JPH11287804A - 免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原又は抗体の反応性を向上させた高感度の
免疫測定試薬の製造方法及びそれにより得られる免疫測
定試薬、並びに、免疫測定方法を提供する。 【解決手段】 抗原又は抗体を不溶性担体へ担持させて
なる免疫測定試薬の製造方法であって、上記抗原又は抗
体は、予めタンパク質折り畳み因子によって処理された
ものである免疫測定試薬の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原又は抗体の活
性を向上させることによる高感度な免疫測定試薬の製造
方法及びそれにより得られる免疫測定試薬、並びに、免
疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原又は抗体を担持した不溶性担体によ
る抗原抗体反応を利用する免疫測定試薬は、血液等の体
液中の微量成分の測定に汎用されている。このような免
疫測定試薬の製造方法としては、不溶性担体に対して抗
原又は抗体を物理吸着させる方法が一般的である。すな
わち、ラテックス、プラスチックプレート等の疎水性材
料や、タンニン酸処理した赤血球等の不溶性担体に対
し、緩衝溶液、生理食塩水又は精製水等の水性溶媒中に
おいて、直接、抗原又は抗体を接触、吸着させ、疎水性
相互作用により固定化させることにより、抗原又は抗体
を不溶性担体に担持させていた。

【０００３】免疫測定試薬に用いられる抗原又は抗体
は、ヒト、マウス、ウサギ及びヤギ等の生体試料から直
接精製して使用することが多い。また、それらの遺伝子
を大腸菌や酵母等に組み込み、遺伝子工学的に生産し、
精製する方法も採られている。

【０００４】抗原又は抗体等のタンパク質は、特有の立
体構造を有することにより、その機能を発揮する。しか
しながら、タンパク質に熱等の環境的ストレスが加わる
と、その立体構造が変化し、タンパク質の持つ特性が消
失してしまう場合がある。また、遺伝子工学的手法によ
り、大腸菌等に発現させた場合においても、封入体と呼
ばれる不活性なタンパク質として生産される場合があ
る。更に、抗原又は抗体を生産・精製する過程で環境ス
トレスを受け、立体構造の変化による機能の消失を引き
起こす場合が多い。

【０００５】ラテックス等の不溶性担体に抗原又は抗体
を担持させる際に、不活性な抗原又は抗体が存在する
と、上記不溶性担体に不活性型タンパク質が吸着し、そ
の結果、試薬の感度低下及び非特異的自己凝集等が起こ
り、試薬としての性能が損なわれてしまう場合があっ
た。

【０００６】タンパク質の安定化方法として、例えば、
酸化防止剤；牛血清アルブミン等のタンパク質；マンニ
トール、ソルビトール等の糖アルコール等を目的とする
タンパク質溶液中に共存させる方法等が提案されてい
る。しかしながら、これらの方法は、ある程度の効果は
見られるものの、タンパク質の種類によっては充分満足
できるものではなかった。

【０００７】特開平１−２１７２６６号公報には、不溶
性担体に吸着した抗原又は抗体等のタンパク質を安定化
し、抗原又は抗体の反応性低下の防止や、不溶性担体の
非特異的自己凝集を防止する目的として、カゼイン等を
用いる方法が開示されている。しかしながら、カゼイン
を失活防止剤や非特異的自己凝集防止剤として用いる
と、検体である体液中に混入してくる内在性のペルオキ
シダーゼにカゼインが吸着し、正確な測定が妨害される
という問題があった。例えば、検体として溶血した血清
を用いた場合、赤血球中のグルタチオンペルオキシダー
ゼ等と吸着して反応を妨害することがあった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、抗原又は抗体の反応性を向上させた高感度の免疫測
定試薬の製造方法及びそれにより得られる免疫測定試
薬、並びに、免疫測定方法を提供することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗原又は抗体
を不溶性担体へ担持させてなる免疫測定試薬の製造方法
であって、上記抗原又は抗体は、予めタンパク質折り畳
み因子によって処理されたものである免疫測定試薬の製
造方法である。以下、本発明を詳述する。

【００１０】本発明の免疫測定試薬の製造方法において
は、抗原又は抗体を、予めタンパク質折り畳み因子によ
って処理することを特徴とする。本発明において用いら
れるタンパク質折り畳み因子としては、抗原又は抗体の
立体構造を維持する作用又は構造変化をすばやく修複す
る作用を有するものであれば特に限定されないが、分子
シャペロン及びベプチジルプロリルシスートランスイソ
メラーゼ（以下「ＰＰＩアーゼ」ともいう）からなる群
より選択される少なくとも１種が好適に用いられる。

【００１１】本発明においては、ブロテインジスルフィ
ドイソメラーゼ（以下「ＰＤＩ」ともいう）を併用すれ
ばより効果的である。ＰＤＩはタンパク質の立体構造中
に含まれるジスルフィド結合の形成に関与する酵素群の
総称である。

