NO178894B

NO178894B - Rekombinant DNA-molekyl, ekspresjonsvektor, vertcelle, fusjonsprotein og fremgangsmåte for fremstilling av proteinet

Info

Publication number: NO178894B
Application number: NO890325A
Authority: NO
Inventors: Donald Bruce Smith
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1989-01-26
Publication date: 1996-03-18
Also published as: ES2045115T3; DK169975B1; ZA883681B; JPH0681596B2; EP0293249B1; AU607511B2; ATE79902T1; NO890325D0; NZ224663A; NO890325L; JPH01503441A; DE3873989D1; DK38189A; GR3006173T3; DK38189D0; EP0293249A1; SG25093G; AU1793288A; WO1988009372A1; DE3873989T2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et rekombinant DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder for ekspresjon av et fusjonsprotein. Oppfinnelsen vedrører også en ekspresjonsvektor istand til å uttrykke et fusjonsprotein, en vertcelle transformert med en ekspresjonsvektor, en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein samt fusjonsprotein for anvendelse in vitro.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Et antall forskjellige vektorer er beskrevet som dirigerer ekspresjonen av fremmede polypeptider i Éscherichia Coli (rapportert av Harris, 1983; Marston, 1986; Mclntyre og medarbeidere 1987). Noen vektorer er konstruert for å for-enkle produktrensing, men en vanskelighet som er felles for de fleste av disse systemer er at denatureringsmidler er nødven-dig for å opprettholde oppløseligheten av proteinene eller eluere dem fra affinitetsreagenser. Denaturering kan ventes å endre antigenisiteten og ødelegge enhver funksjonell aktivitet av det fremmede polypeptid. F.eks. kan polypeptider uttrykt som NH2-ende eller COOH-ende fusjoner med E.coli |3-galaktosidase (Gray og medarbeidere, 1982; Koenen og medarbeidere 1982; Ruther & Muller-Hill, 1983) og som er oppløselige i 1,6 M NaCl, 10 mM (5-merkaptoetanol, renses fra urene cellelysater ved affinitetskromatografi på en kolonne av p-aminofenyl-Ø-D-tiogalaktosid etterfulgt av eluering i 0,1 M natriumborat pH 10,10 mM (3-merkaptoetanol (Germino og medarbeidere, 1983; Ullmann, 1984). Slike fusjonsproteiner vil også bindes til immobilisert anti-(3-galaktosidase-antistof f er og kan fjernes ved eluering i oppløsninger med høy eller lav pH (Promega biotec). Alternativt er fusjoner med p-galaktosidase som mangler de siste 16 COOH-ende aminosyrene i (3-galaktosidase ofte uoppløselige (Itakura og medarbeidere, 1977; Young & Davis, 1983; Stanley & Luzio, 1984) og kan således renses fra uoppløselige fraksjon av lyserte bakterier etter fornyet oppløseliggjøring ved behandling med denaturerende reagenser (Marston, 1986). Den samme metode kan anvendes for rensing av polypeptider uttrykt som uoppløselige COOH-ende fusjoner med et protein inneholdende trpE ledersekvensen og COOH-enden "third" av trpE proteinet (Kleid og medarbeidere, 1981). Bortsett fra bruk av denaturerende betingelser lider disse metoder av den ulempe at E.coli proteiner anvendt som bærere kan føre til en immunrespons overfor fusjonsproteinet, særlig i tilfellet av fusjoner med (3-galaktosidase (Mr 116.000), og kan utløse antistoffer som utviser uønskede kryssreaksjoner.

Andre ekspresjonsvektorer dirigerer syntesen av polypeptider som fusjoner med COOH-enden av stafylokokk-protein A som kan renses fra cellelysater ved affinitetskromatografi på en kolonne av human IgG-Sepharose (Uhlen og medarbeidere, 1983; Nilsson og medarbeidere, 1985; Abrahamsen og medarbeidere, 1986; Lowenadler og medarbeidere 1986). Pga den høye affinitet av protein A for IgG kreves vanligvis denaturerende betingelser for eluering av fusjonsproteinene selv om alterna-tive strategier kan anvendes som f.eks. konkurranse med overskudd av nativt protein A, bruk av IgG fra sau som har en lavere affinitet for protein A (Nilsson og medarbeidere, 1985) eller reduksjon i størrelsen av protein A bæreren slik at affiniteten for IgG reduseres (Abrahamsen og medarbeidere, 1986) . Et mere alvorlig problem er at bindingen av fusjonsproteiner til IgG kompliserer den immunologiske screening av kloner eller analyse av rekombinante produkter ettersom antistoffer som binder til protein A vil gjenkjenne ethvert fusjonsprotein, uten hensyn til deres andre spesifisiteter.

En ytterligere strategi for rensing av fremmede polypeptider fra E.coli er å fremstille polypeptider som inneholder polyarginin ved deres COOH-ende (Sassenfeld & Brewer, 1984). De sterkt basiske argininrester øker affiniteten av fusjonsproteiner for anioniske harpikser slik at fusjoner kan renses ved hjelp av kationbytterkromatografi, hvoretter COOH-ende argininrestene kan fjernes ved behandling med karboksy-peptidase B. Andre vektorer dirigerer utskilling av polypeptider i det periplasmiske rom eller inn i dyrkingsmediet og selv om ekspresjonsnivået ofte er lavt, blir utskilte polypeptider beskyttet mot nedbrytning av bakterielle proteaser og separert fra de fleste andre proteiner (Marston, 1986; Abrahamsen og medarbeidere 1986; Lowenadler og medarbeidere 1986; Kato og medarbeidere 1987). Disse siste arbeider har vært anvendt med hell i enkelte tilfeller, men deres generelle karakter er uklar, særlig for polypeptider inneholdende mange sure rester som er stort sett hydrofobe.

Ved et aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et rekombinant DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder for ekspresjon av et fusjonsprotein hvor et fremmed (eller heterologt) protein eller peptid er fusjonert med COOH-enden til enzymet glytation-S-transferase, eventuelt gjennom en spaltbar link.

Det nye fusjonsprotein i henhold til oppfinnelsen med den fremmede peptidkomponent fusjonert til enzymet glutation-S-transferase (E.C. 2.5.1.18) unngår flere av de vanskeligheter som er assosiert med kjente fusjonsproteiner. Spesielt er fusjonsproteinet i samsvar med oppfinnelsen oppløselig og kan renses fra bakterielysater under ikke-denaturerende betingelser, ved affinitetskromatografi på en kolonne av immobilisert glutation.

Ved en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen beskrevet detaljert heri er enzymet en glutation-S-transferase av parasitt-innvollsormen Schistosoma japonica. Glutation-S-transferasen i fusjonsproteinet kan imidlertid avledes fra andre arter inklusive mennesker og andre pattedyr.

I det arbeidet som førte til den foreliggende oppfinnelse er det vist at en lang rekke eukaryotiske polypeptider kan uttrykkes i E.coli som oppløselige og stabile glutation-S-transferase-fusjonsproteiner som lett kan renses under fysiologiske betingelser.

Ved et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en

ekspresjonsvektor, som f.eks. et bakterieplasmid, hvori det er innskutt en nukleotidsekvens istand til å uttrykke et fusjonsprotein hvor et fremmed protein eller peptid er fusjonert med COOH-enden av et glutation-S-transferaseenzym, eventuelt gjennom en spaltbar link. En slik ekspresjonsvektor vil foretrukket også omfatte en ekspresjonskontrollsekvens som er operativt knyttet til nukleotidsekvensen for ekspresjon av fusjonsproteinet.

I tillegg omfatter den foreliggende oppfinnelse også en verteelle inneholdende denne ekspresjonsvektor.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, idet metoden omfatter trinnet med å dyrke en vertcelle inneholdende en ekspresjonsvektor som beskrevet i det foregående under betingelser slik at fusjonsproteinet uttrykkes i en mengde som deretter kan utvinnes fra cellekulturen ved å lysere vertcellene og deretter isolere fusjonsproteinet fra lysatet ved å bringe dette i kontakt med immobilisert glutation, idet fusjonsproteinet deretter eventuelt spaltes for å separere det fremmede protein eller peptid fra enzymet.

