris claro) o AS 2,2 M (barras en gris oscuro). Los datos de EGFR8 de tipo silvestre representan el promedio con barras de error de desviación estándar de tres mediciones independientes. B) Valores de propensión a la agregación espacial (PAE) para todos los mutantes de adnectina EGFR8, a R = 5 A (barras en gris claro) y R = 10 A (barras en gris oscuro).

Figura 12. Comparación del anticuerpo, el fragmento VH y la Adnectina que muestra el tamaño relativo de las

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moléculas. Diagramas de dibujo de (A) IgG1 (PDB ID 1IGT), (B) VHH (1F2X) con las CDR marcadas 1, 2, 3, (C) una Adnectina, con los bucles diversificados marcados BC, DE y FG y (D) superposición de una adnectina y VHH que muestra que las posiciones de los bucles BC, DE y FG son similares a las de las CDR 1, 2 y 3.

Figura 13. Unión de Adnectina 1 a EGFR. (A) El EGFR se representa como una superficie gris y se muestra unido a Adnectina 1 sobre el dominio I y la porción de Fv de cetuximab sobre el dominio III (PDB 1YY9; Li et al., 2005). La adnectina y el cetuximab se muestran como dibujos con cadenas p (rojo) y estructura secundaria no repetitiva (cian). (B) Restos de Adnectina 1 implicados en los contactos con EGFR. La estructura principal de la adnectina se muestra como un dibujo con el siguiente esquema de colores: cadenas p (rojo), estructura secundaria no repetitiva (naranja) y bucles diversificados (magenta). Los restos implicados en los contactos de los bucles diversificados se muestran con átomos de carbono magenta. Los restos implicados en los contactos del resto de la adnectina se muestran con átomos de carbono negros y regiones negras sobre el dibujo de la estructura secundaria. Nótese el tramo secuencial en la cadena D que se pone en contacto con EGFR. (C) Interacción entre adnectina y el dominio I de EGFR. La adnectina está en magenta y el dibujo de EGFR está en cian. La superficie de interacción en EGFR muestra la definición más estricta de restos de contacto en naranja y la definición relajada de restos internos en amarillo. (D) Se muestra la superposición de las superficies de contacto de adnectina 1 y EGFR sobre el dominio I de EGFR. La adnectina 1 (cian) y el EGF (naranja) se representan como dibujos. Las únicas superficies de contacto y la superficie de solapamiento se muestran como Adnectina 1 (amarillo), eGf (rojo) y para ambos (magenta). (E) Interacciones de tipo cadena p entre los restos 15-18 del EGFR y los restos 76-79 de la adnectina 1 con los enlaces de hidrógeno de N... O=C formados entre Q16 N y D77 O, K79 N y Q16 O, y L17 N y K79 O, y un enlace de hidrógeno de cadena lateral entre T16 OG1 y D77 OD1.

Figura 14. Unión de Adnectina 2 a IL-23. (A) La IL-23 se representa como una superficie gris y se muestra unida a la adnectina 2 en la superficie de contacto entre las subunidades p40 y p19 y la porción Fv de 7G10 se muestra unida a la subunidad p19 (PDB 3D85; Beyer et al., 2008). La adnectina y 7G10 se muestran como dibujos con el mismo código de color que la Figura 2A. (B) Restos de adnectina 2 implicados en los contactos con IL-23. Las adnectinas 1 (Figura 2B) y 2 se orientan de forma idéntica para permitir la comparación de las diferentes formas mediante inspección. El código de color es el mismo que en la Figura 2B. En la adnectina 2 las siguientes regiones hacen contacto con IL-23: la región N-terminal, la cadena C, el bucle CD, la cadena E y la cadena F. (C) Interacción entre la adnectina la IL-23 con el código de color de la superficie y la adnectina siendo igual que en la Figura 2C. El dominio p40 (cadena A) se muestra en un cian más claro y el dominio p19 (cadena B) se muestra en un cian más oscuro. (D) Una vista de la interacción Adnectina 2/IL-23 que implica solo los bucles diversificados y la región N-terminal. El mismo código de color que en la parte (C). (E) Una vista que muestra solo los restos 76-85 del bucle FG de adnectina 2 unida a IL-23.

Figura 15. Comparación de adnectina 1 y adnectina 2 con 10Fn3. (A) Secuencias de aminoácidos de las dos adnectinas frente al dominio parental 10Fn3. Las partes de los bucles BC, DE y FG que se diversificaron se subrayan en la figura, abarcando los restos 23-29, 52-55 y 77-86, respectivamente. (B, C) Dos vistas ortogonales superpuestas en los restos 1416 a 1509 de PDB 1FNF. Código de colores: 1FNF (azul), Adnectina 1 (rojo) y Adnectina 2 (cian). Nótese la excelente superposición de las cadenas p del núcleo y los bucles AB y EF. El bucle DE, que es bastante corto, muestra una pequeña variación en estas estructuras. El bucle BC muestra una variación modesta. Por el contrario, el bucle FG muestra una variación importante en la posición incluso entre los bucles de igual longitud de Adnectina 2 y 10Fn3. En la adnectina 1, las cadenas p F y G se extienden más allá en la región diversificada; sin embargo, para resaltar la región diversificada, esos residuos se dibujaron como una estructura secundaria no repetitiva. Aunque los extremos N-terminales de 10Fn3 y de adnectina 1 son similares, el de la adnectina 2 difiere de manera considerable.

Figura 16. Vistas en estéreo de la densidad de electrones inicial con el modelo final de los bucles diversificados, que no se incluyeron en el modelo inicial, de (A) de adnectina 1 y (B) de adnectina 2.

Figura 17. Vistas en estéreo de las partes C y D de la Figura 13. Ambas figuras rotadas 90 ° en z a partir de su representación en la Figura 13 para acomodar una distancia interocular de aproximadamente 60 mm para la visión en estéreo. C. Interacción entre adnectina 1 y el dominio I de EGFR. Los dibujos de adnectina están en magenta y el EGFR está en cian. La superficie de interacción en EGFR muestra los restos de contacto en naranja y los restos internos en amarillo. D. Se muestra la superposición de las superficies de contacto de adnectina 1 y EGFR sobre el dominio I de EGFR. La adnectina 1 (cian) y el EGF (azul) se representan como dibujos. Se muestran las superficies de contacto de Adnectina 1 (amarillo), EGF (rojo) y la superficie de solapamiento (magenta).

Figura 18. Visiones en estéreo de las partes C, D, y E de la Figura 14. Las Figuras C y D se rotan 90° en z a partir de su representación en la Figura 14 para acomodar una distancia interocular de aproximadamente 60 mm para la visión en estéreo. C. Interacción entre Adnectina y IL-23. La adnectina se muestra como un dibujo (magenta). Los dibujos del dominio p40 (cadena A) se muestran en un cian más claro y el dominio p19 (cadena B) se muestra en un cian más oscuro. La superficie de interacción en IL-23 muestra los restos de contacto en naranja y los restos internos en amarillo. D. Una vista de la interacción Adnectina 2/IL-23 que implica solo los bucles diversificados y la región N-terminal. El mismo código de color que en la parte (C). E. Una vista de la interacción Adnectina 2/IL-23 que implica solo el bucle FG. El mismo código de color que en la parte (C).

Figura 19. Vistas en estéreo de la superposición de variantes basadas en 10Fn3, en relación con la Figura 15, partes B y C, pero que muestran variantes adicionales basadas en 10Fn3. B. Visión en estéreo de la superposición de los dominios basados en 10Fn3 de 2OCF (naranja), 3CSB (rosa), 3CSG (frambuesa), 3K2M (cadena C) (verde), 3QHT (cadena B) (pizarra), 3QWQ (rojo) y 3QWR (cian) en el dominio 10 1FNF (azul). Esta vista se rota 90° en z en comparación con la Figura 15B para acomodar una distancia interocular de aproximadamente 60 mm. C. Vista en estéreo de la superposición de los dominios basados en 10Fn3 de 2OCF (naranja), 3CSB (rosa), 3CSG

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(frambuesa), 3K2M (cadena C) (verde), 3QHT (cadena B) (pizarra), 3QWQ (rojo) y 3QWR (cian) en el dominio 10 1FNF (azul). Esta vista está en la misma orientación que la Figura 15C, pero en comparación con A (anteriormente), está rotada 90° en z y después 90° en y. Estas figuras resaltan que el núcleo de los dominios basados en 10Fn3 se mantiene, pero los bucles diversificados pueden variar en conformación para adaptar la unión a la diana. Figura 20. Estado oligomérico y estabilidad térmica de las adnectinas EGFR8. A) Cromatogramas de SEC para EGFR8 (carga de 75 ug), EGFR8-T58E (carga de 73 ug) y EGFR8-T58D (carga de 52 ug). B) Datos del termograma de DSC para muestras de 1 mg/ml de EGFR8 adnectinas en PBS a pH 7,1. C) Ajuste de datos de DSC para EGFR8. D) Ajuste de datos de DSC para EGFR8-T58E. E) Ajuste de datos de DSC para EGFR8-T58D.

Figura 21. Curvas de precipitación salina en sulfato de amonio para proteínas EGFR8 ensayadas a 0,33 mg/ml. Los símbolos representan los datos para EGFR8 de tipo silvestre, ASm = 2,08 M (círculo blanco o), EGFR8-T58E, ASm = 2,15 M (cuadrado blanco □), y EGFR8-T58D, ASm = 2,16 M (triángulo blanco hacia arriba A).

Figura 22. Propensión a la agregación de las adnectinas EGFR8. A) Relación entre la concentración de proteína medida frente a la concentración de proteína esperada (basándose en estimaciones visuales del volumen) para adnectinas concentradas a pequeña escala usando ultrafiltración. B) Porcentaje de especies de alto peso molecular (% de APM) en la fracción soluble de las muestras de adnectina concentrada tal como se mide mediante SEC. Figura 23. Datos de estabilidad acelerada para adnectinas EGFR8 en PBS a pH 7,1. A) Concentración de proteína adnectina en el momento cero (t0) y tras 1 semana(1s) o 2 semanas (2s) a 40 °C tal como se mide mediante A280- B) Cambios en concentración de proteína soluble tal como se miden mediante integración de picos de SEC. C) Porcentaje de especies de alto peso molecular (% de APM) en la fracción soluble tal como se mide mediante SEC tras 1 semana (1s) o 2 semanas (2s) a 40 °C.

Figura 24. Alineamiento de secuencia de aminoácidos de EGFR4 y EGFR8 con las secuencias de bucle de unión a diana "BC", "DE" y "FG" indicadas.

Figura 25. Estado oligomérico y estabilidad térmica de adnectinas EGFR4. A) Cromatogramas de SEQ para EGFR4 (carga de 50 ug) o EGFR4-T58E (carga de 50 ug). B) Datos del termograma de DSC para muestras de 1 mg/ml de EGFR4 adnectinas en PBS a pH 7,1. C) Ajuste de datos de DSC para EGFR4. D) Ajuste de datos de DSC para EGFR4-T58E.

Figura 26. Curvas de precipitación salina en sulfato de amonio para adnectinas EGFR4 ensayadas a 0,3 mg/ml. Los símbolos representan los datos para EGFR4 de tipo silvestre, ASm = 0,865 ± 0,014 M (círculo blanco o), EGFR4-T58E, ASm = 1,024 ± 0,003 (cuadrado blanco □).

Figura 27. Propensión a la agregación de las adnectinas EGFR4. A) Relación entre la concentración de proteína medida frente a la concentración de proteína esperada (basándose en estimaciones visuales del volumen) para adnectinas concentradas a pequeña escala usando ultrafiltración. B) Porcentaje de especies de alto peso molecular (% de APM) en la fracción soluble de las muestras de adnectina concentrada incubada toda la noche a temperatura ambiente tal como se mide mediante SEC.

Descripción detallada

Definiciones

El término "polipéptido" se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, independientemente de la longitud, de la modificación postraduccional o de la función. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos N.° 6.559.126. Los polipéptidos también se pueden modificar mediante cualquiera de varias formas químicas habituales (por ejemplo, se puede modificar un aminoácido con un grupo protector; el aminoácido de carboxilo terminal se puede convertir en un grupo amida terminal; el resto de amino terminal se puede modificar con grupos para, por ejemplo, mejorar la lipofilia; o el polipéptido se puede glucosilar químicamente o modificar de otro modo para aumentar la estabilidad o la semivida in vivo). Las modificaciones de polipéptidos pueden incluir la unión de otra estructura ta como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también puede incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o, L o D).

Tal como se usa en el presente documento, un "armazón basado en fibronectina" o proteína o resto de "FBS" (siglas del inglés fibronectin based scaffold) se refiere a proteínas o restos que se basan en un dominio de fibronectina, por ejemplo, la repetición de fibronectina tipo III ("Fn3"). Una proteína o un dominio (de una proteína) que se basa en una repetición de Fn3 se cita en el presente documento como "proteína Fn3", "proteína de dominio de Fn3" o "dominio de Fn3". Fn3 es un pequeño dominio (de aproximadamente 10 kDa) que tiene la estructura de un plegamiento de inmunoglobulina (Ig) (es decir, una estructura de sándwich p de tipo Ig, que consiste en siete cadenas p y seis bucles). La fibronectina tiene 18 repeticiones de Fn3, y aunque la homología de secuencia entre las repeticiones es baja, todas comparten una elevada similitud en la estructura terciaria. Los dominios Fn3 también están presentes en muchas proteínas que no son la fibronectina, tales como moléculas de adhesión, moléculas de superficie celular, por ejemplo, receptores de citocina y dominios de unión a hidratos de carbono. La expresión proteína o resto de "armazón basado en fibronectina" o "proteína Fn3" o "dominio Fn3" o "proteína de dominio Fn3" pretende incluir proteínas o dominios basados en dominios Fn3 a partir de estas otras proteínas (es decir, no fibronectina). Los dominios Fn3 a modo de ejemplo incluyen el 7°, 10° y 14° dominio de fibronectina tipo III, que se citan en el presente documento como 7Fn3, 10Fn3 y 14Fn3, respectivamente. Tal como se usa en el presente documento, un "dominio Fn3" o "resto de Fn3" o "proteína de dominio Fn3" se refiere a la Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, las SEQ ID NO: 1-8, 10, 12, 14 o 16, 65 o 66) y variantes biológicamente activas de la misma, por ejemplo, las variantes biológicamente activas que se pueden

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unir específicamente a una diana, tal como EGFR, IL23 y IGF1R. Por ejemplo, las moléculas de 10Fn3 que se unen a dianas específicas se pueden seleccionar a partir de bibliotecas de 10Fn3 usando la técnica PROfusion, que se describe, por ejemplo, en el documento WO02/32925. Un dominio 10Fn3 de tipo silvestre puede comprender una de las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-8, 10, 12, 14, 16. La secuencia de aminoácidos de 10Fn3 humana de tipo silvestre se establece en la SEQ ID NO: 1. Un dominio 7Fn3 de tipo silvestre puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 65. Un dominio 14Fn3 de tipo silvestre puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 66. Las variantes biológicamente activas de un dominio Fn3 incluyen dominios Fn3 que comprenden al menos, como máximo o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 variaciones de aminoácidos, es decir, sustituciones, adiciones o deleciones, en relación con un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO:1-16 y 65-71. Una variante biológicamente activa de un dominio Fn3 también puede comprender, o comprender como máximo, 1-3, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, o 1-40 cambios de aminoácidos en relación con un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-16 y 65-71. En determinadas realizaciones, una variante biológicamente activa de un dominio Fn3 no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1,2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 variaciones de aminoácidos, es decir, sustituciones, adiciones o deleciones, en relación con un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO:1-16 y 65-71. Un(os) cambio(s) de aminoácidos puede(n) estar en una región de bucle y/o en una región no de bucle, por ejemplo, una cadena p. Las secuencias a modo de ejemplo de aminoácidos degenerados de 10Fn3 se proporcionan en el presente documento como las SEQ ID NO: 17-29.

