DK169975B1 - Rekombinant DNA-molekyle, ekspressionsvektor omfattende samme, værtscelle transformeret med ekspressionsvektoren, fusionsprotein og fremgangsmåde til frembringelse af samme - Google Patents

Description

i DK 169975 B1

Opfindelsen angår et rekombinant DNA-molekyle, ekspressionsvektor omfattende samme, værtscelle transformeret med ekspressionsvektoren, fusionsprotein og fremgangsmåde til frembringelse af samme.

5 Den foreliggende opfindelse angår kloning og ekspression af fremmede proteiner og polypeptider i bakterier, såsom Escherichia col i. Opfindelsen angår nærmere bestemt ekspressionen af bakterielt syntetiserede, fremmede proteiner eller polypeptider som fusionerede polypeptider, der almindeligvis er opløselige, og som let kan oprenses 10 fra bakterielle lysater uden at ændre antigeniciteten eller ødelægge den funktionelle aktivitet af det fremmede protein eller polypeptid.

Der er blevet beskrevet en række forskellige vektorer, som styrer ekspressionen af fremmede polypeptider i Escherichia coli (opsumme-15 ret af Harris, 1983, Marston, 1986, McIntyre et al., 1987). Der er blevet udformet nogle vektorer for at forenkle produktoprensningen, men en vanskelighed, som er fælles for de fleste af disse systemer, er, at denatureringsmidler er nødvendige for at bevare proteinernes opløselighed eller for at eluere dem fra affinitetsreagenser. Dena-20 turering kan forventes at ændre det fremmede polypeptids antigenici-tet eller ødelægge enhver funktionel aktivitet. For eksempel kan polypeptider, der bliver udtrykt som fW^-terminale eller COOH-termina-le fusioner med E. coli Ø-galactosidase (Gray et al., 1982, Koenen et al., 1982, Ruther & Muller-Hill, 1983), og som er opløselige i 25 1,6 M NaCl, 10 mM /J-mercaptoethanol, oprenses fra rå cellelysater ved affinitetskromatografi på en søjle af p-aminophenyl-/J-D-thiogal-actosid efterfulgt af eluering i 0,1 M natriumborat, pH 10, 10 mM Ø-mercaptoethanol (Germino et al., 1983, Ullmann, 1984). Sådanne fusionsproteiner vil også bindes til immobil i serede anti-/}-galactosi-30 daseantistoffer og kan udvindes ved eluering i opløsninger med høj eller lav pH (Promega biotec). Alternativt er fusioner med /l-galac-tosidase, som mangler de sidste 16 COOH-terminale aminosyrer af /3-galactosidase, ofte uopløselige (Itakura et al., 1977, Young & Davis, 1983, Stanley & Luzio, 1984) og kan også oprenses fra den u-35 opløselige fraktion af lyserede bakterier efter genopløsning ved behandling med denaturerende midler (Marston, 1986). Den samme fremgangsmåde kan anvendes til at oprense polypeptider udtrykt som uopløselige COOH-terminale fusioner med et protein, der indeholder trpE-1edersekvensen og den COOH-terminale tredjedel af trpE-pro- DK 169975 B1 2 teinet (Kleid et al., 1981). Foruden anvendelsen af denaturerende betingelser har disse metoder den ulempe, at de E. coli proteiner, der anvendes som bærere, kan dominere i et immunrespons over for fusionsproteinet, navnlig i tilfældet med fusioner med /J-galactosi-5 dase (molekylevægt 116.000) og kan fremkalde antistoffer, som udviser uønskede krydsreaktioner.

i

Andre ekspressionsvektorer styrer syntesen af polypeptider som fusioner med den C00H-terminale del af staphylococprotein A, som kan 10 oprenses fra cellelysater ved affinitetskromatografi på en søjle af human IgG-Sepharose (Uhlen et al., 1983, Nilsson et al., 1985,

Abrahmsen et al., 1986, Lowenadler et al., 1986). På grund af protein A's høje affinitet over for IgG, er denaturerende betingelser sædvanligvis påkrævet ved elueringen af fusionsproteiner, omend der 15 kan anvendes alternative strategier, såsom konkurrence med overskydende, nativt protein A, anvendelsen af fåre IgG, der har en lavere affinitet for protein A (Nilsson et al., 1985) eller nedsættelse af størrelsen af protein A-bæreren, således at dets affinitet for IgG er nedsat (Abrahmsen et al., 1986). En mere alvorlig vanskelighed 20 er, at bindingen af fusionsproteiner til IgG komplicerer den immunologiske screening af kloner eller analyse af rekombinerede produkter, eftersom antistoffer, der bindes til protein A, vil genkende hvert fusionsprotein uanset deres andre specificiteter.

25 En anden strategi til oprensningen af fremmede polypeptider fra E. coli er at frembringe popypeptider, som indeholder poly-arginin i deres COOH-terminale ende (Sassenfeld & Brewer, 1984). De stærkt basiske argininrester forøger fusionsproteinernes affinitet for anioniske harpikser, således at fusioner kan oprenses ved kation-30 bytningskromatografi, hvorefter de COOH-terminale argininrester kan fjernes ved behandling med carboxypeptidase B. Andre vektorer styrer secerneringen af polypeptider i det periplasmati ske rum eller i dyrkningsmediet, og omend ekspressionsniveauerne ofte er lave, er secernerede polypeptider beskyttet mod nedbrydning af bakterielle 35 proteaser og adskilt fra de fleste andre proteiner (Marston, 1986,

Abrahmsen et al., 1986, Lowenadler et al., 1986, Kato et al., 1987).

Disse sidste fremgangsmåder er i nogle tilfælde blevet anvendt med held, men deres generelle anvendelse er uklar, navnlig for polypeptider, som indeholder mange sure rester, eller som stort set er DK 169975 B1 3 hydrofobe.

I Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), vol. 83 (1986), side 8703-8707 beskrives, at klonede cDNA'er svarende til et antigen med en molekyl-5 vægt på 26.000 fra udvoksede orme af Schistosoma japonicum er blevet identificeret i et S. japonicumfag Agtll amp3 ekspressionsbibliotek, og deres nukleotidsekvenser er blevet udledt. Den udledte ami-nosyresekvens af antigenet, som specificeres af disse cDNA'er udviser slående homologi med /z-isozymklassen af pattedyrs giutathion-S-10 transferase. I Nature vol. 326 (1987), side 149-153 beskrives isolering og ekspression i Escherichia col i af komplementær DNA-sekvens, som koder et antigen af Schistosoma mansoni med en molekylvægt på 28.000. I The Journal of Biological Chemistry, vol. 252, nr. 8 (1987), side 3739 - 3745 beskrives konstruktion af promotor-gluta-15 thion-S-transferase Ya cDNA-hybridgener. I disse konstruktioner blev enten den tidlige SV40-promotor-enhancer eller HSV-tymidinkinasepro-motoren indsat opstrøms for giutathion-S-transferase kodesekvensen med forskellige længder af ikke-kodende sekvens mellem de respektive promotor-cap-steder og glutathion-S-transferase ATG-initieringsco-20 donen. I DK patentansøgning nr. 2506/87 beskrives konstruktion og anvendelse af et rekombinant-DNA-molekyle, som indeholder et gluta-thion-S-transferasegen (GST-gen), som efter ekspression i en plante forøger aktivitetsniveauerne for GST-enzymer i planten. Fra DK patentansøgning nr. 4380/87 kendes fremstilling af en vaccine mod 25 schistosomose, nærmere bestemt identifikation og bestemmelse af den cDNA-sekvens, som koder for p28-antigenet. Det gen, som koder for proteinet, kan være fusioneret med et område, som koder for transmembranzonen fra rabiesvirusglycoproteinet, for at sikre proteinets forankring i de inficerede cellers cytoplasmatiske membran. Ingen af 30 de ovenfor omtalte referencer angår rekombinant DNA, der koder for fusionsproteiner, eller fusionsproteiner, hvor et protein eller peptid er fusioneret med carboxyterminus af glutathion-S-transfera-seenzymet, og ej heller ekspressionsvektorer af den i krav 7 omhandlede art. Med fusionsproteinet ifølge den foreliggende opfindelse 35 undgås flere af de vanskeligheder, der har været forbundet med hidtil kendte fusionsproteiner, og fusionsproteinet ifølge den foreliggende opfindelse er navnlig almindeligvis opløseligt og kan oprenses fra bakterielysater under ikke-denaturerende betingelser, f.eks. ved affinitetskromatografi på en søjle af immobiliseret glutation.

DK 169975 B1 4

Ifølge ét aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes et rekombineret DNA-molekyle, som er ejendommelig ved, at det omfatter en nukleotidsekvens, som ved ekspression koder for et fusionsprotein, i hvilket et fremmed protein eller peptid er fusioneret med 5 COOH-enden af enzymet glutathion-S-transferase.

