JP3126348B2 - 組換えにより生産されたヒトｌｈ - Google Patents

組換えにより生産されたヒトｌｈ

Info

Publication number
JP3126348B2
JP3126348B2 JP11070356A JP7035699A JP3126348B2 JP 3126348 B2 JP3126348 B2 JP 3126348B2 JP 11070356 A JP11070356 A JP 11070356A JP 7035699 A JP7035699 A JP 7035699A JP 3126348 B2 JP3126348 B2 JP 3126348B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plasmid
fragment
dna
cells
digested
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP11070356A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11308992A (ja
Inventor
レッディ，ヴェムリ・ビー
ヒュング，ナンシー
ベック，アントン・カー
バーンスティン，エドワード・ジョージ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Research Systems ARS Holding NV
Original Assignee
Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems ARS Holding NV filed Critical Applied Research Systems ARS Holding NV
Publication of JPH11308992A publication Critical patent/JPH11308992A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3126348B2 publication Critical patent/JP3126348B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は組換えDNA技術を用
いてヘテロポリマータンパク質を生産することに関す
る。 【０００２】 【従来の技術】組換えDNA技術によって、各種のポリペ
プチド鎖が細菌、酵母および培養哺乳動物細胞のような
宿主細胞内で発現されてきた。J．C．フィッデス（Fidd
es）およびH．M．グッドマン（Goodman）のネイチャー
（Nature）第281巻，351〜356頁（1979年）およびJ．
C．フィッデスおよびH．M．グッドマンのネイチャー第2
86巻，684〜687頁（1980年）はヒト絨毛膜生殖腺刺激ホ
ルモン（ｈＣＧ）のαおよびβサブユニットのそれぞれ
のクローニングについて述べている。 【０００３】カナメ（Kaname）の米国特許第4,383,036
号はｈＣＧの生産方法を開示しており、この方法はヒト
リンパ芽球細胞を実験動物に移植し、その実験動物から
前記細胞を採取してインビトロで培養し、この培養物か
ら蓄積したｈＣＧを得るものである。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】一般に、本発明は１つ
の観点によれば複数のサブユニットから構成される生物
学的に活性なヘテロポリマータンパク質を提供し、各サ
ブユニットはそのサブユニットをコードする異種DNAを
含むところの自律的に複製する（すなわち、宿主細胞の
染色体に組込まれていない）発現ベクターを有する細胞
により合成される。 【０００５】 【課題を解決するための手段】好適な実施態様では、真
核細胞を用いてタンパク質を合成し、このタンパク質が
翻訳後に、最適にはグリコシル化によって、修飾され
る。このタンパク質はホルモン、最適にはｈＣＧ、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）などの性ホルモンもしくは甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）のような分泌タンパク質である。 【０００６】他の観点によれば、本発明は第１の発現ベ
クターを含む細胞を提供し、この細胞がそのベクターに
よって少なくとも部分的にコードされる生物学的に活性
なヘテロポリマータンパク質を生産することができる。
好適な実施態様では、第２の自律的に複製する発現ベク
ターがそのタンパク質の第２部分をコードするか、ある
いは単一の発現ベクターがそのタンパク質の少なくとも
２つのサブユニットをコードする。タンパク質はｈＣＧ
またはヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）であり、ベクター
は複製ウイルスまたはプラスミドであり、細胞はサルま
たはマウスの細胞である。ｈＣＧまたはＬＨの異なるサ
ブユニットの転写がSV40後期プロモーターの支配下にあ
る。または、タンパク質のαサブユニットの転写がSV40
初期プロモーターの支配下にありかつβサブユニットの
転写がマウスメタロチオネインプロモーターの支配下に
あるか、あるいは両方のサブユニットの転写がマウスメ
タロチオネインプロモーターの支配下にある。そしてこ
のマウスメタロチオネインプロモーターを含む発現ベク
ターがウシ乳頭腫ウイルス（BPV）ゲノムの少なくとも6
9％の形質転換領域を含む。 【０００７】また別の観点によれば、本発明は２つの異
なる異種タンパク質をコードする２つの遺伝子を含む自
律的に複製する発現ベクターを提供し、これらの遺伝子
は２つの異なるプロモーター（最適には、メタロチオネ
インプロモーターおよびBPVプロモーター）の支配下に
あり、別々のプロモーターを使用することにより有害な
組換えの可能性が都合よく最小限に抑えられる。 【０００８】本明細書で用いる「サブユニット」という
用語はタンパク質の一部分を意味し、この部分またはそ
の同族体もしくは類似体が本来別個のmRNAによってコー
ドされるものである。従って、例えばIgG免疫グロブリ
ンの重鎖および軽鎖はそれぞれサブユニットであると考
えられる。一方、インシュリンは２つのペプチド鎖で構
成されるが、これらのペプチド鎖は本来１つのmRNAによ
ってコードされ、翻訳後に自然に開裂されて２つのペプ
チド鎖となるので、サブユニットであるとは考えない。 【０００９】「発現ベクター」という用語は、宿主細胞
内での発現を可能にするところの調節配列の支配下にあ
る異種DNA（ベクターに対して異種のDNA）を含むクロー
ニングベクターを意味する。この種のベクターには複製
ウイルス、プラスミドおよびファージが含まれる。 【００１０】本発明は形質転換細胞の単一培養による生
物学的に活性なヘテロポリマータンパク質の生産を可能
にする。同一細胞内でヘテロポリマータンパク質の両サ
ブユニットが生産されることにより、別々の培養からの
サブユニットを再結合させて活性なヘテロポリマー分子
を構成する必要がない。この方法はまたタンパク質の活
性または安定性のために必要な翻訳後修飾（例えば、タ
ンパク質のグリコシル化および加水分解処理）を単一培
養中に受けるところのタンパク質の生産を可能にする。 【００１１】自律的に複製する発現ベクターの使用は、
宿主染色体の調節配列による望ましくない影響が意図す
るコーディング領域へ及ばないようにする。本発明の他
の利点および特徴は次の好適な実施態様の説明ならびに
請求の範囲から明らかになるであろう。 【００１２】今や、本発明の好適な実施態様について説
明するが、最初にその図面について簡単に説明する。 図面 図１はαｈＣＧcDNAクローン、SV40ウイルスDNAの一部
およびプラスミドpBR322の塩基配列を含むプラスミドp
αSVHVP1の作製を示す図面である。 【００１３】図２はβｈＣＧcDNAクローン、SV40DNAの
領域およびpBR322の一部（宿主大腸菌に対してアンピシ
リン耐性を付与する領域を含む）を組込んだプラスミド
pβSVVP1の作製を示す図面である。 【００１４】図３および図４はSV40DNAにαおよびβｈ
ＣＧcDNAクローンを挿入したプラスミドpαβSVVP1の作
製を示す。図５はプラスミドpRF375およびpRF398の作製
を示す。 【００１５】図６はプラスミドRF398αt2の作製を示
す。図７はβｈＣＧcDNAクローン内の88bpプローブの位
置を示す。図８はβＬＨの制限酵素地図、および第９図
のプラスミドの作製において使用する断片を示す。 【００１６】図９は完全な成熟βＬＨcDNAクローンを含
むプラスミドLH520H/Bの作製を示す。図１０はウイルス
ベクターpαLHSVVP1の作製を示す。 【００１７】図１１図はＬＨのβサブユニットをコード
するBPV含有プラスミドpCL28XhoLHBPVの作製を示す。 構造 本発明のクローニングベクターは前述の一般構造を有し
ている。好適なベクターは図面に示す構造のものであ
り、以下に詳しく説明する。 【００１８】 【実施例】クローニングベクターの作製 ｈＣＧのαおよびβサブユニットをコードするcDNAクロ
ーンの分離 本明細書において使用する技術は全てマニエティス（Ma
niatis）らのモレキュラークローニング：実験手引書
（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、コール
ド・スプリング・ハーバー研究所（1982年）に詳細に記
載されており、上記文献は参照することによりここに引
用される。 【００１９】胎盤組織から次の方法を用いてRNAを抽出
する。フェノール：１mM EDTA含有100mM酢酸Na（pH5.
