JPS63501953A - 毛管内皮細胞プロテア−ゼ合成、ｄｎａ合成および遊走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 毛管内皮ＩＢ胞ブＯテアーゼ合　、ＤＮＡ合　およびを促進することの出来るヒ ト胎盤内管ン成誘導囚本出願はＨｏ５ｃａｔｅｌｌｉらの毛管内皮細胞プロテア ーゼ、ＤＮＡ合成および遊走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子 という表題の、１９８５年１２月１７日出願の米国特許出願番号Ｎα８０９．８ ７３の継続出願である。

発明の背景 血管形成誘導因子は種々の性質、即ち、（１）内皮細胞増殖；（り内皮細胞プロ テアーゼ合成増加；（３）蛋白質の位置方向への内皮ｍ胞遊走の促進：および（ ４）生体内毛管増殖の誘起の能力を有する蛋白質として定義されている。特に血 管形成誘導因子として分類される物質は内皮細胞のＤＮＡ合成に影響することで 有糸分裂促進能を有し、従って内皮細胞増殖の速度および血管形成の速度を高め ることが観察されている。

この性質と関連して血管形成誘導因子は内皮細胞によるプロテアーゼ合成を増加 する能力がある。これらプロテアーゼとしてはブラズミノーグン活性化因子（Ｐ Ａ）およびコラゲナーゼがある。具体的には血管形成誘導因子はＰＡおよび潜伏 性コラゲナーゼの合成を促進し、ＰＡはプラスミン前酸素を特異性の広いプロテ アーゼである活性型プラスミンに変換し、これが潜伏性コラゲナーゼを活性型コ ラゲナーゼに変換する。活性型プラスミンおよび活性型コラゲナーゼの２つの酵 素は周囲の組織中のほとんどの蛋白質を分解することができ、従って毛管内皮細 胞等の種々組織の侵蝕を高める。さらに血管形成誘導因子は特に毛管内皮細胞の ようなある種の細胞では化学走性を示し、即ち、血管形成誘導因子はそのような １！ＡＩＩａがそれら因子の方向へ遊走するよう誘導する。

これらの特性を念頭に、血管形成誘導因子を単離することによって器官への血液 供給を増加させることの出来る治療剤を創製することができると考えられた。例 えばある種の心筋梗塞後梗塞の結果中断した心臓への血液供給の再成を促進する こと、或いは慢性閉鎖症で血管の再生長を促進することが望ましい。ざらに、血 管形成誘導因子の使用によりＷ癒、外科切開および特に老人および糖尿病患者の 遅延冶掴性創傷の回復を促進できる。ざらに本物質をやけどに応用すれば治癒の 速度や程度を高めることができる。従ってヒトに対する治療応用に適した精製血 管形成誘導因子を検索した。さらに血管形成を促進する物質を研究することによ りガン細胞への血液供給を阻害し、ガンを飢死させる方法が見つかると考えてい る科学者もいる。

既に「血管形成誘導因子」と称する蛋白質のクラスが同定されているが、これら の蛋白質はヒト以外の動物から単離されている。ヒト以外の動物から単離される 血管形成誘導因子は異種蛋白質に対する免疫反応副作用の可能性のためにヒトへ の治療剤としての使用に適当でないと考えられる。その上、これらの個々の非ヒ ト蛋白質が上述の血管形成誘導因子としての４つの特質を有するかどうか、また 観察される性状が蛋白質の組合せの間での相互反応に起因するのかどうか確認さ れていない。

事実、内皮Ｉｌｌｌｌ系分裂促進作用を有するとされる各種蛋白質は２つのクラ スに分類される：ヘパリン−セファロースより１ＭのＮａＣ；１で溶出され、酸 性ｐ■を有する外皮細胞生育因子様分子：およびヘパリン−セファロースにより 強度に結合し、塩基性ｐ■を有する線維芽細胞生育因子様分子である。ざらに本 発明者らは最近バーバード医学部のＶａｌｌｃｅらによりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ１２４巻、５４８０−５４９９頁（１９８５年）に出版された論文で［アン ジオジエニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）　Ｊと記載されている第三の血管形成誘 導因子が存在すると信じている。アンジオジエニンは真の血管形成誘導因子の性 状を有しているが有糸分裂促進作用のみ持たぬ点で区別される。

これらのいろいろな研究を基に本発明者らは検討を重ね、ＦＧＦ　と分類され得 るヒト胎ｆｉｉｌＪ１から単離塩基性 されるものと実質的に同質であって単一分子の、上述の性状、即ち、有糸分裂促 進性、化学定性で生体内で毛管の増殖を起させると共にプロテアーゼ合成を促進 する性質を有するヒト血管形成誘導因子を発見した。ざらに本発明者らは本血管 形成誘導因子をヒト胎盤組織より実質的にｙＩ製した状態で単離することを試み た。この単離した血管形成誘導因子のアミノ酸配列が決定された。このアミノ酸 配列の決定により本血管形成誘導因子の合成のための組換えＤＮＡ法に有用な染 色体またはｃＤＮＡ配列を得るのに利用するＤＮＡプローブの入手が可能となる 。

１貝Ｊと」ｎ・ 本発明は血管形成誘導因子一般、さらに詳しくはＦ　Ｇ　Ｆ　、、Ａ基性と分類 される血管形成誘導因子に関するものである。特に本発明はヒト胎盤組織から単 離され得るものと実質的に同等であり、有糸分裂促進および化学走性能を有し、 プロテアーゼ合成を誘導して生体内で毛管増殖を起させることが出来るＦ　Ｇ　 Ｆ　ｇ　基性血管形成誘導因子に関する。

本発明の目的はこれらの性質を有する血管形成誘導因子をｔｉ製した状態で提供 することである。ざらに本発明の目的はこのような血管形成誘導因子のアミノ酸 配列を決定することである。さらに本発明の目的としてはプロテアーゼ合成を促 進する能力と共に有糸分裂促進および化学走性能の性質を示す医薬品調製物とし て価値のあるＦＧＦ　を精製した形で提供することがある。

塩基性 本発明のその他の目的および利点は以下の記載に示され、また記載より明かであ るか、或いは本発明の実施から習得される。これらの目的および利点は特に添付 の請求の範囲に指摘するような方法および手段で実現し、達成できる。

目的の達成のため、また本発明の目的に沿って、有糸分裂促進活性、化学定性活 性、プロテアーゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグループから選ばれ る活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する血管形成誘導因子が明かにさ れる。ヒト由来または合成のその血管形成誘導因子はＦ　Ｇ　Ｆ　ｇ　基性と分 類され、ヒト胎盤組織から単離され得る天然の血管形成誘導因子と実質的均質性 を呈する。

血管形成誘導因子自体がプロテアーゼ合成を促進できるのが好ましいのであるが 、ここで使用する「プロテアーゼ」という詔は活性型と前駆体とを含む。そのよ うな前駆体としては潜伏性またはブローコラゲナーゼがある。

さらに本発明の範囲内に含まれるがプロテアーゼ合成を直接促進はしないような 血管形成誘導因子を単離することも可能である。しかしそれらの血管形成誘導因 子は生物応答を起し、その結果プロテアーゼ合成を促進する。

従って、本発明の血管形成誘導因子は直接または間接にプロテアーゼ合成を促進 する。

本発明による特に好ましい血管形成誘導因子は以下の中核アミノ酸配列を有す： ざらに次の配列を有するペプチドが中核配列外のポリペプチド内に存在する。

Ｋ−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−に−Ａ−Ｉ−Ｌ−Ｆ’−Ｌ−Ｐ−Ｍ −５−ＡｍＫＹ−（）−ｓ−ｗ−ｙ−ｖ−（）−Ｌ−（）およびここに示す配列 中カッコは完全に同定されていない一つのアミノＩｊｉ残基の存在を示す。もう 一つの特に好ましい血管形ｌｉ誘導因子は以下の配列を有す。

Ｇ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｇ−５−Ｉ−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｇ− Ｇ−５−Ｇ−Ａ−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ（−Ｆ−に−Ｄ−Ｐ−に−Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｃ −に−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｆ’−Ｌ−Ｒ−Ｉ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ− Ｖ−Ｒ−Ｅ−に−５−Ｄ−Ｐ−Ｈ−ニーに−Ｌ−０−Ｌ−０−人−Ｅ−Ｅ−Ｒ− Ｇ−Ｖ−Ｖ−５−ニーに−Ｇ−Ｖ−Ｃ−Ａ−Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｍ−に−Ｅ− Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ａ−５−に−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆ’−Ｅ −Ｒ−Ｌ−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｒ−５−Ｒ−に−Ｙ−Ｔ’−５− Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−に−Ｒ−Ｔ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−に−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ−Ｇ− Ｐ−Ｇ−０−に−Ａ−ニーＬ−Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｍ−５−Ａ−に−５゜上述の略号で 表わされるアミノ酸は以下の「好ましい実１Ｍ態様の説明」の中に記載されてい る。

さらに、目的を達成するためそして本発明によってヒト胎盤組織から単離できる 天然の１ｆ［Ｉ管形成誘導因子の実質的に精製されたものが開示される。またざ らに、目的を達成するため、また本発明の目的によって少なくとも１つの活性成 分、本発明により記載される血管形成誘導因子を含有する医薬品組成物が開示さ れる。

上記の一般記述および以下の詳細な記載は例示および説明のためのみのものであ って、請求の範囲にある本発明を制限するものではないのは言うまでもない。

好ましい実１Ｍ態様の説明 本発明の現状で好ましい実１Ｍ態様を記載するが、この上述のように、本発明は 精製された形で単離された血管形成誘導因子に関する。好ましくは本発明の血管 形成誘導因子はヒト胎盤組織から単離され得る天然の血管形成誘導因子と実質的 に同質で、免疫的に同等であって特に好ましくは生物学的に同等である単一ポリ ペプチド鎖蛋白質である。本明細書および請求の範囲で用いている「生物学的に 同等」というのは、本発明の組成物が天然の血管形成誘導因子と同じように、し かし必ずしも同じ程度ではなく有糸分裂促進活性および化学走性能を有し、プロ テアーゼ合成を誘導することが出来るという事を意味する。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いている「実質的に同質」というのは 、今までに報告され、精製されている実質的に同質な血管形成誘導因子が示すよ りもより高い天然血管形成誘導因子とのホモロジーを意味する。好ましくはホモ ロジーの程度は５０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％以上高 く、特に好ましい蛋白質は天然の蛋白質と８５％或いは９０％のホモロジーであ る。上記ホモロジーの程度は、特に参考文献として採用する＾ｔｌａｓ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　、第５巻、 １２４頁（１９７２年）、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　’１７シントン、Ｏ，Ｃ，、中でＨ，０ ，Ｄａｙｈｏｆｒ　ｋ：より記載されルヨウに、配列に加えるために１００個の アミノ酸の長さに４ギヤツプを導入し、比較する配列で同一アミノ酸を並べて二 本の配列の短い方の配列で見られるアミノ酸残基のパーセントとして計算する。

