JP2953573B2 - 組換え繊維芽細胞成長因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組織治癒の際に、
脈管系を形成するため、ならびに異常な持続性脈管形成
を抑制するために重要な成長因子の組換え生産に関す
る。特に、本発明は、ヒトの塩基性および酸性の繊維芽
細胞成長因子（FGF）をコードする遺伝子の類似体をク
ローニングし、そして発現させる。

【０００２】

【従来の技術】組織が創傷または火傷のような外傷を受
けた場合の修復過程は極めて複雑であるが、多数のタン
パク因子により仲介されることが知られている。これら
の因子は、破壊された組織を置換するように働く細胞の
増殖および分化に必須である。数多くの候補となる因子
は、脳、脳下垂体、および視床下部などのいろいろな組
織の抽出物が培養細胞の有糸分裂を促進する能力を基準
として同定されている。多数の短縮名がこれらの抽出物
中の活性因子に与えられている。これらの活性因子に
は、血小板由来成長因子（PDGF）、マクロファージ由来
成長因子（MDGF）、表皮成長因子（EGF）、腫瘍脈管形
成因子（TAF）、内皮細胞成長因子（ECGF）、繊維芽細
胞成長因子（FGF）、視床下部由来成長因子（HDGF）、
網膜由来成長因子（RDGF）、およびヘパリン結合成長因
子（HGF）が含まれる。（例えば、Hunt,T.K.,J Trauma
（1984）24：S39-S49；Lobb, R.R., et al., Biochemis
try（1984）23：6295-6299を参照）。

【０００３】Folkman, J.,ら、Science（1983）221：71
9-725は、創傷治癒に関与する過程の１つ、すなわち血
管の形成は、腫瘍においてヘパリンにより強く影響され
ることを報告した。このことおよび他の研究から、ヘパ
リンが、多数のこのような成長因子活性に関連するタン
パクに対して特異的に結合することは明らかである。従
って、ヘパリンが精製手段として用いられてきた。ヘパ
リンが正および負に荷電した両方の因子に結合すること
から、成長因子のヘパリンに対する親和性は、全体のイ
オン電荷に無関係であることが示されている（Maciag,
T.， et al.,Science（1984）225：932-935；Shing,
Y., et al.,Science（1984）223：1296-1299；Klagsbru
n, M., et a1.,Proc Natl Acad Sci（USA) (1985) 82：
805-809）。ヘパリンに対する結合能力または非結合能
力は、いろいろな抽出物における活性を区別する１つの
尺度である。例えば、EGFおよびPDGFはヘパリンに強く
結合しない；実際には、EGFはヘパリンに全く結合しな
い。上述の他の因子は強いヘパリン結合性を示す。しか
しながら、酸性の脳FGF、ECGF、RDGFおよびHGF-αは、
実際には、同一因子であると考えられている。同様に、
脳下垂体FGF、陽イオン性の脳FGF、TAFおよびHGF-も同
一タンパクであると考えられている（Lobb, R.R., et a
l.（前出））。ヘパリン親和性を用いて精製された13の
内皮成長因子の要約および比較が、Lobb, R.,ら、J Bio
lChem（1986）261：1924-1928に示されている。

【０００４】ヘパリン−アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて、毛細血管内皮に対して強い有糸分裂活性
を示す塩基性の繊維芽細胞成長因子が、ラットの軟骨肉
腫（Shing，Y., et al.前出）およびウシの軟骨（Sulli
van，R., et al., J Biol Chem（1985）260：2399-240
3）から単離されている。Thomas, K. A.,ら、Proc Natl
Acad Sci（USA）(1984）81：357-361、米国特許第4,44
4,760号は、16,600および16,800ダルトンの分子量を有
する酸性のウシの脳繊維芽細胞成長因子の２つの異種型
を精製した。Gospodarowiczおよび協同研究者らは、ウ
シの脳および脳下垂体の両方に塩基性の繊維芽細胞成長
因子活性が存在することを示し、そしてヘパリン−アフ
ィニティークロマトグラフィーを他の精製技術と組合せ
て、これらのタンパクを精製した（Bohlen,P., et al,
Proc Natl Acad Sci（USA）(1984）81：5364-5368；Gos
podarowicz, D., et al,（同）6963-6967)。これらの因
子の分子量も、ヒトの胎盤から単離された同様の因子の
分子量のように約16kdである（Gospodarowicz, D., et
al, Biochem Biophys Res Comm（1985) 128 : 554-56
2）。

【０００５】ウシの脳下垂体由来の塩基性FGFに対する
完全な配列が決定されている（Esch，F., et al,Proc N
atl Acad Sci (USA)（1985) 82：6507-6511）。均一な
調製物が得られ、そして内皮細胞を用いたインビトロ分
析で強い有糸分裂活性を示した（塩基性FGFは、60pg／m
lのED₅₀を有する）。

【０００６】酸性FGFは、約6,000pg／mlのED₅₀を有す
る。ウシの脳組織由来の酸性FGFのＮ末端配列は、Bohle
n, P.,ら、EMBO J（1985）4：1951-1956により決定され
た。Gimenez-Gallego, G,らは、ヒトの脳から調製され
た酸性FGFおよび塩基性FGF両方のＮ末端配列を決定し、
そしてそれらをウシのFGFの配列と比較した（Biochem B
iophys Res Comm (1986)135：541-548）。彼らの結果
は、ここに開示された結果と一致している。また、ウシ
の脳由来の酸性FGFの全アミノ酸配列が、単離されたタ
ンパクから決定された（Gimenez-Gallego, G, et al,Sc
ience (1985)230：1385-1388；Esch, F, et al, Bioche
m BioPhys Res Comm (1985) 133：554-562）。これら２
つの決定は、１つのアミノ酸を除いて一致している。し
かし、Eschらは後に、彼らの配列はGimenez-Gallegoら
の配列と一致すると報告した。ヒトの酸性FGFの全アミ
ノ酸配列が、その遺伝子から推定された（Jaye，M., et
al,Science（1986)233：541-545、そして完全なヒトの
タンパク配列もGimenez-Gallego, G., et al, Biochem
Biophys Res Comm (1986) 138：611-617およびHarper,
J.W. et al, Biochem(1986)25：4097-4103により決定さ
れた）。

【０００７】上述のFGFタンパクおよび他の成長因子
は、外傷を受けた組織の治癒を促進する際、明らかに有
効である（例えば、Sporn, M.B., et al, Science(198
3)219：1329-1331；Davidson，J.M., et al,J.C.B.(198
5)100：1219-1227；Thomas, K.A., et al, Proc Natl A
cad Sci (USA)（1985）82：6409-6413を参照）。Davids
onら（前出）は、特に創傷治癒におけるFGFの有効性を
開示している。塩基性FGFの天然タンパクは、心筋梗塞
の治療に有用であると言われている（Svet-Moldavsky,
G.J., et al,Lancet（1977年４月23日）913；米国特許
第4,296,100号および第4,378,347号）。さらに、ヒトの
塩基性FGFが、ラット胎児の海馬体神経細胞における神
経細胞の生存および神経突起の伸長を増大させることが
見出されている（Walicke, P., et al, Proc Natl Acad
Sci (USA) (1986) 83：3012-3016）。このことは、こ
の因子がアルツハイマー病およびパーキンソン病のよう
な退化神経学的疾病の治療にも有用であり得ることを示
唆している。

【０００８】上述のFGFタンパクは、創傷、手術、火
傷、骨折または神経病的変性の結果として外傷を受けた
組織の修復を促進するための、効果的な手段を提供す
る。しかしながら、これらの成長因子のある特性に関す
るデータが集められており、このデータは、FGFの作用
物質は組織の修復に関して天然のFGFタンパクよりも治
療上効果的であり得、ある状況においては、FGF拮抗体
もまた治療上有用であり得るということを示唆してい
る。

【０００９】例えば、天然のFGFと比べてより強い生物
学的活性を有するFGFの作用物質は、上述の創傷治療の
指標に使用するのがより望ましい。対照的に、FGFの拮
抗体は、血管新生が主な病状である治療に非常に有用で
あり、脈管形成過程を阻害するのに治療上有用である。
それゆえ、天然のFGFの効果に拮抗するFGF類似体を構築
することも望ましく、そのため脈管形成が阻害される。

【００１０】はっきりした生物学的活性に関与するタン
パクの領域、または細胞環境での因子の相互作用に重要
な領域を単離するためには、これらの成長因子について
報告されている天然FGFのDNA配列に修飾を与えることが
望ましいと考えられる。特異的相互作用の適当な領域ま
たは部位が決定されて、構造類似体が作られ得る。これ
は、例えば創傷治癒活性のようなある活性を維持する
が、細胞外基質におけるFGFの隔離のような望ましくな
い機能を減少させるかまたは除去する。

【００１１】これらのFGFタンパク類似体を大量に、か
ついかなる毒性不純物あるいは感染性不純物を含まない
形で利用し得ることを保証することもまた望ましい。治
療に用いるには、このタンパクのヒト型のものが好まし
く、そして恐らく必要とされる。ヒトの酸性FGFおよび
塩基性FGFの両方のタンパクをコードするDNA配列が組換
えDNA技術によりクローン化され、発現されているの
で、部位特異的変異処理が用いられて、酸性および塩基
性の種々のFGF類似体が生産され得る。本発明は、ここ
に酸性FGFおよび塩基性FGF類似体を実用的な量で、かつ
純粋であって、汚染されていない形で得る方法を与え
る。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものである。本発明の目的は、ヒトの酸
性および塩基性のFGFの類似体（ヒトaFGFおよびヒトbFG
F）をコードする組換えDNA配列を提供することにある。
本発明の他の目的は、これらのDNA配列を有する組換え
ベクター、このようなベクターを用いて形質転換され、
そしてこれらのDNA配列を保持する宿主細胞、およびこ
れらの形質転換された細胞により生産される組換えタン
パクを提供することにある。本発明のさらなる目的は、
組換え技術を用いたこれらの繊維芽細胞成長因子類似体
の生産方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、創傷、骨折、
火傷組織、創傷心筋組織、退化神経組織または他の外傷
の治癒を効果的に促進させるのに有用な繊維芽細胞成長
因子類似体の合成および操作の手段を与える。同時に、
脈管形成阻害因子のような繊維芽細胞成長因子も提供さ
れる。この因子は、血管新生が主な病状である眼科学、
皮膚科学およびリウマチ病学に共通の疾病、ならびに脳
腫瘍のような最も脈管形成能の高いものを包含するがこ
れに限定されない、ある種の新生物における疾病の治療
に有用である。これらの類似体をコードする遺伝子のク
ローニングおよび発現は、本発明の方法および材料によ
って与えられる。

【００１４】ある様相において、本発明は、ヒトの酸性
および塩基性のFGFの類似体（ヒトaFGFおよびヒトbFG
F）をコードする組換えDNA配列に関する。他の様相にお
いて、本発明は、これらのDNA配列を有する組換えベク
ター、このようなベクターを用いて形質転換され、そし
てこれらのDNA配列を保持する宿主細胞、およびこれら
の形質転換された細胞により生産される組換えタンパク
に関する。さらに他の様相において、本発明は、組換え
技術を用いたこれらの繊維芽細胞成長因子類似体の生産
方法に関する。

【００１５】本発明によれば、哺乳類FGFの類似体をコ
ードする組換えDNA配列が提供される。上記のDNA配列
は、ヒトFGFタンパク類似体をコードし得る。上記のヒ
トFGFタンパク類似体をコードするDNA配列は、ヒト塩基
性FGFタンパク類似体をコードし得る。上記のヒト塩基
性FGFタンパク類似体をコードするDNA配列は、ヘパリン
結合に対する親和性が減少したヒト塩基性FGFタンパク
類似体をコードし得る。上記のDNA配列は、残基128〜13
8を含むヘパリン結合ドメインに位置する１個またはそ
れ以上の正に荷電したアミノ酸残基を、中性アミノ酸ま
たは負に荷電したアミノ酸で置換することを包含し得
る。好ましくは、上記中性アミノ酸または負に荷電した
アミノ酸は、セリン、トレオニン、またはグルタミン酸
からなる群から選択され得る。好ましくは、上記の置換
されたアミノ酸の位置および組成は、セリン₁₂₈、グル
タミン酸₁₂₈、トレオニン₁₂₉、セリン₁₂₈／トレニオン
₁₂₉、およびセリン₁₃₈からなる群から選択され得る。

【００１６】上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体をコ
ードするDNA配列は、１個またはそれ以上のシステイン
残基が中性アミノ酸によって置換されており、天然の塩
基性FGFの生物学的活性を示す、ヒト塩基性FGFタンパク
類似体をコードし得る。上記の中性アミノ酸はセリンま
たはアラニンであり得る。上記の置換されたシステイン
残基は、78位または96位にあり得るか、あるいはそれら
の組み合わせであり得る。

【００１７】上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体をコ
ードするDNA配列は、FGFのレセプターに結合し、生物学
的応答を誘導する能力が減少しているヒト塩基性FGFタ
ンパク類似体をコードし得る。

【００１８】上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体をコ
ードするDNA配列は、FGF拮抗体活性を有する、FGFのア
ミノ末端欠失類似体をコードし得る。上記の欠失はヒト
塩基性FGFの残基１〜24に及び得る。上記のDNA配列は、
中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸で置換され
た、残基128〜138を含むヘパリン結合ドメインに位置す
る１個またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸残基をさ
らに有し得る。

【００１９】上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体をコ
ードするDNA配列は、発現の制御配列に作動可能なよう
に連結され得る。上記の制御配列は転写終結シグナルを
含み得る。

【００２０】上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体をコ
ードするDNA配列は、組換え宿主細胞に形質転換され得
る。

【００２１】本発明はまた、上記のヒト塩基性FGFタン
パク類似体をコードするDNA配列を含み、かつFGFまたは
その類似体を発現させるのに効果的な組換えベクターを
提供する。上記のベクターは、プラスミドpUC9-TSF11お
よびpUC9delH3-pTSF-3からなる群から選択され得る。上
記のベクターでは、FGF類似体をコードするDNA配列が、
細菌に適合する制御配列に作動可能なように連結され得
る。上記のベクターでは、FGF類似体をコードするDNA配
列が、哺乳類宿主に適合する制御配列に作動可能なよう
に連結され得る。

【００２２】本発明はまた、上記の組換えベクターで形
質転換された組換え宿主細胞を提供する。上記の宿主細
胞は、細菌細胞または哺乳類細胞であり得る。

【００２３】本発明はまた、上記のヒト塩基性FGFタン
パク類似体をコードするDNA配列を有する宿主細胞を培
養すること、およびFGFタンパク類似体を回収すること
を包含する、FGFタンパク類似体を製造する方法を提供
する。上記の宿主細胞は、細菌細胞または哺乳類細胞で
あり得る。

【００２４】本発明はまた、ヘパリン結合に対する親和
性が減少したヒト塩基性FGFタンパク類似体を提供す
る。この類似体は、残基128〜138を含むヘパリン結合ド
メインに位置する１個またはそれ以上の正に荷電したア
ミノ酸残基を、中性アミノ酸または負に荷電したアミノ
酸で置換することを包含する。

【００２５】本発明はまた、78位または96位にあるシス
テインあるいはそれらの組合せが中性アミノ酸で置換さ
れており、この類似体が天然のヒト塩基性FGFの生物学
的活性を示す、ヒト塩基性FGFタンパク類似体を提供す
る。上記のヒト塩基性FGFタンパク類似体は、bFGF-C78/
96Sであり得る。

【００２６】本発明はまた、ヒト塩基性FGFの拮抗体を
提供する。上記のヒト塩基性FGFの拮抗体は、塩基性FGF
における最初の24個のアミノ酸末端残基を欠失し得る。

【００２７】

【発明の実施の形態】Ａ．繊維芽細胞成長因子 ２つの異なったウシ（および類似のヒト）繊維芽細胞成
長因子は、他の人々により均一にまで精製され、そして
部分的にあるいは完全に配列決定されている。両因子
は、ウシの脳および副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞、
ヒトの臍静脈内皮細胞、ウシの副腎皮質ステロイド産生
細胞、顆粒膜細胞および脈管平滑筋細胞などの培養細胞
を用いたインビトロ分析において有糸分裂活性を示す。
これらの細胞培養を用いるインビトロ分析は、Gospodar
owicz，D.,ら、J Cell Physiol(1985) 122：323-332；
および Gospodarowicz，D.ら、J Cell Biol (1983)97：
1677-1685によって述べられている。ごく最近、別のイ
ンビトロ分析が、Eschら、ProcNatl Acad Sci (USA)（1
985）82：6507-6511；およびGospodarowicz, D.,ら、JC
ell Physiol (1986) 127：121-136により報告された。
精製されたウシの塩基性bFGFは、ニワトリの漿尿膜分析
においてインビボで脈管形成能があることが示されてい
る（Gospodarowicz, D. ホルモン性タンパクおよびペプ
チドXII：205-230（アカデミックプレス））。精製され
たウシの酸性FGFは、同じ分析においてインビボで脈管
形成能があることが示されている（Thomas, K.A., et a
l,Proc Natl Acad Sci (前出)）。