5）の１：１混合物中で上記組織をホモジナイズし、20
分間60℃に加温する。氷上で10分間冷却した後、遠心分
離にかけて相を分離する。加温したフェノールで２回以
上抽出を繰り返し、続いてクロロホルムで２回抽出す
る。 【００２０】2.5容量のエタノールを添加することによ
り最後の水相からRNAが沈殿する。ポリA+mRNAを分離す
るために、胎盤RNAを10mMトリス-HCl緩衝液（pH7.5）-
0.5M NaCl中のオリゴ（dT）-セルロースカラムに通し、
同じ溶液で洗った。ポリA+mRNAは10mMトリス-HCl（pH7.
5）、１mM EDTA、0.05％SDSで溶出し、エタノールで２
回沈殿させた。初期収量は組織１ｇ当たり全RNA1.5〜2.
0mgであり、このうちの約２％がポリA+mRNAである。 【００２１】胎盤cDNAライブラリーは胎盤mRNAの逆転
写、大腸菌DNAポリメラーゼＩ（大型断片）を用いる第
２鎖の合成、S1ヌクレアーゼによる処理、および末端デ
オキシヌクレオチジル転移酵素によるホモポリマー（d
C）の末端付加（tailing）を行うことによって作製され
る。これらの方法は全て慣用技術によって行われる。 【００２２】一般的な製造例では、mRNAの１本鎖（ss）
cDNAへの転化20〜30％、第２鎖合成後のS1ヌクレアーゼ
消化に対する耐性70％、および長さが10〜25個の塩基か
らなるdC「テイル」が得られる。次に、これらのcDNA分
子をプラスミドpBR322のDNA断片（プラスミドpBR322をP
stIで消化し、これにdG「テイル」を付加したもの）と
アニールする。その後これらの組換えプラスミドを用い
て大腸菌細胞を形質転換し、cDNAライブラリーを作る
（テトラサイクリン耐性に基づいて形質転換細胞を選択
する）。 【００２３】ヒトαｈＣＧクローンを同定するために、
ハイブリダイゼーション用プローブとしてマウスα甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）クローンの219bp断片を使用
する。このプローブはその塩基配列の77％がヒトクロー
ンと相同である。このプローブをニックトランスレーシ
ョンによって放射能でラベルし、相同の程度を考慮する
条件下にcDNAライブラリーとハイブリダイズさせる。強
くハイブリダイズするクローンを制限酵素マッピングに
よって分析し、αｈＣＧの完全なコーディング配列を含
むクローンがDNAの塩基配列決定により証明される。プラスミドpαSVHVP1の作製 図１に示すように、プラスミドα970H/Bを作製するため
にαｈＣＧ断片を含むcDNAクローンをNcoIで消化する。
このNcoI部位（翻訳開始の信号を発するATGコドンのち
ょうど5'側）を修復して合成HindIIIリンカーへ結合さ
せる。同様に、このクローン3'非翻訳領域内の天然Hind
III部位を切断し、大腸菌DNAポリメラーゼクレノウ（Kl
enow）で修復し、その後合成BamHIリンカーへ結合させ
る。この断片をプラスミドpBR322のHindIII部位とBamHI
部位との間でクローン化してプラスミドα574H/Bを作製
する。このプラスミドはBamHIで消化し、アルカリ性ホ
スファターゼで処理し、その後ポリアクリルアミドゲル
により分離したSV40DNAの396bpSau3A断片（0.07〜0.14
図単位）へ結合させる。この結合混成物を用いて大腸菌
をアンピシリン耐性へと形質転換し、これらの形質転換
体から目的のプラスミドα970H/Bを同定する。 【００２４】プラスミドＱ2７はSV40をそのHpaII部位で
切断し、S1ヌクレアーゼで消化することにより平滑末端
を作り、EcoRIリンカーへ結合させ、EcoRIで消化し、得
られた1436bpの断片をpBR322のEcoRI部位内でクローン
化することにより作製される。 【００２５】図１に示すように、Ｑ2７はEcoRIで完全消
化しかつHindIIIで部分消化し、0.72〜0.94図単位の断
片を分離してα970H/B（EcoRIおよびHindIIIで消化して
アリカリ性ホスファターゼで処理したもの）内でクロー
ン化する。この結合混合物を用いて大腸菌を形質転換
し、制限酵素マッピングによりこれらの形質転換体から
目的のプラスミドpαSVLを固定する。 【００２６】pαSVLをEcoRIで消化し、０〜0.72図単位
のSV40断片（SV40複製開始点および完全な初期領域を含
み、その両末端がEcoRI末端であるもの）へ結合させて
プラスミドpαSVHVP1を作製し、これを大腸菌の形質転
換体から分離する。プラスミドpβSVVP1の作製 ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにあるコー
ルドスプリングハーバー研究所のジョンＣ・フィッデス
（John C．Fiddes）からβｈＣＧをコードする579bpのc
DNAクローンを入手した〔フィッデスらのネイチャー第2
86巻，684〜687頁（1980年）を参照〕。この断片の各末
端は合成BamHIリンカーへ結合させる。これをHgaI制限
酵素で消化した後両末端をクレノウDNAポリメラーゼで
修復し、EcoRI部位が信号ペプチドコーディング配列のA
TGコドンに対して約10bp 5'側となるように合成EcoRIリ
ンカーへ結合させる。BamHI部位は該コーディング配列
の末端をマークするナンセンスコドン（終止コドン）に
対して約60bp 3'側にある。図２に示すように、この566
bpのEcoRI-BamHI断片を分離し、pBR322のEcoRI部位とBa
mHI部位との間でクローン化してプラスミドpβ556R/Bを
得る。 【００２７】プラスミドpSVHR（図２）を作製するため
に、SV40DNAをHindIIIで部分消化して線状分子となし、
これをS1ヌクレアーゼで消化して平滑末端を作り、合成
EcoRIリンカーへ結合させ、そしてEcoRIおよびBamHIで
消化する。SV40複製開始点および初期領域を含む0.94〜
0.14図単位のこの断片はEcoRI-BamHI断片としてのpBR32
2内でクローン化する。 【００２８】さらに、図２に示すように、EcoRIメチラ
ーゼによって触媒される反応でプラスミドpβ556R/BのE
coRI部位をメチル化し、この後このプラスミドをNdeIで
切断する。S1ヌクレアーゼ処理したNdeI平滑末端はEcoR
Iリンカーへ結合させ、EcoRIでの消化により活性化し、
その後BamHIで消化する。 【００２９】EcoRI部位からBamHI部位までのpSVHRのSV4
0断片を分離し、pβ556R/Bの消化断片を含む反応混合物
中で結合させる。結合の後、この混成物をSalIで消化し
て、pBR322のEcoRI（NdeI）からBamHIまでの断片を再び
組込んだプラスミドを除く。この消化結合混成物を用い
て大腸菌を形質転換し、pβSVVP1を同定し、分離する。プラスミドpαβSVVP1の作製 図３に示すように、pBR322/KpnはpBR322をEcoRIで消化
し次にS1ヌクレアーゼで消化することによってその唯一
のEcoRI部位を欠失させ、その後この部位にKpnIリンカ
ーを挿入することによってpBR322から誘導される。 【００３０】さらに、図３に示すようにSV40DNAをAvaII
で消化する。得られた断片の接着末端をクレノウDNAポ
リメラーゼで修復して平滑末端を形成し、その後この混
合物はポリアクリルアミドゲルで分画化する。このゲル
から複製開始点および唯一のKpnI部位を含む0.64〜0.77
図単位の682bp断片を分離し、合成HindIIIリンカーへ結
合させ、そしてHindIIIおよびKpnIで消化する。 【００３１】得られた断片はpBR322/Kpnへ結合させる。
266bpのKpnI-HindIII断片（SV40後期プロモーターを含
む）を組込んだp266を分離する。p266はHindIIIおよびB
