KR910000461B1

KR910000461B1 - L-페닐알라닌 암모니아리아제의 아미노산배열, l-페닐알라닌 암모니아리아제의 구조유전자, 이것을 함유하는 신규의 dna배열, 이것을 함유하는 신규의 조환형 dna 플라스미드, 이것에 의해 형성되는 형질전환체 및, 이것을 사용한 l-페닐알라닌의 제조방법

Info

Publication number: KR910000461B1
Application number: KR1019870010264A
Authority: KR
Inventors: 노부히로 후꾸하라; 세쯔오 요시노; 가오루 야마모도; 도모유끼 세; 사도리 소네; 요시유끼 나까지마; 마끼 스즈끼; 노부요시 마끼구찌
Original assignee: 미쯔이도오아쯔가가꾸 가부시기가이샤; 미지마 마사요시
Priority date: 1986-09-16
Filing date: 1987-09-16
Publication date: 1991-01-25
Also published as: US6472196B1; EP0260919B1; DE3751106D1; CA1341230C; EP0260919A1; DK487787D0; JPS6371179A; JP2507345B2; KR880004088A; DE3751106T2; DK487787A; ES2070823T3

Abstract

내용 없음.

Description

L-페닐알라닌 암모니아리아제의 아미노산배열, L-페닐알라닌 암모니아리아제의 구조유전자, 이것을 함유하는 신규의 DNA배열, 이것을 함유하는 신규의 조환형 DNA 플라스미드, 이것에 의해 형성되는 형질전환체 및, 이것을 사용한 L-페닐알라닌의 제조방법

제1도는 pSW101의 구축순서를 도시한 순서도.

제2도는 pYtrp6의 구축순서를 도시한 순서도.

제3도, 제4도 및 제5도는, 제2도의 순서도의 각 부분을 보다 상세하게 도시한 순서도.

제6도는 pKY201의 구축순서를 도시한 순서도.

본 발명은 L-페닐알라닌(L-Phe라고 약칭함)의 제조에 유용하고, 신규의 아미노산배열을 갖는 L-페닐알라닌 암모니아-리아제(이하 PAL이라 약칭함)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 Rhodosporidum toruloides로부터 유도된 PAL 구조유전자(PAL 유전자라고 약칭한 경우도 있다). 여기에, 다른 전핵 또는 진핵숙주미생물에 있어서 발현되는 유전자를 허락하는 하나 이상의 필요 요소를 결합시킨 것을 갖는 PAL 구조유전자로 이루어지는 DNA 배열, 및 이 DNA 배열을 함유하는 PAL의 발현을 위한 조환형 DNA 플라스미드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 이러한 PAL의 발현을 위한 조환형 DNA 플라스미드로 형질전환한 미생물, 이 형질전환체를 사용하여 PAL의 생성물의 제조방법, 형질전화체에 의해 제조되는 PAL 및, 제조한 PAL을 사용하여 L-Phe의 생성물의 제조방법에 관한 것이다.

L-Phe는 필수불가결한 아미노산중의 하나이며, 영양에 필요할 뿐만 아니라 최근에 인공감미제로 사용되는 아스파탐의 제조용 원료로서 유용한 방향족 아미노산이다.

Rhodosporidum torulodies으로부터 유도된 PAL 및, Rhodotorula 속(屬)의 다른 미생물을 L-Phe의 제조에 이용될 수 있다는 것이 알려져 있다.

PAL을 제조하는 방법들이, 예를 들면 일본국 특허공고번호 제10753/1969호 공보 및 일본국 특허공개번호 제86082/1983 공보에 기재되어 있다.

일본국 특허공고번호 제10753/1969호 공보에는 Rhodotorula속의 미생물을 L-페닐알라닌과 접촉시켜 호소의 생산을 유도하는 방법에 대해 설명하고 있고, 일본국 특허공개번호 제86082/1983호 공보에는 Rhodotorula속의 미생물을, L-이솔루신, L-발린, L-류우신 등의 아미노산과 접촉시켜 효소의 생산을 유도하는 방법에 대해 설명하고 있다.

상술한 공정 및 방법을 포함하는 종래 기술에 있어서 PAL의 생산은 PAL 생산을 유발하기 위해 적당한 아미노산을, PAL을 생산할 수 있는 능력을 가진 미생물과 접촉시키는 단계를 요구한다.

그러나 상술한 공정 및 방법을 사용한 PAL의 산업적 생산은, 고가의 아미노산을 다량 사용하여야만 하고, 미생물의 배양을 용이하게 다룰 수 없으며, 항상 만족하게 높은 유도효율로 달성할 수 없기 때문에 경제적 또는 기술적인 관점에서 많은 결점이 있다.

한편, 최근의 분자생물학의 진보는, 이종(異種)의 미생물로부터 유태하는 단백질을 코우드하는(coding) DAN 사슬을, 다른종의 미생물에 도입하여 형질전환시키는 것이 가능하게 되어왔다.

이러한 유전공학기술을 이용하여, 고가의 아미노산을 PAL을 제조할 수 있는 능력을 가진 미생물과 접촉시켜 PAL 생산을 유발시킬 필요성을 배제하였고, 따라서 미생물 배양을 용이하게 다룰 수 있다.

그러나 PAL 구조유전자의 합성, 분리 및 클로우닝(cloning), PAL의 아미노산배열에 대하여 발표된 보고는 아직 없다. 따라서, 유전공학기술을 이용하여 PAL의 생산에 필요한 기술정보는, 현재의 기술단계에서 이용할 수 없었다.

본 발명은 PAL의 생산에 관하여, 상술한 현재의 기술단계의 관점에서 만들었다.

본 발명의 목적은 유전공학기술을 이용하여 PAL의 생산에 유용한, 신규의 PAL 구조유전자, 이 유전자를 함유하는 PAL의 발현을 위한 조환형 플라스미드 및, 이 조환형 플라스미드를 갖는 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 미생물 배양을 용이하게 다룰 수 있고, PAL 생산을 산업적인 규모로 행할 수 있으며, 낮은 비용으로 능률적으로 제조할 수 있는 PAL의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 L-Phe의 생산에 유용하고, 신규한 아미노산을 갖는 PAL 및, PAL을 사용하여 L-Phe를 생산하기 위한 제조방법을 제공하는데 있다.

이들 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 집중적인 연구를 하여, 다음과 같은 결과를 달성하였다.

(1) Rhodosporidum toruloides로부터 유도된 PAL은 이후에 나타낼 아미노산을 갖는다는 것이 명백해졌다.

(2) PAL 구조유전자를 코우드하는 DNA 사슬을, 프로모터영역의 3'-말단과, 터미네이터영역의 5'-말단과의 사이에 삽입시켜서 신규의 조환형 DNA 플라스미드(예를들면, pSW101, pYtrp6 및 pKY201)를 창제하였다.

(3) 이와 같은 신규의 조환형 DNA 플라스미드를 갖는 형질변환체를[즉, Escherichia Col:MT-10410(FERM p-8834, 기탁기관:한국종균협회, 기탁번호:KFCC-10470, 기탁년월일:1987년 12월 15일), Escherichia Col:MT-10414(FERM p-8876, 기탁기관:한국종균협회, 기탁번호:KFCC-10472, 기탁년월일:1987년 12월 15일) 및 빵효모 MT-40390(FERM p-8875, 기탁기관:한국종균협회, 기탁번호:KFCC-10471, 기탁년월일:1987년 12월 15일)]만들었다.

(4) 이 신규의 형질전환체를 배양하고, 배양물중에 PAL을 생산, 축적시키는 신규의 PAL의 제조방법을 만들었다.

