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Die Erfindung betrifft die rekombinante Herstellung von humanem
basischem Fibroblast-Wachstumsfaktor (FGF) in bakteriellen
Wirtszellen und FGF, das durch eine solche Herstellung erhalten
wird, so wie pharmazeutische Zusammensetzungen, die dieses FGF
enthalten.
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Der Heilungsprozess, wenn Gewebe einem Trauma, wie z. B.
Verletzungen oder Verbrennungen ausgesetzt wird, ist ein sehr
komplexer, aber bekannt ist, daß er durch eine Anzahl von
Proteinfaktoren vermittelt wird. Diese Faktoren sind essentiell
bei dem Wachstum und der Differenzierung der Zellen, die dazu
dienen, das zerstörte Gewebe zu ersetzen. Eine Anzahl von
Kandidaten für diese Faktoren wurden auf der Basis der
Fähigkeit der Extrakte von verschiedenen Geweben, z. B. dem
Gehirn, der Hypophyse und dem Hypothalamus, die Mitose der
Kulturzellinien zu stimulieren, isoliert. Viele Kurznamen
wurden den aktiven Faktoren in diesen Extrakten gegeben,
einschließlich dem von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor
(platelet-derived growth factor, PDGF), dem von Makrophagen
stammenden Wachstumsfaktor (macrophage-derived growth factor,
MDGF), dem epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth
factor, EGF), dem Tumorangiogenesefaktor (tumor angiogenesis
factor, TAF) dem Endothelzellwachstumsfaktor (endothelial cell
growth factor, ECGF), dem Fibroblast-Wachstumsfaktor
(fibroplast growth factor, FGF), dem vom Hypothalmus stammenden
Wachstumsfaktor (hypothalamus-derived growth factor, HDGF), dem
von der Retina stammenden Wachstumsfaktor (retina-derived
growth factor, RDGF) und den heparinbindenden Wachstumsfaktor
(heparin-binding growth factor, HGF). (Siehe zum Beispiel Hunt,
T.K., J Trau (1984) 24:S39 -S49; Lobb, R.R. et al.,
Biochemistry, (1984) 23 : 6295-6299).
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Folkman, J. et al., Science (1983) 221 : 719-725, haben
berichtet, daß eines der Verfahren, das bei der Wundheilung
involviert ist, nämlich die Bildung von Blutgefäßen, in Tumoren
grundlegend durch Heparin bewirkt wird. Aus dieser und anderen
Studien wird klar, daß Heparin insbesondere an Protein(e)
bindet, die mit einer Anzahl dieser Wachstumsfaktoren
assoziiert sind, und daß Heparin deshalb als ein Mittel zur
Aufreinigung verwendet wurde. Es wurde gezeigt, daß die
Affinität der Wachstumsfaktoren gegenüber Heparin unabhängig
von der gesamten ionischen Ladung ist, da sowohl positiv als
auch negativ geladen Faktoren gebunden werden (Maciag, T. et
al., Science (1984) 225 : 932-935; Shing, Y. et al., Science
(1984) 223 : 1296-1299; Klagsbrun, M. et al. Proc Natl Acad Sci
(USA) (1985) 82 : 805-809). Die Fähigkeit an Heparin zu binden
oder nicht zu binden, ist eine Messung zur Differenzierung
zwischen den Aktivitäten in den verschiedenen Extrakten. Zum
Beispiel binden EGF und PDGF nicht stark an Heparin; in der Tat
bindet EGF überhaupt nicht an Heparin. Die anderen oben
genannten Faktoren zeigen eine starke Heparinbindung. Es wird
jedoch angenommen, daß der saure Gehirn-FGF, ECGF, RDGF und
HGF-α tatsächlich die gleichen Faktoren sind. In ähnlicher
Weise wird ebenfalls angenommen, daß der Hypophysen-FGF, der
kationische Gehirn-FGF, TAF und HGF-β das gleiche Protein sind.
(Lobb, R.R., et al.(supra)). Eine Zusammenfassung und ein
Vergleich von dreizehn endothelialen Wachstumsfaktoren, die
unter Verwendung von Heparinaffinität gereinigt wurden, wird in
Lobb, R.R., et al. J Biol Chem (1986) 261 : 1924-1928
beschrieben.
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Bei Verwendung der Heparinaffinitätschromatographie wurden
basische Fibroblast-Wachstumsfaktoren, die eine potente
mitogene Aktivität gegenüber kapillarem Endothel zeigen, aus
einem Rattenchondrosarkom (Shing, Y., et al. supra) und aus
Rinderknorpel (Sullivan, R., et al. J Biol Chem (1985)
260 : 2399-2403) isolieft. Thomas, K. A., et al. Proc Natl Acad
Sci (USA) (1984) 81 : 357-361, US Patent Nr. 4 444 760 haben zwei
heterogene Formen eines sauren Rinderhirn-Fibroblast-
Wachstumfaktors mit Molekulargewichten von 16600 und 16800
Dalton gereinigt. Gospodarowicz und Mitarbeiter haben die
Anwesenheit von Aktivität des basischen
Fibroblastwachstumsfaktors sowohl in Rinderhirnen als auch Hypophysen
gezeigt und haben diese Proteine unter Verwendung von
Heparinaffinitätschromatographie in Verbindung mit anderen
Aufreinigungstechniken gereinigt (Bohlen, P., et al. Proc Natl
Acad Sci (USA) (1984) 81 : 5364-5368; Gospodarowicz, D., et al.
(ibid) 6963-6967). Diese Faktoren haben ebenfalls
Molekulargewichte von ungefähr 16 kDa, wie ein ähnlicher
Faktor, der aus humaner Plazenta isoliert wurde (Gospodarcwicz,
D., et al. Biochem Biophys Pes Comm (1985) 128 : 554-562).
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Bohlen et al. haben ebenfalls die Isolierung eines basischen
FGF aus humanem Gehirn und eine teilweise Charakterisierung
einschließlich einer teilweisen amino-terminalen Sequenz
beschrieben (Federation of European Chemical Societies, Letter
(1985) 185 : 177-181).
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Die vollständige Sequenz des aus Rinderhypophyse erhaltenem
basischen FGF ist ermittelt worden (Esch, F., et al., Proc Natl
Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6507-6511). Es wurden homogene
Präparationen erhalten, die potente mitogene Aktivität in in
vitro Versuchen mit Endothelzellen zeigten (basischer FGF
besitzt eine ED&sub5;&sub0; von 60 pg/ml).
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Ein saurer FGF besitzt eine ED&sub5;&sub0; von ungefähr 6000 pg/ml. Eine
N-terminale Sequenz für aus Rinderhirngewebe erhaltenem sauren
FGF wurde von Bohlen, P., et al. EMBO J (1985) 4 : 1951-1956)
bestimmt. Gimenez-Gallego, G., et al. haben die N-terminale
Sequenz sowohl den sauren als auch den basischen FGF, die aus
humanem Gehirn präpariert wurden, bestimmt und diese mit der
Rindersequenz verglichen (Biochem Biophys Res Comm (1986)
135 : 541-548). Ihre Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den
hier offenbarten. Ebenso wurde die vollständige
Aminosäuresequenz von aus Rindergehirn erhaltenem sauren FGF
aus dem isolierten Protein bestimmt (Gimenez-Gallego, G.,
Science (1985) 230 : 1385-1388; Esch F., et al. Biochem Biophys
Res Comm (1985) 133 : 554-562). Diese beiden Bestimmungen stimmen
mit der Ausnahme einer einzelnen Aminosäure überein. Im
Anschluß an vieles der hier beschriebene Arbeit wurde die
vollständige Aminosäuresequenz von humanem sauren FGF aus dem
Gen abgeleitet (Jaye, M., et al. in press).
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Die oben beschriebenen FGF-Proteine und andere
Wachstumsfaktoren sind eindeutig wirksam in der der Förderung
der Heilung von Gewebe, das einem Trauma ausgesetzt ist (siehe
z. B. Sporn, M.B., et al. Science (1983) 219 : 1329-1331;
Davidson, J.M., et al. J.C.B. (1985) 100 : 1219-12279; Thomas,
K.A., et al. Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6409-6413).
Davidson et al. (supra) haben insbesondere die Wirksamkeit in
der Wundheilung offenbart. Für die nativen Proteine des
basischen FGF wurde behauptet, das sie bei der Behandlung von
Herzinfarkten wirksam sind (Svet-Moldavsky, G.J., et al. Lancet
(23. April, 1977) 913; US-Patente 4 296 100 und 4 378 347).
Zusätzlich wurde gefunden, daß humaner basischer FGF das
Überleben von Neuronen und die Neuritenextension in fötalen
Rattenhippocampusneuronen vergrößert (Walicke, P., et al. Proc
Natl Acad Sci (USA) (1986) 83 : 3012-3016), nahelegend, daß diese
Faktoren ebenfalls nützlich in der Behandlung von degenerativen
neurologischen Krankheiten sein können, wie zum Beispiel bei
der Alzheimerschen und der Parkinsonschen Krankheit.
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Es sollte daher erwünscht sein, die Verfügbarkeit dieser FGF-
Proteine in großen Mengen und in einer Form, die frei von
irgendwelchen giftigen oder infektiösen Verunreinigungen ist,
sicherzustellen. Die humane Form dieser Proteine wird bevorzugt
und für die therapeutische Verwendung möglicherweise
erforderlich. Die praktische Verfügbarkeit aus natürlichen
humanen Quellen kann offenbar nicht erreicht werden, da zum
Beispiel die Herstellung einer reinen Präparation eine ungefähr
eine 35000fache Aufreinigung erfordert. Selbst wenn menschliche
Leichen eine weitere praktische Quelle darstellen, könnte die
vollständige Reinigung infolge der Möglichkeit der Übertragung
von AIDS, Hepatitis oder anderen Krankheiten kritisch sein. Die
Erfahrung mit dem Creutzfeld-Jakob-Syndrom (Powell-Jackson et
al. Lancet (1985) ii:244-246) vo kurzem schließen die
Verwendung von humanen Hypophysen als eine Quelle aus. Deshalb
sind rekombinante Techniken insbesondere für die Herstellung
dieser Proteine geeignet. Die vorliegende Erfindung stellt die
Mittel zur Verfügung, durch die basischer humaner FGF in
brauchbaren Mengen und in reiner unkontaminierter Form erhalten
werden können.