amHIで切断し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理
する。 【００３２】さらに図３に示すように、pβSVVP1/Bを次
のようにして作製する：pβSVVP1（図２）をEcoRIで切
断し、続いて結合させてpBR322配列を除く。この後この
DNAをBamHIで切断し、pBR322のBamHI部位内でクローン
化する。 【００３３】次いで、得られたプラスミドpβSVVP1/Bを
HindIIIとBanHIとで消化し、1003塩基対のHindIII-BamH
I断片をp266へ結合させてプラスミドpβVP1266を得る。
このプラスミドにおいてβｈＣＧcDNAは、そのRNA転写
物があたかもウイルスVP1転写物であるかのようにスプ
ライシングされる状態で、SV40後期プロモーターから下
流に位置する。 【００３４】αｈＣＧcDNAはHindIII断片としてのpβVP
1266（そのHindIII部位を切断し、細菌のアルカリ性ホ
スファターゼで処理したもの）内に挿入する。この結合
から誘導された大腸菌形質転換体を制限酵素マッピング
によってスクリーニングし、目的の構造を有するプラス
ミドを分離する。このプラスミドでは正しい方向でαｈ
ＣＧcDNAがVP2と入れ替わり、その下流にβｈＣＧcDNA
が続き、これはＶＰ１と入れ替わった。 【００３５】このようにして分離したプラスミドの１つ
であるpαβVP1を使用してpαβSVVP1の作製を完成させ
る。このプラスミドをKpnIで切断し、KpnIで切断した全
SV40ゲノムをこの部位へ結合させることにより挿入す
る。大腸菌の形質転換後に目的の構造を有するプラスミ
ドpαβSVVP1を単離する。このプラスミドはｈＣＧのα
およびβサブユニットの両方をコードするDNAを含み、
従って宿主哺乳動物細胞内で両サブユニットを発現する
ことができ、こうして生物学的に機能性のグリコシル化
へテロダイマーｈＣＧが生産される。（グリコシル化は
翻訳後に起こる）。プラスミドpRF375およびpRF398の作製 図５に示すように、ネズミメタロチオネインプロモータ
ー、SV40DNAおよびpBR322配列を含むプラスミドCL28
〔プラスミドJYMMT（Ｅ）と同一；ハマー（Hamer）らの
J．Mol．Applied Gen．１，273〜288（1983）を参照〕
を制限エンドヌクレアーゼBglIIで切断する。この部位
にαｈＣＧまたはβｈＣＧのいずれかのcDNAクローン
（それらの5'末端に約10および30bpの非翻訳領域、なら
びにそれらの3'末端に約220および60bpの非翻訳領域を
含む）を挿入する。これらのクローンは末端に合成BamH
Iリンカーを付加することにより遺伝子操作されたもの
である。 【００３６】得られたプラスミドpRF302（α）またはpR
F394（β）は制限酵素BamHIおよびSalIで消化してSV40D
NA配列を除く。全BPVゲノムおよびpBR322配列の一部を
含むプラスミドpB2-2をBamHIおよびSalIで消化してBamH
I/SalI末端をもつBPVゲノムを得る。この断片はメタロ
チオネイン−ｈＣＧ配列を含むpRF302（α）およびpRF3
94（β）へ結合させる。 【００３７】大腸菌の形質転換後にプラスミドpRF375お
よびpRF398を同定して分離する。これらはマウスメタロ
チオネインプロモーターの支配下にあるαｈＣＧまたは
βｈＣＧをコードする。プラスミドRF398αｔ2の作製 図６に示すように、プラスミドpαt2はαｈＣＧ５７４
HindIII断片をプラスミドpVBt2内でクローニングするこ
とにより誘導される〔V．B．レディー（Reddy）らのPNA
S 79，2064〜2067（1982）を参照〕。SV40初期プロモー
ターの支配下にあるαｈＣＧcDNAを含むpαt2はEcoRIで
消化する。5'側の突き出た一本鎖部分はS1ヌクレアーゼ
消化によって除き、その後平滑末端結合により合成BamH
Iリンカーを付加する。 【００３８】プラスミドRF398（図５）はBamHIで消化し
て細菌アルカリ性ホスファターゼで処理する。pαt2の1
735bp BamHI断片をRF398内に挿入する。大腸菌の形質転
換体からプラスミドRF398αt2を分離する。こうして、
このプラスミドはマウスメタロチオネインプロモーター
の支配下にある転写単位内にβｈＣＧcDNAを、そしてSV
40初期プロモーターによって支配される転写単位内にα
ｈＣＧcDNAを有する。黄体形成ホルモン（ＬＨ）cDNAクローンの発現 ヒト下無体cDNAライブラリーの作製 ４Ｍチオシアン酸グアニジン、１M 2-メルカプトエタノ
ール、0.05Ｍ酢酸Na（pH5.0）および0.001M EDTAを含む
溶液20ml中で凍結下垂体５〜10ｇをホモジナイズするこ
とにより、ヒト下垂体からRNAを調製する。ホモジネー
ト１ml当たりCsCl１ｇを加え、この懸濁液を2000rpmで1
5分間遠心分離にかける。上清はCsCl溶液〔最終容量35m
l中に１M酢酸Na（pH５）1.25ml、0.4M EDTA 62.5μｌお
よびCsCl39.8ｇを含有する〕の15mlクッション上に注意
しながらのせて層状となし、ベックマン超遠心分離器の
Ti70ローターを用いて20℃、45000rpmで18〜24時間遠心
する。この密度勾配中に薄膜として肉眼視できるRNAを
注射器で取り出し、希釈し、２容量のエタノールを加え
ることにより沈殿させる。溶解および再沈殿を３回繰り
返した後、RNA沈殿物をH2Oに溶解し、濃縮原液を加える
ことにより0.01Mトリス-HCl（pH7.5）および0.5M NaCl
となるように調製する。その後、胎盤RNAの場合に述べ
たようにオリゴdT-セルロースカラムを２回通過させる
ことにより、この調製物からポリA+mRNAを分離する。 【００３９】ヒト下垂体cDNAライブラリーは胎盤ポリA+
mRNAについて先に述べたごとく下垂体ポリA+mRNAから作
製されるが、この場合は第２鎖cDNA合成のために、大腸
菌DNAポリメラーゼＩ（大型断片）とトリ骨髄芽球症ウ
イルス逆転写酵素の両方を順次使用する。最初はクレノ
ウ（Klenow）が用いられる。フェノール抽出によって反
応を停止させる。遠心分離した抽出物の水相をバイオゲ
ルA-5mの５mlカラムに加える。高分子量の物質を含む画
分をプールし、濃縮し、２容量のエタノールで沈殿さ
せ、乾燥し、そして逆転写のために100mMトリス-HCl（p
H8.3）、10mM MgCl2、140mM KCl、20mM 2-メルカプトエ
タノール、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフ
ェート各々１mMを含む溶液に溶解する。逆転写酵素はcD
NA１μg当たり約20単位加える。その後２本鎖cDNAはS1
ヌクレアーゼで処理し、ホモポリマーの末端付加を行
い、そして先に述べたごとくクローン化する。βＬＨcDNAクローンの単離 25μg/mlのテトラサイクリンを含む栄養寒天平板上に増
殖させたコロニー（細胞集団）はニトロセルロースフィ
ルターへ移す。0.5M NaOHで処理することによりコロニ
ーをその場で溶解し、そして1.5M NaClを含む0.5Ｍトリ
ス-HCl（pH7.4）で中和する。遊離したDNAを真空オーブ
ン中80℃で２時間ベーキングすることによりフィルター
に固定する。このフィルターは成熟ｈＣＧβ鎖の16から
45までのアミノ酸（この部分は30個のアミノ酸のうちβ
ＬＨポリペプチドのこの領域と共通のアミノ酸を29個有
する）に対応するβｈＣＧクローンの32Ｐでラベルした
88bp断片とのハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングする（図７参照）。ハイブリダイゼーションは50
％ホルムアミド、0.75M NaCl、0.075Mクエン酸Na（pH7.