【００１２】上記分子シャペロンは、熱ショックタンパ
ク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々な環境スト
レスにさらされた際に生産されるものである。上記分子
シャペロンは、原核生物、真核生物を問わず広く存在し
ており、特に大腸菌から生産される分子シャペロンとし
て、ＧｒｏＥが良く知られている。上記ＧｒｏＥは、タ
ンパク質の種類を問わず、ＡＴＰ存在下、非特異的にタ
ンパク質の立体構造形成に関与することが明らかにされ
ている。例えば、上記ＧｒｏＥの構成体であるＧｒｏＥ
Ｌは、７個のサブユニットが環状に連なったドーナツ型
構造が２段に重なった、合計１４サブユニットからなる
特徴的な構造を有している。ＧｒｏＥＬはドーナツ構造
の凹部に変性タンパク質を捕捉し、ＡＴＰ等のヌクレオ
チドの消費と補助因子であるＧｒｏＥＳの結合を伴っ
て、効率的に正しい立体構造のタンパク質へと折り畳む
ことが知られている。

【００１３】上記分子シャペロンとしては、上記の大腸
菌から生産されるもの以外に、例えば、大陽菌のＤｎａ
ｋ；酵母のＳｓａｌ−４ｐ、Ｓｓｃｌｐ、Ｋａｒ２ｐＢ
ｉｐ、Ｇｒｐ７８；ほ乳類のｈｓｃ７０、ＨＳＰ５８、
ＨＳＰ１０、ＨＳＰ９０；カビ類のＨＳＰ６０；植物由
来のｒｕｂｉｓｃｏ；大陽菌のＳｅｃＢ等が挙げられ
る。

【００１４】上記ＰＰＩアーゼは、ポリペプチド鎖中の
構成アミノ酸であるプロリン残基のＮ末端側ペプチド結
合の回転を促進する作用を有する酵素である。このプロ
リン残基のＮ末端側ペプチド結合は、自由に回転でき
ず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。そ
の結果、構造変化が生じたタンパク質鎖の正常構造への
変換は、プロリンのシス−トランス異性化反応等が律速
となり、自発的な再生が阻害される。

【００１５】これに対して、上記ＰＰＩアーゼは、上記
プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合の回転を促進する
ため、タンパク質の高次構造の再生を促進し、変性タン
パク質を再生させることができる。

【００１６】上記ＰＰＩアーゼとしては、シクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）（免疫抑制剤であるサイ
クロスポリンＡへの結合タンパク質）タイプ及びＦＫＢ
Ｐ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結合タンパク質）
タイプのうち、いずれのＰＰＩアーゼも用いることがで
きる。

【００１７】上記真核生物由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、ブタ由来の１９ＫＰＰＩアー
ゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ産物、トマトや
トウモロコシ等の高等植物由来のシクロフィリン（Ｃｙ
ｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、アカパンカビ由来のシクロフィ
リン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、Ｎｃ−ＦＫＢＰ、酵
母由来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、
ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が挙げられる。ま
た、例えば、シグマ社から市販されているシクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）タイプのＰＰＩアーゼ
（子牛胸腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰＩアーゼ（ヒ
ト由来）等が手軽に入手できる。

【００１８】上記真正細菌由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、大腸菌由来のＰＰＩアーゼ−
α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる（蛋白質核酸酵素
Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．１１（１９９１））。

【００１９】上記で挙げた折り畳み因子のうち、分子シ
ャペロンは、好ましくは古細菌由来の分子シャペロンで
ある。古細菌由来の分子シャペロンのうち、ＨＳＰ６０
に属する分子シャペロンは、大腸菌のＧｒｏＥＬと同様
の作用を有するが、ＧｒｏＥＳに相当する補助因子なし
で同様の作用を示すことがわかっている。従って、古細
菌由来の分子シャペロンを大量に得ようとする場合、補
助因子の調製の手間が操作が省ける分、作業性に優れ
る。

【００２０】一方、古細菌由来のＰＰＩアーゼは、随意
検討を重ねた結果、本来ＰＰＩアーゼが持つプロリン残
基のＮ末端側ペプチド結合シス−トランス異性化作用だ
けではなく、分子シャペロニン様のタンパク質凝集抑制
作用を併せ持つことがわかった。従って、古細菌由来の
ＰＰＩアーゼを用いることにより、タンパク質の折り畳
み作用を更に効果的に行うことが可能である。

【００２１】上記古細菌のタンパク質折り畳み因子の種
類は、大陽菌等の真正細菌と比較して少ない。そのた
め、古細菌は最小限の種類の折り畳み因子でタンパク質
の折り畳みを発現することから、個々の折り畳み因子の
タンパク質に対する特異性が低く、汎用性に優れている
と期待される。そのタンパク質折り畳み効果は、分子シ
ャペロン、ＰＰＩアーゼ及びＰＤＩの各々の折り畳み因
子を組み合わせることによって更に向上することが期待
される。