Med det nye fusionsprotein ifølge den foreliggende opfindelse, hvor den fremmede peptidkomponent er fusioneret med enzymet glutathion-S-transferase (E.C. 2.5.1.18), undgås adskillige af de vanskeligheder, 10 som er forbundet med andre kendte fusionsproteiner. Fusionsproteinet ifølge den foreliggende opfindelse er navnlig opløseligt og kan oprenses fra bakterielle lysater under ikke-denaturerende betingelser, f.eks. ved affinitetskromatografi på en søjle af immobil i seret glu-tathion. Fusionsproteinet er ejendommelig ved det i den kendetegn-15 ende del af krav 22 og 23 angivne.

I én bestemt udførelsesform for den foreliggende opfindelse, som er beskrevet i detaljer her, er enzymet en glutathion-S-transferase fra parasitindvoldsormen Schistosoma japonica. Glutathion-S-transferasen 20 i fusionsproteinet kan imidlertid hidrøre fra andre arter, herunder humane og andre pattedyrgiutathion-S-transferaser.

I arbejde, som førte til den foreliggende opfindelse, er det blevet vist, at en lang række eukaryotiske polypeptider kan udtrykkes i E.

25 coli som opløselige og stabile glutathion-S-transferasefusionsprote-iner, som let kan oprenses under fysiologiske betingelser.

I et andet aspekt tilvejebringes med den foreliggende opfindelse en ekspressionsvektor, såsom et bakterielt plasmid, hvori den ovenfor 30 beskrevne nukleotidsekvens er indsat. En sådan ekspressionsvektor vil fortrinsvis også omfatte en ekspressionsstyringssekvens, som på funktionsdygtig måde er koblet til nukleotidsekvensen til ekspression af fusionsproteinet. Endvidere angår den foreliggende opfindelse en værtscelle, som er ejendommelig ved, at den indeholder ekspressi-35 onsvektoren ifølge opfindelsen. Ekspressionsvektoren er ejendommelig 4 ved det i den kendetegnende del af krav 6 og 7 angivne.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et fusionsprotein, hvilken fremgangsmåde er ej DK 169975 B1 5 endommelig ved, at den omfatter, at en værtscelle, der indeholder en som ovenfor beskrevet ekspressionsvektor ifølge opfindelsen, dyrkes under sådanne betingelser, at fusionsproteinet udtrykkes i mængder, som kan indvindes.

5

Eftersom fusionsproteinet almindeligvis er opløseligt og let kan udvindes fra bakterielle lysater, omfatter den foretrukne udvindingsmetode for fusionsproteinet, at bakteriecellerne lyseres, og at fusionsproteinet udvindes fra det bakterielle lysat ved at kontakte 10 det med immobiliseret glutathion.

Fusionsproteinet ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som sådant, eftersom det fremmede protein eller peptidkomponenten heraf bevarer dets antigenicitet og funktionelle aktivitet. Alternativt 15 kan fusionsproteinet spaltes til tilvejebringelse af et syntetisk, fremmed protein eller peptid. Hvis fremstillingen af et sådan syntetisk, fremmed protein eller peptid er ønsket, tilvejebringes fortrinsvis en spaltelig kobling i fusionsproteinet mellem glutathion- S-transferasen og det fremmede protein eller peptid. Fremgangsmåden 20 til frembringelse af et protein eller peptid er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 21 angivne.

Eftersom den foreliggende opfindelse kan anvendes til ekspressionen og oprensningen af en række fremmede proteiner eller peptider, ti 1 -25 vejebringer den foreliggende opfindelse i et andet aspekt en ekspressionsvektor, såsom et bakterielt plasmid, hvori der er indsat en nukleotidsekvens, der koder for ekspression af enzymet glutathion- S-transferase efterfulgt af mindst ét restriktionsendonukleasegen-kendelsessted til indsættelse af en nukleotidsekvens, således at det 30 er i stand til at blive udtrykt som et fremmed protein eller peptid fusioneret til COOH-enheden af glutathion-S-transferasen.

I én specifik illustrering af den foreliggende opfindelse er der blevet konstrueret en række plasmidekspressionsvektorer (pGEX), som 35 forenkler oprensningen af fremmede polypeptider, der er frembragt i E. coli. Der er blevet konstrueret et plasmid, som styrer syntesen af enzymatisk aktivt Sj26 i E. coli (Smith et al., 1987b). Mange pattedyrglutathion-S-transferaseisoenzymer kan oprenses ved affinitetskromatografi på immobiliseret glutathion efterfulgt af eluering DK 169975 B1 6 ved konkurrence med et overskud af reduceret glutathion (Simons &

Vander Jagt, 1977, Mannervik 1985), og denne egenskab deles af både nativt Sj26 og rekombineret Sj26, som er frembragt i E. coli (Smith et al., 1986, 1987b). Ifølge den foreliggende opfindelse udtrykkes 5 polypeptider som C00H-terminale fusioner med antigenet med en molekylevægt på 26.000 (Sj26), hvilket antigen kodes af parasitindvoldsormen Schistosoma japonicum som en giutathion-S-transferase og kan t oprenses under ikke-denaturerende betingelser ved affinitetskromatografi på immobiliseret glutathion. Opløseligt materiale fra lyserede 10 bakterier blandes med glutathion-agarosekugler, og efter vask elu-eres fusionsproteinet, f.eks. med 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), som indeholder 5 mM reduceret glutathion. Under anvendelse af portionsvise vaskeprocedurer kan adskillige fusionsproteiner oprenses parallelt på mindre end 2 timer med et udbytte på mellem 1,6 og 15 mg/1 15 kultur. Glutathion-agarosekugler har en kapacitet på mindst 8 mg fusionsprotein/ml kvældede kugler og kan enten anvendes adskillige gange til forskellige præparationer af det samme fusionsprotein eller recirkuleres ved vask med 3 M NaCl (Simons & Vander Jagt, 1981).

20

Dette system er med held blevet anvendt til ekspressionen og oprensningen af forskellige antigener af P. falciparum. Af 21 forskellige P. falciparum cDNA'er eller cDNA-fragmenter, som er blevet udtrykt i pGEX-vektorer, har 14 givet ophav til opløselige eller 25 delvis opløselige fusionsproteiner, der kunne oprenses ved affinitetskromatografi på immobil i seret glutathion.

I et mindretal af tilfælde er oprensningen ikke lykkedes, og disse uheldige tilfælde kan alle tilskrives fusionsproteinets uopløselig-30 hed. Uopløselighed er en hyppig karakteristik for fremmede proteiner, som udtrykkes i E. coli (Harris 1983, Marston, 1986), og i denne sammenhæng er det overraskende, at hovedparten af glutathion- S-transferasefusionsproteiner er helt opløselige eller delvis op- s løselige. Man ved kun lidt om de faktorer, som er ansvarlige for 35 uopløselighed (Marston, 1986), men i adskillige tilfælde er uopløselighed af glutathion-S-transferasefusionsproteiner forbundet med tilstedeværelsen af stærkt hydrofobe områder, og fjernelsen af disse områder forøger i høj grad stabiliteten og/eller opløseligheden. Andre uopløselige fusionsproteiner indeholder enten mange DK 169975 B1 7 ladede rester eller er større end en molekylevægt på 100.000. Uopløselige fusionsproteiner kan ikke desto mindre oprenses ved affinitetskromatografi, hvis de bliver opløst i et opløsningsmiddel, som ikke ophæver bindingen til glutathion-agarose, såsom 1% Triton 5 X-100, 1% Tween 20, 10 mM dithiothreitol eller 0,03% NaDodS04. Op rensning af andre uopløselige fusionsproteiner skal ske ved traditionelle metoder (Marston, 1986) med mindre polypeptidet kan udtrykkes i adskillige fragmenter, der hver danner et opløseligt fusionsprotein. Uopløselighed har i nogle tilfælde været forbundet med 10 forøget proteinstabilitet i E. coli (Cheng et al., 1981), men ikke i andre tilfælde (Schoemaker et al., 1985). Omend der er nogle undtagelser, er både uopløselige og opløselige glutathion-S-transferase-fusionsproteiner almindeligvis stabile, og i de tilfælde, hvor direkte sammenligning er mulig, svarer stabiliteten af et polypeptid 15 udtrykt som en opløselig glutathion-S-transferasefusion til stabiliteten for en uopløselig Ø-galactosidasefusion.

Der er i immuniserede mus, kaniner og får fremkaldt gode antistofrespons mod den fremmede polypeptiddel af fusioner. Nærmere bestemt 20 synes svarene at være lige så gode eller bedre end svar over for ækvivalente /J-galactosidasefusioner, hvilket måske afspejler den mindre størrelse af glutathion-S-transferasebæreren (molekylevægt 26.000 sammenlignet med molekylevægt 116.000). Respons over for Sj26 varierer i forskellige musestammer (Davern et al., 1987), og en 25 lignende variation observeres i respons over for polypeptider udtrykt som fusioner med glutathion-S-transferase.