【００２８】ウシの脳下垂体の塩基性FGFは、Esch, Pro
c Natl Acad Sci USA（前出）により完全に配列決定さ
れている；ヒトの配列は図１ａおよび図１ｂに示されて
いる。報告された一次配列は、146個のアミノ酸を含ん
でおり、図１ａ中の「10」番のプロリン残基で始まって
いる；この配列のＮ末端部分は、Bohlenら、Proc Natl
Acad Sci USA（前出）により先に報告された、天然のウ
シのタンパクのＮ末端と一致している。より大きな分子
量を有するヒトの塩基性FGFは、ヒトの肝細胞系列、SK-
HEP-1について、Sullivan, R.J.ら、J Cell Biol (198
5)101：108ａ；Klagsbrun, M.ら、Proc Natl Acad Sci
USA（1986）83：2448-2452；Klagsburn,M.ら、Proc Nat
l Acad Sci USA（1987）84：1839-1843により報告され
ている。長い型のFGFは、Sommer, A.ら、Biochem Bioph
ys Res Comm（1987）144：543（ヒトの胎盤組織）によ
り報告されており、同様に脳下垂体およびヒトの前立腺
組織由来のものは、Uneoら、Biochem Biophys Res Comm
（1986）138：580-588およびStoryら、Biochem Biophys
Res Comm (1987)142：702-709によりそれぞれ報告され
ている。ヒトの塩基性FGFのDNAにおいて、図１ａの上流
側配列を潜在的なATG翻訳開始コドンまで翻訳すること
は、図１ａにおいて残基10で示されるプロリンの上流側
のアミノ酸を含む、タンパクの別の型のものも生産され
得ることを示す。ATGコドンは、プロリン残基に対応す
るコドンから９コドン上流に存在する。遺伝子が真核系
で発現する場合、メチオニンがこのATGによりコードさ
れるのならば、開始メチオニンとして働き、プロセッシ
ングを受けて除去されることはかなり確かである。遺伝
子が組換えによって細菌系で発現する場合、このような
プロセッシングは、起こり得る場合も、起こり得ない場
合もある。従って、細菌で発現される「長い」型のタン
パクは、さらに８つまたは９つのアミノ酸配列をＮ末端
に含み、合計154個または155個のアミノ酸である。全て
の研究グループは、この伸長したFGFの多くが、そのＮ
末端でブロックされていることも示している。

【００２９】上述のインビトロ分析においてFGF活性を
有し、かつウシの脳下垂体の塩基性FGF（146個のアミノ
酸型）と類似していると推定されるＮ末端配列を有する
タンパクも、ウシの脳、副腎、網膜、およびヒトの胎盤
から単離されている。これらの組織のあるものから得ら
れた天然のタンパクは、不均一である--推定される15個
のＮ末端アミノ酸を欠く第２の型は、活性を保持してい
る（Gospodarowicz, D.,Meth Enz (1987),147A：106-11
9）。従って、ウシおよびヒトの塩基性FGFは、少なくと
も３つの型が存在する。成熟型は図１ａの10番目のアミ
ノ酸（プロリン）から始まり、推定の成熟型配列のう
ち、長い型はＮ末端にさらに８個のアミノ酸を含んでお
り、短い型は15個のアミノ酸を欠いている。従って、天
然で生産される「長い(long)」塩基性FGFは、154個また
は155個のアミノ酸を含み（Abraham, J. A.ら、EMBO J
(1986)5：2523-2528）、「基本型（primary）」塩基性F
GFは、146個のアミノ酸を含み、そして「短い(short)」
塩基性FGFは、131個のアミノ酸を含んでいると考えられ
ている。さらに上流にまで伸長した型が存在することも
可能である。これらのFGFは、非常に多くの塩基性アミ
ノ酸残基（リジン、アルギニン、ヒスチジン）を含んで
おり、従って中性pHの下で陽イオン性であるので、「塩
基性」FGFと呼ばれる。

【００３０】あるタンパクが前述の分析でFGF活性を有
し、ヘパリンに結合し、中性pHの下で陽イオンであり、
そしてウシの血清アルブミン（もし適当なら）、あるい
はウシ（またはヒト）のFGFもしくはそれの合成ペプチ
ドまたは天然ペプチドに対する他の抗体に結合した、ア
ミノ末端配列〔tyr¹⁰〕FGF(1-10)の合成類似体を用いて
調製された抗体と免疫的に反応する場合、このタンパク
をここでは塩基性FGF（またはbFGFと呼ぶ）と定義す
る。Baird, A.ら、Regulatory Peptides (1985)10：309
-317を参照されたい。

【００３１】酸性FGFは、他の人々によりウシおよびヒ
トの脳から単離されており、ヒトの酸性FGFの完全なコ
ード配列が決定され、これは図２で示される。

【００３２】この酸性タンパクはまた３つの活性型が知
られており、第１の型は図の「16」番のフェニルアラニ
ン残基で始まる140アミノ酸配列を有しており、第２の
短い型はアミノ酸22〜155に対応し、そしてＮ末端の伸
長型は2〜155に対応する（アセチル化によりブロックさ
れている）Burgessら、Proc Natl Acad Sci USA (1986)
83：7216。これらのタンパクは、不均衡な数の酸性ア
ミノ酸残基、すなわちグルタミン酸およびアスパラギン
酸を含んでおり、従って中性pHの下で陰イオンである。

【００３３】あるタンパクがインビトロ分析でFGF活性
を示し、ヘパリンに結合し、中性pHの下で陰イオンであ
り、そしてヒトまたはウシの酸性FGFあるいはそれの合
成ペプチドまたは天然ペプチドに対して調製された抗体
と免疫的に反応する場合、このタンパクをここでは酸性
FGF（または、ここではaFGFと呼ぶ）と定義する。

【００３４】酸性FGFおよび塩基性FGFは、上述のタンパ
ク、または図１ａ、図１ｂ、および図２に示されるアミ
ノ酸配列を有するタンパクを示すために、ここで用いら
れる。もちろん、これらの定義は、示された特定の配列
に限定されるものでなく、前述のインビト口分析および
免疫的交叉感受性分析によって測定したFGF作用物質の
生物学的活性が保持される限り、アミノ酸残基の欠失、
付加、延長または交換のような、偶然の変化あるいは計
画的に誘導した変化を含む類似体タンパクを包含する。
拮抗体活性を有するFGF類似体は、もちろん、変化した
活性および特異性を有する。

【００３５】ここで記述した種々のFGF類似体は、定方
向突然変異の技術により計画的に誘導した変化を有す
る。これらの類似体は、FGFの一般的な二次構造を保持
しているが、FGFの種々の拮抗体型および作用物質型を
生じるように突然変異を受けている。

【００３６】このような類似体の設計において、Shing
ら(Science(1984)223:1269-1299）は、塩基性FGFはヘパ
リンと強く結合していることをインビトロで実証してお
り、そしてMaciaq, T.ら、Science(1984)225:932は、酸
性FGFもまたヘパリンと結合していることを報告してい
る。このように、細胞外基質を含む細胞外環境に存在す
るヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン様グリコサミノグ
リカン、およびヘパラン様グリコサミノグリカンは、イ
ンビボでFGFと結合し得るようである。塩基性FGFはイン
ビトロにおいて脈管および毛細血管の内皮細胞により産
生される細胞外基質中で合成されるので（BairdおよびL
ing, Biochem Biophys Res Comm (1987)142：428-43
5）、ヘパリン結合能が小さい塩基性FGF類似体は、潜在
能が高められる。なぜなら、より多くのFGFがその標的
レセプターに達し、そして細胞外環境のヘパリンおよび
ヘパリン様化合物により隔離されないからである。これ
らの類似体は、処置にあたり必要とされる各類似体の投
与量が少ないので、治療上より有用である。

【００３７】Bairdら（Rec Prog Horm Res (1986)42：1
43-205）は、近年ヘパリンとの結合を仲介し得る塩基性
FGFの領域である、図３に示される26〜31番の残基およ
び115〜120番の残基を推定している。恐らく芳香族残基
と共にクラスター化している塩基性残基の、ヘパリンと
の結合を仲介する能力は、他のタンパクに関して以前に
記述されている（Schwarzbauerら、Cell(1983)35：421-
431；Cardinら、Biochem Biophys Res Comm(1986)134：
783-789）。ここで記述されるbFGFに作られる変異は、
分子の２次構造（例えば、αヘリックス、βシート、回
転モチーフ（turn motifs））の変化を最少にするよう
に考慮して、これらの標的領域にある正に荷電したアミ
ノ酸を中性の残基または負に荷電した残基に置き換えて
いる。本発明の研究における主な機能的ヘパリン結合ド
メインであるとは思われない、上記で同定された推定ヘ
パリン結合ドメインとは対照的に、クラスター化された
塩基性残基を含む128〜138番の残基を有するbFGFの第３
の領域は、潜在的なヘパリン結合ドメインとして標的と
された。ヘパリン結合ドメインを標的とする好ましい変
異体は、bFGF-K128S, bFGF-K128E, bFGF-R129T, bFGF-K
134S, bFGF-K138S,およびK128S/R129Tを含む。塩基性ま
たは正に荷電した残基を、グルタミン酸のような負に荷
電した残基を置換するのが好ましい。

【００３８】bFGFの類似体は、bFGF-XYZと定義される：
ここで、Ｘは変異を受ける天然のヒトのbFGF配列のアミ
ノ酸であり、Ｙはアミノ酸Ｘの位置であり、そしてＺは
Ｙ位置にＸの代わりに用いられるアミノ酸残基である。

【００３９】ヘパリンの結合を減少させるか、または除
去することが見い出されているbFGFの変異は、結果とし
て作用物質活性または拮抗体活性のいずれかを有する類
似体を生成することが見出された他の変異と組み合わせ
ることもできる。

【００４０】ここで与えられる教示に従って、さらにFG
F類似体を作ることも、当業者の範囲内である。この教
示においては、ヘパリンの結合に重要なこれらの残基
は、他の中性アミノ酸（例えば、セリン、アラニン、グ
リシンなど）または負に荷電したアミノ酸（例えば、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸）に変えられるか、あるい
はここで記入したHPLCヘパリン−アフィニティー分析で
試験されるようなヘパリン結合活性を減少させるように
欠失させられる。酸性型FGFの類似体は、上述のように
正に荷電したアミノ酸を欠失させるか、またはヘパリン
−結合ドメインに対応する正に荷電したアミノ酸（23〜
27，115〜120，127〜137）を中性もしくは負に荷電した
アミノ酸に置き換えることにより構築され得る。

【００４１】細菌で生産された組換えタンパクは、活性
型で回収するのが困難であるらしいということが見い出
されている。例えば、細菌で生産されたシステインを含
有するタンパクは、しばしば生物学的機能を阻害し得る
間違った分子内システインを生成する（ヒトのインター
ロイキン２；Wangら、Science（1984）224：1431-143
3、およびヒト繊維芽細胞インターフェロン；Markら、P
roc Natl Acad Sci (USA)(1984) 81：5662-5666を参照
のこと）。天然のFGFタンパクに存在する１個またはそ
れ以上のシステイン残基を修飾することは、間違ったジ
スルフィド結合の形成を最小限に抑え、FGFタンパクを
安定にするための還元剤を使用する必要性がなくなり、
このために多量体形成または間違ったジスルフィド結合
を減少させる。そのことにより、組換えにより生産され
た類似体の回収量を増加させ、終始単量体型に保つこと
によりFGF調製物の均一性を高め、その貯蔵安定性を改
善し、そして創傷に適用した場合のその半減期を減ら
す。予期せずにこれらの類似体は増大した生物学的活性
を有することが示されている。

【００４２】一般に、上述のシステイン残基における修
飾は、得られるタンパクのアミノ酸置換に対応して、あ
る特定のシステインを指定するコドン内の１個のヌクレ
オチドを変えることにより行われる。システイン残基
は、塩基性型FGFでは、37、78、96、および101番めの位
置に生じ、酸性型では31、98および132番めの位置に生
じる。天然のFGFのジスルフィド構造は知られていない
ので、FGFの１個および複数個のシステイン置換を両方
とも、ここに例示する。これらの修飾がタンパク類似体
の１次構造に変化を生じさせたとしても、システイン置
換類似体が他の拮抗体の変化と組み合わされてないのな
らば、好適な類似体は、FGFにより正常に誘導される細
胞応答に影響を与える能力を一般に保持する。

【００４３】これらの同様のシステイン置換体が前述の
ヘパリン−結合変異体のような他の類似体の置換体と組
み合わせて作られ得、さらに実例となるFGF類似体が生
産される。同様に、前述のFGF類似体のいずれかを、１
個もしくはそれ以上の以下にあげるアミノ酸置換を有す
るように修飾し得、所望の類似体が生産される。

【００４４】bFGF活性を有する拮抗体は、糖尿病性の網
膜症、後水晶体線維増殖病、血管新生緑内障、慢性関節
リウマチ、血管腫、血管繊維腫、乾癬、アテローム硬化
症を包含する異常な持続性脈管形成に関連する種々の疾
病において（Folkman, J. およびKlagsbrun, M. Scienc
e (1987)235：442-447）、および避妊薬として臨床的に
適用される。さらに、ある種の固体腫瘍は増殖を維持す
るために新生血管形成を必要とすることが示されてい
る。脈管形成過程でFGFが果たす重要な役割が与えられ
ると、FGFの効果を阻害しうるFGF類似体はこれらの疾病
を治療するのに有用であることは明らかである。このよ
うに、FGFレセプターに結合する類似体は、まだ生物学
的応答を引き出さないか、または、小さい生物学的応答
を示す類似体は、有用な拮抗体特性を示す。

【００４５】塩基性FGFに対する特異的な細胞表面レセ
プターを生成する能力は、仔ハムスターの腎臓細胞（Ne
ufeldおよびGospodarowicz,J Biol Chem (1985)260：13
860-13868）、ウシ水晶体上皮細胞（Moennerら、Proc N
atl Acad Sci(USA)(1986)83：5024-5028）、Swiss 3T3
およびねずみ骨格筋細胞系（OlwinおよびHauschka,Bioc
hemistry (1986)25：3487-3492）、ならびにSwiss 3T3
および大動脈内皮細胞（Huangら、J Biol Chem(1986)26
1：11600-11607）を包含する種々の細胞型において記述
されている。さらに、結合についての研究は、塩基性お
よび酸性のいずれの型のFGFも、同じ高い親和性レセプ
ターと結合し得ることを示唆している（OlwinおよびHau
schka, 前出、ならびにNeufeldおよびGospodarowicz,J
Biol Chem(1986)261：5631-5637）。

【００４６】ホルモン（例えば、bFGF）とそのレセプタ
ーとの相互作用は、しっかりとした特異的な分子会合を
もたらす。この会合は、イオン対の形成またはファンデ
ルヴァールス力のようなよく知られた分子内の引き合う
力のいずれか、あるいは全部を伴い得る。この会合の特
異性および安定性は、「適合の正確さ」（レセプターお
よびホルモンの、２つのタンパクの正確な３次元分子構
造）、ならびに「適合のかたさ」（これらの分子構造
は、エネルギー的に好ましい近位のアミノ酸側鎖のため
に特異的な分子内の引き合いをもたらすような、正確な
アミノ酸配列から構成されているという事実）として考
えられ得ることに基づく。このように、レセプター結合
領域内のアミノ酸の置換、欠失および挿入は、該領域の
分子構造またはアミノ酸側鎖の相互作用（ホルモンとレ
セプターとの間における）のいずれか、あるいはその両
方に影響し得る。好ましい構造を安定させるかまたはア
ミノ酸側鎖の相互作用を高める変化は、レセプターの親
和性を増大させるが、好ましい構造を不安定にさせるか
またはアミノ酸側鎖の相互作用を減少させる変化は、レ
セプターの親和性を減少させる。前者の変化は、該変化
の作用体への導入がより効能のある作用物質を生じ得る
ので、そして該変化の拮抗体への導入がより効能のある
拮抗体を生じ得るので、本来有用である。後者の変化
は、レセプター結合にとってきわめて重要なアミノ酸断
片を決定するうえで有用である。

