JP5092160B2 - ラクダ科動物のｖｈｈドメインの安定化 - Google Patents
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本発明は、ラクダ科動物抗体を安定化する技術に関する。
偶蹄目、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）の血清中には軽鎖を持たない特殊な抗体があることが知られている。この抗体の可変領域はVHHドメインと呼
ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量であるため、その利用を目指した研究が活発に進められている。
ばれ、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量であるため、その利用を目指した研究が活発に進められている。
この抗体は保存中に徐々に失活していくため、より安定な抗体が求められていた。
本発明は、ラクダ科動物抗体の保存安定性、熱安定性を高めることを目的とする。
本発明は、以下の安定化ラクダ科動物抗体、遺伝子、ベクター、形質転換体、該抗体の製造方法を提供するものである。
1． ラクダ科動物抗体VHHドメインに2個のシステイン残基を導入し、これらシステイン
残基間にS-S結合を導入してなる、安定化ラクダ科動物抗体。
2． 前記ラクダ科動物抗体が、配列番号1の抗体と64％以上のホモロジーを有するVHHド
メインを有する、項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
3． アミノ酸の数が109〜133であるVHHドメインを有する項1又は2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
4． 配列番号1のポリペプチドの49番目と70番目に相当するアミノ酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
5． 配列番号1のポリペプチドの49番目(アラニン)と70番目(イソロイシン)に対応するアミノ酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、
項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
6． 配列番号7で示されるアミノ酸配列を有する項1または2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
7． 項1〜6のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
8． 項7に記載の遺伝子を有するベクター。
9． 項8に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
10． 宿主がメタノール資化酵母である項9に記載の形質転換体。
11． 項10に記載のメタノール資化酵母をメタノールの存在下で培養し、項1〜6のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体を回収することを特徴とする、ラクダ科動物抗体の製造方法。
1． ラクダ科動物抗体VHHドメインに2個のシステイン残基を導入し、これらシステイン
残基間にS-S結合を導入してなる、安定化ラクダ科動物抗体。
2． 前記ラクダ科動物抗体が、配列番号1の抗体と64％以上のホモロジーを有するVHHド
メインを有する、項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
3． アミノ酸の数が109〜133であるVHHドメインを有する項1又は2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
4． 配列番号1のポリペプチドの49番目と70番目に相当するアミノ酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
5． 配列番号1のポリペプチドの49番目(アラニン)と70番目(イソロイシン)に対応するアミノ酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、
項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
6． 配列番号7で示されるアミノ酸配列を有する項1または2に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
7． 項1〜6のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
8． 項7に記載の遺伝子を有するベクター。
9． 項8に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
10． 宿主がメタノール資化酵母である項9に記載の形質転換体。
11． 項10に記載のメタノール資化酵母をメタノールの存在下で培養し、項1〜6のいずれかに記載の安定化ラクダ科動物抗体を回収することを特徴とする、ラクダ科動物抗体の製造方法。
本発明により熱安定性が増加された抗体は、保存、運搬などの取り扱いが容易になるだけでなく溶解性の増大や、容器への付着性の改善などの効果があり、抗体の取扱性が向上した。
本明細書において、ラクダ科動物としては、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、
アルパカ、ビクーナ、グアノコが挙げられ、好ましくはヒトコブラクダ、ラマが挙げられる。
