JPH0681596B2

JPH0681596B2 - 新規融合蛋白質

Info

Publication number: JPH0681596B2
Application number: JP63504420A
Authority: JP
Inventors: スミス、ドナルド・ブルース
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Current assignee: CSL Innovation Pty Ltd
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1994-10-19
Anticipated expiration: 2009-10-19
Also published as: NO178894B; DK38189D0; DK169975B1; DK38189A; JPH01503441A; NO178894C; DE3873989T2; SG25093G; EP0293249B1; NZ224663A; ATE79902T1; GR3006173T3; AU607511B2; CA1338903C; DE3873989D1; EP0293249A1; AU1793288A; WO1988009372A1; NO890325D0; ES2045115T3

Description

【発明の詳細な説明】［発明の背景］この発明は、細菌、例えばエシェリヒア・コリにおける
外来蛋白質およびポリペプチドのクローニングおよび発
現に関するものである。特にこの発明は、一般的に可溶
性であり、外来蛋白質またはポリペプチドの抗原性の改
変または機能的活性の破壊を伴わずに容易に細菌リゼイ
トから精製され得る融合ポリペプチドとして細菌により
合成された外来蛋白質またはポリペプチドの発現に関す
るものである。

エシェリヒア・コリにおける外来ポリペプチドの発現を
誘導する幾つかの異なるベクターが報告されている（ハ
リス、1983;マーストン、1986;マッキンタイア等、1987
により概説されている）。製品精製を簡易化すべく設計
されたベクターもあるが、これらのシステムの大部分に
共通する問題点は、蛋白質の溶解性の維持またはアフィ
ニティー試薬からのそれらの溶離に変性試薬が必要とさ
れることである。変性は、外来ポリペプチドの抗原性を
改変し、機能的活性を全て破壊するものと予想され得
る。例えば、エシェリヒア・コリβ−ガラクトシダーゼ
とのNH₂−末端またはCOOH−末端融合体として発現され
（グレイ等、1982;ケーネン等、1982;ルターおよびムラ
ー−ヒル、1983）、1.6モルNaCl、10ミリモルβ−メル
カプトエタノールに溶け得るポリペプチドは、ｐ−アミ
ノフェニル−β−Ｄ−チオガラクトシドのカラムによる
アフィニティー・クロマトグラフィー、次いで0.1モル
ほう酸ナトリウム（pH10）、10ミリモルβ−メルカプト
エタノールにおける溶離（ゲルミノ等、1983;ウルマ
ン、1984）により粗細胞リゼイトから精製され得る。ま
たこれらの融合蛋白質は、固定された抗β−ガラクトシ
ダーゼ抗体と結合され、高または低pH溶液（プロメガ・
バイオテク）における溶離により回収され得る。別法と
して、β−ガラクトシダーゼの最後の16COOH−末端アミ
ノ酸を欠くβ−ガラクトシダーゼとの融合体は、不溶性
であることが多いため（板倉等、1977;ヤングおよびデ
ービス、1983;スタンレーおよびルツィオ、1984）、変
性試薬を用いた処理による再可溶化後に溶解した細菌の
不溶性フラクションから精製され得る（マーストン、19
86）。同じ方法を用いることにより、trpE蛋白質のtrpE
リーダー配列およびCOOH−末端３基を含む蛋白質との不
溶性COOH−末端融合体として発現されたポリペプチドを
精製することができる（クレイド等、1981）。変性条件
の使用を除くと、これらの方法は、媒体として使用され
るエシェリヒア（イー）・コリ蛋白質が、特にβ−ガラ
クトシダーゼ（Mr116000）との融合の場合において、融
合蛋白質に対する免疫応答を支配し得、望ましくない交
差反応を示す抗体を誘導し得るという不利益を伴う。

他の発現ベクターは、ヒトIgG−セファロース・カラム
によるアフィニティー・クロマトグラフィーにより細胞
リゼイトから精製され得るスタフィロコッカス・プロテ
インＡのCOOH−末端との融合体としてポリペプチドの合
成を導く（ウーレン等、1983;ニルッソン等、1985;アブ
ラームゼン等、1986;ローベンアドラー等、1986）。IgG
に対するプロテインＡの親和力が高いため、融合蛋白質
の溶離には通常変性条件が要求されるが、代替的戦略、
例えば過剰天然プロテインＡとの競合、プロテインＡに
対する親和力が低いヒツジIgGの使用（ニルッソン等、1
985）、またはプロテインＡ担体のサイズを縮小してIgG
に対するその親和力を低下させる手法（アブラームゼン
等、1986）も使用され得る。さらに深刻な問題点は、プ
ロテインＡと結合する抗体が、それらの他の特異性とは
関係無く融合蛋白質を全て認識するため、IgGとの融合
蛋白質の結合が、クローンの免疫学的スクリーニングま
たは組換え産物の分析を面倒にすることである。

エシエリヒア・コリ由来の外来ポリペプチドの精製に関
する別の戦略は、COOH−末端にポリ−アルギニンを含む
ポリペプチドの生成である（セッセンフェルド・アンド
・ブルーワー、1984）。強塩基性アルギニン残基は、ア
ニオン性樹脂に対する融合蛋白質の親和力を高めるた
め、融合体はカチオン交換クロマトグラフィーにより精
製され得、COOH−末端アルギニン残基はカルボキシペプ
チダーゼＢ処理により除去され得る。他のベクターはペ
リプラスミック空間または培養培地へのポリペプチドの
分泌を誘導し、発現レベルの低い場合も多いが、分泌さ
れたポリペプチドは、細菌性プロテアーゼによる変性か
ら保護され、大部分の他の蛋白質から分離される（マー
ストン、1986;アブラームゼン等、1986;ローベンアドラ
ー等、1986;加藤等、1987）。これらの最新方法の使用
は成功する場合もあるが、特に多くの酸性残基を含む
か、または疎水性の高いポリペプチドにおけるそれらの
普遍性は不明である。

［発明の概略］この発明の一態様によると、外来（または異種）蛋白質
またはペプチド成分が酵素グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ、好ましくは酵素のCOOH−末端と融合されて
いる融合蛋白質の発現をコードするヌクレオチド配列を
含む組換えDNA分子が提供される。

酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（E.C.2.5.
1.1.8）と融合した外来ペプチド成分を有するこの発明
の新規融合蛋白質は、既知融合蛋白質に伴う問題点の幾
つかを回避するものである。特に、この発明の融合蛋白
質は可溶性であり、非変性条件下、例えば固定グルタチ
オン・カラムによるアフィニティー・クロマトグラフィ
ーにより細菌リゼイトから精製され得る。