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Die Erfindung liefert die Mittel zur Synthese und zur
Behandlung von humanem basischem Fibroblast-Wachstumsfaktor,
der bei der Beschleunigung von Heilung von Wunden,
Knochenfrakturen, verbranntem Gewebe, beschädigtigtem
myocardialem Gewebe, degeneriertem neurologischem Gewebe oder
einer anderen Verletzung von Nutzen ist. Die Expression des
Gens, das diesen Faktor kodiert, wird durch die Verfahren und
die Materialien der Erfindung bereitgestellt.
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Die Erfindung liefert humanen basischen FGF, der durch die
Expression in einer rekombinanten bakteriellen Wirtszelle einer
DNA-Sequenz, die die Sequenz von Codons, die mit 16-146 in
Fig. 4 beziffert sind, umfaßt, erhalten wird, und
pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine effektive Menge
eines solchen humanen basischen FGF in einer Mischung mit
wenigstens einem pharamzeutisch akzeptablen Trägermaterial,
umfaßt.
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Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur
Herstellung von humanem basischem FGF, das in einer
rekombinanten bakteriellen Wirtszelle die Expression einer DNA-
Sequenz, die die Sequenz von Codons, die mit 16-146 in Fig. 4
beziffert sind, umfaßt, und die Gewinnung von basischem humanem
FGF umfaßt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Fig. 1 bis 4 zeigen die DNA-Sequenzen, die den sauren
bFGF, den sauren hFGF, den basischen bFGF und basischen hFGF
kodieren und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Fig.
1a zeigt die teilweise Sequenz des basischen Rinder-FGF; Fig.
1b zeigt die vollständige Aminosäuresequenz dieses Proteins.
Fig. 2 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz und die cDNA-
Sequenz, die den humanen basischen FGF codieren, wie von Jaye
et al. beschrieben.
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Fig. 5 zeigt die Oligonukleotidsonden 889/890, 891 und 853-856,
wurden die nach der N-terminalen Sequenz des sauren bFGF
entworfen.
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Fig. 6 zeigt die Restriktionskarten der Inserts für die
genomischen sauren bFGF-Klone LambdaBA2 und LambdaBA3.
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Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz der genomischen Sonde 250/AluI des
sauren Rinder-FGF.
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Fig. 8 zeigt die basische FGF-Sonde 1097/1098.
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Fig. 9 zeigt die Restriktionskarte des cDNA-Klons LambdaBB2 des
basischen bFGF.
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Fig. 10 zeigt die Karte des humanen basischen FGF kodierenden
Gens.
A. Die Fibroblast-Wachstumsfaktoren
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Zwei verschiedene Rinder- (und analoge humane) Fibroblast-
Wachstumsfaktoren wurden durch andere bis zur Homogenität
aufgereinigt und teilweise oder vollständig sequenziert. Beide
Faktoren sind fähig zur mitogenen Aktivität in in vitro
Versuchen unter Verwendung von Kulturzellen, wie z. B. aus
Rinderhirn und aus der Nebennierenrinde stammenden kapillaren
Endothelzellen, humanen Endothelizellen der Nabelvene, Zellen
aus der Nebennierenrinde des Rindes, Granulosazellen und
Gefäßzellen in der glatten Muskulatur. In vitro Versuche, bei
denen diese Zellkulturen verwendet wurden, wurden von
Gospodarowicz, D., et al. J Cell Physiol (1985) 122 : 323-332;
und Gospodarowicz, D., et al. J Cell Biol (1983) 97 : 1677-1685
beschrieben. Vor kurzem wurden alternative in vitro Versuche
von Esch et al. Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6507-6511
und von Gospodarowicz, D., et al. J Cell Physiol (1986)
127 : 121-136 beschrieben. Für gereinigten basischen FGF wurde
gezeigt, daß er in vivo in einem Versuch mit einer
Chorioallantoinmembran des Huhnes angiogen ist. (Gospodarowicz,
D. in Hormonal Proteins and Peptides XII:205-230 (Academic
Press)). Für gereinigten sauren bFGF wurde gezeigt, daß er in
vivo in dem gleichen Versuch angiogen ist (Thomas, K.A., et al.
Proc Natl Acad Sci (supra)).
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Basischer FGF aus der Rinderhypophse wurde vollständig
sequenziert und wird in Fig. 3 gezeigt; die humane Sequenz,
die hier aus genomischer und cDNA bestimmt wurde, wird in Fig.
4 gezeigt. Die Primärsequenzen enthalten 146 Aminosäuren,
beginnend mit dem Prolinrest beziffert mit "1" in den Figuren,
und stimmen mit der Sequenz für den N-Terminus des nativen
Rinderproteins von Giminez-Gallego et al. Biochem Biophys Res
Comm (supra) und mit der Sequenz, die für das vollständige
native Protein von Esch, Proc Natl Acad Sci (supra) beschrieben
wurde, überein. Ein humaner basischer FGF mit einem höheren
Molekulargewicht wurde aus der humanen Hepatomzellinie, SK-Hep-
1, von Sullivan, R.J., et al. J Cell Biol (1985) 101 : 108a und
von Klagsbrun, M., et al. Proc Natl Acad Sci (USA) (1986)
83 : 2448-2452 beschrieben. Die Translation der 3'-5'-Sequenz in
Fig. 3 und 4 zurück an ein ATG-Startcodon in sowohl humaner
als auch Rinder-DNA, zeigt, daß es wahrscheinlich ist, daß eine
zusätzliche Form von jedem Protein, das die Aminosäuren
oberhalb des Prolins enthält, das als Rest 1 in Fig. 3 und 4
gezeigt wird, ebenfalls hergestellt wird. Es gibt 9 3'-5'-
Codons in den DNAs, einschließlich des ATG. Es kann
berechtigterweise als sicher gelten, daß das Methionin, das
durch das ATG kodiert wird, einem weiteren Prozess unterworfen
wird, wenn das Gen in eukaryontischen Systemen exprimiert wird.
Ein solcher Prozess kann oder kann nicht vorkommen, wenn das
Gen rekombinant in bakteriellen Systemen exprimiert wird. Daher
enthält die lange Form des Proteins eine zusätzliche
Aminosäureprosequenz oder eine Gesamtzahl von 154 Aminosäuren.
Es wurde ebenfalls gezeigt, daß dieses erweiterte FGF, wie es
aus SK-Hep-1 Zellen isoliert wurde, am N-Terminus blockiert ist
(Klagsbrun, M. et al. (supra)).
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Proteine, die in den oben genannten in vitro Versuchen eine
FGF-Aktivität haben und die eine ähnliche vermeintliche N-
terminale Sequenz mit dem basischen FGF aus Rinderhypophysen,
der in Fig. 3 gezeigt ist (die Form mit 146 Aminosäuren),
gemeinsam haben, sind ebenfalls aus Hirn, Nebennierendrüse,
Corpus luteum, Retina, Nieren des Rindes und aus humaner
Plazenta isoliert worden. Das native Protein, das aus
bestimmten von diesen Geweben erhalten wurde, ist heterogen -
eine zweiten Form der die vermeintlichen fünfzehn N-terminalen
Aminosäuren fehlen, behält die Aktivität. (Gospodarowicz, D.,
Meth Enz (1986) in press). Es wird deshalb angenommen, daß
Rinder- und humane basische FGF in drei Formen vorkommen -
diese sind als ausgereifte Formen in Fig. 3 und 4 gezeigt,
längere Formen enthalten acht zusätzliche Aminosäuren am N-
Terminus und kürzeren Formen fehlen fünfzehn Aminosäuren der
gezeigten vermeintlichen ausgereiften Sequenz. Daher wird
angenommen, daß die nativ hergestellten "langen" basischen FGF
154 Aminosäuren enthalten, "primäre" basische FGF 146
Aminosäuren enthalten und "kurze" basische FGF 131 Aminosäuren
enthalten. Diese FGFs werden als basisch bezeichnet, weil sie
eine hohe Anzahl von basischen Aminosäureresten (Lysin,
Arginin, Histidin) enthalten und deshalb bei neutralem pH-Wert
Kationen sind.
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Ein Protein wird hier als basischer FGF definiert, wenn es FGF-
Aktivität in den oben erwähnten Versuchen zeigt, an Heparin
bindet, ein Kation bei neutralem pH-Wert ist und immunologisch
mit Antikörpern reagiert, die unter Verwendung eines
synthetischen Analogon der aminoterminalen Sequenz [tyr¹&sup0;] FGF
(1-10) hergestellt wurde, das mit Rinderserumalbumin (wenn es
geeignet ist) oder an andere Antikörpern, die gegen Rinder-
oder humanen FGF hergestellt wurden, oder deren synthetische
oder native Peptiden konjugiert ist. Siehe Baird, A., et al.
Regulatory Peptides (1985) 10 : 309-317.
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Saurer FGF wurde von anderen aus Rinderhirn isoliert und die
ersten 34 Aminosäuren wurden bestimmt. Die hier beschriebene
Klonierung der Gene für Rinder- und humanen sauren FGF erlaubte
es, die Aminosäuresequenzen zusätzlich zu 1-34 für den sauren
bFGF abzuleiten, wie in Fig. 1a gezeigt, und eine teilweise
Sequenz für den sauren hFGF wurde, wie in Fig. 2a gezeigt,
erhalten. Im Anschluß an vieles der unten beschriebenen Arbeit
wurde die vollständige Aminosäuresequenz von Esch et al.
Biochem Biophys Res Comm (supra) und von Gimenez-Gallego, G.,
et al. Science (supra), wie in Fig. 1b, beschrieben. Ebenfalls
nach den meisten der vorliegenden Arbeit wurde die vollständige
kodierende Sequenz für den sauren hFGF durch die Maciag Gruppe
bestimmt, wie in Fig. 2b gezeigt.
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Das saure Protein hat ebenfalls zwei bekannte aktive Formen,
eine mit der 140 Aminosäurensequenz, die an dem
Phenylalaninrest, der mit "1" beziffert ist, beginnt und eine
zweite kürzere Form, die den Aminosäuren 7-140 entspricht.
Sowohl das Rinder- als auch das humane Protein können in N-
terminal erweiterten Formen vorkommen.
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Die Translation der DNA oberhalb des Codons für die Aminosäure,
die mit "1" in den Figuren beziffert ist (rückwärts von dem
ATG-Startcodon bei -15, gezeigt in Klammern) stellt die
zusätzliche Sequenz des erweiterten Proteins dar. Wie im Fall
des basischen FGF, wird das N-terminale Methionin
wegprozessiert in eukaryontischen Expressionswirten, obwohl
dies nicht der Fall sein muß, wenn das Gen in Bakterien
exprimiert wird. Deshalb kann, ähnlich dem oben beschriebenen
basischen FGF, das native Protein in drei aktiven Formen
vorkommen: ein gekürztes, d. h., ein "kurzes" saures FGF, das
134 Aminosäuren enthält; ein N-terminal erweitertes, d. h. eine
"lange" Form, die 154 Aminosäuren enthält; und das andere ein
primärer saurer FGF, der 140 Aminosäuren enthält, der an dem
Rest beginnt, der mit "1" in den Figuren beziffert ist. Es
wurde von Burgess, W.H., et al., (in press) gezeigt, daß die
lange Form aus Rinderhirn durch eine Acetylrest blockiert wird.
