JPH06503949A - 新規インシュリン様成長因子結合タンパク質ｉｇｆｂｐ―５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規イン／ニリン様成　因　結合タンパクＪ　ＩＧＦＢＰ−５本願は、１９９０ 年８月２８日に出願された米国特許第０７７５７４．６１３号（代理人参照番号 ：　ＣＨＩＲ−００７１００ＵＳ）の分割出願である。

遣■ １豆ユ立里 本発明は、精製された天然のタンパク質および組換え遺伝子手法によって製造さ れる対応するタンパク質に関し、特に、イン／ニリン様成長因子結合タンパク質 から誘導されるこのようなタンパク質および遺伝エレメント、ならびに上記タン パク質および遺伝エレメントを用いる方法および組成物に関する。

イン／ニリン様成長因子（ＩＧＦｓ）は、プロインンユｌＪ７と構造か相同の低 分子量のポリペプチドホルモンである。２種類の異なるＩＧＦｓ、すなわちＩＧ Ｆ−１とＩＧＦ−ＩＩが知られており、組織培養中の広範囲の細胞に対して、イ ンビトロで細胞分裂促進作用を有する。どちらのＩＧＦｓも、インビトロで種々 の組織の成長を刺激し、特に、これらはフラーケンの合成を誘導する。ＩＧＦ− Ｉは、軟骨形成時および骨形成時に成長ホルモンの成長促進作用を媒介するので 個体の正常な成長に必須のものである。ピグミーおよびトイブードル犬にはＩＧ Ｆ−１が不足しているか、成長ホルモンの血清中ａ度は正常であることから、上 記のことが実証されている。ＩＧＦ−ＩＩは、胎児の発育と神経の成長に重要な 役割を演じていると考えられている。

これらの因子は、骨格組織に対する主な作用に加えて、他の組織に対しての成長 刺激機能ら示す。創傷の繊維芽細胞は、創傷の治癒に通常必要な構造タンパク質 であるフラーケンを増殖および合成するために、繊維芽細胞を刺激するのに有効 なＩＧＦｓを産生ずることが知られている。創傷組織の血管新生も誘発される。

ざらに［ＧＦｓは、造血を誘発する、エリトロポイエチン様活性を有しているこ とも見比されている。

また最近の研究は、ある種の癌細胞、例えば乳癌および腎臓癌の細胞が産生ずる ＩＧＦｓは、癌細胞の増殖、および癌組織の増殖を維持するのに必要な血管組織 と繊維組織の増殖を自己刺激することを実証している。

これに加えて、両ＩＧＦｓは、特に、グル；−スの輸送と代謝を刺激する、イン ／ニリンと類似の代謝活性スペクトルを示す。ＩＧＦｓトイン／ニリンの生物学 的作用は、これらが特定のレセプターに結合することによって媒介される。特に 、両ＩＧＦｓは、イン／ニリンより約１００倍低い親和性でイン／ニリンのレセ プターと結合する性能をもっている。

両ＩＧＦｓは血中ａ度かイン／ニリンより約１ｏｏ倍高い。低血糖症は、血液中 に存在してＩＧＦｓと複合体を形成し得る輸送タンパク質を含む調節機構で防止 される。このようにしてＩＧＦｓは、イ／ン、　ＩＪノン様性を有しない複合体 の形態で血液中を循環する。ＩＧＦと輸送タンパク質（以降ＩＧＦ結合タンパク 質またはＩＧＦＢＰｓと呼ぶ）の結合によって、ＩＧＦｓが細胞表面のレセプタ ーに結合することが阻害される。ＩＧＦ結合タンパク質の他の機能として、ＩＧ Ｆｓの短い半減期を延ばすことも実証されている。

ＩＧＦｓは遊離の形態で血液中に存在していると迅速にタンパク分解されるから である。

上記のことから、ＩＧＦｓは、インビトロで、ａ）成長ホルモン不足の動物とヒ トの成長、ｂ）赤血球生成および軟骨形成のような組織の再生、Ｃ）創傷の治癒 、およびｄ）肝臓もしくは腎臓のような各種の器官の機能を、刺激するのに有用 であり得る。

その軟骨形成刺激活性のために、ＩＧＦｓは、例えば骨粗しよう症の治療の際、 骨を形成させるため使用するのに特に適している。上記の治療に用いるＩＧＦｓ は、少なくとも１つのＩＧＦ結合タンパク質とともに患者に投与するのか有利で ある。ＩＧＦ単独の投与よりも、上記の組合せの投与の方が、低血糖症および注 射部位に起こり得る細胞分裂促進作用の防止、ならひにＩＧＦの半減期の延長を 含む有益な作用を有する。さらに、結合タンパク質はＩＧＦ−１のエリトロボイ エチン様作用を高めるのにも有用であることが見出された。またその結合タンパ ク質は、ＩＧＦｓに特定の組織を標的つけるのにも有用てあり得る。

また結合タンパク質は、それだけを、すなわちＩＧＦなしで投与すると、ある種 の癌細胞、例えば、乳癌もしくは腎臓癌の細胞のようなホルモン産生癌細胞か遊 離ＩＧＦｓを分泌する場合のように、ＩＧＦｓが過剰に産生される場合に起こる ような、ＩＧＦｓの副作用を阻害するのに治療上有用であり得る。ＩＧＦ結合結 合タンパ色質る治療によって、糖尿病性の増殖性網膜症の二次作用としての失明 も防止することかできる。実際に、ＩＧＦｓ力収糖尿病性網膜症において、内皮 および繊維芽細胞の増殖を刺激する因子の１っであることか見出されている。

ＩＧＦＢＰｓの他の治療用途は、ＩＧＦ結合結合タンパ色質足している患者の過 剰の成長の制御である。なぜなら、高レベルのＩＧＦが異常に低いレベルの結合 タンパク質と組み合わされると、過剰成長の原因となるよってあるからである。

近年、大きさおよび他の特性が異なる、ＩＣＦ結合タンパク質の３つの主な種が 、げっ歯動物およびヒトの血清中に検出された。

最初に発見された結合タンパク質は、現在ＩＧＦＢＰ−３と呼ばれているが、い くつかのサブユニットで構成された、約１５０Ｋｄの糖タノバク質である。その 生成は、２番目に発見された比較的小さなＩＧＦ結合結合タンパ色質なり、成長 ホルモン依存性である。

二番目に発見された結合タンパク質は、現在ＩＧＦＢ−１と呼ばれているが、ヒ トとう、ト中に存在し、分子量か約３０〜４０Ｋｄである。ヒ）　ＩＧＦＢＰ− １は、次のような各種の起源からすてに精製されている。すなわちその起源には 、羊水（Ｐｏｖｏａ、Ｇら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４４巻、１９ ９頁、１９８４年：したかって羊水結合タンパク質とも呼ばれる）、胎盤（Ｋｏ ｉｓｔｅｎｅｎ、　Ｒ，ら、Ｅｎｄ。

ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１８巻、１３７５頁、１９８６年）、および肝癌Ｇ２ 細胞の馴化培地（Ｐｏｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｒ，ら、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ 、　、　４２０巻、１６３頁、１９８７年）が含まれる。はじめの２つの結合タ ンパク質は、ソノアミノ酸の組成とＮ末端アミノ酸の配列が決定され、同等であ るかまたは少な（とも非常に似ていることが分かっている。肝癌Ｇ２細胞から単 離されたＩＧＦ結合結合タンパ色質ｅｅ、Ｙ、Ｌ、ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌ、　、　２（５）＠、４０４頁、１９８８年）と、胎盤ｃＤＮＡライブ ラリーからクローン化された＋ＧＦ結合タンパク質（Ｂｒｉｎｋｍａｎ、　Ａ、 ら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、７（８）巻、２４１７頁、１９８８年） とを比較すると９９％の相同性を示している。さらに、これらの２つのアミノ酸 配列は、ｃＤＮＡライブラリーがコードするＩＧＦ結合結合タンパ色質４％の相 同性を示している（Ｂｒｅｗｅｒ、　Ｍ、Ｔ、ら、ＢｉｏｃｈＢｉｏｐｈｙｓ、 　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗ、　、　１５２（３）巻、１２８９頁、１９８８年）。

ウェスタンプロット法及び［１１２５１−ＩＧＦによる親和性襟識によって、血 清中に存在する２つの主なＩＧＦ結合結合タンパ色質態に加えて、いくつかの他 のＩＧＦ結合結合タンパ色質異なるヒト組織抽出物と細胞培養培地中で同定され ている。これらのタンパク質の分子量は、１５〜１５０Ｋｄの範囲にあり、これ らのタンパク質のいくつかは、より大きなＩＧＦ結合結合タンパ色質ンパク質分 解反応によって生成するようである。特にヒト血清から精製された５３ＫｄのＩ ＧＦ結合結合タンパ色質１５０−ＫｄのＩＧＦＢＰ−１のサブユニ、トとして表 される（　Ｂａｘｔｅｒ、　Ｒ，Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍ、　、　１３９　（３）巻、１２５６頁、１９６６年）。

また池の、ＩＧＦ結合タンパク質の形態かうｙ　ｈ　ＢＲＬ−３Ａ細胞の馴化培 地にも見出されたが、その分子量は約３３〜３６Ｋｄである。

ラットＢＲＬ−３Ａ結合タンパク質のアミノ末端タンノ＜り質配列の一部が決定 されている（Ｍｏｔｔｏｌｌａ、　Ｃら、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２８１ 巻、１１１８０頁、１９８６年；　Ｌｙｏｎｓ、　Ｒ，Ｍ、　、Ｓｍ１ｔｈ　Ｇ 、　Ｌ、　、　Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４５巻、２ ６３頁、１９８６年）。ラットとヒトの末端配列が示す３３％の相同度は、それ ぞれの結合タン／　ＸＴり質を同等物とみなすことができるはと充分に高くない 。

加えて、現在ＩＧＦＢＰ−２と呼ばれ、ＢＲＬ−３Ａ結合タン／　ｓｊり質に関 連しているＩＧＦＢＰも見出されており、そのアミノ酸配列は充分に確認、され ている。ＩＧＦＢＰ−２のアミノ酸配列は、その前に知られれている結合タンパ ク質のアミノ酸配列とは、はっきりと具なっている。

いくつかの異なるＩＧＦ結合結合タンク質か存在しているということは、これら のタンパク質か異なる機能を持っていることを示している。現在知られている結 合タン／ぐり質を用いて、疾売の状懸を診断し、ＩＧＦｓの生物学的活性を種々 の異なる方法で変えることができるので、異なる生物学的特性を宵する別のＩＧ Ｆ結合結合タンパ色質見することには重大な興味がもたれている。

（以下余白） 間」シ【肱 工、Ｄａｕｇｈａｄａｙ、　Ｗ、Ｍ、　、　ｈ−ｉＶゝＦｔｏｃｗｅＬｎ、　Ｐ 、　（１９８９）　ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ　１０，６８−９１゜ ２、　Ｎ１５ｓｌｅｙ、　Ｓ、Ｐ、／　ｈ−＃Ｖ″Ｒｅｅｈｌｅｒ、　Ｍ、Ｍ、 （１９８４］。

３、　Ｃｏｈａｎ、Ｋ、Ｌ、、４．ｐｖ’Ｎ１５ｓｌｅｙ、Ｓ、Ｐ、（１９７６ ）　入ｃｚａ　Ｅｎｄｏｃ＝。

（社り、）８３，２４３−２５８゜ Ｈａｓｌｅ＝、　１ｉ、、　Ｂｉｎｚ、　ｘ、、　Ｇｕｌｃ＝ｒ、　Ｈ−Ｐ、、 Ｓｃｈｍｌ、　Ｃ−、Ｈ１ｐｖ’Ｆｒｏｅｓｃｈ、Ｅ、Ｒ，（１９８９）Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳλ８６．３８１３−３８）７゜ ８、　Ｓｃｈｍｉｄ、　Ｃｈ、　Ｅｒｎ５＝：、　Ｋ、、　Ｚａｐｆ、　Ｊ、、 　Ｎ零ゝｒｒｏｓｓｃｈ、　Ｅ、Ｒ。

１０４゜ Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、σＳ入　８６．　６８９８−６９０２゜１７、Ｚａｐｆ、　 Ｊ、、　Ｓｃｈｍｉｄ、　Ｃｈ、、　Ｇｕｌｅｒ、　Ｈ，Ｐ、、　Ｗａ工ｄｖｏ ｇｅｌ、　Ｋ−ｒＨａｕｒｉ、　Ｃｈ、、　Ｆｕｔ＋ｏ、　Ｅ、、　Ｈｏ５ｓａ ｎｌｏｐｐ、　ｐ、、　Ｂ！＋ｎｏｕｘ、　１４．。

ａｎｄ　Ｆｒｏｅｓｃｈ、　Ｅ、Ｒ，’１９９０）　Ｊ、　Ｃ工ｉｎ、工ｎｖａ ｓｚ、　ＨｑｋＳ丁１８．１４ａｒｔｊ−ｎ、Ｊ、Ｌ、、ｈＪｖ”Ｂａｘｔｅｒ 、Ｒ，Ｃ，（１９８６）：、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈａｒｎ、２６１．　８７５４−８７６０゜１９、ｚａｐｆ、　Ｊ、、　Ｂｏ ｒｎ、　ｗ、、　Ｃｈａｎｇ、　Ｊ、−Ｙ、、　Ｊ＆ｍ＠Ｓ　Ｐ、。

Ｆｒｏｅｓｃｈ、　！：、Ｒ−ｔ　％ｐＶ”ｆ；Ｊ−５Ｃｈ＠ｒｒ　Ｊ、λ、　 ［１９８Ｂ］　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１５６．１１１１１７−１１９４゜２ ０、　Ｎｉ１ｓｏｎ、Ｂ、Ｌ、、　ｉＦ１／’ＢｒｏＷｎ、Ｌ、Ｒ−（１９８４ ）　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、１４１，３１１−３１５゜２１、）Ｉｏｇｓａｎｌｏｐｐ、Ｐ 、、５ｅｕｒｉｎ、Ｄ、、Ｓｅｇｏｖｉａ−Ｑｕｉｎｓｏｎ、Ｂ、。

Ｈａｊ−ｄＯｕｉｎ、Ｓ−ｔ　Ｊ’＋’！ＶＢｉｎＯｕＸ、Ｍ−（１９８６１Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ。

１５４．１３ｆｌ−１４３゜ ２２、Ｚａｐｆ、　Ｊ、ｔ　ｗａｘｚｅ＝ｌ　Ｈｌｒ　ｈ４ｙ’　Ｆｒｏｅｓｃ ｈ、　Ｅ、Ｒ，（１９８１１Ｊ。

Ｃ１ｊ−ｎ、工ｎｖ＊ｓｚ、６８／　１３２１−１３３０゜２３、ｍｚｓｕａａ ＝ａ、ｐ、（１９８７）Ｊ、！１ｉｏ１．Ｃｈｓｗ、２６２，１００３５−１０ ０３８＋ ２４、Ｙｕｅｎ、　Ｓ、Ｗ、、　Ｃｈｕｉ、λ、Ｈ，，Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｋ、Ｊ 、、朴１ｙ’Ｙｕａｎ。

Ｐ、Ｍ、（１９８８）　λｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｚｅｍｊｚ　Ｕｓｅｒ　 Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ。

