JPH07203968A - ヘテロポリマー系蛋白質の発現ベクターおよび該ベクターを含む細胞 - Google Patents
ヘテロポリマー系蛋白質の発現ベクターおよび該ベクターを含む細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換え技法により、複数のサブユニットから
なる生物学的に活性な蛋白質の製法を提供する。 【構成】 各サブユニットを、該サブユニットをコード
する外来ＤＮＡを含むプラスミドまたはウイルスである
発現ベクターを有する一つの宿主細胞により生産させ
る。好ましい宿主は哺乳類細胞である。生産される蛋白
質はｈＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨのようなホルモ
ンである。
なる生物学的に活性な蛋白質の製法を提供する。 【構成】 各サブユニットを、該サブユニットをコード
する外来ＤＮＡを含むプラスミドまたはウイルスである
発現ベクターを有する一つの宿主細胞により生産させ
る。好ましい宿主は哺乳類細胞である。生産される蛋白
質はｈＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨまたはＴＳＨのようなホルモ
ンである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術を用い
てヘテロポリマータンパク質を生産することに関する。
てヘテロポリマータンパク質を生産することに関する。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術によって、各種のポリ
ペプチド鎖が細菌、酵母および培養哺乳動物細胞のよう
な宿主細胞内で発現されてきた。Ｊ．Ｃ．フィッデス
（Ｆｉｄｄｅｓ）およびＨ．Ｍ．グッドマン（Ｇｏｏｄ
ｍａｎ）のネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８１巻，３
５１〜３５６頁（１９７９年）およびＪ．Ｃ．フィッデ
スおよびＨ．Ｍ．グッドマンのネイチャー第２８６巻，
６８４〜６８７頁（１９８０年）はヒト絨毛膜生殖腺刺
激ホルモン（ｈＣＧ）のαおよびβサブユニットのそれ
ぞれのクローニングについて述べている。
ペプチド鎖が細菌、酵母および培養哺乳動物細胞のよう
な宿主細胞内で発現されてきた。Ｊ．Ｃ．フィッデス
（Ｆｉｄｄｅｓ）およびＨ．Ｍ．グッドマン（Ｇｏｏｄ
ｍａｎ）のネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８１巻，３
５１〜３５６頁（１９７９年）およびＪ．Ｃ．フィッデ
スおよびＨ．Ｍ．グッドマンのネイチャー第２８６巻，
６８４〜６８７頁（１９８０年）はヒト絨毛膜生殖腺刺
激ホルモン（ｈＣＧ）のαおよびβサブユニットのそれ
ぞれのクローニングについて述べている。
【０００３】カナメ（Ｋａｎａｍｅ）の米国特許第４３
８３０３６号はｈＣＧの生産方法を開示しており、この
方法はヒトリンパ芽球細胞を実験動物に移植し、その実
験動物から前記細胞を採取してインビトロで培養し、こ
の培養物から蓄積したｈＣＧを得るものである。
８３０３６号はｈＣＧの生産方法を開示しており、この
方法はヒトリンパ芽球細胞を実験動物に移植し、その実
験動物から前記細胞を採取してインビトロで培養し、こ
の培養物から蓄積したｈＣＧを得るものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般に、本発明は１つ
の観点によれば複数のサブユニットから構成される生物
学的に活性なヘテロポリマータンパク質を提供し、各サ
ブユニットはそのサブユニットをコードする異種ＤＮＡ
を含むところの自律的に複製する（すなわち、宿主細胞
の染色体に組込まれていない）発現ベクターを有する細
胞により合成される。
の観点によれば複数のサブユニットから構成される生物
学的に活性なヘテロポリマータンパク質を提供し、各サ
ブユニットはそのサブユニットをコードする異種ＤＮＡ
を含むところの自律的に複製する（すなわち、宿主細胞
の染色体に組込まれていない）発現ベクターを有する細
胞により合成される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】好適な実施態様では、哺
乳類細胞を用いてタンパク質を合成し、このタンパク質
が翻訳後に、最適にはグリコシル化によって、修飾され
る。このタンパク質はホルモン、最適にはｈＣＧ、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）などの性ホルモンもしくは甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）のような分泌タンパク質である。
乳類細胞を用いてタンパク質を合成し、このタンパク質
が翻訳後に、最適にはグリコシル化によって、修飾され
る。このタンパク質はホルモン、最適にはｈＣＧ、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）などの性ホルモンもしくは甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）のような分泌タンパク質である。
【０００６】他の観点によれば、本発明は第１の発現ベ
クターを含む細胞を提供し、この細胞がそのベクターに
よって少なくとも部分的にコードされる生物学的に活性
なヘテロポリマータンパク質を生産することができる。
好適な実施態様では、第２の自律的に複製する発現ベク
ターがそのタンパク質の第２部分をコードするか、ある
いは単一の発現ベクターがそのタンパク質の少なくとも
２つのサブユニットをコードする。タンパク質はｈＣＧ
またはヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）であり、ベクター
は複製ウイルスまたはプラスミドであり、細胞はサルま
たはマウスの細胞である。ｈＣＧまたはＬＨの異なるサ
ブユニットの転写がＳＶ４０後期プロモーターの支配下
にある。または、タンパク質のαサブユニットの転写が
ＳＶ４０初期プロモーターの支配下にありかつβサブユ
ニットの転写がマウスメタロチオネインプロモーターの
支配下にあるか、あるいは両方のサブユニットの転写が
マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にある。
そしてこのマウスメタロチオネインプロモーターを含む
発現ベクターがウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ゲノムの
少なくとも６９％の形質転換領域を含む。
クターを含む細胞を提供し、この細胞がそのベクターに
よって少なくとも部分的にコードされる生物学的に活性
なヘテロポリマータンパク質を生産することができる。
好適な実施態様では、第２の自律的に複製する発現ベク
ターがそのタンパク質の第２部分をコードするか、ある
いは単一の発現ベクターがそのタンパク質の少なくとも
２つのサブユニットをコードする。タンパク質はｈＣＧ
またはヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）であり、ベクター
は複製ウイルスまたはプラスミドであり、細胞はサルま
たはマウスの細胞である。ｈＣＧまたはＬＨの異なるサ
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にある。または、タンパク質のαサブユニットの転写が
ＳＶ４０初期プロモーターの支配下にありかつβサブユ
ニットの転写がマウスメタロチオネインプロモーターの
支配下にあるか、あるいは両方のサブユニットの転写が
マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にある。
そしてこのマウスメタロチオネインプロモーターを含む
発現ベクターがウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ゲノムの
少なくとも６９％の形質転換領域を含む。
【０００７】また別の観点によれば、本発明は２つの異
なる異種タンパク質をコードする２つの遺伝子を含む自
律的に複製する発現ベクターを提供し、これらの遺伝子
は２つの異なるプロモーター（最適には、メタロチオネ
インプロモーターおよびＢＰＶプロモーター）の支配下
にあり、別々のプロモーターを使用することにより有害
な組換えの可能性が都合よく最小限に抑えられる。
なる異種タンパク質をコードする２つの遺伝子を含む自
律的に複製する発現ベクターを提供し、これらの遺伝子
は２つの異なるプロモーター（最適には、メタロチオネ
インプロモーターおよびＢＰＶプロモーター）の支配下
にあり、別々のプロモーターを使用することにより有害
な組換えの可能性が都合よく最小限に抑えられる。
【０００８】本明細書で用いる“サブユニット”という
用語はタンパク質の一部分を意味し、この部分またはそ
の同族体もしくは類似体が本来別個のｍＲＮＡによって
コードされるものである。従って、例えばＩｇＧ免疫グ
ロブリンの重鎖および軽鎖はそれぞれサブユニットであ
ると考えられる。一方、インシュリンは２つのペプチド
鎖で構成されるが、これらのペプチド鎖は本来１つのｍ
ＲＮＡによってコードされ、翻訳後に自然に開裂されて
２つのペプチド鎖となるので、サブユニットであるとは
考えない。
用語はタンパク質の一部分を意味し、この部分またはそ
の同族体もしくは類似体が本来別個のｍＲＮＡによって
コードされるものである。従って、例えばＩｇＧ免疫グ
ロブリンの重鎖および軽鎖はそれぞれサブユニットであ
ると考えられる。一方、インシュリンは２つのペプチド
鎖で構成されるが、これらのペプチド鎖は本来１つのｍ
ＲＮＡによってコードされ、翻訳後に自然に開裂されて
２つのペプチド鎖となるので、サブユニットであるとは
考えない。
【０００９】“発現ベクター”という用語は、宿主細胞
内での発現を可能にするところの調節配列の支配下にあ
る異種ＤＮＡ（ベクターに対して異種のＤＮＡ）を含む
クローニングベクターを意味する。この種のベクターに
は複製ウイルス、プラスミドおよびファージが含まれ
る。
内での発現を可能にするところの調節配列の支配下にあ
る異種ＤＮＡ（ベクターに対して異種のＤＮＡ）を含む
クローニングベクターを意味する。この種のベクターに
は複製ウイルス、プラスミドおよびファージが含まれ
る。
【００１０】本発明は形質転換細胞の単一培養による生
物学的に活性なヘテロポリマータンパク質の生産を可能
にする。同一細胞内でヘテロポリマータンパク質の両サ
ブユニットが生産されることにより、別々の培養からの
サブユニットを再結合させて活性なヘテロポリマー分子
を構成する必要がない。この方法はまたタンパク質の活
性または安定性のために必要な翻訳後修飾（例えば、タ
ンパク質のグリコシル化および加水分解処理）を単一培
養中に受けるところのタンパク質の生産を可能にする。
物学的に活性なヘテロポリマータンパク質の生産を可能
にする。同一細胞内でヘテロポリマータンパク質の両サ
ブユニットが生産されることにより、別々の培養からの
サブユニットを再結合させて活性なヘテロポリマー分子
を構成する必要がない。この方法はまたタンパク質の活
性または安定性のために必要な翻訳後修飾（例えば、タ
ンパク質のグリコシル化および加水分解処理）を単一培
養中に受けるところのタンパク質の生産を可能にする。
【００１１】自律的に複製する発現ベクターの使用は、
宿主染色体の調節配列による望ましくない影響が意図す
るコーディング領域へ及ばないようにする。
宿主染色体の調節配列による望ましくない影響が意図す
るコーディング領域へ及ばないようにする。
【００１２】本発明の他の利点および特徴は次の好適な
実施態様の説明ならびに請求の範囲から明らかになるで
あろう。
実施態様の説明ならびに請求の範囲から明らかになるで
あろう。
【００１３】今や、本発明の好適な実施態様について説
明するが、最初にその図面について簡単に説明する。
明するが、最初にその図面について簡単に説明する。
【００１４】図 面 第１図はαｈＣＧｃＤＮＡクローン、ＳＶ４０ウイルス
ＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＲ３２２の塩基配列
を含むプラスミドｐαＳＶＨＶＰ１の作製を示す図面で
ある。
ＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＲ３２２の塩基配列
