ES2255347B1 - Proteina de fusion gst-fucosidasa con actividad enzimatica alfa-l-fucosidasica. proteina recombinante alfa-l-fucosidasa humana. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a una proteína de fusión denominada GST-fucosidasa (GST-FUC), que presenta actividad enzimática alfa-L-fucosidásica, producida en la bacteria Escherichia coli mediante la expresión del plásmido recombinante pGEX-FUC. Este plásmido incluye una secuencia de cDNA que codifica la enzima alfa-L-fucosidasa humana insertada en el sitio BamHI del vector de expresión procariótico pGEX-2T, que incluye la secuencia de DNA codificante de la proteína glutatión S-transferasa (GST) del helminto Schistosoma japonicum. La proteína GST-FUC, purificada mediante cromatografía de afinidad, se digiere con la proteasa trombina para obtener la proteína recombinante alfa-L-fucosidasa humana. Estas proteínas recombinantes pueden ser utilizadas para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como para estudios estructurales.
Description
Proteína de fusión
GST-fucosidasa con actividad enzimática
alfa-L-fucosidásica. Proteína
recombinante alfa-L-fucosidasa
humana.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a la proteína de
fusión GST-fucosidasa así como a la proteína
recombinante alfa-L-fucosidasa
humana. La invención también hace referencia al DNA recombinante
que codifica la proteína de fusión GST-FUC. En
concreto, el objeto de la invención consiste en la obtención de
las proteínas recombinantes GST-FUC y
alfa-L-fucosidasa humanas, mediante
tecnología recombinante en la bacteria Escherichia coli, que
implica el uso de la secuencia nucleotídica caracterizada por SEC
ID NO 1.
La enzima
alfa-L-fucosidasa
(alfa-L-fucósido fucohidrolasa
3.2.1.51) es una glicosidasa que cataliza la liberación de restos
de fucosa a partir del extremo no reductor de oligosacáridos,
glicoproteínas y glicolípidos. La enzima humana ha sido purificada
a partir de diversos tejidos, células y fluidos, y sus propiedades
cinéticas e inmunológicas han sido estudiadas ampliamente. La
alfa-L-fucosidasa humana es una
sialoglicoproteína, en la que el componente glucídico representa
aproximadamente el 10% de su masa. La función exacta de la porción
glucídica se desconoce, aunque se ha sugerido que la presencia y
tipo de glicosilación afectan a la estabilidad y a las propiedades
cinéticas de la enzima. El componente glucídico está además
involucrado en el plegamiento, el transporte intracelular y la
secreción de esta proteína, así como en la generación de múltiples
formas moleculares [Alhadeff, JA, Trends Comp. Biochem. Physiol.,
4, 105-118, 1998].
Existe un único locus para la enzima
alfa-L-fucosidasa humana, el gen
FUCA 1, que se localiza en el brazo corto del cromosoma 1,
en la región 1p34 [Fowler, ML et al., Cytogenet. Cell Genet.
43, 103-108, 1986]. Contiene 8 exones que se
expanden a lo largo de 23 kb de DNA genómico [Kretz, KA et
al., Genomics 12, 276-280, 1992] con un marco
de lectura abierto que codifica un precursor de 461 aminoácidos
consistente en un péptido señal de 22 aminoácidos y una proteína
madura de 439 aminoácidos [Occhiodoro, T et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 164, 439-445, 1989].
La importancia de la enzima
alfa-L-fucosidasa en el metabolismo
humano se pone de manifiesto cuando se produce un descenso o la
ausencia total de actividad enzimática, provocando la aparición de
una enfermedad de almacenamiento lisosómico denominada
fucosidosis. Este desorden se caracteriza por la acumulación de
fucoglicoconjugados en el cerebro y en los tejidos viscerales de
los individuos afectados [Alhadeff, JA, Trends Comp. Biochem.
Physiol., 4, 105-118, 1998]. En la actualidad se han
descrito más de veinte mutaciones en el gen FUCA 1
relacionadas con la fucosidosis que incluyen mutaciones sin
sentido, alteraciones de la pauta de lectura, deleciones, mutaciones
de cambio de sentido y mutaciones que afectan al proceso de
eliminación de los intrones [Alhadeff, JA, Trends Comp. Biochem.
Physiol., 4, 105-118, 1998].
La presente invención se refiere a la obtención
de un vector recombinante, denominado pGEX-FUC,
que permite la expresión de la enzima
alfa-L-fucosidasa (FUC) humana en
la bacteria Escherichia coli como una proteína de fusión con
la enzima glutatión S-transferasa (GST) de
Schistosoma japonicum. La proteína de fusión
GST-fucosidasa se purificó mediante cromatografia
de afinidad con glutatión sepharosa 4B y fue enzimáticamente
activa. Tras digestión con la proteasa trombina y posterior
electroelución se obtuvo la proteína
alfa-L-fucosidasa humana purificada.
La proteína de fusión GST-FUC y la proteína
recombinante alfa-L-fucosidasa
humana pueden ser útiles para la preparación de anticuerpos
policlonales y monoclonales, así como para estudios
estructurales.