３６、　ニー１７゜ ２５、Ｈｕｎｋａｐｈｌｌａｒ、　ｘ、ｗ、、　Ｈｅ！ＷＬＣｋ、　１．Ｍ−、 Ｄｒｓｙａｒ、　Ｗ、Ｊ−ｔ　ＨＰ’Ｈｏｏｄ、Ｌ−Ｅ、（１９８３）Ｍａｅｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　９１，３９９−４１３゜ ２ｇ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ、　Ｍ−、シ１１工ｔ　Ｌ”、ｔ　ｈｉｐ　Ｃｈ”１３ −ｎｓｒ　Ｊ−Ｆ−（１９１３０１Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、２４５，３８６８ −３８７１゜２７、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、、Ｐｒ＝ｂｙＬａ、λ、Ｅ−， ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、。

ＷＪ１７’ＲｕｔＥｅｒ、　Ｗ、Ｊ、（１９７９）　Ｂｉｏｃｈａｍλ５ｔｒｙ 　１８．５２９４−５２９９゜ ２つ、入ｖｉｖ、Ｈ，、ｈ−＋ｖ＜’Ｌａｄｅｒ、Ｐ、（１９７２）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９，１４０１１−１４１２゜３０、絢ｍ１ａｔｉｓ、　Ｔ− 、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ＥＪ、、　ｈ−Ｆｌｒ：’５ａｘｂｘｏｏｋ、　Ｊ。

（１９８２１Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　Ｌａｂｏｒａｚｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

３１、ｎ１ｎｋｅｒｔ、　ｃ、、　Ｌａｎｄ通ｈｒ、　ｌｊ＋ｙ　ｋ５Ａｑ１　 Ｊ−Ｌ、、　Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ。

Ｊ、、　うよびＨａｉｎｒｉｃｈ　Ｇ、（ｌり日９）　Ｅ）１ＢＯＪｏｕｒｎａ ｌ　Ｂ、２４９７−２５０２゜ ３２、ルぼｇｏｔ、Ｊ、Ｂ−ｔ　ＢｉｎＪｃｅｒｔ／　Ｃ，ｌ　ルｕ了ｊ　Ｊ、 −Ｌ、、Ｌａｎｄｗｅｈｒ。

Ｊ−、Ｈｅ１ｎｒｉｃｈ、　Ｇ、、　ｈ（Ｌ’Ｓｃｈｗａｎｄｅｔ、　Ｊ、（１ ９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　３，１０５３−４ ０６０゜３３、Ｏｋａｙａｍ＆、　Ｈ，、ｈｌ／”Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８ ３）　ＭＱｌ、　ｔｈｄ　Ｃｅ４１゜Ｂｉｏｌ−３，２８０−２８９゜ ３４、Ａ−ｚｆｆｏ、λ−ｔｈＦＶゝ５ｅｅｄ、　Ｂ、［１９８７）　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ−Ｓｃ上、ＵＳＡ　８４，８５７３−８５７７゜３５ 、Ｐｆｅｉｆｆｅ＝、　Ｂ−Ｈ，、δ′ｔｔ／′２ｉｍｍｅｒｍａｎ、　Ｓ、Ｂ 、　（１９８３）　Ｎｕｃ工、λＣ１ｄｓ　Ｒａｇ、１１．　７８５３−７８７ １゜３６、　Ｂａｎｚｏｎ、Ｗ、Ｄ、、　ｈ−＃ｔ；’Ｄａｖｉｓ、Ｒ１，ｗ、 　（１９７−、）　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６゜１９Ｑ−７７７ ３１、Ｙａｎ：Ｌｓｅｎ−Ｐｅｒ＝ｏｎ、Ｃ−、ＶＬｅＬＪ：＆、：、ｔ　５Ｆ ７’ａａｇｓｉｎｇ、；。

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（１９８Ｂ）　Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ５−　Ｃｏｍｍｕｎ、１ ５２．　１２８９−１２９７゜ ５６、Ｂｒｉｎ）ｃｍａｎ、λ、、　Ｇｒｏｆｆａｈ、　Ｃ，、Ｋｏｒｔｌｇｖ ｅ、　Ｄ、Ｊ、、　ＶａｎＫｅｇｓａｌ　、人、Ｇ、、　ｈ−）Ｖ’Ｄｒｏｐ、 　Ｓ、Ｌ、Ｓ、　（１９８Ｂ）　ＥＩＣＢＯＪｏｕｒｎａｌ７．２４１７−２４ ２３゜ ５７、　Ｊｕｌｌｃｕｎｅｎ、Ｋ、、Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ、Ｒ，、λａｌｚｏ− ５ｅｔａ工ａ、Ｍ、。

Ｊａｎｎｅ、　Ｏ，λ、、　ｉ７．＃ｔＫｏｎｚｕｌａ、　Ｘ、　（１９８８） 　ＦＥＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２３６．２９５−３０１ ５８、Ｌｕｔ、ｈｍａｎ、　Ｈ，、Ｓｏｄａｒｌｉｎｇ−Ｂａｒｒｏｓ、　Ｊ、 、　Ｐｅｒｓｓｏｎ、　Ｂ、。

Ｅ＊ｇｂａｒｇ、　Ｃ，、５ｕｅｒｒｘ、工、、　Ｌａｋｅ、　Ｍ、、　Ｆｒａ ｎｚｅｎ、　Ｓ、−入、。

工ｓ＝ａｅ１ｇｓｏｎ、Ｍ、、Ｒａｄａｎ、Ｂ、、Ｌｊ−ｎｄｇｒａｎ、Ｂ’、 。

Ｈｊｅｌｍｑｖｉｓｚ、Ｌ−、Ｉ！ｎａｒｂａｃに、Ｓ、、Ｃａｒｌｓｓｏｎ、 Ｐ、。

Ｂｊｕｒｓｅエエ、Ｇ、、ＰＯＶＯＪＬ、Ｇ、、Ｈａよｌ、Ｋ、、５Ｑｐ”　Ｊ 　；ｎｖａｌ工。

ＢａｙＬｉｎｋ、ｏ、Ｓ、＋　（１９１１１９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ工、Ａｃａｄ −Ｓｃｉ、ＴＪＳ入８６．８３３８−１３３４２゜ ６０、Ｓｚ社ｘ＋、　Ｌ、、　Ｍｏｕｚｅｒｓｈｅａｄ、　Ｄ、Ｇ、、　Ｂａ工 １ａｒｄ、　Ｆ、Ｊ、、＞−ｒ：、ｖ”−ａ工１ａｃｅ、Ｊ、Ｃ，（１，９８８ ）Ｂλｏｃｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

１５１、　２０７−２１４゜ （以下余白） 旦ｍ立 従って、本発明の目的は、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ− ３とは異なる生物学的特性を有するＩＧＦ結合結合タンパク−供することである 。

本発明の他の目的は、新規なＩＧＦ結合結合タンパク一層容易に入手できるよう に、そのＩＧＦ結合結合タンパク−現することができる組換えＤＮＡ分子を用い て、該結合タンパク質を提供することである。

本発明の上記の目的と他の目的は、図１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％ 相同のアミノ酸配列を有するインシニリン様成長因子結合タンパク質、および該 アミノ酸配列の少なくとも１０の連続アミノ酸からなるそのフラグメントからな る群から選択される精製された結合タンパク質を提供することによって達成する ことができ、ここで、前記、精製された結合タンパク質は該タンパク質に特異的 な抗体またはインシュリン様成長因子に結合し得る。結合タンパク質組換え法で 製造された結合タンパク質の分子、および新規な結合タンパク質を認識する抗体 も本発明の一部分である。

及ｉ二！！広五皿 図１は、ヒトＩＧＦＢＰ−５をコードするグロー７のアミノ酸とヌクレオチドの 配列を示す構成図である。

図２は、本発明のヒト結合タンパク質であるヒｌ−ＩＧＦＢＰ−５のアミノ酸配 列を、さきに述へた３種のヒト結合タンパク質の公知の配列および他の新しく発 見されたＩＧＦ結合タンパク貫であるＩＧＦＢＰ−４と比較する構成図である。

相同の領域がこれらの配列中にみとめられる。これらの相同領域は特に重要であ る。

なぜなら、類縁分子を見つけることに成功する確率が高いＤＮＡプローブを得る ことができる領域を示しているからである。

このような相同領域を２つ括弧で示しであるが、他の相同領域も存在している。

白・な−熊　の８日 ＩＧＦＢＰ−５を；−ドする一般配列を用いて製造された組換えタンパク質、お よびこのタンパク質由来のフラグメントを含有する新規な組成物、ならびに天然 源から単離されたタンパク質およびこれらの組成物の使用法が提供される。Ｍ換 えタンパク質を製造するのに使用されるＩＧＦＢＰ−５ｃＤＮＡは、８初、２段 階の手順を用いて、ヒト骨肉腫／λＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーから単離され た。第１に、ＢＰ５のアミノ酸１〜１５をコードするＣＤＮＡの小さなフラグメ ントを、ポリメラーゼ連鎖反応、ゲルによる精製および配列決定によって骨肉腫 ｃＤＮＡから増幅した。

第２に、完全にマツチするオリゴヌクレオチドをＰＣＲＣラプライマー間Ｐ５ヌ クレオチド配列に基づいて合成し、ｃＤＮＡクローンを単離するためのプローブ として使用した。アガロースケル電気泳動法でＤＮＡ挿入フラグメントの大きさ が最大を示す、ＢＰ５ｃＤＮＡクローンの配列を決定した。ＢＰ５のヌクレオチ ドとコードされるアミノ酸配列を図１に示す。

ヌクレオチドとアミノ酸の襟準の略語が、本明細書中のこれらの図および他の部 分に用いられる。

遺伝子工学とタンパク質化学の技術分野に用いられる多数の用語が、以下に定義 する意味で本願に用いられる。

Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記文献の３２０〜３２３頁に記載のハイブリダイゼーシ ョン条件下で互いにハイブリタイプできる場合、２つの核酸フラグメントは°゛ 相同゛′である。しかし、下記の洗浄条件、すなわち２ｘＳＣＣ５０，１％ＳＯ ３、室ｃ思にて２回、３０分間ずっ：次いで、２Ｘ　ＳＣＣ，Ｏ，１％ＳＤＳ、 ５０℃で１回、３０分間；次いて２Ｘ　５ＣＣ１室温て２回、１０分間ずつ、を 用いることによって、せいぜい約２５〜３０％の塩基対のミスマツチを含む相同 な配列を同定することかできる。より好ましくは、相同な核酸ストランドは、１ ５〜２５％の塩基対のミスマツチを含み、さらに好ましくは、塩基対のミスマツ チが５〜１５％である。これらの相同度は、当該分野で公知であるように、遺伝 子ライブラリー（または遺伝物質の他の起源）からクローンを同定する、一層厳 密な洗浄条件を用いることによって選択することかできる。

ＤＮＡフラグメントは、ＩＧＦＢＰづ分子全体のコーディング配列の領域と同し かまたは実質的に同じ塩基対配列をもっている場合、＋ｃＦｓｒ＋：ｓをコード するＤＮＡ配列“由来″である。

”実質的に同じ”という用語は、生物学的活性について用いた場合、その活性は 同じタイプであるが、活性度が異なることを意味する。アミノ酸配列に用いた場 合、′°実質的に回し”という用語は、当該分子か類似の生物学的特性を有し、 好ましくはアミノ酸配列の相同性か少なくとも８５％であることを意味する。さ らに好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９０％同一である。′実質的に同じ ”という用語は他のところで使う場合は、その通常の英語の意味をもっている。

タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−５分子の領域と同じかまたは実質的に同じアミノ酸 配列をもっている場合、ＩＧＦＢＰ＝５分子“由来”である。

グリコ／ル化されたＩＧＦＢＰ−５とグリコジル化されていない］ＧＦＢＰ−５ 、またはそのポリペプチド誘導体は、ＩＧＦＢＰ−５に対して特異的なモノクロ ーナルもしくはポリクローナルの抗体を製造するのに用い得る。これらのＩＧＦ ＢＰのポリペプチド誘導体とは、天然の＋ｃｐｓｐ−ｓとは長さが異なり、かつ 天然起源から得られたＩＧＦＢＰ−５に見られるのと同じ主要配列で、ＩＧＦＢ Ｐ−５由来の５以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＩＧＦＢ Ｐ−５と実質的に同じアミノ酸配列を含有しているが、抗体およびＩＣＦ分子、 特にＩＧＦ−１およびとりわけＩＣＦ−１１のようなＩＧＦＢＰ−５特異的分子 と相互に作用する、ＩＧＦＢＰ−５ポリペプチド誘導体の性質に実質的に影響し ない、小さなアミノ酸置換部分を有するポリペプチド分子は、ＩＧＦＢＰ−５の 定義に含まれる。誘導体には、グリコジル化された形態、他のＩＧＦ−ＢＰ分子 との凝集接合体、および非類縁の化学的部分との共有結合接合体が含まれる。共 有結合誘導体は、ＩＧＦ−ＢＰのアミノ酸連鎖中、またはＮ末端もしくはＣ末端 の残基中に見られる基に、当該技術分野で公知の手段によって官能基を連結させ ることによって製造される。

Ｎ−グリカナーセによる実験は、ＩＧＦＢＰ−５かグリコ／ル化されることを示 唆している。ＩＧＦＢＰ−５をＮ−グリカナーセで処理すると、ＩＧＦＢＰ−５ は分子量が３０ｋＤから２４ｋＤにシフトする。このことは、この結合タンパク 質がグリコリル化されることを強く示唆している。これはコードされている配列 と一致している。

ＩＧＦＢＰ−５特異的分子には、天然産のＩＧＦＢＰ−５アミノ酸配列を含有す るＩＧＦＢＰ−５ポリペプチドに対して特異的な抗体のようなポリペプチドが含 まれる。“特異的結合ポリペプチド”と（１う用語は、ＩＧＦＢＰ−５およびそ の誘導体と結合し、かつ標的ポリペプチド、すなわちＩＧＦＢＰ−５およびＩＧ ＦＢＰ−５のポリペプチド誘導体に対して、結合性を試験される他のポリペプチ ドに対してより、測定可能な程度に高い結合親和性を有するポリペプチドを意味 する。１０倍高い親和性か好ましく、１００倍高い親和性がさらに好ましい。抗 体に対する結合親和性は単結合の場合である（すなわち抗体分子の一価結合であ る）。また抗体による特異的・結合は、結合か、その分子の抗体の通常の結合部 位（可変領域におけるアームの末端）で起こることを意味する。

上記のように、ＩＧＦＢＰづの天然のアミノ酸配列かられずかにアミノ酸配列か 変化したものは、ＩＧＦＢＰ−５という用語に含まれると考えられる。特に保存 的アミノ酸置換か考えられる。保存的置換は、アミノ酸の側鎖に関連するファミ リー内で起こる置換である。遺伝子でコードされるアミノ酸は一般に次の４つの ファミリーに分類される。すなわち（１）酸性＝アス、＜ラギン酸、グルタミン 酸；（２）塩基性＝リン／、アルギニン、ヒスチジン；　（３＞非極性−アラニ ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニ ン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシノ、アスパラギン、グル タミン、ンスチン、セリン、トレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、 トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸として分類されると きがある。例えば、次のような孤立した置換すなわち、ロイシンのイソロイシン またはバリンによる置換、アスパラキン酸のグルタミン酸による置換、トレオン のセリンによる置換、または同様の、構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸 の置換は、特にその置換が、ＩＧＦＢＰ−５もしくはその誘導体とＩＧＦ分子と の相互作用に関与している結合部位におけるアミノ酸を含んでいない場合、生成 した分子の結合特性に大きな影響を与えない。アミノ酸が変化することによって 機能ペプチドが生成するか否かは、ＩＧＦＢＰ７５ポリペプチド誘導体の特異的 結合特性をアッセイすることによって、容易に決定することができる。結合アッ セイについては以下に詳細に述べる。

