JPH01503441A - 新規融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規融合蛋白質 ［発明の背景コ この発明は、細菌、例えばエシェリヒア・コリにおける外来蛋白質およびポリペ プチドのクローニングおよび発現に関するものである。特にこの発明は、一般的 に可溶性であり、外来蛋白質ま１こはポリペプチドの抗原性の改変または機能的 活性の破壊を伴わずに容易に細菌リゼイトから精製され得る融合ポリペプチドと して細菌により合成された外来蛋白質ま几はポリペプチドの発現に関するもので ある。

エシェリヒア・コリにおける外来ポリペプチドの発現を誘導する幾つかの異なる ベクターが報告されている（ハリス、１９８３．マーストン、１９８６；マッキ ンタイア等、１９８７により概説されている）。製品精製を簡易化すべく設計さ れたベクターもあるが、これらのシステムの大部分に共通する問題点は、蛋白質 の溶解性の維持またはアフィニティー試薬からのそれらの溶離に変性試薬が必要 とされることである。変性は、外来ポリペプチドの抗原性を改変し、機能的活性 を全て破壊するものと予想され得る。例えば、エシェリヒア・コリ　β−ガラク トシダーゼとのＮ　Ｈを−末端またはＣ００Ｈ−末端融合体として発現され（グ レイ等、１９８２：ケーネン等、１９８２ニルターおよびムラー−ヒル、１９８ ３）、１．６モルＮａ　ＣＱ、ｌＯミリモルβ−メルカプトエタノールに溶は得 るポリペプチドは、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオガラクトシドのカラムに よるアフィニティー・クロマトグラフィー、次いで０．１モルはう酸ナトリウム （ｐＨ１０）、ｌＯミリモルβ−メルカプトエタノールにおける溶離（ゲルミノ 等、１９８３：ウルマン、１９８４）により粗細胞すゼイトから精製され得る。

またこれらの融合蛋白質は、固定された抗β−ガラクトシダーゼ抗体と結合され 、高または低ｐＨ溶液（プロメガ・バイオチク）における溶離により回収され得 る。別法として、β−ガラクトシダーゼの最後の１６ＣＯＯＨ−末端アミノ酸を 欠くβ−ガラクトシダーゼとの融合体は、不溶性であることが多いため（板金等 、１９７７、ヤングおよびデービス、１９８３．スタンレーおよびルツィオ、１ ９８４）、変性試薬を用いた処理による再可溶化後に溶解した細菌の不溶性フラ クションから精製され得る（マーストン、１９８６）。同じ方法を用いることに より、ｔｒｐＥ蛋白質のｔｒｐＥリーダー配列およびＣ００Ｈ−末端３基を含む 蛋白質との不溶性Ｃ００Ｈ−末端融合体として発現されたポリペプチドを精製す ることができる（フレイド等、１９８１）。変性条件の使用を除くと、これらの 方法は、媒体として使用されるエシェリヒア（イー）・コリ蛋白質が、特にβ− ガラクトシダーゼ（Ｍｒｌ　ｌ　６０００）との融合の場合において、融合蛋白 質に対する免疫応答を支配し得、望ましくない交差反応を示す抗体を誘導し得る という不利益を伴う。

他の発現ベクターは、ヒトＩｇＧ−セファロース・カラムによるアフィニティー ・クロマトグラフィーにより細胞リゼイトから精製され得るスタフィロコッカス ・プロティンＡのＣ００Ｈ−末端との融合体としてポリペプチドの合成を導く（ ウーロン等、１９８３．二ルッソン等、１９８５；アブラームゼン等、１９８６ ．ローペンアドラー等、１９８６）。ＩｇＧに対するプロティンＡの親和力が高 い几め、融合蛋白質の溶離には通常変性条件が要求されるが、代替的戦略、例え ば過剰天然プロティンＡとの鏡台、プロティンＡに対する親和力が低いヒツジＩ ｇＧの使用にルッソン等、１９８５）、またはプロティンＡ担体のサイズを縮小 してＩｇＧに対するその親和力を低下させる手法（アブラームゼン等、１９８Ｂ ）も使用され得る。

さらに深刻を問題点は、プロティンＡと結合する抗体が、それらの他の特異性と は関係無く融合蛋白質を全て認識する１こめ、ＩｇＧとの融合蛋白質の結合が、 クローンの免疫学的スクリーニングまには組換え産物の分析を面倒にすることで ある。

エシェリヒア・コリ由来の外来ポリペプチドの精製に関する別の戦略は、Ｃ００ Ｈ−末端にポリ−アルギニンを含むポリペプチドの生成である（サツセンフェル ド・アンド・ブルーワー、１９８４）。

強塩基性アルギニン残基は、アニオン性樹脂に対する融合蛋白質の親和力を高め るため、融合体はカチオン交換クロマトグラフィーにより精製され得、Ｃ００Ｈ −末端アルギニン残基はカルボキシペプチダーゼＢ処理により除去され得る。他 のベクターはべりプラスミッタ空間または培養培地へのポリペプチドの分泌を誘 導し、発現レベルの低い場合も多いが、分泌されたポリペプチドは、細菌性プロ テアーゼによる変性から保護され、大部分の他の蛋白質から分離される（マース トン、１９８６．アブラームゼン等、１９８６．ローペンアドラー等、１９８６ ．加藤等、１９８７）。これらの最新方法の使用は成功する場合もあるが、特に 多くの酸性残基を含むか、または疎水性の高いポリペプチドにおけるそれらの普 遍性は不明である。

［発明の概略］ この発明の御粘様によると、外来（または異種）蛋白質またはペプチド成分が酵 素グルタチオン−５−）ランスフェラーゼ、好ましくは酵素のＣ００Ｈ−末端と 融合されている融合蛋白質の発現をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤ ＮＡ分子が提供される。

酵素グルタチオン−５−）ランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，５，１，１８）と融 合した外来ペプチド成分を膏するこの発明の新規融合蛋白質は、既知融合蛋白質 に伴う問題点の幾つかを回避するものである。

特に、この発明の融合蛋白質は可溶性であり、非変性条件下、例えば固定グルタ チオン・カラムによるアフィニティー・クロマトグラフィーにより細菌リゼイト から精製され得る。

この明細書で詳述されているこの発明の一実施態様では、酵素は、寄生性ぜん虫 シストソーマ・ジャポニカのグルタチオン−５−）ランスフェラーゼである。し かしながら、融合蛋白質におけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、ヒ トおよび他のは乳類グルタチオン−５−トランスフェラーゼを含む他の種類から 誘導され得る。

この発明を実施する作業において、広範な種類の真核生物ポリペプチドが、生理 学的条件下で容易に精製され得る可溶性および安定性グルタチオン−８−トラン スフェラーゼ融合蛋白質としてエシェリヒア・コリにおいて発現され得ることが 示された。

別の態様において、この発明は、前記ヌクレオチド配列が挿入された発現ベクタ ー、例えば細菌性プラスミドを提供する。また前記発現ベクターは、好ましくは 融合蛋白質の発現を目的とするヌクレオチド配列に機能し得るように結合された 発現制御配列を含む。さらに、この発明は、この発現ベクターを含む宿主細胞を 包含する。

さろに、この発明は、融合蛋白質の製造方法であって、前記発現ベクターを含む 宿主細胞を培養して融合蛋白質の発現を達成し、所望により前記細胞培養から融 合蛋白質を回収する工程を含む方法を包含する。

融合蛋白質は一般的に可溶性であり、細面性リゼイトから容易に回収されるにめ 、融合蛋白質の好ましい回収方法は、細菌細胞を溶かし、固定グルタチオンと接 触させることにより細菌性リゼイトから融合蛋白質を回収する工程を含む。

この発明の融合蛋白質は、その外来蛋白質まにはペプチド成分がその抗原性およ び機能的活性を保持しているため、そのままで使用され得る。別法として、融合 蛋白質を開裂することにより、合成外来蛋白質まにはペプチドが生成され得る。

前述の合成外来蛋白質またはペプチドの製造が望まれる場合、好ましくは融合蛋 白質におけるグルタチオン−５−トランスフェラーゼおよび外来（または異種） 蛋白質またはペプチド成分間に開裂可能な結合が与えられる。

この発明は多様な外来蛋白質またはペプチドの発現および精製に応じ得るため、 この発明は別の態様において、酵素グルタチオンＳ−トランスしエラーゼ、次い で外来（または異種）蛋白質またはペプチドとして発現され得るヌクレオチド配 列の挿入に関与する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位の発現を コードするヌクレオチド配列が挿入された発現ベクター、例えば細菌性プラスミ ドを提供する。

