JPH06503709A - Ｉｇｆｂｐ―４をコードする遺伝物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ８、前記微生物が酵母である、請求項７に記載の微生物。

９、前記細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項７に記載の微生物。

１０、！ＧＦＢＰ−４またはその断片を産生ずる方法であって、請求項１に記載 のＤＮＡ分子を含有する組換え宿主を、該ＩＧＦＢＰ−４または断片が該宿主に より発現される条件下で増殖させる工程、および次に発現させたＩＧＦＢＰ−４ または断片を単離する工程を含む方法。

１１、前記宿主が微生物である、請求項１０に記載の方法。

１２、前記宿主が真核細胞である、請求項１０に記載の方法。

１３、前記宿主が非ヒトトランスノエニノク動物である、請求項１０に記載の方 法。

明細書 ＩＧＦＢＰ−４をコードする遺伝物質 本願は、１９９０年８月２８日に出願された米国特許第０７１５７４．６１３号 （代理人参照番号：　ＣＨＩＲ−００７１００ＵＳ）の分割出願である。

癒！ 灸囲旦豆１ 本発明は天然に存在するタンパク質の遺伝子工学、および対応する組換えタンパ ク質、遺伝子、および遺伝子セグメントに関する。より特定すれば、インシュリ ン様の成長因子結合タンパク質由来のこのようなタンパク質および遺伝子エレメ ント、タンパク質および遺伝子エレメントを用いる方法および組成物、ならびに 診断に青用である遺伝子セグメントに関する。

１五 インシュリン様成長因子（ＩＧＦｓ）は、ブロインンニリンと構造が相同の低分 子量のポリペプチドホルモンである。２種類の異なるＩＧＦｓ、すなわちＩＧＦ −ＩとＩＧＦ−■が知られており、組織培養中の広範囲の細胞に対して、インビ トロで細胞分裂促進作用を宵する。どちらのＩＧＦｓも、インビトロで種々の組 織の成長を刺激し、特に、これらはコラーゲンの合成を誘導する。ＩＧＦ−１は 、軟骨形成時および骨形成時に成長ホルモンの成長促進作用を媒介するので個体 の正常な成長に必須のものである。ピグミーおよびトイブードル犬にはＩＧＦ− Ｉが不足しているが、成長ホルモンの面清中１度は正常であることから、上記の ことが実証されている。ＩＧＦ−ｎは、胎児の発育と神経の成長に重要な役割を 演じていると考えられている。

これらの因子は、骨格組織に対する主な作用に加えて、他の組織に対しての成長 刺激機能も示す。創傷の繊維芽細胞は、創傷の治癒に通常必要な構造タンパク質 であるコラーゲンを増殖および合成するために、繊維芽細胞を刺激するのに有効 なＩＧＦｓを産生ずることが知られている。創傷組織の血管新生も誘発される。

ざらにＩＧＦｓは、造血を誘発する、エリトロポイエチン様活性を宵しているこ とも見出されている。

また最近の研究は、ある種の癌細胞、例えば乳癌および腎臓癌の細胞が産生ずる ［ＧＦｓは、癌細胞の増殖、および癌組織の増殖を維持するのに必要な血管組繊 と繊維組織の増殖を自己刺激することを実証している。

これに加えて、両［ＧＦｓは、特に、グルコースの輸送と代謝を刺激する、イン シュリンと類似の代謝活性スペクトルを示す。ＩＧＦｓとインシュリンの生物学 的作用は、これらが特定のレセプターに結合することによって媒介される。特に 、両ＩＧＦｓは、インシュリンより約１００倍低い親和性でインシュリンのレセ プターと結合する性能をもっている。

両ＩＧＦｓは血中濃度がインシュリンより約１００倍高い。低血糖症は、血液中 に存在してＩＧＦｓと複合体を形成し得る輸送タンパク質を含む調節機構で防止 される。このようにしてＩＧＦｓは、インシュリン様活性を宵しない複合体の形 態で血液中を循環する。ＩＧＦと輸送タンパク質（以降ＩＧＦ結合タンパク質ま たはＩＧＦＢＰｓと呼ぶ）の結合によって、ＩＧＦｓが細胞表面のレセプターに 結合することが阻害される。ＩＧＦ結合タンパク質の他の機能として、ＩＧＦｓ の短い半減期を延ばすことも実証されている。

ＩＧＦｓは遊離の形態で血液中に存在していると迅速にタンパク分解されるから である。

上記のことから、ＩＧＦｓは、インビトロで、ａ）成長ホルモン不足の動物とヒ トの成長、ｂ）赤血球生成および軟骨形成のような組織の再生、Ｃ）創傷の治癒 、およびｄ）肝臓もしくは腎臓のような各種の器官の機能を、刺激するのに有用 であり得る。

その軟骨形成刺激活性のために、ＩＧＦｓは、例えば骨粗しよう症の治療の際、 骨を形成させるため使用するのに特に適している。上記の治療に用いるＩＧＦｓ は、少なくとも１つのＩＧＦ結合タンパク質とともに患者に投与するのが有利で ある。ＩＧＦ単独の投与よりも、上記の組合せの投与の方が、低血糖症および注 射部位に起こり得る細胞分裂促進作用の防止、ならびにＩＧＦの半減期の延長を 含む有益な作用を宵する。さらに、結合タンパク質はＩＧＦ−１のエリトロボイ エチン様作用を高めるのにも有用であることが見出された。またその結合タンパ ク質は、ＩＧＦｓに特定の組織を標的づけるのにも有用であり得る。

また結合タンパク質は、それだけを、すなわちＩＧＦなしで投与すると、ある種 の癌細胞、例えば、乳癌もしくは腎臓癌の細胞のようなホルモン産生癌細胞が遊 離ＩＧＦｓを分泌する場合のように、ＩＧＦｓが過剰に産生される場合に起こる ような、ＩＧＦｓの副作用を阻害するのに治療上有用であり得る。ＩＧＦ結合タ ンパク質による治療によって、糖尿病性の増殖性網膜症の二仄作用としての失明 も防止することができる。実際に、ＩＧＦｓが、糖尿病性網膜症において、内皮 および繊維芽細胞の増殖を刺激する因子の１つであることが見出されている。

ＩＧＦＢＰｓの他の治療用途は、ＩＧＦ結合タンパク質が不足していル患者の過 剰の成長の制御である。なぜなら、高レベルのＩＧＦが異常に低いレベルの結合 タンパク質と組み合わされると、過剰成長の原因となるようであるからである。

近年、大きさおよび他の特性が異なる、ＩＧＦ結合タンパク質の３つの主な種が 、げっ歯動物およびヒトの血清中に検出された。

最初に発見された結合タンパク質は、現在ＩＧＦＢＰ−３と呼ばれているが、い くつかのサブユニットで構成された、約１５０Ｋｄの糖タンパク質である。その 生成は、２番目に発見された比較的小さなＩＧＦ結合タンパク質と異なり、成長 ホルモン依存性である。

二番目に発見された結合タンパク質は、現在ＩＧＦＢＰ−１と呼ばれているが、 ヒトとラット中に存在し、分子量が約３０〜４０Ｋｄである。ヒｌ−ＩＧＦＢＰ −１は、次のような各種の起源からすでに精製されている。すなわちその起源に は、羊水（Ｐｏｖｏａ、Ｇ、ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４４巻、１ ９９頁、１９８４年：したがって羊水結合タンパク質とも呼ばれる）、胎盤（Ｋ ｏｉｓｔｅｎｅｎ、　Ｒ，ら、Ｅｎｄ。