【００２２】上記古細菌のうち、好熱性古細菌に属する
古細菌を用いることがより好ましい。好熱性古細菌由来
の折り畳み因子は熱安定性に侵れているため、高温条件
下にて抗原又は抗体を処理する必要がある際には有利で
ある。

【００２３】上記好熱性古細菌は、温泉地帯や海底の熱
水床といった高温な極限環境で生育する古細菌の総称で
あり、通常、５５℃以上の温度環境で生育する菌であ
る。

【００２４】上記好熱性古細菌としては特に限定され
ず、例えば、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍ
ａ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、
スルフロコッカス（Ｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、
デサルフォロバス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｂｕｓ）属、ア
シディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）属、サーモプロテ
ウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、デスルフロコ
ッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモ
フィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモディス
カス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ）属、ピロディクチウ
ム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、スタフィロサーマス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモコッカ
ス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アーカエオグロバス（Ａｒｃ
ｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ピロバクラム（Ｐｙｒｏｂ
ａｃｕｌｕｍ）属、スルフリスフェラ（Ｓｕｌｆｕｒｉ
ｓｐｈａｅｒａ）属、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒ
ｕｍ）属、イグネオコッカス（Ｉｇｎｅｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、サーモスフェラ（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒ
ａ）属、ハイパーサーマス（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕ
ｓ）属、スルフォフォーボコッカス（Ｓｕｌｆｏｐｈｏ
ｂｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルドコッカス（Ｃａｌｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属、フェログロバス（Ｆｅｒｏｇｌｏｂｕ
ｓ）属、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）
属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属
等が挙げられる。

【００２５】本発明に用いられる古細菌は、特にメタノ
コッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属に所属する
古細菌が好ましい。上記メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属菌としては、メタノコッカス・サー
モリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔ
ｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ；ＡＴＣＣ３
５０９７）、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ；ＡＴＣＣ３３２７
３）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｄｅｌｔａｅ；ＡＴＣＣ３５２９４）、メタ
ノコッカス・フリシュス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｒｉｓｉｕｓ；ＡＴＣＣ４３３４０）、メタノコッ
カス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ；ＡＴＣＣ４３０００）、メタ
ノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｎｎｉｅｌｉｉ；ＡＴＣＣ３５０８９）等が挙げ
られる。なかでもメタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉ
ｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）又はメタノコッカス・ボル
タエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）が
より好ましい。

【００２６】本発明において、上記折り畳み因子は、真
核生物、真正細菌又は古細菌から調製したものを直接精
製して得ることができる。また、真核生物、真正細菌又
は古細菌から調製したＤＮＡから発現されたものを用い
ることができる。

【００２７】上記折り畳み因子を真核生物、真正細菌又
は古細菌から直接調製する方法としては、真核生物、真
正細菌又は古細菌を適当な培地及び培養条件下で培養
し、培養した菌体を破砕後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー等の従来公知の精製方法
によって得る方法が挙げられる。

【００２８】本発明においては、上記真核生物、真正細
菌又は古細菌の折り畳み因子をコードするＤＮＡ塩基配
列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物
に組み込んで調製することが、大量に生産できるので好
ましい。具体的な手法としては、「新生物化学実験の手
引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロト
コール等の常法を応用することで充分である。

【００２９】上記ＤＮＡ塩基配列としては、例えば、メ
タノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）由来ＰＰＩアーゼについては特開平１０−９１
号公報に、同菌由来シャペロニンについては特願平９−
３５０６２３号公報に記載されている。

【００３０】具体的には、上記古細菌としてメタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）
を用いて、このシャペロニンを得る方法としては次の方
法が採用できる。即ち、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ―１６４３８として寄託さ
れているプラスミドｐＥＴＴＳＩは、メタノコッカス・
サーモリソトロフィカスのシャペロニンをコードする遺
伝子を含むプラスミドであるが、これを鋳型とし、適当
な制限酵素サイトを含むプライマーを用い、常法に従っ
てＰＣＲ法によって増幅させる。ＰＣＲ産物から得られ
る遺伝子の断片を、耐性マーカーを含むプラスミドに挿
入し、組み換えプラスミドで大腸菌や酵母等を形質転換
する。この形質転換体を培養し、培養菌体を破砕後、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
等の従来公知の精製方法によって、メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカスのシャペロニンを得ることができ
る。

【００３１】本発明において、上記タンパク質折り畳み
因子による処理は、抗原又は抗体とタンパク質折り畳み
因子結合担体とを反応させることにより行うことが好ま
しい。抗原及び抗体を臨床診断薬等に用いる場合、折り
畳み因子が試薬中に混在していると、試薬の感度等に悪
影響を及ぼす場合が考えられる。従って、各々の折り畳
み因子を不溶性担体に結合して折り畳み因子結合担体と
しておくことにより、折り畳み因子と抗原及び抗体タン
パク質との分離操作が簡略化され、且つ、繰り返し使用
可能なことにより経済性に優れたものとすることができ
る。