(5) 상술한 신규의 방법에의해 제조되며, PAL의 존재하에 암모니아 공여체를 신남산과 반응시켜 L-페닐알라닌을 제조하는 신규한 기술을 만들었다.

상기 단락 1-5에 서술된 새로운 발견 및 기술을 포함하는 본 발명은 유전공학기술을 이용한 간단한 배양법으로 낮은 비용에서 능률적으로 PAL을 제조하는 것을 가능하게 하였다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따라서 대량 배양의 미생물을 PAL의 발현을 위해 조환형 플라스미도 전환할 수 있고, 이 결과의 형질전환체를 용이하게 배양시켜 PAL을 제조할 수 있다. 또한, 이 배양방법은 어떤 고도의 정교한 기술이나 어떤 고가의 유도시약을 필요로하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 PAL의 제조는, 고가의 아미노산을 PAL을 제조할 수 있는 능력을 가진 미생물과 접촉시켜 PAL을 제조하는 단계를 포함하는 어떤 종래의 다루기 힘든 배양공정을 필요로 하지 않는다.

또한 본 발명에 따라 얻은 미생물에 의해 제조되는 PAL은 L-페닐알라닌의 산업적인 생산에 사용하는데 안정하고, 적합하다. 또한, 본 발명은 PAL이 대장균 등에서 합성될 때, 세포벽의 침투성을 향상시키기 위해서 미생물에 표면활성제를 접촉시킬 필요가 없다.

본 발명의 PAL의 구조유전자는, 아래의 가장 필수불가결한 것들을 포함하는 일련의 단계를 행하여 제조될 수있다.

(1) PAL의 메신저 RNA(mRNA)의 분리 및 정제, (2) 이 mRNA를 이중사슬 DNA(ds-cDNA)로 전환, (3)여기에 부가되는 올리고-dC 꼬리를 갖는 ds-cDNA의 구축, (4) 올리고-dG 꼬리를 갖는 벡터에, 올리고-dC 꼬리를 가진 ds-cDNA를 결합시킨 혼성 플라스미드의 구축, (5) 미생물의 형질전화 및 클론(clone)의 선택, (6) DNA 배열의 분석에 의한 PAL 유전자영역의 형질의 확인, (7) PAL 효소활성의 발현의 확인.

PAL 구조유전자를 각각의 숙주에서 기능하는 프로모터영역의 3'-말단과 터미네이터영역의 5'-말단과의 사이에 삽입시킴에 의해서, PAL 구조유전자를 각종 숙주(예를 들면 대장균, 고초균, 빵효모 등)에서 증식 가능한 벡터내에 통합할 수 있다. 따라서 PAL을 발현시킬 수 있는 조환형 DNA 플라스미드를 구축할 수 있다.

이 목적에 사용되는 프로모터영역은, RNA 중합효소가 mRNA의 합성을 개시하는데 결합하는 위치를 포함한 어떤 영역이라도 될 수 있다.

또한 이 프로모터영역은 번역개시영역을 포함한다. 예를 들면 숙주가 대장균인 경우, 번역개시영역은 Shine-Dalgarno 배열 또는 리보오솜 결합위치(즉, 리보오솜을 결합할 수 있는 mRNA의 뉴클레오티드배열에 상당하는 위치)로부터 개시코돈(예를 들면 ATG)까지 연장한다. 바람직하게는, Shine-Dalgarno 배열과 개시코돈 사이의 거리는 약 10염기 정도 긴 거리이다.

숙주가 대장균 등의 원핵생물일 경우, 터미네이터영역은 항상 필요하지 않다. 그러나, 터미네이터영역의 존재는 다소의 추가적인 효과를 갖는다는 것이 알려져 있다.

따라서, 숙주로서 대장균이 사용되는 경우에는, PAL 구조유전자를, 대장균에서 증식가능한 플라스미드상에 있어서 또한 대장균내에서 기능하는 프로모터영역의 3'-말단에 삽입시킬 수도 있다.

바람직한 프로모터영역은 예를 들면, 트립토판(trp)프로모터, 락토오스(lac)프로모터, tac 프로모터, PL 람다프로모터 등을 열거할 수 있다. 따라서 이들 프로모터영역을 함유하는 각종의 벡터(pBR322, pUC등) 들은 본 발명에 유용하다.

실제로는, 이러한 벡터는 프로모터영역의 3'-말단에서 적당한 제한효소에 의해 갈라진다. PAL의 구조유전자가 동일 접착말단을 갖는 경우, 벡터내에 직접 삽입할 수 있다. PAL 유전자의 접착말단이 합쳐지지 않는 DNA 배열을 갖는 경우, 평활말단이 형성된다. 따라서 PAL 유전자를 리가아제에 의해서 벡터내에 삽입 할 수 있다.

이 연결에서, 보다 상세한 정보는, 이후에 집합적으로 나타낼 참고문헌에서 발견할 수 있을 것이다. 특히, 트립토판프로모터는 참고문헌 1-4에, 락토오스프로모터는 참고문헌 5에, tac 프로모터는 참고문헌 6에, PL 람다프로모터는 참고문헌 7 및 8에, 터미네이터영역은 참고문헌 9에 기술되어있다.

프로모터영역의 3'-말단과 터미네이터영역의 5'-말단 사이에 PAL 유전자를 삽입시켜 구성된 조환형 DNA 플라스미드는 공지된 방법에 따라 대장균을 형질전환하는데 사용할 수 있다.

이 형질전환체는 약제저항성(예를 들면, 암피실린에 대한 저항성), 영양요구성 등의 표현형 특성에 근거하여 선택할 수 있다. 따라서 PAL 활성을 갖는 세포는, 이러한 표현형 특성을 발휘하는 세포로부터 선택된다.

상술한 방법으로 선택한 형질전환체는 공지된 방법으로 배양할 수 있다. 이 목적에 사용되는 배지는 예를들면, 글루코오스 및/또는 다른 요구되는 영양소를 함유하는 합성배지 또는 발효액을 열거할 수 있다.

보다 효과적으로 작용하도록 프로모터를 발생시키기를 바란다면, 이소프로필-β-티오갈락토시드(이하 IPTG라 약칭함)또는 인돌아크릴산(이하 IAA라 약칭함)등의 화합약제를 배지에 첨가할 수있다.

형질전환체는 통상 15∼43℃, 바람직하게는 28∼42℃에서 4∼48시간, 바람직하게는 4∼20시간 배양한다. 필요에 의해서, 통기 및/또는 교반을 사용할 수 있다.

빵효모(Saccharomyces Cerevisiae)를 숙주로서 이용하는 경우에는 빵효모의 형질전환체를 다음 방법으로 창제할 수 있다. YRp7(이 취득방법은 참고문헌 10에 기재되어있다) 또는 pMA3a(이 취득방법은 참고문헌 11에 기재되어 있다)등의 대장균-효모셔틀 벡터내에 글리세르알데히드-3인산 디히드로겐아제 유전자의 프로모터영역(이 취득방법은 참고문헌 12에 기재되어 있다) 또는 알코올디히드로겐아제 I 유전자의 프로모터영역(이 취득방법은 참고문헌 13에 기재되어 있다)등의 빵효모에서 기능하는 프로모터영역을 삽입한다. PAL 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편을 리가아제에 의해, 삽입되는 프로모터의 3'-말단에 결합한다. 또한 mRNA에 의해 번역되지 않으며, 알코올디히드로겐아제 I 유전자에 포함되는, 3'-말단의 비번역영역, 또는 mRNA에 의해 번역되지 않으며, 터미네이터로서 글리세르알데히드-3-이산디히드로겐아제 유전자에 포함되는 3'-말단의 비번역영역등을 선택해서, 리가아제에 의해 PAL 구조유전자의 3'-말단을 결합시킨다. 이후에, 셔틀벡터의 5'-말단에, 선택한 비번역영역의 3'-말단을 결합시켜서 플라스미드를 폐환한다.