ここに記載する本発明の血管形成誘導因子はヒトより単離されるか、または合成 のポリペプチドである。「合成」ポリペプチドという用語は今まで天然から実質 的に精製した形で単離されていないアミノ酸配列のことを言う。この定義を用い ると、「合成」という中には他の物と共に組換えＤＮＡ法により創、造されるポ リペプチドまたは全体または一部分を試験管内で合成したものを含む。

特に以下に記載される好ましい配列と１個または２個のアミノ酸が異なる合成ポ リペプチドが企画される。

本発明による好ましい血管形成誘導因子はヒト胎盤組織抽出物より発見され、初 めて精製した形で単離された。

本出願の目的において、ここに開示する血管形成誘導因子に関して使用する「純 粋の形」または「精製した形」というのは血管形成誘導因子以外の他の蛋白質を 実質的に含有していない事をいう。好ましくは本発明の血管形成誘導因子は少な くとも５０％の純度、好ましくは７０％の純度であり、もつと好ましくは８０％ または９０％の純度である。

さらに、本発明の血管形成誘導因子は種々の肢瘍および正常細胞から単離された 。その例として５Ｋ−ＨｅｐＪ細胞、ＨｅＬａｍ胞、Ｋ５６２ｉｉ１胞およびヒ ト胎児肺線維芽細胞などがある。

本発明の血管形成誘導因子は次のステップより成る方法によりヒト胎盤組織から 純粋に単離できる：Ｑヒト胎盤組織の採取：（ハ）組織中の蛋白性物質の分画に よるとｌ−胎盤組織からの血管形成誘導物質の単離；（へ）血管形成誘導因子活 性を有する画分の同定：および（へ）血管形成誘導因子活性を示す両分の濃縮。

好ましい実施態様では、ヒト胎盤組織に存在する蛋白性物質はヘパリンアフイニ テイクロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフィーおよび任意にゲル濾過 クロマトグラフィーの組合せにより分画する。ここで述べる血管形成Ｍ導因子は 胎盤蛋白質特異性のモノクローナル抗体を使用しても単離できる。この具体例で は抗原を胎盤蛋白質に対するモノクローナル抗体を含有するマトリックス（樹脂 ）に結合し、樹脂を緩衝液で洗滌することにより非抗原性蛋白質を除去する。次 に高いｐ＋＋または低い１）ｌ（の緩衝液、高イオン強度の緩衝液或いはカオト ロピック剤を単独または組合せで温度を変化させることにより抗原を抗体から除 去する。

このようにして得られた両分につき而管形成誘導因子活性の存在を検索する。好 ましくは適当な内皮細胞培養、好ましくはｌ乳動物毛管内皮１胞を血管形成誘導 因子の存在下でインキュベートし、培地中の潜伏性コラゲナーゼおよび細胞内の ＰＡを測定することによりＰＡおよびコラゲナーゼ合成への影響を評価すること により行なった。血管形成誘導因子により誘発された細胞が生成するプロテアー ゼの量はＥＬｒＳＡまたはＲＩＡアッセイ或いは免疫沈降法のような免疫学的方 法により測定する。

血管形成誘導因子の有糸分裂促進活性は好ましくは適当な内皮細胞、好ましくは 哺乳動物の毛管内皮細胞を血管形成誘導因子および放射標識ヌクレオチド、好ま しくは１２５■−沃化デオキシウリジン（１２５１−ｄｔＪ）の存在下でインキ ュベートすることにより測定する。トリクロール酸不溶性画分に取り込まれる１ ２５ｒ　ａｕの量をＤＮＡ合成の程度の指標として測定する。血管形成誘導因子 の化学走性能は、適当な内皮細胞培養、好ましくは哺乳動物毛管内皮ｍ胞を血管 形成誘導因子の存在下でインキュベートし、適当な槽中、好ましくは改良型Ｂｏ ｙｄｅｎチャンバー中で細胞の移動性を測定することにより判定する。

上述のように本発明者らは血管形成誘導因子をヒト胎盤組織から今まで得られて いない精製した形で単離することに成功した。本蛋白質をｆｉｌＥＩした形で単 離することは、本蛋白質の正しい配列決定並びに血管形成誘導因子を含む医薬組 成物の開発に必須である。

本発明の好ましい血管形成誘導因子は以下の中核アミノ酸配列を有する： さらにに−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−に−Ａ−ニーＬ−Ｆ’−Ｉ、 −Ｐ−Ｍ−５−Ａ−におよびｙ−０−ｓ−ｗ−ｙ−ｖ−Ｄ−Ｌ−０ なる配列を有するペプチドが中核配列外に存在する。もう一つの特に好ましい血 管形成誘導因子は次の配列を有する： Ｇ−Ｔ−８−Ａ−Ａ−Ｇ−５−Ｉ−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｇ− Ｇ−５−Ｇ−Ａ−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｆ’−に−Ｄ−Ｐ−に−Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｃ −に−蓼一〇−Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−ニーＨ−Ｐ−Ｃ１−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ− Ｖ−Ｒ−Ｅ−に−５−１）−Ｐ−Ｈ−Ｉ−に−Ｌ−Ｑ−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｒ −Ｇ−Ｖ−Ｖ−５−Ｉ−に−Ｇ−Ｖ−Ｃ−Ａ−Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｍ−に−Ｅ −Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ａ−５−に−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｃ−Ｆ’−Ｆ−Ｆ− Ｅ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−：＋−Ｔ−Ｙ−Ｒ−５−Ｒ−に−Ｙ−Ｔ−５ −Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−に−Ｒ−Ｔ−Ｇ−０−Ｙ−に−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ−Ｇ −Ｐ−Ｇ−０−に−Ａ−Ｉ−Ｌ−Ｆ’−Ｌ−Ｐ−Ｍ−５−Ａｍに−５゜上記略号 は例えばＡ、　Ｌ、　ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

第２版、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、ニューヨーク（１９ ７５年）、７２頁に記載される標準のアミノ酸配列略号に対応する。請求されて いる血管形成誘導因子の活性は本来のポリペプチドから１５．１６．１７または １８個のＮ末端アミノ酸残基を除去しても影響されることはないと考えられてい る。従って、これらの省略配列の全てが本発明に含まれる。その上、本来のポリ ペプチドのＮ−末端アミノ酸に１１０個のアミノ酸までを延長することも企画さ れる。

また本発明の血管形成誘導因子のＣ−またはＮ−末端にポリペプチド鎖を付加す ることも考えられる。特に、ポリペプチド鎖はいずれかの末端に蛋白質融合技術 により結合される。これらの添加ポリペプチドは本発明の血管形成誘導因子の薬 効を高める役割を任う。例えば他のポリペプチドとの融合により本ポリペプチド が低＋）Ｈまたは高温下で活性を保持できるようになるか、或いは得られるポリ ペプチドが長い循環寿命、分解に対するより高い抵抗性を有するようになるかま たは小腸上皮を通しての透過性が増加する。

しかし、これらの変化でアミノ酸配列の変異は本血管形成誘導因子を投与する生 物での免疫応答副作用を起すようであってはいけなく、そのような副作用は血管 形成誘導因子に由来する利点が保証されないほどの損害となり得る。生物活性分 子がそのような免疫応答副作用を起すかどうかの判定方法は通常の技術の熟練者 に周知である。

本発明の血管形成誘導因子および本明細書で開示されるアナログは右糸分裂促進 或いは化学走性能を有し、またプロテアーゼ合成を促進する能力を持つ医薬製品 の形でヒトおよび動物に応用される。少なくとも一つの活性医薬品組成物は目的 の剤形によりまた適当な医薬的に許容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤、お よび他の賦形剤を含有する。経口投与用には活性蛋白質の消化管中の分解を防ぐ 手段をとらねばなら゛ない。従って賜溶皮剤形が経口投与に適当な一つの形とし て考えられる。非経口投与を採用する場合には、調製物は水または塩溶液或いは 他の医薬的に許容される溶液剤を含有する。・一般に非経口投与のための調製物 は最終的に全体で体液と同じ浸透圧となる十分濃度の塩化ナトリウムを含むのが 好ましい。本発明の血管形成誘導因子を含む医薬品調製物で傷、外科切開または 皮膚潰瘍の治療のため注射または局部投与のように局所投与用も考えられる。さ らに心筋梗塞後の心臓への血液供給を再開するための投与用に徐放性挿入剤も考 えられる。

上述の各疾病の治療に適当な投与量および前述のデリバリ−法に使用する適量を 決定するのに必要な計算は普通の技術の熟練者により常法で行なわれ、特に標準 アッセイや水明ＷＡ書に開示するアッセイを考慮に、不必要な実験をしないで通 常できる植囲のものである。計算した投与量は適当な投与量応答データー合わせ て有効投与量を決定する確立したアッセイを用いることにより確認される。

本発明の牧えの具体的な個々の問題や状況に応じた応用は本明細書に含まれる教 えを考慮して通常の技術熟練者の能力範囲内のものである。本発明の生成物の例 およびその単離および製造の代表的な方法は以下の例に示す。

胎盤組織からのヒト血管形成誘導因子のｔｌｉＩ製Ａ、蛋白質の精製 出産後の満期ヒト胎盤を一２０℃で凍ｌ；！ｉする。凍結胎盤を小片に切り、電 気食品チョッパー（Ｇｅｎｅｒａ　ｌＳｌｉｃｉｎｇ、ニューヨーク州、バルデ ン）でひき、食品用加工機でホモジナイズする。ホモジナイズ後の操作は全て一 ４℃で行なう。ホモジナイズした胎盤を冷２０＋ａＨトリス、ｐＨ７，５，３ｍ ）Ｉ　ＥＤＴＡで希釈し、５０Ｗ（モデル１８５ソニケーター、Ｂｒａｎｓｏｎ 　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃｏ、、ニューヨーク州、プレーンビュー）で１０ 分間ソニックにかける。通常１幻の凍結胎盤から２リツトルの処理物を得る。

音波処理物を塩酸でｐＨ４とし、２分間このｐＨにインキュベートした後ＮａＯ Ｈで中和する。ＮａＣｊ！を終濃度０．５８となるように添加してから１０．Ｏ ＯＯＸｇで６０分間遠心分離する。上澄液を０．５ＨＮａＣ１／３ｇ＋ＨＥＤＴ Ａ　１２０ｗＨトリス、ｐＨ７，５で平衡化したヘパリン−セファロース（ファ ルマシア、ニューシャーシー州、ビス力タウエイ）のカラム、８５Ｘ１５３ａｎ １にのせる。カラムを同じ緩衝液で洗い、２ＨＮａＣＪｌ／３畑ＨＥＤＴＡ／２ ０腸Ｈトリス、ｐＨ７，５で溶出する。