Oprensede glutathion-S-transferasefusionsproteiner synes at være gode substrater for spaltning med stedspecifikke proteaser. Der er 30 kun få tidligere beskrivelser af den heldige anvendelse af stedspecifikke proteaser ved spaltningen af fusionsproteiner oprenset fra E. coli (Germino & Bastia, 1984, Nagai & Thogersen, 1984), hvilket måske skyldes, at denaturerende midler, der er nødvendige til at genopløse uopløselige fusionsproteiner, hæmmer proteolyse. I mod-35 sætning hertil er mange glutathion-S-transferasefusionsproteiner opløselige under betingelser, som vides at være optimale for proteolyse. Den anvendte protease er fortrinsvis en protease, som ikke spalter glutathion-S-transferasebæreren, således at polypep-tidproduktet efter proteolyse kan separeres fra bæreren og ethvert, DK 169975 B1 8 ikke-spaltet fusionsprotein ved absorption med glutathion-agarose. Egnede stedspecifikke proteaser omfatter f.eks. thrombin eller blodkoagulationsfaktor X3, som er beskrevet i detaljer her, eller α renin (Haffey et al., 1987).

5

Kombinationen af ekspression ved høje niveauer, læserammeskiftede kloningssteder, hurtig oprensning og effektiv, stedspecifik proteolyse af fusionsproteiner vil gøre pGEX-vektorerne til et kraftfuldt system til ekspression af fremmede polypeptider i E.

10 coli. Ud over at forenkle ekspressionen og oprensningen af polypeptider kan vektorerne tilvejebringe et billigt alternativ til den kemiske syntese af peptider til brug som immunogener eller som immunokemiske reagenser. Vektorerne kan også være hensigtsmæssige til konstruktionen af cDNA-biblioteker, navnlig da repression af 15 tac-promotoren af det plasmidkodede lacl^-allel skulle være effektiv i E. colistammer, der har høje transformationseffektiviteter uanset deres lacl-status. Transformanter kan screenes ved traditionelle nukleinsyremetoder eller immunokemiske metoder, og fusionsproteiner, som kodes af kloner, der er af interesse, kan oprenses ved gluta-20 thionaffinitetskromatografi.

De nye fusionsproteiner ifølge den foreliggende opfindelse illustreres sammen med de forskellige andre aspekter, som bredt er skitseret ovenfor, i de efterfølgende eksempler og den tilhørende 25 tegning.

Figur 1 viser et skema for konstruktionen af plasmidet pSj5.

Figur 2 viser SDS-polyacrylamidgel analyse af proteiner, som er til 30 stede i celler, der er transformeret med pSj5. En kultur af celler dyrket natten over blev fortyndet 1:10 i frisk medium og inkuberet ved 37°C i 1 time. IPTG blev derefter tilsat til 0,1 mM, og inkubationen fortsattes ved 37°C i de angivne antal timer. Størrelsen (i kDa) og positionen af molekylevægtsmarkører er angivet. Proteiner 35 blev påvist ved farvning med Coomassieblå.

Figur 3 viser et immunoblot af celler, som udtrykker rekombinant Sj26. Prøver af celler, som indeholdt enten ptacll (moderpiasmidet) eller pSj5, blev fremstillet som beskrevet i figur 2, blev adskilt DK 169975 B1 9 på en 13% SDS-polyacrylamidgel og blev overført til nitrocellulose.

SjAWE er et ekstrakt af voksne S. japonicum orme. Nitrocellulose blev proberet med en kaninantiserum fremstillet mod oprenset β- galactosidase-Sj26-fusionsprotein (Smith et al., 1986), efterfulgt 1 5 af I -mærket protein A. Positionen og størrelsen (kDa) af moleky-levægtsmarkører er angivet.

Figur 4 illustrerer oprensningen af rekombinant Sj26. Et ekstrakt af celler, som udtrykker rSj26, blev sat på en glutathion-agarosesøjle, 10 og specifikt bundet materiale blev elueret med frit, reduceret glutathion. På hinanden følgende fraktioner af eluat eller et totalt celleekstrakt blev separeret på en 13% SDS-polyacrylamidgel, og proteiner blev påvist ved farvning med Coomassieblå. Positionen og størrelsen (kDa) af molekylevægtsmarkører er angivet.

15

Figur 5 viser (a) strukturen af pSjlODBam7Stop7 (ikke i de rigtige forhold), (b) nukleotidsekvensen af de sidste to codoner af Sj26, de multiple kloningssteder indført i Sj26-termineringscodonen, TGA-termineringscodonerne i alle tre læserammer (understreget) efter-20 fulgt af sekvensen for ptacl2 begyndende ved PvuII-stedet (kun de første tre nukleotider er vist, hvilket svarer til nukleotiderne 2067 til 2069 i pBR322).

Figur 6 viser produktionen og oprensningen af Sj26-fusionsproteiner.

25 Ekstrakter af celler, som er transformeret med ptacl2 (moderpias-mid), pSjlODBaml eller pSjlODBaml, som indeholder EcoRI-fragmenter hidrørende fra P. falciparumantigener, blev separeret på 13% SDS-polyacryl amidgel er som enten et totalt ekstrakt (T) eller efter oprensning på glutathion-agarosekugler (P). Proteiner blev påvist 30 ved farvning med Coomassieblå. Størrelsen (kDa) og positionen af molekylevægtsmarkører er angivet.

Figur 7 viser strukturen af pGEX-vektorerne (a) skematisk repræsentation af pGEX-1. Positionen af unikke PstI- og EcoRV-restriktions-35 steder er angivet, (b) nukleotidsekvensen og den kodende kapacitet af pGEX-1, pGEX-2T og pGEX-3X ved den COOH-terminale ende af Sj26-cDNA'et. Den normale translationstermineringscodon for Sj26-cDNA'et begyndte ved nukleotid 7 og er blevet ødelagt ved indføringen af oligonukleotider, som koder for spaltningssteder for BamHI, Smal og DK 169975 B1 10

EcoRI (understreget ved klammer) og TGA-stopcodoner i alle tre læserammer (understreget). Vektorerne pGEX-2T og pGEX-3X indeholder yderligere sekvenser, som koder for proteasespaltningssteder, der genkendes af thrombin henholdsvis blodkoagulationsfaktor X .

α 5

Figur 8 viser ekspressionen og oprensningen af glutathion-S-transferase i celler, som er transformeret med pGEX-1. (a) Tidsfor- £ løbet for ekspression efter induktion. En natkultur af celler transformeret med pGEX-1 blev fortyndet 1:10 i frisk medium, blev dyrket 10 i 90 minutter, og der blev tilsat IPTG til 1 mM. Der blev taget prøver på de angivne tidspunkter, og de blev separeret ved elektro-forese gennem en 13% NaDodSO^-polyacrylamidgel efterfulgt af farvning med Coomassieblå. Positionen og størrelserne (kDa) af molekylevægtsmarkører (M) er angivet, (b) Oprensning af glutathion-S-trans-15 ferase. Celler, der var transformeret med pGEX-1, blev dyrket som ovenfor beskrevet, med undtagelse af at IPTG blev tilsat til 0,1 mM, og kulturen blev høstet 3 timer efter induktion. Glutathion-S-trans-ferase blev oprenset som beskrevet, og der blev taget prøver fra (T) hele celler, (P) uopløselig pellet og (S) supernatant efter centri-20 fugering, (U) ikke-bundet materiale efter inkubering af supernatant med glutathion-agarosekugler og (E) oprenset materiale elueret fra kugler. Prøverne var ækvivalente til 200 /il kultur og blev analyseret som ovenfor beskrevet.

25 Figur 9 viser oprensningen af P. falciparumantigener udtrykt som glutathion-S-transferasefusionsproteiner. Prøver blev analyseret ved elektroforese gennem en 10% NaDodSO^-polyacrylamidgel efterfulgt af farvning med Coomassieblå. (T) totalt celleekstrakt, (P) materiale oprenset på glutathion-agarose. Celler blev transformeret med 30 pGEX-1, Ag63 (EcoRV-EcoRI) i pGEX-3X (63), Ag361 i pSjlO (361), Agl6 i pSjlO (16) og et EcoRI-fragment af RESA i pGEX-3X (R). Positionen og størrelserne (kDa) af molekylevægtsmarkører (M) er angivet.