Diese Proteine enthalten eine disproportionale Anzahl an sauren
Aminosäureresten, d. h. Glutamin- und Asparaginsäure und die
Proteine sind deshalb bei neutralem pH-Wert Anionen.
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Ein Protein wird hier als saurer FGF definiert, wenn er FGF-
Aktivität in in vitro Versuchen zeigt, an Heparin bindet, bei
neutralem pH-Wert ein Anion ist, und immunologisch mit
Antikörpern reagiert, die gegen sauren humanen oder sauren
Rinder-FGF oder gegen deren synthetische oder native Peptide
hergestellt sind.
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Saurer FGF und basischer FGF werden daher hier so verwendet, um
die obigen Proteine oder Proteine mit einer Aminosäuresequenz,
die durch die repräsentiert werden, die in den Fig. 1 bis 4
gezeigt sind, kennzeichnen. Natürlich sind diese Definitionen
nicht auf die gezeigten spezifischen Sequenzen beschränkt,
sondern schließen Proteine ein, die zufällig oder bewußt
induzierte Abänderungen enthalten, wie zum Beispiel Deletionen,
Additionen oder Auswechselungen von Aminosäureresten, solange
sich die biologische Aktivität, wie sie durch die oben
erwähnten in vitro oder immunologischen Versuche gemessen wird,
und sich der jeweilige anionsche oder kationische Charakter bei
neutralem pH-Wert nicht ändert. Natürlich können modifizierte
Formen eine leicht geänderte quantitative Aktivität und
Spezifität besitzen.
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"Gereinigt" oder "rein" bezieht sich auf ein Material, das frei
von Substanzen ist, die es normalerweise begleiten, wenn es in
seinem nativen Zustand gefunden wird. Ein solcher "reiner"
saurer hFGF bezieht sich zum Beispiel auf einen sauren hFGF,
der keinerlei Material enthält, das normalerweise mit seiner in
situ Umgebung in humanem Hirn oder Hypophyse verbunden ist.
Natürlich kann saurer hFGF Materialien einschließen, die mit
ihm kovalent verbinden sind, wie zum Beispiel Glykosidreste.
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"Wirksam verbunden" bezieht sich auf eine
Nebeneinanderstellung, wobei die Komponenten so konfiguriert
sind, daß sie ihre gewöhnliche Funktion ausüben. So sind
Kontrollsequenzen oder Promotoren, die wirksam mit einer
kodierenden Sequenz verbunden sind, fähig, die Expression der
kodierenden Sequenz zu bewirken.
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"Kontrollsequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz oder
Sequenzen, die fähig sind, wenn sie richtig mit der gewünschten
kodierenden Sequenz ligiert sind, ihre Expression in Wirten,
die kompatibel mit solchen Sequenzen sind, zu bewirken. Solche
Kontrollsequenzen umfassen zumindest Promotoren sowohl in
prokaryontischen als auch eukaryontischen Wirten, und wahlweise
Transkriptionsterminationssignale. Zusätzliche Faktoren, die
nötig oder hilfreich in der Durchführung der Expression sind,
können ebenfalls identifiziert werden. Wie hier verwendet,
beziehen sich "Kontrollsequenzen" einfach auf irgendwelche DNA-
Sequenzen, die benötigt werden, um die Expression in dem
speziellen verwendeten Wirt zu bewirken.
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"Zellen" oder "Zellkulturen" oder "rekombinante Wirtszellen"
oder "Wirtszellen" werden häufig austauschbar verwendet, wie
aus dem Zusammenhang klar hervorgehen wird. Diese Begriffe
schließen die unmittelbare Grundzelle und natürlich deren
Nachkommen ein. Es versteht sich, daß nicht alle Nachkommen
genau identisch mit den Elternzellen, infolge von zufälligen
Mutationen und unterschiedlichen Umgebungsbedingungen, sind.
Jedoch sind diese veränderten Nachkommen in diesen Begriffen
eingeschlossen so lange wie die Nachkommen die Eigenschaften
behalten, die denen entsprechen, die auf die Original
transformierte Zelle übertragen wurden. In dem vorliegenden
Fall kann zum Beispiel eine solche Eigenschaft die Fähigkeit
sein, rekombinanten FGF herzustellen.
B. Allgemeine Beschreibung
Verwendung und Verabreichung
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Der humane basische Fibroblast-Wachstumsfaktor ist in
Unterstützung der Wundheilung nutzbar und dieser kann
desweiteren in ausreichend reinen Mengen genommen werden, um
die Bildung von Inhibitoren, die spezifisch für ihn sind, zu
ermöglichen. Der gereinigte Wachtumsfaktor wird im allgemeinen
lokal dem traumatisierten Gewebe zugeführt, um die
Vaskularisation und die Heilung zu stimulieren. Geeignete
Anwendungen sind Verbrennungen, Wunden, Knochenfrakturen,
operative Eingriffe, wie zum Beispiel die plastische Chirurgie,
oder andere, die der Wiederherstellung eines Gewebes bedürfen.
Weil die Anwendung dieser Faktoren die Heilung beschleunigt,
reduzieren sie damit das Risiko einer Infektion.
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Indikationen, wobei FGF in der Unterstützung der
Neovaskularization von Wert ist, schließen muskular-skeletale
Zustände, wie zum Beispiel Knochenfrakturen, Bänderriß und
Sehnenwiederherstellung, Sehnenentzündung und
Schleimbeutelentzündung; Hautzustände, wie zum Beispiel
Verbrennungen, Schnitte, Rißwunden, wundgelegene Stellen und
langsam heilende Geschwüre, wie zum Beispiel die, die bei
Diabetikern beobachtet werden; und bei Gewebewiederherstellung
während Ischaemie und Herzinfarkten, ein.
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Zusammensetzungen des rekombinant hergestellten
Wachstumsfaktors unter Verwendung von verfügbaren
Trägermaterialien und Trägern werden nach Standardverfahren
hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Das
Protein kann in Zusammensetzungen Verwendung finden, wie
Lotionen, wie Gele, als Teil von kontrollierten
Freisetzungssystemen oder von Salben mit zusätzlichen aktiven
Bestandteilen, wie zum Beispiel Antibiotika, wenn es erwünscht
ist.
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Für die lokale Verabreichung, die im Hinblick auf äußerliche
Verletzungen am geeignetsten ist, werden lokale
Standardzusammensetzungen verwendet, unter Verwendung von zum
Beispiel 0,1 bis 10%igen Lösungen. Solche Lösungen sollten 3-6
Mal am Tag auf den betroffenen Bereich aufgetragen werden. Die
Konzentration der Salbe hängt natürlich von der Schwere der
Wunde und der Natur des Subjekts ab. In den meisten Protokollen
wird die Dosis mit der Zeit verringert, um die die
Wahrscheinlichkeit der Vernarbung erniedrigen. Zum Beispiel
werden die schwersten Verwundungen, wie zum Beispiel
Verbrennungen dritten Grades, typischerweise mit einer 10%igen
Zusammensetzung behandelt, aber wenn die Heilung beginnt, wird
die Dosis progressiv auf ungefähr 0,1% oder geringere Werte,
wenn die Wunde heilt, gesenkt. Eine lokale Zusammensetzung für
die lokale Anwendung des EGF unter Verwendung von BSA als
Träger ist von Franklin, J.D., et al., Plastic and Reconstruc
Surg (1979) 64 : 766-770 beschrieben.
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Für Knochen- und Gewebewiederherstellung wird eine lokale
Verabreichung durch Mittel wie subkutane Implantate oder
Zusammensetzungen mit langsamer Abgabe, die unmittelbar in der
Nähe des Zielortes implantiert sind, bevorzugt. Operationen
können bei solche Zuständen wie Knochenverletzungen notwendig
sein, so daß Implantationen unmittelbar praktikabel sind.
Formen mit langsamer Freisetzung können in Polymeren, wie zum
Beispiel Hydron (Langer, R. et al., Nature (1976) 263 : 797-799)
oder Elvax 40P (Dupont) (Murray, J.B., et al., In Vitro (1983)
19 : 743-747), formuliert werden. Andere langanhaltende
Freisetzungssysteme wurden von Hsieh, D.S.T., et al., J Pharm
Sci (1983) 72 : 17-22 vorgeschlagen und eine Zusammensetzung,
speziell für den epidermalen Wachstumfaktor, aber nicht in der
vorliegenden Erfindung bevorzugt, wurde von Buckley, A., Proc
Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 7340-7344 vorgeschlagen.
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Wie für die lokale Verabreichung hängt für langanhaltende
Freisetzungssysteme die Konzentration des FGF in der
Zusammensetzung von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich
die Schwere des Zustandes und der Rate der FGF-Abgabe aus dem
Polymer, ab. Im allgemeinen sind die Zusammensetzungen so
konstruiert, daß eine konstante örtliche Konzentration von
ungefähr 100 Mal über dem Serumniveau der Hormone oder 10 Mal
über der Gewebekonzentration erreicht wird, wie von Buckley et
al. Proc Natl Acad Sci (supra) beschrieben. Basierend auf der
FGF-Konzentration im Gewebe von 5-50 ng/g Naßgewicht
(vergleichbar mit EGF bei 60 ng/g Naßgewicht) ist eine
Freisetzung von 50-5000 ng FGF pro Stunde akzeptabel. Die
Anfangskonzentration ist natürlich abhängig von der Schwere der
Verwundung.
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Es ist zu erwarten, daß das FGF zusammen und sogar
synergistisch mit anderen Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel
dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den transformierenden
Wachstumsfaktoren (TFG-α oder TGF-β), den Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktoren (IGF-1 und IGF-2) und/oder dem von
Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), wirken kann.
Zusätzlich, insbesondere für die Wiederherstellung des
Knochens, kann es synergistisch Antagonisten des
Parathyroidhormons wirken, da Parathyroidhormone die
Knochenresorption fördern. Deshalb sind ebenfalls in die
Zusammensetzungen und Verabreichungsprotokolle der Erfindung
Ausführungsformen miteingeschlossen, bei denen das FGF der
Erfindung in der gleichen Zusammensetzung mit oder in dem
gleichen Protokoll mit einer oder mehreren der vorgenannten
Faktoren verabreicht wird, und so effektiver die gewünschte
Gewebewiederherstellung zu erreichen.
