JPH0767659A - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

組換え繊維芽細胞成長因子

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JPH0767659A JP5297089A JP29708993A JPH0767659A JP H0767659 A JPH0767659 A JP H0767659A JP 5297089 A JP5297089 A JP 5297089A JP 29708993 A JP29708993 A JP 29708993A JP H0767659 A JPH0767659 A JP H0767659A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 組織治癒の際に、循環系を形成するために重
要なヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ヒト塩基性ＦＧ
Ｆ）を生産する。 【構成】 ヒト塩基性ＦＧＦをコードする遺伝子を単離
し、細菌にクローニングして培養し、発現させて、ヒト
塩基性ＦＧＦを回収する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，組織治癒の際に，循環
系を形成するために重要な成長因子の組換え生産に関す
る。特に，本発明は，ウシおよびヒトの，塩基性および
酸性の繊維芽細胞成長因子（FGF)をコードする遺伝子を
クローニングし，そして発現させる。
【０００２】
【従来の技術】組織が創傷または火傷のような外傷を受
けた場合の修復過程は極めて複雑であるが，多数のタン
パク因子により仲介されることが知られている。これら
の因子は，破壊された組織を置換するように働く細胞の
増殖および分化に必須である。数多くの候補となる因子
は，脳，脳下垂体，および視床下部などのいろいろな組
織の抽出物が培養細胞系の有糸分裂を促進する能力を基
準として同定されている。多数の短縮名がこれらの抽出
物中の活性因子に与えられている。これらの活性因子に
は，血小板由来成長因子（PDGF），マクロファージ由来
成長因子（MDGF），表皮成長因子（EGF)，腫瘍脈管形成
因子（TAF)，内皮細胞成長因子（ECGF），繊維芽細胞成
長因子（FGF)，視床下部由来成長因子（HDGF），網膜由
来成長因子（RDGF），およびヘパリン結合成長因子（HG
F)が含まれる。（例えば，Hunt, T.K., J Trauma (198
4) 24 : S39-S49 ; Lobb,R.R., et al, Biochemistry
(1984) 23 : 6295-6299を参照）。
【０００３】Folkman, J.,ら，Science (1983) 221 : 7
19-725は，創傷治癒に関与する過程の１つ，すなわち血
管の形成は，腫瘍においてヘパリンにより強く影響され
ることを報告した。このことおよび他の研究から，ヘパ
リンが，多数のこのような成長因子活性に関連するタン
パクに対して特異的に結合することは明らかである。従
って，ヘパリンが精製手段として用いられてきた。ヘパ
リンが正および負に荷電した両方の因子に結合すること
から，成長因子のヘパリンに対する親和性は，全体のイ
オン電荷に無関係であることが示されている（Maciag,
T., et al, Science (1984) 225 : 932-935 ; Shing,
Y., et al, Science (1984) 223 : 1296-1299 ; Klags
brun, M., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1985)
82 : 805-809）。ヘパリンに対する結合能力または非結
合能力は，いろいろな抽出物における活性を区別する１
つの尺度である。例えば， EGFおよびPDGFはヘパリンに
強く結合しない；実際には，EGF はヘパリンに全く結合
しない。上述の他の因子は強いヘパリン結合性を示す。
しかしながら，酸性の脳FGF ，ECGF，RDGFおよびHGF-α
は，実際には，同一因子であると考えられている。同様
に，脳下垂体FGF ，陽イオン性の脳FGF ，TAF およびHG
F-βも同一タンパクであると考えられている（Lobb, R.
R., et al,（前出））。ヘパリン親和性を用いて精製さ
れた13の内皮成長因子の要約および比較が，Lobb, R.,
ら，J BiolChem (1986) 261 : 1924-1928 に示されてい
る。
【０００４】ヘパリン−アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて，毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性
を示す塩基性の繊維芽細胞成長因子が，ラットの軟骨肉
腫（Shing, Y., et al, 前出）およびウシの軟骨（Sull
ivan, R., et al, J Biol Chem(1985) 260 : 2399-240
3）から単離されている。Thomas, K.A., ら，Proc Natl
Acad Sci (USA) (1984) 81 : 357-361, 米国特許第 4,
444,760号は，16,600および16,800ダルトンの分子量を
有する酸性のウシの脳繊維芽細胞成長因子の２つの異種
型を精製した。Gospodarowicz および協同研究者らは，
ウシの脳および脳下垂体の両方に塩基性の繊維芽細胞成
長因子活性が存在することを示し，そしてヘパリン−ア
フィニティークロマトグラフィーを他の精製技術と組合
せて，これらのタンパクを精製した（Bohlen, P., et a
l, Proc Natl AcadSci (USA) (1984) 81 : 5364-5368
; Gospodarowicz, D., et al,（同）6963-6967)。これ
らの因子の分子量も，ヒトの胎盤から単離された同様の
因子の分子量のように約16kdである（Gospodarowicz,
D., et al, Biochem Biophys Res Comm(1985) 128 : 55
4-562）。
【０００５】ウシの脳下垂体由来の塩基性 FGFに対する
完全な配列が決定されている（Esch, F., et al, Proc
Natl Acad Sci (USA)(1985) 82 : 6507-6511）。均一
な調製物が得られ，そして内皮細胞を用いたインビトロ
分析で強い有糸分裂活性を示した（塩基性 FGFは，60pg
／mlのED50を有する）。
【０００６】酸性 FGFは，約 6,000pg／mlのED50を有す
る。ウシの脳組織由来の酸性 FGFのＮ末端配列は，Bohl
en, P., ら，EMBO J(1985) 4 : 1951-1956により決定さ
れた。Gimenez-Gallego,G,らは，ヒトの脳から調製され
た酸性FGF および塩基性FGF両方のＮ末端配列を決定
し，そしてそれらをウシのFGF の配列と比較した（Bioc
hem Biophys Res Comm (1986) 135 : 541-548)。彼らの
結果は，ここに開示された結果と一致している。また，
ウシの脳由来の酸性FGF の全アミノ酸配列が，単離され
たタンパクから決定された（Gimenez-Gallego, G, et a
l , Science (1985) 230 : 1385-1388 ; Esch, F, et a
l, BiochemBiophys Res Comm (1985) 133: 554-562)。
これら２つの決定は，１つのアミノ酸を除いて一致して
いる。ここでの多くの研究の後に，ヒトの酸性 FGFの全
アミノ酸配列が，その遺伝子から推定された（Jaye,
M., et al,印刷中）。
【０００７】上述の FGFタンパクおよび他の成長因子
は，外傷を受けた組織の治癒を促進する際，明らかに有
効である（例えば，Sporn,M.B., et al, Science (198
3) 219: 1329-1331 ; Davidson, J.M., et al, J.C.B.
(1985) 100 : 1219-1227 ; Thomas, K.A., et al, Pr
oc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6409-6413を参
照）。Davidsonら（前出）は，特に創傷治癒における F
GFの有効性を開示している。塩基性 FGFの天然タンパク
は，心筋梗塞の治療に有用であると言われている（Svet
-Moldavsky, G.J., et al, Lancet (1977年４月23日）
913 ; 米国特許第4,296,100号および第 4,378,347
号）。さらに，ヒトの塩基性 FGFが，ラット胎児の海馬
体神経細胞における神経細胞の生存および神経突起の伸
長を増大させることが見出されている（Walicke, P., e
t al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1986) 83 : 3012-30
16）。このことは，この因子がアルツハイマー病および
パーキンソン病のような退化神経学的疾病の治療にも有
用であり得ることを示唆している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って，これらの FGF
タンパクを大量に，かついかなる毒性不純物あるいは感
染性不純物を含まない形で利用し得ることを保証するこ
とが望ましい。治療に用いるには，このタンパクのヒト
型のものが好ましく，そして恐らく必要とされる。純粋
な調製物を得るには約35,000倍に精製しなければならな
いので，天然のヒト起源のものを用いることは，明らか
に実用的ではない。たとえヒトの死体が実用的な起源で
あるとしても，エイズ，肝炎あるいは他の病気の伝染の
可能性があるため完全な精製は，困難である。最近のク
ロイツフェルト−ヤコブ症候群（Powell-Jackson et a
l, Lancet (1985) ii :244-246)の経験からヒトの脳下
垂体を起源として用いることはできない。従って，組換
え技術は，特にこれらのタンパクの生産への応用に適し
ている。本発明は，ここに酸性 FGFおよび塩基性 FGFを
実用的な量で，かつ純粋であって，汚染されていない形
で得る方法を与える。
【０００９】本発明は，創傷，骨折，火傷組織，創傷心
筋組織，退化神経組織または他の外傷の治癒を効果的に
促進させるのに有用な繊維芽細胞成長因子の合成および
操作の手段を与える。これらの因子をコードする遺伝子
のクローニングおよび発現は，本発明の方法および材料
によって与えられる。
【００１０】ある様相において，本発明は，ウシおよび
ヒトの，酸性および塩基性の FGF（酸性bFGF，酸性hFG
F，塩基性BFGFおよび塩基性hFGF）をコードする組換え
DNA配列に関する。特に，これらはヒトまたはウシのゲ
ノム配列を包含する。他の様相において，本発明は，こ
れらの DNA配列を有する組換えベクター，このようなベ
クターを用いて形質転換され，そしてこれらの DNA配列
を保持する宿主細胞，およびこれらの形質転換された細
胞により生産される組換えタンパクに関する。他の様相
において，本発明は，組換え技術を用いたこれらの繊維
芽細胞成長因子の生産方法に関する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
Ａ．繊維芽細胞成長因子 ２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成
長因子は，他の人々により均一にまで精製され，そして
部分的にあるいは完全に配列決定されている。両因子
は，ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞，
ヒトの臍静脈内皮細胞，ウシの副腎皮質細胞，顆粒膜細
胞および脈管平滑筋細胞などの培養細胞を用いたインビ
トロ分析において有糸分裂活性を示す。これらの細胞培
養を用いるインビトロ分析は，Gospodarowicz, D.,ら，
J Cell Physiol (1985) 122 : 323-332 ; および Gospo
darowicz, D., ら，J Cell Biol (1983)97 : 1677-1685
によって述べられている。ごく最近，別のインビトロ分
析が，Eschら，Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 :
6507-6511 ;および Gospodarowicz, D., ら，J CellPh
ysiol(1986) 127 : 121-136により報告された。精製さ
れた塩基性bFGFは，ニワトリの漿尿膜分析においてイン
ビボで脈管形成能があることが示されている（Gospodar
owicz, D. ホルモン性タンパクおよびペプチドXII : 20
5-230(アカデミックプレス））。精製された酸性bFGF
は，同じ分析においてインビボで脈管形成能があること
が示されている（Thomas, K.A., et al, Proc Natl Aca
d Sci（前出））。
【００１２】ウシの脳下垂体の塩基性 FGFは，完全に配
列決定されており，それを第７図に示す；ゲノムおよび
cDNAからここで決定されたヒトの FGFの配列を第８図に
示す。一次配列は，146 個のアミノ酸を含んでおり，図
中の“１”番のプロリン残基で始まっている。この一次
配列は，Giminez-Gallego ら，Biochem Biophys ResCom
m（前出）により報告された，天然のウシのタンパクの
Ｎ末端配列，および Esch, Proc Natl Acad Sci （前
出）により報告された天然タンパクの全配列と一致して
いる。より大きな分子量を有するヒトの塩基性 FGFは，
ヒトの肝細胞系列，SK-Hep-1について，Sullivan, R.J.