La frase "que comprende una secuencia de aminoácidos basada en" una secuencia específica o primera secuencia pretende incluir secuencias de aminoácidos que provienen de la secuencia específica o de la primera secuencia, por ejemplo, mediante sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos basada en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO:1-29 y 6566 se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que proviene de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-29 y 65-66, incluyendo, por ejemplo, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una o más de las SEQ ID NO: 1-29 y 65-66 en una o más secuencias de bucle o no de bucle, tal como para obtener la unión a una diana deseada.

Una "región" de un dominio Fn3 (o resto) tal como se usa en el presente documento se refiere o bien a un bucle (AB, BC, CD, DE, EF y FG), una cadena p (A, B, C, D, E, F y G), el extremo N-terminal (por ejemplo, los restos de aminoácidos 1-7 de la SEQ ID NO: 1 o 6) o el extremo C-terminal (por ejemplo, los restos de aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 1 o los restos de aminoácidos 93-95 de la SEQ ID No: 6) de un dominio Fn3.

Un dominio Fn3 puede comprender, en orden desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, una cadena beta o de tipo beta, A; un bucle, aB; una cadena beta o de tipo beta, B; un bucle, BC; una cadena beta o de tipo beta, C; un bucle, CD; una cadena beta o de tipo beta, D; un bucle, DE; una cadena beta o de tipo beta, E; un bucle, EF; una cadena beta o de tipo beta, F; un bucle, FG; y una cadena beta o de tipo beta, G. Las siete cadenas p antiparalelas se disponen como dos láminas beta que forman un núcleo estable, mientras que crean dos "caras" compuestas de los bucles que conectan las cadenas beta o de tipo beta. Los bucles AB, CD y EF se localizan en una cara ("el polo sur") y los bucles BC, DE y FG se localizan en la cara opuesta ("el polo norte"). Cualquiera o todos los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG puede participar en o contribuir a la unión del ligando.

El término "región no de bucle" de un dominio Fn3 se refiere a una cadena p, el extremo N-terminal o el extremo C- terminal de un dominio Fn3. Una región no de bucle de un dominio Fn3 también se puede citar como una "región de armazón".

Un "bucle del polo norte" se refiera a uno cualquiera de los bucles BC, DE y FG de un dominio Fn3.

Un "bucle del polo sur" se refiere a uno cualquiera de los bucles AB, CD y EF de un dominio Fn3.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y no considerar cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN- 2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan.

A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A para, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia para, con o frente

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a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente: 100 veces la parte X/Y donde X es el número de restos de aminoácidos registrados como coincidencias idénticas mediante un programa de alineamiento de secuencias, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR), en esa alineación de A y B en el programa y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.

Tal como se usa en el presente documento, se considera que un resto de aminoácido en un polipéptido "contribuye a la unión" a una diana si (1) se descubre que cualquiera de los átomos que no sean de hidrógeno de la cadena lateral o de la cadena principal del resto está a cinco angstroms de cualquier átomo de la diana de unión basándose en una estructura tridimensional del complejo determinada de forma experimental, y/o (2) la mutación del resto a su equivalente en Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), a alanina, o a un resto que tiene una cadena lateral de tamaño similar o más pequeña que el resto en cuestión, lleva a un aumento medido de la constante de disociación de equilibrio para la diana (por ejemplo, un aumento en la k0n).

Tal como se usa en el presente documento, "Fc" abarca dominios que provienen de la región constante de una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina humana, que incluye un fragmento, un análogo, una variante, un mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases tales como IgA, IgD, IgE e IgM. La región constante de una inmunoglobulina se define como un polipéptido de origen natural o producido de forma sintética homólogo a la región C-terminal de inmunoglobulina, y puede incluir un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, o un dominio CH4, por separado o en combinación. La expresión "resto Fc" o "dominio Fc" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier combinación de los dominios CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4. Por lo tanto, un "dominio Fc" o resto puede o no comprender una bisagra.

"Resto" se refiere a una parte de una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender varios restos. En una realización, una proteína de fusión comprende un resto de armazón basado en fibronectina (Fn) y un resto de Fc.

El término "solubilidad mejorada" puede significar mayor proporción (por ejemplo, concentración, molalidad, fracción molar, o proporción molar) de un soluto de proteína en un disolvente designado, en condiciones de solución saturada, en comparación con otra proteína. Esto también se puede expresar como un mayor límite de solubilidad de una proteína. "Solubilidad mejorada" también puede referirse a una reducida agregación de proteínas, o a una menor proporción (por ejemplo, porcentaje, parte o relación) de especie de proteína agregada a una concentración de proteína dada en un disolvente designado, en comparación con otra proteína. Esto se puede expresar de forma alternativa como una reducida propensión de una proteína a la agregación. El término "agregación" se puede referir a la interacción o a la asociación entre dos o más moléculas de proteína, por ejemplo, proteínas en su conformación natural o moléculas de proteína mal plegadas. Las moléculas de interacción o de asociación se pueden citar como, por ejemplo, un "agregado", un "oligómero" (tal como, un dímero, un trímero, un tetrámero u oligómeros de orden superior), una "especie de alto peso molecular", una "especie de orden superior", u otros términos relacionados que comúnmente entiende un experto en la materia. Se puede analizar la solubilidad de una proteína mediante cualquiera de las técnicas adecuadas. En algunas realizaciones, se puede analizar la solubilidad de una proteína mediante el ensayo de solubilidad de sulfato de amonio. En algunas realizaciones, se puede analizar la solubilidad de una proteína mediante ultrafiltración. En algunas realizaciones, se puede analizar la solubilidad de una proteína en condiciones de estrés acelerado.

En algunas realizaciones, la solubilidad de una proteína se puede considerar mejorada si la solubilidad de una proteína en un disolvente mejora en al menos el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 30 % o el 50 % o más en comparación con la solubilidad de otra proteína en el disolvente. En algunas realizaciones, la solubilidad de una proteína se puede considerar mejorada si el límite de solubilidad de una proteína en un disolvente mejora en al menos 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml o 500 mg/ml mayor que el límite de solubilidad de otra proteína en el disolvente. En algunas realizaciones, la solubilidad de una proteína se puede considerar mejorada si el porcentaje de especie de proteína agregada a una concentración dada es menor en al menos el 0,5 %, el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 50 % o más en comparación con el porcentaje de especie de proteína agregada de otra proteína en la concentración.

Descripción general de la solubilidad de la proteína y ensayos

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La agregación de proteínas es un complejo proceso que se puede originar mediante varios mecanismos diferentes (Morris, A.M. et al., 2009, Biochim Biophys Acta. 1794, 375-97; Joubert, M.K. et al., 2011, J Biol Chem 286, 25118-33; Weiss, W.F. et al., 2009, J Pharm Sci. 98, 1246-77; Roberts, C.J. 2007, Biotechnol Bioeng. 98, 927-38; Hawe, A. et al., 2009, Eur J Pharm Sci. 38, 79-87; Mahler, H.C. et al., 2009, J Pharm Sci. 98, 2909-34; Philo, J.S. Y Arakawa, T., 2009, Curr Pharm Biotechnol. 10, 348-51). Los agregados pueden formar, por ejemplo, debido a la autoasociación de la conformación natural, estados alterados de forma estructural tales como un glóbulo fundido, estructuras desnaturalizadas, degradadas o modificadas químicamente. La agregación o solubilidad de la proteína también puede estar influenciada por las condiciones de la solución, la presencia de contaminantes, así como por varios factores externos tales como la temperatura, el estrés mecánico, o el estrés de congelación/descongelación. Además, los tipos de agregado pueden ser covalentes o no covalentes, y pueden diferir en la morfología, variando desde dímeros solubles u oligómeros de orden superior, a precipitados amorfos insolubles, o estructuras amiloides más regulares.

Se puede usar una serie de técnicas para analizar a solubilidad de las proteínas y para detectar los agregados de diferentes tamaños y morfologías, así como para caracterizar los mecanismos de la agregación (Wang, W. 2005, Int J Pharm 289, 1-30; Singh, S.K. et al., 2010, J Pharm Sci. 99, 3302-21; Kamerzell, T.J. et al., 2011, Adv Drug Deliv Rev. 63, 1118-59; Zolls, S. et al., 2012, J Pharm Sci. 101, 914-35). Las técnicas basadas en los principios de dispersión de la luz, espectroscopía, electroforesis, cromatografía y muchas otras se pueden usar para caracterizar la agregación de proteínas, la estabilidad y la solubilidad o para comparar la propensión a la agregación o la solubilidad de diferentes moléculas de proteína entre sí, o una molécula en diferentes condiciones de solución. Las proteínas se pueden concentrar antes del análisis usando métodos tales como ultrafiltración o liofilización. O se pueden usar métodos de menor escala para concentrar las proteínas para análisis de solubilidad y agregación, que incluyen el uso de presión osmótica, congelación/descongelación, y evaporación del disolvente (Shire, S.J. et al., 2004, J Pharm Sci. 93, 1390402). La agregación también se puede estudiar a concentraciones de proteína más bajas en condiciones de estrés acelerado tales como elevada temperatura, tensión de cizalla o estrés de mezclado (Hawe, A. et al., 2012, J Pharm Sci. 101, 895-913), utilizando ensayos de unión de colorante fluorescente de alto rendimiento (Kayser, V. et al., 2012, Biotechnol J. 7, 127-32; He, F. et al., 2010, J Pharm Sci. 99, 1707-20), o incluso predecir usando métodos de simulación computacional (Caflisch, A., 2006, Curr Opin Chem Biol. 10, 437-44; Fernandez-Escamilla, A.M. et al., 2004, Nat Biotechnol. 22, 1302-6; Cellmer, T. et al., 2007, Trends Biotechnol. 25, 254-61).

La propensión a la agregación de las proteínas también se puede analizar basándose en su solubilidad relativa en presencia de uno o más agentes cosmotrópicos, por ejemplo, sulfato de amonio (AS, de ammonium sulfate) u otros cosmótropos tales como fosfato (PO43') o fluoruro (F‘), o en presencia de polímeros de exclusión por volumen tales como polietilenglicol (PEG). El mecanismo de la precipitación de proteínas inducido por AS o "precipitación salina", puede implicar la unión fuerte de moléculas de agua mediante el anión sulfato cosmotrópico polar, que deshidrata las superficies de la proteína, aumenta el potencial químico de la proteína y provoca que las moléculas de proteína se agreguen en un precipitado amorfo (Baldwin, RL., 1996, Biophys J. 71, 2056-63). Debido a que las superficies hidrofóbicas de la proteína están preferentemente deshidratadas sobre las superficies polares, la autoasociación de proteínas inducida por AS se puede dirigir mediante la interacción de las superficies hidrófobas expuestas, similar a las fuerzas que dirigen la agregación en ausencia de AS (Young, L. et al., 1994, Protein Sci. 3, 717-29; Arunachalam, J. y Gautham, N., 2008, Proteins. 71, 2012-25; Fink, A.L., 1998, Fold Des. 3, R9-23). La teoría de la determinación de la solubilidad relativa de la proteína usando AS se revisa por Trevino et al (2008, J Pharm Sci. 97, 4155-66), quienes también describen su aplicación en la determinación de la solubilidad relativa de una serie de variantes de RNAsa (Trevino, S.R. et al., 2007, J Mol Biol. 366, 449-60). En este documento, se describen un método de escala de banco manual así como un método automatizado basado en la valoración en torno a este concepto, y se pueden usar para determinar la solubilidad relativa de la proteína.

Dominios modificados de fibronectina tipo III (Fn3) con solubilidad mejorada

En el presente documento se describen polipéptidos que comprenden un dominio Fn3 modificado, en donde el dominio Fn3 modificado comprende una modificación de aminoácidos que mejora la solubilidad del polipéptido en relación con un polipéptido (o dominio Fn3) que no comprende la modificación de aminoácidos. La modificación de aminoácidos puede estar en un bucle o en una cadena p, por ejemplo, una cadena p E, del dominio Fn3. Los polipéptidos de la invención comprenden un dominio Fn3 modificado, en donde el dominio Fn3 modificado comprende una secuencia de aminoácidos en donde el aminoácido que se corresponde con el resto seleccionado 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E), y en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia del dominio 10Fn3 humano de tipo silvestre establecido en: VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKS

TATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTE/DKPSQ (SEQ ID NO: 1) (los bucles AB, CD y EF están subrayados; los bucles BC, DE y FG se resaltan en negrita; las cadenas p se localizan entre cada una de las regiones bucle; y las regiones de N-terminal y C-terminal se muestran en cursiva). En la SEQ ID NO:1, el bucle AB se refiere a los restos 14-17, el bucle BC se refiere a los restos 23-31, el bucle CD se refiere a los restos 37-47, el bucle DE se refiere a los restos 51-56, el bucle EF se refiere a los restos 63-67, y el bucle FG se refiere a los restos 75-87. Los bucles BC, DE y FG se alinean a lo largo de una cara de la molécula, es decir, el "polo norte", y los bucles AB, CD y EF se alinean a lo largo de la cara opuesta de la molécula, es decir, el "polo sur". En la SEQ ID NO: 1, la cadena p A

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se refiere a los restos 8-13, la cadena p B se refiere a los restos 18-22, la cadena p C se refiere a los restos 32-36, la cadena beta D se refiere a los restos 48-50, la cadena p E se refiere a los restos 57-62, la cadena p F se refiere a los restos 68-74, y la cadena p G se refiere a los restos 88-92. Las cadenas p se unen entre sí a través del correspondiente bucle, por ejemplo, las cadenas A y B están conectadas a través del bucle AB en la formación de la cadena p A, el bucle Ab, la cadena p B, etc. Las regiones de N-terminal y/o de C-terminal de la SEQ ID NO: 1 (anteriormente en cursiva), se pueden eliminar o alterar para generar una molécula que conserva la actividad biológica o para introducir actividad de unión a diana.

Aglutinantes que tienen un bucle de Polo Norte y de Polo Sur modificados

En algunas realizaciones, los polipéptidos que comprenden una mutación de mejora de solubilidad, es decir, una mutación T58E, comprenden un dominio Fn3, por ejemplo, 10Fn3 que tiene (i) una modificación en la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle del polo norte seleccionados de los bucles BC, DE y FG en relación con el correspondiente bucle del dominio Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1 o 5), y (ii) una modificación en la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle del polo sur seleccionado de los bucles AB, CD y EF en relación con el bucle correspondiente del dominio Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1 o 5). Los bucles modificados del polo norte y del polo sur pueden contribuir a la unión a la misma diana. Se contemplan diversas combinaciones de los bucles modificados del polo norte y del polo sur. Por ejemplo, un Fn3, por ejemplo, 10Fn3, puede comprender un bucle modificado del polo norte y un bucle modificado del polo sur, un bucle modificado del polo norte y dos bucles modificados del polo sur, dos bucles modificados del polo norte y un bucle modificado del polo sur, dos bucles modificados del polo norte y dos bucles modificados del polo sur, tres bucles modificados del polo norte y un bucle modificado del grupo del polo sur, etc., en donde cada uno de los bucles modificados contribuyen a la unión a la misma diana. Las combinaciones a modo de ejemplo de los bucles del polo norte y del polo sur que se pueden modificar incluyen, por ejemplo, el bucle CD (polo sur) y el bucle FG (polo norte), el bucle CD (polo sur) y el bucle DE (polo norte), el bucle EF (polo sur) y el bucle FG (polo norte), el bucle AB (polo sur) y el bucle FG (polo norte), o el bucle DE (polo norte) y el bucle EF (polo sur). Otra combinación de bucles a modo de ejemplo es el bucle CD (polo sur), el bucle DE (polo norte) y el bucle EF (polo sur). Otra combinación de bucles a modo de ejemplo más es el bucle DE (polo norte) y una de más de los bucles AB, CD y EF (polo sur). Los bucles modificados pueden tener modificaciones de la secuencia a través de todo el bucle o solo en una parte del bucle. Además, uno o más de los bucles modificados puede tener inserciones o deleciones de manera que la longitud del bucle es variada en relación con la longitud del bucle correspondiente de la secuencia de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, las regiones adicionales en el dominio Fn3 (es decir, además de los bucles del polo norte y del polo sur), tal como las cadenas p, las regiones de N-terminal y/o de C-terminal, también se pueden modificar en la secuencia en relación con el dominio Fn3 de tipo silvestre, y tales modificaciones adicionales también pueden contribuir a la unión a la diana.