アルパカ、ビクーナ、グアノコが挙げられ、好ましくはヒトコブラクダ、ラマが挙げられる。
本明細書において、ラクダ科抗体は、配列番号1のアミノ酸配列の他に、NCBIデータベ
ースのAccessionID が1SHM|A(配列番号9)、AAQ19990(配列番号10)、AAL35851(配列番号11)、CAD22480(配列番号12)、CAH60900(配列番号13)、CAL18275(配列番号14)、BAD00686 (
配列番号15)、BAD00353 (配列番号16)、1JTP_A (配列番号17)、AAS49165(配列番号18)、AAL31965(配列番号19)、CAB40724(配列番号20) BAD00448 (配列番号21)である各アミノ酸
配列が例示できる。
ースのAccessionID が1SHM|A(配列番号9)、AAQ19990(配列番号10)、AAL35851(配列番号11)、CAD22480(配列番号12)、CAH60900(配列番号13)、CAL18275(配列番号14)、BAD00686 (
配列番号15)、BAD00353 (配列番号16)、1JTP_A (配列番号17)、AAS49165(配列番号18)、AAL31965(配列番号19)、CAB40724(配列番号20) BAD00448 (配列番号21)である各アミノ酸
配列が例示できる。
なお、配列番号9-14、19、20の抗体はLama glama（ラマ）由来であり、配列番号15-17
、21の抗体はCamelus dromedarius (ヒトコブラクダ)由来であり、配列番号18 の抗体はCamelus bactrianus（フタコブラクダ）由来である。
、21の抗体はCamelus dromedarius (ヒトコブラクダ)由来であり、配列番号18 の抗体はCamelus bactrianus（フタコブラクダ）由来である。
本発明で使用されるラクダ科動物抗体（重鎖抗体ともいう）は、軽鎖を有さず、重鎖のみから構成される抗体であり、重鎖は、可変領域を有する限り、不変領域の一部を欠失または置換した抗体またはそのフラグメントであってもよい。
本発明において、２つのシステイン残基はアミノ酸の挿入により重鎖抗体に導入してもよいが、好ましくはアミノ酸置換によりラクダ科動物抗体のVHHドメインに導入される。
ラクダ科動物抗体のVHHドメインとは、配列番号１のアミノ酸配列の1〜117番目の配列を
意味する。配列番号１は重鎖抗体の可変領域のドメイン（VHHドメイン）のみで不変領域
は含んでいない。
ラクダ科動物抗体のVHHドメインとは、配列番号１のアミノ酸配列の1〜117番目の配列を
意味する。配列番号１は重鎖抗体の可変領域のドメイン（VHHドメイン）のみで不変領域
は含んでいない。
システイン残基が導入される位置としては、配列番号1のポリペプチドの49番目(アラニン)と70番目(イソロイシン)に対応する位置が挙げられる。
ラクダ科動物抗体において、天然に存在するS-S結合は、ホモロジー検索により容易に
保存されていることが確認される。ラマの場合は１つ、ラクダの場合は1つないし２つで
ある。
保存されていることが確認される。ラマの場合は１つ、ラクダの場合は1つないし２つで
ある。
人工的なS-S結合は、他のVHHドメインに保存されていないS-S結合であり、例えば49位
と70位に相当するアミノ酸は、アラニン、バリン(49位)と、イソロイシンの代わりにバリン、メチオニン(70位)の変異も見られるが、これらの位置には、システイン残基は天然に存在しないので、当該位置の間のS-S結合は人工的に導入されたことを容易に確認できる
。
と70位に相当するアミノ酸は、アラニン、バリン(49位)と、イソロイシンの代わりにバリン、メチオニン(70位)の変異も見られるが、これらの位置には、システイン残基は天然に存在しないので、当該位置の間のS-S結合は人工的に導入されたことを容易に確認できる
。
抗体ドメイン（一般的な抗体の軽鎖可変ドメイン、軽鎖定常（不変）ドメイン、VHHド
メイン、組織適応性抗原軽鎖）のS-S結合を除去するためには、システインのペアをアラ
ニン?バリン、バリンーバリン、アラニン?アラニン、アラニンーイソロイシン、グリシンーロイシンに変換する事が有効である事が示されている（Journal of Biol. Chem., 280,
26, 24752-24758 (2005))。これから、除去とは逆にS-S結合を導入する場合、アラニン
ーアラニン、アラニンーバリン、バリンーバリン、イソロイシンーアラニン、グリシンーロイシンのペアで近傍に存在するものをシステイン残基に置換しS-S結合を形成させるこ
とが抗体ドメインの安定化に有効であるとの着想を得た。
メイン、組織適応性抗原軽鎖）のS-S結合を除去するためには、システインのペアをアラ
ニン?バリン、バリンーバリン、アラニン?アラニン、アラニンーイソロイシン、グリシンーロイシンに変換する事が有効である事が示されている（Journal of Biol. Chem., 280,
26, 24752-24758 (2005))。これから、除去とは逆にS-S結合を導入する場合、アラニン
ーアラニン、アラニンーバリン、バリンーバリン、イソロイシンーアラニン、グリシンーロイシンのペアで近傍に存在するものをシステイン残基に置換しS-S結合を形成させるこ
とが抗体ドメインの安定化に有効であるとの着想を得た。
そこで実施例ではVHHドメイン中で近傍に存在する（β炭素間の距離が約４Å）の49番
目(アラニン)と70番目(イソロイシン)をシステインに置換した。
目(アラニン)と70番目(イソロイシン)をシステインに置換した。
