JP2003038195A - 融合蛋白質より有用蛋白質を取得する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、融合蛋白質より所望の蛋白質を取
得するための選択的な切断方法に関する。また、本発明
は連結部分やその周辺部分のアミノ酸配列を酵素的に切
断することを特徴とする融合蛋白質より所望の蛋白質を
取得する方法に関する。 【解決手段】 特定アミノ酸配列のペプチドと特定分子
量の蛋白質とを連結した融合蛋白質に対し連結部分また
はその周辺部分の配列を酵素分解により選択的に切断し
所望の蛋白質を特異的に取得する工程において、配列に
非特異的な或いは特異性の低いエンドプロテアーゼを用
いることを特徴とする融合蛋白質より有用蛋白質を取得
するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質より所
望の蛋白質を取得するための選択的な切断方法に関す
る。また、本発明は連結部分やその周辺部分のアミノ酸
配列を酵素的に切断することを特徴とする融合蛋白質よ
り所望の蛋白質を取得する方法に関する。本発明は、通
常の方法では選択的に切断し難い融合蛋白質などに有用
である。また、本発明によって、非常に安価に克つ簡便
に融合蛋白質より所望の蛋白質を調製することが可能と
なる。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学の進歩は、これまで天然物か
ら精製していた蛋白質を遺伝子レベルで解析し、目的蛋
白質を人工的に増幅させることを可能にした。その後発
明されたチオレドキシン（特表平５−５０７２０９）
や、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
（特表平１−５０３４４１）等を融合させたＤＮＡ配列
の応用によって、本来発現しにくいような蛋白質をも発
現させることができるようになり、融合蛋白質を発現さ
せる技術は広く用いられるようになった。更に、これら
の融合蛋白質は融合させたペプチドに結合する化合物を
担体として利用することにより簡便に精製することが可
能であり、精製のステップを大幅に簡略化できる。この
ような目的から、融合蛋白質調製に用いることを目的と
した特定のアミノ酸配列のペプチド（タグ）が種々開発
されてきた。結果として、隣接するヒスチジン残基を含
む親和性ペプチド（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（特開昭６３−２
５１０９５）やマルトース結合蛋白質（特開平１−２０
０９４）などと所望の蛋白質を連結部分を介して融合さ
せ、作成した融合蛋白質をアフィニティークロマトグラ
フィー技術等を用いて簡便に精製する技術が確立してい
る。しかしながら、融合蛋白質より所望の蛋白質を取得
するためには融合させたペプチドを切断、除去する必要
がある。融合蛋白質が所望の蛋白質と実質的に同等の特
性、生理活性を有する場合は、融合蛋白質をそのまま応
用に用いることが可能であるが、このようなことは稀で
ある。多くの融合蛋白質は融合させたペプチドの影響を
受け、その特性や生理活性が少なからず変化する。融合
させたペプチドを除去する方法としては酵素的に切断す
る方法と化学反応による方法が考えられるが、所望の蛋
白質を安定な状態で取得するため一般的には酵素的に切
断する方法が採用される。酵素的切断方法とは、所望の
蛋白質と融合させたペプチドとの間の連結部分に配列特
異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列をあらかじめ入れ
ておき、対応する配列特異的プロテアーゼを作用させて
融合させたペプチドを除去する方法である。配列特異的
プロテアーゼは特定のアミノ酸配列のみを認識し切断す
ることができる酵素で、所望の蛋白質を切断してしまう
心配が無い。しかしながら、配列特異的プロテアーゼは
非常に高価であり実用的酵素の創製に本方法を用いるこ
とは現実的ではなく、安価でしかも配列特異的プロテア
ーゼと同等の効果と簡便性が得られる新しい方法が望ま
れていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このような理由から、
安価で簡便に融合蛋白質の選択的な切断をおこなう方法
が求められていた。すなわち本発明の目的は、安価に克
つ簡便な方法で融合蛋白質を選択的に切断する方法を提
供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】我々は、非特異的エンド
プロテアーゼを用いることにより、タグと蛋白質とを連
結した融合蛋白質を切断することが可能となることを見
出し、本発明に至った。さらに詳しくは、非特異的エン
ドプロテアーゼを用いることにより、連結部分のアミノ
酸配列が特定のアミノ酸配列を有する融合蛋白質より有
用蛋白質を取得することが可能となることを見出し、本
発明に至った。これまで、非特異的エンドプロテアーゼ
は特定の配列を認識せず蛋白質を複数の箇所で切断する
と考えられてきたため、融合蛋白質を選択的に切断する
方法に用いることは不可能と思われていた。しかしなが
ら、我々は種々の検討をおこない、非特異的エンドプロ
テアーゼを用いて連結部分のアミノ酸配列が特定のアミ
ノ酸配列を有する融合蛋白質より有用蛋白質を取得する
ことを可能とした。

【０００５】すなわち本発明は、以下の構成からなる。 ［１］タグと、蛋白質とを、連結した融合蛋白質を、非
特異的エンドプロテアーゼで切断する方法。 ［２］タグと蛋白質とを連結した融合蛋白質に対し、蛋
白質部分の配列を切断することなく、連結部分またはそ
の周辺部分の配列を切断し所望の蛋白質を取得する工程
において、非特異的エンドプロテアーゼを用いることを
特徴とする融合蛋白質より有用蛋白質を取得するための
方法。 ［３］連結部分のアミノ酸配列が式（１）で表されるこ
とを特徴とする［２］に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-(Xaa)n-Y（１） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。Xaaは任
意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜５０の整数であ
る。] ［４］連結部分のアミノ酸配列が式（２）で表されるこ
とを特徴とする［２］に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-(Xaa)n-Y（２） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。Xaaは任
意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜４０の整数であ
る。] ［５］連結部分のアミノ酸配列が式（３）で表されるこ
とを特徴とする［２］に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-Y（３） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。] ［６］タグが隣接するヒスチジン残基を含む親和性ペプ
チドであることを特徴とする［１］〜［５］に記載の方
法。 ［７］蛋白質がＤＮＡバインディングプロテインである
ことを特徴とする［１］〜［６］に記載の方法。 ［８］非特異的エンドプロテアーゼがプロティナーゼ
Ｋ、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼよ
り選ばれることを特徴とする［１］〜［７］に記載の方
法。 ［９］非特異的エンドプロテアーゼがプロティナーゼＫ
であることを特徴とする［８］に記載の方法。

【０００６】本発明において、非特異的エンドプロテア
ーゼとは、特定の配列を認識せず蛋白質を複数の箇所で
切断できるプロテアーゼをいう。詳しくは、蛋白質と反
応させたときには特定の配列を認識せず蛋白質を複数の
箇所で切断するが、本発明による該蛋白質の融合蛋白質
と反応させたときには、蛋白質部分の配列を切断するこ
となく、連結部分またはその周辺部分の配列を切断する
プロテアーゼをいう。

【０００７】さらに詳しくは、下記のいずれかの性質を
有するプロテアーゼである。例えば、（ａ）１ｇ／Ｌの
プロテアーゼを２０ｍＭ、ｐＨ７．５のTris−HCｌ緩衝
液中で３ｇ／Ｌの蛋白質と３７℃で３０分反応させたと
きの収率が６０％以上であるが、（ｂ）同条件で本発明
による該蛋白質の融合蛋白質と反応させたときの所望の
蛋白質の収率が４０％を超える様な性質をもつプロテア
ーゼである。好ましくは、（ａ）において、蛋白質の収
率が８０％以上であるが、（ｂ）において本発明による
所望の蛋白質の収率が７０％を超える様な性質をもつプ
ロテアーゼであり、さらに好ましくは、（ａ）におい
て、蛋白質の収率が９５％以上であるが、（ｂ）におい
て本発明による所望の蛋白質の収率が９０％を超える様
な性質をもつプロテアーゼである。収率は、酵素などの
場合は活性を測定すること等により、あるいはイムノア
ッセイなどにより求めることが出来る。すなわち、プロ
テアーゼで処理する前後の活性あるいはイムノアッセイ
値の比率を求めることにより、収率を求めることができ
る。

