ES2746559T3 - Modificación genética de dominios de inmunoglobulina - Google Patents

Abstract

Un andamio de inmunoglobulina sintética que comprende uno o más de un enlace disulfuro no canónico en la región marco (FR), en la que el andamio es una cadena ligera variable (VL) y está en el formato de un dominio variable único de inmunoglobulina con tres CDR, en el que el enlace disulfuro no canónico se forma entre un residuo de Cys en la posición 46-49 de la región FR2 y un residuo de Cys en la posición 62-66 de la región FR3 de una VL, en la que dicho enlace disulfuro no canónico proporciona una estabilidad mejorada en comparación con el andamio de inmunoglobulina sin dicho enlace y en el que la numeración se refiere a la numeración de Kabat.

Description

DESCRIPCIÓN

Modificación genética de dominios de inmunoglobulina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina para mejorar las propiedades biofísicas de la inmunoglobulina.

Antecedentes de la invención

La estabilidad de la proteína juega un papel importante en terapéutica de proteínas, ya que las proteínas inestables conducen a una disponibilidad terapéutica variable y efectos fisiológicos impredecibles in vivo (Horwich, 2002; Wetzel, 1988; Mitraki y King, 1992; Worn y Pluckthun, 2001; Hurle et al., 1994). En el campo de la terapéutica de anticuerpos, los anticuerpos humanos convencionales y los fragmentos de anticuerpo son o bien muy grandes y/o tienen propiedades biofísicas deficientes, tales como baja estabilidad, desarrollo irreversible y baja expresión; por lo tanto, tienen aplicaciones clínicas limitadas. Los anticuerpos de un solo dominio "naturales" (sdAb), por ejemplo, V^hH de camélidos, V^nar de tiburón, no tienen los problemas mencionados anteriormente, aunque son inmunogénicos debido a su naturaleza no humana.

Los sdAb completamente humanos, por ejemplo, V^h o V^l, serían moléculas ideales para la terapia humana debido a su menor (o carencia de) inmunogenicidad esperada; sin embargo, son propensos a la agregación debido a su baja estabilidad y solubilidad (Ward et al., 1989; Davies y Reichmann, 1994; Davies y Riechmann, 1995; Tanha et al., 2001; Kazlauskas y Bornscheuer, 2009; Holliger y Hudson , 2005; Hoogenboom, 2005). Esto limita sus aplicaciones en la terapia humana. Dada la importancia de los anticuerpos estables como moléculas terapéuticas, no es sorprendente que se hayan realizado esfuerzos para seleccionar anticuerpos de dominio único más estables/solubles (Davies y Riechmann, 1996a; Jespers et al., 2004; To et al., 2005; Tanha et al., 2006; Arbabi-Ghahroudi et al., 2009a; Arbabi-Ghahroudi et al., 2009b; Arbabi-Ghahroudi et al., 2010).

Un método típico para mejorar la estabilidad de sdAb es usar un sdAb como andamio para generar una biblioteca de visualización que comprende cientos de millones de variedades de sdAb, cada una con una especificidad única; los aglutinantes (sdAb) se seleccionan luego contra los antígenos objetivo mediante técnicas de barrido. En un enfoque de este método, el andamio progenitor se modifica primero genéticamente para que no se agregue y luego la biblioteca se construye con base en el andamio que no se agrega; dado que se asume que los sdAb de la progenie en la biblioteca en general "hereda" la propiedad de no agregación de el andamio progenitor, se realiza un barrido convencional basado solamente en el criterio de afinidad para seleccionar los sdAb que no se agregan. En un segundo enfoque, el andamio progenitor puede o no agregarse, y las bibliotecas de la misma se escanean con base en criterios de afinidad y no agregación. Independientemente del enfoque, los sdAb agregados y no agregados se seleccionan conjuntamente; en muchos casos, los sdAb que se agregan dominan el proceso de selección, o los aglutinantes seleccionados tienen niveles bajos de solubilidad, estabilidad y expresión. Además, se pierden varios anticuerpos V^h durante la selección por afinidad, donde se producen grandes intervalos de sustituciones de aminoácidos para desestabilizar los V^h que conducen a la agregación (Kazlauskas y Bornscheuer, 2009; Bloom et al., 2006). Estos factores hacen que la selección de sdAb sin agregación sea tediosa y laboriosa y, a veces, desalentadora.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de anticuerpos que no se agreguen, solubles y estables.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones y cualesquiera otros aspectos o realizaciones establecidos en este documento que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones son solo para información. La presente invención se refiere a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina para mejorar las propiedades biofísicas de la inmunoglobulina.

La presente invención proporciona una composición que comprende un andamio de inmunoglobulina, comprendiendo dicho andamio de inmunoglobulina uno o más de un enlace disulfuro no canónico en la región marco (FR), así como métodos para preparar y usar las composiciones. En una realización, el andamio de inmunoglobulina puede ser una V^l; la V^l puede ser de la familia kappa o lambda. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es humana. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es humanitaria. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es de camélido. En una realización, la especie de camélido se selecciona del grupo que consiste en llama, alpaca y camello.

En el andamio de inmunoglobulina como se describió anteriormente, el uno o más de un enlace disulfuro no canónico puede formarse entre cisteínas introducidas por mutaciones en FR2 y FR3. En el caso en el que el andamio de inmunoglobulina sea una V^l, la invención proporciona un método para elaborar el andamio en la que los residuos de Cys pueden introducirse en cualquiera de las posiciones 46-49 y cualquiera de las posiciones 62-66, con base en la numeración de Kabat. En una realización, los residuos de Cys pueden introducirse en las posiciones 48 y 64, con base en la numeración de Kabat.

El andamio de inmunoglobulina descrita en el presente documento puede comprender una secuencia de polipéptidos que comprende al menos dos residuos de Cys no canónicos introducidos en las regiones marco FR2 y FR3 de una región variable de anticuerpo. En una realización, el polipéptido comprende un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 46 a 49 de regiones FR2 de V^l y un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 62 a 66 de regiones FR3 de V^l de un dominio sdAb de V^l.

En una realización, el dominio de V^h de la invención comprende un fragmento de sdAb. En una realización, la invención proporciona una biblioteca de expresión que comprende el fragmento de sdAb de V^h de la invención, en el que los fragmentos de sdAb de la invención comprenden una multiplicidad de secuencias de CDR. En una realización, la posición de las regiones CDR de un fragmento de sdAb de V^h de la invención seleccionado del grupo de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y 8 están en las posiciones proporcionadas en la Figura 1A y las seleccionadas del grupo de SEQ ID NOs : 70 a 83 están en la posición prevista para las secuencias de tipo silvestre correspondientes en la Figura 2 de la publicación PCT WO2006/099747.

En una realización, el polipéptido comprende al menos un residuo de Cys en la posición 48 y al menos un residuo de Cys en la posición 64 de un dominio de V^l. En una realización, el dominio de V^l de la invención comprende un fragmento de sdAb. En una realización, la invención proporciona una biblioteca de expresión que comprende el fragmento de sdAb de V^l de la invención, en el que los fragmentos de sdAb de la invención comprenden una multiplicidad de secuencias de CDR. En una realización, la posición de las regiones CDR de un fragmento de sdAb de V^l de la invención seleccionado del grupo de las SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 están en las posiciones proporcionadas en la Figura 1B.

En una realización, los residuos de CDR de los polipéptidos de la invención pueden estar en cualquier secuencia adecuada y pueden tener un número variable de residuos distinto del número proporcionado en las Figuras 1A y 1B.

En una realización, el polipéptido de inmunoglobulina de la invención comprende la región de el andamio de una o más de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC

SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:2);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC

SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:4);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWVCAISSSSGSTYYADSVKGRFTC

SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:6);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVISESMTWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTCS

RDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAAKKIDGARYDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:8);

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLCFAASTLQSGVPSRFSCSGSGTDF

TLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGHGTKVTVL (SEQ ID NO:10);

EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLCYDASNRATGISARFSCSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPRTFGGGTKVTVL (SEQ ID N0:18);

ETTLTQSPATLSVSPGERATFSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLCYGASSRTTGIPDRFSCSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDTSPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:20);

QSWTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSSYNIGENSVSWYQQLPGTAPKLLCYGNDKRPSGIPDRFSCSKSGTS ATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSNLRASVFGGGTKVTVL (SEQ ID NO:22);

ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRNNLAWYQQRPGQAPRLLGYGASTRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLQVEDVAVYYCQQYYTTPKTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:24),

o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, con la condición de que la secuencia sustancialmente idéntica, retenga tanto los enlaces disulfuro canónicos como no canónicos, y en la que la secuencia en las regiones de las CDR puede ser cualquier secuencia adecuada y puede tener un número adecuado pero variable de residuos en cada una de CDR1, CDR2 y CDR3. En el caso de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22 y 24, los residuos que comprenden las CDR son como se proporcionan en las Figuras 1A y 1B.

La solicitud describe además el polipéptido de inmunoglobulina que comprende la región de el andamio de una o más de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEPRSVSGLRGWDSWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:70)

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFT CSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGTDMEVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:71)

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:74)

EVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFINYAMSWVRQAPDKGLDWVCTISNNGGATYYADSVKGRFTC SRDNSNNTLYLQMNSLRPDDTAVYYCAKGPINTGRYGDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:75)

QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGGGDHTYYADSVKGRFT CSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGMVRGVSSAPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:76) QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWFRQAPGKGLEWVCFIRSKAYGGTTEYAASVKGRF

TCSRDDSKSIAYLQMNSLRAEDTAMYYCARRAKDGYNSPEDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:78)

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMTWVRQAPGKGLEWVCRIKTKTDGGTTDYAAPVKGR

FTCSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRDHSSGSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:79)

DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCTASGFPFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVCRITSKTDGGTTDYVAPVKGR

FTCSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDQANAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:80)

QMQLVQSGGGWQPGGSLRLSCAASGFTVSSSRMSWFRQAPGMGLEWVCVIYSGGSTYYADSVRGRFSC

SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAREREGAVTREDWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:81)

QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVCFIYSGGSTYYADSVKGRFTCS

RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVGGGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:82)

QVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVCVTNNGGSTSYADSVKGRFT

CSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:83)

o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos de las mismas, con la condición de que la secuencia sustancialmente idéntica, o fragmento de la misma, conserve tanto los enlaces disulfuro canónicos como no canónicos, y en la que la secuencia en las regiones de las CDR puede ser cualquier secuencia adecuada y puede tener un número adecuado pero variable de residuos en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3. En el caso de las SEQ ID NOs: 70 a 83, los residuos que comprenden las CDR son como se proporcionan en los clones de tipo silvestre correspondientes como se proporciona en la Figura 2 de la publicación PCT WO2006/099747.

La presente invención también abarca una biblioteca recombinante que codifica una diversidad de dominios variables, comprendiendo los dominios variables una multiplicidad de CDR que comprenden una variedad de secuencias y longitudes adecuadas intercaladas por las regiones marco de un andamio que comprende los residuos de Cys-Cys no canónicos de la invención como se describe en el presente documento. En una realización, la biblioteca recombinante comprende secuencias de mamíferos. En una realización, la biblioteca recombinante comprende secuencias humanas. En una realización, la biblioteca recombinante comprende secuencias de camélido. En una realización, la biblioteca recombinante comprende una diversidad de secuencias que, una vez seleccionadas, opcionalmente se maduran y/o humanizan.

La presente invención también proporciona un método para mejorar la estabilidad de los anticuerpos de un solo dominio, que comprende introducir uno o más de un enlace disulfuro no canónico en las regiones marco.

La presente invención proporciona métodos para modificar genéticamente dominios de V^l con estabilidad mejorada. La formación de un enlace o enlaces disulfuro adicionales en los dominios de V^l mediante la introducción de un par o pares de Cys en ubicaciones específicas se muestra en le presente documento para transformar V^h y V^l en dominios altamente no agregados, solubles, estables y expresables. Específicamente, estas propiedades ventajosas se obtienen cuando los residuos dentro de las regiones FR2 y FR3 se reemplazan de manera que se introduzca un par de Cys en las posiciones de aminoácidos 48 y 64 para V^l (numeración de Kabat). La espectrometría de masas confirmó la formación de enlaces disulfuro entre los residuos no canónicos introducidos en los mutantes de Cys. Todos los mutantes de Cys modificados de esta manera, es decir, que contienen el puente disulfuro no canónico mencionado, no mostraron expresión adversa en E. coli, no hubo cambios conformacionales adversos como se muestra por las mediciones de unión de resonancia de plasmón superficial ("SPR") y mostraron disminución o falta de agregación. Además, todos los mutantes tenían una estabilidad drásticamente más alta, con temperaturas de fusión de al menos 11 °C más altas que las de sus contrapartes de tipo silvestre. Los datos actuales demuestran que la estabilización de los marcos del dominio de V^l mediante la introducción de dicho enlace disulfuro en un andamio de V^l, o ambos, puede mejorar su resistencia a la proteasa. Las bibliotecas de V^l basadas en los andamios modificados genéticamente de la presente invención pueden prepararse para identificar V^l estables y no agregadas que se unen a moléculas objetivo específicas. Se pueden usar varias bibliotecas de despliegue conocidas en la técnica para expresar los constructos de V^l de la invención. En una realización, la biblioteca es una biblioteca de anticuerpos de un solo dominio ("sdAb").

La presente invención proporciona un enfoque novedoso que puede (i) convertir sdAb que se agrega en sdAb que no se agrega; (ii) aumentar la eficiencia de la obtención de sdAb que no se agrega a partir de bibliotecas de sdAb; (iii) aumentar adicionalmente la estabilidad, por ejemplo, la temperatura de fusión, la eficiencia de replegamiento, la resistencia a proteasas y el nivel de expresión de sdAb. La provisión de andamios V^l con estas características puede permitir la recuperación de intervalos más amplios de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos; la retención de un alto grado de no agregación y estabilidad puede conducir al aislamiento de nuevos anticuerpos que de otro modo podrían perderse durante el proceso de selección de anticuerpos. Además, las características biofísicas mejoradas pueden permitir que la V^l sea ampliamente aplicable en el campo terapéutico e industrial.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención se describirán ahora a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra los andamios primarias de V^h, V^l y los mutantes de Cys correspondientes. La Figura 1A muestra la numeración y la designación de CDR de V^h (SEQ ID NOs: 1-38) usando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1991). Los residuos (Ser 49 e Ile 69) actualmente reemplazados por cisteínas están marcados con un sombreado gris. La Figura 1B muestra la numeración y la designación de CDR de V^l usando la numeración de Kabat. Los residuos (Ile/Val 48 y Gly/Ala 64) actualmente reemplazados por cisteínas están marcados con un sombreado gris. "FR" indica regiones marco, CDR, regiones determinantes de complementariedad, de V^h y V^l.

La Figura 2A muestra los perfiles de elución de V^h de la purificación de IMAC (cromatografía de afinidad con metal inmovilizado). Las V^h de tipo silvestre y mutante se indican mediante líneas punteadas y continuas, respectivamente. Los picos que eluyen en o después de 20 mL contienen V^h purificadas. La Figura 2B muestra SDS-PAGE no reductora con V^h mutantes y de tipo silvestre purificadas por IMAC (se muestran los pares HVHAm302/HVHAm302S y HVHPC235/HVHPC235S como ejemplos). Las flechas marcan las especies diméricas de HVHAm302. "M" en el gel SDS-PAGE indica el carril cargado con estándares de proteínas.

La Figura 3A es un dibujo esquemático de péptidos trípticos (SEQ ID NOs: 25-36, véase también la Tabla 2) de V^h por el análisis de espectrometría de masas. Los enlaces disulfuro que conectan un par de Cys se muestran mediante líneas. Los puntos continuos marcan las cisteínas (C) introducidas en las posiciones 49 y 69. Solo se muestran los péptidos principales que portan enlaces disulfuro modificados genéticamente nativos canónicos (presentes en el tipo silvestre y mutantes) o no canónicos (presentes únicamente en mutantes). Los sitios de digestión con tripsina (terminal C de Lys y Arg) están en negrita. El perfil reductor de SDS-PAGE muestra que las V^h han sido digeridas con éxito mediante tripsina en péptidos pequeños (comparar "+T ripsina" con "-T ripsina"). "M" en el gel SDS-PAGE indica el carril cargado con estándares de proteína. La Figura 3B es un espectro de disociación inducida por colisión (CID)-MS² del ion m/z 964,04 (3+) del péptido enlazado por disulfuro modificado genéticamente, GLEWVCAISSSGGSTYYADSVK (P1) (T44-T64)-FTCSR (P2) (T67-T71) (Cys49-Cys69) (SEQ ID NOs: 29 y 30) de la digestión tríptica de HVHAm302S. Los dos péptidos (b¹6+P2 y y¹17+P2) que portan el enlace disulfuro se anotaron en los picos de MS (espectrometría de masas) y se marcaron con asteriscos. Los datos relacionados se presentan en la Tabla 2. La Figura 3C es un espectro C iD-MS² del ion del péptido enlazado por disulfuro a m/z 1042,66 (6+) del péptido tríptico HVLP324S correspondiente al péptido enlazado por disulfuro LLCFAASTLQSGv Ps R (P1) (SEQ ID NO: 43), FSCSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPR (P2) (SEQ ID NO: 44) y VTITCR (P3) (SEQ ID NO: 42) que se observó a partir de la inspección del cromatograma de LC-MS. Se observaron iones del fragmento y muy informativos a partir de P2 con P3 como una modificación a través de un enlace disulfuro. También se observó una serie del ión y casi completa de P1. El enlace disulfuro se confirmó adicionalmente mediante un espectro ETD-MS² del ion del péptido [M 5H]5+ a m/z 1250,99 (5+) del mismo péptido enlazado por disulfuro de HVLP324S a través del cual se observaron todos los iones P1, P2 y P3 intactos a m/z 691,47 (1+), 1648,86 (1+) y 1956,85 (2+), respectivamente, en cantidades relativamente altas tras la disociación de los enlaces disulfuro de los tres fragmentos de péptidos mediante el ETD (datos no mostrados).