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Weil FGF wirksam das Wachsen der Neuriten, die
Nervenregeneration und das Überleben von Neuronen fördert, kann
es bei der Behandlung von bestimmten neurologischen Krankheiten
hilfsreich sein, wie zum Beispiel der Alzheimerschen und der
Parkinsonschen Krankheit, der amyotrophen lateralen Sklerose
und allgemeinem Altern des Nervensystems, ebenso wie bei
traumatischen Verletzungen des Rückenmarks und peripherer
Nerven.
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Die Verabreichung des Mittels bei diesen Indikationen wird
bevorzugt durch Einbringen in Zusammensetzungen durchgeführt,
die ähnlich denen sind, die oben in Verbindung mit Wundheilung
genannt sind. Das Mittel kann ebenfalls mittels Implantation
von Zellkulturen, wie sie in der Transplantationstherapie durch
Behandlung der Kulturen vor der Transplantation mit den FGF-
Präparationen der Erfindung, abgegeben werden. Zusätzlich kann
der FGF unmittelbar in die Rückenmarksflüssigkeit injiziert
oder kann systemisch angewendet werden. Systemische
Formulatierungen sind im allgemeinen nach dem Stand der Technik
bekannt und schließen die Zusammensetzung in Puffer oder
physiologischer Salzlösungen oder anderen geeigneten
Trägermaterialien ein. Dosierungsniveaus sind geeigneterweise
die der Wundheilung; bei Zellkulturen oder der Erhaltung eines
Explantates kann es jedoch mit 0,1-10 ng/ml Serum oder
Kulturmedium angewendet werden.
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FGF Proteine sind insbesondere auch nützlich in der Hilfe der
Reformierung und Wiederherstellung von Geweben, die während
einer Operation verletzt werden. Für diese Verwendung, kann es
hilfreich sein, die FGF-Proteine in Polymere, die als operative
Klammern verwendet werden, einzubetten. Die Proteine sind somit
fähig, auf biologische Weise die mechanische Naht, die durch
die Klammern bewirkt wird, zu ergänzen und den natürlichen
Heilungsprozess in den wiederhergestellten Geweben zu
unterstützen und zu begünstigen.
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Zusätzlich wurde gezeigt, daß angiogene Stimuli, wie zum
Beispiel die, die durch die hier diskutierten FGF-Proteine
geleistet werden, in der Freisetzung von
Gewebsplasminogenaktivators (tPA) und von Kollagenase in vitro
resultieren (Gross, J.L., et al., Proc Natl Acad Sci (USA)
(1983) 80 : 2623-2627). Deshalb sind die FGF-Proteine der
Erfindung ebenfalls nützlich bei der Behandlung von Zuständen,
die auf diese Enzyme reagieren. Während es in akuten
Situationen (wie zum Beispiel das Vorhandensein eine
Blutgerinsels verbunden mit einem Schlag- oder Herzanfall)
notwendig sein kann, unmittelbar hohe Dosen von tPA, um die
Blutgerinsel aufzulösen, zu verabreichen, kann für chronische
die Behandlung einer chronischen Neigung, Embolien zu bilden,
eine Verabreichung von FGF wünschenswert sein, um ein
geeignetes Niveau von tPA in dem Blutfluß aufrechtzuerhalten.
Deshalb wird für diese Indikation die systemische Verabreichung
des Mittels unter Verwendung von herkömmlichen Hilfsmitteln,
wie zum Beispiel intramuskuläre oder intravenöse Injektion,
bevorzugt.
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Die Erfindung stellt praktische Mengen an reinem humanem
basischem FGF Wachstumsfaktor für die Verwendung in Verbindung
mit den vorhergehenden Indikatione bereit. Basischer FGF kann,
wie hier beschrieben, in langer, primärer und kurzer Form
vorkommen. Es wurde gefunden, daß das N-terminale Methionin der
langen Form wegprozessiert wird, wenn das Protein in
eukaryontischen Systemen produziert wird, und daß der
nachfolgende Aminosäurerest wahrscheinlich durch Acetylierung,
nach der Translation, derivatisiert wird.
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Auch wenn der FGF in seinen verschiedenen Formen keine
erkennbare Signalsequenz besitzt, muß er auf irgendeine Weise
selektiert werden, da er außerhalb der Zellen, die ihn
herstellen, an einem membranangebundenen Rezeptor wirkt.
Deshalb, weil er wahrscheinlich nicht durch einen bekannten
konstituiven Sekretionsweg sekretiert wird, wird seine
Sekretion durch andere Mittel geführt, wie zum Beispiel durch
Zellyse oder durch Exocytose. Für die meisten Gewebe, aus denen
FGF natürlicherweise herkommt; und für viele
Säugetierexpressionssysteme kann eine solche Freisetzung durch
Sicherung der Exocytose mit einen Kalziumionophor, wie zum
Beispiel dem üblicherweise verwendeten A23187 (CalBiochem),
erreicht werden, der, in in vitro Bedingungen, zu dem
Kulturmedium in Konzentrationen von 1-10 uM in der Anwesenheit
von 1 mM CaCl&sub2; zugegeben wird. Für Expressionssysteme, die aus
Makrophagen oder Monocyten stammen, wurden andere
Aktivierungsmethoden als effektiv nachgewiesen, wie zum
Beispiel die Zugabe von 10 ug/ml Lipopolysaccharid (LPS) oder
die Zugabe von E.coli Endotoxin (Difco) (300 ng/ml). Für diese
Stimulatoren wurde gezeigt, daß sie den analogen Faktor
Interleukin-1 aus Makrophagen freisetzen, March, C.J., et al.,
Nature (1985) 315 : 641-647. Diese Techniken können ebenfalls für
die Freisetzung von rekombinant hergestellten FGF-Proteinen
verwendet werden, wenn sie ohne hinzugeführte Signalsequenzen,
wie unten beschrieben, intrazellulär hergestellt werden.
Zusätzliche Stimulatoren zur Freisetzung von intrazellulär
hergestellten Proteinen umfassen die Phorbolester und die
Triglyceride.
Auffinden des Gens
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Die allgemeine Vorgehensweise mit der die dargestellte
kodierende Sequenz für den humanen basischen FGF hier erhalten
wurde, ist die folgende. Die bekannte N-terminale Sequenz des
sauren Rinder-FGF wurde verwendet, um eine Serie von Sonden,
für die Verwendung mit einer Rindergenomgenbank, die in den
Phagen ligiert ist, zu entwerfen. Phagenrekombinanten, die mit
diesen Sonden hybridisierten, wurden aus der Genbank isoliert
und zu kleineren Fragmenten, die zur Klonierung in den M13-
Klonierungsvektor geeignet sind, um eine "natürliche" Sonde zu
erhalten, verdaut. Dies ergab eine M13-Sonde, die eine 250 Bp
Sequenz enthielt, die mit einem Teil des sauren Rinderproteins
korrespondierte; diese Sonde ist von zentraler Bedeutung, um
die Gene für die basische Form in diesen Spezies zu erhalten.
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Kurz gesagt, die Fragmente, die durch einen AluI-Verdau eines
ausgewählten sauren bFGF-Genfragments, die in einen Phagen
kloniert worden waren, wurden in M13 Shotgun-kloniert und ein
250 Bp Fragment, das mit einer geeigneten DNA-Sonde
hybridisierte, wurde ausgewählt und sequenziert. Dieses, als
250/AluI bezeichnet, wurde in pBR322 transferriert und wurde
verwendet, um Sonden für die basische Form zu entwerfen, unter
Ausnutzung der verfügbaren Aminosäuresequenzinformation, um die
DNA so zu verändern, damit sie eher zu der basischen als zu
der sauren Form korrespondiert. Die modifizierte Sonde, die so
auf der Basis eines Vergleichs der sauren bFGF N-terminalen
kodierenden Sequenz und der basischen bFGF Aminosäuresequenz
entworfen wurde, wurde verwendet, um eine cDNA-Genbank aus
Rinderhypophyse für die cDNA von basischem FGF zu untersuchen.
Der aufgefundene Rinderklon wurde dann verwendet, um die humane
genomische und cDNA Genbank zu untersuchen, um die genomische
Sequenz, die die kodierende DNA für humanen basischen FGF
kodiert, aufzufinden. Alternativ wurde der Rinder cDNA-Klon
LambdaBB2 mutagenisiert, um die DNA-Sequenz in eine
umzuwandeln, die die humane Form des basischen FGF-Proteins
kodiert. Die cDNA und genomischen Klone, die weiter unten
beschrieben werden, sind nützlich zur Untersuchung von DNA-
Genbanken, die aus verschiedenen Spezies hergestellt wurden, um
die analogen kodierenden Sequenzen aus verschiedenen
Säugetiergenbanken für den basischen FGF zu erhalten;
zusätzlich sine die genomischen Klone zur Expression in
Säugetiersystemen fähig und könnten zu besseren Ergebnissen als
die entsprechenden cDNAs führen. cDNA-Genbanken, die aus
verschiedenen Geweben, wie zum Beispiel aus Hypophsye, Hirn,
Hypothalamus oder Niere hergestellt wurden, können ebenfalls in
dieser Weise gescreent werden.
Expression der FGF-Gene
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Die klonierten genomischen oder cDNA Sequenzen können in
geeigneten Expressionssystemen exprimiert werden. Natürlich muß
für die hier offenbarten DNAs das oben erwähnte Protokoll zu
deren Auffinden nicht wiederholt werden, sondern übliche
chemische Syntheseverfahren können geeigneterweise verwendet
werden. cDNA Sequenzen können mit geeigneten Kontrollen
versehen sein, die für jeden Wirt, einschließlich Bakterien,
Hefen oder eukaryontische Zellen, geeignet sind. Genomische
Sequenzen, die Introns enthalten, können unter Verwendung von
eukaryontischen Kontrollsequenzen und eukaryontischen Wirten,
die fähig sind, die Transkripte zu spleißen, exprimiert werden.
Auf Vaccinia basierende Expressionssysteme können ebenfalls
verwendet werden. Exemplarische für Kontrollsequenz-DNAS und
Wirte werden unter Paragraph C.1 unten angegeben.