ら，J CellBiol (1985) 101 : 108a ;および Klagsbru
n, M.ら，Proc Natl Acad Sci (USA) (1986) 83 : 2448
-2452，により報告されている。ヒトおよびウシの DNA
において，第７図および第８図の上流側配列を元の ATG
開始コドンまで翻訳することは，第７図および第８図に
おいて残基１で示されるプロリンの上流側のアミノ酸を
含む，各タンパクの別の型のものも生産され得ることを
示す。これらの DNAには，ATG を含め９つの上流側コド
ンが存在する。遺伝子が真核系で発現する場合，ATG に
よりコードされるメチオニンが，プロセッシングを受け
ることはかなり確かである。遺伝子が組換えによって細
菌系で発現する場合，このようなプロセッシングは，起
こり得る場合も，起こり得ない場合もある。従って，タ
ンパクの長い型のものは，さらに８つのアミノ酸プロ−
配列または合計154 個のアミノ酸を含む。SK-HEP-1細胞
から単離された，この伸長した FGFは，そのＮ末端がブ
ロックされていることも示されている（Klagsbrun, M.,
et al,(前出））。
【００１３】上述のインビトロ分析において FGF活性を
有し，そして第７図（ 146個のアミノ酸型）に示されて
いるウシの脳下垂体の塩基性 FGFと類似していると推定
されるＮ末端配列を有するタンパクも，ウシの脳，副
腎，黄体，網膜，腎臓，およびヒトの胎盤から単離され
ている。これらの組織のあるものから得られた天然のタ
ンパクは，不均一である--推定される15個のＮ末端アミ
ノ酸を欠く第２の型は，活性を保持している（Gospodar
owicz, D., Meth Enz (1986),印刷中）。従って，ウシ
およびヒトの塩基性 FGFは，３つの型が存在する--これ
らは第７図および第８図に成熟型として示されている。
ここに示されている推定の成熟型配列のうち，長い型は
Ｎ末端にさらに８個のアミノ酸を含んでおり，短い型は
15個のアミノ酸を欠いている。従って，天然で生産され
る“長い（long)"塩基性 FGFは， 154個のアミノ酸を含
み，“基本型（primary)”塩基性 FGFは， 146個のアミ
ノ酸を含み，そして“短い（short)”塩基性 FGFは， 1
31個のアミノ酸を含んでいると考えられている。これら
の FGFは，非常に多くの塩基性アミノ酸残基（リジン，
アルギニン，ヒスチジン）を含んでおり，従って中性pH
の下で陽イオン性であるので，“塩基性” FGFと呼ばれ
る。
【００１４】あるタンパクが前述の分析で FGF活性を有
し，ヘパリンに結合し，中性pHの下で陽イオンであり，
そしてウシの血清アルブミン（もし適当なら），あるい
はウシ（またはヒト）の FGFもしくはそれの合成ペプチ
ドまたは天然ペプチドに対する他の抗体に結合した，ア
ミノ末端配列〔tyr10〕FGF（1-10）の合成類似体を用い
て調製された抗体と免疫的に反応する場合，このタンパ
クをここでは塩基性 FGFと定義する。Baird,A.ら，Regu
latory Peptides (1985) 10 : 309-317を参照された
い。
【００１５】酸性 FGFは，他の人々によりウシの脳から
単離され，そして始めの34個のアミノ酸残基が決定され
ている。ウシおよびヒトの酸性 FGFに対する，ここでの
遺伝子のクローニングにより，酸性bFGFに対してアミノ
酸配列１−34に付加的なアミノ酸配列が第１図に示した
ように推定され，そして第３図に示されるように，酸性
hFGFの部分配列が得られた。以下に記述される多くの研
究により，酸性bFGFに対する完全なアミノ酸配列が，第
２図に示すように，Eschら, Biochem BiophysRes Comm
（前出），および Gimenez-Gallego, G., ら，Science
（前出），により開示された。大部分のこの研究の結果
として，酸性hFGFに対する完全なコード配列が，第４図
に示されるように，マキアグ（Maciag）グループにより
決定された。
【００１６】この酸性タンパクはまた２つの活性型が知
られており，第１の型は図の“１”番のフェニルアラニ
ン残基で始まる 140アミノ酸配列を有しており，そして
第２の型はアミノ酸７− 140に対応する短い型である。
ウシおよびヒトのタンパクは，いずれもＮ末端伸長型で
存在し得る。図の“１”番のアミノ酸に対するコドンの
上流側の DNAの（括弧で示す−15のATG 開始コドンへ戻
る）翻訳によって，伸長したタンパクの付加的配列が示
される。塩基性 FGFの場合のように，Ｎ末端のメチオニ
ンは，遺伝子が細菌で発現する場合にはあり得ないが，
真核発現宿主ではほとんど確実にプロセッシングされ
る。従って，上述の塩基性 FGFのように，天然の酸性タ
ンパクは，３つの型で存在し得る：１つは，切形型（tr
uncated) FGF，すなわち 134個のアミノ酸を含む“短
い”酸性 FGF；１つは，Ｎ末端伸長型，すなわち 154個
のアミノ酸を含む“長い型”；そして残りの１つは，図
の“１”番の残基で始まる 140個のアミノ酸を含む“基
本型”酸性FGF 。Burgess, W.H.,ら，（印刷中）によ
り，ウシの脳の長い型はアセチル残基でブロックされて
いることが示された。これらのタンパクは，不均衡な数
の酸性アミノ酸残基，すなわちグルタミン酸およびアス
パラギン酸を含んでおり，従って中性pHの下で陰イオン
である。
【００１７】あるタンパクがインビトロ分析で FGF活性
を示し，ヘパリンに結合し，中性pHの下で陰イオンであ
り，そしてヒトまたはウシの酸性 FGFあるいはそれの合
成ペプチドまたは天然ペプチドに対して調製された抗体
と免疫的に反応する場合，このタンパクをここでは酸性
FGFと定義する。
【００１８】酸性 FGFおよび塩基性 FGFは，上述のタン
パク，または第１図〜第８図に示されるアミノ酸配列を
有するタンパクを示すために，ここで用いられる。もち
ろん，これらの定義は，示された特定の配列に限定され
るものでなく，前述のインビトロおよび免疫的分析によ
って測定した生物学的活性，および中性pHの下でのそれ
ぞれの陰イオン性または陽イオン性が変化しない限り，
アミノ酸残基の欠失，付加または交換のような，偶然の
変化あるいは計画的に誘導した変化を含むタンパクを包
含する。もちろん，修飾型は若干変化した定量的活性お
よび特異性を有し得る。
【００１９】“精製した”または“純粋の”とは，天然
の状態で見られる，通常それに付随する物質を含まない
ものを意味する。従って，例えば“純粋の”酸性hFGF
は，ヒトの脳または脳下垂体における本来の環境下で通
常付随している物質を含んでいない酸性hFGFを意味す
る。もちろん，“純粋”の酸性hFGFは，グリコシド残基
のような，それと共有結合によって結合している物質を
含み得る。
【００２０】“動作可能に連結した”とは，成分がその
通常の機能を果たすように位置している連結部を意味す
る。従って，コード配列に動作可能に連結した，制御配
列またはプロモーターは，このコード配列の発現に効果
的である。
【００２１】“制御配列”とは， DNA配列，あるいは所
望のコード配列に適切に連結した場合，このような配列
に適合した宿主においてその発現を有効にし得る配列を
意味する。このような制御配列には，少なくとも原核お
よび真核宿主におけるプロモーターが含まれるが，任意
に転写終止シグナルも含まれる。発現を効果的にするの
に必要な他の因子または補助的な他の因子もまた同定さ
れ得る。ここで用いられるように，“制御配列”とは，
単に，用いられる特定の宿主において発現を効果的にす
るのに要求されるどのような DNA配列をも意味する。
【００２２】“細胞”または“細胞培養”，もしくは
“組換宿主細胞”または“宿主細胞”とは，内容から明
らかであるので，しばしば互換性をもって用いられる。
これらの用語は，直接の対象細胞を包含するが，もちろ
ん，その子孫をも包含する。偶然の変異あるいは環境の
変化により，必ずしもすべての子孫が親細胞と正確に同
一でないことが理解されている。しかしながら，このよ
うな変化した子孫は，その子孫が初めの形質転換細胞に
与えられた性質に関連した性質を保持している限り，こ
れらの用語に包含される。この場合，例えばこのような
性質は，組換え FGFを生産する能力であり得る。
【００２３】Ｂ．一般的記載 用途および投与 本発明は成長因子タンパクをコードする DNAを提供す
る。成長因子タンパクは，傷の治癒を促進するのに有効
であり，そして，さらに成長因子タンパクに特異的な阻
害剤の設計を行うために充分な量が純粋に提供され得
る。精製された成長因子は一般に，血管新生や治癒を促
進するために，傷ついた組織に局所的に適用される。適
当な対象としては，火傷，骨折，成形外科で扱われるよ
うな外科的擦過傷，または治療を要する他のものがあ
る。これら因子の適用は治癒を促進するので，それらは
また，感染の危険を減少させる。
【００２４】FGFが血管の新生を促進するということに
おいて価値がある適応症には，骨折，靱帯および腱の治
療，腱炎，および滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火
傷，切傷，裂傷，褥瘡，および糖尿病患者に見られるよ
うな遅治癒性潰瘍のような皮膚の状態；および虚血症お
よび心筋梗塞症時の組織治療時，が包含される。
【００２５】入手可能な賦形剤および担体を用い組換え
技術により生産される成長因子の処方は，当該分野で既
知の標準的な方法により調製される。このタンパクは，
所望であれば，制御された放出システムの一部として，
ローション，ゲル，または抗生物質のような付加的な活
性成分を有する軟膏，として処方され得る。
【００２６】表面の障害に関して最も適当である局所的
な投与においては，例えば， 0.1〜1.0％溶液を用いる
標準的な局所的処方が採用される。そのような溶液は患
部に，１日あたり３〜６回適用される。もちろん軟膏ま
たは他の処方物の濃度は，傷の程度および患者の性質に
依存する。ほとんどの処方（プロトコル）においては，
用量は時間が経過して傷跡が残る可能性が減少するにつ
れて減じられる。例えば，第３度の火傷のような最も重
症の傷は典型的には10％組成物で処置される。しかし，
治癒が始まると，用量は傷が治癒するにつれて徐々に約
0.1％またはそれ以下にまで下げられる。 BSAを担体と
した EGFの局所的処方は，Franklin, J.D., ら，Plasti
c and Reconstruc Surg (1979) 64 : 766-770, に開示
されている。
【００２７】骨および組織の治療には，投与は局所的に
なされることが好ましいが，皮下注入または標的の近傍
に直接的に移入した遅延放出性の処方によることができ
る。外科手術は骨の損傷のような状況に対しては必要と
なることもあり得るので，直接的な注入が有利である。
遅延放出型は，Hydron (Langer, R., et al, Nature(1
976) 263 : 797-799)または Elvax 40P(Dupont)(Murry,
J.B., et al, In Vitro (1983) 19 : 743- 747)のよ
うなポリマーに処方され得る。他の持続的放出系は，Hs
ieh, D.S.T. ら，J Pharm Sci (1983) 72 : 17-22によ
り示唆されている。本発明では望ましくはないが，特に
上皮成長因子の処方が Buckley, A., Proc Natl Acad S
ci USA (1985) 82 : 7340-7344に示唆されている。
【００２８】局所的投与で，持続的な放出の送達につい
ては，処方物中の FGF濃度は，状態の程度および該ポリ
マーからの FGFの放出速度を含む多くの因子に依存す
る。一般的に，その処方は，Buckley ら（Proc Natl Ac
ad Sci USA (前出））により記載されているように，ホ
ルモンが血清レベルの約 100倍，または，組織濃度の10
倍の，定常的な局部的濃度を達成するように構成され
る。５〜50ng／ｇ湿潤重量の組織中の FGF濃度（60ng／
ｇ湿潤重量での EGFに比べて）を基準として，１時間あ
たり50〜5000μg FGFの放出が許容され得る。もちろ
ん，その初期濃度は傷の程度に依存する。
【００２９】FGFは，上皮成長因子（EGF)，形質転換成
長因子（TGF-αまたはTGF-β），インシュリン様成長因
子（IGF-１またはIGF-２），および／または血小板由来
成長因子（PDGF）のような他の成長因子と，協奏的に，
そして共働的にも働き得ると期待される。さらに，骨の
治療に関しては特に，それは副甲状腺ホルモンの拮抗薬
と共働して働き得る。なぜなら，副甲状腺ホルモンは骨
の再吸収を促進するからである。従って，所望の組織の
治療をより効果的に達成するために，本発明のFGF が前
述の因子の１もしくはそれ以上と同じ組成でもしくは同
じ処方で投与される実施態様もまた，本発明の組成物お
よび投与処方内に包含される。
【００３０】FGFは，軸索の成長，神経再生，および神
経単位の生存を促進させることに効果的であるので，そ
れは，アルツハイマー病およびパーキンソン病のような
ある種の神経性の疾患，筋萎縮性側索硬化症，および神
経系の一般的老化の処置；そして脊髄および末梢神経の
外傷に有効であり得る。
【００３１】これらの症状に対して薬剤を投与するとき
には，傷の治癒に関連して上に述べた処方と同様の処方
で注入することによるのが好ましい。この薬剤はまた，
移植に先立ち本発明のFGF 調製物で培養物を処理するこ
とによる移植治療のときのように，細胞培養物の注入と
いう手段を用いて送達され得る。さらに，この FGFは髄
液に直接注入され得，または，系統的に適用され得る。
系統的処方は一般に当該技術分野で既知であり，緩衝液
または生理学的食塩水，または他の適当な賦形剤中での
処方を包含する。用量レベルは，傷を治癒させ得る程度
のレベルである。しかし，組織培養または体外移植組織
の維持については，それは，血清または培地の 0.1〜
1.0ng／mlで供給され得る。
【００３２】FGFタンパクも，外科手術中に損傷した組
織の再形成および治療を促進させることにおいて，特に
有用である。この用途のために，外科用ステープルとし
て用いるポリマー中にFGF タンパクを埋めこむことが有
用であり得る。このタンパクはこのように，ステープル
により行われる機械的縫合を生物学的に補うことがで
き，そして，治療した組織における“自然の”治癒過程
を増大させ促進させることができる。
【００３３】さらに，ここで述べている FGFタンパクに
より供給されるような脈管形成刺激により，インビトロ
における，組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA)およ
びコラゲナーゼの放出が起こる（Gross, J.L., et al,
Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80 : 2623-2627）。従
って，本発明の FGFタンパクもまた，これらの酵素に応
答する状況の処置に有用である。急性な状況（発作また
は心臓発作に関連する血液凝固物が存在するような状
況）では，塞栓症を形成する慢性的傾向に対する処置の
ために，凝固物を溶解するために大用量の tPAを直接投
与することが必要であり得るが，血流の tPAの適当なレ
ベルを維持するために FGFを投与することが望ましいか
もしれない。従って，この症状に対して，筋肉内または
皮下注射のような従来の方法を用いて，薬剤の系統的投
与を行うことが好ましい。
【００３４】本発明は，上記の症状に関連した用途に，
純粋な FGF成長因子の実際的な量を提供する。４つの特
異的な内皮成長因子が例示されており，その各々は３つ
の形（ウシの酸性および塩基性 FGF，およびそれらのヒ
トに相当するもの）について明らかに活性がある。酸性
および塩基性因子はいずれも，ここで述べているよう
に，長型，基本型，そして短型で発現すると考えられ
る。長型のＮ末端メチオニンは，真核細胞系において該
タンパクが生産されると切り離されること，そして，続
くアミノ酸残基が転写後におそらくアセチル化により誘
導されると考えられる。
【００３５】種々の型のFGFは認識されるシグナル配列
を持たないが，それは何らかの方法で分泌されているに
違いない。なぜなら，それを産生している細胞の外の，
膜結合受容体で，作用するからである。従って，たぶん
認識される構造分泌経路によっては分泌されないので，
その分泌は，細胞溶解による，またはエキソサイトシス
（開口分泌）によるような他の方法で達成される。 FGF
が自然に誘導されるほとんどの組織においては，そして
多くの哺乳類の発現系においては，そのような放出は，
通常に用いられているA23187（CalBiochem）のようなカ
ルシウムイオノフォアでのエキソサイトシスを行うこと