La Figura 4A muestra cromatogramas de exclusión por tamaño de dominios de V^h y sus correspondientes versiones mutantes de Cys (HVHAm302/HVHAm302S, HVHAm427/HVHAm427S, HVHAm431/HVHAm431S y HVHPC235/HVHPC235S). La Figura 4B muestra cromatogramas de exclusión por tamaño de 4 dominios de V^h mutantes de Cys adicionales (HVHP414S, HVHP420S, HVHP426S y HVHP429S). Anteriormente se demostró que las versiones de tipo silvestre correspondientes eran monómeros no agregados (To et al., 2005). La Figura 4C muestra cromatogramas de exclusión por tamaño de dominios de V^l humanos y sus versiones mutantes de Cys. Para cada cromatograma en las Figuras 4A, B y C, se restó la absorbancia de fondo y se normalizaron todos los picos con respecto al pico monomérico (mostrado por las puntas de flecha) que se ajustó al 100%. Los picos a la izquierda de los picos monoméricos se consideraron como picos agregados.

La Figura 5 muestra el despliegue térmico de las V^h . Las V^h mutantes de tipo silvestre y Cys se marcaron con símbolos rellenos y sin relleno, respectivamente (HVHAm302 y HVHAm302S (cuadrado); HVHAm431 y HVHAm431S (círculo); HVHPC235 y HVHPC235S (triángulo)). Las temperaturas de despliegue de punto medio calculadas, Tm, de V^h se registran en la Tabla 4.

La Figura 6 muestra el despliegue térmico de V^l de tipo silvestre (Figura 6A) o mutante de Cys (Figura 6B). Las Tm calculadas se registran en la Tabla 4. En la Figura 6C, las curvas de despliegue térmico de HVLP389 y HVLP325, que tenían las Tm más bajas y más altas, respectivamente, se compararon lado a lado con sus versiones mutantes de Cys, HVLP389S y HVLP325S.

La Figura 7 muestra el análisis de unión SPR de V^h contra la proteína A inmovilizada. En la Figura 7A, la concentración de cada V^h en pM fue la siguiente: 0,2; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 y 3,35 (HVHAm302); 0,2; 0,2; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 y 3,88 (HVHAm427); 0,5; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 y 3,81 (HVHAm431); 0,01; 0,01; 0,02; 0,05; 0,25; 0,25; 0,5; 1,0 y 2,5 (HVHAmC235); 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 5,4 y 8,22 (HVHAm302S); 0,2; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,0 y 3,08 (HVHAm427S); 0,5; 1,0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,5; 10,0 y 13,3 (HVHAm431S); 0,025; 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,4; 0,8; 0,8; 0,8; 1,5; 1,5; 3,0; 6,0 y 9,9 (HVHAmC235S). Las K^d calculadas se registran en la Tabla 4. RU, Unidad de resonancia. La Figura 7B es un diagrama de velocidad cinética con un diagrama de diagonales de isoafinidad para las V^h de tipo silvestre y mutantes. Las velocidades cinéticas (kasociación y kdisociación) determinadas por los análisis SPR se trazan en un plano bidimensional en escala logarítmica, de modo que las V^h ubicados en la misma línea diagonal tienen valores de K^d idénticos.

La Figura 8 muestra los sensogramas de Biacore de las V^l para la proteína L. inmovilizada. En la Figura 8A, la concentración de cada V^l fue la siguiente: 0,2; 0,5; 0,75; 1; 2; 3; 5 y 10 pM (HVLP389, HVLP351 y HVLP364); 1; 2; 3; 5; 7,5 y 10 nM (HVLP342); 0,2; 0,5; 1; 2; 3; 5 y 10 pM (HVLP335); 0,2; 0,5; 1; 1,5; 2 y 5 pM (HVLP325); 0,2; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 3 y 5 pM (HVLP3103) y 1; 2; 4; 6; 8 y 10 nM (HVLP324 ). Los sensogramas para las uniones de HVLP324 y HVLP342 al sitio de baja afinidad de la proteína L no están incluidos; aunque las K^d calculadas se registran en la Tabla 4. En la Figura 8B, la concentración de los V^l mutantes de Cys fue: 0,05; 0,1; 0,2; 0,2; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 3; 4 y 7 pM (HVLP389S); 0,1; 0,2; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 2; 4; 6 y 8 pM (HVLP335S); 0,05; 0,1; 0,2; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 2; 4 y 6 pM (HVLP351S); 0,1; 0,2; 0,2; 0,5; 0,75; 1; 2; 4; 7 y 10 pM (HVLP3103S); 4; 8; 8; 16; 32; 64; 120; 240 nM (HVLP324S); 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,5; 3; 6; 12 pM (HVLP325S); 2; 4; 8; 16; 16; 32; 64; 120; 240 nM (HVLP342S). Las K^d calculadas se registran en la Tabla 4.

La Figura 9 muestra la resistencia a la GI proteasa (pepsina, quimotripsina y tripsina) de las V^l. La Figura 9A compara los perfiles de resistencia a la proteasa de las V^l de tipo silvestre (círculos sin relleno) con aquellos de las V^l mutantes de Cys (círculos con relleno) en diferentes relaciones de proteasa a proteína. En la Figura 9B, se muestra un gráfico del % de resistencia a la proteasa frente a la Tm para V^l de tipo silvestre (círculos sin relleno) frente a mutantes de Cys (círculos con relleno).

La Figura 10 muestra el dibujo esquemático del vector fd-tetVL24S. Un gen HVLP324S que porta una secuencia enlazadora en su extremo 3' se preparó mediante PCR, se digirió con enzimas de restricción ApaLI y Notl y posteriormente se clonó en ADN del fago fd-tetGIND (Tanha et al., 2001) que se linealizó mediante enzimas de restricción ApaLI y Notl. Esto coloca a HVLP324S con el enlazador entre las secuencias guía del gen III del fago y del marco de lectura abierto del gen III. La secuencia enlazadora de ADN codifica un polipéptido GSGSKAAA (SEQ ID NO: 86) en el que el residuo de lisina proporciona un sitio de escisión de tripsina (marcado con una flecha). Esto permite eluir los fagos unidos de los antígenos objetivo mediante la adición de tripsina después de la etapa de unión en el barrido de bibliotecas de despliegue en fagos de anticuerpos.

La Figura 11 muestra la construcción de una biblioteca HVLP324S sintética. La secuencia de aminoácidos de HVLP324S (SEQ ID NO: 10), un andamio de V^l humana usada para la construcción de la biblioteca, se numeró de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., 1991). Se subrayaron las posiciones de aminoácidos en las CDR (1, 2 y 3) a ser aleatorizadas. Los residuos de Cys no canónicos se marcaron con puntos. Los codones de HVLP324S en las CDR seleccionadas para mutagénesis in vitro se muestran junto con sus codones de aleatorización correspondientes. La posición del aminoácido 28 (en CDR1) estaba restringida a los codones de Ser o Gly (mostrados como RGC) y la posición 54 (en CDR2) estaba restringida a los codones de Arg o Leu (mostrados como CKN). Para la mutagénesis de CDR3, se usaron 3 oligonucleótidos con varias longitudes (VL24-CDR3/3a/3b; véase la Tabla 6, Ejemplo 8), creando longitudes de CDR3 de 9, 10 u 11 aminoácidos. De conformidad con la nomenclatura IUPAC, las siguientes letras se usaron para designar ácidos nucleicos degenerados en varias posiciones dentro de los oligonucleótidos, en los que N: nucleótidos A, T, G o C; R: nucleótidos A o G; K: nucleótidos T o G.

La Figura 12 muestra la selección de fagos de las V^l que se unen a lisozima humana. La frecuencia (%) de las V^l de lisozima antihumana seleccionada de barridos de fagos (ronda 3 y 4) bajo dos condiciones de selección diferentes (temperatura ambiente y 65 °C - 2 h) se mostró mediante columnas rectangulares grises o negras, respectivamente.

La Figura 13 muestra secuencias de aminoácidos de las V^l de lisozima antihumana y albúmina de suero antihumana. Las secuencias de aminoácidos de HVLP324S (SEQ ID NO: 10) se alinean con 8 V^l de lisozima antihumana y 1 V^l de albúmina de suero antihumano seleccionadas para análisis biofísico detallado. Las CDR y las FR se designaron mediante numeración de Kabat (Kabat et al., 1991).

La Figura 14 muestra el estado de no agregación y la termoestabilidad de las V^l de lisozima antihumana. (A) Cromatografía de exclusión por tamaño SuperdexMR 75 (SEC) de las V^l de lisozima antihumana y de albúmina de suero antihumana. Para cada cromatograma, se restó la absorbancia de fondo y se normalizaron todos los picos con respecto al pico monomérico (puntas de flecha) que se ajustó al 100%. Los picos a la izquierda del pico monomérico se consideran como un pico de agregación. Los valores de % de agregación y % de monómeros se calcularon mediante la integración del área de los cromatogramas como se describió. (B) Curvas de transición de despliegue térmico de las V^l de lisozima antihumana y de albúmina de suero antihumano. El gráfico de la fracción plegada frente a la temperatura se obtuvo como se describió anteriormente. Las temperaturas correspondientes al punto medio de las curvas de transición no desplegadas (F^0,5) se tomaron como las temperaturas de fusión (Tm). El intervalo de Tm se muestra con una flecha de doble punta. (C) Una curva de correlación de Tm versus % de monómero. Los datos fueron graficados se analizaron con Graphpad Prizm (versión 4.02).

La Figura 15 muestra el análisis de SPR de las V^l de lisozima antihumana. Los sensogramas de Biacore que muestran la unión de las V^l de lisozima humana a lisozima antihumana inmovilizada a diversos intervalos de concentraciones indicadas en cada sensograma: 10, 25, 25, 100, 200, 200, 500, 750 y 2000 nM para HVLHLAQ; 100, 250, 500, 1000, 1000, 2500, 5000, 7500, 10000 y 10000 nM para HVLHLDS; 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 10000, 15000 y 20000 nM para HVLHLEM; 10, 25, 50, 100, 250, 250, 500, 750 y 1000 nM para HVLHLNE; 50, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 y 1000 nM para HVLHLNN; 100, 250, 500, 750, 1000, 1000 y 2500 nM para HVLHLQI; 10, 25, 50, 100, 200, 200, 500, 750 y 1000 nM para HVLHLRN; 50,100, 250, 500, 1000, 1000, 2500, 5000, 7500, 10000, 10000, 15000 y 20000 nM para HVLHLYS.

La Figura 16 muestra la purificación por IMAC de las V^l de lisozima antihumana y análisis de SDS-PAGE (A) Perfiles de elución de V^l de lisozima antihumana después de la purificación por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC). Los picos eluidos correspondientes a las V^l purificadas están marcados por un cuadro rectangular. mAU, unidad de miliabsorbancia. (B) Perfiles de SDS-PAGE de V^l purificadas por IMAC en condiciones reductoras (+DTT). Las V^l purificadas se dializaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) antes del análisis mediante SDS-PAGE. El asterisco denota la V^l que ha perdido su etiqueta His. Los estándares de proteína (carril M) están marcados con sus respectivos pesos moleculares en kDa.

La Figura 17 muestra un análisis de SPR de V^l de albúmina de suero antihumano. Sensograma de Biacore que muestra la unión de VL de albúmina de suero antihumano a la albúmina de suero humana inmovilizada a diversos intervalos de concentraciones indicados en el sensograma: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,5; 0,75, 1, 1, 2 y 4 pM

Descripción detallada de la invención

La invención se define por las reivindicaciones y cualesquiera otros aspectos o realizaciones expuestos en el presente documento que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones son solo para información. La presente invención se refiere a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la modificación genética de dominios de inmunoglobulina para mejorar las propiedades biofísicas de la inmunoglobulina. Se proporcionan composiciones de materia y métodos para elaborar y usar tales composiciones.

La presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido que comprende un andamio de VL que comprende uno o más de un enlace disulfuro no canónico en la región marco (FR), en la que el enlace disulfuro no canónico proporciona una estabilidad mejorada y no agregación del polipéptido. En una realización, el polipéptido es un andamio de V^l. En una realización, el polipéptido comprende el fragmento de sdAb de un dominio de V^l. El sdAb puede derivarse de una región V^l como se describe en este documento.

El andamio de inmunoglobulina puede ser una región variable de una cadena ligera ("VL"). En una realización, la V^l puede ser de la familia kappa o lambda. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es de un animal no humano. En una realización, el animal no humano incluye todos los vertebrados, especialmente los vertebrados seleccionados entre aviares, anfibios, reptiles, mamíferos, camélidos, pollos, ratas, ratones, conejos, cabras, ovejas, vacas, gatos, perros, caballos o primates no humanos. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es de humano. En una realización, el andamio de inmunoglobulina es de camélido. En una realización, la especie de camélido se selecciona del grupo que consiste en llama, alpaca y camello. En una realización, el andamio de camélido se deriva de una región V^l.

En una realización, el andamio de inmunoglobulina es "humanitaria" (también alternativamente denominada "humanizada"), es decir, un sdAb que se originó a partir de una especie distinta a la humana que ha tenido residuos de aminoácidos inmunogénicos o potencialmente inmunogénicos reemplazados por aminoácidos que son menos inmunogénicos o no inmunogénicos en el contexto de un sdAb administrado a un sujeto humano. Cualquier método conocido en la técnica para crear anticuerpos humanizados se contempla en la invención, incluyendo pero sin limitarse a la tecnología de humanización de Kalobios. Téngase en cuenta que cuando un andamio se humaniza, un residuo de aminoácido inmunogénico puede ser reemplazado por cualquier otro residuo de aminoácido menos inmunogénico independientemente de si esto constituye o no un cambio conservado de aminoácidos. Se entiende que los andamios humanizados de la invención retienen los residuos de Cys no canónicos descritos en el presente documento, así como cualquier enlace disulfuro nativo (canónico).

Como se usa en el presente documento, el término "V^h" o "V^l", también denominado en el presente documento como "dominios de V^h o V^l", se refiere a la región variable de una cadena pesada de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo, respectivamente. En una realización, el dominio de V^h o V^l está en el formato de un "anticuerpo de un solo dominio" (sdAb). Como se usa en el presente documento, "sdAb" se refiere a un solo dominio de inmunoglobulina que retiene el pliegue de inmunoglobulina; es decir, es un dominio variable en el que hasta tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) junto con hasta cuatro regiones marco (FR) forman el sitio de unión al antígeno. Las CDR del dominio variable de V^h o V^l se denominan en le presente documento como CDR1, CDR2 y CDR3. Las FR del dominio variable de V^h o V^l se denominan en le presente documento como FR1, FR2, FR3 y FR4. Existen varios esquemas para la identificación de las regiones determinantes de la complementariedad, siendo las dos más comunes las de Kabat y de Chothia y Lesk. Kabat et al., (1991) definen las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) con base en la variabilidad de secuencia en las regiones de unión a antígeno de los dominios de V^h y/o V^l. Chothia y Lesk (1987) definen los "bucles hipervariables" (H o L) en función de la ubicación de las regiones del bucle estructural en los dominios de V^h y V^l. Como estos esquemas individuales definen CDR y regiones de bucle hipervariables que son adyacentes o se superponen, los expertos en la técnica de anticuerpos a menudo utilizan los términos "CDR" y "bucle hipervariable" de manera intercambiable, y pueden usarse así en este documento. La mayoría de la variabilidad de secuencia en dominios variables (V^h o V^l) ocurre en los CDR/bucles; las regiones fuera de los CDR/bucles se denominan regiones marco (FR). Las FR proporcionan integridad estructural al dominio variable y asegura la retención del pliegue de inmunoglobulina. Las FR y CDR/bucles se definen en el presente documento de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1991). En una realización, la numeración de las posiciones con las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de los polipéptidos descritos en el presente documento es como se proporciona en la Figura 1A para un dominio de V^h y como se proporciona en la Figura 1B para un dominio de V^l.

Los dominios de V^h o V^l humanos pueden obtenerse a partir de secuencias de cadena pesada o ligera de Ig humana (Holliger y Hudson, 2005; Holt, et al., 2003; Jespers et al., 2004; To et al., 2005). Se conocen técnicas similares en la técnica para obtener dominios de V^h o V^l de especies no humanas. Además, los dominios de V^l de la invención de la presente invención incluyen V^l producida de forma recombinante, así como aquellas V^l generadas mediante modificación adicional de dicha V^l mediante maduración por afinidad, estabilización, solubilización (por ejemplo, camelización) u otros métodos de modificación genética de anticuerpos. La presente invención también abarca homólogos, derivados o variantes que retienen o mejoran la estabilidad y las características de no agregación de la V^l.

La invención proporciona nuevos dominios de V^l que comprenden un andamio que comprende residuos de Cys no canónicos. Como se usa en el presente documento, un "andamio" o, alternativamente, un "andamio de inmunoglobulina" comprende las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) de la V^l, en la que el marco proporciona el andamio principal del polipéptido para las diversas CDR (CDR1, CDR2, CDR3). Como se usa en el presente documento, el término "andamio" ignora las regiones CDR con el propósito de describir la porción marco de la composición de la invención.

