CN101939333A - 非聚集性人vh结构域 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非聚集性VH结构域或其文库。VH结构域在至少一个互补决定区(CDR)中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸和酸性等电点(pI)。增加对非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法包括结合选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤淘选基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库。还提供了包含非聚集性VH结构域的物质的组合物以及使用方法。

Description

非聚集性人VH结构域
发明领域
本发明涉及抗体重链可变结构域。特别地，本发明涉及非聚集性人VH结构域以及制备和使用其的方法。
发明背景
抗体在鉴定及中和病原体的诊断和临床应用中起着重要作用。从成对的重链和轻链多肽构建抗体。当抗体正确折叠时，各链折叠成通过更加线性的多肽序列连接的许多不同球状结构域。例如，轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)结构域。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。通常，VH和VL是最佳抗原结合所必需的，虽然已显示重链二聚体和氨基末端片段在轻链不存在的情况下可保持活性。
轻链和重链可变区负责结合靶抗原，并因此可显示抗体之间的显著序列多样性。恒定区显示较少的序列多样性，其负责结合许多天然蛋白质以引发重要的生物化学事件。抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇，从而确定抗体对其靶抗原的特异性。大部分序列变异性发生在互补决定区(CDR)。总共存在6个CDR，每可变重链和轻链各3个，称为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。CDR外的区域称为构架区(FR)。抗体的该特征结构提供了免疫系统可基于其发掘大量抗原结合多样性以获得对于大量抗原的特异性的稳定支架。
骆驼(骆驼，单峰骆驼和美洲驼(llama))的免疫库(repertoire)是独特的，因为其具有罕见类型的称为重链抗体的抗体(Hamers等人，1993)。此类抗体缺乏轻链，从而它们的结合部位(combining site)由一个结构域组成，称为VHH。在鲨鱼中也观察到单结构域抗体(sdAb)，称为VNAR。
sdAb提供了优于来源于常规四链抗体的单链Fv(scFv)片段的几个有利方面。单结构域抗体在亲和力方面与它们的scFv对应物相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性(refoldability)、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。sdAb的许多上述特性在涉及抗体的应用中是令人期望的。然而，天然发生的sdAb(骆驼VHH和鲨鱼VNAR)的非人性质由于免疫原性的原因限制了它们在人中的使用。在这方面，人VH结构域(″VH″)是人中免疫疗法的理想候选物。虽然可通过只基于结合特性(作为选择标准)的淘选从文库(例如，噬菌体展示文库)分离天然发生的单结构域抗体(Arbabi-Ghahroudi等人，1997；Lauwereys等人，1998)，但在人VH的情况下，事实并非如此，因为它们在溶液中易于形成高分子量聚集体。
一直以来都在尝试分离非聚集性VH(Davies等人，1994；Tanha等人，2001；Tanha等人，2006；Jespers等人，2004a；To等人，2005)。一个现有技术方法包括噬菌体展示文库和连续步骤：将文库经历加热以使噬菌体展示的VH变性；冷却；以及在淘选的结合阶段靶向抗原(Jespers等人，2004a)。具有可逆去折叠特征的VH在冷却步骤中重新获得它们的结合，随后在结合步骤中被选择，而具有不可逆变性特征的VH(其包括不溶性VH)由于聚集而丧失，从而被除去。使用基于噬菌体载体的噬菌体展示文库进行所述方法。然而，该方法需要VH在噬菌体表面上的多价展示；已证明该方法对于基于噬菌体载体的展示文库是有效的，但在用基于噬菌粒载体的系统提供的单价展示形式中是无效的(关于噬菌体展示系统和它们的特征，参见Winter等人，1994；Bradbury和Marks，2004)。
期望分离抗原特异性的、可溶的和结构上稳定的VH以用于临床和诊断应用。因此，在本领域内存在对非聚集性人VH结构域和产生非聚集性人VH结构域的方法的需要，所述非聚集性人VH结构域减少了现有技术的不利方面。
发明概述
在一个方面，本发明包括抗体重链可变(VH)结构域。考虑到与已知的VH结构域和分离其的方法相关的问题，新型人VH结构域已进行了工程改造，其展示有益于临床和诊断应用的特性。
因此，在一个方面，本发明包括非聚集性人VH结构域或其文库，其在至少一个互补决定区中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸，并且具有酸性等电点。
VH结构域可以是可溶性的，能够进行可逆热去折叠，或能够结合蛋白A。VH结构域可在CDR1中具有至少1个半胱氨酸，和/或其可在CDR3中具有至少3个半胱氨酸。VH可在一个CDR内(例如CDR内)或CDR之间(例如CDR间)形成非典范(non-canonical)二硫键。此类CDR内或CDR间二硫键可形成伸出的环(extended loop)。VH可以是酶抑制剂，并且可通过由二硫键形成的伸出的环(或CDR)进行抑制。
在另外的实施方案中，本发明的VH可以以在CDR1的位点32上存在酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸)为特征。VH结构域还可具有低于6的酸性等电点。
在本发明的另一个方面，非聚集性VH结构域或其文库包含人构架序列和至少一个来自不同物种的CDR；例如，VH结构域可包含人构架序列和骆驼CDR序列。备选地，在另外的非限定性实例中，VH结构域可包含人构架序列、人CDR1/HI、人CDR2/H2和骆驼CDR3/H3。
非聚集性VH结构域或其文库还可包括混合的随机化的序列或文库。
在另一个实施方案中，非聚集性VH结构域或其文库包含选自SEQ IDNO：24-90、SEQ ID NO：101-131、SEQ ID NO：132-162的任一个和其组合的序列。
在另外的方面，本发明可包括非聚集性VH结构域或其文库，其可基于人VH种系序列，例如1-f VH区段、1-24VH区段和3-43VH区段。备选地，本发明的VH和其文库可基于骆驼VHcDNA或骆驼种系VH区段(具有酸性pI)。在另一个备选方案中，VH和其文库可基于骆驼VHH cDNA或骆驼种系VHH区段(具有酸性pI)。
在另一个实施方案中，VH结构域包括huVHAm302(SEQ ID NO：15)、huVHAm309(SEQ ID NO：17)、huVHAm316(SEQ ID NO：19)、huVHAm303(SEQID NO：164)、huVHAm304(SEQ ID NO：16)、huVHAm305(SEQ ID NO：15165huVHAm307(SEQ ID NO：166)、huVHAm311(SEQ ID NO：167)、huVHAm315(SEQID NO：18)、huVHAm301(SEQ ID NO：163)、huVHAm312(SEQ ID NO：168)、huVHAm320(SEQ ID NO：171)、huVHAm317(SEQ ID NO：170)、huVHAm313(SEQID NO：169)、huVHAm431(SEQ ID NO：23)、huVHAm427(SEQ ID NO：21)、huVHAm416(SEQ ID NO：20)、huVHAm424(SEQ ID NO：175)、huVHAm428(SEQID NO：22)、huVHAm430(SEQ ID NO：176)、huVHAm406(SEQ ID NO：172)、huVHAm412(SEQ ID NO：173)或huVHAm420(SEQ ID NO：174)中的一个。
在一个实施方案中，从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离VH结构域。VH结构域的分离可包括增强选择非聚集性VH结构域的能力或效率的选择步骤。
在特定的实施方案中，本发明提供了VH结构域或其文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)保持CDR3的位点99和100d上的Cys；c)随机化CDR3的剩余的14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸残基94；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
在另一个方面，本发明包括VH结构域文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)位点93-102(93/94-CDR3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VHH；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明包括VH结构域或其文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)CDR3包括选自SEQ ID NO：24-90和SEQ ID NO：33-63的序列；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
在另一个方面，本发明还提供了通过下列步骤增加非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示产生文库；和
b)使用噬菌体-VH结构域文库和结合靶进行淘选，
其中该方法包括选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤。选择步骤可以是将噬菌体-VH结构域文库经历热变性/复性的步骤，其可在淘选步骤(步骤b))之前发生。备选地，选择步骤可以是在淘选(步骤b))之后发生的测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH的步骤。在另一个备选方案中，选择步骤可包括热变性/复性和测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH。
在一个实施方案中，该方法还可包括从基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库分离特定VH结构域的步骤。
在备选实施方案中，该方法可包括步骤：
c)提供基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pI的VH结构域支架产生文库；
d)使用噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选；和
e)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH结构域。
用于所述方法的VH结构域支架可基于具有酸性pI的人种系序列、骆驼VH cDNA、具有酸性pI的骆驼种系VH区段、骆驼VHH cDNA、或具有酸性pI的骆驼种系VHH区段。可从基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库分离特定VH结构域。上述方法还可包括从基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库分离特定VH结构域的步骤。
在另一个方面，本发明包括编码本发明的VH的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述核酸或载体的宿主细胞。在另一个方面，VH可在宿主包括但不限于任何酵母株系中表达。
在另一个方面，本发明包括药物组合物，所述组合物以使VH结构域与抗原结合的有效量包含一种或多种VH结构域，和可药用的赋形剂。
在另一个方面，本发明包括VH结构域用于制备药剂的用途，所述药剂用于通过结合抗原来治疗或预防医学病状。
本发明还提供了治疗患者的方法，其包括对需要治疗的患者施用包含一种或多种VH结构域的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了包括一种或多种VH结构域以及用于检测和确定一种或多种VH结构域与生物学样品中特定抗原的结合的一种或多种试剂的试剂盒。
本发明的VH还可用于高通量筛选测定，例如微阵列技术，其中VH结构域的使用由于其大小和稳定性而优于常规IgG。
本发明的实施方案对基于噬菌粒的VH噬菌体展示文库使用热变性淘选方法。基于噬菌粒载体的噬菌体展示系统提供了优于基于噬菌体载体的系统的许多有利方面，包括易用性、分离高亲和力结合剂的适合性以及快速抗体表达和分析。此外，辅助噬菌体的使用导致多价展示(Rondot等人，2001；Baek，等人，2002；Soltes等人，2003)，从而导致结合剂的高产率、更少的淘选轮次和更有效的富集。此外，对于噬菌粒载体系统，单价与多价形式之间的转换可通过使用合适类型的辅助噬菌体随意地实现(Rondot等人，2001；O′Connell等人，2002；Kirsch等人，2005)。
本发明的VH以非聚集性和可逆热去折叠特性为特征。本发明的方法将对由基于噬菌体载体的展示文库提供的上述生物物理学特性的选择(Jespers，等人，2004)与用噬菌粒载体构建大容量文库的方便结合在一起，从而导致通过进入更大序列空间来对非聚集性结合剂进行更有效的选择。本方法通过以多价展示形式(使用热变性)和以单价展示形式交替进行淘选还可用于同时选择(i)非聚集性和(ii)高亲和力。所描述的选择方法可用于具有上述特征的噬菌粒文库以改善对非聚集性结合剂，以及对具有可逆热去折叠特性的结合剂的富集。
本发明展示了热变性方法(Jespers等人，2004)至从噬菌粒载体形式的巨大的合成人VH文库选择非聚集性VH的成功扩展。当使用hyperphage(M13KO7ΔpIII辅助噬菌体)和使用热变性步骤通过噬菌体拯救(phage rescue)以多价展示形式进行淘选时，文库产生显示可逆热去折叠的非聚集性VH。选择以富集具有酸性pI和/或CDR1-CDR3间二硫键的VH为特征。文库设计包括增加酶抑制性VH在文库中的频率的特征。