【００４７】Schubertら（J Cell Biol(1987)104：635-
643）は、bFGFのフラグメント（図３によれば33〜77番
および112〜129番の残基）を含む合成ペプチドが、bFGF
とそのレセプターとの結合を阻害することを示してい
る。従って、これらの領域は、FGFレセプター結合配列
を含むことがわかる。ヒトの塩基性FGFの推定されるレ
セプター結合領域および後者に隣接した付加的領域（例
えば、酸性FGFの相当するアミノ酸配列領域と強い相同
性を示す99〜111番のアミノ酸）内のヒト塩基性FGFに、
我々はアミノ酸置換を導入している。荷電した（正およ
び負）アミノ酸および芳香族アミノ酸の両者は、中性の
残基で置換する標的であった。これらの置換は、得られ
るタンパクの２次構造の変化を最少にするように考慮し
て行われた。従って、類似体D99AおよびR116Tは増大さ
れたレセプター親和性および3T3分裂促進活性を示す
が、類似体E105SおよびY112Aは減少されたレセプター結
合を示すと考えられる（本明細書の表７ａ〜７ｃを参照
のこと）。

【００４８】本発明の目的のために、次の用語を以下の
ように定義する。「作用物質（agonist）」とは、FGFレ
セプターと結合し、かつ典型的な生物学的応答をひき起
こし得るFGF類似体を意味する。例えば、FGF作用物質
は、FGFレセプターに結合し得るが、ヘパリンに結合す
る能力は小さいタンパクであり得、そのことによってよ
り効能のある治療薬が作られる。

【００４９】「拮抗体（antagonist）」とは、同じレセ
プター部位に対する競合的な機構によりFGFの効果を妨
げる、FGF類似体を意味する。拮抗体は、通常FGFに付随
している２次的な生物学的応答を誘導する能力が小さ
い。

【００５０】「部位特異的変異処理（site-specific mu
tagenesis）」または「定方向突然、変異（directed mu
tagenesis）」とは、オリゴヌクレオチド定方向突然変
異法の使用を意味する。この方法は、特定のコドンまた
は変えられるコドンの位置でbFGF遺伝子の領域と相補的
であるが該コドン内の１個または複数個の塩基が変えら
れている、合成オリゴヌクレオチドを使用する必要があ
る。この技術により、選択される他のアミノ酸のいずれ
かで置換される特定のアミノ酸を生じるように設計され
た遺伝子を、作製し得る。欠失が望まれる場合には、オ
リゴヌクレオチドプライマーは特定のコドンを欠してい
る。例えば、特定のシステインを、グリシン、バリン、
アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニ
ルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、ス
レオニン、またはメチオニンのような中性アミノ酸に変
換することは、好ましい方法である。セリンおよびアラ
ニンは、システインと化学的に類似しているので、最も
好ましい置換物質である。システインを欠失する場合、
天然の親タンパクまたは微生物により産生された野性型
bFGFよりも、成熟類似体はアミノ酸１個分だけ短い。

【００５１】「精製した」または「純粋の」とは、天然
の状態で見られる、通常それに付随する物質を含まない
ものを意味する。従って、例えば「純粋の」酸性ヒトFG
F(hFGF)は、ヒトの脳または脳下垂体における本来の環
境下で通常付随している物質を含んでいない酸性hFGFを
意味する。もちろん、「純粋」の酸性hFGFは、グリコシ
ド残基のような、それと共有結合によって結合している
物質を含み得る。

【００５２】「動作可能に連結した」とは、成分がその
通常の機能を果たすように位置している連結部を意味す
る。従って、コード配列に動作可能に連結した、制御配
列またはプロモーターは、このコード配列の発現に効果
的である。

【００５３】「制御配列」とは、DNA配列、あるいは所
望のコード配列に適切に連結した場合、このような配列
に適合した宿主においてその発現を有効にし得る配列を
意味する。このような制御配列には、少なくとも原核お
よび真核宿主におけるブロモーターが含まれるが、任意
に転写終止シグナルも含まれる。発現を効果的にするの
に必要な他の因子または補助的な他の因子もまた同定さ
れ得る。ここで用いられるように、「制御配列」とは、
単に、用いられる特定の宿主において発現を効果的にす
るのに要求されるどのようなDNA配列をも意味する。

【００５４】「細胞」または「細胞培養」、もしくは
「組換宿主細胞」または「宿主細胞」とは、内容から明
らかであるので、しばしば互換性をもって用いられる。
これらの用語は、直接の対象細胞を包含するが、もちろ
ん、その子孫をも包含する。偶然の変異あるいは環境の
変化により、必ずしもすべての子孫が親細胞と正確に同
一でないことが理解されている。しかしながら、このよ
うな変化した子孫は、その子孫が初めの形質転換細胞に
与えられた所望の性質を保持している限り、これらの用
語に包含される。この場合、例えばこのような性質は、
組換えFGFの類似体を生産する能力であり得る。

【００５５】Ｂ．一般的記載 用途および投与 本発明は成長因子タンパク類似体をコードするDNAを提
供し、この成長因子タンパク類似体は、２つの異った適
用をされる。第一の適用はFGFの適用と同様であり、類
似体は、血管形成および／または細胞の増殖または細胞
の生存を助長することにより、組織の修復を促進する。
これらの精製された成長因子は一般に、血管新生、再生
および治癒を促進するために、傷ついたもしくは病気に
かかった組織に局所的に適用される。適当な対象として
は、火傷、骨折、成形外科で扱われるような外科的擦過
傷、または治療を要する他のものがある。これら因子の
適用は治癒を促進するので、それらはまた、感染の危険
を減少させる。

【００５６】FGFが血管の新生を促進するということに
おいて価値がある適応症には、骨折、靭帯および腱の治
療、腱炎、および滑液嚢炎のような筋骨格の状態；火
傷、切傷、裂傷、褥瘡、および糖尿病患者に見られるよ
うな遅治癒性潰瘍のような皮膚の状態；および虚血症お
よび心筋梗塞症時の組織治療時、が包含される。

【００５７】創傷の治癒を促進する類似体のほかに、脈
管形成を阻害するFGF類似体を構築し得る。FGFの脈管形
成活性に拮抗的に作用しうるFGF類似体は、糖尿病性の
網膜症、および血管新生緑内障などの眼の網膜傷害；乾
癬および後水晶体線維増殖病などの皮膚病；慢性炎症；
慢性関節リウマチ；アテローム硬化症；および血管腫、
血管繊維腫などのある種の良性および悪性の腫瘍、なら
びに充実性腫瘍の増殖のような高度に血管形成するある
種の新生物；などの新生血管形成が主な病変である、あ
る種の疾病を治療するのに臨床上有用である。

【００５８】入手可能な賦形剤および担体を用い組換え
技術により生産される成長因子の処方は、当該分野で既
知の標準的な方法により調製される。このタンパクは、
所望であれば、制御された放出システムの一部として、
点眼剤、ローション、ゲル、散剤、包帯剤または抗生物
質のような付加的な活性成分を有する軟膏、として処方
され得る。

【００５９】表面の障害に関して最も適当である局所的
な投与においては、例えば、10ng/ml−100mg/mlの溶
液；好ましい範囲は10μg/ml−10mg/mlの溶液を用いる
標準的な局所的処方が採用される。そのような溶液は患
部に、１日あたり６回まで適用される。火傷への適用の
ようなある種の適用には、１回で投与するのが好まし
い。潰瘍への適用のような他の適用には、複数回で投与
するのが好適であり得る。もちろん軟膏または他の処方
物の濃度は、傷の程度または病期、ならびに患者の性質
に依存する。ほとんどの処方（プロトコル）において
は、用量は時間が経過して傷跡が残る可能性が減少する
につれて減じられる。例えば、第３度の火傷のような最
も重症の傷は典型的には100μg/ml組成物で処置され
る。しかし、治癒が始まると、用量は傷が治癒するにつ
れて徐々に約10μg/mlまたはそれ以下にまで下げられ
る。BSAを担体としたEGFの局所的処方は、Franklin, J.
D.,ら、Plasticand Reconstruc Surg（1979）64：766-7
00、に開示されている。

【００６０】持続性の脈管形成に関連する疾病の治療に
は、FGF阻害物質が適用され、その処方物の濃度は投与
の様式にかかわらず一般に10倍高い。高い投薬量は、FG
F阻害物質が細胞内で生産されたFGFと効果的に競合する
のを確実にする。このように乾癬および後水晶体線維増
殖病を治療するのに用いられるFGF阻害物質の局所的投
与のためには、投薬量は10倍に増加させる。

【００６１】関節炎ならびに骨および組織の治療には、
標的の近傍に直接的に移入した皮下移植物、ステープル
または遅延放出性の処方物の手段により、投与が局所的
になされることが好ましい。外科手術は骨の損傷のよう
な状況に対しては必要となることもあり得るので、直接
的な注入が有利である。遅延放出型は、Hydron (Lange
r, R.,ら, Nature(1976)263：797-799)または Elvax 40
P(Dupont)(Murray, J.B.,ら、In Vitro(1983)19：743-7
47)のようなポリマーに処方され得る。他の持続的放出
系は、Hsieh, D.S.T.ら、J Pharm Sci(1983)72：17-22
により示唆されている。本発明では望ましくはないが、
特に上皮成長因子の処方がBuckley, A.,Proc Natl Acad
Sci USA(1985)82：7340-7344に示唆されている。

【００６２】局所的投与で、持続的な放出の送達につい
ては、処方物中のFGF濃度は、状態の程度、37℃におけ
るFGFの安定性、該ポリマーからのFGFの放出速度、なら
びにFGF類似体の作用物質または拮抗体の性質を含む多
くの因子に依存する。一般的に、その処方は、Buckley
ら（Proc Natl Acad Sci (USA)（前出））により記載さ
れているように、因子が血清レベルの約100倍、また
は、組織濃度の10倍の、定常的な局部的濃度を達成する
ように構成される。5〜50ng/g湿潤重量の組織中のFGF濃
度(60ng/g湿潤重量でのEGFに比べて）を基準として、１
時間あたり50〜5000μgFGFの放出が許容され得る。もち
ろん、その初期濃度は傷の程度または病状の進度に依存
する。

【００６３】網膜傷害および血管新生緑内障のような眼
科学に一般的な疾病を治療するには、点眼剤処方物また
は眼への直接注入が２つの好適な投与経路である。これ
らの適用のための液体の処方物が当該分野で一般に知ら
れており、該液体処方物は、緩衝液もしくは生理食塩
水、または適当な賦形剤中の処方物を包含する。用量レ
ベルは、１μg/mlから10mg/mlの間で、１日あたり２〜
４回与えられ得る。

【００６４】FGFは、上皮成長因子（EGF）、形質転換成
長因子（TGF-αまたはTGF-）、インシュリン様成長因子
（IGF-１またはIGF-２）、および／または血小板由来成
長因子（PDGF）のような他の成長因子と、協奏的に、そ
して共働的にも働き得ると期待される。さらに、骨の治
療に関しては特に、それは副甲状腺ホルモンまたはカル
シトニンの作用物質または拮抗体と共働して働き得る。
なぜなら、これらの化合物は骨の増殖および再吸収を促
進するからである。従って、所望の組織の治療をより効
果的に達成するために、木発明のFGFが前述の因子の１
つもしくはそれ以上と同じ組成でもしくは同じ処方で投
与される実施態様もまた、本発明の組成物および投与処
方内に包含される。

【００６５】FGFは、軸索の成長、神経再生、および神
経単位の生存を促進させることに効果的であるので、そ
れは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような
ある種の神経性の疾患、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末
梢神経疾患および神経系の一般的老化の処置；そして脊
髄および末梢神経の外傷に有効であり得る。これらの症
状に対して薬剤を投与するときには、慢性関節リウマチ
および骨の治癒に関連して上に述べた処方と同様の処方
で注入することによるのが好ましい。この薬剤はまた、
FGFを生産する細胞培養物の注入という手段を用いて細
胞培養物を注入するという手段を用いても送達され得
る。神経性疾患の処置はまた、損傷を受けた神経組織の
機能を置き換るために、新しい細胞または組織を移植す
ることも包含し得る（例えば、パーキンソン病患者にお
ける副腎および胎児脳組織の移植）。このようなケース
では、移植の成功の度合いならびに移植された組織の機
能の程度は、移植に先立ちFGFまたは本発明の類似体調
製物で細胞培養物または組織を処理すること、および／
または移植の後にFGFまたは本発明のFGF類似体を投与す
ることにより高められる。

【００６６】FGFおよびその類似体はまた、髄液に直接
注入され得るか、またはカニューレ挿入法（canulatio
n）もしくは浸透圧ミニポンプを用いた投与により脳に
注入され得る。または、それらは全身に適用され得る。
アテローム硬化症末梢神経疾患など、ならびに腫瘍脈管
形成については、手術時に最初から適切な場所に送達さ
れるように薬剤を投与するため、全身に投与するのが好
ましい。

【００６７】全身的処方は一般に当該技術分野で既知で
あり、緩衝液または生理学的食塩水、または他の適当な
賦形剤中の処方物を包含する。FGF作用物質投与のため
の、用量レベルは、傷を治癒させ得る程度のレベルであ
る。しかし、組織培養または体外移植組織の維持、アテ
ローム硬化症または腫瘍脈管形成については、それは、
血清または培地の1.0〜100ng/mlで供給され得る。

【００６８】さらに、ここで述べているFGFタンパクに
より供給されるような脈管形成刺激により、インビトロ
における、プラスミノーゲン活性化因子(PA)およびコラ
ゲナーゼの放出が起こる（Gross，J.L.,ら、Proc Natl
Acad Sci(USA) (1983)80:2623-2627）。従って、本発明
のFGFタンパクもまた、これらの酵素に応答する状況の
処置に有用である。急性な状況（発作または心臓発作に
関連する血液凝固物が存在するような状況）では、凝固
物を溶解するために大用量のPAを直接投与することが必
要であり得るが、塞栓症を形成する慢性的傾向に対する
処置のためには、血流のPAの適当なレベルを維持するた
めにFGFを投与することが望ましいかもしれない。従っ
て、この症状に対して、筋肉内または皮下注射のような
従来の方法を用いて、薬剤、特にヘパリン結合能力が低
減した類似体の全身投与を行うことが好ましい。

【００６９】本発明は、上記の症状に関連した用途に、
純粋なFGF類似体の実際的な量を提供する。ここでは特
異的な成長因子が例示されており、その各々は少くとも
３つの形について明らかに活性がある。酸性および塩基
性類似体はいずれも、上述のように、長型、基本型、そ
して短型で発現すると考えられる。長型のＮ末端メチオ
ニンは、真核細胞系において該タンパクが生産されると
切り離されること、そして、続くアミノ酸残基が転写後
におそらくアセチル化により誘導されると考えられる。

【００７０】種々の型のFGFは認識されるシグナル配列
を持たないが、それは何らかの方法で分泌されている
か、または細胞から回収されているに違いない。なぜな
ら、それを産生している細胞の外の、膜結合受容体で、
作用するからである。従って、認識される構造分泌経路
によっては分泌され得ないので、その分泌は、例えば細
胞溶解による、またはエキソサイトシス（開口分泌）に
よる、あるいはヘパラン硫酸またはヘパリンのようなグ
リコサミノグリカンとの会合によるような他の方法で達
成される。FGFが自然に誘導されるほとんどの組織にお
いては、そして多くの哺乳類の発現系においては、その
ような放出は、通常に用いられているA23187（CalBioch
em）のようなカルシウムイオノフォアでのエキソサイト
シスを行うことにより達成され得る。インビトロの状態
においては、カルシウムイオノフォアは、１mM CaCl₂の
存在下で1〜10μMとなるように培地に加えられる。マク
ロファージまたは単球に由来する発現系では、リポポリ
多糖（LPS）を10μg/mlで添加するような、またはE.col
iエンドトキシン（Difco）(300ng/ml）を加えるような
他の活性化法が効果的であることが示されている。これ
らの刺激は、マクロファージ由来の類似因子インターロ
イキン１を放出することが示されている（March,C.J.,
ら、Nature (1985) 315：641-647）。これらの手法もま
た、以下で述べるように、付加的なシグナル配列なしで
細胞内で生産されると、組換えにより生産されるFGFタ
ンパクを放出させるのに採用され得る。細胞内で産生し
たタンパクの放出を起こさせる刺激には、ホルボールエ
ステルおよびトリグリセリドが包含される。

【００７１】遺伝子回収 例示したFGFをコードしている配列が得られるような一
般的な方法は、Abraham, J.A.ら、EMBO J(1986)前出、
およびAbraham, J.A.ら、Science(1986)233：545-548に
記載されているのと同様である。これらの参照文献の各
々を、ここに参照文献として引用する。