ＩＧＦＢＰ−５に対して特異的な抗体は、精製ＩＧＦＢＰ−５もしくはＩＧＦＢ Ｐ−５のポリペプチド誘導体を、それ自体もしくは通常のアジニバントとともに 用いて、ウサギのような適切なを椎動物の宿主を免疫化することによって製造さ れる。通常２回以上の免疫化が行われ、血液もしくは肺臓を、最後の注射をして から数日後に回収する。ポリクローナル抗血清については、その免疫グロブリン は、アフィニティーカラム中のゲルもしくはビーズのような固体の表面に結合さ せたＩＧＦＢＰづを用いるアフィニティー精製法を含む各種の標準の方法によっ て、沈降させ、単離し精製することができる。モノクローナル抗体については、 スプレ／サイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）が通常、／ゝイブリドーマが生成す る選択された条件下で、骨髄細胞系のような不朽化リンパ球と融合される。次に そのハイブリドーマを限界希釈条件下でクローン化して、それらの上澄み液を、 所望の特異性を有する抗体についてスクリーニングし得る。抗体の製造法は、文 献でよ（知られており、刊行物のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ 　Ｍａｎｕａｌ　（１９８８年）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ縄集、ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｐｒｅｓｓ、および米 国特許第４，３８１．２９２号、同第４．４５１．５７０号および同第４．６１ ８．５７７号に例示されている。

ＩＧＦＢＰ−５は、°血液および成分、例えばｒａ／Ｉ！ｌと血漿、およびＩＧ ＦＢＰ−５またはそのポリペプチド誘導体を産生ずるように遺伝子を改変した細 胞から、ＩＧＦＢＰ−５に対して特異的なモノクローナル抗体を用いるアフィニ ティークロマトグラフィーによって容易に精製し得る。抗体アフィニティークロ マトグラフィーの使用に加えて、各種の他の広く知られているタン１＜り質精製 法（単独もしくは組み合わせて）、例えば免疫沈降法、トゲラフイー、等電点電 気泳動法、選択的沈降法、電気泳動法などでＩＧＦＢＰ−５とそのポリペプチド 誘導体を精製することかできる。精製処理中に単離された両分は、ＩＧＦＢＰ− ５またはＩＧＦＢＰ−５のポリペプチド誘導体の存在について、ＩＧＦＢＰ−５ ）特Ｘ的抗体を用いるイムノア、セイまたＩＧＦＢＰ−５）特異的バイオアッセ イによって分析することができる。詳細な実施例を以下に記載する。

ＩＧＦＢＰ−５をコードするヌクレオチド配列を単離するには、ＩＧＦＢＰ−５ をコードする細胞からゲノムライブラリーを作るか、またはＩＧＦＢＰ−５を発 現する細胞から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作る必要がある。

イントロン／エクソンの境界を決定する試みから起こる可能性かある問題を回避 するために、ｃＤＮＡライブラリーを作ってＩＧＦＢＰ−５をコードするヌクレ オチド配列を単離する方か一般に好ましい。遺伝子ライブラリーは、真核宿主細 胞または原核宿主細胞のいずれについても作ることができる。プラスミド、コス ミド、ファージ、ＹＡＣなどのような広く入手可能なりローユングベクターは、 ＩＧＦＢＰ−５をフードするヌクレオチド配列またはその一部を単離するのに適 切な遺伝子ライブラリーを作るのに使用し得る。

ＩＧＦＢＰ−５のヌクレオチド配列の存在について遺伝子ライブラリーをスクリ ーニングする有用な方法には、精製ＩＧＦＢＰ−５またｉ；！　ａ　製ＩＧＦＢ Ｐ−５の精製内部フラグメントからのＮ末端アミノ酸配列の情報に基づいて、オ リゴヌクレオチドのプローブを作ることが含まれている。標準のトリブレット遺 伝子コードを用いることによって、アミノ酸配列か〜末端分析法で決定されたＩ ＧＦＢＰ−５の部分に一致するように、約１７以上の塩基対の長さのオリゴヌク レオチド配列を通常のイアビトロ合成法で作り得る。得られた核酸配列は、次に 、放射性核種、酵素、ビオチン、蛍光剤などで標識されて、遺伝子ライブラリー をスクリーニングするのに用いるプローブとして使用し得る。

ＩＧＦＢＰ−５をコードする核酸配列を単離するのに重要な他の方法としては、 ＩＧＦＢＰ−５に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナルの抗体によっ て、ＩＧＦＢＰ−５もしくはそのフラグメントの発現について遺伝子ライブラリ ーをスクリーニングする方法がある。特に好ましい方法では、精製ＩＧＦＢＰ− ５の部分アミノ酸配列または公知の類縁分子由来の配列に基ついた縮重プライマ ーと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、プライマー間の遺伝子セグメ ントを増幅する。次にその遺伝子は、上記の増幅された遺伝子セグメントに基つ いた特異的な／％イブリダイゼーンヨンプローブを用いて単離し得、次いでタン パク質の適切な発現について分析される。この好ましい方法の詳細な説明は、後 記の実施例て述へる。

ＩＧＦＢＰ−５をコードするヌクレオチド配列は、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子ライブ ラリーの単離物から回収された組換えＤＮＡ分子から得られ得る。ＩＧＦＢＰ− ５をフードするヌクレオチド配列は、これらの組換え分子の非ベクターヌクレオ チド配列の配列を決定することによって得られ得る。ヌクレオチド配列の情報は 、例えばマキ／ム・キルバート配列決定法、ジデオキ７ヌクレオチド配列決定法 などのような広く用いられている、ＤＮＡ配列決定のプロトコルを使用して得ら れ得る。適切なヌクレオチド配列決定プロトコルの例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫ ｉｍｍｅｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　５２　、Ｇｕｉｄｅ　 ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉｕｅｓ　（１９８７） 　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓに見い出し得る。ｃＤＮＡライブラリーとゲ ノムライブラリーの両者からの単離物を含むい（つかの組換えＤＮＡ単離物から のヌクレオチド配列ｔ１１　報＋；！、ＩＧＦＢＰ−５の全アミノ酸コーディン グ配列、ならひにＩＧＦＢＰ−５遺伝子内のイントロンのヌクレオチド配列、上 流のヌクレオチド配列、および下流のヌクレオチド配列を得るために、組み合わ せ得る。

ＩＧＦＢＰ−５特異的遺伝子ライブラリー単離物の配列を決定することによって 得られたヌクレオチド配列は、ＩＧＦＢＰ−５の遺伝子の重要な領域を同定する ために分析される。これらの重要な領域には、オープンリーディングフレーム、 イントロン、プロモーター配列、終止配列などが含まれる。ヌクレオチド配列の 情報の分析は好ましくはコンピュータで行われる。重要な領域のヌクレオチド配 列を分析するのに適切なソフトウェアは市販されており、例えばＤＮＡ５ＩＳ　 （登録開襟、ＬＫＢ社）がある。ヌクレオチド配列の分析の正確さを改善するた めに、ＩＧＦＢＰ−５ヌクレオチド配列の情報を分析するとき、精製ＩＧＦＢＰ −５のＮ末端の配列決定から得られるアミノ酸配列情報を用いることも重要であ る。

ＩＧＦＢＰ−５をコードする単離されたヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ法ま たはインビトロポリペプチド合成法によって精製ＩＧＦＢＰ−５もしくはそのフ ラグメントを製造するのに使用し得る。

“精製された”および“単離された°′という用語は、ポリペプチドもしくはヌ クレオチドの配列に用いる場合、その指定された分子は、同じタイプの他の生体 高分子が実質的に存在しない状態で存在していることを意味する。゛精製された パという用語は、本願で用いる場合、同しタイプの生体高分子か、好ましくは少 なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％、および最（）好ま しくは少なくとも９９．８重量％存在することを意味する（しかし、水、緩衝剤 などの低分子、特に分子量か１０００より小さい分子は存在していてもよい）。

天然起源からＩＧＦＢＰ−５を単離する場合に比へて、組換えＤＮＡ法によって ＩＧＦＢＰづを製造する場合の大きな利点は、天然起源から結合タンパク質を単 離するのに２・要な出発原料の量より少ない量の出発原料を用いて同量のＩＧＦ ＢＰ−５を製造することかできるということである。また、ＩＧＦＢＰ−５を組 換え法で製造すると、ＩＧＦＢＰ−５を天然に産生ずる細胞内に通常存在するい （つかの分子なして、ＩＧＦＢＰ−５を単離することかできる。組換え非ヒト宿 主で産生される唯一のヒトタンパク質か組換えＩＧＦＢＰであるから、実際に、 ヒトタンパク質の汚染物の痕跡も全く含有しないＩＧＦＢＰ組成物が容易に製造 し得る。天然起源由来で混入する可能性かあるウィルス性物質も回避し得る。ま た組換えＤＮＡ法は、前記の変異体のような、天然では見られないＩＧＦＢＰ− ５ポリペプチド誘導体を製造するのに使用し得ることも明らかである。

ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−５のボ’）ペプチド誘導体は、類縁分子をコ ードするＤＮＡ配列をベクター中に機能的に挿入すると、組換え法によって発現 させ得る。“機能的に挿入する″という用語は、当該技術分野の熟練者であれば 十分に理解できるように、適正なリーディングフレーム中に適切な配向で挿入す ることを意味する。完全なＩＧＦＢＰ−５リーデイングフレームを冑する遺伝子 構造を作るとき、好ましい出発物質は、ゲノムライブラリー単離物よりもむしろ 、ＩＧＦＢＰ−５をコードするｃＤＮＡライブラリー単難物である。典型的には 、ＩＧＦＢＰ−５遺伝子は、プロモーターの下流に挿入され、停止フドンが続く が、所望により、ハイブリ、ドのタンパク質として産生され、次いで切断が行わ れ得る。一般に、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−５ポリペプチド誘導体の製 造収率を改善する宿主細胞特異的配列が用いられ、かつ適切な制御配列、例えば エンバンサー配列、ポリアデニル化配列およびリポゾーム結合部位が発現ベクタ ーに付加される。

適切なコープイン配列が単離されると、種々の異なる発現系で発現させることが できる。

哺乳類の発現系 哺乳類のプロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コーディング 配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３°〉転写を開始するＤＮＡ配 列である。プロモーターは、転写開始領域を有し、この領域は通常、コーディン グ配列の５°末端の近くに位置しており、モしてＴＡＴＡボックスが転写開始部 位の上流２５〜３０塩基対（ｂｐ）の位置に通常位置している。このＴＡＴＡボ ックスは、ＲＮＡポリメラーゼＨに、正しい部位でＲＮＡ合成を開始させると考 えられている。哺乳類プロモーターはまた、上流プロモーターエレメントを有し 、このエレメントは一般にＴＡＴＡボックスの上ａｌｏｏ〜２００ｂｐの範囲内 に位置している。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定 し、両方の配向で作動することができる（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、第２版中のＳａｍｂｒｏｏｋら、（ １９８９）　″　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　ｉ ｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ”）。

哺乳類ウィルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして宿主域か広い。それ 故に、哺乳類ウィルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列 を提供する。その例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルス ＬＴＲプロモーター、アデノウィルスの主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、 および単純ヘルペスウィルスプロモーターがある。さらに、非ウィルス遺伝子も また、例えば不ズミ科動物のメタロチオネイン遺伝子由来の配列も有用なプロモ ーター配列を提供する。発現は、構成的かもしくは制御され（誘導性）、プロモ ーターによって、ホルモン感受性細胞中で、グルココルチコイドで誘導し得る。

先に述べたプロモーターエレメントと組合わせてエンＩ＼ンサーエレメント（エ ンハンサー）が存在すると、一般に発現のレヘルが増大する。二ンノ＼ンサーは 、同種のまたは異種のプロモーターに連結され、合成か通常のＲＮＡ開始部位で 始まると、１０００倍まで転写を刺激し得る制御ＤＮＡ配列である。また、エン ハンサ−は、転写開始部位から上流または下流に、通常の配向もしくはフッノブ された（ｆｌｉｐｐｅｄ）配向、またはプロモーターから１０００ヌクレオチド を超える距離で位置して活性である［Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）、江」＝ 几ユ３６：　１２３７；　Ａｌｂｅｒｔら（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、第２版コ。ウィルスかう誘導されるエン ハンサ−エレメントは特に有用である。

なぜならば、それらは一般に宿主域が広いからである。その例としては、ＳＶ４ ０初期遺伝子エンハンサ−ＪＤｉｊｋｅｍａら（１９８５〉、ＥＭＢＯＪ、、４ ：　７６１］およびラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　５ａｒｃ。

ｍａ　Ｖｉｒｕｓ）の長い末端繰り返しくＬＴＲ）由来のエンハンサ−／プロモ ーター［Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）、Ｐｒｏｃ、　！Ｊａｔ１．　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　７９豊：　５７７７］およびヒトサイトメガロウィルス由来のエ ンハンサ−／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ　ら、恒旦エム璽、５２１頁１９８ ５年）がある。さらに、いくつかのエンハンサ−は、制御可能であり、ホルモン または金属イオンのようなインデューサーが存在する場合にのみ活性になる［５ ａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌ　１ｉ（１９８６）、Ｔｒｅｎｄｓ 　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　２１５頁；　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３６：　１２３７］。

ＤＮＡ分子は、哺乳類の細胞中で、細胞内発現し得る。プロモーター配列は、Ｄ ＮＡ分子に直接結合され、この場合、組換えタンパク質のＮ末端における第１の アミノ酸は常にメチオニンであり、これはＡＴＧ出発コドンによってコードされ ている。所望によりこのＮ末端は、臭化／アンとともにインビトロでインキ二ヘ ートすることによってタンパク質から切取ることができる。

あるいは、哺乳類細胞中で外来タンパク質を分泌するリーダー配列フラグメント からなる、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作ることによって、 細胞から増殖培地中に外来タンパク質を分泌し得る。好ましくはリーダーフラグ メントと外来遺伝子の間にコードされるプロセ／リング部位があり、この部位は インビボまたはインビトロで切断し得る。

リーダー配列フラグメントは一般に、細胞からタンノ寸り質を分泌させる、疎水 性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。アナ／ウィルスの三分節リ ーダーは、外来タン／＜り質を哺乳類細胞内で分泌するリーダー配列の例である 。

一般に、哺乳類細胞によって認識される転写終止配列とポリアデニル化配列は、 翻訳停止フトンに対して３′側に位置する制御領域であり、したがってプロモー ターエレメントとともにコーディング配列の両端に隣接している。成熟ｍＲＮＡ の３゜末端は、部位特異的な転写後の切断とポリアデニル化によって形成される ［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）、Ｃｅ１１．４１：　３４９；　ｌ；　Ｂ 、ＤＨａｍｅｓとり、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ　ＭＡ集＋Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉ■”中のＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌ ａｗ（１９８８）　−Ｔｅｒｍｉｎａｊｉｏｎ　ａｎｄ　３°ｅｎｄ　ｐｒｏｃ ｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＲＮＡ”　；　Ｐｒｏｕｄｆｏｏ ｔ（１９８９）、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、１４：　１０５ １　ｏ　これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳し得 るｍＲＮＡを転写させる。転写ターミネータ−／ポリアデニル化／グナルの例と しては、ＳＶ４０由来の／グナルを含有する。［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１凹」 １：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ中のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８ ９）　−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｃｕ ｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ−］　。