根据下列描述，本发明的另外的方面和有利方面将很显然。详细描述和实施例表示本发明的优选实施方案，且仅以举例说明的方式给出，因为根据本发明的教导，本发明范围内的各种变化和变动对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图概述
现将参考附图通过举例描述本发明的这些和其他特征，其中：
图1举例说明(i)通过未还原/烷基化的(unred/alk)和还原/烷基化的(red/alk)HVHP430 VH的质谱法获得的分子质量特征谱和(ii)HVHP430和4种抗α淀粉酶VH的烷基化反应/质谱实验的结果。基于所有CDR Cys残基参与二硫键形成的假定计算二硫键的数目的理论值。二硫键的“总数”是CDR内/CDR间二硫键和Cys 22与Cys 92之间的典范二硫键的和。
图2A显示HVHP430的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，随机化的残基以下划线标示。H1(高变环1)横跨残基26-32(GFTFSNY；SEQ ID NO：177)(Chothia，等人，1992)。CDR1(互补决定区1)与H1交迭并且横跨残基31-35(NYAMS；SEQ ID NO：178)。CDR和构架区(FR)的名称和编号根据Kabat等人(1991)。
图2B显示人VH噬菌体展示文库的构建的示意性步骤。
图3显示pMED1噬菌粒载体的图谱，多克隆位点和其紧邻的周围区域的核苷酸序列示于(ii)。RBS，核糖体结合部位；L，左；R，右；HA，血凝素；fd，丝状噬菌体，fd。
图4显示通过以单价展示形式(A)或多价展示形式(使用热变性步骤)(B)淘选抗α淀粉酶的VH文库而分离的VH的大小排阻层析谱。(A)huVHAm455(点线)高度沉淀，从而产生低吸光度信号。(B)huVHAm304：点划线；huVHAm309：点线；huVHAm428：实线；huVHAm416：虚线。(C)显示提高的峰分辨率的图4B的放大。
图5显示举例说明VH的聚集倾向(以它们的单体含量的百分比表示)的图。
图6显示确定由huVHAm302的位点32上的琥珀密码子编码的氨基酸的本体的步骤。(A)通过质谱法确定的huVHAm302的序列。空格确定了FR与CDR之间的边界(参见图2A)。通过使用nanoRPLC-MS/MS分析huVHAm302的胰蛋白酶消化物所确定的肽序列以粗体标示(也参见图6B)。发现位点32上的琥珀密码子编码E(下划线标示的)。huVHAm302的N末端被确定为焦谷氨酸(pyroQ)。根据m/z 939.50(2+)处的占优势的双质子化离子的MS/MS光谱(数据未显示)获得N-末端胰蛋白酶酶解的肽序列，pyroQVQLVESGGGLIKPGGSLR(SEQ ID NO：179)。此外，来自m/z 1413.71(11+)处的质子化蛋白质离子的CID的N末端片段离子也显示huVHAm302的N末端为pyroQ(数据未显示)。确定的蛋白质分子量(15,541.2Da)也表明蛋白质的N末端为焦谷氨酸。来自LSEEDLNHHHHHH(SEQ ID NO：180)的m/z 585.91(3+)处的C末端胰蛋白酶酶解的肽离子在DDA实验的全谱扫描(survey scan)中占优势。未观察到在C末端组氨酸后附有氨基酸的肽。此外，进行m/z 1413.71(11+)处的蛋白质离子[M+11H]11+的碰撞诱导解离(CID)，从蛋白质的C末端片段离子获得C-末端胰蛋白酶酶解的肽序列VTVSSGSEQKLSEEDLNHHHHHH(SEQ IDNO：181)(MS/MS数据未显示)。(B)关于胰蛋白酶酶解的肽LSCamAASGDTVSDESMTWVR(SEQ ID NO：13；huVHAm302的残基20-38)的m/z 1036.47(2+)处的双质子化离子的MS/MS谱。位点32上的琥珀编码的氨基酸E以下划线标示。质谱实验还显示CDR3Cys残基形成了二硫键。
图7显示通过利用热变性法淘选抗α淀粉酶的VH文库而分离的VH(huVHAm431、huVHAm416)的SDS-PAGE分析(箭头表示二硫键介导的二聚体VH。R：还原的；NR：非还原的)。
图8显示sensorgram叠加，其显示天然(粗线)和重折叠(细线)的huVHAm309(A)和huVHAm416(B)以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1和2μM(huVHAm309)以及0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2和4μM(huVHAm416)与固定的蛋白A的结合。
图9显示通过对VH(通过针对α淀粉酶的热变性淘选法鉴定的)进行ELISA产生的结合分析，(A)VH对固定的α淀粉酶(点柱)和牛血清白蛋白BSA(方格柱)的结合和(B)辣根过氧化物酶-蛋白A缀合物与固定的VH和BSA对照的结合。在A和B中，与BSA的结合为背景水平。
图10显示确定抗α淀粉酶VH的酶抑制活性的方面。(A)α淀粉酶活性，测量为ΔA405nm，作为时间的函数。对于淀粉酶结合剂huVHAm302(实心正方形)可看到明显的抑制，对于对照VH HVHP430(实心三角形)没有看到明显的抑制。(B)在不同浓度的抗α淀粉酶VH存在的情况下α淀粉酶的残留活性。只有huVHAm302在所有测试VH浓度下起着酶抑制剂的作用。实心正方形：huVHAm302；空心正方形：huVHAm428；实心圆：huVHAm304；空心圆：huVHAm416。
图11A-F是举例说明亚家族VHH1、VHH2和VHH3的大羊驼(L.glama)cDNA VHH、单峰驼(C.dromedarius)cDNA VHH、种系VHH区段和种系VH区段、人种系VH区段和HVHP430文库VH的理论pI分布的图。
图12A显示来自美洲驼VHH CDR3质粒文库的CDR3序列的样品，来源于VHH2亚家族的CDR3序列由星号标记；半胱氨酸残基以下划线标示。编号系统是由Kabat等人(1991)描述的编号系统。图12B显示来自美洲驼VHH CDR3质粒文库的CDR3序列的样品的长度分布；水平线表示平均CDR3长度以及中值(M)。
图13显示来自HVHP430LGH3VH噬菌体展示文库的VH的样品的CDR3长度分布，其中分析了31个VH；水平线表示平均CDR3长度以及中值(M)。
图14显示酸性人种系VH区段的序列。
发明详述
本发明涉及抗体重链可变结构域。特别地，本发明涉及非聚集性人VH结构域和分离其的方法。
本发明包括在至少一个互补决定区中具有至少1个形成二硫键的半胱氨酸并且具有酸性等电点的非聚集性人VH结构域和其文库。所描述的VH结构域还可以是可溶性的，能够可逆热去折叠的和/或能够结合蛋白A的。VH结构域可在CDR1中包含至少一个半胱氨酸。所描述的VH结构域可在CDR3中包含至少3个半胱氨酸。
VH可展示高溶解度和/或可逆热去折叠。它们还可能能够结合蛋白A。在特定的非限定性实施方案中，人VH结构域具有低于6的等电点。本发明的VH结构域和其文库还可在H1/CDR1的位点32或H1/CDR1中或H1/CDR1、H2/CDR2或H3/CDR3中的其他位点上包含Asp或Glu。
如本文中所使用的，“VH结构域”或“VH”是指抗体重链可变结构域。该术语包括天然发生的VH结构域和已通过选择或工程改造进行了改变(以改变它们的特征，包括例如稳定性或溶解度)的VH结构域。该术语包括能够用作VH结构域的同源物、衍生物或片段。
如对于本领域技术人员来说是已知的，VH结构域包括3个“互补决定区”或“CDR”；通常，各CDR是可变重链内与其他CDR组合以形成抗原结合部位的区域。在本领域内熟知的是CDR促成抗原决定簇的结合和识别。然而，可能并非所有CDR是结合抗原所必需的。例如，但不期望限于，1、2或3个CDR可促成本发明的VH结构域对抗原的结合和识别。VH结构域的CDR在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3。
根据Kabat编号系统进行本发明的VH结构域中氨基酸的编号，所述编号系统是指Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)中根据抗体的汇编(compilation)用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。该系统对于本领域技术人员来说是熟知的，并且对于给定的抗体可通过在抗体序列的与“标准”Kabat编号的序列具有同源性的区域上进行比对来确定。根据Kabat编号，VH中CDR的位置如下：CDR1-残基31-35B；CDR2-残基50-65；和CDR 3-残基95-102。
VH结构域也以与CDR交迭的高变区(标记为H1、H2和H3)为特征。H1定义为残基26-32，H2定义为52-56，以及H3定义为残基95-102(http://www.bioinf.org.uk/abs/)。高变区直接参与抗原结合。
本发明的VH结构域和其文库在至少一个CDR中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸。术语“形成二硫键的半胱氨酸”意指通过它们的巯基的氧化与另一个半胱氨酸形成“二硫桥”(也称为“二硫键合”或“二硫键”)的半胱氨酸。不期望受理论束缚，二硫桥帮助蛋白质和酶保持它们的结构构型。特别地，VH结构域包含典范(即，高度保守的)的Cys 22与Cys 92之间的二硫键。除了该典范二硫键外，本发明的VH包含至少1个非典范二硫键。后者可以在VH结构中的任何非典范位置上；例如，非典范二硫键可在构架区中，CDR中，高变环中或其任何组合中。
在一个实施方案中，存在偶数数目的形成二硫键的Cys。例如，但不期望以任何方式限于，在CDR1中可存在至少一个形成二硫键的Cys；在另一个非限定性实例中，在CDR3中可存在至少一个Cys；在另一个非限定性实例中，在CDR3中可存在至少3个Cys。VH结构域的形成二硫键的Cys可形成CDR内二硫键或CDR间二硫键。例如，但不期望限于，VH的CDR3中的Cys残基形成CDR内二硫键；在另一个非限定性实例中，VH的CDR1和CDR3中的Cys残基形成CDR间二硫键。
此外，不期望受理论束缚，本发明的VH的CDR中非典范二硫键可用于产生酶抑制剂；特别地，二硫键可形成突出的CDR环，特别地CDR3环，用于接近隐蔽表位或酶活性部位。也已显示非典范二硫键在单结构域抗体稳定性(Nguyen等人，2000；Harmsen等人，2000；Muyldermans等人，1994；Vu等人，1997；Diaz等人，2002)中以及在就新型拓扑学和增加的库多样性塑造结合部位中是非常重要的。
从制药观点来看，针对牵涉许多疾病状态的病理生物学的酶和蛋白酶的基于抗体的抑制剂的产生是特别有益的。由于它们的预期较低的免疫原性、较小的尺寸、和稳定性，人VH结构域对于治疗应用是优良的。
然而，人VH结构域在溶液中倾向于形成高分子量聚集体。此类聚集体包括不如单体可溶的结构并且显示与其他分子或表面的非特异性相互作用(有时称为“粘性”)。VH结构域可形成二聚体或多聚体或高分子量聚集体，此类结构没有一种是期望的或有用的。术语“非聚集性”是指减少的VH结构域形成此类聚集体的倾向或VH结构域不能形成此类聚集体。本发明的VH结构域是非聚集性的。这可通过在凝胶过滤柱例如但不限于SuperdexTM 75柱上洗脱来验证，其中VH结构域基本上是单体。“基本上是单体”是指95％、96％、97％、98％、99％或100％的VH结构域洗脱为单体。优选，本发明的非聚集性VH结构域是稳定的并且不随时间流逝而沉淀。
本发明的VH结构域和其文库还具有酸性pI。术语″pI″或″等电点″是指VH结构域不携带净电荷时的pH。一般地，当pH为pI时，溶解度最低。酸性等电点可低于7；例如，酸性pI可低于7、6、5、4、3、2或1，或其间的任何值，或在由这些值描述的范围之内；在非限定性实例中，本发明的VH结构域的pI低于6。中性pI是7，碱性pI高于7。不期望受到限定，本发明的VH结构域的酸性pI主要源于非随机化的区域，包括例如，构架区。
本发明的VH的“溶解度”是指其溶解于溶剂中的能力，如根据平衡时溶解在溶剂中的溶质的最大量测量的。本发明的VH在单体形式上是可溶的，并且无粘性。所描述的VH结构域在水性缓冲液例如但不限于Tris缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液或水中是可溶的。
本发明的VH还可展示“可逆热去折叠”。热去折叠是指温度诱导的分子从其天然折叠构象至二级去折叠构象的去折叠。如果分子可从二级去折叠构象恢复至其天然折叠构象，那么热去折叠是可逆的。通过分子的热重折叠效率(TRE)测量可逆热去折叠。上述非聚集性VH结构域可显示比聚集性VH结构域更高的TRE且更有效地重折叠成它们的天然状态。本发明VH去折叠所处的温度将随VH的性质和其熔化温度而变化。通常，大多数VH将在高于60℃、高于85℃或高于90℃的温度下去折叠。在非限定性实例中，本发明的VH可能能够在于高于80℃或甚至高于90℃的温度下进行延长的温育后重新获得抗原特异性。
VH还可结合蛋白A(其对于本领域技术人员来说是熟知的分子)。通常将蛋白A偶联至其他分子而不影响抗体结合部位；例如，但不期望限于，可将蛋白A偶联至荧光染料、酶、生物素、胶体金、放射性碘和磁性胶乳(latex)和琼脂糖珠粒。还可将蛋白A固定至固体支持物上和用作可靠方法用于从混合物例如从血清、腹水或细菌提取物纯化免疫球蛋白，或将其与上述分子之一偶联以检测抗体的存在。可将本发明的VH结合蛋白A的能力用于VH纯化和在诊断测试、免疫印迹和免疫组织化学中用于检测。
VH结构域的文库也包括在本发明内。VH结构域文库可包括许多种展示形式，包括噬菌体展示、核糖体展示、微生物细胞展示、酵母展示、逆转录病毒展示或微珠展示形式或任何其他合适的形式。
本发明的VH和天然发生的骆驼VHH和鲨鱼VNAR单结构域抗体的分析显示在展示高溶解度和可逆热去折叠方面的类似性。通过pI的分析(参见实施例8)，现发现骆驼VHH库具有丰富的具有酸性pI的克隆(53％酸性对43％碱性)。在种系克隆(单峰驼)中，VH库主要由具有碱性pI的VH区段组成，然而VHH库的情况恰好相反，其主要包含具有酸性pI的VHH区段。目前还观察到人种系VH库中绝大部分VH区段(92％)是碱性的。因此，目前已确定了VH溶解度与酸性pI之间的明确关系；虽然并非所有非聚集性VH是酸性的，但酸性VH是非聚集性的。因此，可通过使用酸性支架进行文库构建和/或使随机化偏向酸性残基和/或偏离碱性残基来增加文库中非聚集性VH的比例。