【００７２】FGF遺伝子の発現 ここで記述するDNA配列は、適当な発現系で発現され得
る。もちろん、ここで開示したDNAに対しても、ゲノム
もしくはcDNAのFGF配列を回収するための前述のプロト
コルを繰り返す必要はなく、従来の化学合成法が適当に
用いられ得る。その他、塩基性FGFをコードする遺伝子
は、寄託されたバクテリオファージλBB2から回収さ
れ、そしてヒト型に変えられ得る。部位特異的変異処理
は、DNAを調節することにより、あらゆる所望の形のタ
ンパクを得ることを可能にする。DNA配列は、バクテリ
ア、酵母、あるいは真核細胞を含むどのような宿主にで
も適した適当な制御を供給し得る。典型的な制御配列DN
Aおよび宿主を以下のＣ．１．節で与えている。

【００７３】特に、ここに記述されているFGF類似体の
いずれかをコードする完全なDNAは、例えば、FGFの各DN
A類似配列を得るために、組換え方法および合成方法を
組合せて用いながら構築され得る。これらの遺伝子配列
は、FGFコード配列に結合している都合のよい制限部位
を用いて構築されている。そのため、全遺伝子は、適当
に消化された宿主ベクターに挿入するため、約503bp Nc
oI- HindIII制限断片に挿入され得、FGFコード配列がベ
クター上に存在する制御配列と操作可能に連結される。
細胞内で産生された形態のFGFタンパク類似体は細胞溶
解により得られる。あるいは細胞からのそれらタンパク
の遊離は、所望形態でタンパクを得るために、開裂部位
に対するシグナル配列の既知の関係を利用して遺伝子配
列に融合した、異種シグナル配列を用いることにより刺
激され得る。プラスミドpUC9-TSF11およびpUC9delH3-pT
SF-3のようなE.Coli細胞と適合可能な制御系を利用する
細菌の発現系は、特に好ましい。これらのベクターに
は、pUC9(MessingおよびVieira, Gene(1982)19：259-26
8）に由来する。このpUC9は、pBR322およびM13mp9の一
部と、複数のクローニング部位ポリリンカーとを有す
る。

【００７４】このように産生された組換えFGFタンパク
を、次いで、天然起源からFGFを精製するために用いら
れる方法と同様の方法で精製する。しかし、このタンパ
クは出発材料の極めて大部分を占めているので、精製は
かなり簡単である。

【００７５】Ｂ．標準的方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、オリゴヌクレオチド
の構築、部位特異的変異処理の実施などに用いる技術の
大部分は、当該分野で広く実施されている。そして、ほ
とんどの従業者は、特異的条件および方法を記載してい
る標準資料に通じている。しかしながら、便宜上、以下
の節にその概要を示す。

【００７６】Ｂ．１．宿主および制御配列 原核生物および真核生物の両方の系を用いて、FGF類似
体をコードする配列を発現し得る；原核生物の宿主は、
もちろん、クローニングに最も便利である。最も頻繁に
使われる原核生物は、E.Coliのいろいろな株で代表され
る；しかしながら、他の微生物の株も使用し得る。宿主
に適合した種より導かれる複製部位、選択可能なマーカ
ーおよび制御配列を含むプラスミドベクターが用いられ
る；例えば、E.Coliは、典型的には、pBR322の誘導体、
すなわちBolivar,らGene (1977)2:95,によってE.Coli種
より誘導されたプラスミドの誘導体、を用いて形質転換
される。pBR322は、アンピシリン耐性およびテトラサイ
クリン耐性の遺伝子を含んでいる。従って、所望のベク
ターを構築する際に保持され得るかあるいは分解され得
るような、複数の選択可能なマー力一を与える。一般に
用いた原核生物制御配列（ここでは、リボソーム結合部
位配列に加えて、任意にオペレーターを伴った、転写開
始のためのプロモーターを含むと定義される）は、−ラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（la
c）プロモータ系(Changら、Nature（1977）198：105
6）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel
ら、Nucleic Acids Res (1980)8：4057)、ラムダ由来の
Ｐ_Lプロモーター（Shimatakeら、Nature(1981)292：12
8）およびＮ遺伝子リボソーム結合部位、ならびにtrp-l
ac(trc)プロモーター系（AmannおよびBrosius,Gene (19
85)40：183）のような一般に用いられるプロモーターを
含む。

【００７７】細菌に加え、酵母のような真核微生物も宿
主として、用いられ得る。数多くの他の株または種を一
般に利用し得るにもかかわらず、サッカロマイセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の実験用菌株、
べ一カー酵母（Baker's yeast）が最もよく用いられ
る。例えば、Broach，J. R.,Meth Enz（1983）101：307
の、２μの複製起点、または他の酵母の適合した複製起
点（例えば、Stinchcomb，et al,Nature(1979)282：39,
Tschumper, G., et al, Gene (1980) 10：157および C
larke, L., et al.,Meth Enz (1983) 101：300を参照）
を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベクターに対す
る制御配列は、解糖酵素の合成に対するプロモーター
（Hess, et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7：149；Ho
lland, et al.,Biochemistry（1978）17：4900）を含
む。当該分野に既知の他のプロモーターには、３−ホス
ホグリセレートキナーゼのプロモーター（Hitzeman, et
al., JBiol Chem (1980)255：2073) が含まれる。転写
が増殖条件および／または遺伝的背景により制御される
という付加的利点を有する他のプロモーターとしては、
アルコール脱水素酵素２、インチトクロームＣ、酸性リ
ン酸水解酵素、窒素代謝に関連する分解酵素；アルファ
ー因子系、マルトースおよびガラクトース利用に応答す
る酵素に対するプロモーター領域がある。また、ターミ
ネーター配列は、コード配列の３'末端に存在すること
が望ましいと考えられている。このようなターミネータ
ーは、酵母由来の遺伝子においてコード配列に続く３'
未翻訳領域に見い出される。

【００７８】もちろん、多細胞生物由来の真核生物の宿
主細胞培養中で、ポリペプチドをコードする遺伝子を発
現させることも可能である。例えば、Axelら、4,399,21
6を参照されたい。これらの系は、イントロンをスプラ
イシングし得るという付加的な利点を有し、従って、直
接用いることによってゲノム断片を発現させ得る。有用
な宿主細胞系列には、VERO, HeLa, 仔ハムスターの腎臓
（BHK）、CV-1、COS、MDCK、NIH 3T3、L、そしてチャイ
ニーズハムスターの卵巣（CHO）の細胞が含まれる。こ
のような細胞に対する発現ベクターには、普通、例え
ば、サルウイルス40(SV40)由来の初期および後期プロモ
ーター（Fiersら、Nature（1978）273：113）、あるい
はポリオーマ、アデノウイルス２、ウシの乳頭腫ウイル
スまたはトリの肉腫ウイルス由来のプロモーターのよう
なウイルスプロモーターなどの、哺乳類の細胞に適合す
るプロモーターおよび制御配列が含まれる。制御可能な
プロモーター、hMTII（Karin, M.ら、Nature（1982）29
9：797-802）もまた使用し得る。哺乳類の細胞宿主系に
おける形質転換の一般的な様相は、Axel（前出）により
記述されている。現在では、"エンハンサー（enhance
r）"領域も発現を最適化する際に重要であることは明ら
かである；これらは、一般に、非コードDNA領域におけ
るプロモーター領域の上流側または下流側に見られる配
列である。必要に応じて、ウイルスを起源として、複製
起点を得ることができる。しかしながら、染色体への組
込みが、真核生物におけるDNA複製における共通の機構
である。

【００７９】Ｂ．２．形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適した
標準的技術を用いることにより、形質転換が行われる。
Cohen, S.N.、Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69：2
110によって記述されたような塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理、またはManiatisら、分子クローニン
グ：実験の手引き(1982)コールドスプリングハーバープ
レス, P. 254, および Hanahan，D., J Mol Biol(1983)
166：557-580によって記述されたようなRbCl₂法は、原
核生物または実質的な細胞壁障害を有する他の細胞に対
して用いられ得る。このような細胞壁を持たない哺乳類
細胞に対しては、Grahamおよびvan der Eb, Virology
（1978）52：546）のリン酸カルシウム沈澱法、が用い
られ得るが、任意にはWigler，M.らCell（1979）16：77
7-785により修正された方法が用いられ得る。酵母への
形質転換は、Beggs, J. D., Nature (1978) 275：104-1
09の方法または Hinnen，A.ら（Proc Natl Acad Sci(US
A) (1978)75：1929）の方法に従って実施し得る。

【００８０】Ｂ．３．ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクター
の構築には、当該分野に既知の標準的な連結技術および
制限酵素技術を採用する。単離されたプラスミド、DNA
配列または合成オリゴヌクレオチドを所望の形に、切断
し、整え、そして再連結する。

【００８１】ベクターを形成するDNA配列は、数多くの
供給源から利用し得る。もとになるベクターおよび制御
系は、一般に、構築の際に配列の大部分として用いられ
る、利用可能な“宿主”ベクター上に見い出される。典
型的な配列は、上記のＣ．１．節に示されている。適切
なコード配列に対して、最初の構築は、通常、cDNAライ
ブラリー、ゲノムDNAライブラリー、または寄託された
プラスミドから適当な配列を回収することである。しか
しながら、この配列が開示されれば、それぞれのヌクレ
オチド誘導体から出発して、インビトロで全遺伝子配列
を合成し得る。例えば、500〜1000bpというかなりの長
さの遺伝子に対する全遺伝子配列は、それぞれに重複し
た相補オリゴヌクレオチドを合成し、そして一本鎖の重
複していない部分をデオキシリボヌクレオチド３リン酸
の存在下でDNAポリメラーゼを用いて充填することによ
り、調製し得る。この方法は、配列が既知であるいくつ
かの遺伝子の構築において成功裏に用いられた。例え
ば、Edge, M.D., Nature(1981)292:756;Nambair, K.P.
ら、Science(1984)223:1299;Jay, Ernest,J Biol Chem
(1984)259:6311を参照されたい。

【００８２】合成オリゴヌクレオチドは、EdgeらNature
（前出）および DuckworthらNucleic Acids Res (1981)
9：1691によって記述されたようなホスホトリエステル
法、あるいはBeaucage, S.L.,および Caruthers, M.H.,
Tet Letts(1981)22：1859および Matteucci, M.D., お
よび Caruthers, M.H., J Am Chem Soc (1981)103 :318
5によって記述されたようなホスホアミダイト法のいず
れかによって調製される。また、この合成オリゴヌクレ
オチドは市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用い
て調製し得る。アニーニング前の一本鎖のリン酸化（ki
nasing）あるいはラベルのためのリン酸化（kinasing）
は、50mM Tris(pH 7.6)、10mM MgCl₂, 5mMジチオスレイ
トール、１〜２mMATP, 1.7pmole〔λ−³²Ｐ〕-ATP（2.9
mCi/mmole）、0.1mM スペルミジン、0.1mM EDTAの存在
下で、過剰量、例えば約10単位のポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いることによって行われる。

【００８３】所望のベクターの成分が利用可能な場合に
は、それらを標準的な制限方法および連結方法を用いて
切断し、そして連結し得る。

【００８４】部位特異的なDNAの切断は、当該分野に既
知の条件下で、適当な１つの制限酵素（または複数の制
限酵素）を用いて処理することにより行われるが、特別
なものでは、これらの市販の制限酵素の生産者によって
指定された条件下において行われる。例えば、ニューイ
ングランドバイオラボの製品カタログを参照されたい。
一般に、約１μgのプラスミドまたはDNA配列を、約20μ
lの緩衝液中で、１単位の酵素によって切断する；実施
例においては、典型的には、過剰量の制限酵素を用いて
DNA基質を確実に完全分解する。変更することも可能で
あるが、約37℃にて約１〜２時間にわたってインキュベ
ーションし得る。各インキュベーションの後、フェノー
ル／クロロホルムで抽出することにより、タンパクを除
去する。さらに、引き続いてエーテル抽出を行い得る。
エタノールを用いて沈澱させることにより、水層から核
酸を回収する。必要に応じて、標準的な技術を用いてポ
リアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を
行うことにより、切断された断片を大きさによって分離
し得る。大きさによる分離に関する一般的な記述は、Me
thods in Enzymology（1980）65：499-560に見い出され
る。

【００８５】制限酵素で切断した断片は、４つのデオキ
シヌクレオチド三リン酸（dNTP）の存在下で、E.coli D
NAポリメラーゼＩの大きな断片（クレノー（Klenow))で
処理することによって平端な末端（blunt end）にする
ことが可能である。インキュベーションは、50mMトリス
（pH7.6）、50mM NaCl、６mM MgCl₂、６mM DTTおよび0.
1〜１mM dNTP中、20〜25℃にて15〜25分間にわたって行
う。クレノー断片は、５’一本鎖の突出部分を充填する
が、たとえ４つのdNTPが存在しても、突出した３’一本
鎖を元に戻す（chuw back）。必要に応じて、突出部分
の性質によって受ける制限内で、唯一のdNTP、または選
択されたdNTPを与えることにより、選択的に修復し得
る。クレノー断片で処理した後、混合物をフェノール／
クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させる。適当な
条件下で、S1ヌクレアーゼまたはBAL-31で処理すること
により、どのような一本鎖部分をも加水分解し得る。

【００８６】連結は、15〜50μlの容量で、以下の標準
的な条件および温度の下で行う：例えば、20mMトリス−
Cl（pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM DTT、33μg/ml BSA、1
0mM〜50mM Nacl、そして（“粘着末端”の連結に対して
は）０℃にて40μM ATP、0.01〜0.02（ワイス）単位のT
4 DNAリガーゼ、あるいは（“平端な末端”の連結に対
しては）14℃にて１mM ATP、0.3〜0.6（ワイス）単位の
T4 DNA リガーゼ。分子間の“粘着末端”の連結は、通
常、33〜100μg/mlの全DNA濃度（５〜100nMの全末端濃
度）で行う。分子間の“平端な末端”の連結は、１μＭ
の全末端濃度で行う。

【００８７】“ベクター断片”を用いたベクターの構築
においては、５’リン酸を除去し、ベクターの自己連結
を防ぐため、一般にベクター断片を細菌アルカリホスフ
ァターゼ（BAP）またはウシ腸アルカリホスファターゼ
（CIP）で処理する。分解は、約10mMトリス−HCl，1mM
EDTA中、pH８にてベクター１μgあたり、約１単位のBAP
またはCIPを60℃にて、約１時間にわたって用いること
によって行う。核酸断片を回収するために、調製物をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱さ
せる。あるいは、別の制限酵素で分解し、不要な断片を
分離することによって二重に分解されているベクターに
おいても再連結を防止し得る。

【００８８】配列の修正を必要とする、cDNAまたはゲノ
ムDNA由来のベクター上の部分に対しては、部位特異的
な突然変異を用い得る(Zoller, M.J.,およびSmith，M.N
ucleic Acids Res(1982)10: 6487-6500およびAdelman,
J.P.ら、DNA (1983)2：183-193）。これは、突然変異さ
せるべき一本鎖ファージDNAに対して、限られた不一致
以外は、相補的であって、所望の変異を示す。プライマ
ー合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。

【００８９】オリゴヌクレオチドプライマーのサイズ
は、突然変異が導入される遺伝子領域へのプライマーの
安定したハイブリダイーゼーションヘの必要性、ならび
に現在利用し得るオリゴヌクレオチド合成方法の限界に
より決定される。オリゴヌクレオチド定方向突然変異に
用いるオリゴヌクレオチドを設計する際に検討される要
因（例えば、全体のサイズ、突然変異部位に隣接してい
る部分のサイズ）は、Smith, M.および Gillam, S.,Gen
etic Engineering:Principles and Methods, Plenum Pr
ess(1981)3:1-32により記載されている。一般にオリゴ
ヌクレオチドの全長は、DNAポリメラーゼのエキソヌク
レアーゼ活性による突然変異の編集を避けるのに充分な
サイズであり、突然変異部位から５’および３’側に伸
長したものとの突然変異部位でのハイブリダイゼーショ
ンをできるだけ安定で特異的なものとする。本発明に従
って突然変異に用いられるオリゴヌクレオチドは、通
常、約18個から約45個の塩基、好ましくは約23個から約
27個の塩基を有する。それらは、通常、３’末端の変更
された、もしくは欠失されたコドンの少くとも３個の塩
基を有する。

【００９０】修飾されたbFGF遺伝子の調製法は、一般
に、他のアミノ酸をコードするようにコドンを除去また
は変更する合成ヌクレオチドプライマーを用いて、bFGF
遺伝子の特定のコドンに部位特異的変異処理を誘導する
ことを包含する。欠失が導入された場合、所望のタンパ
クを発現するためのDNA配列の適当な読み枠が保持され
得ることが確認されなければならない。