ｃ　ｒ　ｉｎｏ　ｌｏｇｙ、　１１８巻、１３７５頁、１９８６年）、および肝 癌Ｇ２細胞の馴化培地（Ｐｏｖｅ　ｌ　１．　Ｄ、　Ｒ，ら、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒ、　、　４２０巻、１６３頁、１９８７年）が含まれる。はじめの２ つの結合タンパク質は、そのアミノ酸の組成とＮ末端アミノ酸の配列が決定され 、同等であるかまたは少なくとも非常に似ていることが分かっている。肝６Ｇ２ 細胞から単離されたＩＧＦ結合タンパク質（Ｌｅｅ、　Ｙ、　Ｌ、ら、Ｍｏ１． 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　、　２（５）巻、４０４頁、１９８８年）と、胎盤 ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたＩＧＦ結合タンパク質（Ｂｒｉｎｋ ｍａｎ、Ａ、ら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、７（８）巻、２４１７頁、 １９８８年）とを比較すると９９％の相同性を示している。さらに、これらの２ つのアミノ酸配列は、ｃＤＮＡライブラリーがコードするＩＧＦ結合タンパク質 と９４％の相同性を示している（Ｂｒｅｗｅｒ、　Ｍ、　Ｔ、ら、Ｂｉｏｃｈ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ、　、　１５２（３）巻、１２８９頁、 １９８８年）。

ウェスタンプロット法及び［１”５］　−１ＧＦによる親和性標識によって、血 清中に存在する２つの主なＩＧＦ結合タンパク質の形態に加えて、いくつかの他 のＩＧＦ結合タンパク質が、異なるヒト組織抽出物と細胞培養培地中で同定され ている。これらのタンパク質の分子量は、１５〜１５０にｄの範囲にあり、これ らのタンパク質のいくつかは、より大きなＩＧＦ結合タンパク質のタンパク質分 解反応によって生成するようである。特にヒト血清から精製された５３ＫｄのＩ ＧＦ結合タンパク貫は、１５０−ＫｄのＩＧＦＢＰ−１のサブユニットとして表 される（　Ｂａｘｔｅｒ、　Ｒ，Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃａｍ、　、　１３９　（３）巻、１２５６頁、１９６６年）。

また他の、ＩＣＦ結合タンパク質の形態がラットＢＲＬ−３Ａ細胞ノ馴化培地に も見出されたが、その分子量は約３３〜３６Ｋｄである。

ラノｌ−ＢＲＬ−３Ａ結合タンパク質のアミン末端タンパク分解列の一部が決定 されている（ＭＯｔｔＯｌｌａ、　Ｃら、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６１ 巻、１１１８０頁、１９８６年；　Ｌｙｏｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｓｍ１ｔｈ　Ｇ、Ｌ 、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４５巻、２６３頁、１９８６ 年）。ラットとヒトの末端配列が示す３３％の相同度は、それぞれの結合タンパ ク質を同等物とみなすことができるほど充分に高くない。

加えて、現在ＩＧＦＢＰ−２と呼ばれ、ＢＲＬ−３Ａ結合タンパク質に関連して いるＩＧＦＢＰも見出されており、そのアミノ酸配列は充分に確認されている。

ＩＧＦＢＰ−２のアミノ酸配列は、その前に知られれている結合タンパク質のア ミノ酸配列とは、はっきりと異なっている。

いくつかの異なるＩＧＦ結合タンパク質が存在しているということは、これらの タンパク質が異なる機能を持っていることを示している。現在知られている結合 タンパク質を用いて、疾患の状態を診断し、ＩＧＦｓの生物学的活性を種々の異 なる方法で変えることができるので、異なる生物学的特性を有する別のＩＧＦ結 合タンパク質を発見することには重大な興味がもたれている。

（以下余白） 腎１又旦 ｚ、　Ｄａｕｇｈａｄａｙ、　Ｗ、Ｈ，、９ｔｘ　Ｒｏｚｗｅｉｎ、　Ｐ、（１ ９８９）　ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ　１０．　６Ｂ−９１゜１２７− ２０３．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄ ｏｎ。

３、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｋ、Ｌ−＋　２ｉｓ；　Ｎ１５ｓｌｅｙ、　Ｓ、Ｐ、（１ ９７６１Ａｃｔ、ａεｎｄｏｃｒ　−（Ｋｂｈ、）８３，２４３−２５８゜ ４、ｚａｂｔ、Ｊ、、Ｈａｕｒｉ＋Ｃｈ、、ＷａｌｄｖｏｇＧｌ、Ｍ、ｈ＞ｐｏ Ｆｒｏｅｓｃｈ。

Ｅ、Ｒ，（１９８６）、：、Ｃｈｉｎ、工ｎｖａｓ＝、７７．１７６８−１７７ ５−６、ｚａｐｔ、　Ｊ、、　Ｈａｕｒｉ、　Ｃ，、Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ、　Ｍ 、、　ｒｕｔｏ、　Ｅ、。

）！ａｓｌｅｒ、Ｈ，、Ｂｉｎｚ、Ｘ、、Ｇｕｌｅｒ、Ｈ，Ｐ、、ＳｃｈｍＬｄ 、Ｃ，、ｓ゛ｉｔｈ’Ｆｒｏｅｓｃｈ、　Ｅ、Ｒ，（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６゜３［１１３−３１１１７゜ ７、　５ｃ）ｕｎｉｄ、　Ｃ，、Ｚａｏｆ、　Ｊ、、　７．７ｙ−Ｆｒｏｅｓｅ ｈ、　Ｅ、Ｒ，（Ｌ９Ｂ９）　ｒＥＢｓＬｅｔｔｅｒｓ　２４４，３２８−３３ ２゜ａ、　５ｃｈｒｎＬｄ、Ｃｈｒ　Ｅ）”ｎｓｔ、Ｍ、ｒ　Ｚａｐｆ、Ｊ−ｒ 　ｈ’Ｘひ”　Ｐｒｏ＠５Ｃｈｔ　Ｅ、Ｒ。

（１９８９）　Ｂｉｏｅｈｅｍ、ＢＬｏｐｈｙｇ、只ａｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１６ ０．　７８８−７９４゜９°Ｅ１９ｉｎｌＲ，Ｇ、、Ｂｕｓｂｙ、Ｗ、Ｌ、Ｂｐ ｕ′Ｃ１ａｍｍｏｎｓ、Ｄ、Ｒ，［１９［］７１Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、Ａｃａｄ 、ＳｃＬ、ＵＳＡ　８４．　３２５４−３２５Ｂ。

１０−　Ｄｅ　Ｍｅｌｌｏｗ、Ｊ−５−Ｍ−ｒ　Ｋｉｔ”　Ｂａｘｔｅｒ、只、 Ｃ，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｒｃ。

ａｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１５６．１９９−２０４゜１１ 、ＫｎａＶｅｒ、　Ｄ、Ｊ、、　ｍｊｐ”　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｌ、　（１９８ ０）　Ｉ’！−ＱＣ，Ｎａｐ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７７、７２５２−７２５６゜１４、　ｘａｒ−ｉ ｎ、Ｊ、Ｌ、ｒ　’Ｆｊｌ’Ｊ　ｎａｘｔｅ＝、Ｒ，Ｃ，（１９８１１Ｊ、Ｃ上 ｉｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、６１．　７９９−８０１゜１５、Ｂａｘｔ ｅｒ、　Ｒ−Ｃ−、％ＪｚＨ”　Ｍａｒ’！ｉｎ、　Ｊ、＝、　４１９Ｆ＋９） 　Ｐｒ０ｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、ＳｃＬ、ＵＳＡ　［１６，６８９１］−６９ ０２゜（レメ）臀、ｂン １６、Ｗｏｏｄ、劉１：、、　Ｃａｅｈｉａｎｅｓ、　Ｇ、、　Ｈｅｎｚｅｌ、 　Ｗ、Ｊ、、　Ｗｉ、ｎｓｌｏｗ。

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Ｈａｕｒｉ、　ｃｈ、、　Ｆｕｔｏ、　Ｅ、、　ＨＯ５Ｓ＠ｎ１Ｏｐｐｔ　ｐ− 、Ｂｉｎｏｕｘ、　Ｍ、。

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Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、Ｌ５６．　１１８７−１１９４゜２０ 、　Ｎｉ１ｓｏｎ、Ｂ、Ｌ−、３ＴｈＢｒｏｗｎ、Ｌ、Ｒ−（１９８４）　Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

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Ｒ，Ｃ，、５ｅｓ１ａ、　Ｆ、／　？＋’）ゾＴｏｌａｎ、　Ｄ、（１９８６） 　Ｂｉｏ℃ａｃｈｎｉｑｕａｓ４．４２１１！−４３２゜ ４０、Ｌｅｈｒａｃｈ、Ｈ，、Ｄｉａｍａｎｄ、Ｄ、、Ｗｏｚｎｅｙ、Ｊ、Ｍ、 、＞メｖｙＢｏｅｃｆｔｋｅｒ、Ｈ，（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １６，４７４３−４７５１゜４１、　Ｔｈｏｍａｓ、ｐ、（１９８０１Ｐｒ０Ｃ −Ｎａｔ−１，ｋＣａｄ−ＳＣ１，ＵＳＡ　７７゜５２０１−５２０５゜ ４２、ＦｅＬｎｂｅｒｑ、　Ａ、Ｐ、、　％’ＦＩｒ”　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ 、　Ｂ、（１５１８４）　Ａｎａｌ。

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Ｒｕｔａｎｅｎ、Ｅ、、ｓｙｐ’　Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ、Ｊ、Ｊ、（１９８９） Ａ＝ｔａ＋ｌ＋ｎｄｏｃｒ、（’Ｋｂｈ、）　（Ｋｂｉ、ｌ　１２１．　７５ニ ー７５２゜４５、　Ｒｏｇ’ｎａｎｉ、ｘ、、ＨＯ５Ｓｅｎ１ｏｐｐｒ　Ｐ’＋ 　Ｌｅｐａ、ｇａ、ｐ、、Ｂａ１ｌａｎｄ。

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Ｊ、Ｅ、、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、に、、　ｗｖ　Ｃｚｅｃｈ、　Ｍ、Ｐ、 　（１９８６）　Ｊ−Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ、　２６１．１１１８０−１１１８ ８゜５０、　ＢｒＯ’ｄＴ１ｔ　Ａ、Ｌ−ｒ　ＣｈＬ＆ｒＬＯｅｔｉ、Ｌ、ｒ　 ０ｒＬＯＷＳｋＬｔ　Ｃ−Ｃ−１Ｍｅｈ１ｍａｎ、　’ｒ、、　Ｂｕｒｑｅ１５ ／　Ｗ、）！、、　Ａｃｋｅｒｍａｎ、　Ｅ、Ｊ、、　Ｂｒｕｎｉ。

Ｃ，Ｂ１．　Ｈｌ、／Ｒｅｃｈｌｅｒ、　Ｍ、Ｍ、　（１９Ｂ９）　Ｊ、　Ｂｉ 。１．　Ｃｈｅｍ、　２６４゜５１４８−５１５４゜ ５１、　Ａｌｂｉｓｔｏｎ、ａ、＝、ｆｌｌ（ｐ’　Ａ−Ｃ，！（ａｒｉｎｇｔ ｏｎ　（１９９ｏ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｎｙｓ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１６６、　８９２−Ｅ１９７゜ ５２、Ｗａｎｇ、　Ｊ、Ｆ、、　Ｈａｍｐｔｏｎ、　Ｂ、、　Ｍｓｈｌｍａｎ、 　Ｔ、、　ａｕｒｇｅｓｓ。

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Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、只、Ｃ，、Ｂｕｓｂｙ、　Ｗ、Ｈ，、ｙｒａｖ　Ｃｌｅｍｍ ｏｎｓ、　Ｄ、Ｒ。

（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ：、　Ｃｏｍｍｕｎ 、　１５２．１２８９−１２９７゜ ５６、　Ｂｒｉｎｍａｎ、Ａ、、Ｇｒｏｊｆｅｎ、Ｃ，、Ｋａｒｔユｅｖｅ、Ｄ 、Ｊ、、ＶａｎＫ６ｓｓｅｌ、入、Ｇ、、−Ｈ＞７　Ｄｒｏｐ、ｓ、ｚ、ｓ、（ １９８８１ＥＫＢＯＪｏｕｒｎａｌ７．２４１７−２４２３゜ ５７、　ＪｕＸｋｕｎｅｎｔ　Ｍ−ｒ　１ｏｔｓ＋＋＝ｘｎｅｎ、只２．　λａ 上ｃｏ−５ｅｔａｌ、Ｊζ、１Ｊａｎｎ＠、　Ｏ，Ａ、、　Ｗ＃　Ｋｏｎｔｕｌ ａ、　Ｋ、（１９８８）　ＦＥＢＢＳ　ｂｅｃｔｅｒｓ２３６．２９５−３０２ ゜ ５８、　Ｌ＊：ｈｎ＋ａｎ、Ｈ，、Ｓｃｄｅｒｌｉｎｇ−Ｂａ＝ｒｏｓ、、７． 、ｐｅｒｓｓｏｎ、Ｂ、。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８０，２５９−２６５゜５９、Ｍｏｈａｎ、Ｓ−ｒ　Ｂ ａｕ：１ｓｚａ、Ｃ，Ｘ、、Ｗｅｒｇａｄａｌ、Ｊ−ｒ　ＷＰＶＢａｙｌｉｎｋ 、Ｄ、Ｊ、、（１９８９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ｊｗａｄ、ＳＣＬ、ＵＳλ１１ １６．８３３８−８３４２゜ ６０、　５ｚａｂｏ、Ｌ、、　Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａａ、Ｄ、Ｇ、、Ｂａ１ｌａ ｒｄ、Ｆ、Ｊ、ｒ　７’１Ｆｔ）Ｗａｌｌａｃｅ、Ｊ、Ｃ，（１９８８１Ｂｉｏ ｅｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒａｓ、Ｃｏｒｎｒｎ。

１５１．２０７−２λ４゜ （レヌ゛Ｆ°　るＦ　−） 光旦しと【約 従って、本発明の目的は、遺伝子工学的手法によりＩＧＦ−結合タンパク質を産 生ずる手段を提供することであって、この結合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−１、 ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−３とは異なる生物学的特性を有する。

本発明の他の目的は、新規なＩＧＦ結合結合タンパク一層容易に入手できるよう に、そのＩＧＦ結合結合タンパク−現することができる組換えＤＮＡ分子を用い て、該結合タンパク質を提供することである。