폐환 플라스미드를 사용하여, 공지의 방법으로 대장균을 형질전환한다.

이와 같이해서 얻어진 형질전환체는, 암피실린저항성 등의 표현형 특성에 근거하여 선택할 수 있다.

이들 형질전환 대장균의 세포로부터, 플라스미드 DNA를 알칼리 추출방법에 따라 단리하고, 이 플라스미드를 사용하여, 효모의 영양요구주[예를 들면, S. Cerevisiae ATCC 44771군주의 돌연변이에 의해 얻은 MT-40391 리신-종속군주]를 공지의 방법 또는 다른 동등한 방법에 따라 형질전환한다.

형질전환효모는 숙주의 영양요구성의 복귀에 근거하여 선택할 수 있다.

형질전환효모는 그것 자체가 공지의 배지로 배양할수 있다. 이 목적에 사용되는 배지로서는, 예를 들면, Wickerhams의 아미노산이 없는 배지(참고문헌 14)에 글루코오스 및 다른 영양요구물을 첨가한 배지 등을 열거할 수 있다.

효모는 통상 15∼40℃에서 24∼72시간 배양하고, 필요에 따라 통기 및/또는 교반을 사용할 수도 있다.

상술한 방법으로 미생물을 배양 후, 종래 방법에 따라 배양액으로부터 세포를 집균하고, 그들 세포벽 및 다른 세포구조를 파괴시켜서 집균세포내에 생산축적되는 PAL을 추출할 수 있다. 이 목적을 위해서, 유기용매, 표면활성제 등의 접촉: 초음파, 유리구슬 팝쇄 등의 기계적 처리: 적당한 용균효소, 자기소화등의 생화학적 처리 등을 사용할 수 있다.

상술한 방법으로 제조한 조(粗)효소, 폴리아크릴아미드 유전자 또는 아르기네이트 유전자 등의 불가동성 약제에 집균세포를 매립시켜서 얻은 불가동세포, 또는 집균세포는, 신남산으로 암모니아 공여체의 효소작용을 달성할 수 있도록 사용될 수 있고, 이것에 의해 L-Phe를 제조한다. 이 효소반응은, 예를들면 반응 혼합물이 신남산에 대하여 과잉으로 암모니아 공여체를 함유하며, 신남산의 농도가 효소작용을 억제하는 정도를 초과하지 않는다라고 기재된 일본 특허공보번호 제44474/1986의 방법을 포함하여 여러 가지의 공지방법에 따라 행할 수 있다.

다음의 실시예를 참조로하여 각 단계에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

[실시예]

1. PAL mRNA의 단리 및 정제

Rhodosporidium toruloides IFO 559(ATCC 10788와 동일하다)을, 2% 글루코오스를 함유하는 합성배지(표1)에서, 통기 및 교반조건하에 27℃에서 배양하였다. 배양초기에 첨가된 글루코오스 전부를 소비한 직후, 세균세포를 원심분리로 집균하고, 집균한 습한 세포를, 멸균한 0.85% 식염수로 세정하고 원심분리에 의해 다시 집균하여 습한 세정세포를 얻었다.

[표 1]

이 습한 세정세포를 즉시 PAL 유도배지[즉, 2% L-Phe를 함유하는 0.17% Yeast Nitrogen Base (Difco 사제: 무(無) 황산암모늄 및 무 아미노산 타입]에 세포농도 0.5∼0.8% 되도록 현탁시키고, 이 결과의 현탁액을 27℃에서 진탕교반을 행하여 PAL를 유도하였다.

27℃에서 PAL의 유도를 위해 2시간 처리 후, 원심 분리에 의해 PAL 유도배지로부터 세포를 회수하였다. 집균한 습한 세포를 등량의 멸균수로 현탁하고, 이 현탁액을 액체 질소에 적하하여 동결세포를 얻었다.

동결세포(10g)을 액체질소에 첨가하여 막자사발에서 막자로 미세하게 분쇄하였다. 다음에, 액체질소가 자연적으로 증발하고, 가루로 빻은 동결물질이 녹기 시작하자마자, 5% SDS를 함유하는 완충액 C50ml[0.1M Na₂HPO₄(pH 7.4), 0.15M 염화나트륨, 1% 디옥시콜산나트륨, 1% Triton X-100으로 구성]를 첨가하고, 서서히 30분간 교반하였다.

교반완료 후, 페놀-클로로포름 혼합액(페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 25:24:1의 혼합 용량비로 구성됨) 50ml를 첨가하고, 15분간 교반하여 혼합했다.

이 혼합액을 원심분리하여 수층을 회수하였다. 이 수층에 새로운 페놀-클로로포름 혼합액 50ml를 첨가하고, 15분간 교반하였다. 이것을 원심분리한 후, 수층을 다시 회수하였고, 계속해서, 페놀-클로로포름 혼합액으로 추출하는 이 절차를 2회 반복하였다.

염화나트륨의 최종농도가 0.2M이 되도록, 최후에 얻은 수층에 멸균된 5M 식염수를 첨가하였고, 또한 냉(冷)에탄올 2.5부피를 첨가하였다. 이 혼합액을 -20℃ 이하에서 보존하여 핵산성분을 침전시켰다.

이 침전물을 원심분리로 회수하여, 냉에탄올로 세정한 후 감압하에서 건조하였다.

이와 같이하여 얻은 건조물을 10ml 의 멸균수에 용해하고, 이 용액을 65℃에서 5분간 가열처리한 후, 올리고-d(T) 셀룰로오스를 사용한 Maniatis(참고문헌 15)의 공지방법에 따라 mRNA를 단리하였다.

이와 같이하여 얻는 mRNA를 샘플 완충액(5M 요소, 1mM EDTA 및 0.05% 브로모페놀 블루우로 구성됨)에 용해한 후, 65℃에서 2분간 가열처리하여 RNA의 고차구조를 변성시킨다. 이후에, 8M 요소-아크릴 아미드슬랩겔(3% 농도의 아크릴아미드를 가지며 8M 요소를 함유)을 사용하여 전기영동용 완충액(89mM Tris, 89mM 붕산, 2mM EDTA)에서 전기영동시킨다.

전기영동의 종료 후, 아크릴아미드겔을 에티듐브로마이드로 처리하고, 자외선하에서 mRNA 밴드를 발색시킨다. 2.0∼3.0kb 의 mRNA 크기범위에 상당하는 겔부분을 세로로 똑같이 3등분하고, 3개의 절단편을 슬랩겔로부터 자른다.

각 겔단편을 투석튜우브에 밀봉하고, 상술한 성분을 갖는 전기영동용 완충액에 침적시킨다. 따라서 mRNA를 겔단편으로부터 전기적으로 용출한다.

각 투석튜우브내의 액에 페놀-클로로포름 혼합액을 첨가하고, 이 혼합물을 물로서 2회 추출하고, 이와같이 해서 얻어진 수층을 에테르로 재추출하여 잔류페놀을 제거한다. 이 수층에 1/10부피의 3M 아세트산나트륨 수용액을 첨가한후, 2.5부피의 냉에탄올을 첨가하고, 이 혼합물을 -20℃에서 보존하여 mRNA를 침전시킨다.