【００９１】プライマーは、bFGF遺伝子鎖がクローン化
されている、M13、fd、またはデルタX174のような一本
鎖ファージにハイブリダイズされる。ファージは、遺伝
子のセンス鎖かまたはアンチセンス鎖を有すると理解さ
れる。ファージがアンチセンス鎖を有する場合、プライ
マーは、他のアミノ酸をコードするコドンもしくはトリ
プレットの欠失を規定するコドンと適合しないが、突然
変異をうけるコドンを有するセンス鎖領域と同じであ
る。ファージがセンス鎖を有する場合、プライマーは、
欠失されるコドンと対になるトリプレットにおける適当
な不適合を除いては、突然変異を受けるコドンを有する
センス鎖領域と相補的である。ハイブリダイゼーション
に使用され得る条件は、Smith，M.および Gillam, S.
（前出）により記述されている。温度は、通常、約０℃
から70℃の間の範囲であり、より一般的には約10℃〜50
℃の間の範囲である。ハイブリダイゼーションの後で、
DNAポリメラーゼI、T₄DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、
または適切なDNAポリメラーゼを用いた反応により、プ
ライマーはファージDNA上で伸長される。得られたdsDNA
は、T₄DNAリガーゼのようなDNAリガーゼで処理すること
により、閉環状のdsDNAに変えられる。１本鎖領域を有
するDNA分子は、S1エンドヌクレアーゼ処理により分解
され得る。

【００９２】得られた二本鎖のDNAを、ファージを補助
する宿主細菌に形質転換させる。形質転換した細菌の培
養液を上層寒天に注ぎ、ファージを含む単一細胞からプ
ラークを形成させる。

【００９３】理論的には、新しいプラークの50％は、一
本鎖として変異型を有するファージを含み；50％はもと
の配列を有する。得られたプラークをリン酸化した合成
プライマーとハイブリダイゼーションさせた後、正確に
一致するものは結合し得るが、もとのDNA鎖と一致しな
いものは結合が阻止されるのに十分な、洗浄温度で洗浄
する。次いで、プローブとハイブリダイズするプラーク
を選択し、培養し、そしてDNAを回収する。

【００９４】Ｃ．４.構築の確認 以下に示した構築において、プラスミド構築に対する正
しい連結は、まずM. Casadaban博士から提供されたE.Co
li株 MC1061 (Casadaban, M.,ら、J Mol Biol(1980) 13
8 : 179-207)または他の適当な宿主をライゲーション混
合液で形質転換することによって確認する。好結果の形
質転換体は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性
または他の抗生物質耐性により選択するか、あるいは当
該分野に既知のプラスミド構築の方法に依存した他のマ
ーカーを用いて選択する。この形質転換体由来のプラス
ミドは、Clewell, D.B.らProc Natl Acad Sci（USA) (1
969) 62 : 1159 の方法に従って、また任意にクロルア
ンフェニコール増幅（Clewell, D.B.,J Bacteriol (197
2)110 : 667)を行った後、調製される。いくつかの小規
模のDNA調製法が一般に用いられる（例えば、Holmes,D.
S.,ら、Anal Biochem (1981) 114 ： 193-197および Bi
rnboim, H.C.,ら、Nucleic Acids Res (1979)7：1513-1
523)。単離されたDNAを、Kafatos, F.C.ら、Nucl Acid
Res(1977)7：1541-1552により記載されているようなド
ットブロット分析法や制限酵素分析により分析するか、
またはSanger，F.らProc Natl Acad Sci (USA)(1977)7
4：5463のジデオキシヌクレオチド法、さらにMessingら
Nucleic Acids Res(1981)9：309によって記述されてい
るようなジデオキシヌクレオチド法、あるいはMaxamらM
ethods in Enzymology (1980)65：499の方法によって塩
基配列を決定する。

【００９５】Ｃ．５. 例示される宿主 ここで、クローニングおよび原核生物の発現に用いた宿
主株は、以下のとおりである：クローニングおよび塩基
配列の決定に対して、そしてほとんどの細菌のプロモー
ターの制御下における構築物の発現に対して、MC1061、
DH1、RR1、B、C600hf1、K803、HB101、JA221およびJM10
1のようなE.coli株を用いた。

【００９６】Ｄ. 例示的な方法 以下の実施例は、本発明を例証することを意図したもの
であって、本発明を限定することを意図したものではな
い。FGFの出発物質をコードするDNAは、ますウシのゲノ
ムライブラリーをスクリーニングし、そして中枢プロー
ブを得、次いで、付加的なDNAの修復を行うことによっ
て得られた。しかしながら、中枢プローブの配列が、現
在、既知であり、従って、インビトロで化学的に構築し
得るので、この方法を繰り返す必要はない。さらに、ウ
シのaFGFおよびbFGF配列、ならびにヒトのaFGFおよびbF
GF配列を保持するバクテリオファージは、アメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託されている。このよ
うに、以下の実施例において突然変異を誘発する出発物
質として使用されるDNA配列は、種の材料源から入手し
得る。

【００９７】

【実施例】

（実施例１：pTrp-233細菌発現プラスミドの構築） １.合成のトリプトファンオペロンのプロモーターとオ
ペレーター調節配列の構築 図４に示す10個のオリゴデキシヌクレオチドをホスホト
リエステル法で合成し次いで精製した。１と10を除く各
オリゴデオキシヌクレオチドの500ピコモルを、60mMト
リス−HCl(pH8)、15mM DTT、10mM MgCl₂、20uCiの〔λ
−³²P〕−ATPおよび20単位のポリヌクレオチドキナーゼ
（P/L Biochemicals社）を含有する20μl中で、別々に3
0分間37℃でホスホリル化した。これにさらに、60mMト
リス−HCl(pH8)、15mM DTT、10mM MgCl₂、1.5mM ATP お
よび追加の20単位のポリヌクレオチドキナーゼを含有す
る10μlを添加し、さらに30分間37℃でインキュベート
した。インキュベートに続いて、得られた試料を５分間
100℃でインキュベートした。１と10のオリゴデオキシ
ヌクレオチドの500ピコモルを、ATPを除いた上記緩衝液
で30μlに希釈した。

【００９８】二本鎖対を構成する各オリゴデオキシヌク
レオチド（例えば１と２、３と４などのオリゴデオキシ
ヌクレオチド、図４）の16.7ピコモルを混合し、90℃で
２分間インキュベートし、次いで室温まで徐々に冷却し
た。次いで各対を他の対と結合して構築を行い、フェノ
ール／クロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱
させた。得られたオリゴデオキシヌクレオチド対を、５
mMトリス−HCl(pH8)、10mM MgCl₂、20mM DTTを含有する
30μl中で再構成させ、50℃で10分間加熱し、次に室温
まで冷却して、ATPを最終濃度0.5mMまで添加した。次
に、800単位のT4DNAリガーゼを添加して得られた混合物
を12.5℃で12〜16時間インキュベートした。

【００９９】得られた連結混合物をフェノール／クロロ
ホルムで抽出し、このDNAをエタノールで沈澱させた。
乾燥したDNAを再構成して30μlとし、EcoRIとPstIで、
１時間37℃にて消化した。得られた混合物をフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、
Laemmliら、Nature(1970)227巻、680の方法にしたがっ
て、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動法によっ
て、種々の二本鎖DNAセグメントを分離した。得られたD
NA断片を、ウェットゲル・オートラジオグラフィ化によ
って目視できるようにし、長さが約100bpに相当するバ
ンドを切取って、前記したのと同様にして一夜溶離し
た。切取った合成のＤＮＡ断片を、同様にEcoR IとPst
Iで消化したプラスミドM13-mp8もしくはM13-mp9（Messi
ngとVieiraの前記文献）に連結し、次いでジデオキシヌ
クレオチド配列分析法（Sangerらの前記文献）に付し
て、図４に示す設計された配列を確認した。この設計さ
れた配列は、トリプトファンオペロン（trp）の、プロ
モーター（-35と-10領域）とオペレーターの領域と、ト
リプトファンオペロンのリーダーペプチドのリボソーム
結合領域とを有する。図４に示す配列と類似の配列は、
E.coli内での非相同タンパクの発現に有用であることが
証明されている（Hallewell, R.A.とEmtage, S.Gene(19
80)９巻：27-47，Ikehara，M.,らProc Natl Acad Sci(U
SA)(1984)81:5956〜5960)。

【０１００】２.合成のtrpプロモーター／オペレーター
を有するプラスミドpTrp-233の構築 プラスミドpKK233-2(Amann, E. and Brosius, J.の前記
文献）を、NdeＩで完全に消化した後、Maniatisら（Mol
ecular Cloing，Cold Spring Harbor Laboratories, 19
82年, 394頁）の方法にしたがって、E.coliのポリメラ
ーゼＩの５単位で、末端に、クレノー断片（Boehrinber
-Mannheim, Inc.）を充填し、dATP、dCTP、dGTPおよびT
TPを50μM添加した。これを25℃で20分間インキュベー
トした。フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱させた後、NdeＩで消化したDNAを、連結し、E.
coliに形質転換した（Nakamura, K.らJ Mol Appl Gene
t,(1982) 1：289〜299)。得られたNdeＩ部位を欠いたプ
ラスミドはpKK-233-2-Ndeと命名された。

【０１０１】20ナノグラムのプラスミドpKK-233-2-Nde
をEcoRＩとPstＩで完全に消化した後、Maniatisらの前
記文献133-134頁にしたがって小ウシ腸ホスファターゼ
で処理した（Boehringer Manheim)。 EcoRＩとPstＩで
消化することによって、（前記の）M13RFから得た合成
のtrpプロモーター／オペレーター配列の50ナノグラム
を、 EcoRＩ−PstＩで消化したpKK-233-2-Ndeの10ナノ
グラムと混合し、前記のT4-DNA-リガーゼで連結し、次
いでE.coli JA221 1pp^-/I'1acIに形質転換した。得られ
た形質転換体を、100bpのEcoRＩ−PstＩ合成trpプロモ
ーター／オペレーターを含有するプラスミドDNAの存在
に対してスクリーニングし、次に適切なプラスミドを分
離してpTrp-233と命名した。

【０１０２】（実施例２：プラスミドpTSF11の構築） Ａ．ヒトの塩基性繊維芽細胞増殖因子 米国特許第869,382号上記文献；Abraham, J.A.ら、Scie
nce(1986)上記文献；およびAbraham, J.A.ら、The EMBO
Journal(1986)前記文献（これら文献はすべて本願に引
用されている）に記載のヒトcDNAとゲノムライブラリー
から塩基性FGFクローンを単離するためのハイブリダイ
ゼーションプローブを発生させるのに、ウシ塩基性FGF
cDNAを用いた。

【０１０３】塩基性ウシFGFとヒトFGFとでは、２つのア
ミノ酸しか差異がない。すなわち、123位には、ウシタ
ンパクSerを有しているが、Thrを有し、137位には、ウ
シタンパクはProを有し、ヒトタンパクはSerを有してい
る。これらの差異は、各場合、単一のヌクレオチドの差
異によるものであるから、ウシcDNAは、通常、下記のよ
うに部位に突然変異を誘発させることによって、前記の
ヒトタンパクをコードするよう修飾され、実際には、標
準の部位突然変異法を用いてこれらのコドンを変化させ
る。λBB2クローン（ATCC番号40196）をEcoRＩで消化し
て、bFGFタンパクをコードする部分にかかっている1.4k
bの領域をM13mp8のEcoRＩ部位に連結し、適切な方向に
挿入物を有するファージを回収した。そのインビトロで
の突然変異の誘発は、３つのオリゴヌクレオチドつま
り”汎用（universal）”プライマーである17-mer；コ
ドン123のコード配列を変える突然変異誘発性の16-mer
の5'-GAAATACACCAGTTGG-3'；およびコドン137の配列を
変える突然変異誘発性の17-merの5'-ACTTGGATCCAAAACAG
-3'の存在下で実施される。また突然変異を誘発された
ファージは、２度目のインビトロでのプライマーによる
突然変異誘発法に付され、突然変異誘発性の25-merの5'
-TTTTACATGAAGCTTTATATTTCAG-3'を用いて、翻訳終止コ
ドンから34bp下流にHind III部位を作る。得られた突然
変DNAの配列を、ジデオキシヌクレオチド配列分析法（S
angerら、前記文献）で決定し、所望の突然変異誘発が
起こったことを確認し、FGFをコードする領域にかかっ
ている約630bp断片をHind IIIで切取り、Hind IIIで消
化したpUC13に連結し、中間体のプラスミドpJJ15-1を得
た。

【０１０４】Ｂ．FGF遺伝子のＮ末端の合成コード領域
を有するGeneの構築 pJJ15-1に含有されるコード領域の５’末端（最初の125
塩基対）のＧ＋Ｃ含量を低下させるために、合成DNA断
片を、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下に
示す配列で構築した。そのオリゴヌクレオチドをアニー
ルして対にし、順に連結し、次いでHind IIIで切断した
m13mp9に連結した。mp9内の合成125bp挿入物の配列をジ
デオキシ配列決定法で確認した。その合成挿入物のNde
ＩからNhaＩサブ断片を単離して、塩基性FGFのカルボキ
シル末端の約3/4をコードする配列にかかっているJJ15-
1由来のHhaＩからHind IIIのDNA断片である377の塩基対
に連結し、次に発現ベクターpTrp-233のNdeＩ部位とHin
d III部位に連結して、プラスミドpTFS11を得た。

【０１０５】オリゴヌクレオチドは次のとおりである。

【０１０６】

【表１】 bFGFのアミノ末端領域に対する合成遺伝子の構造は次の
とおりである。

【０１０７】

【表２】

【０１０８】pTSF11のプラスミド遺伝子地図を、添付図
面の図５に示す。

【０１０９】（実施例３：突然変異を誘発された遺伝子
挿入物の発現ベクターの調製）プラスミドpUC9のポリリ
ンカー領域のHind III部位を除去して、図５に示す最終
の発現ベクターへの突然変異DNAのサブクローン化を容
易にした。約５μgのpUC9(new England Biolabs)を、Hi
nd III（20単位； new England Biolabs）を用い、メー
カーの指示に従って0.05ml中で消化した。次に反応物に
0.5mM dNTPsとDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片（５単
位；Boehringer Manheim）を補充し、15℃で30分間イン
キュベートした。次に反応物を、同体積のフェノール／
クロロホルム（１/１）で２回、クロロホルムで２回抽
出し、0.2Ｍ NaClとし、次いで2.5倍体積のエタノール
で沈澱させた。得られた沈澱物を遠心分離〔４℃にてマ
イクロファージ（microfuge）で15,000g〕によって集
め、凍結乾燥し、次いで１Ｘキナーゼリガーゼ緩衝剤、
１mM ATPおよびT4 DNAリガーゼ（20単位； new England
Biolabs）を合有する0.1ml中で、12℃にて４時間インキ
ュベートした。

【０１１０】反応生成物の一部（0.01ml）を、コンピテ
ントMC1061細胞にトランスフェクトするのに用いた。ト
ランスフェクトされた細菌は、100μg/mlのアンピシリ
ンを補充したＬ寒天プレート上で一夜増殖させた。DNA
を、アルカリ溶解法によって６個のコロニーから単離し
て、Hind III部位の喪失について試験した。プラスミド
pUC9delH3-1を含有する細胞を単離した。このプラスミ
ドDNAを調製し、10μgをPvuＩ（20単位； new England
Biolabs）とEcoRＩ（50単位； new England Biolabs）
とで、0.4ml中で、メーカーの指示にしたがって２時間
消化した。次いで反応生成物を、同体積のフェノール／
クロロホルム（１/１）で２回、同体積のフェノールで
２回抽出して、次にイソプロパノールで沈澱させた。生
じた沈殿物を遠心分離で集め、70％エタノールで洗い、
凍結乾燥し、0.008mlの水中に再懸濁させて、複製開始
点を有する、pUC9delH3-1の約2.07kbのPvuＩ-EcoRＩ断
片（断片Ａと命名）をアクリルアミトゲル電気泳動法で
単離した。