により達成され得る。インビトロの状態においては，カ
ルシウムイオノフォアは，１mM CaCl2の存在下で１〜10
μM となるように培地に加えられる。マクロファージま
たは単球に由来する発現系では，リポポリ多糖（LPS)を
10μg ／mlで添加するような，または大腸菌エンドトキ
シン（Difco)（ 300ng／ml）を加えるような他の活性化
法が効果的であることが示されている。これらの刺激
は，マクロファージ由来の類似因子インターロイキン１
を放出することが示されている（March,C.J., et al,
Nature (1985) 315 :641-647)。これらの手法もまた，
以下で述べるように，付加的なシグナル配列なしで細胞
内で生産されると，組換えにより生産される FGFタンパ
クを放出させるのに採用され得る。細胞内で産生したタ
ンパクの放出を起こさせる刺激には，ホルボールエステ
ルおよびトリグリセリドが包含される。
【００３６】遺伝子回収 例示した FGFをコードしている配列がここで得られるよ
うな一般的な戦略は以下のようである。ウシの酸性 FGF
の既知のＮ末端配列を，ファージに連結したウシのゲノ
ムライブラリーとともに使用するための一連のプローブ
を設計するのに用いた。プローブにハイブリダイズした
ファージ組換体をライブラリーより単離し，“天然の”
プローブを得るために， M13クローニングベクターにク
ローニングするのに適したより小さな断片にまで分解し
た。これにより，ウシの酸性タンパクの一部分に相当す
る 250bpの配列を含む M13プローブが得られた。このプ
ローブは，これらの種の中の塩基性型の遺伝子を得るた
めだけでなく，ウシとヒトの両起源の酸性型に対し完全
にコードしている配列を回収するための中心である。
【００３７】簡単には，ファージにクローン化した選抜
された酸性bFGF遺伝子断片のAluI分解により得られた断
片を，ショットガン法でM13 にクローン化した。適当な
プローブ DNAにハイブリダイズされた 250bp断片を選抜
し，配列決定した。上記のものを 250／AluIと表すが，
それをpBR322に転写し，そしてウシの脳，視床下部，あ
るいは脳下垂体のcDNAライブラリーを探索するため（イ
ントロンで中断されていない完全な酸性bFGF配列を得る
ため），およびヒトのゲノムライブラリーを探索するた
め（ヒトの酸性 FGFゲノム配列の最初のエキソンを得る
ため），に用いた。酸性 FGFをコードしているヒト遺伝
子の中央部および第三番目のエキソンを，以下の実施例
に記述のように，オリゴマーのプローブを用いて得た。
これらのプローブを，合成したヒトの酸性 FGF遺伝子を
もとにして設計した。加えて，この同じ 250bpの断片
を，酸性型よりもむしろ塩基性型に相応する DNAを変え
るために，入手可能なアミノ酸配列の情報を有効に利用
して，塩基性型のプローブを設計するのに用いた。それ
ゆえ，酸性型bFGFのＮ末端をコードしている配列と塩基
性型のbFGFのアミノ酸配列との比較をもとにして設計し
た修飾プローブを，塩基性型bFGF cDNA に対して，同じ
ウシの脳下垂体cDNAライブラリーを探索するために用い
た。回収されたウシのクローンを，次いでヒトの塩基性
型 FGFをコードしている DNAをコードするゲノム配列を
回収するために，ヒトのゲノムおよびcDNAライブラリー
を探索するのに用いた。選択的には，ウシのcDNAクロー
ンλBB2を，塩基性型 FGFタンパクのヒト型をコードす
るものに DNA配列を変換させるために変異させた。酸性
型および塩基性型の両 FGFに対して，下記のcDNAクロー
ンおよびゲノムクローンは，このような哺乳類のライブ
ラリーから類似のコード配列を得るために，種々の種か
ら調製した DNAライブラリーを探索するのに有効であ
る。加えて，このゲノムクローンは哺乳類系で発現させ
ることができ，かつ相当するcDNA以上のよい結果を与え
ることもある。脳下垂体，脳，視床下部，あるいは腎臓
のような種々の組織から調製したcDNAライブラリーもこ
のようにして選抜され得る。
【００３８】FGF遺伝子の発現 このクローン化したゲノムあるいはcDNA配列は，適当な
発現系で発現され得る。もちろん，ここで開示した DNA
に対しても，それらを回収するための前述のプロトコル
を繰り返す必要はなく，従来の化学合成法が適当に用い
られ得る。このことは， DNAを調節することにより，あ
らゆる所望の形のタンパクを得ることを可能にする。cD
NA配列は，バクテリア，酵母，あるいは真核細胞を含む
どのような宿主にでも適した適当な制御を供給し得る。
ヒトの酸性 FGFのゲノム配列の再構築を，３つのエキソ
ンを含む３つの寄託されたλファージから得ることがで
きる。イントロンを含むゲノム配列は，真核細胞の制御
配列，および転写物のスプライシングが可能な真核細胞
宿主を用いて発現させ得る。ワクシニアをもとにした発
現も用い得る。典型的な制御配列DNAsおよび宿主を以下
のＣ．１．節で与えている。
【００３９】特に，完全長の FGFをコードする完全な D
NAは，例えば，酸性あるいは塩基性FGFの長型，基本
型，あるいは短型のどれでも得るために，組換え方法お
よび合成方法を組合せて用いながら構築され得る。異種
のシグナル配列をこれらに融合することも可能であり，
所望形態でタンパクを得るために，開裂部位に対するシ
グナル配列の既知の関係を考慮に入れることも利用可能
である。細胞内で産生された形態のタンパクは細胞溶解
により得られる，あるいは細胞からのそれらタンパクの
遊離は，上で述べたように刺激され得る。細胞に関係し
た形態，もしくは分泌されシグナル配列に融合されると
推定される形態（この形態は， CHO細胞のような哺乳類
細胞と和合可能な制御系を利用する）の発現系は，特に
好ましい。また，ワクシニアをもとにしたシステムがよ
り好ましい。このシステムは，感染しやすい細胞中に
て，安定な，あるいは一時的な発現に使用可能である。
【００４０】このように産生された組換え FGFタンパク
を，次いで，天然起源から FGFを精製するために用いら
れる方法と同様の方法で精製する。しかし，このタンパ
クは出発材料の極めて大部分を占めているので，精製は
かなり簡単である。
【００４１】多形性 ヒトのゲノム DNAは，遺伝子の第二のエキソンの領域に
多形性があることがすでに示されている。この多形性の
存在は， FGFが腫瘍により分泌されるので，充実性腫瘍
になる傾向を予想させる。そして，多形性は腫瘍への滋
養物の流れを保つ血管の成長を促進するので，それらが
生存するためにおそらく必要である。
【００４２】この多形性を検出するために，ヒトのゲノ
ム DNAが，例えば，血液サンプルから従来の方法により
得られ，そしてポリアクリルアミドゲル上でサイズによ
る分離に供され，そして標準的なサザンブロット操作を
用いて探索される。効果的なプローブは，以下で述べる
λBB2 への 2.1kbの挿入から得られた 1.4kb EcoRI断片
である。このようなプローブあるいはそれと同等物を，
単離されたヒト DNAのHindIII分解物を含むゲルにハイ
ブリダイズさせるべく用いると， 2.7kbの断片が通常検
出される。いくつかの個体では，付加的な 2.9kb断片も
見い出される。これらの断片は，第２１図に示すよう
に，エキソン２の周辺の遺伝子領域に地図化される。
【００４３】検査した３つの個体のうちで，２つは 2.7
kb断片だけを示した。１つは 2.7断片および 2.9kb断片
の両方を示した。ハイブリダイゼーションの強度は，両
断片を持つ個体が両対立形質を含むことを示した。この
ことは，マウス／ヒトハイブリッド細胞系由来の DNAの
サザンブロット分析により得られた結果によって，支持
される。このようなハイブリッド（ここでは１つの染色
体のみが転写される）では，２つの断片のうちの１つだ
けが各系に現れる。
【００４４】Ｃ．標準的方法 細胞の形質転換，ベクターの構築，メッセンジャー RNA
の抽出，cDNAライブラリーの調製などに用いる技術の大
部分は，当該分野で広く実施されている。そして，ほと
んどの従業者は，特異的条件および方法を記載している
標準資料に通じている。しかしながら，便宜上，以下の
節にその概要を示す。
【００４５】Ｃ．１．宿主および制御配列 原核生物および真核生物の両方の系を用いて，FGF をコ
ードする配列を発現し得る；原核生物の宿主は，もちろ
ん，クローニングに最も便利である。最も頻繁に使われ
る原核生物は，大腸菌のいろいろな株で代表される；し
かしながら，他の微生物の株も使用し得る。宿主に適合
した種より導かれる複製部位，選択可能なマーカーおよ
び制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる；例
えば，大腸菌は，典型的には，pBR322の誘導体，すなわ
ち Bolivar, らGene (1977) 2 :95，によって大腸菌種
より誘導されたプラスミドの誘導体，を用いて形質転換
される。pBR322は，アンピシリン耐性およびテトラサイ
クリン耐性の遺伝子を含んでいる。従って，所望のベク
ターを構築する際に保持され得るかあるいは分解され得
るような，複数の選択可能なマーカーを与える。一般に
用いた原核生物制御配列（ここでは，リボソーム結合部
位配列に加えて，任意にオペレーターを伴った，転写開
始のためのプロモーターを含むと定義される）は，β−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（la
c)プロモーター系（Chang,et al, Nature (1977) 198
: 1056）およびトリプトファン（trp)プロモーター系
（Goeddel, et al, Nucleic Acids Res (1980) 8 : 405
7)およびラムダ由来のPLプロモーターおよびＮ遺伝子リ
ボソーム結合部位（Shimatake, et al, Nature (1981)
292 : 128)のような一般に用いられるプロモーターを含
む。
【００４６】細菌に加え，酵母のような真核微生物も宿
主として，用いられ得る。数多くの他の株または種を一
般に利用し得るにもかかわらず，サッカロマイセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の実験用菌株，
ベーカー酵母（Baker's yeast)が最もよく用いられる。
例えば，Broach, J. R., Meth Enz(1983) 101 : 307
の，２μの複製起点，または他の酵母の適合した複製起
点（例えば，Stinchcomb, et al, Nature (1979) 282
: 39, Tschumper, G., et al, Gene (1980) 10 :157
および Clarke, L, et al, Meth Enz (1983) 101 : 30
0 を参照）を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベク
ターに対する制御配列は，解糖酵素の合成に対するプロ
モーター（Hess, et al, J Adv Enzyme Reg (1968) 7
: 149 ; Holland, et al, Biochemistry (1978) 17 :
4900)を含む。当該分野に既知の他のプロモーターに
は，３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター
（Hitzeman,et al,J Biol Chem (1980) 255 :2073）が
含まれる。転写が増殖条件および／または遺伝的背景に
より制御されるという付加的利点を有する他のプロモー
ターとしては，アルコール脱水素酵素２，イソチトクロ
ームＣ，酸性リン酸水解酵素，窒素代謝に関連する分解
酵素，アルファー因子系，マルトースおよびガラクトー
ス利用に応答する酵素に対するプロモーター領域があ
る。また，ターミネーター配列は，コード配列の3'末端
に存在することが望ましいと考えられている。このよう
なターミネーターは，酵母由来の遺伝子においてコード
配列に続く3'未翻訳領域に見い出される。
【００４７】もちろん，多細胞生物由来の真核生物の宿
主細胞培養中で，ポリペプチドをコードする遺伝子を発
現させることも可能である。例えば，Axelら，4,399,21
6 を参照されたい。これらの系は，イントロンをスプラ
イシングし得るという付加的な利点を有し，従って，直
接用いることによってゲノム断片を発現させ得る。有用
な宿主細胞系列には，VEROおよびHeLa細胞，そしてチャ
イニーズハムスターの卵巣（CHO)細胞が含まれる。この
ような細胞に対する発現ベクターには，普通，例えば，
サルウイルス40（SV40）由来の初期および後期プロモー
ター（Fiers, et al, Nature (1978) 273 : 113), ある
いはポリオーマ，アデノウイルス２，ウシの乳頭腫ウイ
ルスまたはトリの肉腫ウイルス由来のプロモーターのよ
うなウイルスプロモーターなどの，哺乳類の細胞に適合
するプロモーターおよび制御配列が含まれる。制御可能
なプロモーター，hMT 〓（Karin, M., et al, Nature
(1982) 299 : 797-802)もまた使用し得る。哺乳類の細
胞宿主系における形質転換の一般的な様相は，Axel（前
出）により記述されている。現在では，“エンハンサー
（enhancer)"領域も発現を最適化する際に重要であるこ
とは明らかである；これらは，一般に，非コード DNA領
域におけるプロモーター領域の上流側または下流側に見
られる配列である。必要に応じて，ウイルスを起源とし
て，複製起点を得ることができる。しかしながら，染色
体への組込みが，真核生物における DNA複製における共
通の機構である。
【００４８】Ｃ．２．形質転換 使用する宿主細胞に依存して，そのような細胞に適した
標準的技術を用いることにより，形質転換が行われる。
Cohen,S.N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 2
110)によって記述されたような塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理，または Maniatis ら，分子クローニン
グ：実験の手引き（1982) コールドスプリングハーバー
プレス，P. 254，およびHanahan,D., J Mol Biol (198
3) 166 :557-580 によって記述されたような RbCl2法
は，原核生物または実質的な細胞壁障害を有する他の細
胞に対して用いられ得る。このような細胞壁を持たない
哺乳類細胞に対しては，Grahamおよび vander Eb, Viro
logy(1978) 52 : 546）のリン酸カルシウム沈澱法，が
用いられ得るが，任意には Wigler, M. ら Cell (1979)
16 : 777-785により修正された方法が用いられ得る。
酵母への形質転換は，Beggs, J.D., Nature (1978) 275
: 104-109の方法または Hinnen,A.ら（Proc Natl Acad
Sci(USA) (1978) 75 : 1929)の方法に従って実施し得
る。
【００４９】Ｃ．３．ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクター
の構築には，当該分野に既知の標準的な連結技術および
制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド， DNA
配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形に，切断
し，整え，そして再連結する。
【００５０】ベクターを形成する DNA配列は，数多くの
供給源から利用し得る。もとになるベクターおよび制御
系は，一般に，構築の際に配列の大部分として用いられ
る，利用可能な“宿主”ベクター上に見い出される。典
型的な配列は，上記の節Ｃ．１．に示されている。適切
なコード配列に対して，最初の構築は，通常，cDNAライ
ブラリーまたはゲノム DNAライブラリーから適当な配列
を回収することである。しかしながら，この配列が開示
されれば，それぞれのヌクレオチド誘導体から出発し
て，インビトロで全遺伝子配列を合成し得る。例えば，
500〜1000bpというかなりの長さの遺伝子に対する全遺
伝子配列は，それぞれに重複した相補オリゴヌクレオチ
ドを合成し，そして一本鎖の重複していない部分をデオ
キシリボヌクレオチド３リン酸の存在下で DNAポリメラ
ーゼを用いて充填することにより，調製し得る。この方
法は，配列が既知であるいくつかの遺伝子の構築におい
て成功裏に用いられた。例えば，Edge, M.D., Nature
(1981) 292 : 756 ; Nambair,K. P.ら，Science (1984)