Figur 10 viser proteasespaltning af oprensede fusionsproteiner, (a)

35 Thrombinspaltning. Oprenset fusionsprotein fra celler, som var transformeret med pGEX-1 eller med pGEX-2T, som indeholdt et 580 bp langt Rsal-EcoRI-fragment af Ag63, blev inkuberet med protease i de angivne antal minutter. Banerne T, U og G, spaltningsreaktioner efter fjernelse af glutathion ved fortynding med 40 voluminer MTPBS

DK 169975 B1 11 efterfulgt af koncentrering under anvendelse af en Centri con-10-kon-centrator (Amicon Corp.). (T) total reaktion efter koncentrering, (U) reaktion efter inkubering med glutathion-agarosekugler, (G) materiale bundet til glutathion-agarosekugler. Prøverne blev analy-5 seret ved elektroforese gennem en 13% NaDodSO^-polyacrylamidgel efterfulgt af farvning med Coomassieblå. Størrelsen (kDa) og positionen af molekylevægtsmarkører (M) er angivet, (b) Spaltning med blodkoagulationsfaktor X . Oprenset fusionsprotein fra celler, α som var transformeret med pGEX-1 eller med pGEX-3X, som indeholdt et 10 555 bp langt EcoRV-EcoRI-fragment af Ag63, blev inkuberet i forskellige perioder med blodkoagulationsfaktor X. eller blev absorberet med glutathion-agarose efter spaltning og analyseret som beskrevet i (a).

15 Eksempel 1

Materialer oq metoder:

Konstruktion af bakterielle plasmider: 20

Et 780 bp langt EcoRI-fragment af pSjl, som indeholdt et cDNA af Schistosoma japonicum giutathion-S-transferase med molekylevægt 26.000 (Sj26) (Smith et al., 1986), blev spaltet med restriktionsenzymet Sau96i under betingelser til delvis spaltning, blev ligeret 25 med to annellerede (eng.: annealed) oligonukleotider og blev indsat i EcoRI-stedet i ptacll (Amann et al., 1983) (figur 1). Ved transformation af E. coli JM 101 blev der identificeret en koloni, som indeholdt et plasmid (pSj5), i hvilket tac-promotoren er direkte efterfulgt af et EcoRI-genkendelsessted, sekvensen ATGTCC (som koder 30 for Met.Ser) og derefter Sj26-cDNA'et for pSjl fra nukleotid 12 indtil det 3'-terminale EcoRI-sted. Plasmidet pSj4 blev konstrueret på en lignende måde med undtagelse af, at der blev anvendt forskellige oligonukleotider, som indførte sekvensen GATCCCACC 5' for Met-codonen, Sj26-cDNA'et blev isoleret fra pSjl som et Hi nfI-35 BamHI-fragment, og det rekonstruerede Sj26-cDNA blev indsat i BamHI-stedet i pG$62 (Langford et al., 1986). Et BamHI-fragment af pSj4, som indeholdt hele Sj26-cDNA'et, blev spaltet med restriktionsenzymet Mnll, blev ligeret med BamHI-linkere og blev klonet i BamHI-stedet i pLK8 (C. Langford, ikke-publiceret arbejde), hvilket DK 169975 B1 12 frembragte et plasmid (pSj7), som indeholdt et BamHI-fragment med hele den kodende sekvens for Sj26 indtil AAA.TAA-terminerings-codonen, som var blevet ødelagt ved indføringen af et BamHI- genkendelsessted, hvilket frembragte sekvensen AAA.TCG.GAT.CC.

5 Sj26-BamHI-fragmentet blev isoleret fra p$j7 og blev indsat i BamHI-stedet i pIC19H (March et al., 1984), hvilket frembragte et plasmid (pSj8), i hvilket den 5'-terminale ende af Sj26 sidder ved siden af Pstl-genkendelsesstedet. DNA fra dette plasmid blev spaltet med restriktionsenzymet PstI, blev inkuberet med 1 enhed exonuclease 10 Bal31 (Bethesda Research Laboratories) i 2 minutter, blev spaltet med EcoRV og blev indsat i PvuII-stedet i ptacl2-Eco (frembragt fra ptac-12 (Amann et al., 1983) ved fjernelse af det unikke EcoRI-sted ved behandling af EcoRI-fordøjet DNA med Klenow-fragmentet af E. coli-DNA-polymerase og ved genligering). Transformanter blev 15 screenet for ekspression af Sj26 ved koloniimmunoanalyse som beskrevet (Crewther et al., 1986) under anvendelse af kaninantiserum rejst mod hele, voksne orme af S. japonicum (Saint et al., 1986).

Der blev identificeret én kraftig immunoreaktiv klon (pSjlO), men den indeholdt to BamHI-genkendelsessteder; BamHI-stedet ved den 20 5'-terminale ende af Sj26-cDNA'et blev ødelagt ved udfyldning af delvis BamHI-fordøjet pSjlO-DNA og genligering. DNA blev transformeret i JM 101 (hvilket frembragte plasmidet pSjlODBaml) eller i den methylase-defekte E. coli-stamme GM48 (Yanish-Perron et al., 1985).

Plasmid DNA (pSjlODBam7) fra én GM48-transformant, blev spaltet med 25 Clal under betingelser til delvis spaltning og blev ligeret med et par annellerede oligonukleotider, som koder for TGA-terminerings- codoner i alle tre læserammer, hvilket frembragte plasmidet pSjlODBam7Stop7 (figur 5). Manipuleringer af DNA blev udført som beskrevet (Maniatis et al., 1982). Restriktionsenzymer blev opnået 30 fra New England Biolabs.

Oprensning af S.i26-fusionsprotein

En natkultur af bakterier blev fortyndet 1:10 i frisk medium (800 35 ml), blev dyrket ved 37°C i 1 time, blev induceret med 0,1 mM IPTG

i og blev dyrket i yderligere 3 til 5 timer. Celler blev opsamlet ved centrifugering, blev lyseret ved ultralydsbehandling i PBS og blev centrifugeret ved 13.000 g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten blev sat på en søjle af glutathion-agarose (svovlkobling) (Sigma), søjlen DK 169975 B1 13 blev vasket med PBS, og fusionsproteinet blev elueret med 50 mM Tris-HCl, pH 9,6, som indeholdt 5 mM reduceret glutathion (Sigma) (Simons & Vander Jagt, 1977, Harvey & Beutler, 1982). Der blev foretaget en oprensning i lille skala (1,5 ml kultur) ved at inkubere 5 supernatanten af lyserede celler med 50 /il kvældede glutathion-agarosekugler i 30 minutter og kogning af de vaskede kugler i proteingel prøvepuffer. Fremstilling af et ekstrakt af voksne S. japonicum orme og SDS-polyacrylamidelektroforese samt immunoblotting blev foretaget som beskrevet (Saint et al., 1986).

10

Primerforlænqelsessekventerinq af RNA

Voksne orme af S. japonicum (Sorsogon-stamme) blev opnået ved portal perfusion af inficerede kaniner, og RNA blev oprenset som beskrevet 15 (Saint et al., 1986). Et oligonukleotid, som var komplementært til nukleotiderne 53 til 37 af pSjl Sj26-cDNA'et, blev forlænget på en enkeltstrenget DNA-template, som var isoleret fra M13-fag, der indeholdt en fuldstændig kopi af pSjl Sj26-cDNA'et. Reaktionerne blev udført ved 20°C i 30 minutter, og reaktionsblandingerne indeholdt 20 annelleret template og primer, 10 /xCi af hver af ^PdATP og ^PdCTP, 0,05 mM dTTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 5, mM MgCl£ og 2 enheder af Klenow-fragment af E. coli DNA-polymerase I. Den forlængede primer (34 nukleotider) blev udskåret fra en 10% polyacrylamidgel med 7,6 M urinstof og blev udvundet ved ethanolpræcipitering efter gennem-25 vædning i 0,5 M ammoniumacetat, 5 mM EDTA, 0,1% SDS i 16 timer ved 4°C. Ca. 0,5 /ig af total S. japonicum RNA blev opvarmet ved 100°C i 32 1 minut med 100.000 cpm P-mærket primer i nærværelse af 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,1 mM EDTA, 10 mM DTT, 7,5 mM MgCl£, 10 mM NaCl og blev derefter inkuberet ved 60°C i 20 minutter. Blandingen blev 30 opdelt i fire og blev inkuberet ved 42°C i 15 minutter i reaktionsblandinger, som indeholdt 5 enheder RNAsin (BRL), 0,5 enheder revers transkriptase fra aviær myoblastosevirus (Life Sciences Inc.), 0,1 mM af hver af deoxynukleotiderne og enten 0,075 mM ddATP, 0,06 mM ddCTP, 0,03 mM ddGTP eller 0,15 mM ddTTP. Reaktionsprodukter 35 blev separeret på en 8% polyacrylamid-urinstofgel og blev påvist ved autoradiografi.