【０１１１】同時にpTSF11 DNA(10μg)を、0.15ml中
で、PvuＩ（10単位）とEcoRＩ（10単位）とともに、メ
ーカーの指示にしたがって37℃で１時間インキュベート
して、上記のようにして収集した。Trpプロモーター／
オペレーター領域、FGFをコードする領域および転写終
結配列を有し、pTSF11の断片Ｂと命名された。pTSF11の
約1.3kbのPvuＩ-EcoRＩ断片を、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で単離し、pUC9delH3-1の約2.07kbのPvuＩ
-EcoRＩ断片Ａに連結して、コンピテントE.coli HB101
細胞にトランスフェクトするのに用いた。この細菌を、
100μg/mlのアンピシリンを補充したＬ寒天プレート上
で一夜増殖させた。１つの組換え体pUC9delH3-pTSF-3由
来のプラスミドDNAが単離され、予想された制限地図を
有することを示した（Hind IIIはそのプラスミドを１回
だけ切断したが、Hind III-EcoR断片、Hind III-PvuＩ
断片およびHind III-PstＩ断片の大きさはそれぞれ、約
560と2900bp、800と2700bpおよび560と2900bpである。
プラスミドpUC9delH3-pTSF-3由来のDNAを単離し、メー
カーの指示にしたがって、得られたDNAの200μgを、1.0
mlで、100単位のHind III、100単位のEcoRＩ、５mMのス
ペルミジンとともに、37℃で４時間インキュベートし
た。反応物をブタノ一ルで抽出し、その体積を0.7mlに
減少させ、次に、上記のように、フェノール／クロロホ
ルムとクロロホルムで抽出した。DNAをエタノールで沈
澱させて収集し、アンピシリン耐性遺伝子、複製開始点
および２つの転写終始シグナルを有し、pUC9delH3-pTSF
-3の断片Ｃと命名された約2.9kbのHind III-EcoRＩ断片
を、ポリアクリルアミトゲルで２回続けて処理して単離
した。このベクター断片は、インビトロでの突然変異誘
発によって変化させられたいすれのDNAを発現させるの
にも好ましいベクターとして有用である。このベクター
の構築物を図５に示す。

【０１１２】プラスミドpUC9delH3-pTSF-3に非常によく
似ており、多部位ポリリンカー領域に自然のままのHind
III部位を有するプラスミドpUC9-pTSF11も、組換え法
によって調製されたFGF（全形態）と本発明の類似体の
いずれをも発現する好ましいベクターとして用いること
ができる。このベクターは、プラスミドpUC9とpTSF11と
をPvuＩとEcoRＩとで別個に消化して、pUC9から約2.07b
pのPvuＩ-EcoRＩベクター断片を単離し、pTSF11からはt
rpプロモーター／オペレーター領域、FGFコード領域お
よび転写終結配列を有する約1.3kbのPvuＩ-EcoRＩ断片
を単離し、これら２つの単離された断片を連結すること
によって構築された。次に、このベクターは、Hind III
-EcoRＩ DNAカセットを適切に消化されたベクター内に
挿入し、E.coli細菌に形質転換することによって、pUC9
-pTSF11について教示されたように、FGF類似体の遺伝子
配列を発現するのに用いることができる。

【０１１３】（実施例４：FGF突然変異体を調製する一
般的な方法）本願に記載のFGF類似体をコードするDNA配
列のすべてを構築するのに、下記のプロトコルを用いる
ことができる。プラスミドFGFt7910を、pTSF11の約603b
pのEcoRＩ-Hind III DNA断片（Trpプロモーター領域と
ヒトbFGFをコードするDNAを含んでいる）をm13mp9ベク
ターのEcoRＩ-Hind III部位に連結することによって構
築した。FGFt7910の一本鎖DNAを単離した後、ZollerとS
mithの前記の文献に記載されているインビトロでの突然
変異誘発を、本願のいずれかの表に示されている合成オ
リゴヌクレオチドの１つ以上を利用して行うことができ
る。

【０１１４】部位特異的突然変異誘発の条件は次のよう
に概括することができる。１μgの一本鎖DNAを、５ngの
ホスホリル化突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（適当
な突然変異をコードする23〜25merのもの）と１ngのM13
汎用配列決定用プライマー（P.L. Biochemicals社より
購入した17merのもの）とともに、10mMトリス−HCl（pH
7.5）および10mM MgCl₂の溶液0.01ml中で、５〜15分間5
5℃でハイブリッドさせる。反応物を室温まで冷却し、
0.01mlの0.12mM dXTPs、DNAポリメラーゼＩのクレノウ
断片５単位（Bocheinger Mannheim）、20単位のT4 DNA
リガーゼ（newEngland Biolabs）に添加し、15℃で４〜
６時間インキュベートした。次に反応物の一部（0.002m
l）をコンピテントJM101細菌に添加し、Ｌ寒天プレート
上で、37℃にて一夜プレート化を行う。得られたM13の
クローンのDNAを２枚のニトロセルロースのフィルター
の各々に移し、減圧下80℃で２時間焼き、次いでプレハ
イブリダイゼーション溶液：６×SSC（１×SSCは、150m
M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.1％ドデ
シル硫酸ナトリウム、２×デンハートの溶液（0.05％フ
ィコール、0.05％ポリビニルピロリドン、0.05％ウシ血
清アルブミン）および0.4mg/mlの変性サーモン精液DNA
中で、42℃にて２時間インキュベートする。次いで上記
フィルタを、５'末端を〔λ-³²Ｐ〕-ATPで標識付けした
適当な突然変異誘発性オリゴヌクレオチドとT4ポリヌク
レオチドキナーゼとを含有する新鮮なプレハイブリダイ
ゼーション溶液とともに42℃で３時間インキュベートし
た。次にフィルターを、４×SSCを用いて室温で15分間
２回と、65℃で15分間１回、およびTMACL溶液（３mMテ
トラメチルアンモニウクロリド、50mMトリス-HCl pH8.
0、２mM EDTA、0.1％SDS）中で室温にて１回と、TMACL
溶液中で65℃で１回洗浄して、一夜室温でＸ線フィルム
に暴露するのに用いる。Ｘ線フィルム上の黒い陽画に対
応するクローンを元のプレートから採取し、DNAを単離
し、次いでジデオキシ配列決定法によって、突然変異し
た配列の分析を行う。２つのオリゴヌクレオチドが二重
の突然変異体を産生するのに用いられている場合は、一
方のフィルターは、一方のオリゴヌクレオチドでスクリ
ーニングされ、他方のフィルターは第２のオリブヌクレ
オチドでスクリーニングされる。二重の突然変異体は、
両者のオリゴヌクレオチドに対して正のシグナルを持っ
ている。

【０１１５】突然変異したM13クローンのDNA複製型を調
飽し、EcoRＩとHind IIIで消化し、突然変異FGFをコー
ドするDNA断片を、アガロースゲル電気泳動法で単離す
る。得られたDNA断片を、pUC9delH3-pTSF-3の断片Ｃ
（実施例３に記載し、図６に示す）連結し、コンピテン
トHB101細胞にトランスフェクトし、次いで100μg/mlの
アンピシリンを補充した。Ｌ寒天プレート上で一夜増殖
させる。コロニーを選択し、100μg/ml泌のアンピシリ
ンを補充したＬブロス中で増殖させ、次いでプラスミド
DNAを細菌から単離する。得られたDNAをコンピテントE.
coliＢ細胞（Luriaand Delbrck,Arch Biochem(1942)1：
111）を形質転換するのに用いる。

【０１１６】（実施例５：塩基性FGF類似体bFGF-C34/10
1Sの調整）この実施例では、ヒト塩基性FGFタンパクの3
4位と101位のシステイン残基をセリン残基に変化させる
ことにより二重突然変異を製造した。突然変異原性の23
-merの５'-ACGTCTGTACTCCAAAAACGGTG-３'(#2022)（コド
ン34の配列を変える）、および突然変異原性の23-merの
５'-TACAGACGAGTCTTTCTTTTTG-３'(#2323)（コドン101の
配列を変える）の各々約２μgを、50μlの１×キナーゼ
／リガーゼ緩衝液（７mmトリス−HCl pH7.6、10mm MgCl
₂、５mmジチオトレイトール）中、１mM ATPと５単位のT
4ポリヌクレオチドキナーゼとともに、37℃で30分間イ
ンキュベートした。ホスホリル化されたオリゴヌクレオ
チドを、１mMトリス-HCl pH8.0と１mMEDTAで２倍に希釈
した。

【０１１７】一重鎖のM13鋳型FGFt7910の１μgを、ホス
ホリル化されたオリゴヌクレオチドの2222と2323各々20
ngと汎用のM13配列決定用のプライマー（New England B
iolabs）の１ngとともに、10mmトリス-HCl pH7.5と10mm
MgCl₂の10μl中、55℃で20分間および室温で10分間イ
ンキュベートした。反応混合物に、0.5mM dXTPs、DNAポ
リメラーゼＩのクレノウ断片５単位、１mM ATPおよび20
単位のT4DNAリガーゼを補充し、15℃で５時間インキュ
ベートした。得られた反応混合物２μlを、コンピテン
トJM101細菌を形質転換するのに用いた。得られた形質
転換細胞を37℃で一夜プレート上で培養し、得られたM1
3DNAを前記のようにしてニトロセルロースのフィルター
に移した。各オリゴヌクレオチド（#2222と#2323）１μ
gを、１mCiの〔λ-³²P〕-ATP(new England Nuclear #NE
GO35C、約５mCi/ナノモル）を冷ATPの代わりに用いるこ
と以外前記したのと同様にしてホスホリル化した。得ら
れた放射性プローブを、二重フィルターに各別に添加
し、前記したのと同様にして処理した。得られたオート
ラジオグラフからの正シグナルに対応するM13クローン
を単離し、Sangerらの前記文献の方法によって、一重鎖
M13 DNAを製造した。得られたM13 DNA鋳型（#8725）
を、ジデオキシ配列決定法によって分析した結果、予想
した変化が含まれていることが分かった。

【０１１８】M13鋳型#8725の二重鎖複製型分子（RF）
を、Birnboim and Doly,Nucl Acids Res(1979年）７
巻、1513〜1519頁の方法で単離した。この方法では、感
染されたJM101から単離た50μlのM13ファージ#8725を、
50mlのJM101培養物（飽和培養物、Ｊブロスで20倍に希
釈）に接種するのに用い、次いで37℃で６時間増殖させ
た。細菌を遠心分離によって集め、Birnboim and Doly
の前記文献に記載したのと同様にしてDNAを単離した。
約５μgのRFDNAをメーカーの説明どおりに１×Hind III
緩衝液0.4ml中で、Hind IIIとEcoRＩの各々40単位によ
って、37℃にて２時間かけて切断した。次に反応混合物
を、等体積のフェノール／クロロホルム（１/１）で２
回とクロロホルムで２回抽出し次いでエタノールで沈澱
させた。得られたDNAを遠心分離によって採集し、70％
エタノールで洗い、凍結乾燥し、次いで20μlの１mMト
リス-HCl pH8.0と１mM EDTA中に再懸濁させた。得られ
たEcoRＩ-Hind III断片を、メーカーの指示にしたがっ
て、GENECLEAN(BI0101 Inc.；米国、カリフォルニア
州、ラ・ジョラ）を用いてアガロースゲル電気泳動法で
単離した。約50ngのEcoRＩ-Hind III挿入物を、pUS9del
H3-pTSF-3のEcoRＩ-Hind IIIベクター断片Ｃに連結し
て、コンピテントMC1061細胞を形質転換するのに用い
た。FGF類似体を精製するために、得られた細菌を実施
例７に記載したのと同様に処理し、次に精製された類似
体を、副腎皮質内皮（ACE）細胞を刺激する性能につい
て、実施例８に示すようにして試験した。

【０１１９】システインからセリンヘの置換部分を有す
る他の突然変異体を構築して細菌中に発現させた。これ
らの構築物は１〜４個のCys→Ser置換部分を有してい
る。これら置換部分すべてによって、各種レベルの活性
をもったFGFタンパクが得られる。物理的な構築物を下
記の表３に挙げる。これらのFGF類似体タンパクは各々
ヘパリン親和性カラムを用いて単離した。

【０１２０】

【表３】

【０１２１】⁺bFGFの類似体をbFGF-XYZと定義する（但
しＸは突然変異されている未変性のヒトbFGFの配列のア
ミノ酸、Ｙはアミノ酸Ｘの位置およびＺはＹ位置でＸの
代わりに置換されているアミノ酸残基）。多重突然変異
が示されている。未変性のbFGFタンパクの領域の欠失を
伴う突然変異を、Ｘ〜Ｚの残基を含むアミノ酸によって
形成される欠失領域について挿入語句（Ｘ−Ｚ）で示し
てある。^# インビトロで突然変異誘発に用いたオリゴクレオチ
ド。^* 突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドの番号。 注：上記の凡例は、以下の表と、類似の説明すべてに適
用できる。特定のアミノ酸を示す一文字のコードは次の
とおりである。

【０１２２】

【表４】

【０１２３】以下の表５に記載したbFGF類似体の、ウシ
副腎皮質内皮細胞の増殖を刺激する性能について試験し
た。以下に示すように、二重突然変異体のbFGF-C78/96S
は、活性が野生型bFGFよりも増大している。保存位置34
と101、すなわちヒトとウシのaFGF、ウシとアフリカツ
メガエルのbFGF、マウスint2、ヒトhstおよびヒトKS3を
含むFGF類縁分子のファミリー全体を通じて保存されて
いる位置のシステインが変ると、生成した類似体の活性
は著しく減少した。

【０１２４】

【表５】 ^*２個の別個の測定値の平均⁺ ３個の別個の測定値の平均

【０１２５】（実施例６：ヘパリン結合性の測定）bFGF
類似体とヘパリンとの相互作用は、ヘパリン−セファロ
ース樹脂からタンパクを溶離するのに必要なトリス−塩
酸緩衝溶液のイオン強度（NaCl濃度）によって特性が決
定される。この分析法によってヘパリン−セファロース
樹脂に結合したbFGF類似体を除去するのに要するNaClの
濃度が測定される。

【０１２６】Bio-Rad Laboratories社（米国、カリフォ
ルニア州、リッチモンド）が、ヘパリンをBio-Gel TSK-
50樹脂に導入することによってヘパリン−5PWカラムを
製造した。このカラム（75×7.5mm内径；４〜６mg／ml
のヘパリン）を、２台のBeckman 110B型Solvent Delive
ry Modu1e，１台のBeckman 421型制御器および１台のKr
atos Spectraf1ow吸光度検出器757型とともに使用し
た。試料を0.5M NaCl，20mMトリス-HC1 pH7.5中のカラ
ムに入れ、次いで0.6〜3.0Mの勾配液で溶離した。タン
パクを214nmにおける吸光度で監視した。各種の試料の
伝導率を試験し、NaCl緩衝標準溶液と比較して、上記勾
配液のNaCl濃度を決定した。吸光度検出器で得たデータ
を集め、Access^*Chrom(Nelson Ana1ytical, Inc., Cupe
rtino)を用いて分析した。

【０１２７】実施例５のシステインが置換されたFGF類
似体をヘパリンHPLCで分析した。類似体のbFGF-C78/96S
は、ジチオトレイトール処理ありの場合(図７ａ)とジチ
オトレイトール処理なしの場合（図７ｂ）に単一の種と
して溶出する。このことは、野生型bFGFが、ジチオトレ
イトール処理された場合には単一の種として溶出するが
（図７ｃ）、還元剤が存在しない場合は非相同性の種と
して溶出する（図７ｄ）のと著しく異なっている。その
上、この二重突然変異体は、野生型bFGFの場合のように
逆層HPLCまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって
分析された場合、全く非相同性を示さない。

【０１２８】単一のシステインが置換された突然変異体
のC78SとC96Sは、上記のように分析した場合、得られた
生成物の非相同性が野生型bFGFに比べて減少する。

【０１２９】同じ上澄み画分の分裂促進活性を、以下に
述べる内皮細胞増殖測定法またはBalb/C3T3チミジン補
足測定法(Hauschkaら(1986年),J Biol Chem. 261巻, 12
665〜12674頁）を利用して試験した。

【０１３０】（実施例７：組換体のヒトbFGFとbFGF類似
体の、単離と、インビトロ活性の特性決定）この実施例
では、約100μｇの組換え体bFGFを、細菌から単離する
方法を述べる。この方法は、大量を得るために規模を大
きくすることができる。適切なプラスミドを有する細菌
を、100μg/mlのアンピシリンを補充したＬブロス中で
一夜増殖させる。１×M9塩（Maniatisら、前記文献）0.
4％グルコース、2μg／mlチアミン、200μg/ml MgSO₄・7
H₂O,0.5%カザミノ酸、100μM CaCl₂および100μg/mlアン
ピシリン含有の100μl中に、０.2mlの培養物を接種し、
振盪機にて37°で増殖させる。550nmの波長で光学密度
が0.1に達した時、培養物に、20μg/mlのインドールア
クリル酸を補充する。光学密度が1.0に達した時、細菌
を遠心分離(5000rpm，４℃、15分間）によって採集し、
ドライアイス／エタノール浴中で急速凍結させ−80℃で
貯蔵する。細菌のペレットを、0.02Ｍトリス−塩酸pH7.
5, 0.6MNaCl，1mM PMSF，80ng／mlアプロチニンおよび1
0μgのリゾチームを含有する1.0ml中に再懸濁し、４℃
で15分間インキュベートする。得られた混合物を、Soni
cator Ce11 Disruptor（加熱システム）を用いて３のセ
ッティングで５回超音波処理を行う。反応生成物を、DN
アーゼＩ（100単位）とRNアーゼＡ（100単位）とともに
15分間４℃で培養し、次いで15分間４℃にて10,000rpm
で遠心分離する。3.0M NaCl，10mMトリス-HCl pH7.5で
予め洗浄し、0.6M NaClと0.02Mトリス-HC1 pH7.5で平衡
化された8.0mlのヘパリン−セファロースカラム（Pharm
acia社）に、上記の遠心分離で得られた上澄み液を注入
する。280nmの吸光度から判定してタンパクが検出され
なくなるまで、カラムをO.6M NaClで洗浄する。次いで
カラムを1.0M NaClで洗浄し、結合寄質を、2.0M NaCl，
20mMトリス−HCl pH7.5で溶離する。生成物質の精製
は、５mMのジチオドレイトールの存在もしくは不在下の
緩衝液中で行うことができる。