本发明的VH结构域和其文库还可在CDR1、CDR2和/或CDR3中包括酸性氨基酸。例如，但不期望限于，VH结构域和其文库可在H1/CDR1的位点32或在H1/CDR1中或在H1/CDR1、H2/CDR2或H3/CDR3中其他位点上包括Asp或Glu。
本发明的VH结构域和其文库可基于本领域内已知的任何合适的VH序列。术语“基于”是指使用“支架”作为起始VH结构域，通过本发明的方法获得VH结构域。本领域技术人员可容易地理解，虽然VH结构域文库可基于单个支架或许多支架，但可随机化CDR/高变环。这样，可获得大量VH结构域，其中序列在随机化区域中变化；这在本领域内称为VH结构域的“库”或“文库”。VH结构域库中的VH结构域可各自识别相同或不同的表位。此外，本发明的VH结构域所基于的支架可具有非聚集性VH结构域的一个或多个上述特征。
在特定的非限定性实例中，本发明的VH结构域基于具有酸性pI的VH序列。本发明的VH结构域可基于具有酸性pI的任何人种系序列，特别地来自VH3家族的序列，以及更特别地具有蛋白A结合活性的序列；例如，但不被认为是限定性的，VH结构域可基于人种系序列1-f VH区段、1-24VH区段和3-43VH区段(参见图14；SEQ ID NO：182-184)。备选地，VH结构域可基于骆驼VH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VH区段。用作文库支架的酸性骆驼种系VH区段可以是本领域内已知的任何此类区段；在特定的非限定性实例中，VH区段可以是Nguyen等人，2000中描述的区段。在另外的备选实例中，所描述的VH和其文库可基于骆驼VHH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VHH区段。用作文库支架的酸性骆驼VH或VHHcDNA或种系序列可以是本领域内已知的任何此类序列；例如，但不限于Harmsen等人(2000)，Tanha等人(2002)中描述的此类序列，Nguyen等人(2000)中在具有NCBI登录号AB091838-AB092333的VHH的库中的此类序列，或人序列的VBASE数据库中的此类序列(Medical ResearchCouncil，Centre for Protein Engineering)。
本发明的VH结构域和其文库还可基于在CDR1、CDR2和/或CDR3中还包含酸性氨基酸的支架。在非限定性实例中，支架可在H1/CDR1的位点32上，或H1/CDR1中或H1/CDR1、H2/CDR2或H3/CDR3中的其他位点上包含Asp或Glu。
本发明的VH结构域和其文库还可基于嵌合支架；例如，但不期望限于，嵌合支架可在人构架序列上包含一个或多个骆驼或鲨鱼CDR/高变环序列。在特定的非限定性实例中，嵌合支架在人VH构架(人CDR1/H1和CDR2/H2)上包含骆驼CDR3/H3环。嵌合抗体结构域在本领域内是熟知的，用于获得它们的方法在本领域内也是熟知的。
在特定的非限定性实例中，本发明提供了VH结构域或其文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)保持CDR3的位点99和100d上的Cys；c)随机化CDR3的剩余14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸残基94；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。在另外的非限定性实例中，提供了VH结构域文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)位点93-102(93/94-CDR3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VHH；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。在另一个非限定性实例中，提供了VH结构域或其文库，其中a)VH结构域基于HVHP430(SEQ ID NO：1)；b)CDR3包含选自SEQ ID NO：24-90和SEQ ID NO：33-63的序列；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
本发明的文库中的非聚集性VH的比例，如上所述，可以比常规文库中的大。
在另一个方面，本发明的VH结构域和其文库可以是混合的随机化文库。在该类型的文库中，通过使用随机化的寡核苷酸和本领域内已知的方法体外产生CDR。
在一个实例中，通过使用本发明的方法分离非聚集性、可重折叠的VH。其中，3种具有酸性pI，且2种具有形成CDR1-CDR3间二硫键的CDR1Cys残基。此外，3种在它们的CDR3中具有一对Cys的VH(以及亲本支架，HVHP430)形成CDR3内二硫键。然而，在一个实施方案中，包含横跨CDR1至CDR3的非典范二硫键的本发明的VH在淘选的重折叠步骤中比具有CDR3内二硫键或只具有Cys22与Cys92之间的典范二硫键的VH更有效地重折叠成它们的天然结构。因此，可在淘选的结合步骤中有利地选择此类VH。此外，大多数非聚集性的可重折叠VH具有低于6的理论pI，这可能是由于高于pI6(和特别地更接近于pI7)的VH变得易于聚集(因为它们的净电荷接近于0)。在9种利用热变性方法分离的VH中，4种具有最低溶解度的VH中，有3种具有大约7.0(6.4-7.3)的pI。
本发明的VH可以是展示本文中描述的期望的特征的任何VH。在特定的非限定性实例中，人VH结构域可包括huVHAm302(SEQ ID NO：15)、huVHAm309(SEQ ID NO：17)、huVHAm316(SEQ ID NO：19)、huVHAm303(SEQID NO：164)、huVHAm304(SEQ ID NO：16)、huVHAm305(SEQ ID NO：15165huVHAm307(SEQ ID NO：166)、huVHAm311(SEQ ID NO：167)、huVHAm315(SEQID NO：18)、huVHAm301(SEQ ID NO：163)、huVHAm312(SEQ ID NO：168)、huVHAm320(SEQ ID NO：171)、huVHAm317(SEQ ID NO：170)、huVHAm313(SEQID NO：169)、huVHAm431(SEQ ID NO：23)、huVHAm427(SEQ ID NO：21)、huVHAm416(SEQ ID NO：20)、huVHAm424(SEQ ID NO：175)、huVHAm428(SEQID NO：22)、huVHAm430(SEQ ID NO：176)、huVHAm406(SEQ ID NO：172)、huVHAm412(SEQ ID NO：173)或huVHAm420(SEQ ID NO：174)中的一个。在另一个非限定性实例中，人VH结构域或其文库包括选自SEQ ID NO：101至131，或132-162中的任一个的序列，或选自图12A中显示的那些(SEQID NO：24-90)中的任一个的序列，或其组合。
本文中描述的VH结构域可通过下文中描述的新方法获得。在非限定性实例中，可从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离VH结构域。使用完全合成设计的基于噬菌粒的噬菌体展示文库，然后进行以富集具有本文中提及的期望的特性的人VH为特征的选择是之前未曾用于人VH的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了通过下列步骤增加非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体的表面上的多价展示来产生文库；和
b)使用噬菌体-VH结构域文库和结合的靶进行淘选，
其中该方法包括选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤。在一个实例中，选择步骤可在淘选步骤之前发生，并且可包括将噬菌体-VH结构域文库经历热变性/复性步骤。备选地，选择步骤可在淘选后发生，并且可包括测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH。在另一个备选实例中，进行热变性/复性步骤和测序步骤。
例如，但不期望限于，增加非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法可包括：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生文库；
b)将基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库经历热变性/复性步骤；和
c)使用噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选。
在另一个非限定性实例中，增加非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法可包括：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生文库；
b)使用噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选；和
c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH结构域。
上述方法可包含随后的淘选轮次；例如，可进行2、3、4、5、6、7、8、9或10轮淘选。所述方法还可包括通过扩增编码VH结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体；在允许编码VH结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特异性的VH结构域来分离特定的VH结构域。
可通过本领域内已知的任何方法制备基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库。例如，但不期望限于，可通过下列来制备文库：将噬菌粒(各自包含编码VH结构域的核酸)插入细菌种类；将细菌种类与hyperphage接触，并且将细菌种类经历用于感染的条件；和，将噬菌粒插入的和hyperphage-感染的细菌种类经历用于产生噬菌体-VH结构域文库的条件。
用于本发明的方法的“噬菌粒”是通过修饰质粒衍生的载体，其包含噬菌体的复制起点以及质粒复制起点。噬菌粒包含丝状噬菌体gIII或其片段；在该实例中，编码VH结构域的核酸以与全长或截断的gIII产物(pIII)融合的形式表达并且通过pIII在噬菌体颗粒上展示。噬菌粒还包含编码VH结构域的核酸；各噬菌粒可包含编码VH结构域的库的不同成员的核酸。噬菌粒至细菌种类的插入可通过本领域内已知的任何方法来进行。
噬菌粒中编码的VH结构域可基于任何合适的VH序列。VH结构域支架可以是本领域内已知的任何合适的支架。在特定的非限定性实例中，本发明的VH结构域基于具有酸性pI的VH序列。本发明的VH结构域可基于具有酸性pI的任何已知的人种系序列，特别地来自VH3家族的序列，和更特别地具有蛋白A结合活性的序列；例如，但不被认为是限定性的，VH结构域可基于人种系序列1-fVH区段，1-24VH区段和3-43VH区段(参见图14)。备选地，VH结构域可基于骆驼VH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VH区段。用作文库支架的酸性骆驼种系VH区段可以是本领域内已知的任何此类区段；在特定的非限定性实例中，VH区段可以是Nguyen等人，2000中描述的VH区段。在另一个备选实例中，所描述的VH和其文库可基于骆驼VHH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VHH区段。用作文库支架的酸性骆驼VHH cDNA可以是本领域内已知的任何此类cDNA；例如，但不限于，VH区段可以是Harmsen等人(2000)，Tanha等人(2002)中描述的VH区段，具有NCBI登录号AB091838-AB092333的VHH的库中的VH区段或Nguyen等人(2000)中的VH区段。上文中描述了VH结构域可基于的各种其他支架。如本领域技术人员所公认的，虽然文库中VH结构域可基于支架，但由于选择的区域的随机化，大量不同的VH结构域存在于文库中。本发明的文库中非聚集性VH的比例可比常规文库中的大。
可将噬菌粒插入任何合适的细菌种类和株系；本领域技术人员熟悉此类细菌种类和株系。不期望受到限定，细菌种类可以是例如大肠杆菌(E.coli)；在另一个非限定性实例中，大肠杆菌株系可以是TG1、XL1-blue、SURE、TOP10F’、XL1-Blue MRF’或ABLE
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K。用于将噬菌粒插入细菌种类的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
在如上文中刚刚描述的本发明的方法中，通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生使用的文库。这可通过将已将噬菌粒插入其中的细菌种类与hyperphage接触，然后将细菌种类经历用于感染的条件来实现。
“Hyperphage”是一种类型的辅助噬菌体，其具有野生型pIII表型，从而能够以高效率感染F(+)大肠杆菌细胞；然而，它们的功能性pIII基因的缺乏意味着噬菌粒编码的pIII-抗体融合物在噬菌体组装中是pIII的唯一来源。这导致在它们的表面上携带抗体片段的噬菌体颗粒的比例有相当大的增加和导致噬菌体颗粒多价展示抗体片段。在一个非限定性实例中，hyperphage可以是M13KO7ΔpIII。然而，其他合适的同源物可用于本发明的方法；例如，但不期望以任何方式限于，Ex-phage(Baek等人，2002)或Phaberge(Soltes等人，2003)。
hyperphage感染细菌种类的条件在本领域内是熟知的；例如，但不期望以任何方式限于，所述条件可以是Arbabi-Ghahroudi，等人(2008)或Rondot等人(2001)中描述的条件，或适合于hyperphage感染细菌的任何其他条件。
然后将感染的细菌种类经历用于产生噬菌体-VH结构域文库的条件。此类条件在本领域内是熟知的；例如，但不期望限于，合适的条件描述于(Arbabi-Ghahroudi，等人，2008；Harrison，等人，1996)中。