0）、2.5％デキストランサルフェート、0.1％ポリビニ
ルピロリドン、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、および少
なくとも105cpm/フィルターの32Ｐでラベルした88bpβ
ｈＣＧ断片を含む溶液中32℃で一晩実施する。オートラ
ジオグラフィーを行う前に、フィルターを37℃において
0.15M NaCl、0.015Mクエン酸Naで数回洗う。陽性の単離
クローンのうちの１つであるLH12（図８）をこの後使用
する。LH12は長さが365bpであり、プレβ信号配列の15
個のアミノ酸および成熟βＬＨポリペプチドの105個の
アミノ酸をコードする塩基配列を含んでいる。このヌク
レオチドの塩基配列を決定する。LH12は完全な成熟βＬ
Ｈをコードしないので、 32Ｐでラベルしたハイブリダイ
ゼーションプローブとしてLH12の240bp NcoI-PvuII断片
（図８）を用いて、ヒト下垂体cDNAライブラリーの以後
のスクリーニングを行う。このスクリーニングによって
クローンLH6（図８）を単離する。LH6はmRNAの非翻訳部
分からmRNAのポリA「テイル」の27個のＡ残基までに対
応する領域を含むのでβＬＨの完全な3'末端を有する。
5'方向へLH12を越えて伸びるクローンは１つも見出され
ない。組合せた完全な成熟βＬＨコーディング領域のDN
A塩基配列の決定は、文献に発表されたβＬＨのアミノ
酸配列データとはそのアミノ酸配列が２つの点で相違す
ることを示している：すなわち42位はメチオニンであ
り、55位はバリンである。また、成熟βＬＨはcDNAの塩
基配列に基づくと121個のアミノ酸を含む。 【００４０】完全な信号ペプチドコーディング配列と完
全な成熟βＬＨ配列を含むクローンは、図８に示す制限
酵素断片を使って、図９のようにして作製される。プラ
スミドβ579Hから104bpのEcoRI-DdeI断片を分離し、LH1
2プラスミドから分離した181bpのDdeI断片（その後PstI
で消化したもの）へ結合させる。15℃で一晩結合させた
後、この結合混成物をEcoRIおよびPstIで消化し、７％
ポリアクリルアミドゲルで分画化し、ゲルから目的の25
6bp断片を分離する。この断片は20個のアミノ酸からな
る信号ペプチドのコーディング配列を与えるようにβｈ
ＣＧ信号配列とプレβＬＨの信号配列とを融合させたも
のである。 【００４１】256bpのEcoRI-PstI断片は、EcpRIおよびPs
tIで消化したpBR322内でクローン化してプラスミドLHβ
260を得る。図９に示す146bpのEcoRI-NcoI断片をポリア
クリルアミドゲルから分離し、これは以下に述べるよう
なプラスミド作製の際にあとで使用する。 【００４２】LH6プラスミド（図９）をSau3aで消化し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって390bp断片を
分離する。次にこの断片はHincIIで消化し、BamHIリン
カー結合させ、BamHIで消化し、そしてプラスミドpAPP
内のBamHI部位でクローン化する。pAPPはpBR322をAvaI
で消化し、5'末端側の突き出た部分をdNTPおよび大腸菌
の大型断片DNAポリメラーゼＩを用いて修復し、PvuIIで
消化し、そしてこのプラスミドを閉環してPvuII切断部
位を除くことによりpBR322から誘導される。pAPPのBamH
I部位へ340bpのBamHI断片を結合させることにより分離
したプラスミドLH6BをEcoRIおよびPvuIIで消化し、細菌
アルカリ性ホスファターゼで処理する。この断片は先に
述べたLHβ260の146bp EcoRI-NcoI断片および図９に示
すプラスミドLH12から分離した241bp NcoI-PvuII断片の
混合物へ結合させる。この結合混成物はアンピシリン耐
性へと大腸菌を形質転換するのに用いる。形質転換体か
らプラスミドLH520H/Bを分離する。LH520H/Bはハイブリ
ッド信号ペプチド配列をもつ完全なβＬＨコーディング
配列を含んでいる。pαLHSVVP1の作製 先に述べたプレαおよびプレβｈＣＧクローンに対して
行ったようにして、SV40を基礎とするベクター内でこの
プレβＬＨクローンを発現させるために、プレβコーデ
ィング配列のATGコドンに非常に接近してEcoRI切断部位
を配置することが望ましい。このことは、LH520H/BをHg
aIで消化し、5'末端側の突出部分を修復し、合成EcoRI
リンカーへ結合させ、EcoRIおよびBanHIで消化し、そし
て分離した496bpのEcoRI-BamHI断片をEcoRIおよびBamHI
で消化しかつ細菌アルカリ性ホスファターゼで処理した
pBR322内でクローン化することにより達成される。この
結合混成物を用いて形質転換させた大腸菌からプラスミ
ドPLH496R/Bを分離し、このプラスミドは発現しようと
する496bp断片の出所源として使用する。 【００４３】プラスミドpαβVP1（このプラスミドの作
製およびｈＣＧの両サブユニットを発現させる際のこの
プラスミドの使用については既に述べており、図４を参
照されたい）はEcoRIおよびBamHIで消化し、これらの両
酵素で消化したプラスミドPLH496R/Bを含む反応混合物
中で結合させる（図１０参照）。大腸菌の形質転換体か
らプラスミドpαLHVP1を同定する。図１０に示すよう
に、pαSVHVP1（図１）から完全なSV40ウイルス初期領
域をとり出し、そしてこの領域をKpnIおよびSalIで消化
したpαLHVP1内にKpnI-SalI断片として結合させること
により挿入してプラスミドpαLHSVVP1を得る。このプラ
スミドをBamHIで切断して再結合させることにより、ウ
イルスαLHSVVP1が形成される。このウイルスはSV40後
期プロモーターの支配下にある特異なβＬＨサブユニッ
トおよび共通（ＬＨ，ｈＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨに共
通）のαサブユニットのためのクローン化cDNAを含んで
いる。これらのクローン化cDNAは、共通のα挿入物がウ
イルスVP1タンパク質コーディング配列と入れ替わりか
つβＬＨ挿入物がウィルスVP2コーディング配列と入れ
替わるような状態で位置づけられる。BPVを基礎とする発現系へのβＬＨcDNA（信号ペプチド
のβｈＣＧ5'末端を含む）の挿入 LH520H/B（図９）をHindIIIおよびBamHIで消化し、大腸
菌DNAポリメラーゼ（クレノウ）で処理し、合成SalIリ
ンカーへ結合させ、SalIで消化し、そしてpBR322のSalI
部位内でクローン化する。得られたプラスミドLH530Sal
は図１１に示すプラスミドCL28のマウスメタロチオネイ
ン遺伝子内に挿入するためのＬＨcDNAクローンの出所源
として使用する。 【００４４】CL28はBglIIで切断し、S1ヌクレアーゼで
処理し、XhoIリンカーへ結合させる。XhoIでの消化、結
合およびBglIIでの消化後にこの反応混成物を用いて大
腸菌を形質転換させ、プラスミドCL28Xhoを得る。この
プラスミドはBamHIおよびSalIで消化し、プラスミドpB2
-2（図５）のBamHI＋SalI消化物へ結合させてプラスミ
ドCL28XhoBPVを得る。後者のＬＨ挿入物は次にSalI断片
としてCL28XhoBPVのXhoI部位内へ結合させる。なぜな
ら、SalI消化物の5'突出部分がXhoI消化物のそれに相補
的であるからである。XhoIで消化してバックグランドを
除いた後、大腸菌を形質転換させ、そしてBPVを基礎と
するプラスミド内にマウスメタロチオネインプロモータ
ーの支配下にある（ハイブリッド）プレβＬＨ挿入物を
含む目的のプラスミドpCL28XhoLHBPVを分離する。宿主サル細胞のトランスフェクションおよび感染 ヘテロポリマータンパク質生産用の真核細胞内へのウイ
ルス含有ベクターの組込みは一般に次のようにして達成
される。最初に、ウィルスDNAおよびホモポリマータン
パク質をコードするDNAが例えば大腸菌内に保持される
プラスミド内に組込まれる場合、そのプラスミド配列
（例えばpBR322配列）を除き、得られたDNAを結合させ
てウイルス領域およびヘテロポリマータンパク質をコー
ドする塩基配列１つまたはそれ以上を含む環状DNAを形
成する。この環状DNAは一般に複製ウイルスを生ずるの
に必要な全ての遺伝情報を含むとは限らず、他の必要な
塩基配列（例えば、ウイルス外殻のタンパク質をコード
する配列）がヘテロポリマータンパク質をコードする塩
基配列の１つまたはそれ以上によって置換される。プラ
スミドDNAを欠いた環状DNAは、そのDNAが適当な宿主哺
乳動物細胞内に入って複製することができるように、そ
れが誘導されるところの自然界に存在するウイルスDNA
に類似した大きさでなければならない。 【００４５】この環状DNAはその後の感染に使用するウ
イルス株をつくるために宿主細胞をトランスフェクショ
ンするの用いる。ウイルスを形成するのに必要なDNAが
一部失われているので、複製ウイルスを生ずるためには
その欠損機能を十分コードするヘルパーウイルスDNAの
助けをかりてトランスフェクションを行わなければなら
ない。 【００４６】トランスフェクトされた宿主細胞はそれが
複製ウイルスによって溶解されるまで増殖を続け、イン
キュベートされる。得られた複製ウイルス株（ヘルパー
ウイルスを含み）は次にヘテロポリマータンパク質生産
用の宿主細胞を感染させるのに使用する。一般に、感染
したタンパク質生産用宿主細胞は最後にはウイルスによ
って溶解されるので、宿主細胞の新しいバッチ分を感染
させるためにウイルスを再び利用する必要があり、それ