【０１３１】（実施例８：分裂促進性の測定）Gospodar
owiczら、J Ce11 Physiol(1985年）122巻、323-332頁、
に記載されている副腎皮質も管内皮(ACE）細胞増殖測定
法で、FGF類似体の野生型FGFに対する活性物質活性もし
くはアンタゴニステト活性を試験する。個々の類以体を
以下のようにして試験した。約１×10⁴の細胞を、10％
仔ウシ血清、50単位／ウエルのペニシリンおよび50単位
／ウエルのストレプトマイシンを補充したDME16の２ml
を入れたファルコン(Fa1con)６ウエルプレートにプレー
トした。各試料と野生型(ウシ脳下垂体塩基性)FGFの適当
な希釈物(1pg/mlから1μg/mlの最終濃度まで)の10μl
を、細胞に添加した。負の対照として、FGF試料を添加して
いない６ウエルを同時に試験した。プレートは37℃で48
時間インキュベートし、細胞試料は、適当なウエルに再
添加され、さらに37℃で48時間インキュベートした。次
に細胞をトリプシン処理して収集し、コールターカウン
ターで計数した。

【０１３２】ATCCから入手したBalb/C 3T3細胞を用い、H
auschkaら、1986年の前記文献に記載の方法によって、bFG
F製剤の時にDNA合成を刺激する性能を試験した。4.5g/l
グルコース、2.2g/l NaHCO₃、50単位/mlのペニシリン、5
0μg/mlのストレプトマイシンおよび10%仔ウシ血清（HY
CLONE）を含有するダルベッコの改質イーグル培地（DM
E;GlBCO）の0.2mlに、約20,000／ウエルの密度で96ウエ
ルプレート上に細胞を播種し、５％CO₂、95％空気のイ
ンキュベーター内で37℃にて、集密するまで（２〜３日
間）増殖させた。培養物を、0.01％ウシ血清アルブミン
含有の血清なしの培地に移した後、試験物質の適切な希
釈物0.01mlを添加した。培養物をさらに16時間37℃で培
養し、その後、培地を、0.01％ウシ血清アルブミン＋50
μCi／mlの〔³H〕チミジンを含有する血清なしの培地に
変更した。次にプレートを２時間培養した後、TCAの沈
降性カウントを次のようにして測定した。96ウエルのプ
レートを氷上に置き、培地を注意深く取外し、冷PBSで
２回洗浄し、次いで10％トリクロロ酢酸とともに４℃で
20分間培養した。残留放射性物質を0.1N NaOHで可溶化
してカウントした。

【０１３３】これらの測定法を、野生型塩基性FGFに対
する、FGF類似体それぞれの活性物質活性もしくは拮抗
体活性を試験するのに用いた。FGF類似体が塩基性FGFに
対する拮抗体として作用する可能性は、１〜1000ngのよ
うな適当な量の特定の類似体と１ngの塩基性FGFを混合
し、その混合物を上記の測定法で試験することによって
確認される。

【０１３４】（実施例９：レセプターと結合するFGF類
似体の構築）いくつかのオリゴヌクレオチドを構築し、
FGFレセプター競合的結合測定法で試験した。特異的突
然変異体を以下に示すが、単一アミノ酸の置換体、二重
アミノ酸の置換体および欠失体、突然変異体が含まれて
いる。

【０１３５】

【表６】

【０１３６】プラスミドpUC9delH3-pTSF11-3もしくはpU
C9-pTSF11のような適当な発現ベクターを用い、実施例７
に記載したのと同様にして、FGF類似体を調製し、ヘパ
リン−セファロースクロマトグラフィーで単離した。

【０１３７】競合結合測定法は、FGFレセプターに対す
る組換え塩基性FGFの相対的親和性と比較した。FGF類似
体の相対的親和性を測定するために確立された。FGFレ
セプターに対して高い親和性を有し、分裂促進活性を減
少させた類似体は、潜在的FGF拮抗体と呼ばれている。

【０１３８】この測定法は、各種濃度の未標識のFGFも
しくは類似体の存在下で、飽和濃度の〔¹²⁵Ｉ〕−塩基
性組換えFGF（10ng／ml）をBalb/c3T3細胞に結合させて
行われる。その結合は、平衡に達するまで４℃で３〜４
時間行われる。次いで細胞は、12倍の、0.1％ゼラチ
ン、pHを7.5に保持するために50mM Hepesを含有する２N
NaClで調製された塩類溶液で洗浄した。細胞を１Ｎ NaO
Hで可溶化し、細胞に結合した放射能を測定した。この
工程後、非特異的結合は５％もしくはそれより低く保持
された。50％まで特異的な結合を阻害するFGFの濃度に
対する50％まで特異的な結合を阻害する類似体の濃度の
比率をとることによって、FGFレセプターに対する類似
体の親和性は、ウシ脳下垂体FGFの親和性を基準にして
測定された。比率が１より小さい場合は、類似体がFGF
よりもFGFレセプターに対して親和性が高いことを示
し、比率が１より大きい場合は、類似体がFGFよりもFGF
レセプターに対して親和性が低いことを示した。

【０１３９】ACE測定法によって分裂促進活性が低下し
ていることがわかったいくつかの類似体は、ウシ脳下垂
体FGFと比較して、FGFレセプターに対する親和性が同等
もしくは高かった。ACE測定法による野性型の活性が５
％より小さいが、FGFレセプターに対する親和性が同等
もしくは高い突然変異体には、R31S、K35S、D46A、R48
L、D50A、V52K、R53L、R90T、E100S、E100A、R106L、R1
16T、R118L、K119Sが挙げられる。これらの化合物は拮
抗体として有用であり得る。

【０１４０】また、これらの類似体も、前記の測定法の
いずれか１つを用いて分裂促進性を試験した。試験結果
を以下の表７ａ、表７ｂおよび表７ｃに示す。

【０１４１】

【表７ａ】

【０１４２】

【表７ｂ】

【表７ｃ】

【０１４３】^*bbaはaa95-155の代わりにhFGF(a)を有す
るhFGF(b)である。^# KKRはK27，K30およびR31の代わりに中性の置換部(M,S
もしくはT）を有する。^@ C-４-Ｓは、４個の炭素が各々４個のＳで置換されてい
る。 注：データは、野性型FGFの活性に対する種々のFGF類似
体の活性を示す。第１行に括弧書きで、各測定法での野
性型FGFのED₅₀実測値を示す。ED₅₀は、類似体が、その
測定法での最大値の半分の反応をもたらす濃度であり、
そのためこれは力価の尺度となる。野性型の活性より低
い活性を示す類似体については、より高い濃度が野性型
FGFに等しい活性をもたらすために必要である。そのた
めに、上記類似体のED₅₀値は野性型より高い(最大値の
半分の刺激をもたらすのには、より多くの量の類似体が
必要である)。

【０１４４】野性型の活性より高い活性を示す類似体に
ついては、野性型の活性に等しい活性をもたらすのに
は、より少ない量の類似体でよい。そのために、このよ
うな類似体のED₅₀値は野性型より低い（類似体が最大値
の半分の刺激をもたらすのには、より少ない量の類似体
でよい）。各測定法における各種類似体のED₅₀値は、野
性型の活性を百分率で示してある（野性型FGFのED₅₀値
を類似体のED₅₀値で割って100倍した％値）。そのため
に、100％より大きな値を示す類似体は、その測定法に
おいて、野性型FGFより大きな活性を有すると考えら
れ、一方100％より小さい値を示す類似体は、その測定
法において、野性型FGFより小さな活性を有すると考え
られる。

【０１４５】「3T3Mito.／ヘパリン−／＋」：このデー
タは、3T3/Balb/c細胞の分裂促進性測定法で観察された
活性（チミジンの取込み）を、この測定法で野性型FGF
について観察された活性を基準にして示す。１μg／ml
のヘパリンが存在しない場合と存在している場合に得ら
れた活性値をそれぞれスラッシュ印の左と右に示してあ
る。

【０１４６】「ACE Mito.／ヘパリン−／＋」：このデ
ータは、副腎皮質内皮細胞増殖測定法で観察された活性
を、この測定法で野性型FGFについて観察された活性を
基準にして示す。1μg/mlのヘパリンが存在しない場合
と存在している場合に得られた活性値をそれぞれスラッ
シュ印の左と右に示してある。

【０１４７】「FGF-Rc Comp．/ヘパリン-/+」:このデータ
は、競合結合測定法で測定され、FGFレセプターと結合
する類似体の相対的性能を示す。その値は、この測定法
における、類似体のED₅₀値の野性型FGFのED₅₀値に対す
る比率である。そのために、1.0より小さい値を示す類
似体は、レセプターに対する親和性が野性型より大きい
と考えられる。1.0より大きい値を示す類似体は、レセ
プターに対する親和性が野性型FGFより小さいと考えら
れる。１μg／mlのヘパリンが存在しない場合と存在し
ている場合に得られた活性値をそれぞれスラッシュ印の
左と右に示してある。

【０１４８】野性型のレセプター活性に近い活性を示
し、分裂促進性測定法において低い相対的活性を示す類
似体は、潜在的な拮抗体である。

【０１４９】「ヘパリン／溶出」：このデータは、類似
体が、高速液体クロマトグラフィーにてヘパリン−TSK
カラムから溶出する、適切な塩(NaCl）の濃度を示す。
1.58Mより小さい値を示す類似体は、この方法から判断
してヘパリンとの結合が減少していると考えられる。1.
58にほぼ等しい値(1.53〜1.63）を示す類似体は、この
方法から判断して、ヘパリンに対する親和性が野性型bF
GFと著しく変わっていると考えられる。

【０１５０】（実施例１０：ヘパリンとの結合性が減少
したFGF類似体）ヘパリンとヘパリン様化合物との結合
に関連する、塩基性FGF分子の領域を目標として突然変
異を誘発させて、FGF類似体を構築した。これら類似体
は、変更されたアミノ酸に対応する特定のヌクレオチド
配列を有し、以下に列挙する。

【０１５１】

【表８】

【０１５２】これらの遺伝子配列は、先に教示したよう
な適当な発現ベクターに挿入して、得られたタンパクの
減少したヘパリン結合活性について試験した。表７ａ〜
７ｃに記載した結果は、128〜138の残基を有するbFGFの
領域が、ヘパリンが結合する標的領域であることを示し
ているけれども、この領域でアミノ酸が置換されると、
ヘパリン−SPW樹脂からの溶出によって測定されるよう
に、ヘパリンとの結合が減少する。

【０１５３】（実施例１１：Ｎ末端の欠失によるFGF拮
抗体の調製）pUC9delH3−PTSF−３由来で平滑末端処理
をしたNdeI-HindIII FGF断片をM13mp18のSmaI-HindIII
部位にサブクローン化した。１つのオリゴを用い、イン
ビトロ突然変異誘発法を利用して、新規のNdeI部位を、
FGF分子のアミノ酸25の位置に導入した。この新規NdeI
部位は、FGF断片をサブクローン化するための新しい制
限部位および短い形態のFGFの新しい翻訳開始部位とし
て役立っている。使用される突然変異誘発性オリゴの配
列は次のとおりである。

【０１５４】5'−TTG GGT CTT TGA AGT GCA TAT GTG GG
A AGG CAC CAG短くしたFGFを、発現用のpTSF−デルベー
ター−galに、NdeI−HindIII断片としてサブクローン化
し、得られたプラスミドをbFGF（25〜155）と命名し
た。タンパクの配列は、そのタンパクのＮ−末端がヒス
チジンであることが確認された。pTSF−デルベーター−
galは、pTSF11をPvuIIとEcoRIで消化して、β−galのプ
ロモーターのオペレーターの近位側の半分を欠失させる
ことによって構築した。

【０１５５】Ｎ末端欠失類似体のbFGF(25〜155）を前記
のヘパリン−セファロースクロマトグラフィーで精製し
た。この類似体は、3T3分裂促進測定法ではbFCFと類似
のED₅₀を示し、作用物質活性を示す。3T3測定法におけ
る刺激は、野性型とbFGF(25〜155)の両者について約１n
g／mlでピークになるが、(ヘパリンなしで測定した）類
似体についての刺激のレベルは野性型bFGFについて観察
されるほど大きくはない。したがって、bFGF(25〜155）
は部分的に作用物質の特徴を示す。さらに、bFGF(25〜1
55)類似体の濃度が１ng／mlより大きいと、明らかに活
性が阻害される。一方、野性型bFGFについては、3T3測
定法における活性は約１ng／mlでピークになり、１μg
／mlでさえもそれほど減少しないが、10ng／mlでのbFGF
(25〜155）の活性は、野性型bFGFの活性の約15％であ
り、100ng／mlでは、bFGF(25〜155)は実質的に活性がな
くなる。

【０１５６】FGF類似体bFGF(25〜155)は、１ng/ml以上
の濃度でその性能を測定した場合FGF拮抗体であり、こ
れはヘパリンなしで野生型FGFの活性を阻害する。１ng/
mlの野生型FGFによってもたらさせる活性は、１ng/mlの
bFGF(25〜155)の存在下で約50％減少し、10ng/mlのbFGF
(25〜155)の存在下で約75％減少し、そして100ng/mlのb
FGF(25〜155)の存在下では95％より高い値で減少する。
この阻害性が競合的であるということは、類似体bFGF(2
5〜155)の存在下で観察される野生型bFGFのED₅₀のシフ
トで説明される。野生型bFGFのED₅₀は、類似体bFGF(25
〜155)が存在しない場合１ng/mlより小さく、10ng/mlの
bFGF(25〜155)の存在下では約10ng/mlであり、そして10
0ng/mlの類似体bFGF(25〜155)の存在下では約100ng/ml
である。これらのデータは、bFGF(25〜155)は、恐らく
野生型FGFと類似の親和性でFGFレセプターと結合する
が、活性が変化する（減少する）ことを示唆している。
したがって、ヘパリンが存在しない場合、FGF類似体bFG
F(25〜155)は、野生型FGFの競合的阻害剤であり、その
ため、拮抗体となる。

【０１５７】FGF類似体bFGF(25〜155)は、FGF拮抗体活
性を示したとはいえ、部分作用物質活性を保持してい
る。その上、この類似体の作用物質活性は、ヘパリンの
存在によって高められるが、拮抗体活性は阻害される。
それ故、類似体のFGFレセプ夕ーに対する親和性を大き
く減少させることなく、類似体の活性をさらに減少させ
るために、配列をさらに変えることが望ましい。bFGF(2
5〜155)の活性が減少する理由は知られていないが、野
性型FGFのＮ-末端セグメントの完全性が、十分な活性を
得るのに必要であると予想される。そのために、さら
に、レセプター結合領域を除くＮ-末端領域に欠失およ
び／またはアミノ酸置換を行うことによって、レセプタ
ー結合性を減少させることなく、活性を減少させること
ができる。例えば、25〜33位のアミノ酸領域の欠失によ
ってこの目的は達成される。他の方法としては、78〜98
位もしくは130〜155位のアミノ酸のような他の非レセプ
ター結合領域のアミノ酸を欠失させるかまたは変更する
方法がある。結局、この類似体の拮抗体活性は、ヘパリ
ンによって阻害されるので、ヘパリンの結合を減少させ
る置換部を導入することによって、作用物質活性を減少
させ、相対的に拮抗体活性を増大させることができる。
これらの方法は組合わせて用いることができ、本発明の
範囲に含まれるものである。

【０１５８】（実施例１２：発現ベクターの構築および
哺乳動物細胞中でのFGFの類似体の安定な発現）FGFをコ
ードするcDNA配列は、上のC.1節で述べたように、種々の
宿主中で組換えタンパクを生産するために、最も都合よ
く用いられる。しかし、哺乳動物系での発現は、該哺乳
動物宿主が、本来生産されるタンパクで見られるプロセ
ッシングに類似した翻訳後プロセッシングを行い得るた
め、細菌系での発現に比べて有利である。

【０１５９】このベクターを構築するために、このクロ
ーン化されたFGFをコードする類似体は、EcoRIおよびHi
ndIIIで切断され、必要であればEcoRIリンカーまたは他
の適当なリンカーが付けられる。そしてこれは、次い
で、pHS1や、以下に記述のようなその誘導体といった適
当な宿主ベクターに挿入される。