각 겔단편으로부터 정제한 mRNA 분획(分劃)이 pal mRNA를 함유하는지 않는지를 확인하기위해서, 각 분획에 함유된 mRNA를 단백질로 번역시켜, 생산단백질을 PAL의 특이한 항체를 사용하여 시험한다.

보다 상세하게는, 각 mRNA 분획을 토끼의 망상적 혈구의 용해물을(참고문헌 16)사용하여 무세포계 번역키트(kit)로 실험한다.

토끼의 망상적혈구 아세이(assay)용 키트는 Promega Biotec Co.사의 것을 사용하고, 표식 아미노산은 S-메티오닌(Amersham Co.제)를 사용하였다.

토끼의 망상적혈구를 사용하는 생체의 번역시스템에서 번역되는 단백질내에 포함되는 PAL은 다음과 같이 확인한다: 단백질을 용해시키기 위해 번역 반응액에 완충액 C를 첨가한다. 불용물을 원심분리에 의해 제거한 후, 상청액에 자체 제조한 토끼의 항-PAL IgG를 첨가하고, 이 반응 혼합액을 얼음위에서 30분간 지속시킨 후, 양(羊)혈청의 항-토끼 IgG(자체제조)를 첨가하고 얼음위에서 30분간 놓아두었다. 따라서 단백질이 토끼항체와 함께 침전되었다.

이 침전물을 원심분리로 회수하고, 완충액 C로 2회 세정한 후, 2% SDS 및 10% β-메르캅토에탈올용액의 혼합액과, 0.1M Tris-인산(PH6.8), 1% SDS 및 50% 글리세롤 용액의 혼합액과를 3:1의 용량비로 혼합하여 구성된 용액에 용해하였다. 이 반응 혼합액을 95℃에서 2시간동안 가열하여 단백질의 2황화물 결합으로 절단하였고, 반응 혼합물을 SDS-폴리아크릴아미드 슬랩겔 전기영동(아크릴아미드 농도 10%에서)을 LAemmli's 법(참고문헌17)에 따라서 행하였다. 전기영동의 종료 후, 겔을 건조하고, 방사선자동사진법에 의해 PAL을 발견하였다. 따라서 PAL mRNA를 함유하는 분획을 확인하였다.

2. PAL mRNA의 2중 사슬 cDNA(ds-cDNA)로의변환

상기 1에 서술한 바와같이 PAL 유도를 위해 2시간 처리후의 세포로부터 얻은 PAL mRNA를 함유하는 겔단편으로부터 분획을 정제하고, 이와 같이해서 얻어진 mRNA를, 참고문헌 18에 서술한 방법에 따라, Awv역 전사로 처리하여 단일사슬 cDNA 분자로 변환하였다.

보다 상세하게는, 단일사슬 cDNA-mRNA 혼성체를 형성한 후 RNaseH, DNA 중합효소 I 및 리가아제로 처리하였다. 따라서 mRNA를 제거하는 동시에 이중사슬 cDNA(ds-cDNA)를 구축하였다.

3. 3'-말단에 올리고-dC 꼬리를 갖는 ds-cDNA의 구축

상기 2에서 얻은 ds-cDNA에 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼아제를 작용시켜서 ds-cDNA의 3'-말단에 올리고 -ds 꼬리를 첨가하였다.

보다 상세하게는, ds-cDNA 3㎍을 TdT 완충액[100mM 카코딜산칼륨(PH7.2),2mM 염화코발트, 0.2mM 디티오트레이톨로 구성됨]과 0.2mM dCTP를 함유하는 반응배지에 용해사고, 37℃에서 5분간 전처리하였다. 다음에는, 50단위의 TdT를 첨가하고 37℃에서 15분간 반응을 진행시킨 후, 최종농도 40mM가 되도록 EDTA를 첨가하고, 반응 혼합액을 얼음위에 놓았다. 그리고나서 페놀-클로로포름 혼합액을 첨가하여 TdT를 변성시키고, 비활성화하였다. 변성 불용화단백질을 원심분리에 의해 반응 혼합액으로부터 제거한 후, 상청액을 페놀로 추출하고, 분리한 수층에 냉에탄올을 혼합하였다. 이와같이해서 형성된 침전물을 70% 에탄올로 세정한 후, 감압하에서 건조하여 3'-말단에 올리고 dC 꼬리를 갖는 ds-cDNA를 얻었다.

4. 혼성플라스미드의 구축

pUC9 분자(올리고-dG 꼬리를 가짐)와 ds-cDNA 분자(올리고-dC 꼬리를 가짐)와의 결합

상기 3에서 얻은 올리고-dC 꼬리를 갖는 ds-cDNA와 플라스미드 pUC9(올리고-dG 꼬리를 가짐:스웨덴 Pharmacia Co.로부터 용이하게 입수가능)과를 dC-dG 호모폴리머방법으로 공지의 방법인 Maniatis 법에 따라 결합하였다.

5. 형질전환 클론의 선택

상기 4에서 얻은 혼성플라스미드(올리-dG 꼬리를 갖는 pUC9 분자의 올리고-dC 꼬리를 갖는 ds-cDNA 분자로 구성)를 CaCl₂처리한 대장균 MC 1061(참고문헌 26)의 세포에, 감응세포(Competent cell)법에 따라 도입하였다.

약 4만개의 형질전환체의 콜로니(colony)를 얻은 후, 이후에 후술할 참조예 3에 기술한 방법에 근거하여 콜로니 교잡법에 따라서 형질전환 세포의 선택을 행하였다.

이와 같이 해서 얻은 양성 콜로니로부터, 플라스미드를 추출하고 정제하였다. 이들 플라스미드를 각종의 제한효소로 절단하였고, 이 결과의 DNA 단편의 크기를 아가로우즈겔 전기영동에 의해 분석하였다.

6. 완전한 PAL 구조유전자를 갖는 ds-cDNA의 구축

상기 5에서 얻은 형질전환체로부터 플라스미드 pSW2 및 pSW11을 단리하였다.

보다 상세하게는, 각종의 제한효소를 사용하여 상기 5에서 행한 분석결과로서, PAL mRNA에 상당하는 완전한 cDNA는 pSW2 및 pSW11을 결합시켜서 구축할 수있다는 것이 분명히 밝혀졌다. 따라서, 각각을 함유하는 형질전환세포로부터 플라스미드를 추출, 정제하였다.

pSW2를 함유하는 세포로부터 얻은 플라스미드를 제한효소 BanIII로 절단한 후, 제한효소 HindIII 로 절단하였다. 이 결과의 단편 혼합물을 아가로우즈겔 전기영동에 의해 분획하였다. 따라서 4.2kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하고, 페놀-클로로포름 혼합액으로 처리 및 냉에탄올로 침전조작을 각각 여러번 반복하여 정제하였다.

한편, pSW11을 함유하는 세포로부터 얻은 플라스미드를 제한효소 BanIII 및 HindIII로 절단후, 이 결과의 단편 혼합물을 전기영동에 의해 0.8kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하고 정제하였다. 이들 4.2kb 및 0.8kb DNA 단편을 리가아제로 폐환하였고, 이 생성물을 사용하여 대장균 JM 83(ATCC 35067, 참고문헌 27)을 형질 변환하였다.

마커(marker)로서 사용되는 암피실린저항성을 발휘하는 형질전환체로부터 플라스미드를 추출한 후, 각종의 제한효소를 작용시켜 절단지도를 작성하였다. 따라서, 제1도의 제한효소 절단지도에 나타낸 정확한 PAL 구조를 갖는 플라스미드 pSW13을 선택하였다.