在本发明的方法中，使用噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选。如对于本领域技术人员来说是已知的，“淘选”是指其中将丝状噬菌体展示的抗体文库(例如，本发明的噬菌体-VH结构域文库)的库暴露于目的靶(或“抗原”)的过程。靶可以是固定的或可获得的，或可在固体表面上，溶液中，细胞表面上，或可以是任何其他合适的形式。可通过不同方法包括用含有去垢剂例如Tween 20的缓冲液充分清洗来去除非结合的噬菌体-抗体；备选地，可利用链霉抗生物素蛋白磁珠捕获出结合至生物素化的靶的噬菌体。然后可利用本领域内熟知的方法从靶中洗脱结合的噬菌体-抗体。然后可在F+细菌宿主中扩增(繁殖)洗脱的噬菌体抗体。可在1轮或多于1轮的淘选中进行选择和扩增的过程；例如，可进行2，3，4，5，6，7，8，9或10轮淘选。这导致抗体-噬菌体结合剂至靶的特异性富集和导致单特异性抗体(例如VH结构域)的分离。用于淘选的条件对于本领域技术人员来说是熟知的；例如，条件可以是Marks等人(1991)，Griffiths等人(1994)，或Sidhu等人(2004)，Hoogenboom(2002)，Bradbury(2004)中描述的条件或任何其他合适的条件。
用于淘选步骤的“靶”可以是任何合适的选择的靶。例如，靶可以是大体上纯化的抗原、缀合至分子例如生物素或类似分子的抗原、部分纯化的抗原、细胞、组织；靶还可以是固定的或可获得的，或可在固体表面上，在溶液中，在细胞表面上或可以是任何其他合适形式(参见Hoogenboom，2005)。抗原与例如生物素的缀合使得选择步骤容易进行和更有效，和需要低得多的量的纯化抗原。还可基于所得的基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库或VH结构域的期望的特异性选择靶。靶可以是任何类型的目的分子；例如，靶可以是酶、细胞表面抗原、TNF、白细胞介素、ICAM家族中的分子等。本领域技术人员将容易地理解，通过本文中描述的方法获得的VH结构域文库可被导向任何目的靶或具有治疗重要性的靶。例如，但不期望以任何方式进行限定，酶可以是α淀粉酶、碳酸酐酶或溶菌酶。
本发明的方法还可包括选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤。
在一个实施方案中，选择步骤可在淘选步骤之前发生并且可包括将噬菌体-VH结构域文库经历热变性/复性步骤。该步骤包括VH结构域的热去折叠，随后重折叠成它们的天然构象，并且可通过本领域内已知的任何方法来进行；参见例如Jespers等人(2004)。例如，但不期望限于，可将噬菌体-VH结构域文库在大约55℃至大约90℃的范围内的温度下经历变性；温度可以是55、60、65、70、75、80、85或90℃，或其间的任何温度。在一个实施方案中，噬菌体-VH结构域文库保持在该升高的温度下，进行大约1分钟至大约30分钟的范围内的时间；例如但不期望限于，温度可保持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟，或其间的任何时间。然后，通过将温度返回至更低的温度，例如室温或更低，4或5℃(进行与用于变性的时间相似的时间)来将噬菌体-VH结构域文库经历复性。本领域技术人员公认，噬菌体-VH结构域文库中VH变性所处的温度将取决于VH结构域的性质和它们的熔化温度。此外，本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，可将更高的变性温度与更短的暴露时间组合；类似地在其他实施方案中，可将更低的变性温度与更长的暴露时间组合。可以在本领域内已知的任何合适的水性缓冲液中进行变性/复性步骤；例如，但不期望以任何方式进行限定，缓冲液可以是Tris缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液或水。
在另一个实施方案中，该方法可包括测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH的步骤。非聚集性VH结构域的该筛选步骤基于可通过本领域内已知的任何方法确定的理论pI值。例如，但不期望限于，可利用可商购获得的软件包确定理论pI。如之前所描述的，本发明已显示具有酸性pI的VH可以是可溶性的和非聚集性的。基于只通过DNA测序获得的pI值从聚集性VH中筛选非聚集性VH结构域避免了对大量VH的亚克隆、表达、纯化和生物物理学表征的需要。
在另外的实施方案中，进行热变性/复性步骤和测序步骤。
本文中描述的方法还可包括通过下列来分离特定VH结构域：扩增编码回收的噬菌体-VH结构域中的VH结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体；在允许编码VH结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特异性的VH结构域。用于进行此类步骤的方法和特定条件对于本领域技术人员来说是熟知的。
上述方法是使用基于噬菌粒载体的噬菌体展示(通过使用hyperphage产生)和基于热变性或理论pI的分析的选择步骤的新型组合。该新型方法可增加选择非聚集性人VH的效率。在非限定性实例中，本方法可选择包含非典范二硫键的VH结构域，如上文所描述的；不期望限于，非典范二硫键可在CDR1和/或CDR3中发生。在另一个实例中，上述方法可选择具有酸性pI的VH结构域。
与基于噬菌体载体的系统相比较，本方法的基于噬菌粒载体的噬菌体展示系统提供了许多有利方面，包括：使构建大文库(其在非免疫文库的情况下是期望的)变得容易；适合于从免疫或亲和力成熟文库中分离高亲和力结合剂；使用于提高亲和力或生物物理学性质的操作变得容易；和易于从抗体-pIII融合物转换至未融合的抗体片段(以进行快速抗体表达和分析)。此外，在本发明的方法中导致多价展示(Rondot等人，2001；Baek，H.等人，2002；Soltes，G.等人，2003)的辅助噬菌体，例如，hyperphage(M13KO7ΔpIII)的使用，提供了由基于噬菌体载体的展示系统给予的有利方面(由于亲合力效应)，包括：结合剂的高产率和淘选的更少轮次(O′Connell等人，2002)；抗细胞表面抗原的抗体的更有效富集；和用于选择针对需要自交联的细胞表面受体的抗体的适合性(Becerril等人，1999；Huie等人，2001)。此外，对于噬菌粒载体系统，可通过使用合适类型的辅助噬菌体容易地进行单价与多价形式之间的转换(Rondot等人，2001；O′Connell等人，2002；Kirsch等人，2005)。为了进一步利用基于噬菌粒的文库在选择非聚集性VH方面提供的有利方面，我们决定使用hyperphage技术(Rondot等人，2001)以使上述热变性策略(Jespers等人，2004)适应于基于噬菌粒的文库。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过下列步骤增加非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法，包括：
a)提供基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pI的VH结构域支架产生文库；
b)使用噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选；和
c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH结构域
可通过本领域内已知的任何方法制备基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库。例如，但不期望限于，可通过下列来制备文库：将噬菌体载体(各自包含编码VH结构域的核酸)插入细菌种类；和，将噬菌体载体-插入的细菌种类经历用于产生噬菌体-VH结构域文库的条件。
″噬菌体载体″是指通过修饰噬菌体基因组衍生的载体，其包括噬菌体的复制起点但不包括质粒的复制起点；噬菌体载体可以具有或可以不具有抗生素抗性标记。
用于产生基于噬菌体载体的噬菌体展示文库的方法在本领域内已良好建立，并且对于本领域技术人员来说是熟知的。
本文中描述的方法还可包括通过下列来分离特定的VH结构域：扩增编码回收的噬菌体-VH结构域中的VH结构域的核酸序列；将扩增的核酸序列克隆入表达载体；在允许编码VH结构域的核酸表达的条件下用表达载体转化宿主细胞；和回收具有期望的特异性的VH结构域。用于进行这些步骤的方法和特定条件对于本领域技术人员来说是熟知的。
本发明还涉及融合至货物分子(cargo molecule)的本发明的VH。如本文中所使用的，“货物分子”是指为了靶向、增加亲和力、提供第二功能或否则提供有益效应的目的的任何分子。货物分子可具有与本发明的VH相同或不同的特异性。例如，但不期望限于，货物分子可以是：毒素、抗体的Fc区域、完整抗体或酶(如在抗体导向的酶前体药物疗法(ADEPT)的背景中(Bagshawe，1987：2006))；具有相同或不同特异性的一种或多于一种的单结构域例如VH、VL、VHH、VNAR等；用于靶向的药物递送的脂质体；治疗性分子，放射性同位素；或提供期望的作用的任何其他分子。将货物分子偶联或附着至本发明的VH结构域的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
本发明的方法和VH结构域文库不必限于噬菌体展示技术，其还可扩展至其他形式。例如，但不期望限于，本发明的方法和VH结构域文库可以是核糖体和mRNA展示、微生物细胞展示、逆转录病毒展示、微珠展示等(参见Hoogenboom，2005)。用于进行这些类型的展示方法的条件在本领域内是熟知的。
还可以以多聚体形式重组产生本发明的VH；在非限定性实例中，VH可产生为二聚体、三聚体、五聚体等。以多聚体形式存在的本发明的VH的提供可增加VH的亲和力。存在于多聚体形式中的单体单位可具有相同的或不同的特异性。
本发明还包括编码本发明的VH的核酸。如本文中所使用的，“核酸”或“多核苷酸”包括核酸、寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸和其任何片段、变体或衍生物。核酸或多核苷酸可以是双链的、单链的或三链的DNA或RNA(包括cDNA)或遗传或合成来源的DNA-RNA杂交体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合以及碱基包括但不限于腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、肌苷、黄嘌呤和次黄嘌呤的任何组合。可将核酸或多核苷酸与碳水化合物、脂质、蛋白质或其他材料组合。可使用本领域技术人员已知的多种技术之一(包括但不限于具有相应于目的核苷酸序列的部分序列的序列或其变异序列的寡核苷酸的自动化合成)，利用可商购获得的寡核苷酸合成仪例如AppliedBiosys tems Model 392 DNA/RNA合成仪来化学合成目的核酸序列。
本发明的VH的核酸还可包含在载体中。可使用任何合适的载体，并且本领域技术人员对该主题十分熟悉。
本发明还提供了包含上述核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何合适的宿主细胞，例如，但不限于大肠杆菌或酵母细胞。合适的大肠杆菌株系的非限定性特定实例是：TG1、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。
本发明的VH结构域可具有对于临床和诊断应用来说是期望的特性。在一个实施方案中，可使用可检测的标志物或标记来标记VH。可使用多种标记技术之一(包括本领域内已知的过氧化物酶、化学发光标记以及本领域内已知的放射性标记)来进行抗体的标记。本发明的可检测的标志物或标记可以是例如非放射性或荧光标志物例如生物素、荧光素(FITC)、吖啶、胆固醇或羧基-X-罗丹明，其可使用本领域内已知的荧光和其他成像技术来检测。备选地，可检测的标志物或标记可以是放射性标志物包括例如，放射性同位素。放射性同位素可以是发射可检测的辐射的任何同位素。由放射性同位素发射的放射性可通过本领域内熟知的技术来检测。例如，来自放射性同位素的γ发射可使用γ成像技术，特别地闪烁成像技术来检测。此外，还可通过与绿色荧光蛋白(GFP)、RFP、YFP等的融合来进行检测。
本发明的VH还可用于高通量筛选测定例如微阵列技术，其中VH结构域的使用是有利的或提供了与常规IgG相比有用的另一选择。
在另一个方面，本发明提供了以将其结合至抗原的有效量包含一种或多于一种的VH和可药用的赋形剂的药物组合物。合适的药物赋形剂对于本领域技术人员来说是熟知的。
在另外的实施方案中，本发明提供了治疗患者的方法，包括给需要治疗的患者施用包含一种或多种VH的药物组合物。对于本领域技术人员来说，很显然的是文库例如本文中公开的文库可以是靶的结合剂的来源。因此，它们可用于治疗、诊断和检测。可被本发明的VH结构域靶向的适应症是癌症(用于肿瘤标志物的检测和/或任何癌症的治疗)、炎性疾病(其包括通过抗体调节靶分子、杀死靶细胞、阻断分子相互作用)、自身免疫疾病(例如，狼疮、类风湿性关节炎等)、神经退行性疾病(例如帕金森氏病、阿尔茨海默病等)、由朊病毒、病毒、细菌和真菌因子引起的感染性疾病或，一般地由任何已知的或未知的微生物或因子引起的感染导致的任何感染性疾病。靶可包括特异于给定的疾病状态的任何分子。例如，但不期望以任何方式限定，靶可包括：细胞表面抗原、酶、TNF、白细胞介素、ICAM家族中的分子等。根据本发明获得的文库还可用于获得用于检测病原体的VH结构域。病原体可包括人、动物或植物病原体例如细菌、真细菌、古细菌、真核微生物(例如，原生动物、真菌、酵母和霉菌)、朊病毒、病毒和生物毒素(例如，细菌或真菌毒素或植物凝集素)。本领域技术人员易于理解，通过本文中描述的方法获得的VH结构域文库可被导向任何目的靶。在非限定性实例中，靶可以是酶；在另外的实例中，但不期望限于，酶可以是溶菌酶、α淀粉酶或碳酸酐酶。
在另一个方面，本发明预期提供可用于检测和确定一种或多于一种的VH与生物学样品中特定抗原的结合的试剂盒。试剂盒包括一种或多于一种的VH和一种或多种试剂。可标记一种或多于一种的VH结构域。此外，试剂盒还可包含阳性对照试剂。还可包括试剂盒的使用说明书。
本发明的VH结构域还可用于抗体微阵列技术。该技术是常规免疫测定的另一选择，并且可平行进行数千个测定。抗体VH结构域在该类型的测定中优于完整IgG，因为它们是小的、稳定的且高特异性的试剂。用于抗体微阵列的方法在本领域内是熟知的。
本发明将在下列实施例中得到进一步说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明目的并且不应当用于以任何方式限定本发明的范围。
实施例