［発明の詳細な記載］ この発明の一実施態様では、エシェリヒア・コリにおいて生産されｆこ外来ポリ ペプチドの精製を簡易化する一連のプラスミド発現ベクター（ｐＧＥＸ）が構築 された。エシェリヒア・コリにおいて酵素活性５ｊ２６の合成を誘導するプラス ミドは既に構築されている（スミス等、１９８７ｂ）。多くのは乳類グルタチオ ンＳ−）ランスフェラーゼ・イソ酵素は、固定グルタチオンでのアフィニティー ・クロマトグラフィー、続いて過剰還元グルタチオンとの競合による溶離により 精製され得（サイモンズ・アンド・）（ンダー・ジャブト、１９７７：マナーピ ツク、１９８５）、この特性は天然５ｊＺ６およびエシェリヒア・コリで生産さ れた組換え５ｊ２６（スミス等、１９８６．１９８７ｂ）の両方に共有される。

この発明によると、ポリペプチドは、グルタチオン−５−トランスフェラーゼと して寄生性ぜん虫シストソーマ・ジャポニクムによりコードされたＭｒ２６００ ０抗原（Ｓｊ２６）とのＣ００Ｈ−末端融合体として発現され、非変性条件下、 固定グルタチオン・アフィニティー・クロマトグラフィーに上り精製され得る。

溶解された細菌から得られた可溶性材料を、グルタチオン−アガロース・ビーズ と混合し、洗浄後、例えば５０１Ｍ還元グルタチオンを含む５０　ｍＭ　）リス −ＨＣｆｆ（ＰＨ８，０）により融合蛋白質を溶離する。バッチ洗浄方法を用い ると、幾つかの融合蛋白質が２時間未満で同時に精製され得、収率は培養１リツ トル当たり１．６ないし１５πりの範囲である。グルタチオン−アガロース・ビ ーズは、少なくとも８＋９（融合蛋白質）／ｊｌｃ（膨張ビーズ）の受容力を有 し、同融合蛋白質の相異なる製剤に対して数回使用され得るか、または３モルＮ ａＣｆｆで洗浄することにより再使用され得る（サイモンズ・アンド・バング− ・ジャブト、１９８１）。

このシステムは、ビー・ファルシパルムの様々な抗原の発現および精製に有効に 適用されている。ｐＧＥＸベクターにおいて発現され１ニ２１種の相異なるビー ・ファルシパルムｃＤＮＡまにはｃＤＮＡフラグメントのうち、１４種が固定グ ルタチオン・アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製され得る可溶性ま たは部分的可溶性融合蛋白質を生成させる。

少数の例では精製がうまくいかないこともあっ１ニが、これらの失敗は全て融合 蛋白質の不溶性に帰し得る。不溶性はエシェリヒア・コリにおいて発現される融 合蛋白質に多く見出される特性であるか（ハリス、１９８３；マーストン、１９ ８６）、この情況において驚くべきことには、少数のグルタチオンＳ−）ランス フェラーゼ融合蛋白質は全体的ま１こは部分的に可溶性である。不溶性に関与す る因子に関しては殆ど知られていないが（マーストン、１９８６）、幾つかの例 において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質の不溶性は強疎水性 領域の存在と関係があり、これらの領域を除去すると、安定度および／または溶 解度は大きく高められる。他の不溶性融合蛋白質は多くの荷電した残基を含むか 、ま１こはＭｒｌｏｏｏｏｏより大きい。それにも拘わらず、グルタチオン−ア ガロースとの結合を崩壊しない可溶化剤、例えば１％トリトンＸ−１００，１％ トウィーン２０．１０ｍＭジチオトレイトールまたは０．０３％Ｎ　ａＤ　ｏｄ 　Ｓ　Ｏａに不溶性融合蛋白質を可溶化させると、それらはアフィニティー・ク ロマトグラフィーにより精製され得る。ポリペプチドが各々可溶性融合蛋白質を 形成する幾つかのフラグメントにおいて発現され得ない場合、他の不溶性融合蛋 白質は常法により（マーストン、＋９８６）精製されなければな：）すい。不溶 性はエシェリヒア・コリにおける高い蛋白質安定性と関連している場合もあるか （チェンジ等、１９８１）、関連性の無い場合もある（シェーマ−カー等、１９ ８５）、幾つかの例外も存在するが、不溶性および可溶性グルタチオンＳ−）ラ ンスフェラーゼ融合蛋白質の両方が総じて安定し、直接比較が可能な場合、可溶 性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合体として発現され几ポリペプチドの 安定性は、不溶性β−ガラクトシダーゼ融合体の場合と類似している。

良好な抗体応答は、免疫マウス、ウサギおよびヒツジにおける融合体の外来ポリ ペプチド部分に対して発せられた。特に応答は、均等なβ−ガラクトシダーゼ融 合体の場合と同程度またはさらに良好な状態であると思われ、恐らくグルタチオ ンＳ−）ランスフェラーゼ担体のサイズが小さい（Ｍｒｌ１６０００と比べてＭ ｒ２６０００）ことを反映していると考えられる。５ｊ２６に対する応答は相異 なるマウス系統において変動しくダバーン等、１９８７）、同様の変動は、グル タチオンＳ−）ランスフェラーゼとの融合体として発現されたポリペプチドに対 する応答において妓察される。

精製されｌこグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ融合蛋白質は、部位特異性プ ロテアーゼによる開裂における良好を基質であると思われる。エシェリヒア・コ リから精製された融合蛋白質の開裂における部位特異性プロテアーゼの有効な使 用（ゲルミノおよびバスチア、１９８４．水弁およびトガーゼン、１９８４）に 関する報告はこれまで殆ど為されていないが、恐らく不溶性融合蛋白質の再可溶 化に必要とされる変性試薬が蛋白質加水分解を阻むＴ；めであると考えられる。

逆に、多くのグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ融合蛋白質は、蛋白欠如水分 解に最適であることが知みれている条件下では可溶性である。好ましくは、使用 されるプロテアーゼは、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ担体を開裂しない ものであり、蛋白質加水分解後、ポリペプチド生成物は、グルタチオン−アガロ ースによる吸収により担体および未開裂融合蛋白質（有れば）から分離され得る 。適当な部位特異性プロテアーゼには、例えばこの明細書で詳述されているトロ ンビンまたは血液凝固因子Ｘａ、またはレニンがある（ハフエイ等、１９８７） 。

融合蛋白質の高レベル発現、フレーム・シフト・クローニング部位、迅速な精製 および有効な部位特異性蛋白質加水分解を組み合わせると、ｐＧＥＸベクターは エシェリヒア・コリにおける外来ポリペプチドの発現に用いられる強力なシステ ムとなる。ポリペプチドの発現および精製の簡易化に加えて、これらのベクター は、免疫原または化学試薬として使用されるペプチドの化学合成に対する安価な 代替手段を提供し得る。特にプラスミドコード化１ａｃ　Ｉ　ｑ対立遺転子によ るｔａｃプロモーターの抑制が、ｌａｃ　１状態とは関係無く、高い形質転換効 率を有するエシェリヒア・コリ株において有効であることを要するため、これら のベクターもまたｃＤＮＡライブラリーの構築に好都合であり得る。形質転換体 は常用の核酸または免疫化学技術によりスクリーニングされ、興味の対象である クローンによりコードされた融合蛋白質はグルタチオン−アフィニティー・クロ マトグラフィーにより精製され得る。

以下、単なる実例として実施例および添付図面を示すことにより、上記において 広い範囲で概説した様々な他の態様と共にこの発明の新規融合蛋白質を説明する 。

［図面の簡単な記載コ 添付図面において、第１図は、プラスミドｐＳｊ５の構築の略図を示す。

第２図は、ｐＳｊ５により形質転換された細胞に存在する蛋白質の５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル分析を示す。細胞の一夜培養物を新鮮な培地において１：１ ０の割合で希釈し、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、ＩＰＴＧ を０．１ｍＭ液に加え、示された時間数の間インキュベーションを３７℃で続行 した。分子量マーカーのサイズ（ｋＤａ、キロダルトン）および位置を示す。ク ーマシー・ブルー染色により蛋白質が検出され乙。

第３図は、組換え５３２６を発現する細胞のイムノプロットを示す。ｐｔａｃｌ ｌ（親プラスミド）またはｐＳｊ５を含む細胞試料を第２図の記載に従い調製し 、１３％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、ニトロセルロースに 移した。Ｓ　ｊ　Ａ　ｗＥは、シストソーマ・ジャポニクム成虫の抽出物である 。精製β−ガラクトシダーゼ−５ｊ２６融合蛋白質（スミス等、１９８６）に対 して調製されたウサギ抗血清、次いで！１２５−標識プロチインＡによりニトロ セルロースをプローブした。分子量マーカーの位置およびサイズ（ｋＤａ）を示 す。

第４図は、組換え５３２６の精製を示す。ｒＳｊ２６を発現する細胞の抽出物を グルタチオン−アガロース・カラムに適用し、特異結合材料を遊離還元グルタチ オンにより溶離させた。溶離液の連続フラクションまには細胞の全抽出物を１３ ％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、蛋白質をクーマシー・ブル ー染色により検出した。分子量マーカーの位置およびサイズ（ｋＤａ）を示す。