Figura 1. Oligonucleótidos diseñados para la
amplificación por PCR de la secuencia codificante de la enzima
alfa-L-fucosidasa humana con
extremos BamHI.
Figura 2. Mapa del plásmido recombinante
pGEX-FUC, indicando algunos elementos
estructurales: promotor tac (Ptac); secuencia de la
enzima glutatión S-transferasa (GST); secuencia de
la enzima alfa-L-fucosidasa humana
(FUC), secuencia de la enzima beta-lactamasa
(b-lactamase), secuencia del represor del operón de
la lactosa (lacI^{9}), sitios de reconocimiento de la
endonucleasa de restricción BamHI (BamHI).
Para la expresión de la enzima
alfa-L-fucosidasa humana en
Escherichia coli, como proteína de fusión con GST, se usó
el vector procariótico pGEX-2T (Amersham
Biosciences). Este plásmido, con un tamaño de 4948 pb, contiene los
siguientes elementos estructurales: un promotor tac
(Ptac), un promotor híbrido trp-lac
que contiene la región - 35 del promotor trp unido a la
región -10 del promotor lacUV5; la secuencia codificante
completa de la proteína GST en la que el codón de terminación ha
sido sustituido por un sitio de inserción múltiple que contiene
las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de
restricción BamHI, SmaI y EcoRI, seguidas por
codones de terminación de la traducción en los tres marcos de
lectura; la secuencia de reconocimiento de la proteasa trombina;
el gen codificante de la \beta-lactamasa
(Amp^{R}); el origen de replicación de pBR322
(ori); y un fragmento del operón lac conteniendo el
alelo lacI^{q} (Smith y Johnson, 1988). La secuencia del
plásmido pGEX-2T puede consultarse en la base de
datos GenBank en el número de acceso U13850. Se crearon sitios de
restricción BamHI en ambos extremos del cDNA codificante de
la enzima alfa-L-fucosidasa humana,
mediante PCR, usando los oligonucleótidos FucD y FucR (Figura 1).
Como molde se utilizó un plásmido pUC19 que contenía el cDNA
codificante de la enzima
alfa-L-fiicosidasa humana. El
producto de PCR se sometió a digestión con la enzima BamHI y
se ligó con el plásmido pGEX-2T digerido con
BamHI y tratado con fosfastasa alcalina. El resultado de la
reacción anterior se utilizó para transformar células competentes de
Escherichia coli de la cepa TG2. El análisis con
endonucleasas de restricción permitió la selección de los clones
bacterianos que contenían el inserto en la orientación adecuada. La
identidad de uno de los clones se confirmó determinando la
secuencia del inserto, y el plásmido recombinante obtenido se
denominó pGEX-FUC (Figura 2). Los transcritos de RNA
mensajero que se inicien en el promotor tac de
pGEX-FUC codificaran la proteína de fusión
GST-FUC, formada por 226 aminoácidos del extremo
N-terminal de la proteína GST fusionados con la
secuencia completa de la proteína precursora de la enzima
alfa-L-fucosidasa humana (461
aminoácidos).
La enzima
alfa-L-fucosidasa humana se expresó,
como proteína de fusión con GST, transformando células competentes
de Escherichia coli de la cepa BL21 con el plásmido
pGEX-FUC. Las bacterias se crecieron a 30ºC hasta
alcanzar la fase logarítmica y la expresión de la proteína de
fusión se indujo añadiendo al cultivo
isopropil-beta-D-tiogalactopiranó
sido (IPTG) a una concentración final de 0,1 mM y continuando la
incubación durante 180 minutos. Para la obtención del extracto
celular, el cultivo bacteriano se centrifugó a 4.800 rpm y 4ºC
durante 15 minutos para sedimentar las células que, a
continuación, se resuspendieron en un volumen de PBS (140 mM NaCl;
2,7 mM KCl; 10 mM Na_{2}HPO_{4}; 1,8 mM KH_{2}PO_{4}; pH
7,3) equivalente a 1/20 del volumen de cultivo inicial. A
continuación, las muestras se centrifugaron en las condiciones
descritas y se resuspendieron en un volumen de disolución de lisis
(50 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; pH 8,0)
que contenía inhibidores de proteasas, (Complete™, Boehringer
Mannheim). Seguidamente, las bacterias se lisaron mediante un
tratamiento con ultrasonidos que se realizó utilizando un aparato
"Sonifier cell disruptor 450" de Branson, con una punta de
2,5 mm de diámetro.
El lisado bacteriano, obtenido según consta en
el apartado anterior, se centrifugó a 10.000 rpm y 4ºC durante 15
minutos y se obtuvieron dos fracciones, sobrenadante y precipitado.