この明細書で詳述されているこの発明の一実施態様で
は、酵素は、寄生性ぜん虫シストソーマ・ジャポニカの
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。しかし
ながら、融合蛋白質におけるグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼは、ヒトおよび他のほ乳類グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼを含む他の種類から誘導され得
る。

この発明を実施する作業において、広範な種類の真核生
物ポリペプチドが、生理学的条件下で容易に精製され得
る可溶性および安定性グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ融合蛋白質としてエシェリヒア・コリにおいて発
現され得ることが示された。

別の態様において、この発明は、前記ヌクレオチド配列
が挿入された発現ベクター、例えば細菌性プラスミドを
提供する。また前記発現ベクターは、好ましくは融合蛋
白質の発現を目的とするヌクレオチド配列に機能し得る
ように結合された発現制御配列を含む。さらに、この発
明は、この発現ベクターを含む宿主細胞を含有する。

さらに、この発明は、融合蛋白質の製造方法であって、
前記発現ベクターを含む宿主細胞を培養して融合蛋白質
の発現を達成し、所望により前記細胞培養から融合蛋白
質を回収する工程を含む方法を含有する。

融合蛋白質は一般的に可溶性であり、細菌性リゼイトか
ら容易に回収されるため、融合蛋白質の好ましい回収方
法は、細菌細胞を溶かし、固定グルタチオンと接触させ
ることにより細菌性リゼイトから融合蛋白質を回収する
工程を含む。

この発明の融合蛋白質は、その外来蛋白質またはペプチ
ド成分がその抗原性および機能的活性を保持しているた
め、そのままで使用され得る。別法として、融合蛋白質
を開裂することにより、合成外来蛋白質またはペプチド
が生成され得る。前述の合成外来蛋白質またはペプチド
の製造が望まれる場合、好ましくは融合蛋白質における
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよび外来（ま
たは異種）蛋白質またはペプチド成分間に開裂可能な結
合が与えられる。

この発明は多様な外来蛋白質またはペプチドの発現およ
び精製に応じ得るため、この発明は別の態様において、
酵素グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、次いで外来
（または異種）蛋白質またはペプチドとして発現され得
るヌクレオチド配列の挿入に関与する少なくとも１つの
制限エンドヌクレアーゼ認識部位の発現をコードするヌ
クレオチド配列が挿入された発現ベクター、例えば細菌
性プラスミドを提供する。

［発明の詳細な記載］この発明の一実施態様では、エシエリヒア・コリにおい
て生産された外来ポリペプチドの精製を簡易化する一連
のプラスミド発現ベクター（pGEX）が構築された。エシ
エリヒア・コリにおいて酵素活性Sj26の合成を誘導する
プラスミドは既に構築されている（スミス等、1987
b）。多くのほ乳類グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ・イソ酵素は、固定グルタチオンでのアフィニティー
・クロマトグラフィー、続いて過剰還元グルタチオンと
の競合による溶離により精製され得（サイモンズ・アン
ド・バンダー・ジャグト、1977;マナービック、198
5）、この特性は天然Si26およびエシエリヒア・コリで
生産された組換えSj26（スミス等、1986、1987b）の両
方に共有される。この発明によると、ポリペプチドは、
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとして寄生性ぜ
ん虫シストソーマ・ジャポニクムによりコードされたMr
26000抗原（Sj26）とのCOOH−末端融合体として発現さ
れ、非変性条件下、固定グルタチオン・アフィニティー
・クロマトグラフィーにより精製され得る。溶解された
細菌から得られた可溶性材料を、グルタチオン−アガロ
ース・ビーズと混合し、洗浄後、例えば5mM還元グルタ
チオンを含む50mMトリス−HCl（pH8.0）により融合蛋白
質を溶離する。バッチ洗浄方法を用いると、幾つかの融
合蛋白質が２時間未満で同時に精製され得、収率は培養
１リットル当たり1.6ないし15mgの範囲である。グルタ
チオン−アガロース・ビーズは、少なくとも8mg（融合
蛋白質）/ml（膨張ビーズ）の受容力を有し、同融合蛋
白質の相異なる製剤に対して数回使用され得るか、また
は３モルNaClで洗浄することにより再使用され得る（サ
イモンズ・アンド・バンダー・ジャグト、1981）。

このシステムは、ピー・ファルシパルムの様々な抗原の
発現および精製に有効に適用されている。pGEXベクター
において発現された21種の相異なるピー・ファルシパル
ムcDNAまたはcDNAフラグメントのうち、14種が固定グル
タチオン・アフィニティー・クロマトグラフィーにより
精製され得る可溶性または部分的可溶性融合蛋白質を生
成させる。

少数の例では精製がうまくいかないこともあったが、こ
れらの失敗は全て融合蛋白質の不溶性に帰し得る。不溶
性はエシェリヒア・コリにおいて発現される融合蛋白質
に多く見出される特性であるが（ハリス、1983;マース
トン、1986）、この情況において驚くべきことには、大
多数のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質
は全体的または部分的に可溶性である。不溶性に関与す
る因子に関しては殆ど知られていないが（マーストン、
1986）、幾つかの例において、グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ融合蛋白質の不溶性は強疎水性領域の存在
と関係があり、これらの領域を除去すると、安定度およ
び／または溶解度は大きく高められる。他の不溶性融合
蛋白質は多くの荷電した残基を含むか、またはMr100000
より大きい。それにも拘わらず、グルタチオン−アガロ
ースとの結合を崩壊しない可溶化剤、例えば１％トリト
ンＸ−100、１％トウィーン20、10mMジチオトレイトー
ルまたは0.03％NaDodSO₄に不溶性融合蛋白質を可溶化さ
せると、それらはアフィニティー・クロマトグラフィー
により精製され得る。ポリペプチドが各々可溶性融合蛋
白質を形成する幾つかのフラグメントにおいて発現され
得ない場合、他の不溶性融合蛋白質は常法により（マー
ストン、1986）精製されなければならない。不溶性はエ
シエリヒア・コリにおける高い蛋白質安定性と関連して
いる場合もあるが（チェング等、1981）、関連性の無い
場合もある（シェーマーカー等、1985）。幾つかの例外
も存在するが、不溶性および可溶性グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ融合蛋白質の両方が総じて安定し、直
接比較が可能な場合、可溶性グルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ融合体として発現されたポリペプチドの安定
性は、不溶性β−ガラクトシダーゼ融合体の場合と類似
している。