DK 169975 B1 14

Resultater

Konstruktion af pS.ilODBaml: 5 Voksne orme af parasitindvoldsormen Schistosoma japonicum indeholder et antigen med en molekylevægt på 26.000 (Sj26), som er en funktionel glutathion-S-transferase (Mitchell et al., 1984, Smith et al., 1986). Der blev konstrueret et plasmid (pSj5), som forventedes at kode for et molekyle, der er identisk med nativ Sj26 (figur 1). Den 10 korrekte 5'-terminale struktur af Sj26 (Met.Ser.Pro.Ile.....) blev deduceret ud fra den direkte sekvensanalyse af Sj26-mRNA oprenset fra voksne orme af S. japonicum (materialer og metoder) og blev bekræftet ved proteinsekventering af den N-terminale ende af Sj26 fra voksne parasitter (i samarbejde med M. Rubira fra Joint Protein 15 Structure Laboratory, Ludwig Institute for Cancer Research, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research). Dette plasmid dirigerer i E. coli syntesen af et molekyle med en molekylevægt på 26.000 (rekombinant Sj26, rSj26), som ikke kan skelnes fra nativ Sj26 ved dets vandring i SDS-polyacrylamidgel er (figur 2) eller dets 20 antigenicitet (figur 3). Dette molekyle er endvidere opløseligt, enzymatisk aktivt som en glutathion-S-transferase og bevarer en egenskab for mange glutathion-S-transferaser (Simons & Vander Jagt, 1977, Harvey & Beutler, 1982) med at bindes til en søjle af immobil iseret glutathion (figur 4).

25

Der blev konstrueret et plasmid, pSjlO DBaml, som indeholder den fuldstændige, kodende sekvens for Sj26 under transkriptionel styring af tac-promotoren (Amann et al., 1983) og efterfulgt af adskillige unikke restriktionsendonukleasegenkendelsessteder (materialer og 30 metoder). Induktion af celler, som er transformeret med dette plasmid, resulterede i syntesen af et rigeligt forekommende molekyle med en molekylevægt på 28.000 (figur 6). Den større størrelse af dette protein skyldes ødelæggelsen af den normale Sj26-terminerings-codon i pSjlODBaml, på grund af indføringen af en BamHI-1inker, der 35 resulterer i translationen af 14 yderligere aminosyrer, før der er en termineringscodon i læseramme. På trods af disse yderligere aminosyrer er den ændrede glutathion-S-transferase opløselig og bindes til glutathion (figur 6), hvilket lader formode, at mindre tilføjelser til den COOH-terminale ende af Sj26 ikke nødvendigvis DK 169975 B1 15 ødelægger binding.

Ekspression af S.i26-fusionspo1 vpeptider 5 For at undersøge virkningen af større tilføjelser til den C00H- terminale ende af Sj26 blev cDNA'er svarende til en række forskellige antigener af Plasmodium falciparum indsat i det unikke EcoRI-sted i pSjlODBaml. Disse cDNA'er blev alle valgt, fordi det var kendt, at de var i korrekt læseramme til ekspression som Sj26-10 fusionsproteiner. cDNA'erne svarede til antigenerne 16 (Coppel et al., 1983), 44 (Anders et al., 1984), 361 (G. Peterson, manuskript under forberedelse) og 32 (Cowman et al., 1984). I hvert tilfælde kunne der identificeres transformanter, som udtrykte et nyt fusionsprotein med en molekylevægt på over 28.000, som let kunne identifi-15 ceres ved Coomassiefarvning efter elektroforese gennem en SDS-poly- acrylamidgel (figur 6). Endvidere var det Sj26-fusionsprotein, som blev syntetiseret af disse kloner, i hvert tilfælde opløseligt og kunne oprenses fra ultralydsbehandlede bakterieekstrakter ved inkubering med glutathion-agarosekugler (figur 6). Da oprensnings-20 proceduren blev opskaleret til 1 1 cellesuspension, opnåedes ca. 5 mg protein, som vurderet ved Coomassiefarvning af polyacrylamidgel er var fri for kontaminering. Kromatografi af lysater af ikke-trans-formerede celler på en glutathionsøjle resulterede ikke i oprensning af noget protein. Sj26-fusionsproteinerne bevarede deres antigenici-25 tet, eftersom de blev genkendt på Western blots af specifikke antisera (resultater ikke vist).

Eksempel 2 30 Materialer og metoder:

Konstruktion af pGEX-vektorer:

Der blev skabt multiple kloningssteder i pSjl Sj26-cDNA'et (Smith et 35 al., 1986, 1987a) ved indføring af en BamHI-1 inker i det unikke Mnll-spaltningssted, således at TAA-translationstermineringscodonen fra Sj26 blev erstattet med sekvensen TCGGATCC. Den 5'-terminale ende af pSjl-cDNA'et blev også ændret ved udskiftningen af det 5'-terminale EcoRI-Sau96i-fragment med oligonukleotider, som indeholdt DK 169975 B1 16 et BamHI-spaltningssted efterfulgt af sekvensen CACCATGTCC og derefter nukleotiderne 12-38 af pSjl-cDNA'et, hvorved der frembragtes et BamHI-fragment, som koder for nativ Sj26 (Smith et al., 1987b). Dette BamHI-fragment blev indsat i BamHI-stedet i pIC19H (Marsh et 5 al., 1984), således at 3'-enden af cDNA'et blev efterfulgt af unikke Smal-, EcoRI-, Cl al- og EcoRV-spaltningssteder. Et med stumpe ender forsynet BamHI-EcoRV-fragment, som indeholdt det rekonstruerede Sj26-cDNA, blev indsat i PvuII-stedet i ptacl2AEco (ptacl2 (Amann et al., 1983) modificeret ved udfyldning af det unikke EcoRI-sted og 10 genligering) i den korrekte orientering til transkription fra tac-promotoren. Dette plasmid (pSjlO) blev yderligere modificeret ved indføringen af et oligonukleotid (TGACTGACTGA), som koder for stop-codoner i alle tre læserammer, i det med stumpe ender forsynede Cl al-sted ved 3'-enden af cDNA'et, medens BamHI-spaltningsstedet ved 15 5'-enden af cDNA'et blev fjernet ved udfyldning under anvendelse af

Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I.

Celler transformeret med dette plasmid (pSjlOABam7Stop7) og induceret med IPTG syntetiserede et polypeptid med en molekylevægt på 20 27.500, men ved mindre end 20% af niveauet i celler, som er trans formeret med PSj5, et plasmid hidrørende fra ptacll, som koder for nativ Sj26 (Smith et al., 1987b). Denne ekspressionsforskel kan skyldes det forøgede GC-indhold og længden af området mellem tac-ribosombindingsstedet og ATG-translationsinitieringscodonen i 25 pSjlOABam7Stop7 (Stormo et al., 1982, De Boer et al., 1983b), og således blev 3'-enden af det modificerede Sj26-cDNA i pSj10ABam7Stop7, som indeholdt de multiple kloningssteder og terminenngscodoner, indført i pSj5 på følgende måde.

30 Et Hindlll-Ndel-fragment af pSj5, som koder for tetracycli nresistensgenet, blev erstattet med et 1,7 kb langt EcoRI-fragment hidrørende fra pMC9 (Miller et al., 1984), som indeholdt lacl^-allelet og en del af lacZ. Stumpende!i gering af rensede fragmenter efter behandling med Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I frem-35 bragte et plasmid (p4,5), i hvilket laclq, ampr og tac-Sj26 alle transkriberes i samme retning. EcoRI-spaltningsstedet i 3'-enden af Sj26-cDNA'et i p4,5 blev fjernet ved udfyldning og genligering, medens EcoRI-stedet i 5'-enden af cDNA'et blev ødelagt ved mutageni-sering, hvilket er beskrevet af Mandecki (1986), under anvendelse af DK 169975 B1 17 et 30-mer oligonukleotid til frembringelse af sekvensen tac-GTATTC-Sj26-cDNA. Et BelI-fragment af dette plasmid, som indeholdt 3'-enden af lacl^, tac-promotoren og 5'-enden af Sj26-cDNA'et, blev indsat i det unikke BclI-sted i et plasmid, som er dannet ved at sammenføje 5 et Bel I-EcoRI-fragment fra p4,5, som indeholder ampr, ori og 5'- delen af laclq, og et Bad I-Accl-fragment af pSjlODBam7Stop7, som indeholder 3'-enden af Sj26-cDNA'et efterfulgt af multiple kloningssteder, termineringscodoner og nukleotiderne 2067-2246 fra pBR322. Spaltning med Bell var på plasmid-DNA dyrket i methylasedefekte 10 GM48-celler (Marinus, 1983), og EcoRI- og AccI-enderne blev gjort stumpe ved behandling med Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I. Der blev identificeret en transformant, som indeholdt et plasmid (pGEX-1) med den i figur 7 viste struktur. Oligonukleotider, som koder for spaltningsgenkendelsessteder for thrombin eller 15 blodkoagulationsfaktor X., blev indsat i BamHI-stedet i pGEX-1, α hvilket frembragte plasmider (pGEX-2T og pGEX-3X), i hvilke det unikke BamHI-sted er skiftet i læseramme med en eller to nukleotider (figur 7b). Nukleotidsekvenser blev bekræftet ved dideoxynukleotid-sekventering af plasmid DNA (Chen & Seeburg, 1985), og med mindre 20 andet er angivet, blev plasmider transformeret i E. coli stamme JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985). Restriktionsenzymer og DNA- modificerende enzymer blev købt fra New England Biolabs og blev anvendt ifølge producentens instruktioner.