Fusjonsproteinet i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes som sådant ettersom det fremmede protein eller peptid derav bibeholder sin antigenisitet og funksjonelle aktivitet. Alternativt kan fusjonsproteinet spaltes til å tilveiebringe syntetisk fremmed protein eller peptid. Hvis fremstillingen av slikt syntetisk fremmed protein eller peptid er ønskelig er det foretrukket anordnet en spaltbar link i fusjonsproteinet mellom glutation-S-transferasen og det fremmede (eller hetero-loge) protein eller peptid.

Ettersom den foreliggende oppfinnelse kan tilpasses ekspresjon og rensing av en rekke forskjellige fremmede proteiner eller peptider, tilveiebringer oppfinnelsen ved et ytterligere aspekt en ekspresjonsvektor, som f.eks. et bakterieplasmid, som har en nukleotidsekvens innskutt deri istand til å uttrykke et glutation-S-transferaseenzym etterfulgt av minst ett restriksjonsendonukleasegjenkjennelsessete for innskyting av en nukleotidsekvens i stand til å uttrykke et fremmed protein eller peptid fusjonert med COOH-enden av den nevnte glutation-S-transferase, idet vektoren eventuelt inkluderer en nukleotidsekvens i stand til å uttrykke en spaltbar link mellom enzymet og det nevnte fremmede protein eller peptid, og idet vektoren også omfatter en ekspresjonskontrollsekvens operativt koblet til nukleotidsekvensen for ekspresjon av fusj onsproteinet.

For spesifikt å illustrere den foreliggende oppfinnelse ble det konstruert en rekke plasmid-ekspresjonssvektorer (pGEX) som forenkler rensingen av fremmede polypeptider fremstilt i E.coli. Et plasmid som styrer syntesen av enzymatisk aktivt Sj26 i E.coli er blitt bygget opp (Smith og medarbeidere, 1987b). Mange pattedyr-glutation-S-transferase-isozymer kan renses ved affinitetskromatografi på immobilisert glutation etterfulgt av eluering ved konkurranse med overskudd av redusert glutation (Simons & Vånder Jagt, 1977, Mannervik, 1985) og denne egenskap deles av både nativt Sj26 og. rekombinant Sj26 fremstilt i E.coli (Smith og medarbeidere, 1986, 1987b). I samsvar med den foreliggende oppfinnelse uttrykkes polypeptider som COOH-ende fusjoner og med Mr 26.000 antigenet (Sj26) kodet av parasitt-innvollsormen Schistosoma Japonicum som en glutation-S-transferase, og kan renses under ikke-denaturerende betingelser ved affinitetskromatografi på immobilisert glutation. Oppløselig material fra lyserte bakterier blandes med glutationagarosekuler og etter vasking elueres fusjonsprotein med f.eks. 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) inneholdende 5 mM redusert glutation. Under anvendelse av batch-vaskeprosedyrer kan flere fusjonsproteiner renses parallelt i løpet av mindre enn to timer med utbytter på mellom 1,6 og 15 mg/liter kultur. Glutationagarosekuler har en kapasitet på minst 8 mg fusjonsprotein/ml svellede kuler og kan enten anvendes flere ganger for forskjellige prepareringer av det samme fusjonsprotein eller kan også resirkuleres ved vasking med 3 M NaCl (Simons & Vånder Jagt, 1981).

Dette system er med hell blitt anvendt for ekspresjon og rensing av forskjellige antigener av P.falciparum. Av 21 forskjellige P.falciparum cDNAer eller cDNA fragmenter som er blitt uttrykt i pGEX vektorer har 14 ført til oppløselige eller delvis oppløselige fusjonsproteiner som kan renses ved affinitetskromatografi på immobilisert glutation.

I noen få tilfeller har rensingen vært uten hell og dette skyldes uoppløseligheten av fusjonsproteinet. Uoppløselighet er en hyppig egenskap hos fremmede proteiner uttrykt i E.coli (Harris, 1983; Marston, 1986) og i denne sammenheng er det overraskende at majoriteten av glutation-S-transferase fusjonsproteiner er fullstendig eller delvis oppløselig. Det er lite kjent vedrørende faktorene som er ansvarlige for uoppløselighet (Marston 1986), men i flere tilfeller forbindes uoppløseligheten av glutation-S-transferase fusjonsproteiner med tilstedeværelsen av sterkt hydrofobe områder og fjernelse av disse områder øker sterkt stabiliteten og/eller oppløse-ligheten. Andre uoppløselige fusjonsproteiner inneholder enten mange ladede rester eller er større enn Mr 100.000. Uoppløselige fusjonsproteiner kan likevel renses ved affinitetskromatografi hvis de oppløseliggjøres i et oppløselig-gjørende middel som ikke bryter bindingen til glutationagarose, som f.eks. 1 % "Triton X-100", 1 % "Tween 20, 10 mM ditiotreitol eller 0,03 % NaDodS04. Rensing av andre uopp-løselige fusjonsproteiner må skje ved konvensjonelle metoder (Marston, 1986) med mindre polypeptidet kan uttrykkes i flere fragmenter som hvert danner et oppløselig fusjonsprotein.

Uoppløselighet er enkelte ganger forbundet med økt protein-stabilitet i E.coli (Cheng og medarbeidere, 1981), men ikke i andre tilfeller (Schoemaker og medarbeidere, 1985). Selv om der er noen unntagelser, er generelt både uoppløselige og oppløselige glutation-S-transferase fusjonsproteiner stabile og hvor direkte sammenligning er mulig er stabiliteten av et polypeptid uttrykt som en oppløselig glutation-S-transferase fusjon tilsvarende stabiliteten som en uoppløselige p-galak-tosidasefusjon.

Gode antistoffresponser er blitt utviklet mot den fremmede polypeptiddel av fusjoner i immunisert mus, kaniner og sauer. Spesielt synes responsene å være så gode som, eller bedre enn responser til ekvivalente (3-galaktosidasef us joner, noe som muligens avspeiler den mindre størrelsen av glutation-S-transferase bæreren (Mr 26.000 sammenlignet med Mr 116.000). Responser til Sj26 varierer i forskjellige musestammer (Davern og medarbeidere, 1987) og lignende variasjon iakttas i responsen til polypeptider uttrykt som fusjoner med glutation-S-transf erase .

Rensede glutation-S-transferase fusjonsproteiner synes å være gode substrater for kutting ved hjelp av setespesifikke proteaser. Der er få tidligere rapporter om heldig bruk av sete-spesif ikke proteaser ved kutting av fusjonsproteiner renset fra E.coli (Germino og Bastia, 1984; Nagai og Thogersen, 1984) muligens pga at denaturerende reagenser som kreves for fornyet oppløseliggjøring av fusjonsproteiner vil inhibere proteolyse. I motsetning til dette er mange glutation-S-transferase fusjonsproteiner oppløselige under betingelser som er kjent å være optimale for proteolyse. Foretrukket er den anvendte protease en protease som ikke kutter glutation-S-transferase bæreren slik at, etter proteolyse, kan polypeptidproduktet separeres fra bæreren og eventuelt ukuttet fusjonsprotein ved absorpsjon med glutationagarose. Egnede setespesifikke proteaser inkluderer f.eks. trombin eller blodkoagulasjonsfaktor Xa som beskrevet detaljert heri, eller rennin (Haffey og medarbeidere, 1987).

Kombinasjonen av ekspresjon på høyt nivå, ramme-skiftede kloningseter, hurtig rensing og effektiv setespesifikk proteolyse av fusjonsproteiner vil gjøre pGEX-vektorene til et sterkt system for ekspresjon av fremmede polypeptider i E.coli. I tillegg til forenkling av ekspresjonen og rensingen av polypeptidene kan vektorene tilveiebringe et billig alternativ til den kjemiske syntese av peptider for bruk som immunogener eller som immunokjemiske reagenser. Vektorene kan også være egnet for konstruksjon av cDNA- bibliotek særlig ettersom represjon av tac-promoteren ved hjelp av det plasmid-kodede lacl<q> allelet bør være effektiv i E.coli stammer som har høye transformasjonseffektiviteter, uansett deres lad status. Transformanter kan screenes ved konvensjonelle nukleinsyre- eller immunokjemiske metoder og fusjonsproteiner som er kodet av kloner av interesse kan renses ved hjelp av glutation-affinitetskromatografi.