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Insbesondere kann eine vollständige DNA, die humanen basischen
FGF in voller Länge kodiert, konstruiert werden, zum Beispiel
unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten und
synthetischen Verfahren, um irgendeine der langen, primären
oder kurzen Form des humanen basischen FGF zu erhalten.
Heterologe Signalsequenzen können ebenfalls mit diesen
fusioniert sein, und um die bekannte Beziehung zwischen der
Signalsequenz und der Schnittstelle auszunutzen, um das Protein
in der gewünschten Form zuerhalten. Intrazellulär hergestellte
Formen des Proteins können erhalten werden, durch Zellyse oder
ihre Freisetzung kann in der oben beschriebenen Weise
stimuliert werden.
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Das so hergestellte rekombinante humane basische FGF-Protein,
wird dann in einer Weise, die ähnlich der ist, die für die
Reinigung des FGF aus natürlichen Quellen verwendet wird,
gereinigt, aber die Reinigung ist beträchtlich einfacher, da
die Proteine einen wesentlich größeren Anteile am
Ausgangsmaterial besitzen.
C. Standardverfahren
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Die meisten Techniken, die zur Transformation von Zellen, zur
Vektorkonstruktion, zur Extraktion von Messenger-RNA, zur
Herstellung von DNA-Genbanken und dergleichen verwendet werden,
werden allgemein in der Praxis angewendet und die meisten
Anwender sind mit den Standardquellenmaterialien vertraut, die
spezielle Bedingungen und Durchführungen beschreiben. Aus
praktischen Gründen können jedoch die folgenden Paragraphen als
Richtlinie dienen.
C.1. Wirte und Kontrollsequenzen
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Prokaryontische Systeme können verwendet werden, um die FGF
kodierenden Sequenzen zu exprimieren; prokaryontische Wirte
sind natürlich für Klonierungsverfahren am zweckmäßigsten.
Prokaryonten werden am häufigsten durch verschiedene E.coli-
Stämme repräsentiert; es können jedoch auch andere mikrobielle
Stämme verwendet werden. Plasmidvektoren, die
Replikationsstellen, Selektionsmarker und Kontrollsequenzen
enthalten, die aus einer Spezies abgeleitet werden, die mit dem
Wirt kompatibel sind, werden verwendet; zum Beispiel wird
E.coli typischerweise unter Verwendung eines Abkömmlings von
bBR322 transformiert, einem Plasmid, das aus einer E.coli
Spezies von Bolivar, et al., Gene (1977) 2 : 95 abgeleitet wurde.
pBR322 enthält Genen mit Ampicillin- und Tetracyclinrestistenz
und liefert so eine Vielzahl von Selektionsmarkern, die
entweder bei der Konstruktion des gewünschten Vektors erhalten
oder entfernt werden können. Üblicherweise verwendete
prokaryontische Kontrollsequenzen, die hier definiert sind, um
Promotoren für die Transkriptionsinitiation, wahlweise mit
einem Operator, zusammen mit ribosomalen Bindestellensequenzen
zu erhalten, schließen solche üblicherweise verwendeten
Promotoren, wie das β-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-
(lac) Promotorsystem (Chang, et al., Nature (1977) 198 : 1056)
und das Tryptophan-(trp) Promotorsystem (Goeddel, et al.,
Nucleic Acids Res (1980) 8 : 4057) und den vom Lambda stammenden
PL
Promotor und N-Gen ribosomale Bindestellen (Shimatake, et
al., Nature (1981) 292 : 128) ein.
C. 2. Transformationen
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Abhangig von der verwendeten Wirtszelle, wird die
Transformation unter Verwendung von Standardtechniken, die für
solche Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die
Kalziumbehandlung, die Kalziumchlorid verwendet, wie von Cohen,
S.N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69 : 2110 beschrieben,
oder die RbCl&sub2; Methode, wie in Maniatis, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press,
S. 254 und Hanahan, D., J Mol Biol (1983) 166 : 557-580, können
für prokaryontische oder andere Zellen, die wesentliche
Zellwandbarrieren enthalten, verwendet werden.
C. 3. Vektorkonstruktion
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Für die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die
gewünschten kodierenden und Kontrollsequenzen enthalten, werden
Standardligations- und Restriktionstechniken verwendet, die im
Stand der Technik bekannt sind. Die isolierten Plasmide, die
DNA-Sequenzen oder die synthetisierten Oligonukleotide werden,
um die gewünschte Form zu erhalten, geschnitten, auf die
richtige Größe gebracht und wieder ligiert.
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Die DNA-Sequenzen, die den Vektor bilden, sind aus einer
Vielzahl von Quellen verfügbar. Backbone Vektoren und
Kontrollsysteme sind im allgemeinen auf verfügbaren Vektoren
enthalten, die für den größten Teil der Sequenzen bei der
Konstruktion verwendet werden. Typische Sequenzen wurden unter
C.1. oben genannt. Für die relevante kodierende Sequenz kann
und ist im allgemeinen auch die Initialkonstruktion eine Sache
des Wiederherstellen der geeigneten Sequenz aus cDNA- oder
genomischen DNA-Genbank. Ist jedoch die Sequenz einmal bekannt,
ist es möglich, die vollständige Gensequenz in vitro, ausgehend
von den einzelnen Nukleosidderivaten zu synthetisieren. Die
vollständige Gensequenz für Gene mit größerer Länge, z. B. 500-1000
Bp
kann durch Synthese von einzelnen überlappenden
komplementären Oligonukleotiden und Auffüllen der nicht
überlappenden Einzelstranganteile durch DNA-Polymerase in
Anwesenheit von Desoxyribonukleotidtriphosphaten, hergestellt
werden. Diese Vorgehensweise wurde erfolgreich für die
Konstruktion von verschiedenen Genen mit bekannter Sequenz
verwendet. Siehe zum Beispiel Edge, M.D., Nature (1981)
292 : 756; Nambair, K.P., et al., Science (1984) 223 : 1299; Jay,
Ernest, J Biol Chem (1984) 259 : 6311.
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Synthetische Oligonukleotide werden entweder durch die
Phosphotriestermethode, wie sie von Edge, et al., Nature
(supra) und Duckworth, et al., Nucleich Acids Res (1981) 9 : 1691
beschrieben wurde, oder durch die Phosphoramiditmethode, wie
sie von Beaucage, S.L. und Caruthers, M.H., Tet Lett (1981)
22 : 1859 und Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H., J Am Chem Soc
(1981) 103 : 3185 beschrieben wurde, hergestellt und können unter
Verwendung von handelsüblich verfügbaren automatischen
Oligonukleotidsyntheseapparaten hergestellt werden. Die
Kinasereaktion von Einzelsträngen vor dem Annealing oder für
die Markierung wird, durch Verwendung eines Überschusses
erreicht, z. B. ungefähr 10 Units an Polynukleotidkinase zu 1
nMol Substrat in der Anwesenheit von 10 mM Tris, pH 7,6, 10 mM
MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 1-2 mM ATP, 1,7 pmol τ³²P-ATP (2,9
mCi/mMol), 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA.
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Sind einmal die Komponenten der gewünschten Vektoren so
verfügbar, können sie unter Verwendung von Standardrestiktions-
und Ligationsverfahren herausgeschnitten und ligiert werden.
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Das spezifische Schneiden der DNA an bestimmten Stellen wird
durch die Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym
(oder Enymen) unter Bedingungen, die im allgemeinen gut im
Stand der Technik verstanden sind, und die mit den
Besonderheiten, die von den Herstellern dieser handelsüblich
verfügbaren Restriktionsenzyme spezifiziert sind, durchgeführt.
Siehe z. B. New England Biolabs, Produktkatalog. Im allgemeinen
wird ungefähr 1 ug eines Plasmids oder einer DNA-Sequenz durch
ein Unit eines Enzyms in ungefähr 20 ul Pufferlösung
geschnitten; in den hier beschriebenen Beispielen wird
typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um
den vollständigen Verdau des DNA-Substrates sicherzustellen. Es
wird mit Inkubationszeiten von ungefähr 1 bis 2 Stunden bei
ungefähr 37ºC gearbeitet, obwohl Änderungen toleriert werden
können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion
mit Phenol/Chloroform entfernt und darauf kann eine
Etherextraktion folgen und die Nukleinsäure kann aus den
wässrigen Fraktionen durch Ausfällung mit Ethanol
wiedergewonnen werden. Wenn gewünscht, kann eine Trennung nach
Größe der geschnittenen Fragmente mit einer Polyacrylamidgel-
oder Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von
Standardtechniken durchgeführt werden. Eine allgemeine
Beschreibung der Trennung nach Größe kann in Methods of
Enzymolocy (1980) 65 : 499-560 gefunden werden.
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Die geschnittenen Restriktionsfragemente werden durch
Behandlung mit der großen Untereinheit der E.coli DNA-
Polymerase I (Klenow) in der Anwesenheit der vier
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) zu glatten Enden
aufgefüllt, unter Verwendung von Inkubationszeiten von 15 bis
25 Minuten bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 6
mM MgCl&sub2;, 6 mM DTT und 0,1-1,0 mM dNTPs. Das Klenowfragment
füllt die 5'-überhängenden Einzelstränge auf, aber baut
rückwärts vorstehende 3'-Einzelstränge ab, selbst wenn die vier
dNTPs vorhanden sind. Wenn gewünscht, kann eine selektive
Reparatur, durch Zugabe von einem der dNTPs oder ausgewählten
dNTPs innerhalb der Grenzen, die durch die Natur des Überhangs
bestimmt sind, durchgeführt werden. Nach der Behandlung mit
Klenow, wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und
mit Ethanol gefällt. Die Behandlung unter geeigneten
Bedingungen mit S1-Nuklease oder Bal-31 führt zur Hydrolyse von
jedem Einzelstranganteil.
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Die Ligationen werden in einem Volumen von 15-50 ul unter den
folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt:
zum Beispiel 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT,
33 ug/ml
BSA, 10-50 mM NaCl und entweder 40 uM ATP, 0,01-0,02
(Weiss) Units T4-DNA-Ligase bei 0ºC (für eine "sticky end"-
Ligation) oder 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) Units T4-DNA-Ligase
bei 14ºC (für eine "blunt end"-Ligation). Intermolekulare
"sticky end"-Ligationen werden herkömmlicherweise bei 33-100
ul/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen (5-100 nM
Gesamtendkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare "blunt
end"-Ligationen werden bei 1 uM Gesamtendkonzentration
durchgeführt.