25 p. falciparum-cDNA'er indsat i pGEX-vektorerne var et 555 bp langt EcoRV-EcoRI-fragment og et 580 bp langt Rsal-EcoRI-fragment af Ag63 (Bianco et al., 1986) i Smal-EcoRI-spaltet pGEX-3X henholdsvis pGEX-2T, 763 bp og 1010 bp lange EcoRI-fragmenter af Agl6 (Coppel et al., 1983) og Ag361 (G. Peterson, personlig meddelelse) i EcoRI-30 spaltet pSjlO og et 1317 bp langt EcoRI-fragment af RESA (Favaloro et al., 1986) i EcoRI-skåret pGEX-3X.

Affinitetsoprensnina af fusionsproteiner 35 Natkulturer af E. coli transformeret med moderplasmid eller rekombi- nant pGEX-plasmid blev fortyndet 1:10 i 800 ml frisk medium og blev dyrket i 1 time ved 37°C før tilsætning af IPTG til 0,1 mM. Efter yderligere 3-7 timers vækst blev cellerne pelletteret og resuspen-deret i 1/50-1/100 dyrkningsvolumen musetonicitetsphosphatpufferet DK 169975 B1 18

saltvand (MTPBS) (150 mM NaCl, 16 mM Na2HP04, 4 mM NaH2P04 (pH

7,3)). Cellerne blev lyseret på Is ved mild ultralydsbehandling og blev efter tilsætning af Triton X-100 (BDH Chemicals) til 1%, underkastet centrifugering ved 10.000 g i 5 minutter ved 4°C.

5 Supernatanten blev ved stuetemperatur i et 50 ml polypropylenrør på en roterende plade blandet med 1-2 ml 50% glutathion-agarosekugler (svovlkobling, Sigma). Før brug blev kuglerne for-kvældet i MTPBS, blev vasket to gange i samme puffer og blev opbevaret i MTPBS ved 4°C som en 50% opløsning (v/v). Efter absorption blev kuglerne op-10 samlet ved centrifugering ved 500 g i 10 sekunder og blev vasket tre gange med 50 ml MTPBS. Fusionsprotein blev elueret ved konkurrence med frit glutathion ved anvendelse af 2 x 1 kuglevolumen af 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), som indeholdt 5 mM reduceret glutathion (Sigma) (slut pH 7,5, frisk fremstillet). Absorption af fusionsprotein til 15 glutathion-agarosekuglerne og efterfølgende eluering er begge fuldstændige i løbet af 2 minutter. Binding af fusionsproteiner til glutathion-agarose kan foretages i andre neutrale puffere, såsom 50 mM Tris-HCl ( pH 7,4) eller MTPBS uden Triton X-100, omend tilsætningen af detergent nedsætter kontaminering med E. coli proteiner.

20 Kontaminering kan også nedsættes ved at minimere den periode, hvor under cellerne udsættes for ultralydsbehandling. Udbyttet af ustabile fusionsproteiner kan forøges ved at forsinke tilsætningen af IPTG, indtil mindre end 1 time før cellehøst. Udbytter af fusionsprotein blev beregnet ud fra absorbansen ved 280 nm under anvendelse 25 af relationen 1 0^280 = mg/ml hidrørende fra proteinkoncentrationsbestemmelser (Hartree, 1972) af protein oprenset fra celler transformeret med pGEX-1 og under anvendelse af bovin serumalbumin som en standard.

30 Massescreening af transformanter for ekspression af fusionsprotein udføres bekvemt på 1,5 ml kultur resuspenderet i 300 /il MTPBS. Efter lydbehandling og centrifugering blev supernatanten blandet med 50 /il 50% glutathion-agarosekugler, blev vasket med 3 x 1 ml MTPBS, og kuglerne blev kogt i 100 /il prøvepuffer til analyse på en 10% 35 NaDodS04-polyacrylamidgel (Laemmli & Favre, 1973) efterfulgt af farvning med 0,05% Coomassieblå.

DK 169975 B1 19

Stedspecifik proteolvse af fusionsproteiner

Spaltning af oprensede fusionsproteiner med thrombin blev udført ved 5 25°C i elueringspuffer indeholdende 150 mM NaCl, 2,5 mM CaClg og 100 ng human thrombin (Sigma) (Eaton et al., 1986) og 50 /jg fusionsprotein. Spaltning med human blodkoagulationsfaktor X blev foretaget ved 25°C i elueringspuffer indeholdende 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 500 ng human faktor X_ og 50 øg oprenset fusionsprotein (Nagai & α 10 Thogersen, 1984). Aktivering af faktor X (Sigma) til faktor X, blev α foretaget ved behandling med Russell s slangegiftaktiveringsenzym (Sigma) ved 37°C i 5 minutter i en reaktionsblanding indeholdende 7 /ig faktor X, 75 ng aktiveringsenzym, 8 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM NaCl og 8 mM CaCl2 (Fujikawa et al., 1972).

15

Resultater

Konstruktion og struktur af pGEX-vektorerne 20 Plasmidet pSj5 dirigerer syntesen af Sj26 i E. coli under styringen af den kraftige isopropyl-/5-D-thiogalactopyranosidinducerbare (IPTG-inducerbare) tac-promotor (Smith et al., 1987b). Gennem en række manipuleringer blev pSj5 modificeret således, at fremmede po-lypeptider kunne blive udtrykt som fusioner med COOH-enden af Sj26.

25 Det fremkomne plasmid (pGEX-1) (figur 7) indeholder (a) tac- promotoren (Amann et al., 1983, De Boer et al., 1983a) efterfulgt af den fuldstændige, kodende sekvens for Sj26 (Smith et al., 1986, 1987a), i hvilken den normale termineringscodon er erstattet med en polylinker, som indeholder unikke genkendelsessteder for restrik-30 tionsendonukleaserne BamHI, Smal og Ecol, og efterfulgt af TGA- translationstermineringscodoner i alle tre læserammer (figur 7b), (b) Ø-lactamasegenet, der givet resistens mod ampici1 lin, (c) et repli kationsbegyndelsessted og (d) et fragment af lac-operonen indeholdende det overudtrykte 1acl^-al1 el af lac-repressoren og en 35 del af lacZ. Der blev konstrueret to derivater af pGEX-1 (pGEX-2T og pGEX-3X, figur 7b), i hvilke læserammen i det multiple kloningssted er skiftet med enten en eller to nukleotider ved indføringen af oligonukleotider, som koder for spaltningsgenkendelsessekvenserne for de stedspecifikke proteaser thrombin (pGEX-2T) eller blodkoa- DK 169975 B1 20 gulationsfaktor X_ (pGEX-3X).

α

Induktion af tac-promotoren med IPTG i celler, som er transformeret med pGEX-1, resulterer i syntesen af et polypeptid med en molekyle-5 vægt på 27.500, og som består af Sj26 med ti yderligere aminosyre-rester i COOH-enden (figur 8a). Polypeptidet med en molekylevægt på 27.500 danner til trods for dets rigelige forekomst ikke uopløselige inklusionslegemer og forbliver i supernatanten fra celler lyseret ved lydbehandling og underkastet centrifugering ved 10.000 g i 5 10 minutter (figur 8b). Den COOH-terminale forlængelse til Sj26 på virker endvidere ikke binding til glutathion-agarose, og affinitetskromatografi af celleekstrakter resulterer således i den effektive oprensning af molekylet med en molekylevægt på 27.500 med udbytter på mindst 15 mg/1 kultur og i fravær af påviselig kontaminering med 15 E. coli proteiner (figur 8b). Lignende egenskaber blev observeret for de modificerede Sj26-polypeptider, som kodes af pGEX-2T og pGEX-3X, som begge indeholder 14 yderligere rester ved COOH-enden. I fravær af induceringsmiddel er det plasmidkodede lacl^-allel effektivt til undertrykkelse af transkription fra tac-promotoren (figur 20 8a), selv i E. coli-stammer, såsom C600 eller GM48 (Marinus, 1973), som bærer et vildtype lad-allel (ikke-publicerede resultater).