故にこのウイルス株は保持される。 【００４７】先に述べた特定の組換えDNA配列は次のよ
うにして宿主細胞をトランスフェクトし、その後感染さ
せるのに使用される。上記のSV40含有プラスミドからpB
R322配列を除いてトランスフェクション用ウイルスDNA
をつくる。pαSVHVP1およびpαβSVVP1の場合に、これ
はBamHIで消化後断片の環化を助ける条件下で結合させ
てαSVHVP1およびαβSVVP1を（他の生産物の中から）
得ることにより達成される。pβSVVP1の場合には、EcoR
Iでの消化およびその後の再結合により、pBR322配列が
除かれβSVVP1が形成されるのと同時にSV40後期プロモ
ーターおよびVP1スプライス領域がβｈＣＧcDNA挿入物
と並置される。同時に、ptsA58Bam（pBR322のBamHI部位
内でクローン化したtsA58SV40ウイルスDNA）はBamHIで
切断し、結合させて自己結合環を得る。類似方法がＬＨ
ベクターに対して用いられる。個々のウイルス株は下記
のようにしてつくられる。 【００４８】先に述べたようにして切断しかつ結合した
DNAをエタノール沈殿させ、滅菌水に溶解する。約１μg
のptsA58Bam DNA（ヘルパーウイルス）および10μgの組
換えDNA（αおよび／またはβｈＣＧ、もしくはＬＨを
コードする）を無菌試験管内で合わせ、２mlのTBS緩衝
液〔G．キムラ（Kimura）およびR．ダルベコ（Dulbecc
o）のVirology，49，79〜81（1972）を参照〕および１m
lの２mg/mlDE-デキストラン溶液と混合し、そしてT-75
フラスコ内のTBS 10mlで予め２回洗浄した全面サルCV-1
細胞の単層へ加える。細胞は時々振とうしながら37℃に
１〜２時間保ち、TBSで２回洗い、５％胎児ウシ血清を
含むDMEM 10mlを供給し、そして40℃に10〜15日間保持
する。細胞が完全に溶解した後、培地を試験管に移し、
冷凍および解凍を５回繰り返し、そして3000rpmで５分
間遠心する。得られた上清は新しいCV-1細胞の感染用ウ
イルス株として役立つ。 【００４９】ウイルスを感染させるために、T-150フラ
スコ内でCV-1細胞を全面増殖させる。このフラスコにウ
イルス株の１種（上記のようにして作ったもの）１mlを
加え、細胞を40℃で５日間インキュベートする。 【００５０】混合感染のために、CV-1細胞をT-150フラ
スコ内で全面増殖させる。αSVHVP1ウイルスおよびβSV
VP1ウイルスを１：１の比で混合し、この混合ウイルス
１mlを使って40℃でCV-1細胞を感染させる。マウス細胞のトランスフェクション 混合トラスンフエクションによってヘテロダイマーｈＣ
Ｇを生産するために、pRF375（αｈＣＧ）およびpRF398
（βｈＣＧ）のBPVプラスミド各々５μgを混合し、担体
としてサケ精子DNA 10μgを含む250mM CaCl2溶液0.5ml
に加える。この混合物は280mM NaCl 0.5ml、50mM HEPES
および1.5mM燐酸ナトリウム中で通気する。室温で30〜4
0分間燐酸カルシウム沈殿物を形成させる。 【００５１】トランスフェクションの24時間前に、５×
105個のマウスC127細胞〔メリーランド州ベテスダ、NI
H、国立ガン研究所（National Cancer Institute）のデ
ィーン・ハマー（Dean Hamer）博士から入手できる〕を
100mmペトリ皿またはT-75フラスコに入れる。外来性DNA
を加える直前に新しい培地（ダルベッコ（Dulbecco）の
修飾培地、10％胎児ウシ血清）を細胞に供給する。それ
ぞれの皿（10ml）に燐酸カルシウム沈殿物１mlを加え、
37℃で６〜８時間細胞をインキュベートする。 【００５２】培地を吸引し、室温で２分間燐酸緩衝食塩
水（PBS）pH7.0中の20％グリセロール５mlと置き換え
る。この細胞をPBSで洗い、培地10mlを供給して37℃で
インキュベートする。20〜24時間後培地を変え、その後
の細胞の再供給を３〜４日ごとに行う。個々のクローン
はT-25cmフラスコ内で増殖させる。７〜21日後に細胞ク
ローンは分析のためにさらに大きなフラスコに移すこと
ができる。 【００５３】単一トランスフェクションによりヘテロダ
イマーｈＣＧを生産するために、プラスミドRF398αt2
が混合トランスフェクションで使用した上記の２つのプ
ラスミドの場合と同じ方法で使用される。 【００５４】ヘテロダイマーＬＨを作るためには、ｈＣ
Ｇの場合に述べたようにして、プラスミドpRF375および
pCL28XhoLHBPVを混合する。興味あることには、βｈＣ
ＧまたはβＬＨをコードするベクターのみを含む培養細
胞は、αサブユニットをコードする細胞が存在しないと
実際にβサブユニットを全く生産しないが、αおよびβ
サブユニットをコードする塩基配列を含む細胞は、ヘテ
ロダイマーを生産するばかりでなく遊離のβサブユニッ
トも生産するということが観察された。このことは、い
かなる理由によるのか不明であるがαサブユニットの存
在がβサブユニットを安定化させるという別の利点を単
一細胞培養での両サブユニットの生産が有するとの概念
を支持するものである。寄託 次に述べるものはメリーランド州ロックビルのATCCに寄
託された。 【００５５】αβSVVP1，ATCC VR2077； αSVHVP1，ATCC VR2075； βSVVP1，ATCC VR2075； C127細胞内のpRF375，ATCC CRL8401； C127細胞内のpRF398，ATCC CRL8401； pCL28XhoLHBPV大腸菌，ATCC 39475； C127細胞内のpRF398αt2。用途 本発明の形質転換細胞系列は生物学的に活性なヘテロポ
リマータンパク質を生産するために使用される。本発明
によって作られるｈＣＧは、例えばヒトの生殖に関係す
る多数のよく知られた医療用途を有している。 【００５６】本発明の他の実施態様として例えば、他の
ヘテロポリマータンパク質（例えば、卵胞刺激ホルモン
または甲状腺刺激ホルモン）を生産することができ、同
様にヒトまたは動物の免疫グロブリンもしくは免疫応答
抗原も生産することができる。 【００５７】ヘテロポリマータンパク質は１種の細胞に
よって、または単一培養において生産される必要がない
かも知れない。１つの別法は２種の細胞（このうちの一
方が一方のサブユニットを生産し、他方が他方のサブユ
ニットを生産する）を同時培養することであり、分泌さ
れたサブユニットをその後培地中で会合させてヘテロダ
イマーを形成することができる。もう１つの別法は別個
の培養を使用することであり、それぞれの培養が異なる
サブユニットを生産し、その後各培養からの培地を合わ
せてヘテロポリマーへと会合させる。 【００５８】その他の宿主細胞、ベクター、プロモータ
ー、形質転換用塩基配列、およびウイルスも使用でき
る。一般に、使用する宿主細胞は使用するベクターによ
って定まる。例えば、ベクターが複製ウイルスDNAまた
は非複製ウイルスDNAである場合、宿主細胞はこれらの
ベクターによって感染またはトランスフェクションされ
得る細胞であり、例えばSV40含有ベクターはサル宿主細
胞、好ましくはCV-1細胞を必要とする。クローニングベ
クターが原核生物の調節配列を有するプラスミドである
場合には、原核生物の宿主細胞（例えば大腸菌）を使用
する。 【００５９】クローニングベクターが真核生物の調節配
列を有するプラスミドである場合には、適当な真核生物
の宿主細胞（例えばマウスC127細胞）を使用する。
【図面の簡単な説明】 【図１】αｈＣＧcDNAクローン、SV40ウイルスDNAの一
部およびプラスミドpBR322の塩基配列を含むプラスミド
pαSVHVP1の作製を示す図面である。 【図２】βｈＣＧcDNAクローン、SV40DNAの領域およびp
BR322の一部（宿主大腸菌に対してアンピシリン耐性を
付与する領域を含む）を組込んだプラスミドpβSVVP1の
作製を示す図面である。 【図３】SV40DNAにαおよびβｈＣＧcDNAクローンを挿
入したプラスミドpαβSVVP1の作製を途中まで示す。 【図４】図３の続きであり、pαβSVVP1の作製を最後ま
で示す。 【図５】プラスミドpRF375およびpRF398の作製を示す。 【図６】プラスミドRF398αt2の作製を示す。 【図７】βｈＣＧcDNAクローン内の88bpプローブの位置
を示す。 【図８】βＬＨの制限酵素地図、および図９のプラスミ
ドの作製において使用する断片を示す。 【図９】完全な成熟βＬＨcDNAクローンを含むプラスミ
ドLH520H/Bの作製を示す。 【図１０】ウイルスベクターpαLHSVVP1の作製を示す。 【図１１】ＬＨのβサブユニットをコードするBPV含有
プラスミドpCL28XhoLHBPVの作製を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヒュング，ナンシー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02181，ウェルズレィ，ワシントン・ス トリート 590 ４エイ (72)発明者 ベック，アントン・カー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02167，チェスナット・ヒル，クロスビ ー・ロード 42 (72)発明者 バーンスティン，エドワード・ジョージ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02114，ボストン，ロングフェロー・プ レイス ４，ナンバー 2005 (56)参考文献 特開 昭57−43696（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，94 （１）（1982），ｐ．29−36 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．αサブユニットおよびβサブユニットを有し、βサ