La presente divulgación incluye adicionalmente restos de armazón a base de fibronectina que comprenden un dominio 10Fn3 que se define generalmente siguiendo la secuencia:

VSDVPRDLEVVAA(X),,LLISWÍX)',YRITY(X)wFTV(X)yATISGL(X)yYII TVYA(X)zISINYRT (SEQ ID NO: 17), o mediante la secuencia que tiene la SEQ ID NO: 18-29. En las SEQ ID nO: 17-29, el bucle AB se representa mediante (X)u, el bucle BC se representa mediante (X)v, el bucle CD se representa mediante (X)w, el bucle DE se representa mediante (X)x, el bucle EF se representa mediante (X)y y el bucle FG se representa mediante Xz. X representa, independientemente, cualquier aminoácido, y el subíndice tras la X representa un número entero del número de aminoácidos. Por ejemplo, u, v, w, x, y y z pueden ser cada uno un número entero seleccionado, independientemente, de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 y 6-7. Las secuencias de las cadenas beta (subrayadas) pueden tener en cualquier parte de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, deleciones o adiciones a través de las 7 regiones de armazón en relación con los correspondientes aminoácidos mostrados en las SEQ ID NO: 17-29. Las secuencias de las cadenas beta pueden tener en cualquier parte de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservativas, a través de las 7 regiones de armazón en relación con los correspondientes aminoácidos mostrados en las SEQ ID NO: 17-29. En determinadas realizaciones, los restos de aminoácidos hidrófobos del núcleo (restos en negrita en la SEQ ID NO: 17 anterior) son fijos, y cualquiera de las sustituciones, sustituciones conservativas, deleciones o adiciones tienen lugar en otros restos que no sean los restos de aminoácidos hidrófobos del núcleo. En algunas realizaciones, los restos hidrófobos del núcleo de los polipéptidos proporcionados en el presente documento no se han modificado en relación con el dominio 10Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede ser al menos el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la de un dominio Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, un dominio Fn3 humano de la SEQ ID NO: 1-16, 65, o 66. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede ser al menos el 50 % idéntica a la de un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede ser al menos el 65 % idéntica a la de un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede ser al menos el 80 % idéntica a la de un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede ser al menos el 90 % idéntica a la de un dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, uno o más de los bucles no se

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modificarán en relación con la secuencia del correspondiente bucle de la secuencia de tipo silvestre y/o una o más de las cadenas p no se modificará en relación con la secuencia de la correspondiente cadena p de la secuencia de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, cada una de las cadenas de tipo beta de un dominio 10Fn3 en un resto Fn3 puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de una correspondiente cadena beta o de tipo beta de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, las variaciones en las regiones de la cadena p pueden no alterar la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones, la región no de bucle del dominio 10Fn3 se puede modificar mediante una o más sustituciones conservativas. Se puede alterar hasta un 3 %, un 5 %, un 10 %, un 20 % o incluso un 30 % o más de los aminoácidos en el dominio 10Fn3 mediante sustitución conservativa sin alterar sustancialmente la afinidad del 10Fn3 por un ligando. En determinadas realizaciones, las regiones no de bucle, por ejemplo, las cadenas p pueden comprender en cualquier parte de 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 5-15, o 510 sustituciones conservativas de aminoácidos. En realizaciones ilustrativas, la modificación del armazón puede reducir la afinidad de unión del Fn3, por ejemplo, 10Fn3, el aglutinante para un ligando en menos de 100 veces, 50 veces, 25 veces, 10 veces, 5 veces o 2 veces. Puede ser que tales cambios puedan alterar la inmunogenicidad del Fn3 in vivo, y cuando se reduce la inmunogenicidad, tales cambios pueden ser deseables. Tal como se usa en el presente documento, "sustituciones conservativas" son restos que son físicamente o funcionalmente similares a los correspondientes restos de referencia. Es decir, una sustitución conservativa y su resto de referencia tienen un tamaño, forma, carga eléctrica y propiedades químicas similares que incluyen la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno o similares. Las sustituciones conservativas a modo de ejemplo incluyen aquellas que cumplen los criterios definidos para una mutación puntual aceptada en Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1978 & Supp.). Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen sustituciones en los siguientes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina, tirosina.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede diferir de un Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 en, como mucho, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede diferir de un dominio Fn3 de tipo silvestre en, como mucho, 30 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede diferir de un dominio Fn3 de tipo silvestre en, como mucho, 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 modificado puede diferir de un dominio Fn3 de tipo silvestre en, como mucho, 10 aminoácidos.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido seleccionada de una sustitución, deleción y adición en al menos un bucle en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, un dominio 10Fn3 humano de la SEQ ID NO: 1-16, 65, o 66. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos dos bucles en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos tres bucles en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en al menos un bucle seleccionado de bucles del polo norte (bucles BC, DE y FG), en comparación con un dominio de Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en al menos un bucle seleccionado de bucles del polo sur (bucles AB, CD y EF), en comparación con un dominio de Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido seleccionada de sustitución, deleción y adición, en al menos una región no de bucle y al menos un bucle, en comparación con un dominio de Fn3 de tipo silvestre. En los polipéptidos de la invención, el dominio Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido en una cadena p en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos dos cadenas p en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos tres cadenas p en comparación con un dominio Fn3 de tipo silvestre.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 comprende un bucle, AB; un bucle, BC; un bucle, CD; un bucle, DE; un bucle, EF; y un bucle, FG; y tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG con una secuencia de aminoácidos alterada en relación con la secuencia del correspondiente bucle del dominio 10Fn3 humano de la SEQ ID NO: 1-16. En algunas realizaciones, se alteran los bucles BC, DE y FG. En determinadas realizaciones, se alteran los bucles AB, CD y EF. En determinadas realizaciones, el bucle FG es el único bucle que se altera. En otras realizaciones, se alteran los bucles CD y FG, y de forma opcional, no se alteran otros bucles. En determinadas realizaciones, se alteran los bucles CD y EF, y de forma opcional, no se alteran otros bucles. En algunas realizaciones, se combinan una o más alteraciones específicas del armazón con una o más alteraciones del bucle. Con "alteración" se refiere a una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos en relación con una secuencia de molde (es decir, el correspondiente dominio de fibronectina humana de tipo silvestre) e incluye adiciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos.

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En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden comprender un dominio Fn3 modificado en donde las regiones no de bucle comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o el 100 % idéntica a las regiones no de bucle de un dominio Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, un dominio Fn3 humano de la SEQ ID NO: 116, 65 o 66), en donde al menos un bucle seleccionado de AB, BC, CD, DE, EF y FG se puede alterar. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el bucle AB puede tener hasta 4 sustituciones de aminoácidos, hasta 10 inserciones de aminoácidos, hasta 3 deleciones de aminoácidos o una combinación de las mismas; el bucle BC puede tener hasta 10 sustituciones de aminoácidos, hasta 4 deleciones de aminoácidos, hasta 10 inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas; el bucle CD puede tener hasta 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 10 inserciones de aminoácidos, hasta 4 deleciones de aminoácidos o una combinación de las mismas; el bucle DE puede tener hasta 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 4 deleciones de aminoácidos, hasta 13 inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas; el bucle EF puede tener hasta 5 sustituciones de aminoácidos, hasta 10 inserciones de aminoácidos, hasta 3 deleciones de aminoácidos o una combinación de las mismas; y/o el bucle FG puede tener hasta 12 sustituciones de aminoácidos, hasta 11 deleciones de aminoácidos, hasta 25 inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas.

Se debería de entender que no todos los restos en una región de bucle o no de bucle necesitan modificarse para lograr un dominio de unión de Fn3 que tiene una gran afinidad por una diana deseada. Además, también se pueden hacer inserciones y deleciones en las regiones bucle mientras que aún se producen dominios de unión de Fn3 de alta afinidad. Por consiguiente, en algunas realizaciones, uno o más bucles seleccionados de AB, BC, CD, DE, EF y FG se pueden alargar o acortar en longitud en relación con el correspondiente bucle, un Fn3 de tipo silvestre. En cualquiera de los polipéptidos dados, uno o más bucles se pueden extender en longitud, uno o más bucles se pueden reducir en longitud o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la longitud de un bucle dado se puede extender en 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, o 10-15 aminoácidos. En algunas realizaciones, la longitud de un bucle dado se puede reducir en 1-15, 1-12, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2, 2-10, o 2-5 aminoácidos. En particular, el bucle FG de 10Fn3 es de 13 restos de longitud, mientras que el correspondiente bucle en las cadenas pesadas de los anticuerpos varía de 4-28 restos. Para optimizar la unión al antígeno en los polipéptidos que dependen del FG para la unión a la diana, por lo tanto, la longitud del bucle FG de Fn3 se puede alterar en longitud así como en la secuencia para obtener la mayor flexibilidad y afinidad posibles en la unión a la diana.

En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de las regiones N-terminal y/o C-terminal del dominio Fn3 modificado se pueden modificar mediante deleción, sustitución o inserción en relación con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones de un dominio Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, un dominio Fn3 humano de la SEQ ID NO: 1-16, 65, o 66). También se pueden añadir secuencias adicionales al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del dominio Fn3 modificado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la extensión de N-terminal puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: M, MG y G. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cola de C-terminal del dominio Fn3 modificado se puede modificar o truncar en relación con la secuencia de aminoácidos de la cola de C-terminal de un dominio Fn3 de tipo silvestre (por ejemplo, un dominio Fn3 humano de la SEQ ID NO:1-16, 65 o 66). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal del dominio Fn3 modificado se puede modificar o truncar en relación con la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de un dominio Fn3 de tipo silvestre.

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de los primeros 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos del dominio Fn3 modificado se pueden modificar o delecionar en los polipéptidos proporcionados en el presente documento en relación con la secuencia de los correspondientes aminoácidos en un dominio Fn3 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, los aminoácidos que se corresponden con los aminoácidos 1-8 de la SEQ ID NO: 1 se pueden reemplazar con una región N-terminal alternativa que tiene de 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 aminoácido de longitud. Las regiones a modo de ejemplo de N-terminal alternativas incluyen M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 30) y GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 31), o truncamiento en N-terminal de una cualquiera de las SEQ ID No: 30 y 31. Otras regiones adecuadas de N-terminal alternativas incluyen, por ejemplo, XnSDVPRDL (SEQ ID NO: 32), XnDVPRDL (SEQ ID NO: 33), XnVPRDL (SEQ ID NO: 34), XnPRDL (SEQ ID NO: 35), XnRDL (SEQ ID NO: 36), XnDL (SEQ ID NO: 37), o XnL, en donde n = 0, 1 aminoácidos, en donde cuando n = 1, X es Met o Gly, y cuando n = 2, X es Met-Gly. Cuando se añade una secuencia de Met-Gly al extremo N-terminal de un dominio 10Fn3, la M se puede escindir, dejando una G en el extremo N-terminal. En otras realizaciones, la región de N-terminal alternativa comprende la secuencia de aminoácidos MASTSG (SEQ ID NO: 38).

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos que se corresponde con los aminoácidos 93-101, 94101, 95-101, 96-101, 97-101, 98-101, 99-101, 100-101, o 101 de la SEQ ID NO: 1 se pueden delecionar o modificar en los polipéptidos proporcionados en el presente documento en relación con la secuencia de los correspondientes aminoácidos en el dominio 10Fn3 humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). En realizaciones ilustrativas, los aminoácidos que se corresponden con los aminoácidos 95-101 de la SEQ ID NO: 1 se pueden reemplazar con una región de C-terminal alternativa que tiene de 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 aminoácidos de longitud. Los ejemplos específicos de secuencias alternativas de la región C-terminal incluyen, por ejemplo, polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en, EIEK (SEQ ID NO: 39), EGSGC (SEQ ID NO: 40), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 41), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 42), EIEKP (SEQ ID NO: 43), EIEKPS (SEQ ID NO: 44), EIEKPC (SEQ ID No: 45) o HHHHHH (SEQ ID NO: 46). En algunas realizaciones, la región alternativa de C-terminal comprende EIDK (SEQ ID NO: 47), y en realizaciones particulares, la región alternativa de C-terminal es o bien

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EIDKPCQ (SEQ ID NO: 48) o EIDKPSQ (SEQ ID NO: 49).

En determinadas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede tener tanto una secuencia alternativa de la región N-terminal como una secuencia alternativa de la región de C-terminal.

En algunas realizaciones, para alterar la unión a integrina se puede mutar o delecionar al menos un resto del motivo de unión a integrina "arginina-glicina-ácido aspártico" (RGD) (por ejemplo, los aminoácidos 78-80 de la SEQ ID NO:1). En algunas realizaciones, el bucle FG de los polipéptidos proporcionados en el presente documento no contiene un sitio de unión a integrina RGD. En una realización, la secuencia de RGD se puede reemplazar por una secuencia de aminoácido polar-aminoácido neutro-aminoácido ácido (en la dirección de N-terminal a C-terminal). En otra realización, la secuencia de RGD se puede reemplazar con SGE. En aún otra realización, la secuencia de RGD se reemplaza con RGE (véase, por ejemplo, La SEQ ID NO: 16). El polipéptido de la invención se une de forma específica a una diana a la que no se une mediante un dominio Fn3 de tipo silvestre, en particular, el dominio Fn3 humano de tipo silvestre que tiene, por ejemplo, La SEQ ID NO: 1-16, 65, o 66.

En algunas realizaciones, el polipéptido se puede unir a una diana deseada con una Kd de menos de 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM o menos. En algunas realizaciones, el polipéptido se une a una diana deseada con una Kd de entre 1 pM y 1 jM, entre 100 pM y 500 nM, entre 1 nM y 500 nM, o entre 1 nM y 100 nM. En algunas realizaciones, el polipéptido se une a una diana deseada con una Kd de menos de 500 nM. En algunas realizaciones, el polipéptido se une a una diana deseada con una Kd de menos de 100 nM.

En algunas realizaciones, un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en las SEQ ID NO: 1-16, y el polipéptido se une de forma específica a una diana, por ejemplo, con una Kd de menos de 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM o menos. El polipéptido puede comprender cambios (o alteraciones) de aminoácidos en uno o más bucles y una o más cadenas.