7. 클론 DNA 의 뉴클레오티드 배열의 결정

상기 플라스미드 pSW13을 함유하는 클론으로부터 플라스미드 pSW13을 단리하고, 이 클론 DNA 단편을 각종의 제한효소로 절단하였다. 적당한 제한 단편으로 Maxam-Gilbert법(화학분해법)에 의해서 및, Maat의 디데옥시(dideoxy)법(참고문헌19)에 의해 생화학적으로 DNA의 뉴클레오티드 배열을 분해하였다.

각각의 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열을 컴퓨터로 편집하였다. 이와 같이 결정된 뉴클레오티드 배열을 이후에 나타낼 PAL 구조유전자를 함유하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열과 동일하게 하였다.

8. pSW 101의 구축(제1도 참조)

플라스미드 pUC13(Pharmacia 사 제조)0.9㎍에 10단위의 제한효소 Sal I을 14㎕의 반응 배지[7mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.75mM EDTA, 7mM MgCl₂,175mM NaCl, 7mM β-메르캅토에탄올 및 0.01% 소혈청 알부민(이하 BSA로 약칭함)으로 구성]중에서, 37℃,16시간 작용시켜, 페놀-클로로포름 혼합액으로 처리하고, 에탄올로 침전시켜 선형 DNA를 얻었다. 이 선형 DNA를 니크(nick) 번역완충액[50mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 0.1mM 디티오트레이톨, 2% BSA, 80μM dATP, 80μM dGTP, 80μM dTTP, 80μM dCTP로 구성]에서 DNA 중합효소의 Klenow 단편(Takara Shuzo K.K 제조)으로 실온에서 30분간 처리하여, 접착말단을 평활말단으로 전환하였다. 페놀로탈단백질을 행한 후, 냉에탄올로 DNA를 침전시켜 회수하였다. 이 DNA 단편을 송아지비장으로부터 유도된 인산디에스테라아제(CIP:Bohringer제조)로 처리하여, 5'-말단의 인산기를 제거해서 선형 pUC13의 자기폐환을 방지하였다.

한편, pSW13을 함유하는 세포로부터 이플라스미드 pSW13을 추출,정제하였다. 반응 배지[4mM Tris-HCl, (pH7.5), 0.4mM EDTA 및 50mM NaCl로 구성]에서, 이 플라스미드 pSW13을 제한효소 DraI로 37℃에서 28시간 처리하였다. 다음에, 식염액을 첨가하여 염화나트륨 농도를 100mM로 하고, 이플라스미드 pSW13을 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 37℃에서16시간 작용시켰다.

처리종료 후, 반응 혼합액을 아가로우즈겔 전기영동하여, 2.3kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 겔로부터 회수하였다. 다음에 이 DNA 단편을 페놀로 추출, 페놀-클로로포름 혼합액처리 및 냉에탄올 침전을 각각 3회 반복하여 PAL cDNA 단편 로우드를 얻었다.

이 cDNA 단편을 상술한 니크번역 완충액에서, DNA 중합효소의 Klenow 단편으로 실온에서 45분간 작용시킨 후,페놀-클로로포름 혼합액처리, 냉에탄올 침전조작을 각각 3회 반복하여 평활말단을 양단에 갖는 cDNA 단편을 얻었다.

다음에 평활말단을 갖는 pUC13 단편과 평활말단을 갖는 cDNA과를 리가아제를 사용하여 결합시켜서 원형 플라스미드 pSW101을 구축하였다.

이 혼성 DNA 플라스미드를 사용하여, 공지방법에 따라서 E.coli JM 83을 형질전환하였다. 암피실린 저항성 콜로니들로부터 세포를 선택하였고, PAL 활성을 측정하였다.

9. pYtrp6의 구축 및 형질전환

상기 8에 기술한 방법으로 구축한 플라스미드 pSW101을 Pst I 및 BamH I 으로 소화하였다. 이 결과의 단편 혼합물을 아가로우즈겔 전기영동행한후, 370bp의 DNA 단편을 회수하였다. 이 단편을 2부분으로 나누고, 이들중 하나를 BanI 으로, 나머지 하나를 Bbe I 으로 소화하였다.

소화후, 이 결과의 단편혼합물을 아크릴라미드겔 전기영동하여, 70bp의 크기를 갖는 단편을 Ban I 소화물질로부터 회수하였고, 280bp의 크기를 갖는 단편을 Bbe I 소화물질로부터 회수하였다.

70bp 단편을 DNA 중합효소로 처리하여 평활말단을 만들고, Cla I(BanIII)링커를 리가아제로 결합시켰다.

ClaI 링커를 양단에 결합한 DNA 단편을 BanIII 및 BbeI 으로 소화하였다. 한편, pBR322를 BanIII 및 BanH I 으로 소화하였고, 아가로우즈겔 전기영동법에 의해서 4.0kb의 DNA 단편을 회수하였다. 상술한 Ban III+Bbe I 단편과, 앞서 제조한 Bbe I 단편(280bp)을 리가아제에 의해 pBR322 단편(4.0kb)에 결합시켰다. 따라서, 플라스미드 pSYA1을 얻었다. 다음에, 이 pSYA1으로 대장균(E.coli)을 공지의 칼슘법에 따라서 형질전환하였다.

암피실린을 함유하는 LB 배지 3ml 내에 pSYA1을 함유하는 대장균을 식균(植菌)하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양된 세포를 원심분리로 집균하고, 50mM 글루코오스, 25mM Tris-HCl(PH8.0) 및 10mM EDTA 로 구성된 용액 60㎕에 현탁시켜 세포현탁액을 만들었다. 여기에 40㎕의 10mg/ml 리소자임 용액을 첨가하고, 이 결과의 반응혼합액을 실온에서 5분간 방치하였다. 반응종료후, 1% SDS를 함유하는 0.2N NaOH 200㎕를 첨가하였고, 서서히 저은후, 반응혼합액을 얼음위에 놓고 5분간 유지하였다. 여기에 5M 아세트산 나트륨용액(PH 4.8) 150㎕을 첨가하고, 서서히 저은후 반응혼합액을 얼음위에 놓고 반응을 정지시켰다.

이 결과의 용해물을 12,000rpm으로 10분간 원심분리하고 상청액을 분리하였다. 다음에, 이 상청액을 페놀-클로로포름 혼합액 처리, 냉에탄올 침전 조작을 각각 3회 반복하였다.

이와같이하여 얻은 침전물로부터, 공지방법에 따라서 pSYA1을 추출하였다. 이 pSYA1을 BamH I 및 BanIII로 소화시키고 350kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다. 한편, 상기 6에서 구축한 플라스미드, pSW13을 Xba I 으로 소화시키고, 이 결과의 접착말단을 DNA 중합효소로 처리하여 평활말단을 만들었다. 다음에, 여기에 HindIII 링커를 리가아제로 결합시켜 pSW13H를 구축하였다. 이 결과의 소화물질로부터, 아가로우즈겔 전기영동에 의해 1.9kb 의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

다음에는, 참조예 5에 기술된 방법으로 구축한 플라스미드 pFtrp2를 BanIII 및 HindIII로 소화시키고, 이 결과의 단편혼합물로부터, 아가로우즈겔 전기영동에 의해 4.7kb의 단편을 회수하였다. 제4도에 도시한 바와 같이 이 4.7kb 단편에 앞서 제조한 350bp의 BamHI+BanIII 단편 및 1.9kb 의 BamH I+HindIII 단편을 리가아제로 결합시켰다. 따라서 원형플라스미드 pSYA2(제5도)를 구축하였다.