第５図は、（ａ）ｐｓｊｌ　ＯＤＢａｍ７Ｓｔｏｐ７の構造（目盛らず）、（ｂ ）Ｓｊ２６の最後の２コドン、Ｓ、ｉ２６終止コドンに導入された多重クローニ ング部位、全３フレーム（下線）におけるＴＧＡ終止コドンのヌクレオチド配列 、次いでＰｖｕｎ部位で始まるｐｔａｃ１２の配列（最初の３ヌクレオチドのみ 図示、ｐＢＲ３２２のヌクレオチド２０６７〜２０６９に対応）を示す。

第６図は、Ｓｊ２６−融合蛋白質の製造および精製を示す。ｐｔ　ａｃ１２（親 プラスミド）、ｐｓｊｌ　ＯＤＢａｍｌまｒニはビー・ファルシパルム抗原に由 来するＥｃｏＲＩフラグメントを含むｐｓｊｌ　０ＤＢａ＋ｎｌにより形質転換 された細胞の抽出物を、全抽出物（Ｔ）またはグルタチオン−アガロース・ビー ズ精製後（Ｐ）として１３％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離した。

クーマシー・ブルー染色により蛋白質が検出された。分子量マーカーのサイズ（ ｋＤａ）および位置を示す。

第７図は、ｐＧＥＸベクターの構造の例として（ａ）ｐＧ　Ｅ　Ｘ　−１の概略 図を示す。特有のＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位の位置を示す。

（ｂ）Ｓｊ２６　ｃＤＮＡのｃＯＯＨ−末端におけるｐＧＥＸ−１，ｐＧＥＸ− ２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘのヌクレオチド配列およびコード受容力。５ｊ２６ｃ ＤＮ、Ａの通常の翻訳終止コドンはヌクレオチド７から始まり、ＢａｍＨＩ　、 　５ｉａｌおよびＥｃｏＲＩにおける開裂部位をコードするオリゴヌクレオチド （括弧で区切った下線部）および３フレーム全てにおけるＴＧＡ停止コドン（下 線部）の導入により破壊された。ベクターＰＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘ は、トロンビンおよび血液凝固因子Ｘａによりそれぞれ認識されるプロテアーゼ 開裂部位をコードする追加配列を含む。

第８図は、ｐＧＥＸ−１により形質転換された細胞におけるグルタチオンＳ−） ランスフェラーゼの発現および精製を示す。

（ａ）誘導後の発現の時間推移。ｐＧＥＸ−１により形質転換され元細胞の一夜 培養物を新鮮な培地において１：ｌＯに希釈し、９０分間生長させ、Ｉ　ＰＴＧ を加えた（１ｍＭ）。示された時点で試料を採取し、１３％Ｎ　ａ　Ｄ　ｏｄ　 Ｓ　Ｏ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によす分離し、次いでクーマシー・ ブルーで染色し乙。分子量マーカー（Ｍ）の位置およびサイズ（ｋＤａ）を示す 。

（ｂ）グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼの精製。ｐＧＥＸ−１により形質転 換された細胞を前記と同様に生長させ（１こだし、ＩＰＴＧを０　、１　ｍＭ液 に加えない）、誘導の３時間後培養物を採収し乙。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを前記と同様に精製し、（Ｔ）全細胞、（ Ｐ）不溶性沈澱および（Ｓ）遠心分離後上清、（し）グルタチオン−アガロース ・ビーズと上滑のインキュベーション後の未結合材料並びに（Ｅ）ビーズから溶 離した精製材料の試料を採取しに。試料は２００μｇの培養物と同等であり、前 記と同様に分析された。

第９図は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質として発現されたピ ー・ファルシパルム抗原の精製を示す。試料をｌＯ％ＮａＤｏｄＳＯ４−ポリア クリルアミドゲル電気泳動、次いでクーマシー・ブルー染色により分析した。（ Ｔ）全細胞抽出物、（Ｐ）グルタチオン−アガロース精製材料。ｐＧＥＸ−１％ ｐＧＥＸ−３ＸにおけるＡｇ６３　（ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ　Ｘ６３）、ｐＳ ｊｌＯにおけるＡｇ３６１（３６１）、ｐｓｊｌ　Ｏｌ＝おけ６Ａｇｌ　６（１ ６）およびｐＧＥＸ−３ＸにおけるＲＥ　Ｓ　ＡｃりＥｃｏＲＩフラグメント（ Ｒ）により細胞を形質転換した。分子量マーカー（Ｍ）の位置およびサイズ（ｋ Ｄａ）を示す。

第１０図は、精製融合蛋白質のプロテアーゼ開裂を示す。

（ａ）トロンビン開裂。Ａｇ６３の５８０ｂｐ　Ｒｓａｌ　−ＥｃｏＲＩフラグ メントを含むｐＧＥＸ−１ま１ニはｐＧＥＸ−２Ｔにより形質転換された細胞か ら得られた精製融合蛋白質を、示された時間（分）数の間プロテアーゼとインキ ュベーションした。レーンＴ％ＵおよびＧ。

４０倍容量のＭＴＰＢＳでの希釈によるグルタチオン除去、次いでセントリコン −１Ｏ濃縮装置（アミコン・コーポレーション）を用いた濃縮後の開裂反応。（ Ｔ）濃縮後の全反応、（′Ｕ）グルタチオン−アガロース・ビーズとのインキュ ベーション後の反応、（Ｇ）グルタチオン−アガロース・ビーズに結合した材料 。１３％−ＮａＤｏｄＳＯ＊−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでクーマ シー・ブルー染色により試料を分析した。分子量マーカー（Ｍ）のサイズ（ｋＤ ａ）および位置を示す。

（ｂ）血液凝固因子Ｘａ開裂。Ａｇ６３の５５５ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを含むｐＧＥＸ−１またはｐＧＥＸ−３Ｘにより形質転換された細 胞から得られた精製融合蛋白質を様々な期間血液凝固因子Ｘａとインキュベーシ ョンするか、または開裂後グルタチオンーアガロースを用いて吸収させ、（ａ） の記載と同様Ｊ二分析し乙。

実施例１ 材料および方法 細菌性プラスミドの構築 Ｍｒ２６０００シストソーマ・ジャポニクム・グルタチオンＳ−トランスフェラ ーゼ（Ｓｊ２６）のｃＤＮＡを含むｐＳｊｌの７８０ｂｐＥｃｏＲＩフラグメン ト（スミス等、１９８６）を制限酵素５ａｕ９６ｉによる部分的条件下で開裂し 、２つのアニール化オリゴヌクレオチドと連結し、ｐｔａｅｌｌのＥｃｏＲ１部 位（アマン等、１９８３）に挿入した（第１図）。エシェリヒア・コリＪＭＩＯ Ｉの形質転換後、ｔａｃプロモーターの後、直接ＥｃｏＲＩ認識部位、配列ＡＴ 　Ｇ　Ｔ　ＣＣ（Ｍｅｔ・Ｓｅｔをコードする）、次いでヌクレオチド１２から ３゛−末端Ｅｃ。

Ｒ１部位までのｐｓｊｌの５ｊ２６　ｃＤＮＡが並ぶプラスミド（ｐＳｊ５）を 含むコロニーが同定された。プラスミドｐＳｊ４も同様の方式で構築されたが、 １こだし、異なるオリゴヌクレオチドを用いて配列ＧＡ゛　ＴＣＣＣＡＣＣ５’ をＭｅｔコドンに導入し、５ｊ２６　ｃＤＮＡをＨｉｎｆ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフ ラグメントとしてｐｓ３１がら分離し、再構薬され？＝Ｓｊ２６　ｃＤＮＡをｐ ＧＳ６２（ラングフォード等、１９８６）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。全５ｊ ２６　ｃＤＮＡを含むｐＳｊ４のＢａｍＨＩフラグメントを制限酵素Ｍｎ１Ｉに より開裂し、ＢａｍＨＩリンカ−と結合し、ｐＬＫ８（ラングフォード、未発表 研究）のＢａ＠Ｈ１部位にクローン化することにより、ＡＡＡ、ＴＡＡ終止コド ン（ＢａｍＨＩ認識部位の導入により破壊されて配列ＡＡＡ、ＴＣＧ、ＧＡＴ、 ＣＣ。