223 : 1299 ; Jay, Ernest, J Biol Chem (1984) 259
: 6311を参照されたい。
【００５１】合成オリゴヌクレオチドは，EdgeらNature
（前出）およびDuckworth ら Nucleic Acids Res (198
1) 9 : 1691によって記述されたようなホスホトリエス
テル法，あるいは Beaucage,S.L., および Caruthers,
M.H., Tet Letts (1981) 22 :1859 および Matteucci,
M.D., および Caruthers, M.H., J Am Chem Soc (198
1) 103 : 3185 によって記述されたようなホスホアミダ
イト法のいずれかによって調製される。また，この合成
オリゴヌクレオチドは市販の自動オリゴヌクレオチド合
成装置を用いて調製し得る。アニーニング前のリン酸化
（kinasing）あるいはラベルのためのリン酸化（kinasi
ng）は，50mM Tris （pH 7.6），10mM MgCl2，５mMジチ
オスレイトール，１〜２mM ATP，1.7pmoleγ32p-ATP
(2.9mCi/mmole)， 0.1mMスペルミジン， 0.1mM EDTA の
存在下で，過剰量，例えば約10単位のポリヌクレオチド
キナーゼを用いることによって行われる。
【００５２】所望のベクターの成分が利用可能な場合に
は，それらを標準的な制限方法および連結方法を用いて
切断し，そして連結し得る。
【００５３】部位特異的な DNAの切断は，当該分野に既
知の条件下で，適当な１つの制限酵素（または複数の制
限酵素）を用いて処理することにより行われるが，特別
なものでは，これらの市販の制限酵素の生産者によって
指定された条件下において行われる。例えば，ニューイ
ングランドバイオラボの製品カタログを参照されたい。
一般に，約１μg のプラスミドまたは DNA配列を，約20
μｌの緩衝液中で，１単位の酵素によって切断する；実
施例においては，典型的には，過剰量の制限酵素を用い
て DNA基質を確実に完全分解する。変更することも可能
であるが，約37℃にて約１〜２時間にわたってインキュ
ベーションし得る。各インキュベーションの後，フェノ
ール／クロロホルムで抽出することにより，タンパクを
除去する。さらに，引き続いてエーテル抽出を行い得
る。エタノールを用いて沈澱させることにより，水層か
ら核酸を回収する。必要に応じて，標準的な技術を用い
てポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳
動を行うことにより，切断された断片を大きさによって
分離し得る。大きさによる分離に関する一般的な記述
は，Methods in Enzymology (1980) 65 :499-560 に見
い出される。
【００５４】制限酵素で切断した断片は，４つのデオキ
シヌクレオチド三リン酸（dNTP）の存在下で，大腸菌 D
NAポリメラーゼＩの大きな断片（クレノー(Klenow)）で
処理することによって平端な末端（blunt end)にするこ
とが可能である。インキュベーションは，50mMトリス
（pH 7.6），50mM NaCl,６mM MgCl2, ６mM DTTおよび
0.1〜１mM dNTP 中，20〜25℃にて15〜25分間にわたっ
て行う。クレノー断片は，5'一本鎖の突出部分を充填す
るが，たとえ４つのdNTPが存在しても，突出した3'一本
鎖を元に戻す（chuw back)。必要に応じて，突出部分の
性質によって受ける制限内で，唯一のdNTP，または選択
されたdNTPを与えることにより，選択的に修復し得る。
クレノー断片で処理した後，混合物をフェノール／クロ
ロホルムで抽出し，エタノール沈澱させる。適当な条件
下で，S1ヌクレアーゼまたはBAL-31で処理することによ
り，どのような一本鎖部分をも加水分解し得る。
【００５５】連結は，15〜50μｌの容量で，以下の標準
的な条件および温度の下で行う：例えば，20mMトリス−
Cl（pH 7.5），10mMMgCl2, 10mM DTT, 33μg／ml BSA,
10mM〜50mM NaCl, そして（“粘着末端”の連結に対し
ては）０℃にて40μM ATP, 0.01〜0.02（ワイス）単位
の T4 DNA リガーゼ，あるいは（“平端な末端”の連結
に対しては）14℃にて１mM ATP, 0.3〜 0.6（ワイス）
単位の T4 DNA リガーゼ。分子間の“粘着末端”の連結
は，通常，33〜 100μg ／mlの全 DNA濃度（５〜100 nM
の全末端濃度）で行う。分子間の“平端な末端”の連結
は，１μM の全末端濃度で行う。
【００５６】“ベクター断片”を用いたベクターの構築
においては，5'リン酸を除去し，ベクターの自己連結を
防ぐため，一般にベクター断片を細菌アルカリホスファ
ターゼ（BAP)またはウシ腸アルカリホスファターゼ（CI
P)で処理する。分解は，約10mMトリス−HCl,１mM EDTA
中，pH８にてベクター１μg あたり，約１単位の BAPま
たは CIPを60℃にて，約１時間にわたって用いることに
よって行う。核酸断片を回収するために，調製物をフェ
ノール／クロロホルムで抽出し，エタノールで沈澱させ
る。あるいは，別の制限酵素で分解し，不要な断片を分
離することによって二重に分解されているベクターにお
いても再連結を防止し得る。
【００５７】配列の修正を必要とする，cDNAまたはゲノ
ム DNA由来のベクター上の部分に対しては，部位特異的
なプライマーによって導かれる突然変異誘発を用い得る
（Zoller, M.J., およびSmith, M. Nucleic Acids Res
(1982) 10 : 6487-6500および Adelman, J.P., et al,
DNA (1983) 2 : 183-193)。これは，突然変異させるべ
き一本鎖ファージ DNAに対して，限られた不一致以外
は，相補的であって，所望の変異を示す合成オリゴヌク
レオチドのプライマーを用いて行う。簡単に言えば，こ
の合成ヌクレオチドをプライマーとして用い，ファージ
に相補的な DNA鎖の合成を導き，そして得られた部分的
に，あるいは全体が二本鎖の DNAを，ファージを補助す
る宿主細菌に形質転換させる。形質転換した細菌の培養
液を上層寒天に注ぎ，ファージを含む単一細胞からプラ
ークを形成させる。
【００５８】理論的には，新しいプラークの50％は，一
本鎖として変異型を有するファージを含み；50％はもと
の配列を有する。得られたプラークをリン酸化した合成
プライマーとハイブリダイゼーションさせた後，正確に
一致するものは結合し得るが，もとの DNA鎖と一致しな
いものは結合が阻止されるのに十分な，洗浄温度で洗浄
する。次いで，プローブとハイブリダイズするプラーク
を選択し，培養し，そして DNAを回収する。
【００５９】Ｃ．４．構築の確認 以下に示した構築において，プラスミド構築に対する正
しい連結は，まず M.Casadaban 博士から提供された大
腸菌株MC1061（Casadaban, M., et al, J MolBiol (198
0) 138 : 179-207)または他の適当な宿主をライゲーシ
ョン混合液で形質転換することによって確認する。好結
果の形質転換体は，アンピシリン耐性，テトラサイクリ
ン耐性または他の抗生物質耐性により選択するか，ある
いは当該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存した
他のマーカーを用いて選択する。この形質転換体由来の
プラスミドは，Clewell, D.B. ら Proc Natl Acad Sci
(USA) (1969) 62 : 1159 の方法に従って，また任意に
クロルアンフェニコール増幅（Clewell,D.B., J Bacter
iol (1972) 110 : 667）を行った後，調製される。いく
つかの小規模の DNA調製法が一般に用いられる（例え
ば，Holmes, D.S., etal, Anal Biochem (1981) 114 :
193-197 および Birnboim, H.C., et al, Nucleic Aci
ds Res (1979)7 : 1513-1523)。単離された DNAは，制
限処理によって分析され，および／または Sanger, F.
ら Proc Natl Acad Sci (USA) (1977)74 : 5463 のジデ
オキシヌクレオチド法であって，さらに Messingら Nuc
leic Acids Res (1981) 9 : 309 によって記述されてい
るようなジデオキシヌクレオチド法，あるいは Maxamら
（Methods in Enzymology (1980)65 : 499）の方法によ
って塩基配列を決定する。
【００６０】Ｃ．５．例示される宿主 ここで，クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿
主株は，以下のとおりである：クローニングおよび塩基
配列の決定に対して，そしてほとんどの細菌のプロモー
ターの制御下における構築物の発現に対して，MC1061,
DH1, RR1, C600hfl, K803, HB101, JA221 および JM101
のような大腸菌株を用いた。
【００６１】Ｄ．例示的な方法 以下の実施例は，本発明を例証することを意図したもの
であって，本発明を限定することを意図したものではな
い。図示した FGF配列をコードする DNAは，まずウシの
ゲノムライブラリーをスクリーニングし，そして中枢プ
ローブを得，次いで，付加的な DNAの修復を行うことに
よって得られる。しかしながら，中枢プローブの配列
が，現在，既知であり，従って，インビトロで科学的に
構築し得るので，この方法を繰り返す必要はない。さら
に，４つの図示した配列を保持するバクテリオファージ
は，アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託さ
れている。
【００６２】
【実施例】実施例１ 250/AluIプローブの構築；酸性bFGFゲノムDNA の調製 図示した酸性FGF タンパクに対する完全なコード配列を
得るために，ウシの250bp AluI ゲノム断片をプローブ
として用いてヒトおよびウシの両方のライブラリーを調
べた。250/AluIと呼ばれるこのプローブは，以下のよう
にして得た。ウシの酸性FGF の残基１〜34に対するＮ末
端アミノ酸配列は既知である。コドンの選択性（Anders
on, S., et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 80
: 6838-6842 ; Jaye, M. ら，Nucleic Acids Res (198
3) 11 : 2325-2335）に基づき，自動合成機およびホス
ホアミダイトカップリング試薬を用いて，３つの長いプ
ローブを調製した。このヌクレオチドプローブの配列を
第９図に示す。プローブ 891は，アミノ酸１−16に対応
する48-merである；プローブ 889および 890は，アミノ
酸18−34に対応する51-merであり，24位のアルギニンに
対するコドンを除いて等しい２つのオリゴヌクレオチド
の50：50混合物として用いた。これらのプローブは，部
分的なMboI分解物として調製し，BamHI で処理したファ
ージベクター，シャロン28（Woychik, R.F., et al, Nu
cleic Acids Res (1982)10 : 7197-7210）にクローニン
グした。これらのプローブは，Fritz Rottman 博士（ケ
ースウェスターンリザーブ）から提供されたウシのゲノ
ムライブラリーをスクリーニングするのに用いた。
【００６３】ハイブリダイゼーションは，Ullrich, A.
ら EMBO J (1984) 3 : 361-364 によって述べられた方
法の変法を用い，フィルター上に複製された変性 DNAに
関して行った；そして洗浄条件は，Wood, W.I.ら Natu
re (1984) 312 : 330-337 の洗浄条件に従った。プレハ
イブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液
には，20％ホルムアミド，５×デンハート溶液（ 100×
デンハート溶液は，２％ウシ血清アルブミン，２％ポリ
ビニルピロリドン，２％フィコルに等しい）；６×SSC
(20×SSC は，３M NaCl, 0.3Mクエン酸ナトリウムに等
しい）；50mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）； 100μg ／
mlニシン精子 DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液には，さらに10％デキストラン硫酸および約
105 〜106cpm／mlのリン酸化されたプローブ 891または
889／890 が含まれていた。プレハイブリダイゼーショ
ンおよびハイブリダイゼーションは，42℃にてそれぞれ
１時間および16時間にわたって行った。次いで，フィル
ターを１×SSC, 0.1％SDS で22℃にて15分間，２度洗浄
し，その後１×SSC, 0.1％SDS 中で55℃にて10分間，１
度洗浄した。洗浄後，これらのフィルターは，増感紙を
用いて１日，感光した。
【００６４】スクリーニングされたウシのゲノムライブ
ラリーには，両方のプローブにハイブリダイズした106
個の組換え体の中，50個のファージが含まれていた。こ
れらの50個のファージは，さらにプローブ 853−856 の
混合物でスクリーニングされた。このスクリーニングに
おいて，プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼ
ーション緩衝液には，６×SSC, １×デンハート溶液，
0.1％ SDS，0.05％ピロリン酸ナトリウムおよび 100μ
g/mlサケ精子 DNAが含まれていた；ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液には，さらに105〜106cpm／mlのプローブが
含まれていた。プローブ 853−856 は，16の配列からな
る４つのプールであって，64個（全体）の17-merの各々
はアミノ酸７−12に対応しており，ホスホトリエステル
法を用いて合成される。しかしながら，50個のクローン
のうち46個は，より短いプローブにさらにハイブリダイ
ズさせた。このハイブリダイゼーションは，65℃から35
℃の間で16時間にわたって行った。そして50℃にてテト
ラメチルアンモニウムクロリドを用いる，塩基組成に依
存しない洗浄法を採用した（Wood, W.I., Proc Natl Ac
ad Sci (USA) (1985) 82 : 1585-1588）。
【００６５】確実にハイブリダイズする２つのファージ
（λBA2 およびλBA3 ）を選択し，ファージ挿入部分の
制限地図を第１０図に示されているように作製し，そし
て第１図に示されるように部分的に配列決定した。この
推定されたアミノ酸配列を，天然のウシの酸性 FGFタン
パクのＮ末端34残基に対して公表されているアミノ酸配
列と比較したところ，これらのクローンは正確であっ
た。コード配列の性質から，アミノ酸残基１−41（第１
図に示されている）は，これらのクローンにコードされ
ていることは明らかである；直後のヌクレオチドは，イ
ントロンを表しているようである。このイントロンの長
さは，現在のところ，明らかではないが，完全な酸性bF
GFコード配列は，これらのλBA2 およびλBA3 DNA上に
存在し得る。しかしながら，このタンパクに対する完全
なコード配列を得るために必要な他の DNAは，“ウォー
キング（walking)”技術にλBA2 またはλBA3 を用い
て，同一の遺伝子ライブラリーから得ることが可能であ
る。Ｎ末端残基より上流側のコドンは，指摘された15ア
ミノ酸のプロ配列または，先に考察したような単離され
た“基本”型に比較して，Ｎ末端において15個のアミノ
酸（Ｎ末端のメチオニンが開裂する場合は，14個のアミ
ノ酸）だけ伸長した天然のタンパクの“長”型をコード
すると考えられている。
【００６６】250/AluIプローブを調製するために，λBA
２をAluIで部分的に分解し，M13 へのショットガンクロ
ーニングを行った（Messing, J., et al, Gene (1982)
19 :269-276）。M13 プラークをプローブ 853−856 お
よび 889／890 と２通りにハイブリダイズさせた。両方
のプローブにハイブリダイズするファージの配列を決定
した。得られた 250bp AluI プローブは，対応する推定
アミノ酸配列とともに第１１図に示す；第１０図のλBA