El andamio de inmunoglobulina descrita en el presente documento puede comprender una secuencia de polipéptidos que comprende al menos dos residuos de Cys no canónicos introducidos en las regiones marco FR2 y FR3 de una región variable de anticuerpo. En una realización, el polipéptido comprende un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 46 a 49 de regiones FR2 de V^l y un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 62 a 66 de regiones FR3 de V^l de un dominio sdAb de V^l. Como se usa en el presente documento, "introducido" o "introducción" significa incorporar un cambio en la composición de polipéptidos o la secuencia de nucleótidos que codifica la composición de polipéptidos usando cualquier método adecuado conocido por un experto en la técnica, y especialmente incluyendo tecnología recombinante. En una realización, los residuos de Cys se introducen en el constructo de V^l reemplazando un codón existente en un gen, una secuencia de codificación y/o un ARNm con un codón que es específico para un residuo de cisteína.

En una realización, la composición de la invención comprende un andamio de inmunoglobulina seleccionada de un andamio de V^l , en la que el andamio de V^l comprende al menos un enlace disulfuro no canónico en la FR, en la que el enlace disulfuro no canónico se forma entre los residuos de Cys introducidos en las posiciones 48 y 64, según la numeración de Kabat.

Como se usa en este documento, un constructo de V^l "de la invención" o un fragmento de sdAb comprende al menos un puente disulfuro no canónico que comprende al menos un residuo de Cys en la posición 48 y al menos un residuo de Cys en la posición 64.

En una realización, el polipéptido comprende al menos un residuo de Cys en la posición 48 y al menos un residuo de Cys en la posición 64 de un dominio de V^l. En una realización, el dominio de V^l de la invención comprende un fragmento de sdAb. En una realización, la invención proporciona una biblioteca de expresión que comprende el fragmento de sdAb de V^l de la invención, en el que los fragmentos de sdAb de la invención comprenden una multiplicidad de secuencias de CDR. En una realización, la invención proporciona una biblioteca recombinante que comprende el andamio de inmunoglobulina de V^l de la invención y una multiplicidad de secuencias de CDR adecuadas para proporcionar bibliotecas con diversidades de al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o más de 109 clones por biblioteca. En una realización, la posición de las regiones CDR del fragmento de sdAb de V^l de la invención seleccionado del grupo de las SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 están en las posiciones proporcionadas en la Figura 1B.

En una realización, los residuos de CDR de los polipéptidos de la invención pueden ser cualquier secuencia adecuada y pueden tener un número variable de residuos distinto del número proporcionado en las Figuras 1A y 1B. Cada una de CDR1, CDR2 y CDR3 puede variar en secuencia y longitud de acuerdo con las pautas conocidas por los expertos en la técnica de anticuerpos. Sin desear limitarse a ninguna referencia específica, se proporcionan ejemplos de pautas en las publicaciones de Kabat y Chothia y Lesk citadas en este documento. En un ejemplo no limitativo, el diseño y la construcción de una biblioteca de fagos con base en el andamio HVLP324S se proporciona en la Figura 11 y en el Ejemplo 8 y la biblioteca se caracteriza en el Ejemplo 9.

Las composiciones de V^l de la presente invención proporcionan andamios en la construcción de bibliotecas o anticuerpos adicionales. En una realización, las regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) de la V^l se pueden usar para transportar diversas CDR, es decir, en las que las FR son como se proporcionan y en las que la secuencia y el número de residuos de la región CDR son como se proporcionan o varían en uno o más, o en todos, los residuos específicos de CDR. De esta manera, las bibliotecas de V^l sintéticas pueden construirse en andamios individuales insertando oligonucleótidos adecuados que comprenden secuencias aleatorizadas para proporcionar CDR/bucles aleatorios. Dichas bibliotecas pueden ser bibliotecas de despliegue tales como despliegue en fagos, despliegue en ribosomas o despliegue en levadura. Este enfoque es rutinario en la técnica y se ha descrito en muchas publicaciones (por ejemplo, pero sin limitarse a Arbabi-Ghahroudi et al., 2009a y las referencias citadas allí). Las bibliotecas se pueden usar opcionalmente para la modificación genética adicional de anticuerpos o para maduración de afinidad in vitro (Davies y Riechmann, 1996b; Yau et al., 2005). Alternativamente, una biblioteca existente basada en un sdAb natural puede usarse para modificar genéticamente un enlace o enlaces disulfuro en cada miembro de la biblioteca mediante empalme por extensión por superposición - reacción en cadena de polimerasa (SOE-PCR) (Arbabi-Ghahroudi, et al., 2010 y las referencias citadas allí; Ho et al., 1989) u otros métodos (Kunkel et al., 1987; Sidhu et al., 2000).

En otra alternativa más, la V^l puede usarse como un andamio para incorporar secuencias de CDR específicas; por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, se puede construir un anticuerpo humanizado a partir de cualquier anticuerpo no humano mediante el uso de tecnología recombinante para comprender además el puente disulfuro no canónico de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento. Este constructo puede modificarse luego para unirse a un objetivo específico insertando los segmentos de codificación de CDR apropiados (responsables de las propiedades de unión deseadas, y que pueden variar en secuencia y longitud de acuerdo con las pautas citadas en este documento y conocidas por los expertos en las técnicas de anticuerpos) en el andamio de anticuerpos humanizados de acuerdo con la presente invención. Como sabría una persona experta en la técnica, estas técnicas se logran mediante clonación estándar y métodos de ADN recombinante usando vectores apropiados y de expresión en células (de mamífero o de otro tipo). Dichos métodos y técnicas son bien conocidos por los expertos en la materia, y no se describen en el presente documento.

Los andamios de V^l de la presente invención comprenden uno o más de un enlace disulfuro no canónico en las regiones marco. Un enlace disulfuro es una fuerza covalente que estabiliza las proteínas mediante el acoplamiento de dos grupos tiol entre residuos de cisteína (Betz, 1993). Por "no canónico", se entiende que el enlace disulfuro no se encuentra en la V^l humano natural, sino que se introduce utilizando técnicas de modificación genética molecular. El enlace disulfuro natural (o "canónico") que conecta dos láminas p dentro de un dominio variable está altamente conservado en las superfamilias de V^l (Amzel y Poljak, 1979; Williams y Barclay, 1988). Los enlaces disulfuro conservados se forman entre Cys23 y Cys88 en las V^l, en las que los residuos están numerados de acuerdo con Kabat (véase la Figura 1). En la presente invención, uno o más de un enlace disulfuro no canónico adicional se modifica genéticamente en el dominio de V^l. Preferiblemente, el enlace disulfuro modificado genéticamente se forma entre un Cys de una primera lámina beta y un Cys de una segunda lámina beta cercana en el pliegue de la inmunoglobulina. Por ejemplo, esto se puede lograr mediante la introducción de un número apropiado de un par o pares de Cys en ubicaciones en las regiones marco que formarán un enlace disulfuro en la proteína expresada y completamente plegada. Los residuos de Cys pueden introducirse en regiones marco que son adyacentes en el andamio tridimensional del dominio variable. Por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, los residuos de Cys podrían introducirse en la región de la lámina beta de FR2 y la región de la lámina beta de FR3. Los residuos de Cys se introducen en las regiones marco adyacentes en ubicaciones que están dentro del intervalo para el acoplamiento de los grupos tiol. Por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, los residuos de Cys pueden introducirse en una de las posiciones 46-49 (4 posiciones) y una de las posiciones 62-66 (5 posiciones) para V^l (con base en la numeración de Kabat), siempre y cuando los respectivos pares de Cys estén lo suficientemente cerca como para formar un enlace disulfuro. En otro ejemplo no limitativo, los residuos de Cys pueden introducirse en las posiciones 48 y 64 para V^l (con base en la numeración de Kabat).

La Cys puede introducirse en las regiones marco de dominios de V^l usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Sin desear estar limitado, la Cys puede introducirse mediante mutación puntual o inserción a través de métodos de ADN recombinante; por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, la Cys puede introducirse mediante empalme por extensión por superposición (SOE)-PCR (Arbabi-Ghahroudi, et al., 2010 y referencias en el mismo; Ho et al., 1989).

El uno o más de un enlace disulfuro no canónico en los andamios de V^l proporciona una estabilidad mejorada y la no agregación del anticuerpo. La no agregación se refiere a la molécula existente en un estado monomérico; por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, los monómeros producen esencialmente un pico con cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Las moléculas de agregación forman dímeros, trímeros y agregados de orden superior. La estabilidad de un anticuerpo incluye características biofísicas tales como la termoestabilidad, la eficiencia de replegamiento térmico y químico y la resistencia a la proteasa. Otros factores a considerar al evaluar los andamios de V^l de la presente invención incluyen niveles de expresión y solubilidad. Como se sabe en la técnica, la solubilidad se refiere al número de moléculas por volumen (por ejemplo, en molaridad o mg/mL) que pueden disolverse en un líquido antes de la precipitación; en el caso de los sdAb, y en el contexto de la presente invención, el número de moléculas monoméricas es de particular importancia.

La adición de un enlace disulfuro no canónico puede mejorar una o más de una de las características biofísicas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, y sin querer limitarse a la teoría, la introducción de un enlace disulfuro no canónico en un dominio de V^l puede mejorar la estabilidad (por ejemplo, mayor temperatura de fusión y resistencia a la proteasa, al estabilizar el marco); y/o mejorar la no agregación (al reducir las interacciones intermoleculares y la formación de agregados).

El andamio de V^l en la que se introducen enlaces disulfuro no canónicos puede ser de cualquier origen de línea germinal adecuado. Por ejemplo, y sin querer estar limitado de ninguna manera, la V^l puede ser de la familia lambda o kappa, por ejemplo kappa 1 o kappa 3, o su composición puede derivarse de varias combinaciones de secuencias de línea germinal del segmento V y J. (To et al., 2005; base de datos V BASE del Centro para Modificación Genética de Proteínas MRC, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).

En una realización, los andamios de V^l de la presente invención pueden incluir, pero no están limitadas a andamios que comprenden las regiones marco de secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS (HVHAm302S; SEQ ID NO:2);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTVSS (HVHAm427S; SEQ ID NO:4);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWVCAISSSSGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS (HVHAm431S; SEQ ID NO:6);

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVISESMTWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTCS RDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAAKKIDGARYDYWGQGTMVTVSS (HVHPC235S; SEQ ID NO:8)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLCFAASTLQSGVPSRFSCSGSGTDF TLTISNLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGHGTKVTVL (HVLP324S; SEQ ID NO:10);

EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGRYLAWYQQRPGQAPRLLCFDTSNRAPGVPARFSCRGSGTLF TLTISSLEPEDSAVYFCQQRSSGLTFGGGTKVTVL (HVLP325S; SEQ ID NO:12);

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLGYGTSNRATGIPDRFSCSGSGT HFTLTINRLEPGDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK (HVLP335S; SEQ ID NO:14);

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRTDLDWFQQRPGRAPHRLCYGASSLQGGVPSRFSCSGSGTE FTLTISGLQPEDFATYYCLQHHTYPRTFGLGTKVTVL (HVLP342S; SEQ ID NO:16);

ETTLTQSPATLSVSPGERATFSCRASQSVSNNLAWYQQKPGQAPRLLCYGASSRTTGIPDRFSCSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDTSPRTFGQGTKVEIK (HVLP364S; SEQ ID NO:20);

QSWTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSSYNIGENSVSWYQQLPGTAPKLLCYGNDKRPSGIPDRFSCSKSGTS ATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSNLRASVFGGGTKVTVL (HVLP389S; SEQ ID NO:22);

ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRNNLAWYQQRPGQAPRLLCYGASTRATGIPARFSCSGSGTD FTLTISSLQVEDVAVYYCQQYYTTPKTFGQGTKVEIK (HVLP3103S; SEQ ID NO:24),

o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, con la condición de que la secuencia sustancialmente idéntica retenga los enlaces disulfuro canónicos y no canónicos y en donde la secuencia en las regiones de las CDR puede ser cualquier secuencia adecuada y puede tener un número de residuos adecuado pero variable en cada una de CDR1, CDR2 y CDR3. En el caso de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18,20, 22 y 24, los residuos que comprenden las CDR son como se proporcionan en las Figuras 1A y 1B.

La solicitud describe además el polipéptido de inmunoglobulina que comprende la región de el andamio de una o más de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDEPRSVSGLRGWDSWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:70

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFT GSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGTDMEVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:71)

QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFT CSRDNSKNSLYLQMNSLGAEDTAVYYCARSWSGSSYGGDLDSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:73)

QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTC SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:74)

EVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFINYAMSWVRQAPDKGLDWVCTISNNGGATYYADSVKGRFTC SRDNSNNTLYLQMNSLRPDDTAVYYCAKGPINTGRYGDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:75)

QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGGGDHTYYADSVKGRFT CSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGMVRGVSSAPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:76)

EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVCGISGSGASTYYADSVKGRFT CSRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTALYYCARQSITGPTGAFDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:77) DVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCTASGFPFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVCRITSKTDGGTTDYVAPVKGR

FTCSRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDQANAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:80)

QMQLVQSGGGWQPGGSLRLSCAASGFTVSSSRMSWFRQAPGMGLEWVCVIYSGGSTYYADSVRGRFSC

SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAREREGAVTREDWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:81)

QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVCFIYSGGSTYYADSVKGRFTCS

RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRVGGGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:82)

y

QVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVCVTNNGGSTSYADSVKGRFT

CSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:83)

o secuencias sustancialmente idénticas a las mismas, o fragmentos de las mismas, con la condición de que la secuencia sustancialmente idéntica, o fragmento de la misma, conserve los enlaces disulfuro tanto canónicos como no canónicos y en la que la secuencia en las regiones de las CDR puede ser cualquier secuencia adecuada y puede tener un número adecuado pero variable de residuos en cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3. En el caso de las SEQ ID NOs: 70 a 83, los residuos que comprenden las CDR son como se proporcionan en los clones de tipo silvestre correspondientes como se proporciona en la Figura 2 de la publicación PCT WO2006/099747.

Las secuencias sustancialmente idénticas también deberían retener o mejorar la estabilidad y las características de no agregación de la V^h o V^l. Como se señala a lo largo del texto, los andamios de la invención no se limitan a los residuos enumerados en las regiones CDR, que están delimitadas en las Figuras 1A y 1B para los clones enumerados en el presente documento.

Una secuencia sustancialmente idéntica puede comprender una o más mutaciones conservadoras de aminoácidos. Se sabe en la técnica que una o más mutaciones conservadoras de aminoácidos en una secuencia de referencia pueden producir un péptido mutante sin un cambio sustancial en las propiedades fisiológicas, químicas o funcionales en comparación con la secuencia de referencia; en tal caso, las secuencias de referencia y mutantes se considerarían polipéptidos "sustancialmente idénticos". La mutación conservadora de aminoácidos puede incluir adición, eliminación o sustitución de un aminoácido; una sustitución conservadora de aminoácidos se define en el presente documento como la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, tamaño, carga o polaridad).

En un ejemplo no limitante, una mutación conservadora puede ser una sustitución de aminoácidos. Tal sustitución conservadora de aminoácidos puede sustituir un aminoácido básico, neutro, hidrófobo o ácido por otro del mismo grupo. Por el término "aminoácido básico" se entiende aminoácidos hidrófilos que tienen un valor de pK de cadena lateral mayor que 7, que típicamente están cargados positivamente a pH fisiológico. Los aminoácidos básicos incluyen histidina (His o H), arginina (Arg o R) y lisina (Lys o K). Por el término "aminoácido neutro" (también "aminoácido polar"), se entiende aminoácidos hidrófilos que tienen una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartidos en común por dos átomos está más cerca de uno de los átomos. Los aminoácidos polares incluyen serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparagina (Asn o N) y glutamina (Gln o Q). El término "aminoácido hidrófobo" (también "aminoácido no polar") incluye aminoácidos que exhiben una hidrofobicidad mayor que cero según la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg (1984). Los aminoácidos hidrófobos incluyen prolina (Pro o P), isoleucina (Ile o I), fenilalanina (Phe o F), valina (Val o V), leucina (Leu o L), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M), alanina (Ala o A) y glicina (Gly o G). "Aminoácido ácido" se refiere a aminoácidos hidrófilos que tienen un valor de pK de cadena lateral de menos de 7, que típicamente están cargados negativamente a pH fisiológico. Los aminoácidos ácidos incluyen glutamato (Glu o E) y aspartato (Asp o D).

La identidad de secuencia se usa para evaluar la similitud de dos secuencias; se determina calculando el porcentaje de residuos que son iguales cuando las dos secuencias están alineadas para una correspondencia máxima entre las posiciones de residuos. Se puede usar cualquier método conocido para calcular la identidad de secuencia; por ejemplo, el software de ordenador está disponible para calcular la identidad de secuencia. Sin desear ser limitante, la identidad de secuencia puede calcularse mediante software tal como el servicio BLAST2 del NCBI mantenido por el Instituto Suizo de Bioinformática (y como se encuentra en http://ca.expasy.org/tools/blast/), BLAST-P, Blast-N, o FASTA-N, o cualquier otro software apropiado conocido en la técnica. En una realización, el cálculo del porcentaje de identidad se limita a la comparación de las regiones marco y no tiene en cuenta los residuos dentro de las CDR. En una realización, el cálculo del porcentaje de identidad compara todos los residuos en un polipéptido, incluidos los de las regiones marco y las CDR.