除非另外指出，否则使用标准克隆技术(Sambrook等人，1989)进行分子生物学工作。通过引入第二非相容性Sfi I位点和6个His密码子来修饰噬菌粒pHEN4(Arbabi-Ghahroudi等人，1997)。将称为pMED1的新型载体用于噬菌体展示文库的构建。将pSJF2H质粒用于单结构域抗体在大肠杆菌中的可溶性表达。除了其以与His6而非His5融合的形式表达蛋白质外，pSJF2H与pSJF2(Tanha等人，2003)相同。
实施例1：HVHP430 VH文库的构建
构建完全合成的基于噬菌粒的人VH噬菌体展示文库。
当在HVHP430支架(图2A，SEQ ID NO：1)上构建VH文库时，保持2个CDR3 Cys以促进CDR内二硫键的形成，从而增加文库中酶抑制性VH的频率。随机化剩余的14个CDR3位点、位点94以及8个H1/CDR1位点(图2A)。让CDR2保持不变，因为已显示其参与蛋白A结合(Randen等人，1993；Bond等人，2003)。除此以外，缺乏CDR2的VNAR(Stanfield等人，2004)或利用它们的CDR1和CDR3(Decanniere等人，1999)或只利用CDR3(Desmyter等人，2001)进行抗原识别的骆驼VHH显示纳摩尔的亲和力。按照图2B中显示的方案用噬菌粒载体(图3)构建文库。
将人VH HVHP430(其在CDR3中在位点99和100d上具有2个Cys残基)(To等人，2005)用作构架以通过随机化CDR1和CDR3中以及位点94上的残基构建文库。使用含有HVHP430基因的质粒(作为模板)和引物对HVHBR1-R/HVHFR2-F和HVHBR3-R/HVHFR5-F(关于使用的引物的列表，参见表1)，利用标准聚合酶链式反应(PCR)构建了2个分别具有随机化的H1/CDR1和94/CDR3密码子的交迭片段。
表1.用于VH克隆的引物的列表。
  名称   序列
 HVHBR1-R(SEQ ID NO：4)   5’-CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’
 HVHFR2-F(SEQ ID NO：5)   5’-GAGCCTGGCGGACCCAGSYCATANHSTNAKNGNTAANSNTAWMTCCAGAGGCTGCACAGGAG-3’
 HVHBR3-R(SEQ ID NO：6)   5’-TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAG-3’
 HVHFR5-F(SEQ ID NO：7)   5’-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAADASBNMNNMNNMNNMNNGCAMNNMNNMNNMNNACAMNNMNNMNNMNNWSYCACACAGTAATACACAGCCGT-3’
 HVHFR4-F(SEQ ID NO：8)   5’-CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCC-3’
 HVHP430Bam(SEQ ID NO：9)   5’-TTGTTCGGATCCTGAAGAGACGGTGACCAT-3’
 HVHP430Bbs(SEQ ID NO：10)   5’-TATGAAGACACCAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3’
 M13RP(SEQ ID NO：11)   5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’
将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick GelExtractionTM试剂盒(QIAGEN Inc.，Mississauga，ON，Canada)凝胶纯化亚片段。使用HVHBR1-R和HVHFR4-F引物，通过重叠延伸拼接PCR(splice overlap extension-PCR)(Aiyar等人，1996)拼接和随后扩增亚片段。使用QIAquick PCR PurificationTM试剂盒(QIAGEN Inc.)纯化构建的VH产物，然后用Sfi I限制性内切核酸酶进行消化。平行地，用Sfi I限制性内切核酸酶，然后用Pst I和Xho I来切割pMED1噬菌粒载体，使用QIAquick PCR PurificationTM试剂盒纯化线性化的载体。进行连接和转化(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。使用总共84μg载体和11μg VH插入物以1∶1.5的载体对插入物的摩尔比在总共1mL的体积中进行连接，在转化之前使用QIAquick PCR PurificationTM试剂盒除去连接混合物的盐分。通过将50μL TG1细胞与1μL连接产物混合来进行总共105个转化。扩增文库并且将其冷冻贮藏。确定文库的功能容量(functional size)。除了用5x1010个文库细胞接种500mL2xYT/Amp/1％葡萄糖培养基和在500mL而非300mL推荐的培养基中进行过夜噬菌体扩增外，根据Arbabi-Ghahroudi等人(2009)进行文库噬菌体产生。VH与在它们的N末端上的PelB前导肽和在它们的C末端上的His6-标签、HA-标签、琥珀终止密码子和fd基因III符合读框。VH在噬菌体表面上的单价展示基于使用辅助噬菌体M13KO7进行超感染。
文库样品(n＝36)的DNA测序显示独特的克隆，其在期望的位点上具有突变并且无缺失的VH变种。
实施例2：淘选和噬菌体ELISA
A.以单价展示形式进行的淘选
在第一淘选尝试中，将辅助噬菌体M13KO7用于超感染，从而导致VH在噬菌体表面上的单价展示(O′Connell等人，2002)。初始目的是探索文库在产生酶抑制剂中的可行性。如下文所述，针对α淀粉酶、溶菌酶和碳酸酐酶进行4轮淘选。
将于100μL PBS中的总共50μg的抗原(溶菌酶、α淀粉酶和碳酸酐酶)用于包被MaxisorpTM孔(Nunc，Roskilde，Denmark)，在4℃下进行过夜。然后除去溶液，通过加入200μL的于PBS中的3％BSA并且在37℃下温育孔2小时来封闭孔。除去封闭试剂，向各孔中加入1012个文库噬菌体(输入)，将孔在37℃下温育2小时。除去上清液，用0.1％PBST(0.1％v/v的于PBS中的Tween 20)清洗孔7次。为了洗脱结合的噬菌体，向各孔中加入100μL三乙胺(100mM于H2O中，每天新配制的)，然后在室温下温育10分钟。为了中和噬菌体溶液，将洗脱的噬菌体转移至装有100μL 1M Tris-HCl缓冲液pH 7.5的管中并且进行混合。噬菌体用于在37℃下感染2mL的在LB培养基中指数生长的TG1细菌细胞，进行15分钟(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。取出2μL的感染的细胞以确定洗脱的噬菌体(输出)的滴度，并且向剩余部分中加入6mL的2xTY。以50μg/mL的终浓度加入氨苄青霉素，将培养物在37℃下以220rpm温育1小时。通过以20∶1的噬菌体对细胞的比加入M13KO7辅助噬菌体或hyperphage并且在不振荡的情况下在37℃下温育混合物30分钟，然后在振荡的情况下温育1.5小时来超感染细胞。将细胞转移至装有92mL的2xTY培养基的培养瓶中。分别以100和50μg/mL的终浓度加入氨苄青霉素和卡那霉素，然后将培养物以250rpm在37℃下温育过夜。纯化噬菌体并且对其进行滴定(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)，然后将其用作输入以进行第二轮淘选。对于第二、第三和第四轮淘选，分别使用总共40、30和20μg的抗原。输入噬菌体对于所有轮次都相同，但清洗次数对于第二轮增加至9次，对于第3轮增加至12次以及对于第4轮增加至15次。
来自不同轮次的80个克隆的测序显示，主要富集了位点35上的Gly(很可能由于Gly35赋予VH有利的生物物理学特性)(Jespers等人，2004a)。然而，40％以上的VH具有琥珀终止密码子(TAG)，几乎全部在CDR1的位点32上。琥珀终止密码子在噬菌体宿主大肠杆菌TG1中被读为Glu(参见下文)。
在淘选后，利用噬菌体ELISA(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)就与它们的靶抗原的结合检测10-20个第4轮的克隆；分别地，6/20，10/10和19/20对于与溶菌酶、α淀粉酶和碳酸酐酶的结合是阳性的。将12种VH(3种α淀粉酶结合剂、4种溶菌酶结合剂和5种碳酸酐酶结合剂)亚克隆入载体，在1L培养物中表达和经历SuperdexTM 75凝胶过滤层析以检查它们的聚集状态。没有一种VH是完全单体的，范围从低至12％和16％的单体至最佳85％(中值：78％)(图4A和5)。此外，几种VH在它们纯化后不久于4℃下沉淀。
B.使用热变性以多价展示形式进行的淘选
使用VH噬菌体展示文库的淘选的结果显示，只基于结合的选择在产生功能性结合剂中不是有效的。使用之前显示从VH噬菌体展示文库有效地产生非聚集性结合剂的热变性方法(Jespers等人，2004a)。已显示所述方法由于其多价呈现而与基于噬菌体载体的文库但不与单价展示形式的基于噬菌粒的文库一起起作用。因此，为了具有多价展示形式的基于噬菌粒的噬菌体展示文库，使用hyperphage而非辅助噬菌体进行超感染(Rondot等人，2001)。
为了利用热变性进行选择，使用多价展示形式的输入噬菌体(即，通过使用hyperphage进行超感染来产生噬菌体)。将输入噬菌体在80℃下加热10分钟，然后在4℃下冷却20分钟，在微量离心机中以最大速度离心20分钟，将上清液加入至抗原包被的孔中以进行结合。利用热变性法进行针对α淀粉酶的3轮淘选。还平行地进行非处理淘选作为对照。在3轮淘选后，对于各条件，利用噬菌体ELISA检测20个克隆，发现所有克隆都结合α淀粉酶(数据未显示)。在单个集落上进行单克隆噬菌体ELISA(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。将ELISA阳性克隆经历DNA测序以鉴定它们的VH(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。使用软件Laser gene v6.0(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)测定VH的等电点pI。此处获得的pI值(高2％)与其他地方报导的pI值(Jespers等人，2004a)之间存在小差异。
将所有40个克隆经历DNA测序，结果显示在处理和非处理VH之间没有序列重叠。除了2个在非热处理克隆之中的VH外，其余的VH在位点35上具有非Ser残基，主要为Gly。此外，所有VH在它们的CDR1(位点32)和/或CDR3中具有琥珀终止密码子，并且如之前一样，琥珀密码子主要在位点32上。与非处理的淘选(其与以单价展示形式进行的淘选相似，不产生重复克隆)不同，在热变性下进行的淘选产生出现多于一次的VH(表2，huVHAm302，huVHAm309，huVHAm316)，这表明在热性下选择具有非随机性特征。只对热变性下的那些继续进行淘选。测定来自第4轮的27个ELISA阳性克隆的序列，在9个新鉴定的VH中，8个具有琥珀终止密码子(表2)。有趣地，对于第3轮的所有克隆和4个克隆，位点32(如果其不被琥珀密码子占据)包含Asp(D)或Glu(E)，这表明位点32上的酸性残基对于VH稳定性和非聚集性的重要性。对于其他合成的文库，已观察到对具有琥珀密码子的结合剂(scFv)的偏好性富集(Marcus，W.D.等人，2006a)(Marcus，W.D.等人，2006b)(Yan，J.P.等人，2004)。与不具有琥珀密码子的VH相比较，在大肠杆菌TG1中具有琥珀密码子的VH的减少的表达应当给展示这样的VH的噬菌体提供生长优势，从而导致它们的优先选择。
选择以对(i)在它们的CDR中具有形成二硫键的半胱氨酸(Cys)和(ii)具有酸性等电点(pI)的VH的富集为特征。在第3轮淘选后，就具有酸性pI和/或在它们的CDR中具有偶数数目的Cys残基(其中1个CDR1Cys与1或3个CDR3 Cys残基匹配(表2))的VH富集文库。此外，从2个固定的CDR3 Cys残基缺失1个Cys或向其加入1个Cys，再加上CDR1Cys，以使Cys的总数分别保持2个或4个。极常见地，骆驼和鲨鱼单结构域具有非典范Cys残基，其几乎不变地成对出现以形成二硫键(许多在CDR1与CDR3之间)。来自未经淘选的文库的36个已测序的VH中没有一个具有酸性pI或在它们的CDR1和CDR3中具有成对的Cys残基的事实进一步突出了对上述2个特性的强选择。
表2的说明：
CDR1和3中的星号表示在噬菌体宿主大肠杆菌TG1中读为Glu(E)的琥珀终止密码子。
#在FR中观察到突变。
Figure BPA00001185329500301
理论pI。
Figure BPA00001185329500302
热重折叠效率。
Nd，未确定的。
Figure BPA00001185329500311
富集的VH库包含一定比例的聚集性VH。这是预料之中的，因为CDR可影响VH溶解度(Jespers等人，2004a；Jespers等人，2004b；Martin等人，1997；Desmyter等人，1996；Decanniere等人，1999；Vranken等人，2002)。使用用于文库构建的稳定支架，因为其耐受去稳定突变，从而接受更广泛的有益突变而不丧失其天然折叠(Bloom等人，2006)。已显示，与在最低限度稳定形式上构建的文库(Bloom等人，2006)相比较，从细胞色素P450BM3的稳定形式构建的文库产生3倍的具有新的或提高的酶促活性的突变体。类似地，使用具有提高的溶解度和稳定性的VH支架构建的文库产生抗数种抗原的功能性结合剂，然而建立在易于聚集的野生型形式上的相同容量的文库只产生无功能的截断的VH(Tanha等人，2006)。在两个研究中，基于更稳定的支架的文库成员比基于较不稳定的支架的文库成员更可能折叠。支架稳定性的差异可解释事实，即与使用本发明的方法从多样性少十倍的VH文库分离到数种VH相比较，现有技术从VH噬菌体展示文库只分离到一种抗人血清白蛋白的功能性VH(Jespers等人，2004a)。考虑到利用具有含有琥珀密码子的VH的文库的亚组获得粘合剂，相当的产率变得甚至更显著。
本文库，当以单价展示形式进行淘选时，不能产生可溶的结合剂。然而，当通过使用hyperphage进行超感染并且进行热变性，以多价展示形式进行淘选时，文库令人惊讶地产生非聚集性VH。hyperphage的使用与现有技术不同，现有技术一般教导使用导致单价展示文库的辅助噬菌体例如VCS(Vieira等人，1987；Vaughan等人，1996；Baca等人，1997；Hoogenboom等人，1991)。