ある遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれている）が存在するとより効率 的に発現し得る。しかしいくつかのｃＤＮＡは、スプライ７ングングナル（スプ ライスドナーおよびアクセプタ一部位とも呼ばれる）を欠いているベクターから 効率的に発現されている［例えばＧｏｔｈｉｎｇとＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１ ）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９３：　６２０］。イントロンは、スプライスドナーと アクセプタ一部位を含有するコーディング配列内にある介在非コーディング配列 である。この配列は、一時転写産物のポリアデニル化の後、”スプライシングと 呼ばれる工程で切除され　口Ｎｅｖｉｎｓ　（１９８３）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２：　４４１：　Ｇｒｅｅｎ　（１９８６）、＃ｎ ｎｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０：　６７１；　Ｐａｄｇｅｔｔら（１９８６） 、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、旧ｏｃｈＨ，，５５；　１１１９；　Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅ ｓおよびり、　Ｍ、　Ｇ　１ｏ　ｅｒ　’ｉｓ渠Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉｎ中のＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ　（ １９８８）のＲＮＡ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ、−コ。

一般に、上記のエレメントは、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび転 写終止配列を包含し、発現構築体に組み合わされる。エンハンサ−１機能的スプ ライスドナーとアクセプタ一部位を有するイントロン、およびリーダー配列もま た、所望されるなら発現構築体に包含され得る。発現構築物は、哺乳類細胞また は細菌のような宿主内に安定に保持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミ ド）のようなレブリフン内に保持されている場合か多い。哺乳類の複製系として は、動物ウィルス由来の複製系を包含し、復製するためにトランスに作用する因 子が必要である。例えば、ＳＶ４０　［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）、　Ｃｅ１ ｌ　２３：　１７５コまたはポリオーマウィルスのようなバポバウィルス類の？ Ｉ製糸を包含するプラスミドは、適切なウィルスＴ抗原の存在下で極端に高いコ ピー数で複製する。

哺乳類レプリコンの別の例として、ウンパビローマウィルスとＥＢウィルス（Ｅ ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）由来のレプリコンがある。さらにレプリ コンは、２つの複製系を持ち得る。したがってこの場合、例えば発現のためには 哺乳類の細胞で保持させ得、そしてクローン化および増幅のためには原核宿主に 保持し得る。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例としては、　ｐＭＴ ２　［Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、：９ ４６コおよびｐＨＥＢｏ　［Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ６：　１０７４コ　がある。

バキュロウィルス発現系 バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスＲＮＡポリメラーゼを結合 し、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３”）転写 を開始し得るすべてのＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の ５°末端に近接して通常配置される転写開始領域を宵し得る。この転写開始領域 は、通常、ＲＮＡボリメラーセ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウ ィルスプロモーターはまた、エンハンサ−と呼ばれる第二トメ・ｒンら有し得る 。このエンハンサ−は、もし存在する場合には、通常、構造遺伝子から離れた場 所にある。発現は、制御されるかまたは構成性であり得る。

感染サイクルの後期において豊富に転写される遺伝子をコードする配列は、特に 有用なプロモーター配列を提供する。

その例としては、ポリヘトリン由来の配列［Ｆｒ１ｅｓｅｎら、（１９８６）　 Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ 　（Ｗａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒりの°Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−：ヨーロノパ 特許公開第１２７．８３９号および第１５５．４７６号］、およびｐｌｏ　［Ｖ ｌａｋら、（１９８８）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９＋７６５］遺伝 子が挙げられる。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接 連結され得る。その場合、組換えタンパク質のＮ末端の第一アミノ酸は、常に、 ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチ゛オニンである。所望されるなら、 Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンと共にインビトロでインキコベーションする ことによって、タンパク質から開裂され得る。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。内因性酵母タンパク質または 他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコーディ ング配列の５°末端に融合される。発現すると、この構築物は、２つのアミノ酸 配列の融合を提供し得る。例えば、ポリヘトリン遺伝子のＮ末端は、外来の遺伝 子の５゛末端で連結され、酵母中で発現され得る。２つのアミノ酸配列の結合部 のＤＮＡ配列は、開裂可能な部位をコードし得るか、またはフードし得ない。Ｌ ｕｃｋｏｗら、（１９８８）　Ｂｉ。

ムＬ加回ユ旺」：４７を参照のこと。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を生成することによって細 胞から分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、昆虫において外来タンパク質の 分泌を促すｌ）−ダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードする。リ ーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を誘導する疎水 性アミノ酸を含む／グナルベブチトをコードする。

適切な／グナル配列をフードするＤＮＡは、バキュロウィルスポリヘトリン遺伝 子のような、昆虫またはノ＼キュロウイルスの分泌されるタンパク質の遺伝子由 来てあり得る［Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８８）　Ｇｅｎｅ　７３：４０９ ］　。あるいは、ヒトαインター７ｓロン［Ｍａｅｄａら、（１９８５）　Ｎａ ｔｕｒｅ　３１５：５９２］　、ヒトガストリン放出ペプチド［Ｌｅｂａｃｑ− Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 ８：３１２９コ、ヒ　ト　ＩＬ−２［Ｓ＋ｎ１ｔｈ　ら　、（１９８５）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ　８２：８４０４］、マウスＩ Ｌ−３［Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）　Ｇｅ−はまた、昆虫において分泌 を促す。

通常、昆虫によって認識される転写終止配列は、畦訳終止フドンの３゛に位置す る制御配列であるため、プロモーターと共にコーディング配列の側面に位置する 。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍ ＲＮＡの転写を方向づける。例としては、ポリヘトリン遺伝子由来の転写終止配 列か挙げられるＪＭｉｌｌｅｒら、（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　’Ａ外 来の遺（分子をバキュロウィルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、リーダ ー（所望されるなら）、目的のコーディング配列、および転写終止配列を含む上 記成分は、通常、組合されて中間置換体構築物となる。中間置換体構築物は、し ばしば、バクテリアのような宿主中に安定して維持され得る染色体外要素（例え ば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維持される。レプリコンは複製系 を有し得るため、クローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持され得る。

構築物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常、二重交叉組換えによって外 来遺伝子をバキュロウィルスゲノムに取り込むための、バキュロウィルスゲノム の２．５ｋｂセクションを含ミ、バキュロウィルス発現ベクターを生成し得る［ Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）　ＢｌｏｅΣ１１ユニ　９１　］。バキュロウィ ルス発現ヘクターは、通常、感染性組換えバキュロウィルスにパッケージされる 。

バキュロウィルス発現ベクターを使用する際には、抗生物質抵抗性遺伝子のよう な選択可能なマーカーは、一般的には、使用されない。選択は、通常、閉塞体（ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）を肉眼で観察することによってなされる。選択 可能なマーカーの使用に関する例は、本明細書の至るところに記載されている。

組換えバキュロウィルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞に感染させるため に開発されている。例えば、特に、江ｄｅｓ　柱Ｌ＝■、狂胆肛鉦旦ｃａｌｉｆ ｏｒｎｉｃａ、　泣畦■ｍｏｒｉ、ニャ虹ロ肚お匪甚月工旺、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉ ｓた狙、江蜘並上■葺土りとＵ組、およびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ旦［Ｐ、Ｃ ，Ｔ、　ＷＯ８９１０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｆら、（１９８５）　Ｊ 、Ｖｉｒｏｌ、５６：１５３：　Ｓｍ１ｔｈら、（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、３：２１５６；　Ｗｒｉｇｈｔ　（１９８６）　Ｎａｔｕｒ ｅ　３２１ニア１８；　一般に、Ｆｒａｓｅｒら、（１９８９）　Ｉｎ　’／１ ｔｒｏ　Ｃｅ１１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、２５：２２５を参照のこと］のよう な組換えバキュロウィルスか、開発されて（Ａる。

外因性ＤＮＡを昆虫宿主に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、 一般に、宿主昆虫細胞をＤＮＡでトランスフェクトするか、または昆虫細胞もし くは生きた昆虫、通常、幼虫をウィルスに感染させることを含む。トランスフエ フシコン手法は、本来哺乳類細胞のために開発されたリン酸カル／ウム手法［Ｇ ｒａｈａｍら、（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６］　に基づく。

ＤＮＡトランスフエク７−Ｊンおよびウィルス感染手法は、通常、形質転換され る昆虫種によって変わる。例えば、眞」又１吐［Ｃａｒｓｔｅｎｓら、（１９８ ０）　■二江ｕＬ±０１：３１１］　、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　（ｖｉｒｅ＝）口 Ｐ、　Ｃ，Ｔ公開第ＷＯ３８１０２０３０号コ、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　［Ｋａ ｎｇ（１９８８＞　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　３５巻の”　ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅｓ＋コを参照のこと〇二ムニュニュ 旦玉 バクテリアプロモーターは、ＩＮクチリアＲＮＡボポリメラーゼ結合し、コーデ ィング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３）転写を開始し得る すへてのＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５゛末端に近 接して通常配置される転写間・始領域を有し得る。この転写開始領域は、通常、 ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。／＜クチリアプロモー ターはまた、オペレーターと呼ばれる第ニドメインも含み、このオペレーターは 、ＲＮＡ合成が開始する隣接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重なり得る。オペ レーターは、リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それによって 特定的遺伝子の転写を阻害する遺伝子として、負の調節された（誘導可能な）転 写を可能にする。構成的な発現は、オペレーターのような負の調節要素の非存在 下で発生し得る。

さらに、正の調節は、遺伝子アクテイベータータンノくり質結合配列によって成 し遂げられ得る。この遺伝子アクティベータータンパク質配列は、存在する場合 には、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配°列に近接して（５°）に位置する。遺 伝子アクティベータータンパク質の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ　ｉａ坦ユ （ａｃｏｌｉ）　ｆ：　オイてｌａｃオペロンの転写開始を助ける、カタボライ ト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる［Ｒａ１ｂａｕｄら、（１９８４） 　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８：１７３］　ｏ従って、制御され る発現は、ポジティブまたはネガティブであり、それによって転写を同上または 減少させる得る。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。そ の例としては、ガラクトース、ラクトース（１ａｃ）　［Ｃｈａｎｇら、（１９ ７７）　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６コ、およびマルトースのような糖代謝 酵素由来のプロモーター配列カダ挙げられる。別の例としては、トリプトファン （！ｆｆ）のような。

生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる［Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８ ０）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７：　Ｙｅｌｖｅｒｊｏｎら、 （１９８１）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９ニア３１：米国特許第４ ．７３８．９２１号；ヨー口、　／　ｚ＋特許公開第３６．７７６号および第１ ２１．７７５号〕。γ−ラクタマーセ（当）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｎ　（１９８１）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３　（１、Ｇｒｅｓｓｅｒｍ）の＋ Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　 ｍ１ｓｔａｋｅｓ、　”コ、バクテリオファージλ　ＰＬ　［Ｓｈｉｍａｔａｋ ｅら、（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８］　およびＴ５［米国特許 第４．６８９．４０６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提 供する。

さらに、天然にない合成プロモーターはまた、ｌ（クチリアプロモータとして機 能する。例えば、１つの）（クチリアまたはバクテリオファージプロモーターの 転写活性化配列は、他のバクテリアまたはバクテリオファー７プロモーターのオ ペロン配列と結合し得、合成／・イブリＩドプロモーターを生成する［米国特許 第４．５５１．４３３号］。例えば、エプロモーターは、ニプロモーター配列、 およびエリプレノサーによって制御されるｌａｃオペロン配列の両方を含む／％ イブリ／ド■ニー上ａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら、（１９８３）　Ｇ ｅｎｅ　２５：１６７：　ｄｅＢｏｅｒら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８０：２１］。さらに、バクテリアプロモーターは、ノ＼ クチリアＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始する能力を宵する非ノ・クチ リア起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非、ｓＨクチリア起源の天 然に存在するプロモーターはまた、適合性のあるＲＮＡボリメラーセと連結し得 、原核生物のいくつかの遺伝子を高度なしへルで発現する。バクテリオファージ Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例で ある［５ｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９：１ １３：　Ｔａｂｏｒら、（１９８５）　Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、８２：１０７４］　ｏ　さらに、／％イブリ、ドブ口モーターはまた、バク テリオファージプロモーターおよびＥ、　ｅｏｌｉオペレーター領域を含み得る ［ヨーｏ　’ｙバ特許公開第２６７．８５１号］。

機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリポソーム結合部位はまた、原核 生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ−、ｃｏｌｉにおいて、リポソ ーム結合部位は、ンヤインダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴ Ｇ）および開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流にある長さ３−９のヌクレオ チドの配列を含む［５ｈｉｎｅら、（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４ コ。

ＳＤ配列は、ＳＤ配列およびＥ、　ｃｏｌｉ　１６ｓ　ｒＲＮＡの３°末端との 間の塩基の対合によって、ｍＲＮＡのリポソームへの結合を促進すると考えられ ている［５ｔｅｉｔｚら、（１９７９）　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅ　ｕｌａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ：　Ｇｅｎｅ　ＥＸ　ｒｅｓｓｉｏ ｎ　（Ｒ，Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒｍ）の−Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌ ｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｓｓｅｎ ｇｅｒ　ＲＮＡ、“］。弱いリポソーム結合部位で真核遺伝子および原核遺伝子 を発現すること［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕロニＣ１（ 皿亘又二工上独立ロ工圧りヱ肛工＋Ｉの“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｏ ｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、−］　。

’　ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子に 直接連結され得、この場合、Ｎ末端の第一アミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドン によってコードされるメチオニンである。所望されるなら、Ｎ末端のメチオニン は、臭化シアンと共にインビトロでインキュベートすることによって、またはバ クテリアメチオニンＮ末端ベブチターセと共にインビボもしくはインビトロでイ ンキユベートすることによってタンパク質から開裂され得る（ヨーロッパ特許公 開第２１９．２３７号）。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。通常、内因性バクテリアタン パク質、または池の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列か、 異種コーディング配列の５゛末端に融合される。発現されると、この構築物は、 ２つのアミノ酸配列の融合物を提供し得る。例えば、バクテリオファージλ細胞 遺伝子は、外来遺伝子の５′末端に連結され、バクテリア内で発現され得る。得 られた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子からバグテリオファージタン パク質を開裂するためにプロセッシング酵素（因子Ｘａ）の部位を保持する［Ｎ ａｇａｉら、＜１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０コ。融合タンパク質 はまた、１ａｃＺ　［Ｊｉａら、（１９８？）　Ｇｅｎｅ　６０：１９７］　、 ＬＩＥ　［Ａ１１ｅｎら、（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５：９３ ：　Ｍａｋｏｆｆら、（１９８９）　Ｊ、Ｇｅｎ、　％１ｉｃｒｏｂｉｏ１．　 １３５：１１］　、および二［ヨーロ、バ公開策３２４、６４７号］遺伝子由来 の配列を用いて形成され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は、開 裂可能な部位をコードし得るか、またはコードし得ない。池の例としては、ユビ 牛チン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）融合タンパク質か挙げられる。このような融合タ ンパク質は、好適には外来タンパク質からユビキチンを開裂するために、プロセ ッシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセノリングブロテアーセ）の部位 を保持するユビキチン領域を有する。この方法によって、天然の外来タンパク質 が、単離され得る［Ｍｉ　ｌ　ｌｅｒら、（１９８９）　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏ二Ｚ：６９８］。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を形成することによって細 胞から分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、バクテリア中で外来タンパク質 を分泌するシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をフードす る［米国特許第４．３３６．３３６号］。シグナル配列フラグメントは、通常、 細胞からタンパク質の分泌を誘導する疎水性アミノ酸を含む／グナルベブナドを コードする。タンパク質は、増殖培地（グラム陽性バクテリア）または細胞の内 膜と外膜との間に位置するペリプラズム空間（グラム陰性バクテリア）に分泌さ れる。シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、イン ビボまたはインビトロで開裂され得るプロセッシング部位が存在するのが好まし い。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、旦、ヨ外膜タンパク質遺伝子（ＯＪ ！Ａ）　［Ｍａｓｕｉら、（１９８３）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉ 　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ：　Ｇｈｒａｙｅｂ ら、（１９８４）　ＥＭＢＯＬ」・２４３７］およびＥ−、ｃｏｌｉアルカリ性 ホスファターゼシグナル配列（ヒ）　［Ｏｋａら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８ｉニア２Ｌ２］のような、分泌されたバ クテリアタンパク質の遺伝子由来であり得る。さらなる例として、様々なりａｃ ｉｌｌｕｓ株からのαアミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｆ４．５ｕｂｔｉｌ ｉｓからの異種タンパク質を分泌するために使用され得る［Ｐａ１ｖａら、（１ ９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：５ ５８２：　ヨーロッパ特許公開第２４４．０４２号〕。