【０００８】あるいは、例えば、１ｇ／Ｌのプロテアー
ゼを２０ｍＭ、ｐＨ７．５のTris-HCl緩衝液中で３ｇ／
Ｌの蛋白質と３７℃で３０分反応させたとき、生成する
分解産物のうち最も量の多い分解産物の全体に対する比
率が４０％を超えない様な性質をもつプロテアーゼであ
る。好ましくは、最も量の多い分解産物の全体に対する
比率が２０％を超えない様な性質をもつプロテアーゼで
ある。さらに好ましくは、最も量の多い分解産物の全体
に対する比率が１０％を超えない様な性質をもつプロテ
アーゼである。分解産物の比率は例えばＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅなどのデータから計算により求めることが出来る。す
なわち、反応液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を一次元画像
解析装置、デンシトメーターにかけ、各分解産物のバン
ドの濃度を数値として算出することにより比率を求める
ことができる。

【０００９】本発明の方法において対象となる蛋白質の
性質については特に問わないが、特定の分子量を有する
単一の蛋白質であることが好ましい。

【００１０】本発明における融合蛋白質の選択的な切断
方法は、以下の工程によって行われるのが好ましい。即
ち、（１）タグと対象となる蛋白質とを連結した融合蛋
白質をコードする遺伝子の作成。（２）融合蛋白質の合
成。（３）融合蛋白質の調製。（４）融合蛋白質の連結
部分またはその周辺部分の配列の酵素分解。（５）所望
の蛋白質の調製。ただ、（４）〜（５）の工程はまとめ
ても実質的に同様の結果が得られることになると思われ
る。

【００１１】本発明において、用いられる融合蛋白質の
合成手段は特に問わない。方法としては、従来からおこ
なわれてきた遺伝子工学的手法やその変法、および蛋白
質工学的手法などを用いることができる。具体的には、
タグと蛋白質とを遺伝子レベルで連結し、作成した融合
蛋白質遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて組換え菌で発
現させて合成することができる。更に、培養・精製技術
を用いることにより融合蛋白質の純度を高め、実質的に
単一の蛋白質標品を得ることも可能である。微生物の遺
伝子操作系を用いて目的の蛋白質を得る一般的な方法を
以下に記す。

【００１２】本発明の蛋白質の遺伝子を得る方法として
は、例えば染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破
砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、
リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または
接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖さ
せて組換えベクターを構築する。こうして得られた組換
えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベク
ターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリー
ニングして、所望の蛋白質をコードする遺伝子を含有す
る組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微
生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離
・精製し、該組換えベクターから所望の蛋白質の遺伝子
を採取すれば良い。

【００１３】染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のよう
に採取される。すなわち、供与生物を例えば１〜３日間
撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次
いでこれを溶菌させることにより遺伝子の含有溶菌物を
調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリ
ゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が
施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリ
ル硫酸ナトリウム（SDS)等の界面活性剤が併用され、さ
らに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕
方法と組み合わせても良い。このようにして得られた溶
菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例
えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処
理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理など
の方法を適宜組み合わせることによりおこなうことがで
きる。分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例え
ば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
る。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型
制限酵素が適している。

【００１４】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia col
i）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10、Lambda
-gt11などが使用できる。またプラスミドとしては、例
えばエシェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合に
は、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９、pBluescript 、ｐＬＥ
Ｄ−Ｍ１(Journal of Fermentation and Bioenzineerin
g, Vol.76, 265-269 (1993))などが使用できる。このよ
うなベクターを、上述した染色ＤＮＡの切断に使用した
制限酵素で切断してベクター断片を得ることができる
が、必ずしも染色体ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と
同一の制限酵素を用いる必要はない。染色体ＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤ
ＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば染色体
ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのア
ニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により染
色体ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクタ
ーを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生
物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベ
クターを作成することもできる。

【００１５】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できる
ものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3
110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリ
ーHB101、エシェリヒア・コリーJM109などを用いること
ができる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法
としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの
場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法や
エレクトロポレーション法などが用いることができる。
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄
養培地で培養されることにより、多量の蛋白質を安定に
生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入
の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持する
ベクターの薬剤耐性マーカーを発現する微生物を検索す
れば良い。上記の方法により得られた組換えベクター
は、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入
することも容易に実施することができる。また、制限酵
素やＰＣＲにより蛋白質をコードする遺伝子であるＤＮ
Ａを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物
に移入することも容易に実施できる。

【００１６】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
ればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的
には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源
としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使
用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であ
ればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクト
ース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸な
どが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが
使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必
要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、目的の
蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培
養時間は条件によって多少異なるが、目的の蛋白質が最
高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了
すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨ
は菌が発育し目的の蛋白質を生産する範囲で適宜変更し
得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度であ
る。

【００１７】培養物中の目的の蛋白質を生産する菌体を
含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、
一般には、常法に従って目的の蛋白質が培養液中に存在
する場合は濾過、遠心分離などにより、目的の蛋白質を
含有する溶液と微生物菌体とを分離した後に利用され
る。目的の蛋白質が菌体内に存在する場合には、得られ
た培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体
を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチー
ムなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴ
Ａ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して目的
の蛋白質を可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００１８】このようにして得られた目的の蛋白質を含
有する溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水
性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン
などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。ま
た、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。そ
の後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことによ
り、精製された目的の蛋白質を得ることができる。例え
ば、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシア
バイオテク）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL
-6B(ファルマシア バイオテク）、オクチルセファロー
スCL6-B(ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグ
ラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ること
ができる。この精製酵素標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的
に、ほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。

【００１９】また、無細胞蛋白質合成法を用いて融合蛋
白質を合成しても良い。無細胞蛋白質合成法を用いた蛋
白質の合成は、近年のバイオテクノロジーの進展にとも
ないその利用価値が急速に注目されるようになりつつあ
る。無細胞蛋白質合成は生体の蛋白質合成に関係する成
分を生体外へ取り出し、目的蛋白質をコードするmRNAと
ATP、GTPなどのエネルギー源を添加することにより、半
人工的に蛋白質を合成する手段である。その生体材料と
しては、大腸菌、網状赤血球や、コムギ胚芽が用いられ
ることが多く、現在までに様々な調製方法や利用方法が
検討されている。組換え微生物や培養細胞などを用いる
蛋白質の合成方法に対し無細胞蛋白質合成法の利点は、
１）生体に負に作用するような蛋白質（翻訳系に影響を
及ぼすものは除く）の合成が比較的容易である、２）簡
便に条件を決定することができる（微生物などを用いる
場合、最低一ヶ月程度を要するのが普通である）、３）
非天然型アミノ酸を用いることができる、ことなどを挙
げることができる。

【００２０】本発明において、融合蛋白質の連結部分ま
たはその周辺部分の配列を酵素的に分解するために使用
される配列非特異的プロテアーゼの由来は特に問わない
が、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼなどに
属するプロテアーゼ、具体的にはプロティナーゼＫ、ト
リプシン、キモトリプシン、サチライシン、Ｖ８プロテ
アーゼなどを用いることが好ましい。プロテアーゼによ
る分解反応の条件は各プロテアーゼの酵素的性質に依存
するが、一般的にはＧＯＯＤバッファーやリン酸バッフ
ァーなどの緩衝液で反応液のｐＨを固定し、１０〜９０
℃で５分間〜２４時間反応させる。詳しくは、例えば、
中性プロテアーゼを弱酸性〜弱アルカリ性のTris−HCｌ
緩衝液中で２０〜８０℃で１０分〜１６時間反応させ
る。 あるいは、アルカリプロテアーゼをｐＨ８〜１１
のＧＯＯＤバッファー中で１０〜６０℃で３０分〜１６
時間反応させる。

【００２１】本発明で使用される融合蛋白質は合成した
後その溶液をそのまま使用しても良いが、精製したもの
を用いても良い。好ましくは、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシアパトイト、ま
たは等電点クロマトグラフィーを用いて高純度に精製す
る。さらに好ましくは、チオレドキシンやＧＳＴ、Ｈｉ
ｓ−ｔａｇ、マルトース結合蛋白質など融合させる特定
のアミノ酸配列のペプチドを特異的に認識し吸着するこ
とを利用した精製方法によりアフィニティー精製するこ
ともできる。

【００２２】本発明で用いる蛋白質は、酵素に限定され
ず、何らかの形で存在を確認可能なものであれば良い。
酵素としては、ウリカーゼ，カタラーゼ，アミンオキシ
ダーゼ，グルコースオキシダーゼ，アミノ酸脱水素酵
素，ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡリガーゼ，制限酵素，
プロテインキナーゼ，プロテアーゼ，リパーゼ，アミラ
ーゼなど、その他存在を確認可能な蛋白質としてＤＮＡ
結合蛋白質，レセプター蛋白質，シャペロニン，サイト
カイン，ホルモン様蛋白質などが挙げられる。