溶出液を３ｍＨＥＤＴＡ／２０１ＲＨトリス、１）８７．５で希釈して電導度を ２４　ｍｏ＋ｈｏとし、二回目のヘパリン７セフアロースカラム（１６Ｘ１９０ ｍ＋）にのせる。カラムを３ｗＨＥＤＴＡ／２０ｍＨトリス、ｐＨ７，５、中０ ．７８ＮａＣ１溶液で洗い、同じＭ功液中ＮａＣｊ！の０．７から２Ｈの勾配で 溶出する。

各両分につきプロテアーゼ誘導活性を測定し、活性画分を三回目のヘパリン−セ ファロースカラム（１２Ｘ７５　ａｍ　）で濃縮する。カラムを先ず３＋＋＋Ｈ ＥＤＴＡ／２０ｍＪ−リス、ｐＨ７，５、中０．８Ｍ、ＮａＣｊ！溶液で、次に ０．１Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ６，０、中０．２ＨＮａＣｊ！溶液で洗滌し、 ０．１Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ６，０中０．２ＨＮａＣＪＩ溶液で溶出する。

三回目のヘパリン−セファロースカラムからの活性画分を２０倍員の０．１８り ん酸ナトリウム、ｐＨ６，０で希釈する。

希釈液を１０．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離してから同じ！ｌｌ液液平衡化し た９Ｘ７２１ｍのＣＭ−セファデックスＣ−５０カラム（ファルマシア）にのせ る。カラムを０．１Ｍりん酸ナトリウム中０．１５Ｍ５０．５Ｍおよび２ＭのＮ ａＣＪ溶液で順次溶出し、各両分のプロテアーゼ誘導活性を測定する。

プロテアーゼ誘導活性を含むＣＭ−セファデックスカラムからの０．５８　Ｎａ Ｃｊ！溶出液を０．５ａｅのヘパリン−セファロースカラムで濃縮する。このカ ラムは６０ＤＩＭりん酸ナトリウム、ｐＨ６，０，中２ＨＮａＣ１溶液の０、！ Ｍずつで順次洗う。活性は全て最初の１１ｄに溶出された。この溶出液につき、 ２ＨＮａＣ１，６０１１Ｈりん酸ナトリウム、ｐＨ６，０を用い、流速０．５ｄ ／ｓｉｎでＦＰＬＣスベロース−１２のカラム（ファルマシア）にかける。

本発明の請求の範囲にある血管形成誘導因子はこの溶出液から単離される。この 血管形成誘導因子は本例中で「蛋白質」とも呼ぶ。

Ｂ、　の性　および血管形成誘導因子活性の確認１、ＮａＤｏｄ　５ｏ４−ＰＡ ＧＥ ＮａＤｏｄ　Ｓ０４ポリアクリルアミドゲルを用い、３％の上層ゲルおよび１０ −１８％勾配の分解ゲルを調製し、特にここに参考文献として採用するＮａｔＵ ｒｅ２７７巻、６８０−６８５頁（１９７０年）に記載されるＬａｅｌｌｌｌｌ ＋の方法に従って泳動する。カラムからの活性画分はＮａＤＯｄ　５ｏ４−ＰＡ ＧＥｒ分子ｆｆ１１８，７００の単一バンドであった。

２、蛋白測定 蛋白濃度はウシ血清アルブミンを標準として用いた８ｉｏ−Ｒａｄ蛋白アッセイ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ、カリフォルニア州、リッチモン ド）により測定する。本蛋白質の配列に関する情報は例４に記載する。

３、有糸分裂促進活性−■−沃化デオキシウリジンの取り込み 屠殺したばかりの一才牛の副腎皮質よりウシ毛管内皮（ＢＣＥ）細胞を、ここに 参考文献として採用するＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　０３ ４７６巻、５２１７−５２２１頁（１９７９年）に報告されているＦＯｌｋｌｌ ａｎらの方法により単離する。特にここに参考文献として採用するＪ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、　９５巻、９７４−９８１頁（１９８２年）中でＧｒｏｓｓらに より記載されるようにマウス肉腫１８０細胞で条件づけした培地で補足した１０ ％（Ｖ／Ｖ）仔つシ血清加アルファ最少必須培地＜ＭＥＭ）中でｌｉＩ胞をフン フルエンドになるまで生育させる。コンフルエントに到達したら培地を５％仔ウ つ血清加の条件因子を含まぬＭＥＭ培地と交換する。

ＢＣＥＩ［ｌ胞のフンフルエンド培養物を５％仔ウつ血清加ＭＥＭ培地中で７日 間維持する。その後培地を各種濃度の精製胎盤血管形成誘導因子を含む５％仔ウ つ血清加ＭＥＭ培地に変える。２０時間後に培地を５％仔ウシ血清および０．３ μＣｉ／Ｉｄ！の１２５１−沃化デオキシウリジン（２０００Ｃｉ　／ｒＡｍｏ ｔｅ　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチュセツツ州ボスト ン）を含有するダルベツコ改良イーグル培地に置換する。標識培地中で１６時間 インキュベート後、細胞を冷りん酸緩！ｉｉ塩液で洗滌して標識を停止する。細 胞を冷５％トリクロロ酢１（ＴＣＡ）と３０分間インキュベートし、５％ＴＣＡ および蒸溜水で二回洗滌して酸不溶物に取り込まれる １２５Ｉ−沃化デオキシウリジンを測定する。

４、　Ｔ１走性測定 遊走性測定は、ここに参考文献として採用されるＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ７９巻：５５９７−５６０１頁に記載されるＣａ５ｔｅ ｌｌｏｔの方法に従い、ゼラチンおよびフィブロネクチンで被覆したＰＶＰ非含 有のボアサイズ５μ−のポリカーボネート製フィルターを用いて２００１１１の ブラインドウェル（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、カリフォルニア州、プレサントン） 中で行なう。０．５％のウシ胎児血清含有のＭＥＭ培地で１０段階希釈した精製 プロテアーゼ誘導因子をウェルの下層に入れる。次にフィルターを挿入し、２０ ０μｌの０．５％ウシ胎児血清加ＭＥＭｍ地に入った５Ｘ１０’個のＢＣＥｉｌ ｌ胞をウェル上層に添加する。３７℃で４時間インキュベート後ウェル上層の培 地を除去し、フィルターの上部表面の細胞を静かに綿棒で取り除く。次にフィル ターを取り外して空温で乾燥し、ライトーギムザ色素（Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｎｉ ｃａｌ　Ｃｏ、、ニューシャーシー州、フィラデルフィア）で染色する。

フィルターの下部表面の全細胞数を光学顕微鏡（４００倍の倍率）で数える。

５、ＰＡおよびコラゲナーゼの誘８１測定少なくとも２日間５冗仔ウシ血清含有 のＭＥＭで維持したＢＣＥＩ胞のフンフルエンド培養物を５％仔ウシ血清および 試験する物質を含む新しいＭＥＭ培地と交換する。、３７℃で２４時間インキュ ベート後培地を集め、参考文献に採用するＣｅ１１．２０巻：３４３−３５１頁 （１９８０年）中にＨｏ５ｃａｔｅｌｌｉらにより記載されるようにしてコラゲ ナーゼを測定する。コラゲナーゼは全て潜伏性であるので活性を検出するためト リプシンで活性化する。

この同じ培養物からのｍ胞単層を冷りんＭＭ衝塩液で２回洗滌し、０６１Ｍりん 酸ナトリウム、ｐＨ８，１、中の０．５％（ｖ／ｖ）トウィトンｘ−ｉｏｏ溶液 で抽出してからｃｒｏｓｓら（前述）により記載されるようにＰＡ活性を測定す る。実験の結果、細胞抽出物中のＰＡｆｆｌは条件づけした培地中で見られたａ に比例していることがわかった。プロテアーゼ誘導活性の１単位はＰＡおよびコ ラゲナーゼ合成の最大読導の半分まで誘導するのに必要な量と定義する。

例２ ヒト胎盤組織からの血管形成促進因子の精製例１の方法に従って二回目のヘパリ ン−セファ０−ス力ラムにかける溶出液を得る。カラムを３ｗ＋ＨＥＤＴＡ／２ ００１Ｈトリス、ｐＨ７，５、中０．９５．ＨＮａＣ１溶液で洗い、同じ緩衝液 中の２８ＮａＣＪ溶液で溶出する。

２Ｍ溶出液を０．２）Ｉ　Ｎａ（１／２０１ＩＩＨＭＥＳ、ｐＨ６，０、に対し て透析する。透析物を１００．０ＯＯＸグで６０分間遠心分離して不溶物を除き 、Ｆａｓｔ　ＰｒｏｔｅｉｎＬｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　（ Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）システムを用いてＨｏｎｏ−Ｓカラムにかける。カラムを０． ２）Ｉ　ＮａＣｚ／２０１１８　ＹＥＳ、　ｐＨ６，０、で洗滌後２０ｍＨＭＥ Ｓ。

ｐＨ６，０中の０．２−２８　ＮａＣＪ！勾配で溶出する。各両分につきプロテ アーゼ誘導活性を測定する。プロテアーゼ誘導活性は０．４５−０．６８　Ｎａ ＣＪ！で溶出した。

肝癌細胞からの血管形成ｐｋ導因子の精製ＦＰＬＣ以外の全ての精製ステップは ４℃で行なう。

Ｓ　Ｋ−Ｈｅ　Ｏ−１ａｍ　（Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｇｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　［Ａ　Ｔ　ＣＣ］寄託番＠ｋｌＨＴＢ５２）のフンフル エンド単層よりｍａを冷ＰＢＳにかり取り、４００×３で１０分間遠心分離して 集める。細胞ベレットを１０倍容聞のＰＢＳｌｏ、５）Ｉ　ＮａＣｊにけん濁し 、Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ　にューヨーク州、プレインビュー）を 用いて５ワツトで３分間音波処理を行なう。抽出物を遠心分離にかけ（１０，ｏ ｏｏｘｇ、１時間）、上澄液を集める。ベレットは等容ｉのＰＢＳｌｏ、５ＨＮ ａＣ１に再けん濁して音波処理を行ない、遠心分離する。上澄液を合わせｒ２８ Ｘ７５ａｅのＰＢＳｌｏ、５８Ｎａｃｊ！で平衡化したヘパリン−セファロース カラム（ファルマシア、ニューシャーシー州、ビス力タウエイ）を通す。カラム を０．５ＨＮａＣ１勾配ｍＨＥＤＴＡ／１００ｉＨ１−リス、ｐＨ７，５で洗滌 後、同じ緩衝液中の０．５−２８　ＮａＣ１勾配で溶出する。各両分についてＰ Ａ誘導活性を測定し、活性画分を集めて伝導率が２０ｍｗｈｏとなるまで３＋ｏ ＨＥＤＴＡ／２（ｌ）ｌトリス、ｐ）１７．５で希釈する。