De nye fusjonsproteiner i samsvar med oppfinnelsen sammen med de forskjellige andre aspekter som generelt er omtalt i det foregående, illustreres nærmere i det etterfølgende eksempel og vedføyde tegninger.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser i store trekk skjemaet for konstruksjonen av

plasmidet pSj 5.

Fig. 2 viser SDS-polyakrylamidgelanalyse av proteiner tilstede i celler transformert med pSj5. En kultur av celler dyrket over natten ble fortynnet 1:10 i friskt medium og inkubert ved 37°C i 1 time. IPTG ble så tilsatt til 0,1 mM og inkubasjonen ble fortsatt ved 37°C i det angitte antall timer. Størrelsen (i kDa) og posisjonen av molekylvektmarkører er indikert. Proteiner ble påvist ved farging med Coomassie-blått. Fig. 3 viser et immunoblot av celler som uttrykker rekombinant Sj26. Prøver av celler som inneholdt enten ptacll (det parentale plasmid), eller pSJ5 ble fremstilt som beskrevet i fig. 2, separert på en 13 % SDS-polyakrylamidgel og overført til nitrocelluldse. SjAWE er en ekstrakt av voksne S.japonicum innvollsormer. Nitrocellulosen ble probebehandlet med et kaninantiserum fremstilt mot renset P-galakosidase-Sj26-fusjonsprotein (Smith og medarbeidere, 1986) etterfulgt av I<125->merket protein A. Posisjon og størrelse (kDa) av molekylvektmarkører er indikert. Fig. 4 illustrerer rensingen av rekombinant Sj26. Et ekstrakt av celler som uttrykker rSj26 ble ført inn på en glutationagarosekolonne og spesifikt bundet material ble eluert med fritt redusert glutation. Påfølgende fraksjoner av eluat eller total ekstrakt av celler ble separert på 13 % SDS-polyakrylamidgel og proteiner ble påvist ved farging med Coomassie-blått. Posisjon og størrelse (kDa) av molekylvekt-markører er indikert. Fig. 5 viser (a) struktur av pSj 10DBam7Stop7 (ikke i måle-stokk) ; (b) viser nukleotidsekvens av de siste to kodoner av Sj26, de multiple kloningsseter innført i Sj26 endekodonet, TGA-termineringskodonene i alle tre rammer (understreket) etterfulgt av sekvensen av ptacl2 som begynner ved PvuII-setet (bare de første tre nukleotider er vist, tilsvarende nukleotidene 2067 til 2069 av pBR322). Fig. 6 viser fremstilling og rensing av Sj26-fusjonsproteiner. Ekstrakter av celler transformert med ptacl2 (parental plasmid), pSjlODBaml eller pSjlODBaml inneholdende EcoRI fragmenter avledet fra P.falciparum antigener ble separert på 13 % SDS-polyakrylamidgeler som enten en total ekstrakt (T), eller etter rensing på glutationagarosekuler (P). Proteiner ble påvist ved farging med Coomassie-blått. Størrelsen (kDa) og posisjon av molekylvektmarkører er indikert. Fig. 7 viser strukturen av pGEX-vektorene; (a) skjematisk representasjon av pGEX-1. Posisjonen av unike Ps ti og EcoRV restriksjonsseter er indikert,

(b) nukleotidsekvens og kodingskapasitet av pGEX-1, pGEX-2T og pGEX-3X ved COOH-enden av Sj26 DNA. Det normale translasjonstermineringskodon av Sj26 cDNA begynte ved nukleotid 7 og er blitt ødelagt ved

innføring av oligonukleotider som koder for kutteseter for BamHI, Smal og EcoRI (understreket ved hakeparenteser) og TGA stopp-kodoner i alle tre rammer (understreket). Vektorene pGEX-2T og pGEX-3X inneholder ytterligere sekvenser som koder for protease-kutteseter som gjenkjennes av henholdsvis trombin og blodkoagulasjonsfaktor Xa.

Fig. 8 viser ekspresjon og rensing av glutation-S-transferase i celler transformert med pGEX-1.

(a) Tidsforløp av ekspresjon etter induksjon. En cellekultur dyrket over natten transformert med pGEX-1 ble fortynnet 1:10 i friskt medium, dyrket i 90

minutter og IPTG ble tilsatt til 1 mM. Prøver ble tatt ved de angitte tidspunkter og separert ved elektroforese gjennom en 13 % NaDodS04-pblyakryl-amidgel etterfulgt av farging med Coomassie-blått. Posisjon og størrelser (kDa) av molekylvektmarkører

(M) er indikert.

(b) Rensing av glutation-S-transferase. Celler transformert med pGEX-1 ble dyrket som i det foregående med unntagelse av at IPTG ble tilsatt til 0,1 mM og kulturen ble høstet 3 timer etter induksjon. Glutation-S-transferase ble renset som beskrevet og prøver tatt av (T) hele celler, (P) uoppløselig pellet og (S) supernatant etter sentrifugering, (U) ubundet material etter inkubasjon av supernatant med glutationagarosekuler og (E) renset material eluert fra kuler. Prøver var ekvivalent med 200 Jll kultur og ble analysert som beskrevet i det foregående.

Fig. 9 viser rensing av P.falciparum antigener uttrykt som glutation-S-transferase fusjonsproteiner. Prøver ble analysert ved elektroforese gjennom en 10 % NaDodS04-polyakrylamidgel etterfulgt av farging med Coomassie-blått. (T) totalt celleekstrakt, (P) material renset på glutationagarose. Celler ble transformert med

pGEX-1, Ag63 (EcoRV-EcoRI) i pGEX-3X (63), Ag361 i pSjlO (361), Agl6 i pSjlO (16) og EcoRI fragment av

RESA i pGEX-3X ^R). Posisjon og størrelse (kDa) av molekylvektmarkører (M) er indikert.

Fig. 10 viser proteasekutting av rensede fusjonsproteiner.

(a) Trombinkutting. Renset fusjonsprotein fra celler transformert med pGEX-1 eller med pGEX-2T inneholdende 580 bp Rsal-EcoRI fragment av Ag63 ble inkubert med protease i det antall minutter som er indikert. Felter T, U og G, kuttingsreaksjoner etter fjernelse av glutation ved fortynning med 40 volum-deler MTPBS etterfulgt av konsentrering under anvendelse av en "Centricon-10" konsentrator (Amicon Corp.). (T) total reaksjon etter konsentrering, (U) reaksjon etter inkubasjon med glutationagarosekuler,

(G) material bundet til glutationagarosekuler. Prøver ble analysert ved hjelp av elektroforese

gjennom en 13 % NaDodSC^-polyakrylamidgel etterfulgt av farging med Coomassie-blått. Størrelsen (kDa) og

posisjon av molekylvektmarkører (M) er indikert.

(b) Blodkoagulasjonsfaktor Xa kutting. Renset fusjonsprotein fra celler transformert med pGEX-1 eller pGEX-3X inneholdende et 555 bp EcoRV-EcoRI fragment av Ag63 ble inkubert i forskjellige perioder med blodkoagulasjonsfaktor Xa eller absorbert med glutationagarose etter kutting og analysert som beskrevet i (a).