또한, pSYA2를 BanIII로 부분적으로 소화하고, 이결과의 접착말단을 DNA 중합효소로 처리하여 평활말단을 만들었다. 다음에 이 단편을 리가아제로 폐환하여 Nru I 절단점을 갖는 플라스미드 pYtrp6(제5도)를 창제하였다.

pYtrp6를 대장균 MC 1061에 공지방법에 따라 형질전환하고, 암피실린 저항성의 콜로니로부터 세포를 선택한후 PAL 활성을 측정하였다. pYtrp6의 구축을 제2도의 순서도에 도시하였고, 보다 상세한 것을 제3도∼제5도에 도시하였다. PAL 활성을 나타내는 단리된 대장균의 형질전환체를 MT-10414(FERM P-8876)라고 명명했다.

10. pKY201의 구축 및 형질전환

상기 9에서 구축한 플라스미드 pYtrp6를 NruI 으로 소화한후, CIP 처리하였다. 여기에 HindIII 링커를 리가아제로 결합하고, HindIII 로 소화하였다. 이 결과의 단편혼합물로부터, 아가로우즈겔 전기영동에 의해 2.3kb의 DNA 단편을 회수하였다.

한편, ADHI(알코올 디히드로겐아제 I를)갖는 대장균과 빵효모의 어느쪽에서도 기능하는 G.Ammerer의 셔틀벡터 -AHH 5(참고문헌13)을 HindIII으로 소화한후, CIP 처리하였다. 리가아제를 사용하여, pYtrp6로부터 제조한 2.3kb DNA 단편을 삽입하여 플라스미드를 구축하였다.

이 플라스미드를 사용하여, 감응법에 따라 대장균 MC 1061을 형질전환하였다. 암피실린 저항성을 나타내는 세포로부터 플라스미드를 공지방법에 따라 추출하고, 정확한 방향에 삽입되는 상술한 DNA 단편을 갖는 플라스미드를 선택하였다.

정확한 방향에 삽입되는 상술한 DNA 단편을 갖는, 배열분석에 의해 나타낸 플라스미드를 pKY201(제6도)라고 명명했다. 이 pKY201을 사용하여, KU 법(참고문헌20)에 따라 빵효모(Saccharomycescerevisiae MT-40391)의 L-류우신 요구주(leu 2)를 형질전환하였다. 다음에, 이 효모를, L-류우신을 함유하지 않는 합성배지인 YAL 한천배지(Bacto Yeast Nitrogen base0.67%, 글루코오스 0.5%, 황산아데닌 0.005%, L-리신 0.05% 및 한천 1.5%로 구성)위에 식균하였다. 이 배지는 25℃에서 3일간 배양한후, 형성된 콜로니로부터 세포를 분리하고, PAL 활성을 측정했다. PAL 활성을 나타내는 세포주를 MT-40390(FERMP-8875)라고 명명했다.

11. 형질전환체에 의한 PAL 의제조

형질전환체(E.coli MT-10414)를 암피실린(0.1mg/ml)을 함유하는 LB 배지에 식균하고, 35℃에서 10시간 진탕 배양한후, 인돌아크릴산을 에탄올에 10mg/ml 용해한 용액을, 배지중의 인돌아크릴산 농도가 0.02mg/ml 되도록 무균적으로 첨가하였다.

인돌아크릴산의 첨가후, 배지를 35℃에서 6시간동안 진탕배양하였다.

이후, 이결과의 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하였다. 이 세포를 0.1M Tris-HCl 완충액(PH 8.5)로 현탁한후 0.25mm 직경의 유리구슬을 함유하는 DYNO 분쇄기 (KDL형)에서 분쇄하였다.

처리액을 원심분리하고, 잔유물과 상청액을 분리하였다. 상청액에 황산 암모늄을 첨가해서 염석하였다. 이와같이해서 형성된 침전물을 0.1M Tris-HCl 완충액(PH 8.5)에 용해하고, DEAE-셀룰로오즈 컬럼크로마토그래피에 의해 PAL 활성을 나타내는 분획을 자르고, 겔 여과에 의해 정제하고, 농축한후, PAL의 특이항체를 사용한 면역흡수(immunoboltting) 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 분자량의 측정 및 등전점 전기영동에 의해 등전점의 측정을 행하였다.

PAL 활성을 나타내는 분획의 단백질은, PAL의 특이항체로 항원항체반응을 나타내었다. SDS 전기영동으로 측정한 경우, 분자량은 약77,000이였으며, 등전점(PI)은 5.5였다.

이 값들은 R.toruloides로부터 얻은 PAL의 분자량 및 등전점과 일치하였다. 이결과 PAL의 생성을 확인하였다.

12. 형질전환체를 사용한 L-페닐알라닌의 제조

Na₂HPO₄, 6g, KH₂PO₄3g, NaCl 0.5g 및 NH₄Cl 1g을 증류수1ℓ에 용해시키고, 이 용액을 KOH로 PH 7.5로 조절한후 120℃에서 10분간 오오토클레이브 살균처리하여 M9배지를 제조하였다. 다음에, M9배지1ℓ에 1M MgSO₄2ml, 20% 글루코오스 수용액 10ml 및 1M CaCl₂0.1ml를 0.22㎛의 세공(細孔)직경을 갖는 필터(MILLEX-GS:Millipore.제)로 여과하여 살균하였다. 농도가 0.1mg/ml 되도록 암피실린을 첨가한후, 배지를 형질전환체(E.coli MT-10414)로 식균하였다.

접종한 배지를 통기 및 교반조건하에 37℃에서, 6시간 배양한후, 인돌아클리산을 에탄올에 10mg/ml 용해한 용액을 배지중의 인돌아크릴산 농도가 0.02mg/ml 되도록 무균적으로 첨가하였다.

인돌아크릴산의 첨가후, 통기 및 교반조건하에 37℃에서 4시간동안 배양을 계속하였다.

소정시간후, 배양액을 원심분리하고 배양세포를 얻었다.

암모니아수 90ml에 신남산 4g을 용해하고, 이 용액을 황산으로 PH10으로 조절한 후, 증류수로 희석하여 부피를 195ml로 한 반응배지를 제조하였다. 이 반응배지에 배양세포 5g을 첨가하였다. 이 반응혼합액을 30℃에서 20시간 유지하고, 서서히 교반하여 세포에 의해 제조된 효소존재하에서 암모니아에 신남산이 반응 되도록 하였다.

소정시간후, 이 반응액을 원심분리하여 세포를 회수하였다. 상청액을 감압하에서 농축하고, 농축액에 황산을 가해 PH 1.5∼1.8으로 조절하였다.

황산산성화 조건하에 생긴 미반응 신남산의 침전을 여과에 의해 제거하고, 여액을 Amberlite IR-120(H⁺)에 통과시켰다. 통과후, 수지컬럼을 수세하고 0.25N 암모니아수로 역세정하였다. 이 결과의 용출액을 회수하고 증발건조시켜 조L-페닐알라닌 2.8g을 얻었다.

이 생성물을 아미노산 분석계에 의해서 L-페닐알라닌으로서 동일시하였다.

13. 형질전환체를 사용한 L-페닐알라닌의 제조

YAL합성배지(Bacto

Yeast Nitrogen Base 0.67%, 글루코오스 1.0%, 황산아데닌 0.001%, L-리신 0.005% 및 우라실 0.001% 로 구성)를 0.4㎛의 세공직경을 갖는 무균필터로 여과하여 살균하고, 200ml 씩 Sakaguchi 플라스크에 부었다. 이 배지에 형질전환체(S.Cerevisiae MT-40390)을 식균한후, 25℃에서 44시간 진탕배양하였다.

이 결과의 배양액 4ℓ를 원심분리하여 세포를 집균하였다. 이들 세포를 냉수로 세정하여 세정된 세포를 얻었다.