【００２３】本発明の一態様は、融合蛋白質より所望の
蛋白質を簡便かつ安価に取得する方法である。また、本
発明の別な態様は、蛋白質精製・構造解析の研究に関す
る試薬系である。本発明を使用することにより、今まで
の技術では安価に精製することが困難であった蛋白質の
簡便な調製が可能となりうる。また、構造解析の材料供
給において効率よく目的の蛋白質を調製することが可能
となる。

【００２４】

【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとするが、こ
れに限定されるものではない。 実施例１ 融合蛋白質をコードする遺伝子の作成 所望の蛋白質として、尿酸測定臨床検査薬に使用する実
用的酵素であるバチルス・エスピー（Bacillus sp.）TB
90株由来ウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ,EC1.7.3.3）を
取り上げた。特定のアミノ酸配列を有するペプチドとし
て、隣接するヒスチジン残基を含む親和性ペプチド、具
体的には６つのヒスチジン残基が並んだ６ｘＨｉｓ−ｔ
ａｇを取り上げ、これがウリカーゼのカルボキシル末端
に連結部分を介して結合した融合蛋白質をコードする遺
伝子の作成を下記の手順にておこなった。作成の流れ
は、図1においても示した。ウリカーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＵＯＤ（特開平２−５３４８８広報）(Journ
al of Biochemistry, Vol.119, 80-84 （1996）)（バ
イオインダストリー,Vol.13, 20-28（1996））を鋳型
として、以下の組成および条件にてポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）をおこない融合蛋白質遺
伝子を作成するためのウリカーゼ遺伝子を調製した。 ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡製）） １μｌ 鋳型（ｐＵＯＤ） ０．０５ｎｇ プライマー（１）（配列表の配列番号１記載） ２５ｐｍｏｌｅ プライマー（２）（配列表の配列番号２記載） ２５ｐｍｏｌｅ ｘ１０ バッファー（東洋紡製） ５μｌ ２ｍＭ ｄＮＴＰ（東洋紡製） ５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＳＯ４（東洋紡製） ４μｌ 全液量：５０μｌ ＰＣＲ条件： ９４℃,２分間 ↓ ９４℃,１５秒間→５０℃,３０秒間→６８℃,１分間 （３０サイクル） ↓ ６８℃,２分間 ＰＣＲ産物として取得したウリカーゼ遺伝子の配列を配
列表の配列番号３に、ウリカーゼのアミノ酸配列を配列
表の配列番号４に、それぞれ記載した。取得したウリカ
ーゼ遺伝子はＰＣＲ産物精製キット（MagExtractor-PCR
&Gel Clean Up-（東洋紡製））にてプロトコール通りに
精製し、制限酵素EcoRIとPstIにて切断し、同様にEcoRI
とPstIにて切断した発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ア
マーシャム・ファルマシア社製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結した。得られたウリカーゼ遺伝子の発現プ
ラスミドをｐＵＯＤＳＰ１と命名した（図１）。ｐＵＯ
ＤＳＰ１を制限酵素SmaIとPstIで切断し、ウリカーゼ遺
伝子のカルボキシル末端側を開裂した。これに配列表の
配列番号５および６記載の配列を有する合成オリゴヌク
レオチドをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、最終的
に６つのヒスチジン残基が並んだ６ｘＨｉｓ−ｔａｇが
ウリカーゼのカルボキシル末端に連結部分を介して結合
した融合蛋白質をコードする遺伝子を含む発現プラスミ
ド、ｐＵＯＤＳＰ１−ＨＴを作成することができた（図
１）。作成した融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を
配列表の配列番号７に、融合蛋白質のアミノ酸配列を配
列表の配列番号８に、それぞれ記載した。

【００２５】実施例２ 融合蛋白質の調製 ｐＵＯＤＳＰ１−ＨＴでエシェリヒア・コリーJM109の
コンピテントセル（Competent High（東洋紡製））を形
質転換し、融合蛋白質生産組換え菌JM109/ｐＵＯＤＳＰ
１−ＨＴを調製した。これを５０ｍｌ・ＴＢ−ｂｒｏｔ
ｈを含む５００ｍｌ容量フラスコに植菌し、３７℃で１
７時間培養した。培養液より菌体を遠心分離にて集菌し
バッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）,３５０ｍＭ ＮａＣｌ）にて懸濁後、超音波破砕
にて蛋白質を抽出した。破砕上清をニッケルキレート・
カラムクロマトグラフィー（HiTrap-Chelating-（アマ
ーシャム・ファルマシア社製））に通し、製造者のプロ
トコールに従いバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）, ３５０ｍＭ ＮａＣｌ,５００ｍ
Ｍ イミダゾール）にて溶出した。更に、溶出液をＳｅ
ｐｈａｄｅｘＧ−２５脱塩・カラムクロマトグラフィー
（Hitrap-Desalting-（アマーシャム・ファルマシア社
製））に通し、製造者のプロトコールに従いバッファー
Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））にて
溶出、バッファー置換し、融合蛋白質の精製標品を調製
した。破砕上清および精製蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルによる分析結果を、図２に示した。

【００２６】実施例３ 非特異的プロテアーゼによる処
理と所望の蛋白質の調製 融合蛋白質の精製標品を、プロティナーゼＫ（ナカライ
テスク社製）の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液にて処理した。５０μｌ融合蛋白質：約２ｍｇ
／μｌに対しプロティナーゼＫ：約０．１〜１μｇ／ｍ
ｌの終濃度で添加し、３７℃で３０分間処理した。反応
は、プロティナーゼＫの阻害剤であるＰＭＳＦ（フッ化
フェニルメチルスルホニル（ナカライテスク社製））を
終濃度１ｍＭ分添加して終結させた。結果として、プロ
ティナーゼＫの処理濃度に伴い融合蛋白質のカルボキシ
ル末端が選択的に切断され、所望の蛋白質であるウリカ
ーゼを得ることができた。融合蛋白質のプロティナーゼ
Ｋ処理産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる分
析結果を、図２に示した。融合蛋白質の連結部分がプロ
ティナーゼＫの酵素分解作用により切断を受け、６ｘＨ
ｉｓ−ｔａｇペプチドが除かれ、ウリカーゼが調製され
ていく様子が分析結果より明らかとなった。非特異的プ
ロテアーゼによる融合蛋白質の連結部分の切断は、ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦＦ−ＭＡＳＳによる質量分析によっても
確認された。非特異的プロテアーゼによる融合蛋白質の
選択的切断は連結部分または連結部分とその周辺部分の
構造的な特徴にあると推察されるが、現時点では詳細な
基礎的メカニズムは明らかとなっておらず、応用面での
有用性のみが判明している。従って、連結部分のアミノ
酸配列が式（１）で表されることを特徴とする、 X-Met-Phe-Ser-(Xaa)n-Y（１） [式中、Xは特定分子量の蛋白質を意味しYは特定アミノ
酸配列のペプチドを意味する。Xaaは任意のアミノ酸残
基を意味する。nは０〜５０の整数である。] 或いは連結部分のアミノ酸配列が式（２）で表されるこ
とを特徴とする、 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-(Xaa)n-Y（２） [式中、Xは特定分子量の蛋白質を意味しYは特定アミノ
酸配列のペプチドを意味する。Xaaは任意のアミノ酸残
基を意味する。nは０〜４０の整数である。]或いは連結
部分のアミノ酸配列が式（３）で表されることを特徴と
する、 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-Y（３） [式中、Xは特定分子量の蛋白質を意味しYは特定アミノ
酸配列のペプチドを意味する。] 新規な方法としての情報が実施例として開示された。