    ブユニットは42位がMetでありそして55位がValである、
    組換えにより生産されたヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）
    であって、その製造に用いられる可能性がある宿主細胞
    由来以外の他のヒトタンパク質を含まず、他のホルモン
    を含まない、上記ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）。
JP11070356A 1983-11-02 1999-03-16 組換えにより生産されたヒトｌｈ Expired - Lifetime JP3126348B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/548,228 US4840896A (en) 1983-11-02 1983-11-02 Heteropolymeric protein
US548228 1983-11-02

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP07208877A Division JP3091673B2 (ja) 1983-11-02 1995-08-16 ヘテロポリマー系蛋白質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11308992A JPH11308992A (ja) 1999-11-09
JP3126348B2 true JP3126348B2 (ja) 2001-01-22

Family

ID=24187922

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59504232A Expired - Lifetime JPH0832244B2 (ja) 1983-11-02 1984-10-31 ヘテロポリマ−系蛋白質
JP59503897A Pending JPS61500249A (ja) 1983-11-02 1984-10-31 異種重合体タンパク質
JP5162620A Pending JPH06107692A (ja) 1983-11-02 1993-06-30 ヘテロポリマー系蛋白質
JP7010985A Expired - Lifetime JP2573817B2 (ja) 1983-11-02 1995-01-26 ヘテロポリマー系蛋白質の発現ベクターおよび該ベクターを含む細胞
JP07208877A Expired - Lifetime JP3091673B2 (ja) 1983-11-02 1995-08-16 ヘテロポリマー系蛋白質
JP11070356A Expired - Lifetime JP3126348B2 (ja) 1983-11-02 1999-03-16 組換えにより生産されたヒトｌｈ

Family Applications Before (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59504232A Expired - Lifetime JPH0832244B2 (ja) 1983-11-02 1984-10-31 ヘテロポリマ−系蛋白質
JP59503897A Pending JPS61500249A (ja) 1983-11-02 1984-10-31 異種重合体タンパク質
JP5162620A Pending JPH06107692A (ja) 1983-11-02 1993-06-30 ヘテロポリマー系蛋白質
JP7010985A Expired - Lifetime JP2573817B2 (ja) 1983-11-02 1995-01-26 ヘテロポリマー系蛋白質の発現ベクターおよび該ベクターを含む細胞
JP07208877A Expired - Lifetime JP3091673B2 (ja) 1983-11-02 1995-08-16 ヘテロポリマー系蛋白質

Country Status (9)

Country Link
US (2) US4840896A (ja)
EP (1) EP0487512B1 (ja)
JP (6) JPH0832244B2 (ja)
AT (1) ATE79408T1 (ja)
DE (1) DE3485869T2 (ja)
HK (1) HK26196A (ja)
LU (1) LU90806I2 (ja)
NL (1) NL300049I2 (ja)
WO (1) WO1985001958A1 (ja)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455282B1 (en) 1983-11-02 2002-09-24 Genzyme Corporation Cells, vectors and methods for producing biologically active TSH
US5639639A (en) * 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
US4840896A (en) * 1983-11-02 1989-06-20 Integrated Genetics, Inc. Heteropolymeric protein
US5156957A (en) * 1983-11-02 1992-10-20 Genzyme Corporation Follicle stimulating hormone
US4923805A (en) * 1983-11-02 1990-05-08 Integrated Genetics, Inc. Fsh
JPS60145098A (ja) * 1984-01-09 1985-07-31 Suntory Ltd 糖付加ポリペプチドの製造法
DE3520404C2 (de) * 1984-06-08 1994-06-16 Genzyme Corp Schweine-ß-FSH
WO1986007383A1 (en) * 1985-06-04 1986-12-18 Biotechnology Research Partners, Ltd. Autoantigen vaccines
FI98829C (fi) * 1986-01-27 1997-08-25 Chiron Corp Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta
EP0259632B1 (en) * 1986-08-13 1995-12-13 Zymogenetics, Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
JPS63112978A (ja) * 1986-10-31 1988-05-18 Daicel Chem Ind Ltd エシエリチア・コリ
JPS63112985A (ja) * 1986-10-31 1988-05-18 Daicel Chem Ind Ltd 新規プラスミド
JP2769170B2 (ja) * 1987-12-08 1998-06-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 真核細肪中での同時発現
US5260421A (en) * 1987-12-21 1993-11-09 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Site-directed mutagenesis modified glycoprotein hormones
US5635475A (en) * 1987-12-21 1997-06-03 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Site-directed mutagenesis modified glycoprotein hormones and methods of use
EP0386203A1 (en) * 1988-09-01 1990-09-12 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Methods for producing gonadotropin and tsh super-agonists
US5196524A (en) * 1989-01-06 1993-03-23 Eli Lilly And Company Fusion reporter gene for bacterial luciferase
CA2045131A1 (en) * 1989-01-11 1990-07-12 Frederic E. Wondisford Biologically active synthetic thyrotropin and cloned gene for producing same
EP0461200B1 (en) * 1989-02-21 1997-01-22 Washington University Modified forms of reproductive hormones
US6828125B1 (en) * 1989-05-10 2004-12-07 Baxter Biotech Technology, S.A.R.L. DNA encoding fused di-alpha globins and use thereof
US5545727A (en) * 1989-05-10 1996-08-13 Somatogen, Inc. DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