EKSEMPEL 1

MATERIALER OG METODER

Konstruksjon av bakterieplasmider

Et 780bp EcoRI fragment av pSjl som inneholder et cDNA av Mr 26.000 Schistosoma japonicum glutation-s-transferasen (Sj26)

(Smith og medarbeidere, 1986) ble kuttet under delbetingelser med kutteenzymet Sau96i, ligert med to annealet oligonukleotider og innskutt i EcoRI setet av ptacll (Amman og medarbeidere, 1983) (fig. 1). Etter transformasjon av E.coli JM 101 ble en koloni identifisert inneholdende et plasmid (pSj5) hvori tac promoteren etterfølges direkte av et EcoRI gjenkjennelsessete, sekvensen ATGTCC (koder for Met.Ser) og

deretter Sj26 cDNA av pSjl fra nukleotid 12 inntil det 3'-terminale EcoRI setet. Plasmidet pSj4 ble konstruert på en lignende måte med unntagelse av at forskjellige oligonukleotider ble anvendt som innførte sekvensen GATCCCACC 5' til Met-kodonet, Sj26 cDNA ble isolert fra pSjl som et Hinfl-GamHI fragment og det rekonstruerte Sj26 cDNA ble innskutt i BamHI-setet av pGS62 (Langford og medarbeidere, 1986) . Et BamHI-fragment av pSj4 som inneholder det totale Sj26 cDNA ble kuttet med restriksjonsenzymet Mnll, ligert med BamHI-linkere og klonet inn i BamHI-setet av pLK8 (C.Langford, upublisert arbeide) og frembragte et plasmid (pSj7) som inneholdt et BamHI-fragment med den fullstendige kodesekvens av Sj26 opp til AAA.TAA. terminseringskodonet som var blitt ødelagt ved innføring av et BamHI-gjenkjennelsessete, og frembragte sekvensen AAA.TCG.GAT.CC. Sj26 BamHI-fragmentet ble isolert fra PSj7 og innskutt i BamHI-setet av pIC19H (Marsh og medarbeidere, 1984) og frembragte et plasmid (pSj8) hvori 5'-enden av Sj26 ligger inntil Pstl, gjenkjennelsessetet. DNA fra dette plasmid ble kuttet med restriksjonsenzymet Pstl, inkubert med 1 enhet av eksonuklease Bal31 (Bethesda Research Laboratories) i 2 minutter, spaltet med EcoRV og innskutt i PvuII-setet av ptacl2-Eco (utviklet fra ptacl2 (Amman og medarbeidere, 1983) ved fjernelse av det unike EcoRI-setet ved behandling av det EcoRI behandlede DNA med Klenow-fragmentet av E.coli DNA-polymerase og religering). Transformanter ble underkastet screening for ekspresjon av Sj26 ved hjelp av koloniimmunoassay som beskrevet (Crewther og medarbeidere, 1986) under anvendelse av kaninantisera utviklet mot hele voksne ormer av S.japonicum (Saint og medarbeidere, 1986). En sterkt immunoreaktiv klon (pSjlO) ble identifisert, men inneholdt to BamHI-gjenkjennelsesseter. BamHI-setet ved 5'-enden av Sj26 cDNA ble ødelagt ved innfylling av delvis BamHl-kuttet pSjlO DNA og religering. DNA ble transformert inn i JM 101 (under utvikling av plasmidet pSjlODBaml) eller inn i den metylasemanglende E.coli stamme GM48 (Yanish-Perron og medarbeidere, 1985). Plasmid DNA (pSjlODBam7)fra en GM48 transformant ble kuttet under delbetingelser med Clal og ligert med et par annealet oligonukleotider som koder for TGA-termineringskodoner i alle tre leserammer med generering av plasmidet pSjlODBam7Stop7 (fig. 5). Manipulasjoner av DNA ble gjennomført som beskrevet (Maniatis og medarbeidere, 1982). Restriksjonsenzymer ble oppnådd fra New England Biolabs.

Rensing av Sj26- fusionsprotein

En kultur av bakterier som var dyrket over natten ble fortynnet 1:10 i friskt medium (800ml), dyrket ved 37°C i 1 time, indusert med 0,1 mM IPTG og dyrket i ytterligere 3-5 timer. Celler ble samlet ved sentrifugering, lysert ved lydbehandling i PBS og sentrifugert ved 13.000 g i 10 min. ved 4°C. Supernatanten ble påført på en kolonne av glutationagarose (svovelbinding) (Sigma), kolonnen ble vasket med PBS og fusjonsproteinet eluert med 50 mM Tris-HCl pH 9,6 inneholdende 5 mM redusert glutation (Sigma) (Simons & Vånder Jagt, 1977; Harvey & Beutler, 1982). Rensing i liten skala (1,5 ml av kulturen) foregikk ved inkubasjon av supernatanten av lyserte celler med 50 jxl svellede glutationagarosekuler i 30 min. og koking av de vaskede kuler i proteingel-prøvebuffer. Fremstillingen av S.japonicum ormeekstrakt og SDS-polyakrylamidelektroforese og immunoblotting var som beskrevet (Saint og medarbeidere, 1986) .

Primerforlengelses- sekvensering av RNA

Voksne ormer av S.japonicum (Sorsogonstammen) ble oppnådd ved portal perfusjon av infiserte kaniner og RNA ble renset som beskrevet (Saint og medarbeidere, 1986) . Et oligonukleotid komplementært til nukleotidene 53 til 37 av pSJl Sj26 cDNA ble forlenget på et enkelttrådet DNA-templat isolert fra M13 fagen inneholdende en komplett kopi av pSjl Sj26 cDNA. Reaksjonene foregikk ved 20°C i 30 min. og omfattet basepartilpasset

32 32

templat og primer, 10 |iCi hver av pdATP og pdCTP, 0,05 mM dTTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,5, 5 mM MgCl2 og 2 enheter av Klenowfragmentet av E.coli DNA polymerase I. Den forlengede primer (34 nukleotider) ble skåret ut fra en 10 % poly-akrylamid, 7,6 M ureagel og gjenvunnet ved hjelp av etanol-utfelling etter bløtlegging i 0,5 M ammoniumacetat, 5 mM EDTA, 0,1 % SDS i 16 timer ved 4°C. Omtrent 0,5 \ ig av totalt

S.japonicum RNA ble oppvarmet ved 100°C i 1 min. med 100.000 cpm <32>P-merket primer i nærvær av 50 mM Tris-HCl pH 8,3,

0,1 mM EDTA, 10 mM DTT, 7,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl og deretter inkubert ved 60°C i 20 min. Blandingen ble så delt opp i fire deler og inkubert ved 42°C i 15 min. i reaksjonsløsninger inneholdende 5 enheter av RNAsin (BRL), 0,5 enheter av avian myoblastosevirus revers transkriptase (Life Sciences Inc.), 0,1 mM av hver av deoksynukleotid og enten 0,075 mM ddATP, 0,06 mM ddCTP, 0,03 mM ddGTP eller 0,15 mM ddTTP. Reaksjons-produkter ble separert på en 8 % polyakrylamidureagel og detektert ved hjelp av autoradiografi.

RESULTATER

Konstruksjon av pSjlODBaml

Voksne ormer av den parasittiske innvollsorm Schistosoma japonicum inneholder et Mr 26.000 antigen (Sj26) som er en funksjonell glutation-S-transferase (Mitchell og medarbeidere, 1984; Smith og medarbeidere, 1986). Et plasmid ble konstruert (pSj5) som forventes å kode for et molekyl identisk med nativ Sj26 (fig. 1). Den korrekte 5'-ende struktur av Sj26 (Met.Ser.Pro.Ile ) ble avledet fra den direkte sekvensana-lyse av Sj26 mRNA renset fra voksne ormer av S.japonicum (Materialer og metoder) og bekreftet ved hjelp av proteinsek-vensering av N-enden av Sj26 fra voksne parasitter (i samar-beid med M.Rubira i Joint Protein Strueture Laboratory, Ludwig Institute for Cancer Research, Walter og Eliza Hall Institute of Medical Research). Dette plasmid dirigerer syntesen i E.coli av et Mr 26.000 molekyl (rekombinant Sj26, rSj26) som ikke kan skjelnes fra nativ Sj2 6 ved mobiliteten derav i SDS polyakrylamidgeler (fig. 2) eller antigenisiteten derav (fig. 3). Videre er dette molekyl oppløselig, enzymatisk aktivt som en glutation-S-transferase og bibeholder en egenskap til mange glutation-S-transferaser (Simons & Vandler Jagt, 1977; Harvey & Beutler, 1982) med binding til en kolonne av immobilisert glutation (fig. 4).