Aglutinantes que tienen modificaciones en la región del bucle y del armazón

También se proporcionan en el presente documento dominios 10Fn3 que tienen una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una sustitución T58E, y que tienen combinaciones de modificaciones de bucle y armazón. En particular, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden una solubilidad que mejora la mutación y un dominio 10Fn3 que comprende (i) una modificación en la secuencia de aminoácidos de al menos uno de los bucles AB, BC, CD, DE, EF o fG y (ii) una modificación en la secuencia de aminoácidos de al menos una región de armazón (es decir, una modificación en al menos una cadena p, la región N-terminal y/o la región C-terminal) que incluye la sustitución T58E, en donde el(los) bucle(s) modificado(s) y la(s) región(es) de armazón modificada(s) contribuyen a la unión a la misma diana. En realizaciones ilustrativas, las modificaciones en la región del armazón se localizan adyacentes a las modificaciones en una región de bucle, por ejemplo, si se modifica en bucle AB, las mutaciones del armazón pueden tender a localizarse en la cadena p A y/o en la cadena p B, que son adyacentes al bucle AB en la secuencia lineal del dominio 10Fn3. En otras realizaciones, se puede hallar una agrupación de modificaciones juntas en regiones de bucle y de armazón que son adyacentes entre sí en la secuencia lineal del dominio Fn3. Por ejemplo, los aglutinantes de Fn3 que tienen tanto modificaciones en el bucle como en el armazón, pueden tener agrupaciones de modificaciones de aminoácidos en las siguientes combinaciones de regiones de bucle y de armazón que son adyacentes entre sí en la secuencia lineal del dominio Fn3: cadena p/bucle/cadena p, bucle/cadena p/bucle, bucle/cadena p/bucle/cadena p, región terminal/cadena p/bucle, o bucle/cadena p/región terminal, etc. Por ejemplo, los dominios Fn3 que tienen nuevas combinaciones de modificaciones de bucle y de armazón pueden ser agrupaciones de modificaciones de manera que sobre un tramo de 20 aminoácidos contiguos, al menos 15 de los aminoácidos están modificados en relación con el tipo silvestre. En otras realizaciones, al menos 17 de 20, 18 de 20, 17 de 25, 20 de 25 o 25 de 30 restos en un tramo contiguo están modificados en relación con la secuencia del dominio Fn3 de tipo silvestre sobre el tramo correspondiente de aminoácidos. En determinadas realizaciones, un dominio Fn3 dado puede tener dos o tres agrupaciones de modificaciones separadas mediante tramos de secuencia no modificada (es decir, de tipo silvestre). Para cualquier región dada (es decir, un bucle, una cadena p o una región terminal) que se modifica, se puede modificar todo o solo una parte de la región en relación con la secuencia de tipo silvestre. Cuando se modifica una región de cadena p, preferentemente los restos hidrófobos del núcleo permanecen sin modificar (es decir, de tipo silvestre) y se modifican uno o más restos no del núcleo en la cadena p.

Aglutinantes del "lado oeste"

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona dominios 10Fn3 que comprenden una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que tienen una cara de unión a lo largo del "lado oeste" de la molécula ("aglutinantes del lado oeste" o "aglutinantes WS", WS del inglés west-side, lado oeste). Los aglutinantes WS tal como se describen en el presente documento, comprenden un dominio 10Fn3 que tiene un bucle CD modificado y un bucle FG modificado, en comparación con las correspondientes secuencias de los bucles CD y FG establecidas en la SEQ ID NO: 1 o 5. El bucle CD y el bucle FG contribuyen ambos a la unión a la misma diana. En determinadas realizaciones, los aglutinantes WS pueden comprender modificaciones adicionales en una o más regiones en el dominio Fn3. Por

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ejemplo, Los aglutinantes WS pueden comprender modificaciones del armazón en una o más de las regiones de cadena p adyacentes a los bucles CD y/o FG. En particular, los aglutinantes pueden comprender modificaciones de secuencia en una o más de la cadena p C, la cadena p D, la cadena p F y/o la cadena p G. Las modificaciones del armazón a modo de ejemplo incluyen modificaciones en una o más posiciones de la región del armazón que se corresponden con las posiciones de los aminoácidos: 33, 35, 49, 69, 71, 73, 89 y/o 91 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Los aglutinantes WS también pueden comprender modificaciones en el bucle BC, particularmente en la parte C-terminal del bucle BC. En una realización, los dos últimos restos del bucle BC (es decir, que se corresponden con los aminoácidos 30 y 31 en el dominio 10Fn3 de tipo silvestre) se modifican en relación con la secuencia de tipo silvestre. Todo o una parte de las modificaciones adicionales del bucle y del armazón pueden contribuir a la unión a la diana en conjunto con los bucles modificados CD y FG. Preferentemente, los restos hidrófobos del núcleo no se modifican en relación con la secuencia de tipo silvestre.

En determinadas realizaciones, un aglutinante WS tiene un bucle CD que es de aproximadamente 3-11, 4-9 o 5 restos de longitud; un bucle FG que es de aproximadamente 1-10, por ejemplo, 6 o 5, restos de longitud; una cadena C que es de aproximadamente 6-14, 8-11 o 9 restos de longitud; y/o una cadena F que es de aproximadamente 9-11 o 10 restos de longitud. Las posiciones 31, 33, 35 y 37-39 de la cadena beta C se pueden alterar en relación con la secuencia de tipo silvestre. Las posiciones 32, 34 y 36 de la cadena beta C pueden ser restos hidrófobos. Las posiciones 67, 69, 71 y 73 de la cadena beta F se pueden alterar en relación con la secuencia de tipo silvestre. Las posiciones 68, 70 y 72 de la cadena beta F pueden ser restos hidrófobos. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y/o 39, tales como las posiciones 31, 33, 35, 37, 38 y/o 39, por ejemplo, las posiciones 31 y/o 33, de la SEQ ID nO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 y/o 51, tales como las posiciones 44, 45, 47 y/o 49, de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 40, 41, 42, 43, 44 y/o 45 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 y/o 76, tales como las posiciones 67, 69, 71, 73 y/o 76 o las posiciones 71, 73, 75 y/o 76, de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85 y/o 86, tal como las posiciones 84 y/o 85 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 y/o 94 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender sustituciones de aminoácidos en las posiciones 31, 33, 47, 49, 73 y/o 75 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Un aglutinante WS puede comprender un bucle C que comprende de 4-9 variados, por ejemplo, aminoácidos de tipo no silvestre; un bucle FG que comprende de 5-6 variados, por ejemplo, aminoácidos de tipo no silvestre; y en donde los aminoácidos 31, 33, 35, 37-39, 67, 69, 71, 73 y 76 son de tipo no silvestre. Los aminoácidos "de tipo no silvestre" son aminoácidos que no son los que se encuentran en la misma posición en la molécula de 10Fn3 humana de tipo silvestre (que tiene, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o 5).

Los aglutinantes WS a modo de ejemplo incluyen aquellos que tienen un aminoácido de tipo silvestre o mutado en las posiciones 30, 31, 33, 35, 37, 38, 46, 47, 49, 50, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 84, 85, 86, 87, 89 o 91. Por ejemplo, un diseño de aglutinante WS puede comprender una o más modificaciones en los aminoácidos 39-45 del bucle CD y una o más modificaciones de aminoácidos en los aminoácidos 77-83 en el bucle FG (diseño WS-LI1), y en donde una molécula 10Fn3 que tiene ese diseño se une específicamente a una molécula diana (y opcionalmente no comprende una secuencia RGD). Un diseño de aglutinante WS puede comprender el diseño de WS-LI1 y, como mucho, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 o 25 modificaciones de aminoácidos adicionales en los bucles o en las cadenas. Por ejemplo, un diseño de aglutinante WS puede comprender el diseño de WS-LI1 y, como mucho, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 o 25 modificaciones de aminoácidos adicionales en las posiciones de los aminoácidos tales como las posiciones de aminoácidos 37, 38, 46, 47, 75, 76 y 85-88. Otras modificaciones de aminoácidos que se pueden incluir son las de las posiciones 30, 31, 33, 35, 49, 50, 67, 69, 71, 73, 89 y 91.

En determinados aglutinantes WS descritos en el presente documento, al menos o como mucho 10, 20, 30, 40, 50 o 50 aminoácidos de la secuencia del diseño no varían, por ejemplo, no varían por sustitución. Por ejemplo, uno o más de los siguientes aminoácidos se conservan como los aminoácidos de la molécula 10Fn3 humana de tipo silvestre: los aminoácidos en las posiciones 1-29, 32, 34, 36, 48, 51-66, 68, 70, 72, 88, 90 y 92-101.

Aglutinantes "frontales"

En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en el presente documento comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que tiene modificaciones en los bucles CD, DE y, en algunos casos, en los bucles EF, en donde todas las modificaciones de bucle contribuyen a la unión a la diana. Estos polipéptidos se citan como "aglutinantes frontales". Los aglutinantes frontales pueden comprender adicionalmente modificaciones en una o más regiones del armazón, particularmente en regiones del armazón que flanquean o que son adyacentes a una región de bucle modificada. Por ejemplo, los aglutinantes frontales pueden comprender una modificación del armazón en una o más de cadena p C, cadena p D y/o cadena p E en relación con las secuencias de las correspondientes cadenas p del dominio Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, un dominio 10Fn3 humano (la SEQ ID NO: 1 o 5). Preferentemente, los restos hidrófobos del núcleo no se modifican en relación con la secuencia de tipo silvestre. Las modificaciones del armazón a modo de ejemplo que pueden estar presentes en los aglutinantes frontales, incluyen modificaciones en una o más posiciones que se corresponden con las posiciones de aminoácidos 36, 49 y/o 50 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Tales modificaciones del armazón pueden

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contribuir a la unión a la diana junto con los bucles modificados. En determinadas realizaciones, los aglutinantes frontales pueden comprender agrupaciones de modificaciones que abarcan varias regiones de bucle y de cadenas del dominio 10Fn3. En particular, los aglutinantes frontales pueden comprender modificaciones en al menos 15, 20, 24, 25 o 27 de los 31 restos entre los aminoácidos que se corresponden con los restos 36 a 66 del Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 humano (SEQ ID NO: 1 o 5). Las modificaciones del bucle y/o de la cadena pueden incluir sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas. En realizaciones ilustrativas, el bucle CD se extiende en longitud o se reduce en longitud en relación con el bucle CD del Fn3, por ejemplo, el dominio 10Fn3 humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 o 5).

Aglutinantes "posteriores"

En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en el presente documento comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que tiene modificaciones en los bucles EF y FG, en donde las modificaciones de los bucles contribuyen a la unión a la misma diana. Estos polipéptidos se citan como "aglutinantes posteriores" en el presente documento. Los aglutinantes posteriores pueden comprender modificaciones adicionales en otras regiones de bucle y/o de armazón. Por ejemplo, un aglutinante posterior puede contener modificaciones en al menos una parte del bucle AB, preferentemente la parte N-terminal del bucle AB. En una realización a modo de ejemplo, los dos primeros aminoácidos del bucle AB (es decir, los que se corresponden con los restos de aminoácidos 14 y 15 del dominio 10Fn3 de tipo silvestre) se modifican en relación con la secuencia de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, un aglutinante posterior también puede contener una o más modificaciones del armazón, particularmente, modificaciones en una o más regiones del armazón que son adyacentes a una región de bucle modificada. Por ejemplo, los aglutinantes posteriores pueden contener una o más modificaciones en una o más de la cadena p A, la cadena p G, la región N-termina y/o la región C-terminal. Preferentemente, los restos hidrófobos del núcleo no se modifican en relación con la secuencia de tipo silvestre. Las modificaciones del armazón a modo de ejemplo incluyen modificaciones en una o más posiciones que se corresponden con las posiciones de aminoácidos 1-7, 9-13, 89, 91, 93 y/o 94 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Una o más modificaciones adicionales del bucle y/o del armazón pueden contribuir a la unión a la diana junto con los bucles EF y FG modificados. Las modificaciones adecuadas de la región del bucle y/o del armazón incluyen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del bucle FG se extiende en longitud o se reduce en longitud en relación con el bucle FG del dominio 10Fn3 humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 o 5).

En determinadas realizaciones, un aglutinante posterior puede comprender una agrupación de restos de aminoácidos modificados sobre un tramo contiguo de varias regiones en el dominio 10Fn3. Por ejemplo, al menos 14 de los primeros 15 restos de aminoácidos del dominio 10Fn3 se pueden modificar en relación con los correspondientes restos en el Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 humano (SEQ ID NO: 1 o 5) y/o al menos 15 de los 18 restos entre los aminoácidos que se corresponden con los restos 80 a 97 (o 94) del Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 humano (sEq ID NO: 1 o 5) se puede modificar en relación con los correspondientes restos en la secuencia de tipo silvestre.

Aglutinantes del "polo sur"

En determinadas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3, en donde el dominio 10Fn3 comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E y modificaciones en las secuencias de aminoácidos de la cadena p A, el bucle AB, la cadena p B, el bucle CD, la cadena p E, el bucle EF y la cadena p F, en relación con las secuencias de las correspondientes regiones de la secuencia de tipo silvestre. Estos polipéptidos se citan como "aglutinantes del polo sur" o "aglutinantes SP" (SP, siglas del inglés South Pole, Polo Sur) en el presente documento. Los bucles y las cadenas modificadas contribuyen a la unión a la misma diana. La secuencia de aminoácidos del bucle CD se puede extender en longitud o reducir en longitud en relación con el bucle CD del Fn3 de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 humano (SEQ ID NO: 1 o 5). Los aglutinantes del polo sur pueden comprender modificaciones adicionales en la cadena p G y/o en la región C-terminal en relación con la secuencia de la correspondiente región de la secuencia de tipo silvestre. En realizaciones ilustrativas, los aglutinantes del polo sur pueden comprender una o más modificaciones en los aminoácidos que se corresponden con las posiciones 11, 12, 19, 60, 61, 69, 91, 93 y 95-97 de la secuencia de tipo silvestre.

Aglutinantes del "Noroeste"

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que comprende bucles BC, DE y FG modificados, en comparación con las correspondientes secuencias de los bucles BC, DE y FG establecidas en la SEQ ID NO: 1 o 5, así como modificaciones adicionales en una o más de los restos de la cadena p C, la cadena p D, la cadena p F y la cadena p G. Las modificaciones de la región del bucle y de la cadena p contribuyen juntas a la unión a la diana. Estas proteínas se citan como "aglutinantes del Noroeste" o "aglutinantes NW" (NW, siglas del inglés Northwest, Noroeste) en el presente documento. En realizaciones ilustrativas, los aglutinantes NW comprenden una o más modificaciones del armazón en una cualquiera de, o una combinación de, posiciones de aminoácidos que se corresponden con las posiciones de la región del armazón R33, T49, Y73 y S89 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Las

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modificaciones adecuadas en las regiones del bucle y del armazón incluyen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, uno o más de los bucles BC, DE y FG se extienden en longitud o se reducen en longitud, o combinaciones de los mismos, en relación con la secuencia de tipo silvestre. En una realización, cada uno de los bucles BC, DE y FG se extienden en longitud o se reducen en longitud, o combinaciones de los mismos, en relación con la secuencia de tipo silvestre (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o 5). En determinadas realizaciones, solo se modifica una parte del bucle BC, en particular, la parte de C-terminal, en relación con la secuencia de tipo silvestre. Por ejemplo, el bucle BC se puede modificar solo en los restos de aminoácidos que se corresponden con los aminoácidos 27-31 del bucle BC de tipo silvestre, mientras que el resto del bucle BC (es decir, el que se corresponde con los restos 23-26 del bucle de tipo silvestre) se deja sin modificar.

Aglutinantes del "Noreste"

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que comprende un bucle BC, De y FG modificado así como una o más modificaciones adicionales en una cualquiera de, o combinación de, la región N-terminal, la cadena p A, la cadena p B y/o la cadena p E. Estas proteínas se citan como "aglutinantes del noreste" o "aglutinantes NE" (NE del inglés Northeast, Noreste) en el presente documento. En realizaciones ilustrativas, los aglutinantes NE se modifican a una cualquiera de, o una combinación de, los aminoácidos que se corresponden con las posiciones de la región del armazón 1-7, E9, L19 y/o S21 de la secuencia de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 o 5). La combinación de las regiones modificadas del bucle y del armazón contribuye a la unión a la diana.

Aglutinantes frontales del sur

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58e y que comprende modificaciones en uno o más de los bucles AB, cD, DE y EF, así como modificaciones adicionales en una o más de la cadena p B, la cadena p D y/o la cadena p E. Estas proteínas se citan como "aglutinantes frontales del sur" en el presente documento. La combinación de los restos modificados del bucle y de la cadena contribuye a la unión a la diana. En realizaciones ilustrativas, se puede modificar un aglutinante frontal del sur en una o más posiciones de aminoácidos que se corresponden con las posiciones de la región del armazón L19, T49, S60 y/o G61 de la SEQ ID NO: 1 o 5 y/o en una o más posiciones de aminoácidos que se corresponden con las posiciones de la región del bucle T14-S17, P51, T56, G40-E47 y/o K63-G65 de la SEQ ID NO: 1 o 5. En realizaciones ilustrativas, un aglutinante frontal del sur se puede extender en longitud o reducir en longitud en el bucle AB, entre los aminoácidos que se corresponden con los restos 18 y 20 de la secuencia de tipo silvestre y/o en el bucle CD.