La proteína GST-fucosidasa se purificó a partir del
precipitado bacteriano mediante cromatografia de afinidad con
glutatión sepharosa 4B (GS4B). El precipitado se resuspendió en 50
mL de disolución de lisis que se mezclaron con 12 mL de la resina
GS4B y se incubaron en agitación suave durante 1 hora a 4ºC. A
continuación, la resina se sedimentó mediante centrifugación a 500
x g y 4ºC durante 5 minutos. Posteriormente, se realizaron tres
lavados a 4ºC, durante 15 minutos cada uno, con cinco volúmenes de
PBS. Seguidamente, se llevó a cabo la elución de la proteína de
fusión GST-fucosidasa, incubando la resina en un
volumen de disolución de elución [glutatión reducido (GSH) 7,5 mM,
Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5] a 4ºC durante toda la noche
en agitación suave. Posteriormente, la resina se sedimentó por
centrifugación a 500 x g y 4ºC durante 5 minutos, y se recuperó el
sobrenadante, que contenía la proteína de fusión
GST-fucosidasa. Mediante esta cromatografia de
afinidad se obtuvieron 65 mg de la proteína de fusión
GST-fucosidasa a partir de 1 litro de cultivo
bacteriano.
Se determinó la actividad
alfa-L-fucosidásica de la proteína
de fusión GST-fucosidasa purificada utilizando el
sustrato fluorimétrico
4-metil-umbeliferil-alfa-L-fucopiranósido
(4-MU-fucósido) siguiendo un método
descrito previamente [Alhadeff, JA, O'Brien, JS, Practical \cdot
Enzymology of Sphingolipidoses, Alan R. Liss, New York, 1977]. La
proteína GST-fucosidasa mostró su máxima actividad
a pH 5,0 y valores de Km y Vmax de 0,18 \pm 0,01 mM y 7,90 \pm
0,19 mU/mg, respectivamente.
La proteína de fusión
GST-fucosidasa se sometió a digestión con la
proteasa trombina. Para ello, 200 \mug de la proteína de fusión
purificada se incubaron con 20 unidades de trombina a 24ºC durante
17 horas. El producto de la digestión se sometió a electroforesis
preparativa y la enzima
alfa-L-fucosidasa se recuperó por
electroelución utilizando un aparato de electroelución modelo 422
de BioRad. Esta proteína presentó una masa molecular en geles de
poliacrilamida de aproximadamente 51 kDa, y su identidad se
confirmó al ser reconocida por un antisuero
anti-alfa-L-fucosidasa
de placenta humana.
<110> Alejandro de Carlos Villamarín
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de fusión
GST-Fucosidasa con actividad enzimática
alfa-L-fucosidásica. Proteína
recombinante alfa-L-fucosidasa
humana
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200301185
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 29.05.2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2061
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 689
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Molécula de DNA recombinante, denominada
pGEX-FUC, caracterizada por SEC ID NO 1 que
consiste en una secuencia de cDNA que codifica la enzima
alfa-L-fucosidasa humana insertada
en el sitio BamHI del vector de expresión procariótico
pGEX-2T, que incluye la secuencia de DNA
codificante de la proteína glutatión S-transferasa
del helminto Schistosoma japonicum.
2. Células huésped de Escherichia coli de
la cepa BL21 transformadas con el vector recombinante formado
según reivindicación 1.
3. Proteína de fusión
GST-fucosidasa (GST-FUC)
caracterizada por SEC ID NO 2, con actividad enzimática
alfa-L-fucosidásica, obtenida
mediante la inducción con
isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido
de las células formadas según la reivindicación 2 y purificada
mediante cromatografia de afinidad con glutatión sefarosa 4B.
4. Proteína recombinante
alfa-L-fucosidasa humana
caracterizada por SEC ID NO 3, obtenida a partir de la
proteína de fusión GST-fucosidasa, formada según
reivindicación 3, mediante digestión con la proteasa trombina y
electroelución.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301185A ES2255347B1 (es) | 2003-05-21 | 2003-05-21 | Proteina de fusion gst-fucosidasa con actividad enzimatica alfa-l-fucosidasica. proteina recombinante alfa-l-fucosidasa humana. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301185A ES2255347B1 (es) | 2003-05-21 | 2003-05-21 | Proteina de fusion gst-fucosidasa con actividad enzimatica alfa-l-fucosidasica. proteina recombinante alfa-l-fucosidasa humana. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2255347A1 ES2255347A1 (es) | 2006-06-16 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2255347B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ224663A (en) * | 1987-05-28 | 1990-11-27 | Amrad Corp Ltd | Fusion proteins containing glutathione-s-transferase and expression of foreign polypeptides using glutathione-s-transferase encoding vectors |
-
2003
- 2003-05-21 ES ES200301185A patent/ES2255347B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DE CARLOS, A. et al. "Purification of human alpha-l fucosidase precursor expressed in Escherichia coli as a glutathione S- transferase fusion proteine". JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: ANALYTICAL TECHNOLOGIES IN THE BIOMEDICAL AND LIFE SCIENCES. 25.03.2003. Vol. 786 (1-2), páginas 7-15, todo el documento. * |
| OCCHIODORO, T. et al. "Human alpha-L-fucosidase: Complete coding sequence from cDNA clones". BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS. 16.10.1989. Vol. 164, nº 1, páginas 439-445, todo el documento. \\ Y 1-3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2255347A1 (es) | 2006-06-16 |
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