を生ずる）ま、での５ｊ２６の全コード配列を有するＢａｍＨ１フラグメントを 含むプラスミド（ｐＳｊ７）を製造した。５ｊ２６　ＢａｍＨＩフラグメントを ｐＳｊ７から分離し、ｐｌｃ１９Ｈ（マーシュ等、１９８４．）のＢａｍＨＩ部 位に挿入することにより、５ｊ２６の５°−末端がＰｓｔＩ制限部位の隣に位置 するプラスミド（ｐＳｊ８）を製造した。このプラスミドからのＤＮＡを制限酵 素Ｐｓｔｌに上り開裂し、１単位のエキソヌクレアーゼＢａｌ　３１　（ベゼス ダ・リサーチ・ラボラトリーズ）と２分間インキュベーションし、Ｅ　ｃｏＲＶ により開裂し、ｐｔａｃ１２−　Ｅ　ｃｏ（エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラ ーゼのフレノウ・フラグメントによるＥｃｏＲＩ消化Ｄ　Ｎ　Ａの処理および再 結合による特有なＥｃｏＲ１部位の除去によりｐｔａｃ１２（アマン等、１９８ ３）から生成された）のＰｖｕ１１部位に挿入した。ニス・ジャポニクムの全成 虫に対して生じたウサギ抗血清（セイント等、１９８６）を用いたクルーザー等 （１９８Ｅｌ）記載のコロニー免疫検定により、形質転換体を５ｊ２６の発現に ついてスクリーニングした。強い免疫反応を示す一クローン（ｐｓｊｌＯ）が同 定されたが、２つのＢａｍＨＩ認識部位を含んでいた。５ｊ２６ｅＤＮＡの５′ −末端のＢａｍＨ１部位を、部分的ＢａｍＨＩ消化ｐｓ３１０　ＤＮＡの補充お よび再連結により開裂した。ＤＮＡをＪＭＩＯＩ（プラスミドｐｓｊｌ　０ＤＢ ａＩＩｌｌを生成）またはメチラーゼ欠損エシェリヒア・コリ株ＧＭ４８（ヤニ ッシューペロン等、１９８５）に形質転換しｊ：、−ＧＭ４８形質転換体から得 られたプラスミドＤＮＡ（ｐＳ３１０ＤＢａｍ？）を部分的条件下でＣ１ａＩに より開裂し、３つ全部のリーディング・フレームにおいてＴＧＡ終止コドンをコ ードする一組のアニール化オリゴヌクレオチドと結合してプラスミドｐｓｊｌ　 ＯＤＢａｍ７Ｓｔｏｐ７を生成した（第５図）。

ＤＮＡの操作は、マニアチス等（１９Ｂ　２）の記載に従い行なわれた。

制限酵素は二ニーイングランド・バイオラブズから入手した。

Ｓｊ２６−融合蛋白質の精製 細菌の一夜培養物を新鮮な培地（８００１ｆｆ）においてｌ：１０に希釈し、３ ７℃で１時間生長させ、０．１　ミリモルＩ　ＰＴＧにより誘導し、さらに３− ５時間生長させた。遠心分離により細胞を集め、ＰＢＳ中音波処理により溶解さ せ、１３０００ｇで１０分間４℃で回転させた。上溝をグルタチオン−アガロー ス・カラム（硫黄連結）（シグマ）に適用し、カラムをＰＢＳで洗浄し、５ｍＭ 還元グルタチオン（シグマ）含有５０ｍＭ）リス−ＨＣＱｐ８９．６により融合 蛋白質を溶離させた（シモンズおよびバング−・ジャブト、１９７７、ハーベイ およびポイトラー、１９８２）。小規模精製（１，Ｅ＋＋ｆ２の培養物）は、３ ０分間５０μｇの膨潤グルタチオン−アガロース・ビーズと溶解細胞の上清との インキュベーションおよび蛋白質ゲル試料緩衝液中での洗浄したビーズの沸騰に より行なわれた。ニス・ジャポニクム成虫抽出物の製造および５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動および免疫プロッティングは、セイント等（１９８６） の記載に従い行なわれた。

ＲＮＡのプライマー伸長配列決定 ニス・ジャポニクム（ソーソゴン株）の成虫を感染したウサギの門脈潅流により 得、ＲＮ　Ａをセイント等（１９８６）の記載に従い純化した。ＰＳｊｌ　５ｊ ２６　ｃＤＮＡのヌクレオチド５３〜３７に相補的なオリゴヌクレオチドを、ｐ ｓｊｌ　５ｊ２６　ｃＤＮＡの完全コピーを含むＭ１３ファージから分離された 一本鎖ＤＮＡ鋳型において伸長させた。反応は２０℃で３０分間行なわれ、アニ ール化鋳型およびプライマー、”ＰｄＡＴＰおよび”ＰｄＣＴＰの各々１０μＣ ｉ、０゜０５ミリモルｄＴＴＰ、１０ｍＭ）リス−Ｈ０ｆｆ（ｐＨ８，５）、５ ミリモルＭｇＣ＋２ｔおよびのエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレ ノウ・フラグメント２単位を含んだ。伸長されたプライマー（３４ヌクレオチド ）を１０％ポリアクリルアミド、７．６モル尿素ゲルから取り出し、０．５Ｍ酢 酸アンモニウム、５ミリモルＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　。

０．１％ＳＤＳに４℃で１６時間浸漬後エタノール沈澱により回収し１ニ。全ニ ス・ジャポニクムＲＮＡ約０．５μ？を、５０ｍＭ）’ＪスーＨＣｆｆ（ｐＨ８ ，３）、０．１ミリモルＥＤＴＡ％　ｌＯミリモルＤＴＴ。

７．５ミリモルＭｇＣｌ２．１０ミリモルＮａＣ］の存在下１００℃で１分間１ １０００００ｃｐの”Ｐ−標識プライマーと加熱し、次いで６０℃で２０分間イ ンキュベーションした。次に、混合物を４つに分割し、５単位のりボヌクレアシ ン（ＢＲＬ）、０．５単位のとりマイオブラストシス・ウィルス逆転写酵素（ラ イフ・サイニンシーズ・インコーホレイテッド）、０　、１　ｍＭの各デオキシ ヌクレオチドおよび０．ｏ　７５　ミ！Ｊ％ルｄｄＡＴＰ、０．０６　ミ’１モ ルｄｄｃＴＰ、０゜３ミリモルｄｄＧＴＰまたは０．１５ミリモルｄｄＴＴＰを 含む反応物中、４２℃で１５分間インキュベーションした。反応生成物を８％ポ リアクリルアミド−尿素ゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した 。

結果 ｐｓｊｌ　ＯＤＢａｍｌの構築 寄生性ぜん虫シストソーマ・ジャポニクムの成虫は、機能的グルタチオンＳ−ト ランスフェラーゼであるＭｒ２６０００抗原（Ｓｊ２６）を含む（ミッチェル等 、１９８４；スミス等、１９８６）。天然５５２６と同一の分子をコードすると 予想されるプラスミド（ｐＳ　ｊ　５　）を構築した（第１図）。５３２６の正 確な５−末端構造（Ｍｅｔ、　Ｓ　ｅｔ。

Ｐｒｏ、　Ｉ　ｌｅ、、、、、）を、ニス・ジャポニクムの成虫から精製された Ｓ５２６ｍＲＮＡの直接配列分析から推理しく材料および方法）、成熟寄生虫か らのＳ３２６ＯＮ−末端の蛋白質配列決定により確認し７；（ジヨイント・プロ ティン・ストラフチャー・ラボラトリ−のエム・ルビラ、ルードビヒ・インステ ィテユート・フォー・キャンサー・リサーチ、ウォルター・アンド・エリーザ・ ホール・インスティテユート・オフ・メディカル・リサーチと共同した）。この プラスミドは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでのその移動性（第２図）または その抗原性（第３図）による天然５５２６との識別が不可能なＭｒ２６０００分 子（組換え体Ｓｊ２６、ｒＳｊ２６）のエシェリヒア・コリにおける合成を指図 する。さらに、この分子は可溶性で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとし ての酵素活性を示し、固定グルタチオンのカラムと結合する多くのグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（シモンズおよびバング−・ジャブト、１９７７；ハー ベイおよびボイトラー、１９８２）の特性を保持している（第４図）。

ｔａｃプロモーター（アマン等、１９８３）の転写制御下のＳ３２６の完全コー ド配列および続いて幾つかの特有な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプラ スミドｐｓｊｌ　ＯＤＢａｍｌを構築した（材料および方法）。このプラスミド により形質転換された細胞を誘導することにより、豊富なＭｒ２８０００分子の 合成が行なわれた（第６図）。この蛋白質のサイズが大きいのは、ＢａｍＨＩリ ンカ−の導入によりｐｓｊｌＯＤＢａｍｌにおける通常の５ｊ２６終止コドンが 破壊され１；結果、フレーム内終止コドンと出会う前にさらに１４の追加アミノ 酸が翻訳されるためである。これらの追加アミノ酸にも拘わらず、改編されたグ ルタチオンＳ−トランスフェラーゼは可溶性であり、グルタチオンと結合するた め（第６図）、Ｓ３２６のＣ００Ｈ−末端に小配列を追加しても必ずしも結合は 崩壊されないことを示唆している。