抗体にシステイン残基を導入する方法としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)
；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日
本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸
アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日
本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸
アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
本発明の安定化されたラクダ科動物抗体は、例えば該抗体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、このベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培地中で培養し、抗体を回収することにより得ることができる。前記ベクターで形質転換される宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌などの微生物が例示され、大腸菌、酵母が好ましい。酵母としては、例えばメタノール資化酵母を好ましく例示できる。
本発明で得られた抗体は、エンザイムイムノアッセイ（EIA）法、イムノブロッティン
グ法、ドットブロット法、イムノクロマト法、マルチ蛍光マイクロビーズ法等の免疫学的検出法に用いることができ、EIA法と、イムノクロマト法（金コロイド法など）が好まし
い。例えば、EIA法としては、サンドイッチELISA法、競合法及び直接法等を例示できる。或いは、捕捉用抗体を固相化する上記のheterogeneousな検出系ばかりではなく、捕捉用
抗体も浮遊する、homogeneousな検出系であっても良い。供試抗体を標識する場合には、
酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ
）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチアネート）、生物発光物質（例えば、ルシフェリン-ルシフェラーゼ）、化学発光物質（例えば、ルミノール、アクリジン誘導体又
はアダマンタン誘導体）、ビオチン/標識ストレプトアビジン、金コロイド等を用いるこ
とができる。具体的な用途としては、例えば妊娠検査薬などの用途を例示できる。
グ法、ドットブロット法、イムノクロマト法、マルチ蛍光マイクロビーズ法等の免疫学的検出法に用いることができ、EIA法と、イムノクロマト法（金コロイド法など）が好まし
い。例えば、EIA法としては、サンドイッチELISA法、競合法及び直接法等を例示できる。或いは、捕捉用抗体を固相化する上記のheterogeneousな検出系ばかりではなく、捕捉用
抗体も浮遊する、homogeneousな検出系であっても良い。供試抗体を標識する場合には、
酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ-ガラクトシダーゼ
）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチアネート）、生物発光物質（例えば、ルシフェリン-ルシフェラーゼ）、化学発光物質（例えば、ルミノール、アクリジン誘導体又
はアダマンタン誘導体）、ビオチン/標識ストレプトアビジン、金コロイド等を用いるこ
とができる。具体的な用途としては、例えば妊娠検査薬などの用途を例示できる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１
材料と方法
新規ジスルフィド結合導入位置
抗体ドメインの分子内部に人工的なS-S結合を導入した例はない。そこで本研究では分子
内部に埋もれた49番（アラニン）と70番（イソロイシン）のアミノ酸をシステインに置換しその効果を調べた。
実施例１
材料と方法
新規ジスルフィド結合導入位置
抗体ドメインの分子内部に人工的なS-S結合を導入した例はない。そこで本研究では分子
内部に埋もれた49番（アラニン）と70番（イソロイシン）のアミノ酸をシステインに置換しその効果を調べた。
ラマVHH：ここで用いたラマVHHはヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）のαサブユニット
を抗原とするものである。Protein Data Bankの1G9Eのアミノ酸配列（配列番号１：49番
（アラニン）と70番（イソロイシン）は太字・下線で示す）をもとに、酵母のコドン頻度
に合わせ、cDNA（配列番号２）を作製し、これをメタノール資化酵母Pichia pastorisの
発現用ベクターに組み込んだ。新規ジスルフィド結合導入変異体は抗hCGラマVHHの49位、70位をシステインにしたプライマー（それぞれ配列番号３、４及び５、６）を用いたPCR
法によりシステインを導入し、作製した（配列番号７：導入したシステインを太字・下線で示す、配列番号８）。
を抗原とするものである。Protein Data Bankの1G9Eのアミノ酸配列（配列番号１：49番
（アラニン）と70番（イソロイシン）は太字・下線で示す）をもとに、酵母のコドン頻度
に合わせ、cDNA（配列番号２）を作製し、これをメタノール資化酵母Pichia pastorisの
発現用ベクターに組み込んだ。新規ジスルフィド結合導入変異体は抗hCGラマVHHの49位、70位をシステインにしたプライマー（それぞれ配列番号３、４及び５、６）を用いたPCR