本発明の上記の目的と他の目的は、図１に示すアミノ酸配列と少なくとも８５％ 相同のアミノ酸配列を宵するインシュリン様成長因子結合タンパク質、および該 アミノ酸配列の少なくとも１０の連続アミノ酸からなるそのフラグメントからな る群から選択される結合タンパク質をコードする遺伝情報を提供することによっ て達成することができ、ここで、前記、精製された結合タンパク質は該タンパク 質に特異的な抗体またはインシュリン様成長因子に結合し得る。新規なインシュ リン様成長因子結合タンパク質およびその断片をコードする核酸配列を有する組 換えＤＮＡ分子もまた、タンパク質および新規な結合タンパク質を認識する抗体 を発現し得る組換え微生物および細胞株と共に、本発明の一部である。

の　なｆ　日 図１は、ヒトＩＧＦＢＰ−４をコードするクローンのアミノ酸およびヌクレオチ ド配列を示す略図である。矢印は推定のセリンペプチダーゼ切断部位を示す。

図２は、本発明のヒト結合タンパク質であるヒトＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸配列 を、さきに述べた３種のヒト結合タンパク質の公知の配列および別の新規なヒト 結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ−５と比較する構成図である。相同の領域がこれら の配列中にみとめられる。これらの相同領域は特に重要である。なぜなら、類縁 分子を見つけることに成功する確率が高いＤＮＡプローブを得ることができる領 域を示しているからである。このような相同領域を２つ括弧で示しであるが、他 の相同領域も存在している。

、な　態　の１日 ＩＧＦＢＰ−４をフードする遺伝配列およびそれから生じるフラグメントからな る新規の組成物が、遺伝配列を用いて生産される組換えタンパク質、およびこれ ら組成物の使用法とともに、提供される。ＩＧＦＢＰ−４ｃＤＮＡは、最初、２ 段階の手順を用いて、ヒト骨肉ａ／λＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーから単離さ れた。第１に、ＢＦ２のアミノ酸７〜２２をコードするｃＤＮＡの小さなフラグ メントを、ポリメラーゼ連鎖反応、ゲルによる精製および配列決定によって骨肉 １１１ｃＤＮＡから増幅した。第２に、完全にマツチするオリゴヌクレオチドを ＰＣＲＣラプライマー間Ｐ４ヌクレオチド配列に基づいて合成し、ｃＤＮＡクロ ーンを単離するためのプローブとして使用した。アガロースゲル電気泳動法でＤ ＮＡ挿入フラグメントの大きさが最大を示す、ＢＰ４ｃＤＮＡクローンの配列を 決定した。ＢＦ２のヌクレオチドとコードされるアミノ酸配列を図１に示す。

ヌクレオチドとアミノ酸の標準の略語が、本明細書中のこれらの図および他の部 分に用いられる。

遺伝子工学とタンパク質化学の技術分野に用いられる多数の用語が、以下に定義 する意味で本願に用いられる。

Ｍａｎｉａｔｉｓらの前記文献の３２０〜３２３頁に記載のハイブリダイゼーシ ョン条件下で互いにハイブリダイズできる場合、２つの核酸フラグメントは”相 同”である。しかし、下記の洗浄条件、すなわち２ＸＳＣＣ１０，１％ＳＤＳ、 室温にて２回、３０分間ずつ；次いで、２ｘＳＣＣ，０，１％ＳＤＳ、　５０℃ で１回、３０分間；次いで２ｘｓｃｃ、室温で２回、１０分間ずつ、を用いるこ とによって、せいぜい約２５〜３０％の塩基対のミスマ・ノチを含む相同な配列 を同定することができる。より好ましくは、相同な核酸ストランドは、１５〜２ ５％の塩基対のミスマツチを含み、さらに好ましくは、塩基対のミスマツチが５ 〜１５％である。これらの相同度は、当該分野で公知であるように、遺伝子ライ ブラリー（または遺伝物質の他の起＃）からクローンを同定する、一層厳密な洗 浄条件を用いることによって選択することができる。

ＤＮＡフラグメントは、ＩＧＦＢＰ−４分子全体のコーディング配列の領域と同 じかまたは実質的に同じ塩基対配列をもって０る場合、ＩＧＦＢＰ−４をコード するＤＩＩＡ配列“由来”である。

“実質的に同じ”という用語は、生物学的活性について用いた場合、その活性は 同じタイプであるが、活性度が異なることを意味する。アミノ酸配列に用いた場 合、　“実質的に同じ”という用語は、当該分子が類似の生物学的特性を有し、 好ましくはアミノ酸配列の相同性が少なくとも８５％であることを意味する。さ らに好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９０％同一である。′実質的に同じ ”という用語は他のところで使う場合は、その通常の英語の意味をもっている。

タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−４分子の領域と同じかまたは実質的に同じアミノ酸 配列をもっている場合、ＩＧＦＢＰ−４分子“由来”である。

グリコジル化されたＩＧＦＢＰ−４とグリコフル化されていないＩＧＦＢＰ−４ 、またはそのポリペプチド誘導体は、ＩＧＦＢＰ−４に対して特異的なモノクロ ーナルもしくはポリクローナルの抗体を製造するのに用い得る。これらのＩＧＦ ＢＰのポリペプチド誘導体とは、天然のＩＧＦＢＰ−４とは長さが異なり、かつ 天然起源から得られたＩＧＦＢＰ−４に見られるのと同じ主要配列で、ＩＧＦＢ Ｐ−４由来の５以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＩＧＦＢ Ｐ−４と実質的に同じアミノ酸配列を含有しているが、抗体およびＩＧＦ分子、 特に＋ＧＦ−１およびとりわけＩＧＦ−１１のようなＩＧＦＢＰ−４特異的分子 と相互に作用する、ＩＧＦＢＰ−４ポリペプチド誘導体の性質に実質的に影響し ない、小さなアミノ酸置換部分を有するポリペプチド分子は、ＩＧＦＢＰ−４の 定義に含まれる。誘導体には、グリコジル化された形態、他のＩＧＦ−ＢＰ分子 との凝集接合体、および非類縁の化学的部分との共有結合接合体が含まれる。共 有結合誘導体は、ＩＧＦ−ＢＰのアミノ酸連鎖中、またはＮ末端もしくはＣ末端 の残基中に見られる基に、当該技術分野で公知の手段によって官能基を連結させ ることによって製造される。

Ｎ−グリカナーゼによる実験は、ＩＧＦＢＰ−４がグリコジル化されないことを 示唆している；すなわち、ゲル上の結合タンパク質の移動度はＮ−グリカナーゼ による消化後も変わらない。しかし、コードされたタンパク質はＮ−糖鎖形成部 位を含むため、このタンパク質は適切な環境下では糖鎖が形成され得る。従って 、天然の分子は、分子中に埋没しこのためグリカナーゼに接近し得ない糖を含み 得る。これは、ＩＧＦＢＰ−３分子上の糖鎖の場合であると考えられる。ＢＰ− ４分子が糖鎖形成し得る徴候はその分子量により得られる。（ｃＤＮＡからの） 　ＩＧＦＢＰ−４の予想される分子量は、ゲル移動度から得られる分子量より少 ない。