【００３２】上記折り畳み因子結合担体中に使用される
不溶性担体としては、タンパク質の固定等に用いられて
いるものであれば特に限定されず、例えば、セルロー
ス、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲン、
アミノ酸ポリマー、ポリスチレン、ポリアクリルアミ
ド、イオン交換樹脂、ビニルポリマー、ガラスビーズ、
セラミック、光架橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられ
る。また、セルロースやアガロースを臭化シアンで活性
化した担体やビニルポリマーに官能基を導入した担体等
がタンパク質の結合用担体として市販されており、それ
らを用いてもよい。

【００３３】上記折り畳み因子を上記不溶性担体に担持
する方法としては、タンパク質の固定等に用いられてい
るものであれば特に限定されず、例えば、共有結合法、
物理的吸着法、イオン結合法、架橋法、包括格子型、マ
イクロカプセル格子型等が挙げられる。

【００３４】その他、折り畳み因子を、ヒスチジン６残
基又はグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等と
の融合蛋白として発現させれば、市販のアフィニティー
担体との固定が容易にできるため、簡単に折り畳み因子
結合担体を得ることができる。上記折り畳み因子の吸着
量は特に限定されないが、上記不溶性担体１ｃｍ3 当た
りタンパク量０．１〜１０００ｍｇが好ましい。

【００３５】上記折り畳み因子結合担体を用いた抗原又
は抗体の処理方法としては特に限定されず、例えば、上
記折り畳み因子結合担体をカラムに充填し、これに抗原
又は抗体を含有する液を展開、反応させて溶出された抗
原又は抗体を回収する方法、上記折り畳み因子結合担体
と抗原又は抗体とを混合、反応させた後に上記折り畳み
因子結合担体を沈殿させて上清に含まれる抗原又は抗体
を回収する方法、折り畳み因子結合膜と抗原又は抗体と
を反応させる方法等が挙げられる。

【００３６】本発明の免疫測定試薬の製造方法は、例え
ば、以下のようにして実施される。まず、抗原又は抗体
を好適な緩衝液で希釈し、これを抗原液又は抗体液とす
る。この抗原液又は抗体液と上記タンパク質折り畳み因
子とを水性媒体中で接触させ、所定時間インキュベート
することにより抗原又は抗体を処理し、立体構造を正常
化する。

【００３７】上記水性媒体中における上記タンパク質折
り畳み因子のモル濃度は、抗原又は抗体のモル濃度の
０．０５〜５００倍が好ましい。０．０５倍未満である
と、期待される効果が得られず、５００倍を超えると、
特異的な凝集を阻止する場合がある。

【００３８】その後、必要であれば上記折り畳み因子を
除去する。その際、折り畳み因子結合担体を使用すれ
ば、遠心分離等の操作により容易に除去することが可能
である。折り畳み因子により処理された抗原又は抗体
を、ラテックス等の不溶性担体と水性媒体中で接触さ
せ、所定時間インキュベートすることにより、抗原又は
抗体を上記不溶性担体に固定し、担持させることができ
る。なお、上記抗原又は抗体の不溶性担体への担持は、
折り畳み因子結合担体の調製とは別途実施されるもので
ある。

【００３９】上記水性媒体としては、用いられる抗原又
は抗体に対して最適な緩衝液が適宜選択されるが、例え
ば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリ
シン系緩衝液等の一般に用いられている緩衝液が好適に
用いられる。上記緩衝液のイオン強度は、用いられる抗
原又は抗体に対して最適な強度であればよい。また、上
記緩衝液のｐＨは、４．５〜９．０が好ましい。

【００４０】上述の抗原又は抗体を担持させるための不
溶性担体としては、全体又は部分的に疎水性表面を有す
るものであれば特に限定されず、例えば、ラテックス、
プラスチックピーズ、プラスチックプレート等の合成高
分子からなる材料；シリカ等の無機材料；タンニン酸処
理した赤血球；ニトロセルロース等の高分子膜等が挙げ
られる。特に、工業的に安定した品質で大量生産するこ
とができるので、ラテックス、ブラスチックビーズ、プ
ラスチックプレート等のプラスチック成形品が好適に用
いられる。

【００４１】上記不溶性担体は、その表面に、化学結合
を目的とする種々の官能基を有するものであってもよ
い。また、アビジン・ビオチン等の親和性を利用して物
質を固定化するためのスペーサー等を有するものであっ
てもよい。