Et plasmid, pSjlO DBaml, ble konstruert inneholdende den komplette kodings sekvens av Sj26 under transskripsjonen styring av tac-promoteren (Amann og medarbeidere, 1983) og etterfulgt av flere unike restriksjonsendonuklease-gjenkjennelsesseter (materialer og metoder). Induksjon av celler transformert med dette plasmid resulterte i syntese av et rikelig Mr 28.000 molekyl (fig. 6). Den større størrelsen av dette protein skyldes nedbrytningen av det normale Sj26 termineringskodon i pSjlODBaml pga innføringen av en BamHI-linker som resulterer i translasjon av 14 ytterligere aminosyrer før et "i-rammen" termineringskodon påtreffes. Til tross for disse ytterligere aminosyrer er den endrede glutation-S-transferase oppløselig og binder til glutation (fig. 6) noe som antyder at mindre tillegg til COOH-enden av Sj26 ikke nødvendigvis ødelegger binding.

Ekspresjon av Sj26 fusjonspolypeptider

For å teste virkningen av større tilføyelser til COOH-enden av Sj26 ble cDNAer tilsvarende en varietet av forskjellige antigener av Plasmodium falciparum innskutt i det unike EcoRI-setet av pSjlODBaml. Disse cDNAer vår alle valgt pga at det var kjent at de var i den riktige leseramme for ekspresjon som Sj26-fusjonsproteiner. cDNAene tilsvarte antigener 16 (Coppel og medarbeidere 1983), 44 (Anders og medarbeidere 1984), 361 (G.Peterson, manuskript under arbeid) og 32 (Cowman og medarbeidere 1984). I hvert tilfelle kunne transformanter identifiseres som uttrykte et nytt fusjonsprotein med Mr >28.000 som lett kunne identifiseres ved Coomassie-farging etter elektroforese gjennom en SDS-polyakrylamidgel (fig. 6). Videre, i hvert tilfelle var Sj26 fusjonsproteinet syntetisert av disse kloner oppløselig og kunne renses fra bakteriesoni-kater ved inkubasjon med kuler av glutationagarose (Fig. 6). Når renseprosedyren ble oppskalert til 1 liter cellesuspensjon ble det oppnådd omtrent 5 mg protein fritt for forurensning som bedømt ved Coomassie-farging av polyakrylamidgeler. Kromatografi av lysater av utransformerte celler på en glutationkolonne resulterte ikke i rensing av noe protein. Sj26-fusjonsproteinene bibeholdt sin antigenisitet ettersom de ble gjenkjent på Western blots av spesifikke antisera (data ikke vist).

EKSEMPEL 2

MATERIALER OG METODER

Konstruksjon av pGEX- vektorer.

Multiple kloningsseter ble skapt i pSjl Sj26 cDNA (Smith og medarbeidere 1986, 1987a) ved innføring av en BamHI-linker ved det unike Mnll kuttesete slik at TAA translasjons-termina-sjonskodonet av Sj26 ble erstattet med sekvensen TCGGATCC. 5'-enden av pSjl cDNA ble også endret ved erstatning av 5'-ende-EcoRI-Sau96i fragmentet med oligonukleotider inneholdende et BamHI kuttesete etterfulgt av sekvensen CACCATGTCC og deretter nukleotidene 12-38 av pSjl cDNA, slik at det ble frembragt et BamHI-fragment som kodet for nativt Sj26 (Smith og medarbeidere 1987b). Dette BamHI-fragment ble innskutt i BamHI-setet av pIC19H (Marsh og medarbeidere 1984) slik at cDNA-3'-enden ble etterfulgt av unike Smal, EcoRI, Clal og EcoRV kutteseter. Et buttendet Bam-EcoRV-fragment inneholdende det rekonstruerte Sj26 cDNA ble innskutt i PvuII-setet av ptacl2AEco (ptacl2 (Amann og medarbeidere 1983) modifisert ved innfylling i det unike EcoRI-setet og religering) i den riktige orientering for transkripsjon fra tac-promoteren. Dette plasmid (pSjlO) ble ytterligere modifisert ved innføring av et oligonukleotid (TGACTGACTGA) som koder for stoppkodoner i alle tre rammer i buttende Clal-setet ved cDNA 3'-enden, mens BamHI-kuttestedet ved cDNA 5'-enden ble deletert ved innfylling under anvendelse av Klenow fragmentet av E.coli DNA polymerase I.

Celler transformert med dette plasmid (pSj10ABam7Stop7) og indusert med IPTG syntetiserte et Mr 27.500 polypeptid, men ved mindre enn 20 % av nivået i celler transformert med PSj5, et plasmid avledet fra ptacll som koder for nativt Sj26 (Smith og medarbeidere, 1987b). Denne forskjell i ekspresjon kan skyldes det økede GC-innhold og lengden av området mellom tac ribosom-bindingssetet og ATG-translasjons-initieringskodonet i pSj10ABam7Stop7 (Stormo og medarbeidere, 1982; De Boer og medarbeidere, 1983b) og således ble 3'-enden av det modifiserte Sj26 cDNA i pSJ10ABam7Stop7 inneholdende de multiple kloningsseter og termineringskodoner innført i pSj5 som følger: Et Hindlll-Ndel fragment av pSj5 som koder for tetracyklin-resistensgenet ble erstattet med et 1,7 kb EcoRI-fragment avledet fra pMC9 (Miller og medarbeidere, 1984) inneholdende lacl<q> allelet og en del av lacZ. Buttendeligering av rensede fragmenter etter behandling med Klenow-fragmentet av E.coli DNA polymerase I frembragte et plasmid (p4,5) hvori lacl<q>, amp<r> og tac-Sj26 alle transkriberes i den samme retning. EcoRI kuttesetet ved 3'-enden av Sj26 cDNA i p4,5 ble fjernet ved innfylling og religering mens EcoRI-setet ved cDNA 5'-enden ble ødelagt ved mutagenese som beskrevet av Mandecki

(1986) under anvendelse av et 30-mer oligonukleotid for å utvikle sekvensen tac-GTATTC-Sj26 cDNA. Et Bell-fragment av dette plasmid inneholdende 3'-enden av lacl<q>, tac-promoteren og 5'-enden av Sj26 cDNA ble innskutt i det unike Bcll-setet av et plasmid dannet ved å forene et BclI-EcoRI fragment av p4,5 inneholdende amp<r>, ori og 5'-delen av lacl<q> og et Bacll-Accl-fragment av pSj10DBam7Stop7 inneholdende 3'-enden av Sj26 cDNA etterfulgt av multiple kloningsseter, endekodoner og nukleotider 2067-2246 av pBR322. Kutting med Bell foregikk på plasmid DNA dyrket i metylasedefisiente GM48 celler (Marinus, 1983) og EcoRI og Accl-endene ble buttendebehandlet ved behandling ved Klenow fragmentet av E.coli DNA polymerase I. En transformant ble identifisert inneholdende et plasmid (pGEX-1) med strukturen vist i fig. 7. Oligonukleotider som koder for kutte-gjenkjennelsesseter av trombin eller blod-koagulasjons f aktor Xa ble innskutt i BamHI-setet av pGEX-1 og utviklet plasmider (pGEX-2T og pGEX-3X) hvori det unike BamHI-setet rammeskiftes med ett eller to nukleotider (fig. 7b). Nukleotidsekvenser ble bekreftet ved dideoksynukleotid-sekvensering av plasmid DNA (Chen & Seeburg, 1985) og med unntagelse av hvor det er indikert, ble plasmider transformert inn i E.coli stammen JM109 (Yanisch-Perron og medarbeidere, 1985). Restriksjonsenzymer og DNA-modifiserende enzymer ble anskaffet fra New England Biolabs og anvendt i henhold til produsentens instruksj oner.