【００２７】実施例４ 融合蛋白質のアフィニティー・
ビーズへの結合と非特異的プロテアーゼ処理による所望
の蛋白質の調製Ｉ 本特許の方法を利用すれば、従来は費用面から実質的に
困難であった融合蛋白質をアフィニティー・ビーズへ結
合させ配列選択的切断により所望の蛋白質を取得すると
いう手法が可能になる。この手法が可能となることによ
り、蛋白質のハイスループット精製が簡便に実施可能と
なる。本特許の方法による蛋白質のハイスループット精
製のフローの一例を図３に示した。実施例２と同様に、
融合蛋白質生産組換え菌JM109/ｐＵＯＤＳＰ１−ＨＴを
ＴＢ−ｂｒｏｔｈに植菌し、３７℃で１７時間培養し
た。培養液より菌体を遠心分離にて集菌しバッファーＡ
にて懸濁後、超音波破砕にて蛋白質を抽出した。破砕液
をニッケルキレート・磁性体ビーズ（MagExtractor-His
-tag-（東洋紡製））に吸着させ、製造者のプロトコー
ルに従い添付バッファーにてビーズを洗浄した。この操
作で、融合蛋白質が吸着した磁性体ビーズが調製され
る。この磁性体ビーズをプロティナーゼＫ（ナカライテ
スク社製）の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液にて処理し、所望の蛋白質を溶出させた。融合
蛋白質吸着磁性ビーズ２０μｌ容量に対しプロティナー
ゼＫ溶液を約１〜４μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ添加
し、３７℃で６０分間処理した。結果として、プロティ
ナーゼＫの処理濃度に伴い融合蛋白質のカルボキシル末
端が選択的に切断され、所望の蛋白質であるウリカーゼ
を得ることができた。磁性体ビーズのプロティナーゼＫ
処理産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる分析
結果を、図３に示した。融合蛋白質の連結部分がプロテ
ィナーゼＫの酵素分解作用により切断を受け、６ｘＨｉ
ｓ−ｔａｇペプチドが磁性体ビーズに吸着した状態で所
望の蛋白質が溶出され、固液分離により所望の蛋白質を
含む溶液が調製されていく様子が分析結果より明らかと
なった。非特異的プロテアーゼによる融合蛋白質の連結
部分の切断は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ−ＭＡＳＳによる
質量分析によっても確認された。 実施例５ 融合蛋白質のアフィニティー・ビーズへの結
合と非特異的プロテアーゼ処理による所望の蛋白質の調
製II 本特許の方法を利用すれば、ＤＮＡバインディングプロ
テインのハイスループット精製も簡便に実施可能とな
る。ＤＮＡバインディングプロテインの融合蛋白質をコ
ードする遺伝子の配列を配列表の配列番号９に、融合蛋
白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１０に、それぞ
れ記載した。実施例４と同様に、ＤＮＡバインディング
プロテインの融合蛋白質生産組換え菌をＴＢ−ｂｒｏｔ
ｈに植菌し、３７℃で１７時間培養した。培養液より菌
体を遠心分離にて集菌しバッファーＡにて懸濁後、超音
波破砕にて蛋白質を抽出した。破砕液をニッケルキレー
ト・磁性体ビーズ（MagExtractor-His-tag-（東洋紡
製））に吸着させ、製造者のプロトコールに従い添付バ
ッファーにてビーズを洗浄した。この操作で、融合蛋白
質が吸着した磁性体ビーズが調製される。この磁性体ビ
ーズをプロティナーゼＫ（ナカライテスク社製）の２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて処理
し、所望のＤＮＡバインディングプロテインを溶出させ
た。磁性ビーズ２０μｌ容量に対しプロティナーゼＫ溶
液を約１〜４μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ添加し、３
７℃で６０分間処理した。結果として、プロティナーゼ
Ｋの処理濃度に伴い融合蛋白質のカルボキシル末端が選
択的に切断され、所望のＤＮＡバインディングプロテイ
ンを得ることができた。なお、本実施例では磁性体ビー
ズを用いているため、固液分離は遠心分離をおこなわず
とも磁石を用いて非常に簡便に実施することができる。
磁石を用いた磁性体ビーズの固液分離システムは自動化
も容易であり、実際、自動化装置が既に開発、販売され
ている（MFX-2000, MFX-6000, MFX-9600（東洋紡
製））。従って、これらの装置と本特許の方法を組合せ
ることにより、蛋白質のハイスループット精製は容易に
実現できる。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、今までの技術では困難で
あった非特異的プロテアーゼによる融合蛋白質の選択的
な切断が可能となる。これにより、融合蛋白質より所望
の蛋白質を簡便克つ安価に調製することが可能となる。
また、本方法のコスト面での優位性を活かして、従来は
コスト的に難しかった蛋白質のハイスループット・スク
リーニングへの応用が期待できる。

【００２９】

【配列表】 <110> Toyo Boseki Kabushiki Kaisya <120> Specific cleavage method of fusion protein <130> 01-0504 <141> 2001-07-03 <160> 8 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 1 aaacagaatt cgagctcgcg c 21

【００３０】 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide for PCR primer, described in example No.1 <400> 2 gatatctgca gtcacccggg tttaagtgct cctttatgat c 41

【００３１】 <210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Bacillus sp.TB-90 <400> 3 aaacagaatt cgagctcgcg caatgtttcg tttgcaagaa atatttcgtg aaggagagaa 60 taattcg atg acc aaa cac aaa gaa aga gtg atg tat tat gga aaa ggt 109 Met Thr Lys His Lys Glu Arg Val Met Tyr Tyr Gly Lys Gly 1 5 10 gac gta ttt gct tat cgc acc tat tta aaa cca ctt act gga gtt aga 157 Asp Val Phe Ala Tyr Arg Thr Tyr Leu Lys Pro Leu Thr Gly Val Arg 15 20 25 30 acg att cct gaa tct cca ttt tcc ggt cga gat cat att ctt ttt gga 205 Thr Ile Pro Glu Ser Pro Phe Ser Gly Arg Asp His Ile Leu Phe Gly 35 40 45 gta aat gta aaa atc tca gta gga gga aca aaa ttg ctg acc tcc ttt 253 Val Asn Val Lys Ile Ser Val Gly Gly Thr Lys Leu Leu Thr Ser Phe 50 55 60 acg aaa ggg gat aac agc tta gtc gtt gca aca gac tcg atg aaa aac 301 Thr Lys Gly Asp Asn Ser Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Met Lys Asn 65 70 75 ttt ata caa aaa cat tta gct agt tat aca gga aca acg ata gaa ggt 349 Phe Ile Gln Lys His Leu Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Thr Ile Glu Gly 80 85 90 ttt tta gaa tat gta gct act tct ttt ttg aag aaa tat tct cat att 397 Phe Leu Glu Tyr Val Ala Thr Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Ser His Ile 95 100 105 110 gaa aag att tcg ttg ata gga gag gaa att ccc ttt gaa aca act ttt 445 Glu Lys Ile Ser Leu Ile Gly Glu Glu Ile Pro Phe Glu Thr Thr Phe 115 120 125 gca gta aag aat gga aat aga gca gct agt gag cta gta ttt aaa aaa 493 Ala Val Lys Asn Gly Asn Arg Ala Ala Ser Glu Leu Val Phe Lys Lys 130 135 140 tca cga aat gaa tat gcc acc gct tat ttg aat atg gtt cgt aat gaa 541 Ser Arg Asn Glu Tyr Ala Thr Ala Tyr Leu Asn Met Val Arg Asn Glu 145 150 155 gat aac acc cta aac att act gaa caa caa agc gga ctt gct ggt ctt 589 Asp Asn Thr Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Ser Gly Leu Ala Gly Leu 160 165 170 caa tta ata aaa gtc agc gga aat tcc ttt gtc ggt ttt att cgt gac 637 Gln Leu Ile Lys Val Ser Gly Asn Ser Phe Val Gly Phe Ile Arg Asp 175 180 185 190 gaa tac aca act ctt cca gag gat tca aac cgc cct cta ttt gtt tac 685 Glu Tyr Thr Thr Leu Pro Glu Asp Ser Asn Arg Pro Leu Phe Val Tyr 195 200 205 tta aac atc aaa tgg aag tac aaa aac acg gaa gac tca ttt gga acg 733 Leu Asn Ile Lys Trp Lys Tyr Lys Asn Thr Glu Asp Ser Phe Gly Thr 210 215 220 aat cca gaa aat tat gtt gca gct gaa caa att cgc gac atc gcc act 781 Asn Pro Glu Asn Tyr Val Ala Ala Glu Gln Ile Arg Asp Ile Ala Thr 225 230 235 tcc gta ttt cat gaa acc gag acg ctt tcc atc caa cat tta att tat 829 Ser Val Phe His Glu Thr Glu Thr Leu Ser Ile Gln His Leu Ile Tyr 240 245 250 tta atc ggc cgc aga ata tta gaa aga ttc cct caa ctt caa gaa gtt 877 Leu Ile Gly Arg Arg Ile Leu Glu Arg Phe Pro Gln Leu Gln Glu Val 255 260 265 270 tac ttc gaa tct caa aat cat aca tgg gat aaa ata gtg gag gaa att 925 Tyr Phe Glu Ser Gln Asn His Thr Trp Asp Lys Ile Val Glu Glu Ile 275 280 285 cct gaa tca gaa ggg aaa gta tat aca gaa ccg cga ccg cca tat gga 973 Pro Glu Ser Glu Gly Lys Val Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Pro Tyr Gly 290 295 300 ttt caa tgc ttt act gtc acc caa gaa gac ttg cca cac gaa aac att 1021 Phe Gln Cys Phe Thr Val Thr Gln Glu Asp Leu Pro His Glu Asn Ile 305 310 315 ctt atg ttc tct gat gaa ccc gat cat aaa gga gca ctt aaa ccc ggg 1069 Leu Met Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys Pro Gly 320 325 330 tgactgcaga tatc 1083