Como se indica a lo largo del texto, los andamios descritos en el presente documento no se limitan a los residuos enumerados en las regiones CDR, que están delimitadas en las Figuras 1A y 1B para los clones enumerados en el presente documento como las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; y están delimitadas en la Figura 2 de la publicación PCT WO2006/099747 para las secuencias de tipo silvestre correspondientes a los clones enumerados en le presente documento como las SEQ ID NOs: 70 a 83.

Las secuencias sustancialmente idénticas de la presente invención pueden ser al menos 90% idénticas; en otro ejemplo, las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% (o cualquier porcentaje entre ellas) idénticas a nivel de aminoácidos a las secuencias descritas en el presente documento. En una realización adicional, una secuencia sustancialmente idéntica puede contener una, dos, tres o cuatro diferencias de aminoácidos en la región marco cuando se alinea con una composición inventiva proporcionada en este documento. Es importante destacar que las secuencias sustancialmente idénticas conservan la estabilidad y las propiedades biofísicas de la secuencia de referencia. En una realización no limitante, la diferencia en la identidad de secuencia puede deberse a una mutación o mutaciones conservadoras de aminoácidos. En una realización, las secuencias sustancialmente idénticas consisten en los residuos que comprenden FR1, FR2, FR3 y FR4 y no considera los residuos que comprenden uno o más de CDR1, CDR2 y CDR3.

Los andamios de V^l pueden incluirse como parte de proteínas o fragmentos de anticuerpos más grandes, tales como uno o más de un sdAb, scFv, Fab, F(ab)2 y/o inmunoglobulina madura, que incluyen pero no se limitan a una IgG, IgE , y/o IgM, con el fin de aumentar sus propiedades biofísicas, tal como la no agregación, la estabilidad, el nivel de expresión y la solubilidad. Como se usa en el presente documento, una "inmunoglobulina madura" comprende una cadena ligera, dicha cadena ligera que comprende una región variable y constante, y una cadena pesada, dicha cadena pesada que comprende una región variable y constante. En una realización, la inmunoglobulina madura se selecciona del grupo que consiste en una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE y/o IgM. En una realización, la secuencia introducida de este constructo de anticuerpo más grande es humano o está humanizado. El enfoque anterior también se puede aplicar a derivados de V^l tales como constructos de fusión elaborados por fusiones de las V^l con otros polipéptidos tales como toxinas, las V^l con la misma o diferente especificidad, dominios de Fc, etc. con el fin de aumentar sus propiedades biofísicas tales como la solubilidad, no agregación, nivel de expresión y estabilidad.

Los andamios de V^l de la presente invención también pueden fusionarse con secuencias adicionales para ayudar en la expresión, detección o purificación de un anticuerpo recombinante o fragmento del mismo. Se puede usar cualquiera de tales secuencias o etiquetas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, y sin querer ser limitante, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una secuencia de direccionamiento o señal (por ejemplo, pero sin limitarse a ompA), una etiqueta de detección (por ejemplo, pero sin limitarse a c-Myc), un etiqueta de purificación (por ejemplo, pero sin limitarse a His5 o His6), un fragmento Fc o una combinación de los mismos. En otro ejemplo, la secuencia adicional puede ser un sitio de reconocimiento de biotina tal como el descrito por Cronan et al., en el documento WO 95/04069 o Voges et al., en el documento WO/2004/076670. Como también saben los expertos en la materia, las secuencias enlazadoras pueden usarse junto con las secuencias o etiquetas adicionales.

Los andamios de V^l de la presente invención también pueden estar en una presentación multivalente. La multimerización se puede lograr mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, la multimerización se puede lograr utilizando moléculas de autoensamblaje como se describe en Zhang et al., (2004a; 2004b) y el documento WO2003/046560. El método descrito produce pentacuerpos expresando una proteína de fusión que comprende el andamio de V^h o V^l de la presente invención y el dominio de pentamerización de la subunidad B de una familia de toxinas AB5 (Merritt y Hol, 1995); el dominio de pentamerización se ensambla en un pentámero, a través del cual se forma una presentación multivalente del anticuerpo o fragmento del mismo. Además, el dominio de pentamerización puede enlazarse a el andamio de V^l utilizando un enlazador; dicho enlazador debe ser suficientemente largo y de composición adecuada para proporcionar una unión flexible de las dos moléculas, pero no debe obstaculizar las propiedades biofísicas de el andamio de V^l.

Otras formas de presentación multivalente también están abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, y sin querer estar limitado, el andamio de V^l puede presentarse como al menos un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero o cualquier otro oligómero adecuado. Esto puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, conexión de enlace directo (Nielson et al., 2000), interacción c-jun/Fos (de Kruif y Logtenberg, 1996), interacción de "botón en ojales" (Ridgway et al., 1996) o la clonación secuencial de unidades repetitivas de la región de codificación del clon de la invención y los enlazadores del polipéptido corto adecuado conocidos en la técnica.

Otro método conocido en la técnica para la multimerización es dimerizar la composición de V^l usando un dominio de Fc. Cuando se aplica in vivo, los sdAb monoméricos se eliminan rápidamente de la circulación (Bell et al., 2010). Para resolver este problema y proporcionarles a V^h o V^l la capacidad de inducir una respuesta inmune después de la unión al antígeno, los andamios de V^l pueden fusionarse a un fragmento de región constante de anticuerpo ("Fc") para generar anticuerpos quiméricos de cadena pesada (Bell et al., 2010). En este enfoque, el gen de Fc se inserta en un vector junto con el gen de V^l para generar una proteína de fusión sdAb-Fc (Bell et al., 2010; Iqbal et al., 2010); la proteína de fusión se expresa de forma recombinante y luego se purifica. Dichos anticuerpos son fáciles de modificar genéticamente y de producir (Zhang et al., 2009), pueden extender en gran medida la vida media en suero de V^h o V^l, y pueden ser excelentes reactivos de formación de imágenes de tumores (Bell et al., 2010). En una realización, la porción de Fc es humana.

La presente invención también abarca secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas como se describe en el presente documento. En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un andamio de inmunoglobulina seleccionado de un andamio de VL, en la que el andamio de VL comprende al menos un enlace disulfuro no canónico en la FR formado entre los residuos de Cys introducidos en las posiciones 48 y 64, con base en la numeración de Kabat. En una realización, el ácido nucleico codifica una o más de las secuencias seleccionadas de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 70-83. En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende cualquier codón del código degenerado que codifica el residuo de aminoácido apropiado. En una realización, la región codificante de la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado. En una realización, el ácido nucleico está en un vector de expresión. En una realización, el vector de expresión está en una célula u organismo huésped capaz de expresar dicho ácido nucleico.

Como es bien sabido por los expertos en la técnica, es posible mejorar la expresión de una secuencia de ácido nucleico en una célula u organismo huésped reemplazando los ácidos nucleicos que codifican un aminoácido particular (es decir, un codón) con otro codón que se expresa mejor en el organismo huésped. Una razón por la que surge este efecto se debe al hecho de que diferentes organismos muestran preferencias por diferentes codones. En particular, los organismos bacterianos y los organismos de levadura prefieren diferentes codones de plantas y animales. El proceso de alterar la secuencia de un ácido nucleico para lograr una mejor expresión basada en la preferencia del codón se denomina optimización del codón. Se han generado métodos estadísticos para analizar el sesgo de uso de codones en varios organismos y se han desarrollado muchos algoritmos informáticos para implementar estos análisis estadísticos en el diseño de secuencias de genes con codones optimizados (Lithwick y Margalit, 2003). En una realización, la secuencia de ácido nucleico puede ser de codón optimizado para la expresión en células de mamífero. En una realización, la secuencia de ácido nucleico puede ser de codones optimizado para la expresión en diversos microorganismos. En una realización, la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado para la expresión en E. coli. En una realización, la secuencia de ácido nucleico es de codón para la expresión en levadura. En una realización, la secuencia de ácido nucleico es de codón optimizado para la expresión en levadura y para la presentación en la superficie de anticuerpos, es decir, el transporte entre la presentación en fagos del anticuerpo y presentación en levadura del anticuerpo. La presente invención también abarca vectores que comprenden los ácidos nucleicos como se acaba de describir. Además, la invención abarca células que comprenden el ácido nucleico y/o el vector como se describe.

La presente invención abarca además el andamio de V^l inmovilizado sobre una superficie usando diversas metodologías; por ejemplo, y sin querer estar limitado, el andamio de VL puede estar enlazada o acoplada a la superficie a través de acoplamiento de etiqueta His, unión a biotina, unión covalente, adsorción y similares. La superficie sólida puede ser cualquier superficie adecuada, por ejemplo, pero sin limitarse a la superficie del pozo de una placa de microtitulación, canales de chips de sensores de resonancia de plasmón superficial (SPR), membranas, perlas (tales como perlas magnética o con base en sefarosa u otras resina de cromatografía), vidrio, una película o cualquier otra superficie útil.

La presente invención proporciona además una V^l de la invención unida a una molécula de carga; el anticuerpo o fragmento del mismo puede entregar la molécula de carga a un sitio deseado. La molécula de carga puede ser cualquier tipo de molécula que pueda usarse para diagnosticar, tratar o detectar un biomarcador. En una realización, el marcador de carga es una molécula que puede reducir y/o inhibir el crecimiento de células objetivo. En una realización, las células objetivo son células asociadas con una enfermedad proliferativa. En una realización, la enfermedad proliferativa es un cáncer, que incluye varios tipos de tumores, en el que las células objetivo expresan un marcador reconocido por la porción del dominio de V^l de la invención. Por lo tanto, en una realización, la molécula de carga es un agente terapéutico o de diagnóstico. En una realización, la molécula de carga está unida a un agente terapéutico o de diagnóstico.

Por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, el agente terapéutico puede ser un radioisótopo, que puede usarse para radioinmunoterapia; una toxina, tal como una inmunotoxina; una citoquina, tal como una inmunocitoquina; una citotoxina; un inductor de apoptosis; una enzima o cualquier otra molécula terapéutica adecuada conocida en la técnica. Como alternativa, un agente de diagnóstico puede incluir, entre otros, un radioisótopo, una etiqueta paramagnética, un fluoróforo, una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina, avidina, etc.) fusionada a una molécula detectable con base en proteínas, o cualquier otro agente adecuado que pueda detectarse mediante métodos de formación de imágenes. En un ejemplo específico, no limitante, el anticuerpo o fragmento del mismo puede estar unido a un agente fluorescente tal como FITC o puede estar genéticamente fusionado a la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP).

El anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse a la molécula de carga usando cualquier método conocido en la técnica (tecnología recombinante, conjugación química, etc.).

La presente invención también proporciona un método para mejorar la estabilidad de los anticuerpos de un solo dominio, que comprende introducir uno o más enlaces disulfuro no canónicos en la región marco. En una realización, el método comprende introducir al menos dos residuos de Cys no canónicos en las regiones marco de la inmunoglobulina de interés. En una realización, los dos residuos de Cys reemplazan a los residuos en la FR2 y FR3 de una región variable de anticuerpo. En una realización, el método comprende introducir un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 46 a 49 de regiones FR2 de V^l y un residuo de Cys en una posición seleccionada de los residuos 62 a 66 de regiones FR3 de V^l de un dominio de sdAb de V^l.

En una realización, el método comprende introducir al menos un residuo de Cys no canónico en la posición 48 y al menos un residuo de Cys no canónico en la posición 64 de un dominio de V^l.

En una realización, el método comprende la creación de una biblioteca de expresión que comprende el fragmento de sdAb de V^l de la invención que comprende un puente disulfuro entre los residuos de Cys no canónicos en las posiciones 48 y 64, en las que los fragmentos de sdAb de la invención comprenden una multiplicidad de secuencias CDR. Se puede usar cualquier método adecuado conocido en la técnica para el reemplazo de la creación de la biblioteca de anticuerpos de secuencias de CDR. En una realización, la posición de las regiones CDR es como se define por Kabat. En una realización, la posición de las regiones CDR es como se define por Chothia y Lesk. En una realización, la biblioteca de expresión es un codón optimizado para la expresión en células de mamífero. En una realización, la biblioteca de expresión es un codón optimizado para la expresión en levadura. En una realización, la biblioteca de expresión es un codón optimizado para la expresión en E. coli.

En una realización, las mutaciones pueden introducirse mediante el enfoque SOE-PCR (Arbabi-Ghahroudi et al., 2010 y las referencias citadas allí; Ho et al., 1989) o por otro método (Kunkel et al., 1987; Sidhu et al., 2000, Hussack et al., 2012 (c)). Alternativamente, los genes para los mutantes se pueden obtener comercialmente, ya sea solos o dentro del vector de clonación y expresión objetivo (Kim et al., 2012).

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben usarse para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplo 1: Clonación, expresión y purificación de las V^h y V^l mutantes

Los dominios de V^h y V^l agregados y no agregados, así como sus mutantes homólogos de doble cisteína se clonaron, expresaron y purificaron. V^h y V^l utilizadas, así como sus correspondientes mutantes de Cys, se enumeran en la Tabla 1 y se muestran en la Figura 1.

Tabla 1. V^h V^l mutantes construidos.

continuación

Los constructos de la invención, también denominados en este documento como "mutantes de Cys", de las V^h y V^l (HVHAm302, HVHAm427, HVHAm431 y HVHPC235) se crearon con empalme por extensión de solapamiento (SOE) -PCR (Ho et al., 1989; Kim et al., 2012; Arbabi-Ghahroudi et al., 2010) para introducir un par de Cys en las posiciones 49 y 69 (V^h) o en las posiciones 48 y 64 (V^l) según lo definido por la numeración de Kabat (Kabat et al., 1991) y como se proporciona en la Figura 1A para un dominio de V^h y la Figura 1B para un dominio de V^l. Brevemente, para generar mutantes de V^h, se prepararon subfragmentos de clones con mutación de Cys, luego se ensamblaron para formar mutantes de Cys de longitud completa por SOE-PCR. Por ejemplo, en el caso de HVHAm302S, los subfragmentos 302S-1 y 302S-2 se generaron por separado mediante PCR estándar utilizando el plásmido que contiene el gen HVHAm302 de tipo silvestre como plantilla de ADN y los siguientes pares de cebadores:

M13RPa (5'-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3 ') (SEQ ID NO: 37)

KT131 (5'-ACCACTACTACTAATAG CGCAGACCCACTCCAGCCCCTTC-3') (SEQ ID NO: 38) (para el subfragmento 302S-1) y

M13FP (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTC ACGAC-3') (SEQ ID NO: 39)

KT129 (5'-GCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCTGCTCCAGAGACAAT TCCAAGAAC-3') (SEQ ID NO: 40) (para el subfragmento 302S-2),

En segundo lugar, usando 302S-2 como plantilla, el fragmento 302S-2-2 se prepara por PCR usando el siguiente par de cebadores de PCR: M13FP y

KT130 (5'-TGCGCTATTAGTAGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGA AGGGCCG-3') (SEQ ID NO: 41).

Esta ETAPA agregó la región superpuesta a 302S-2. Posteriormente, los subfragmentos 302S-1 y 302S-2-2 se ensamblaron para crear un fragmento de V^h de longitud completa con mutaciones de Cys por SOE-PCR usando el par de cebadores M13RP o b/M13FP. Otros mutantes de V^h se generaron a partir de su correspondiente plásmido de V^h de tipo silvestre usando los mismos procedimientos y cebadores; los mutantes de V^l se generaron usando el mismo procedimiento SOE-PCR que para los mutantes de V^h, excepto que se usaron diferentes cebadores de PCR específicos del gen de V^l y las plantillas de plásmido de V^l de tipo silvestre correspondientes. Las versiones mutantes de Cys de las 14 V^h no agregadas, HVHP44, HVHB82, HVHP421, HVHP419, HVHP430, HVHP429, HVHM41, HVHM81, HVHP428, HVHP420, HVHP414, HVHP423, HVHP413 y HVHP426 se sintetizaron mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA, EE. UU.). Se denominan como HVHP44S, HVHB82S, HVHP421S, HVHP419S, HVHP430S, HVHP429S, HVHM41S, HVHM81S, HVHP428S, HVHP420S, HVHP414S, HVHP423S, HVHP413S y HVHP426S, respectivamente. Para estos 14 constructos, el marco y las regiones CDR son iguales, a aquellas de las secuencias de tipo silvestre correspondientes, que se proporcionan en la publicación PCT WO2006/099747, especialmente como se muestra en la Figura 2 de la publicación.

Los mutantes de Cys de longitud completa se clonaron en un vector de expresión, se expresaron, se purificaron y se determinaron sus concentraciones como se describe en otra parte (Sambrook et al., 1989; To, et al., 2005; Arbabi-Ghahroudi et al 2009a ; 2009b; 2010).

El enlace disulfuro adicional no tuvo efecto adverso sobre el rendimiento de expresión de las V^h y V^l mutantes de Cys; los sdAb mutantes y de tipo silvestre tuvieron un rendimiento comparable en cantidades de miligramos. De hecho, en algunos ensayos de expresión, HVHAm302S y HVHAm431S tuvieron rendimientos de expresión significativamente más altos que sus contrapartes de tipo silvestre (véase los perfiles de elución de IMAC en la Figura 2A).