P.falciparum cDNAer innskutt i pGEX vektorer var et 555 bp EcoRV-EcoRI-fragment og et 580 bp Rsal-EcoRI-fragment av Ag63 (Bianco og medarbeidere, 1986) i Smal-EcoRI-kuttet pGEX-3X og pGEX-2T, 7 63 pb og 1010 bp EcoRI-fragmenter av Agl6 (Coppel og medarbeidere, 1983), og Ag361 (G.Peterson, personlig kommu-nikasjon) i EcoRI-kuttet pSjlO og et 1317 bp EcoRI-fragment av RESA (Favaloro og medarbeidere, 1986) i EcoRI-kuttet pGEX-3X.

Affinitetsrensing av fusjonsproteiner

Kulturer dyrket over natten av E.coli transformert med parentale eller rekombinante pGEX-plasmider ble fortynnet 1:10 i 800 ml friskt medium og dyrket i 1 time ved 37°C før tilsetning av IPTG til 0,1 mM. Etter ytterligere 3-7 timers dyrking ble celler pelletisert og resuspendert i 1/50 - 1/100 kulturvolum av musetonisitets-bufret saltløsning (MTPBS)

(150 mM NaCl, 16 mM Na2HP04, 4 mM NaH2P04 (pH 7,3)). Celler ble lysert på is ved mild lydbehandling og etter tilsetning av "Triton X-100" (BDH Chemicals) til 1 %, ble de underkastet sentrifugering ved 10.000 g i 5 min. ved 4°C. Supernatanten ble blandet ved romtemperatur i et 50 ml polypropylenrør på en roterende plattform med 1-2 ml 50 % glutationagarosekuler (svovelbinding. Sigma). Før bruk ble kulene forhåndssvellet i MTPBS, vasket to ganger i den samme buffer og lagret i MTPBS ved 4°C som en 50 % oppløsning (volum/volum). Etter absorpsjon ble kuler samlet ved sentrifugering ved 500 g i 10 sek. og vasket tre ganger med 50 ml MTPBS. Fusjonsprotein ble eluert ved konkurranse med fritt glutation under anvendelse av 2x1 kulevolum av 50 mM Tris-HCl (pH 8,9) inneholdende 5 mM redusert glutation (Sigma) (slutt pH 7,5, nylaget). Absorpsjon av fusjonsprotein til glutationagarosekulene og etterfølgende eluering er begge fullstendig i løpet av to min. Binding av fusjonsproteiner til glutationagarose kan foregå i andre nøytrale buffere som 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) eller MTPBS uten "Triton X-100", selv om inklusjon av detergent reduserer forurensning med E.coli proteiner. Forurensning kan også

reduseres ved å nedsette perioden hvorunder cellene under-kastes lydbehandling til et minimum. Utbyttet av ustabile fusjonsproteiner kan økes ved å utsette tilsetningen av IPTG inntil mindre enn 1 time før cellehøsting. Utbytter av fusjonsprotein ble beregnet fra absorpsjon ved 280 nm under . anvendelse av forholdet 1 OD2g0 = 0,5 mg/ml avledet fra proteinkonsentrasjonsestimeringer (Hartree, 1972) av protein renset fra celler transformert med pGEX-1 og under anvendelse av bovint serumalbumin som en standard.

Massescreening av transformanter for ekspresjon av fusjonsprotein gjennomføres passende på 1,5 ml kultur resuspendert i 300 jil MTPBS. Etter lydbehandling og sentrifugering blandes supernatanten med 50 |Xl 50 % glutationagarosekuler, vasket med 3 x 1 ml MTPBS og kulene ble kokt i 100 \ il prøvébuffer for analyse på en 10 % NaDodS04-polyakrylamidgel (Laemmli & Favre, 1973) etterfulgt av farging med 0,05 % Coomassie-blått.

Setespesifikk proteolyse av fusjonsproteiner.

Kutting av rensede fusjonsproteiner med trombin foregikk ved 25°C i elueringsbuffer inneholdende 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 og 100 ng human trombin (Sigma) (Eaton og medarbeidere, 1986) og 50 (lg fusjonsprotein. Kutting med koagulasjonsfaktor Xa fra humant blod foregikk ved 25°C i elueringsbuf f er inneholdende 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 500 ng human faktor Xa og 50 (lg renset fusjonsprotein (Nagai & Thogersen, 1984) . Aktivering av faktor X (Sigma) til faktor Xa foregikk ved behandling med Russells slangegift-aktiverende enzym (Sigma) ved 37°C i 5 min. i en reaksjonsblanding inneholdende 7 (lg faktor X, 75 ng aktiverende enzym, 8 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM NaCl og 8 mM CaCl2 (Fusjikawa og medarbeidere, 1972) .

RESULTATER

Konstruksjon og struktur av pGEX vektorer.

Plasmidet pSj5 dirigerer syntesen av Sj26 i E.coli under styring av den sterke isopropyl-P-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) induserbare tac promoter (Smith og medarbeidere 1987b). Ved en serie av manipulasjoner ble pSj5 modifisert slik at fremmede polypeptider kunne uttrykkes som fusjoner med COOH-enden av Sj26. Det resulterende plasmid (pGEX-1) (fig. 7) inneholder (a) tac-promoteren (Amann og medarbeidere, 1983; De Boer og medarbeidere, 1983a) etterfulgt av den fullstendige kodings-sekvens for Sj26 (Smith og medarbeidere, 1986, 1987a) hvori det normale termineringsskodon er erstattet med en polylinker inneholdende unike gjenkjennelsesseter for restriksjons-endo-nukleasene BamHI, Smal og EcoRI og etterfulgt av TGA trans-lasjonstermineringskodoner i alle tre leserammer (fig. 7b),

(b) p-laktamasegenet som meddeler ampicillinresistens,

(c) et replikasjonsorigo,

(d) et fragment av lac operonet inneholdende det over-uttrykte lacl<q->allel av lac-repressoren og del av lacZ. To derivater av pGEX-1 ble konstruert (pGEX-2T og pGEX-3X. fig. 7b) hvori leserammen ved det multiple kloningssete forandres med enten ett eller to nukleotider ved innføringen av oligonukleotider som koder for kuttegjenkjennelsessekvensene av de setespesifikke proteaser trombin (pGEX-2T) eller blodkoagulasjonsfaktor Xa (pGEX-3X).

Induksjon av tac promotoren med IPTG i celler transformert med pGEX-1 resulterer i syntesen av et Mr 27.500 polypeptid bestående av Sj26 med ti ytterligere aminosyrerester ved dets COOH-ende (fig. 8a). Til tross for dets rikelighet danner Mr 27.500 polypeptidet ikke uoppløselige inklusjonslegemer og forblir i supernatanten av celler som er lysert ved lydbehandling og underkastet sentrifugering ved 10.000 g i 5 minutter (fig. 8b). Videre påvirker COOH-ende forlengelsen til Sj26 ikke binding til glutationagarose og affinitetskromatografi av celleekstrakter resulterer således i den effektive rensing av Mr 27.500 molekylet med utbytter på minst 15 mg/liter kultur og i fravær av detekterbar forurensning med E.coli proteiner (fig. 8b). Lignende egenskaper iakttas for de modifiserte Sj26 polypeptider som kodes for av pGEX-2T og pGEX-3X som begge inneholder 14 ytterligere rester ved COOH-enden. I fravær av induser er det plasmid-kodede lacl<q->allel effektivt i represjon av transkripsjon fra tac-promoteren

(fig. 8a) endog i E.coli stammer som f.eks. C600 eller GM48 (Marinus, 1973) som bærer et villtype lacl-allel (upubliserte data).