良好な抗体応答は、免疫マウス、ウサギおよびヒツジに
おける融合体の外来ポリペプチド部分に対して発せられ
た。特に応答は、均等なβ−ガラクトシダーゼ融合体の
場合と同程度またはさらに良好な状態であると思われ、
恐らくグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ担体のサイ
ズが小さい（Mr116000と比べてMr26000）ことを反映し
ていると考えられる。Sj26に対する応答は相異なるマウ
ス系統において変動し（ダバーン等、1987）、同様の変
動は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体
として発現されたポリペプチドに対する応答において観
察される。

精製されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋
白質は、部位特異性プロテアーゼによる開裂における良
好な基質であると思われる。エシェリヒア・コリから精
製された融合蛋白質の開裂における部位特異性プロテア
ーゼの有効な使用（ゲルミノおよびバスチア、1984;永
井およびトガーゼン、1984）に関する報告はこれまで殆
ど為されていないが、恐らく不溶性融合蛋白質の再可溶
化に必要とされる変性試薬が蛋白質加水分解を阻むため
であると考えられる。逆に、多くのグルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ融合蛋白質は、蛋白質加水分解に最適
であることが知られている条件下では可溶性である。好
ましくは、使用されるプロテアーゼは、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ担体を開裂しないものであり、蛋
白質加水分解後、ポリペプチド生成物は、グルタチオン
−アガロースによる吸収により担体および未開裂融合蛋
白質（有れば）から分離され得る。適当な部位特異性プ
ロテアーゼには、例えばこの明細書で詳述されているト
ロンビンまたは血液凝固因子Xa、またはレニンがある
（ハフェイ等、1987）。

融合蛋白質の高レベル発現、フレーム・シフト・クロー
ニング部位、迅速な精製および有効な部位特異性蛋白質
加水分解を組み合わせると、pGEXベクターはエシェリヒ
ア・コリにおける外来ポリペプチドの発現に用いられる
強力なシステムとなる。ポリペプチドの発現および精製
の簡易化に加えて、これらのベクターは、免疫原または
化学試薬として使用されるペプチドの化学合成に対する
安価な代替手段を提供し得る。特にプラスミドコード化
lacI^q対立遺伝子によるtacプロモーターの抑制が、lacI
状態とは関係無く、高い形質転換効率を有するエシェリ
ヒア・コリ株において有効であることを要するため、こ
れらのベクターもまたcDNAライブラリーの構築に好都合
であり得る。形質転換体は常用の核酸または免疫化学技
術によりスクリーニングされ、興味の対象であるクロー
ンによりコードされた融合蛋白質はグルタチオン−アフ
ィニティー・クロマトグラフィーにより精製され得る。

以下、単なる実例として実施例および添付図面に示すこ
とにより、上記において広い範囲で概説した様々な他の
態様と共にこの発明の新規融合蛋白質を説明する。

［図面の簡単な記載］添付図面において、第１図は、プラスミドpSj5の構築の
略図を示す。

第２図は、pSj5により形質転換された細胞に存在する蛋
白質のSDS−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。細胞
の一夜培養物を新鮮な培地において1:10の割合で希釈
し、37℃で１時間インキュベーションした。次いで、IP
TGを0.1mM液に加え、示された時間数の間インキュベー
ションを37℃で続行した。分子量マーカーのサイズ（kD
a、キロダルトン）および位置を示す。クーマシー・ブ
ルー染色により蛋白質が検出された。

第３図は、組換えSj26を発現する細胞のイムノブロット
を示す。ptacll（親プラスミド）またはpSj5を含む細胞
試料を第２図の記載に従い調製し、13％SDS−ポリアク
リルアミドゲルにおいて分離し、ニトロセルロースに移
した。SjAWEは、シストソーマ・ジャポニクム成虫の抽
出物である。精製β−ガラクトシダーゼ−Sj26融合蛋白
質（スミス等、1986）に対して調製されたウサギ抗血
清、次いでI¹²⁵−標識プロテインＡによりニトロセルロ
ースをプローブした。分子量マーカーの位置およびサイ
ズ（kDa）を示す。

第４図は、組換えSj26の精製を示す。rSj26を発現する
細胞の抽出物をグルタチオン−アガロース・カラムに適
用し、特異結合材料を遊離還元グルタチオンにより溶離
させた。溶離液の連続フラクションまたは細胞の全抽出
物を13％SDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離
し、蛋白質をクーマシー・ブルー染色により検出した。
分子量マーカーの位置およびサイズ（kDa）を示す。

第５図は、（ａ）pSj10DBam7Stop7の構造（目盛ら
ず）、（ｂ）Sj26の最後の２コドン、Sj26終止コドンに
導入された多重クローニング部位、全３フレーム（下
線）におけるTGA終止コドンのヌクレオチド配列、次い
でPvuII部位で始まるptac12の配列（最初の３ヌクレオ
チドのみ図示、pBR322のヌクレオチド2067〜2069に対
応）を示す。

第６図は、Sj26−融合蛋白質の製造および精製を示す。
ptac12（親プラスミド）、pSj10DBam1またはピー・ファ
ルシパルム抗原に由来するEcoRIフラグメントを含むpSj
10DBam1により形質転換された細胞の抽出物を、全抽出
物（Ｔ）またはグルタチオン−アガロース・ビーズ精製
後（Ｐ）として13％SDS−ポリアクリルアミドゲルによ
り分離した。クーマシー・ブルー染色により蛋白質が検
出された。分子量マーカーのサイズ（kDa）および位置
を示す。

第７図は、pGEXベクターの構造の例として（ａ）pGEX−
１の概略図を示す。特有のPstIおよびEcoRV制限部位の
位置を示す。

（ｂ）Sj26 cDNAのCOOH−末端におけるpGEX−１、pGEX-
2TおよびpGEX−3Xのヌクレオチド配列およびコード受容
力。Sj26 cDNAの通常の翻訳終止コドンはヌクレオチド
７から始まり、BamHI、SmaIおよびEcoRIにおける開裂部
位をコードするオリゴヌクレオチド（括弧で区切った下
線部）および３フレーム全てにおけるTGA停止コドン
（下線部）の導入により破壊された。ベクターpGEX-2T
およびpGEX-3Xは、トロンビンおよび血液凝固因子Xaに
よりそれぞれ認識されるプロテアーゼ開裂部位をコード
する追加配列を含む。

第８図は、pGEX−１により形質転換された細胞における
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの発現および精製
を示す。

（ａ）誘導後の発現の時間推移。pGEX−１により形質転
換された細胞の一夜培養物を新鮮な培地において1:10に
希釈し、90分間生長させ、IPTGを加えた（1mM）。示さ
れた時点で試料を採取し、13％NaDodSO₄−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離し、次いでクーマシー・
ブルーで染色した。分子量マーカー（Ｍ）の位置および
サイズ（kDa）を示す。