En los geles de SDS-PAGE no reductores, las V^h y V^l mutantes migraron más lentamente que sus contrapartes de tipo silvestre (Figura 2B, ejemplos mostrados para los pares de V^h HVHAm302/HVHAm302S y HVHPC235/HVHPC235S). Las diferencias migratorias desaparecieron en condiciones reductoras. Tal patrón de movilidad en SDS-PAGE también se ha visto en el caso de las V^hH y se sugirió como un indicio de que se han formado enlaces disulfuro Cys49/Cys69 en mutantes de Cys (Hussack et al., 2011). Dado que los pares de tipo silvestre/mutante tienen esencialmente los mismos pesos moleculares, las diferencias de migración de gel entre las V^h de tipo silvestre y mutantes se deben a sus diferencias conformacionales como consecuencia de los enlaces disulfuro adicionales modificados genéticamente en mutantes (Kim y Tanha, 2010). Además, e1HVHAm302 de V^h de tipo silvestre forma agregados (véanse las bandas diméricas en la Figura 2B), que se confirmó adicionalmente mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-His (Figura 2B y datos no mostrados). Las bandas diméricas desaparecen para la correspondiente V^h mutante, HVHAm302S (Figura 2B). Esto muestra que el enlace disulfuro modificado genéticamente mejora la no agregación de V^h y es consistente con los hallazgos por cromatografía de exclusión por tamaño (véase más adelante y la Figura 4A).

Ejemplo 2: mapeo de enlaces disulfuro de mutantes de Cys

Como el enlace disulfuro introducido en los mutantes de Cys de V^h y V^l no es natural para el anticuerpo, se verificó la presencia de enlace disulfuro en la posición mutada antes de la caracterización adicional de los mutantes de V^h y V^l.

Con base en el conocimiento de los dos residuos de Cys (Cys22 y Cys92) que forman un enlace disulfuro nativo en las V^h de tipo silvestre (Amzel y Poljak, 1979; Williams y Barclay, 1988) y los residuos mutados de los mutantes, podría predecirse la ubicación de los enlaces disulfuro. Como había algunos sitios de escisión de tripsina presentes entre los enlaces disulfuro pronosticados en las V^h, fue posible tripsinizar los mutantes de Cys y utilizar espectrometría de masas para verificar la presencia del enlace disulfuro modificado genéticamente.

La determinación del enlace de disulfuro para las V^h y V^l se llevó a cabo como se describe en otra parte (Hussack et al., 2012 (b); Kim y Tanha, 2012; Wu et al., 2009). La determinación del enlace d disulfuro para HVHAm302 y HVHAm302S se realizó exactamente como se describe en Kim y Tanha (2012). Brevemente, los mutantes de Cys de V^h se concentraron en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5, usando un dispositivo de filtro centrífugo Ultrafree-0.5 con membrana biomax-5 (MWCO 5000; Millipore, Nepean, ON, Canadá) y se sometieron a digestión con tripsina (Roche Diagnostics Canadá, Laval, QC, Canadá) a una concentración de 0,5 mg/mL en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5, y se analizaron por SDS-PAGE para el éxito de la digestión con tripsina y posteriormente se sometieron a un análisis de espectrometría de masas de péptidos (Figura 3 y Tabla 2).

Los resultados mostraron que los péptidos unidos por disulfuro producidos por digestión tríptica de V^h podrían identificarse mediante el método de espectrometría de masas empleado (Figura 3b y Tabla 2). Se determinó que todos los pesos moleculares de las proteínas recombinantes tenían una precisión de masa de 40 ppm usando e SI-MS de infusión. La cobertura de identificación de cada proteína a partir del análisis de sus digeridos trípticos usando nanoRPLC-MS2 con DDA (análisis dependiente de datos) fue más del 30%. Los iones de péptidos unidos por disulfuro aparecieron prominentes en el barrido de inspección del experimento DDA. Las secuencias de péptidos unidas por disulfuro esperadas de las V^h se confirmaron todas por nueva secuenciación manual.

Tabla 2. Determinación de enlaces disulfuro de las V^h por espectrometría de masas. Se muestran los principales péptidos trípticos que contienen enlaces disulfuro, con cisteínas conectadas representadas en negrita y subrayadas; las secuencias restantes en la V^h se pierden por tripsinización. Los espacios dentro de los dobletes peptídicos denotan discontinuidad de la secuencia.

continuación

En el caso de HVHAm302S, se secuenció un ion prominente a m/z 964,04 (3+) como un péptido enlazado por disulfuro GLEWVCAISSSGGSTYYADSVK (P1) (SEQ ID NO: 29) y FTCSR (P2) (SEQ ID NO: 30 ) (Figura 3B y Tabla 2), en el que los iones del fragmento del péptido que contienen enlace disulfuro, y-i 17 P2 y b-i6 P2, se observaron claramente a m/z 1153,85 (2+) y a m/z 649,78 (2+), respectivamente (Figura 3 y Tabla 2). Esto confirmó la presencia del enlace disulfuro modificado genéticamente entre Cys49 y Cys69 en HVHAm302S. También se determinó la presencia del enlace disulfuro modificado genéticamente entre Cys49 y Cys69 en HVHPC235S (Tabla 2). Sin embargo, los enlaces disulfuro de HVHAm427S y HVHAm43S no pudieron confirmarse por espectrometría de masas, ya que eran altamente resistentes a la digestión con proteasas (tripsina o pepsina). Sin embargo, el aumento drástico de Tm (Tabla 4), así como el cambio de movilidad en SDS-PAGE (Figura 2B) de HVHAm427S y HVHAm431S en comparación con sus respectivas formas de tipo silvestre indica la presencia del enlace disulfuro modificado genéticamente tanto en HVHAm427S como en HVHAm431S.

Como otro representante, uno de las 14 V^h mutantes (HVHP426S) también fue elegido para la determinación de la formación de enlaces disulfuro Cys 49/Cys 69. Como en el caso de otras V^h, los resultados de la MS mostraron que HVHP426S había formado un enlace disulfuro entre Cys 49 y Cys 69 (Tabla 2).

Un análisis de espectrometría de masas similar en las V^l mutantes confirmó la presencia del enlace disulfuro modificado genéticamente entre las posiciones Cys48 y Cys64 en todas las V^l (Tabla 3).

El análisis de el andamio cristalino ha confirmado la presencia del puente disulfuro entre los residuos de Cys-Cys no canónicos además del puente disulfuro entre los residuos de Cys-Cys canónicos en todas los constructos de V^h y V^l ensayados.

Ejemplo 3: cromatografía de exclusión de tamaño analítica

La cromatografía de exclusión por tamaño (o cromatografía de filtración en gel) separa las proteínas por tamaño molecular y volumen hidrodinámico (Porath y Flodin, 1959). Por lo tanto, este método es útil para evaluar el estado de agregación de proteínas en solución. La cromatografía de exclusión por tamaño que emplea SuperdexMR 75 se usa para evaluar el estado de agregación de los dominios de V^h (o V^l). Las V^h no agregados (o V^l) deberían producir cromatogramas con un único pico simétrico con volúmenes de elución esperados para una V^h (o V^l) monomérica. Por el contrario, los perfiles cromatográficos de las V^h agregadas, además de los picos monoméricos, consisten en picos adicionales, por ejemplo, agregados grandes, agregados diméricos, que se eluyen antes. El porcentaje de monómero puede calcularse mediante la integración del área de los picos y usarse como una medida cuantitativa de la tendencia de agregación de V^h (o V^l) (cuanto mayor es el % de monómero de una V^h (o V^l), menor es su tendencia de agregación y viceversa, mayor es el % de agregados de una V^h (o V^l cuanto mayor es su tendencia de agregación).

La cromatografía de exclusión por tamaño de V^h y V^l, así como sus correspondientes mutantes de Cys, se llevó a cabo como se describió previamente (Sambrook et al., 1989; To, et al., 2005; Arbabi-Ghahroudi et al., 2009a; Arbabi-Ghahroudi et al., 2009b; Arbabi-Ghahroudi et al., 2010; Kim y Tanha, 2012). Brevemente, una columna de exclusión de tamaño SuperdexMR 75 se lavó con 50 mL de ddH2O filtrada y desgasificada y posteriormente se equilibró con 50 mL de PBS filtrado y desgasificado a una velocidad de bombeo de 0,5 mL/min. Las muestras fueron filtradas a través de unidad de filtro desechable de 0,22 pm y posteriormente sometida a cromatografía de exclusión por tamaño en un FPLC AKTA utilizando la columna Superdex con regulador PBS a un caudal de 0,5 mL/min, según las instrucciones del fabricante. Los eluatos correspondientes a los picos se recogieron usando un colector de fracciones AKTA con 0,5 mL de volumen de fracción por tubo. Después de la cromatografía de exclusión por tamaño, se graficó A280 versus el volumen de elución usando el software de gráficos GraphPad Prism (versión 4.02 para Windows; Software GraphPad, San Diego, CA) (Figura 4). El pico monomérico y los picos de agregados se integraron para obtener el % de monómero o el % de agregado.

Los valores de absorbancia (A280) en los cromatogramas de exclusión por tamaño (SEC) se normalizaron y se graficaron contra a los volúmenes de elución. La normalización de la absorbancia se realizó de acuerdo con la siguiente fórmula:

% A280 - (A280N - A280B)/(A280M - A280B) x 100

En la que % A280 es la absorbancia normalizada, A280N es la absorbancia en cualquier volumen de elución, A280M es la absorbancia máxima y A280B es la absorbancia de referencia.

Los resultados (Figura 4A) muestran que la mutación mejoró enormemente la no agregación de proteínas en las tres V^h agregados, HVHAm302, HVHAm427 y HVHAm431. Mientras que las V^h de tipo silvestre mostraron picos de elución tempranos típicos para V^h agregadas (aproximadamente 22% para HVHAm302 y HVHAm427, y 25% para HVHAm431) además de los picos monoméricos, estos picos de elución temprana desaparecieron en los mutantes correspondientes, que consistieron esencialmente en picos monoméricos; esto indica que la modificación genética de enlace disulfuro convirtió las V^h agregadas en V^h no agregadas. La V^h no agregada, HVHPC235, mantuvo su característica de no agregación cuando Cys mutaba a HVHPC235S como se muestra por su cromatografía de exclusión por tamaño (Figura 4A). La Figura 4B muestra los perfiles de SEC representativos de los 14 mutantes de V^h de las V^h, HVHP44S, HVHB82S, HVHP421S, HVHP419S, HVHP430S, HVHP429S, HVHM41S, HVHM81S, HVHP428S, HVHP420S, HVHP414S, HVHP423S, HVHP413S, y HVHP426S. Como se puede observar en los 4 casos examinados (HVHP414S, HVHP420S, HVHP426S y HVHP429S), los mutantes permanecieron sin agregarse de forma similar a sus V^h de tipo silvestre progenitores. Esto demuestra nuevamente que en el caso de las V^h no agregadas, mientras que la modificación genética de disulfuro no compromete el carácter de no agregación de las V^h, mejora enormemente su estabilidad como se muestra a continuación.

Las V^l de tipo silvestre estaban esencialmente libres de agregados y daban picos simples simétricos. Los mutantes de Cys de V^l también fueron monoméricos con la excepción de HVLP364S, que mostró una ligera agregación (11% de agregado dimérico). Por lo tanto, en general, el enlace disulfuro modificado genéticamente no comprometió el carácter de no agregación de las VL (Figura 4C).

Ejemplo 4: Mediciones de termoestabilidad por espectroscopía de dicroísmo circular (CD)

Para evaluar si el enlace disulfuro adicional modificado genéticamente en la V^h y V^l mutantes mejoraría la estabilidad de la proteína, se evaluó la estabilidad térmica mediante la medición de la temperatura de fusión (Tm) mediante espectroscopía de CD.

Para todas las V^h y V^l mutantes, se usó un espectropolarímetro Jasco J-815 equipado con un sistema de control de temperatura de tipo termoeléctrico Peltier (Jasco, Easton, MD, EE. UU.) para llevar a cabo los experimentos. Se usó una cubeta de c D con una longitud de paso de 1 mm. Los espectros se registraron en un intervalo de longitud de onda de 180-260 nm con una velocidad de barrido de 50 nm/min, tiempo de integración digital (DIT) de 4 s, un ancho de banda de 1 nm, separación de datos de 1 nm y un tiempo de integración de 1 s. Para medir la temperatura de fusión o Tm (Greenfield, 2006a; 2006b), los espectros de CD se registraron en un intervalo de temperatura de 30 °C a 96 °C. Todos los espectros de CD se restaron del blanco correspondiente a los espectros del regulador. Las mediciones se realizaron con concentraciones de 50 pg/mL de V^h en regulador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4. La desnaturalización de proteínas inducida por calor se controló a 210 nm para todas las V^l mutantes de Cys y para HVHAm431, HVHAm431S y HVHP419S; a 205 nm para HVHAm427, HVHAm427S, HVHAm302, HVHAm302S, HVHB82, HVHP421, HVHP426, HVHP428, HVHP429, HVHP420S, HVHP429S, HVHM81S, HVHP430S, HVHP421S, HVHP426S, HVHP428S, HVHM41, y HVHP414S; a 220 nm para HVHPC235; a 200 nm para HVHPC235S, HVHP430, HVHP413, HVHP423, HVHM81, HVHP419, HVHP420, y HVHB82S; a 202 nm para HVHP44, HVHP414, y HVHP423S; a 208 nm para HVHP44S; y a 209 nm para HVHM41S por cambios en la elipticidad. La fracción plegada (ff) se obtuvo mediante una fórmula como se describe (Greenfield, 2006a; 2006b):

ff = ([9]^t -[0]^u)/([0]^f -[0]^u) fórmula I

en la que [0]^t es la elipticidad molar a cualquier temperatura, [0]^f, es la elipticidad molar de la proteína completamente plegada a 30 °C y [0]^u es la elipticidad molar de la proteína desplegada a 90 °C. La temperatura de fusión (Tm) se obtuvo como punto medio de la curva desplegada (fracción plegada (ff) versus temperatura) mediante un ajuste de curva de regresión no lineal (ecuación sigmoidal de Boltzman) utilizando el software de gráficos GraphPad Prism (versión 4.02 para Windows) y se registraron en la Tabla 4.

Para V^l de tipo silvestre, se usó un espectropolarímetro Jasco J-810 con un accesorio de baño NESLAB RTE-111. Se usó una celda circular con una longitud de paso de 0,02 cm. Los espectros se registraron con una velocidad de barrido de 100 nm/min, un ancho de banda de 1 nm y un tiempo de integración de 1 s. Los espectros de CD se registraron en un intervalo de temperatura de 25 °C a 85 °C para HVLP342, HVLP351 y HVLP3103, de 25 °C a 80 °C para HVLP324, HVLP325, HVLP364 y HVLP389, y de 25 °C a 90 °C para HVLP335. Los cambios inducidos por calor en la elipticidad molar se monitorizaron a 203 nm para HVLP325 y HVLP389 y a 218 nm para HVLP324, HVLP335, HVLP342, HVLP351, HVLP364 y HVLP3103. Las mediciones se realizaron en regulador de fosfato de sodio con concentraciones que oscilaban entre 4,1 x 10^{' 5} M y 5,7 x 10^{' 5} M. Todos los espectros de CD se restaron de los espectros del regulador correspondiente al blanco y se obtuvo la temperatura de fusión (Tm) como anteriormente. descrito para las V^h y las V^l mutantes.

Tabla 4. Constantes de afinidad, K^d y temperaturas de fusión, Tm, de las V^h, V^l y mutantes de Cys correspondientes.

continuación

Las temperaturas de fusión (Tm) de las V^h (HVHAm302 y HVHAm302S, HVHAm427 y HVHAm427S, HVHAm431 y HVHAm431S, HVHPC235 y HVHPC235S, HVHP44 y HVHP44S, HVHB82 y HVHB82S, HVHP421 y HVHP421S, HVHP419 y HVHP419S, HVHP430 y HVHP430S, HVHP429 y HVHP429S, HVHM41 y HVHM41S, HVHM81 y HVHM81S, HVHP428 y HVHP428S, HVHP420 y HVHP420S, HVHP414 y HVHP414S, HVHP423 y HVHP423S, HVHP413 y HVHP413S, y HVHP426 y HVHP426S) y las V^l fueron determinadas con base en los datos de elipticidad asumiendo un sistema de dos estados, que está de acuerdo con las curvas de desnaturalización observadas correspondientes a una transición aguda en la desnaturalización (Figuras 5 y 6 y Tabla 4). Los valores de Tm se tomaron en el punto medio de las curvas de desnaturalización sigmoidal de la fracción plegada (ff) versus la temperatura. A diferencia de HVHAm302 y HVHC235, tanto HVHAm427 como HVHAm431 tenían Tm considerablemente más altas, probablemente debido a la presencia de posibles enlaces disulfuro entre CDR1-CDR3 (Figura 1A y Tabla 4). En el caso de las V^h de HVHAm302 y HVHAm302S, HVHAm427 y HVHAm427S, HVHAm431 y HVHAm431S, HVHPC235 y HVHPC235S, se encontró que las V^h mutantes tenían una Tm significativamente más alta en comparación con sus contrapartes correspondientes de tipo silvestre (Tabla 4), (prueba t pareada, dos colas, p = 0,0008), lo que significa los efectos estabilizadores del enlace disulfuro modificado genéticamente. Las V^h de tipo silvestre tenían Tm, de 52,8 °C - 70,9 °C que se incrementaron a 65,4 °C - 84,6 °C para las V^h mutantes. Esto corresponde a aumentos de Tm (ATm) de 12,6 °C - 16,5 °C. Patrones similares se observaron en el caso de las V^h de HVHP44 y HVHP44S, HVHB82 y HVHB82S, HVHP421 y HVHP421S, HVHP419 y HVHP419S, HVHP430 y HVHP430S, HVHP429 y HVHP429S, HVHM41 y HVHM41S, HVHM81 y HVHM81S, HVHP428 y HVHP428S, HVHP420 y HVHP420S, HVHP414 y HVHP414S, HVHP423 y HVHP423S, HVHP413 y HVHP413S, y HVHP426 y HVHP426S en los que las V^h de tipo silvestre tenían Tm de 54,2 °C - 72,5 °C mientras que los homólogos mutantes tenían Tm de 64,7 °C - 82,7 °C. Esto corresponde a incrementos de Tm (ATm) de 8,9 °C - 16,8 °C, para las V^h mutantes (Tabla 4). Al comparar los patrones de enlaces disulfuro de las V^h mutantes versus las de tipo silvestre (Tabla 2), es claro que los aumentos de Tm se deben realmente a la presencia de enlaces disulfuro adicionales de Cys49/Cys69. Sin desear limitarse a la teoría, el enlace disulfuro en HVHAm427S podría causar una alteración conformacional para acercar los módulos conformacionales, tales como las láminas beta, (actuando a través del contacto de corto o largo alcance) para inducir fuerzas químicas adicionales, tales como la interacción hidrófoba. o puentes salinos, para estabilizar aún más el andamio a ese nivel.