【００３２】 <210> 4 <211> 334 <212> PRT <213> Bacillus sp.TB-90 <400> 4 Met Thr Lys His Lys Glu Arg Val Met Tyr Tyr Gly Lys Gly Asp Val 1 5 10 15 Phe Ala Tyr Arg Thr Tyr Leu Lys Pro Leu Thr Gly Val Arg Thr Ile 20 25 30 Pro Glu Ser Pro Phe Ser Gly Arg Asp His Ile Leu Phe Gly Val Asn 35 40 45 Val Lys Ile Ser Val Gly Gly Thr Lys Leu Leu Thr Ser Phe Thr Lys 50 55 60 Gly Asp Asn Ser Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Met Lys Asn Phe Ile 65 70 75 80 Gln Lys His Leu Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Thr Ile Glu Gly Phe Leu 85 90 95 Glu Tyr Val Ala Thr Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Ser His Ile Glu Lys 100 105 110 Ile Ser Leu Ile Gly Glu Glu Ile Pro Phe Glu Thr Thr Phe Ala Val 115 120 125 Lys Asn Gly Asn Arg Ala Ala Ser Glu Leu Val Phe Lys Lys Ser Arg 130 135 140 Asn Glu Tyr Ala Thr Ala Tyr Leu Asn Met Val Arg Asn Glu Asp Asn 145 150 155 160 Thr Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Ser Gly Leu Ala Gly Leu Gln Leu 165 170 175 Ile Lys Val Ser Gly Asn Ser Phe Val Gly Phe Ile Arg Asp Glu Tyr 180 185 190 Thr Thr Leu Pro Glu Asp Ser Asn Arg Pro Leu Phe Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Ile Lys Trp Lys Tyr Lys Asn Thr Glu Asp Ser Phe Gly Thr Asn Pro 210 215 220 Glu Asn Tyr Val Ala Ala Glu Gln Ile Arg Asp Ile Ala Thr Ser Val 225 230 235 240 Phe His Glu Thr Glu Thr Leu Ser Ile Gln His Leu Ile Tyr Leu Ile 245 250 255 Gly Arg Arg Ile Leu Glu Arg Phe Pro Gln Leu Gln Glu Val Tyr Phe 260 265 270 Glu Ser Gln Asn His Thr Trp Asp Lys Ile Val Glu Glu Ile Pro Glu 275 280 285 Ser Glu Gly Lys Val Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Pro Tyr Gly Phe Gln 290 295 300 Cys Phe Thr Val Thr Gln Glu Asp Leu Pro His Glu Asn Ile Leu Met 305 310 315 320 Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys Pro Gly 325 330

【００３３】 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide, described in example No.1 <400> 5 ggtcatcacc atcaccatca ctgactgca 21

【００３４】 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> the sequence of designed polynucleotide, described in example No.1 <400> 6 gtcagtgatg gtgatggtga tgacc 25

【００３５】 <210> 7 <211> 1101 <212> DNA <213> Bacillus sp.TB-90 <400> 7 aaacagaatt cgagctcgcg caatgtttcg tttgcaagaa atatttcgtg aaggagagaa 60 taattcg atg acc aaa cac aaa gaa aga gtg atg tat tat gga aaa ggt 109 Met Thr Lys His Lys Glu Arg Val Met Tyr Tyr Gly Lys Gly 1 5 10 gac gta ttt gct tat cgc acc tat tta aaa cca ctt act gga gtt aga 157 Asp Val Phe Ala Tyr Arg Thr Tyr Leu Lys Pro Leu Thr Gly Val Arg 15 20 25 30 acg att cct gaa tct cca ttt tcc ggt cga gat cat att ctt ttt gga 205 Thr Ile Pro Glu Ser Pro Phe Ser Gly Arg Asp His Ile Leu Phe Gly 35 40 45 gta aat gta aaa atc tca gta gga gga aca aaa ttg ctg acc tcc ttt 253 Val Asn Val Lys Ile Ser Val Gly Gly Thr Lys Leu Leu Thr Ser Phe 50 55 60 acg aaa ggg gat aac agc tta gtc gtt gca aca gac tcg atg aaa aac 301 Thr Lys Gly Asp Asn Ser Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Met Lys Asn 65 70 75 ttt ata caa aaa cat tta gct agt tat aca gga aca acg ata gaa ggt 349 Phe Ile Gln Lys His Leu Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Thr Ile Glu Gly 80 85 90 ttt tta gaa tat gta gct act tct ttt ttg aag aaa tat tct cat att 397 Phe Leu Glu Tyr Val Ala Thr Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Ser His Ile 95 100 105 110 gaa aag att tcg ttg ata gga gag gaa att ccc ttt gaa aca act ttt 445 Glu Lys Ile Ser Leu Ile Gly Glu Glu Ile Pro Phe Glu Thr Thr Phe 115 120 125 gca gta aag aat gga aat aga gca gct agt gag cta gta ttt aaa aaa 49 3 Ala Val Lys Asn Gly Asn Arg Ala Ala Ser Glu Leu Val Phe Lys Lys 130 135 140 tca cga aat gaa tat gcc acc gct tat ttg aat atg gtt cgt aat gaa 541 Ser Arg Asn Glu Tyr Ala Thr Ala Tyr Leu Asn Met Val Arg Asn Glu 145 150 155 gat aac acc cta aac att act gaa caa caa agc gga ctt gct ggt ctt 589 Asp Asn Thr Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Ser Gly Leu Ala Gly Leu 160 165 170 caa tta ata aaa gtc agc gga aat tcc ttt gtc ggt ttt att cgt gac 637 Gln Leu Ile Lys Val Ser Gly Asn Ser Phe Val Gly Phe Ile Arg Asp 175 180 185 190 gaa tac aca act ctt cca gag gat tca aac cgc cct cta ttt gtt tac 685 Glu Tyr Thr Thr Leu Pro Glu Asp Ser Asn Arg Pro Leu Phe Val Tyr 195 200 205 tta aac atc aaa tgg aag tac aaa aac acg gaa gac tca ttt gga acg 733 Leu Asn Ile Lys Trp Lys Tyr Lys Asn Thr Glu Asp Ser Phe Gly Thr 210 215 220 aat cca gaa aat tat gtt gca gct gaa caa att cgc gac atc gcc act 781 Asn Pro Glu Asn Tyr Val Ala Ala Glu Gln Ile Arg Asp Ile Ala Thr 225 230 235 tcc gta ttt cat gaa acc gag acg ctt tcc atc caa cat tta att tat 829 Ser Val Phe His Glu Thr Glu Thr Leu Ser Ile Gln His Leu Ile Tyr 240 245 250 tta atc ggc cgc aga ata tta gaa aga ttc cct caa ctt caa gaa gtt 877 Leu Ile Gly Arg Arg Ile Leu Glu Arg Phe Pro Gln Leu Gln Glu Val 255 260 265 270 tac ttc gaa tct caa aat cat aca tgg gat aaa ata gtg gag gaa att 925 Tyr Phe Glu Ser Gln Asn His Thr Trp Asp Lys Ile Val Glu Glu Ile 275 280 285 cct gaa tca gaa ggg aaa gta tat aca gaa ccg cga ccg cca tat gga 973 Pro Glu Ser Glu Gly Lys Val Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Pro Tyr Gly 290 295 300 ttt caa tgc ttt act gtc acc caa gaa gac ttg cca cac gaa aac att 1021 Phe Gln Cys Phe Thr Val Thr Gln Glu Asp Leu Pro His Glu Asn Ile 305 310 315 ctt atg ttc tct gat gaa ccc gat cat aaa gga gca ctt aaa ccc ggt 1069 Leu Met Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys Pro Gly 320 325 330 cat cac cat cac cat cac tgactgcaga tatc 1101 His His His His His His 335 340