を含むプラスミドｐαＳＶＨＶＰ１の作製を示す図面で
ある。
【００１５】第２図はβｈＣＧｃＤＮＡクローン、ＳＶ
４０ＤＮＡの領域およびｐＢＲ３２２の一部（宿主大腸
菌に対してアンピシリン耐性を付与する領域を含む）を
組込んだプラスミドｐβＳＶＶＰ１の作製を示す図面で
ある。
４０ＤＮＡの領域およびｐＢＲ３２２の一部（宿主大腸
菌に対してアンピシリン耐性を付与する領域を含む）を
組込んだプラスミドｐβＳＶＶＰ１の作製を示す図面で
ある。
【００１６】第３図および第４図はＳＶ４０ＤＮＡにα
およびβｈＣＧｃＤＮＡクローンを挿入したプラスミド
ｐαβＳＶＶＰ１の作製を示す。
およびβｈＣＧｃＤＮＡクローンを挿入したプラスミド
ｐαβＳＶＶＰ１の作製を示す。
【００１７】第５図はプラスミドｐＲＦ３７５およびｐ
ＲＦ３９８の作製を示す。
ＲＦ３９８の作製を示す。
【００１８】第６図はプラスミドＲＦ３９８αｔ2 の作
製を示す。
製を示す。
【００１９】第７図はβｈＣＧｃＤＮＡクローン内の８
８ｂｐプローブの位置を示す。
８ｂｐプローブの位置を示す。
【００２０】第８図はβＬＨの制限酵素地図、および第
９図のプラスミドの作製において使用する断片を示す。
９図のプラスミドの作製において使用する断片を示す。
【００２１】第９図は完全な成熟βＬＨｃＤＮＡクロー
ンを含むプラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂの作製を示す。
ンを含むプラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂの作製を示す。
【００２２】第１０図はウイルスベクターｐαＬＨＳＶ
ＶＰ１の作製を示す。
ＶＰ１の作製を示す。
【００２３】第１１図はＬＨのβサブユニットをコード
するＢＰＶ含有プラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ
の作製を示す。
するＢＰＶ含有プラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ
の作製を示す。
【００２４】構 造 本発明のクローニングベクターは前述の一般構造を有し
ている。好適なベクターは図面に示す構造のものであ
り、以下に詳しく説明する。
ている。好適なベクターは図面に示す構造のものであ
り、以下に詳しく説明する。
【００２５】
【実施例】クローニングベクターの作製 ｈＣＧのαおよびβサブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの分離 本明細書において使用する技術は全てマニエティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラークローニング：実験
手引書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバー研究所（１９８２年）に詳細に記載さ
れており、上記文献は参照することによりここに引用さ
れる。
ａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラークローニング：実験
手引書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ
リング・ハーバー研究所（１９８２年）に詳細に記載さ
れており、上記文献は参照することによりここに引用さ
れる。
【００２６】胎盤組織から次の方法を用いてＲＮＡを抽
出する。フェノール：１ｍＭＥＤＴＡ含有１００ｍＭ酢
酸Ｎａ（ｐＨ５．５）の１：１混合物中で上記組織をホ
モジナイズし、２０分間６０°Ｃに加温する。氷上で１
０分間冷却した後、遠心分離にかけて相を分離する。加
温したフェノールで２回以上抽出を繰り返し、続いてク
ロロホルムで２回抽出する。
出する。フェノール：１ｍＭＥＤＴＡ含有１００ｍＭ酢
酸Ｎａ（ｐＨ５．５）の１：１混合物中で上記組織をホ
モジナイズし、２０分間６０°Ｃに加温する。氷上で１
０分間冷却した後、遠心分離にかけて相を分離する。加
温したフェノールで２回以上抽出を繰り返し、続いてク
ロロホルムで２回抽出する。
【００２７】２．５容量のエタノールを添加することに
より最後の水相からＲＮＡが沈殿する。
より最後の水相からＲＮＡが沈殿する。
【００２８】ポリＡ+ ｍＲＮＡを分離するために、胎盤
ＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
−０．５ＭＮａＣｌ中のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカ
ラムに通し、同じ溶液で洗った。ポリＡ+ ｍＲＮＡは１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．０５％ＳＤＳで溶出し、エタノールで２回沈殿
させた。初期収量は組織１ｇ当たり全ＲＮＡ１．５〜
２．０ｍｇであり、このうちの約２％がポリＡ+ ｍＲＮ
Ａである。
ＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
−０．５ＭＮａＣｌ中のオリゴ（ｄＴ）−セルロースカ
ラムに通し、同じ溶液で洗った。ポリＡ+ ｍＲＮＡは１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．０５％ＳＤＳで溶出し、エタノールで２回沈殿
させた。初期収量は組織１ｇ当たり全ＲＮＡ１．５〜
２．０ｍｇであり、このうちの約２％がポリＡ+ ｍＲＮ
Ａである。
【００２９】胎盤ｃＤＮＡライブラリーは胎盤ｍＲＮＡ
の逆転写、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（大型断片）を
用いる第２鎖の合成、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理、お
よび末端デオキシヌクレオチジル転移酵素によるホモポ
リマー（ｄＣ）の末端付加（ｔａｉｌｉｎｇ）を行うこ
とによって作製される。これらの方法は全て慣用技術に
よって行われる。
の逆転写、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（大型断片）を
用いる第２鎖の合成、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理、お
よび末端デオキシヌクレオチジル転移酵素によるホモポ
リマー（ｄＣ）の末端付加（ｔａｉｌｉｎｇ）を行うこ
とによって作製される。これらの方法は全て慣用技術に
よって行われる。
【００３０】一般的な製造例では、ｍＲＮＡの１本鎖
（ｓｓ）ｃＤＮＡへの転化２０〜３０％、第２鎖合成後
のＳ１ヌクレアーゼ消化に対する耐性７０％、および長
さが１０〜２５個の塩基からなるｄＣ“テイル”が得ら
れる。次に、これらのｃＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ
３２２のＤＮＡ断片（プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔ
Ｉで消化し、これにｄＧ“テイル”を付加したもの）と
アニールする。その後これらの組換えプラスミドを用い
て大腸菌細胞を形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを作
る（テトラサイクリン耐性に基づいて形質転換細胞を選
択する）。
（ｓｓ）ｃＤＮＡへの転化２０〜３０％、第２鎖合成後
のＳ１ヌクレアーゼ消化に対する耐性７０％、および長
さが１０〜２５個の塩基からなるｄＣ“テイル”が得ら
れる。次に、これらのｃＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ
３２２のＤＮＡ断片（プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔ
Ｉで消化し、これにｄＧ“テイル”を付加したもの）と
アニールする。その後これらの組換えプラスミドを用い
て大腸菌細胞を形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを作
る（テトラサイクリン耐性に基づいて形質転換細胞を選
択する）。
【００３１】ヒトαｈＣＧクローンを同定するために、
ハイブリダイゼーション用プローブとしてマウスα甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）クローンの２１９ｂｐ断片を
使用する。このプローブはその塩基配列の７７％がヒト
クローンと相同である。このプローブをニックトランス
レーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によ
って放射能でラベルし、相同の程度を考慮する条件下に
ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせる。強くハ
イブリダイズするクローンを制限酵素マッピングによっ
て分析し、αｈＣＧの完全なコーディング配列を含むク
ローンがＤＮＡの塩基配列決定により証明される。
ハイブリダイゼーション用プローブとしてマウスα甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）クローンの２１９ｂｐ断片を
使用する。このプローブはその塩基配列の７７％がヒト
クローンと相同である。このプローブをニックトランス
レーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によ
って放射能でラベルし、相同の程度を考慮する条件下に
ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせる。強くハ
イブリダイズするクローンを制限酵素マッピングによっ
て分析し、αｈＣＧの完全なコーディング配列を含むク
ローンがＤＮＡの塩基配列決定により証明される。
【００３２】プラスミドｐαＳＶＨＶＰ１の作製 第１図に示すように、プラスミドα９７０Ｈ／Ｂを作製
するためにαｈＣＧ断片を含むｃＤＮＡクローンをＮｃ
ｏＩで消化する。このＮｃｏＩ部位（翻訳開始の信号を
発するＡＴＧコドンのちょうど５′側）を修復して合成
ＨｉｎｄＩＩＩリンカーへ結合させる。同様に、このク
ローン３′非翻訳領域内の天然ＨｉｎｄＩＩＩ部位を切
断し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）で修復し、その後合成ＢａｍＨＩリンカーへ結合さ
せる。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でクローン化してプラ
スミドα５７４Ｈ／Ｂを作製する。このプラスミドはＢ
ａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理
し、その後ポリアクリルアミドゲルにより分離したＳＶ
４０ＤＮＡの３９６ｂｐＳａｕ３Ａ断片（０．０７〜
０．１４図単位）へ結合させる。この結合混成物を用い
て大腸菌をアンピシリン耐性へと形質転換し、これらの
形質転換体から目的のプラスミドα９７０Ｈ／Ｂを同定
する。
するためにαｈＣＧ断片を含むｃＤＮＡクローンをＮｃ
ｏＩで消化する。このＮｃｏＩ部位（翻訳開始の信号を
発するＡＴＧコドンのちょうど５′側）を修復して合成
ＨｉｎｄＩＩＩリンカーへ結合させる。同様に、このク
ローン３′非翻訳領域内の天然ＨｉｎｄＩＩＩ部位を切
断し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）で修復し、その後合成ＢａｍＨＩリンカーへ結合さ
せる。この断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でクローン化してプラ
スミドα５７４Ｈ／Ｂを作製する。このプラスミドはＢ
ａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理
し、その後ポリアクリルアミドゲルにより分離したＳＶ
４０ＤＮＡの３９６ｂｐＳａｕ３Ａ断片（０．０７〜
０．１４図単位）へ結合させる。この結合混成物を用い
て大腸菌をアンピシリン耐性へと形質転換し、これらの
形質転換体から目的のプラスミドα９７０Ｈ／Ｂを同定
する。
【００３３】プラスミドＱ2 ７はＳＶ４０をそのＨｐａ
ＩＩ部位で切断し、Ｓ１ヌクレアーゼで消化することに
より平滑末端を作り、ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させ、