Aglutinantes "AG"

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58e, y que comprende una cadena p A y una cadena p G, en comparación con la correspondiente cadena de la SEQ ID NO: 1 o 5. Estas proteínas se citan como "aglutinantes AG" o "cadena AG" en el presente documento. En determinadas realizaciones, los aglutinantes de la cadena AG comprenden agrupaciones de modificaciones en las partes de N-terminal y de C-terminal del dominio 10Fn3, mientras que la parte media del Fn3 permanece sin modificar. Por ejemplo, un aglutinante de cadena AG puede comprender modificaciones en 16 de 19 de los primeros 19 aminoácidos en el dominio 10Fn3 (es decir, correspondiente con las posiciones de aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 1 o 5) y modificaciones en 13-17 de 18 de los últimos 18 aminoácidos en el dominio 10Fn3 (es decir, correspondiente con las posiciones de aminoácidos 84-101 de la SEQ ID NO: 1) o en 14-18 de 22 de los últimos 22 aminoácidos en el dominio 10Fn3 (es decir, correspondiente con las posiciones de aminoácidos 80-101 de la SEQ ID NO: 1). En realizaciones ilustrativas, un aglutinante AG puede comprender modificaciones en una o más posiciones que se corresponden con las posiciones 1-7, 9, 11-17, 19, 8489 y 91-97 de la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, las regiones modificadas en un aglutinante AG contribuyen a la unión a la misma diana.

Aglutinantes del "Suroeste"

En algunas realizaciones, la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad, es decir, una mutación T58E, y que comprende bucles CD y Ef modificados, así como modificaciones adicionales en uno cualquiera de, o combinación de restos que se corresponden con las posiciones 69 o 91-97 de la SEQ ID NO: 1. Estas proteínas se citan como "aglutinantes del Suroeste" o "aglutinantes SW" (SW, siglas del inglés Southwest, Suroeste) en el presente documento. Las regiones modificadas del bucle y del armazón contribuyen a la unión a la diana.

Proteínas que tienen inmunogenicidad reducida

La solicitud describe adicionalmente polipéptidos que tienen inmunogenicidad reducida que comprenden un dominio 10Fn3 en donde una parte del bucle BC se deja como de tipo silvestre. Preferentemente, tales polipéptidos tienen una menor inmunogenicidad en relación con un polipéptido equivalente con modificaciones en una mayor parte del bucle

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BC. Por ejemplo, la parte de N-terminal del bucle BC se deja como de tipo silvestre. Por ejemplo, los primeros 1, 2, 3, 4, 5 o 5 restos del bucle BC se pueden dejar como de tipo silvestre, mientras que se pueden modificar los restos restantes de C-terminal del bucle BC. En los diseños de Fn3 que tienen al menos una parte de la región de N-terminal del bucle BC como de tipo silvestre, también puede ser deseable dejar todo o una parte de la cadena p B y/o de la cadena p C sin modificar en relación con la secuencia de tipo silvestre, particularmente las partes de la cadena p B y/o de la cadena p C que son adyacentes al bucle BC (es decir, la parte de C-terminal de la cadena p B y/o la parte de N-terminal de la cadena p C). Por ejemplo, los dominios Fn3 que tienen la secuencia de tipo silvestre en una parte de N-terminal del bucle BC e inmunogenicidad reducida pueden no tener ninguna modificación en la región de N- terminal, la cadena p A, el bucle AB y la cadena p B. En diseños de Fn3 con una parte del bucle BC como de tipo silvestre, la parte modificada del bucle BC puede contribuir a la unión a la diana junto con las modificaciones en otras regiones del dominio 10Fn3.

La solicitud también describe polipéptidos que tienen inmunogenicidad reducida que comprenden dominios Fn3, en donde anclaje de HLA en la región de cadena p B/bucle BC/cadena p C (el "anclaje de BC") se ha eliminado o destruido (por ejemplo, modificado en relación con la secuencia de tipo silvestre de una forma que reduce la afinidad de unión a uno o más receptores de HLA). Por ejemplo, el anclaje de BC se puede eliminar o destruir modificando el Fn3, por ejemplo, el dominio 10Fn3 en una o más posiciones que se corresponden con las posiciones L19, S21, R33 y/o T35 de la SEQ ID NO: 1 o 5. Cuando el anclaje de BC se ha eliminado o destruido, es posible modificar la secuencia del bucle BC sin aumentar de manera significativa el potencial inmunogénico de la región BC. Por consiguiente, muchos de estos diseños de Fn3 tienen modificaciones en el bucle BC además de las modificaciones en la cadena p B y/o en la cadena p C. El bucle BC puede contribuir a la unión a la diana, de manera opcional, en combinación con modificaciones en otras regiones del dominio Fn3. Las modificaciones en la cadena p B y/o en la cadena p C pueden o no contribuir a la unión a la diana.

Mutaciones que mejoran la solubilidad de Fn3

En algunas realizaciones, un dominio Fn3 modificado comprende una secuencia de aminoácidos que se basa en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-29 y 65-66, en donde el dominio Fn3 comprende una mutación que mejora la solubilidad. Una mutación que mejora la solubilidad puede estar en una región de bucle o no de bucle. Por ejemplo, una mutación que mejora la solubilidad puede estar en una localización que se corresponde con al menos uno de los restos 24, 27, 54, 58, 78, 80 y 83 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad se localiza en una región no de bucle, tal como una cadena p. En los polipéptidos de la invención, una mutación que mejora la solubilidad se localiza en una cadena p E, principalmente en la treonina (T) 58 que se sustituye por ácido glutámico (E).

En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, la mutación T58E, en un dominio Fn3 que se une de manera específica a una diana, no contribuye a la unión del dominio Fn3 a la diana. En algunas realizaciones, el aminoácido que se muta para mejorar la solubilidad, por ejemplo, T58, no contribuye a la unión del dominio Fn3 a su diana. En algunas realizaciones, el aminoácido que se muta para mejorar la solubilidad, por ejemplo, T58, no está en contacto con la diana.

En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, la mutación T58E, en un dominio Fn3 que se une de manera específica a una diana, contribuye a la unión del dominio Fn3 a la diana. En algunas realizaciones, el aminoácido que se muta para mejorar la solubilidad, por ejemplo, T58, contribuye a la unión del dominio Fn3 a su diana. En algunas realizaciones, el aminoácido que se muta para mejorar la solubilidad, por ejemplo, T58, está en contacto con la diana.

La solubilidad del dominio Fn3 modificado del polipéptido de la invención se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 que comprende la misma secuencia de aminoácidos salvo en que el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SeQ ID NO: 1 no se muta.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que se basa en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-29 y 65-66, en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E) y en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que es un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 98 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 1-29 y 65-71.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 17-29, en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E) y en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta.

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En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 67-68, en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E) y en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 modificado puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO:69 y 71.

Además, en el presente documento se describen dominios Fn3 modificados que se basan en un dominio 10Fn3 (por ejemplo, uno cualquiera de los dominios 10Fn3 humanos de la SEQ ID NO: 1-16, o uno cualquiera de los dominios 10Fn3 humanos de la SEQ ID NO:17-29), un dominio 7Fn3 (por ejemplo, un dominio 7Fn3 humano de la SEQ ID NO:65) o un dominio 14Fn3 (por ejemplo, un dominio 14Fn3 humano de la SEQ ID NO:66), en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se puede mutar. En los polipéptidos de la invención, el dominio Fn3 es un dominio 10Fn3 modificado en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E).

Además, en el presente documento se describen dominios Fn3 modificados en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a cualquier aminoácido excepto Thr (T), por ejemplo, a un aminoácido hidrofílico tal como un aminoácido seleccionado de Gln (Q), Glu (E) y Asp (D). En los polipéptidos de la invención, el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E) en el dominio 10Fn3 modificado.

En algunas realizaciones, el dominio Fn3 comprende una mutación que mejora la solubilidad en el resto 58, es decir, T58E, y comprende un aminoácido en la posición 19, 21 y/o 50 que se corresponde con el resto de tipo silvestre en esa posición, por ejemplo, Leu para el resto 19, Ser para el resto 21 y Ser para el resto 60. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 comprende una mutación que mejora la solubilidad en el resto 58, es decir, T58E y una secuencia de aminoácidos en donde 1, 2, 3 o 4 de los aminoácidos en las posiciones 63-66 se corresponden con el resto de tipo silvestre en esa posición (por ejemplo, K para el resto 63, P para el resto 64, G para el resto 65, V para el resto 66). En determinadas realizaciones, el dominio Fn3 puede comprender una mutación que mejora la solubilidad en el resto 58, es decir, T58E, y una secuencia de aminoácidos en donde al menos 1, 2, 3, 4 o 5 de los restos de los bucles AB, CD, DE, EF o de los 7 aminoácidos de N-terminal se corresponden con el resto de tipo silvestre en esa posición.

En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle AB en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle BC en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle CD en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle DE en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle EF en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en el bucle FG en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en los dominios N-terminal o C-terminal en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p A en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p B en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p C en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p D en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p F en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácidos en la cadena p G en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre. En determinadas realizaciones, una proteína del dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad no comprende una modificación de aminoácido en ninguno de los dos bucles, de las dos cadenas, los dos bucles y una cadena, los dos bucles y las dos cadenas, o un bucle y dos cadenas en relación con la secuencia de aminoácidos del dominio Fn3 de tipo silvestre.

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En determinadas realizaciones, el bucle BC de una proteína de dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad tiene la secuencia de aminoácidos del correspondiente bucle del dominio Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, los 2 primeros restos del bucle BC de una proteína de dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad son los mismos que los restos correspondientes en el bucle BC del domino Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, los 3 primeros restos del bucle BC de una proteína de dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad son los mismos que los restos correspondientes en el bucle BC del domino Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, los 4 primeros restos del bucle BC de una proteína de dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad son los mismos que los restos correspondientes en el bucle BC del domino Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, los 5 primeros restos del bucle BC de una proteína de dominio Fn3 que comprende una mutación que mejora la solubilidad son los mismos que los restos correspondientes en el bucle BC del domino Fn3 humano de tipo silvestre, por ejemplo, el dominio 10Fn3 (SEQ ID NO: 1).

Los cambios de aminoácidos en las regiones de bucle y/o no de bucle de un dominio Fn3 que se hacen para mejorar la solubilidad de un dominio Fn3 preferentemente no afectan de manera significativa a la actividad biológica del dominio Fn3. Por ejemplo, una mutación que mejora la solubilidad preferentemente no reduce de manera significativa la afinidad de unión (por ejemplo, Kd) del dominio Fn3 a su diana deseada. En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, una mutación T58, puede reducir la afinidad de unión (Kd) de un dominio Fn3 en menos de un 1 %, un 3 %, un 5 %, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 50 %, un 70 % o un 90 %. En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad puede no reducir significativamente la estabilidad (por ejemplo, Tm) de un dominio o proteína de Fn3 que comprende un dominio Fn3. En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, una mutación T58, puede reducir la estabilidad (por ejemplo, Tm) de un dominio o proteína Fn3 que comprende un dominio Fn3 en menos de un 1 %, un 3 %, un 5 %, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 50 %, un 70 % o un 90 %, o en relación con la Tm, menos de 0,1 °C, 0,3 °C, 0,5 °C, 0,7 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C o 13 °C. En algunas realizaciones, una mutación que mejora la solubilidad no reduce de manera significativa bien la estabilidad o la afinidad de unión de una proteína Fn3.

Además, en el presente documento se describen dominios Fn3, en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a un aminoácido hidrófilo tal como Gln (Q), Glu (E) y Asp (D), en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se puede mejorar en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta, y en donde la mutación puede reducir la estabilidad (por ejemplo, Tm) del dominio Fn3 en menos de un 1 %, un 3 %, un 5 %, un 10 %, un 20 %, un 30 % o un 50 %, o en relación con la Tm, en menos de 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C o 13 °C. En algunas realizaciones, en un dominio Fn3, el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Glu (E), en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se mejora en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta, y en donde la mutación puede reducir la estabilidad (por ejemplo, Tm) del dominio Fn3 en menos de un 5 %, de un 10 %, o de un 15 %, o en relación con la Tm, en menos de 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C o 10 °C. Además, en el presente documento se describen dominios Fn3, en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 se muta a Asp (D), en donde la solubilidad del dominio Fn3 modificado se puede mejorar en relación con la solubilidad de un dominio Fn3 en donde el aminoácido que se corresponde con el resto 58 de la SEQ ID NO: 1 no se muta, y en donde la mutación puede reducir la estabilidad (por ejemplo, Tm) del dominio Fn3 en menos del 15 % o del 20 %, o en relación con la Tm, en menos de 5 °C, 10 °C o 15 °C.

En determinadas realizaciones, las mutaciones descritas en el presente documento mejoran la solubilidad de una proteína que es una proteína multivalente que comprende dos o más dominios Fn3, por ejemplo, los dominios 10Fn3. Por ejemplo, una proteína multivalente puede comprender 2, 3 o más dominios Fn3, por ejemplo, los dominios 10Fn3, que se asocian de manera covalente. En realizaciones ilustrativas, la proteína puede ser una proteína biespecífica o dimérica que comprende dos dominios 10Fn3. Una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, la mutación T58E, puede estar presente en uno o más de los dominios Fn3 de una proteína Fn3 multimérica. En determinadas realizaciones, cada dominio Fn3 de una proteínas Fn3 multimérica puede comprender una mutación que mejora la solubilidad, por ejemplo, la mutación T58E.

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En algunas realizaciones, el polipéptido descrito en el presente documento comprende adicionalmente al menos un resto farmacocinético (PK) seleccionado de: un resto de polioxialquileno, una proteína de unión a albúmina sérica humana, ácido siálico, albúmina sérica humana, transferrina, IgG, una proteína de unión a IgG y un Fc (o un fragmento del mismo). En algunas realizaciones, el resto de PK es el resto de polioxialquileno. En algunas realizaciones, el resto de polioxialquileno es polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, el resto de PEG está unido de manera covalente al polipéptido a través de un aminoácido de Cys o de Lys. En algunas realizaciones, el PEG está entre aproximadamente 0,5 kDa y aproximadamente 100 kDa. En algunas realizaciones, el resto de PK es un fragmento de Fc.

Tal como se describe en el presente documento, los dominios Fn3 modificados se pueden usar para unirse a cualquier diana de interés para el tratamiento de enfermedades o trastornos. Las enfermedades o trastornos que se pueden tratar estarán dictados por la especificidad de unión de los dominios Fn3. El polipéptido de la invención se une de forma específica a una diana a la que no se une mediante un dominio Fn3 humano de la SEQ ID NO: 1-16, 65 o 66. Las dianas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, TNF-alfa, VEGFR2, PCSK9, IL-23, EGFR, IGF1R, DLL4, IL-17 y PXR. Simplemente como un ejemplo, los dominios Fn3 modificados que se unen a TNF-alfa se pueden usar para tratar trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y asma. Los dominios Fn3 modificados que se unen a IL-17 se pueden usar para tratar asma; y los dominios Fn3 modificados que se unen a DLL4 o EGFR se pueden usar para tratar trastornos o enfermedades hiperproliferativas asociadas con angiogénesis no deseada, tales cánceres o tumores.

La solicitud también describe métodos para administrar los polipéptidos descritos en el presente documento a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. De manera conveniente, las proteínas son farmacéuticamente aceptables para un mamífero, en particular un ser humano. Una composición "farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición que se administra a un animal sin consecuencias médicas adversas significativas.