法によりシステインを導入し、作製した（配列番号７：導入したシステインを太字・下線で示す、配列番号８）。
安定性の評価：天然型配列は大腸菌で発現後、Resource Sカラム（アマシャムバイオサイ
エンス社）で精製した。また、変異型配列はP. pastorisをホストとして発現し、SP Sepharose FF及びHiLoad26/60Superdex75カラム（アマシャムバイオサイエンス社）で精製を
行った。これらについて、中性（20mMリン酸カリウム、pH7.1）で円二色性分散計（日本
分光、J-720）を用いて熱による変性過程を調べ、変性の中点温度を測定した。なお測定
は１cmセルを使い、蛋白質濃度４μM、昇温速度は1℃／分で行なった。
エンス社）で精製した。また、変異型配列はP. pastorisをホストとして発現し、SP Sepharose FF及びHiLoad26/60Superdex75カラム（アマシャムバイオサイエンス社）で精製を
行った。これらについて、中性（20mMリン酸カリウム、pH7.1）で円二色性分散計（日本
分光、J-720）を用いて熱による変性過程を調べ、変性の中点温度を測定した。なお測定
は１cmセルを使い、蛋白質濃度４μM、昇温速度は1℃／分で行なった。
抗原hCGとの結合：精製した天然型VHH、及び変異体は臭化シアン活性化セファロース（アマシャムバイオサイエンス社）に付属のプロトコールにより固相化した。それぞれのVHHを結合した20μLのセファロース樹脂（10μgのVHHを結合）と10μgのhCG（シグマアルドリッチ社）をバッファー（20 mM Tris-HCl 、0.15 M NaCl、pH 8）中、室温で90分間インキュベートした後、3回同じバッファーで樹脂を洗浄した。洗浄した樹脂に10μLのSDS電
気泳動用のサンプルバッファー（78mM Tris-HCl、pH6.8、2.5% SDS、2%グリセロール、1.25mg/mLブロモフェノールブルー、120mMβ-メルカプトエタノール）を加えて、95℃で15
分間インキューべートしVHHに結合したhCGを溶出した。樹脂を遠心で沈澱させ、上清をSDS電気泳動にかけ、クーマジーブリリアントブルーで染色を行なった。
結果
得られた変異体の安定性：新規ジスルフィド結合を導入した変異体は協同的な熱変性を示し（図１）、中性、室温で安定な構造を維持していることが明らかとなった。さらに天然型VHHドメインに比較して、変性の中点温度は約９℃向上しており、新規ジスルフィド結
合導入により、大幅に熱安定性が向上した。
得られた変異体の抗原hCGへの結合：得られた変異体について、抗原であるhCGとの結合を調べた。その結果を図２に示す。変異体は天然型配列（図２のCC）と同等の抗原結合性を示した。これらの結果は新規ジスルフィド結合の導入により抗原結合活性が損なわれていないことを示している。
気泳動用のサンプルバッファー（78mM Tris-HCl、pH6.8、2.5% SDS、2%グリセロール、1.25mg/mLブロモフェノールブルー、120mMβ-メルカプトエタノール）を加えて、95℃で15
分間インキューべートしVHHに結合したhCGを溶出した。樹脂を遠心で沈澱させ、上清をSDS電気泳動にかけ、クーマジーブリリアントブルーで染色を行なった。
結果
得られた変異体の安定性：新規ジスルフィド結合を導入した変異体は協同的な熱変性を示し（図１）、中性、室温で安定な構造を維持していることが明らかとなった。さらに天然型VHHドメインに比較して、変性の中点温度は約９℃向上しており、新規ジスルフィド結
合導入により、大幅に熱安定性が向上した。
得られた変異体の抗原hCGへの結合：得られた変異体について、抗原であるhCGとの結合を調べた。その結果を図２に示す。変異体は天然型配列（図２のCC）と同等の抗原結合性を示した。これらの結果は新規ジスルフィド結合の導入により抗原結合活性が損なわれていないことを示している。
Claims (9)
- ラクダ科動物抗体VHHドメインに2個のシステイン残基を導入し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、安定化ラクダ科動物抗体であって、配列番号1のポリペプチドの49番目と70番目に相当するアミノ酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、安定化ラクダ科動物抗体。
- アミノ酸の数が109〜133であるVHHドメインを有する請求項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
- 配列番号1のポリペプチドの49番目(アラニン)と70番目(イソロイシン)に対応するアミノ
酸をシステイン残基に置換し、これらシステイン残基間にS-S結合を導入してなる、請求
項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。 - 配列番号7で示されるアミノ酸配列からなる請求項1に記載の安定化ラクダ科動物抗体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
- 請求項5に記載の遺伝子を有するベクター。
- 請求項6に記載のベクターで宿主を形質転換された形質転換体。
- 宿主がメタノール資化酵母である請求項7に記載の形質転換体。
- 請求項8に記載のメタノール資化酵母をメタノールの存在下で培養し、請求項1〜6のいず
れかに記載の安定化ラクダ科動物抗体を回収することを特徴とする、ラクダ科動物抗体の製造方法。
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