ＥｃｏＲＩで消化し、得られた１４３６ｂｐの断片をｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位内でクローン化することに
より作製される。
ＩＩ部位で切断し、Ｓ１ヌクレアーゼで消化することに
より平滑末端を作り、ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させ、
ＥｃｏＲＩで消化し、得られた１４３６ｂｐの断片をｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位内でクローン化することに
より作製される。
【００３４】第１図に示すように、Ｑ2 ７はＥｃｏＲＩ
で完全消化しかつＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、０．７
２〜０．９４図単位の断片を分離してα９７０Ｈ／Ｂ
（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化してアリカリ
性ホスファターゼで処理したもの）内でクローン化す
る。この結合混合物を用いて大腸菌を形質転換し、制限
酵素マッピングによりこれらの形質転換体から目的のプ
ラスミドｐαＳＶＬを固定する。
で完全消化しかつＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、０．７
２〜０．９４図単位の断片を分離してα９７０Ｈ／Ｂ
（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化してアリカリ
性ホスファターゼで処理したもの）内でクローン化す
る。この結合混合物を用いて大腸菌を形質転換し、制限
酵素マッピングによりこれらの形質転換体から目的のプ
ラスミドｐαＳＶＬを固定する。
【００３５】ｐαＳＶＬをＥｃｏＲＩで消化し、０〜
０．７２図単位のＳＶ４０断片（ＳＶ４０複製開始点お
よび完全な初期領域を含み、その両末端がＥｃｏＲＩ末
端であるもの）へ結合させてプラスミドｐαＳＶＨＶＰ
１を作製し、これを大腸菌の形質転換体から分離する。
０．７２図単位のＳＶ４０断片（ＳＶ４０複製開始点お
よび完全な初期領域を含み、その両末端がＥｃｏＲＩ末
端であるもの）へ結合させてプラスミドｐαＳＶＨＶＰ
１を作製し、これを大腸菌の形質転換体から分離する。
【００３６】プラスミドｐβＳＶＶＰ１の作製 ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにあるコー
ルドスプリングハーバー研究所のジョンＣ・フィッデス
（Ｊｏｈｎ Ｃ．Ｆｉｄｄｅｓ）からβｈＣＧをコード
する５７９ｂｐのｃＤＮＡクローンを入手した〔フィッ
デスらのネイチャー第２８６巻，６８４〜６８７頁（１
９８０年）を参照〕。この断片の各末端は合成ＢａｍＨ
Ｉリンカーへ結合させる。これをＨｇａＩ制限酵素で消
化した後両末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼで修復
し、ＥｃｏＲＩ部位が信号ペプチドコーディング配列の
ＡＴＧコドンに対して約１０ｂｐ５′側となるように合
成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させる。ＢａｍＨＩ部位は
該コーディング配列の末端をマークするナンセンスコド
ン（終止コドン）に対して約６０ｂｐ３′側にある。第
２図に示すように、この５６６ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を分離し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位と
ＢａｍＨＩ部位との間でクローン化してプラスミドｐβ
５５６Ｒ／Ｂを得る。
ルドスプリングハーバー研究所のジョンＣ・フィッデス
（Ｊｏｈｎ Ｃ．Ｆｉｄｄｅｓ）からβｈＣＧをコード
する５７９ｂｐのｃＤＮＡクローンを入手した〔フィッ
デスらのネイチャー第２８６巻，６８４〜６８７頁（１
９８０年）を参照〕。この断片の各末端は合成ＢａｍＨ
Ｉリンカーへ結合させる。これをＨｇａＩ制限酵素で消
化した後両末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼで修復
し、ＥｃｏＲＩ部位が信号ペプチドコーディング配列の
ＡＴＧコドンに対して約１０ｂｐ５′側となるように合
成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させる。ＢａｍＨＩ部位は
該コーディング配列の末端をマークするナンセンスコド
ン（終止コドン）に対して約６０ｂｐ３′側にある。第
２図に示すように、この５６６ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を分離し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位と
ＢａｍＨＩ部位との間でクローン化してプラスミドｐβ
５５６Ｒ／Ｂを得る。
【００３７】プラスミドｐＳＶＨＲ（第２図）を作製す
るために、ＳＶ４０ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分消化
して線状分子となし、これをＳ１ヌクレアーゼで消化し
て平滑末端を作り、合成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合さ
せ、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化する。Ｓ
Ｖ４０複製開始点および初期領域を含む０．９４〜０．
１４図単位のこの断片はＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と
してのｐＢＲ３２２内でクローン化する。
るために、ＳＶ４０ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分消化
して線状分子となし、これをＳ１ヌクレアーゼで消化し
て平滑末端を作り、合成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合さ
せ、そしてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化する。Ｓ
Ｖ４０複製開始点および初期領域を含む０．９４〜０．
１４図単位のこの断片はＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と
してのｐＢＲ３２２内でクローン化する。
【００３８】さらに、第２図に示すように、ＥｃｏＲＩ
メチラーゼによって触媒される反応でプラスミドｐβ５
５６Ｒ／ＢのＥｃｏＲＩ部位をメチル化し、この後この
プラスミドをＮｄｅＩで切断する。Ｓ１ヌクレアーゼ処
理したＮｄｅＩ平滑末端はＥｃｏＲＩリンカーへ結合さ
せ、ＥｃｏＲＩでの消化により活性化し、その後Ｂａｍ
ＨＩで消化する。
メチラーゼによって触媒される反応でプラスミドｐβ５
５６Ｒ／ＢのＥｃｏＲＩ部位をメチル化し、この後この
プラスミドをＮｄｅＩで切断する。Ｓ１ヌクレアーゼ処
理したＮｄｅＩ平滑末端はＥｃｏＲＩリンカーへ結合さ
せ、ＥｃｏＲＩでの消化により活性化し、その後Ｂａｍ
ＨＩで消化する。
【００３９】ＥｃｏＲＩ部位からＢａｍＨＩ部位までの
ｐＳＶＨＲのＳＶ４０断片を分離し、ｐβ５５６Ｒ／Ｂ
の消化断片を含む反応混合物中で結合させる。結合の
後、この混成物をＳａｌＩで消化して、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ（ＮｄｅＩ）からＢａｍＨＩまでの断片を再
び組込んだプラスミドを除く。この消化結合混成物を用
いて大腸菌を形質転換し、ｐβＳＶＶＰ１を同定し、分
離する。
ｐＳＶＨＲのＳＶ４０断片を分離し、ｐβ５５６Ｒ／Ｂ
の消化断片を含む反応混合物中で結合させる。結合の
後、この混成物をＳａｌＩで消化して、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ（ＮｄｅＩ）からＢａｍＨＩまでの断片を再
び組込んだプラスミドを除く。この消化結合混成物を用
いて大腸菌を形質転換し、ｐβＳＶＶＰ１を同定し、分
離する。
【００４０】プラスミドｐαβＳＶＶＰ１の作製 第３図に示すように、ｐＢＲ３２２／ＫｐｎはｐＢＲ３
２２をＥｃｏＲＩで消化し次にＳ１ヌクレアーゼで消化
することによってその唯一のＥｃｏＲＩ部位を欠失さ
せ、その後この部位にＫｐｎＩリンカーを挿入すること
によってｐＢＲ３２２から誘導される。
２２をＥｃｏＲＩで消化し次にＳ１ヌクレアーゼで消化
することによってその唯一のＥｃｏＲＩ部位を欠失さ
せ、その後この部位にＫｐｎＩリンカーを挿入すること
によってｐＢＲ３２２から誘導される。
【００４１】さらに、第３図に示すようにＳＶ４０ＤＮ
ＡをＡｖａＩＩで消化する。得られた断片の接着末端を
クレノウＤＮＡポリメラーゼで修復して平滑末端を形成
し、その後この混合物はポリアクリルアミドゲルで分画
化する。このゲルから複製開始点および唯一のＫｐｎＩ
部位を含む０．６４〜０．７７図単位の６８２ｂｐ断片
を分離し、合成ＨｉｎｄＩＩＩリンカーへ結合させ、そ
してＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化する。
ＡをＡｖａＩＩで消化する。得られた断片の接着末端を
クレノウＤＮＡポリメラーゼで修復して平滑末端を形成
し、その後この混合物はポリアクリルアミドゲルで分画
化する。このゲルから複製開始点および唯一のＫｐｎＩ
部位を含む０．６４〜０．７７図単位の６８２ｂｐ断片
を分離し、合成ＨｉｎｄＩＩＩリンカーへ結合させ、そ
してＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化する。
【００４２】得られた断片はｐＢＲ３２２／Ｋｐｎへ結
合させる。２６６ｂｐのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
（ＳＶ４０後期プロモーターを含む）を組込んだｐ２６
６を分離する。ｐ２６６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理
する。
合させる。２６６ｂｐのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
（ＳＶ４０後期プロモーターを含む）を組込んだｐ２６
６を分離する。ｐ２６６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理
する。
【００４３】さらに第３図に示すように、ｐβＳＶＶＰ
１／Ｂを次のようにして作製する：ｐβＳＶＶＰ１（第
２図）をＥｃｏＲＩで切断し、続いて結合させてｐＢＲ
３２２配列を除く。この後このＤＮＡをＢａｍＨＩで切
断し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位内でクローン化す
る。
１／Ｂを次のようにして作製する：ｐβＳＶＶＰ１（第
２図）をＥｃｏＲＩで切断し、続いて結合させてｐＢＲ
３２２配列を除く。この後このＤＮＡをＢａｍＨＩで切
断し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位内でクローン化す
る。
【００４４】次いで、得られたプラスミドｐβＳＶＶＰ
１／ＢをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで消化し、１０
０３塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐ２６
６へ結合させてプラスミドｐβＶＰ１２６６を得る。こ
のプラスミドにおいてβｈＣＧｃＤＮＡは、そのＲＮＡ
転写物があたかもウイルスＶＰ１転写物であるかのよう
にスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）される状態で、
ＳＶ４０後期プロモーターから下流に位置する。
１／ＢをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで消化し、１０
０３塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐ２６
６へ結合させてプラスミドｐβＶＰ１２６６を得る。こ
のプラスミドにおいてβｈＣＧｃＤＮＡは、そのＲＮＡ
転写物があたかもウイルスＶＰ１転写物であるかのよう
にスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）される状態で、
ＳＶ４０後期プロモーターから下流に位置する。
【００４５】αｈＣＧｃＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ断片と
してのｐβＶＰ１２６６（そのＨｉｎｄＩＩＩ部位を切
断し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理したも
の）内に挿入する。この結合から誘導された大腸菌形質
転換体を制限酵素マッピングによってスクリーニング
し、目的の構造を有するプラスミドを分離する。このプ
ラスミドでは正しい方向でαｈＣＧｃＤＮＡがＶＰ２と
入れ替わり、その下流にβｈＣＧｃＤＮＡが続き、これ
はＶＰ１と入れ替わった。
してのｐβＶＰ１２６６（そのＨｉｎｄＩＩＩ部位を切
断し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理したも
の）内に挿入する。この結合から誘導された大腸菌形質
転換体を制限酵素マッピングによってスクリーニング
し、目的の構造を有するプラスミドを分離する。このプ
ラスミドでは正しい方向でαｈＣＧｃＤＮＡがＶＰ２と
入れ替わり、その下流にβｈＣＧｃＤＮＡが続き、これ
はＶＰ１と入れ替わった。
【００４６】このようにして分離したプラスミドの１つ
であるｐαβＶＰ１を使用してｐαβＳＶＶＰ１の作製
を完成させる。このプラスミドをＫｐｎＩで切断し、Ｋ
ｐｎＩで切断した全ＳＶ４０ゲノムをこの部位へ結合さ
せることにより挿入する。大腸菌の形質転換後に目的の
構造を有するプラスミドｐαβＳＶＶＰ１を単離する。
このプラスミドはｈＣＧのαおよびβサブユニットの両
方をコードするＤＮＡを含み、従って宿主哺乳動物細胞
内で両サブユニットを発現することができ、こうして生
物学的に機能性のグリコシル化へテロダイマーｈＣＧが
生産される。（グリコシル化は翻訳後に起こる）。
であるｐαβＶＰ１を使用してｐαβＳＶＶＰ１の作製
を完成させる。このプラスミドをＫｐｎＩで切断し、Ｋ
ｐｎＩで切断した全ＳＶ４０ゲノムをこの部位へ結合さ
せることにより挿入する。大腸菌の形質転換後に目的の
構造を有するプラスミドｐαβＳＶＶＰ１を単離する。
このプラスミドはｈＣＧのαおよびβサブユニットの両
方をコードするＤＮＡを含み、従って宿主哺乳動物細胞
内で両サブユニットを発現することができ、こうして生
物学的に機能性のグリコシル化へテロダイマーｈＣＧが
生産される。（グリコシル化は翻訳後に起こる）。
【００４７】プラスミドｐＲＦ３７５およびｐＲＦ３９
８の作製 第５図に示すように、ネズミメタロチオネインプロモー
ター、ＳＶ４０ＤＮＡおよびｐＢＲ３２２配列を含むプ
ラスミドＣＬ２８〔プラスミドＪＹＭＭＴ（Ｅ）と同
一；ハマー（Ｈａｍｅｒ）らのＪ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｇｅｎ．１，２７３〜２８８（１９８３）を参
照〕を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで切断する。
この部位にαｈＣＧまたはβｈＣＧのいずれかのｃＤＮ
Ａクローン（それらの５′末端に約１０および３０ｂｐ
の非翻訳領域、ならびにそれらの３′末端に約２２０お
よび６０ｂｐの非翻訳領域を含む）を挿入する。これら
のクローンは末端に合成ＢａｍＨＩリンカーを付加する
ことにより遺伝子操作されたものである。
８の作製 第５図に示すように、ネズミメタロチオネインプロモー
ター、ＳＶ４０ＤＮＡおよびｐＢＲ３２２配列を含むプ
ラスミドＣＬ２８〔プラスミドＪＹＭＭＴ（Ｅ）と同
一；ハマー（Ｈａｍｅｒ）らのＪ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｇｅｎ．１，２７３〜２８８（１９８３）を参
照〕を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで切断する。
この部位にαｈＣＧまたはβｈＣＧのいずれかのｃＤＮ
Ａクローン（それらの５′末端に約１０および３０ｂｐ
の非翻訳領域、ならびにそれらの３′末端に約２２０お
よび６０ｂｐの非翻訳領域を含む）を挿入する。これら
のクローンは末端に合成ＢａｍＨＩリンカーを付加する
ことにより遺伝子操作されたものである。
【００４８】得られたプラスミドｐＲＦ３０２（α）ま
たはｐＲＦ３９４（β）は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳ
ａｌＩで消化してＳＶ４０ＤＮＡ配列を除く。
たはｐＲＦ３９４（β）は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳ
ａｌＩで消化してＳＶ４０ＤＮＡ配列を除く。
【００４９】全ＢＰＶゲノムおよびｐＢＲ３２２配列の
一部を含むプラスミドｐＢ２−２をＢａｍＨＩおよびＳ
ａｌＩで消化してＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ末端をもつＢＰ
Ｖゲノムを得る。この断片はメタロチオネイン−ｈＣＧ
配列を含むｐＲＦ３０２（α）およびｐＲＦ３９４
（β）へ結合させる。
一部を含むプラスミドｐＢ２−２をＢａｍＨＩおよびＳ
ａｌＩで消化してＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ末端をもつＢＰ
Ｖゲノムを得る。この断片はメタロチオネイン−ｈＣＧ
配列を含むｐＲＦ３０２（α）およびｐＲＦ３９４
（β）へ結合させる。
【００５０】大腸菌の形質転換後にプラスミドｐＲＦ３
７５およびｐＲＦ３９８を同定して分離する。これらは
マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるα
ｈＣＧまたはβｈＣＧをコードする。
７５およびｐＲＦ３９８を同定して分離する。これらは
マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるα
ｈＣＧまたはβｈＣＧをコードする。
【００５１】プラスミドＲＦ３９８αｔ2 の作製 第６図に示すように、プラスミドｐαｔ2 はαｈＣＧ５
７４ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプラスミドｐＶＢｔ2 内でク
ローニングすることにより誘導される〔Ｖ．Ｂ．レディ
ー（Ｒｅｄｄｙ）らのＰＮＡＳ ７９，２０６４〜２０
６７（１９８２）を参照〕。ＳＶ４０初期プロモーター
の支配下にあるαｈＣＧｃＤＮＡを含むｐαｔ2 はＥｃ
ｏＲＩで消化する。５′側の突き出た一本鎖部分はＳ１
ヌクレアーゼ消化によって除き、その後平滑末端結合に
より合成ＢａｍＨＩリンカーを付加する。
７４ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプラスミドｐＶＢｔ2 内でク
ローニングすることにより誘導される〔Ｖ．Ｂ．レディ
ー（Ｒｅｄｄｙ）らのＰＮＡＳ ７９，２０６４〜２０
６７（１９８２）を参照〕。ＳＶ４０初期プロモーター
の支配下にあるαｈＣＧｃＤＮＡを含むｐαｔ2 はＥｃ
ｏＲＩで消化する。５′側の突き出た一本鎖部分はＳ１
ヌクレアーゼ消化によって除き、その後平滑末端結合に
より合成ＢａｍＨＩリンカーを付加する。
【００５２】プラスミドＲＦ３９８（第５図）はＢａｍ
ＨＩで消化して細菌アルカリ性ホスファターゼで処理す
る。ｐαｔ2 の１７３５ｂｐ ＢａｍＨＩ断片をＲＦ３
９８内に挿入する。大腸菌の形質転換体からプラスミド
ＲＦ３９８αｔ2 を分離する。こうして、このプラスミ
ドはマウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあ
る転写単位内にβｈＣＧｃＤＮＡを、そしてＳＶ４０初
期プロモーターによって支配される転写単位内にαｈＣ
ＧｃＤＮＡを有する。
ＨＩで消化して細菌アルカリ性ホスファターゼで処理す
る。ｐαｔ2 の１７３５ｂｐ ＢａｍＨＩ断片をＲＦ３
９８内に挿入する。大腸菌の形質転換体からプラスミド
ＲＦ３９８αｔ2 を分離する。こうして、このプラスミ
ドはマウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあ
る転写単位内にβｈＣＧｃＤＮＡを、そしてＳＶ４０初
期プロモーターによって支配される転写単位内にαｈＣ
ＧｃＤＮＡを有する。
【００５３】黄体形成ホルモン（ＬＨ）ｃＤＮＡクロー
ンの発現 ヒト下無体ｃＤＮＡライブラリーの作製 ４Ｍチオシアン酸グアニジン、１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、０．０５Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）および０．
００１ＭＥＤＴＡを含む溶液２０ｍｌ中で凍結下垂体５
〜１０ｇをホモジナイズすることにより、ヒト下垂体か
らＲＮＡを調製する。ホモジネート１ｍｌ当たりＣｓＣ
ｌ１ｇを加え、この懸濁液を２０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離にかける。上清はＣｓＣｌ溶液〔最終容量３５
ｍｌ中に１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５）１．２５ｍｌ、０．４
ＭＥＤＴＡ６２．５μｌおよびＣｓＣｌ３９．８ｇを含
有する〕の１５ｍｌクッション上に注意しながらのせて
層状となし、ベックマン超遠心分離器のＴｉ７０ロータ
ーを用いて２０°Ｃ、４５０００ｒｐｍで１８〜２４時
間遠心する。この密度勾配中に薄膜として肉眼視できる
ＲＮＡを注射器で取り出し、希釈し、２容量のエタノー
ルを加えることにより沈殿させる。溶解および再沈殿を
３回繰り返した後、ＲＮＡ沈殿物をＨ2 Ｏに溶解し、濃
縮原液を加えることにより０．０１ＭトリスーＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．５ＭＮａＣｌとなるように調
製する。その後、胎盤ＲＮＡの場合に述べたようにオリ
ゴｄＴ−セルロースカラムを２回通過させることによ
り、この調製物からポリＡ+ ｍＲＮＡを分離する。
ンの発現 ヒト下無体ｃＤＮＡライブラリーの作製 ４Ｍチオシアン酸グアニジン、１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール、０．０５Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）および０．
００１ＭＥＤＴＡを含む溶液２０ｍｌ中で凍結下垂体５
〜１０ｇをホモジナイズすることにより、ヒト下垂体か
らＲＮＡを調製する。ホモジネート１ｍｌ当たりＣｓＣ
ｌ１ｇを加え、この懸濁液を２０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離にかける。上清はＣｓＣｌ溶液〔最終容量３５
ｍｌ中に１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５）１．２５ｍｌ、０．４
ＭＥＤＴＡ６２．５μｌおよびＣｓＣｌ３９．８ｇを含
有する〕の１５ｍｌクッション上に注意しながらのせて
層状となし、ベックマン超遠心分離器のＴｉ７０ロータ
ーを用いて２０°Ｃ、４５０００ｒｐｍで１８〜２４時
間遠心する。この密度勾配中に薄膜として肉眼視できる
ＲＮＡを注射器で取り出し、希釈し、２容量のエタノー
ルを加えることにより沈殿させる。溶解および再沈殿を
３回繰り返した後、ＲＮＡ沈殿物をＨ2 Ｏに溶解し、濃
縮原液を加えることにより０．０１ＭトリスーＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．５ＭＮａＣｌとなるように調
製する。その後、胎盤ＲＮＡの場合に述べたようにオリ
ゴｄＴ−セルロースカラムを２回通過させることによ
り、この調製物からポリＡ+ ｍＲＮＡを分離する。
【００５４】ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーは胎盤ポ
リＡ+ ｍＲＮＡについて先に述べたごとく下垂体ポリＡ
+ ｍＲＮＡから作製されるが、この場合は第２鎖ｃＤＮ
Ａ合成のために、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（大型断