Las Tm de las V^l estaban en el intervalo de 49,3 °C - 64,6 °C, un intervalo observado en otros sdAb (Jespers et al., 2004; Tanha et al., 2006) (Figura 6 y Tabla 4). Como en el caso de las V^h mutantes, para todas las V^l mutantes, las Tm aumentaron drásticamente en un promedio de 17 °C (intervalo: 11,2 °C -21,1 °C) en comparación con las Tm de las V^l de tipo silvestre. Las Tm de las V^l mutantes estaban en el intervalo de 63,8 °C - 82,5 °C en comparación con 49,3 °C - 64,6 °C para las V^l de tipo silvestre. Por lo tanto, la Tm del mutante menos termoestable, HVLP342S, era comparable a la del tipo silvestre más termoestable, HVLP325 (Figura 6C); HVLP325S tenía la Tm más alta (82,5 °C), mientras que HVLP342S tenía la más baja (63,8 °C). El efecto de la modificación genética de disulfuro en la estabilidad de las V^l parece ser universal, ya que estabiliza las V^l de tipo lambda y kappa e independientemente de su origen de secuencia de línea germinal.

Ejemplo 5: Resonancia de plasmón superficial (SPR)

La propiedad de unión de proteína A y proteína L de las V^h y las V^l, respectivamente, se usó en análisis de unión de SPR para explorar cualquier posible cambio estructural sutil debido a los enlaces disulfuro modificados genéticamente en mutantes de V^h y V^l. La proteína A se usa a menudo para controlar la integridad conformacional de las V^h (Starovasnik et al., 1999). Se llevaron a cabo procedimientos estándar para el análisis por SPR de las V^h y las V^l .

Las V^h y las V^l se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño con SuperdexMR 75 10/300 (GL) (GE Healthcare) en regulador HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005%) con un caudal de 0,5 mL/min antes del análisis BlAcORE y picos de monómeros purificados recogidos incluso en ausencia de evidencia de material agregado. Se determinaron por SPR las cinéticas de unión para la interacción de las V^h con la proteína A (Pierce, Nepean, ON, Canadá) y las V^l con la proteína L (Pierce) utilizando el sistema biosensor BIa Co RE 3000 (GE Healthcare).

Para las V^h, HVHAm302, HVHAm302S, HVHAm427, HVHAm427S, HVHAm431 y HVHAm431S, la proteína A y la ovoalbúmina (como proteína de referencia) (Sigma, Oakville, ON, Canadá) de 540 RU y 1350 RU, respectivamente, fueron inmovilizadas en chips sensores CM5 de grado investigación (GE Healthcare). Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a razón de 50 pg/mL en regulador de acetato 10 mM, pH 4,5, usando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante (GE Healthcare). Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C en regulador HBS-EP a un caudal de 50 pL/min. Las superficies se regeneraron lavando con el regulador de operación.

Para HVHPC235 y HVHPC235S, se inmovilizaron aproximadamente 1.100 RU y 1.000 RU de proteína A recombinante y ovoalbúmina (proteína de referencia), respectivamente, en el chip sensor CM5 de grado investigación. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a razón de 50 pg/mL en regulador de acetato 10 mM (pH 4,0 o pH 4,5 para proteína A u ovoalbúmina, respectivamente) usando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C en regulador HBS-EP a un caudal de 20 pL/min o 40 pL/min para HVHPC235 o HVHPC235S, respectivamente.

Para las V^h mutantes (HVHP44S, HVHB82S, HVHP421S, HVHP419S, HVHP430S, HVHP429S, HVHM81S, HVHP428S, HVHP420S, HVHM41S, HVHP423S, HVHP413S, HVHP426S, y HVHP414S), se inmovilizaron aproximadamente 1.170 RU y 1.2400 RU de proteína A recombinante y ovoalbúmina (proteína de referencia), respectivamente, en el chip sensor CM5 de grado investigación. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a razón de 50 pg/mL en regulador de acetato 10 mM (pH 4,5 para proteína A y ovoalbúmina) usando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C en regulador HBS-EP a un caudal de 20 pL/min o 40 pL/min para HVHB82S, HVHP421S, HVHP429S, HVHM41S, HVHM81S, HVHP423S, HVHP413S, HVHP426S, y HVHP414S o HVHP44S, HVHP419S, HVHP430S, HVHP428S y HVHP420S, respectivamente. La propiedad de unión a la proteína A de las contrapartes de tipo silvestre se determinó previamente (To et al., 2005).

Para las V^l de tipo silvestre, se inmovilizaron 600 RU de proteína L u 800 RU de una proteína de referencia Fab en chips sensores CM5 de grado investigación (GE Healthcare). Para las mutantes de V^l, se inmovilizaron aproximadamente 400 RU de proteína L recombinante u ovoalbúmina (proteína de referencia). Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a concentraciones de proteína de 20 o 50 pg/mL en regulador de acetato 10 mM, pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante (GE Healthcare). Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C en regulador HBS-EP a un caudal de 40 o 50 pL/min. Las superficies se regeneraron lavando con el regulador de operación. Todos los datos fueron evaluados utilizando el software BIA Evaluation 4.1 (GE Healthcare).

El análisis por SPR mostró que la gran mayoría de las VH mutantes (HVHAm302S, HVHAm427S, HVHAm431S, HVHPC235S, HVHB82S, HVHP421S, HVHP419S, HVHP430S, HVHP429S, HVHM81S, HVHP420S, HVHM41S, HVHP423S, HVHP413S, HVHP426S, y HVHP44S) unidas a proteína A con menos afinidad, reflejada por valores de K^d más altos, en comparación con sus contrapartes de tipo silvestre (Figura 7 y Tabla 4) (solo dos V^h mutantes [HVHP428S y HVHP414S] mostraron más o menos los mismos valores de K^d que sus contrapartes de tipo silvestre). La reducción en la unión a la proteína A (aumento en los valores de K^d) varía desde 1,6 veces para el par HVHM81/HVHM81S hasta 10 veces para el par HVHPC235/HVHPC235S (Figura 7A y Tabla 4). Esto demuestra que el enlace disulfuro modificado genéticamente altera algo las conformaciones estructurales de las V^h. Sin desear estar ligados a la teoría, los sitios de unión a la proteína A, que se sabe que residen dentro de las FR1 y FR3 de las V^h (Starovasnik et al., 1999; Riechmann y Davies, 1995), pueden haberse visto comprometidos por la introducción de las dos Cys en las cadenas beta de FR2 y FR3. Curiosamente, las V^h mutantes mostraron constantes de velocidad de disociación (kdisociación) consistentemente mayores en comparación con sus contrapartes de tipo silvestre, lo que resultó en el aumento de la constante de unión de equilibrio (K^d) (Figura 7B).

Se encontró que los mutantes de Cys de V^l se unieron a la proteína L con afinidades similares a sus contrapartes de tipo silvestre (Figura 8 y Tabla 4), lo que indica que el enlace disulfuro no afectó el andamio general de las V^l.

Ejemplo 6: estabilidad a la proteasa

El efecto del enlace disulfuro modificado genéticamente sobre la estabilidad a la proteasa de las V^l y V^h se evaluó utilizando las principales proteasas GI tripsina, quimotripsina y pepsina. Después de las reacciones de digestión con las proteasas GI, se examinaron las V^l y las V^h para detectar la aparición de escisión enzimática por SDS-PAGE y espectrometría de masas. Las digestiones se realizaron esencialmente como se describió (Hussack et al., 2011).

Para las V^l, se realizaron experimentos de digestión en un volumen total de 30 pL con 6 pg de V^l a 37 °C durante 1 h con una relación de enzima a sdAb de 1:200, 1:40, 1:20 y 1:10 (tripsina/quimotripsina), o 1:200, 1:20, 1:10 y 1:4 (pepsina). Los experimentos de digestión tríptica y quimotríptica se llevaron a cabo utilizando enzimas de grado de secuenciación (Hoffmann-La Roche Ltd., Mississauga, ON, Canadá), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de digestión con pepsina (Sigma) se realizaron a ~pH 2,0 donde se ajustó el pH mediante la adición de un volumen apropiado de HCl 400 mM. En los experimentos de control, las enzimas se reemplazaron con un volumen igual de regulador de reacción. Las reacciones se detuvieron agregando un volumen igual de regulador de muestra SDS-PAGE (que contenía ditiotreitol 0,2 M) y ebullendo la mezcla a 95 °C durante 5 min. Posteriormente, las muestras se sometieron a análisis mediante SDS-PAGE y el porcentaje de sdAb intactos después de las digestiones con proteasa se determinaron mediante análisis de densidad de puntos como se describe en Hussack et al., 2012(a) y se compararon con los controles para calcular el porcentaje de las V^l con andamio intacto después de la digestión con proteasas.

Para las V^h, se realizaron experimentos de digestión con tripsina/quimotripsina/pepsina en un volumen total de 30 pL con 6 pg de V^h y su contraparte V^h mutante en paralelo a 37 °C durante 1 h con una relación de enzima a sdAb de 1 :20 y duplicado por dos ensayos independientes. Las digestiones y análisis se llevaron a cabo como se describió para las V^l.

Los resultados se muestran en la Figura 9A. No se observaron diferencias significativas entre las V^l de tipo silvestre y mutantes en términos de resistencia a la tripsina o la quimotripsina (prueba t de pares emparejados de Wilcoxon, valores de P de dos colas = 0,2969 [tripsina] y 0,0625 [quimotripsina]), pero la diferencia en resistencia a la pepsina fue significativa (prueba t de pares emparejados de Wilcoxon, valor de P de dos colas = 0,0078). Las V^l mutantes probadas mostraron una resistencia mejorada contra pepsina, una de las cuales, HVLP3103S, mostró un aumento dramático de 0% de resistencia (tipo silvestre) a casi 90% de resistencia (mutante). La media de resistencia a la pepsina fue del 51% para las V^l mutantes frente al 11% para las V^l de tipo silvestre con una relación de pepsina a V^l de 1:20. En la misma proporción, la mediana de la resistencia a la pepsina fue del 54% para las V^l mutantes frente al 1,5% para las V^l de tipo silvestre. Por lo tanto, la modificación genética de enlaces disulfuro de sdAb aumentó su resistencia a la pepsina significativamente sin afectar sus propiedades de resistencia a la tripsina y la quimotripsina.

La correlación entre la estabilidad térmica y la resistencia a la proteasa se exploró adicionalmente graficando la resistencia a la proteasa (%) frente a Tm (Figura 9B). En general, las V^l con mayor Tm mostraron una mayor resistencia a la pepsina (dos colas, valor de P = 0,0012, R² (Spearman) = 0,7344). Dicha correlación no se observó en el caso de la tripsina y la quimotripsina (dos colas, valor P = 0.5245, R² (Spearman) = -0,1719 [tripsina]; dos colas, valor P = 0,5407, R² ( Spearman) = -0,1653 [quimotripsina]).

En el caso de las V^h que se muestran en la Tabla 5, las V^h mutantes mostraron una mayor resistencia (% de la mediana) a las tres proteasas GI (77% y 82% [tripsina], 69% y 75% [quimotripsina] y 96% y 98% [pepsina], para las V^h de tipo silvestre y mutantes, respectivamente), aunque las diferencias no fueron tan significativas (prueba t de pares emparejados de Wilcoxon, valores de P de dos colas = 0,0899 [tripsina], 0,7896 [quimotripsina] y 0,7832 [pepsina]).

Mientras que la mayoría de las V^h mutantes mostraron resistencia sin cambios o ligeramente mejorada contra la pepsina, dos V^h mutantes (HVHM81S y HVHP423S) mostraron una resistencia disminuida del 100% (tanto para HVHM81 como para HVHP423) hasta 53% (para HVHM81S) y hasta 68% (para HVHP423S), aunque la resistencia a la pepsina de HVHM81S parecía estar subestimada debido a la incapacidad de la herramienta de análisis de densidad de puntos para reconocer las bandas de proteínas correctamente. Curiosamente, se mostraron grandes mejoras en términos de resistencia a la tripsina de dos V^h mutantes (HVHP44S y HVHP413S) donde su resistencia a la tripsina mejoró de 5% y 29% (HVHP44 y HVHP413, respectivamente) hasta 57% y 100% (HVHP44S y HVHP413S, respectivamente). Tomados en conjunto, los mutantes son tan resistentes a las proteasas como las contrapartes de tipo silvestre.

Ejemplo 7: Identidades de secuencia entre las V^h y entre las V^l

Se determinaron las identidades de secuencia entre las V^h, así como las V^l. Solo las secuencias de FR se incluyeron en el análisis, es decir, se excluyeron las secuencias de CDR.

Las secuencias de pares de V^h o pares de V^l se alinearon usando ClustalW (Thompson et al., 1994), y el porcentaje de identidad entre los pares de V^h o pares de V^l se calculó usando el editor de alineación de secuencias BioEdit.

Las consecuencias biofísicas de las sustituciones de pares de Cys en las posiciones 49 y 69 para las V^h y 48 y 64 para las V^l son universales independientemente de su secuencia, origen de línea germinal y longitud y composición de las CDR. Las V^h tienen diversos orígenes de línea germinal y longitudes de CDR y composición de aminoácidos. En particular, la longitud y composición de CDR3 es más diversa. Sin embargo, independientemente de estas variaciones estructurales, la introducción de pares de Cys en las posiciones 49 y 69 conduce a la formación del enlace disulfuro Cys49/Cys69 y a mejoras significativas en la no agregación, la estabilidad térmica y la estabilidad a la proteasa de las V^h sin comprometer los rendimientos de expresión. Las 32 V^l descritas en el documento WO 2006/099747 son diversas: pertenecen a las familias kappa y lambda y tienen diversos orígenes de línea germinal del segmento V y del segmento J y composiciones y longitudes de aminoácidos de la CDR. La longitud de CDR3, en particular, varía de 6 a 11 aminoácidos. Se seleccionaron 8 V^l no agregadas que representan diferentes clases (Figura 1B) de las 32 mencionados anteriormente para evaluar las consecuencias biofísicas de la sustitución de Cys48/Cys64. Como en el caso de las V^h, un análisis lado a lado de las 8 V^l y sus versiones mutantes de Cys mostró que, independientemente de las variaciones estructurales, la introducción de pares de Cys en las posiciones 48 y 64 conduce a la formación del enlace disulfuro Cys48/Cys64 y mejoras significativas en la estabilidad térmica y la estabilidad a la proteasa de las V^l sin comprometer su estado de no agregación o rendimientos de expresión.

Ejemplo 8: Construcción de una biblioteca de despliegue en fagos de V^l estabilizada con disulfuro

La biblioteca de despliegue en fagos de V^l de HVLP324S se construyó en dos etapas mediante el método descrito por Hussack et al., (2012 (c)). Primero, se construyó una biblioteca con una CDR3 aleatorizada con base en el andamio de V^l de HVLP324S (Figura 10). Luego, la biblioteca aleatorizada de CDR3 se utilizó como andamio para construir la biblioteca final con las 3 CDR aleatorizadas.