Además, la solicitud describe composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden el polipéptido descrito en el presente documento. La composición puede ser esencialmente sin pirógenos. La composición puede estar sustancialmente libre de contaminación microbiana, haciéndola adecuada para la administración in vivo. La composición se puede formular, por ejemplo, para la administración (IV), intraperitoneal (IP) o subcutánea (SubQ). La composición puede comprender un vehículo fisiológicamente aceptable. El pH de la composición puede estar entre 29, 3-8, 4-7.5, 4-7, 4-6,5, o entre 4-5,5, o a aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, o 5,5. La concentración del polipéptido puede ser 1-1000, 1-500, 1-200, 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, o 0,5-2 mg/ml en la composición.

Además, la solicitud describe un ácido nucleico que codifica los polipéptidos tal como se describen en el presente documento. También se incluyen los vectores que contienen los polinucleótidos para tales polipéptidos. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores de expresión. Además, la solicitud describe una célula, que comprende un polinucleótido, un vector, o un vector de expresión, que codifica un polipéptido descrito en el presente documento. Las secuencias se optimizan preferentemente para maximizar la expresión en el tipo celular usado. La expresión puede ser en una célula bacteriana, tal como E. coli. Como alternativa, la expresión puede ser en una célula de mamífero. La célula puede expresar un polipéptido que comprende un dominio Fn3 modificado tal como se describe en el presente documento. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos descritos en el presente documento pueden estar optimizados por codón para la expresión en el tipo celular seleccionado. También se describen métodos para producir un polipéptido tal como se describe en el presente documento, que comprenden cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico, un vector o un vector de expresión que codifica el polipéptido descrito, y recuperar el polipéptido expresado del cultivo.

En determinadas realizaciones, la solicitud proporciona bibliotecas que comprenden una pluralidad de los polipéptidos de la invención. Las bibliotecas proporcionadas en el presente documento pueden comprender, por ejemplo, al menos 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o 1014 o más polipéptidos, comprendiendo cada opción una secuencia de aminoácidos diferente. También se proporcionan métodos para identificar un polipéptido que se une a una diana de interés de una de las bibliotecas descritas en el presente documento. Por ejemplo, un método de cribado de la biblioteca puede comprender, por ejemplo, poner en contacto una biblioteca de los polipéptidos de la invención con una diana de interés, y aislar los miembros de la biblioteca que se unen a la diana (por ejemplo, con una afinidad particular o en condiciones de lavado adecuadas). La etapa de aislamiento se puede llevar a cabo usando cualquier método adecuado, tal como una presentación en fago o una presentación en ARNm. De manera similar, la unión a la diana se puede llevar a cabo usando cualquier método adecuado tal como la inmovilización de la diana sobre un soporte sólido (por ejemplo, una columna, una microplaca, perlas, etc.) y mezclando la diana inmovilizada con la biblioteca en condiciones adecuadas para permitir la unión de la proteína. Los miembros de la biblioteca unidos después se pueden separar de los miembros de la biblioteca no unidos para producir una proteína Fn3 aislada que se une a la diana. En determinadas realizaciones, el método de aislamiento puede implicar repetidas rondas de las etapas de unión a la diana y de aislamiento.

También se proporcionan polipéptidos aislados identificados mediante un método descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido aislado se puede unir a la diana con una Kd de menos de 1500 nM (1,5 |jM), 1000 nM (1 jM), 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM o menos. En algunas realizaciones, el polipéptido se puede unir a la diana con una Kd de entre 1 pM y 1 jM, entre 100

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pM y 500 nM, entre 1 nM y 500 nM, o entre 1 nM y 100 nM. SECUENCIAS

Dominios 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGEKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ (SEQ ID NO: l)

Dominio 10Fn3 de la SEQ ID NO: 1 con D97E:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSICSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIEKPSQ (SEQ ID NO: 2)

Versión 1 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

LEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST AT1SGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY (SEQ ID NO: 3)

Versión 2 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

EVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 4)

Versión 3 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 5)

Versión 4 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTE (SEQ ID NO:

6)

Versión 5 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEI (SEQ ID NO: 7)

Versión 6 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

5

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25

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP1SINYRTEID (SEQ ID NO: 8)

Versión 7 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 (versión 6 con D97E):

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIE (SEQ ID NO: 9)

Versión 8 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSK.STATISGLKPGVDYT1TVYAVTGRGDSPASSKP1SINYRTE1DK (SEQ ID NO: I0)

Versión 9 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 (versión 8 con D97E):

VSDVPRDLEVVAATPTSLLJSWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTE1EK (SEQ ID NO: 11)

Versión 10 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLL1SWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP1SINYRTE1DKP (SEQ ID NO: 12)

Versión 11 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 (versión 10 con D97E):

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIEKP (SEQ ID NO: U)

Versión 12 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPIS1NYRTE1DKPS (SEQ ID

NO: 14)

Versión 13 de la secuencia del núcleo del dominio 10Fn3 (versión 12 con D97E):

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGÜNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIEKPS (SEQ ID NO: 15)

Dominio 10Fn3 de TS con sustitución D80E

5

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGESPASSKP1SINYRTEIDKPSQ (SEQ ID NO: 16)

Secuencia degenerada del núcleo del dominio 10Fn3 de TS:

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X\vFTV{X)xATISGL(X)yYTIT VYA(X)zISINYRT (SEQ ID NO; 17)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)wFTV(X)xATISGL(X)yYTIT VYA(X)ZISINYRTE (SEQ ID NO: 18)

VSDVPRDLEWAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)aFTV(X)xATISGL(X)yYTIT VYA(X)JSINYRTEI (SEQ ID NO: 19)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(XVFTV(X)xATlSGL(X)yYTIT VYA(X)ZISINYR TEID (SEQ ID NO: 20)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITV'(X)viFTV(X)xATISGL(X)vYTIT VYA(X)ZISINYRTEIE (SEQ ID NO: 21)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(XVFTV(X)xATlSGL(X)yYTIT VYA(X)ZISINYRTEIDK (SEQ ID NO: 22)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)viFTV(X)xATISGL(X)vYTIT VYA(X)ZISINYRTEIEK (SEQ ID NO: 23)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)viFTV(X)xATlSGL(X)yYTIT VYA(X)ZISINYRTEIDKP (SEQ ID NO: 24)

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VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYR]TY(X)wFTV(X)xATISGL(X)yYTlT VYA(Xy SINYRTEIEKP (SEQ ID NO: 25)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYR]TY(X)wFTV(X)*ATISGL(X)yYTlT VYA(X)ZISINYRTEIDKPS (SEQ 10 NO: 26)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRlTY(XXvFTV(X)xATISGL(X)yYTlT VYA(X)Z]SINYRTEIEKPS (SEQ ID NO: 27)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(X)vYRITY(X)wFTV(X)xATISGL(X)vYTIT VYA(X)ZISINYRTE1DKPSQ (SEQ ID NO: 28)

VSDVPRDLEVVAA(X)uLLISW(XXrYRITY(XXvFTV(X)xATlSGL(X)yYTlT VYA(X)Z1SINYRTEIEKPSQ (SEQ ID NO: 29)

MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 30)

GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 31)

XnSDVPRDL (SEQ ID NO: 32)

XnDVPRDL (SEQ ID NO: 33)

XnVPRDL (SEQ ID NO: 34)

XnPRDL (SEQ ID NO: 35)

XnRDL (SEQ ID NO: 36)

XnDL (SEQ ID NO: 37)

MASTSG (SEQ ID NO: 38)

EIEK (SEQ ID NO: 39)

EGSGC (SEQ ID NO: 40)

EIEKPCQ (SEQ ID NO: 41)

EIEKPSQ (SEQ ID NO: 42)

EIEKP (SEQ ID NO: 43)

EIEKPS (SEQ ID NO: 44)

EIEKPC (SEQ ID NO: 45)

HHHHHH (SEQ ID NO: 46)

EIDK (SEQ ID NO: 47)

EIDKPCQ (SEQ ID NO: 48)

EIDKPSQ (SEQ ID NO: 49)

MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFTVP PSVSSATITGLKPGTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGG (FibconB; la SEQ ID NO: 50) TPSS (SEQ ID NO: 51)

TPPRVQI (SEQ ID NO: 52)

VGSDGR (SEQ ID NO: 53)

PSVS (SEQ ID NO: 54)

GLKPG (SEQ ID NO: 55)

KDNQESEP (SEQ ID NO: 56)

LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYRITYTPSNGPGEPKELTVP PSSTSVTITGITPGVEYVVSVYALKDNQESPPLVGTCTT (SEQ ID NO: 57)

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTV PGSERSYDLTGLKPGTEYTVS1YGVKGGHRSNPLSAEKTI (SEQ ID NO: 58)

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TEDS (SEQ ID NO: 59) TAPDAAF (SEQ ID NO: 60) SEKVGE (SEQ ID NO: 61) GSER (SEQ ID NO: 62) GLKPG (SEQ ID NO: 63) KGGHRSN (SEQ ID NO: 64) Dominio 7Fn3 de tipo silvestre:

PLSPPTNLHLEANPDTÜVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNÜQQGNSL EEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIP (SEQ ID NO: 65)

Dominio 14Fn3 de tipo silvestre:

imagen1

Dominio 10Fn3 de EGFR8:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPGPVIITATISGLKPGVDYTITVYAVTDHKPIIADGPUTYHESPISINYRTEID KPSQ (SEQ ID NO: 67)

Dominio 10Fn3 de EGFR4:

MGVSDVPRDLEWAATPTS LLIS WY W EGLPY QYYRTTYGETGGN S P V QEFTVPRDVNTATISGLKPGVDYTITVYAVTDWYNPDTHEYIYHTIPISINYRTEIE KPSQ (SEQ ID NO: ÓK)

Dominio 10Fn3 de EGFR8-T58E:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYR1TYGETGGNSPVQ EFTVPGPVHTAEISGEKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPIS1NYRTEID KPSQ (SEQ ID NO: 69)

Dominio 10Fn3 de EGFR8-T58D:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDSGRGSYQYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPGPVHTADISGLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHESPISINYRTEID KPSQ (SEQ ID NO: 70)

Dominio 10Fn3 de EGFR4-T58E:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWYWEGLPYQYYRITYGETGGNSPV QEFTVPRDVNTAEISGLKPGVDYTITVYAVTDWYTSPDTHEYIYHTIPISINYRTEID KPSQ (SEQ ID NO: 71)

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Ejemplos

La invención descrita en el presente documento se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen meramente con fines ilustrativos de determinados aspectos y realizaciones de la presente divulgación, y no pretenden limitar de ningún modo la invención.

Ejemplo 1: Solubilidad de proteínas basada en un ensayo basado en cosmótropo

Este ejemplo describe la propensión a la agregación de las proteínas basado en su solubilidad relativa en sulfato de amonio (AS).

El efecto del AS sobre la solubilidad de las proteínas se sabe desde hace más de 80 años (Green, A.A., 1931, J. Biol. Chem. 93, 495-516), cuando se ha usado más comúnmente para la partición y la purificación de proteínas. Se cree que el mecanismo de la precipitación de proteínas inducido por AS o "precipitación salina" implica la unión fuerte de moléculas de agua mediante el anión sulfato cosmotrópico polar, que deshidrata las superficies de la proteína, aumenta el potencial químico de la proteína y provoca que las moléculas de proteína se agreguen en un precipitado amorfo (Baldwin, R.L., 1996, Biophys J. 71/2056-63). Debido a que las superficies hidrofóbicas de la proteína están preferentemente deshidratadas sobre las superficies polares, la autoasociación de proteínas inducida por AS se dirige mediante la interacción de las superficies hidrófobas expuestas, similar a las fuerzas que dirigen la agregación en ausencia de AS (Young, L. et al., 1994, Protein Sci. 3, 717-29; Arunachalam, J. y Gautham, N., 2008, Proteins. 71, 2012-25; Fink, A.L. 1998, Fold Des. 3, R9-23).

En este ejemplo se describe un método alrededor de este concepto y su aplicación en el análisis de la solubilidad o la propensión a la agregación de los compuestos terapéuticos de proteínas de varios formatos diferentes que incluyen adnectinas de dominio único, adnectinas multidominio/multiespecíficas, fusiones de adnectina-Fc (Adn-Fc), fusiones de anticuerpo de dominio (dAb)-Fc (dAb-Fc) y anticuerpos monoclonales (mAb). Los datos de solubilidad con AS se correlacionaron con la propensión a la agregación observada mediante otros métodos establecidos (véase, Yamniuk, A.P. et al, 2013, J Pharm. Sci. 102, 2424-2439).

MATERIALES Y MÉTODOS

Proteínas:

Las adnectinas anti-EGFR de dominio único, las adnectinas de tándem biespecífico anti-EGFR/IGF1R (EI-tándems) y las adnectinas de tándem biespecífico anti-EGFR/IGFR PEGiladas se expresaron y se purificaron tal como se ha descrito anteriormente (Emanuel, S. L. et al., 2011, MAbs 3, 38-48). Las fusiones Adnectina-Fc y dAb-Fc, así como los mAb se expresaron en células HEK293-6E o CHO-S y se purificaron mediante cromatografía convencional de afinidad con proteína A seguida de cromatografía preparativa de exclusión por tamaño (SEC, del inglés size exclusión chromatography). Las proteínas de fusión Adn-Fc Adn-Fc-a, Adn-Fc-b y Adn-Fc-e se sobreexpresaron en E. coli, y cada proteína se replegó resuspendiendo la parte insoluble del lisado en guanidina-HCl 6 M a pH 10,0 seguido por diálisis frente a tampón a pH neutro. La proteína replegada resultante se purificó tal como se describe anteriormente para las fusiones expresadas de mamífero. Se determinó que todas las proteínas eran puras a más del 95 % mediante SDS-PAGE.

Ensayo de solubilidad en sulfato de amonio a escala de banco:

Los estudios de solubilidad en AS a escala de banco se llevaron a cabo a temperatura ambiente, y salvo que se especifique lo contrario, el tampón fue NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM a pH 7,1. Las muestras se prepararon mezclando solución madre de proteína con tampón y AS 3,5 M en tampón combinado y pH, para producir una serie de 8-12 muestras de [proteína] idéntica y aumentar [AS] en un intervalo deseado. Tal como se observa en otros estudios (Trevino, S.R. et al., 2007, J Mol Biol. 366, 449-60; Schein, C.H., 1990, Biotechnology 8, 308-17), la precipitación de la proteína fue rápida (<5 min), en gran medida reversible tras la dilución, y la concentración de proteína soluble permaneció estable durante horas hasta días tras la eliminación de proteína precipitada mediante centrifugación o filtración. En algunos casos, se aprovechó la reversibilidad de la precipitación generando muestras de una concentración de proteína dada a las concentraciones de AS más bajas y más altas deseadas, y mezclando estas dos muestras en volúmenes apropiados para generar las concentraciones de AS intermedias de la serie de titulación. Las muestras se incubaron durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente, seguido bien por centrifugación o por filtración para eliminar la proteína precipitada, y se determinó la concentración de la proteína usando la absorbancia a 280 nm (A280) de 2-3 ul de muestra en un instrumento NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

Ensayo automático de solubilidad en sulfato de amonio:

Las muestras del ensayo automático de solubilidad en AS se prepararon usando un instrumento Tecan Genesis Freedom 200 a temperatura ambiente. En primer lugar, se aspiraron 125 ul de solución madre de proteína de un tubo o placa estándar y se dispensaron 15 ul en cada uno de los 8 pocillos en una placa de 384 pocillos (Whatman Uniplate n.° 7701-5101). A continuación, se aspiraron 40 ul de 8 soluciones de AS diferentes en tampón de una placa de 96

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pocilios profundos y se dispensaron 35 ul en los 8 pocilios de proteína con mezcla suave inmediata. Tras la preparación de la última muestra en un conjunto dado, todas las muestras se incubaron durante 5 minutos adicionales a temperatura ambiente. Después, las muestras se mezclaron suavemente y se aspiraron 47 ul de la mezcla proteína/AS y se dispensaron 45 ul en una placa de filtro de 384 pocillos (PALL AcroPrep384 100 ul, 0,45 um, GHP n.° PN5071) colocada enzima de una placa de UV de fondo plano y claro de 384 pocillos de Corning (Corning UV 384 pocillos n.° 3675). La proteína precipitada se filtró mediante centrifugación durante 5 minutos a 21 °C. La proteína soluble se detectó usando un lector de placas SpectroMax M5, midiendo o bien la absorbancia a 280 nm (A280) o la fluorescencia intrínseca usando una longitud de onda de excitación de 280 nm y una longitud de onda de emisión de 350 nm. Ambos métodos de detección generalmente dan resultados comparables, pero la detección mediante A280 se implementó como el método por defecto para el análisis.