【００４２】上記不溶性担体としては、検査の全自動処
理による検査時間の短縮・省力化が可能なこと等の理由
から、ラテックスからなるものが特に好適に用いられ
る。上記ラテックスとしては特に限定されず、例えば、
ポリスチレン系、合成ゴム系等が挙げられる。好ましく
は、ポリスチレン系ものものである。上記ラテックスか
らなる不溶性担体の平均粒径は、０．０５〜２．０μｍ
が好ましい。より好ましくは、０．１〜０．５μｍであ
る。

【００４３】本発明２は、本発明１の免疫測定試薬の製
造方法により得られた免疫測定試薬である。本発明２の
免疫測定試薬は、抗原又は抗体の反応性低下が防止され
たものであるので、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）、ラテックス凝集法等に好適に用い
ることができる。

【００４４】本発明３は、本発明２によって得られた免
疫測定試薬を用いて測定する免疫測定方法である。本発
明３の免疫測定方法は、タンパク質折り畳み因子で処理
した抗原又は抗体を担持した不溶性担体と、被検物質中
の対応する抗体又は抗原との抗原抗体反応を行う。

【００４５】上記反応液としては、用いられる抗原又は
抗体に対して適時選択されるが、例えば、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等の一般に用いられ
ている緩衝液が好適に使用される。上記緩衝液のイオン
強度は、用いられる抗原又は抗体に対して最適な強度で
あればよい。上記緩衝液のｐＨは、４．５〜９．０が好
ましい。

【００４６】次いで、ラテックス凝集法の測定原理につ
いて例示する。被検物質中に含まれている抗原又は抗体
と、本発明によって作製された被検物質中に含まれてい
る抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原をラテックスに
担持した免疫試薬を混合し、抗原抗体反応の結果生じた
凝集の度合いを光学的に測定することにより、被検物質
中の抗原又は抗体の量を測定する。具体的には、ラテッ
クスの凝集の度合いを光学的に検出する方法において
は、測定は散乱光強度、吸光度及び透過光強度を測定す
る光学機器で行う。測定波長は、２５０〜１，０００ｎ
ｍが使用できる。測定方法については、公知の方法に従
い、使用する不溶性担体の粒子の大きさ、又は、濃度の
選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度又は
透過光強度の増加若しくは減少を測定することにより行
われる。また、これらの方法を併用することもできる。

【００４７】

【実施例】以下の本発明の実施例においては、血清中の
抗トレポネーマ抗体の免疫測定試薬についてその効果を
具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
るものではない。また、参考例１に好熱性古細菌由来分
子シャペロン（シャペロニン）の調製方法の一例を記載
したが、これに限定されるものではない。他の折り畳み
因子も公知の方法にて調製することができる。

【００４８】参考例１ 好熱性古細菌由来分子シャペロ
ン（シャペロニン）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大陽菌へのトランスフ
ォーメーション メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｓ）のシャペロニンをコードする遺伝子の断片
を、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１６４３８として寄託されているプラスミドｐＥＴＴ
ＳＩを鋳型とし、配列表の配列番号１のフォワードプラ
イマー及び配列表の配列番号２のリバースプライマーを
用いるＰＣＲ法によって増幅させた。

【００４９】上記プライマーを用いるＰＣＲ法によって
増幅、回収された断片を、ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩで消化
後、同様の制限酵素処理が施された発現ベクターｐＥＴ
−１１ｄ（ストラティジェン社製）にライゲーションし
た。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティ
ジェン社製）にトランスフォーメーションし、アンピシ
リン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地プレート（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ
（ｐＨ７．０）にて培養後、コロニーをピックアップ
し、グリセロールストックとした。

【００５０】（２）組み換え大腸菌からのシャペロニン
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ
（ｐＨ７．０））２００ｍＬに、上記発現プラスミドを
保持するＢＬ２１（ＤＥ３）株（組み換え大陽菌）一白
耳を接種し、３７℃で１６時間予備培養した。この培養
液を上記ＬＢ培地６リットルに植菌し、ジャーファメン
ターにより本培養を行った。本培養開始３時間後に、Ｉ
ＰＴＧ（和光純薬工業社製）を１ｍＭ濃度となるように
添加し、更に、培養を４時間継続した。培養終了後、遠
心分離にて菌を回収し、−３０℃にて凍結保存した。

【００５１】次に、回収した組み換え大陽菌を、５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７．５／５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 含有）に懸濁させ、超音波処理にて菌体破砕し
た。遠心分離にて上清を採取し、９０分問、６５℃の水
浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集さ
せ、遠心分離にて除去した。得られた上清に硫酸アンモ
ニウムを１．３Ｍ濃度になるように添加し、硫安塩析を
行った後、上清をＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ
（東ソー社製）による疎水クロマトグラフィーにより精
製した。シャペロニンに相当するサイズのタンパク質が
存在するフラクションを回収し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
（ｐＨ６．８）−ＫＯＨ、５％グリセロール緩衝液で透
析した。透析内液をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５Ｐ
Ｗカラム（東ソー社製）による陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより精製した。シャペロニンに相当するサイ
ズのタンパク質が存在するフラクションを回収した後、
これを限外濃過によって濃縮し、濃縮液をＴＳＫｇｅｌ
Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社製）によるゲル
濾過（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、展開液：２５ｍＭＨ
ＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により精製し、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス由来のシャペロニンを含
むフラクションを得た。