(i) Construcción de la biblioteca de despliegue en fagos de V^l aleatorizada con CDR3

El ADNcs del fago que contiene uridina en lugar de timidina (plantilla dU-ADNcs) se preparó como se describe (Hussack et al., 2012 (c)), excepto que el fago usado para la preparación del ADNcs fue fd-tetVL24S. fd-tetVL24S es un fago de fd-tetGIIID (Tanha et al., 2001) con el gen de V^l de HVLP324S en su genoma y fusionado con el gen de p3 del fago (Figura 10). La incorporación de uridina en el ADNcs del fago se confirmó valorando el fago contra las células de E. coli TG1 y CJ236 como se describe (Hussack et al., 2012 (c)). Se preparó un total de 75 |jg de ADNcs de fd-tetVL24S en ddH2O. La síntesis in vitro del ADN heterodúplex con aleatorización simultánea de CDR3 usando los cebadores V^l24-CDR3, VL24-CDR3a y VL24-CDR3b se realizó como se describe (Hussack et al., 2012 (c)). Los cebadores se fosforilaron (Hussack et al., 2012 (c)) y se usaron en reacciones de hibridación. Se realizaron tres reacciones de hibridación separadas a 93 °C durante 5 min, 50 °C durante 15 min, 20 °C durante 20 min en un volumen total de 15 jL con 8,2 jL de 121,5 ng/jL de dU-ADNcs de fd-tetVL24S, 0,33 jL de cebadores fosforilados V^l24-CDR3, VL24-CDR3a o VL24-CDR3b, 1 jL de la mezcla (2 jL de regulador TM 10x [Tris-HCl 500 mM, MgCh 100 mM, pH 7,5], 2 jL de ATP 10 mM, 1 jL de DTT 100 mM, 15 jL de ddH2O) y 1,5 jL de regulador TM 10x. El ADN circular cerrado covalentemente (CCC-ADN) se sintetizó como se describe (se preparó un total de 100 |jg de CCC-ADN en ddH2O y se concentró mediante un SpeedVacMR a 82,5 jg en 255 jL (323 ng/jL). Se llevaron a cabo 23 transformaciones 11 jL de CCC-ADN más 350 jL de E. coli TG1 electrocompetente como se describe. Después de la incubación en medio SOC, los materiales de transformación se valoraron y se cultivaron en 1 L de 2xYT/tetraciclina (12,5 jg/mL) durante la noche a 37 °C y 180 rpm. Por la mañana, las células se recogieron y los patrones de bibliotecas congeladas como se describe. La densidad celular de los patrones de bibliotecas congeladas se estimó mediante mediciones de A600 nm. El fago de la biblioteca amplificada se purificó a partir del sobrenadante, se valoró (véase Hussack et al (c)) y utilizado como material de partida para construir la biblioteca final (véase Sección (ii)). A partir de los experimentos de valoración de los materiales de transformación (véase mas arriba), se determinó el tamaño de la biblioteca (número de transformantes) era de 2,3 x 10⁸.

(ii) Construcción de la biblioteca de despliegue en fagos de V^l aleatorizada con CDR1/CDR2/CDR3

En la segundo etapa de la construcción de la biblioteca, CDR1 y CDR2 fueron aleatorizados. La plantilla de dU-ADNcs se preparó comenzando con 4 x 10¹² ufc del fago anterior de la biblioteca aleatorizada con CDR3 (véase Hussack et al (c)). Se obtuvieron 200 jg de ADNcs a partir de 2 mL de fago (2 x 10⁹/jL ). La incorporación de uridina en el ADNcs del fago se confirmó como anteriormente. La plantilla de dU-ADNcs se usó en la segunda ronda de mutagénesis que usó oligonucleótidos mutagénicos V^l24-CDR1 y V^l24S-CDR2. La etapas de hibridación y síntesis de CCC-ADN fueron esencialmente idénticas a los descritas anteriormente. Se preparó un total de 300 jg de CCC-ADN en 1 mL de ddH2O. Se llevaron a cabo 77 transformaciones (13 jL de CCC-ADN más 200 jL de E. coli TG1 electrocompetente como se describe. Después de la incubación en medio SOC, los materiales de transformación se valoraron y se cultivaron en 3 L de 2xYT/tetraciclina (5 jg/mL) durante la noche a 180 RPM y 37 °C. Se elaboraron patrones de bibliotecas congeladas y se estimó su densidad celular como se describió anteriormente. El fago de la biblioteca se purificó del sobrenadante en un volumen final de 20 mL de PBS, se valoró contra TG1 y se almacenó congelado a -80 °C en partes alícuotas de 500 jL para futuros barrido de primera ronda como el fago de entrada. Se determinó que el tamaño de la biblioteca era de 1 x 10⁸ transformantes. Se sometieron a secuenciación 78 clones de V^l de las placas de valoración de la biblioteca (biblioteca no amplificada) como se describe en Hussack et al., (c).

Se usó V^l de HVLP324S como el andamio para la construcción de una biblioteca de V^l sintética estabilizada con disulfuro. HVLP324S es la versión mutante del HVLP324 descrito anteriormente pero con un enlace disulfuro adicional entre Cys48 y Cys64. La biblioteca de despliegue en fagos de V^l de HVLP324S se construyó mediante la introducción de diversidad en 16 (CDR3 = 9 aminoácidos), 17 (CDR3 = 10 aminoácidos) y 18 (CDR3 = 11 aminoácidos) ubicaciones en todas las 3 CDR esencialmente como se describió para una biblioteca de despliegue en fagos de V^l de HVLP324 descrita anteriormente (Figura 11, Hussack et al., (c)). El tamaño de la biblioteca fue modesto con 1 x 10⁸ transformantes. El análisis de secuencia de 78 clones de VL de la biblioteca no amplificada mostró que se había introducido diversidad en todas las posiciones de CDR con una aleatorización sesgada a favor de los residuos de aminoácidos de VL (HVLP324S) parental. La secuenciación de 78 clones mostró que 2 eran idénticos a HVLP324S de tipo silvestre, 8 tenían secuencias de tipo silvestre para CDR1, 2 tenían secuencias de tipo silvestre para CDR2, 18 tenían secuencias de tipo silvestre para CDR3, 9 tenían secuencias de tipo silvestre tanto para CDR1 como para CDR2, 1 tenía secuencia de tipo silvestre tanto para CDR2 como para CDR3, y 2 tenían secuencias de tipo silvestre tanto para CDR1 como para CDR3. La presencia de estos clones en la biblioteca contribuye al sesgo de secuencia mencionado anteriormente.

Un análisis de distribución de longitud de CDR3 de los 76 clones de la biblioteca mostró que la mayoría (71%) de los clones de la biblioteca tenían una longitud de CDR3 de 9 aminoácidos. Los clones con longitudes de CDR3 de 10 y 11 aminoácidos estaban en 18% y 11%, respectivamente.

Se proporcionan detalles adicionales del diseño, construcción y caracterización de la biblioteca en la leyenda y la figura para la Figura 11). Los oligonucleótidos específicos utilizados son los que se proporcionan en la Tabla 6, en la que se utiliza nomenclatura IUPAC para designar los residuos de nucleótidos degenerados en la indicación de las posiciones por N, K y R.

Ejemplo 9: Validación de la biblioteca de despliegue en fagos de V^l estabilizada con disulfuro

Para validar la biblioteca de despliegue en fagos V^l HVLP324S, la biblioteca se sometió a selección para aglutinantes a dos antígenos de prueba diferentes, a saber, lisozima humana y albúmina de suero humano (HSA). Los aglutinantes candidatos positivos (las V^l desplegadas en fagos) identificados mediante ensayos de unión inicial (ELISA de fagos) se subclonaron en vectores para expresión en E. coli. Los aglutinantes de V^l se expresaron, purificaron y analizaron por afinidad y estabilidad.

Ejemplo 9a: barrido

La selección de V^l de lisozima antihumana se realizó mediante técnicas de barrido estándar (véase, por ejemplo, Lee et al., 2007; Arbabi-Ghahroudi et al., 2009a). Brevemente, se recubrió un pozo de microtitulación Nunc (VWR International, Ltd., Mississauga, ON, Canadá) con 100 j L de lisozima humana de 1 mg/mL (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) en PBS estéril (Na2HPO4 3,2 mM, KH2PO40,5 mM, KCl 1,3 mM, NaCl 135 mM, pH 7,4) durante la noche a 4 °C. El pozo se lavó 3 veces con PBS estéril, se secó sobre una toalla de papel y se bloqueó con 150 j L de leche al 2% (p/v) en PBS estéril (MPBS al 2%) a 37 °C durante 2 h. El agente de bloqueo se retiró del pozo y se añadieron 100 j L de fago de biblioteca (fago amplificado preparado en el Ejemplo 8, Sección (ii) en MPBS al 1% (5 x 1011 ufc; preincubado a 37 °C durante 1,5 h) al pozo y se incubaron durante 1,5 h a 37 °C. Después de 10 lavados con PBST (Tween-20 al 0,05% (v/v) en PBS estéril), los fagos se eluyeron incubando el pozo con 100 |jL de trietilamina 124 mM recién preparada durante 10 minutos a temperatura ambiente, pipeteando hacia arriba y hacia abajo a los 8 minutos. La solución de fago eluida se neutralizó en un microtubo de 1,5 mL mezclándolo con 50 j L de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se mantuvo en hielo hasta la fase de infección. Se prepararon 2 x 5 mL de células E. coli TG1 en crecimiento exponencial (DO600 = ~ 0,5) (Arbabi-Ghahroudi et al., 2009a) en tubos Falcon estériles de 50 mL de los cuales 2 mL se infectaron a 37 °C durante 30 minutos con 145 j L de fago eluido (se mantuvieron a un lado 5 j L para determinar el título del fago eluido como se describe a continuación). Las células infectadas se centrifugaron a 4.000 rpm y 4 °C durante 20 min utilizando el rotor y la centrífuga Sorval Legend RT (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Canadá), se retiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1 mL de 2xYT y se extendió igualmente en 3 placas de Petri grandes con agar 2xYT/5 pg/mL de tetraciclina (2xYT/Tet). Las placas de Petri se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, los fagos amplificados se recuperaron de las placas de Petri grandes. Brevemente, se añadieron de 10 a 15 mL de PBS estéril (volumen agregado de acuerdo con la densidad de la colonia) a cada placa, las células se rasparon usando un esparcidor de vidrio y se recogieron en tubos Falcon estériles de 50 mL. Las células fueron raspadas una vez más como antes y agrupadas con las anteriores. La suspensión se fraccionó en sedimento celular y sobrenadante por centrifugación durante 20 minutos a 4.000 rpm y 4 °C usando un rotor y una centrífuga Sorval Legend RT (Thermo Fisher Scientific). Los fagos amplificados se purificaron del sobrenadante esencialmente como se describe (Lee et al., 2007). Brevemente, al sobrenadante del fago que fue prefiltrado con un filtro estéril de 0,22 pm se le añadió 1/5 de volumen de PEG-8000 al 20%/NaCl 2,5 M en tubos Falcon estériles de 50 mL, y la mezcla se incubó en hielo durante 1 h. La solución se centrifugó durante 20 minutos a 4.000 rpm y 4 °C utilizando un rotor y una centrífuga Sorval Legend RT (Thermo Fisher Scientific). El sedimento del fago se redisolvió en 3 mL de PBS estéril, se transfirió a un tubo Falcon estéril de 15 mL, se mezcló con 1/5 volúmenes de PEG-8000 al 20%/NaCl 2,5 M (0,6 mL) y se incubó en hielo durante 20 minutos. La solución de fago se centrifugó a 4.000 rpm y 4 °C durante 20 minutos usando un rotor y una centrífuga Sorval Legend RT (Thermo Fisher Scientific), y el sedimento de fago se disolvió en 0,5 - 1 mL de PBS estéril, el volumen de disolución depende del tamaño del sedimento. La solución de fago se dividió en partes alícuotas en volúmenes de 0,1 mL en un microtubo estéril de 1,5 mL. El título del fago amplificado se determinó como se describe a continuación.

Para la segunda ronda de barrido, en paralelo con el barrido convencional descrito anteriormente, también se realizó un barrido térmico en el que el fago amplificado en PBS estéril de la primera ronda se calentó a 65 °C durante 2 h en un microtubo estéril de 1,5 mL, posteriormente se centrifugó, y el sobrenadante del fago se añadió al pozo recubierto con lisozima humana para la unión (en la segunda ronda de barrido). Todos las etapas restantes fueron los mismos para ambos métodos de barrido. Se continuaron los barridos paralelos durante dos rondas más. Los lavados fueron 12x, 15x y 15x para la segunda, tercera y cuarta rondas de barrido, respectivamente.

El barrido (barrido convencional) contra albúmina de suero humano se realizó como se describe para lisozima humana, excepto que no se realizó un barrido térmico en paralelo. Después del barrido, se realizó un ELISA de fagos estándar (Harrison et al., 1996; Tanha et al., 2001; Hussack et al., 2012 (c)) en clones de placas de valoración (obtenidas de fagos eluidos) para identificar las V^l de despliegue en fagos positivas para la unión con lisozima humana o albúmina de suero.

Ejemplo 9b: determinación del título del fago

Se usaron técnicas estándar para determinar los títulos del fago. Para determinar el título del fago eluido, se realizaron diluciones del fago eluido en PBS a 10'1 - 10'4 (se añadieron 2 pL de fago a 18 pL de PBS para hacer la dilución 10'1 y así sucesivamente). Se mezclaron 10 pL de cada dilución con 100 pL de células E. coli TG1 en crecimiento exponencial (DO600 = ~0,5), y las mezclas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para que ocurriera la infección de las células E. coli TG1 por el fago. Las células TG1 infectadas se sembraron en placas de Petri con agar 2xYT/Tet y se incubaron a 37 °C durante la noche. El número de colonias se usó para determinar el título (ufc/mL) del fago eluido. Se realizó PCR de colonias en colonias para verificar la presencia de insertos (los resultados positivos dieron un tamaño de alrededor de 500 pb) y para proporcionar plantillas para la secuenciación de ADN usando cebadores fdTGIII y -96GIII (Tabla 6). Las secuencias fueron analizadas y manipuladas por DNASTAR Lasergene 8.

Brevemente, para determinar el título del fago amplificado (fago de entrada), se hicieron diluciones de fago a 10'3, 10' 6, 10'8 y 10'10. Se mezclaron 10 pL de cada fago diluido con 100 pL de células TG1 en crecimiento exponencial, y las mezclas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para que ocurriera la infección de las células por el fago. Posteriormente, usando esparcidores desechables estériles, las células infectadas con fagos se extendieron sobre placas de Petri con medio de agar 2xYT/Tet y se dejaron en una superficie limpia durante 5 minutos. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Por la mañana, los títulos de colonias en las placas se usaron para determinar el título del fago amplificado.

Para mostrar la utilidad de la biblioteca, la biblioteca se analizó contra la lisozima humana y la albúmina de suero humano durante cuatro rondas. En el caso del barrido contra la lisozima humana, se realizó un barrido convencional en la primera ronda seguido de barrido convencional y barrido térmico en paralelo a partir de la segunda ronda en adelante. En el enfoque de barrido térmico, el fago de entrada se incubó a 65 °C durante 2 h, se centrifugó para eliminar cualquier posible agregado, y el sobrenadante se añadió al pozo recubierto con lisozima para la unión. En el enfoque de barrido convencional, el fago de entrada (amplificado) se añadió directamente al pozo recubierto con lisozima sin el tratamiento térmico. El barrido térmico se aplicó para ver si se enriquece preferentemente para aglutinantes de V^l estables (termoestables y/o no agregados) en comparación con el barrido convencional que se esperaba que fuera indiscriminado con respecto a aglutinantes de V^l estables e inestables.

La Tabla 7 muestra los resultados del barrido contra lisozima humana con respecto al título del fago de salida (o el título del fago eluido). En general, los títulos de fagos de salida son 3 a 4 órdenes de magnitud más bajos para el enfoque de barrido térmico en comparación con el convencional. Esto puede deberse a los títulos de fagos de entrada más bajos utilizados y a una mayor pérdida de fagos (posiblemente agregando las V^l desplegadas en fagos) para agregación durante el tratamiento térmico (datos no mostrados).

Tabla 7. Títulos de fagos para barridos realizados a temperatura ambiente (barrido convencional) versus condiciones de selección de 65 °C-2 h (barrido térmico). Los datos son para barrido contra lisozima humana. ufc: unidades formadoras de colonias.

El ELISA de fagos y los análisis de secuencia de las rondas 3 y 4 identificaron 9 V^l de lisozima antihumana con afinidades variables a la lisozima humana inmovilizada (Figura 13 y Tabla 8). Después de 4 rondas de barrido, del total de 177 V^l (101 V^l y 76 V^l para las rondas 3 y 4, respectivamente) analizadas, sobrevivieron 5 clones del total de 9 identificados en la ronda 3: HVLHLRN; HVLHLDS; HVLHLNE; HVLHLNN; HVLHLFL (Figura 12). Estos se representaron en 54,2% y 25% para HVLHLRN y HVLHLDS, respectivamente, seguidos por 8,3%, 8,3% y 4,2% para HVLHLNE, HVLHLNN, y HVLh Lf L, respectivamente, en el enfoque de barrido térmico (65 °C, 2 h). Por el contrario, con el enfoque de barrido convencional (temperatura ambiente [RT]), HVLHLRN y HVLHLDS no estaban representados, y HVLHLNE, HVLHLNN, y HVLHLFL se produjeron con frecuencias relativas de 28,6%, 42,9% y 28,6%, respectivamente (Figura 12) HVLHLRN y HVLHLDS también fueron los clones predominantes en la ronda 3 de barrido térmico y marginalmente presentes en la ronda 3 del barrido convencional. HVLHLYS, HVLHLAQ, HVLHLQI, y HVLHl Em no se seleccionaron ni con el barrido convencional ni con el barrido térmico ni en el barrido de la ronda 4.