Ekspression og oprensning af Plasmodium falciparum antigener 25 For at undersøge den generelle anvendelse af pGEX-vektorerne som et system til ekspression og oprensning af fremmede polypeptider blev cDNA'er, som svarer til adskillige forskellige antigener fra Plasmodium falciparum, der er den organisme, som forårsager falciparum malaria, indsat i det multiple kloningssted i den hen-30 sigtsmæssige pGEX-vektor. De valgte cDNA'er koder for dele af to forskellige antigener (Ag63, Ag361), der begge er relateret til varmechokprotein 70 (Bianco et al., 1986, Peterson et al., 1987) og to antigener, som indeholder peptider gentaget i tandem (Agl6, EcoRI-RESA) (Coppel et al., 1983, Favaloro et al., 1986). I hvert 35 tilfælde blev der observeret syntese af et hyppigt forekommende giutathion-S-transferasefusionsprotein, og disse fusionsproteiner kunne oprenses ved affinitetskromatografi af celleekstrakter på immobil i seret glutathion med udbytter på mellem 1,6 og 5 mg/1 kultur (figur 9). Andre polypeptider, som med held er blevet udtrykt og DK 169975 B1 21 oprenset under anvendelse af pGEX-vektorerne, omfatter 8 andre P. falciparum antigener, ti forskellige antigener af parasitiske bændelorme Taenia ovis og T. taeniaformis og muse-interleukin-4 samt granulocytmacrofagkolonistimulerende faktor (ikke-publicerede re-5 sul tater).

Proteasespaltnina af oprensede fusionsproteiner

Anvendeligheden af pGEX-vektorerne til frembringelsen af fremmede 10 polypeptider i E. coli kan forøges, hvis glutathion-S-transferase-bæreren efter oprensning kan fjernes fra fusionsproteiner ved spaltning med stedspecifikke proteaser. Denne fremgangsmåde har vist sig at være vellykket for fusionsproteiner, som indeholder genkendelsesstedet for blodkoagulationsfaktor X. (Nagai & Thogersen, 1984) 15 eller collagenase (Germino & Bastia, 1984), men har nogle gange været ineffektiv (Allen et al., 1985).

Oligonukleotider, som koder for spaltningsgenkendelsesstedet for thrombin (Chang, 1985) eller blodkoagulationsfaktor X^ (Nagai & α 20 Thogersen, 1984), blev indført umiddelbart 5' for det multiple kloningssted i pGEX-1, hvilket frembragte pi asmiderne pGEX-2T henholdsvis pGEX-3X (figur 7b). Indføjelsen af et 580 basepar (bp) langt Rsal-EcoRI-fragment fra Ag63-cDNA'et (Bianco et al., 1986) i Smal-EcoRI-stederne i pGEX-2T resulterede i ekspressionen af et fu-25 sionsprotein med en molekylevægt på 43.000, hvilket fusionsprotein kunne oprenses på glutathion-agarose (figur 10a). Inkubering af dette protein med thrombin førte til frembringelsen af to fragmenter, det ene var glutathion-S-transferasebæreren og det andet en del af Ag63 med en molekylevægt på 22.500 (figur 10a). Effektiv spalt-30 ning skete inden for 30 minutter og ved et forhold mellem enzym og substrat på 1:500. En lille del af fusionsproteinet var bestandig mod spaltning selv efter inkubering i to timer med en ti gange højere koncentration af enzym. PÅ lignende måde resulterede ekspression af et 555 bp langt EcoRV-EcoRI-fragment af Ag63 under anvendel-35 se af pGEX-3X-vektoren i syntesen af et fusionsprotein med en molekylevægt på 43.000, hvilket fusionsprotein blev spaltet i to fragmenter med blodkoagulationsfaktor X, (figur 10b). Spaltning med faktor Xa var langsommere og mindre effektiv end med thrombin, hvilket muligvis kyldes ineffektiv aktivering af faktor X. Tre andre DK 169975 B1 22 pGEX-2T-fusioner og en yderligere pGEX-3X-fusion er blevet undersøgt for følsomhed over for spaltning med den hensigtsmæssige protease, og i hvert tilfælde blev der observeret effektiv spaltning (ikke-publicerede resultater). Ingen af proteaserne spaltede glutathion-5 S-transferasebæreren, og efter proteolyse kan således bæreren og ethvert ikke-spaltet fusionsprotein fjernes fra spaltningsreaktionsblandingen ved absorption på glutathion-agarose, hvilket kun efterlader det rensede polypeptidprodukt (figur 10).

10 15 20 25 30 35 DK 169975 B1 23

Referencer 1. Abrahamsen, L, Moks, T., Nilsson, B. og Uhlen, M. (1986),

Nucl. Acids Res. 14, 7487-7500.

5 2. Allen, G., Paynter, C.A. og Winther, M.D. (1985), J. Cell. Sci. Suppl. 3, 29-38.

3. Amann, E., Brosius, J. og Ptashne, M. (1983), Gene 25, 167-178.

10 4. Anders, R.F., Coppel, R.L., Brown, G.V., Saint, R.B., Cowman, A.F., Lingelbach, K.R. Mitchell, G.F. og Kemp, D.J. (1984),

Mol. Biol. Med. 2, 177-191.

15 5. Balloul, J.M., Sondermeyer, P., Dreyer, D., Capron, M., Grzych, J.M., Pierce, R.J., Carvallo, D., Lecoq, J.P. og Capron, A.

(1987), Nature 326, 149-153.

6. Bianco, A.E., Favaloro, J.M., Burkot, T.R., Culvenor, J.G.

20 Crewther, P.E., Brown, G.V., Anders, R.F., Coppel, R.L. og

Kemp, D.J. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8713-8717.

7. Chang, J-Y. (1985), Eur. J. Biochem. 151, 217-224.

25 8. Chen, E.Y. og Seeburg, P.H. (1985) DNA 4, 165-170.

9. Cheng, Y-S.E., Kwoh, D.Y., Kwoh, T.J., Soltvedt, B.C. og Zipser, D. (1981), Gene 14, 121-130.

30 10. Coppel, R.L., Cowman, A.F., Lingelbach, K.R., Brown, G.V.,

Saint, R.B., Kemp, D.J. og Anders, R.F. (1983), Nature 306, 751-756.

11. Cowman, A.F., Coppel, R.L., Saint, R.B., Favaloro, J.M., 35 Crewther, P.E., Stahl, H.D., Bianco, A.E., Brown, G.V., Anders, R.F. og Kemp, D.J. (1984), Mol. Biol. Med. 2, 207-221.

12. Crewther, P.E., Bianco, A.E., Brown, G.V., Coppel, R.L., Stahl, H.D., Kemp, D.J. og Anders, R.F. (1986), Methods 86, 257-264.

DK 169975 B1 24 13. Davern, K.M., Tiu, W.U., Morahan, G., Wright, M.D., Garcia, E.G. og Mitchell, G.F. (1987), Immunol. Cell. Bioil. (in press).

5 14. De Boer, H.A., Comstock, L.J. og Vasser, M. (1983a), Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25.

15. De Boer, H.A., Comstock, L.J. og Vasser, M. (1983b), DNA 2, 231-235.

10 16. Eaton, D., Rodriguez, H. og Vehar, G.A. (1986), Biochemistry 25, 505-512.

17. Favaloro, J.M., Coppel, R.L., Corcoran, L.M., Foote, S.J., 15 Brown, G.V., Anders, R.F. og Kemp, D.J. (1986), Nuel. Acids

Res. 14, 8265-8277.

18. Fujikawa, K., Legaz, M.E. og Davie, E.W. (1972), Biochemistry 11, 4892-4899.

20 19. Germino, J. og Bastia, D. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4692-4696.

20. Germino, J., Gray, J.G., Charbonneau, H., Vanaman, T. og 25 Bastia, D. (1983), Proc. Natl. Sci. USA 80, 6848-6852.

21. Gray, M.R., Colot, H.V., Guarente, L. og Rosbash, M. (1982),

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6598-6602.

30 22. Haffey, M.L., Lehman, D. og Boger, J. (1987), DNA 6, 565.

23. Harris, T.J.R. (1983). I Williamson, R. (red.), Genetic Engineering, Academic Press, London, bind. 4, 128-175.

35 24. Hartree, E.F. (1972), Anal. Biochem. 48, 422-427.

25. Harvey, J.W. og Beutler, E. (1982), Blood 60, 1227-1230.

26. Itakura, K., Hirose, T. Crea, R., Riggs, A.D., Heyneker, H.L., DK 169975 B1 25

Bolivar, F. og Boyer, H.W. (1977), Science 198, 1056-1063.