US5240832A (en) * 1989-06-20 1993-08-31 Genzyme Corporation Heteropolymeric protein production methods
CA2080589A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-17 Joseph De Angelo Expression of recombinant hemoglobin in yeast
US6172039B1 (en) 1990-04-16 2001-01-09 Apex Bioscience, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
DE69226197T2 (de) * 1991-11-08 1999-02-11 Somatogen Inc Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem
US6737515B2 (en) 1993-11-19 2004-05-18 Washington University Follicle stimulating hormone-glycosylation analogs
US6017697A (en) 1994-11-14 2000-01-25 Eli Lilly And Company Excitatory amino acid receptor protein and related nucleic acid compounds
EP0786523A3 (en) 1996-01-29 2000-01-12 Eli Lilly And Company Protein kinase and method of using
US6162905A (en) * 1996-11-07 2000-12-19 Ibsa Institut Biochimique S.A. FSH and LH separation and purification process
US6476211B1 (en) * 1998-07-16 2002-11-05 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
AU779869B2 (en) 1999-04-13 2005-02-17 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
US6911204B2 (en) * 2000-08-11 2005-06-28 Favrille, Inc. Method and composition for altering a B cell mediated pathology
US20030012782A1 (en) * 2000-08-11 2003-01-16 Gold Daniel P. Method and composition for altering a T cell mediated pathology
US6824822B2 (en) 2001-08-31 2004-11-30 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Residual solvent extraction method and microparticles produced thereby
DK2279755T3 (da) 2001-10-10 2014-05-26 Ratiopharm Gmbh Remodellering og glycokonjugering af fibroblastvækstfaktor (FGF)
EP1471891A4 (en) * 2002-02-08 2007-04-11 Alkermes Inc POLYMER-BASED COMPOSITIONS FOR PROLONGED RELEASE
BRPI0409571B1 (pt) * 2003-03-04 2016-05-31 Aspenbio Pharma Inc método para manter uma ou mais gravidezes em um ou mais mamíferos
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
UA88879C2 (en) * 2003-09-02 2009-12-10 Эплайд Рисерч Системз Эрс Холдинг Н.В. Fsh glycosylation mutant
JP4412989B2 (ja) * 2003-12-15 2010-02-10 株式会社日立製作所 複数の記憶システムを有するデータ処理システム
AU2005207960A1 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Heterodimeric follicle stimulating hormone-Fc (FSH-Fc) fusion proteins for the treatment of infertility
ES2392282T3 (es) 2004-02-13 2012-12-07 Stem Cell Therapeutics Corp. Uso de la hormona luteinizante (LH) y de la gonadotropina coriónica (hCG) para la proliferación de células precursoras neurales y la neurogénesis
US7456254B2 (en) * 2004-04-15 2008-11-25 Alkermes, Inc. Polymer-based sustained release device
US20060110423A1 (en) * 2004-04-15 2006-05-25 Wright Steven G Polymer-based sustained release device
US8617613B2 (en) 2004-04-15 2013-12-31 Alkermes Pharma Ireland Limited Polymer-based sustained release device
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
EP2004212A4 (en) * 2006-03-17 2010-07-14 Stem Cell Therapeutics Corp CONTINUOUS DOSING SCHEMES FOR NEURAL STEM CELL PROLIFERATING AGENTS AND NEURAL STEM CELL DIFFERENTIATING AGENTS
CN102274557B (zh) 2006-08-09 2014-12-03 精达制药公司 渗透性递送系统和活塞组件
DK2157967T3 (da) 2007-04-23 2013-04-08 Intarcia Therapeutics Inc Suspensionsformuleringer af insulinotropiske peptider og anvendelser deraf
AU2009211331B2 (en) 2008-02-08 2014-07-03 Theramex HQ UK Limited Liquid formulation of FSH
US8343140B2 (en) 2008-02-13 2013-01-01 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
NZ595661A (en) * 2009-04-01 2013-07-26 Method for purifying recombinant follicle stimulating hormone (fsh)
LT2462246T (lt) 2009-09-28 2017-11-27 Intarcia Therapeutics, Inc Esminio stacionaraus vaisto tiekimo greitas įgyvendinimas ir (arba) nutraukimas
TWI604850B (zh) 2009-10-05 2017-11-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
CN103509121B (zh) 2012-11-22 2015-01-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
WO2014183175A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Universidade De São Paulo Methods for production and/or purification of hormones
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
CN113598842A (zh) 2015-06-03 2021-11-05 因塔西亚制药公司 植入物放置和移除系统
EP3458084B1 (en) 2016-05-16 2020-04-01 Intarcia Therapeutics, Inc Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