（ｂ）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの精製。pG
EX−１により形質転換された細胞を前記と同様に生長さ
せ（ただし、IPTGを0.1mM液に加えない）、誘導の３時
間後培養物を採収した。グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼを前記と同様に精製し、（Ｔ）全細胞、（Ｐ）不
溶性沈澱および（Ｓ）遠心分離後上清、（Ｕ）グルタチ
オン−アガロース・ビーズと上清のインキュベーション
後の未結合材料並びに（Ｅ）ビーズから溶離した精製材
料の試料を採取した。試料は200μｌの培養物と同等で
あり、前記と同様に分析された。

第９図は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋
白質として発現されたピー・ファルシパルム抗原の精製
を示す。試料を10％NaDodSO₄−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、次いでクーマシー・ブルー染色により分析し
た。（Ｔ）全細胞抽出物、（Ｐ）グルタチオン−アガロ
ース精製材料。pGEX−１、pGEX−3XにおけるAg63（EcoR
V-EcoRI）（63）、pSj10におけるAg361（361）、pSj10
におけるAg16（16）およびpGEX−3XにおけるRESAのEcoR
Iフラグメント（Ｒ）により細胞を形質転換した。分子
量マーカー（Ｍ）の位置およびサイズ（kDa）を示す。

第10図は、精製融合蛋白質のプロテアーゼ開裂を示す。

（ａ）トロンビン開裂。Ag63の580bp RsaI-EcoRIフラグ
メントを含むpGEX−１またはpGEX-2Tにより形質転換さ
れた細胞から得られた精製融合蛋白質を、示された時間
（分）数の間プロテアーゼとインキュベーションした。
レーンＴ、ＵおよびＧ、40倍容量のMTPBSでの希釈によ
るグルタチオン除去、次いでセントリコン−10濃縮装置
（アミコン・コーポレーション）を用いた濃縮後の開裂
反応。（Ｔ）濃縮後の全反応、（Ｕ）グルタチオン−ア
ガロース・ビーズとのインキュベーション後の反応、
（Ｇ）グルタチオン−アガロース・ビーズに結合した材
料。13％−NaDodSO₄−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、次いでクーマシー・ブルー染色により試料を分析し
た。分子量マーカー（Ｍ）のサイズ（kDa）および位置
を示す。

（ｂ）血液凝固因子Xa開裂。Ag63の555bp EcoRV-EcoRI
フラグメントを含むpGEX−１またはpGEX-3Xにより形質
転換された細胞から得られた精製融合蛋白質を様々な期
間血液凝固因子Xaとインキュベーションするか、または
開裂後グルタチオン−アガロースを用いて吸収させ、
（ａ）の記載と同様に分析した。

実施例１材料および方法細菌性プラスミドの構築 Mr26000シストソーマ・ジャポニクム・グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（Sj26）のcDNAを含むpSj1の780b
pEcoRIフラグメント（スミス等、1986）を制限酵素Sau9
6iによる部分的条件下で開裂し、２つのアニール化オリ
ゴヌクレオチドと連結し、ptacllのEcoRI部位（アマン
等、1983）に挿入した（第１図）。エシェリヒア・コリ
JM101の形質転換後、tacプロモーターの後、直接EcoRI
認識部位、配列ATGTCC（Met・Serをコードする）、次い
でヌクレオチド12から３′−末端EcoRI部位までのpSjl
のSj26 cDNAが並ぶプラスミド（pSj5）を含むコロニー
が同定された。プラスミドpSj4も同様の方式で構築され
たが、ただし、異なるオリゴヌクレオチドを用いて配列
GATCCCACC5′をMetコドンに導入し、Sj26 cNDAをHinfI-
BamHIフラグメントとしてpSj1から分離し、再構築され
たSj26cDNAをpGS62（ラングフォード等、1986）のBamHI
部位に挿入した。全Sj26 cDNAを含むpSj4のBamHIフラグ
メントを制限酵素MnlIにより開裂し、BamHIリンカーと
結合し、pLK8（ラングフォード、1987年９月９日コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー会議で発表、
バクシーンズ88（Vaccines88）第90頁のLVK8）のBamHI
部位にクローン化することにより、AAA.TAA終止コドン
（BamHI認識部位の導入により破壊されて配列AAA.TCG.G
AT.CC.を生ずる）までのSj26の全コード配列を有するBa
mHIフラグメントを含むプラスミド（pSj7）を製造し
た。Sj26 BamHIフラグメントをpSj7から分離し、pIC19H
（マーシュ等、1984）のBamHI部位に挿入することによ
り、Sj26の５′−末端がPstI制限部位の隣に位置するプ
ラスミド（pSj8）を製造した。このプラスミドからのDN
Aを制限酵素PstIにより開裂し、１単位のエキソヌクレ
アーゼBa131（ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）
と２分間インキュベーションし、EcoRVにより開裂し、p
tac12-Eco（エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼのクレ
ノウ・フラグメントによるEcoRI消化DNAの処理および再
結合による特有なEcoRI部位の除去によりptac12（アマ
ン等、1983）から生成された）のPvuII部位に挿入し
た。エス・ジャポニクムの全成虫に対して生じたウサギ
抗血清（セイント等、1986）を用いたクルーザー等（19
86）記載のコロニー免疫検定により、形質転換体をSj26
の発現についてスクリーニングした。強い免疫反応を示
す一クローン（pSj10）が同定されたが、２つのBamHI認
識部位を含んでいた。Sj26 cDNAの５′−末端のBamHI部
位を、部分的BamHI消化pSj10 DNAの補充および再連結に
より開裂した。DNAをJM101（プラスミドpSj10DBam1を生
成）またはメチラーゼ欠損エシェリヒア・コリ株GM48
（ヤニッシュ−ペロン等、1985）に形質転換した。一GM
48形質転換体から得られたプラスミドDNA（pSj10DBam
7）を部分的条件下でClaIにより開裂し、３つ全部のリ
ーディング・フレームにおいてTGA終止コドンをコード
する一組のアニール化オリゴヌクレオチドと結合してプ
ラスミドpSj10DBam7Stop7を生成した（第５図）。DNAの
操作は、マニアチス等（1982）の記載に従い行なわれ
た。制限酵素はニューイングランド・バイオラブズから
入手した。