Ｓｊ２６融合ポリペプチドの発現 プラスモディウム・ファルシパルムの様々な相異なる抗原に対応する５ｊ２６　 ｃＤＮＡのＣ０ＯＨ末端に大きな配列を追加した場合の影響を試験するために、 ｐｓｊｌＯＤＢａｍｌの唯一のＥｃｏＲ１部位への挿入を行った。これらのｃＤ ＮＡは全て、それらが５３２６−融合蛋白質として発現されるための正確なリー ディング・フレームに存することが知られているにめ選択された。これらのｃＤ ＮＡは、抗原１６（コツペル等、１９８３）、４４（アンダース等、１９８４） 、３６１（ピーダーリン、原稿準備中）および３２（カラマン等、１９８４）に 対応し１こ。各場合とも、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（第６図）後 クーマシー染色により容易に同定され得るＭ　ｒ　＞２８０００の新規融合蛋白 質を発現する形質転換体が同定され得た。

さらに各場合とも、これらのクローンにより合成されたＳｊ２６融合蛋白質は可 溶性であり、グルタチオン−アガロース・ビーズとのインキュベージジンにより 細菌超音波分解体から精製され得た（第６図）ｅ精製工程を１リツトルの細胞懸 濁液に規模拡大すると、ポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色により判断し １こところでは汚染物質を含んでいない約５！９の蛋白質が得られた。グルタチ オン・カラムによる非形質転換細胞すゼイトのクロマトグラフィーの結果、蛋白 質は一切精製されなかった。５ｊ２６融合蛋白質は、それらが特異的抗血清によ りウェスタン・プロットにおいて認められたため、抗原性を保持していた（デー タは示さず）。

実施例２ 材料および方法 ＰＧＥＸベクターの構築 特有のＭｎ１ｌ開裂部位におけるＢａｍＨ１リンカ−の導入によりｐＳｊｌ　Ｓ ｊ２６　ｃＤＮＡ（スミス等、１９８６．１９８７ａ）において多重クローニン グ部位を作製することにより、５ｊ２６のＴＡＡ翻訳終止クドりを配列ＴＣＧＧ ＡＴＣＣと置き換えた。また、５”−末端ＥｃｏＲＩ　−５ａｕ９６　ｉフラグ メントを、ＢａｍＨＩ開裂部位、次いで配列ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣ，次いでｐｓ ｊｌ　ｃＤＮＡのヌクレオチド１２−３８を含むオリゴヌクレオチドと置き換え ることにより、ｐＳｊｌ　ｃＤＮＡの５°−末端を改編し、天然５３２６（スミ ス等、１９８７ｂ）をコードするＢａｍＨＩフラグメントを作製した。このＢａ ｍＨｌフラグメントを、ｃＤＮＡ　３’−末端の後に特有のＳｍａｌ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｃ１ａｌおよびＥ　ｃｏＲＶ開裂部位が続く形でｐｌｃ１９Ｈ（ｖ−シュ等 、１９８４）のＢａｌｌ１）（Ｉ部位に挿入した。再構築された５ｊ２６ｃＤＮ Ａを含むプラント末端ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｔａｅプロモー ターからの転写に関して正確な配向てｐｔａｅ１２ΔＥ　ｃｏ（特有のＥｃｏＲ １部位を補充し、再連結することにより修飾され１：ｐｔａｃ　１２　（アマン 等、１９８３））のＰｖｕ１１部位に挿入した。さらに、３フレ一ム全部におい て停止コドンをコードするオリゴヌクレオチド（ＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡ）をｃ ＤＮＡ３°−末端のプラント末端Ｃ１ａＩ部位に導入することによりこのプラス ミド（ｐｓｊｌＯ）を修飾し、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼｌのフレ ノウ・フラグメントを用いて補充することによりｃＤＮＡ　５°−末端のＢａｍ Ｈ１開裂部位を削除した。

このプラスミド（ｐｓｊｌＯΔＢａｌ１１７Ｓｔｏｐ７）により形質転換され、 Ｉ　ＰＴＧにより誘導されに細胞は、Ｍｒ２７５００ポリペプチドを合成したが 、ｐＳｊ５、天然５ｊ２６（スミス等、１９８７ｂ）をコードするｐｔａｃｌｌ から誘導されたプラスミドにより形質転換された細胞においては、２０％未満の レベルであった。発現におけるこの差異は、高いＧＣＣ含量量よびｐＳ３１０Δ Ｂａｍ７　Ｓ　ｔｏｐ？　（ストルモ等、１９８２；ド・ボア等、１９８３ｂ） におけるｔａｃリポソーム結合部位およびＡＴＧ翻訳開始コドン間の領域の長さ に起因し得るため、多重クローニング部位および終止コドンを含むｐｓ３１０Δ Ｂａｍ７Ｓｔ。

ｐ７における修飾５ｊ２６　ｃＤＮＡの３゛−末端は、下記の要領でｐｓｊ５に 導入された。

テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするｐＳｊ５のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｎｄｅｌ フラグメントを、１ａｃｌｑ対立遺伝子および凪の一部分を含むｐＭＣ９（ミラ ー等、１９８４）から誘導された！　、７ｋｂ　ＥｃｏＲ１フラグメントと置き 換えた。イー・つりＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウ・フラグメントによる処理 後に精製され几フラグメントのプラント末端結合により、ｌａｃ　Ｉ　ｑ、　ａ ｍｐ’およびｔａｃ−Ｓｊ２６が全て同じ方向で転写されているプラスミド（ｐ ４．５）が生成された。Ｍ。

５における５ｊ２６　ｃＤＮＡの３゛−末端のＥｃｏＲＩ開裂部位を補充および 再連結により除去し、３０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いたマンデツキ（１ ９８６）により記載された突然変異手法によりｃＤ−ターおよび５ｊ２６　ｃＤ ＮＡの５°一部分を含むこのプラスミドのＢｅ１ｌフラグメントを、斐２１、釘 および１ａｃｌｑの５°一部分を含むｐ４．５のＢｃｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲ１フラ グメントと、５ｊ２６ｃＤＮＡの３°−末端、次いで多重クローニング部位、終 止コドンおよびＰＢＲ３２２のヌクレオチド２０６７−２２４６を含むｐｓｊｌ ｏΔＢａｍ７Ｓｔｏｐ７のＢａａｌｌ−Ａｃｃｌフラグメントとを連結すること により形成されたプラスミドの特有のＢｅ１１部位に挿入した。Ｂｃｌｌによる 開裂は、メチラーゼ欠損ＧＭ４　Ｂ細胞（マリヌス、１９８３）で生長させたプ ラスミドＤＮＡにおいて行なわれ、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼｌの フレノウ・フラグメントで処理することによりＥｃｏＲＩおよびＡｃｅｌ末端を プラント末端化した。第７図に示す構造を有するプラスミド（ｐＧＥＸ−１）を 含む形質転換体が同定された。トロンビンまたは血液凝固因子Ｘａの開裂認識部 位をコードするオリゴヌクレオチドをｐＧＥＸ−１０ＢａｍＨ１部位に挿入する ことにより、特有のＢａｍＨＩ部位が１個ま１ニは２個のヌクレオチドによりフ レーム・シフトされているプラスミド（ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘ） を製造した（第７ｂ図）。プラスミドＤＮＡのジデオキシヌクレオチド配列決定 （チェノおよびシーバーブ、１９８５）によりヌクレオチド配列を確認し、例外 が示され、プラスミドはイー・コｌＪ株ＪＭ１０９（ヤニッシューペロン等、１ ９８５）に形質転換されｋｃ制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素はニューインク１ラ ンド・バイオラブズから購入され、メーカーの指示に従い使用された。

ｐｃＥｘベクターに挿入さオー几ピー・ファルシパルムｃＤＮＡは、各々Ｓｍａ ｌ　−ＥｃｏＲＩ開裂ｐＧＥＸ−３ＸおよびｐＧＥＸ−２ＴにおけるＡｇ６３（ ビアンコ等、１９８６）の５５５ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ＥｅｏＲＩフラグメントお よび５８０ｂｐ　ＲｓａＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント、ＥｃｏＲ１開裂ｐｓｊ １０におけるＡｇ１６（コツペル等、１９８３）およびＡｇ３６１　（ビーダー リン、私所見）の７６３ｂｐおよび１０１０ｂｐＥｃｏＲＩ：７ラグメント並ヒ ｉ：　Ｅ　ｅｏＲ１切断ｐＧＥＸ−３Ｘｌ：おけるＲＥＳＡ（ファバロロ等、１ ９８６）の１３１７ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントであった。