しかし、実験により糖分子を検出することはできなかった。

ＩＧＦＢＰ−４特異的分子には、天然産のＩＧＦＢＰ−４アミノ酸配列を含有す るＩＧＦＢＰ−４ポリペプチドに対して特異的な抗体のようなポリペプチドが含 まれる。“特異的結合ポリペプチド”という用語は、ＩＧＦＢＰ−４およびその 誘導体と結合し、かつ標的ポリペプチド、すなわちＩＧＦＢＰ−４および＋ＧＦ ＢＰ−４のポリペプチド誘導体に対して、結合性を試験される他のポリペプチド に対してより、測定可能な程度に高い結合親和性を有するポリペプチドを意味す る。１０倍高い親和性が好ましく、１００倍高い親和性かさらに好ましい。抗体 に対する結合親和性は単結合の場合である（すなわち抗体分子の一価結合である ）。また抗体による特異的結合は、結合か、その分子の抗体の通常の結合部位（ 可変領域におけるアームの末端）で起こることを意味する。

上記のように、ＩＧＦＢＰ−４の天然のアミノ酸配列かられずかにアミノ酸配列 か変化したものは、＋ＧＦＢＰ−４という用語に含まれると考えられる。特に保 存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、アミノ酸の側鎖に関連するファ ミリー内で起こる置換である。遺伝子でコードされるアミノ酸は一般に次の４つ のファミリーに分類される。すなわち（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン 酸；（２〉塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；　（３）非極性＝アラニ ン、バリン、ロイシン、インロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニ ン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グル タミン、ンスチン、セリン、トレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、 トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸として分類されると きがある。例えば、次のような孤立した置換すなわち、ロイシンのインロイノン またはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、トレオン のセリンによる置換、または同様の、構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸 の置換は、特にその置換が、ＩＧＦＢＰ−４もしくはその誘導体と＋ＧＦ分子と の相互作用に関与している結合部位におけるアミノ酸を含んでいな（Ａ場合、生 成した分子の結合特性に大きな影響を与えない。アミノ酸が変化することによっ て機能ペプチドが生成するか否かは、ＩＧＦＢＰ−４ポリペプチド誘導体の特異 的結合特性をアッセイすることによって、容易に決定することができる。結合ア ッセイについては以下に詳細に述べる。

ＩＧＦＢＰ−４に対して特異的な抗体は、精製［ＧＦＢＰ−４もしくはＩＧＦＢ Ｐ−４のポリペプチド誘導体を、それ自体もしくは通常のアジュバントとともに 用いて、ウサギのような適切なを椎動物の宿主を免疫化することによって製造さ れる。通常２回以上の免疫化が行われ、血液もしくは膵臓を、最後の注射をして から数日後に回収する。ポリクローナル抗血清については、その免疫グロブリン は、アフィニティーカラム中のゲルもしくはビーズのような固体の表面に結合さ せたＩＧＦ１３Ｐ−４を用いるアフィニティー精製法を含む各種の標準の方法に よって、沈降させ、単離し精製することができる。モノクローナル抗体について は、スブレノサイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）が通常、ハイブリドーマが生成 する選択された条件下で、骨髄細胞株のような不朽化リンパ球と融合される。次 にそのハイブリドーマを限界希釈条件下でクローン化して、それらの上澄み液を 、所望の特異性を有する抗体についてスクリーニングし得る。抗体の製造法は、 文献でよく知られており、刊行物のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ ｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８８年）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ′ｔＡ集、Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｐｒｅｓｓ、お よび米国特許第４，３８１、２９２号、同第４．４５１．５７０号および同第４ ．６１８．５７７号に例示されている。

ＩＧＦＢＰ−４は、血液および成分、例えば血清と血漿、およびＩＧＦＢＰ−４ またはそのポリペプチド誘導体を産生ずるように遺伝子を改変した細胞から、Ｉ ＧＦＢＰ−４に対して特異的なモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロ マトグラフィーによって容易に精製し得る。抗体アフィニティークロマトグラフ ィーの使用に加えて、各種の他の広く知られているタンパク質精製法（単独もし くは組み合わせで）、例えば免疫沈降法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラ フィー、等電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動法、選択的沈降法、電気泳 動法などでＩＧＦＢＰ−４とそのポリペプチド誘導体を精製することができる。

精製処理中に単離された画分は、ＩＧＦＢＰ−４またはＩＧＦＢＰ−４のポリペ プチド誘導体の存在について、ＩＧＦＢＰ−４−特異的抗体を用いるイムノアッ セイまた＋ＧＦＢＰ−４−特異的バイオアソセイによって分析することができる 。詳細な実施例を以下に記載する。

ＩＧＦＢＰ−４をコードするヌクレオチド配列を単離するには、ＩＧＦＢＰ−４ をコードする細胞からゲノムライブラリーを作るか、またはＩＧＦＢＰ−４を発 現する細胞から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作る必要がある。

イントロン／エクソンの境界を決定する試みから起こる可能性がある問題を回避 するために、ｃＤＮＡライブラリーを作ってＩＧＦＢＰ−４をコードするヌクレ オチド配列を単離する方が一般に好ましい。遺伝子ライブラリーは、真核宿主細 胞または原核宿主細胞のいずれについても作ることができる。プラスミド、コス ミド、ファージ、ＹＡＣなどのような広く入手可能なりローニングベクターは、 ＩＧＦＢＰ−４をコードするヌクレオチド配列またはその一部を単離するのに適 切な遺伝子ライブラリーを作るのに使用し得る。

ＩＧＦＢＰ−４のヌクレオチド配列の存在について遺伝子ライブラリーをスクリ ーニングする有用な方法には、精製ＩＧＦＢＰ−４または精！ｆ！　ＩＧＦＢＰ −４の精製内部フラグメントからのＮ末端アミノ酸配列の情報に基ついて、オリ ゴヌクレオチドのプローブを作ることが含まれている。標準のトリブレット遺伝 子コードを用いることによって、アミノ酸配列がＮ末端分析法で決定されたＩＧ ＦＢＰ−４の部分に一致するように、約１７以上の塩基対の長さのオリゴヌクレ オチド配列を通常のインビトロ合成法で作り得る。得られた核酸配列は、次に、 放射性核種、酵素、ビオチン、蛍光剤などで標識されて、遺伝子ライブラリーを スクリーニングするのに用いるプローブとして使用し得る。

ＩＧＦＢＰ−４をコードする核酸配列を単離するのに重要な他の方法としては、 ＩＧＦＢＰ−４に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナルの抗体によっ て、ＩＧＦＢＰ−４もしくはそのフラグメントの発現について遺伝子ライブラリ ーをスクリーニングする方法がある。特に好ましい方法では、精製ＩＧＦＢＰ− ４の部分アミノ酸配列または公知の類縁分子由来の配列に基づいた縮重プライマ ーと、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、プライマー間の遺伝子セグメ ントを増幅する。次にその遺伝子は、上記の増幅された遺伝子セグメントに基づ いた特異的なノ＼イブリダイゼーシ３ンブローブを用いて単離し得、次いでタン 、＜り質の適切な発現について分析される。この好ましい方法の詳細な説明は、 後記の実施例で述べる。