2 およびλBA3 の挿入部分の位置は，プローブ889／890
および 891の部位と一致する。 250／AluIプローブは，
酸性bFGFタンパクのＮ末端部分と一致する。
【００６７】実施例２ 酸性bFGF cDNA の回収 酸性bFGFをコードするcDNA配列を回収するために 250／
AluIプローブを用いる。Huynh, V.T.,ら DNAクローニン
グ技術：実用の手引き（IRL プレス，オックスフォー
ド，1984）のλgt10ベクターを用いてウシの脳下垂体，
脳または視床下部のmRNAからcDNAライブラリーが得られ
る。得られハイブリダイジングクローンにより，酸性bF
GFをコードする全配列を回収する。他の哺乳類由来の類
似mRNAを用いて構築された同様のcDNAライブラリーを，
250／AluIプローブを用いて調べて，例えば，ラット，
ヒツジ，ウシ，ネコ，イヌ，ウマまたはブタの塩基性 F
GFが得られる。
【００６８】実施例３ 酸性hFGFゲノム DNAの調製 Charon 4A （Lawn, R.M., et al, Cell (1978) 15 : 1
157-1174）のヒト胎児の肝臓のゲノムライブラリーをヒ
トの配列の起源として用いた。ニックトランスレーショ
ンした 250／AluIプローブを用いてこのライブラリーを
調べた。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼ
ーションの条件は，40％ホルムアミドを用いること以外
は実施例１のプローブ889／ 890および 891に対する条
件と同一であった。ハイブリダイゼーションは，42℃に
て16時間にわたって行った。次いで，フィルターを室温
にて１×SSC, 0.1％SDS で洗浄し，そしてさらに同じ緩
衝液で50℃にて15分間，２度洗浄した。確実にハイブリ
ダイズしたクローンを培養したところ，λHAG-9.1 と呼
ばれるものは，所望の酸性hFGF配列を含んでいた。この
クローンの部分的な制限地図を第１２図に示す；ヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列に関する情報は，第３図に示
す。アミノ酸１−41をコードするヌクレオチド配列を同
定し得る；この配列には，ゲノム酸性bFGFにおけるよう
に，イントロンが続いていた。酸性hFGFおよび酸性bFGF
のアミノ酸配列は，５位，21位および35位において異な
っている。
【００６９】ヒトの酸性 FGFをコードする DNAは，これ
に対応する単離されたウシのタンパクのＮ末端の上流
に，さらに15個のコドンを含んでいる。これらのコドン
は，ウシのタンパクのＮ末端の延長部分と高い相同性を
有するアミノ酸配列をコードする。この翻訳配列は，第
３図の括弧内に示されている。ウシの DNAと比較する
と，−３位，−６位，−９位および−12位のコドンには
ヌクレオチド置換が存在するが，翻訳されたタンパクは
存在しない。−10位のコドンにおけるヌクレオチド置換
によって，ウシのタンパクの Thr残基はヒトのタンパク
では Ile残基となる。ウシの酸性 FGFと同様に，このＮ
末端延長部分は，プロ配列または単離された“基本”型
タンパクの“長”型を表し得るが，このいずれかはメチ
オニンの開裂に依存して，14もしくは15のアミノ酸のＮ
末端延長部分を含んでいる。
【００７０】ヒトの酸性 FGFをコードするゲノム DNAの
エキソンであって，中間エキソン，およびＣ末端をコー
ドするエキソンに対応するヌクレオチド配列を含むλフ
ァージクローンも得た。上述のλHAG-9.1 とともに，こ
れらのファージは完全なタンパクコード配列を与える。
【００７１】Wyman, A.R. ら Proc Acad Natl Sci (US
A) (1985) 82 :2880-2884 によって述べられているよう
に調製したヒトのゲノムライブラリーから中間エキソン
を有するファージを得た。これは，ヒトのゲノムを Sau
3AI で部分分解し，得られた断片をλシャロン30ファー
ジのポリリンカー領域の BamHI部位へ挿入することによ
って調製されるライブラリーである。この挿入部分は，
容易に除去され得るので，ライブラリー中の２つの Eco
RI制限部位の間に位置している。
【００７２】このゲノムライブラリーは，２つのオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして調べられた。これらのオ
リゴヌクレオチドは，次の実施例４に記述され，第１３
図に示されているようにヒトの合成酸性 FGF遺伝子を構
築するために用いられていた。この図で“３”および
“４”と示されたオリゴヌクレオチドが，プローブとし
て用いられたものである。λHG-3と呼ばれる，回収され
たファージのコード領域を第４図に示すこのコード配列
は，Jaye配列のアミノ酸42−48をコードするが，塩基性
FGFタンパクをコードする遺伝子のエキソン／イントロ
ン境界に対応している。
【００７３】同様に，第３のエキソンは，上述のように
調製されたシャロン−4Aにおける Lawn,ら（前出）のマ
ニアチス（Maniatis) のヒトゲノムライブラリーから得
られた。そして，第１３図に示されている合成遺伝子の
“６”および“７”をラベルしたオリゴヌクレオチドを
プローブとして，この第３のエキソンを調べた。λHAG-
3 と呼ばれる，回収されたλファージクローンは，部分
的に配列決定されており，その結果を第５図に示す。こ
の配列情報から，λHAG-3 挿入部分中にＣ末端エキソン
配列の存在することが確かめられる。
【００７４】前述の３つの挿入部分は，再結合させるこ
とにより完全なヒトの酸性 FGFゲノム配列を再構築し得
るが，これはEcoRI によって各ファージを切断してこの
挿入断片を取り出し，そして得られた断片を連結して遺
伝子を再構築することによってなし得る。このゲノム配
列を用いれば，以下の実施例７においてcDNA配列につい
て述べた方法に類似した方法により，発現ベクターを構
築し得る。特に，この再構築された遺伝子は，合成型−
酸性 hFGF NcoI（平端（blunt)）／HindIII（平端（blu
nt)）について述べた方法と同様の方法により，EcoRI
（平端（blunt)）断片として挿入し得る。
【００７５】実施例４ 酸性hFGFコード配列の調製 ヒトの脳下垂体，胸部癌腫，脳，脳幹，SK-HEP-1または
視床下部のmRNAから，実施例２においてウシのmRNAに対
して述べたような Huynhの方法によって調製されたcDNA
ライブラリーを，実施例３において述べた条件下で 250
／AluIをプローブとして用いて調べ，酸性hFGFをコード
するcDNAを得る。第１のエキソンを含むスプライシング
されていないcDNAは，胸部癌腫のライブラリーから得ら
れた。
【００７６】別の方法として，Jaye, M.ら Science (19
86),印刷中，によって得られたcDNA配列の情報（第６図
参照）を酸性hFGFをコードする遺伝子の合成のガイドと
して用いた。Jayeらによって報告されたcDNAクローン
は，ヒトの脳幹由来のメッセンジャー RNAを用いて得ら
れ，酸性hFGFをコードするが，この酸性hFGFの推定され
るアミノ酸配列は第４図に示されている。
【００７７】実施例３において述べたゲノムλ HAG-9.1
クローンを用いて遺伝子の5'部を得た。この部分を調製
するために，1.9kb BamHI 断片をλHAG-9.1 から単離
し，そして pUC13中へサブクローニングしてpCBI-101を
得た。次いで，この中間体プラスミドをNcoI／BamHI で
切断し，そして成熟“基本”型の酸性hFGFの最初の25個
のアミノ酸とともに，プロ配列の15個のアミノ酸に対す
るコドンを含む 118bp断片を５％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて単離した。主配列の開始点から−15のアミノ
酸において開始コドンを形成していると考えられるATG
を含むNcoI部位の位置は，第１３図に示されている。こ
の図は合成遺伝子を図示したものである。コード配列の
残りの部分は，第１３図における１〜20番の合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて合成された。各オリゴヌクレオチ
ドの合成は，簡便な自動化技法を用いて行う。オリゴヌ
クレオチドは，Jayeら（上記）によって報告されたもの
と２つの例外を除いて同一のヌクレオチド配列を与える
ように設計した：オリゴヌクレオチド４および14は，星
印によって示されるように，コドン66のアラニンをコー
ドする GCCをGCT に変更することによって，コドン67ま
で拡がっているＮｃｏＩ部位をこわすように構築した；
さらに，オリゴヌクレオチド１９および20は，TGA終結
コドンに続くHindIIIおよび EcoRI切断部位を付加する
ように修飾した。前記の変化は，いずれもコードされた
アミノ酸配列に影響を与えない。
【００７８】標準反応条件を用いて５μg の各オリゴヌ
クレオチド（＃１および＃20を除く）をリン酸化し，10
個の異なる相補的オリゴヌクレオチド対（１＋11，２＋
11，など）をアニーリングし，次いで10個のオリゴヌク
レオチド対を３つの断片に連結することによって，合成
オリゴヌクレオチドを連結し，第１３図に示される配列
を得た。これらの断片は，標準条件下でT4リガーゼを用
いて連続的に形成される。断片Ａを得るために，対１／
11を対２／12と連結し，次いで対３／13と連結し，さら
に対４／14と連結させる。断片Ｂは，対５／15を対６／
16と連結し，次いで対７／17に連結させることによって
形成する。断片Ｃは，対８／18を対９／19と連結し，次
いでこの生成物を対10／20と連結させることによって得
られる。３つの連結した副断片（Ａ＝ 144bp, Ｂ＝ 108
bpおよびＣ＝ 106bp）は，ゲル電気泳動を用いて精製
し，次いで標準条件下でT4リガーゼを用いてＢおよびＣ
を混合することによって連続的に連結し，その後Ａを添
加する。最終反応液は，フェノールで抽出し，エタノー
ルで沈澱させる。エタノール沈澱物は，５％アクリルア
ミドゲルで電気泳動し， 358bp断片Ａ＋Ｂ＋Ｃを溶出さ
せる。この断片は，第１３図に示されるように，BamHI
／ EcoRI部位に及んでおり，そしてその配列は，この断
片をM13mp19 中へサブクローニングすることによって，
ジデオキシ配列決定法を用いて，確かめられる。
【００７９】コード配列を完成させるために，合成 358
bp BamHI／EcoRI 断片をファージまたはポリアクリルア
ミドゲルから単離し，その末端を必要に応じてリン酸化
し，そしてpCBI-101由来の 118bp NcoI／BamHI断片に連
結する。酸性hFGFをコードする，得られた部分合成ヌク
レオチド配列を第１３図に示し，そして合成型−酸性hF
GFと名付ける。
【００８０】もちろん，酸性 FGFの“基本”型および
“短”型が，ATG 開始コドンから始まり，そして最適な
制限部位を含む，付加的な構築物をも構築し得る。
【００８１】実施例５ 塩基性 bFGF のゲノムおよびcDNAクローンの回収 次いで 250/AluI プローブを用いて，対応する塩基性bF
GF配列を得るために適当なプローブを設計した。Esch,
F., ら（前出）が見出した，酸性bFGFのアミノ酸 4-29
が塩基性bFGF配列のアミノ酸 13-38と整列しているとい
う利点が得られた。プローブは，塩基性bFGFの残基18-3
6 および酸性bFGFの残基9-27に基づいて設計したが，ど
ちらの領域も19アミノ酸残基のうち14個が相同的であ
る。
【００８２】プローブ1097および1098は，この領域をコ
ードするように設計されている40-merであり，自動合成
装置で，ホスホアミダイト法を用いて調製した。これら
のプローブは第１４図に示されている；それらは塩基性
配列のアミノ酸23-31 の領域で重複している。これらの
プローブを設計する際，250/AluI配列を用いたが，その
アミノ酸配列は同一であった。またコードされた配列に
おいては，必要な変化を与えるための最小限のヌクレオ
チドの相違が含まれていた。
【００８３】実施例２において述べたような Huynh, V.
T.の方法により得られたウシの脳下垂体cDNAライブラリ
ーをプローブ1098でスクリーニングした。ハイブリダイ
ゼーションに対する適切な条件は，サザンブロットにゲ
ノムDNA （実施例１）を用いて次のように決定した。
【００８４】もちろん，プローブ1097および1098は，そ
れほど厳しくない条件の下で酸性FGF をコードするDNA
とクロスハイブリダイゼーションし得ることが期待され
た。サザンブロット分析を行ったところ，55℃の洗浄温
度でプローブ1097および1098にハイブリダイゼーション
する酸性bFGFをコードすることが知られているゲノムの
配列は，65℃ではハイブリダイゼーションできなかった
（プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液および条件は，実施例１におけるプローブ 889
/890および891 に対するものと同様であった）。従っ
て，65℃という洗浄温度を選んだ。この温度では， Eco
RI分解物における10kb断片およびPstI分解物における
3.4kb断片がプローブ1097および1098にハイブリダイゼ
ーションした。
【００８５】cDNAライブラリーを65℃の洗浄温度を用い
て上述のようにプローブで調べたところ， EcoRIリンカ
ーを有する2.1kb cDNAを表す，λBB2 と名付けられた単
一クローンが回収された。このファージの制限地図を第
１５図に示す。λBB2 における挿入部分の副断片を，配
列決定を行うために M13に移した。1.4kb EcoRI 分解副
断片は，ウシの塩基性FGF の（完全な“一次”配列の）
アミノ酸 1-146をコードすることがわかった。Ｎ末端コ
ドンより上流側の配列は，９アミノ酸のプロ配列あるい
は活性を保持してる天然のタンパクのＮ末端伸長“長”
型のいずれかをコードすると考えられている。Ｎ末端の
伸長部分は，単に８つの残基しか含み得ないが，これは
もちろんメチオニンが翻訳後のプロセッシング中に切断
されるかどうかに依存している。塩基性bFGFをコードす
るこの副断片の部分は，第７図に示されている；位置１
を始まりとするアミノ酸の番号付けは，単離された“一
次”タンパクのＮ末端に対応している。上流側の９コド
ンは，括弧内に翻訳されている。この伸長部分が天然の
活性タンパクの必須部分を表している可能性は，肝細胞
から調製されたヒトの塩基性FGF の，より分子量が大き
な型によって示唆されている（Klagsbrun, et al, Proc
Natl Acad Sci (前出））。
【００８６】次いで 1.4kbの副断片をニックトランスレ
ーションし，そして塩基性bFGFゲノム配列に対する実施
例１の方法と同様に，構築されたウシのゲノムライブラ
リーのスクリーニングに用いた。
【００８７】1.4kb の塩基性bFGFをコードするcDNA断片
は，ラット，ブタ，あるいはウシ，ネコ，イヌ，ウマあ
るいはネズミを起源とするような，別の哺乳類のcDNAラ
イブラリーをプローブで調べ，上記の種の配列であっ
て，塩基性bFGFをコードする配列を得るためにも用いら
れる。
【００８８】実施例６ ヒトの塩基性FGF のゲノムクローンおよびcDNAクローン
の調製 ヒトの腎臓のmRNAから調製されたλgt10cDNAライブラリ
ーを，ウシの1.4kb 塩基性副断片を用いて調べた。プレ
ハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝
液には，40％ホルムアミド，５mMリン酸ナトリウム（pH
6.5），５×デンハート溶液，５×SSC ，および50μg/
mlニシン精子DNA が含まれていた；ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液には，さらに，10％硫酸デキストランおよび
104 〜105 cpm/mlのプローブが含まれていた。３つのク
ローンを単離し，そして特徴を調べるために１つを選択
した。このクローンは，λKB7 と呼ばれ，約1.4kb Eco
RI断片を含んでいた。この断片を部分的に配列決定した
ところ，推定のアミノ酸配列とともに，第８図に示した
データが得られた。配列決定されたコード領域によっ
て，図中に示したアミノ酸 1-50 が推定された；下流側
に直ちに続く配列は，スプライシングされていないmRNA
のcDNAコピーを表しているようであり，このことはイン
トロンが，塩基性FGF 遺伝子において，ウシおよびヒト
の酸性FGF 遺伝子におけるアミノ酸41の後のイントロン
に対して相同的な位置に存在することを示している。λ
KB7 クローンも，示した長型の９アミノ酸のＮ末端の伸