融合蛋白質のアフィニティー精製 親または組換えＰＧＥＸプラスミドにより形質転換されたイー・コリの一夜培養 物を新鮮な培地８００πｇ中１：１０に希釈し、１時間３７℃で生長させ、ＩＰ ＴＧを加えた（０．１＋ｏＭ）、さらに３−７時間生長させた後、沈澱した細胞 を１　／　５０−１　／　ｌ　００培養容量のマウス毒性燐酸緩衝食塩水（ＭＴ 　Ｐ　Ｂ　ＳＸ１５０　ミリモルＮ　ａ　Ｃ１ｓ１６ミリモ゛ルＮａ１ＨＰＯ， ，４ミリモルＮａＨｔＰＯ４（ＰＨ７，３））に再懸濁した。緩い音波処理によ り細胞を氷上で溶解させ、トリトンＸ−１００ＣＢＤＨ’！ミカルズ）を加えた （１％）後、４℃で５分間１００００ｇで遠心分離を行った。上滑を回転プラッ トホーム上に置いた５０ｖｒＱのポリプロピレン管中室温で１−２ＲＱの５０％ グルタチオン−アガロース・ビーズ（硫黄連結、シグマ）と混合しｆこ。使用前 、ビーズをＭＴＰＢＳ中で予め膨潤させ、同緩衝液で２回洗浄し、４℃でＭＴＰ ＢＳ中５０％中休０％体積）溶液として貯蔵した。吸収後、ビーズを１０秒間遠 心分離（５００ｇ）により集め、５０好のＭＴＰＢＳで３回洗浄した。２×１ビ 一ズ体積の５ｍＭ還元グルタチオン（シグマ）含有５ｍＭ）リス−ＨＣ４（ｐＨ ８、０）（最終ｐＨ７、５、新たに調製）を用いて遊離グルタチオンと競合させ ることにより融合蛋白質を溶離させた。グルタチオン−アガロース・ビーズへの 融合蛋白質の吸収および後続の溶離は共に２分以内に完了する。グルタチオン− アガロースへの融合蛋白質の結合は、他の中性緩衝液、例えば５ＯｍＭ）リス− ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）またはＭＴＰＢＳ（トリトンＸ−１００を含まず）にお いても行なわれ得るが、デタージエントを含有させると、エシェリヒア・コリ蛋 白質に伴う汚染が減少する。汚染はまた、細胞を音波処理に付す期間を最小限に することにより低減化され得る。非安定性融合蛋白質の収率は、細胞採収の１時 間足らず前までＩ　ＰＴＧの添加を遅らせることにより高められ得る。融合蛋白 質の収率は、ｐＧＥＸ−１により形質転換された細胞から精製された蛋白質の蛋 白質濃度評価（バートリー、１９７２）から誘導され７：　１　０　Ｄ　ｔａ。

＝０．５ｒ、９／ｖＱの関係を用い、標準としてうし血清アルブミンを用いて２ ８０μｍでの吸光度から計算された。

融合蛋白質発現を目的とする形質転換体のマススクリーニングは、好都合には３ ００μＣのＭＴＰＢＳに再懸濁した１、５ｉ１２培養物において実施される。音 波処理および遠心分離後、上清を５０μＱの５０％グルタチオン−アガロース・ ビーズと混合し、３　ｘ　ｉ　ｔａのＭＴＰＢＳで洗浄し、ビーズを１００μｇ の試料緩衝液中で煮沸して、−プル、１９７３）分析、次いで０．０５％クーマ シー・ブルー染色を行った。

融合蛋白質の部位特異的蛋白質加水分解トロンビンによる精製融合蛋白質の開裂 は、２５℃で１５０ミリモルＮａＣ１，２，５ミリモルＣａ　Ｃ１ｔおよび１０ ０ｒ＋９ひとトロンビンむ溶離緩衝液中において行なわれた。ひと血液凝固因子 Ｘａによる開裂は、２５℃で１００ミリモルＮａＣ１，１ミリモルＣａＣ１ｔ、 ５００ｎ９ひと因子Ｘａおよび５０μりの精製融合蛋白質（水弁およびトガーゼ ン、１９８４）を含む溶離緩衝液中において行なわれに。因子Ｘａへの因子Ｘ（ シグマ）の活性化は、３７℃で５分間、７μりの因子Ｘ、７５ｎ９の活性化酵素 、８１１ＩＭトリスーＨＣ（（ｐＨ８，０）、７０ミリモルＮａＣ１および８ミ リモルＣａＣ１＊を含む反応においてラッセルのクサリヘビ毒液活性化酵素（シ グマ）を用いた処理により行なわれた（藤用等、１９７２）。

結果 ｐＧＥＸベクターの構築および構造 プラスミドｐＳｊ５は、強いイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）−誘導可能ｊにプロモーター（スミス等、１９８７ｂ）の制御下でのエ シェリヒア・コリにおける５ｊ２６の合成を指図する。一連の操作を通してｐＳ ｊ５を修飾した結果、外来ポリペプチドが５３２６のＣ００Ｈ−末端との融合体 として発現され得た。

生成したプラスミド（ｐＧＥＸ−ＩＸ第７図）は、（ａ）ｔａｅプロモーター（ アマン等、１９８３．ド・ボア等、１９８３ａ）、次いでＳｊ２６の完全コード 配列（スミス等、１９８６．１９８７ａ）（ただし、通常の終止コドンが制限エ ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ。

ＳｍａｌおよびＥｃｏＲＩに対する特有の認識部位を含むポリリンカーにより置 き換えられ、３リーデイング・フレーム全部におけるＴＧＡ翻訳終止コドンが続 り）（第７ｂ図）、（ｂ）アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子 、（ｃ）複製開始点および （ｄ）ｌａｃリプレッサーの過剰発現１ａｃ　Ｉ−ｑ対立遺伝子および］ａｃＺ の一部を含むｌａｃオペロンのフラグメントを含む。多重クローニング部位のリ ーディング・フレームが、部位特異性プロテアーゼ・トロンビン（ｐＧＥＸ−２ Ｔの場合）または血液凝固因子Ｘａ（ｐＧＥＸ−３Ｘの場合）の開裂認識配列を コードするオリゴヌクレオチドの導入を介して１個または２個のヌクレオチドに よりシフトされている、ｐＧＥＸ−１７７）２つの誘導体（ｐＧＥＸ−２Ｔおよ びｐＧＥＸ−３Ｘ。

第７ｂ図）が構築された。

ｐＧＥＸ−１により形質転換された細胞でのＩ　ＰＴＧによるり９プロモーター の誘導の結果、Ｃ００Ｈ−末端に１０個の追加アミノ酸残基を有する５３２６か ら成るＭｒ２７５００ポリペプチドの合成が行なわれる（第８ａ図）。その豊富 さにも拘わらず、Ｍｒ２７５００ポリペプチドは不溶性細胞封入体を形成せず、 音波処理により溶解され、５分間１００００ｇでの遠心分離に付された細胞の上 清に残存している（第８ｂ図）。さらに、Ｓｊ２６へのＣ００Ｈ−末端の伸長は グルタチオン−アガロースとの結合に影響を与えないため、細胞抽出物のアフィ ニティー・クロマトグラフィーの結果、少なくとも１５２９／Ｉ２Ｃ培養物）の 収率によりイー・コリ蛋白質に伴う検出可能な汚染物質・が存在しない状態でＭ ｒ２７５００分子が効果的に精製される（第８ｂ図）。共にＣ００Ｈ−末端に１ ４追加残基を含むｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘによりコードされた修飾 Ｓ＋２６ポリペプチドの場合にも似た特性が観察される。誘導物質の不在下では 、野生型１ａｃ　Ｉ対立遺伝子を担うイー・コリ株、例えばＣ６００またはＧＭ ４８（マリヌス、１９７３）の場合でも、プラスミド・コード化１ａｃＩｑ対立 遺伝子はｔａｃプロモーターからの転写抑制に有効である（未発表データ）（第 ８ａ図）ｅ プラスモディウム・ファルシパルム抗原の発現および精製外来ポリペプチドの発 現および精製用システムとしてのｐＧＥＸベクターの普遍性を試験する１ニめに 、ファルシパルム・マラリアの原因となるプラスモディウム・ファルシパルムの 幾つかの相異なる抗原に対応するｃＤＮＡを、適当なｐＧＥＸベクターの多重ク ローニング部位に挿入した。選ばれ７：　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、共に熱シヨツク蛋 白質７０（ビアンコ等、１９８６．ビーダーリン等、１９８７）に関連した２種 の相異なる抗原（Ａｇ６３、Ａｇ３６１）、および縦一列に反復したペプチドを 含む２種の抗原（Ａｇ１６、ＥｃｏＲＩ　−ＲＥＳＡＸコツペル等、１９８３． ファバロロ等、１９８６）の一部分をコードする。

各場合において、豊富なグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ−融合蛋白質の合 成が観察され、これらの融合蛋白質は、固定グルタチオンにおける細胞抽出物の アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製され得、収率は培養物１リツト ルに対し１．６ないし５２ｇであった（第９図）。ｐＧＥＸベクターを用いて有 効に発現および精製された他のポリペプチドは、８種の他のピー・ファルシパル ム抗原、寄生性条虫テニア・オビスおよびティー・テニアホルミスの１０種の相 異なる抗原およびねずみインターロイキン−４およびか粒球マクロファージ・コ ロニー刺激因子を含む（未発表データ）。