Ekspresjon og rensing av Plasmodium faliciparum antigener. For å teste generaliteten av pGEX-vektorene som et system for ekspresjon og rensing av fremmede polypeptider, ble cDNA tilsvarende flere forskjellige antigener av Plasmodium falciparum, som er det middel som frembringer falciparum malaria, innskutt i det multiple kloningssete av den angjeldende pGEX-vektor. De cDNAer som ble valgt koder for deler av to forskjellige antigener (Ag63, Ag3 61) som begge er beslektet med varmesjokkprotein 70 (Bianco og medarbeidere, 1986; Peterson og medarbeidere, 1987) og to antigener inneholdende tandemaktig gjentatte peptider (Agl6, Ecorl-RESA)(Coppel og medarbeidere, 1983; Favaloro og medarbeidere, 1986). I hvert tilfelle ble syntese av et rikelig glutation-S-transferase-fusjonsprotein iakttatt og disse fusjonsproteiner kunne renses ved affinitetskromatografi av celleekstrakter på immobilisert glutation med utbytter på mellom 1,6 og 5 mg/liter kultur (fig. 9). Andre polypeptider som er uttrykt og renset med hell under anvendelse av pGEX-vektorer inkluderer 8 andre P.falciparum antigener, ti forskjellige antigener av parasittiske innvollsormer Taenia ovis og T.taeniaformis, og muse-interleukin-4 og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (upubliserte data).

Proteasekutting av rensede fusjonsproteiner.

Anvendbarheten av pGEX-vektorene for fremstilling av fremmede polypeptider i E.coli kan økes hvis, etter rensing, glutation-S-transf erasebæreren kan fjernes fra fusjonsproteinene ved kutting med setespesifikke proteaser. Denne metode har vist seg heldig for fusjonsproteiner inneholdende blodkoagulasjonsfaktor Xa (Nagai & Thogersen, 1984) eller kollagenase gjenkjenningssetet (Germino & Bastia, 1984), men har enkelte ganger vært ineffektiv (Allen og medarbeidere 1985). Oligonukleotider som koder for kutte-gjenkjennelsessetet av trombin (Chang, 1985) eller blodkoagulasjonsfaktor Xa (Nagai & Thogersen, 1984) ble innført umiddelbart nær 5' til det multiple kloningssete av pGEX-1 og utviklet plasmidene pGEX-2T, henholdsvis pGEX-3X (fig. 7b). Innskudd av et 580 basepar (bp) Rsal-EcoRI-fragment av AG63 cDNA (Bianco og medarbeidere, 1986) i Smal-EcoRI-setene av pGEX-2T resulterte i ekspresjon av et Mr 43.000 fusjonsprotein som kunne renses på glutationagarose (fig. 10a). Inkubasjon av dette protein med trombin førte til fremstilling av to fragmenter, hvorav det ene er glutation-S-transferasebæreren og det annet er en Mr 22.500 del av Ag63 (fig. 10a). Effektiv kutting skjedde i løpet av 30 min. og med et forhold enzym til substrat på 1:500. En liten andel av fusjonsproteinet var motstandsdyktig mot kutting selv etter inkubasjon i 2 timer med en ti ganger høyere konsentrasjon av enzym. Tilsvarende resulterte ekspresjon av et 555 bp EcoRV-EcoRI-fragment av Ag63 under anvendelse av pGEX-3X vektoren i syntese av et Mr 43.000 fusjonsprotein som ble kuttet i to fragmenter ved hjelp av blodkoagulasjonsfaktor Xa (fig. 10b). Kutting med faktor Xa foregikk mere langsomt og mindre effektivt enn med trombin, muligens pga ineffektiv aktivering av faktor X. Tre andre pGEX-2T-fusjoner og en ytterligere pGEX-3X-fusjon er blitt testet mht tendensen til kutting ved hjelp av den angjeldende protease og i hvert tilfelle ble effektiv kutting iakttatt (upubliserte data). Ingen av proteasene kutter glutation-S-transf erasebæreren og, etter proteolysen, kan således både bærer og ethvert ukuttet fusjonsprotein fjernes fra kutte-reaksjonen ved absorpsjon på glutationagarose etterlatende bare det rensede polypeptidprodukt (fig. 10).

HENVISNINGER

1. Abrahamsen, L., Moks, T., Nilsson, B. og Uhlen, M. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 7487-7500. 2. Allen, G., Paynter, CA. og Winther, M.D. (1985) J. Cell. Sei. SuppI. 3, 29-38. 3. Amann, E., Brosius, J. og Ptashne, M. (1983) Gene 25, 167-178. 4. Anders, R.F., Coppél, R.L., Brown, G.V., Saint, R.B., Cowman, A.F., Lingelbach, K.R., Mitchell, G. F. og Kemp, D.J. (1984) Mol. Biol. Med. 2 : 177-191. 5. Balloul, J.M., Sondermeyer, P., Dreyer, D., Capron, M., Grzych, J.M., Pierce, R.J., Carvallo, D., Lecoq, J.P. og Capron, A. (1987), Nature 326, 149-153. 6. Bianco, A.E., Favaloro, J.M., Burkot, T.R., Culvenor, J.G., Crewther, P.E., Brown, G.V., Anders, R.F., Coppel, R.L., og Kemp, D.J.

(1986), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 8713-8717. 7. Chang, J-Y. (1985), Eur. J. Biochem. 151, 217-224. 8. Chen, E.Y. og- Seeburg, P.H. (1985) DNA 4, 165-170. 9. Cheng, Y-S.E., Kwoh, D.Y., Kwoh, T.J., Soltvedt, B.C. og Zipser, D. (1981), Gene 14, 121-130. 10. Coppel, R.L., Cowman, A.F., Lingelbach, K.R., Brown, G.V., Saint, R.B., Kemp, D.J. og Anders, R.F. (1983), Nature 306. 751-756. 11. Cowman, A.F., Coppel, R.L., Saint, R.B., Favaloro, J.M., Crewther, P.E., Stahl, H.D., Bianco, A.E., Brown, G.V., Anderes, R.F. og Kemp, D.J., (1984) Mol. Biol. Med. 2 : 207-221. 12. Crewther, P.E., Bianco, A.E., Brown, G.V., Coppel, R.L., Stahl, H.-D., Kemp, D.J. og Anders, R.F. (1986) Methods 86 : 257-264. 13. Davern, K.M., Tiu, W.U., Morahan, G., Wright, M.D., Garcia, E.G. 0g Mitchell, G.F. (1987), Immunol. Cell. Bioil. (in press). 14. De Boer, H.A., Comstock, L.J. og Vasser, M. (1983a), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 21-25. 15. De Boer, H.A., Comstock, L.J. og Vasser, M. (1983b) DNA 2, 231-235. 16. Eaton, D., Rodriguez, H. 0g Vehar, G.A. (1986), Biochemistry 25., 505-512. 17. Favaloro, J.M., Coppel, R.L., Corcoran, L.M., Foote, S.J., Brown, G.V., Anders, R.F. og Kemp, D.J. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 8265-8277. 18. Fujikawa, K., Legaz, M.E. 0g Davie, E.W. (1972), Biochemistr<y> 11, 4892-4899. 19. Germino, J. og Bastia, D. (1984), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81. 4692-4696. 20. Germino, J., Gray, J.G., Charbonneau, H., Vanaman, T. og Bastia, D. (1983), Proe. Nati. Sei. USA 80, 6848-6852. 21. Gray, M.R., Colot, H.V., Guarente, L. og Rosbash, M. (1982), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 6598-6602. 22. Haffey, M.L., Lehman, D. og Boger, J. (1987), DNA 6, 565. 23. Harris, T.J.R. (1983). In Williamson R. (utgiver) Genetic Engineering, Academic Press, London, Vol.4 128-175. 24. Hartree, E.F. (1972) Anal. Biochem. 48/ 422-427. 25. Harvey, J.W. og Beutler, E. (1982). Blood 60 : 1227-1230. 26. Itakura, K., Hirose, T., Crea, R., Riggs, A.D., Heyneker, H.L., Bolivar, F. og Boyer, H.W.

(1977), Science 198, 1056-1063. 27. Kato, C., Kobayashi, T., Kudo, T., Furusato, T., Murakami, Y., Tanaka, T., Baba, H., Oishi, T., Ohtsuka, E., Ikehara, M., Yanagida, T., Kato, H., Moriyama, S. og Horikoshi, K. (1987), Gene 54, 197-202. 28. Koenen, M., Ruther, U. og Muller-Hill, B.