長部分をコードする上流側のDNA を与える。
【００８９】付加的なゲノムライブラリーおよびcDNAラ
イブラリーを，上述のヒトの腎臓のλgt10ライブラリー
に対して用いた条件と正確に同じハイブリダイゼーショ
ン条件下で，1.4kb 塩基性bFGFをコードする同じ断片を
用いてスクリーニングした。さらに４つのクローンを得
たが，それらの間では，第８図に示すような単離された
塩基性bFGFに対応する完全な 146アミノ酸のタンパクを
コードする。上述のλKB7 に含まれている９つの上流側
のコドンは，ウシの塩基性FGF クローンにおいて翻訳さ
れた上流側のコドンと完全に相同的な配列へ翻訳する
が，コドン−８には発現しないヌクレオチド置換があ
る。この翻訳されたＮ末端の伸長部分を第４図の括弧内
に示す；そしてこの伸長部分は，上述のように，Ｎ末端
の伸長した活性タンパクのプロ配列または付加的なアミ
ノ酸を表し得る。
【００９０】より詳細には，Lawn, R.M.ら（前出）によ
って記述されたように調製した，λシャロン 4A におけ
るヒトのゲノムライブラリーに由来する２つの確実にハ
イブリダイゼーションするクローンをλMG4 およびλMG
10と名付けた。λMG4 は，アミノ酸（−９）−51をコー
ドし；λMG10は，アミノ酸86-146をコードする。このこ
とは，３つのエキソンのうち第３のエキソンが遺伝子の
成熟型タンパクをコードする領域内に含まれることを示
している。（エキソン／イントロン境界の位置は，ウシ
の配列との相同性によって決定した。）E. Fritschから
得た，λシャロン 28 における少し異なったゲノムライ
ブラリーは，第２の成熟型タンパクのエキソンを含み，
アミノ酸 51-85をコードするλHT1 を与えた。最終的に
は，上述のようにλgt10で調製したヒト胎児の肝臓のラ
イブラリーから得られたcDNAクローン，すなわちλHFL1
は，アミノ酸 56-146 をコードする。そしてこのことか
ら関連のあるイントロン／エキソン接合点の位置が確認
される。
【００９１】塩基性bFGFおよびhFGFは２つのアミノ酸が
相違しているだけである。位置 112においてウシのタン
パクがセリンを有するのに対し，ヒトのタンパクはスレ
オニンを有する。また位置 128においては，ウシのタン
パクがプロリンを有するのに対し，ヒトのタンパクはセ
リンを有する。これらの相違は，各々の場合の単一のヌ
クレオチドの相違によるものである；従って，ウシのcD
NAを以下に述べるように突然変異を導く部位により，便
宜的に修飾してヒトのタンパクをコードし得るが，実際
には，標準的な部位特異的変異技法を用いてこれらのコ
ドンを変更した。実施例５のλBB2 クローンを EcoRIで
分解し，そしてbFGFタンパクをコードする部分にまで及
ぶ1.4 kbの領域をM13mp8の EcoRI部位に連結した。イン
ビトロ変異を３つのオリゴヌクレオチドの存在下で実施
した：“共通”プライマー，17-mer；変異16-mer，5'-G
AAATACACCAGTTGG-3'，これはコドン 112のコード配列を
変更する；そして，変異17- mer, 5'-ACTTGGATCCAAAACA
G-3'，これはコドン 128の配列を変更する。変異させた
ファージは，さらにインビトロでプライマーによって導
かれる変異を２度行い，変異25-mer，5'- TTTTACATGAAG
CTTTATATTTCAG-3'を用いて翻訳終結コドンより34bp下流
側にHindIII部位を創造した。得られた変異DNA は，ジ
デオキシ配列決定法により配列決定を行い，所望の変異
が生じたことを確認した。そして，FGF コード領域に及
ぶ約630bp の断片をHindIIIで切断し，そして pUC13へ
連結して中間体プラスミド pJJ15-1を得た。
【００９２】もちろん，塩基性FGF の３つの既知のＮ末
端修飾体のうちのいずれをもコードするコード領域の修
飾型は，やはり標準的合成技術を用いることによって調
製し得る。
【００９３】実施例７ 発現ベクターの構築および哺乳動物細胞中でのFGFの安
定な発現 FGF をコードするcDNAクローンは，上の C.1節で述べた
ように，種々の宿主中で組換えタンパクを生産するため
に，最も都合よく用いられる。しかし，哺乳動物系での
発現は，その宿主が，本来生産されるタンパクで見られ
るプロセッシングに類似した翻訳後プロセッシングを行
い得る場合，およびcDNA配列あるいはゲノム配列のいず
れの配列を用いたとしても，宿主がイントロンのプロセ
ッシングをも行い得る場合には，有利である。
【００９４】それゆえ，全長cDNAあるいはゲノムFGF を
コードするクローンは，以下に述べる宿主ベクターによ
り例示されるような（しかしこれに限定されないが）宿
主ベクターに挿入するために，調製される。
【００９５】このベクターを構築するために，このクロ
ーン化されたFGF をコードする挿入断片は， EcoRIで
（挿入断片自体が EcoRI部位を含むなら，部分分解によ
る）切断されるか，または他の適当な酵素で切断され，
EcoRIリンカーまたは必要であれば他の適当なリンカー
が付けられる。そしてこの挿入断片は，次いで，pHS1
や，以下に記述のようなその誘導体といった適当な宿主
ベクターに挿入される。
【００９６】宿主ベクターの構築 ｐＨＳ１ このプラスミドｐＨＳ１は，哺乳動物宿主中での挿入DN
A の発現に適している。このプラスミドは，p84H（Kari
n, M., et al, Nature (1982) 299 : 297-802)からの 8
40bpの hMT−II配列を含む。この配列は， hMT−II遺伝
子の−765 の位置のHindIII部位から，＋70の BamHI開
裂部位にわたっている。pHS1を構築するために，プラス
ミドp84Hを BamHIで完全なまでに分解し，末端のヌクレ
オチドを除去するべくエキソヌクレアーゼ BAL-31 で処
理し，次いでHindIIIで分解した。所望の840bp 断片をp
UC8（Vieira, J., et al, Gene (1982) 19 : 259-268)
に連結した。このpUC8はHindIIIおよびHincIIの分解に
より，開いている。この連結混合物は，大腸菌 HB101を
AmpRに形質転換するために用いられた。pHS1と名付け
られた１つの候補プラスミドは単離され，ダイデオキシ
配列法により，配列決定された。pHS1は，好都合な制限
部位を含むポリリンカーの上流側に， hMT−II制御配列
を含む。
【００９７】使用可能な宿主プラスミドpHS1は，メタロ
チオネインプロモーターのほかに，付加的な制御要素を
含有させて，さらに改変され得る。特に，SV40のような
ウイルス系のエンハンサー要素だけでなく，hGH のよう
な他のタンパクの3'非翻訳領域に結合した終結シグナル
も包含され得る。
【００９８】ウイルスエンハンサー MT−IIプロモーターに動作可能に連結された状態にある
SV40エンハンサーを含む一対の宿主発現ベクターは，pH
S1のMT−IIプロモーター配列の前方にあるHindIII部位
に，1120bpのSV40 DNA 断片を挿入することにより，構
築された。このSV40 DNA断片は，SV40の複製起点まで及
び，5171番目のヌクレオチドから5243番目のヌクレオチ
ド（起点）と， 107−250 番目のヌクレオチドの72bp反
復構造とを含んでおり，そして後期ウイルスmRNAの5'末
端を含む起点側の1046番目のヌクレオチドにまで至る。
この1120bpからなるHindIII断片は，SV40 DNA（Buchma
n, A.R., et al, DNA Tumor Viruses, 2d ed (J.Tooze,
ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (19
81), pp. 799-841)のHindIIIによる分解から得られ，増
幅のためにpBR322にクローン化される。このクローニン
グベクターをＨｉｎｄＩＩＩで切断し，そしてこの１１
２０ｂｐのSV40 DNA断片をゲル電気泳動法により単離
し，そしてpHS1（これはHindIIIにより分解し，CIP 処
理した）に連結した。得られたベクター（これは，pHS1
- SV(9) およびpHS1-SV(10) と名付けられた）は，それ
ぞれ反対方向に，MT−IIプロモーターを生じる断片を含
む。 pHS1-SV(9) では，エンハンサーは，5'mRNAの転写
開始部位から約1600bpのところにあり，また反対方向に
は，このエンハンサーは，5'mRNAの転写開始部位から
は，およそ980bpのところにある。両方向とも動作可能
であるが，エンハンサー配列が転写開始部位に近い方向
では，より高いレベルの発現を示す。
【００９９】転写開始部位の 250-400bp上流側にエンハ
ンサーを置くことを避けることは，最適であると考えら
れている。
【０１００】さらに，MTプロモーターのTATAボックスの
5'−末端から上流側に，それぞれ，190bp, 250bpおよび
360bpに，SV40エンハンサーの3'末端を置いたベクター
が構築された。この構築は，ヒトMTプロモーター上流側
の制御領域の地図化に基づいてなされた。このことは，
Karin, M., ら，Nature (1984) 308 : 513-519 に記述
されている。全ての構築物は，重金属による制御のため
の反復部位を含む配列を保持している。しかし，190bp
と 250bpとに分離した構築物は，これらの部位からさら
に上流側にあるグルココルチコイドによる制御のための
配列を保持していない。
【０１０１】これらのベクター（これは，pHS'-SV190,
pHS'-SV250およびpHS'-SV360と名付けられた）は，以下
のように調製される：全ての構築物は，メタロチオネイ
ンプロモーターおよび上流領域を含む配列の長さ以外は
一致している。このプロモーターおよび上流領域は，pH
S1から切断された断片として供される。
【０１０２】pHS'-SV190に対し，pHS1が SacIIで分解さ
れ，平滑化され，そしてKpnIリンカーに連結される。次
いで，このDNA は，MT−II制御配列の適当な部分を遊離
させるために， EcoRIおよびKpnIで分解される。同様
に，pHS'-SV250では，pHS1がHgaIで分解され，平滑化さ
れ，KpnIリンカーに連結された後， EcoRIおよびKpnIで
分解される。pHS'-SV360に対して，最初の分解において
DdeIが用いられる。
【０１０３】このSV40エンハンサーを含む中間ベクター
は，SV40のHindIII／KpnI断片（これは，5171番目の位
置から 294番目の位置にまで及んでおり，また，KpnI部
位から50bpのところにエンハンサー要素を含んでいる）
を，KpnI／HindIIIで分解されたpUC-SVに挿入すること
により調製され，pUC-SVが得られる。（pUC19 は，ポリ
リンカー領域に，順番にHindIII，KpnIおよび EcoRIの
３つの好都合な制限部位を含む）。この完成したベクタ
ーは，上で記述のように調製されるKpnI／EcoRI 断片
を，KpnI／EcoRI で分解されたpUC-SVに挿入することに
より，得られる。
【０１０４】それゆえ，先に改変された全てのベクター
は，SV40のエンハンサー要素を利用している。もちろ
ん，他のウイルスのエンハンサーであれば，同様の方法
で用いられるだろう。
【０１０５】転写終結配列 転写終結制御配列を供与するために，このコード配列，
およびヒト成長ホルモンの3'非翻訳配列を表すDNA をpH
S1に連結した。この中間ベクターは，hGH コード配列に
代えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対
し，hGH3' 非翻訳配列を供与し得る。
【０１０６】このゲノム配列をコードする hGHを， Bam
HIおよび EcoRIで分解し，続いてポリアクリルアミドゲ
ル精製することにより，p2.6-3 (DeNoto, et al, Nucl
eicAcids Res (1981)19: 3719) から単離した。この Ba
mHIは最初のエキソンの5'末端で切断する。 EcoRIは機
能遺伝子の3'位で切断する。この単離された断片を，Ba
mHI／EcoRI で分解されたpHS1に連結した。この連結混
合物を大腸菌 MC1061の AmpR に形質転換した。成功し
た形質転換体は，制限分析により選抜し，所望のプラス
ミド pMT-hGHg を含む株をさらに増殖させて，多量のプ
ラスミドDNA を調製した。
【０１０７】pHS1-SV(9)またはpHS1-SV(10) を構築する
ためではあるが，pHS1を代用するために，先に記述の方
法と同様の方法で，MTプロモーターの制御下にある hGH
遺伝子を含み，SV40エンハンサーと動作可能に連結さ
れ，そしてそれぞれ，pHGHg-SV(9) およびphGHg-SV(10)
と名付けられた一対のベクター（pMT-hGHg）を得た。そ
の連結混合物は大腸菌 1061 を AmpR に形質転換するた
めに用いられた。そして適切な構造が確認された。
【０１０８】発現ベクターの構築 次いで，合成の酸性 hFGF に適応する宿主ベクターとし
て，phGHg-SV(10)を用いた。phGHg-SV(10)を BamHIおよ
びSmaIで分解し，クレノーで平滑化し，そして hGHコー
ド配列を切断するために CIPで処理した。この開かれた
ベクターをNcoI（平滑末端）／EcoRI(平滑末端）合成の
酸性 hFGF 断片に連結し，所望の発現ベクター pahFGF-
SV(10)を得た。ここで，合成の酸性 hFGF 断片のNcoI部
位は再生されている。
【０１０９】同様に，上で記述の残留 FGFをコードする
断片を phGHg-SV(10) に連結して，ウイルスエンハンサ
ー，MT−IIプロモーターおよびhGH 3'非翻訳領域の制御
下にて，これらのコード配列を含む類似ベクターを調製
する。例えば，実施例６のpJJ 15-1からの500bp までの
NcoI（平滑末端）／HindIII（平滑末端）断片を， BamH
I（平滑末端）／SmaIで分解したphGH-SV(10) にうまく
挿入して，pJJ16-2 を得る。
【０１１０】さらに，pHS1，および上で記述のような，
SVエンハンサーの種々の配置を含むべく改変されたpHS1
を包含するこれらの配列の発現を得るために，他の宿主
ベクターが用いられてもよい。挿入は，この宿主ベクタ
ーの BamHI／EcoRI 分解を用いての，類似の方法によ
る。また，酸性または塩基性FGF の“長い”形態，“基
本の”形態あるいは“短い”形態のいずれをもコードす
るべく改変されたDNA も用いられ得る。
【０１１１】これらのベクターは，以下で論じる目的の
ために，一般的に pMT-FGFと呼ばれる。
【０１１２】哺乳動物の組換え体によるFGF の生産 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞を，F12 培地
および DME培地の１：１混合物から構成される培地上
で，12％ウシ胎児血清とともに生長させた。このコンピ
テント細胞は，pMT-FGF および pSV2 : NEO (Southern,
P., et al, J Mol Appl Genet (1982)1 : 327-341)で
共形質転換した。pSV2 :NEO は，ネオマイシン類似体 G
418 に耐性を与える機能遺伝子を含む。この形質転換で
は，500ng の pSV2-NEO および５μg の pMT-FGFを，Wi
gler, M., ら，Cell (1979) 16 : 777- 785 ，のプロト
コルに従って，リン酸カルシウム−DNA 共沈澱物中で，
16mmディシュの細胞に適用した。それとともに，これら
をDNA に４時間さらした後，15％グリセロールで２分間
“ショック”を加えた。１日後，G418耐性コロニーのプ
ールを与えるために，この細胞を１mg／mlのG418にさら
した。これらの耐性コロニーはFGF 生産のために分析さ
れ，次いでクローン化され得る。
【０１１３】成功した形質転換体（これらはまた pMT-F
GFの安定な遺伝形質を有する）を，クローン単離体の精
製のため，低密度でプレート上にまく。これらの単離体
の少量を，FGF 生産をうまく分析するために，10-4M の
塩化亜鉛にさらした後，多孔プレート上で生長させる。
FGF の定量は通常の方法を用いて，適当なFGF タンパク
に対し調製される抗血清に対して，標準的な ELISAまた
はラジオイムノアッセイにより行われる。所望のFGF を
大量に生産するクローン分離体が選抜される。
【０１１４】適当な条件下にてFGF を生産するべく示さ
れる細胞を，10％のウシ胎児血清で補足された基本培地
に 1/10 集密度でまき，一夜インキュベートし，次い
で，１×10-4M 〜３×10-4M の濃度範囲の塩化亜鉛を加