片）とトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素の両方を順次
使用する。最初はクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）が用いられ
る。フェノール抽出によって反応を停止させる。遠心分
離した抽出物の水相をバイオゲルＡ−５ｍの５ｍｌカラ
ムに加える。高分子量の物質を含む画分をプールし、濃
縮し、２容量のエタノールで沈殿させ、乾燥し、そして
逆転写のために１００ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭＫＣｌ、２０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、４種のデオキシリボヌク
レオシドトリホスフェート各々１ｍＭを含む溶液に溶解
する。逆転写酵素はｃＤＮＡ１μｇ当たり約２０単位加
える。その後２本鎖ｃＤＮＡはＳ１ヌクレアーゼで処理
し、ホモポリマーの末端付加を行い、そして先に述べた
ごとくクローン化する。
リＡ+ ｍＲＮＡについて先に述べたごとく下垂体ポリＡ
+ ｍＲＮＡから作製されるが、この場合は第２鎖ｃＤＮ
Ａ合成のために、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（大型断
片）とトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素の両方を順次
使用する。最初はクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）が用いられ
る。フェノール抽出によって反応を停止させる。遠心分
離した抽出物の水相をバイオゲルＡ−５ｍの５ｍｌカラ
ムに加える。高分子量の物質を含む画分をプールし、濃
縮し、２容量のエタノールで沈殿させ、乾燥し、そして
逆転写のために１００ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭＫＣｌ、２０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、４種のデオキシリボヌク
レオシドトリホスフェート各々１ｍＭを含む溶液に溶解
する。逆転写酵素はｃＤＮＡ１μｇ当たり約２０単位加
える。その後２本鎖ｃＤＮＡはＳ１ヌクレアーゼで処理
し、ホモポリマーの末端付加を行い、そして先に述べた
ごとくクローン化する。
【００５５】βＬＨｃＤＮＡクローンの単離 ２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む栄養寒天平板
上に増殖させたコロニー（細胞集団）はニトロセルロー
スフィルターへ移す。０．５ＭＮａＯＨで処理すること
によりコロニーをその場で溶解し、そして１．５ＭＮａ
Ｃｌを含む０．５ＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中
和する。遊離したＤＮＡを真空オーブン中８０°Ｃで２
時間ベーキングすることによりフィルターに固定する。
このフィルターは成熟ｈＣＧβ鎖の１６から４５までの
アミノ酸（この部分は３０個のアミノ酸のうちβＬＨポ
リペプチドのこの領域と共通のアミノ酸を２９個有す
る）に対応するβｈＣＧクローンの32Ｐでラベルした８
８ｂｐ断片とのハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングする（第７図参照）。ハイブリダイゼーション
は５０％ホルムアミド、０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７
５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）、２．５％デキストラ
ンサルフェート、０．１％ポリビニルピロリドン、０．
１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および少なくとも１
０5 ｃｐｍ／フィルターの32Ｐでラベルした８８ｂｐβ
ｈＣＧ断片を含む溶液中３２°Ｃで一晩実施する。オー
トラジオグラフィーを行う前に、フィルターを３７°Ｃ
において０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎ
ａで数回洗う。陽性の単離クローンのうちの１つである
ＬＨ１２（第８図）をこの後使用する。ＬＨ１２は長さ
が３６５ｂｐであり、プレβ信号配列の１５個のアミノ
酸および成熟βＬＨポリペプチドの１０５個のアミノ酸
をコードする塩基配列を含んでいる。このヌクレオチド
の塩基配列を決定する。ＬＨ１２は完全な成熟βＬＨを
コードしないので、32Ｐでラベルしたハイブリダイゼー
ションプローブとしてＬＨ１２の２４０ｂｐＮｃｏＩ−
ＰｖｕＩＩ断片（第８図）を用いて、ヒト下垂体ｃＤＮ
Ａライブラリーの以後のスクリーニングを行う。このス
クリーニングによってクローンＬＨ６（第８図）を単離
する。ＬＨ６はｍＲＮＡの非翻訳部分からｍＲＮＡのポ
リＡ“テイル”の２７個のＡ残基までに対応する領域を
含むのでβＬＨの完全な３′末端を有する。５′方向へ
ＬＨ１２を越えて伸びるクローンは１つも見出されな
い。組合せた完全な成熟βＬＨコーディング領域のＤＮ
Ａ塩基配列の決定は、文献に発表されたβＬＨのアミノ
酸配列データとはそのアミノ酸配列が２つの点で相違す
ることを示している：すなわち４２位はメチオニンであ
り、５５位はバリンである。また、成熟βＬＨはｃＤＮ
Ａの塩基配列に基づくと１２１個のアミノ酸を含む。
上に増殖させたコロニー（細胞集団）はニトロセルロー
スフィルターへ移す。０．５ＭＮａＯＨで処理すること
によりコロニーをその場で溶解し、そして１．５ＭＮａ
Ｃｌを含む０．５ＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中
和する。遊離したＤＮＡを真空オーブン中８０°Ｃで２
時間ベーキングすることによりフィルターに固定する。
このフィルターは成熟ｈＣＧβ鎖の１６から４５までの
アミノ酸（この部分は３０個のアミノ酸のうちβＬＨポ
リペプチドのこの領域と共通のアミノ酸を２９個有す
る）に対応するβｈＣＧクローンの32Ｐでラベルした８
８ｂｐ断片とのハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングする（第７図参照）。ハイブリダイゼーション
は５０％ホルムアミド、０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７
５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）、２．５％デキストラ
ンサルフェート、０．１％ポリビニルピロリドン、０．
１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および少なくとも１
０5 ｃｐｍ／フィルターの32Ｐでラベルした８８ｂｐβ
ｈＣＧ断片を含む溶液中３２°Ｃで一晩実施する。オー
トラジオグラフィーを行う前に、フィルターを３７°Ｃ
において０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎ
ａで数回洗う。陽性の単離クローンのうちの１つである
ＬＨ１２（第８図）をこの後使用する。ＬＨ１２は長さ
が３６５ｂｐであり、プレβ信号配列の１５個のアミノ
酸および成熟βＬＨポリペプチドの１０５個のアミノ酸
をコードする塩基配列を含んでいる。このヌクレオチド
の塩基配列を決定する。ＬＨ１２は完全な成熟βＬＨを
コードしないので、32Ｐでラベルしたハイブリダイゼー
ションプローブとしてＬＨ１２の２４０ｂｐＮｃｏＩ−
ＰｖｕＩＩ断片（第８図）を用いて、ヒト下垂体ｃＤＮ
Ａライブラリーの以後のスクリーニングを行う。このス
クリーニングによってクローンＬＨ６（第８図）を単離
する。ＬＨ６はｍＲＮＡの非翻訳部分からｍＲＮＡのポ
リＡ“テイル”の２７個のＡ残基までに対応する領域を
含むのでβＬＨの完全な３′末端を有する。５′方向へ
ＬＨ１２を越えて伸びるクローンは１つも見出されな
い。組合せた完全な成熟βＬＨコーディング領域のＤＮ
Ａ塩基配列の決定は、文献に発表されたβＬＨのアミノ
酸配列データとはそのアミノ酸配列が２つの点で相違す
ることを示している：すなわち４２位はメチオニンであ
り、５５位はバリンである。また、成熟βＬＨはｃＤＮ
Ａの塩基配列に基づくと１２１個のアミノ酸を含む。
【００５６】完全な信号ペプチドコーディング配列と完
全な成熟βＬＨ配列を含むクローンは、第８図に示す制
限酵素断片を使って、第９図のようにして作製される。
プラスミドβ５７９Ｈから１０４ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｄ
ｄｅＩ断片を分離し、ＬＨ１２プラスミドから分離した
１８１ｂｐのＤｄｅＩ断片（その後ＰｓｔＩで消化した
もの）へ結合させる。１５°Ｃで一晩結合させた後、こ
の結合混成物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、７
％ポリアクリルアミドゲルで分画化し、ゲルから目的の
２５６ｂｐ断片を分離する。この断片は２０個のアミノ
酸からなる信号ペプチドのコーディング配列を与えるよ
うにβｈＣＧ信号配列とプレβＬＨの信号配列とを融合
させたものである。
全な成熟βＬＨ配列を含むクローンは、第８図に示す制
限酵素断片を使って、第９図のようにして作製される。
プラスミドβ５７９Ｈから１０４ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｄ
ｄｅＩ断片を分離し、ＬＨ１２プラスミドから分離した
１８１ｂｐのＤｄｅＩ断片（その後ＰｓｔＩで消化した
もの）へ結合させる。１５°Ｃで一晩結合させた後、こ
の結合混成物をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、７
％ポリアクリルアミドゲルで分画化し、ゲルから目的の
２５６ｂｐ断片を分離する。この断片は２０個のアミノ
酸からなる信号ペプチドのコーディング配列を与えるよ
うにβｈＣＧ信号配列とプレβＬＨの信号配列とを融合
させたものである。
【００５７】２５６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片
は、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＢＲ３２２
内でクローン化してプラスミドＬＨβ２６０を得る。第
９図に示す１４６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片をポ
リアクリルアミドゲルから分離し、これは以下に述べる
ようなプラスミド作製の際にあとで使用する。
は、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＢＲ３２２
内でクローン化してプラスミドＬＨβ２６０を得る。第
９図に示す１４６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片をポ
リアクリルアミドゲルから分離し、これは以下に述べる
ようなプラスミド作製の際にあとで使用する。
【００５８】ＬＨ６プラスミド（第９図）をＳａｕ３ａ
で消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって３
９０ｂｐ断片を分離する。次にこの断片はＨｉｎｃＩＩ
で消化し、ＢａｍＨＩリンカー結合させ、ＢａｍＨＩで
消化し、そしてプラスミドｐＡＰＰ内のＢａｍＨＩ部位
でクローン化する。ｐＡＰＰはｐＢＲ３２２をＡｖａＩ
で消化し、５′末端側の突き出た部分をｄＮＴＰおよび
大腸菌の大型断片ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて修復
し、ＰｖｕＩＩで消化し、そしてこのプラスミドを閉環
してＰｖｕＩＩ切断部位を除くことによりｐＢＲ３２２
から誘導される。ｐＡＰＰのＢａｍＨＩ部位へ３４０ｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を結合させることにより分離したプ
ラスミドＬＨ６ＢをＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化
し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理する。この断