27. Kato, C., Kobayashi, T., Kudo, T., Furusato, T., Murakami, Y., Tanaka, T., Baba, H., Oishi, T., Ohtsuka, E., Ikehara, M., 5 Yanagida, T., Kato, H., Moriyama, S. og Horikoshi, K. (1987),

Gene 54, 197-202.

28. Koenen, M., Ruther, U. og Muller-Hin, B. (1982), EMBO. J. 1, 509-512.

10 29. Kleid, D.A., Yansura, D., Small, B., Dowbenko, D., Moore, D.M., Grubman, M.J., McKercher, P.D., Morgan, D.O., Robertson, B.H. og Bachrach, H.C. (1981), Science 214, 1125-1129.

15 30. Laemmli, U.K. og Favre, M. (1973), J. Mol. Biol. 80, 575-599.

31. Langford, C.J., Edwards, S.J., Smith, G.L., Mitchell, G.F.,

Moss, B., Kemp, D.J. og Anders, R.F. (1986), Mol. Cell. Biol.

6, 3191-3199.

20 32. Lowenadler, B., Nilsson, B., Abrahmsen, L., Moks, T.,

Ljungqvist, L., Holmgren, E., Paleus, S., Josephson, S.,

Philipson, L. og Uhlen, M. (1986), EMBO J. 5, 2393-2398.

25 33. McIntyre, P., Coppel, R.L., Smith, D.B., Stahl, H.D., Corcoran, L.M., Langford, C.J., Favaloro, J.M., Crewther, P.E., Brown, G.V., Mitchell, G.F., Anderson, R.F. og Kemp, D.J. (1987), Int.

J. Parasitol. .17, 59-67.

30 34. Mandecki, W. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181.

35. Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrook, J., "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

35 36. Mannervik, B. (1985), Adv. Enzymol. 57, 357-417.

37. Marinus, M.G. (1973), Molec. gen. Genet. 127, 47-55.

DK 169975 B1 26 38. Marsh, J.L., Erfle, M. og Wykes, E.J. (1984), Gene 32, 481-485.

39. Marston, A.O. (1986), Biochem. 0. 240, 1-12.

5 40. Miller, J.H., Lebkowski, J.S., Greisen, K.S. og Calos, M.P.

(1984), EMBO. J. 3, 3117-3121.

41. Mitchell, G.F., Cruise, K.M., Garcia, E.G. og Tiu, W.U. (1984), J. Parasi to!. 70, 983-985.

10 42. Nagai, K. og Thogersen, H.C. (1984), Nature 309, 810-812.

43. Nilsson, B., Abrahmsen, L. og Uhlen, M. (1985), EMBO. J. 4, 1075-1080.

15 44. Peterson, M.G., Crewther, P.E., Thompson, J.K., Corcoran, L.M., Coppel, R.L., Brown, G.V., Anders, R.F. og Kemp, D.J. (1987), DNA (in press).

20 45. Ruther, U. og Muller-Hill, B. (1983), EMBO. J. 2, 1791-1794.

46. Saint, R.B., Beall, J.A., Grumont, R.J., Mitchell, G.F. og Garcia, E.G. (1986), Mol. Biochem. Parasitol. 18, 333-342.

25 47. Sassenfeld, H.M. og Brewer, S.J. (1984), Bio. Technology 2, 76-81.

48. Schoemaker, J.M., Brasnett, A.H. og Marston, A.O. (1985), EMBO.

J. 4, 775-780.

30 49. Simons, P.C. og Vander Jagt, D.J. (1977), Anal. Biochem. 82, 334-341.

50. Simons, P.C. og Vander Jagt, D.J. (1981), Methods Enzymol. 77, 35 235-237.

51. Smith, D.B., Davern, K.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G. og Mitchell, G.F. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8703-8707.

DK 169975 B1 27 52. Smith, D.B., Davern, K.M., Board, P.G., Tiu, W.U., Garcia, E.G.

og Mitchell, G.F. (1987a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6541.

5 53. Smith, D.B., Rubira, M.R., Simpson, R.J., Davern, K.M., Tiu, W.U., Board, P.G. og Mitchell, G.F. (1987b), Mol. Biochem.

Parasitol. (in press).

54. Stanley, K.K. og Luzio, J.P. (1984), EMBO. J. 3, 1429-1434.

10 55. Stormo, G.D., Schneider, T.D. og Gold, L.M. (1982), Nuel.

Acids. Res. 10, 2971-2996.

56. Uhlen, M., Nilsson, B., Guss, B., Lindberg, M., Gatenbeck, S.

15 og Philipson, L. (1983), Gene 23, 369-378.

57. Ullmann, A. (1984), Gene 29, 27-31.

58. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. og Messing, J. (1985), Gene 33, 20 103-119.

59. Young, R.A. og Davis, R.W. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198.

25 30 35

Claims (23)

1. Rekombinant DNA-molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nukleotidsekvens, der ved ekspression koder for et fusi- 5 onsprotein, i hvilket et fremmed protein eller peptid er fusioneret med COOH-enden af enzymet glutathion-S-transferase.

2. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymet er 26 kDa glutathion-S-transferase fra Schistosoma 10 japonicum.

3. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1 eller 2, kend et eg-n e t ved, at nukleotidsekvensen ved ekspression koder for et fusionsprotein, i hvilket det fremmede protein eller peptid er fusione- 15 ret til enzymet gennem en spaltelig kobling.

4. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den spaltelige kobling er en kobling, som kan spaltes af en stedspecifik protease. 20

5. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den spaltelige kobling er en kobling, som kan spaltes af thrombin, blodkoagulationsfaktor X. eller renin. d

6. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at der heri er indsat en nukleotidsekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5.

7. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at der heri er 30 indsat en nukleotidsekvens, som er i stand til at blive udtrykt som enzymet glutathion-S-transferase efterfulgt af mindst ét restrikti-onsendonucleasegenkendelsessted til indsættelse af en nukleotidsekvens, således at det er i stand til at blive udtrykt som et fremmed protein eller peptid fusioneret til COOH-enden af glutathion-S-35 transferasen.

8. Ekspressionsvektor ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den normale transiationstermineringscodon af nukleotidsekvensen, der kan udtrykkes som et glutathion-S-transferaseenzym, erstattes DK 169975 Bl 29 med en polylinker indeholdende unikke genkendelsessteder for restri ktionsendonucleaserne BamHI, Smal og EcoRI fulgt af TGA-transla-tionstermineringscodoner i alle tre læserammer.

9. Ekspressionsvektor ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at enzymet er den 26 kDa store glutathion-S-transferase fra Schistosoma japonicum.

10. Ekspressionsvektor ifølge krav 7-9, kendetegnet ved, 10 at nukleotidsekvensen omfatter en sekvens, som er i stand til at blive udtrykt med en spaltelig kobling mellem enzymet og det fremmede protein eller polypeptid.

11. Ekspressionsvektor ifølge krav 10, kendetegnet ved, 15 at den spaltelige kobling er en kobling, som kan spaltes af en stedspecifik protease.

12. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 6-11, kendetegnet ved, at den omfatter en ekspressionsstyrings- 20 sekvens, som på funktionsdygtig måde er koblet til nukleotidsekvensen til ekspression af fusionsproteinet.

13. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 6-12, kendetegnet ved, at den er et bakterielt plasmid. 25

14. Ekspressionsvektor ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den omfatter et plasmid udvalgt fra gruppen bestående af pSjlO, pSjlODBaml og pSjl0DBam7Stop7, som defineret i eksempel 1.

15. Ekspressionsvektor ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den omfatter et plasmid udvalgt fra gruppen bestående af pGEX-1, pGEX-2T og pGEX-3X, som defineret i eksempel 2.

16. Værtscelle transformeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 35 6-15.

17. Værtscelle ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den er E. coli. DK 169975 B1 30

18. Fremgangsmåde til frembringelse af et fusionsprotein, kendetegnet ved, at værtsceller ifølge krav 16 eller 17 transformeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 6 dyrkes under sådanne betingelser, at fusionsproteinet udtrykkes i mængder, som kan 5 indvindes.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at fusionsproteinet indvindes fra cellekulturen.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at fu sionsproteinet indvindes ved, at værtscellerne lyseres, og fusi ons -proteinet isoleres fra lysatet ved at kontakte det med immobil i seret glutathion.

21. Fremgangsmåde til frembringelse af et protein eller peptid, kendetegnet ved, at der ved fremgangsmåden ifølge krav 18-20 frembringes et fusionsprotein, og at fusionsproteinet derefter spaltes til separering af det fremmede protein eller peptid fra enzymet . 20

22. Fusionsprotein frembragt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-20.

23. Fusionsprotein, kendetegnet ved, at det omfatter en 25 første sekvens svarende til enzymet glutathion-S-transferase, der ved dens C00H-ende er sammenføjet med en anden sekvens svarende til et andet protein eller peptid. 30 35