(1982), EMBO. J. 1, 509-512. 29. Kleid, D.G., Yansura, D., Small, B., Dowbenko, D., Moore, D.M., Grubman, M.J., McKercher, P.D., Morgan, D.O., Robertson, B.H. og Bachrach, H.C.

(1981), Science 214. 1125-1129. 20. Laemmli, U.K. og Favre, M. (1973), J. Mol. Biol. 80/ 575-599. 31. Langford, C.J., Edwards, S.J., Smith, G.L.> Mitchell, G.F., Moss, B., Kemp, D.J. 0g Anders, R.F. (1986) Mol. Cell. Biol. 6 : 3191-3199. 32. Lowenadler, B., Nilsson, B., Abrahmsen, L., Moks, T., Ljungqvist, L., Holmgren, E., Paleus, S., Josephson, S., Philipson, L. og Uhlen, M.

(1986), EMBO J. 5, 2393-2398. 33. Mclntyre, P., Coppel, R.L., Smith, D.B., Stahl, H.D., Corcoran, L.M., Langford, C.J., Favaloro, J.M., Crewther, P.E., Brown, G.V., Mitchell, G.F., Anderson, R.F. og Kemp, D.J. (1987) Int. J. Parasitol. 17, 59-67. 34. Mandecki, W. (1986), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83. 7177-7181. 35. Maniatis, T. , Fritsch, E.F. 0g Sambrook, J. "Molecular cloning : a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. 36. Mannervik, B. (1985), Adv. Enzvmol. 57, 357-417. 37. Marinus, M.G. (1973), Molec. aen. Genet. 127, 47-55. 38. Marsh, J.L., Erfle, M. og" Wykes, E.J. (1984), Gene 22, 481-485.

39. Marston, A.O. (1986), Biochem, J 240, 1-12.

40. Miller, J.H., Lebkowski, J.S., Greisen, K.S. og Calos, M.P. (1984), EMBO. J. 3, 3117-3121.

41. Mitchell, G.F., Cruise, K.M., Garcia, E.G. og

Tiu, W.U. (1984) J. Parasitol. 70 : 983-985.

42. Nagai, K. og Thogersen, H.C. (1984), Nature 309, 810-812. 43. Nilsson, B., Abrahmsen, L. og- Uhlen, M. (1985), EMBO J. 4, 1075-1080. 44. Peterson, M.G., Crewther, P.E., Thompson, J.K., Corcoran, L.M., Coppel, R.L., Brown, G.V., Anders, R.F. 0g Kemp, D.J. (1987) DNA (under trykking) 45. Ruther, U. og Muller-Hill, B. (1983), EMBO J. 2, 1791-1794.

46. Saint, R.B., Beall, J.A., Grumont, R.J.,

Mitchell, G.F. og Garcia, E.G. (1986) Mol. Biochem. Parasitol. 18 : 333-342. 47. Sassenfeld, H.M, og Brewer, S.J. (1984), Bio. Technology 2, 76-81. 48. Schoemaker, J.M., Brasnett, A.H. og_ Marston, A.O. (1985), EMBO. J. 4, 775-780. 49. Simons, P.C. og Vånder Jagt, D.L. (1977), Anal. Biochem. 82, 334-341. 50. Simons, P.C. og Vånder Jagt, D.L. (1981), Methods Enzymol. 77, 235-237. 51. Smith, D.B., Davern, K.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G. og Mitchell, G.F. (1986), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83/ 8703-8707. 52. Smith, D.B., Davern, K.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G. og Mitchell, G.F. (1987a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6541. 53. Smith, D.B., Rubira, M.R., Simpson, R.J., Davern, K.M., Tiu, W.U., Board, P.G. 0g Mitchell, G.F.

(1987b), Mol. Biochem. Parasitol. (in press).

54. Stanley, K.K. og' Luzio, J.P. (1984), EMBO. J. 3, 1429-1434. 55. Stormo, G.D., Schneider, T.D. og. Gold, L.M.

(1982), Nucl. Acids. Res. 10, 2971-2996. 56. Uhlen, M., Nilsson, B., Guss, B., Lindberg, M., Gatenbeck, S. 0g Philipson, L. (1983), Gene 23, 369-378.

57. Ullmann, A. (1984), Gene 29. 27-31.

Claims

1. Rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for ekspresjon av et fusjonsprotein hvor et fremmed protein eller peptid er fusjonert med COOH-enden av et glutation-S-transferaseenzym, eventuelt gjennom en spaltbar link.

2. Rekombinant DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at enzymet er 26kDa-glutation-S-transferase av Schistosoma japonicum.

3. Rekombinant DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at den spaltbare link er en som kan spaltes ved hjelp av en setespesifikk protease.

4. Rekombinant DNA-molekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at den spaltbare link er en som kan spaltes ved hjelp av trombin, blodkoagulasjonsfaktor xa eller rennin.

5. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har en nukleotidsekvens som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4 innskutt deri istand til å uttrykke et fusjonsprotein hvor et fremmed protein eller peptid er fusjonert med COOH-enden av et glutation-S-transferaseenzym, eventuelt gjennom en spaltbar link.

6. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har en nukleotidsekvens innskutt deri istand til å uttrykke et glutation-S-transf eraseenzym etterfulgt av minst ett restriksjonsendonukleasegjenkjennelsessete for innskyting av en nukleotidsekvens istand til å uttrykke et fremmed protein eller peptid fusjonert med COOH-enden av den nevnte glutation-S-transferase, idet vektoren eventuelt inkluderer en nukleotidsekvens istand til å uttrykke en spaltbar link mellom enzymet og det nevnte fremmede protein eller peptid, og idet vektoren også omfatter en ekspresjonskontrollsekvens operativt koblet til nukleotidsekvensen for ekspresjon av fusjonsproteinet.

7. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 6, karakterisert ved at det normale translasjons termineringskodonet til nukleotidsekvensen istand til å uttrykke et glutation-S-transferaseenzym er erstattet med én polylinker inneholdende unike gjenkjennelsesseter for restrik-sjonsendonukleasene BamHI, Smal og EcoRI og etterfulgt av TGA-translasjonstermineringskodoner i alle tre leserammer.

8. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert ved at enzymet er 2 6kDa glutation-S-transferase av Schistosoma japonicum.

9. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 6 til 8, karakterisert ved at den spaltbare link er en som kan spaltes ved hjelp av en setespesifikk protease.

10. Ekspresjonsvektor som angitt i et eller flere av kravene 5 til 9, karakterisert ved at den er et bakterieplasmid.

11. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 6, karakterisert ved at den omfatter et plasmid, valgt fra gruppen bestående av pSJlO, pSjlO-DBaml og pSjlO-DBam7Stop7, som angitt i fig. 5.

12. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 6, karakterisert ved at den omfatter et plasmid valgt fra gruppen bestående av pGEX-1, pGEX-2T og pGEX-3X som angitt i fig. 7.

13. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor som angitt i et eller flere av kravene 5 til 12 istand til å uttrykke et fusjonsprotein hvor et fremmed protein eller peptid er fusjonert med COOH-enden av et glutation-S-transferaseenzym, eventuelt gjennom en spaltbar link.

14. Vertcelle som angitt i krav 13, karakterisert ved at den er E. coli.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, karakterisert ved at en vertcelle som angitt i krav 13 eller 14 dyrkes under betingelser slik at fusjonsproteinet uttrykkes i en mengde som deretter kan utvinnes fra cellekulturen ved å lysere vertcellene og deretter isolere fusjonsproteinet fra lysatet ved å bringe dette i kontakt med immobilisert glutation, idet fusjonsproteinet deretter eventuelt spaltes for å separere det fremmede protein eller peptid fra enzymet.

16. Fusjonsprotein for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det er fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte som angitt i krav 15 og at det omfatter en første sekvens tilsvarende enzymet glutation-S-transf erase fusjonert ved sin COOH-ende med en annen sekvens tilsvarende et forskjellig protein eller peptid.

17. Fusjonsprotein for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det omfatter en første sekvens tilsvarende enzymet glutation-S-transferase fusjonert ved sin COOH-ende med en annen sekvens tilsvarende et forskjellig protein eller peptid.