【００５２】なお、シャペロニンの分子量は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにおいて約６０ＫＤａであり、この分子量を有
する画分をトレースすることにより確認した。また、シ
ャペロニンはＡＴＰアーゼ活性を有するので、Ｌｉｌ
ｌ，Ｒ．，Ｄｏｗｈａｎ，Ｗ．＆Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．
著、Ｃｅｌｌ、６０号２７１〜２８０号記載のＡＴＰア
ーゼ活性測定法を用いることにより評価した。

【００５３】本フラクションに塩化マグネシウム、ＡＴ
Ｐ及び硫酸アンモニウムをそれぞれ５０ｍＭ、０．２５
ｍＭ及び３００ｍＭとなるように添加し、３０℃にて５
時間インキュベートした。この溶液を再度ゲル濃過に供
し、シャペロニンの１６量体フラクションを得た。この
画分を以下の実施例及び比較例に使用した。

【００５４】実施例１ （１）遺伝子工学的方法による梅毒菌（トレポネーマ・
パリダム ニコルス株）特有タンパク質（以下「４７ｋ
Ｄａ抗原」及び「１５ｋＤａ抗原」ともいう）の調製 例として４７ｋＤａ抗原の調製法を挙げる。

【００５５】梅毒トレポネーマ継代ウサギ睾丸より梅毒
トレポネーマ菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知である（Ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．６０．１
９９２．１５６８〜１５７６）ので、それらをもとにＤ
ＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。このプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。ＧＳＴとの融合タンパク質を発現するた
めに作られたベクターｐＧＥＸ４３にこのＤＮＡ断片を
挿入し、得られたプラスミドをｐＧＥＸ４３―４７ｋと
命名した。これを大陽菌に導入し、培養液にＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−（−）−チオガラクトピラノシ
ド）を加えることにより、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの融
合タンパク質の発現を誘導した。充分に融合タンパク質
が発現した大腸菌を超音波処理により菌体を破砕し、遠
心分離により細胞膜、核等を除いた上清にグルタチオン
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加え、一晩放
置し融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着
させた。遠心分離により融合タンパク質が吸着したグル
タチオンセファロースを回収し、これをカラムにつめ
た。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流すことによ
り、融合タンパク質をグルタチオンセファロースから遊
離し溶出させた。こうして精製された４７ｋＤａ抗原―
ＧＳＴ融合タンパク質溶液にトロンビン溶液を添加し、
４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この結果、
４７ｋＤａ抗原、ＧＳＴ及びトロンビンを含む溶液がで
きた。この溶液をグルタチオンセファロースカラムにか
けることによりＧＳＴを除去することができた。更にヘ
パリンカラムにかけることによりトロンビンを除去する
ことができ、４７ｋＤａ抗原が精製された。１５ｋＤａ
抗原も同様にして精製された。

【００５６】（２）４７ｋＤａ抗原の折り畳み処理 上記（１）で得られた４７ｋＤａ抗原タンパク質（タン
パク濃度；１ｍｇ／ｍｌ）に、参考例１で示したシャペ
ロニン、並びに、塩化マグネシウム、ＡＴＰ及び塩化カ
リウムを、それぞれ５μＭ、５０ｍＭ、０．２５ｍＭ、
３００ｍＭとなるように添加し、４５℃にて９０分間放
置し、４７ｋＤａ抗原タンパク質に折り畳み処理を行っ
た。得られた処理溶液を限外濾過及びゲル濾過により、
シャペロニンを除去し、折り畳み処理を施した４７ＫＤ
ａ抗原タンパク質を得た。

【００５７】（３）４７ｋＤａ抗原タンパク質担持ラテ
ックス液の調製 ３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに上記
（２）で得られた４７ｋＤａ抗原タンパク質（タンパク
濃度；１ｍｇ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加えた。この抗原タ
ンパク質溶液０．３ｍｌと平均粒径４００ｎｍのポリス
チレンラテックス（積水化学工業社製）０．０５ｍｌを
添加し、３７℃で２時間攪拌した。

【００５８】次いで、牛血清アルブミン（バイエル社
製、以下「ＢＳＡ」とする）を１％（Ｗ／Ｖ）含有する
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．５ｍＬ添加
し、更に、３７℃で１時間攪拌し、ラテックスヘ担持し
た。この液を、１５，０００ｒｐｍで３０分問遠心分離
した。得られた沈澱物に、ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）含有
する３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２ｍｌ添加
し、ラテックスを再懸濁し、４７ｋＤａ抗原タンパク質
担持ラテックス溶液を調製した。