Sj26−融合蛋白質の精製細菌の一夜培養物を新鮮な培地（800ml）において1:10
に希釈し、37℃で１時間生長させ、0.1ミリモルIPTGに
より誘導し、さらに３−５時間生長させた。遠心分離に
より細胞を集め、PBS中音波処理により溶解させ、13000
gで10分間４℃で回転させた。上清をグルタチオン−ア
ガロース・カラム（硫黄連結）（シグマ）に適用し、カ
ラムをPBSで洗浄し、5mM還元グルタチオン（シグマ）含
有50mMトリス−HClpH9.6により融合蛋白質を溶離させた
（シモンズおよびバンダー・ジャグト、1977;ハーベイ
およびボイトラー、1982）。小規模精製（1.5mlの培養
物）は、30分間50μｌの膨潤グルタチオン−アガロース
・ビーズと溶解細胞の上清とのインキュベーションおよ
び蛋白質ゲル試料緩衝液中での洗浄したビーズの沸騰に
より行なわれた。エス・ジャポニクム成虫抽出物の製造
およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免
疫ブロッティングは、セイント等（1986）の記載に従い
行なわれた。

RNAのプライマー伸長配列決定エス・ジャポニクム（ソーソゴン株）の成虫を感染した
ウサギの門脈潅流により得、RNAをセイント等（1986）
の記載に従い純化した。pSj1 Si26 cDNAのヌクレオチド
53〜37に相補的なオリゴヌクレオチドを、pSj1 Sj26 cD
NAの完全コピーを含むM13ファージから分離された一本
鎖DNA鋳型において伸長させた。反応は20℃で30分間行
なわれ、アニール化鋳型およびプライマー、³²PdATPお
よび³²PdCTPの各々10μCi、0.05ミリモルdTTP、10mMト
リス−HCl（pH8.5）、５ミリモルMgCl₂およびのエシェ
リヒア・コリDNAポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメ
ント２単位を含んだ。伸長されたプライマー（34ヌクレ
オチド）を10％ポリアクリルアミド、7.6モル尿素ゲル
から取り出し、0.5M酢酸アンモニウム、５ミリモルEDT
A、0.1％SDSに４℃で16時間浸漬後エタノール沈澱によ
り回収した。全エス・ジャポニクムRNA約0.5μｇを、50
mMトリス−HCl（pH8.3）、0.1ミリモルEDTA、10ミリモ
ルDTT、7.5ミリモルMgC12、10ミリモルNaClの存在下100
℃で１分間100000cpmの³²Ｐ−標識プライマーと加熱
し、次いで60℃で20分間インキュベーションした。次
に、混合物を４つに分割し、５単位のリボヌクレアシン
（BRL）、0.5単位のとりマイオブラストシス・ウイルス
逆転写酵素（ライフ・サイエンシーズ・インコーポレイ
テッド）、0.1mMの各デオキシヌクレオチドおよび0.075
ミリモルddATP、0.06ミリモルddCTP、0.3ミリモルddGTP
または0.15ミリモルddTTPを含む反応物中、42℃で15分
間インキュベーションした。反応生成物を８％ポリアク
リルアミド−尿素ゲルで分離し、オートラジオグラフィ
ーにより検出した。

結果 pSj10DBam1の構築寄生性ぜん虫シストソーマ・ジャポニクムの成虫は、機
能的グルタチオンＳ−トランスフェラーゼであるMr2600
0抗原（Sj26）を含む（ミッチェル等、1984;スミス等、
1986）。天然Sj26と同一の分子をコードすると予想され
るプラスミド（pSj5）を構築した（第１図）。Sj26の正
確な５′−末端構造（Met.Ser.Pro.Ile……）を、エス
・ジャポニクムの成虫から精製されたSj26 mRNAの直接
配列分析から推理し（材料および方法）、成熟寄生中か
らのSj26のＮ−末端の蛋白質配列決定により確認した
（ジョイント・プロテイン・ストラクチャー・ラボラト
リーのエム・ルビラ、ルードビヒ・インスティテュート
・フォー・キャンサー・リサーチ、ウォルター・アンド
・エリーザ・ホール・インスティテュート・オブ・メデ
ィカル・リサーチと共同した）。このプラスミドは、SD
Sポリアクリルアミドゲルでその移動性（第２図）また
はその抗原性（第３図）による天然Sj26との識別が不可
能なMr26000分子（組換え体Sj26、rSj26）のエシェリヒ
ア・コアにおける合成を指図する。さらに、この分子は
可溶性で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとして
の酵素活性を示し、固定グルタチオンのカラムと結合す
る多くのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（シモン
ズおよびバンダー・ジャグト、1977;ハーベイおよびボ
イトラー、1982）の特性を保持している（第４図）。

tacプロモーター（アマン等、1983）の転写制御下のSj2
6の完全コード配列および続いて幾つかの特有な制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を含むプラスミドpSj10 DBam
1を構築した（材料および方法）。このプラスミドによ
り形質転換された細胞を誘導することにより、豊富なMr
28000分子の合成が行なわれた（第６図）。この蛋白質
のサイズが大きいのは、BamHIリンカーの導入によりpSj
10DBam1における通常のSj26終止コドンが破壊された結
果、フレーム内終止コドンと出会う前にさらに14の追加
アミノ酸が翻訳されるためである。これらの追加アミノ
酸にも拘わらず、改編されたグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼは可溶性であり、グルタチオンと結合するた
め（第６図）、Sj26のCOOH−末端に小配列を追加しても
必ずしも結合は崩壊されないことを示唆している。

Sj26融合ポリペプチドの発現プラスモディウム・ファルシパルムの様々な相異なる抗
原に対応するSj26 cDNAのCOOH末端に大きな配列を追加
した場合の影響を試験するために、pSj10DBam1の唯一の
EcoRI部位への挿入を行った。これらのcDNAは全て、そ
れらがSj26−融合蛋白質として発現されるための正確な
リーディング・フレームに存することが知られているた
め選択された。これらcDNAは、抗原16（コッペル等、19
83）、44（アンダース等、1984）、361（ピーターソ
ン、原稿基準中）および32（カウマン等、1984）に対応
した。各場合とも、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動（第６図）後クーマシー染色により容易に同定され得
るMr＞28000の新規融合蛋白質を発現する形質転換体が
同定され得た。さらに各場合とも、これらのクローンに
より合成されたSj26融合蛋白質は可溶性であり、グルタ
チオン−アガロース・ビーズとのインキュベーションに
より細菌超音波分解体から精製され得た（第６図）。精
製工程を１リットルの細胞懸濁液に規模拡大すると、ポ
リアクリルアミドゲルのクーマシー染色により判断した
ところでは汚染物質を含んでいない約5mgの蛋白質が得
られた。グルタチオン・カラムによる非形質転換細胞リ
ゼイトのクロマトグラフィーの結果、蛋白質は一切精製
されなかった。Sj26融合蛋白質は、それらが特異的抗血
清によりウエスタン・ブロットにおいて認められたた
め、抗原性を保持していた（データは示さず）。