通常、・・クチリアによって認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３° に位置するため、プロモーターと共にコーディング配列の側面に位置する制御領 域である。これらの配列は、ＤＮＡによってフードされるポリペプチドへ翻訳さ れ得るｍＲＮＡの転写を方向つける。転写終止配列は、しばしば、転写の終止を 助けるステムループ（ｓｔｅｍ　１ｏｏｐ）構造を形成し得る約５０個のヌクレ オチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、旦　並りにおける迫遺伝子および他の 生合成遺伝子のような強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終止配列が 挙げられる。

通常、プロモーター、／グナル配列（所望されるなら）、目的のコーディング配 列および転写終止配列を含む上記の成分は、組合されて発現構築物となる。発現 構築物は、しばしば、バクテリアのような宿主において安定して維持され得る染 色体外要素く例えば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維持される。レ プリコンは、復製系を有するため、発現またはクローニングおよび増幅のために 、原核宿生中に維持される。さらに、レプリコンは、コピー数の多いまたは少ナ イフラスミドであり得る。コピー数の多いプラスミドは、一般に、約５から約２ ００の範囲のコピー数を持ち、典型的には約１０から約１５０の範囲のコピー数 を持つ。コピー数の多いプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０ 個、さらに好ましくは少なくとも２０個のプラスミドを含み得る。ベクターおよ び外来タンパク質の宿主に対する影響により、コピー数の多いまたはコピー数の 少ないベクターが選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いてバクテリアゲノムに組込まれ 得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組込めるバクテリア染色体に相同な 少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクター中の相同なりＮＡと、バクテ リア染色体との組換えから生じるようである。例えば、様々なｈｅｉｌｌｕｓ株 からのＤＮＡで構築された組込みベクターは、ＢａｃｉｌｌｕΣ染色体に組込ま れる（ヨーロッパ特許公開第１２７．３２８号）。

組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列を含み得 る。

通常、染色体外および組込まれる発現構築物は、形質転換されたバクテリア株を 選択できるように、選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、バクテ リア宿主中で発現され、バクテリアをアンビンリン、クロラムフェニコール、エ リスロマイシン、カナマイノン（不オマインン）およびテトラサイクリンのよう な薬物に対して耐性とする遺伝子を含み得るＣ　Ｄａｖｉｅｓら、（１９７８） 　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３２：４６９コ。

選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイ７ン生合成 経路における遺伝子のような生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組合され得る。

上記のように、形質転換ベクターは、通常、レプリコンにおいて維持されるか、 または組込みベクターに形成される選択可能マーカーを含む。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くのバクテリアに形質転換されるために開発されている。例えば、発現ベ クターが、特に、以下のバクテリアで開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ ｕｂｔｉｌｉｓ　［Ｐａ１ｖａら、（１９ｇ２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：５５８２；　ヨーロ／パ特許公開第３６．２５９号 および第６３．９５３号：Ｐ、Ｃ，Ｔ、　ＷＯ８４１０４５４１］　、Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ±−［Ｓｈ　ｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）　Ｎａｔｕ ｒｅ　２９２：１２８；　＋ｈ＋ａｎｎら、（１９８５）　Ｇｅｎｅ　４０：１ ８３；　５ｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８９ ：１１３；　ヨー０　ツバ特許公開第３６．７７６号、東１３６，８２９号およ び第１３６，９０７号；英国特許出願第８４１１３２７３号］、５ｔｒｅ　ｔｏ ｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）　Ａ　１． 　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：５５５）　：　５ｔｒｅ　ｔｏ ｃｏｃｃｕｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ　［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９１１８）　Ａ　１ ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４：６５５］　、　５ｔｒｅ 　ｔｏｍ　ｃｅ＠　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　［米国特許第４．７４５．０５６号］。

外因性１）？ｌＡをバクテリア宿主に導入する方法は、当該技術分野において公 知であり、通常、ＣａＣｌ２て処理したバクテリアまたは二価のカチオンおよび ＤＭＳＯのような他の物質で処理したバクテリアの形質転換を含む。ＤＮＡはま た、エレクトｏボレーシコンによって、バクテリア細胞に導入され得る。形質転 換手法は、通常、形質転換されるバクテリア種に応じて変化する。例えば、　［ Ｍａｓｓｏｎら、（１９８９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、６ ０：２７３ＨＰａ１ｖａら、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　７９：５５８２：ヨーロノハ特許公開第３６．２５９号および第 ６３．９５３号；Ｐ、Ｃ、Ｔ、Ｗｏ　８４１０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、 　［Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８５：８５６：　Ｗａｎｇら、（１９９０）　Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１７２：９４９、Ｃａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒｌ　ｓ　ＥＣｏｈｅｎら、（１９） ３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、６９：２１１０；　Ｄｏｗｅｒら 、（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５２−上ｉ：６１２７；　 Ｋｕｓｈｎｅｒ　（１９７８）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　：　 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｎｔｅｒｎａｉｔｏｎａｊ　Ｓ　ｍ 　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅ」（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅ ｒおよびＳ、　Ｎｌｃｏｓｉａ編）の−Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ 　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　ｗｉｔｈ　Ｃｏ１Ｅｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ−；　Ｍａ ｎｄｅｌら、（１９７０）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、５３：１５９：　Ｔａｋ ｅｔｏ（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ　９４９ ：３ｔ８；　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、　［Ｃｈａｓｓｙら、（１９ｇ？）　 ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、４４：１７３　Ｌａｃｔｏｂａｃｉ ｌｌｕｓ］　；　［Ｆｉｅｄｌｅｒら、（１９８８）　Ａｎａｌ、Ｂｔｏｃｈｅ ｍ−口重：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］　；　［Ａｕｇｕｓｔｉｎら、（１ ９９０）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　６６：２０３．　Ｓ ｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓコ　、　［Ｂａｒａｎｙら、　（１９８０）　Ｊ、 　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４４：６９８；　）Ｉａｒｌａｎｄｅｒ　（１９８ ７）　江二匹匹姐ｃａｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｊ、　Ｆｅｒｒｅｔｔｉおよび Ｒ，ＣｕｒｔｉｓｓＪｌｇｌｌｌ）の”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ ｉｏｎ−；　Ｐｅｒｒｙら、（１９８１）　１ｎｆｅｃ、１ｍｍｕｎ、３２：１ ２９５；　Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）　Ａ　１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、５４：ｆｉ５５；　Ｓｏｍｋｕｔｉら、（１９８７）　Ｐｒｏｃ 、４ｔｈ　Ｅｖｒ、Ｃｏｎ　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　ｌ：４１２．　鈷工Ｊ 匹＝λ匹旦］を参照のこと。

晟朋二ＪＬＬ１１玉 酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コーディング配列（ 例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３゛）転写を開始するすべてのＤＮ Ａ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５°末端に近接して通常位 置する転写開始領域を有し得る。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラー ゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボ、クス」）および転写開始部位を含む。

酵母プロモーターはまた、上流アクティヘーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第ニ ドメインを有し、もし存在するなら、この第ニドメインは、通常、構造遺伝子か ら離れて位置する。ＵＡＳは、制御された（誘導可能な）発現を可能にする。構 成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。制限された発現は、ポジティブまたは ネガティブであり得、転写を同上または減少させる。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵微生物であるため、代謝経路における酵素 をフードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例としては 、アルコールデヒドロケナーゼ（ＡＤ＋＋）　（ヨーロッパ特許公開系２８４０ ４４号）、エノラーゼ、グルフキナーゼ、グルツース−６−ホスフェートイソメ ラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートーデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰま たはＧＡＰＤＨ＞　、へ牛ソ牛ナーセ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグ リセレートムターセ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（ヨーロッパ特許 公開第３２９２０３号）が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母Ｐ Ｈ０５遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供するＣＭｙａｎｏｈａｒａ ら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：ｌ ］。

さらに、天然には存在しない合成プロモーターはまた、酵母プロモーターとして も機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、他の酵母プロモ ーターの転写活性化領域と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する 。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に 結合したＡＤＨ制御配列が挙げられる（米国特許第４、８７６、１９７号および 第４．８８０．７３４号）。ハイブリッドプロモーターのその他の例としては、 匡、鉦旦、ＧＡＬＩＯｌまたは胆並遺伝子のいずれかの制御配列からなり、ＧＡ ＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせられた プロモーターが挙げられる（ヨーロッパ特許公開第１６４５５６号）。

さらに、酵母プロモータは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始する 能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。このような プロモーターの例としては、特に、　ＣＣｏｈｅｎら、（１９８０）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ工：１０７８；　Ｈｅｎ１ｋｏｆｆら 、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、（ １９８１）如」二」」二鉛」紅虹廊工ヨーユだ囮二ニー９６：１１９；　Ｈ。

１１ｅｎｂｅｒｇら、（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ 、Ｅｎｖｉｒｏｒ＋ｍｅｎｔａｌａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　１ｍ　ｏｒｔ ａｎｃｅ　（Ｋ、Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓおよびＡ、　Ｐｕｈｌｅｒｍ）の−Ｔｈｅ 　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏ【ｉｃ　 Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉ　ｔｈｅ　Ｙ、ｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏ ｎら、（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１：１６３：　Ｐａｎｔｈｉｅｒら、（１９ ８０）　Ｃｕｒｒ。

Ｇｅｎｅｔ、　ｉ：１０９：コを包含する。

ＤＮＡ分子は、酵母中で細胞内で発現され得る。プロモーター配列はＤＮＡ分子 に直接連結され得る。この場合、組換えタンパク質のＮ末端第一アミノ酸は、常 に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望されるなら 、Ｎ末端のメチオニンｉ；！、ｆｉ化ノンアン共にインビトロでインキュベート することによって、タンパク質から開裂され得る。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質 または池の適切なタンパク質のＮ末端部分をフードするＤＮＡ配列は、異種コー ディング配列の５°末端に融合される。発現すると、この構築物は、２つのアミ ノ酸配列の融合物を提供し得る。例えば、酵母またはヒトスーパーオキシドジス ムターゼ（５ＯＤ）遺伝子は、外来の遺伝子の５°末端で連結され得、酵母中で 発現する。２つのアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、開裂可能な部位をコー ドし得るか、またはコードし得ない。例えば、ヨーロッパ特許公開第１９６０５ ６号を参照のこと。他の例としては、ユビキチン融合タンパク質が挙げられる。

このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを開裂するために 、好ましくはブロセ、７ング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセノ／ングプ ロテアーゼ）の部位を保持するユビキチン領域を用いて形成される。

従って、この方法によって、天然の外来タンパク質は、単離され得る（１９８９ 年８月７日付けで提出された米国特許出願第３５９、５９９号と同一出願人のＰ 、Ｃ，Ｔ、　Ｗｏ　８８１０２４０６５、この開示は、本願では参考のために援 用している）。この系は、ＩＧＦＢＰ−５を生産するための現在好ましい系であ る。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を形成することによって細 胞から増殖培地に分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、酵母中で外来タンパ ク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコード する。

好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて開裂され得る、リーダーフラグ メントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位がある。リーダー 配列フラグメントは、通常、細胞からタンパク質の分泌を誘導する疎水性アミノ 酸を含むシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（Ｊ　Ｑ 　ツバ公開第１２８７３号、Ｊ、Ｐ、Ｏ，公開第６２．０９６゜０８５号）およ びＡ因子遺伝子（米国特許第４．５８８．６８４号）のような分泌される酵母タ ンパク質の遺伝子由来であり得る。あるいは、インターフェロンリーダーのよう な、酵母中での分泌を提供する非酵母起源のリーダーが存在する（ヨーロ７バ特 許公開第６００５７号）。

好ましいクラスの分泌リーダーは、「ブレーｐｒｅ”」シグナル配列と「プロ” ｐｒｏ−Ｊ領域の両方を含む、酵母α因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダ ーである。使用され得るα因子フラグメントのタイプには、全長ブレープロα因 子リーダー（約８３個のアミノ酸残基）および一部欠けたα因子リーダー（通常 約２５から約５０個のアミノ酸残基）か含まれる（米国特許第４．５４６．０８ ３号および第４．８７０．００８号；ヨーロッパ特許公開第３２４２７４号）。

分泌を促すアルファ因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーには 、第一の酵母のブレー列、第二の酵母のプロ領域で形成されるハイブリッドα因 子リーダーが含まれる（例えば、Ｐ、Ｃ，Ｔ、　Ｗｏ　８９１０２４６３を参照 のこと）通常、酵母によって認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３° に位置する制御領域であり、プロモーターと共にコーディング配列の側面に位置 する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得 るｍＲＮＡの転写を方向づける。転写終止配列および解糖系酵素をコードする配 列のような、他の酵母で認識される終止配列の例。

通常、プロモーター、リーダー（所望されるなら）、目的のコーディング配列お よび転写終止配列を含む上記の成分は、組合されて発現構築物となる。発現構築 物は、しばしば、酵母またはバクテリアのような宿主において安定して維持され 得る染色体外要素（例えば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維持され る。レプリコンは、２つの複製系を有するため、例えば、発現のための酵母中で 、ならびにクローニングおよび増幅のための原核宿主中に維持される。このよう な酵母−バクテリアンヤトルヘクターの例としては、ＹＥｐ２４が含まれる　Ｉ Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、（１９７９）　Ｇｅｎｅ　ｉ：１７−２４］　、ｐｃｉ／ Ｉ　ＥＢｒａｋｅら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　 ＵＳＡ　８１：４６４２−４６４６］　、およびＹＲｐ１７　［Ｓｔｉｎｃｈｃ ｏｍｂら、（１９１１１２）　Ｊ、１４ｏ１．　Ｂｉｏｌ、１５８：１５７〕。