【００５９】（４）検体希釈液の調製 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、ＢＳＡを１
％（Ｗ／Ｖ）、グリコシルメチルメタクリレート（日本
精化社製、平均分子量１００万、以下「ＧＥＭＡ」とい
う）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解し、検体希釈液
を調製した。なお、この溶液に含むＧＥＭＡは、抗原抗
体反応の促進剤として使用した。

【００６０】（５）抗トレポネーマ抗体測定試薬 本実施例の抗トレポネーマ抗体の測定試薬は、上記
（３）で調製された抗原タンパク質担持ラテックス溶液
からなる第１試薬と、上記（４）で調製した検体希釈液
からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬であ
る。

【００６１】（６）抗トレポネーマ抗体の測定方法 生化学用自動分析装置（日立７１５０形、日立製作所社
製）により、検量線感度の測定を実施する。操作法を以
下に示す。梅毒陽性標準血清（抗トレポネーマ抗体量は
既知、積水化学工業社製）２０μＬに、検体希釈液（第
２試薬）２１０μＬを添加・混合し、一定時間経過後、
抗原タンパク質担持ラテックス液（第１試薬）３０μ１
を添加、混合した。ラテックス液（第１試薬）添加後、
約８０秒から３００秒問の濁度変化量を、該標準血清の
反応量とした。尚、全反応は、３７℃で実施し、測定波
長は７００ｎｍとした。得られた結果を表１に示した。

【００６２】実施例２ 実施例１中（３）において、４７ｋＤａ抗原タンパク質
の代わりに、１５ｋＤａ抗原タンパク質を用いた以外
は、実施例１に従って、試薬の製造及び測定を実施し
た。得られた結果を表１に示した。

【００６３】実施例３ 実施例１中（３）において、４７ｋＤａ抗原タンパク質
の代わりに、４７ＫＤａと１５ｋＤａ抗原タンパク質を
１：１（Ｖ／Ｖ）で混合した抗原タンパク質を用いた以
外は、実施例１に従って、試薬の製造および測定を実施
した。得られた結果を表１に示した。

【００６４】参考例２ シャペロニン結合担体の調製 参考例１で用いた配列表の配列番号２のリバースブライ
マーの代わりに配列表の配列番号３記載のプライマーを
用い、シャペロニンペブチド鎖のＣ末端にヒスチジン６
残基を導入した。参考例１と同様の方法で精製したＨｉ
ｓ（６）−シャペロニンモノマー１．０ｍｇを、Ｎｉ2+
をキレート担持させたＨｉ−ＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎ
ｇゲル１ｇ（ファルマシア製）に２０ｍＭリン酸緩衝液
中にて吸着固定させた。

【００６５】一方、参考例１で得られたシャペロニン１
６量体溶液に、ＥＤＴＡを１０ｍＭとなるように添加
し、３時間反応させることによりシャペロニンモノマー
溶液を得た。このシャペロニンモノマー（タンパク質量
として２０ｍｇ）を、上記で得られたＨｉｓ（６）−シ
ャペロニンモノマーが吸着固定されたＨｉ−ＴｒａｐＣ
ｈｅｌａｔｉｎｇゲル１ｇに添加し、更に、塩化マグネ
シウム、ＡＴＰ及び硫酸アンモニウムをそれぞれ５０ｍ
Ｍ、０．２５ｍＭ及び３００ｍＭとなるように添加後、
３０℃にて５時間インキュベートした。得られたシャペ
ロニンオリゴマー結合担体を以下の実験に使用した。

【００６６】実施例４ 実施例１（１）で得られた４７ＫＤａ抗原タンパク質
に、上記参考例２で得られたシャペロニン結合担体０．
２ｇと、塩化マグネシウム、ＡＴＰ及び塩化カリウムを
それぞれ５μＭ、５０ｍＭ、０．２５ｍＭ、３００ｍＭ
となるように添加し、４５℃にて９０分間、抗原タンパ
ク質に折り畳み処理を行った。得られた処理溶液を限外
濾過及びゲル濾過により、シャペロニンを除去し、折り
畳み処理を施した４７ＫＤａ抗原タンパク質を得た。以
下、実施例１に従って、試薬の製造及び測定を実施し
た。得られた結果を表１に示した。

【００６７】参考例３ ＰＰＩアーゼ結合担体の調製 不溶性担体としてＣＮＢｒ−活性型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂゲル（ファルマシア社製）を用いた。このゲル１ｇ
を秤量し、１ｍＭＨＣｌで洗浄、膨潤させた。特願平９
−２３５９９９号公報記載の調製法に従って得たメタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｓ）由来ＰＰＩアーゼ３５ｍｇを０．５ＭＮａＣｌを含
む０．１Ｍ、ｐＨ８．３のＮａＨＣＯ3 溶液１０ｍＬに
溶解させたタンパク溶液に、膨潤させたゲルを混合し、
室温にて２時間振盪した。上清液を除いた後、０．２Ｍ
グリシン（ｐＨ８．０）を１ｍＬ加え、室温にて２時間
振盪した。この反応で過剰の活性基をブロッキングし
た。