次に活性物質を３ａ＋ＨＥＤＴＡ／２０ｍＨトリス、°ＩＩＨ７，５中０．５） Ｉ　ＮａＣ１溶液で平衡化した二回目のヘパリン−セファロースカラム（１０Ｘ ７５ｍ）にかける。

カラムを先ず０．５）Ｉ　ＮａＣｊで、次に３ｍＨＥＤＴＡ／２０關Ｈトリス、 ｐＨ７，５、で洗い、同じ緩衝液中の０．９−２）Ｉ　ＮａＣ１勾配で溶出する 。活性画分を三回目のヘパリン−セファロースカラム（７Ｘ８５ｍ＋）にのせて ２０ｍＨＹＥＳ、ｐＨ５，０中の０．５８　Ｎａ（、！で洗滌後、ＮａＣ）を２ Ｈとして溶出する。三回目のヘパリン−セファロースカラムからの活性画分を２ ０１）ＩＭＥＳ１ｐＨ６，０、で１：１０に希釈して１００，０００Ｘｇ、７時 間の遠心分離で不溶性物質を除く。

これを０．２８　ＮａＣｊ／２０ｍＨＭＥＳ、ｐＨ６，０で平衡化したＮｏｎｏ 　−Ｓ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム（ファルマシア）にのせる。カラムを０．２ＨＮ ａＣ１で洗ってから溶出をＮａｃｔの勾配（２０ＩＩＨＭＥＳ％ｐＨ６，０，中 ０．２から２８）で溶出する。各画分につきＰＡ誘導活性を測定し、活性画分を 集めて純度をＮａＤＯｄＳｏ４−ＰＡＧＥで検定する。

乳Ａ ヒト胎盤より単層した胎盤通管形成誘導因子（ＰＡＦ）のアミノ酸配列の決定 Ａ、Ｌｌ／Ｓ−Ｃペプチド 上述の例２の方法により２０鵬ＨＭＥＳ、　１ｌＨ６，、、０゜０．５ＨＮａＣ １に溶解したＭ製ＰＡＦを得る。天然蛋白質を以下のようにエンド型プロテナー ゼｔ−ｙｓ−ｃを用いて消化する：２ｎｍｏ＋ｅの天然蛋白質を３５０μｌの２ ０ｍＨＭＥＳ、ｐＨ６，０，０，５８ＮａＣ１に溶解して含有する反応液を２１ （ＮＨ＋ｃｏ３１５μｌを添加してｐＨ８，７に調整する。１．１７単位のエン ド型プロテナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー）を添加し、３７℃で７時間３０分 消化を行なう。次に２−メルカプトエタノールをＪｉｌ終濃度が１％（■ハ）と なるように添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベートする。トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度０．１％（Ｖ／Ｖ）となるように添加し、消化物を５ ｙｎｃｈｒｏａ　ＲＰ　８カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）で分画する。ペプチドは０．１％ＴＥＡ水溶液および次に０．１％ＴＦ Ａ中のアセトニトリル勾配（６０分間でＯ−６０％のアセトニトリル）でカラム から溶出する。カラムからのペプチド溶出はＡ２１５およびＡ２８ｏで追跡し、 適当な両分を手動で集める。

１９％のアセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマン分解により配列決定 した結果、次の配列を示した：（Ｋ　）−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−Ｉ−Ｈ −Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ−Ｖ−ＲＬＥ−にこの配列および以下の配列中カ ッコ内に示すアミノ酸残基ははっきりと同定されていない残基である。

１９．８％のアセトニトリルで溶出したペプチドを配列決定した結果数の配列で あった： （Ｋ）−Ｇ−Ｖ−（）−Ａ−Ｎ−（）−Ｙ−Ｌ−（Ａ）−Ｍ−に−（Ｅ）−Ｄ− Ｇ−同じ消化物から１７．５％アセトニトリルで溶出した他のペプチドは次のア ミノ酸配列を示した：（に）−Ｌ−０−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ− ５−Ｉ−に２６％のアセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマン分解にか けて次のアミノ酸配列を示した：（Ｋ）−（Ｃ）−Ｖ−Ｔ−（ＤＪ−Ｅ−（Ｃ） −Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｅ−（）−Ｌ−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−（Ｔ）−１６％のアセ トニトリルで溶出したもう二個のペプチドは混合物として得られ、配列決定前に 再精製した。得られ、たペプチド混合物を真空下で乾燥し、１００μｌの５０ｍ Ｈトリスー塩酸、１）Ｈ８，５，８Ｈ尿素に再けん渇する。２０　ｎ１ｌｉｏＩ ８のジチトトライトール（ＤＴＴ）を添加して３７℃１５分で存在するＳ−８結 合を還元する。次に５　Ｑ　ｎ１ｌｌｏＩｅの３Ｈ−沃度酢酸を添加してペプチ ドを力°ルボキシメチル化し、室温で暗所下２０分インキュベートする。さらに ５　Ｑ　ｎｍｏｌｅのＤＴＴを添加して室温で３０分間インキュベートした後、 反応液をＴＦＡｏ、１％に調整し、Ａｌｔｅｘ　Ｃ−３逆相カラムを用いたＨＰ ＬＣで再分画する。ペプチドはカラムより０．１％ＴＦＡ水溶液および続くアセ トニトリル勾配（１２０分間で０−６０％アセトニトリル）で溶出する（流速１ ｍ／１ｎ）。

１３％アセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマン分解にかけたところ次 の配列を示した：（に）−Ｇ−Ｖ−Ｃ−ＡｍＮ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｍ−ＫＢ、Ｓ ＭＰ−ペプチド 天然ＰＡＦ蛋白質をマウス下顎腺プロテアーゼで消化してさらにペプチドを得る 。

３５０μｆの２０ｍ）ｌ　ＭＥＳ、ｐＨ６，０，０，５８ＮａＣｆ中に２ｎｍｏ ｌｅの蛋白質を含む溶液に２５μｌの１８　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９，０、を添加 しＴｐＨ８，０ニ１整する。下顎腺ブＯテアーゼ（３，６μび）を添加して消化 を３７℃で２４時間行なう。９　Ｑ　ｎｍｏｌｅのＤＴＴを添加して３７℃のイ ンキュベーションを３０分間続ける。

３６０　ｎｍｏｌｅの３ト１−ヨード酢酸を添加してペプチドのカルボキシメチ ル化を行ない、空温暗所で２０分間インキュベーションをする。さらに３６０　 ｎｍｏｌｅのＤＴＴを添加してから反応液をＴＦ’Ａ中０．１％（ｖ／ｖ）に調 整し、上述のようにペプチド混合物をＲＰ−８ＨＰＬＣで分画する。

１２％アセトニトリルで溶出するペプチド混合物を一つの画分に集め、乾燥して １００μｌの５０１１１Ｈトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，８Ｈ尿素に再けん濁し てＡＩｔｅＸＣ−３カラムを用いたＨＰＬＣで再分画してＬＶＳ−Ｃペプチドの 精製で記載した溶出スケジュールと同じように溶出した。

１４．８％アセトニトリルに）および１５．３％アセトニトリル０で溶出した二 つのペプチドを自動エドマン分解にかけて次のようなアミノ酸配列を得た：ａ） 　（Ｒ）−Ｇ−Ｖ−Ｖ−（）−Ｘ−に−Ｇ−Ｖ−Ｃ−Ａ−：Ｔ−ｂ）　ＴＲ）− Ｉ、−Ｖ−Ｃ−に−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｆ−天然ＰＡＦをｓ、　ａｕｒｅｕｓプロ テアーゼ（ｖ８）で消化していくつかのペプチドを得た。５００ｔｌＡの２０Ｉ ＩＩＨＩ−リス−ＨＣ１、ｐＨ７，５，２８ＮａＣｊ！に溶解した１　ｍｏｌｅ の蛋白質をＲＰ−８逆相カラムを用いてＨＰＬＣで脱塩する。蛋白含有の脱塩画 分を乾燥し、５０ｍＨ酢酸、ｐＨ４，０の５０μｍに再けん濁し、１μ９の■８ プロテアーゼを加える。３７℃１８時間消化を行なう。ペプチドを上述のように ＲＰ−８逆相カラムを用いたＨＰＬＣで分画する。

１７％アセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマン分解にかけ次のアミノ 酸配列を得た：（Ｅ）−に−５−（）−Ｐ−Ｈ〜Ｉ−に−Ｉ、−Ｑ−Ｌ−（）− Ａ−Ｅ■８消化物からの２０％アセトニトリル溶出のペプチドも配列決定し、次 の結果を得た： （Ｅ）−（）−（ｃｌ−（）−Ｌ−ｒ、−Ａ−（）−に−２１％アセトニトリル で溶出した■８ペプチドを配列決定して次の結果を得た： （Ｅ）−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｒ−（Ｓ）−上記アミノ酸配列を整理す ると以下に示すヒト塩基性線維芽精胞増殖因子の中核配列が得られる：さらに他 のペプチドを単離して自動エドマン分解にかけた。それらのアミノ酸配列は上記 中核配列外にあった。

下顎腺消化物（上記参照）の分画で１３％のアセトニトリルで溶出したペプチド は次のアミノ酸配列を示した：に−ｒ＝−Ｇ−ｓ−に−ｒ−Ｇ−ｐ−ａ−０−に 一、ｚ−ｘ−ｒ−−ｒ−Ｌ−ｐ−ｓ−ｓ−Ａｍに２０％アセトニトリルで溶出し たＬｙｓ−Ｃペプチドは次のアミノ酸配列であった： Ｙ−（）−５−Ｗ−Ｙ−Ｖ−（）−Ｌ−（、）鉄玉 治療剤として臨床応用に適した血管形成誘導因子性状の同定 例１および例２の方法により単離した胎盤由来の因子および肝癌細胞から単離し た因子が血管形成誘導因子に予想される試験管内の三つの全ての性質を示すこと を明かにした。先ず、０．１から１０ｎｏ／ａｔ！の範囲の濃度でこれらの分子 はＢＣＥ細胞のＰＡおよび潜伏性コラゲナーゼの合成を促進する。ＰＡは前酵素 プラズミノーゲンを特異性の広いプロテアーゼであるブラズミンに変換すること ができる。ブラズミンは潜伏性コラゲナーゼを活性コラゲナーゼに変換できる。

従って低濃度の本因子の影響で毛管内皮細胞は周囲組織のほとんどの蛋白質を分 解できる少なくとも２つのプロテアーゼを生成し、その結果＠胞が組織に、侵入 する。

精製分子はＢＣＥ細胞のＰＡおよびコラゲナーゼを９度依存的に促進する（第３ Ａ図）。コラゲナーゼは全て活性型である。トリプシン処理の後コラーゼ分解活 性が検出された。ＰＡおよび潜伏性コラゲナーゼの両者が相関して促進される。