えることにより，FGF の生産を誘導する。２×10-4M Zn
Cl2 の最適の誘導条件下で，７〜10日間にわたりFGF の
レベルが上昇する。
【０１１５】特定の実験では，実施例６の pJJ15-1に由
来のヒト塩基性FGF をコードする約500bpの NcoI(平滑
末端）／HindIII（平滑末端）断片を含む pMT-FGFを用
いて，CHO 細胞が形質転換された。上に記述のように，
pMT-FGF のこの特別な形（上ではpJJ16-2 と名付けた）
を得るために，この断片を BamHI（平滑末端）／SmaIで
分解された phGH-SV(10)に挿入した。このベクター（pS
V-neo および pHS1-MT）で，この細胞を共形質転換し
た。G418選抜の後，このプールされた耐性コロニーは，
106 細胞当たり約 500pgのヒト塩基性FGF を生産した。
【０１１６】生産されたFGF の量は，ヘパリン−セファ
ロースを用いて，溶解した細胞から塩基性FGF をアフィ
ニティー精製により定量し，続いて組織培養中の内皮細
胞の生長促進のための分析を行った。このヘパリンアフ
ィニティー精製は，以下に記述の方法のような標準的な
方法により，達成される。この方法は，例えば，Sulliv
an, R., ら，J Biol Chem (1985)260 : 2399-2403 ，あ
るいは Shing, ら，Science (1984)223 : 1296- 1299で
ある。また，活性の分析は Gospodarowicz, D., ら，J
Cell Physiol (1985) 122 : 323-332 ，あるいは Gospo
darowicz, D., ら，J Cell Biol (1983)97 : 1677-1685
に記述のように行われる。
【０１１７】500pg/106 細胞のレベルで生産する先のプ
ールを，次いで，誘発物質としての100μM ZnCl2 とと
もに10μM CdCl2 の存在下にて生長させることにより，
カドミウム耐性体を選抜した。耐性クローンのプール
を，次いで，上で記述のように分析した。5.6ng/106 細
胞の生産レベルが１回の分析で見出された。
【０１１８】望むなら，FGF がこの溶解した細胞から得
られ，そして天然タンパクに対する先に述べた方法によ
るか，または当業者に公知の他の標準方法により，精製
され得る。
【０１１９】さらに，先に論じたように，前述の構築物
により生産されるFGF タンパクの分泌は，カルシウムイ
オノフォアや他の適当な刺激剤によって開始されるエキ
ソサイトシスにより，達成され得る。CHO 細胞により生
産されるタンパクが，特に，LPS やホルボールエステル
の刺激により，放出されるということは期待できないも
のの，例えば，CHO 細胞に代えて，組換え宿主としてマ
クロファージ由来の細胞系を用いることにより，このよ
うな分泌が行われ得る。また，以下に例示するような h
GH由来のシグナル配列を与えるために，その構築を変え
ることにより，通常の構築経路を用いる分泌も，CHO や
他の哺乳動物細胞の宿主を用いて行われるだろう。もち
ろん，分泌を生じることは，タンパク精製作業がずっと
簡単になるので有利である。
【０１２０】合成した酸性 hFGF の部分合成配列を含む
pMT-FGFベクターでのトランスフェクションにより，成
熟した基本型の 140アミノ酸の上流側にある14アミノ酸
の前部領域を含む“長い型”FGF の生産が行われるだろ
う。それにより，処理されたMet 残基はまた，アセチル
基のようなブロッキング基と置き換えられてもよい。プ
ロセッシングはまた，哺乳動物細胞中で行われ，その結
果成熟型になる。しかし，最初の Metを欠き，アセチル
化されたＮ末端アラニン残基を有するリーダー配列を含
む長い型のものが，分裂促進因子としての活性を有する
ことがわかっている。
【０１２１】いずれの場合にも，FGF は，ヘパリン／セ
ファロースに適し，酸性FGF には 1.2M NaClでそして塩
基性FGF には 2M NaClで溶出することにより，一部精製
される。この溶出物は，SDS-PAGE，および内皮細胞や 3
T3細胞に対する分裂促進活性により，酸性または塩基性
FGF の存在について分析される。
【０１２２】実施例８ ヒトFGF に対するワクシニアベクターの構築，およびCV
-1細胞の一時的な発現 基本のhFGFをコードする配列は， BamHIおよびSmaIでph
GH- SV(10)（前出）を分解し，クレノーを用いて平滑化
し，そして pJJ15-1からこのFGF にわたる約500bpのNco
I（平滑末端）／HindIII（平滑末端）断片を挿入するこ
とにより，hGH から3'非翻訳領域と共に供給された。得
られたプラスミド，pJJ16-2 は，上に記述の発現ベクタ
ーとして直接用いられ得る。
【０１２３】しかしながら，基本のbFGFをコードする領
域およびhGHpolyA付加シグナルを含むNcoI／EcoRI 断片
（約 1.1kb）を，５％アクリルアミドゲル上で精製し，
溶出し，クレノーで平滑化し，そしてSmaIで分解したホ
スファターゼ化 pGS20に連結した（Mackett et al, J
Virol (1984)49 : 857-864）。得られたプラスミド（pJ
V1-1と命名された）は，大腸菌 MC1061 中で増幅され
た。そしてこのプラスミドDNA は，セシウムクロライド
濃度勾配を用い単離された。
【０１２４】実施例４で合成された合成の酸性hFGF DNA
断片も，ワクシニアの一時的な発現ベクター pGS20の中
に連結される。第１３図に示される合成の酸性hFGF遺伝
子は，NcoIおよび EcoRIで切断され，クレノーで平滑化
され，そしてSmaIで切断されたホスファターゼ化 pGS20
に連結される。得られたプラスミドの調製物は，セシウ
ムクロライド中で平衡状態に遠心分離することにより精
製され，pJV1-2と命名された組換えプラスミドが回収さ
れる。
【０１２５】このpJV1-1ベクターおよびpJV1-2ベクター
は，Cochran, M. A., ら，Proc Natl Acad Sci (USA)
(1985) 82 : 19-23によって記述されるように，ワクシ
ニアに感染するCV-1細胞に形質転換される。
【０１２６】pJV1-1またはpGS20 にトランスフェクトさ
れたCV-1細胞は，SDS-PAGEオートラジオグラフィーを用
いる基本のFGF を生産するために，分析された。この結
果は，第１６図に示される。レーン１およびレーン２
は，それぞれpJV1-1 および pGS20でトランスフェクト
された細胞の培地である。レーン３およびレーン４は，
対応する細胞溶解産物のサンプルであり，レーン５およ
びレーン６は，以下のこと以外は，レーン３およびレー
ン４と同じである。溶解産物のサンプルを，0.6M塩化ナ
トリウムの存在下にてヘパリンセファロースに結合し，
10mMリン酸塩，pH 7.4／1.1M塩化ナトリウムで洗い，そ
して同じ緩衝液中で２M塩化ナトリウムを用いてカラム
から溶出した（この溶出物は，ゲル上に載せる前に TCA
で沈澱させた）。レーン７は，146 アミノ酸型にて125I
でラベルされた基本のFGF である。レーン５中の約18kd
の所のバンド（これはFGF の標準よりも少し高い分子量
をもっている）によると，ウシ配列のその“長い”型
が，組織から得られた“基本の”タンパクよりも多く形
成されていることがわかる。
【０１２７】レーン５およびレーン６に示すように調製
されたサンプル（TCA 沈澱を除く）も，ウシの脳の毛細
管内皮細胞の分裂促進活性について検査された（実施例
９参照）。pGS20 サンプルには活性は全くなかったが，
pJV1-1サンプルは，20pg FGF／μｌに相当する活性を含
んでいた。
【０１２８】実施例９ FGF に対するインビトロ分析 この分析は，Eschら，Proc Natl Acad Sci (USA) (198
5) 82 : 6507-6511：および Gospodarowiczら，J Cell
Physiol(1985)122 : 323-332 に記述のように実質的に
行われた。
【０１２９】簡単に言うと，ウシの脳の毛細管内皮細胞
は，10％ウシ血清で補われたDMEMの存在下で維持され
た。複数の単層が，0.9 ％塩化ナトリウム，0.01M リン
酸ナトリウム，pH 7.4, 0.05％トリプシン，そして0.02
％EDTAを含む溶液に，室温にて２〜３分間さらすことに
よって，解離された。この細胞を集めた後，それらを，
DMEMおよび10％ウシ血清中に再懸濁させ，そして細胞懸
濁液のアリコートをコルターカウンター（Coulter coun
ter)で計測した。この細胞を，２mlDMEMに10％ウシ血清
を加えた全体を含む各皿に，35mm皿あたり２×104 細胞
の初期密度で植えつけた。６〜12時間後，２通り作成し
たプレート１セットをトリプシン処理し，そして細胞を
計測してプレート化効果を測定した。
【０１３０】FGF 活性について検査され得るサンプルの
アリコートを，0.5 ％ BSAを加えたDMEMを用いて1:2,
1:4, そして 1:8に希釈し，そして，この希釈液の10μ
ｌを３通りの検査プレートに０日目および２日目に加え
た。４日目に，各サンプル希釈液に対する３通りのプレ
ートをトリプシン処理し，そしてこの細胞密度をコルタ
ーカウンターにより測定した。
【０１３１】実施例10 シグナル配列融合の発現 FGF の組換え型は，CHO 細胞またはCV-1細胞の培地中で
は見出されなかったので，このFGF をコードするDNA 配
列も，組換えFGF タンパクの分泌を起こすために，異種
シグナル配列に連結される。次いで，この融合した配列
は，ワクシニアで感染させたCV-1細胞中での一時的な発
現および分泌を生じるようなワクシニアにもとづくベク
ターに連結されるか，または CHO細胞での発現および分
泌のためのベクターにもとづくpHS1に連結される。
【０１３２】ヒトの成長ホルモンからのシグナル配列
を，コード配列全部を含む 800bpのHindIII断片とし
て， Martial, J.A., ら，Science (1979)205 : 602-60
7,のcDNAベクター chG H800/pBR322から得た。NaeI制限
部位は，部位特異的な突然変異によって，26番目のアミ
ノ酸シグナルをコードするDNA の3'位にすぐに配置され
る。その結果，NaeIによる次の開裂は，このシグナル配
列のＣ末端でのアラニン残基に対するコドンのすぐあと
に平滑末端を有する断片になる。要約すると，このHind
III断片をM13mp19 に連結し，そしてプライマー：5'-AT
GGTTGGGCCGGCACTGCC-3'を用いて突然変異させる。そし
て，この突然変異した配列は，回収され， BamHIおよび
NaeIで分解されてシグナル配列を含む断片を与える。
【０１３３】（β−ラクタマーゼのシグナル配列の正し
く合わせた型も，類似の構築物中に用いられるだろう
（Lingappa, V.R., ら，Proc Natl Acad Sci(USA) (198
4) 81 : 456-460) 。）基本のhFGFの４つの型をコード
するDNA は，上に記述の改変されたλBB２クローンから
の一定のＣ末端断片，および可変的な合成のＮ末端部分
をそれぞれ含む部分的に合成された断片として供給され
る。このＣ末端の位置に対し，この改変されたλBB２ク
ローンは，3'非翻訳領域のHindIII部位に及ぶ377bp の
副断片を得るために，HhaIおよびHindIIIで分解され
る。このHhaIは，開始メチオニンコドンから 122bp下流
側を切断する。HhaI部位から上流側の欠けている部分
は，合成のオリゴヌクレオチドを用いて供給される。
【０１３４】この合成オリゴヌクレオチドは，第１７図
に示される。それらは，合成の酸性hFGF の産生に関連
して上述された方法と類似の方法で合成され，そして連
結される。この個々のオリゴヌクレオチドは，標準の自
動核酸合成器を用いて合成され，アニーリングされる。
そしてこの２重鎖部分は，その3'末端にHhaI部位を含む
適切な全体の上流側部分を形成するように，連結され
る。次いで，これらの合成の上流側断片は，完全なFGF
遺伝子を得るように，T4リガーゼを用いて，下流側のHh
aI／HindIII断片に連結された後，hGH シグナル配列を
コードする領域を加えるために， hGH BamHI−NdeI断片
に連結される。
【０１３５】この合成の上流側部分によってコードされ
る hGH／基本のFGF タンパクの結合は，第１８図に示さ
れる。タンパクＡは，再構築された上流側部分および連
結されたＣ末端コドンを含む。このＣ末端コドンは，そ
れゆえ，−９〜146 のアミノ酸（第８図に示す）をコー
ドしている。つまり，このコドンは，ヒト FGFの長い型
をコードするアミノ酸全部である。タンパクＢは，−９
位のＮ末端メチオニンがアラニン残基によって置き換え
られていること以外は，同じ配列を含む。タンパクＣ
は，第８図の12-146のアミノ酸をコードしている。そし
て，タンパクＤは，このタンパクの16-146のアミノ酸，
つまりヒトの基本の FGFの“短い”型をコードしてい
る。この短い型は分裂促進活性を示すことが既に知られ
ている。
【０１３６】第１８図も，von Heijne, G., Eur J Bioc
hem (1983)133 : 17-21 によって示された規則によれ
ば，直接の発現産物に対する予測されたシグナル配列の
開裂部位（太い矢印）を示す。
【０１３７】構築を完全にするために，第１８図で示さ
れる hGHシグナル配列に融合された４つのタンパクをコ
ードする断片は， BamHI（部分）／HindIII配列として
増幅するため，キャリアープラスミド pUC9 中に挿入さ
れる。正しい構築はダイデオキシシーケンス法により確
立される。この配列断片を確認する BamHI（部分）／Hi
ndIIIは，次いで，キャリアープラスミドから削除さ
れ，クレノーにより平滑化され，そして pGS20（前述）
のSmaI部位に連結される。連結された組換えプラスミド
は，上に記述のように，ワクシニアに感染したCV-1細胞
中で発現される。
【０１３８】同様に，構築物は，同じ発現系での分泌の
ために，酸性hFGFから作られる。このFGF をコードする
配列は，合成された酸性の hFGF DNA 断片から誘導さ
れ，修飾されて，第１９図におけるタンパク E, F およ
び Gを生産する。第１９図は，第４図の−15残基から 1
40残基に及ぶ酸性FGF の長い型，第４図の１〜140 残基
によって表される基本型，そして，その図の７〜140 残
基に及ぶ短い型の hGH／酸性FGF タンパク結合領域を表
す。全ては，この図に示されているように，このFGF の
アミノ末端に少しの変化をもたらす。
【０１３９】これらのFGF をコードする配列を構築する
ために，このNcoI／EcoRI の合成の酸性FGF を，NcoI部
位にて，クレノーにより平滑化し，そしてSmaI／EcoRI
で分解された M13mp19に連結する。得られたファージ
は，オリゴヌクレオチド：5'-GTAATTCCCGGGAGGCAGAT-3'
で突然変異を誘発され，それゆえ，グリシンに対するコ
ドンのすぐ前に，第１３図の核酸位置62にてSmaI部位を
作る。このグリシンは，主要な酸性hFGFの残基６であ
る。SmaIおよび EcoRIを有する突然変異された断片の分
解により，414bp の断片が生じ，この断片は，第１９図
中のタンパクＧのように示される組換え型をコードする
DNA を得るために， BamHI／NaeI hGHシグナルをコード
する断片に直接連結される。または，この断片は，合成
したオリゴヌクレオチド（第２０図に示される）にまず
連結され，次いで，第１９図のＥおよびＦと命名される
ペプチドをコードする配列を得るために， BamHI／NaeI
断片に連結される。
【０１４０】ヒト塩基性FGF に対して先に述べた方法に
全く類似の方法にて，このシグナル配列を進行させる酸
性FGF のDNA 断片を，pGS20 中に配置し，そしてワクシ
ニアに感染したCV-1細胞中にトランスフェクトして，酸
性FGF の分泌型の一時的な発現を分析する（この処理さ
れたタンパクの予期されるシグナル開裂部位を，von He
ijneからも推測されるように，第１９図の太い矢印によ
り指示する）。
【０１４１】このFGF 配列は，伝統的なシグナル配列を
含んでおらず，したがって構築条件下にてシグナルの仮
定的な機構により，それらの配列自体の分泌を生じさせ
る性能を有することは，注目されるべきである。正常な
細胞質タンパクに外来シグナル配列を融合することによ
り，それらの分泌を生じ得るかどうかということは，当
該技術分野からは明らかでない（malEシグナル配列に融
合されるβ−ガラクトシダーゼは，細菌中ではペリプラ
ズムに達しないことが示された。しかし，Lingappa，V.