Tabla 8. Propiedades de las V^l de lisozima antihumana y de albúmina de suero antihumana aisladas de las rondas 3 ___________________________________y 4 del barrido^__________________________________

V_l K^d (MM T^m (°C) Monómero/Ag. Selección

HVLHLRN (SEQ ID NO: 101) 0,05 74 Monómero 65° HVLHLDS (SEQ ID NO: 100) 6,1 68,3 Monómero 65° HVLHLEM (SEQ ID NO: 104) >73 72,2 Monómero RT HVLHLAQ (SEQ ID NO: 103) 0,2 66,5 Ag. (7%) RT HVLHLQI (SEQ ID NO: 105) 2,6 62 Ag. (17%) RT HVLHLNE (SEQ ID NO: 102) 0,06 62 Ag. (13%) RT/ HVLHLYS (SEQ ID NO: 106) 6,4 66,8 Ag. (7%) RT HVLHLNN (SEQ ID NO: 99) 0,2 62,6 Ag. (12%) RT/ HVLHLFL (SEQ ID NO: 108 ND

ND

ND

RT/ HVLHSA1 (SEQ ID NO: 107) 0,8 71 Monómero RT

ND, no determinado; RT, temperatura ambiente; Ag., agregado. Los % son %

Después de 4 rondas de barrido contra la albúmina de suero humana, el cribado de 50 clones mediante ELISA de fagos y la secuenciación revelaron una V^l predominante, a saber, HVLHSA1 (Figura 13; Tabla 8) que fue positiva mediante ELISA de fagos para la unión a la albúmina de suero humana.

Todos los 10 aglutinantes de V^l de fagos antilisozima y antialbúmina se procesaron posteriormente para una caracterización adicional como se describe a continuación.

Ejemplo 9c: Caracterización biofísica de las VL de lisozima antihumana y albúmina de suero antihumana

Partiendo de los clones de V^l desplegados en fagos, se clonaron, expresaron y purificaron las V^l mediante técnicas estándar como se describió anteriormente para otros dominios de anticuerpos. Las V^l se analizaron posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el estado de agregación, mediante CD para termoestabilidad, y mediante resonancia de plasmón superficial para su afinidad y especificidad de unión.

Nueve V^l de lisozima antihumana y V^l de HVLHSA1 (Figura 13; Tabla 8) se clonaron y se expresaron en E. coli y se purificaron mediante técnicas estándar como se describe para otros dominios. Como las V^l tenían etiquetas His6 en sus terminales C, se purificaron por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado. La Figura 16A muestra los perfiles del cromatograma de IMAC de las V^l purificadas que muestra el intervalo de A280 de 400 mAU (HVLHLEM) a 2400 mAU (HVLHLRN) para los picos de elución más altos. Los perfiles SDS-PAGE de las V^l muestran que las V^l son muy puras (Figura 16B). El rendimiento de la expresión de HVLHSA1 también fue alto según su perfil de cromatograma de IMAC (datos no mostrados). Por lo tanto, las V^l pueden expresarse con altos rendimientos en E. coli con alta pureza.

Posteriormente, se analizó el comportamiento de agregación de las V^l mediante cromatografía de exclusión por tamaño SuperdexMR75. El % de agregación (o % de monómero) para cada V^l también se determinó como se describe (Arbabi-Ghahroudi et al., 2010). Como se muestra en la Figura 14A, 3 V^l de lisozima antihumana (HVLHLRN, HVLHLEM y HVLHLDS) eran puramente monoméricas (no agregadas), mientras que el resto de los aglutinantes de V^l se estaban agregando con % de agregados que variaban del 7% al 17% (Tabla 8) V^l de HVLHSA1 también se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño como se describe para otros dominios. El cromatograma produjo un pico monomérico simétrico que demuestra que la V^l era 100% monómero no agregado (Figura 14A; Tabla 8). Estos resultados muestran que las bibliotecas de V^l (o V^h) con la característica de enlace disulfuro Cys48/Cys64 (o Cys49/Cys69) no canónica producen aglutinantes no agregados.

Para obtener una medida de la termoestabilidad de los aglutinantes de V^l, las temperaturas de fusión (Tm) de las V^l se determinaron mediante CD como se describió anteriormente para otros dominios. La Figura 14B muestra los perfiles de fusión de las V^l de lisozima antihumana que están en el intervalo de 62 °C a 74 °C. Las Tm calculadas se registran en la Tabla 8. La Tm de HVLHSA1 antialbúmina también se determinó y se muestra que es alta: 71 °C (Figura 14B; Tabla 8). Estas Tm son significativamente más altas que las V^l sin el enlace disulfuro no canónico, lo que demuestra que las bibliotecas de V^l (o V^h) con la característica de enlace disulfuro Cys48/Cys64 (o Cys49/Cys69) no canónico producen aglutinantes más estables. En el caso del barrido de lisozima humana, HVLHLRN y HVLHLDS que no se agregan (Tabla 8) y tienen las Tm más altas también fueron los clones que se enriquecieron de manera muy significativa a través de la agregación, menos termoestables por barrido térmico y no por barrido convencional. Esto demuestra que si bien ambos enfoques de barrido producen aglutinantes termoestables no agregados, el barrido térmico es más eficiente para enriquecerlos. (El hecho de que HVLHLEM, que no era agregante y termoestable y, sin embargo, incluso no se seleccionó en la ronda 4 mediante barrido térmico, podría deberse a su muy baja afinidad durante la etapa de unión del barrido [Figura 12; Tabla 8]). La Figura 14C muestra que existe una fuerte correlación positiva entre Tm y % de monómero de las V^l antilisozima y antialbúmina (R2 = 0,8568; valor P (dos colas) = 0,0013, Spearman r = 0,9061), lo que significa que cuanto mayor sea la Tm de una V^l, más probable es que la V^l no se agregue. Esto también significa que, dado que las bibliotecas de V^l/V^h con la característica de enlace disulfuro no canónica producen aglutinantes de V^l/V^h más termoestables que las bibliotecas sin esta característica, también producen más aglutinantes de V^l/V^h no agregados. Como agentes terapéuticos, los aglutinantes de V^l/V^h no agregados y termoestables son más eficaces.

También se determinaron las afinidades (K^d) de las V^l de lisozima antihumana con su antígeno, la lisozima humana. La unión de la lisozima humana a los aglutinantes de V^l de lisozima antihumana inmovilizados se determinó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando BIACORE 3000 (GE Healthcare). 298 unidades de resonancia (RU), 312 RU, 295 RU, 339 RU, 315 RU, 412 RU, 370 RU, 345 RU y 349 RU de cada aglutinante de V^l (HVLHLAQ, HVLHLNE, HVLHLEM, HVLHLYG, HVLHLRN, HVLHLNN, HVLHLQI, HVLHLYS, y HVLHLDS, respectivamente) se inmovilizaron en un chip sensor CM5 de grado investigación. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a concentraciones de 10 pg/mL en acetato 10 mM a pH 4,5 usando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. La lisozima humana se pasó a través de una columna Superdex 75 (GE Healthcare) en regulador h BS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005%) con un caudal de 0,5 mL/min para eliminar cualquier posible agregado antes del análisis Biacore. Para los estudios de unión, los análisis se llevaron a cabo a 25 °C en HEPES 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005%. Los caudales utilizados fueron 20 pL/min. Para la regeneración, las superficies se lavaron durante 15 minutos con el regulador de operación. Los datos se analizaron con el software BIAevaluation 4.1. Los perfiles de unión y las K^d calculadas se muestran en la Figura 15 y la Tabla 8. A partir de los perfiles de SPR (Figura 15), se puede ver que las V^l de lisozima antihumana se unen de hecho a su antígeno objetivo, la lisozima, confirmando los resultados de unión obtenidos por ELISA de fagos. Las afinidades de unión calculadas (K^d) son diversas, con un buen número de ellas con altas afinidades (K^d = 0,05 pM - 0,2 pM).

La K^d de la V^l contra la albúmina de suero humano se determinó por resonancia de plasmón superficial como se describe para otros dominios anteriores. Brevemente, la unión de la V^l a la albúmina de suero humana inmovilizada se determinó mediante SPR usando el BIACORE 3000 (GE Healthcare). Aproximadamente 1.600 RU de albúmina de suero humano, 1.900 RU de albúmina de suero bovino y 2.200 RU de ovoalbúmina se inmovilizaron en un chip sensor CM5 de grado investigación. Se preparó una superficie bloqueada con etanolamina, como referencia, exactamente de la misma manera que las superficies proteicas. Las inmovilizaciones se llevaron a cabo a concentraciones de 20 pg/mL en regulador de acetato 10 mM pH 4,5 usando el kit de acoplamiento de aminas suministrado por el fabricante. La V^l se pasó a través de una columna Superdex 75 (GE Healthcare) para eliminar cualquier posible agregado antes del análisis Biacore. Para los estudios de unión, los análisis se llevaron a cabo a 25 °C en HEPES 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005%. Los caudales utilizados fueron de 40 pL/min y los volúmenes de muestra fueron de 60 pL. Para la regeneración, la superficie se lavó durante 10 minutos con el regulador de operación. Los datos se analizaron con el software BIAevaluation 4.1. La Figura 17 muestra claramente que la V^l se une a su antígeno objetivo, albúmina de suero humana. Se determinó que la K^d calculada era de 0,8 pM (Tabla 8). La unión fue específica ya que la V^l no se unió a la ovoalbúmina ni a la albúmina de suero bovino.

Por lo tanto, los resultados muestran que los dominios de V^h y V^l con enlaces disulfuro no canónicos son factibles como andamios para construir bibliotecas sintéticas de V^h/V^l que son fuentes de aglutinantes de antígenos con alta afinidad, estabilidad (no agregación y termoestabilidad), y rendimientos de expresión.

Ejemplo de referencia 10: Construcción de una biblioteca de despliegue en fagos de V^h estabilizada con disulfuro

Los experimentos se diseñaron para crear una biblioteca de despliegue en fagos de V^h con CDR aleatorizadas construidas en un andamio de V^h estabilizada por un enlace disulfuro adicional en las posiciones 49 y 69. Para construir la biblioteca, se usó una biblioteca de despliegue en fagos de V^h (HVHP430LGH3) como plantilla para introducir un enlace disulfuro adicional reemplazando dos residuos de aminoácidos seleccionados (49Ser y 69Ile) con cisteínas utilizando el método descrito anteriormente para la biblioteca de V^l y previamente (Sidhu et al., 2000; Hussack et al (c)). La biblioteca de despliegue en fagos de HVHP430LGH3 es una biblioteca con base en vectores de fagémidos con los genes de V^h humanos aleatorizados con CDR clonados en el fagémido pMED-1 y fusionados con el gen de la proteína 3. (Publicación PCT WO2009/079093 "dominios de V^h humanos no agregados").

El procedimiento para construir la biblioteca de despliegue en fagos de V^h estabilizados con disulfuro se realizó esencialmente como se describió anteriormente y en Hussack et al., (c) y Sidhu et al., 2000). Brevemente, la construcción se realizó mediante dos rondas separadas de mutagénesis dirigida al sitio en los dos residuos de aminoácidos seleccionados para ser reemplazados por cisteínas. En primer lugar, se preparó dU-ADNcs (ADN de fago de cadena sencilla que contiene uridina) usando E. coli CJ236 infectado con fago (4 x 1012 ufc (unidad formadora de colonias)) de la biblioteca de HVHP430LGH3. Después de confirmar la incorporación de uridina en el dU-ADNcs mediante la determinación de títulos contra E. coli TG1 y CJ236 como se describió anteriormente y en Hussack et al (c), una serie de reacción de síntesis de ADN in vitro que incluye la fosforilación del cebador KT124 para hibridación para mutagenizar 49Ser por 49Cys, ligación y polimerización se realizaron posteriormente usando 20 |jg del dU-ADNcs. La reacción de síntesis de ADN in vitro dio como resultado 23 jg de ADN heterodúplex en total. Las siguientes 10 transformaciones separadas usando 50 jL de células competentes E. coli TG1 con 564 ng del ADN heterodúplex para cada transformación produjo la diversidad de 1,1 x 1010 ufc en total. Las selecciones clonales por PCR con cebadores (M13RPa o b y -96GIII) revelaron que aproximadamente el 50% (8 de 16) de los clones tenían la mutación 49Ser por 49Cys. Para la siguiente ronda de mutagénesis, se preparó el fago de la biblioteca de fagémidos mutados 49Ser por 49Cys ((HVHP430LGH3C1)) rescatándolos con fago auxiliar M13K07, lo que resultó en el título de fago de 2,1 x 1013 ufc/mL. Posteriormente, se preparó dU-ADNcs a partir de E. coli CJ236 usando el fago (4 x 1012 ufc) de (HVHP430LGH3C1) que fue seguido por una reacción de síntesis de ADN in vitro con 8 jg del dU-ADNcs y el cebador KT125 que se hibrida para mutagenizar otro residuo de aminoácido (69Ile por 69Cys), dando como resultado 12 jg de ADN heterodúplex en total. Las siguientes 22 transformaciones separadas usando 50 jL de células competentes E. coli TG1 con 230 ng del ADN heterodúplex para cada transformación produjo un tamaño de biblioteca de 5,3 x 109 ufc en total. Para determinar el porcentaje de la biblioteca que representa los genes de V^h que tienen mutaciones dobles (49Ser por 49Cys y 69Ile por 69Cys), se seleccionaron 65 colonias por PCR con cebadores (M13RP a o b y -96GIII), se secuenciaron y analizaron, revelando que 28% (18 de 65) de los clones tenían mutaciones dobles (49Ser por 49Cys y 69Ile por 69Cys), 35% (23 de 65) tenían mutaciones sencillas (49Ser por 49Cys), 15% (10 de 65) tenían la mutación sencilla 69Ile por 69Cys, y 22% (14 de 65) no tenían mutaciones. Por lo tanto, el tamaño de la biblioteca con ambas mutaciones Cys (HVHP430LGH3C2) se corrigió a 1,5 x 109 ufc (= 5,3 x 109 x 28%) de acuerdo con el resultado de la selección clonal. La biblioteca de despliegue en fagos HVHP430LGH3C2 se amplificó en 300 mL de 2xYT, las células de la biblioteca se resuspendieron en 15 mL de glicerol al 10%, y posteriormente se mantuvieron como alícuotas de 1 mL a -80°C.

La diversidad de la biblioteca es alta (5,3 x 109 transformantes) con las mutaciones estabilizadoras adicionales 49Ser por 49Cys y 69Ile por 69Cys en todos sus miembros de V^h. La biblioteca debería proporcionar aglutinantes con alta estabilidad a los antígenos objetivo, debido a la presencia de enlaces disulfuro Cys49/Cys69 en sus miembros de V^h, utilizando las técnicas de selección y barrido estándar conocidas en el arte.

Referencias

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(b) . Hussack, G., Keklikian, A., Alsughayyir, J., Hanifi-Moghadam, P., Arbabi-Ghahroudi, M., van Faassen, H., Hou, S. T. , Sad, S., MacKenzie, R., y Tanha, J. A VL single-domain antibody library yields a high-propensity of non-aggregating binders. Protein Eng Des Sel. Junio de 2012; 25(6): 313-8. doi: 10.1093/protein/gzs014. Epub abril 6 de 2012.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un andamio de inmunoglobulina sintética que comprende uno o más de un enlace disulfuro no canónico en la región marco (FR), en la que el andamio es una cadena ligera variable (VL) y está en el formato de un dominio variable único de inmunoglobulina con tres CDR, en el que el enlace disulfuro no canónico se forma entre un residuo de Cys en la posición 46-49 de la región FR2 y un residuo de Cys en la posición 62-66 de la región FR3 de una V^l, en la que dicho enlace disulfuro no canónico proporciona una estabilidad mejorada en comparación con el andamio de inmunoglobulina sin dicho enlace y en el que la numeración se refiere a la numeración de Kabat.

2. El andamio de la reivindicación 1, en la que el andamio es parte de una proteína o fragmento de anticuerpo más grande seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo de un solo dominio (sdAb), scFv, Fab, F(ab)² o inmunoglobulina madura.

3. El andamio de la reivindicación 1, en la que el andamio de inmunoglobulina deriva de una V^l humana.

4. El andamio de la reivindicación 1 en el que la V^l es de la familia kappa o lambda.

5. El andamio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los andamios son multimerizados.

6. El andamio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el andamio se fusiona con un fragmento Fc, una secuencia de direccionamiento, una secuencia señal y una etiqueta de purificación, o cualquier combinación de las mismas.

7. El andamio de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el andamio de inmunoglobulina comprende las regiones marco de secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

o s e cu e n c ia s su s ta n c ia lm e n te id é n tica s a las m ism as, que re tie n e n los e n la ces d isu lfu ro ca n ó n ico s y no c a n ó n ico s y en las que los re s id u o s que co m p re n d e n C D R 1, C D R 2 y C D R 3 p u e de n se r c u a lq u ie r se cu e n c ia ad e cua d a .

8. Un ác id o n u c le ico que c o d ifica el a n d a m io de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7.

9. Un v e c to r de e xp re s ió n que co m p re n d e el ác ido nuc le ico de la re iv in d ica c ió n 8.

10. U na cé lu la u o rg a n ism o hu é spe d que c o m p re n d e el v e c to r de e xp re s ió n de la re iv in d ica c ió n 9.

11. U na b ib lio te ca re c o m b in a n te que co m p re n d e al m en o s un a n d a m io co m o se d e fine en la re iv in d ica c ió n 1 o 2, en la que el a n d a m io c o m p re n d e a d e m á s una m u ltip lic id a d de se cu e n c ia s de C D R a d e cua d a s , en las que la m ultip lic id a d de se cu e n c ia s de C D R p ro p o rc io n a una d ive rs id a d de al m en o s 105, al m en o s 106, al m en o s 107, y h asta 108 c lo n e s p o r b ib lio teca .

12. El a n d a m io de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7, en la que el a n d am io está in m o v iliza d o so b re una superfic ie .

13. El a n d am io de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7, en la que el a n d a m io e stá e n la za d o a una m o lé cu la de carga.

14. U na co m p o s ic ió n que c o m p re n d e el a n d a m io de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7.