ＩＧＦＢＰ−４をフードするヌクレオチド配列は、ＩＧＦＢＰ−４遺伝子ライブ ラリーの単離物から回収された組換えＤＮＡ分子から得られ得る。ＩＧＦＢＰ− ４をフードするヌクレオチド配列は、これらの組換え分子の非ベクターヌクレオ チド配列の配列を決定することによって得られ得る。ヌクレオチド配列の情報は 、例えばマキシム・ギルバート配列決定法、ノブオキシヌクレオチド配列決定法 などのような広く用いられている、ＤＮＡ配列決定のプロトコルを使用して得ら れ得る。適切なヌクレオチド配列決定プロトコルの例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫ ｉｍｍｅｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　５２　Ｇｕｉｄｅ　ｔ ｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉｕｅｓ　（１９８７）　 、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓに見い出し得る。ｃＤＮＡライブラリーとゲノ ムライブラリーの両者からの単離物を含むいくつかの組換えＤＮＡ単離物からの ヌクレオチド配列情報は、ＩＧＦＢＰ−４の全アミノ酸コーディング配列、なら びにＩＧＦＢＰ−４遺伝子内のイントロンのヌクレオチド配列、上流のヌクレオ チド配列、および下流のヌクレオチド配列を得るために、組み合わせ得る。

ＩＧＦＢＰ−４特異的遺伝子ライブラリー単難物の配列を決定することによって 得られたヌクレオチド配列は、ＩＧＦＢＰ−４の遺伝子の重要な領域を同定する ために分析される。これらの重要な領域には、オープンリーディングフレーム、 イントロン、プロモーター配列、終止配列などが含まれる。ヌクレオチド配列の 情報の分析は好ましくはコンピュータで行われる。重要な領域のヌクレオチド配 列を分析するのに適切なソフトウェアは市販されており、例えばＤＮＡ５ＩＳ　 （登録商標、ＬＫＢ社）がある。ヌクレオチド配列の分析の正確さを改善するた めに、ＩＧＦＢＰ−４ヌクレオチド配列の情報を分析するとき、精製ＩＧＦＢＰ −４のＮ末端の配列決定から得られるアミノ酸配列情報を用いることも重要であ る。

ＩＧＦＢＰ−４をコードする単離されたヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ法ま たはインビトロポリペプチド合成法によって精製！ＧＦＢＰ−４もしくはそのフ ラグメントを製造するのに使用し得る。

“精製された”および“単離された”という用語は、ポリペプチドもしくはヌク レオチドの配列に用いる場合、その指定された分子は、同じタイプの他の生体高 分子が実質的に存在しない状態で存在していることを意味する。“精製された” という用語は、本願で用いる場合、同じタイプの生体高分子が、好ましくは少な くとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％、および最も好ましく は少なくとも９９．８重量％存在することを意味するくしかじ、水、緩衝剤など の低分子、特に分子量が１０００より小さい分子は存在していてもよい）。

天然起源からＩＧＦＢＰ−４を単離する場合に比べて、組換えＤＮＡ法によって ＩＧＦＢＰ−４を製造する場合の大きな利点は、天然起源から結合タンパク質を 単離するのに必要な出発原料の量より少ない量の出発原料を用いて同量のＩＧＦ ＢＰ−４を製造することができるということである。また、ＩＧＦＢＰ−４を組 換え法で製造すると、ＩＧＦＢＰ−４を天然に産生ずる細胞内に通常存在するい くつかの分子なしで、＋ＧＦＢＰ−４を単離することができる。組換え非ヒト宿 主で産生される唯一のヒトタンパク質が組換えＩＧＦＢＰであるから、実際に、 ヒトタンパク質の汚染物の痕跡も全く含有しないＩＧＦＢＰ組成物が容易に製造 し得る。天然起源由来で混入する可能性があるウィルス性物質も回避し得る。ま た組換えＤＮＡ法は、前記の変異体のような、天然では見られないＩＧＦＢＰ− ４ポリペプチド誘導体を製造するのに使用し得ることも明らかである。

ＩＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−４のポリペプチド誘導体は、類縁分子をコー ドするＤＮＡ配列をベクター中に機能的に挿入すると、組換え法によって発現さ せ得る。６機能的に挿入する”という用語は、当該技術分野の熟練者であれば十 分に理解できるように、適正なリーディングフレーム中に適切な配向で挿入する ことを意味する。完全なＩＧＦＢＰ−４リーデイングフレームを有する遺伝子構 造を作るとき、好ましい出発物質は、ゲノムライブラリー単難物よりもむしろ、 ＩＧＦＢＰ−４をコードするｃＤＮＡライブラリー単難物である。典型的には、 ＩＧＦＢＰ−４遺伝子は、プロモーターの下流に挿入され、停止コドンが続くが 、所望により、ハイブリ、ドのタンパク質として産生され、次いで切断が行われ 得る。一般に、ＩＧＦＢＰ−４およびＩＧＦＢＰ−４ポリペプチド誘導体の製造 収率を改善する宿主細胞特異的配列が用いられ、かつ適切な制御配列、例えばエ ンバンサー配列、ポリアデニル化配列およびリポゾーム結合部位が発現ヘクター に付加される。

、　適切なコープイン配列が単離されると、種々の異なる発現系で発現させるこ とができる。

ｌユ星亘且里上 哺乳類のプロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コーディング 配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３°）転写を開始するＤＮＡ配 列である。プロモーターは、転写開始領域を有し、この領域は通常、コーディン グ配列の５°末端の近くに位置しており、そしてＴＡＴＡボックスが転写開始部 位の上流２５〜３０塩基対（ｂｐ）の位置に通常位置している。このＴＡＴＡボ ックスは、ＲＮＡポリメラーゼ■に、正しい部位でＲＮＡ合成を開始させると考 えられている。哺乳類プロモーターはまた、上流プロモーターエレメントを有し 、このエレメントは一般にＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００ｂｐの範囲内 に位置している。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定 し、両方の配向で作動することができる（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ　： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、策２版中の５ａＩＩｌｂｒｏｏｋら 、（１９８９）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１ｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　ｉ ｎ　Ｍａａ＋ｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ″）。

哺乳類ウィルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして宿主域が広い。それ 故に、哺乳類ウィルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列 を提供する。その例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルス ＬＴＲプロモーター、アデノウィルスの主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、 および単純ヘルペスウィルスプロモーターがある。さらに、非ウィルス遺伝子も また、例えば不ズミ科動物のメタロチオネイン遺伝子由来の配列も有用なプロモ ーター配列を提供する。発現は、構成的かもしくは制御され（誘導性）、プロモ ーターによって、ホルモン感受性細胞中で、グルココルチコイドで誘導し得る。

先に述べたプロモーターエレメントと組合わせてエンハンサ−エレメント（エン ハンサ−）が存在すると、一般に発現のレベルが増大する。工／ハンサーは、同 種のまたは異種のプロモーターに連結され、合成が通常のＲＮＡ開始部位で始ま ると、１０００倍まで転写を刺激し得る制御ＤＮＡ配列である。また、エンハン サ−は、転写開始部位から上流または下流に、通常の配回もしくはフリップされ た（ｆｌｉｐｐｅｄ）配回、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超 える距離で位置して活性である［Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３６：　１２３７；　Ａｌｂｅｒｔら（１９８９Ｌ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１１．第２版］。ウィルスから誘導される エンハンサ−エレメントは特に有用である。

なぜならば、それらは一般に宿主域が広いからである。その例としては、Ｓ’／ ４０初期遺伝子エンハンサ−［Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）、ＥＭＢＯＪ、　 ４：　７６１］　およびラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　５ａｒｃ。

１＋ＨＶｉｒｕｓ＞の長い末端繰り返しくＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモ ーター：Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、７９豆：　５７７７］およびヒトサイトメガロウィルス由来のエンハン サ−／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ　ら、薊旦ユ旦屈、５２１頁１９８５年） がある。さらに、いくつかのエンハンサーは、制御可能であり、ホルモンまたは 金属イオンのようなインデューサーが存在する場合にのみ活性になる［５ａｓｓ ｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌ　１ｉ（１９８６）、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅ ｎｅｔ、　２　：　２１５頁；　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３６：　１２３７］。