【００３６】 <210> 8 <211> 340 <212> PRT <213> Bacillus sp.TB-90 <400> 8 Met Thr Lys His Lys Glu Arg Val Met Tyr Tyr Gly Lys Gly Asp Val 1 5 10 15 Phe Ala Tyr Arg Thr Tyr Leu Lys Pro Leu Thr Gly Val Arg Thr Ile 20 25 30 Pro Glu Ser Pro Phe Ser Gly Arg Asp His Ile Leu Phe Gly Val Asn 35 40 45 Val Lys Ile Ser Val Gly Gly Thr Lys Leu Leu Thr Ser Phe Thr Lys 50 55 60 Gly Asp Asn Ser Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Met Lys Asn Phe Ile 65 70 75 80 Gln Lys His Leu Ala Ser Tyr Thr Gly Thr Thr Ile Glu Gly Phe Leu 85 90 95 Glu Tyr Val Ala Thr Ser Phe Leu Lys Lys Tyr Ser His Ile Glu Lys 100 105 110 Ile Ser Leu Ile Gly Glu Glu Ile Pro Phe Glu Thr Thr Phe Ala Val 115 120 125 Lys Asn Gly Asn Arg Ala Ala Ser Glu Leu Val Phe Lys Lys Ser Arg 130 135 140 Asn Glu Tyr Ala Thr Ala Tyr Leu Asn Met Val Arg Asn Glu Asp Asn 145 150 155 160 Thr Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Ser Gly Leu Ala Gly Leu Gln Leu 165 170 175 Ile Lys Val Ser Gly Asn Ser Phe Val Gly Phe Ile Arg Asp Glu Tyr 180 185 190 Thr Thr Leu Pro Glu Asp Ser Asn Arg Pro Leu Phe Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Ile Lys Trp Lys Tyr Lys Asn Thr Glu Asp Ser Phe Gly Thr Asn Pro 210 215 220 Glu Asn Tyr Val Ala Ala Glu Gln Ile Arg Asp Ile Ala Thr Ser Val 225 230 235 240 Phe His Glu Thr Glu Thr Leu Ser Ile Gln His Leu Ile Tyr Leu Ile 245 250 255 Gly Arg Arg Ile Leu Glu Arg Phe Pro Gln Leu Gln Glu Val Tyr Phe 260 265 270 Glu Ser Gln Asn His Thr Trp Asp Lys Ile Val Glu Glu Ile Pro Glu 275 280 285 Ser Glu Gly Lys Val Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Pro Tyr Gly Phe Gln 290 295 300 Cys Phe Thr Val Thr Gln Glu Asp Leu Pro His Glu Asn Ile Leu Met 305 310 315 320 Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys Pro Gly His His 325 330 335 His His His His 340

【００３７】 <210> 9 <211> 603 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12 <400> 9 atg gcc agc aga ggc gta aac aag gtt att ctc gtt ggt aat ctg ggt 48 Met Ala Ser Arg Gly Val Asn Lys Val Ile Leu Val Gly Asn Leu Gly 1 5 10 15 cag gac ccg gaa gta cgc tac atg cca aat ggt ggc gca gtt gcc aac 96 Gln Asp Pro Glu Val Arg Tyr Met Pro Asn Gly Gly Ala Val Ala Asn 20 25 30 att acg ctg gct act tcc gaa tca tgg cgt gat aaa gcg acc ggc gag 44 Ile Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ser Trp Arg Asp Lys Ala Thr Gly Glu 35 40 45 atg aaa gaa cag act gaa tgg cac cgc gtt gtg ctg ttc ggc aaa ctg 192 Met Lys Glu Gln Thr Glu Trp His Arg Val Val Leu Phe Gly Lys Leu 50 55 60 gca gaa gtg gcg agc gaa tat ctg cgt aaa ggt tct cag gtt tat atc 240 Ala Glu Val Ala Ser Glu Tyr Leu Arg Lys Gly Ser Gln Val Tyr Ile 65 70 75 80 gaa ggt cag ctg cgt acc cgt aaa tgg acc gat caa tcc ggt cag gat 288 Glu Gly Gln Leu Arg Thr Arg Lys Trp Thr Asp Gln Ser Gly Gln Asp 85 90 95 cgc tac acc aca gaa gtc gtg gtg aac gtt ggc ggc acc atg cag atg 336 Arg Tyr Thr Thr Glu Val Val Val Asn Val Gly Gly Thr Met Gln Met 100 105 110 ctg ggt ggt cgt cag ggt ggt ggc gct ccg gca ggt ggc aat atc ggt 384 Leu Gly Gly Arg Gln Gly Gly Gly Ala Pro Ala Gly Gly Asn Ile Gly 115 120 125 ggt ggt cag ccg cag agc ggt tgg ggt cag cct cag cag ccg cag ggt 432 Gly Gly Gln Pro Gln Ser Gly Trp Gly Gln Pro Gln Gln Pro Gln Gly 130 135 140 ggc aat cag ttc agc ggc ggc gcg cag tct cgc ccg cag cag tcc gct 480 Gly Asn Gln Phe Ser Gly Gly Ala Gln Ser Arg Pro Gln Gln Ser Ala 145 150 155 160 ccg gca gcg ccg tct aac gag ccg ccg atg gac ttt gat gat gac att 528 Pro Ala Ala Pro Ser Asn Glu Pro Pro Met Asp Phe Asp Asp Asp Ile 165 170 175 ccg ttc ctt atg ttc tct gat gaa ccc gat cat aaa gga gca ctt aaa 576 Pro Phe Leu Met Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys 180 185 190 ccc ggt cat cac cat cac cat cac tga 603 Pro Gly His His His His His His 195 200

【００３８】 <210> 10 <211> 200 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12 <400> 10 Met Ala Ser Arg Gly Val Asn Lys Val Ile Leu Val Gly Asn Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asp Pro Glu Val Arg Tyr Met Pro Asn Gly Gly Ala Val Ala Asn 20 25 30 Ile Thr Leu Ala Thr Ser Glu Ser Trp Arg Asp Lys Ala Thr Gly Glu 35 40 45 Met Lys Glu Gln Thr Glu Trp His Arg Val Val Leu Phe Gly Lys Leu 50 55 60 Ala Glu Val Ala Ser Glu Tyr Leu Arg Lys Gly Ser Gln Val Tyr Ile 65 70 75 80 Glu Gly Gln Leu Arg Thr Arg Lys Trp Thr Asp Gln Ser Gly Gln Asp 85 90 95 Arg Tyr Thr Thr Glu Val Val Val Asn Val Gly Gly Thr Met Gln Met 100 105 110 Leu Gly Gly Arg Gln Gly Gly Gly Ala Pro Ala Gly Gly Asn Ile Gly 115 120 125 Gly Gly Gln Pro Gln Ser Gly Trp Gly Gln Pro Gln Gln Pro Gln Gly 130 135 140 Gly Asn Gln Phe Ser Gly Gly Ala Gln Ser Arg Pro Gln Gln Ser Ala 145 150 155 160 Pro Ala Ala Pro Ser Asn Glu Pro Pro Met Asp Phe Asp Asp Asp Ile 165 170 175 Pro Phe Leu Met Phe Ser Asp Glu Pro Asp His Lys Gly Ala Leu Lys 180 185 190 Pro Gly His His His His His His 195 200

【図面の簡単な説明】

【図１】 融合蛋白質をコードする遺伝子の作成を示す
図。

【図２】 融合蛋白質とその選択的な切断の様子を分析
したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの結果を示す図。

【図３】 アフィニティー・ビーズを用いた蛋白質のハ
イスループット精製のフローを示す図。

【図４】 融合蛋白質とその選択的な切断の様子を分析
したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの結果を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月８日（２００１．８．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質よりＤ
ＮＡバインディングプロテインを取得するための選択的
な切断方法に関する。また、本発明は連結部分やその周
辺部分のアミノ酸配列を酵素的に切断することを特徴と
する融合蛋白質よりＤＮＡバインディングプロテインを
取得する方法に関する。本発明は、通常の方法では選択
的に切断し難い融合蛋白質などに有用である。また、本
発明によって、非常に安価に克つ簡便に融合蛋白質より
ＤＮＡバインディングプロテインを調製することが可能
となる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】