１／２最大促進は１ｎｇ／Ｉｄのプロテアーゼ誘導因子の９度で観察される。未 処理細胞で生成するＰＡおよびコラゲナーゼの量は実験により差があり、従って 促進の割合も変化する。プロテアーゼ誘導因子の濃度を非常に高くすると、化学 走性および有糸分裂促進と同様にＰＡ合成の促進も低下する。ＢＣＥ細胞をＰＡ およびコラゲナーゼを誘導する濃度のプロテアーゼ誘導因子と２４時間インキュ ベートすると、細胞の形態が典型的な玉石型から伸長した紡鉗型に変化する。

第二番目として本因子はＢＣＥ！［１ｒＩｉに対して化学走性能を示す。そこで 試験管内で毛管内皮細胞は本因子の方向に移動する。本因子を０．００１および ０．１ｎｏ／Ｊ゛　の範囲の濃度で添加するとＢＣＥ細胞の化学定性がブライン ドウェル槽内で促進される。これより高い濃度では化学定性は見られない。上槽 から下槽への細胞移動の増加は下槽に上槽より高濃度の因子が存在する場合のみ 観察され、このことは真の化学走性が起きていることを示す。化学走性は観察さ れる運動性増加の２５％以上を占めることはなかった。

第三番目に、本因子はＢＣＥ！Ｉｌｌ胞に対して有糸分裂促進を示す。第３Ｂ図 はＢＣＥ！Ｉｔ胞培養にプロテアーゼ誘導因子を添加した時、その添加量に依存 した１２５Ｉ−ヨードデオキシウリジンのＤＮＡへの取り込み促進を示す。

プロテアーゼ誘導因子の濃度を高めるとこのｆｌ　’Ｊ活性は低下する。　■− ヨードデオキシウリジン取り込みの促進はＰＡおよびコラゲナーゼ誘導ができる と同じ濃度で観察される。胎盤由来の粗音波処理物による１２５Ｉ−ヨードデオ キシウリジンのＤＮＡへの取り込み促進は他の有糸分裂促進活性と相関している ことを本発明者は既に確認している。従って本因子は真に有糸分裂促進的に作用 している。精製した単一分子が８ＣＥ細胞でＰＡおよびコラゲナーゼを誘導し、 細胞複製を促進し、その運動性を促進する能力があると考えられる。

例６ 血管形成活性 血管形成の測定のためにＡｕａｔ、　Ｒｅｃ、　１９９巻、３３−４２頁（１９ ８１年）に報告されているようにＤｕｎｎらの方法を用いた実験で、例２の血管 形成誘導因子はトリ繊毛法股上で６５ｒ＋ｏの投与散で９１％の卵で血管形成を 促進した。

上述のようにして（例１および例２参照）ヒト胎ｍ白管形成因子を精製する。２ ０　ｍＨＭ　Ｅ　Ｓ緩笥液、ｐＨ６，０、および５００ｍＨＮａＣｊ！Ｉｃ溶解 した精製蛋白質をＲＰ−８逆相方ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで脱 塩する。２５０がら５０００１ｏｌｅの脱塩蛋白質を自動エドマン分解するため Ａ３１４７０Ａ気相蛋白質シークエンサーにかける。得られるＰＴＨアミノ酸を シアン逆相カラムを用いた高速液り０で同定する。

これらの実験結果よりＰＡＦのＮ末端アミノ酸配列は以下のように決定された： Ｇ−Ｔ−Ｈ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｓ−１−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｐ　−Ｅさらに、 上述のＰＡＦのＮ末端アミノ酸配列は例４、Ａに記載するクロマトグラフィー系 で２３％アセトニトリルで溶出したＬｙｓ−ｃペプチドの自動エドマン分解によ っても確認された。

ｂ）　ＰＡＦのＣ末端アミノ酸配列 ＰＡＦのＬｙＳ−Ｃ消化物より例４に記載のようにＣ−末端ＰＡＦペプチドを単 離した。本ペプチドは２２％アセトニトリルで溶出する。このペプチドを自動エ ドマン分解にかけて次のアミノ酸配列を示した：Ａ−ニーＬ−Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｍ− ５−Ａ−に−５（１）例：　（ｉｉ）ＰＡ　ＦのＮ末端アミノ酸配列；（面ＰＡ ＦのＣ末端アミノ酸配列；および（Ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのデータを総合してＰＡ Ｆの全アミノ酸配列は以下のとおりである：１、ＰＡＦｌ型 Ｇ−Ｔ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｇ−５−ニーＴ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｉ、−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｇ −Ｇ−５−Ｇ−ＡｍＦ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｆ−に−Ｄ−Ｐ−に−Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｃ −に−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｒ（−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ−Ｖ− Ｒ−Ｅ−に−５−Ｄ−Ｐ−Ｈ−Ｘ　−に−Ｌ　−Ｑ−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｒ− Ｇ−Ｖ　−Ｖ−５−工−に−Ｇ　−ＶニーＣ−Ａ−Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｍ−に −Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｆｔ−Ｌ−Ｌ−Ａ−５−に−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｃ−Ｆ’−Ｆ −Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ　−Ｙ−Ｎ　−Ｔ−Ｙ−Ｒ−５−Ｒ−に−Ｙ −Ｔ−５−Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−に−Ｒ−Ｔ−Ｇ−０−Ｙ−に−Ｌ−Ｇ−５−に −Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−に−Ａ−ニーＬ−Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｈ−５−Ａ−に−５゜２ 、ＰＡＦ２型：　Ｎ末端ブロックＰＡＦ精製ＰＡＦおよび天然ＰＡＦを自動エド マン分解にかけた多くの実験で、チャージした蛋白質のある部分（５０−８０％ ）がエドマン処理で分解しないことがわかった。

ＰＡＦ蛋白質分子の一部分はＮ末端がブロックされて存在するものと考えられた 。

ブロックしている基の性状は精製アミノ末端ペプチドの研究により明白になった 。ＰＡＦの酵素分解（例４参照）から得られるアミン末端ペプチドはアミノ酸分 析で同定する。また濾紙電気泳動または薄層クロマトグラフィーと参照文献とし て採用するＣｈｅＩＩｌ、　Ｂｅｒ、８７巻、１１０３−１１０７頁（１，９５ ４年）中にＦ、Ｒｅ１ｎｄｅｌおよびＩＪ、　ＨＯＤＤｅにより記載される塩素 １０−トリジン試薬による染色で同定される。（ブロックされているペプチドは 側鎖のりジン残基による弱い呈色以外には、先ず加水分。

解しない限りニンヒドリンで検出されない。）さらに、小さいＮ−末端ブロック ＰＡＦペプチドは酸性サーモリシンまたはペプシンによるＰＡＦ消化物をＮａｒ ｉｔａら（１９７５年）によりＰｒｏｔｅｉｎ　ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｏｎ　、　３０−１０３頁、ｓｐｒ＋ｎｇｅｒ−ｖｅｒ＋ａｇ　。

ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク、中に記載されるようにＤｏｗｅｘ　 ５０、×２（Ｈ＋型）のりＯマドグラフィーで単離するか、■、にｆｕｎにより Ｃｏ１１．　Ｃｚｅｃｈ、　Ｃｈｅｔａ、　Ｃｏｔａｔｓ、　（英語版）４４巻 、１４５−１４７頁（１９７９年）に記載されるようにスルホエチル−セファデ ックスのクロマトグラフィーにより単離できる。これらの文献は参考文献として とり上げている。

ブロックされた短かいペプチドの構造は多くの標準手法および方法により決定さ れる。例えば、Ｇ、　Ａ１１ｅｎのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　；　ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　７ムステルタム、ニューヨーク、オックスフォ ード（１９８１年）またはそこに記載されている文献で、これらは本出願の参考 文献として採用している。これらの手順および方法はＮ末端のブロックしたペプ チドのカルボキシペプチダーゼ、プログルタミン酸アミノペプチダーゼによる消 化、ヒドラジン分解、質量分析、核磁器共鳴、ガスクロマトグラフィーおよびＢ ＯｉＳＳｅｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８ ２巻、８４４８−８４５２　（１９８５年）により記載されるＦＡＢ質ｍ分析な どがある。

３、ＰＡＦ３型：短縮および伸長Ｐ　Ａ’　Ｆウシ腎線維芽細胞生育因子（ＦＧ Ｆ）はＮ末端からのアミノ酸の多くを欠損していることがわがっている（八。

ｅａ　ｉ　ｒｄら、Ｒｅｇｕｌ、　ｐｅｐｔ　、印刷中：１９８５年）（Ｄ、　 Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ印刷中：１９８６ 年）　、　Ｇ、　Ｎｅｕｆｅｌｄおよびり、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　 Ｊ、　Ｂ１１１゜Ｃｈｅｌｌｌ、　２６０巻、１３８６０−１３８６８頁（１９ ８５年）により示されているように短縮した線維芽細胞生育因子はＦＧＦレセプ ターの結合能力を保持しており、このことは本蛋白質のＮ末端はＦＧＦの細胞表 層レセプターとの相互作用に重要な役割を持たないことを示している。従って、 ＰＡＦの短縮７！！および伸長型の両者ともレセプター結合能を保持すると予想 される。ＰＡＦの生物活性を保持したままのＮ末端最大欠損および伸長はまだ決 定されていない。

肚溢：ＰＡＦのＣＤＮＡクローン ５Ｋ−ＨＥＰ−１１胞を１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸およびＰｅｎ−８ ｔｒｅｐ添加の最少必須イーグル培地で培養する。ＲＮＡはここに参考文献とし て採用するＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ　。

（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ　、　１９８２年、１９１−１９３頁）中にＨａｎｉａｔｉｓらにより 記載されるＮＰ−４０溶解法を用いて単離した。Ｐｏ１ｌ／（＾）＋ｍＲＮＡを 文献として採用したＰｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ６９巻、１４０８頁（１９７２年）に記載されるｕ、ＡｖｔｖおよびＰ、 　Ｌｅｄｅｒの手法を用いたオリゴｄＴクロマトグラフィー（ＢＲＬ）により選 択した。こ）に文献として採用したＧｅｎｅ、　２５巻、２６３−２６９頁（１ ９８・”３年）にＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎが記載するように、オリゴ ｄＴによる第−鎖合成およびＲＮａｓｅ　Ｈ−ＤＮＡポリメラーゼ関与の第二鎖 合成を用い、５μびのｍＲＮＡから８μグの二重鎖ＣＤＮＡを得た。この操作に はＡｍｅｒｓｈａｍの試薬を使用した。以下の反応は特に記載しない限り製造元 の指示通り行なった。このＣＤＮＡを１０単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）　ヲ用いて平滑末端化した。ＥＣｏＲＩ部位は４００単位のＥＣ ０ＲＩメチラーゼ（Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）および１００ ｍＨのＳ−アデノシルメチオニンで保護した。同量のＥｃｏＲＩリンカ−（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　、　８塩基対）を１単位のＴ４ＤＮＡリ ガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）で結合した。過剰のリンカ−は２００ 単位のＥＣＯＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）で消化して除 去し、１００ｎＯのこのＣＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化のアルカリフォスファターゼ 処理ラムダＱ　ｉ　−１０Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｖｅｃｔｏｒ　ＣｌｏｎｉｎｃｌＳｙ ｓｔｅｍＳ　）　１μ９と連結する。ＤＮＡをインビトロでバケツジングしく　 Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００Ｈ ＦＬａにブレーティングして８．２×１０５個の形質転換株を得た。