片は先に述べたＬＨβ２６０の１４６ｂｐＥｃｏＲＩ−
ＮｃｏＩ断片および第９図に示すプラスミドＬＨ１２か
ら分離した２４１ｂｐＮｃｏＩ−ＰｖｕＩＩ断片の混合
物へ結合させる。この結合混成物はアンピシリン耐性へ
と大腸菌を形質転換するのに用いる。形質転換体からプ
ラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂを分離する。ＬＨ５２０Ｈ／
Ｂはハイブリッド信号ペプチド配列をもつ完全なβＬＨ
コーディング配列を含んでいる。
で消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって３
９０ｂｐ断片を分離する。次にこの断片はＨｉｎｃＩＩ
で消化し、ＢａｍＨＩリンカー結合させ、ＢａｍＨＩで
消化し、そしてプラスミドｐＡＰＰ内のＢａｍＨＩ部位
でクローン化する。ｐＡＰＰはｐＢＲ３２２をＡｖａＩ
で消化し、５′末端側の突き出た部分をｄＮＴＰおよび
大腸菌の大型断片ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて修復
し、ＰｖｕＩＩで消化し、そしてこのプラスミドを閉環
してＰｖｕＩＩ切断部位を除くことによりｐＢＲ３２２
から誘導される。ｐＡＰＰのＢａｍＨＩ部位へ３４０ｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を結合させることにより分離したプ
ラスミドＬＨ６ＢをＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化
し、細菌アルカリ性ホスファターゼで処理する。この断
片は先に述べたＬＨβ２６０の１４６ｂｐＥｃｏＲＩ−
ＮｃｏＩ断片および第９図に示すプラスミドＬＨ１２か
ら分離した２４１ｂｐＮｃｏＩ−ＰｖｕＩＩ断片の混合
物へ結合させる。この結合混成物はアンピシリン耐性へ
と大腸菌を形質転換するのに用いる。形質転換体からプ
ラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂを分離する。ＬＨ５２０Ｈ／
Ｂはハイブリッド信号ペプチド配列をもつ完全なβＬＨ
コーディング配列を含んでいる。
【００５９】ｐαＬＨＳＶＶＰ１の作製 先に述べたプレαおよびプレβｈＣＧクローンに対して
行ったようにして、ＳＶ４０を基礎とするベクター内で
このプレβＬＨクローンを発現させるために、プレβコ
ーディング配列のＡＴＧコドンに非常に接近してＥｃｏ
ＲＩ切断部位を配置することが望ましい。このことは、
ＬＨ５２０Ｈ／ＢをＨｇａＩで消化し、５′末端側の突
出部分を修復し、合成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させ、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして分離した
４９６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化しかつ細菌アルカリ性ホスファ
ターゼで処理したｐＢＲ３２２内でクローン化すること
により達成される。この結合混成物を用いて形質転換さ
せた大腸菌からプラスミドＰＬＨ４９６Ｒ／Ｂを分離
し、このプラスミドは発現しようとする４９６ｂｐ断片
の出所源として使用する。
行ったようにして、ＳＶ４０を基礎とするベクター内で
このプレβＬＨクローンを発現させるために、プレβコ
ーディング配列のＡＴＧコドンに非常に接近してＥｃｏ
ＲＩ切断部位を配置することが望ましい。このことは、
ＬＨ５２０Ｈ／ＢをＨｇａＩで消化し、５′末端側の突
出部分を修復し、合成ＥｃｏＲＩリンカーへ結合させ、
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして分離した
４９６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化しかつ細菌アルカリ性ホスファ
ターゼで処理したｐＢＲ３２２内でクローン化すること
により達成される。この結合混成物を用いて形質転換さ
せた大腸菌からプラスミドＰＬＨ４９６Ｒ／Ｂを分離
し、このプラスミドは発現しようとする４９６ｂｐ断片
の出所源として使用する。
【００６０】プラスミドｐαβＶＰＩ（このプラスミド
の作製およびｈＣＧの両サブユニットを発現させる際の
このプラスミドの使用については既に述べており、第４
図を参照されたい）はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消
化し、これらの両酵素で消化したプラスミドＰＬＨ４９
６Ｒ／Ｂを含む反応混合物中で結合させる（第１０図参
照）。大腸菌の形質転換体からプラスミドｐαＬＨＶＰ
１を同定する。第１０図に示すように、ｐαＳＶＨＶＰ
１（第１図）から完全なＳＶ４０ウイルス初期領域をと
り出し、そしてこの領域をＫｐｍＩおよびＳａｌＩで消
化したｐαＬＨＶＰ１内にＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片とし
て結合させることにより挿入してプラスミドｐαＬＨＳ
ＶＶＰ１を得る。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し
て再結合させることにより、ウイルスαＬＨＳＶＶＰ１
が形成される。このウイルスはＳＶ４０後期プロモータ
ーの支配下にある特異なβＬＨサブユニットおよび共通
（ＬＨ，ｈＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨに共通）のαサブ
ユニットのためのクローン化ｃＤＮＡを含んでいる。こ
れらのクローン化ｃＤＮＡは、共通のα挿入物がウイル
スＶＰ１タンパク質コーディング配列と入れ替わりかつ
βＬＨ挿入物がウィルスＶＰ２コーディング配列と入れ
替わるような状態で位置づけられる。
の作製およびｈＣＧの両サブユニットを発現させる際の
このプラスミドの使用については既に述べており、第４
図を参照されたい）はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消
化し、これらの両酵素で消化したプラスミドＰＬＨ４９
６Ｒ／Ｂを含む反応混合物中で結合させる（第１０図参
照）。大腸菌の形質転換体からプラスミドｐαＬＨＶＰ
１を同定する。第１０図に示すように、ｐαＳＶＨＶＰ
１（第１図）から完全なＳＶ４０ウイルス初期領域をと
り出し、そしてこの領域をＫｐｍＩおよびＳａｌＩで消
化したｐαＬＨＶＰ１内にＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片とし
て結合させることにより挿入してプラスミドｐαＬＨＳ
ＶＶＰ１を得る。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断し
て再結合させることにより、ウイルスαＬＨＳＶＶＰ１
が形成される。このウイルスはＳＶ４０後期プロモータ
ーの支配下にある特異なβＬＨサブユニットおよび共通
（ＬＨ，ｈＣＧ、ＦＳＨおよびＴＳＨに共通）のαサブ
ユニットのためのクローン化ｃＤＮＡを含んでいる。こ
れらのクローン化ｃＤＮＡは、共通のα挿入物がウイル
スＶＰ１タンパク質コーディング配列と入れ替わりかつ
βＬＨ挿入物がウィルスＶＰ２コーディング配列と入れ
替わるような状態で位置づけられる。
【００６１】ＢＰＶを基礎とする発現系へのβＬＨｃＤ
ＮＡ（信号ペプチドのβｈＣＧ５′末端を含む）の挿入 ＬＨ５２０Ｈ／Ｂ（第９図）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノ
ウ）で処理し、合成ＳａｌＩリンカーへ結合させ、Ｓａ
ｌＩで消化し、そしてｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位内で
クローン化する。得られたプラスミドＬＨ５３０Ｓａｌ
は第１１図に示すプラスミドＣＬ２８のマウスメタロチ
オネイン遺伝子内に挿入するためのＬＨｃＤＮＡクロー
ンの出所源として使用する。
ＮＡ（信号ペプチドのβｈＣＧ５′末端を含む）の挿入 ＬＨ５２０Ｈ／Ｂ（第９図）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノ
ウ）で処理し、合成ＳａｌＩリンカーへ結合させ、Ｓａ
ｌＩで消化し、そしてｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位内で
クローン化する。得られたプラスミドＬＨ５３０Ｓａｌ
は第１１図に示すプラスミドＣＬ２８のマウスメタロチ
オネイン遺伝子内に挿入するためのＬＨｃＤＮＡクロー
ンの出所源として使用する。
【００６２】ＣＬ２８はＢｇｌＩＩで切断し、Ｓ１ヌク
レアーゼで処理し、ＸｈｏＩリンカーへ結合させる。Ｘ
ｈｏＩでの消化、結合およびＢｇｌＩＩでの消化後にこ
の反応混成物を用いて大腸菌を形質転換させ、プラスミ
ドＣＬ２８Ｘｈｏを得る。このプラスミドはＢａｍＨＩ
およびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＢ２−２（第５
図）のＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ消化物へ結合させてプラス
ミドＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶを得る。後者のＬＨ挿入物は
次にＳａｌＩ断片としてＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶのＸｈｏ
Ｉ部位内へ結合させる。なぜなら、ＳａｌＩ消化物の
５′突出部分がＸｈｏＩ消化物のそれに相補的であるか
らである。ＸｈｏＩで消化してバックグランドを除いた
後、大腸菌を形質転換させ、そしてＢＰＶを基礎とする
プラスミド内にマウスメタロチオネインプロモーターの
支配下にある（ハイブリッド）プレβＬＨ挿入物を含む
目的のプラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶを分離す
る。
レアーゼで処理し、ＸｈｏＩリンカーへ結合させる。Ｘ
ｈｏＩでの消化、結合およびＢｇｌＩＩでの消化後にこ
の反応混成物を用いて大腸菌を形質転換させ、プラスミ
ドＣＬ２８Ｘｈｏを得る。このプラスミドはＢａｍＨＩ
およびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＢ２−２（第５
図）のＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ消化物へ結合させてプラス
ミドＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶを得る。後者のＬＨ挿入物は
次にＳａｌＩ断片としてＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶのＸｈｏ
Ｉ部位内へ結合させる。なぜなら、ＳａｌＩ消化物の
５′突出部分がＸｈｏＩ消化物のそれに相補的であるか
らである。ＸｈｏＩで消化してバックグランドを除いた
後、大腸菌を形質転換させ、そしてＢＰＶを基礎とする
プラスミド内にマウスメタロチオネインプロモーターの
支配下にある（ハイブリッド）プレβＬＨ挿入物を含む
目的のプラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶを分離す
る。
【００６３】宿主サル細胞のトランスフェクションおよ
び感染 ヘテロポリマータンパク質生産用の哺乳類細胞内へのウ
イルス含有ベクターの組込みは一般に次のようにして達
成される。最初に、ウィルスＤＮＡおよびホモポリマー
タンパク質をコードするＤＮＡが例えば大腸菌内に保持
されるプラスミド内に組込まれる場合、そのプラスミド
配列（例えばｐＢＲ３２２配列）を除き、得られたＤＮ
Ａを結合させてウイルス領域およびヘテロポリマータン
パク質をコードする塩基配列１つまたはそれ以上を含む
環状ＤＮＡを形成する。この環状ＤＮＡは一般に複製ウ
イルスを生ずるのに必要な全ての遺伝情報を含むとは限
らず、他の必要な塩基配列（例えば、ウイルス外殻のタ
ンパク質をコードする配列）がヘテロポリマータンパク
質をコードする塩基配列の１つまたはそれ以上によって
置換される。プラスミドＤＮＡを欠いた環状ＤＮＡは、
そのＤＮＡが適当な宿主哺乳動物細胞内に入って複製す
ることができるように、それが誘導されるところの自然
界に存在するウイルスＤＮＡに類似した大きさでなけれ
ばならない。