【課題を解決するための手段】我々は、非特異的エンド
プロテアーゼを用いることにより、タグとＤＮＡバイン
ディングプロテインとを連結した融合蛋白質を切断する
ことが可能となることを見出し、本発明に至った。さら
に詳しくは、非特異的エンドプロテアーゼを用いること
により、連結部分のアミノ酸配列が特定のアミノ酸配列
を有する融合蛋白質よりＤＮＡバインディングプロテイ
ンを取得することが可能となることを見出し、本発明に
至った。これまで、非特異的エンドプロテアーゼは特定
の配列を認識せずＤＮＡバインディングプロテインを複
数の箇所で切断すると考えられてきたため、融合蛋白質
を選択的に切断する方法に用いることは不可能と思われ
ていた。しかしながら、我々は種々の検討をおこない、
非特異的エンドプロテアーゼを用いて連結部分のアミノ
酸配列が特定のアミノ酸配列を有する融合蛋白質よりＤ
ＮＡバインディングプロテインを取得することを可能と
した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】すなわち本発明は、以下の構成からなる。
［１］タグとＤＮＡバインディングプロテインとを連結
した融合蛋白質を、非特異的エンドプロテアーゼで切断
する方法。［２］タグとＤＮＡバインディングプロテイ
ンとを連結した融合蛋白質に対し、蛋白質部分の配列を
切断することなく、連結部分またはその周辺部分の配列
を切断し所望のＤＮＡバインディングプロテインを取得
する工程において、非特異的エンドプロテアーゼを用い
ることを特徴とする融合蛋白質よりＤＮＡバインディン
グプロテインを取得するための方法。［３］連結部分の
アミノ酸配列が式（１）で表されることを特徴とする
［２］に記載の方法。X-Met-Phe-Ser-(Xaa)n-Y（１）
[式中、XはＤＮＡバインディングプロテインを意味しY
はタグを意味する。Xaaは任意のアミノ酸残基を意味す
る。nは０〜５０の整数である。]［４］連結部分のアミ
ノ酸配列が式（２）で表されることを特徴とする［２］
に記載の方法。X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Ly
s-Gly-Ala-Leu-Lys-(Xaa)n-Y（２）[式中、XはＤＮＡバ
インディングプロテインを意味しYはタグを意味する。X
aaは任意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜４０の整
数である。]［５］連結部分のアミノ酸配列が式（３）
で表されることを特徴とする［２］に記載の方法。X-Me
t-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-
Y（３）[式中、XはＤＮＡバインディングプロテインを
意味しYはタグを意味する。]［６］タグが隣接するヒス
チジン残基を含む親和性ペプチドであることを特徴とす
る［１］〜［５］に記載の方法。［７］非特異的エンド
プロテアーゼがプロティナーゼＫ、トリプシン、キモト
リプシン、Ｖ８プロテアーゼより選ばれることを特徴と
する［１］〜［６］に記載の方法。［８］非特異的エン
ドプロテアーゼがプロティナーゼＫであることを特徴と
する［７］に記載の方法。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】本発明の方法において対象となるＤＮＡバ
インディングプロテインの性質については特に問わない
が、特定の分子量を有する単一の蛋白質であることが好
ましい。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】