【００６８】０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ、ｐＨ
８．３のＮａＨＣＯ3 溶液２０ｍＬで洗浄し、次に０．
５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ、ｐＨ４の酢酸緩衝液２０
ｍＬで洗浄した。再び、０．５ＭＮａＣｌを含む０．１
Ｍ、ｐＨ８．３のＮａＨＣＯ3溶液２０ｍＬで洗浄し、
このゲルをＰＰＩアーゼ結合担体として以下の実験に用
いた。

【００６９】実施例５ 実施例４において、シャペロニンオリゴマー結合担体
０．２ｍｇに加えて、上記参考例３で得られたＰＰＩア
ーゼ結合担体０．２ｍｇを使用したこと以外は、実施例
４に従って試薬の製造及び測定を実施した。得られた結
果を表１に示した。

【００７０】実施例６ 実施例１（２）で用いたメタノコッカス・サーモリソト
ロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のシャペロニン
の代わりに、メサノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓｖｏｌｔａｅ）由来のシャペロニンを用
い、４５℃にて９０分間処理する代わりに、３７℃にて
９０分間処理したこと以外は、実施例１に従って試薬の
製造及び測定を実施した。得られた結果を表１に示し
た。

【００７１】比較例１ 実施例１（２）記載の折り畳み処理を行わなかったこと
以外は、実施例１に従って試薬の製造及び測定を実施し
た。得られた結果を表１に示した。

【００７２】比較例２ 実施例１（２）記載の折り畳み処理を行わなかったこと
以外は、実施例３に従って試薬の製造及び測定を実施し
た。得られた結果を表１に示した。

【００７３】表１及び図１に、実施例及び比較例に従っ
て実施した場合の検量線感度（反応性）を示す。

【００７４】

【表１】

【００７５】表中、標準品は、メディエースＴＰＬＡで
血清を測定した時の抗トレポネーマ抗体の抗体量を表す
単位（Ｔ．Ｕ．）である。実施例１〜６は、比較例１及
び２と比べて高い検量線感度を得ることができた。

【００７６】

【発明の効果】本発明の免疫測定試薬の製造方法は、上
述の構成からなるので、試薬に含まれる抗原又は抗体の
反応性を向上させ、高感度な免疫反応の測定を行うこと
ができる。

【００７７】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GGCCATGGCA GCTAACCAGC CA 22

【００７８】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTT ACATCATTCC GCCCATAC 28

【００７９】 配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCTT AATGGTGATG GTGATGGTGC ATCATTCCGC CCATAC 46

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜６並びに比較例１及び２における抗
トレポネーマ抗体の抗体量と吸光度変化量との関係を示
す図である。縦軸は、吸光度変化量であり、横軸は、メ
ディエースＴＰＬＡで血清を測定した時の抗トレポネー
マ抗体の抗体量を表す単位（Ｔ．Ｕ．）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原又は抗体を不溶性担体へ担持させて
   なる免疫測定試薬の製造方法であって、前記抗原又は抗
   体は、予めタンパク質折り畳み因子によって処理された
   ものであることを特徴とする免疫測定試薬の製造方法。
2. 【請求項２】 タンパク質折り畳み因子による処理は、
   抗原又は抗体とタンパク質折り畳み因子結合担体とを反
   応させて行うものである請求項１記載の免疫測定試薬の
   製造方法。
3. 【請求項３】 不溶性担体は、ラテックスである請求項
   １又は２記載の免疫測定試薬の製造方法。
4. 【請求項４】 タンパク質折り畳み因子は、分子シャペ
   ロン及びペプチジルプロリルシス−トランスイソメラー
   ゼからなる群より選択される少なくとも１種である請求
   項１、２又は３記載の免疫測定試薬の製造方法。
5. 【請求項５】 分子シャペロン及びペプチジルプロリル
   シス−トランスイソメラーゼは、古細菌から調製したも
   の、又は、古細菌から調製したＤＮＡから発現されたも
   のである請求項４記載の免疫測定試薬の製造方法。
6. 【請求項６】 古細菌は、好熱性古細菌である請求項５
   記載の免疫測定試薬の製造方法。
7. 【請求項７】 古細菌は、メタノコッカス属に属するも
   のである請求項６記載の免疫測定試薬の製造方法。
8. 【請求項８】 古細菌は、メタノコッカス・サーモリソ
   トロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒ
   ｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）又はメタノコッカ
   ス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔ
   ａｅ）である請求項７記載の免疫測定試薬の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１、２、３、４、５、６、７又は
   ８記載の免疫測定試薬の製造方法により製造されてなる
   ことを特徴とする免疫測定試薬。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の免疫測定試薬を用いて
    測定することを特徴とする免疫測定方法。