実施例２材料および方法 pGEXベクターの構築特有のMnlI開裂部位におけるBamHIリンカーの導入によ
りpSi1 Sj26 cDNA（スミス等、1986、1987a）において
多重クローニング部位を作製することにより、Sj26のTA
A翻訳終止コドンを配列TCGGATCCと置き換えた。また、
５′−末端EcoRI−Sau96iフラグメントを、BamHI開裂部
位、次いで配列CACCATGTCC、次いでpSj1 cDNAのヌクレ
オチド12-38を含むオリゴヌクレオチドと置き換えるこ
とにより、pSj1 cDNAの５′−末端を改編し、天然Sj26
（スミス等、1987b）をコードするBamHIフラグメントを
作製した。このBamHIフラグメントを、cDNA3′−末端の
後に特有のSmaI、EcoRI、ClaIおよびEcoRV開裂部位が続
く形でpIC19H（マーシュ等、1984）のBamHI部位に挿入
した。再構築されたSj26 cDNAを含むブラント末端BamHI
-EcoRVフラグメントを、tacプロモーターからの転写に
関して正確な配向でptac12ΔEco（特有のEcoRI部位を補
充し、再連結することにより修飾されたptac12（アマン
等、1983））のPvuII部位に挿入した。さらに、３フレ
ーム全部において停止コドンをコードするオリゴヌクレ
オチド（TGACTGACTGA）をcDNA3′−末端のブラント末端
ClaI部位に導入することによりこのプラスミド（pSj1
0）を修飾し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩの
クレノウ・フラグメントを用いて補充することによりcD
NA5′−末端のBamHI開裂部位を削除した。

このプラスミド（pSj10ΔBam7Stop7）により形質転換さ
れ、IPTGにより誘導された細胞は、Mr27500ポリペプチ
ドを合成したが、pSj5、天然Sj26（スミス等、1987b）
をコードするptac11から誘導されたプラスミドにより形
質転換された細胞においては、20％未満のレベルであっ
た。発現におけるこの差異は、高いGC含有量およびpSj1
0ΔBam7Stop7（ストルモ等、198I;ド・ボア等、1983b）
におけるtacリボソーム結合部位およびATG翻訳開始コド
ン間の領域の長さに起因し得るため、多重クローニング
部位および終止コドンを含むpSj10ΔBam7Stop7における
修飾Sj26 cDNの３′−末端は、下記の要領でpSj5に導入
された。

テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするpSj5のHindII
I-NdeIフラグメントを、lacI^q対立遺伝子およびlacZの
一部分を含むpMC9（ミラー等、1984）から誘導された1.
7kb EcoRIフラグメントと置き換えた。イー・コリDNAポ
リメラーゼＩのクレノウ・フラグメントによる処理後に
精製されたフラグメントのブラント末端結合により、la
cI^q、amp^rおよびtac-Sj26が全て同じ方向でも転写され
ているプラスミド（p4.5）が生成された。p4.5における
Sj26 cDNAの３′−末端のEcoRI開裂部位を補充および再
連結により除去し、30-merオリゴヌクレオチドを用いた
マンデッキ（1986）により記載された突然変異手法によ
りcDNA5′−末端のEcoRI部位を破壊して配列tac-GTATTC
-Sj26 cDNAを生成させた。lacI^qの３′−末端、tacプロ
モーターおよびSj26 cDANの５′−部分を含むこのプラ
スミドのBclIフラグメントを、amp^r、oriおよびlacI^qの
５′−部分を含むp4.5のBclI−EcoRIフラグメントと、S
j26 cDNAの３′−末端、次いで多重クローニング部位、
終止コドンおよびpBR322ヌクレオチド2067−2246を含む
pSj10ΔBam7Stop7のBaclI−AccIフラグメントとを連結
することにより形成されたプラスミドの特有のBclI部位
に挿入した。BclIによる開裂は、メチラーゼ欠損GM48細
胞（マリヌス、1983）で生長させたプラスミドDNAにお
いて行なわれ、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ
のクレノウ・フラグメントで処理することによりEcoRI
およびAccI末端をブラント末端化した。第７図に示す構
造を有するプラスミド（pGEX−１）を含む形質転換体が
同定された。トロンビンまたは血液凝固因子Xaの開裂認
識部位をコードするオリゴヌクレオチドをpGEX−１のBa
mHI部位に挿入することにより、特有のBamHI部位が１個
または２個のヌクレオチドによりフレーム・シフトされ
ているプラスミド（pGEX−2TおよびpGEX-3X）を製造し
た（第7b図）。プラスミドDNAのジデオキシヌクレオチ
ド配列決定（チェンおよびシーバーグ、1985）によりヌ
クレオチド配列を確認し、例外が示され、プラスミドは
イー・コリ株JM109（ヤニッシュ−ペロン等、1985）に
形質転換された。制限酵素およびDNA修飾酵素はニュー
イングランド・バイオラブズから購入され、メーカーの
指示に従い使用された。

pGEXベクターに挿入されたピー・ファルシパルムcDNA
は、各々SmaI−EcoRI開裂pGEX-3XおよびpGEX-2Tにおけ
るAg63（ビアンコ等、1986）の555bp EcoRV−EcoRIフラ
グメントおよび580bp RsaI-EcoRIフラグメント、EcoRI
開裂pSj10におけるAg16（コッペル等、1983）およびAg3
61（ピーターソン、私所見）の763bpおよび1010bp EcoR
Iフラグメント並びにEcoRI切断pGEX−3XにおけるRESA
（ファバロロ等、1986）の1317bp EcoRIフラグメントで
あった。