オリゴヌクレオチドプローブのデザイン５Ｋ−ＨＥＰ−１ｃＤＮＡクローンの単 離のため２種の混合配列オリゴヌクレオチドプローブを使用した。

プローブは決めたアミノ酸配列に対応する全ゆるＤＮＡ配列をプールしたものよ り成る。プローブは木明１１＆ｔに記載されるＰＡＦの中核アミノ酸配列中の配 列を選択した。プローブ＃５はアミノ酸配列 １１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−ＡｌａをコードするＤＮＡとハイブ リダイズするように作成し、１９２配列から成る１７７−である： ＃　５　１１ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ａｌａ５′　＾ＴＺ　ＡＡ Ｎ　ＧＧＸ　ＧＴＸ　ＴＧＹ　ＧＣ３’１９２倍低下、１７マー、 Ｘ−Ａ、ＴＳＧ＊ｒ、：はｃ Ｎ−ＡまたはＧ Ｙ−ＴまたはＣ Ｚ−Ｔ、ＣまたはＡ プローブ＃８はアミノ酸配列 Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｈｅ、をコードする ＤＮＡとハイブリダイズするように作成し、２５６種の配列より成る２０マーで ある。

＃８　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ５°　ＴＡＹ 　ＴＧＹ　′ＡＡＮＡＡＹ　ＧＧＸ　ＧＧＸ　ＴＴ　３゜２５６倍低Ｔ１２０マ ー 両プローブともＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂ１０５ｌ／５ｔｅｆｆｉＳ　Ｑ　Ｎ　Ａ合成 礪で合成した。いずれもゲルによりＲ’ｌＪしてＴ４ボリヌ、タレオチドキナー ゼ（ファルマシア）を用い［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　ｔ’ ４−６Ｘ　１０６ｃ　ｐｍ／ｐｍｏ　１の比活性に放射標識した。

ハイブリダイゼーション温度は文献に特に採用しているｓ、ｖ、ｓｕｇｇｓら、 （Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＵｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅｄ 　Ｇｅｎｅｓ：　Ｄ、Ｄ、ＢｒｏｗｎおよびＣ，Ｆ、　Ｆｏｘ編集、６８３−６ ９３頁：１９８２年、Ａｃａｄｅｖｔｃ　Ｐｒｅｓｓ、　二１−９−ク）により 記載されているように、ＡＴの多いもののほとんどで計算したＴｍ（ｉ！１より も２℃低い温度とした。

最後の洗脩については計算値どおりのＴｍで行なった（即ちハイブリダイゼーシ ョン温度より２℃高い温度）。

ｃＤＮＡのライブラリーを１５０ａｏｒルリアーベルトニ寒天平板につき５０． ０００個のプラーク濃度となるように、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ＨＦＬａ株とＮ ＺＣＹＭ上層寒天（０，７％）を用いてプレートした。ファージＤＮＡは二枚の ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ 、ＢＡ８５）にトライス’７７−し、文献に採用しティる５ｃｉｅｎｃｅ　、　 １９６巻、１８０−１８２頁（１９７９年）のＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓに より記載されているようにハイブリダイゼーション用に調製−パシタ。フイ／ｌ ／　ターハロ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｇ　（２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃは３ＨＮａＣ１，０，３ Ｈクエン酸ナトリウム、１）８７．５）、２Ｘデンハルツ溶液（１００ｘデンハ ルツ溶液は２％ファイコール、２％ポリビニルピロリドンおよび２％８℃で２時 間ブレハイブリダイゼーションを行なう。プローブ＃８を０．２ｐｍｏｌ／　Ｉ ｄで添加し、１６時間ハイブリダイゼーションを行なうニハイブリダイゼーショ ン後、フィルターを以下のように洗蜂した：　６ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ 中空温で中空弁間ずつ３回と最後の１回は５０℃で８分間。次にフィルターを乾 燥し、コダックＸＡＲ５フィルムおよび「ライトニング・プラス」増幅スクリー ンを用いて一７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行なう。二枚のフィル ターで陽性であるプラークを精製のため吊る。それらのプラークをプローブ＃５ および＃８を用いて二次選択を行ない、両プローブとハイブリダイズしたプラー クを血管形成誘導因子をコードする候補として選んだ。

文献として特に採用したＡｄｖａｎｃｅｄ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃ ｓ：Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃ ｏｌｄ　Ｐｒｉｎｇ　Ｈｏｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨークコ１９ ８０年）中でＲ，ｕ、　ＤａＶｉＳ　、　Ｄ、ＢＯ５ｔｅｉｎおよびＪ、　Ｒ， Ｒｏｔｈにより記載されている方法に従い、このファージよりプレート溶解法お よびホルムアミド抽出によりＤＮＡを調製した。このＤＮＡのＥＣ０ＲＩ消化に より１％アガロースゲルで１．１ｋｂの挿入断片を放出した。この挿入断片をＨ ａｎｉａｔｉｓら、上述、１７３−１７８頁により記載されるようにサブクロー ニングのため５％アクリルアミドゲルから精製した。挿入断片をバクテリオファ ージＭ１３ｍｐ１９ＲＦ　ＤＮＡのＥＣ０ＲＩ消化物に連結し、参考文献のＪ、 　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　９４巻、４４１頁（１９７５年）に記載されるｓａｎ ｇｅｒのジデオキシヌクレオチド法を用いて配列決定した。得られた配列の解析 の結果、ＰＡＦの一時構造をコードする読みワタが得られた。

蛋白質の配列データ（例７参照）および報告されているＦＧＦの情報（Ｅｓｃｈ ら；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２巻、６５０ ７−６５１１：１９８５年）から、ＰＡＦのいくつかの活性型が精製されている ものと思われる。ＰＡＦ　ｉ型（例７参照）はこのＤＮＡよりＡＧＴＭＡＡの５ ′側のどこかから翻訳が開始し、まだ解明されていないプロセスによるＡＧ結合 の翻訳後の切断により生成される。ざらにＰＡＦ３型はコンセンサス開始部位（ Ｈｌにｏｚａｋ、　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４７巻、１−４５頁：　 １９８３年）であるＭＡＡ配列から翻訳が開始し、任意にメチオニンの分解除去 により精製する。ＰＡＦ３型はまた他の機能的開始部位からの翻訳開始によって も精製される。そのような部位は技術に熟練した物に容易に理解されるもので、 特に本明細書の記載より明かである。さらに、翻訳−次生成物の翻訳後のプロセ シングも起るが、これは必須ではない。ＰＡＦ２型は１型または３型からまだわ かっていないプロセスによりＮ末端のアミノ酸の遊離アミノ基のブロックが起る ことにより生じる。

伊１９：ＰＡＦの発現 ＰＡＦ発現の原理は以下のとおりである。ラムダｇｔ１０グローンから単離した １、ｌｋｂのＥＣ０ＲＩ断片をプラスミドｐＵｃ９にサブクローンする。この断 片はＰＡＦの全コード配列を含む。サブクローンの小さい２つの断片が発現シス テムの構築に有用である。１つは３６７ｂｐのＡｖａＩから３　ａ　ｍ　ＨＩま での断片で、これは胎盤由来の１型蛋白質のＧＴＭＡＡ残基を１から５と数えて １７から１３７までのアミノ酸残基のＰＡＦをコードする配列を含む。もう一つ は４０５ｂｌ）のＮＣ０Ｉから３ａｍＨＩまでの断片で、これはＰＡＦの４から １３７までのアミノ酸残基をコードする配列を含む。これらの制限断片の両端に 合成アダプターをつけてコード配列を完全し、翻訳開始、終了またはカプリング 配列などを調製して適当な発現ベクターとの連結に必要な配ダＪも加える。

ヒト胎盤から単離したＰＡＦはＧ　Ｔ　Ｍ　Ａ　Ａで開始する配列を有する。５ Ｋ−Ｈｅｐ−１１ｆＵ胞から単離したＣＤＮＡクローンからＧＴＭＡＡ配列より 少なくとも１００アミノ酸上流から、またはＭＡＡでｙＤ始するＰＡＦの他の型 が存在することが示唆される。胎盤型を用いて酵母（Ｓ、　ＣｅｒｉＶｉＳｉａ ｅ　）および細菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）で発現した。他の５Ｋ−Ｈｅｐ−１型および アミノ末端の短縮型は下に記述する方法の改良で発現させることが出来、その方 法は技術に熟練する者には明白である。その方法はＣＤＮＡ断片のアミノ末端（ ＮＣＯＩ部位またはＡＶａ工部位）を発現ベクターに連結するのに用いる合成ア ダプターを変化させることより成る。また別の方法としては、以下に示すＧＴＭ ＡＡ型からヌクレオチド−支持欠損変位処理（文献として採用する’　Ｎｕｃｌ ｅｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ　ｒｕｔｕｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　”　、に、 　Ｈｉｚｏｂｕｃ旧、１、　ＷａｔａｎａｂｅおよびＪ、　Ｄ、　ｗａｔｓｏｎ ｉ集、Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク、４１９−４３６頁：１９８３年にＨ，Ｉｎｏｕｙｅ　、に、　Ｎ ａｋａｍｕｒａ　、　Ｓ、　Ｉｎｏｕｙｅおよびｙ、　Ｈａｓｕｉにより記載） によって短縮型の発現プラスミドを構築できる。

以下のアダプターをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成礪 で合成し、ゲルＩＩをする。５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファル マシア）でりん酸化する。対の相補オリゴヌクレオチドを以下のようにしてアニ ールし、二重鎖アダプターを精製する。等量の核オリゴヌクレオチドを５０ｍＨ ＮａＣｊ！、１０ｍＨトリス、ｐｌ＋７．５およびＩｍ）ＩＥＤＴＡに添加する 。この溶液を沸とう温浴中で加熱する。続いて温浴を火がら外し、２時間で室温 まで冷やす。以下が使用したアダプターのリストおよびその説明である。