实施例3：克隆的分析
鉴定了9种VH，huVHAm302、huVHAm304、huVHAm309、huVHAm315、huVHAm316、huVHAm416、huVHAm427、huVHAm428和huVHAm431，用于亚克隆和进一步分析。然而，除了1种VH(huVHAm431)外，所有VH都具有甚至在将用作表达宿主的琥珀抑制株系例如TG1中阻止它们的表达的琥珀终止密码子(在TG1细胞中，琥珀终止密码子被读作氨基酸但大多数情况下作为终止密码子)。因此，用编码相同氨基酸的非终止密码子替代琥珀密码子，然后再表达所得的VH。
然而，在选择合适的替换密码子时，关于在大肠杆菌TG1细胞中由琥珀密码子编码的氨基酸的性质，发现不一致的信息。一些人报导Glu为重写(overwriting)氨基酸(Hoogenboom，H.R.等人，1991)(Baek，H.等人，2002)，而其他人报导Gln为重写氨基酸(Soltes，G.等人，2003)(Marcus，W.D.等人，2006a)。由于确切的氨基酸指定在避免抗原-抗体相互作用的可能破坏和在VH pI分析中不得出错误结论方面是关键的(参见实施例8)，因此确定由琥珀密码子编码的氨基酸的性质。
为此，将8种具有琥珀密码子的VH亚克隆入TG1细胞，随后通过质谱确定氨基酸。然而，只有一种VH，huVHAm302以足以进行质谱分析的量产生。
用100μL 2mM DTT在37℃下还原60μL 50ng/μL的huVHAm302(于50mM碳酸氢铵中)的溶液，进行1小时，然后用40μL 50mM碘乙酰胺在37℃下进行烷基化30分钟。通过离心超滤(3,000MWCO)除去用于还原和烷基化的试剂。在加入1μL胰蛋白酶溶液(0.33μg/μL)后在37℃下温育蛋白质溶液(0.25mL于50mM碳酸氢铵中)16小时。将huVHAm302的胰蛋白酶消化物的等分重悬浮于10μL的0.2％甲酸(aq)中，并使用偶联至具有DDA的Q-TOF UltimaTM杂交四矩/飞行时间质谱仪(Waters，Millford，MA)的CapLCTM毛细管液相色谱系统，通过nano-反相HPLC质谱法(nanoRPLC-MS)进行分析。首先将肽装载至300μm i.d.x5mm C18 PepMap100TM阱(LC Packings，San Francisco，CA)上，然后在23分钟期间使用从5％至42％的溶剂B(乙腈，0.2％甲酸)的线性梯度，在3分钟期间使用42％至95％的溶剂B的线性梯度将其洗脱至PicofritTM柱(New Objective，Woburn，MA)。溶剂A是0.2％的甲酸水溶液。使用MascotTM数据库搜索算法(Matrix Science，London，UK)针对蛋白质序列搜索肽MS/MS谱。
使用具有数据依赖性分析(DDA)的nanoRPLC-MS/MS分析胰蛋白酶酶解的蛋白质消化物，huVHAm302的鉴定覆盖度(coverage)是86％(图6A；SEQ ID NO：12)。在m/z 1036.47(2+)处占优势的双质子化的离子的序列测定为LSCamAASGDTVSDESMTWVR(SEQ ID NO：13；Cam是羧基氨基甲基化的半胱氨酸，其残基质量为160.03Da)(对于huVHAm302的残基20-38)(图6B)。完全没有检测到来自LSCamAASGDTVSDQSMTWVR(SEQ IDNO：14)的肽离子，这表明谷氨酸(以下划线标示)在huVHAm302的位点32上的占有率为100％。其余的氨基酸序列与预期的huVHAm302的序列相同。琥珀密码子在翻译过程中被读为Q但随后脱氨为E的可能性被排除，因为所有其他Q(参见图6A中的胰蛋白酶酶解片段)实际上还是Q。紧接其His6标签之后，huVHAm302在TAA翻译终止密码子之前具有另一个琥珀密码子。为了提供第二实例，确定由该第二琥珀密码子编码的氨基酸的本体。然而，质谱结果显示在该情况下琥珀密码子完全被读为终止密码子。已知琥珀密码子，当它们之后跟着T或C时，在抑制株系例如TG1大肠杆菌中不被有效抑制(Miller，J.H.等人，1983)(Bossi，L.，1983)。测定的蛋白质分子量(15,541.2Da)也证实，huVHAm302具有His6标签作为其最后的残基。因此，再克隆所有VH，用Glu密码子置换琥珀密码子。
实施例4：可溶性人VH的产生
亚克隆9种VH，huVHAm302(SEQ ID NO：15)、huVHAm304(SEQ IDNO：16)、huVHAm309(SEQ ID NO：17)、huVHAm315(SEQ ID NO：18)、huVHAm316(SEQ ID NO：19)、huVHAm416(SEQ ID NO：20)、huVHAm427(SEQID NO：21)、huVHAm428(SEQ ID NO：22)和huVHAm431(SEQ ID NO：23)，用Glu密码子置换琥珀密码子。
使用引物HVHP430Bam和HVHP430Bbs将VH基因亚克隆入pSJF2H载体以在大肠杆菌株系TG1中进行可溶性表达(Arbabi-Ghahroudi等人，2009)。使用含有VH基因的pSJF2H载体作为模板通过SOE和PCR构建在位点32上用Glu密码子替换它们的琥珀密码子的VH沉默突变体(Ho等人，1989)(Yau等人，2005)。在各情况下，将特定的诱变引物用于扩增2个在CDR1基因中具有前述突变的片段。然后通过SOE将2个片段拼接在一起，再次通过PCR进行扩增，将其克隆以进行表达。进行表达和纯化(Arbabi-Ghahroudi等，2009)。用SuperdexTM75柱(GE Healthcare，Baie d′Urfé，QC，Canada)对纯化的VH进行大小排阻层析。
VH的大小排阻层析显示VH的溶解度显著提高。图5显示根据它们的单体含量的百分比说明VH的聚集倾向的图。通过对来自大小排阻层析谱的单体和多聚体峰下的面积积分获得百分比单体。″Mono″表示通过以单价噬菌体展示形式进行淘选而鉴定的VH。所有VH具有碱性pI(9.1±0.3，平均值±SD)。″Multi/Ht″表示通过具有热变性步骤的以多价展示形式进行的淘选鉴定的VH。由水平线条显示的中值为78％(对于″MonoVH″)和90％(对于″Multi/Ht VH″)。插图显示作为它们的pI的函数的Multi/Ht VH的聚集状态。
与通过以单价展示形式进行的淘选分离的VH(中值：78％)相比较，以多价展示形式通过热变性分离的VH显示更高比例的单体含量(中值：90％)，4种(huVHAm304、huVHAm309、huVHAm416、huVHAm428)完全为单体(图4B和5)。有趣地，在这4种VH中，3种是酸性的(huVHAm304，pI5.3；huVHAm416，pI 5.8；huVHAm428，pI 5.8)，而只有一种是碱性的(huVHAm309，pI 8.2)(图5插图；表2)。其余5种VH是碱性的或几乎中性的(表2)。在具有最少单体含量的4种VH中，3种(huVHAm315、huVHAm427、huVHAm302)具有接近中性pH(7.3、7.0、6.4)的pI。
之前观察到，利用热变性方法获得的VH具有酸性pI(5.7)并且在热变性后显示可逆的折叠；然而，在不使用加热步骤的情况下获得的其他VH具有更高的pI(7.4±1.2，平均值±SD)并且不显示可逆的热变性(Jespers等人，2004a)。同样，在6种抗聚集的结合蛋白A的VH中，4种VH具有酸性pI(4.3-4.7)，而2种VH，C85和C 36，分别具有中性(7.0)和碱性(8.0)pI。同样，还显示高度可重折叠且非聚集性的溶菌酶特异性VH，HEL4(Jespers等人，2004b)，具有非常酸性的pI，4.7。通过使用单价展示形式的本发明的方法分离的所有聚集性VH具有碱性pI(9.1±0.3，平均值±SD)(图5)。有趣地，实施例8中描述的分析(参见下文)显示，所有非聚集性酸性VH(Jespers等人，2004b；Jespers等人，2004a)具有低于6的pI。
实施例5：烷基化反应和通过质谱法进行的分子量测定
5种聚集性VH(huVHAm302、huVHAm315、huVHAm316、huVHAm427和huVHAm431)的SDS-PAGE分析显示，对于所述VH中的四种，在非还原性凝胶但不在还原性凝胶上显示二聚体类别，这表明这些VH中存在结构域间二硫键(图7；表1)。因此，对于这些VH，非典范Cys残基促成了它们的聚集。通过烷基化反应/质谱实验就CDR内和CDR间二硫键的存在进一步检测4种非聚集性VH。
按照Tanha等人(2001)，用碘乙酰胺作为烷化剂进行烷化反应/质谱法。简而言之，向30μg VH溶液中加入冷丙酮(5x体积)，然后混合内容物，在微量离心机中以最大速度在4℃下离心10分钟。将沉淀暴露于空气5分钟，溶解于250μL 6M盐酸胍中，并加入27.5μL 1M Tris缓冲液，pH 8.0。加入相对于Cys残基摩尔过量的20x DTT，将混合物在室温下温育30分钟。加入相对于DTT 5倍摩尔过量的新制备的碘乙酰胺，将反应物在室温下于黑暗中温育1小时。使用具有10kDa MWCO的Slide-A-LyzerTM(Pierce，Rockford，IL)，在3.5L ddH2O中于4℃下透析烷基化的产物。用SpeedVac将反应溶液减少至15μL，随后将溶液经历MALDI质谱以确定VH的分子量。除了用ddH2O置换DTT外，对照实验完全相同。
图1举例说明(i)通过质谱发获得的未还原/烷基化的(unred/alk)和还原/烷基化的(red/alk)HVHP430 VH的分子量特征谱。图1(ii)展现了HVHP430和在本研究中鉴定的4种抗α淀粉酶的VH的烷基化反应/质谱实验的结果。所有VH具有c-Myc-His5(6)标签。组合HVHP430 VH的质谱特征谱以提供更好的可视比较。未还原的、碘乙酰胺处理的VH具有15,517.25Da的质量，未烷基化的VH的预期的质量(15,524.39Da)。相比之下，相对于未还原的VH，还原的、碘乙酰胺处理的VH显示232.32Da的质量增加，表明在所有4个Cys残基上发生烷基化(4x58.08Da＝232.32Da)。VH烷基化只在还原Cys巯基基团后发生的观察结果证明2个CDR3 Cys残基参与CDR3内二硫键。
如图1(ii)中所示，所有CDR半胱氨酸都参与二硫键。因此，huVHAm304和huVHAm309具有CDR3内二硫键，huVHAm428具有CDR1-CDR3二硫键，huVHAm416具有CDR内和CDR间二硫键。
实施例6：热重折叠效率实验
通过比较天然的(KDn)和热处理/冷却的(KDref)VH与蛋白A的结合的KD来就它们的可逆热去折叠状态检查4种非聚集性VH(huVHAm304、huVHAm309、huVHAm416和huVHAm428)(To等人，2005)。
根据用BIACORE 3000生物传感器系统(Biacore Inc.，Piscataway，NJ)收集的表面等离子共振(SPR)数据，测量天然的和热变性/冷却的VH与蛋白A的结合，从而确定在0.5和5μM的浓度上VH的热重折叠效率。将600共振单位(RU)的蛋白A(Sigma)或卵清蛋白(Sigma)作为参照蛋白固定在研究级CM5-传感器芯片(Biacore Inc.)上。使用厂商提供的胺偶联试剂盒以50μg/mL的蛋白质浓度在10mM乙酸盐缓冲液pH 4.5中进行固定。将所有VH通过SuperdexTM 75柱(GE Healthcare)，收集单体类别以进行重折叠效率实验。为了获得重折叠效率值，将VH在85℃下以0.5和5μM的浓度温育20分钟，然后冷却至室温，进行30分钟。在微量离心机中以16,000g在22℃下离心VH5分钟以沉淀和除去任何可能的聚集体。在25℃下于含有150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20的10mM HEPES，pH 7.4中以40μL/分钟的流速进行天然的和热变性/冷却的VH对蛋白A的结合分析。用运行缓冲液充分清洗表面以进行再生。根据处于稳定状态的结合的量计算重折叠效率。使用BIAevaluation 4.1软件分析数据。
图8显示sensorgram叠加，其显示天然的(粗线)和重折叠的(细线)huVHAm309(A)和huVHAm416(B)以0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1和2μM(huVHAm309)以及0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1，2和4μM(huVHAm416)的浓度与固定的蛋白A的结合。根据各自的sensorgram计算KDn和KDref，并用于确定TRE。数据是关于5μM浓度上的VH的热去折叠的数据(KDn，天然VH的KD；KDref，重折叠的(热变性/冷却的)VH的KD)。
将KDn对KDref的比定义为热重折叠效率(TRE)，其提供了VH在热变性后重折叠成它们的天然状态的程度的量度。在两个不同的VH浓度：0.5和5μM上进行变性和TRE的测量(图8；表2)。只有huVHAm304显示浓度依赖性TRE，其中其TRE从0.5μM上的99％减少至5μM上的87％。在更高的蛋白质浓度下加速的聚集形成很可能是该减少的原因。然而，对于所有VH，TRE值在5μM上仍然非常高，范围在86％至97％之间。比其他3种多1个非典范二硫键(参见上文)的huVHAm416显示了最高的TRE，这突出了非典范二硫键在单结构域稳定性中的重要性。
实施例7：α淀粉酶结合和抑制测定
选择4种单体VH，huVHAm304、huVHAm309、huVHAm416和huVHAm428，用于进一步的针对α淀粉酶的结合分析。
基本上如所描述的进行α淀粉酶抑制测定(Lauwereys，M.等人，1998)。简而言之，用不同浓度的纯化的单体抗α淀粉酶VH在室温下预温育终浓度为1.5μg/mL的在0.1％酪蛋白，150mM NaCl，2mM CaCl2，50mM Tris-HCl pH 7.4中的酶1小时(总体积：50μL)。将混合物分配至两个ELISA孔，向每一个孔加入75μL底物溶液(0.2mM 2-氯-4-硝基苯基麦芽三糖苷，150mM NaCl，2mM CaCl2，50mM Tris-HCl pH 7.4)。对照反应物包括不具有VH的反应物和以所有测试的VH浓度具有HVHP430VH的反应物。使用PowerWave 340微量滴定板分光光度计(BioTekInstruments，Inc.Winooski，VT)，通过测量405nm处的反应溶液的吸光度的变化(ΔA405nm)来在25℃下连续监控反应的进展。相对于在非结合剂，文库支架，HVHP430 VH存在的情况下的其活性，计算酶的残留活性。通过Biacore不能确定平衡解离常数，因为α淀粉酶在固定在Biacore芯片上后失去其活性。因此通过ELISA分析VH。