融合蛋白質のアフィニティー精製親または組換えpGEXプラスミドにより形質転換されたイ
ー・コリの一夜培養物を新鮮な培地800ml中1:10に希釈
し、１時間37℃で生長させ、IPTGを加えた（0.1mM）。
さらに３−７時間生長させた後、沈澱した細胞を1/50−
1/100培養容量のマウス毒性燐酸緩衝食塩水（MTPBS）
（150ミリモルNaCl、16ミリモルNa₂HPO₄、４ミリモルNa
H₂PO₄（pH7.3））に再懸濁した。緩い音波処理により細
胞を氷上で溶解させ、トリトンＸ−100（BDHケミカル
ズ）を加えた（１％）後、４℃で５分間10000gで遠心分
離を行った。上清を回転プラットホーム上に置いた50ml
のポリプロピレン管中室温で１−2mlの50％グルタチオ
ン−アガロース・ビーズ（硫黄連結、シグマ）と混合し
た。使用前、ビーズをMTPBS中で予め膨潤させ、同緩衝
液で２回洗浄し、４℃でMTPBS中50％（体積／体積）溶
液として貯蔵した。吸収後、ビーズを10秒間遠心分離
（500g）により集め、50mlのMTPBSで３回洗浄した。２
×１ビーズ体積の5mM還元グルタチオン（シグマ）含有5
mMトリス−HCl（pH8.0）（最終pH7.5、新たに調製）を
用いて遊離グルタチオンと競合させることにより融合蛋
白質を溶離させた。グルタチオン−アガロース・ビーズ
への融合蛋白質の吸収および後続の溶離は共に２分以内
に完了する。グルタチオン−アガロースへの融合蛋白質
の結合は、他の中性緩衝液、例えば50mMトリス−HCl（p
H7.4）またはMTPBS（トリトンＸ−100を含まず）におい
ても行なわれ得るが、デタージェントを含有させると、
エシェリヒア・コリ蛋白質に伴う汚染が減少する。汚染
はまた、細胞を音波処理に付す期間を最小限にすること
により低減化され得る。非安定性融合蛋白質の収率は、
細胞採取の１時間足らず前までIPTGの添加を遅らせるこ
とにより高められ得る。融合蛋白質の収率は、pGEX−１
により形質転換された細胞から精製された蛋白質の蛋白
質濃度評価（ハートリー、1972）から誘導された1 OD
₂₈₀＝0.5mg/mlの関係を用い、標準としてうし血清アル
ブミンを用いて280nmでの吸光度から計算された。

融合蛋白質発現を目的とする形質転換体のマススクリー
ニングは、好都合には300μｌのMTPBSに再懸濁した1.5m
l培養物において実施される。音波処理および遠心分離
後、上清を50μｌの50％グルタチオン−アガロース・ビ
ーズと混合し、３×1mlのMTPBSで洗浄し、ビーズを100
μｌの試料緩衝液中で煮沸して、10％NaDodSO₄−ポリア
クリルアミドゲル（レムリおよびファーブル、1973）分
析、次いで0.05％クーマシー・ブルー染色を行った。

融合蛋白質の部位特異的蛋白質加水分解トロンビンによる精製融合蛋白質の開裂は、25℃で150
ミリモルNaCl、2.5ミリモルCaCl₂および100ngひとトロ
ンビン（シグマ）（イートン等、1986）および50μｇの
融合蛋白質を含む溶離緩衝液中において行なわれた。ひ
と血液凝固因子Xaによる開裂は、25℃で100ミリモルNaC
l、１ミリモルCaCl₂、500ngひと因子Xaおよび50μｇの
精製融合蛋白質（永井およびトガーゼン、1984）を含む
溶離緩衝液中において行なわれた。因子Xaへの因子Ｘ
（シグマ）の活性化は、37℃で５分間、７μｇの因子
Ｘ、75ngの活性化酵素、8mMトリス−HCl（pH8.0）、70
ミリモルNaClおよび８ミリモルCaCl₂を含む反応におい
てラッセルのクサリヘビ毒液活性化酵素（シグマ）を用
いた処理により行なわれた（藤川等、1972）。

結果 pGEXベクターの構築および構造プラスミドpSj5は、強いイソプロピルβ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（IPTG）−誘導可能tacプロモーター
（スミス等、1987b）の制御下でのエシェリヒア・コリ
におけるSj26の合成を指図する。一連の操作を通してpS
j5を修飾した結果、外来ポリペプチドがSj26のCOOH−末
端との融合体として発現され得た。生成したプラスミド
（pGEX−１）（第７図）は、（ａ）tacプロモーター（アマン等、1983;ド・ボア等、
1983a）、次いでSj26の完全コード配列（スミス等、198
6、1987a）（ただし、通常の終止コドンが制限エンドヌ
クレアーゼBamHI、SmaIおよびEcoRIに対する特有の認識
部位を含むポリリンカーにより置き換えられ、３リーデ
ィング・フレーム全部におけるTGA翻訳終止コドンが続
く）（第7b図）、（ｂ）アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺
伝子、（ｃ）複製開始点および（ｄ）lacリプレッサーの過剰発現lacI^q対立遺伝子およ
びlacZの一部を含むlacオペロンのフラグメントを含
む。多重クローニング部位のリーディング・フレーム
が、部位特異性プロテアーゼ・トロンビン（pGEX-2Tの
場合）または血液凝固因子Xa（pGEX-3Xの場合）の開裂
認識配列をコードするオリゴヌクレオチドの導入を介し
て１個または２個のヌクレオチドによりシフトされてい
る、pGEX−１の２つの誘導体（pGEX-2TおよびpGEX-3X、
第7b図）が構築された。

pGEX−１により形質転換された細胞でのIPTGによるtac
プロモーターの誘導の結果、COOH−末端に10個の追加ア
ミノ酸残基を有するSj26から成るMr27500ポリペプチド
の合成が行なわれる（第8a図）。その豊富さにも拘わら
ず、Mr27500ポリペプチドは不溶性細胞封入体を形成せ
ず、音波処理により溶解され、５分間10000gでの遠心分
離に付された細胞の上清に残存している（第8b図）。さ
らに、Sj26へのCOOH−末端の伸長はグルタチオン−アガ
ロースとの結合に影響を与えないため、細胞抽出物のア
フィニティー・クロマトグラフィーの結果、少なくとも
15mg/l（培養物）の収率によりイー・コリ蛋白質に伴う
検出可能な汚染物質が存在しない状態でMr27500分子が
効果的に精製される（第8b図）。共にCOOH−末端に14追
加残基を含むpGEX−2TおよびpGEX−3Xによりコードされ
た修飾Sj26ポリペプチドの場合にも似た特性が観察され
る。誘導物質の不在下では、野生型lacI対立遺伝子を担
うイー・コリ株、例えばC600またはGM48（マリヌス、19
73）の場合でも、プラスミド・コード化lacI^q対立遺伝
子はtacプロモーターからの転写抑制に有効である（未
発表データ）（第8a図）。