R., ら，Proc Natl Acad Sci (前述）は，β−ラクタマ
ーゼシグナルに融合されるβ−グロビンが，インビトロ
でイヌの脾臓のミクロソームにより処理され，そしてこ
の処理されたタンパクが，トリプシンの分解から保護さ
れることを示している）。
【０１４２】この連結されたシグナル／FGF をコードす
る配列も，上述された MT-IIプロモーターを含む宿主ベ
クターの中に挿入され得，そしてCHO 細胞中で発現され
得る。
【０１４３】実施例11 FGF の細菌での発現 FGF をコードするcDNA配列（これはイントロンによって
分断されていない）も，細菌系にて発現可能である。発
現のために都合のよい宿主ベクターは pKT52であり，そ
れは，“trc ”プロモーターおよびそれに続く ATG開始
コドンを含んでいる。
【０１４４】この“trc ”プロモーターは，trp プロモ
ーターの上流部分および下流部分，オペレーターを含む
部分，lac プロモーターの領域，を含む。このプロモー
ターを含む pKT52は，pKK233-2の簡単な操作により構築
された。それは，Amman, E.,ら，Gene (1985) 40 : 183
-190により，記述されている。pKK233-2は， EcoRIおよ
びPvuIIで分解され，dATPおよびdTTPで満たされ，そし
て所望のベクターを得るべく再連結された。
【０１４５】pKT52 は，所望のtrc プロモーターおよび
下流側の ATG開始コドンに加えて，下流側のNcoI部位，
PstI部位，およびHindIII部位を含む。
【０１４６】発現ベクターを構築するために，このFGF
をコードするcDNAは， EcoRIまたは他の適当な酵素で分
解すること，単離すること，およびもし必要ならば，適
当な断片を修飾することにより，得られる。この3'末端
は，ある都合のよい制限酵素部位にて終止コドンの下流
側を切断し，そしてPstIリンカーまたはHindIIIリンカ
ーを与えることにより，pKT52 中に導入するために，調
製される。この5'末端は，このコード配列の内側の部位
にて切断し，そしてこの欠けているコドンおよびNcoI部
位を合成DNA を用いて与えることによるか，または変異
操作によって適当に配置されたNcoI部位を供給すること
により，調製される。得られるNcoI／HindIIIまたはNco
I／PstI断片は，次いで，NcoI／HindIIIで分解される p
KT52か，またはNcoI／PstIで分解される pKT52に連結さ
れ，読み枠中にて，このATG 開始コドンとともに，FGF
をコードするcDNAを供給する。このNcoI／HindIIIを境
界とする合成の酸性 hFGF DNA は，この方法で直接に挿
入される。同様のベクターは，ヒトの塩基性FGF をコー
ドするDNA を用いて構築される。
【０１４７】細菌での発現では，得られた発現ベクター
は大腸菌 MC1061 または他の適当な宿主細胞を AmpR に
形質転換するために用いられ，次いで形質転換された細
胞は，O.D.が 0.2〜0.5 になる３〜５時間の間，１mMの
IPTGを含むM9培地上で生長される（IPTGは，lac オペレ
ーターによって制御される制御配列に対する標準の誘導
物質である）。次いで，細胞を集め，細胞破砕または５
％トリクロロ酢酸での処理により溶菌し，そしてこの細
胞抽出物を，所望のFGF について分析する。FGF は，天
然タンパクに対して用いられる方法，または当該技術分
野に既知の他の操作によって，抽出物から精製され得
る。
【０１４８】実施例12 傷害の修復を促進するFGF の活性 傷害の修復を促進するFGF 活性を，対照としてのGospod
arowicz らの方法（Proc Natl Acad Sci (USA) (1984)
81 : 6963-6967）により，ウシの脳下垂体から精製した
純粋な塩基性FGF を用い分析した。分析され得る対照の
FGF は，Davidson, J.M., ら，J.C.B. (1985) 100 : 12
19-1227 の手順によれば，ネズミへのポリビニルアルコ
ールスポンジの皮下注入に適用された。代わりの方法と
して，ゴルテックスホローファイバーも，用いられ得る
（Goodson, W.H., et al, J SurgRes (1982) 33 : 394-
401）。
【０１４９】標準的な手法では，全部で４匹のネズミ
を，それぞれ２つの同一の処理をしたスポンジで処理し
た。このスポンジは，ヘパリンセファロースビーズによ
る処理，スポンジあたり５μg のFGF を用いてヘパリン
セファロースビーズに結合されたFGF による処理，また
は溶液中にて５μg FGF で処理を施す，のいずれかであ
った。このスポンジを，６日後に回収し，そして，傷害
修復を示している肉芽組織について組織構造的に調べ
た。
【０１５０】FGF を含むスポンジは，高い量の肉芽組織
を示した。そして，この肉芽組織は，スポンジの場合に
は，ヘパリンセファロースビーズのまわりに集まってい
た。このスポンジのところでは，FGF は，これらのビー
ズに結合して供給された。
【０１５１】同様の結果により，FGF が天然源によるか
または組換え体によるものか，そしてFGF が塩基性か酸
性かについて観察される。
【０１５２】1985年９月９日またはそれ以前に，出願人
は，American Type Culture Collection (ATCC), Rockv
ille, MD, USA,にλファージのλBA2,λBA3,λHAG-9.1,
λBB2,およびλKB-7を寄託した。これらは，ATCC受託番
号 40195, 40194, 40197, 40196 ，および 40198をそれ
ぞれ割り当てられた。これらの寄託は，特許目的のため
の培養菌寄託に関するATCCの承認のもとで与えられるよ
うな状況下にてなされた。1986年９月12日またはそれ以
前に，λBB2 (ATCC 40196)およびλHAG-9.1 (ATCC 4019
7)の寄託条件は，微生物の寄託に対する国際的な承認
（ブダペスト条約）に関するブダペスト条約で明記され
た条件に適合するように変えられた。1986年９月12日ま
たはそれ以前に，λHG-3およびλHAG-3 と命名されたλ
ファージは，ブダペスト条約の条件下でATCCに寄託さ
れ，ATCC受託番号 40257および 40258を，それぞれ割り
当てられた。寄託された株の有用性は，その特許法に従
って，いかなる政府の権威の下で許された権利にも違反
して，その発明を実施するためのライセンスとして解釈
されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】酸性のウシFGFに対する部分配列を表す。
【図２】酸性ウシＦＧＦタンパクの完全なアミノ酸配列
を表す。
【図３】λファージλHAG-9.1に含まれるヒトの酸性FGF
の遺伝子の第１エキソンに対応するヌクレオチド配列お
よび推定されるアミノ酸配列を表わす。
【図４】λファージλHG-3に含まれるヒトの酸性ＦＧＦ
の遺伝子の第２エキソンに対応するヌクレオチド配列お
よび推定されるアミノ酸配列を表わす。
【図５】λファージλHAG-3に含まれるヒトの酸性ＦＧ
Ｆの遺伝子の第３エキソンに対応するヌクレオチド配列
および推定されるアミノ酸配列を表わす。
【図６】Jayeらにより開示された、完全なアミノ酸配列
およびヒトの酸性ＦＧＦをコードするcDNA配列を表わ
す。
【図７】塩基性ウシＦＧＦをコードするDNA配列，およ
び推定されたこれらのアミノ酸配列を表す。
【図８】塩基性ヒトＦＧＦをコードするDNA配列，およ
び推定されたこれらのアミノ酸配列を表す。
【図９】酸性bFGFのＮ末端配列から設計されたオリゴヌ
クレオチドプローブ889/890，891および853-856を表
す。
【図１０】ゲノムの酸性bFGFクローンλBA2およびλBA3
に対する挿入部分の制限地図を表す。
【図１１】ウシの酸性FGFゲノムプローブ 250／AluIのD
NA配列を表す。
【図１２】酸性hFGFゲノムクローンλHAG-9.1における
挿入部分の制限地図を表す。
【図１３】酸性hFGFの部分合成遺伝子，すなわち“合成
型−酸性hFGF”を表す。
【図１４】塩基性FGFプローブ1097／1098を表す。
【図１５】塩基性bFGF cDNAクローンλBB2の制限地図を
表す。
【図１６】CV-1細胞における塩基性hFGFの一時的な発現
の結果を表す。
【図１７】塩基性hFGFを構築するためにhGHシグナル配
列への融合物として用いた合成オリゴヌクレオチドを表
す。
【図１８】いくつかの塩基性hFGF組換えタンパクに対す
るhGH／FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。
【図１９】いくつかの酸性hFGF組換えタンパクに対する
hGH／FGF融合連結部におけるアミノ酸配列を表す。
【図２０】図１５のタンパクのいくつかの部分をコード
するために用いたDNA配列を表す。
【図２１】ヒトの塩基性FGFをコードする遺伝子の地図
を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アブラハム，ジュディス エー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086, サニーヴェイル，ナンバー アイ−207, サウス フェアオークス 655

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質を生産する
    方法であって、 発現を制御する配列に作動可能に連結された、ヒト塩基
    性ＦＧＦタンパク質をコードする、単離され、クローン
    化された組換えまたは合成ＤＮＡ配列で形質転換された
    哺乳動物細胞または細菌を、ヒト塩基性ＦＧＦタンパク
    質が発現される条件下で培養する工程、 該培養して得られたヒト塩基性ＦＧＦタンパク質を回収
    する工程、 を包含する、ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質の生産方法：
    ここで、該ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質は、以下のアミ
    ノ酸配列Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群
    から選択される： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】
  2. 【請求項２】 前記制御配列が、ヒトＭＴ−IIプロモー
    ター、ＳＶ４０由来のウイルスのエンハンサー、ワクシ
    ニアウイルス由来の制御配列、およびｈＧＨ由来の転写
    シグナルのうち少なくとも一種を含む、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ配列が、プレハイブリダイゼ
    ーション／ハイブリダイゼーション緩衝液、ｐＨ６．５
    中で、ＢＢ２（ＡＴＣＣ４０１９６として寄託してい
    る）をEcoRIで分解して得られるウシ塩基性ＦＧＦをコ
    ードする１．４Ｋｂの断片とハイブリダイズし得るＤＮ
    Ａ配列である、請求項１または２に記載の方法：ここ
    で、該緩衝液は、４０％ホルムアミド、５ｍＭリン酸ナ
    トリウム、５Xデンハート溶液（０．１％ウシ血清アル
    ブミン、０．１％ポリビニルピロリドンおよび０．１％
    フィコル）、５XＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、
    ０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０μｇニシン精
    子ＤＮＡおよび１０％硫酸デキストランを含む。
  4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ配列が、その上流側に、作動
    可能に連結された異質のシグナル配列をさらに含む、請
    求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質をコードす
    るＤＮＡを哺乳動物細胞または細菌の組換え宿主細胞で
    発現させて得られるヒト塩基性ＦＧＦタンパク質であっ
    て、 該ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質は、以下のアミノ酸配列
    Ｉ、II、IIIおよびIVを含有するタンパク質群から選択
    されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列の２５、６
    ９、８７、および９２番目の部位に４つのシステイン残
    基を有する： 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】
  6. 【請求項６】 前記細菌宿主がE.coliである、請求項５
    に記載のヒト塩基性ＦＧＦタンパク質。
  7. 【請求項７】 ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質と、薬学的
    に許容される少なくとも１つの賦形剤との混合物を含有
    する薬学的組成物であって、 該ヒト塩基性ＦＧＦタンパク質は、ヒト塩基性ＦＧＦタ
    ンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞または細菌
    の組換え宿主細胞で発現させて得られるヒト塩基性ＦＧ
    Ｆタンパク質であって、以下のアミノ酸配列Ｉ、II、II
    IおよびIVを含有するタンパク質群から選択されるアミ
    ノ酸配列を有し、該アミノ酸配列の２５、６９、８７、
    および９２番目の部位に４つのシステイン残基を有す
    る、組成物： 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】
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