암모니아수 90ml 에 신남산 4g을 용해하고, 염산을 가해 PH9.5로 조절한후, 증류수로 희석하여 부피를 190ml 로 한 반응배지를 제조하였다. 이 반응배지에 세정세포 10g을 첨가하고, 서서히 교반하면서 30ℓ로 유지하고, 36시간 반응시켰다.

소정시간후, 반응혼합액을 감압하에 농축하고, 이 농축액에 염산을 가해 PH 2 이하로 조절하였다. 이 용액을 10℃에서 9시간 유지하고, 미반응신남산의 침전 및 불용성 세포를 여과에 의해 제거하고, 여액에 인산트리부틸을 동량첨가하여 신남산을 추출하였다.

추출후, 수층을 감압하에서 농축건조하여 고형분 4g을 얻었다. 이 고형분을 묽은 염산에 용해시켰다. 활성탄 1g을 첨가한후, 혼합액을 90℃로 10분간 가열하고, 이후에 여과하여 활성탄을 제거하였다. 따라서 맑은용액을 얻었다.

이 용액을 암모니아수로 PH 6.0으로 조절한후, 냉각하여 결정으로써 L-페닐알라닌을 얻었다. 이 결정을 여과에 의해 분리한후, 여액을 다시 냉각하여 침전된 결정을 회수하였고, 앞에서 얻은 L-페닐알라닌의 결정과 결합하였으며, 감압하에서 건조하였다. 따라서, L-페닐알라닌 2g을 결정으로서 얻었다.

14. L-페닐알라닌 암모니아-티아제를 사용한 L-페닐알라닌의 제조

상기 11에 기술한 바와 동일한 방법으로 미생물을 배양하였다. 집균하여 세정한 세포 30g으로부터, L-페닐알라닌 암모니아-리아제를 상기 11에 기술한 바와 동일한 방법으로 추출, 정제하였다. 정제한 L-페닐알라닌 암모니아-리아제를 8M NH₃를 함유하는 NH₄OH-(NH₄)₂SO₄완충액(PH 10.0) 20ml 에 용해하였다. 이 혼합액을 투석튜우브(Union Carbide Copr.제)에 넣고, 양쪽끝을 봉했다. 8M NH₃를 함유하는 NH₄OH-(NH₄)₂SO₄완충액(PH 10.0)200ml에 신남산 4g을 첨가해 제조한 반응혼합액에 이 튜우브를 침적시키고, 외부액으로 서서히 교반하면서 30℃에서 40시간 반응을 행하였다. 소정시간후, 13의 방법을 반복하여 L-페닐알라닌 2.0g을 얻었다.

[참조예 1]

[Rhodosporidum toruloides의 PAL을 코우드하는 염색체 DNA의 클로우닝]

Rhodosporidum toruloides의 염색체 DNA를 Gilbert 등(참고문헌 21)의 방법에 따라 제조하였다. 보다 상세하게, 이 미생물로부터 염색체 DNA를 추출한후, 제한효소 Pst I 및 Bcl I 으로 절단하였다. 이 결과의 DNA 단편을 아가로우즈겔 전기영동하고, 5.6kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 전기투석법에 의해 겔로부터 회수하였다.

리가아제를 사용하여, 이 DNA 단편을 제한효소 Pst I으로 절단하였던 pBR322과 결합하였다. 따라서, PAL 염색체 DNA를 갖는 pBR322로 구성되는 혼성플라스미드를 조립하였다.

이 혼성플라스미드를 사용하여, E.coli MC 1061을 형질전환하고, 대장균의 형질전환세포를 얻었다. 이 형질전환세포로부터, 신속 플라스미드 추출법(참고문헌 22)에 따라서 플라스미드 DNA를 추출, 정제하였다. 다음에, 플라스미드 DNA에 각종의 제한효소를 작용시켜, 플라스미드의 구조를 조사하였다.

[참조예 2]

[³²P-표식화한 PAL 단일사슬 cDNA의 합성]

실시예 2에 기술한 방법으로 PAL mRNA로부터 단일사슬 cDNA를 합성하는데 있어서, 반응혼합액중의 dCTP 대신에 α-³²P-dCTP를 사용하여³²P-표식화한 단일사슬 cDNA를 얻었다.

이 표식단일사슬 cDNA에 RNaseH을 작용시켜, mRNA를 소화한후, 페놀처리 및 냉에탄올침전에 의해 DNA를 회수하였다. 이와같이 해서 얻은 단일사슬 cDNA를 참조예 3에서 프로우브(Probe)로서 사용하였다.

[참조예 3]

[PAL 염색체 DNA와 pBR322로 구성된 혼성플라스미드를 함유하는 형질전환 대장균의 검출]

참조예 1에 기술한 방법으로 얻은 형질전환 대장균을 참조예 2의 방법으로 제조한³²P-표식 단일사슬 cDNA를 프로우브로서 사용하여 콜로니 혼성화를 행하였다(참고문헌 23).

형질전환 대장균으로부터 양성콜로니를 선택하고, 공지방법에 따라 이들 콜로니로부터 플라스미드를 추출,정제하였다. 이 플라스미드에 각종의 제한효소를 작용시킨후, 이 결과의 DNA 단편혼합물을 아가로우즈겔 전기영동을 행하였다. 따라서, 플라스미드의 제한효소 절단도를 작성하였다.

또한, 이 플라스미드에 PAL을 코우드하는 유전자가 삽입되어있는 것을 확인하기 위해 다음방법을 사용하였다. 맨먼저, 플라스미드를 제한효소 BamHI으로 절단하였다. 이 결과의 DNA 단편 혼합물을 아가로우즈겔 전기영동을 행한후, 3kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편으로부터, 비장 DNase I, 대장균 DNA 중합효소 I, α-³²P-dCTP를 사용한 니크번역방법에 따라³²P-표식 DNA 프로우브를 제조하였다.

한편, 실시예 1에서 제조한 PLA mRAN 함유하는 정제 mRNA를 글리옥살 처리에 의해 변성시킨후, 아가로우즈겔 전기영동을 행하였다. 전기영동의 종료후, 겔로부터 mRNA를 나일론종이에 전사하였다. 그리고나서, 상술한³²P-표식 DNA 프로우브를 사용한 northern 혼성화방법을 행하였다(참고문헌 24). 따라서, 상술한 혼성플라스미드에는 PAL 유전자를 함유하고 있다는 것을 확인하였다.

[참조예 4]

[PAL 유전자를 코우드하는 DNA의 크기의 확인]

참조예 3에 기술한 방법으로 확인된 PAL 염색체 DNA를 함유하는 혼성플라스미드를 형질전환 대장균으로부터 추출,정제한후, 각종의 제한효소를 작용시켰다. 이 결과의 DNA 단편혼합물을 아가로우즈겔 전기영동을 행하고, 분류한 DNA 단편을 니트로셀룰로오즈필터에 전사한후, 참조예 2의 방법에 따라 제조한³²P-표식단일사슬 cDNA 로 구성되는 프로우브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화 방법을 행하였다.

[참조예 5]

[트립토판(trp)프로모터 영역의 조립]

대장균의 trp 오페론의 일부를 함유하는 플라스미드 pVV1을 제한효소 Hinf I으로 소화하였다. 이 소화플라스미드의 DNA 단편을 아가로우즈겔 전기영동에 의해 분리하고, 실시예 1에 기술한 방법에 따라 겔로부터 0.9kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

Hinf I으로 소화시켜 생긴 0.9kb DNA 단편의 접착말단을, 실시예 8에 기술한 방법에 따라 평활말단으로 절환시킨후, EcoR I 링커(GGAATTCC)를 리가아제로 5'-말단에 결합하였다. 여기에 결합된 EcoR I 링커를 갖는 DNA 단편에 제한효소 EcoR I을 작용시켜 EcoR I 절단접착말단을 갖는 DNA 단편을 창제하였다(참고문헌 25).