为了利用ELISA估量VH与α淀粉酶的结合，在4℃下用100μL 10μg/mL的在PBS中的猪胰腺α淀粉酶(Sigma，Oakville，ON，Canada)包被MaxisorpTM微量滴定板(Nunc)，进行过夜。在用3％牛血清白蛋白(300μL)于37℃下封闭2小时和随后除去封闭试剂后，加入100μL数μM浓度的带His6标签的VH，然后在37℃下温育2小时。用PBST清洗孔5次，然后以1∶5000的稀释度加入100μL兔抗His-IgG/辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX)。然后在37℃下温育孔1小时。在用PBST清洗孔后，加入100μL ABTS底物(KPL，Gaithersburg，MD)，在5分钟后通过加入100μL 1M磷酸，终止反应，观察显色。使用微量滴定板读数器在450nm的波长处测量吸光度值。如上估量VH的蛋白A结合活性，其中将蛋白A/HRP缀合物(Upstate，LakePlacid，NY)作为检测剂加入用VH包被的孔。以一式二份重复进行测定。
如图9A中所示，所有4个克隆结合α淀粉酶。它们以及其他5种VH(huVHAm302、huVHAm315、huVHAm316、huVHAm427和huVHAm431)结合蛋白A(表1，图9B)。此外，在酶抑制测定中检测的4种VH中，也形成CDR 3内二硫键(参见表1)的1种(huVHAm302)抑制α淀粉酶(图10)。
实施例8：VH和VHH结构域的等电点的分析
使用Laser gene V6.0软件进行大羊驼cDNA VHH(Harmsen等人，2000；Tanha等人，2002)、单峰驼cDNA VHH(NCBI，登录号AB091838-AB092333)、单峰驼种系VHH和VH区段(Nguyen等人，2000)和人种系VH区段(V BASE；http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的理论pI分布分析。图11A-F显示举例说明亚家族VHH1、VHH2和VHH3的大羊驼cDNA VHH、单峰驼cDNA VHH、种系VHH区段和种系VH区段、人种系VH区段和HVHP430文库VH的理论pI分布(A-F)的图。点线表示pI 7.0。在F中，对于7个VH/VHH组(A-D)中的每一个组，显示具有中性pI(白色条块)、碱性pI(黑色条块)和酸性pI(灰色条块)的克隆的百分比。A+B显示通过将大羊驼与单峰驼cDNA VHH混合在一起获得的组合特征谱。
关于来自VHH1亚家族的大羊驼cDNA VHH(68个克隆)，22％的VHH是酸性的，72％是碱性的。VHH2亚家族成员(49个克隆)的数值是相当的：23％酸性对71％碱性。相反地，对于VHH3亚家族(34个克隆)，68％的VHH具有酸性pI，29％具有碱性pI。然而，许多序列条目不具有前面数个FR1氨基酸(其通常在位点1上具有酸性氨基酸)。算上FR1中包含的酸性残基，酸性VHH的比例可以为高至34％(VHH1)、37％(VHH2)和79％(VHH3)。单峰驼VHH库(495个克隆[NCBI，登录号AB091838-AB092333])显示与VHH3亚家族的大羊驼VHH库相似的模式，主要由酸性VHH组成(56％酸性对41％碱性)。有趣地，在3个大羊驼VHH亚家族中，VHH3亚家族也是单峰驼VHH与其共有最多结构特征的亚家族。考虑所有646个骆驼VHH，酸性VHH的综合数值为50％，当考虑在位点1上的酸性残基时，其可高至53％(对比碱性VHH的43％)。单峰驼种系VH区段相对VHH区段的比较显示，对于VH，pI分布模式为64％碱性对36％酸性，对于VHH，模式相反：69％酸性对29％碱性。在人种系VH区段的情况下，绝大多数VH具有碱性pI：92％碱性对6％酸性(1-f VH区段，pI 4.4；1-24VH区段，pI 4.7；3-43VH区段，pI 5.1)。在36个分析的文库克隆中，没有一个具有酸性pI(8.7±0.7，平均值±SD)(图11E)。因此，基于到目前为止在本研究和之前的研究(Jespers，L.等人，2004b；Jespers，L.等人，2004a)中累积的关于人和骆驼VH/VHH的生物物理学和统计学数据，骆驼sdAb库中的酸性VHH的高丰度可能不是随机事件，而是通过体内进化自然达到产生可溶性和稳定的sdAb的解决方案的结果。蛋白质酸化可以是产生功能性单结构域的另一个方法。
实施例9：克隆美洲驼VHH CDR3库
在大肠杆菌中构建美洲驼VHH CDR3的质粒文库。使用由厂商提供的First-Strand cDNA SynthesisTM试剂盒(GE Healthcare)和pd(T)18，将260纳克RNA(利用QIAamp RNA Blood MiniTM试剂盒(QIAGEN Inc.)从110μL美洲驼(大羊驼)血液纯化)用作模板来合成cDNA。使用引物对VHHFR3Bgl-R/CH2B3-F、VHBACKA6/CH2B3-F、VHHFR3Bgl-R/CH2FORTA4和VHBACKA6/CH2FORTA4(参见表3(关于引物列表)和小节′HVHP430LGH3VH文库构建′)通过PCR扩增整个cDNA制备物。将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick Gel ExtractionTM试剂盒(QIAGEN Inc.)凝胶纯化来源于重链抗体的条带。使用引物对VHHFR3Bgl-R/VHHFR4Bgl-F将总共730ng的纯化的DNA经历第2轮PCR。用Bgl II消化扩增产物，然后通过QIAquick PCR PurificationTM试剂盒(QIAGENInc.)纯化。174个VHH序列的检查已显示只有2种VHH在它们的CDR3中具有内部Bgl II限制性位点。用Bgl II消化克隆载体，pSJF2，(Tanha等人，2003)，然后进行凝胶纯化。在200μL的总体积中于16℃下进行连接反应过夜，连接反应物包含总共1.25μg的消化的DNA(以2∶1的插入物：载体摩尔比)和4μL 400个单位/μL的DNA连接酶(NEB，Pickering，ON，Canada)(于厂商提供的缓冲液中)。使用PCR纯化试剂盒脱去连接产物的盐分，然后用90μL去离子水洗脱。为了进行转化，将50μL大肠杆菌TG1细胞与5μL的连接产物混合，然后进行电穿孔(Tanha等人，2001)。在转化后，将细胞立即转移至1mL SOC培养基(Sambrook等人，1989)中。进行总共18次电穿孔。将电穿孔的细胞混合(总体积＝18mL)，以220rpm在37℃下温育1小时。取出小等分，在LB培养基中进行细胞的连续稀释，将其涂板在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB板上，在32℃下将滴定板温育过夜。向SOC中的剩余细胞中加入氨苄青霉素至100μg/mL的终浓度，然后以220rpm在37℃下温育2.5小时。将培养物转移至装有1L LB+100μg/mL氨苄青霉素的培养瓶中，以220rpm在37℃下温育过夜。使用Plasmid MaxiTM试剂盒(QIAGEN Inc.)将100mL用于获得纯化的文库质粒的原液，将剩余部分离心，然后将沉淀的细胞重悬浮于15％的于LB中的甘油中，然后以小等分于-80℃下冷冻贮藏。滴定板上的集落数目用于计算文库的容量。利用单个集落的集落PCR从滴定板扩增CDR 3序列，然后进行纯化(QIAquick PCR PurificationTM试剂盒)和测序。
美洲驼VHH CDR3的质粒文库具有9.3x108个独立转化体。从文库滴定板中选择91个VHH克隆并且进行测序。所有克隆都具有真实的CDR3序列，长度范围为5至31个氨基酸，平均值/中值为15个氨基酸(图12)。15个CDR3序列出现多于一次(2-5次)(图12A；SEQ ID NO：24-90)。本发明人在之前的研究中遇到过具有相同CDR3的VHH克隆的此类重复(数据未显示)。其他人也在大约170个重排的大羊驼VHH的样品中发现，数个在CDR3中具有至少80％的序列同一性的VHH(Harmsen等人，2000)。18个克隆(13个不同的序列)在CDR3中具有Cys残基，如之前观察到的，主要是具有较长的CDR3的克隆(Harmsen等人，2000)。4个克隆具有2个Cys残基(Harmsen等人，2000)。10个CDR3序列可追溯至它们的VHH2亚家族来源，因为它们在位点93上具有Asn或His(Harmsen等人，2000)。关于剩余的CDR3的来源，不能得出确定性结论，但至少一些具有Cys的CDR3极可能来源于来自VHH3亚家族的VHH。此外，许多较短的CDR3可能是VHH1和VHH2亚家族来源的CDR3，而较长的CDR3可能来源于VHH3家族。
实施例10：HVHP430LGH3 VH文库的构建
构建基于HVHP430VH支架的VH合成噬菌体展示文库。通过在数量上超过来自VHH CDR3质粒文库的CDR3序列和来自HVHP430噬菌体展示文库的H1/CDR1序列来产生文库的多样性，如本文中描述的。通过体外CDR随机化产生多样性还可在文库中产生不溶性的VH类别。然而，已知VHHCDR3使VHH增溶(Desmyter等人，2002)(Vranken等人，2002)(Tanha等人，2002和本文中的参考文献)，并且其可能为此已在进化上经历选择。由于它们的增溶性质，将美洲驼VHH CDR3整合入发明人的文库以使不溶性VH的比例减少至最低，同时产生多样性。
用于文库构建的引物列于下面的表3中；前2个引物已出现在表2中。基于属于亚家族VHH1、VHH2和VHH3的174个大羊驼VHH的核苷酸序列的比对，设计FR3和FR4特异性引物，VHHFR3Bgl-R和VHHFR4Bgl-F(Harmsen等人，2000；Tanha等人，2002)。
表3.用于构建HVHP430LGH3 VH噬菌体展示文库的引物
  名称   序列
  HVHBR1-R(SEQ ID NO：91)   5’-CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’
  HVHFR4-F(SEQ ID NO：92)   5’-CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCC-3′
  VHHFR3Bgl-R(SEQ ID NO：93)   5’-ACTGACAGATCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGT-3’
  VHHFR4Bgl-F(SEQ ID NO：94)   5’-ACTGACAGATCTTGAGGAGACGGTGACCTG-3’
  VHBACKA6*(SEQ ID NO：95)   5’-GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG-3’
  CH2B3-F(SEQ ID NO：96)   5’-GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA-3’
  CH2FORTA4*(SEQ ID NO：97)   5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’
  P430FR3-R(SEQ ID NO：98)   5’-CTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT-3’
  P430FR3-F(SEQ ID NO：99)   5’-ACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCAG-3’
  P430FR4Mod-F(SEQ ID NO：100)   5’-TGAGGAGACGGTGACCATGGTCCCCTGGCCCCA-3’
为了构建文库，通过标准PCR产生2个交迭片段。首先，使用HVHP430文库噬菌粒(作为模板)和引物HVHBR1-R和P430FR3-F产生包含随机化的H1/CDR1的上游片段。其次，使用VHH CDR3库质粒(作为模板)和引物P430FR3-R和P430FR4Mod-F产生包含美洲驼VHH CDR3库的下游片段。将2个片段进行凝胶纯化(Qiagen Inc.)，以等摩尔量混合，通过拼接重叠延伸/PCR进行拼接/扩增以构建全长VH基因。使用Expand高保真DNA聚合酶系统(Hoffmann-La Roche Limited，Mississauga，ON，Canada)和以非相容性Sfi I限制性酶位点结尾的构架1和4特异性引物(分别地HVHBR1-R和HVHFR4-F)进行SOE/PCR。用QIAquick PCRPurificationTM试剂盒(Qiagen Inc.)纯化VH片段，用Sfi I酶沿着噬菌粒载体(pMED1)消化过夜。为了在连接反应期间使载体自连接降至最低，用在两个Sfi I位点之间具有识别位点的Pst I和Xho I进一步消化pMED1 3小时。随后利用PCR纯化试剂盒纯化消化的载体和VH制备物，使用LigaFastTM Rapid DNA Ligation System(Promega，Madison，WI)分别地以1∶2的摩尔比进行连接。组合总共112.5μg载体和20μgVH，加入连接缓冲液和T4 DNA连接酶，混合内容物，在室温下温育2小时。随后利用PCR纯化试剂盒纯化连接材料，将其浓缩至大约1μg/μL。使用每电穿孔杯50μL电转感受态(electrocompetent)TG1细胞(Stratagene，La Jolla，CA)和2μL连接材料的混合物通过标准电穿孔进行转化。进行总共50次电穿孔。在每一次电穿孔后，将电穿孔的细菌细胞稀释在1mL SOC培养基中，在振荡培养箱中于37℃和200rpm下温育1小时。在温育后，取出等分用于确定文库容量，将剩余的细胞文库在200mL含有100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT(2xYT/Amp/2％Glu)中于37℃和200rpm下扩增过夜。通过离心沉淀细胞，将其重悬浮于20mL终体积的35％的于YT/Amp/1％Glu中的甘油，然后以1mL的等分于-80℃下贮藏。
HVHP430LGH3噬菌体展示文库的容量为4.5x108。从文库随机选择31个克隆，测定它们的VH的序列，如表4中显示的。
表4：来自HVHP430LGH3VH噬菌体展示文库的31个克隆的CDR3的序列。
  克隆   H1/CDR1   SEQ ID NO.   93-102(93/94/CDR3)   SEQ ID NO.