精製融合蛋白質のプロテアーゼ開裂 精製後、グルタチオン−５−）ランスフェラーゼ担体が部位特異的プロテアーゼ 開裂に上り融合蛋白質から除去され得る場合、エシェリヒア・コリでの外来ポリ ペプチドの生産に用いられるＰＧＥＸベクターの有用性は高くなり得る。この方 法は、血液凝固因子Ｘａ（永井およびトガーゼン、１９Ｂ４）またはコラゲナー ゼ（ゲルミノおよびバスチア、１９８４）の認識部位を含む融合蛋白質量して有 効で。

あることが判ったが、有効で；い場合もあった（アレン等、１９８５）。

トロンビン（チャンク、１９８５）または血液凝固因子Ｘａ（永井およびトガー ゼン、１９８４）の開裂認識部位をコードするオリゴヌクレオチドをｐＧＥＸ− １の多重クローニング部位へ５°に隣接して導入することにより、それぞれプラ スミドｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘが生成された（第７ｂ図）。Ａｇ６ ３　ｃＤＮＡ（ビアンコ等、１９８６）の５８０塩基対（ｂｐ）Ｒｓａ　Ｉ　− ＥｃｏＲＩフラグメントをＩ）ＧＥＸ−２ＴのＳｍａｌ　−ＥｃｏＲ１部位に挿 入しに結果、グルタチオン−アガロースにおいて精製され得るＭｒ４３０００融 合蛋白質の発現が行なわれた（第１０ａ図）。この蛋白質をトロンビンとインキ ュベーションすると、一方はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ担体および他 方はＡｇ６３のＭｒ２２５００部分の２種のフラグメントが生成された（第１０ ａ図）。有効な開裂は、１　：５００の酵素対基質比で３０分以内に行なわれた 。小比率の融合蛋白質は、ｌＯ倍高濃度の酵素との２時間のインキュベーション 後でも開裂に対する抵抗を示した。同様に、ｐＧＥＸ−３Ｎベクターを用いたＡ ｇ６３の５５５ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントの発現の結果、血液 凝固因子Ｘａにより２つのフラグメントに開裂されるＭｒ４３０００融合蛋白質 の合成が行なわれた（第１０ｂ図）。因子Ｘａによる開裂は、トロンビンの場合 よりも緩慢で効率も劣ったが、恐らく因子Ｘの非効率的な活性化に起因すると考 えられる。３種の他のｐＧＥＸ−２７融合体および１種の追加ｐＧＥＸ−３Ｘ融 合体が、適当なプロテアーゼによる開裂に対する感受性に関して試験されにが、 各場合とも有効な開裂が観察された（未発表データ）。どのプロテアーゼもグル タチオンＳ−）ランスフェラーゼ担体を開裂しないため、蛋白質加水分解後担体 および未開裂融合蛋白質は、グルタチオン−アガロース吸収により共に開裂反応 から除去され得、精製されたポリペプチド生成物のみが残り得る（第１Ｏ図）。

（参考文献） ｌ、アブラハムゼン、モックス、ニルッソンおよびウーレン、（１９８６）、「 二二−クリーク・アシッズ・リサ−ｆＪ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、 １４．７４８７−７５００゜２、アレン、ペインターおよびウィンザー、（１９ ８５）、「ジ工３、アマン、ブロシウスおよびブタジン、（１９８３）、「ジニ ン」（Ｇｅｎｅ）、旦、１６７−１７８゜ ４、アンダース、コツペル、ブラウン、セイント、コラマン、リンゲルバッハ、 ミッチェルおよびケンプ、（１９８４）、「モル、パイオル、メト、　ｊ（Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）、２：１７７−１９１゜５、バロウル、ソンダー マイヤー、ドレイヤー、エム・カプロン、グリツィヒ、ピアス、カーバロ、ルコ ックおよびニー・カプロン、（１９８７）、［ネイチ＋　−ｊ（Ｎ　ａｔｕｒｅ ）、３２６．１４９−１５３゜６、ビアンコ、ファバロロ、バーコツト、カルベ ナー、クルーザ−、ブラウン、アンダース、コツペルおよびケンブ、（１９８Ｂ ）、「プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ ンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・才ブ・ア９、チェンジ、ディー ・ワイ・クラオー、ティー・ジエイ・クラ第１０、コツペル、コラマン、リンゲ ルバッハ、ブラウン、セイント、ケンブおよびアンダース、（１９８３）、「ネ イチャー」、ｌ立見、７５１−７５６゜ １１、コラマン、コツペル、セイント、ファバロロ、クルーイー、スタール、ビ アンコ、ブラウン、アンダースおよびケンブ、（１９８４）、璽モル、パイオル 、メト、：、２：２０７−２２１゜１２、クルーイー、ビアンコ、ブラウン、コ ツペル、スタール、ケ１３、ダバーン、チウ、モラハン、ライト、ガルシアおよ びミッチェル、（１９８７）、「イミュノル、セル、パイオイル、　ｊ（Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｉｌ、Ｘ印刷中）。

１４、ド・ボア、カムストックおよびバッサ−１（１９８３ａ）、「プロシーデ ィングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカ」、見立、２１−２５゜ １５、ド・ボア、カムストックおよびバッサ−１（１９８３ｂ）、「ＤＮＡＪ、 主、２３１−２３５ｃ １６、イートン、ロドリゲスおよびベハー、（１９８６）、「バイオケミストリ ーｊ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、旦、５０５−５１２ｃ１７、ファバロロ 、コツペル、コーコラン、フープ、ブラウン、アンダースおよびケンブ、（１９ ８６）、「ニュークリーク・アシツズ・リサーチ」、１４．８２６５−８２７７ ゜１Ｂ、藤用、レガスおよびディー、（１９７２）、「バイオケミストリー」、 上上、４８９２−４８９９゜ １９、ゲルミノおよびバスチア、（１９８４）、ｒプロシーデイングズ・オフ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド ・ステーブ・オフ・アメリカ」、■、４６９２−４６９６゜ ２０、ゲルミノ、グレイ、シャルボンノ、バナマンおよびバスチア、（１９８３ ）、ｒプロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ ンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカ」、見立、６８ ４ｇ−６８５２゜２１、グレイ、コルット、ガレンテおよびロスバージ＞、（１ ９８２）、「プロシーディングズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・ サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカ」、Ｌ見 、６５９８−６６０２゜２２、バッフエイ、レーマンおよびボガー、（１９８７ ）、ｒＤＮＡｊ、６．５６５゜ ２３゜ハリス（１９８３）。ウィリアムソン（編集）−「ジェネティック・エン ジニアリングｊ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツク・ プレス、ロンドン、第４巻、１２８−１７５゜２４、バートリー、（１９７２） 、ｒアナリティカル・バイオケミストリー」（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　１ｏｃｈｅｓ 、）、−先」−１４２２−４２７゜２５、ハーベイおよびボイトラー、（１９８ ２）。「ブラッドｊ（Ｂｌｏ。

ｄ）、　６０−二　１２２７−１２３０　。

２６、板金、広瀬、フレア、リッグス、ハイネッカー、ポリパルおよびボイヤー 、（１９７７）、「サイエンスｊ（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、±９８．１０５６−１ ０６３゜ ２７、加藤、小林、工藤、古里、村上、日中、馬場、大石、大塚、１９７−２０ ２゜ ２８．ケーネン、ルターおよびムラー−ヒル、（１９８２）、「アンダ・ジャー ナＪｌ、ｊ（ＥＭＢＯＪ、）、上、５０９−５１２゜２９、クライト、ヤンスラ 、スモール、ダウベンコ、ムーア、グルブマン、マツカーチャー、モーガン、ロ バートソンおよびバハラハ、（１９８１）、「サイエンス」、凪、１１２５−１ １２９゜３０、レムリおよびファブル、（１９７３）、ｒジャーナル・オフ・３ １、ラングフォード、エドワーズ、スミス、ミッチェル、モス、ラングおよびア ンダース、（１９８６）、「モル、セル、パイオル、」、６：３１９１−３１９ ９゜ ３２、ローペンアドラー、ニルッソン、アブラームゼン、モックス、リュングク ビスト、ホルムグレン、パレウス、ヨセフソン、フィリブソンおよびウーレン、 （１９８６）、「アンダ・ジャーナル」、５゜２３９３−２３９８゜ ３３、マツキンダイア、コツペル、スミス、スタール、ニーコラン、ラングツ１ −ド、ファバロロ、クルーイー、ブラウン、ミツチェル、アンダーソンおよびラ ング、（１９８７）、「インターナショナル・。