さらに、レプリコンは、コピー数の多いまたは少ないプラスミドであり得る。コ ピー数の多いプラスミドは、一般に、約５から約２００の範囲のコピー数を有し 、典型的には約１０から約１５０の範囲である。コピー数の多いプラスミドを含 む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、さらに好ましくは少な（とも２０個 のプラスミドを含み得る。ベクターおよび外来タンパク質の宿主に対する影響に 応じて、コピー数の多いまたはコピー数の少ないベクターが選択され得る。例え ば、Ｂｒａｋｅら、上記を参照のこと。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組込まれる。組 込みベクターは、通常、ベクターを組込む酵母染色体に相同な少なくとも１つの 配列を含み、好ましくは、発現構築物の両側にある２つの相同な配列を含む。組 込みは、ベクター中の相同なりＮＡと、酵母染色体との組換えから生じるようで ある［０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、＜１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｖｍｏｌ、　ｌｏｔ：２２ｇ−２４５］　。組込みベクターは、ベクターに含ま れるのに適切な相同配列を選択することによって、酵母中の特定の遺伝子座に方 向づけられ得る。０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、上記を参照のこと。１つまたはそれ 以上の発現構築物が組込み得、生産された組換えタンパク質のレベルに影響し得 る［Ｒ４ｎｅら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８０：６７５０］。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中 の単一セグメントとして存在し、ベクター全体を組込むか、または染色体中の隣 接するセグメントに相同で、ベクター中の発現構築物の前側に存在する２つのセ グメントとして存在し、発現構築物のみを安定して組込み得る。

通常、染色体外構築物および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株を選択 できるように、選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、ＡＤＨ２、 口、匡販、１１およびＡｌＯ２のような、酵母宿主中で発現され得る生合成遺伝 子、および酵母細胞中に、ツニカマインンおよび０４１８耐性を供与するＧ４１ ８耐性遺伝子をそれぞれ含み得る。さらに、適切な選択可能マーカーはまた、酵 母に、金属のような毒性化合物の存在下で増殖する能力を与える。例えば、二の 存在により、酵母は、銅イオンの存在下で増殖する［３ｕｔｔら、（１９８７） 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｖ、’５１：３５１］。

あるいは、上記の成分のいくつかは、組合されて形質転換ベクターになり得る。

上記のように、形質転換ベクターは、通常、レプリコンに保持されるか、または 組込みベクターに組込まれる選択可能マーカーを含む。

細胞外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクターが 、多くの酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特 に以下の酵母について開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　 ［Ｋｕｒｔｚら、＜１９８６）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ’ｏ１．　６：１４２ ］　、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ　［Ｋｕｎｚｅら、９１９８５）　Ｊ、 　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１４１Ｅ　、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ 　凹旦二皿吐Ｌ　［Ｇｌｅｅｓｏｎら、（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ’ｃｒｏ ｂｉｏ１．　ｔ３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、（１９８６）　Ｍ ａｔ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２：３０２］　、１ユだ二二二凹　ＬＬ１１工 上ｉｓ［Ｄａｓら、（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５８：１１ ６５コ　、Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　［Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎ ｃｏｕｒｔら、（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４ニア３７；　Ｖ ａｎ　Ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら、（１９９０）　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ「ｉ：１ ３５］　、Ｐｉｃｈｉａ　Ｌ！！工１１ｅｒｉｍｏｎｄｉユ［Ｋｕｎｚｅら、（ １９８５）　Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５°１４１］　、Ｐｉｃ ｈｉａ　ト工匹Ｌ」［Ｃｒｅｇｇら、（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、　５：３３７６；米国特許第４．８３７．１４８号および東４．９２９ ．５５５号］　、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　［Ｈｉ ｎｎｅｎら、（１９７ｇ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 ７５：　１９２９；　Ｉｔｏら、（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１ ５３＋１６３コ　、　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　２９」すλ旦 ［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０６ ］　、およびｙａｒｒｏｗｉａ　■ｚ江■±！［Ｄａｖｉｄｏｗら、＜１９８５ ）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、ｌｏ：３８０４７１　Ｇａ１１１ａｒｄｉｎら、（ １９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１０：４９］。

外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、 通常、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理した無傷の酵母細胞の形 質転換を含む。形質転換手法は、通常、形質転換される酵母種に応じて変わる。

例えば、　［Ｋｕｒｔｚら、（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 ６：１４２：　Ｋｕｎｚｅら、９１９８５）　Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｅｒｏｂ ｉｏｌ、　２５：１４ｂ　Ｃａｎｄｉｄａ］　；　［Ｇｌｅｅｓ。

ｎら、９１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ　１３２：３４５９；　 Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０ ２：３０２；　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ］　；　［Ｄａｓら、（１９８４）　Ｊ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、＜ １９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４：１１６５；　Ｖａｎ　ｄｅｎ　 Ｂｅｒｇら、（１９９０）　Ｌツユｅｃｈｎｏｌ旦Ｕ　ｊｊ：、１３５；　Ｋｌ ｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ］　：　［Ｃｒｅｇｇら、（１９８５）　Ｍ。

１、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５：３３７６：　Ｋｕｎｚｅら、（１９８５）　Ｊ 、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂ−Ｌ■：１４１：米国特許第４．８３７．１４８号 および第４．９２９．５５５号；Ｐｉｅｈｉａ］　；　［Ｈｉｎｎｅｎら、（１ ９７８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　、ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５；１９２９；　 ｌｔｏら、（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３：１６３５ａｃｃｈ ａｒ規匹旦］　；　［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ　（＋９８１）　Ｎａｔｕｒ ｅ　３００ニア０５：　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ３　；　ＩＤ ａｖｉｄｏｗら、（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ穴］ｊ」［じ二１］鈴り ま 本発明の抗原および遺伝子物質を含む組成物は、診断ア。

セイにおいて使用され得る。得られる生物学的に有用な情報のうちの１つに、過 剰な結合タンパク質のレベルがあり、これは、腫瘍の存在による。そのため、Ｉ ＣＦまたはＩＧＦＢＰ結合タンパク質のうちの１つの産生が増加している（なぜ なら、結合タンパク質は、過剰なＩＧＦの存在下で生産されるから）。さらに、 多数の公知の疾５缶は、ＩＧＦの濃度と関連し得る。例えば、いくつかのタイプ のオステオポローシスは、ＩＧＦレベルと関連している。さらに、結合タンパク 質は、組換えによって生産されたＩＣＦ類の同定、生産および精製に使用され得 る。ＩＧＦＢＰ−５の存在を検出する方法には、血液試料、髄液、または膿瘍も しくは骨組織のような生物学試料を分析することが含まれる。

通常、本発明の結合タンパク質のような分析物を検出する方法は、免疫アッセイ に基ついている。このような技術は公知であり、ここで詳細を述へる必要はない 。例としては、異種および同種免疫アッセイ技術が含まれる。この技術は両方と も、結合タンパク質とそれに対応する特異的抗体との間に免疫複合体を形成する ことに基づいている。ＩＧＦＢＰ−５の異種アッセイでは、通常、固体表面に結 合した特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する。サンド ライ。

チアノセイは、次第にボピニラーとなってきている。固相の非存在下の溶液中で 行われる同種アッセイもまた、使用され得る。これは、例えば、遊離抗体を酵素 −抗原結合体に結合することによってもたらされる酵素活性の相違を決定するこ とによる。多数の適切なアッセイは、米国特許第３．８１７．８３７号、第４． ００６．３６０号、および第３．９９６．３４５号に記載されている。

上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質物質を、高分子ビーズ、デ ィノプスティノク、またはフィルター物質のような固体支持体物質に付着させる 公知の技術によって調製される。これらの付着方法は、一般に、タンパク質を支 持体に非特異的に吸着させること、またはタンパク質を、通常、ｉｌ！ｌ子離ン 基を解して、活性カルボ牛シル基、ヒドロキシル基またはアルデヒド基のような 固体支持体上の化学的に反応性の基に共有結合させることを含む。

同種アッセイとして知られている第二の診断形態において、分析物に結合する抗 体は、培地中で直接検出され得る反応培地にいくつかの変化をもたらす。これま で提案された公知の一般的なタイプの同種アッセイは、以下のものを含む：（ａ ）スピン標識されたリポータ−であって、抗原に結合する抗体が、リポートされ た可動性の変化（スピン分割ピークが広がること）によって検出される、リボ− ター：（ｂ）結合か蛍光効力の変化によって検出される、蛍光リポータ−；（Ｃ ）抗体結合が、酵素／基質相互反応に影響を与える、酵素リポータ−；および（ ｄ）結合によりリポソームが溶解し、カプセル化されたリポータ−が放出される 、リボノーム結合すポーター０本発明のタンパク質抗原に対するこれらの方法の 適用は、同種アッセイ試薬を調製するための従来の方法に従う。

（以下余白） 伝　プローブを　用しての診断　の応 本発明の遺伝子物質は、それ自身、天然の物質中に存在する遺伝子物質に対する プローブとして多くのアッセイに使用され得る。分析物は、（通常）少なくとも 約１６個の連続ヌクレオチド、通常は３０から２００のヌクレオチド、最高は上 記に示す配列（ｃＤＮＡ配列）の実質的に全長の配列を含むプローブにハイブリ ダイズするヌクレオチド配列であり得る。分析物はＲＮＡもしくはｃＤＮＡであ り得る。試料は、典型的には前の章に記載の通りである。陽性の結果は一般的に は、明細書に記載の配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの配列と少な（ とも約７０％相同である配列、通常は、配列中の少なくとも約６０の連続ヌクレ オチドと少なくとも約８０％相同である配列を含む遺伝子物質を同定することと して特徴づけられる。そして実質的には、全長配列に相同である配列を含み得る 。分析物を検出するために、分析物がプローブにハイブリダイズする場合には、 そのプローブは検出標識を含有し得る。特に、結合タンパク質を検出するのに有 用であるプローブは、これらのタンパク質の保存領域、特に、図２の括弧内に示 すＢＦ２のアミノ酸ＰＮＣＤおよびアミノ酸ｃｗｃｖからの保′＃領域に基つく 。これらのアミノ酸は、関連のＩＧＦ結合タンパク質のすへてに高度に保存され ている。ＩＧＦＢＰ−１のみが異なり、１９１位のＤがＮである。

標的核酸の増幅のための１つの方法である、ハイブリダイゼ−７コンアノセイに よる後の分析のための方法は、ポリメラーゼチェーン　リアクンヨンすなわちＰ ＣＲ法として知られている。ＰＣＲ法は、疑わしい試料中で本発明のＩＧＦＢＰ −５を検出するために適用され得る。この中で、互いに間隔を隔てた、明細書に おける前述の遺伝子配列に基つくオリコヌクレオチドプライマーを用いる。この プライマーは、２本蹟ＤＮＡ分子のそれぞれのストランドに相補的であり、典型 的には約５０から４５０　ｎｔもしくはそれを越えて（通常は２０００　ｎｔを 越えない）離れている。この方法には、特定のオリコヌクレオチドプライマーの 調製および次に標的ＤＮＡの変性の繰り返しサイクル、プライマー結合、および ＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって、プライマー間の間隔に基つく予測され る長さのＤＮＡフラグメントを得ること、が含まれる。１つのプライマーから生 成された伸長産物は、もう一方のプライマーのさらなる標的配列として作用する 。標的配列の増幅の程度は、実施されるサイクル数により制御され、簡単な式２ ｎにより理論的に夏出される。

（ここで、ｎはサイクル数である。）ｌサイクルあたりの平均効率が、約６５％ から８５％の範囲である場合には、２５サイクルで、標的配列の０３から４．８ 　Ｘ　１．０００，０００コピーが産生される。ＰＣＲ法は、５ａｉｋｉら、５ ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０：１３５０−１３５４：　５ａｉｋ＋ら、 Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３２４：１６３−１６６＋および５ｃｈａｒｆら 、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｂ＞　２３３：１０７６−１０７８を含む多くの文 献に記載されている。さらに、米国特許第４．６８３．１９４号、第４．６８３ ．１９５号および第４，６８３゜２０２号を参照のこと。

本発明は、ＩＧＦＢＰ−５をコードするＤＮＡフラグメントの選択的増幅に基つ く、ＩＧＦＢＰ−５を測定するための特異的な診断法を倉む。この方法は、図１ に示す配列から選択されたＤＮＡの２本鎖フラグメントのそれぞれのストランド の非相同領域由来の一対の１本鎖プライマーを使用する。本発明の１８面をなす これらの「ブライマーフラグメント」は、上記のよにＩＧＦＢＰ−５７ラグメン トから調製される。この方法では、上記に検討したように、米国特許第４．６８ ３．２０２号に開示されているとおり、選択された核酸配列を増幅するための方 法に従う。

ｉ△ム三二二二五盗 ＩＧＦＢＰ−５に対する抗体および抗イデイオタイプ抗体のインビボ使用、ナラ ひに診断への使用の両方には、モノクローナル抗体の使用が好ましい。モノクロ ーナル抗ウイルス粒子抗体あるいは抗イデイオタイプ抗体は、以下のように産生 され得る。免疫された動物から牌臓あるいは白血球を取り出し、当業者に公知の 方法により、不死化するかあるいは使用して、ハイブリドーマを調製する。ヒト −ヒトハイブリドーマを産生ずるために、ヒト白血球ドナーを選択する。エプス タイン・バールウィルス（ＥＢＶ）が、ヒト白血球の不死化に使用され得るか、 あるいはヒト融合パートナ−がヒト−ヒトハイブリドーマを産生ずるために使用 され得る。ペプチドによるインビトロ−次ＩＥもまた、ヒトモノクローナル抗体 の生成に使用すれ得る。不死化細胞により分泌された抗体は、所望の特異性を有 する抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーニングされる。

ＩＧＦＢＰ−５の　８・　に交・するア／セイイン／ユソン様成長因子に結合す る性質は、本発明のタンパク質の生物学的性質の１つである。これらのタンパク 質は、好都合にＩＧＦ−１を使用した結合アッセイ［Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ 、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、（ １９７８）　２５３２７５９］あるいは、ＩＧＦ−１１を使用した、好ましくは 、襟識化、例えばヨウ素化形態でのＩＧＦ−１１を使用した結合アッセイ［Ｒｉ ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　ＦＥＢＳ　 （１９７８）　８９：２８３］で試験され得る。

例えば、このようなアッセイは、都合よく、本発明のタンパク質のゲル電気泳動 （５ＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施し、後にゲルのウェスタッフロノドを実施し、次に Ｃ１２５１］　［ＣＦ−ｆもしくは［＋の存在下にその）゛ロットをインキニヘ ートして、そのフ′ロットを洗浄して遊離のＩＧＦ−１もしくは−ＩＩを除き、 そのプロットの放射活性を検出することを含み得る。

匹」旦笠豆 本発明のＩＧＦ−ＢＰ類はもとは、ヒトｌ０Ｆ−ＢＰ類を意味し、哺乳動物、例 えば、ネズミ、ブタ、ウマもしくはウソのｌ０Ｆ−ＢＰ類が、必要とされる程度 に相同性を有する限りＩＧＦ−ＢＰ類の定義内に含まれる。

本発明のｆＧＦ−ＢＰ類には、組織抽出物あるいは馴化培養培地からの精製物、 ならひに組み換え法により得られるものが含まれる。

匹旦旺５己ソ引盈 本発明の結合タンパク質の治療上の応用には、単独治療剤としての使用、ＩＧＦ との組み合わせによる使用か含まれ、後者が好ましい。

ＩＧＦとの組み合わせによる使用の場合は、本発明の結合タンパク質は、上記の 表示のような使用、おもに、成長誘導剤、組繊再生剤、もしくは傷冶疹剤として の使用に適している。

従って、本発明は以下の（１）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）あるいは（ｉｖ）を提供 する。