EP3565580B1 (en) 2017-01-03 2024-03-06 i2o Therapeutics, Inc. Continuous administration of exenatide and co-adminstration of acetaminophen, ethinylestradiol or levonorgestrel
CN108264549A (zh) * 2018-03-29 2018-07-10 北京伟杰信生物科技有限公司 重组绒促性素rhCG的制备方法及应用
ES2912503T3 (es) 2018-10-10 2022-05-26 Innomed Seven L L C Sistema para inseminación intrauterina
BR102019004147A2 (pt) 2019-02-28 2020-10-06 Ouro Fino Saude Animal Participacoes S.A. Gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa e processo para obtenção da mesma, composição veterinária e uso
EP3969026A1 (en) 2019-05-16 2022-03-23 Ceva Santé Animale Compositions and methods for increasing reproduction performance in non human mammals using recombinant luteinizing hormone

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4468464A (en) * 1974-11-04 1984-08-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biologically functional molecular chimeras
FR2458584A1 (fr) * 1979-06-08 1981-01-02 Pasteur Institut Vecteurs pour le transfert et l'expression de materiel genetique dans une cellule eucaryote et procede pour la production d'une proteine determinee dans des cellules eucaryotes
US4401759A (en) * 1980-05-01 1983-08-30 Harvey Rubin Detection and isolation of glucagon mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide
JPS586475B2 (ja) * 1980-08-23 1983-02-04 株式会社 林原生物化学研究所 ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの製造方法
JPS585671B2 (ja) * 1980-08-27 1983-02-01 株式会社 林原生物化学研究所 ヒト卵胞刺激ホルモンの製造方法
US4394443A (en) * 1980-12-18 1983-07-19 Yale University Method for cloning genes
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4385586A (en) * 1981-09-04 1983-05-31 Schriever Frederick G Escape/rescue system
EP0078154A3 (en) * 1981-10-28 1985-01-09 The Regents Of The University Of California Plasmids and cells for heterologous expression of metallothioneins and processes for producing and using the metallothionein
JPH0783715B1 (ja) * 1981-11-23 1995-09-13
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
WO1984000775A1 (en) * 1982-08-10 1984-03-01 Univ Columbia The use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
LU84795A1 (fr) * 1983-05-09 1985-03-21 Labofina Sa Genes conferant la resistance de la levure a des herbicides
US4923805A (en) * 1983-11-02 1990-05-08 Integrated Genetics, Inc. Fsh
US4840896A (en) * 1983-11-02 1989-06-20 Integrated Genetics, Inc. Heteropolymeric protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９４（１）（１９８２），ｐ．２９−３６

Also Published As

Publication number Publication date
WO1985001958A1 (en) 1985-05-09
JPH0832244B2 (ja) 1996-03-29
DE3485869T2 (de) 1993-02-18
DE3485869D1 (de) 1992-09-17
EP0487512B1 (en) 1998-08-05
ATE79408T1 (de) 1992-08-15
NL300049I2 (nl) 2005-07-01
JP3091673B2 (ja) 2000-09-25
JPS61500249A (ja) 1986-02-20
JPH11308992A (ja) 1999-11-09
US5767251A (en) 1998-06-16
EP0487512A1 (en) 1992-05-27
JPH0884588A (ja) 1996-04-02
US4840896A (en) 1989-06-20
HK26196A (en) 1996-02-16
NL300049I1 (nl) 2001-10-01
JPH07203968A (ja) 1995-08-08
JP2573817B2 (ja) 1997-01-22
JPS61500251A (ja) 1986-02-20
JPH06107692A (ja) 1994-04-19
LU90806I2 (fr) 2001-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3126348B2 (ja) 組換えにより生産されたヒトｌｈ
JP2761513B2 (ja) 組換え繊維芽細胞成長因子
US5639639A (en) Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
EP0506477B1 (en) Vascular endothelial cell growth factor C subunit
JP3207416B2 (ja) ソマトトロピン・アナログ類
US5439818A (en) DNA encoding human recombinant basic fibroblast growth factor
CA2063810C (en) Production of vascular endothelial cell growth factor
EP0578328B1 (en) Material and methods for the production of a heterodimeric human LH with a Met42 Val55 alpha subunit
EP0476983A1 (en) Vascular endothelial cell growth factor II
CA1339936C (en) Animal interferons
JPH0724584B2 (ja) 卵胞刺激ホルモン
JPS61219395A (ja) ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途
JP2834111B2 (ja) 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産
JPS63240788A (ja) 真核細胞の分泌シグナルペプチドを含むプラスミドによるタンパク質をコードしている遺伝子の合成及びコードされているタンパク質の分泌方法
JPS61149089A (ja) Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
JPH05103666A (ja) ヒト神経成長因子を発現させるための方法
JPS63503309A (ja) 心房性ナトリウム排出増加ペプチドレセプタータンパク
EP0160091A1 (en) Production of heterodimeric human fertility hormones
JPH03224491A (ja) ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
EXPY Cancellation because of completion of term