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Bei Vektorkonstruktionen für die "Vektorfragmente" verwendet
werden, wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller
alkalischer Phosphatase (BAK) oder Kalbsdarm alkalischer
Phosphatase (CIP) behandelt, um die 5'-Phosphate zuentfernen
und die Selbstligation des Vektors zu verhindern. Verdaus
werden bei einem pH-Wert von 8 in ungefähr 10 mM Tris-Cl, 1 mM
EDTA unter Verwendung von etwa 1 Unit BAP oder CIP pro ug
Vektor für etwa 1 Stunde durchgeführt. Um die
Nukleinsäurefragmente wiederzufinden, wird die Preparation mit
Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol prezipitiert.
Alternativ kann das Rückligieren in Vektoren, die doppelt
verdaut wurden, durch zusätzlichen Restriktionsenzymverdau und
Trennung der unerwünschten Fragmenten verhindert werden.
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Für Teile des Vektors, die aus einer cDNA oder genomischen DNA
stammen, die eine Sequenzmodifizierung benötigen, kann eine
stellenspezifische, Primer-gesteuerte Mutagenese verwendet
werden (Zoller, M.J. und Smith, M. Nucleic Acids Res (1982)
10 : 6487-6500 und Adelman, J.P., et al. DNA (1983) 2 : 183-193).
Dies wird unter Verwendung eines spezifischen Primer-
Oligonukleotids, das komplementär zu einer Einzelstrang-Phagen-
DNA ist, die mutagenisiert werden soll, ausgenommen für eine
begrenzte Basenfehlpaarung, die die gewünschte Mutation
repräsentiert. Kurz gesagt, das synthetische Oligonukleotid
wird als Primer verwendet, um die Synthese eines Strangs, der
komplementär zu dem Phagen ist, zu steuern und die resultiernde
teilweise oder vollständig doppelsträngige DNA wird in ein
phagenunterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen
der transformierten Bakterien werden auf Topagar ausplattiert,
um die Plaquebildung von einzelnen Zellen, die den Phagen
enthalten, zu gestatten.
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Theoretischerweise werden 50% der neuen Plaques den Phagen, der
die mutierte Form als ein Einzelstrang besitzt, enthalten; 50%
werden die Originalsequenz besitzen. Die resultierenden Plaques
werden nach der Hybridisierung mit kinasehaltigem synthetischen
Primer bei einer Waschtemperatur, die die Bindung einer exakten
Basenpaarung erlaubt, gewaschen, aber bei der die
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Basenfehlpaarungen mit dem Originalstrang ausreichend sind, um
eine Bindung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde
hybridisieren, werden dann auf genommen, in Kultur gebracht und
die DNA wiedergewonnen.
C.4. Überprüfung der Konstruktion
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Bei den oben beschriebenen Konstruktionen, werden die korrekten
Ligationen für die Plasmidkonstruktion durch erstens die
Transformation des E.coli-Stammes MC1061, der von Dr. M.
Casadaban (Casadaban, M., et al., J Mol Biol (1980) 138 : 179-
207) erhalten wurde, oder eines anderen geeigneten Wirtes mit
der Ligationsmischung, sicherzustellen. Erfolgreiche
Tranformanten werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder einer
anderen Antibiotikaresistenz oder durch die Verwendung anderer
Marker, die von der Art der Plasmidkonstruktion abhängen,
ausgewählt, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Plasmide
aus den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von
Clewell, D.B., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1969) 62 : 1159
hergestellt, wahlweise gefolgt von einer Chloramphenicol-
Amplifikation (Clewell, D.B., J Bacteriol (1972) 110 : 667).
Mehrere DNA-Minipräparationen werden üblicherweise verwendet,
z. B. Holmes, D.S., et al. Anal Biochem (1981) 114 : 193-197 und
Birnboim, H.C., et al. Nucleic Acids Res (1979) 7 : 1513-1523).
Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder
mit der Didesoxynukleotidmethode von Sanger, F., et al. Proc
Natl Acad Sci (USA) (1977) 74 : 5463, wie desweiteren von
Messing, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9 : 309 beschrieben
oder durch die Methode von Maxam, et al., Methods in Enzymoloav
(1980) 65 : 499, sequenziert.
C.5. Erläuterung der Wirte
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Wirtsstämme, die hier für die Klonierung und prokaryontische
Expression verwendet werden, sind wie folgt:
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Für die Klonierung und Sequenzierung und für die Expression der
Konstruktion unter der Kontrolle der meisten bakteriellen
Promotoren, werden E.coli-Stämme, wie zum Beispiel MC1061, DH1,
RR1, C600hfl, K803, HB101, JA221 und JM101 verwendet.
D. Veranschaulichendes Verfahren
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Mit den folgenden Beispielen wird beabsichtigt, die Erfindung
zu veranschaulichen, aber nicht zu begrenzen. Die DNA, die die
gezeigten FGF-Sequenzen kodiert, wird durch anfängliches
Screenen einer genomischen Rindergenbank erhalten und enthält
eine zentrale Sonde, dem das Wiedergewinnen der DNA folgt. Es
wird jedoch nicht nötig sein, das Verfahren zu wiederholen,
weil die Sequenz der zentralen Gensonde nun bekannt ist und so
chemisch in vitro konstruiert werden kann. Zusätzlich sind die
Bakteriophagen, die die vier gezeigten Sequenzen enthalten, bei
der American Type Culture Collection hinterlegt.
Beispiel 1
Konstruktion der 250/AluI Sonde
Herstellung der sauren bFGF genomischen Genbank
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Ein 250 Bp großes AluI genomisches Rinderfragement wurde als
Gensonde verwendet, um beide, die humane und die Rindergenbank
zu untersuchen, um die vollständige kodierende Sequenz für die
gezeigten sauren FGF-Proteine zu erhalten. Diese Sonde, die als
250/AluI bezeichnet ist, wurde wie folgt erhalten.
-
Die N-terminale Aminosäuresequenz für die Reste 1-34 des sauren
Rinder-FGF ist bekannt. Drei lange Sonden wurden hergestellt,
die auf Kodonauswahl (Anderson, S., et al. Proc Natl Acad Sci
(USA) (1983) 80 : 6838-6842; Jaye, M., et al., Nucleic Acids Res
(1983) 11 : 1325-2335) unter Verwendung einer automatischen
Synthesemaschine und einem Phosphoramiditkupplungsreagenz
basierte. Die Sequenzen dieser Nukleotidsonden sind in Fig. 5
gezeigt. Sonde 891 ist ein 48mer, die mit den Aminosäuren 1-16
korrespondiert, Sonden 889 und 890 sind 51-mere, die mit den
Aminosäuren 18-34 korrespondieren und werden als 50-50 Mischung
der zwei Oligonukleotide verwendet, die außer für das Kodon für
Arginin an Position 24 identisch sind. Die Sonden werden zum
Screenen der genomischen Rindergenbank verwendet, die von Dr.
Fritz Rottmann, Case Western Reserve erhalten wurde, die als
ein teilweiser MboI-Verdau hergestellt wurde und die in den mit
BamHI behandelten Phagenvektor Charon 28 kloniert wurde
(Woychik, R.F., et al. Nucleic Acids Res (1982) 10 : 7197-7210).
-
Die Hybridisierung wurde auf denaturierte DNA, die auf Filter
repliziert war, unter Verwendung des Verfahrens, das von
Ullrich, A., et al., Nature (1984) 3 : 361-364 beschrieben ist,
durchgeführt; und die Waschbedingungen waren die von Wood,
W.I., et al., Nature (1984) 312 : 330-337. Der
Prehybridisierungs/Hybridisierungspuffer enthielt 20% Formamid,
5x Denhardtsche Lösung (100x Denhardts ist gleich 2%
Rinderserumalbumin, 2% Polyvinylpyrollidon, 2% Ficoll), 6x SSC
(20x SSc ist gleich 3 M NaCl, 0,3 M Na-citrat), 50 mM
Natriumphosphat pH 6,8, 100 ug/ml Heringssperma-DNA, der
Hybridisierungspuffer enthielt desweiteren 10% Dextransulfat
und etwa 10&sup5;-10&sup6; cpm/ml kinasierte Sonde 891 oder 889/890. Die
Prehybridisierung und Hybridisierung wurden jeweils für 1 Std.
und 16 Std. bei 42ºC durchgeführt. Nach dem Waschen wurden die
Filter für 1 Tag unter Verwendung von Verstärkerfolien
exponiert.
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Die gescreente genomische Rindergenbank enthielt 50 Phagen aus
106 Rekombinanten, die mit beiden Sonden hybridisierten. Diese
50 Phagen wurden desweiteren mit einer Mischung von Sonde 853-
856 gescreent. In dem Screen enthielt der
Prehybridisierungs/Hybridisierungspuffer 6x SSC, 1x
Denhardtsche Lösung, 0,1% SDS, 0,5% Na-pyrophosphat und
100 ug/ml
Lachssperma-DNA, der Hybridisierungspuffer enthielt
desweiteren 10&sup5;-10&sup6; cpm/ml Sonde. Die Sonden 853-856 bestanden
aus 4 Pools von 16 Sequenzen, jedes der 64 (gesamt) 17-mere
korrespondierten mit den Aminosäuren 7-12, die mit der
Phosphotriestermethode synthetisiert wurden. Jedoch
hybridisierten 46 der 50 Klone weiterhin mit kürzeren Sonden.
Diese Hybridisierung wurde zwischen 65ºC bis 35ºC für 16 Std.
durchgeführt und das von der Basenzusammensetzung unabhängige
Waschverfahren wurde unter Verwendung von
Tetramethylammoniumchlorid bei 50ºC durchgeführt (Wood, W.I.,
Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 1585-1588).
-
Zwei positiv hybridisierende Phagen wurden ausgewählt
(LambdaBA2 und LambdaBA3) und die Phageninserts wurden
restriktionskartiert, wie in Fig. 6 gezeigt ist, und
teilweise, wie in Fig. 1a gezeigt ist, sequenziert. Der
Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der, die für
die N-terminalen 34 Reste der sauren nativen Rinder FGF-
Proteins publiziert ist, bestätigte, daß die Klone richtig
sind. Aus der Natur der kodierenden Sequenz ist es
offensichtlich, daß die Aminosäuren 1-41 (wie in Fig. 1a
gezeigt) in diesen Klonen kodiert sind; die unmittelbar
nachfolgenden Aminosäuren scheinen ein Intron darzustellen. Die
Länge dieses Introns ist im Moment ungewiß, aber es ist
möglich, daß sich die vollständige bFGF kodierende Sequenz auf
diesen LambdaBA2- oder LambdaBA3-DNAs befindet. Jedoch kann
jede zusätzlich benötigte DNA, um die vollständige kodierende
Sequenz zu erhalten, aus der gleichen Genbank unter Verwendung
von LambdaBA2 oder LambdaBA3 durch die Chromosome "Walking"-
Technik erhalten werden. Für die Codons, die dem N-terminalen
Rest vorangehen, wird angenommen, daß sie die bezeichnete
fünfzehn Aminosäurenprosequenz oder, wie oben diskutiert, die
"lange" Form des nativen Proteins, das um fünfzehn Aminosäuren
am N-Terminus erweitert ist (oder um vierzehn, wenn das N-
terminale Methionin abgeschnitten ist), kodieren, verglichen
mit der isolierten "primären" Form.