オフ・バラサイトロジーｊ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）、上７ｃ ５９−６７゜ ３４、マンデツキ、（１９８６）、「プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・ オフ・アメリカ」、８３，７１７７−７１８１゜ ３５、マニアチス、フリーチュおよびザンブルック、「モレキュラー・クローニ ングニア・ラボラトリ−・マニュアルｊ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　 ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）、コールド０スプリング０ハー バ−・ラボラトリ−１１９８２゜ ３６、マンナービック、（１９８５）、ｒアトパンシーズ・イン・エンサイモロ ジーｊ（Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、５７．３５７−４１７゜３７、マリヌ ス、（１９７３）、「モレク、ジエン、ジエネツ、ｊ（Ｍｏｌｅｃ、　ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ、）、１２７，４７−５５゜３８、マーシュ、ニーフルおよびワイ クス、（１９８４）、「ジーン」、３２．４８１−４８５ｃ ３９、マーストン、（１９８６）、「バイオケミカル・ジャーナル」（Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｊ、）、主王立、１−１２゜４０、ミラー、レブコウスキー、グライ ゼンおよびカロス、（１９８４）、「アンダ・ジャーナル」、主、３１１７−３ １２１゜４１、ミラー、クルイズ、ガルシアおよびチウ、（１９８４）、ｒジャ ８１０−８１２゜ ４３、ニルッソン、アブラームゼンおよびウーレン、（１９８５）、？アンダ・ ジャーナル」、土、１０７５−１０８０゜４４、ペーダーリン、クルーイー、ト ンプソン、ニーコラン、コツペル、ブラウン、アンダースおよびラング、（１９ ８７）、ｒＤＮＡＪ（印刷中）。

４５、ルターおよびムラー−ヒル、（１９８３）、「アンダ・ジャーナル」、主 、１７９１−１７９４゜ ４６、セイント、ビオール、グルモント、ミッチェルおよびガルシア、（１９８ ６）、「モル、バイオケム、パラシトル円（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐ　 ａｒａｓｉｔｏｌ、）、１８：３３３−３４２゜４７、サツセンフェルドおよび ブルーワー、（１９８４）、ｒバイオ。

テクノロジーｊ（Ｂ　ｉｏ、　Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２，７６−８１゜４ ８、シェーマ−カー、プラスネットおよびマーストン、（１９８５）、「アンダ ・ジャーナル」、土、７７５−７８０゜４９、シモンズおよびバンダー・ジャブ ト、（１９７７）、「アナリティカル・バイオケミストリーｊ（Ａ　ｎａｌ、　 Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、８２．３３５０、シモンズおよびバンダー・ジャブト、 （１９８１）、「メソッズ・インーｘンザイモロジーｊ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、）、工１．２３５−２３７゜ ５１、スミス、ダバーン、ボード、チウ、ガルシアおよびミンチェル、（１９８ ６）、ｒブロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ エンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカム８３．８７ ０３−８７０７゜５２、スミス、ダバーン、ボード、チウ、ガルンアおよびミッ チェル、（１９８７ａ）、「プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・ア メリカＪ、８４．６５４１゜５３、スミス、ルビラ、シンプソン、ダバーン、チ ウ、ボードおよびミッチェル、（１９８７ｂ）、「モル、バイオケム、バラシト ル、」（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、Ｘ印刷中）。

５４、スタンレーおよびロツィオ、（１９８４）、ｒアンボ・ジャーナル」、主 、１４２９−１４３４゜ ５５、ストーモ、シュナイダーおよびゴールド、（１９８２）、「ニュークリー ク・アシッズ・リサーチ」、１見、２９７１−２９９６゜５６、ウーレン、ニル ッソン、ゲス、リンドバーグ、ガーテンベッ７８゜ ５７、ウルマン、（１９８４）、「ジーンム玄９，２７−３１゜５８、ヤニッシ ューベロン、ビニイラおよびメツシング、（１９８５）、「ジーン」、主１．１ ０３−１１９゜５９、ヤングおよびデービス、（１９８３）、［ブロシーディン グズ・万ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカ」、影±、１１９４−１１９８゜ ０　０−５　１　１・５　２２５ ０　１　２　３　０　＋　２　３　ＡｗＥ、−、−Ｃコ囁；Ｃ）　− ＦＩＧ、Ｊ。

ＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＴ　Ｐ 口 ←− ＬＪ ０く　ロく　ロく １−　ＬＪ　Ｌ　ＩＪ　ＬＩＪ ユＩ＋＋　乙り　乙Ｕ Ｆｔｃ、８Ａ。

ＭＴＰＳＵＥ ｐＧＥＸ−１６３３６１１６Ｒ ＭＴ　ＰＴＰＰＰＰ ゝ−”　−六＋Ｖ楓−４−一、−一〜・−−Ｂ　ｐＧＥＸ−１ｐＧＥＸ−３Ｘ− Ａｇ６３国際調査報告 −１Ｍ＋ｈＩ物＋ｈａｅｂｔｗ−１１ｅ、ｐ（τ／ＡＬＩ８Ｂ／Ｃｏ：６４Ｍ１ 　７７１７０７８７　ＤＫ　４３８０／８７　Ｅ？　２６Ｅ！５０１　ＦＲ２６ ０３０４０二〇ＯＦλＭζＸ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）外来蛋白質またはペプチドが酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ と融合されている融合蛋白質の発現をコードするヌクレオチド配列を含む組換え ＤＮＡ分子。 （２）ヌクレオチド配列が、外来蛋白質またはペプチドが酵素のＣＯＯＨ−末端 と融合されている融合蛋白質の発現をコードする、請求項１記載の組換えＤＮＡ 分子。 （３）酵素が、シストソーマ・ジャポニクム（日本住血吸虫）の２６ｋＤａグル タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、請求項１または請求項２記載の組換 えＤＮＡ分子。 （４）ヌクレオチド配列が、外来蛋白質またはペプチドが開裂可能な結合を介し て酵素と融合されている融合蛋白質の発現をコードする、請求項１、２または３ 記載の組換えＤＮＡ分子。 （５）開裂可能な結合が、部位特異性プロテアーゼにより開裂され得る結合であ る、請求項４記載の組換えＤＮＡ分子。 （６）開裂可能な結合が、トロンビン、血液凝固因子Ｘａまたはレニンにより開 裂可能な結合である、請求項５記載の組換えＤＮＡ分子。 （７）請求項１〜６のいずれか１項記載のヌクレオチド配列が挿入されている発 現ベクター。 （８）融合蛋白質の発現を目的として前記ヌクレオチド配列に機能し得るように 結合された発現制御配列を含む、請求項７記載の発現ベクター。 （９）細菌性プラスミドである、請求項７または請求項８記載の発現ベクター。 （１０）請求項７〜９のいずれか１項記載の発現ベクターにより形質転換された 宿主細胞。 （１１）エシェリヒア・コリである、請求項１０記載の宿主細胞。 （１２）融合蛋白質が回収可能な量で発現される条件下での請求項１０または請 求項１１記載の宿主細胞の培養工程を含む、融合蛋白質の製造方法。 （１３）細胞培養からの融合蛋白質の回収工程を含む、請求項１２記載の方法。 （１４）宿主細胞を溶解させ、リゼイトを固定グルタチオンと接触させることに よりリゼイトから融合蛋白質を分離する工程により、融合蛋白質が回収される、 請求項１３記載の方法。 （１５）請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法により融合蛋白質を製造し 、次いで融合蛋白質を開製して外来蛋白質またはペプチドを酵素から分離させる 工程を含む、蛋白質またはペプチドの製造方法。 （１６）請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法により製造される融合蛋白 質または請求項１５記載の方法により製造される蛋白質。 （１７）酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対応する第１配列および 異種蛋白質またはペプチドに対応する第２配列を含む融合蛋白質。 （１８）酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとして発現され得るヌクレ オチド配列、次いでグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合した外来蛋白 質またはペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列の挿入を目的とする少な くとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位が挿入されている、発現ベクター 。 （１９）酵素が、シストソーマ・ジャポニクムの２６ｋＤａグルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼである、請求項１８記載の発現ベクタ（２０）ヌクレオチド 配列が、酵素および外来蛋白質またはポリペプチド間の開裂可能な結合として発 現され得る配列を含む、請求項１８または請求項１９記載の発現ベクター。 （２１）開裂可能な結合が部位特異性プロテアーゼにより開裂され得る結合であ る、請求項２０記載の発現ベクター。 （２２）融合蛋白質の発現を目的としてヌクレオチド配列に機能し得るように結 合された発現制御配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の発現ベク ター。 （２３）細菌性プラスミドである、請求項１８〜２２のいずれか１項記載の発現 ベクター。 （２４）ｐＳｊｌＯ、ｐＳｊｌＯ　ＤＢａｍｌおよびｐＳｊｌＯ　ＤＢａｍ７Ｓ ｔｏｐ７から成る群から選ばれるプラスミドを含む、請求項１８記載の発現ベク ター。 （２５）ｐＧＥＸ−１、ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘから成る群から選 ばれるプラスミドを含む、請求項１８記載の発現ベクター。