（ｉ）被験体の成長、組織あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を促進するため の、ｉｉ離あるいは固定化されたＩＧＦとの組み合わせでの、本発明の結合タン パク質の使用；あるいは、 （百）、ＶＬ験体の成長、被験体の組織あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を 促進する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の ＩＧＦとともに、本発明の結合タンパク質の治療上有効な量を投与することを包 含する、方法；あるいは （ｉｉｉ）被験体の成長、組織あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を促進する 薬学的組成物であって、本発明の結合タンパク質を、ＩＣＦおよび薬学的に受容 可能な牛ヤソアあるいは希釈剤とともに含有する、組成物：あるいは（ｉＶ）混 合もしくは付随投与についての説明書とともに、本発明の結合タンパク質とＩＣ Ｆとを使用まで分離した形態で含有する、バノケイン。

ＩＧＦに関連して、本発明の結合タンパク質は軟骨形成あるいは造血機能を媒介 する特に興味深いものである。このことは、以下のＡからＣの試験によって示さ れ得る。

Ａ）　ＩＧＦは、例えば、胎児う、ト頭蓋冠中のコラーゲンおよび非コラーゲン タンパク質への［３Ｈ］−プロリンの取り込みの増加によって示されるように、 骨の形成を増大させる。ＩＧＦか、本発明の結合タンパク質の存在下に使用され ると、相乗効果を生じる。う、ト頭Ｍ冠の組織培養物は、２１日齢の胎児う、ト から何頭および後頭部の骨を解剖し、来状縫合にそって分割して、Ｋｒｅａｍら の方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　（１９８５）　１１６：２９６）に従っ て培養することにより調製する。結合タンパク質あるいはＩＧＦを、培養物１ｍ ｌあたり１０から２００　ｎｇの用量範囲で添加する。それらを組み合わせて添 加する場合には、モル比は１：１である。培養は、２４から４８時間行われる。

コラゲナーゼ消化タンパク質および非コラ−ケンタンパク質への［３Ｈ〕プロリ ンの取り込みを定量するために、骨をホモジネートしたものをＳＤｉｅｇｅｌｍ ａｎ　ＲおよびＰｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ　（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、（１９７２） ２８：４４３）の方法、およびｋｒｅａｍら、（ＥｎｄｏｃｒＩｎｏｒｏｇｙ　 （１９８５）１１６：２９６）の変法に従って、細菌性コラゲナーゼで消化する 。

Ｂ）　ＩＧＦは、骨からの［４５］Ｃａの放出か減少することによって示される ように、骨吸収を減少させる。ＩＧＦが本発明の結合タンパク質の存在下に使用 されると相乗効果が生じる。この試験は、Ｒａ１ｓｚの原理（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、（１９６５）　４４：１０３）に従って行われる。妊娠ラットに 、妊娠１８日目に［４５］Ｃａを皮下注射する。ＩＣＦを、単独であるいは本発 明の結合タンパク質の存在下で、１匹あたり１０　ｎｇから２（１０ｎｇの投与 Ｉで注射する。

結合タンパク質は、ＩＣＦに対するモル比が１：１になるように加える。１９日 目に、その動物を殺し、胎児を取り出す。とぅ骨および尺骨の鉱質強化幹を解剖 で取り出し、培養に移す。

骨移植物からの［４５］Ｃａの放出に基づいて、吸収を定量する。

Ｃ〉本発明のＩＧＦ−結合タンパク質および他のＩＧＦ−結合タンパク質は、Ｉ ＧＦ−１のエリトクボエチン様効果を増す。このことは、特に以下のものをＦａ ｇｇ、　Ｂ、　Ｒｏｉｔｓｃｈ、　Ｃ，Ａ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（ １９８６）　１２６：ｌに記載のＣＦＵ−Ｅアッセイで試験することにより確か められ得る。つまり、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、ＩＣＦ単独ならび に、図１もしくは２の成熟ＩＧＦ結合結合タンパ上質組み合わせ、例えば、図１ の成熟ＩＧＦ結合結合タンパ上質現するＣ）１０細胞株培養物白来の上清の５０ μｌとの組み合わせを調べる。ＩＧＦ結合結合タンパ単質単独られた結果は、コ ントロールと有意な差はないが、一方、ＩＣＦ−１単独と比較して組み合わせの 相乗効果はみられる。

さらに、本発明の結合タンパク質と組み合わせたＩＧＦの分裂促進活性は、以下 のように試験され得る。ＣＣＬ　３９細胞（チャイニースハムスター肺線維芽細 胞）への［３Ｈ１メチルチミジンの取り込みを、Ｐｌｏｕｅｔら、Ｃｅ１１．　 Ｍｉｏｌ、（１９８４＞　３０：１０５の記載に従って測定する。このアッセイ では、細胞株ＣＣＩ　３９を、１０％胎児ウン血清、０．１％ベニノリン、０． ４％ストレブチマイシンおよび０．５％ファンギゾンを含有するＭＥＭ培養培地 （Ｇｉｂｃｏ）　０．５１１１１中に、ウェルあたり４０．０００細胞を播種す る。５％ｃｏ２雰囲気下で、３７℃でのイン牛ユベー７−１ンを７２時間を行っ た後、細胞を、胎児ウシ血清を含まないＭＥＭ培地で洗浄し、２０時間この培地 中で培養した。この段階で、細胞培養を集密的にし、ＩＧＦあるいは結合タンパ ク質、もしくはその両方ともを、培養培地に１０　ｎｇから２００１ｇの用量範 囲で各々を混入させる。両方ともを加える場合のモル比は、■＝１であるべきで ある。この試験試料を３７°Ｃで２４時間インキュベートし、次に１０μＩ　Ｐ ＢＳ中の１μＣ１［３旧メチルチミジンとともに加える。４時間インキコベート した後、メチルチミジノの取り込みを、細胞をＰＢＳで洗浄して停止する。細胞 を０．５ｍｌト’Ｊクロロ酢酸（５％）で３０分間固定し、水で洗浄して、最後 に０．Ｓｍｌ　ＮａＯＨ０，ＩＭで、２時間３７℃に保って溶解し、溶解物のＯ ，Ｓｍｌをシンチレーシコンフラスコに移し、モしてβ−放射活性を測定するた めに３ｍｌのシンチレーシせン液と混合する。結合タンパク質は、ＩＧＦのマイ トジェン活性を高める。しかし、結合タンパク質が単独で使用された場合に測定 される放射活性レベルは、実質的にコントロール試料のレベルと相違がない。

さらに詳細には、本発明の結合タンパク質は、ＩＧＦとの組み合わせによって以 下のことに有用である。ａ）下垂体機能減退症、Ｌａｒｏｎタイプ小人症、骨粗 しよう症、貧血、特に合併症をともなう慢性腎不全症、および肝不全あるいは腎 不全を治療するために、ならびにｂ）ｆｉ！および火傷のような傷、あるいは事 故により生じた傷もしくは手術の結果による傷の治癒を促進するために、有用で ある。

本発明の結合タンパク質に関連する使用のために、ＩＧＦは、Ｒｉｎｄｅｒｋｎ ｅｃｈｔ、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　（１９７８＞　２５３：２７６９に記載のＩＧＦ−１，Ｒｉｎｄｅｒｋ ｎｅｃｈｊ、　Ｅ、およびＨｕａ＋ｂｅ１、　Ｒ，Ｅ、、　ＦＥＢＳ　（１９７ ８）　８９：２８３１こＳ己載のＩＧＦ−１１，およびインシュリン様成長°因 子活性を有する、ＩＧＦ−１ならびにＩＧＦ−１１の誘導体およびフラグメント から選択されるのが好ましい。ＩＧＦ−１１が最も好ましい。

ＩＧＦに関連する使用のために、本発明の結合タンパク質は、図１に示すブレＩ ＧＦ−ＢＰもしくはＩＧＦ−ＢＰと、８５％から１００％相同性があるタンパク 質が好ましい。

ＩＧＦに関連しない場合は、本発明の結合タンパク質は、遊離ＩＧＦｓａの過剰 産生による任意の生理学的異常、例えば、乳癌もしくは腎臓癌のようなＩＣＦ産 生癌、糖尿病性増殖網膜症、もしくは、遊離１ＧＦの血清レベルが高い異常成長 の高身長児に、さらに治療上の応用を有する。

従って、本発明はさらに、以下の（ｉ）、（１１）、（ｉｉｉ）あるいは（ｉｖ ）を提供する。

（ｉ）人体などの哺乳動物による、遊離ＩＧＦの過剰産生の結果による生理学的 異常、例えば、ＩＧＦ産生癌、糖尿病性網膜症もしくは高身長被験体の異常成長 を治療するための、本発明の結合タンパク質の使用；あるいは（百）遊離ＩＧＦ の過剰産生の結果による生理学的異常、例えば、ＩＧＦ産生癌、糖尿病性網膜症 もしくは被験体の異常成長を治療するための方法であって、本発明の結合タンパ ク質の治療上有効な量を、このような治療を必要とする被験体に投与することを 包含する、方法；ある（＼（ｉ（ｉｉｉ）遊離ＩＧＦの過剰産生の結果による生 理学的異常、例えば、ＩＧＦ産生癌、糖尿病性網膜症もしくは被験体の異常成長 を治療するための方法であって、本発明の結合タン、Ｎ＋り質を薬学的に受容可 能なキャリアあるし１は希釈剤ととも（こ含宵する、組成物；あるいは （１ｖ）生物学的試験を行うことにより示されるような、ＩＧＦＢＰ−５の異な る結合能に基つく、特定の器官ある（Ｘ（よ組織；こＩＧＦを送達する方法。

図１に示すプレーＩＧＦ−ＢＰもしくはｌ　ＣＦ−ＢＰの変異形態のフラグメン トは、人体における遊離ＩＧＦの過剰産生の結果（こよる生理学的異常を治療す るために、特に価値のあるものである。

本発明の結合タン／ぐり質は、単独もしくはＩＧＦと組み合わせて、ペプチドに 適した任意の都合のよ−１経路で、すなわち、特に腸の経路には、例えば、錠剤 あるＬＮｔよりブセルの形態で、そして、皮下あるいは静脈内経路では、例え（ ｆ、注入用注射剤の５呼で投与され得る。さら（こ、それ（よ局所（こ使用され マ尋て、例えば、傷治癒剤のような使用には、軟膏ある−）（よ５１間液の形管 で使用され得る。

上記に示されたすべての適切な投与量は、例え（ズ、治療されるへき障害の性質 ならびに重篤さ、および投与汗三態１こ依存して変化する。例えば、骨粗しよう 症ある１、Ｎま貧血の治療では、本発明の結合夕／〕望り賞の毎日の投与量（ま 、約０１μｇ／ｋｇ体重から４０μｇ／’ｋｇ体重、好ましくは、約０５μｇ　 、”　ｋ　ｇ体重から約２０μｇ／ｋｇ体重の範囲で、満足な結果が得られ得る 。例えばヒトのような比較的大きな哺乳動物では、示されたように毎Ｂの投与量 は、例えば１日に一度とすると、約５μｇが好都合に腸に投与される。傷冶痔に は、傷面積ｃｍ２あたりに対して、本発明のタンパク質の０１から１０μｇか毎 日の投与量として、例えばヒトのような比較的大きな哺乳動物において、適切に 示される。これは１日に一度、好都合に投与される。ＩＧＦと組み合わせて使用 される場合には、結合タンパク質とＩＧＦのモル比は、好ましくは０．１：１か ら５＝１であり、より好ましくは０．５：ｌから２：１であり、最も好ましくは １：１である。

本発明の薬学的組成物は、従来の手法で生産され得る。

本発明の結合タンパク質の他の使用には、組み換え技術によるＩＧＦ分子の生産 においての種々の使用が含まれる。本発明の結合タンパク質は、天然（活性）コ ンホメーシヨン（この反対は不活性型）である酵母産生ＩＧＦを検出するために 使用され得る。さらに、本発明のタンパク質は、ＩＣＦの生産においてのキャリ ア（おそらくは同時発現されたタンパク質の形態）として使用され得る。結合タ ンパク質がインビボにおいてＩＧＦを固定化するので、インビトロにおいても同 様に固定化することか予測される。結合タンパク質はまた、固相表面に結合させ て（アフィニティークロマトグラフィーなど）酵母で産生されたＩＧＦを精製す るために使用され得る。

本発明は、特定の実施態様、方法、構成、および使用を参考として記載している か、本発明から逸脱することなく、種々の変形ならびに改変がなされ得ることは 、当業者にとって明白である。

亥１！しよ セファロース−ＩＧＦ−１アフィニティ一カラム６０ａ＋ｇの組み換えヒトＩＧ Ｆ　Ｉ　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ　ＡＧ、　Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎ ｄ）を、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含有する２０ｍ１の０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ ３、ｐＨ８，３に溶解し、ＣＮＢｒ活性化セファロース４８　（４ｇの乾燥ゲル ）に、販売元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｐ ｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）のプロトコルに従って力、ブリングした。そのゲル を、１．５Ｘ　１５　ａｍのガラスカラム（ゲルベト容積は１５ｍ１）中で、５ ００　ｍｌの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１０．５　Ｍ　ＮａＣｌ５ｐＨ ６，５で平衡化した。

７ＩＧＦＢＰ順の　製 この方法は、Ｍａｒ　ｔ　ｉ　ｎおよびＢａｘｔｅｒ（１８，１９）の変法に従 って行った。実施例中の括弧内の参考文献は、本明細書の関連文献の章に番号を つけて挙げている参考文献をさす。過日採取した、クエン酸塩添加ヒト血漿のＩ Ｌを、トロンビンーカルシウム５０　Ｕ（ｌ　ｍｌ）と室温で２時間攪拌し、チ ーズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）で濾過し、酸性化した。解離させたＩＧ ＦをＳＰ−セフアゾ７クス　Ｃ−２５で取り出した。次にｐＨを６５に調整し、 沈澱を２０．０００　ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。上清を、上記の ように３４ｍ１／分の流速でセファロース−ＩＧＦアフィニティーカラムにポン プで送り、そのカラムを、５００　ｍｌの０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 ／′０．５　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ６，５で洗浄した。結合タンパク質（すなわち 、ＩＧＦＢＰ）を０．５Ｍ酢酸４０　ｍｌで溶出し、２Ｌの０．１Ｍ酢酸アンモ ニウムを外液として３回透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物（４０ｍｇ） を２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する、４ｍｌのＯ，１Ｍへブタフルオ ロブチリック酸に溶解し、不溶物を１０．０００で１０分間遠心分離して除去し た。透明の上清をＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ１Ｂカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａ ｇｅｌ、　Ｄ　ｒｅｎ。

ＦＲＧ）のＨＰＬＣ（各２ｍｌで２回）にかけた（１９）０溶出画分を５ｐｅｅ ｄ−Ｖａｃ　（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　）Ｉｉｃｋｓｖｉｌ ｌｅ、　ＮＹ）で乾燥し、ｌ　ｍｌの０．０１Ｍ酢酸中に取り出し、再度乾燥し た。得られた物質を、リガンドブロフト分析（下記を参照のこと）および銀染色 用に、２５０μｌ　Ｈ２Ｏに溶解したく２０）。

１２５Ｉ−ＩＧＦリガンドプロット　析Ｈａｓ　ｓｅｎ　１ｏｐｐら（２１）の 方法を少し改変して使用した（６．１９）。

ＨＰＬＣ溶出画分の５μｌを、非還元条件下で１５％ＳＤＳポリアクリルアミド スラブゲルで電気泳動にかけた。１４Ｃ−標識の分子量マーカー（Ｒａｉｎｂｏ ｗ　Ｍａｒｋｅｒ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＵＫ）を還元したＯゲルをニトロセ ルロース膜にトランスプロットし、記載のように処理した（２１）。膜を、シー ルされたプラステイノクバ／グ内で、室温で６時間、３　ｘ　１０’　ｃｐｍ　 １２５Ｉ−標識ＩＧＦＩＩとインキユベートした（２２）。数回洗浄の後、空気 乾燥した膜を一７０°Ｃで１２−４８時間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴＩＣカセ ット（Ｅａｓｔｍａｎ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）中でＸ線フィルム（Ｋ ｏｄａｋ、　Ｘ−ＯＭＡＴ、　ＡＲ）に曝した。