Análisis de datos de solubilidad en sulfato de amonio y ajuste de la curva:

La solubilidad de una proteína en AS en la región de precipitación salina se puede describir mediante la relación lineal (Ec. 1) (Green, A.A., 1931, J. Biol. Chem. 93, 495-516):

logS = p - Ks[AS]

(1)

en donde S es la solubilidad de la proteína (concentración de la proteína), p es la solubilidad teórica a cero molar de AS, Ks es la constante de precipitación salina, y [AS] es la concentración de AS. Teóricamente, la solubilidad de las diferentes proteínas se puede evaluar comparando los valores de p extrapolados de los datos en la región de precipitación salina. Sin embargo, a las bajas concentraciones de proteínas y volúmenes deseados para la selección sistemática de alto rendimiento, hubo datos limitados dentro de la región de precipitación salina y, por lo tanto, una considerable incertidumbre en la extrapolación, lo que hace que la comparación del valor p no sea fiable. Por lo tanto, los datos de precipitación salina se ajustaron a una función de curva sigmoidal (Ec. 2):

Y =

A1 A2 1 + g(x-ASm)/dx

+ A2

(2)

en donde A1 es el valor de Y inicial (absorbancia o fluorescencia), A2 es el valor de Y final, dx es la pendiente y ASm es el valor del punto medio. El análisis de ASm permitió una rápida comparación cuantitativa de la solubilidad relativa de las diferentes proteínas usando bien A280 o la detección por fluorescencia, y eliminó la necesidad de convertir los datos a unidades de concentración de proteína. En general, los errores de ajuste de la curva calculados estaban en un intervalo similar a la desviación estándar típica para múltiples mediciones independientes de una proteína dada (aproximadamente 0,01-0,04 M). El análisis de los valores de ASm es también similar a la determinación de los valores del punto medio de PEG descrito recientemente por Gibson, T.J. et al (2011, J Pharm Sci. 100, 1009-21)

Estudios de estabilidad acelerada:

Los estudios de estabilidad acelerada (degradación forzada) se llevaron a cabo para varias moléculas de adnectina- Fc incubando 1 mg/ml de muestras de proteína en fosfato de sodio (NaH2PO4) 50 mM a pH 7,0 y/o succinato de sodio (Na2C4H4O4) 50 mM a pH 6,0 durante 2-4 semanas a temperaturas que varían de 30-37 °C. En todos los casos, las temperaturas de incubación fueron al menos 15° por debajo de la temperatura de fusión (Tm, del inglés melting temperature, temperatura de fusión) de otras moléculas tal como se determina mediante calorimetría de barrido diferencial o fluorescencia de barrido térmico, con el fin de minimizar las vías de degradación del estado no natural. En diversos puntos temporales durante la incubación, se eliminaron las alícuotas y se sometieron a un análisis de cromatografía analítica por exclusión de tamaño (SEC) para determinar el porcentaje de especies de monómero, de alto peso molecular (APM) y de bajo peso molecular (BPM).

Ultrafiltración:

Los estudios de ultrafiltración con moléculas de adnectina anti-EGFR se realizaron en concentradores VivaSpin 3000 MWCO a temperatura ambiente. Se concentraron lentamente 0,5 - 1,0 mg/ml de proteína en PBS a pH 7,1 usando la fuerza centrífuga hasta un objetivo de 30 - 40 mg/ml con mezclado periódico para evitar la formación del gradiente, y después se incubaron las muestras a 4 °C durante 5 días. La proteína precipitada se eliminó mediante centrifugación, y la concentración de la proteína soluble se midió mediante a280 en un instrumento Nanodrop 2000, con el estado de agregación medido con DLS tal como se describe a continuación. Los estudios de ultrafiltración para las moléculas de adnectina-Fc o dAb-Fc se realizaron a 4 °C en concentradores VivaSpin 10.000 MWCO usando presión neumática positiva regulada a 15 psi. Para minimizar la formación de gradiente, los concentradores se colocaron en una placa oscilante ajustada a 60 rpm para la mezcla continua, y las muestras se retiraron periódicamente y se mezclaron suavemente con una pipeta. Normalmente, las muestras de partida fueron de 1-7 mg/ml de proteína y se concentraron hasta aproximadamente 50 mg/ml o más durante el trascurso de 6-8 horas. Se retiraron 20 - 40 ul en diversos puntos

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temporales y se almacenaron toda la noche a 4 °C, seguido por la centrifugación para eliminar cualquiera de los precipitados, y después se determinó la concentración de las proteínas mediante A280 y el estado de agregación de las muestras no diluidas se caracterizó mediante SEC analítico.

Dispersión de luz dinámica:

Los estudios de dispersión de luz dinámica (DLS, del inglés dynamic light scattering) se realizaron en un lector de placas Wyatt DynaPro en placas de 384 pocillos a 25 °C, usando muestras de proteína en NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM a pH 7,1. Los parámetros experimentales típicos fueron 20 adquisiciones de 5 s cada una por medición y las mediciones se registraron al menos por triplicado y se promediaron para dar los valores documentados. Las funciones de autocorrelación de intensidad se ajustaron usando el algoritmo de "Regularización" en el programa informático Dynamics (Wyatt Technologies).

RESULTADOS

Solubilidad de adnectinas en sulfato de amonio:

Se realizaron estudios iniciales de solubilidad en AS a escala de banco usando un conjunto de moléculas de adnectina de dominio único (monoadnectinas) con bucles diseñados genéticamente para unirse de manera específica al receptor EGFR (EGFR1-7) o al receptor IgF1R (IGFR1) (Emanuel, S.L. et al., 2011, MAbs 3, 38-48). Un ejemplo de curva de precipitación salina para 1 mg/ml de IGF1R se muestra en la Figura 2. A baja [AS], la [proteína] (concentración de proteína) medida fue la misma que la [proteína] que se ensayó (1 mg/ml), lo que indica que no ha tenido lugar la precipitación. Sin embargo, a mayor [AS] (concentración de AS), la solubilidad de IGFR1 disminuyó, dando como resultado la precipitación o "precipitación salina", y un correspondiente descenso en la [proteína] medida. Los datos se ajustaron a una función de curva sigmoidal para obtener el valor del punto medio de la precipitación salina (ASm), tal como se describe en Materiales y Métodos.

Las curvas de precipitación salina para EGFR1-7, así como para IGFR1 se muestran en la Figura 3A, y los valores de Asm junto con otros datos biofísicos se resumen en la Tabla 1. A pesar de ser proteínas monoméricas de tamaño y estructura similar, cada una de las adnectinas tenía propiedades únicas de precipitación salina, con valores de ASm que varían desde 0,67 M para la adnectina menos soluble (EGFR4, SEQ ID nO:68) hasta ASm = 2,01 M para la adnectina más soluble (EGFR6). Para determinar si estos valores de ASm eran predictivos de la propensión a la agregación observada usando otros métodos, se realizaron experimentos de ultrafiltración a pequeña escala concentrando cada adnectina de EGFR hasta una concentración objetivo de 30 - 40 mg/ml. La concentración de proteína soluble se midió mediante A280 y el estado de agregación se evaluó usando DLS. Estos datos mostraron que las adnectinas con menores valores de ASm también tenían límites de solubilidad más bajos (EGFR2, EGFR3, EGFR4) y/o mayores niveles de agregación (EGFR2, EGFR4, EGFR5) a elevadas concentraciones de proteína (Tabla 1). Por el contrario, los datos de solubilidad no muestran correlación con los parámetros biofísicos tales como la estabilidad térmica o con parámetros predichos a partir de la secuencia de aminoácidos tales como el pI, la carga o la hidropatía.

Se realizaron estudios similares de precipitación salina a escala de banco usando cada una de las adnectinas EGFR1- 7 fusionadas en línea con IGF1R1 (EI-tándems), así como para los EI-tándems unidos de manera covalente con un polietilenglicol ramificado de 40 kDa en el extremo C-terminal (EI-tándem-PEG) que se hizo para extender la semivida sérica (Emanuel et al., 2011, mAbs 3, 38-48). La pendiente de las curvas de precipitación salina para los EI-tándems fue similar para las monoadnectinas (Figura 3B). Sin embargo, en todos los EI-tándem PEGilados se dio la precipitación salina en un intervalo [AS] muy estrecho de aproximadamente 0,7 - 0,9 M y tuvieron transiciones de precipitación salina mucho más pronunciadas (Figura 3C). También se observó un comportamiento similar para otras proteínas PEGiladas (Figura 4), que probablemente se deba a efectos de exclusión de volumen adicionales del resto de PEG unido (Stevenson, C.L. y Hageman, M.J., 1995, Pharm Res. 12, 1671-6). Curiosamente, a pesar de las diferencias en los valores de solubilidad absoluta en AS para los diferentes formatos de adnectina, la clasificación de la solubilidad relativa basada en la identidad de un dominio de adnectina anti-EGFR se conservó ampliamente entre los formatos (Figura 3D), lo que sugiere que la solubilidad en AS de las monoadnectinas es predictiva de la solubilidad para las moléculas biespecíficas multidominio o de formato PEG más complejas.

Solubilidad en sulfato de amonio de fusiones adnectina-Fc:

Para determinar si la solubilidad en AS era predictiva de la propensión a la agregación de otros formatos terapéuticos de proteína tales como fusiones a Fc, se usó un método automático de solubilidad en AS basado en placa para generar curvas de precipitación salina usando o bien la absorbancia en UV (A280) o la detección por fluorescencia usando tan solo 50 microgramos de proteína para generar una curva de 8 puntos (Figura 5B y C). Las comparaciones de solubilidad relativa descritas a continuación para Adn-Fc, dAb-Fc y mAb se realizaron todas usando idénticas concentraciones de proteína de 0,45 mg/ml.

Se aplicó el método automático de solubilidad en AS a una serie de moléculas de Adn-Fc con diversos bucles de unión seleccionados de manera específica para unirse a diferentes proteínas de dianas terapéuticas, cada una de las cuales

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estaba fusionada a un dominio de Fc de IgG1 (Adn-Fc). La mayoría de los Adn-Fc se produjeron en células de mamífero y se indican con letras mayúsculas (es decir, Adn-Fc-A), pero también se produjeron unas pocas moléculas en E. coli, y se indican con minúsculas (es decir, Adn-Fc-a). La propensión a la agregación de muchas de estas moléculas de Adn-Fc se han caracterizado previamente a baja concentración (1 mg/ml) en condiciones aceleradas de estrés térmico, en donde tres moléculas (Adn-A, Adn-a y Adn-L) demostraron tener una propensión a la agregación significativamente mayor que las otras (Figura 6A). Aquellas moléculas que demostraron una baja propensión a la agregación en el estudio de estabilidad acelerada se ampliaron y se concentraron mediante ultrafiltración, y se midieron los niveles de alto peso molecular (APM) soluble mediante SEC a una elevada concentración de proteína. Estos experimentos identificaron dos moléculas adicionales, Adn-B y Adn-b, con una propensión a la agregación significativamente mayor en comparación con las otras (Figura 6B).

Las propiedades de precipitación salina de las moléculas Adn-Fc se caracterizaron usando el método automático, y el comportamiento de precipitación salina se comparó con los datos de estabilidad acelerada y de ultrafiltración. Se descubrió que las moléculas de Adn-Fc precipitan durante un intervalo bastante amplio de [AS], con valore de ASm de 0,67 - 1,33 M Figura 6C y D). Las moléculas producidas en células HEK y CHO tuvieron curvas de precipitación salina indistinguibles (no mostradas). Sin embargo, se descubrió que las proteínas producidas por E: coli eran o bien de solubilidad superior (Adn-Fc-b), menor (Adn-Fc-e) o similar (Adn-Fc-a) en comparación con las moléculas producidas por los mamíferos, Adn-Fc-B, Adn-Fc-E y Adn-Fc-A respectivamente (Figura 6d). Las tres moléculas (Adn- Fc-A, Adn-Fc-a, Adn-Fc-L) con la propensión a la agregación más alta en los estudios de estabilidad acelerada, también tuvieron los valores de ASm más bajos (ASm = 0,67 - 0,76 M). Adn-Fc-B y Adn-Fc-b también tuvieron una menor solubilidad en AS (ASm = 0,94 - 1,03 M) en comparación con las otras moléculas ensayadas (ASm = 1,15-1,33 M), que es consistente con mayores niveles de agregación observados para estas moléculas a concentraciones de proteína mayores. Por lo tanto, el ensayo de solubilidad en AS fue capaz de identificar fácilmente las mismas moléculas Adn-Fc de "elevada propensión a la agregación" que se identificaron en los estudios de estabilidad acelerada y de ultrafiltración.

Solubilidad de fusiones dAb-Fc:

Para determinar si el método de solubilidad en AS es predictivo de la solubilidad relativa de un agente terapéutico de proteína que no sean las adnectinas, se ensayó una serie de moléculas de fusión de anticuerpo de dominio y Fc (dAb- Fc) usando el método automático. Los dAb eran de varias familias de secuencia diferente con bucles de unión seleccionados específicamente para unirse a diferentes dianas terapéuticas. La nomenclatura depara estas moléculas incluye un identificador para la familia de la secuencia (ej. "3" en dAb3-1) incluso para la variante de secuencia específica dentro de la familia (ejemplo "1" en dAb3-1). Se produjeron moléculas de dAb como fusiones bien al dominio IgG4 Fc humano que contiene una bisagra que estabiliza la mutación S228p (Newman, R. et al., 2001, Clin Immunol. 98, 164-74) (citada como IgG4), o fusionada a uno de muchos dominios de IgG1 Fc que se identifican con asteriscos, por ejemplo, IgG1*, IgG1**, IgG1***, etc. Muchas de estas moléculas dAb-Fc (familias de dAb3, dAb5, dAb6, dAb9) se podrían purificar como monómeros estables tal como se determina mediante SEC-MALS (no mostrado) o DLS (Figura 7B y C), mientras que otras familias demostraron propiedades indeseables que incluyen una mayor agregación (familias dAb2 y dAb8) (Figura 7B y C), y/o interacción con varias columnas analíticas de SEC (familias dAb2, dAb8 y dAb9).

Los ejemplos de curvas de precipitación salina para las moléculas dAb-Fc representativas se muestran en la Figura 7A, los datos del radio hidrodinámico (Rh) dependiente de la concentración de la proteína para moléculas seleccionadas se muestra en la Figura 7B, y los valores de ASm se comparan con el Rh medido a una concentración de proteína de 1 mg/ml en la Figura 7C. Como en los Adn-Fc descritos anteriormente, se descubrió que los dAb-Fc tienen un amplio intervalo de propiedades de precipitación salina, con valores de ASm de 0,64 - 1,40 M. En comparación con los datos para las moléculas que contienen el mismo dAb pero diferentes dominios Fc (familias dAb3, dAb5 y dAb8) se muestra que las propiedades de precipitación salina principalmente dependen de la identidad del dominio dAb y son principalmente independientes del dominio Fc (Figura 7C). Las moléculas monoméricas dAb-Fc de las familias dAb3, dAb5 y dAb6 tenían los valores de ASm más altos (1,11 - 1,40 M), incluyendo las siete moléculas de la familia dAb6-Fc (ASm = 1,33 -1,40 M) que tenían una elevada identidad de secuencia (98,6 - 99,7 %) y propiedades biofísicas muy similares. Por otro lado, todas las moléculas dAb-Fc delas familias dAb2, dAb8 y dAb9 que demostraron una mayor agregación y/o "pegajosidad" hacia las columnas analíticas de SEC, se descubrió que tenían valores de ASm más bajos (0,64 - 1,05 M) (Figura 7C). Uno de los dAb-Fc con solubilidad en AS favorable (dAb5-4- IgG1 *) se produjo a gran escala para generar suficiente material para estudios de solubilidad de ultrafiltración y se confirmó la baja propensión a la agregación, con menos del 2 % de las especies de APM observadas a concentraciones tan altas como 100 mg/ml (Figura 8).