び感染 ヘテロポリマータンパク質生産用の哺乳類細胞内へのウ
イルス含有ベクターの組込みは一般に次のようにして達
成される。最初に、ウィルスＤＮＡおよびホモポリマー
タンパク質をコードするＤＮＡが例えば大腸菌内に保持
されるプラスミド内に組込まれる場合、そのプラスミド
配列（例えばｐＢＲ３２２配列）を除き、得られたＤＮ
Ａを結合させてウイルス領域およびヘテロポリマータン
パク質をコードする塩基配列１つまたはそれ以上を含む
環状ＤＮＡを形成する。この環状ＤＮＡは一般に複製ウ
イルスを生ずるのに必要な全ての遺伝情報を含むとは限
らず、他の必要な塩基配列（例えば、ウイルス外殻のタ
ンパク質をコードする配列）がヘテロポリマータンパク
質をコードする塩基配列の１つまたはそれ以上によって
置換される。プラスミドＤＮＡを欠いた環状ＤＮＡは、
そのＤＮＡが適当な宿主哺乳動物細胞内に入って複製す
ることができるように、それが誘導されるところの自然
界に存在するウイルスＤＮＡに類似した大きさでなけれ
ばならない。
【００６４】この環状ＤＮＡはその後の感染に使用する
ウイルス株をつくるために宿主細胞をトランスフェクシ
ョンするの用いる。ウイルスを形成するのに必要なＤＮ
Ａが一部失われているので、複製ウイルスを生ずるため
にはその欠損機能を十分コードするヘルパーウイルスＤ
ＮＡの助けをかりてトランスフェクションを行わなけれ
ばならない。
ウイルス株をつくるために宿主細胞をトランスフェクシ
ョンするの用いる。ウイルスを形成するのに必要なＤＮ
Ａが一部失われているので、複製ウイルスを生ずるため
にはその欠損機能を十分コードするヘルパーウイルスＤ
ＮＡの助けをかりてトランスフェクションを行わなけれ
ばならない。
【００６５】トランスフェクトされた宿主細胞はそれが
複製ウイルスによって溶解されるまで増殖を続け、イン
キュベートされる。得られた複製ウイルス株（ヘルパー
ウイルスを含み）は次にヘテロポリマータンパク質生産
用の宿主細胞を感染させるのに使用する。一般に、感染
したタンパク質生産用宿主細胞は最後にはウイルスによ
って溶解されるので、宿主細胞の新しいバッチ分を感染
させるためにウイルスを再び利用する必要があり、それ
故にこのウイルス株は保持される。
複製ウイルスによって溶解されるまで増殖を続け、イン
キュベートされる。得られた複製ウイルス株（ヘルパー
ウイルスを含み）は次にヘテロポリマータンパク質生産
用の宿主細胞を感染させるのに使用する。一般に、感染
したタンパク質生産用宿主細胞は最後にはウイルスによ
って溶解されるので、宿主細胞の新しいバッチ分を感染
させるためにウイルスを再び利用する必要があり、それ
故にこのウイルス株は保持される。
【００６６】先に述べた特定の組換えＤＮＡ配列は次の
ようにして宿主細胞をトランスフェクトし、その後感染
させるのに使用される。
ようにして宿主細胞をトランスフェクトし、その後感染
させるのに使用される。
【００６７】上記のＳＶ４０含有プラスミドからｐＢＲ
３２２配列を除いてトランスフェクション用ウイルスＤ
ＮＡをつくる。ｐαＳＶＨＶＰ１およびｐαβＳＶＶＰ
１の場合に、これはＢａｍＨＩで消化後断片の環化を助
ける条件下で結合させてαＳＶＨＶＰ１およびαβＳＶ
ＶＰ１を（他の生産物の中から）得ることにより達成さ
れる。ｐβＳＶＶＰ１の場合には、ＥｃｏＲＩでの消化
およびその後の再結合により、ｐＢＲ３２２配列が除か
れβＳＶＶＰ１が形成されるのと同時にＳＶ４０後期プ
ロモーターおよびＶＰ１スプライス領域がβｈｃＧ ｃ
ＤＮＡ挿入物と並置される。同時に、ｐｔｓＡ５８Ｂａ
ｍ（ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位内でクローン化した
ｔｓＡ５８ＳＶ４０ウイルスＤＮＡ）はＢａｍＨＩで切
断し、結合させて自己結合環を得る。類似方法がＬＨベ
クターに対して用いられる。個々のウイルス株は下記の
ようにしてつくられる。
３２２配列を除いてトランスフェクション用ウイルスＤ
ＮＡをつくる。ｐαＳＶＨＶＰ１およびｐαβＳＶＶＰ
１の場合に、これはＢａｍＨＩで消化後断片の環化を助
ける条件下で結合させてαＳＶＨＶＰ１およびαβＳＶ
ＶＰ１を（他の生産物の中から）得ることにより達成さ
れる。ｐβＳＶＶＰ１の場合には、ＥｃｏＲＩでの消化
およびその後の再結合により、ｐＢＲ３２２配列が除か
れβＳＶＶＰ１が形成されるのと同時にＳＶ４０後期プ
ロモーターおよびＶＰ１スプライス領域がβｈｃＧ ｃ
ＤＮＡ挿入物と並置される。同時に、ｐｔｓＡ５８Ｂａ
ｍ（ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位内でクローン化した
ｔｓＡ５８ＳＶ４０ウイルスＤＮＡ）はＢａｍＨＩで切
断し、結合させて自己結合環を得る。類似方法がＬＨベ
クターに対して用いられる。個々のウイルス株は下記の
ようにしてつくられる。
【００６８】先に述べたようにして切断しかつ結合した
ＤＮＡをエタノール沈殿させ、滅菌水に溶解する。約１
μｇのｐｔｓＡ５８ＢａｍＤＮＡ（ヘルパーウイルス）
および１０μｇの組換えＤＮＡ（αおよび／またはβｈ
ＣＧ、もしくはＬＨをコードする）を無菌試験管内で合
わせ、２ｍｌのＴＢＳ緩衝液〔Ｇ．キムラ（Ｋｉｍｕｒ
ａ）およびＲ．ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のバイロ
ジー（Ｖｉｒｏｇｙ），４９，７９〜８１（１９７２）
を参照〕および１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキス
トラン溶液と混合し、そしてＴ−７５フラスコ内のＴＢ
Ｓ１０ｍｌで予め２回洗浄した全面サルＣＶ−１細胞の
単層へ加える。細胞は時々振とうしながら３７°Ｃに１
〜２時間保ち、ＴＢＳで２回洗い、５％胎児ウシ血清を
含むＤＭＥＭ１０ｍｌを供給し、そして４０°Ｃに１０
〜１５日間保持する。細胞が完全に溶解した後、培地を
試験管に移し、冷凍および解凍を５回繰り返し、そして
３０００ｒｍｐで５分間遠心する。得られた上清は新し
いＣＶ−１細胞の感染用ウイルス株として役立つ。
ＤＮＡをエタノール沈殿させ、滅菌水に溶解する。約１
μｇのｐｔｓＡ５８ＢａｍＤＮＡ（ヘルパーウイルス）
および１０μｇの組換えＤＮＡ（αおよび／またはβｈ
ＣＧ、もしくはＬＨをコードする）を無菌試験管内で合
わせ、２ｍｌのＴＢＳ緩衝液〔Ｇ．キムラ（Ｋｉｍｕｒ
ａ）およびＲ．ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のバイロ
ジー（Ｖｉｒｏｇｙ），４９，７９〜８１（１９７２）
を参照〕および１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキス
トラン溶液と混合し、そしてＴ−７５フラスコ内のＴＢ
Ｓ１０ｍｌで予め２回洗浄した全面サルＣＶ−１細胞の
単層へ加える。細胞は時々振とうしながら３７°Ｃに１
〜２時間保ち、ＴＢＳで２回洗い、５％胎児ウシ血清を
含むＤＭＥＭ１０ｍｌを供給し、そして４０°Ｃに１０
〜１５日間保持する。細胞が完全に溶解した後、培地を
試験管に移し、冷凍および解凍を５回繰り返し、そして
３０００ｒｍｐで５分間遠心する。得られた上清は新し
いＣＶ−１細胞の感染用ウイルス株として役立つ。
【００６９】ウイルスを感染させるために、Ｔ−１５０
フラスコ内でＣＶ−１細胞を全面増殖させる。このフラ
スコにウイルス株の１種（上記のようにして作ったも
の）１ｍｌを加え、細胞を４０°Ｃで５日間インキュベ
ートする。
フラスコ内でＣＶ−１細胞を全面増殖させる。このフラ
スコにウイルス株の１種（上記のようにして作ったも
の）１ｍｌを加え、細胞を４０°Ｃで５日間インキュベ
ートする。
【００７０】混合感染のために、ＣＶ−１細胞をＴ−１
５０フラスコ内で全面増殖させる。αＳＶＨＶＰ１ウイ
ルスおよびβＳＶＶＰ１ウイルスを１：１の比で混合
し、この混合ウイルス１ｍｌを使って４０°ＣでＣＶ−
１細胞を感染させる。
５０フラスコ内で全面増殖させる。αＳＶＨＶＰ１ウイ
ルスおよびβＳＶＶＰ１ウイルスを１：１の比で混合
し、この混合ウイルス１ｍｌを使って４０°ＣでＣＶ−
１細胞を感染させる。
【００７１】マウス細胞のトランスフェクション 混合トラスンフエクションによってヘテロダイマーｈＣ
Ｇを生産するために、ｐＲＦ３７５（αｈＣＧ）および
ｐＲＦ３９８（βｈＣＧ）のＢＰＶプラスミド各々５μ
ｇを混合し、担体としてサケ精子ＤＮＡ１０μｇを含む
２５０ｍＭＣａＣｌ2 溶液０．５ｍｌに加える。この混
合物は２８０ｍＭＮａＣｌ０．５ｍｌ、５０ｍＭＨＥＰ
ＥＳおよび１．５ｍＭ燐酸ナトリウム中で通気する。室
温で３０〜４０分間燐酸カルシウム沈殿物を形成させ
る。
Ｇを生産するために、ｐＲＦ３７５（αｈＣＧ）および
ｐＲＦ３９８（βｈＣＧ）のＢＰＶプラスミド各々５μ
ｇを混合し、担体としてサケ精子ＤＮＡ１０μｇを含む
２５０ｍＭＣａＣｌ2 溶液０．５ｍｌに加える。この混
合物は２８０ｍＭＮａＣｌ０．５ｍｌ、５０ｍＭＨＥＰ
ＥＳおよび１．５ｍＭ燐酸ナトリウム中で通気する。室
温で３０〜４０分間燐酸カルシウム沈殿物を形成させ
る。
【００７２】トランスフェクションの２４時間前に、５
×１０5 個のマウスＣ１２７細胞〔メリーランド州ベテ
スダ、ＮＩＨ、国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のディーン・ハマー
（Ｄｅａｎ Ｈａｍｅｒ）博士から入手できる〕を１０
０ｍｍペトリ皿またはＴ−７５フラスコに入れる。外来
性ＤＮＡを加える直前に新しい培地（ダルベッコ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ）の修飾培地、１０％胎児ウシ血清）を細
胞に供給する。それぞれの皿（１０ｍｌ）に燐酸カルシ
ウム沈殿物１ｍｌを加え、３７°Ｃで６〜８時間細胞を
インキュベートする。
×１０5 個のマウスＣ１２７細胞〔メリーランド州ベテ
スダ、ＮＩＨ、国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のディーン・ハマー
（Ｄｅａｎ Ｈａｍｅｒ）博士から入手できる〕を１０
０ｍｍペトリ皿またはＴ−７５フラスコに入れる。外来
性ＤＮＡを加える直前に新しい培地（ダルベッコ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ）の修飾培地、１０％胎児ウシ血清）を細
胞に供給する。それぞれの皿（１０ｍｌ）に燐酸カルシ
ウム沈殿物１ｍｌを加え、３７°Ｃで６〜８時間細胞を
インキュベートする。
【００７３】培地を吸引し、室温で２分間燐酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中の２０％グリセロール５ｍｌ
と置き換える。この細胞をＰＢＳで洗い、培地１０ｍｌ
を供給して３７°Ｃでインキュベートする。２０〜２４
時間後培地を変え、その後の細胞の再供給を３〜４日ご
とに行う。個々のクローンはＴ−２５ｃｍフラスコ内で
増殖させる。７〜２１日後に細胞クローンは分析のため
にさらに大きなフラスコに移すことができる。
水（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中の２０％グリセロール５ｍｌ
と置き換える。この細胞をＰＢＳで洗い、培地１０ｍｌ
を供給して３７°Ｃでインキュベートする。２０〜２４
時間後培地を変え、その後の細胞の再供給を３〜４日ご
とに行う。個々のクローンはＴ−２５ｃｍフラスコ内で
増殖させる。７〜２１日後に細胞クローンは分析のため
にさらに大きなフラスコに移すことができる。
【００７４】単一トランスフェクションによりヘテロダ
イマーｈＣＧを生産するために、プラスミドＲＦ３９８
αｔ2 が混合トランスフェクションで使用した上記の２
つのプラスミドの場合と同じ方法で使用される。
イマーｈＣＧを生産するために、プラスミドＲＦ３９８
αｔ2 が混合トランスフェクションで使用した上記の２
つのプラスミドの場合と同じ方法で使用される。
【００７５】ヘテロダイマーＬＨを作るためには、ｈＣ
Ｇの場合に述べたようにして、プラスミドｐＲＦ３７５
およびｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶを混合する。
Ｇの場合に述べたようにして、プラスミドｐＲＦ３７５
およびｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶを混合する。
【００７６】興味あることには、βｈＣＧまたはβＬＨ
をコードするベクターのみを含む培養細胞は、αサブユ