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Um die 250/AluI-Sonde herzustellen, wurde LambdaBA2 teilweise
mit Alul verdaut und in M13 Shotgun kloniert (Messing, J., et
al., Gene (1982) 19 : 269-276). Die M13 Plaques wurden zweifach
mit 853-86 und 889/890 hybridisiert. Die Phagenhybridisierung
an beide Sonden wurde sequenziert. Die resultierende 250 Bp
AluI Sonde ist in Fig. 7 zusammen mit der entsprechenden
abgeleiteten Aminosäuresequenz gezeigt; ihre Lage auf den
LambdaBA2 und LambdaBA3 Inserts in Fig. 6 korrespondiert mit
den Stellen der Sonden 889/890 und 891. Die 250/AluI Sonde
korrespondiert mit dem N-terminalen Teil des sauren bFGF-
Proteins.
Beispiel 2
Auffinden der basischen bFGF genomischen und cDNA Klone
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Die 250/AluI Sonde wurde verwendet, um geeignete Sonden zu
bestimmen, um die entsprechenden basischen bFGF Sequenzen zu
erhalten. Die Erkenntnis von Esch, et al., (supra), daß die
Aminosäuren 4-29 des sauren bFGF mit den Aminosäuren 13-38 der
basischen bFGF Sequenz übereinstimmen, wurde ausgenutzt. Es
wurden Sonden entworfen, die auf den basischen bFGF Resten 18-
36 und den sauren bFGF 9-27 Resten basieren deren Regionen in
14 von 19 Aminosäuren homolog sind.
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Die Sonden 1097 und 1098, 40-mere wurden entworfen, diese
Region zu kodieren, wurden unter Verwendung der
Phosphoramiditmethode mit einer automatischen Synthesemaschine
hergestellt. Die Sonden sind in Fig. 8 gezeigt; sie überlappen
in der Aminosäureregion 13-31 der basischen Sequenz. Beim
Entwerfen der Sonden, wurde die 250/AluI Sequenz verwendet, wo
die Aminosäuresequenz die gleiche ist, und wo sie verschieden
ist, wurden minimale Nukleotidunterschiede, um den benötigten
Wechsel in der kodierenden Sequenz zu bewirken, eingebaut.
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Eine Rinderhypophysen-cDNA-Genbank wurde aus Hypophysen-mRNA
unter Verwendung des Lambda-gt10-Vektors von Huynh, V.T. -DNA
cloning technique: A Practical Approach (IRL Press, Oxford,
1984)] erhalten und mit 1098 gescreent. Genaue Bedingungen für
die Hybridisierung unter Verwendung von genomischer DNA
(Beispiel 1) für den Southern Blot wurden wie folgt bestimmt:
-
Es wurde natürlich erwartet, daß die 1097 und 1098 Sonden mit
der sauren FGF kodierenden DNA unter niedrigen stringenten
Bedingungen, kreuzhybridisieren würden. Die Southern Blot
Analyse zeigte, daß genomische Sequenzen, die bekanntweise
sauren bFGF kodieren, der an 1097 und 1098 bei
Waschtemperaturen von 55ºC hybridisierten, nicht bei bei 65ºC
hybridisierten. (Der Prehybridisierung/Hybridisierungs-Puffer
und die Bedingungen waren wie die für die 889/890 und 891
Sonden in Beispiel 1.) Deshalb wurde eine Waschtemperatur von
65ºC gewählt. Bei dieser Temperatur hybridisierten ein 10 kBp-
Fragment in einem EcoRI Verdau und ein 3,4 kBp-Fragment in
einem PstI Verdau mit den Sonden 1097 und 1098.
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Wenn die cDNA-Genbank, wie oben beschrieben, bei einer
Waschtemperatur von 65ºC untersucht wurde, wurde ein einzelner
bestimmter LambdaBB2-Klon, der eine 2,1 kBp große DNA mit
EcoRI-Linkern darstellt, wiedergefunden. Eine Restriktionskarte
dieses Phagen ist in Fig. 9 gezeigt. Unterfragmente des
Inserts in LambdaBB2 wurden in M13 zur Sequenzierung
transferriert und für ein 1,4 kBp großes EcoR1 verdautes
Unterfragment wurde gezeigt, daß es die Aminosäuren 1-146 (die
vollständige "primäre" Sequenz) des basischen Rinder-FGF
kodiert. Für die Sequenz oberhalb von dem N-terminalen Kodon
wird angenommen, daß es entweder eine neun Aminosäuren große
Prosequenz oder eine N-terminal erweitere "lange" Form des
nativen Proteins, das Aktivität aufweist, kodiert. Die N-
terminale Erweiterung kann nur acht Reste enthalten, was
natürlich davon abhängt, ob das Nethionin während des Post-
Translationsprozesses herausgeschnitten wird. Der Teil dieses
Unterfragmentes, das den basischen FGF kodiert, ist in Fig. 3
gezeigt; die Bezifferung der Aminosäuren beginnt bei der
Position 1 und korrespondiert mit dem N-Terminus des isolierten
"primären" Proteins. Die oberhalb gelegenen neun Kodons sind
mit Klammern versetzt. Die Möglichkeit, daß diese Erweiterung
einen integralen Teil des nativen Proteins darstellt, wird
durch die höhere Molekulargewichtsform des humanen basischen
FGF, der aus Hepatomzellen von Klagsbrun, et al., Proc Natl
Acad Sci (supra) hergestellt wurde, nahegelegt.
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Das 1,4 kBp große Unterfragment wurde dann einer Nick-
Translation unterworfen und zum Screenen einer genomischen
Rindergenbank, die in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1
für die genomische Sequenz des basischen bFGF konstruiert
wurde, verwendet.
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Das 1,4 kBp große basische bFGF kodierende cDNA-Fragment wurde
ebenfalls verwendet, um alternierende Säugetier-cDNA-Genbanken,
wie zum Beispiel die aus Ratte-, Schwein- oder Rind-, Katze-,
Kanninchen-, Pferd- oder Mausquellen, zu untersuchen, um die
basischen FGF kodierenden Sequenzen aus diesen Spezies zu
erhalten.
Beispiel 3
Herstellung der humanen basischen FGF genomischen und cDNA-
Klone
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Eine Lambda-gt10 cDNA-Genbank, die aus humaner Nieren mRNA
hergestellt wurde, wurde ebenfalls unter Verwendung des 1,4 kBp
großen basischen Rinterunterfragment, untersucht. Der
Prehybridisierung/Hybridisierung-Puffer enthielt 40% Formamid,
5 mM Na-Phosphat pH 6,5, 5x Denhardtsche Lösung, 5x SSC und
50 ug/ml Heringssperma-DNA; der Hybridisierungspuffer enthielt
auch 10% Dextransulfat und 10&sup4;-10&sup5; cpm/ml Sonde. Drei Klone
wurden isoliert und einer für die Charakterisierung ausgewählt.
Dieser Klon, mit LambdaKB7 bezeichnet, enthielt ein etwa 1,4
kBp großes EcoRI-Fragment, das teilweise sequenziert wurde, um
die Daten, die in Fig. 4 gezeigt sind, zu erhalten, zusammen
mit der erweiterten Aminosäuresequenz. Die sequenzierte
kodierende Region erlaubte die Ableitung von Aminosäuren 1-50,
die in der Figur gezeigt sind; die fortgesetzte Sequenz
unmittelbar unterhalb liegt scheint die cDNA-Kopie der
ungespleißten mRNA darzustellen, was anzeigt, daß ein Intron in
dem basischen FGF-Gen enthalten ist in einer homologen Position
zu dem Intron nach Aminosäure 41 in den Rinder- und humanen
sauren FGF-Genen. Der LambdaKB7-Klon liefert ebenfalls oberhalb
liegende DNA, die die neun Aminosäure lange N-terminale
Erweiterung der gezeigten langen Form kodiert.
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Zusätzliche genomische und cDNA-Genbanken wurden unter
Verwendung des 1,4 kBp großen basischen bFGF kodierenden
Fragments, unter genau den gleichen Hybridisierungsbedingungen
wie denen, die für die oben genannte humane Nieren Lambda-gt10
Genbank verwendet wurden, gescreent. Vier zusätzliche Klone
wurden erhalten, die zwischen ihnen das vollständige 146
Aminosäureprotein, das dem isolierten basischen bFGF
entspricht, wie in Fig. 4 gezeigt, kodiert. Neun oberhalb
liegende Kodons, die in dem oben genannten LambdaKB7
eingeschlossen sind, translatieren in eine Sequenz, die eine
vollständige Homologie mit den translatierten oberhalb
liegenden Kodons in dem basischen Rinder-FGF-Klon hat, obwohl
dort eine stumme Nukleotidsubstitution bei Kodon -8 vorhanden
ist. Diese translatierte N-terminale Erweiterung ist in
Klammern in Fig. 4 gezeigt; und kann, wie oben beschrieben,
eine Prosequenz oder die zusätzlichen Aminosäuren eines N-
terminal erweiterten aktiven Proteins darstellen.
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Noch genauer gesagt, wurden zwei positiv hybridisierende Klone
aus einer humanen genomischen cDNA-Genbank in Lambda Charon 4A,
hergestellt wie von Lawn , R.M. et al., (supra) beschrieben,
mit LambdaMG4 und LambdaMG10 bezeichnet. LambdaMG4 kodiert die
Aminosäuren (-9)-51; LambdaMG10 kodiert die Aminosäuren 86-146,
die das dritte von drei Exons, die in der reifen
proteinkodierenden Region der Gene enthalten ist,
repräsentieren. (Die Lokalisierung der Exon/Intron-Bindungen
wurde durch Homologievergleich mit den Rindersequenzen
bestimmt.) Eine leicht unterschiedliche genomische Genbank in
Lambda Charon 28, die von E. Fritsch erhalten wurde, ergab
LambdaHT1, das ein zweites reifes Proteinexon enthielt, das die
Aminosäuren 51-85 kodiert. Schließlich kodiert LambdaHFL1, ein
cDNA-Klon, der aus einer humanen fötalen Lebergenbank, die in
Lambda-gt10 wie oben beschrieben hergestellt wurde, erhalten
wurde, die Aminosäuren 56-146, was die Lokalisierung der
relevanten Intron/Exon Verbindung bestätigt.