全てのバンドが”１−ＩＧＦ　＋で検出されるわけではないので、１２’Ｉ−Ｉ ＧＦ　Ｉ＋をスクリーンング用のトレーサーとして選択した（結果を参照のこと ）。

ポリビニリデンンフルオライド（Ｉｍｍｏｂｉ　ｌ　１ｏｎ）　でのエレクトロ ブロッティング ｌＯから３０μｇのＨＰＬＣ精１１ＧＦＢＰを、上記のように（ポリアクリルア ミドスラブケル　１５　Ｘ　１５　Ｘ　０．１５　ｃｍ）還元条件下で電気泳動 にかけ、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　（２３）の記載のように、［ｍｍｏｂｉｌ。

ｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）にエレク トロブａ　ノティングした（０．８Ａで２時間）。膜を０．１％クマノーフルー Ｒ−２５０の５０％メタノール溶液で５秒間染色し、５０％メタノール／１０％ 酢酸中で、室温で５分間脱色し、そして十分にＨ２Ｏですすいだ。

膜を空気乾燥し、タンパク質のバンドを切り出し、−２０°Ｃで保存した。

アミノ酸分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０ Ａタンパク質ンークエンサー（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）を使用して、目 動エドマン分解（２５）により実施した。

組織およびＲＮＡの単離 ヒト骨肉腫組織を、Ｄｒ、　Ｍａｒｓｈａｌｌ　Ｕｒｉｓｔ、　ＵＣＬＡから得 た。

全ＲＮＡをグアニノウムチオシア不−ト法（２７）により単離した。

０ｓｔｅｒｉｚｅｒを使用して組織をホモジナイズし、ポリ（Ａ）　”ＲＮＡヲ オリコ（ｄＴ）セルロースによる単分画（２９）により精製シオリコヌクレオチ ドアダプター、プローブ、ならびに配列決定用およびＰＣＲ用ブラプライマーＡ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、　ＣＡ）モ デル３８０Ａ合成機を用いて、ホスホルアミダイト法により合成し、ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により精製し、そして５ＥＰ−ＰＡＫ　Ｃ，８カートリッ ジ（Ｗａｔｅｒｓ：　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）で脱塩した。

１４−ｍａｒオリゴヌクレオチド（５’　ＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＧ　３° ）および１８−ｍａｒオリコヌクレオチド（５’　ＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＴＣＴ ＡＣＡＧＧ　３°）を合成し、λＺＡＰに構築されたヒト骨肉腫ｃＤＮＡライブ ラリーに対するＥｃｏＲ１アタブターとして使用した。この１４−ｍａｒをリン 酸化（３０）　Ｌ、直ちに、９５℃で１５分間加熱して、ポリヌクレオチドキナ ーゼを不活性化した。アダプターは、さらに内部Ｂｇｌ　Ｉ＋を含有し、ｃ　Ｄ ＮＡライブラリーの構築について記載されている下記の章でさらに詳細に記載す る。

ＢＦ２に対する２つのＰＣＲプライマーは；　（１）４８種の２６−ｍａｒの混 合物［５°ＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＣＸＡＴ （Ａ／Ｔ／Ｃ）ＣＡ　３’ｌからなる「センス」プライマー、および（２）６４ 種の２６−ｍａｒ混合物［５’　ＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣ（Ｔ／Ｃ）Ａ（ Ｇ／Ａ）（Ｔ／Ｃ）ＴＴＸＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ３’コからなる「アンチセンス」 プライマーであり、ここでＸは４種の全部のデオキシヌクレオチドである。Ｅｃ ｏ　Ｒ１部位は、プライマー中に含まれていて、Ｍ１３シークエンスベクターに サブクローニングされる。　ＲＰ５ブローフ゛は、２０−ｍｅｒ　（５°ＴＣＧ ＧＡＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧ　３゛）および７−ｍｅｒ　（５’　ＣＡ ＣＴＧＣＣ３’）のプライマーからなる。

針Σ【刀二２工せ１嗅 ＰＣＲ反応をＰＣＲキットの販売元（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ） の指示に従って、上記のＰＣＲプライマー（オリゴヌクレオチド合成の章を参照 のこと）を使用して、最終濃度８μＭで行った。鋳型ｃＤＮＡを、２．５μｇの ヒト骨肉腫（ＯｓＬ２）ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡの合成 条件は、第一ストランドｃＤＮＡ合成（ｃＤＮＡライブラリーの構築を参照のこ と）について下記に示す条件と同じであった。ｃＤＮＡをＢｉｏｇｅｌ　Ａ−１ ５ｍで分画し、エタノール沈降により回収し、そして１００μｍの滅菌水に再度 ！Ｕ！！濁させた。２．５から５μＩのｃＤＮＡ鋳型を各ＰＣＲ反応に使用した 。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーモサイクラ−て、ＰＣＲ を３５サイクル実施した。最初の１０サイクルは、９４°Ｃ，１分間の変性工程 ；４０°Ｃ１１分間のアニーリング工程；および４０°Ｃ，１分間の伸長工程か らなる。次の２５サイクルは、９４℃、１分間の変性工程；５５℃、１分間のア ニーリング工程；および７２℃、１分間の伸長工程からなる。最終サイクルでの 最後の伸長工程は、７分間であった。試料を、フェノール５／クロロホルム／Ｉ ＡＡ　（１：ｌ：０．０４）で１回抽出し、クロロホルム／′ＩＡＡ　（２４： 　ｌ）で１回抽出し、エタノール沈降で回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、そして７ ％アクリルアミド、１　ｘ　ＴＢＥゲルでの電気泳動（３０）により分画した。

４Ｏ−７０ｂ、　ｐ間のＤＮＡの移動部分をゲルから切り出し、Ｅｌｕｔｉｐ− ｄカラムに通過させて精製し、Ｅｃｏ−Ｒｌ切断したｍ１３　ｍｏ１８に連結し 、そしてＤＨ５αＦ°にＤ）ＪＡ配列分析のために導入した。

ｃＤＮＡライブラリーの　築 第−ストランドｃＤＮＡを、記載（３３）のように、ヒト骨肉腫（Ｏｓｔ３）ポ ’）　（Ａ）　”　ＲＮＡから合成したか、しかし、下記の改変を行って実施し た：１０μｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡを２０μｍの５ａ＋Ｍトリスー塩酸（ｐ Ｈ７，５）中で、６５°Ｃで３分間加熱し、直ちに、水上に１分間置き、次に、 ５０ｍＭトリス−塩酸（４２°ＣでｐＨ８，３）、８　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．３０ 　ｍＭ　ＫＣＩ、ｌｏｍＭ／チオトレイトール、各２　ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＧ ＴＰ、　ｄＴＴＰおよび［ａ　−３２］ｄＣＴＰ　（３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ） 、６０　Ｕ　ＲＮａｓｉｎ、ならびに２．５ｕｇオリゴ（ｄＴ）　＋２−１８を 含有するヨウに（室温で）調整した。６０１Ｊのクローン化モロニー不ズミ白血 病ウィルス逆転写酵素を、ｃＤＮＡ合成を開始させるために加え（合計反応体積 は４０μｍ）、そして反応を４２℃で６０分間続けた。第二ｃＤＮＡストランド を合成し、記載（３４）のようにＥｃｏＲ１アダプター（オリゴヌクレオチド合 成の章を参照のこと）に連結した。ｄｓｃＤＮＡをリン酸化（３０）　Ｌ、、次 に、０．５　Ｍ　ＮａＣ１／２５　ｍＭ　ＥＤＴＡに調整して、７５℃で１５分 間加熱してポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。ｄｓｃＤＮＡを、Ｂｉｏ ｇｅｌ　Ａ−１５ｍでのクロマトグラフィーにより、連結されていないアダプタ ーから分離して１．エタノール沈降により回収した。ｄｓｃＤＮＡを、販売元の 記載に従って、ＥｃｏＲｌ−切断したλＺＡＰ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連 結したが、反応媒質中に１５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　８０００　 （Ｓｉｇｍａ）を含むように前述（３５）を改変して実施した。連結されたＤＮ Ａを遠心分離（１２，０００Ｘ　ｇ）により回収し、クロロホルムで洗浄し、乾 燥させて、４μｍのＨ２Ｏに再懸濁させ、販売元の指示に従って、インビトロパ ッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とインキｘへ−１−した。２．３ 　ｘ　１０”の個別の組み換えクローンのライブラリーを得た。組み換えファー ジをＥ、　ｃｏｌｉ　ＢＢ４　（Ｓｔｒａｊａｇｅｎｅ）で増殖させた。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング０ｓｔ３　ｃＤＮＡライブラリー由来の 約３００．０００個の組み換えファー／をＥ、　ｃｏｌｉ　ＢＢ４に植え（５０ ，０００フアー／／直径１３７　ｍｍプレート）、３７℃で５−６時間増Ｍさせ ｆこ。ファー／をニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　）ＩＡ ＴＦ　１３７）に移し、処理（３６）し、そしてＢＦ２あるいはＢＰ５プローブ てスクリーニングした。

ＢＰ４プローブは、Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−３２り］ＡＴＰ で標識しく２８）、比活性を１２　ｘ　１１０８ｃｐ／μｇとした。ＢＰ５プロ ーブを、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　（４２）に従って標識 した。フィルターを、５　Ｘ　５ＳＣ（Ｉ　ＳＳＣ＝　０．１５　Ｍ塩化ナトリ ウム１０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）　４０％ホルムアミド、５Ｘ デンハート溶液（ｌｘ　テ′ンノ・−ト溶ン夜＝０．０２％ポリビニルピロリド ン１０．０２％フィコール１０．０２％２％ランアルブミン）、１０％デキスト ラン硫酸、５０　ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，１ｍＭピロリン酸ナトリ ウム、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ，、および５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中 で、３７°Ｃてｌ−２時間、プレハイブリダイズさせた。標識プローブをａ度か １０’　ｃｐｍ／ｍｌになるように加え、ハイブリタイセーンヨンを、おだやか に振盪させながら３７℃で一夜続けた。フィルターを、６５°Ｃ１２ｘ　５ＣＣ １０，１％ＮａＤｏｄｓｏ、中で洗浄し、ＤｕＰｏｎｔ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　 Ｐｌｕｓ増感スクリーンを用いて、−８０°Ｃで一夜、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−２ フイルムに曝した。二重の／グナルを与えるプラーク部分を取り出し、再度植え 付け、再度スクリーニングし、純粋なプラークか得られるまで繰り返した。

ＢＦ２　ｃＤＮＡ挿入断片を含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）を、販 売元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が記載しているＭ１３レスキュー／切り出しのプ ロトコルにより、λＺＡＰから放出させた。プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解 法（３０）で単離した。挿入断片を、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ベクター からＢｇｌ　ＩＨ！！ｉ化により切り出し、アガロースゲル電気泳動により分画 した。挿入断片をゲルから切り出し、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５、ｌ　ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）中でおだやかに振盪しながら１２時間にわたっておだやか に抽出し、販売元（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）の記載の ようにｅｌｕｔｉｐ−Ｄにより精製して、Ｍ１３シークエンスヘクター（３７） にサフ゛クローニングした。ＤＮＡ配列決定を、Ｍ１３プライマーおよび特異的 な内部プライマーを用いて、チェインターミ不−ンヨン法（３８）により行った 。不明瞭な領域は、７−ジアザ−２−ブオキシグアニジンートリホスフエート（ ３９）および７−クエナーゼ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ）を使用して 分析した。

ｌｉ五１五旦皇丘 図１に示す遺伝子配列は、アメリカンタイプ力ルチャーコレク／ヨン（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されてい る。これらは、以下のように同定されている。

−Ｑ　曙Ｑ　−〇　”　Ｑ　−Ｏａｏ　＜　−１じ−Ｃ，ｌ　＋ｊ（Ｊ　ｌ−Ｉ Ｃ：）　−Ｑ　ｌｅ　ｋ−−Ｑ　（５←＜ｏ　＜ｏ　＜ｏ　ロロ　＞ｏ　＜ロ　 〉口ＦＩＧ、　１Ｇ ２二〇 ＣＴＣＡＧＣＧＴＣＣＣｙτＧＣτＡＣＴＣＣτＧＴＧＣＴＣτＧＧＡＧＧＣＴ Ｃ；ＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧτ０ＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧ ＧＣＴ？ＣＣＴＧＧＣ；ＴＣＣＴＧ）τＣ００τ人ｃｃＯ：人ＴττＧＴＧＧＴ ＣＡＣＡＧＣＣ人ＴＣ，人ＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＡＴｃＡＡＣＣＴＡＴＣＣττ ＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣ；、：ＴＣにτＧτＡＧＣτＣＴＧＣＣτＣＣＣＴＣＴＣ ＣＡＴＡＴＣτＯ０τ′：ＣＣＣ：ＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣ？Ｃ０’ニーＣＡＣＡ Ｃ：τＯここτＡＣτ００００τＧＧＧＣＡ？ＣＴ’ＴＣ’：ＧＧbτ ＴＧＡＣＴＧＳ）ＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣττＡＧＧＡＡＣ０τＡＣＣλＧττ にＧＣＣλＴＣＡＴＧＴＣττ：τ０：τＣττττ？０７τττττττλ人 ＣＡＡＡＡＣＣＣτＧτ人Ｇ人τ０τＣＣＧＡＡＴτ０蛭鉄鉢与ｌハＪ　−２７ ９３８，６１ ８＼゛りのタノｆ＼°フ１１１−乍１万ドぜケＮ　Ｚ５’１７も　’Ｔｆ−Ｗｌ 　Ｃｒ　ＬａＪｉｕ−ロー　−の騙ｅ＞　（４５ψａ：１（（＋＞　ｌ　Ｉ　ｌ 　ｃｃｃｒｔｘｃ−ｘ　＋（＜％ｃ／１国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ１２Ｎ　１／２ １　７２３６−４Ｂ（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　Ｃ Ａ、ＪＰ Ｉ （７２）発明者　ツァフ、ユルゲン　ヨハン　レオボルドスイス国　チューリッ ヒ、シーエイチー８０８４　、ギルハルデンシュトラーセ　３６（７２）発明者 　ボーン、ウォルター　ハンススイス国　チューリッヒ、シーエイチー８００８ 　、ツォリカーシュトラーセ　２５３

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．図１のアミノ酸配列と少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する、 インシュリン様成長因子結合タンパク質であって、該タンパク質に特異的な抗体 もしくはインシュリン様成長因子に結合し得る、タンパク質；および、該配列の 少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含むそのフラグメントであって、該タン パク質に特異的な抗体もしくはインシュリン様成長因子に結合し得る、フラグメ ント；からなる群より選択される、精製された結合タンパク質。
2. ２．前記タンパク質が、図１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タン パク質。
3. ３．前記タンパク質が、前記フラグメントの１つを含む、請求項１に記載の結合 タンパク質。
4. ４．請求項１に記載の精製されたタンパク質からなるヒトタンパク質を含む、組 成物。
5. ５．組み換えＩＧＦＢＰ−５。
6. ６．ＩＧＦＢＰ−５を認識する、抗体、抗体フラグメントもしくはその誘導体。