【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとするが、こ
れに限定されるものではない。参考例１ 融合蛋白質を
コードする遺伝子の作成所望の蛋白質として、尿酸測定
臨床検査薬に使用する実用的酵素であるバチルス・エス
ピー（Bacillus sp.）TB90株由来ウリカーゼ（尿酸オキ
シダーゼ,EC1.7.3.3）を取り上げた。特定のアミノ酸配
列を有するペプチドとして、隣接するヒスチジン残基を
含む親和性ペプチド、具体的には６つのヒスチジン残基
が並んだ６ｘＨｉｓ−ｔａｇを取り上げ、これがウリカ
ーゼのカルボキシル末端に連結部分を介して結合した融
合蛋白質をコードする遺伝子の作成を下記の手順にてお
こなった。作成の流れは、図1においても示した。ウリ
カーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＯＤ（特開平２−５
３４８８広報）(Journal of Biochemistry, Vol.119,
80-84 （1996）)（バイオインダストリー,Vol.13, 20-
28（1996））を鋳型として、以下の組成および条件にて
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）をお
こない融合蛋白質遺伝子を作成するためのウリカーゼ遺
伝子を調製した。ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕ
ｓ−（東洋紡製）） １μｌ鋳型（ｐＵＯＤ）
０．０５ｎｇプライマー（１）
（配列表の配列番号１記載） ２５ｐｍｏｌｅプ
ライマー（２）（配列表の配列番号２記載） ２
５ｐｍｏｌｅｘ１０ バッファー（東洋紡製）
５μｌ２ｍＭ ｄＮＴＰ（東洋紡製）
５μｌ２５ｍＭ ＭｇＳＯ４（東洋紡
製） ４μｌ全液量：５０μｌＰＣＲ
条件： ９４℃,２分間↓９４℃,１５秒間→５０℃,３
０秒間→６８℃,１分間（３０サイクル）↓６８℃,２分
間ＰＣＲ産物として取得したウリカーゼ遺伝子の配列を
配列表の配列番号３に、ウリカーゼのアミノ酸配列を配
列表の配列番号４に、それぞれ記載した。取得したウリ
カーゼ遺伝子はＰＣＲ産物精製キット（MagExtractor-P
CR&Gel Clean Up-（東洋紡製））にてプロトコール通り
に精製し、制限酵素EcoRIとPstIにて切断し、同様にEco
RIとPstIにて切断した発現ベクターｐＫＫ２２３−３
（アマーシャム・ファルマシア社製）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。得られたウリカーゼ遺伝子の発
現プラスミドをｐＵＯＤＳＰ１と命名した（図１）。ｐ
ＵＯＤＳＰ１を制限酵素SmaIとPstIで切断し、ウリカー
ゼ遺伝子のカルボキシル末端側を開裂した。これに配列
表の配列番号５および６記載の配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、最
終的に６つのヒスチジン残基が並んだ６ｘＨｉｓ−ｔａ
ｇがウリカーゼのカルボキシル末端に連結部分を介して
結合した融合蛋白質をコードする遺伝子を含む発現プラ
スミド、ｐＵＯＤＳＰ１−ＨＴを作成することができた
（図１）。作成した融合蛋白質をコードする遺伝子の配
列を配列表の配列番号７に、融合蛋白質のアミノ酸配列
を配列表の配列番号８に、それぞれ記載した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】参考例２ 融合蛋白質の調製ｐＵＯＤＳＰ
１−ＨＴでエシェリヒア・コリーJM109のコンピテント
セル（Competent High（東洋紡製））を形質転換し、融
合蛋白質生産組換え菌JM109/ｐＵＯＤＳＰ１−ＨＴを調
製した。これを５０ｍｌ・ＴＢ−ｂｒｏｔｈを含む５０
０ｍｌ容量フラスコに植菌し、３７℃で１７時間培養し
た。培養液より菌体を遠心分離にて集菌しバッファーＡ
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）,３５０
ｍＭ ＮａＣｌ）にて懸濁後、超音波破砕にて蛋白質を
抽出した。破砕上清をニッケルキレート・カラムクロマ
トグラフィー（HiTrap-Chelating-（アマーシャム・フ
ァルマシア社製））に通し、製造者のプロトコールに従
いバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）, ３５０ｍＭ ＮａＣｌ,５００ｍＭ イミダ
ゾール）にて溶出した。更に、溶出液をＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５脱塩・カラムクロマトグラフィー（Hitrap-D
esalting-（アマーシャム・ファルマシア社製））に通
し、製造者のプロトコールに従いバッファーＣ（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））にて溶出、バッ
ファー置換し、融合蛋白質の精製標品を調製した。破砕
上清および精製蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルによる分析結果を、図２に示した。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】参考例３ 非特異的プロテアーゼによる処
理と所望の蛋白質の調製融合蛋白質の精製標品を、プロ
ティナーゼＫ（ナカライテスク社製）の２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて処理した。５０μ
ｌ融合蛋白質：約２ｍｇ／μｌに対しプロティナーゼ
Ｋ：約０．１〜１μｇ／ｍｌの終濃度で添加し、３７℃
で３０分間処理した。反応は、プロティナーゼＫの阻害
剤であるＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル
（ナカライテスク社製））を終濃度１ｍＭ分添加して終
結させた。結果として、プロティナーゼＫの処理濃度に
伴い融合蛋白質のカルボキシル末端が選択的に切断さ
れ、所望の蛋白質であるウリカーゼを得ることができ
た。融合蛋白質のプロティナーゼＫ処理産物のＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルによる分析結果を、図２に示し
た。融合蛋白質の連結部分がプロティナーゼＫの酵素分
解作用により切断を受け、６ｘＨｉｓ−ｔａｇペプチド
が除かれ、ウリカーゼが調製されていく様子が分析結果
より明らかとなった。非特異的プロテアーゼによる融合
蛋白質の連結部分の切断は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ−Ｍ
ＡＳＳによる質量分析によっても確認された。非特異的
プロテアーゼによる融合蛋白質の選択的切断は連結部分
または連結部分とその周辺部分の構造的な特徴にあると
推察されるが、現時点では詳細な基礎的メカニズムは明
らかとなっておらず、応用面での有用性のみが判明して
いる。従って、連結部分のアミノ酸配列が式（１）で表
されることを特徴とする、X-Met-Phe-Ser-(Xaa)n-Y
（１）[式中、Xは特定分子量の蛋白質を意味しYは特定
アミノ酸配列のペプチドを意味する。Xaaは任意のアミ
ノ酸残基を意味する。nは０〜５０の整数である。]或い
は連結部分のアミノ酸配列が式（２）で表されることを
特徴とする、X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-
Gly-Ala-Leu-Lys-(Xaa)n-Y（２）[式中、Xは特定分子量
の蛋白質を意味しYは特定アミノ酸配列のペプチドを意
味する。Xaaは任意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜
４０の整数である。]或いは連結部分のアミノ酸配列が
式（３）で表されることを特徴とする、X-Met-Phe-Ser-
Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-Y（３）[式
中、Xは特定分子量の蛋白質を意味しYは特定アミノ酸配
列のペプチドを意味する。]新規な方法としての情報が
例示された。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２７】参考例４ 融合蛋白質のアフィニティー・
ビーズへの結合と非特異的プロテアーゼ処理による所望
の蛋白質の調製本特許の方法を利用すれば、従来は費用
面から実質的に困難であった融合蛋白質をアフィニティ
ー・ビーズへ結合させ配列選択的切断により所望の蛋白
質を取得するという手法が可能になる。この手法が可能
となることにより、蛋白質のハイスループット精製が簡
便に実施可能となる。本特許の方法による蛋白質のハイ
スループット精製のフローの一例を図３に示した。参考
例２と同様に、融合蛋白質生産組換え菌JM109/ｐＵＯＤ
ＳＰ１−ＨＴをＴＢ−ｂｒｏｔｈに植菌し、３７℃で１
７時間培養した。培養液より菌体を遠心分離にて集菌し
バッファーＡにて懸濁後、超音波破砕にて蛋白質を抽出
した。破砕液をニッケルキレート・磁性体ビーズ（MagE
xtractor-His-tag-（東洋紡製））に吸着させ、製造者
のプロトコールに従い添付バッファーにてビーズを洗浄
した。この操作で、融合蛋白質が吸着した磁性体ビーズ
が調製される。この磁性体ビーズをプロティナーゼＫ
（ナカライテスク社製）の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）溶液にて処理し、所望の蛋白質を溶出さ
せた。融合蛋白質吸着磁性ビーズ２０μｌ容量に対しプ
ロティナーゼＫ溶液を約１〜４μｇ／ｍｌの濃度で１０
０μｌ添加し、３７℃で６０分間処理した。結果とし
て、プロティナーゼＫの処理濃度に伴い融合蛋白質のカ
ルボキシル末端が選択的に切断され、所望の蛋白質であ
るウリカーゼを得ることができた。磁性体ビーズのプロ
ティナーゼＫ処理産物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルによる分析結果を、図３に示した。融合蛋白質の連結
部分がプロティナーゼＫの酵素分解作用により切断を受
け、６ｘＨｉｓ−ｔａｇペプチドが磁性体ビーズに吸着
した状態で所望の蛋白質が溶出され、固液分離により所
望の蛋白質を含む溶液が調製されていく様子が分析結果
より明らかとなった。非特異的プロテアーゼによる融合
蛋白質の連結部分の切断は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ−Ｍ
ＡＳＳによる質量分析によっても確認された。実施例１
融合蛋白質のアフィニティー・ビーズへの結合と非特
異的プロテアーゼ処理による所望の蛋白質の調製本特許
の方法を利用すれば、ＤＮＡバインディングプロテイン
のハイスループット精製も簡便に実施可能となる。ＤＮ
Ａバインディングプロテインの融合蛋白質をコードする
遺伝子の配列を配列表の配列番号９に、融合蛋白質のア
ミノ酸配列を配列表の配列番号１０に、それぞれ記載し
た。参考例４と同様に、ＤＮＡバインディングプロテイ
ンの融合蛋白質生産組換え菌をＴＢ−ｂｒｏｔｈに植菌
し、３７℃で１７時間培養した。培養液より菌体を遠心
分離にて集菌しバッファーＡにて懸濁後、超音波破砕に
て蛋白質を抽出した。破砕液をニッケルキレート・磁性
体ビーズ（MagExtractor-His-tag-（東洋紡製））に吸
着させ、製造者のプロトコールに従い添付バッファーに
てビーズを洗浄した。この操作で、融合蛋白質が吸着し
た磁性体ビーズが調製される。この磁性体ビーズをプロ
ティナーゼＫ（ナカライテスク社製）の２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液にて処理し、所望のＤ
ＮＡバインディングプロテインを溶出させた。磁性ビー
ズ２０μｌ容量に対しプロティナーゼＫ溶液を約１〜４
μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ添加し、３７℃で６０分
間処理した。結果として、プロティナーゼＫの処理濃度
に伴い融合蛋白質のカルボキシル末端が選択的に切断さ
れ、所望のＤＮＡバインディングプロテインを得ること
ができた。なお、本実施例では磁性体ビーズを用いてい
るため、固液分離は遠心分離をおこなわずとも磁石を用
いて非常に簡便に実施することができる。磁石を用いた
磁性体ビーズの固液分離システムは自動化も容易であ
り、実際、自動化装置が既に開発、販売されている（MF
X-2000, MFX-6000, MFX-9600（東洋紡製））。従っ
て、これらの装置と本特許の方法を組合せることによ
り、蛋白質のハイスループット精製は容易に実現でき
る。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】タグと、蛋白質とを、連結した融合蛋白質
   を、非特異的エンドプロテアーゼで切断する方法。
2. 【請求項２】タグと蛋白質とを連結した融合蛋白質に対
   し、蛋白質部分の配列を切断することなく、連結部分ま
   たはその周辺部分の配列を切断し所望の蛋白質を取得す
   る工程において、非特異的エンドプロテアーゼを用いる
   ことを特徴とする融合蛋白質より有用蛋白質を取得する
   ための方法。
3. 【請求項３】連結部分のアミノ酸配列が式（１）で表さ
   れることを特徴とする請求項２に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-(Xaa)n-Y（１） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。Xaaは任
   意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜５０の整数であ
   る。]
4. 【請求項４】連結部分のアミノ酸配列が式（２）で表さ
   れることを特徴とする請求項２に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-(Xaa)n-Y（２） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。Xaaは任
   意のアミノ酸残基を意味する。nは０〜４０の整数であ
   る。]
5. 【請求項５】連結部分のアミノ酸配列が式（３）で表さ
   れることを特徴とする請求項２に記載の方法。 X-Met-Phe-Ser-Asp-Glu-Pro-Asp-His-Lys-Gly-Ala-Leu-Lys-Y（３） [式中、Xは蛋白質を意味しYはタグを意味する。]
6. 【請求項６】タグが隣接するヒスチジン残基を含む親和
   性ペプチドであることを特徴とする請求項１〜５に記載
   の方法。
7. 【請求項７】蛋白質がＤＮＡバインディングプロテイン
   であることを特徴とする請求項１〜６に記載の方法。
8. 【請求項８】非特異的エンドプロテアーゼがプロティナ
   ーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアー
   ゼより選ばれることを特徴とする請求項１〜７に記載の
   方法。
9. 【請求項９】非特異的エンドプロテアーゼがプロティナ
   ーゼＫであることを特徴とする請求項８に記載の方法。