Solubilidad de anticuerpos monoclonales:

Se ensayó la solubilidad de AS de un panel de anticuerpos monoclonales (mAb) que tenía o bien el mismo dominio Fc pero diferentes dominios Fab de unión a diana, o bien los mismos dominios Fab fusionados a diferentes dominios Fc. Los dominios Fc en este conjunto de muestras incluyeron la IgG1 de tipo silvestre, diversos dominios de Fc de IgG1 modificada (IgG1*, IgG1**, IgG1***), IgG4-S228P (identificada como IgG4), IgG2a, o una IgG2a modificada (identificada como IgG2a*). Los datos de precipitación salina para los mAb se muestran en la Figura 9, y los valores

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de ASm y los identificadores de Fab/Fc se enumeran en la Tabla 2. En comparación con las adnectinas, los Adn-Fc y los dAb-Fc, se descubrió que todos los mAb tenían precipitación salina en un intervalo de AS más estrecho, con valores de ASm de 1,31 - 1,62 M. A pesar de este intervalo estrecho, hubo diferencias claras y reproducibles en la solubilidad de las diferentes moléculas, que principalmente dependían de la identidad de los dominios Fab y eran menos dependientes del dominio Fc. Por ejemplo, los valores de ASm para mAb-A que tiene 3 dominios Fc diferentes fueron todos 1,54-1,62 M, y para mAb-B que tiene 5 dominios Fc diferentes fueron todos 1,38-1,51 M (Tabla 2). Esto implica que la agregación de mAB puede estar dirigida por la autoasociación de los dominios Fab y probablemente las CDR de unión a diana que son las regiones más variables de estas moléculas.

Aplicación del ensayo de solubilidad en sulfato de amonio en la optimización del fármaco:

Tal como se describe en el presente documento, se usó una estrategia de barrido de Alanina para examinar la contribución de los restos del bucle de unión a la energía de interacción para una adnectina que se une al receptor EGFR (citado como EGFR8, que comprende un dominio 10Fn3 de la SEQ ID NO: 67). Todos los restos en los bucles de unión a diana BC, DE y FG se sustituyeron individualmente con Ala, y se evaluaron los efectos sobre la unión a la diana. Además, un resto adyacente al bucle DE, T58, también se identificó basándose en la modelación molecular como un sitio en el que la energía de unión podría modificarse a través de la mutación. Por lo tanto, se crearon tres mutantes adicionales (T58^E, T58^D, T58^Q) y se estudió su unión a la diana. Aquellos mutantes de T58 y de Ala también se ensayaron para determinar si cualquiera de las mutaciones podría mejorar la solubilidad de EGFR8.

La adnectina EGFR8 de tipo silvestre (SEQ ID NO:67) ensayada a 0,33 mg/ml, se descubrió que tenía precipitación salina entre aproximadamente 1,9 - 2,3 M de AS, con ASm = 2,1 M (Figura 10). Los estudios iniciales con mutantes seleccionados indicaron que los mutantes generalmente tenían precipitación salina en un intervalo similar al de la proteína de tipo silvestre. Por lo tanto, para seleccionar rápidamente los mutantes con un mínimo consumo de proteína, cada proteína se ensayó solo a una [AS] cerca del inicio (2,0 M) y cerca de la base (2,2 M) de la transición de la precipitación salina para EGFR8 de tipo silvestre, en donde los datos a 2,0 M podrían documentar principalmente moléculas con solubilidad reducida y los datos a 2,2 M podrían identificar moléculas con solubilidad más alta. Este experimento identificó mutantes con solubilidad más baja tales como D77^A, K79^A y E85^A y mutantes con solubilidad más alta que incluyen S24^A, G27^A, V54^A, T58^E, T58^D, H78^A, P80^A y Y83^A, en comparación con la adnectina EGFR8 de tipo silvestre (Figura 11A). Las tendencias en solubilidad para un subconjunto de estas moléculas se confirmaron generando curvas de titulación completas (Figura 10). Las mutaciones con solubilidad reducida generalmente fueron las de los restos hidrófilos tales como Asp, Glu o Lys a Ala, mientras que las que mejoraban la solubilidad generalmente fueron las mutaciones de los restos más hidrófobos a Ala, o la introducción de un resto hidrófilo Glu o Asp en el lugar de T58.

Dado que se determinó la estructura de EGFR8, las propensiones a la agregación específicas de los restos se calcularon para todos los restos mutados en la proteína usando el algoritmo de "propensión a la agregación espacial" (PAE) (Chennamsetty, N. et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 106, 11937-42). Los valores de PAE se calcularon a alta resolución usando un radio de 5 A para identificar los restos específicos propensos a la agregación, así como a baja resolución con R = 10 A para identificar parches hidrofóbicos propensos a la agregación más grandes. Los datos de PAE para los restos mutados se muestran en la Figura 11B. Aunque se descubrió que la mayoría de la adnectina era altamente hidrófila (valores de PAE negativos), en el bucle de unión DE se predijo que tiene un carácter hidrófobo moderado (valores PAE positivos) y posiblemente propenso a la agregación. De los restos en este parche hidrófobo, las mutaciones que se predijo que reducían la hidrofobicidad y, por lo tanto, la agregación (por ejemplo, V54^A, T58^E y T58^D), la mayoría, de hecho, aumentó significativamente la solubilidad de EGFR8 en el ensayo de solubilidad en AS (Figura 11A y Figura 10). Los datos de solubilidad medidos también identificaron mutaciones adicionales tales como H78^A o Y83^A en las que la solubilidad se podría mejorarse mediante mutación, que no se predijeron solo mediante PAE. A la vista de los datos de unión a la diana basados en la estructura (Ejemplo 2), algunas de las mutaciones que mejoran la solubilidad (V54^A, H78^A, Y83^A) dieron como resultado reducciones indeseables en afinidad/potencia, probablemente debido a la retirada de interacciones hidrófobas importantes con la proteína diana de EGFR. Sin embargo, algunas otras mutaciones que mejoran la solubilidad (S24^A, G27^A, T58^E y T58^D) dieron como resultado una unión/potencia sin cambios o mejorada, lo que sugiere que estas mutaciones podrían ser modificaciones útiles para optimizar tanto la solubilidad como la potencia de la adnectina.

Claims (18)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido que comprende restos de armazones a base de fibronectina que comprenden un 10° dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) modificado, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende una secuencia de aminoácidos en donde el resto de aminoácido que se corresponde con el resto de treonina en la posición 58 de la SEQ ID NO: 1 es un resto de ácido glutámico (E);

   la solubilidad del dominio 10Fn3 modificado está mejorada en relación con la solubilidad de un dominio 10Fn3 que comprende la misma secuencia de aminoácidos que el dominio 10Fn3 modificado, excepto en que el resto de aminoácido que se corresponde con el resto de treonina en la posición 58 de la SEQ ID NO: 1 no está mutado; y el dominio 10Fn3 modificado se une específicamente a una diana que no está unida mediante un dominio de Fn3 humana seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
2. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio 10Fn3 modificado es al menos el 50 % o al menos el 70 % idéntico al de un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
3. 3. El polipéptido de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio 10Fn3 modificado difiere en, como mucho, 40 aminoácidos de un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
4. 4. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido seleccionada de sustitución, deleción y adición en al menos un bucle en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
5. 5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos dos bucles en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
6. 6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido en cada uno de al menos tres bucles en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
7. 7. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido en al menos un bucle seleccionado de bucles del polo norte (bucles BC, DE y FG), en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
8. 8. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido en al menos un bucle seleccionado de bucles del polo sur (bucles AB, Cd y EF), en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
9. 9. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el dominio 10Fn3 modificado comprende al menos una variación de aminoácido seleccionada de sustitución, deleción y adición, en al menos una región no de bucle y al menos un bucle, en comparación con un dominio Fn3 humano seleccionado de los establecidos en las SEQ ID NO: 1-16, 65 y 66.
10. 10. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el dominio 10Fn3 modificado se une de manera específica a una diana con un Kd de menos de 500 nM o menos de 100 nM.
11. 11. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende adicionalmente al menos uno de los restos farmacocinéticos (PK) seleccionados de: un resto de polioxialquileno, una proteína de unión a albúmina sérica humana, ácido siálico, albúmina sérica humana, IgG, una proteína de unión a IgG, transferrina y un fragmento Fc.
12. 12. El polipéptido de la reivindicación 11, en donde el resto de PK es un Fc o un fragmento de Fc.
13. 13. Una biblioteca que comprende una pluralidad de polipéptidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. 14. La biblioteca de la reivindicación 13, en donde la biblioteca comprende al menos 105 polipéptidos que comprende cada uno una secuencia de aminoácidos diferente.
15. 15. Un método para identificar un polipéptido que se une a una diana, que comprende el cribado de la biblioteca de las reivindicaciones 13 o 14 para identificar un polipéptido que se une a la diana.

    imagen1

    WVSPPRRARVTDATET-TITISWR-TKTETITGFQVDAVPANGQ--TP V S DV PRDLEWAAT P T - SLLISWD - AP AV T VRY YRITYGETGGN-SPV PLSFPTNLHLEAWFDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTFTNGQQGNS A AB 3 BC C CD

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    VPISDTIIP 33

    Figura 1

    [sulfato de amonio (M)

    Figura 2

    A)

    E

    05

    E

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    •w

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    !_

    Q.

    imagen2

    [sulfato de amonio] (M)

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    0,0

    imagen3

    _i-----'1-------r------1-------r------1-------1-------1-------1—

    0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

    [sulfato de amonio] (M)

    imagen4

    0,9

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    3

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    s
16. 0.7

    Figura 3

    0,5 1,0 1,5 2,0

    ASm de monoadnectina EGFR (M)

    imagen5

    4^

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    imagen6

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    [sulfato de amonio] (M)

    imagen9

    Figura 5

    os

    A280

    imagen10

    % de APM

    imagen11

    imagen12

    imagen13

    tes c —1 tu

    en

    ASm(M)

    imagen14

    Adn-Fc-a

    Adn-Fc-A

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    AdrvFc-B

    Adn-Fc-b

    Adn-Fc-e

    Adn-Fc-G

    Adn-Fc-H

    Adn-Fc-D

    Adn-Fc-K

    Adn-Fc-J

    Adn-Fc-C

    Adn-Fc-F

    Adn-Fo-f

    Adn-Fc-E

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    "O

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    % de APM

    imagen15
17. 81.02-1.1.-20 80fr90ZH3

    A280

    imagen16

    imagen17

    imagen18

    Figura 7

    x

    ZT

    imagen19

    imagen20

    ****

    2,01
18. 0.5-

    proteina] (mg/ml)

    Figura 8

    nnAb-A

    igd

    mAb-A

    lgG1’

    mAb-A

    lgG4

    0,3

    mAb-B

    lcG2

    mAb-B

    lgG2

    mAb-B

    lgG1

    mAb-B

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    mAb-B

    igG4

    mAb-C

    lgG1

    mAb-D

    igGi

    mAb-E

    lgG1

    mAb

    !gG1

    mAb-G

    -lgG4

    mAb-H

    lgG4

    sulfato de amonio (M)

    Figura 9

    imagen21

    imagen22

    imagen23

    Figura 12

    imagen24

    imagen25

    imagen26

    N-terminal

    Bucle BC

    Bucle

    FG

    i0Fn3

    VS D VP RDLE WAAT PTS M.I SW DAPAVTVRYYRITYGETGGNS PVOEFTV

    Adnectina 1 MGVSDVPRDIEvVAATPTSLLISWDSGRGSíQiYRITYGETGGNSPvQEFTv

    Adnectina 2 MGVSDVPRDLEWAATPTSLLISWEHDYPYRRYYRITYG2TGGNS PVOEFTV

    -A—

    —C- —

    “D

    100

    ABC DE

    10 Fr. 3

    PG S KSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRG

    DSPASSKPISINYRTEIjKPS

    Adnectina 1 PGPVHTATISGLKPGVDYTITVYAVTDHKPHADGPHTYHES PISINYRTEIDKP 3

    Adnectina 2 PKDVDTATISGLKPGVDYTITVYAVTSSY

    kydmqyspisimyrteidkps

    — F--

    107

    10Fn3

    Adnectina 1

    OHHHHHÍ!

    Adnectina 2

    N-term

    Buc e BC

    C-terminal

    Bucle DE

    Buc e DE

    Buc e FG

    Figura 15

    imagen27

    imagen28

    imagen29

    imagen30

    B.

    imagen31

    imagen32

    -----EGFR8

    A) 600

    -----EGFR8

    — EGFR8-T58E

    — EGFR8-T58D

    EGFR8-T58E

    ... EGFR8-T58D

    500

    E 400

    5 300

    200

    100

    90 100

    Temperatura (°C)

    Tiempo (min)

    Datos de CDB

    Datos de CDB

    —Ajuste de datos

    — A usté de datos

    00 100

    Temperatura (°C)

    Temperatura (°C)

    Datos de CDB

    — Ajuste de datos

    Temperatura (°C)

    imagen33

    a EGFR8

    □ EGFR0-T58E

    a EGFR8-T58D

    0,0"

    [sulfato de amonio] (M)

    Figura 21

    B) 3,0-i

    140

    120

    100-

    EGFR0

    EGFR8

    EGFR8-T58E

    EGFR8-T58E

    EGFR8-T58D

    20-

    EGFR8-T58D

    20 40 6C 80 100120 1401 SO 180 200

    concentración esperada (mg/ml)

    concentración (mg/ml)

    Figura 22

    imagen34

    VSDVPRDLE WAAT PT S LLI

    VSDVPRDLEVVAATPTSLUSW

    100

    co ■ üj

    O

    15 80

    _] 1s

    ----115

    I |2s

    ' “_l2s

    40

    EGFR8 EGFR8-T58E EGFR8-T58D

    EGFR8 EGFR8-T58E EGFR8-T58D

    □ 25

    IEGFR8 EGFR8-T58E EGFR8-T58D

    Figura 23

    EGFR4

    EGFR8

    Consenso

    ÍVíEGL

    □YYRITYGETGGNSPvQEFtVP

    AH3

    j-I

    38 GR GE i

    qyyritygetggnspvqeftv

    ■ 4

    ;pv

    HI

    ATIS

    iQYrR.TYGETGGNSPVQEFTVí

    TAI Ib

    112

    EGFR4

    EGFR8

    Consenso

    GLKPGV ) íTIxVYAVTI

    ÍYNPDTHEYTYHTT3

    isinyrteidkpsqhkhhhh

    GLKPGVjYTITVYAVTE

    -i K AL- CP.- i'Y HE 8

    IS INYRTEIDKPSQHHH.-ÍHH

    GLK PGV J YTIT VYAVTí:

    ti YH

    ISINYRTE11 )KPSQHHHiHH

    O)

    imagen35

    imagen36

    imagen37

    30 40 50 60 70 80 90 100

    Temperatura (°C)

    imagen38

    -----J-----1----1-----1-----------1-----------1-----------1----1-----i---T------1--

    30 40 50 60 70 80 90 100

    imagen39

    concentración observada (mg/ml)

    imagen40

    imagen41

    Figura 27