ＤＮＡ分子は、哺乳類の細胞中で、細胞内発現し得る。プロモーター配列は、Ｄ ＮＡ分子に直接結合され、この場合、組換えタンパク質のＮ末端における第１の アミノ酸は常にメチオニンであり、これはＡＴＧ出発コドンによってコードされ ている。所望によりこのＮ末端は、臭化ンアンとともにインビトロでインキュベ ートすることによってタンパク質から切取ることができる。

あるいは、哺乳類細胞中で外来タンパク質を分泌するリーダー配列フラグメント からなる、融合タンパク質をフードするキメラＤＮＡ分子を作ることによって、 細胞から増殖培地中に外来タンパク質を分泌し得る。好ましくはリーダーフラグ メントと外来遺伝子の間にコードされるプロセッシング部位があり、この部位は インビボまたはインビトロで切断し得る。

リーダー配列フラグメントは一般に、細胞からタンパク質を分泌させる、疎水性 アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。アデノウィルスの三分節リー ダーは、外来タンノくり質を哺乳類細胞内で分泌するリーダー配列の例である。

一般に、哺乳類細胞によって認識される転写終止配列とポリアデニル化配列は、 翻訳停止コドンに対して３゛側に位置する制御領域であり、したがってプロモー ターエレメントとともにコーディング配列の両端に隣接している。成熟ｍＲＮＡ の３゛末端は、部位特異的な転写後の切断とポリアデニル化によって形成される ［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）、Ｃｅ１１．４１＋　３４９：　１；　Ｂ 、ＤＨａｍｅｓとり、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ　ｔｒａｉｌ　−Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｃｒ ｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｃｉ１”中のＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔ ｅｌａｗ（１９８ｇ）”Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　３’ｅｎｄ　ｐｒｏ ｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＲＮＡ＋；　Ｐｒｏｕｄｆｏｏ ｔ（１９８９）、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１４：　１０ ５］。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳し得る ｍＲＮＡを転写させる。転写ターミネータ−／ポリアデニル化シグナルの例とし ては、ＳＶ４０由来のシグナルを含有する。　［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩＱＬ ＬＬ！ＬＫ：　Ａユａｂｏｒａｔｏｒ　５ｌａｎｕａｌ中の　Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら（１９８９）　−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　 ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ”］。

ある遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれている）が存在するとより効率 的に発現し得る。しかしい（つかのｃＤＮＡは、スプラインングングナル（スプ ライスドナーおよびアクセプタ一部位とも呼ばれる）を欠いているベクターから 効率的に発現されている［例えばＧｏｔｈｉｎｇとＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１ ）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９３：　６２０］。イントロンは、スプライスドナーと アクセプタ一部位を含有するコーディング配列内にある介在非コーディング配列 である。この配列は、一時転写産物のポリアデニル化の後、”スプライ／フグと 呼ばれる工程で切除され　［Ｎｅｖｉｎｓ　（１９８３）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５２：　４４１：　Ｇｒｅｅｎ　（１９８６）、Ａｎｎ ｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、２０：　６７１：　Ｐａｄｇｅｔｔら（１９８６）、 Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５５：　１１１９；　Ｂ、Ｄ、Ｈ ａｍｅｓおよびり、　Ｍ、　Ｇ　１ｏ　ｅｒ　［集Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　ｓ　１ｉｃｉｎ中のＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｆａｅｉｓ　 （１９８８）の°ＲＮＡ　５ｐｌｉｃｉＢ、−］。

一般に、上ご己のエレメントは、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび 転写終止配列を包含し、発現構築体に組み合わされる。エンハンサ−１機能的ス プライスドナーとアクセプタ一部位を有するイントロン、およびリーダー配列も また、所望されるなら発現構築体に包含され得る。発現構築物は、哺乳類細胞ま たは細菌のような宿主内に安定に保持し得る染色体外エレメント（例えばプラス ミド）のようなレプリコン内に保持されている場合が多い。哺乳類の複製系とし ては、動物ウィルス由来の複製系を包含し、′ｆｊ１製するためにトランスに作 用する因子が必要である。例えば、ＳＶ４０　［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）、 　Ｃｅ１ｌ　２３：　１７５］　またはポリオーマウィルスのようナハポバウィ ルス類の復製系を包含するプラスミドは、適切なウィルスＴ抗原の存在下で極端 に高いコピー数で複製する。

［、類レプリコンの別の例として、ウシパピローマウィルスとＥＢウィルス（Ｅ ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）由来のレプリコンがある。さらにレプリ コンは、２つの複製系を持ち得る。したがってこの場合、例えば発現のためには 哺乳類の細胞で保持させ得、そしてクローン化および増幅のためには原核宿主に 保持し得る。このような補乳類−細菌シャトルベクターの例としては、　ｐＭＴ ２　［Ｋａｕｆｎ＋ａｎら（１９１１９）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 ９＋９４６］　およびｐＨＥＢＯ［Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）、Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ６：　１０７４コ　がある。

（以下余白） バキュロウィルス　ｎ バ牛ユロウイルスプロモーターは、バキニロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合 し、コーディング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３）転写を 開始し得るすべてのＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５ ゛末端に近接して通常配置される転写開始領域を有し得る。この転写開始領域は 、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位ヲ含ム。バキ二口ウイ ルスプロモーターはまた、エンハンサ−と呼ばれる第ニドメインも有し得る。こ のエンハンサ−は、もし存在する場合には、通常、構造遺伝子から離れた場所に ある。発現は、制御されるかまたは構成性であり得る。

感染サイクルの後期において豊富に転写される遺伝子をコードする配列は、特に 有用なプロモーター配列を提供する。

その例としては、ポリヘトリン由来の配列［Ｆｒ１ｅｓｅｎら、（１９８６）　 Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ 　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）の＋Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−：ヨーロノ パ特許公開第１２７．８３９号および第１５５．４７６号］、およびｐｌＱ　［ Ｖｌａｋら、（１９８８）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　５９ニア６５］遺 伝子が挙げられる。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され鼻る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接 連結され得る。その場合、組換えタンパク質のＮ末端の第一アミノ酸は、常に、 ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望されるなら、Ｎ 末端のメチオニンは、臭化シアンと共にインビトロでインキュベーションするこ とによって、タンパク質から開裂され得る。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。内因性酵母タンパク質または 他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコーディ ング配列の５゛末端に融合される。発現すると、この構築物は、２つのアミノ酸 配列の融合を提供し得る。例えば、ポリヘトリン遺伝子のＮ末端は、外来の遺伝 子の５゛末端で連結され、酵母中で発現され得る。２つのアミノ酸配列の結合部 のＤＮＡ配列は、開裂可能な部位をコードし得るか、またはコードし得ない。Ｌ ｕｃｋｏｗら、（１９８８）　Ｂｉ。