プラスモディウム・ファルシパルム抗原の発現および精
製外来ポリペプチドの発現および精製用システムとしての
pGEXベクターの普遍性を試験するために、ファルシパル
ム・マラリアの原因となるプラスモディウム・ファルシ
パルムの幾つかの相異なる抗原に対応するcDNAを、適当
なpGEXベクターの多重クローニング部位に挿入した。選
ばれたcDNAは、共に熱ショク蛋白質70（ビアンコ等、19
86;ピーターソン等、1987）に関連した２種の相異なる
抗原（Ag63、Ag361）、および縦一列に反復したペプチ
ドを含む２種の抗原（Ag16、EcoRI-RESA）（コッペル
等、1983;ファバロロ等、1986）の一部分をコードす
る。各場合において、豊富なグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ−融合蛋白質の合成が観察され、これらの融
合蛋白質は、固定グルタチオンにおける細胞抽出物のア
フィニティー・クロマトグラフィーにより精製され得、
収率は培養物１リットルに対し1.6ないし5mgであった
（第９図）。pGEXベクターを用いて有効に発現および精
製された他のポリペプチドは、８種の他のピー・ファル
シパルム抗原、寄生性条虫テニア・オビスおよびティー
・テニアホルミスの10種の相異なる抗原およびねずみイ
ンターロイキン−４およびか粒球マクロファージ・コロ
ニー刺激因子を含む（未発表データ）。

精製融合蛋白質のプロテアーゼ開裂精製後、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ担体が
部位特異的プロテアーゼ開裂により融合蛋白質から除去
され得る場合、エシェリヒア・コリでの外来ポリペプチ
ドの生産に用いられるpGEXベクターの有用性は高くなり
得る。この方法は、血液凝固因子Xa（永井およびトガー
ゼン、1984）またはコラゲナーゼ（ゲルミノおよびバス
チア、1984）の認識部位を含む融合蛋白質関して有効で
あることが判ったが、有効でない場合もあった（アレン
等、1985）。

トロンビン（チャング、1985）または血液凝固因子Xa
（永井およびトガーゼン、1984）の開裂認識部位をコー
ドするオリゴヌクレオチドをpGEX−１の多重クローニン
グ部位へ５′に隣接して導入することにより、それぞれ
プラスミドpGEX-2TおよびpGEX-3Xが生成された（第7b
図）。Ag63cDNA（ビアンコ等、1986）の580塩基対（b
p）RsaI-EcoRIフラグメントをpGEX-2TのSamI-EcoRI部位
に挿入した結果、グルタチオン−アガロースにおいて精
製され得るMr43000融合蛋白質の発現が行なわれた（第1
0a図）。この蛋白質をトロンビンとインキュベーション
すると、一方はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ担
体および他方はAg63のMr22500部分の２種のフラグメン
トが生成された（第10a図）。有効な開裂は、1:500の酵
素対基質比で30分以内に行なわれた。小比率の融合蛋白
質は、10倍高濃度の酵素との２時間のインキュベーショ
ン後でも開裂に対する抵抗を示した。同様に、pGEX-3X
ベクターを用いたAg63の555bp EcoRV-EcoRIフラグメン
トの発現の結果、血液凝固因子Xaにより２つのフラグメ
ントに開裂されるMr43000融合蛋白質の合成が行なわれ
た（第10b図）。因子Xaによる開裂は、トロンビンの場
合よりも緩慢で効率も劣ったが、恐らく因子Ｘの非効率
的な活性化に起因すると考えられる。３種の他のpGEX-2
T融合体および１種の追加pGEX-3X融合体が、適当なプロ
テアーゼによる開裂に対する感受性に関して試験された
が、各場合とも有効な開裂が観察された（未発表デー
タ）。どのプロテアーゼもグルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼ担体を開裂しないため、蛋白質加水分解後担体
おび未開裂融合蛋白質は、グルタチオン−アガロース吸
収により共に開裂反応から除去され得、精製されたポリ
ペプチド生成物のみが残り得る（第10図）。

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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，83（1986）Ｐ．8703−8707 Ｎａｔｕｒｅ，326（12）（1987）Ｐ. 149−153 Ｎａｔｕｒｅ，309（28）（1984）Ｐ. 810−812

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発現に際し外来蛋白質またはペプチドが酵
素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのCOOH−末端
と融合されている融合蛋白質をコードするヌクレオチド
配列を含む組換えDNA分子。
【請求項２】酵素が、シストソーマ・ジャポニクム（日
本住血吸虫）の26kDaグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼである、請求項１記載の組換えDNA分子。
【請求項３】ヌクレオチド配列が、外来蛋白質またはペ
プチドが開裂可能な結合を介して酵素と融合されている
融合蛋白質の発現をコードする、請求項１または２記載
の組換えDNA分子。
【請求項４】開裂可能な結合が、部位特異性プロテアー
ゼにより開裂され得る結合である、請求項３記載の組換
えDNA分子。
【請求項５】開裂可能な結合が、トロンビン、血液凝固
因子Xaまたはレニンにより開裂可能な結合である、請求
項４記載の組換えDNA分子。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項記載のヌクレ
オチド配列が挿入されている発現ベクター。
【請求項７】請求項６記載の発現ベクターにより形質転
換された宿主細胞。
【請求項８】融合蛋白質が回収可能な量で発現される条
件下での請求項７記載の宿主細胞の培養工程を含む、融
合蛋白質の製造方法。
【請求項９】請求項８記載の方法により融合蛋白質を製
造し、次いで融合蛋白質を開裂して外来蛋白質またはペ
プチドを酵素から分離させる工程を含む、蛋白質または
ペプチドの製造方法。
【請求項１０】請求項８記載の方法により製造される融
合蛋白質。
【請求項１１】酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼに対応する第１アミノ配列および上記第１アミノ酸
配列のCOOH−末端に融合しており異なる蛋白質またはペ
プチドに対応する第２アミノ酸配列を含む融合蛋白質。
【請求項１２】酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼとして発現され得るヌクレオチド配列、次いでグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合した外来蛋白
質またはペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列
の挿入を目的とする少なくとも１つの制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位が挿入されている、発現ベクター。
【請求項１３】酵素が、シストソーマ・ジャポニクムの
26kDaグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである、
請求項12記載の発現ベクター。
【請求項１４】ヌクレオチド配列が、酵素および外来蛋
白質またはポリペプチド間の開裂可能な結合として発現
され得る配列を含む、請求項12または請求項13記載の発
現ベクター。
【請求項１５】開裂可能な結合が部位特異性プロテアー
ゼにより開裂され得る結合である、請求項14記載の発現
ベクター。
【請求項１６】pGEX−１、pGEX-2TおよびpGEX-3Xから成
る群から選ばれるプラスミドを含む、請求項12記載の発
現ベクター。