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Es bestehen nur zwei Aminosäureunterschiede zwischen den
basischen bFGF und hFGF an Position 112, wo das Rinderprotein
ein Ser und das humane Protein ein Thr hat, und an Position
128, wo das Rinderprotein ein Pro und das humane Protein ein
Ser hat. Diese Unterschiede sind jeweils das Ergebnis eines
einzelnen Nukleotidunterschieds; deshalb kann die Rinder cDNA
vorteilhafterweise durch Site-directed Mutagenese Techniken,
wie unten beschrieben, um das humane Protein zu kodieren,
modifiziert werden und tatsächlich wird die Standard Site
directed Mutagenese Technik verwendet, um diese Kodons zu
ändern. Der LambdaBB2-Klon des Beispiels 2 wurde mit, EcoRI
verdaut und die 1,4 kBp große Region, die den bFGF-Protein
kodierenden Teil umfaßt, wurde in die EcoRI-Schnittstelle des
M13mp8 ligiert. Die in vitro Mutagenese wurde in der
Anwesenheit von drei Oligonukleotiden durchgeführt: dem
"universellen" Primer, einem 17-mer; dem mutagenen 16-mer
5'-GAAATACACCAGTTGG-3', das die kodierende Sequenz bei Kodon
112 ändert und dem mutagenen 17-mer 5'-ACTTGGATCCAAAACAG-3''
der die Sequenz bei Kodon 128 ändert. Die mutagenisierten
wurden Phagen einem zweiten Durchgang der in vitro
Primerausgerichteten Mutagenese unterworfen, um eine HindIII-
Schnittstelle 34 Bp unterhalb des
Translationsterminationskodons unter Verwendung des mutagenen
25-mer 5'-TTTTACATGAAGCTTTATATTTCAG-3' zu bilden. Die
resultiernde mutierte DNA wurde mit Didesoxysequenzierung
sequenziert, um zu bestätigen, daß die gewünschte Mutation
entstanden ist und das ungefähr 630 Bp große Fragment, das die
FGF kodierende Region umfaßt, wurde mit HindII geschnitten und
in pUC13 ligiert, um das Zwischenplasmid pJJ15-1 zu erhalten.
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Natürlich können modifizierte Formen der kodierenden Sequenz,
um irgendeine der drei bekannten N-terminalen Modifikationen
des basischen FGF zu kodieren, ebenfalls mit bekannten
Standardsynthesetechniken hergestellt werden.
Beispiel 4
In vitro Assay für FGF
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Der Versuch wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie von Esch
et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1985) 82 : 6507-6511 und von
Gospodarowicz, D., et al. J Cell Physiol (1985) 122 : 323-332
beschrieben.
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Kurz gesagt, kapillare Endothelzellen aus Rinderhirn wurden in
der Anwesenheit von DMEM, dem 10% Kälberserum zugegeben waren,
in Kultur gehalten. Monolayerschichten wurden dissoziiert,
indem sie für 2 bis 3 Minuten einer Lösung, die 0,9% NaCl, 0,01
M Natriumphosphat pH 7,4. 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA
enthielt, bei Raumtemperatur ausgesetzt wurden. Nachdem die
Zellen sich abgerundet hatten, wurden sie in DMEM und 10%
Kälberserum resuspendiert und ein Aliquot der Zellsuspension
wurde in einem Coulterzähler gezählt. Die Zellen wurden mit
einer anfänglichen Dichte von 2 · 10&sup4; Zellen pro 35 mm Schale
angesetzt, jede Schale enthielt ein Gesamtvolumen von 2 ml DMEM
plus 10% Kälberserum. Sechs bis zwölf Stunden später, wurde ein
Satz von duplizierten Platten mit Trypsin behandelt und die
Zellen wurden gezählt, um die Plattierungseffizienz zu
bestimmen.
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Aliquote der Proben wurden zum Testen auf FGF-Aktivität 1 : 2,
1 : 4 und 1 : 8 mit DNEN plus 0,5% BSA verdünnt und 10 ul der
Verdünnung wurden zu Versuchsplatten in dreifacher Ausfertigung
an den Tagen 0 und 2 zugegeben. Am 4. Tag wurden die in
dreifacher Ausfertigung vorliegenden Platten mit Trypsin
behandelt und die Zelldichte wurde mit dem Coulterzähler
bestimmt.
Beispiel 5
Bakterielle Expression des FGF
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Die cDNA-Sequenzen, die FGF kodieren, die durch Introns nicht
unterbrochen sind, sind auch in bakteriellen Systemen
exprimierbar. Ein geeigneter Wirtsvektor für die Expression ist
pKT52, der den "trc"-Promotor, gefolgt durch das ATG Startkodon
enthält. Der "trc"-Promotor enthält die oberhalb liegenden
Anteile des trp-Promotors und die unterhalb liegende
operatorenthaltenden Regionen des lac-Promotors. pKT52, das
diesen Promotor enthält, wurde eine einfache Manipulation von
pKK233-2 konstruiert, was von Amman, E., et al. Gene (1985)
40 : 183-190 beschrieben wurde: pKK233-2 wurde mit EcoRI und
PvuII verdaut, mit dATP und dTTP aufgefüllt und religiert, um
den gewünschten Vektor zu erhalten.
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pKT52 enthält zusätzlich zu dem gewünschten trc-Promotor und
dem ATG-Startkodon unterhalb liegende NcoI-, PstI- und HindIII-
Schnittstellen.
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Für die Konstruktion der Expressionsvektoren, wurde die humane
basische FGF kodierende cDNA, durch Schneiden mit EcoRI oder
anderen geeigneten Verdauungsenzymen und Isolierung und wenn
gewünscht, Modifizierung des geeigneten Fragments, erhalten.
Das 3'-Ende wird für die Insertion in pKT52 durch Scheiden
unterhalb des Terminationskodons an jeder günstigen
Restiktionsschnittstelle und Zugabe von PstI- und HindIII-
Linkern präpariert. Das 5'-Ende wird durch Schneiden an einer
Stelle, die innerhalb der kodierenden Sequenz liegt und durch
Zugabe der fehlenden Kodons und einer NcoI-Schnittstelle unter
Verwendung einer synthetischen DNA oder Herstellung einer
geeignet lokalisierten NcoI-Schnittstelle durch Mutagenese,
präpariert. Das resultierende NcoI/HindIII oder NcoI/PstI
Fragment wird dann in Ncol/HindIII verdautes pKT52 oder
NcoI/PstI verdautes pKT52 ligiert, um die FGF kodierende cDNA
in Leseraster mit dem ATG-Startkondon bereitzustellen.
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Für die bakterielle Expression werden die sich ergebenden
Expressionsvektoren verwendet, um E.coli MC1061 oder andere
geeignete Wirtszellen zu AmpR zu transformieren und die
transformierten Zellen werden dann in M9 Medium, das 1 mM IPTG
enthält, für 3-5 Std. bis zu einer O.D. von 0,2-0,5 wachsen
gelassen. (IPTG ist ein Standardinduzierer für
Kontrollsequenzen, die durch den lac-Operator reguliert
werden.) Die Zellen werden dann geerntet, durch
Schallbehandlung oder durch Behandlung mit 5%
Trichloressigsäure lysiert und die Zellextrakte werden auf das
gewünschte FGF getestet. FGF kann aus den Extrakten durch
Verfahren, die für die nativen Proteine verwendet werden, oder
durch andere bekannte Verfahren, gereinigt werden.
Beispiel 6
Aktivität des FGF in der Förderung des Wundheilung
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Die FGF-Aktivität in der Förderung der Wundheilung wurde unter
Verwendung von nativem basischen FGF, der aus Rinderhypophysen
nach dem Verfahren von Gospodarowicz, et al. als Kontrolle
(Proc Natl Acad Sci (USA) (1984) 81 : 6963-6967), getestet. Das
zu untersuchende Kontroll-bFGF wurde die der subkutanen
Implantation von Polyvinylalkoholschwämmen in Ratten getestet,
gemäß dem Verfahren von Davidson, J.M., et al. J.B.C. (1985)
100 : 1219-1227. Als Alternative können auch Gortexhohlfasern
verwendet werden (Goodson, W.H., et al., J Surq Res (1982)
33 : 394-401).
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Bei dem Standardverfahren erhält eine Gesamtzahl von vier
Ratten jeweils zwei identisch behandelte Schwämme. Die Schwämme
werden entweder nicht behandelt, mit Heparinsepharosekügelchen
behandelt, mit FGF, das an Heparinsepharosekügelchen mit 5 ug
FGF pro Schwamm gebunden ist, behandelt oder mit 5 ug FGF in
Lösung behandelt. Die Schwämme werden nach 6 Tagen entfernt und
histologisch auf Granulationsgewebe untersucht, das bezeichnend
für die Wundheilung ist.
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Schwämme, die FGF enthielten, zeigten einen höheren Anteil an
Granulation, die rund um die Heparinsepharosekügelchen
angeordnet war, in dem Fall mit den Schwämmen, bei dem das FGF
gebunden an diese Kügelchen zugeführt wurde.
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Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, egal ob der FGF aus
einer nativen oder rekombinanten Quelle stammte.
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An oder vor dem 9. September 1985 hat der Anmelder bei der
American Type Culture Collection (ATCC), Rochville, MD. USA,
die Lambda-Phagen LambdaBA2, LambdaBA3, LambdaBB2 und LambdaK3-
7 hinterlegt, die jeweils die ATCC Registrierungsnummer 40195,
40194, 40196 und 40198 erhalten haben. Diese Hinterlegungen
wurden unter den Bedingungen durchgeführt, wie sie das ATCC-
Übereinkommen für die Zellkulturhinterlegung für die Zwecke von
Patentverfahren vorsieht. An oder vor dem 12. September 1986
wurden die Bedingungen für die Hinterlegung des LambdaBB2 (Atcc
40196) umgewandelt, um mit denen in Übereinstimmung zu sein,
die gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale
Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen (Budapester
Vertrag) spezifiziert sind. Die Verfügbarkeit der hinterlegten
Stämme ist nicht als Lizenz ausgelegt, um die Erfindung
anzuwenden, um gegen Rechte zu verstoßen, die von irgendeiner
Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentgesetzen vergeben
worden sind.