EcoR I 접착말단을 갖는 DNA 단편을 pBR322의 EcoRI 소화물을 실시예 8에 기술한 방법에 따라 CIP로 처리하여 얻었던 DNA 단편에, 리가아제를 사용하여 결합하였다. 이 결과의 생성물을 제한효소 EcoR I 및 Bgl II 로 소화하고, 이 소화물을 아가로우즈겔 전기영동을 행하여, 0,4kb의 크기를 갖는 DNA 단편을 분리, 회수하였다.

제한효소 Tag I의 세 개의 절단위치를 갖는 이 DNA 단편을 Tag I으로 부분적으로 소화하여, 345bp의 크기를 갖는 DNA 단편을 회수하였다.

이 345bp DNA 단편을, pBR332를 EcoR I 및 Cla I으로 소화시켜 얻은 3.4bk DNA 단편에 결합하였다. 따라서, trp 프로모터를 함유하는 플라스미드 pFtrp2를 얻었다.

[참조예 6]

[PAL 활성의 측정]

PAL 생산능력을 가진 플라스미드를 함유하는 미생물을 배양하였다. 필요에 따라, 플라스미드의 프로모터의 기능을 향상시키는 유도처리를 행한후에 배양세포를 집균하였다.

세포벽을 파괴하고 세포내효소를 가용화하기 위해서, 세포를, 음파파쇄 또는 유리구슬파쇄등의 기계적처리, 또는 용균효소나 표면활성제로 처리하는 화학적방법을 행하였다. 따라서 세포추출물을 얻었다.

이후에, 세포추출물을 원심분리하고, 이 결과의 상청액을 시료로서 사용하였다.

PAL 활성은 L-페닐알라닌으로부터 신남산을 생성하는 효소반응으로 나타내기 때문에, 상술한 상청액을 25mM Tris-HCl완충액(PH 8.8)으로 희석하였고, 희석한 상청액 10ml를 5ml의 효소반응 배지[즉, 10mM L-페닐알라닌을 함유하는 25mM Tris-HCl 완충액(PH8.8)]에 첨가하였다. 이 반응혼합액을 30℃에서 20분간 배양한후, PAL 활성을 검사하였다.

보다 상세하게 1ml의 1N HCl을 첨가하여 반응을 정지시키고, 생성된 신남산을 액체크로마토그래피를 검출하였다.

액체크로마토그래피는 분리컬럼으로서 컬럼 YMC Pack-312(Yamamura Clemical Laboratory Co.제)를 사용하여 행하였다. 검출목적을 위해서, 자외선분광 광도계를 검출파장 260mm에서 사용하였다.

PAL 의 아미노산 배열

이 미생물군주 중에서, ATCC 번호를 갖는 균주들은 미국의 "American Type Culture Collection"(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, U.S.A.)에 기탁되어 있고, FERM번호를 갖는 군주들은 일본국의 "Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology"(일본국 이바라끼껭쯔꾸바군 야다베마찌)에 기탁되어있다.

Claims

아래의 아미노산 배열을 가진 L-페닐알라닌 암모니아리아제:
L-페닐알라닌 암모니아리아제 구조유전자로서 기능하고, 아래에 나타내는 1부터 716까지의 아미노산을 이 순서로 코우드 되어 있는 DNA 배열:
DNA 배열이 제2항에 기재한 1부터 716까지의 아미노산 배열을 이 순서로 코우드하고, 제2항의 DNA 배열과 실질적으로 구조유전자로서 동일한 기능을 갖는 L-페닐알라닌 암모니아리아제 구조유전자.
제2항 또는 제3항에 있어서, C-말단에 정지코돈을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 배열.
제4항에 있어서, 정지코돈이 TAG 또는 TAA를 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 배열.
Rhodosporidum toruloides로부터 유도된 L-페닐알라닌 암모니아리아제를 코우드하는 DNA의 제조방법이, (a) L-페닐알라닌 암모니아리아제를 도입할 수 있는 조건하에서 효모 Rhodosporidum toruloides를 배양하고, (b)이 효모세포로부터 L-페닐알라닌 암모니아리아제 mRNA를 함유하는 분획을 분리하고, (c) 역 전사에 의해 mRNA로부터 단일사슬 cDNA를 발생하고, (d)이 단일사슬 cDNA을 이중사슬로 전환하고, (e)이중사슬 cDNA을 벡터내에 삽입시키고, (f) 벡터로 숙주세포를 형질전환하고, (g) cDNA 의 서고(library)를 생성하고, (h) 서고로부터 L-페닐알라닌 암모니아리아제 구조유전자를 코우드하는 cDNA를 복제증식하는 과정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 L-페닐알라닌 암모니아리아제 구조유전자를 코우드하는 DNA 의 제조방법.
조환형 DNA 플라스미드가, 제1항에 기재된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 배열의 DNA 사슬을, 벡터내에 통합시킨 발현벡터로 구성되는 것을 특징으로하는 조환형 DNA 플라스미드.
제7항에 있어서, DNA 사슬이, 프로모터의 3'-말단에 터미네이터의 5'-말단과의 사이에 위치되도록 발현벡터내에 통합시키는 것을 특징으로하는 조환형 DNA 플라스미드.
제7항에 있어서, 조환형 DNA 플라스미드가 신규의 조환형 DNA 플라스미드 pSW101인 것을 특징으로 하는 조환형 DNA 플라스미드.
제7항에 있어서, 조환형 DNA 플라스미드가 신규의 조환형 DNA 플라스미드 pYtrp6인 것을 특징으로 하는 조환형 DNA 플라스미드.
제7항에 있어서, 조환형 DNA 플라스미드가 신규의 조환형 DNA 플라스미드 pky201인 것을 특징으로 하는 조환형 DNA 플라스미드.
제7항의 조환형 DNA 플라스미드를 갖는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 L-페닐알라닌 암모니아리아제의 생산능력을 갖는 조환형 미생물.
제12항에 있어서, 조환형 미생물이, 신규의 형질전환체 대장균 MT10410(FERM-8834)(한국기탁번호:KFCC-10470)인 것을 특징으로 하는 조환형 미생물.
제12항에 있어서, 조환형 미생물이, 신규의 형질전환체 대장균 MT10410(FERM-8876)(한국기탁번호:KFCC-10472)인 것을 특징으로 하는 조환형 미생물.
제12항에 있어서, 조환형 미생물이, 신규의 형질전환제 빵효모 MT40390(FERM-8875)(한국기탁번호:KFCC-10471)인 것을 특징으로 하는 조환형 미생물.
L-페닐알라닌 암모니아리아제의 제조방법에 있어서, 제12항의 조환형 미생물을 배양하여, 배양액중에 L-페닐알라닌 암모니아리아제를 생성, 축적시키는 것을 특징으로 하는 L-페닐알라닌 암모니아리아제의 제조방법.
제12항의 조환형 미생물을 사용하여 제조한 L-페닐알라닌 암모니아리아제.
L-페닐알라닌의 제조방법에 있어서, 제12항의 조환형 미생물을 배양하여, 배양액중에 L-페닐알라닌 암모니아리아제를 생성, 축적시키고, 생성된 L-페닐알라닌 암모니아리아제의 존재하에 암모니아 공여체를 신남산과 반응시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 L-페닐알라닌의 제조방법.