禿楚ぶ削檜目Ｉ貝髄目訂誤訂■弓 訪　肘　討　Ｕ　転フ　醇　目ぶ 肘　耳５　ソ茨　吋　昌　眠　東　酩 ３？　キ３　ｕ　ミ昇　Ｕ　睦　６困　６旧　蒔　訂　軽３　修ぶ　萄唾　ミ３ 　ｕ目μ　踪　目！　しぶ　Ｉ　ｌ９　恥　Ｉ＝−：３　ｖ’３　ｏ＞　５Ｊ　 ５３　Ｆ≧　３６　’ｇ　＝百コ　訂　詰　転層　日　■　吋　Ｕ 肘　日　基　託　鷲宕　屈　３Ｘ　Ｅ＝すと　Ｕ　詰　韮　屓　’ｅ：３　Ｆ　 Ｅ３弱　闘　Ｕ　曇ヨ　ν３　基　ｊコ　鮎普茨　混　眠　韮　仔が　韮　訪　 Ｉ 吋　討　試農　転属　Ｉ　狂χ　詩　絡目コ　眠　弱　韮　弓１　日　ソＳ　託 葬　Ｉ　ピ２　―占　写９　旧　卦　東匠旦：酵母発現プラスミドの構築 ｐＵＣ８をＨ＋ｎｃ１ｍで消化してｐＵｃ８由来でポリリンカーのＨｉｎｄＩ［ １部位からＳｍａＩ部位までの制限酸素部位を欠いているプラスミドｐＧＳ　１ ８５を横築し、それをＨｉｎｄ［部位を再生しないＨｉｎｄＩ［／Ｓｍａ　ｌア ダプター（Ａｎｅｒｓｈａａ＋、カタログ番号ＤＡＩ００６）と３ｍａ　ｌ消化 および希薄溶液（Ｉｎａ／ｄ）中でライゲーションして連結し、Ｅ、ｃｏｌｔ　 ＪＭ８３を形質転換する。形質転換株から単離したプラスミドＤＮＡをＥＣ０Ｒ Ｉ、Ｓｍａ工またはｌ−１ｉｎｄＩ［ｌで消化して正しいプラスミドを同定する 。このようにしてＥＣＯＲ工部位およびＳｍａ■部位を有するが）（ｉｎｄ■部 位を欠いているプラスミドを保有する形質転換株を同定した。

酵母ＭＦＩ遺伝子を含むＥＣ０ＲＩ断片をＪ、にｕｒｇａｎおよびＩ、　Ｈｅ’ ｒＳｋＯＷｉｔＺによりＣｅ１ｌ、３０巻：９３３頁（１９８２年）中に記載さ れるようにプラスミドｐＣＹ１７からゲル電気泳動により精製し、ＥｃｏＲＩで 切断した１）ＧＳ　１８５に連結する。このライゲーション反応液を用いてＥ、 ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌを形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換株を選択する 。形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡをＥＣ０ＲＩで消化して正 しい挿入の存在を確認する。これがプラスミドｐＧ３２８５である。

プラスミド１）ＧＳ２８５を）ｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで完全消化し、希薄状態 （１ｒ＋ｇ／ＩＲ１）で連結して上述のＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒＳｋＯＷｉｔ Ｚにより記載されるＭＦ１遺伝子中の４個のＨｉｎｄｎ１部位の３個を除去する 。上に記載のようにして正しい構成を選択する。これがプラスミドｐＧ８３８５ である。

部位特異変異のため、ＥＣ０ＲＩ消化によりｐＧＳ３８５からＭＦ１遺伝子を除 き、ゲルで精製後（１，５ｋｂ）ＥＣＯＲＩで消化したＭ１３段１）１８ＲＦと 連結する。ライゲーション反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉ　７１−１８を形質転換 し、ＭＦ１遺伝子が正しい方向性で挿入されているクローンを［３２Ｐ］標ＩＭ ＦＩ遺伝子とハイブリダイズにより同定する。ＭＦｌの配列をＺｏｌｌｅｒおよ びＳｏ＋ｉｔｈ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　１００ 巻、１９８３年、Ａｃａｄｅｌｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、４６８頁）が記載す る部位特異インビトロ変異の標準法を用いてＧＴＡ　ＴＣＴＴＴＧ　ＧＡＴ　Ａ ＡＡ　ＡＧＡからＧＴＡ　ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡに変える。− ファクター遺伝子変異、ＭＦ　−Ｈをジデオキシ法配列決定により確認する。

Ｍ１３ｍｐ１８クローンのＲＦ型をＥＣＯＲＩで消化してＭＦ−Ｈ遺伝子を除去 し、１．５ｘｂのＥｃｏＲＩ断片をアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、 ＥｃｏＲＩ切断のＤＧＳ　１８５と連結する。得られるライゲーション反応液を 用いてＥ、Ｃｏ　ｌ　ｉ　）ＩＢＩＯＩを形質転換し、ＭＦ−３ｆｆ伝子を有す るプラスミドを保有するコロニーをＭＦ　−Ｈ遺伝子を含む３２Ｐ標識の１．５ Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズして同定する。そのようなプラスミドを ｐＧＳ２８６と命名する。

ＰＡＦ遺伝子を以下のとおりｐＧＳ２８６に挿入する。

アダプター＃１および＃２をＰＡＦ　ＮｃｏＩ／３ａｍＨＩ断片と連結する。反 応液をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、アダプターを付加したＰＡＦＤＮ ＡをＭ　Ｗの増加により同定する。この正しく連結したＤＮＡ断片をゲルより溶 出し、Ｈ＋　ｎｄｌ［［／Ｓａ　ｌ　Ｉ消化のｐＧＳ２８６と連結する。Ｅ、ｃ ｏｌｉ　ＨＢｌｏｌをこのライゲーション反応液で形質転換し、アンピシリン耐 性のコロニーを選択する。正しい挿入を有するプラスミドを保有する形質転換株 を［γ−”２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとインキュベート して放射標識したアダプターｌＡｌ３よび２Ａとハイブリダイズして同定する。

このようにして構築し、単離したプラスミドをｐＧＳ２８６−ＰＡＦと命名して いる。このプラスミドはＭＦ　Ｈ遺伝子がＭＦ　Ｈ遺伝子の”プレープロ“領域 のＨｉ　ｎ６１部位でＰＡＦ遺伝子と融合している。このような′Ｉａ築物は酵 母に導入されると、Ａ、　Ｊ、　Ｂｒａｋｅら、１９８１年（ＰＮＡＳ　：　Ｕ ＳＡ８１巻、４６４２頁）により示されるように異種蛋白質の合成、プロセシン グおよび分泌を指示することが知られている。

ＭＦ　Ｈ遺伝子およびＰＡＦの融合物を含むＥＣ０ＲＩ断片はｐＧｓ２８６−Ｐ ＡＦである。この断片はＥＣ０ＲＩによる消化およびポリアクリルアミドゲル電 気泳動により単離する。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後Ｔ４ 　ＤＮＡリガーゼを用いてｐｓｔエアダブター（ファルマシア）を連結する。こ の断片を次にベクターｐｃｉ／１　（Ａ、　Ｊ、　Ｂｒａｋｅら、１９８１年、 ＰＮＡＳ　ＵＳＡ８１巻：　４０４２頁）のＰＳｔＩ消化物に連結し、Ｅ、ｃｏ ｌｉ　ＨＢｌｏｌをこの反応液で形質転換してＴＥＴ　のコロニーを選択する。

ＰＡＦ遺伝子とのハイブリダイゼーションにより正しい構築を同定する。このプ ラスミドをＳ、　ＣｅｒｉＶｉＳｉａｅＤＢＹ　７４６　（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、カリポル−ニア州、バークレイ）にＴｏ ｈ−ＥおよびＷｉＣｋｎｅｒ（Ｊ、　ＢａｃｔｃｒｉｏｌｏＯＶ　、１４５巻、 １９８１年、１４２１−１４２４頁）により記載されるように欠損させた２ミク ロンＤＮＡプラスミドを用い、標準の形質転換プロトコールにより導入する。Ｐ ＡＦを発現する形質転換株は精製波ＰＡＦ　ＩｑＧとのアフィニティーの反応性 により選択する。

Ｋ１皇：ｌ：、ｃｏｌｉペリプラズマ分泌ＰＡＦ発現をＥ、ｃｏｌｉベリプラズ マへの輸送に適した型に制御するため、以下のようなυ１６１因子を使用した： 転写開始を高レベルで行なうためのプラスミドｐＣＪ−１上のｔａｃプロモータ ー；転写調節のためのプラスミドＩ）ＣＪ−１上のＩａｃオペレーター：Ｅ、ｃ ｏｌｉ　ＪＭ１０７株の染色体上に存在するＩａｃレプレッサー（ＩａｃＩ）、 ＰＡＦのペリプラズマへの輸送を行なうため０ｍ１）　ＡリーダーペプチドをＰ ＡＦをコードするＤＮＡに、前者ペプチドのＣ−末端Ａ１ａとＰＡＦｌ型のＮ− 末端Ｇｌｙとが融合し、−法度物中のＡ　Ｉ　ａ−Ｇ　Ｉ　Ｖ結合がＥ、ｃｏ　 ｌ　ｉのリーダーペプチダーゼにより切断されて成熟ＰＡＦが生成するように連 結する。

Ｅ、Ｇｏ　ｌ　ｉの分泌ベクターは以下の通り構築する。

アダプター＃５および＃４を、ＰＡＦのＡｖａｌ：／３ａｍＨＩ断片に連結する 。正しい大きさのＤＮＡをポリアクリルアミドゲルより溶出し、Ｏｍｐ　Ａリー ダーＤＮＡとおよび、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦと連結する 。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ−１０７をライゲーション反応液で形質転換する。ＰＡＦ ３！Ｗ伝子を含む形質転換株を制限酵素マツピングにより検出し、ジデオキシ法 配列決定により構築物の配列を確認する。

ＰＡＦ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ／ＰＳ、ｔＩ断片をＥＣ０ＲＩおよびＰＳｔ 工による消化およびポリアクリルアミドゲルからの溶出によりＲＦ　ＤＮＡから 単離する。これをＥＣ０ＲＩ／Ｐｓｔｌ消化のｐＣＪ−１に連結し、反応液でＥ 、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０７を形質転換する。ＰＡＦを生成するコロニーを７ｅｔ平 板に生育させアフィニティーで精製した抗ＰＡＦ　ＩｏＧで免疫スクリーニング して選択する。