ニットをコードする細胞が存在しないと実際にβサブユ
ニットを全く生産しないが、αおよびβサブユニットを
コードする塩基配列を含む細胞は、ヘテロダイマーを生
産するばかりでなく遊離のβサブユニットも生産すると
いうことが観察された。このことは、いかなる理由によ
るのか不明であるがαサブユニットの存在がβサブユニ
ットを安定化させるという別の利点を単一細胞培養での
両サブユニットの生産が有するとの概念を支持するもの
である。
をコードするベクターのみを含む培養細胞は、αサブユ
ニットをコードする細胞が存在しないと実際にβサブユ
ニットを全く生産しないが、αおよびβサブユニットを
コードする塩基配列を含む細胞は、ヘテロダイマーを生
産するばかりでなく遊離のβサブユニットも生産すると
いうことが観察された。このことは、いかなる理由によ
るのか不明であるがαサブユニットの存在がβサブユニ
ットを安定化させるという別の利点を単一細胞培養での
両サブユニットの生産が有するとの概念を支持するもの
である。
【００７７】寄 託 次に述べるものはメリーランド州ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）に寄託された。
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ）に寄託された。
【００７８】αβＳＶＶＰ１，ＡＴＣＣ ＶＲ２０７
７；αＳＶＨＶＰ１，ＡＴＣＣ ＶＲ２０７５；βＳＶ
ＶＰ１ ，ＡＴＣＣ ＶＲ２０７５；Ｃ１２７細胞内の
ｐＲＦ３７５，ＡＴＣＣ ＣＲＬ８４０１；Ｃ１２７細
胞内のｐＲＦ３９８，ＡＴＣＣ ＣＲＬ８４０１；ｐＣ
Ｌ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ大腸菌，ＡＴＣＣ ３９４７
５；Ｃ１２７細胞内のｐＲＦ３９８αｔ2 。
７；αＳＶＨＶＰ１，ＡＴＣＣ ＶＲ２０７５；βＳＶ
ＶＰ１ ，ＡＴＣＣ ＶＲ２０７５；Ｃ１２７細胞内の
ｐＲＦ３７５，ＡＴＣＣ ＣＲＬ８４０１；Ｃ１２７細
胞内のｐＲＦ３９８，ＡＴＣＣ ＣＲＬ８４０１；ｐＣ
Ｌ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ大腸菌，ＡＴＣＣ ３９４７
５；Ｃ１２７細胞内のｐＲＦ３９８αｔ2 。
【００７９】用 途 本発明の形質転換細胞系列は生物学的に活性なヘテロポ
リマータンパク質を生産するために使用される。本発明
によって作られるｈＣＧは、例えばヒトの生殖に関係す
る多数のよく知られた医療用途を有している。
リマータンパク質を生産するために使用される。本発明
によって作られるｈＣＧは、例えばヒトの生殖に関係す
る多数のよく知られた医療用途を有している。
【００８０】本発明の他の実施態様として例えば、他の
ヘテロポリマータンパク質（例えば、卵胞刺激ホルモン
または甲状腺刺激ホルモン）を生産することができ、同
様にヒトまたは動物の免疫グロブリンもしくは免疫応答
抗原も生産することができる。
ヘテロポリマータンパク質（例えば、卵胞刺激ホルモン
または甲状腺刺激ホルモン）を生産することができ、同
様にヒトまたは動物の免疫グロブリンもしくは免疫応答
抗原も生産することができる。
【００８１】ヘテロポリマータンパク質は１種の細胞に
よって、または単一培養において生産される必要がない
かも知れない。１つの別法は２種の細胞（このうちの一
方が一方のサブユニットを生産し、他方が他方のサブユ
ニットを生産する）を同時培養することであり、分泌さ
れたサブユニットをその後培地中で会合させてヘテロダ
イマーを形成することができる。もう１つの別法は別個
の培養を使用することであり、それぞれの培養が異なる
サブユニットを生産し、その後各培養からの培地を合わ
せてヘテロポリマーへと会合させる。
よって、または単一培養において生産される必要がない
かも知れない。１つの別法は２種の細胞（このうちの一
方が一方のサブユニットを生産し、他方が他方のサブユ
ニットを生産する）を同時培養することであり、分泌さ
れたサブユニットをその後培地中で会合させてヘテロダ
イマーを形成することができる。もう１つの別法は別個
の培養を使用することであり、それぞれの培養が異なる
サブユニットを生産し、その後各培養からの培地を合わ
せてヘテロポリマーへと会合させる。
【００８２】その他の宿主細胞、ベクター、プロモータ
ー、形質転換用塩基配列、およびウイルスも使用でき
る。一般に、使用する宿主細胞は使用するベクターによ
って定まる。例えば、ベクターが複製ウイルスＤＮＡま
たは非複製ウイルスＤＮＡである場合、宿主細胞はこれ
らのベクターによって感染またはトランスフェクション
され得る細胞であり、例えばＳＶ４０含有ベクターはサ
ル宿主細胞、好ましくはＣＶ−１細胞を必要とする。ク
ローニングベクターが原核生物の調節配列を有するプラ
スミドである場合には、原核生物の宿主細胞（例えば大
腸菌）を使用する。
ー、形質転換用塩基配列、およびウイルスも使用でき
る。一般に、使用する宿主細胞は使用するベクターによ
って定まる。例えば、ベクターが複製ウイルスＤＮＡま
たは非複製ウイルスＤＮＡである場合、宿主細胞はこれ
らのベクターによって感染またはトランスフェクション
され得る細胞であり、例えばＳＶ４０含有ベクターはサ
ル宿主細胞、好ましくはＣＶ−１細胞を必要とする。ク
ローニングベクターが原核生物の調節配列を有するプラ
スミドである場合には、原核生物の宿主細胞（例えば大
腸菌）を使用する。
【００８３】クローニングベクターが哺乳類生物の調節
配列を有するプラスミドである場合には、適当な哺乳類
生物の宿主細胞（例えばマウスＣ１２７細胞）を使用す
る。
配列を有するプラスミドである場合には、適当な哺乳類
生物の宿主細胞（例えばマウスＣ１２７細胞）を使用す
る。
【図１】第１図はαｈＣＧｃＤＮＡクローン、ＳＶ４０
ウイルスＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＲ３２２の
塩基配列を含むプラスミドｐαＳＶＨＶＰ１の作製を示
す図面である。
ウイルスＤＮＡの一部およびプラスミドｐＢＲ３２２の
塩基配列を含むプラスミドｐαＳＶＨＶＰ１の作製を示
す図面である。
【図２】第２図はβｈＣＧｃＤＮＡクローン、ＳＶ４０
ＤＮＡの領域およびｐＢＲ３２２の一部（宿主大腸菌に
対してアンピシリン耐性を付与する領域を含む）を組込
んだプラスミドｐβＳＶＶＰ１の作製を示す図面であ
る。
ＤＮＡの領域およびｐＢＲ３２２の一部（宿主大腸菌に
対してアンピシリン耐性を付与する領域を含む）を組込
んだプラスミドｐβＳＶＶＰ１の作製を示す図面であ
る。
【図３】第３図はＳＶ４０ＤＮＡにαおよびβｈＣＧｃ
ＤＮＡクローンを挿入したプラスミドｐαβＳＶＶＰ１
の作製を途中まで示す。
ＤＮＡクローンを挿入したプラスミドｐαβＳＶＶＰ１
の作製を途中まで示す。
【図４】図４は図３の続きであり、ｐαβＳＶＶＰ１の
作製を最後まで示す。
作製を最後まで示す。
【図５】第５図はプラスミドｐＲＦ３７５およびｐＲＦ
３９８の作製を示す。
３９８の作製を示す。
【図６】第６図はプラスミドＲＦ３９８αｔ2 の作製を
示す。
示す。
【図７】第７図はβｈＣＧｃＤＮＡクローン内の８８ｂ
ｐプローブの位置を示す。
ｐプローブの位置を示す。
【図８】第８図はβＬＨの制限酵素地図、および第９図
のプラスミドの作製において使用する断片を示す。
のプラスミドの作製において使用する断片を示す。
【図９】第９図は完全な成熟βＬＨｃＤＮＡクローンを
含むプラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂの作製を示す。
含むプラスミドＬＨ５２０Ｈ／Ｂの作製を示す。
【図１０】第１０図はウイルスベクターｐαＬＨＳＶＶ
Ｐ１の作製を示す。
Ｐ１の作製を示す。
【図１１】第１１図はＬＨのβサブユニットをコードす
るＢＰＶ含有プラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶの
作製を示す。
るＢＰＶ含有プラスミドｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶの
作製を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/74 Ｄ 7431−4Ｃ 38/22 ＡＥＥ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＥＥ (72)発明者 ヒュング，ナンシー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02181, ウェルズレィ，ワシントン・ストリート 590 ４エイ (72)発明者 ベック，アントン・カー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02167, チェスナット，ヒル，クロスビー・ロード 42 (72)発明者 バーンスティン，エドワード・ジョージ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ロングフェロー・プレイス ４，ナンバー 2005
Claims (16)
- 【請求項１】下記サブユニットの各々をコードする異種
ＤＮＡを含むベクターであって、複数のサブユニットか
らなる生物学的に活性な翻訳後修飾された蛋白質ホルモ
ンを生産することが可能な一もしくはそれ以上の発現ベ
クター、でトランスフェクトされた哺乳類細胞。 - 【請求項２】翻訳後修飾がグリコシル化である、請求項
１記載の細胞。 - 【請求項３】ホルモンがヘテロダイマー性であり、アル
ファおよびベータサブユニットからなる、請求項２記載
の細胞。 - 【請求項４】ホルモンが生殖ホルモン（ｆｅｒｔｉｌｉ
ｔｙ ｈｏｒｍｏｎｅ）である、請求項３記載の細胞。 - 【請求項５】各ベクターが少なくともサブユニットの一
つをコードする異種ＤＮＡを有する一種より多い発現ベ
クターでトランスフェクトされた、請求項１ないし４の
いずれか１項記載の細胞。 - 【請求項６】各サブユニットをコードする異種ＤＮＡを
有する一つの発現ベクターでトランスフェクトされた、
請求項１ないし４のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項７】各サブユニットをコードする異種ＤＮＡ
が、それぞれのプロモーターのコントロール下に存在す
る、請求項１ないし６のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項８】少なくとも一つのサブユニットをコードす
る異種ＤＮＡが、ＳＶ４０の初期プロモーター、ＳＶ４
０の後期プロモーター、マウスメタロチオネインプロモ
ーターまたはウシパピローマウイルスプロモーターのコ
ントロール下に存在する、請求項７記載の細胞。 - 【請求項９】一つのもしくは各々の発現ベクターが、プ
ラスミド由来のＤＮＡおよび／または複製ウイルス由来
のＤＮＡを含む、請求項１ないし８のいずれか１項記載
の細胞。 - 【請求項１０】一つのもしくは各々のベクターが、ウシ
パピローマウイルスゲノムの形質転換領域の少なくとも
６９％を含む、請求項９記載の細胞。 - 【請求項１１】哺乳類細胞である、請求項１ないし１０
のいずれか１項記載の細胞。 - 【請求項１２】複数のサブユニットを有し且つ生物学的
に活性な翻訳後修飾された蛋白質ホルモンをコードする
異種ＤＮＡと各サブユニットのプロモーターとを含んで
なる、哺乳類細胞をトランスフェクトする能力を有する
発現ベクター。 - 【請求項１３】各ベクターが哺乳類細胞をトランスフェ
クトする能力を有し、そして各ベクターが複数のサブユ
ニットを有する生物学的に活性な翻訳後修飾された蛋白
質ホルモンの各サブユニットをコードする異種ＤＮＡと
各サブユニットのプロモーターとを含む、複数の発現ベ
クターからなる請求項１２記載のベクター。 - 【請求項１４】プラスミド由来ＤＮＡおよび／または複
製ウイルス由来ＤＮＡを含む請求項１２または１３記載
の単数もしくは複数のベクター。 - 【請求項１５】ＳＶ４０の初期プロモーター、ＳＶ４０
の後期プロモーター、ウシパピローマウイルスプロモー
ターまたはマウスメタロチオネインプロモーターを含
む、請求項１４記載の単数もしくは複数のベクター。 - 【請求項１６】ウシパピローマウイルスゲノムの形質転
換領域の少なくとも６９％を含む、請求項１５記載の記
載の単数もしくは複数のベクター。
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