  HLlib25   FMFSN*IMS   101   AVDEGLLYNDNYYFTLHPSAYDY   132
  HLlibM6   DSVTHECMT   102   GQGQGLYNSVADYYTGRADFDS   133
  HLlib12   VRFIDEVMG   103   ITVQLNPVVFGAGWIIDYNY   134
  HLlibM14   FNFIAETMT   104   AAATRPSIAFPISVGAYET   135
  HLlibM5   VMLNHECMT   105   VTLYDAVCATYVPEGLRDY   136
  HLlibM3   YILTAESMT   106   VTNTNYLSF*RASIVRSF   137
  HLlib18   FIFSYEGMG   107   AANQGGHSRFAQRYDY   138
  HLlibM16   TIIIPECMT   108   TLTQAC*TACRIGPPS   139
  HLlibM18   FNFSAEIMT   109   PNWSRLTHQCSPNMSY   140
  HLlib16   VSFSA*FMA   110   GARIGWYTCRYDYDY   141
  HLlibM12   DNFTPEFMS   111   GARIGWYTCRYDYDY   142
  HLlib05   VMFTP*DMG   112   YLQLFRSTTRSYDTY   143
  HLlibM9   FTSIAEVMG   113   AADIRSPSRFSISGY   144
  HLlibM7   VKFTSKSMT   114   VGITMSVVG*LCARY   145
  HLlibM15   TNLTHETMA   115   AAGPTLSTDAYEYRY   146
  HLlib02   FNISTYFMG   116   NADYFRGNSYRTMT   147
  HLlib10   YMVIS*AMA   117   NARQWKNTDWVDY   148
  HLlib13   YMFSYEVMG   118   NARQWKNTDWVDY   149
  HLlibM1   YSVTTETMS   119   NARQWKNTDWVDY   150
  HLlibM5   FMFTPETMA   120   NARQWKNTDWVDY   151
  HLlib14   FIVNDESMT   121   AAKKIDGPRYDY   152
  HLlib23   YTLSYEI MA   122   NARTGSGLREY   153
  HLlib21   FMLSSYAMT   123   NAMKRLYCMTT   154
  HLlib28   VRFSDEFMG   124   YARSVRSPDDY   155
  HLlibM17   DIFIAESMG   125   VTTMNPVPAPS   156
  HLlibM8   DMFSHESMG   126   NAESSAVPYDY   157
  HLlibM9   DSLSYENMT   127   TVRGPYGSSRY   158
  HLlib01   FMFSS*CMA   128   TTSPFGTPNY   159
  HLlib15   FKFSYECMG   129   AADLLSGRL   160
  HLlib19   FTLNTEFMA   130   NAQNW   161
  HLlib1   YSFNSESMG   131   VAWF   162
*由琥珀终止密码子编码的，重写为Glu
VH在H1/CDR1上不同，但6个在CDR3上显示序列重叠(HLlib16和HLlibM12；HLlib10、HLlib13、HLlibM1和HLlibM5)。事实上，后4个克隆具有与来自质粒CDR3文库的克隆CH2-16A相同的CDR 3。有趣地，31个克隆中有28个在位点32上具有酸性残基E。CDR3的长度范围在2至21个氨基酸之间，平均值/中值为12(表4和图13)。
实施例11：文库噬菌体的产生
在冰上解冻1mL文库的冷冻等分(大约5x1010个细胞)，将其与200mL 2xYT/Amp/1％Glu混合，在37℃和220rpm下培养至0.5的OD600。以20∶1的噬菌体对细菌细胞的比率用辅助噬菌体感染培养物，在不振荡的情况下温育15分钟，然后在以200rpm振荡的情况下于37℃下温育1小时。然后通过以3,000g离心10分钟来沉淀细菌细胞，将其重悬浮于200mL含50μg/mL卡那霉素的2xYT/Amp中。将培养物在振荡培养箱中于37℃和220rpm下温育过夜。将噬菌体纯化在2mL终体积的无菌PBS中，然后等分，于-20℃下冷冻贮藏。如所描述的进行噬菌体滴定(Arbabi等人，2009)。
如之前所述进行淘选。
本文中描述的实施方案和实施例是举例说明性的并且无意限定所请求保护的本发明的范围。本发明人意欲将前述实施方案的变型，包括替代物、变动和等价物包括在权利要求中。此外，所论述的特征的组合可能对于本发明的解决方案不是必需的。
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本文中提及的所有专利、专利申请和公开案通过引用合并入本文。
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附录-序列
HVHP430：SEQ ID NO 1(图2a)
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO：2-3图3
SEQ ID NO：4-11表1
SEQ ID NO 12图6A
SEQ ID NO：13-14第3、5个实施例。
huVHAm302：SEQ ID NO 15
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTDNRSCQTSLCTSTTRSWGQGTMVTVSS
huVHAm304：SEQ ID NO 16
VQLVESGGGLIEPGGSLRLSCAASGFSFSDEGMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRLPKQCTSPDCETEVSSWGQRTMVTVSS
huVHAm309：SEQ ID NO 17
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVNFSNEGMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTAQRACANSPCPGSITSWGQETMVTVSS
huVHAm315：SEQ ID NO 18
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDMFSSEGMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVAAPTTCTSHNCAEPFRSWGQETMVTVSS
huVHAm316：SEQ ID NO 19
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDRFTYESMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVALETACTRPACAHTPRFWGQGTMVTVSS
huVHAm416：SEQ ID NO 20
QVQLVESGGG LIKPGGSLRLSCAASGVSFTDDCMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVADHTQCRQPECESQLCSWGQGTMVTVSS
huVHAm427：SEQ ID NO 21
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVTLSPECMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVSCEGENAFWGQGTMVTASS
huVHAm428：SEQ ID NO 22
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSLSDDCMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTGNQACKHEPWPDEALLLGPRDNVTVSS
huVHAm431：SEQ ID NO 23
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYTVSSECMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDSKNCHDKDCTRPYCSWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO：24-90图12A
SEQ ID NO：91-100表3
SEQ ID NO：101-162表4
huVHAm301：SEQ ID NO 163
QVQLVESGGG LIKPGGSLRLPCAASGFRISHEGMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVAYNEECTKPSCHTKARSWGQGTMVTVSS
huVHAm303：SEQ ID NO 164
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFRFSYEVMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTPKVDCETHPCRERPYFWGQGTMVTVSS
huVHAm305：SEQ ID NO 165
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYRFNNEVMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTSTPACNQDKCERWRPSWGQGTMVTASS
huVHAm307：SEQ ID NO 166
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSVSDEDMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTPLPKCTNPNCKSPPKYWGQETMVTVSS
huVHAm311：SEQ ID NO 167
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFRVTPECMTWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHEVECPTEQCPFHCPSWGQGTMVTVSS
huVHAm312：SEQ ID NO 168
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGVMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVAPETQCSEGRCLGTASSWGQGTMVTVSShuVHAm313：SEQ ID NO 169
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFRFIDEDMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVAGAKGQWSPSLQAQAGQ
huVHAm317：SEQ ID NO 170
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYMISDEIMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVAPNRAKGQWSTVSS
huVHAm320：SEQ ID NO 171
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGYSVSDESMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTTDPLGAKGQWSPSSSGQAGQ
huVHAm406：SEQ ID NO 172
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFSFTPECMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVGHKNNCPGQGTMVTVSS
huVHAm412：SEQ ID NO 173
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDMLSAECMGWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVAKPYHCAVQGTMVTVSS
huVHAm420：SEQ ID NO 174
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDRFSYEDMAWVPQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVATEESCPEGNCPPPRRSWGQETMVTVSS
huVHAm424：SEQ ID NO 175
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDRVISECMGWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVALPPEVCEADVPDRGDLLGPRTMVTVSS
huVHAm430：SEQ ID NO 176
QVQLVESGGG LI KPGGSLRLSCAASGDRVSPEDMAWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVTSGVPSGSFWGQETMVTVSS
SEQ ID NO：177-178图2A的图例
SEQ ID NO：179-181图6的图例
SEQ ID NO：182-184图14

Claims (39)

1.非聚集性VH结构域或其文库，所述VH结构域在至少一个互补决定区(CDR)中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸，并且包括酸性等电点(pI)。
2.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域是可溶性的，能够可逆热去折叠，和/或能够结合蛋白A。
3.权利要求1或2的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域在CDR1中包含至少一个形成二硫键的半胱氨酸。
4.权利要求1至3的任一项的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域在CDR3中包含至少3个形成二硫键的半胱氨酸。
5.权利要求3或4的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域在1个CDR内或CDR之间包含非典范二硫键。
6.权利要求5的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含通过CDR内或CDR间非典范二硫键形成的伸出的环。
7.权利要求1至6的任一项的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含存在于CDR1的位点32上的酸性氨基酸残基。
8.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包括低于6的等电点。
9.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：24-90，SEQ ID NO：101-131，SEQ ID NO：132-162的任一个和其组合的序列。
10.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含人构架序列和至少一个来自不同物种的CDR。
11.权利要求10的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含人构架序列、人CDR1/H1、人CDR2/H2和骆驼CDR3/H3。
12.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域包含混合的随机化的序列。
13.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域是酶抑制剂。
14.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域基于人种系序列1-f VH区段、1-24VH区段和3-43VH区段。
15.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域基于具有酸性pI的人种系序列、骆驼VHcDNA、具有酸性pI的骆驼种系VH区段、骆驼VHH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VHH区段。
16.权利要求1的非聚集性VH结构域或其文库，其中所述VH结构域是huVHAm302、huVHAm309、huVHAm316、huVHAm303、huVHAm304、huVHAm305、huVHAm307、huVHAm311、huVHAm315、huVHAm301、huVHAm312、huVHAm320、huVHAm317、huVHAm313、huVHAm431、huVHAm427、huVHAm416、huVHAm424、huVHAm428、huVHAm430、huVHAm406、huVHAm412和huVHAm420中的一个。
17.权利要求1至9的任一项的非聚集性VH结构域或其文库，其中从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离所述VH结构域。
18.权利要求1至9的任一项的非聚集性VH结构域或其文库，其中通过选择步骤从基于噬菌粒的噬菌体展示文库分离所述VH结构域，所述选择步骤增强对非聚集性VH结构域的选择的能力或效率。
19.增加对非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法，包括：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生所述文库；和
b)使用所述噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选，
其中所述方法包括选择非聚集性噬菌体-VH结构域的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述选择步骤是在淘选步骤(步骤b))之前发生的将噬菌体-VH结构域文库经历热变性/复性的步骤。
21.权利要求19或20的方法，其中所述选择步骤是在淘选步骤(步骤b))后发生的测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH的步骤。
22.权利要求19的方法，其包括：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生所述文库；
b)将所述基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库经历热变性/复性步骤；和
c)使用所述噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选。
23.权利要求19的方法，其包括：
a)提供基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库，其中通过VH结构域在噬菌体表面上的多价展示来产生所述文库；
b)使用所述噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选；和
c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH结构域。
24.权利要求19至23的任一项的方法，其还包括从基于噬菌粒的VH结构域噬菌体展示文库分离特定VH结构域的步骤。
25.增加对非聚集性VH结构域的选择的能力或效率的方法，包括：
a)提供基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库，其中基于具有酸性pI的VH结构域支架产生所述文库；
b)使用所述噬菌体-VH结构域文库和靶进行淘选；和
c)测定单个克隆的序列以鉴定具有酸性pI的VH结构域。
26.权利要求25的方法，其中所述VH结构域支架基于具有酸性pI的人种系序列、骆驼VH cDNA、具有酸性pI的骆驼种系VH区段、骆驼VHH cDNA或具有酸性pI的骆驼种系VHH区段。
27.权利要求25的方法，其还包括从基于噬菌体载体的VH结构域噬菌体展示文库分离特定VH结构域的步骤。
28.编码权利要求1至18的任一项的VH结构域的核酸。
29.包含权利要求28的核酸的载体。
30.包含权利要求28的核酸或权利要求29的载体的宿主细胞。
31.药物组合物，其包含有效量的用于结合抗原的一种或多于一种的权利要求1至18的任一项的VH结构域，和可药用的赋形剂。
32.权利要求1至18的任一项的VH结构域或其文库在制备药剂中的用途，所述药剂用于通过与抗原结合来治疗或预防医学病状。
33.治疗患者的方法，其包括给需要治疗的患者施用包含一种或多于一种的权利要求1至18的任一项的VH结构域的药物组合物。
34.试剂盒，其包括一种或多于一种的权利要求1至18的任一项的VH结构域和一种或多种试剂，其用于检测和确定所述一种或多于一种的VH结构域与生物学样品中特定抗原的结合。
35.权利要求1至18的任一项的VH结构域在用于分析样品的高通量筛选测定中的用途。
36.VH结构域或其文库，其中a)所述VH结构域基于HVHP430(SEQ IDNO：1)；b)保持CDR3的位点99和100d上的Cys；c)随机化CDR3的剩余的14个氨基酸残基；d)随机化氨基酸残基94；和e)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
37.VH结构域文库，其中a)所述VH结构域基于HVHP430(SEQ IDNO：1)；b)在位点93-102(93/94-CDR3)上的氨基酸残基来源于美洲驼VHH；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
38.VH结构域或其文库，其中a)所述VH结构域基于HVHP430(SEQ IDNO：1)；b)CDR3包含选自SEQ ID NO：24-90和SEQ ID NO：33-63的序列；c)随机化CDR1/H1的8个氨基酸残基。
39.权利要求1-18或36-38的任一项的VH结构域或其文库，其偶联至货物分子，或用可检测的标记或标志物进行标记。
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