例１１　：Ｅ、ｃｏｌ　ｉの細胞質内発現ＰＡＦの発現をｌ：、ｃｏｌｉの細胞 質内に留めるよう制御するために次のような操作因子を用いたニブラスミドＩ） ＣＪ−１上のｔａｃプロモーター：プラスミドｐＣＪ−１上のｌａｃオペレータ ーおよびＥ、ｃｏｌｉＪＭ１０７株の染色体上のＩａｃレプレッサー（ＩａｃＩ ”）；コンセンサスシャインーダルガーノ配列；高レベルの翻訳を開始するため の翻訳カプラーとして使用するＯｍｐ　Ａリーダーペプチド断片。翻訳カプリン グ配列は○ｍｌ）　Ａ遺伝子のｖＡ訳開始領域をコードするＤＮＡ、Ｏｍｒｌ　 Ａリーダーペプチドの最初の８アミノ酸、上述のコンセンサスシャインーダルガ ーノ配列およびＣ＃訳ターミネータ−より成る。翻訳カプリング配列はｌａｃオ ペレーターとＰＡＦ遺伝子の翻訳開始部位との間に後者に重なって挿入する。（ 翻訳カプラーの特性は［：、ｃｏｌｉの分ｇ発現でアダプターと共に示したＤＮ Ａ配列に組込まれている。） ＰＡＦ遺伝子はＤＣＪ−１７ラスミドに以下のように翻訳カプラーと共に取り込 まれる。アダプター＃３およびＯｍｐ　Ａ翻訳カプラーを例１０に記載するＭ１ ３ｍｐ１９構築物からのＰＡＦ　ＡｖａＴ／ＰｓｔＩ断片に結合する。この断片 をポリアクリルアミドゲルから精製する。次にこの断片をＭ１３　ｍｐ１９　Ｒ ＦのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化物に連結し、連結反応液を用いてＥ、ｃｏｌｉ　 ＪＭ１０７細胞を形質転換する。

ＰＡＦ遺伝子融合物を含むプラークを制限醍素マツピングにより選択する。ＰＡ Ｆ遺伝子融合物を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩＸ片をポリアクリルアミドゲルから 溶出し、ｐｃＪ−１のＥＣ０ＲＩ／ＰＳｔＩ消化物と連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ Ｍ１０７細胞を反応液で形質転換する。テトラサイクリン耐性を示すコロニーを 選択し、ＰＡＦ生産をアフィニティー精製した抗ＰＡＦ■ｇＧで免疫スクリーニ ングする。

本発明の方法および生産物について多くの修飾および変異があることは技術の熟 練者には明白である。従って、本発明はそれらが添付の請求の範囲およびそれに 同等なものの範囲内である限りそのような本発明の修飾および変異を含む。

例１２：Ｅ、Ｃｏｔ　ｉでの細胞質内 例１１に記載したＭ１３　ｍｌ）１９分泌用構築物をＮｒＵＩおよびＮｃｏＩで 潤化し、大きい断片をゲルから溶出する。次にアダプター＃６をＮｒｕＩ／ＮＣ ０Ｉ切断ＤＮＡに連結する。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０７株を反応液で形質転換す る。ＰＡＦ遺伝子融合物を含有するプラークをジデオキシ法配列決定により確認 する。

ＰＡＦ遺伝子融合物を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片をポリアクリルアミドゲル より溶出してＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで消化したｐＣＪ−１と連結し、反応液でＥ 、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０７細胞を形質転換する。テトラサイクリン耐性を示すコロ ニーを選択し、ＰＡＦ生産をアフィニティーｆｉｌｌした抗−ＰＡＦ　ＩＱＧで 免疫スクリーニングする。アダプター＃６ ＄６ａ　Ｏｎ＋ｐの５買−ＴＯＩ、ＧＳ）％ＣＵ）、Ｔｆｉ）ＡＴＣＣＧＧＡＣ ３°ＰＡＦのＮｃｏ　Ｉ＃６８Ｎ、　ｕ■３　’　ＧＣＴＡＧｒＴＣＣｒＣＩＴ ＴＡＴＴＴＡＣＣＣＣＴＧＧＴＡＣ５°部位へ部位 例１３：肱ＩＵビ１１ 以下の細胞株より全ＲＮＡを単離する：　Ｓ　Ｋ　＝　ＨＥ　Ｐ　＝゛−１ヒト 肝癌細胞、ヒト胎児肺（ＨＥＬ）細胞、Ｒ，ＰＭＩ　７２７２ヒト黒・腫細胞お よび肉腫１８０細胞。

次にｐｏｌｙ　ＡプラスマイナスメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をオリゴ（ ＤＴ）セルロースクロマトグラアガロース／ホルムアルデヒドゲルの電気泳動に より分離する。これらのＲＮＡをゼタブローブメンブレンに移す。ヒト肝癌細胞 ＳＫ　＋＃ｐ−１からのヒト塩基性ＦＧＦに対するＣＤＮＡプローブ（ＦＧＦ１ ５、ＥＣ０ＲＩ挿入）をニックトランスレーション法により比活性が８．６４Ｘ １０８ｃｐｍ／μ９となるよう３２Ｐ−ＤＣＴＰで１５識する。３２Ｐ−ＢＦＧ Ｆ　ｃＤＮＡプローブのＲＮＡへのハイブリダイゼーションは５０パーセントホ ルムアミド、６ＸＳＳＣ，２Ｘデンハルト溶液、１パーセントＳＤＳ、０．０５ パーセント　ビロリン酸ナトリウムおよび１７５μ９／ａｌｌ！　ｔＲＮＡ中で ４２℃１６時間行なう。ゼターブローブメンブレンを０．５×ＳＳＣ／１パーセ ントＳＤＳ、０．２ＸＳＳＣ／１パーセントＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣ／１パーセ ントＳＤＳの各１リツトルで６５℃１５分洗憬し、さらに０．１×ＳＳＣ／１パ ーセントＳＤＳで７０℃１５分間洗う。次にメンブレンを乾燥し、オートラジオ グラフィーを一８０℃で１日および３日間行なう。ＳＫ　ＨＥＰ−１細胞、ＨＥ Ｌ細胞およびＲＰＭＩ　７２７２細胞はそれぞれ大きさが８．０ＫＢ、　４．３ ＫＢ、　２．３ＫＢおよび１．０にＢの上記ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズ する４種のＲＮＡを含有した。ｃＤＮＡプローブはマウス肉腫１８０細胞のどの ＲＮＡともハイブリダイズしなかった。

Ｉｎ書ｊ内１１＋＋ＩＩａｌＡｅ仙ｅｌｕ＠Ｎｌ１ａ＋ＰＣＴ／ｌ’５８６１０ ２６６９ＰＣ′Ｉｌ／ＵＳ８６１０２６６９ ＡＴＴＡＣＨＭＥＮＴ　Ｔｏ　ＦＯＲｕ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　ＰＡＲＴ 　ＶＩ。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを 示す精製したヒト由来または合成一本鎖ポリペプチド蛋白質より成り、該血管形 成誘導因子が有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ合成促進能および それらの組合せより成るグループから選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性 部位を有する血管形成誘導因子。
2. ２．有糸分裂促進および化学走性活性およびプロテアーゼ合成促進能を有する少 なくとも一つの活性部位を持つ精製一本鎖ポリペプチド蛋白質より成り、該蛋白 質がヒト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘導因子と実質的なホモロジー を示す血管形成誘導因子。
3. ３．化学走性活性を有する少なくとも一つの活性部位を持ち、プロテアーゼ合成 促進能を有する請求の範囲第１項の血管形成誘導因子。
4. ４．有糸分裂促進活性およびプロテアーゼ合成促進能を有する少なくとも一つの 活性部位を保有する請求の範囲第１項の血管形成誘導因子。
5. ５．ヒト胎盤から実質的に精製された状態で単離した請求の範囲第１項の血管形 成誘導因子。
6. ６．有糸分裂促進および化学走性活性およびプロテアーゼ合成促進能を有する少 なくとも一つの活性部位を持つ精製単ポリペプチド鎖蛋白質より成り、該蛋白質 が部分的に次に示すアミノ酸配列より成る血管形成誘導因子。 【配列があります】； 【配列があります】；および 【配列があります】．
7. ７．有糸分裂促進および化学走性活性およびプロテアーゼ合成促進能を有する少 なくとも一つの活性部位を持つ精製単ポリペプチド鎖蛋白質より成り、該蛋白質 が一部的に次に示すアミノ酸配列より成る血管形成誘導因子。 【配列があります】．
8. ８．蛋白質のアミノ酸配列が請求の範囲第７項の配列と１個のアミノ酸残基だけ 異なる血管形成誘導因子蛋白質。
9. ９．蛋白質のアミノ酸配列が請求の範囲第７項の配列と２個のアミノ酸残基だけ 異なる血管形成誘導因子蛋白質。
10. １０．該蛋白質のＮ−末端がブロツクされている請求の範囲第７項の血管形成誘 導因子。
11. １１．組織より純粋に血管形成誘導因子を得るための以下より成る方法： （ａ）血管形成誘導因子を生産することの出来る組織を集め、 （ｂ）組織中の蛋白性物質を分画することにより組織から血管形成誘導因子を単 離し、 （ｃ）血管形成誘導因子活性を有する画分を同定し；そして （ｄ）血管形成誘導因子がヒト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘導因子 と実質的ホモロジーを示す一本鎖ポリペプチド蛋白質より成り、有糸分裂促進活 性、化学走性活性、プロテアーゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグル ープから選ばれる活性を有する少なくとも一つの活性部位を有する血管形成誘導 因子であるような血管形成誘導因子活性を呈する画分を濃縮する。
12. １２．血管形成誘導因子を生産することの出来る組織がヒト胎盤組織である請求 の範囲第１１項の方法。
13. １３．該血管形成誘導因子がヒト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘導因 子と実質的ホモロジーを示し、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ 合成促進能およびそれらの組合せより成るグループから選択される活性を有する 少なくとも一つの活性部位を持つ、以下のステツプより成る血管形成誘導因子の 製造方法：（ａ）血管形成誘導因子をコードするＤＮＡ配列を単離し； （ｂ）そのＤＮＡ配列を宿主中で発現可能なベクターに挿入し； （ｃ）該ＤＮＡ配列を含むベクターで血管形成誘導因子を発現できる宿主微生物 を形質転換し；（ｄ）形質転換微生物中で血管形成誘導因子を発現し；そして （ｄ）どの順序ででも発現させた血管形成誘導因子を単離、精製する。
14. １４．宿主微生物をｐＧＳ２８６−ＰＡＦで形質転換する請求の範囲第１３項の 方法。
15. １５．ＤＮＡ配列が次に示すアミノ酸を含む蛋白質をコードしている請求の範囲 第１３項の方法：【配列があります】； 【配列があります】；および 【配列があります】．
16. １６．ＤＮＡが次のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしている請求の範囲第１ ３項の方法：【配列があります】．
17. １７．宿主生物がＥ．ｃｏｌｉである請求の範囲第１３項の方法。
18. １８．宿主生物が酵母である請求の範囲第１３項の方法。