【０１６０】宿主ベクターの構築 pHS1 このプラスミドpHS1は、哺乳動物宿主中での挿入DNAの
発現に適している。このプラスミドは、p84H(Karin，
M、et al，Nature(1982)299：297-802)からの840bpのhM
T-II配列を含む。この配列は、hMT−II遺伝子の−765の
位置のHindIII部位から、＋70のBamHI開裂部位にわたっ
ている。pHS1を構築するために、プラスミドp84HをBamH
Iで完全なまでに分解し、末端のヌクレオチドを除去す
るべくエキソヌクレアーゼBAL-31で処理し、次いでHind
IIIで分解だ。所望の840bp断片をpUC8(Vieira，Ｊ.,et
al，Gene(1982)19：259-268)に連結した。このpUC8はHi
ndIIIおよびHincIIの分解により、開いている。この連
結混合物は、大腸菌HB101をAmp^Rに形質転換するために
用いられた。pHS1と名付けられた１つの候補プラスミド
は単離され、ダイデオキシ配列法により、配列決定され
た。pHS1は、好都合な制限部位を含むポリリンカーの上
流側に、hMT-II制御配列を含む。

【０１６１】使用可能な宿主プラスミドpHS1は、メタロ
チオネインプロモーターのほかに、付加的な制御要素を
含有させて、さらに改変され得る。特に、SV40のような
ウイルス系のエンハンサー要素だけでなく、hGHのよう
な他のタンパクの3’非翻訳領域に結合した終結シグナ
ルも包含され得る。

【０１６２】ウイルスエンハンサー MT-IIプロモーターに動作可能に連結された状態にあるS
V40エンハンサーを含む一対の宿主発現ベクターは、pHS
1のMT-IIプロモーター配列の前方にあるHindIII部位
に、1120bpのSV40 DNA断片を挿入することにより、構築
された。このSV40DNA断片は、SV40の複製起点まで及
び、5171番目のヌクレオチドから5243番目のヌクレオチ
ド（起点）と、107-250番目のヌクレオチドの72bp反復
構造とを含んでおり、そして後期ウイルスmRNAの５'末
端を含む起点側の1046番目のヌクレオチドにまで至る。
この1120bpからなるHindIII断片は、SV40DNA(Buchman，
A．R.,et al，DNA Tumor Viruses, 2d ed(J．Tooze，e
d.),Co1d Spring Harbor Laboratory,New York(1981),p
p.799-841)のHindIIIによる分解から得られ、増幅のた
めにpBR322にクローン化される。このクローニングベク
ターをHindIIIで切断し、そしてこの1120bpのSV40 DNA
断片をゲル電気泳動法により単離し、そしてpHS1(これ
はHindIIIにより分解し、CIP処理した）に連結した。得
られたベクター（これは、pHS1−SV(9)およびpHS1-SV(1
0)と名付けられた)はそれぞれ反対方向に、MT-IIプロモ
ーターを生じる断片を含む。pHS1-SV(9)では、エンハン
サーは、５’mRNAの転写開始部位から約1600bpのところ
にあり、また反対方向には、このエンハンサーは、５’
mRNAの転写開始部位からは、およそ980bpのところにあ
る。両方向とも動作可能であるが、エンハンサー配列が
転写開始部位に近い方向では、より高いレベルの発現を
示す。転写開始部位の250-400bp上流側にエンハンサー
を置くことを避けることは、最適であると考えられてい
る。

【０１６３】さらに、MTプロモーターのTATAボックスの
５'-末端から上流側に、それぞれ、190bp，250bpおよび
360bpに、SV40エンハンサーの３'末端を置いたベクター
が構築された。この構築は、ヒトMTプロモーター上流側
の制御領域の地図化に基づいてなされた。このことは、
Karin,M.,ら，Nature(1984)308:513-519に記述されてい
る。全ての構築物は、重金属による制御のための反復部
位を含む配列を保持している。しかし、190bpと250bpと
に分離した構築物は、これらの部位からさらに上流側に
あるグルココルチコイドによる制御のための配列を保持
してしていない。

【０１６４】これらのベクター（これは、pHS'-SV190,p
HS'-SV250およびpHS'-SV360と名付けられた)は、以下の
ように調製される:全ての構築物は、メタロチオネイン
プロモーターおよび上流領域を含む配列の長さ以外は一
致している。このプロモーターおよび上流領域は、pHS1
から切断された断片として供される。

【０１６５】pHS'-SV190に対し、pHS1がSacIIで分解さ
れ、平滑化され、そしてKpnIリンカーに連結される。次
いで、このDNAは、MT-II制御配列の適当な部分を遊離さ
せるために、EcoRIおよびKpnIで分解される。同様に、p
HS'-SV250では、pHS1がHgaIで分解され、平滑化され、K
pnIリンカーに連結された後、EcoRIおよびKpnIで分解さ
れる。pHS'-SV360に対して、最初の分解においてDdeIが
用いられる。

【０１６６】このSV40エンハンサーを含む中間ベクター
は、SV40のHindIII／KpnI断片（これは、5171番目の位
置から294番目の位置にまで及んでおり、また、KpnI部
位から50bpのところにエンハンサー要素を含んでいる）
を、KpnI／HindIIIで分解されたpUC-SVに挿入すること
により調製され、pUC-SVが得られる。(pUC19は、ポリリ
ンカー領域に、順番にHindIII、KpnIおよびEcoRIの３つ
の好都合な制限部位を含む）。この完成したベクター
は、上で記述のように調製されるKpnI／EcoRI断片を、K
pnI／EcoRIで分解されたpUC-SVに挿入することにより、
得られる。

【０１６７】それゆえ、先に改変された全てのベクター
は、SV40のエンハンサー要素を利用している。もちろ
ん、他のウイルスのエンハンサーであれば、同様の方法
で用いられるだろう。

【０１６８】転写終結配列 転写終結制御配列を供与するために、このコード配列、
およびヒト成長ホルモンの３’非翻訳配列を表すDNAをp
HS1に連結した。この中間ベクターは、hGHコード配列に
代えてこのベクターに続けて連結されたコード配列に対
し、hGH3’非翻訳配列を供与し得る。

【０１６９】このゲノム配列をコードするhGHを、BamHI
およびEcoRIで分解し、続いてポリアクリルアミトゲル
精製することにより、p2．6-3(DeNoto，et al，Nucleic
Acids Res(1981)19:3719）から単離した。このBamHIは
最初のエキソンの５’末端で切断する。EcoRIは機能遺
伝子の３’位で切断する。この単離された断片を、BamH
I／EcoRIで分解されたpHS1に連結した。この連結混合物
を大腸菌MC1061のAmp^Rに形質転換した。成功した形質転
換体は、制限分析により選抜し、所望のプラスミドpMT
−hGHgを含む株をさらに増殖させて、多量のプラスミド
DNAを調製した。

【０１７０】pHS1-SV(9)またはpHS1-SV(10)を構築する
ためではあるが、pHS1を代用するために、先に記述の方
法と同様の方法で、MTプロモーターの制御下にあるhGH
遺伝子を含み、SV40エンハンサーと動作可能に連結さ
れ、そしてそれぞれ、pHGHg-SV(9)およびphGHg-SV(10)
と名付けられた一対のベクター(pMT-hGHg)を得た。その
連結混合物は大腸菌1061をAmp^Rに形質転換するために用
いられた。そして適切な構造が確認された。

【０１７１】発現ベクターの構築 次いで、FGF類似体のいずれをもコードするDNA配列に適
応する宿主ベクターとして、phGHg-SV(10)を用いる。ph
GHg-SV(10)をBamHIおよびSmaIで分解し、クレノーで平
滑化し、そしてhGHコード配列を切断するためにCIPで処
理する。この開かれたベクターをNdeI（平滑末端）／Hi
ndIII（平滑末端）FGF類似体断片に連結し、所望の発現
ベクターpFGF-SV(10)を得る。

【０１７２】さらに、pHS1、および上で記述のような、SV
エンハンサーの種々の配置を含むべく改変されたpHS1を
包含するこれらの配列の発現を得るために、他の宿主ベ
クターが用いられてもよい。挿入は、この宿主ベクター
のBamHI/EoRI分解を用いての、類似の方法による。ま
た、酸性または塩基性FGF類似体の“長い”形態、“基本
の”形態あるいは“短い”形態のいずれをもコードする
べく改変されたDNAも用いられ得る。

【０１７３】これらのベクターは、以下で論じる目的の
ために、一般的にpMT-FGFと呼ばれる。

【０１７４】哺乳動物の組換え体によるFGFの生産 チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞を、F12培地
およびDME培地の１：１混合物から構成される培地上
で、12％ウシ胎児血清とともに生長させる。このコンピ
テント細胞を、pMT-FGFおよびpSV2：NE0(Southern，P.,
et al,J Mol App1 Genet(1982)1:327-341)で共形質転換
する。pSV2:NEOは、ネオマイシン類似体G418に耐性を与
える機能遺伝子を含む。この形質転換では、500ngのpSV
2-NEOおよび５μgのpMT-FGFを、Wigler，M.、ら、Ce11
(1979)16：777-785、のプロトコルに従って、リン酸カ
ルシウム−DNA共沈澱物中で、16mmディシュの細胞に適
用する。それとともに、これらをDNAに４時間さらした
後、15％グリセロールで２分間“ショック”を加える。
１日後、G418耐性コロニーのプールを与えるために、こ
の細胞を１mg/mlのG418にさらす。これらの耐性コロニ
ーはFGF生産のために分析され、次いでクローン化され
得る。

【０１７５】成功した形質転換体(これらはまたpMT-FGF
の安定な遺伝形質を有する）を、クローン単離体の精製
のため、低密度でプレート上にまく。これらの単離体の
少量を、FGF生産をうまく分析するために、10^-4Ｍの塩
化亜鉛にさらした後、多孔プレート上で生長させる。FG
Fの定量は通常の方法を用いて、適当なFGFタンパク類似
体に対し調製される抗血清に対して、標準的なELISAま
たはラジオイムノアッセイにより行われる。所望のFGF
を大量に生産するクローン分離体が選抜される。

【０１７６】適当な条件下にてFGF類似体を生産するべ
く示される細胞を、10％のウシ胎児血清で補足された基
本培地に1/10集密度でまき、一夜インキュベートし、次
いで、１×10^-4Ｍ〜３×10^-4Ｍの濃度範囲の塩化亜鉛を
加えることにより、FGFの生産を誘導する。２×10^-4M Z
nC1₂の最適の誘導条件下で、７〜10日間にわたりFGFの
レベルが上昇する。

【０１７７】望むなら、FGF類似体がこの溶解した細胞
から得られ、そして天然タンパクに対する先に述べた方
法によるか、または当業者に公知の他の標準方法によ
り、精製され得る。

【０１７８】さらに、先に論じたように、前述の構築物
により生産されるFGFタンパク類似体の分泌は、カルシ
ウムイオノフォアや他の適当な刺激剤によって開始され
るエキソサイトシスにより、達成され得る。CHO細胞に
より生産されるタンパクが、特に、LPSやホルボールエ
ステルの刺激により、放出されるということは期待でき
ないものの、例えば、CHO細胞に代えて、組換え宿主と
してマクロファージ由来の細胞系を用いることにより、
このような分泌が行われ得る。また、シグナル配列を与
えるために、その構築を変えることにより、通常の構築
経路を用いる分泌も、CHOや他の哺乳動物胞の宿主を用
いて行われ得る。もちろん、分泌を生じることは、タン
パク精製作業がずっと簡単になるので有利である。

【０１７９】1985年９月９日またはそれ以前に、出願人
はAmerican Type Culture Collection(ATCC)、Rockvill
e，MD，USA、にλファージのλBB2を寄託した。これは、
ATCC受託番号40196を割り当てられた、1986年9月12日ま
たはそれ以前に、λBB2(ATCC40196)の寄託条件は、微生
物の寄託に対する国際的な承認に関するブダペスト条約
(ブダペスト条約)で明記された条件に適合するように変
えられた。寄託された株が入手可能であるということ
は、その特許法に従って、いかなる政府の権威の下で許
された権利にも違反して、その発明を実施するためのラ
イセンスとして解釈されるべきではない。

【０１８０】

【発明の効果】本発明によれば、ヒトの酸性および塩基
性のFGFの類似体（ヒトaFGFおよびヒトbFGF）をコード
する組換えDNA配列が提供される。さらに本発明によれ
ば、これらのDNA配列を有する組換えベクター、このよ
うなベクターを用いて形質転換され、そしてこれらのDN
A配列を保持する宿主細胞、およびこれらの形質転換さ
れた細胞により生産される組換えタンパクが提供され
る。さらに本発明によれば、組換え技術を用いたこれら
の繊維芽細胞成長因子類似体の生産方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ヒトの塩基性FGFをコードする天然のDNA配
列、ならびにこの推定アミノ酸配列を示す。

【図１ｂ】図１ａの続きである。

【図２】酸性FGFをコードする天然のDNA配列、ならびに
この推定アミノ酸配列を示す。

【図３】ヒトの酸性FGFおよび塩基性FGFのアミノ酸配列
の比較、ならびに潜在的なヘパリン結合領域および受容
体結合領域を含む、変更の標的となる種々の領域を示
す。

【図４】合成トリプトファンオペロンプロモーターおよ
びオペレーター調節配列の構築、ならびにプラスミドpT
RP-233の制限酵素切断部位の地図を示す。

【図５】プラスミドpUC9delH3-pTSF-3の構築の流れ図で
ある。

【図６】FGF類似体の遺伝子配列のいずれかを、発現ベ
クターpUC9delH3-pTSF-3に挿入するのに用いた方法の説
明図である。

【図７】高速液体クロマトグラフィー（HPLC）ヘパリン
アフィニティーカラムを用いて、野性型bFGFを、二重シ
スティン置換FGF類似体bFGF-C78/96Sとを比較した結果
を示す。図７は、NaCl濃度勾配（0.6Ｍ〜3.0Ｍ）で展開
したヘパリンHPLCカラムからの10μgの還元型（図７
ａ）および非還元型（図７ｂ）bFGF-C78/96Sの溶出を示
す。還元条件下（図７ｃ）および非還元条件下（図７
ｄ）における、精製された野性型bFGFを用いて同様の実
験を、比較のために提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 598107909 2450 Ｂａｙｓｈｏｒｅ Ｐａｒｋｗａ ｙ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94043 Ｕ．Ｓ. Ａ. (72)発明者 ジュディス エー． アブラハム アメリカ合衆国 カリフォルニア 95129， サンホゼ， カントリー レ ーン 4901 (72)発明者 アンドリュー プロッター アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301， パロアルト， ノース カリ フォルニア 185 (56)参考文献 特開 平２−193（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト塩基性ＦＧＦタンパク類似体をコー
   ドする組換えＤＮＡであって、該タンパク類似体中で
   は、１個またはそれ以上のアミノ酸が、以下のアミノ
   酸：セリン₃₁、セリン₃₅、アラニン₄₆、ロイシン₄₈、ア
   ラニン₅₀、リシン₅₂、ロイシン₅₃、トレオニン₉₀、セリ
   ン₁₀₀、アラニン₁₀₀、ロイシン₁₀₆、トレオニン₁₁₆、ロ
   イシン₁₁₈、またはセリン₁₁₉によって置換され、そして
   該タンパク類似体はＦＧＦのレセプターに結合し、生物
   学的応答を誘導する能力が減少している、ＤＮＡ。
2. 【請求項２】 発現の制御配列に作動可能なように連結
   されている、請求項１のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２のＤＮＡであって、前記制御配
   列は転写終結シグナルを含む、ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 組換え宿主細胞に形質転換される、請求
   項２のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１のＤＮＡを含み、かつＦＧＦま
   たはその類似体を発現させるのに効果的な組換えベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 プラスミドpUC9-TSF11およびpUC9delH3-
   pTSF-3からなる群から選択される、請求項５のベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 請求項５のベクターであって、ＦＧＦタ
   ンパク類似体をコードするＤＮＡは、細菌、または哺乳
   類宿主に適合する制御配列に作動可能なように連結され
   ている、ベクター。
8. 【請求項８】 請求項５のベクターで形質転換された組
   換え宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項７のベクターで形質転換された細
   菌細胞、または哺乳類細胞。
10. 【請求項１０】 ＦＧＦタンパク類似体を製造する方法
    であって、該製造方法は、請求項１のＤＮＡを有する宿
    主細胞を培養すること、およびＦＧＦタンパク類似体を
    回収すること、を包含する、方法。
11. 【請求項１１】 前記宿主細胞が細菌細胞または哺乳類
    細胞である、請求項１０の方法。