ム２エニ匝■」：４７を参照のこと。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を生成することによって細 胞から分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、昆虫において外来タンパク質の 分泌を促すリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードする。リー ダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を誘導する疎水性 アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、バキュロウィルスポリヘトリン遺伝 子のような、昆虫またはバキュロウィルスの分泌されるタンパク質の遺伝子由来 であり得る［Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８８）　Ｇｅｎｅ　７３：４０９］ 。あるいは、ヒトαインターフェロン［Ｍａｅｄａら、（１９８５）　Ｎａｔｕ ｒｅ　３１５：５９２］、ヒトガストリン放出ペプチド［Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒ ｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂ匹上８：３１Ｚ ９］、　ヒ　トＩＬ−２［Ｓｍ１ｔｈら、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、ＡｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ　８２：８４０４］、マウスＩＬ−３ＣＭｉｙａｊ ｉｍａら、（１９８７）　Ｇｅ七二５８：２７３］、およびヒトグルコセレブロ ンターゼ［Ｍａｒｔｉｎう、（１９８８）　ＤＮＡ　７：９９］のような非バキ ュロウィルス起源のリーダーはまた、昆虫において分泌を促す。

通常、昆虫によって認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３°に位置す る制御配列であるため、プロモーターと共にコーディング配列の側面に位置する 。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍ ＲＮＡの転写を方向づける。例としては、ポリヘトリン遺伝子由来の転写終止配 列が挙げられる［ＭｉＩｌｅｒら、（１９８８）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　４２：１７７］。

外来の遺伝子をバキュロウィルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、リーダ ー（所望されるなら）、目的のコーディング配列、および転写終止配列を含む上 記成分は、通常、組合されて中間置換体構築物となる。中間置換体構築物は、し ばしば、バクテリアのような宿主中に安定して維持され得る染色体外エレメント （例えば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維持される。レプリコンは 複製系を有し得るため、クローニングおよび増幅のために原核宿主中に維持され 得る。構築物のプロモーターおよび転写終止配列は、通常、二重交叉組換えによ って外来遺伝子をバキュロウィルスゲノムに取り込むための、バキュロウィルス ゲノムの２．５ｋｂセクンコンを含み、バキュロウィルス発現ベクターを生成し 得るＥＭｉｌｌｅｒら、（１９８９）　肛匹１１■」：　９１　］。バキュロウ ィルス発現ヘベクタは、通常、感染性組換えバキュロウィルスにパッケージされ る。

バキュロウィルス発現ベクターを使用する際には、抗生物質抵抗性遺伝子のよう な選択可能なマーカーは、一般的には、使用されない。選択は、通常、閉塞体（ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）を肉眼で観察することによってなされる。選択 可能なマーカーの使用に関する例は、本明細書の至るところに記載されている。

組換えバキュロウィルス発現ベクターが、いくつかの昆虫細胞に感染させるため に開発されている。例えば、特に、口出、およびＴｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａｎｉ 　［Ｐ、Ｃ，Ｔ、　ＷＯ８９１０４６５９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｆら、　（１ ９８５）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５６：１５３：　Ｓ＋ｎｊｔｈら、　（１９８３＞ 　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３：２１５６：　Ｗｒｉｇｈｔ　（１９８ ６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１ニア１８：　一般に、Ｆｒａｓｅｒら、（１９８９ ）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２５＋２２５を参 照のことコのような組換えパ牛ユ口ウイルスが、開発されている。

外因性ＤＮＡを昆虫宿主に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、 一般に、宿主昆虫細胞をＤＮＡでトランスフェクトするか、または昆虫細胞もし くは生きた昆虫、通常、幼虫をウィルスに感染させることを含む。トランスフェ クンコン手法は、本来哺乳類細胞のために開発されたリン酸カル／ウム手法［Ｇ ｒａｈａｍら、（１９７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６コに基づく。

［）ＮＡ　Ｉ−ランスフエタン３ンおよびウィルス感染手法は、通常、形質転換 される昆虫種によって変わる。例えば、赳造又１吐［Ｃａｒｓｔｅｎｓ　ら、（ １９８０）　Ｖｉｒｏｌｏ　１０１：３１１コ　、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　（ｖｉ ｒｅｓｃｅｎｓ）　［Ｐ、Ｃ，Ｔ、公開第ＷＯ３８１０２０３０号］、５ｐｏｄ ｏｐｔｅｒａ　［Ｋａｎｇ（１９８８）　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｕｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、３５巻の−ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ　ｆｏ ｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅｓ−］を参照のこ と０バクテリア　ｎ バクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリメラーゼを結合し、コーディ ング配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３°）転写を開始し得る すべてのＤＮＡ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５°末端に近 接して通常配置される転写開始領域を有し得る。この転写開始領域は、通常、Ｒ ＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バクテリアプロモーター はまた、オペレーターと呼ばれる第ニドメインも含み、このオペレーターは、Ｒ ＮＡ合成が開始する隣接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位に重なり得る。オペレー ターは、リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それによって特定 的遺伝子の転写を阻害する遺伝子として、負の調節された（誘導可能な）転写を 可能にする。構成的な発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存 在下で発生し得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクティベータータンパク質結 合配列によって成し遂げられ得る。この遺伝子アクティベータータンパク質配列 は、存在する場合には、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に近接して（５゛） に位置する。遺伝子アクティベータータンパク質の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ刈ユ（旦、　ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロノの転写開始を助ける、 カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる［　Ｒａ１ｂａｕｄら、 （１９８４）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、１８：１７３］。従って、 制御される発現は、ポジティブまたはネガティブであり、それによって転写を向 上または減少させる得る。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。そ の例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）　［Ｃｈａｎｇら、（１９ ７７）　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６］、およびマルトースのような糖代謝 酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン＜ ｔｓｉ）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられるＣ　Ｇｏｅｄ ｄｅｌら、（１９８０）　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７；　Ｙｅ ｌｖｅｒｔｏｎら、　（１９８１）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９ニ ア３１；米国特許第４．７３８．９２１号；ヨーロッパ特許公開第３６．７７６ 号および第１２１．７７５号］。γ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ　（１９８１）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３　（１、Ｇｒｅ ｓｓｅｒ編）の−Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ 　ｏｔｈｅｒ　ｍ１ｓｔａｋｅｓ、　”］、ババクテリオファージλＰＬ　［Ｓ ｈｉｍａｊａｋｅら、（１９８］）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８］およびＴ ５［米国特許第４．６８９．４０６号コブロモーター系もまた、有用なプロモー ター配列を提供する。

さらに、天然にない合成プロモーターはまた、バクテリアプロモータとして機能 する。例えば、１つのバクテリアまたはバクテリオファージプロモーターの転写 活性化配列は、池のバクテリアまたはバクテリオファージプロモーターのオペロ ン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する［米国特許第４． ５５１．４３３号コ。例えば、雲プロモーターは、ｍプロモーター配列、および 主リプレッサーによって制御されるエオペロン配列の両方を含むハイブリッドｍ −ｉ匹プロモーターである［Ａｍａｎｎら、（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５：１ ６７；　ｄａＢｏｅｒら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、８０：２１］。さらに、バクテリアプロモーターは、バクテリアＲＮＡポリ メラーゼを結合し、転写を開始する能力を有する非バクテリア起源の天然に存在 するプロモーターを含み得る。非バクテリア起源の天然に存在するプロモーター はまた、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと連結し得、原核生物のいくつかの遺 伝子を高度なレベルで発現する。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である［５ｔｕｄｉｅｒら、 　（１９８６）　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８９：１１３；　Ｔａｂｏｒら、 　（１９８５）　Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　８２：１０７４］ 。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーター および旦、　ｃｏｌｉオペレーター領域を含み得るＣヨーロッパ特許公開第２６ ７．８５１号］。

機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリポソーム結合部位はまた、原核 生物における外来遺伝子の発現に有用である。旦、岨且において、リポソーム結 合部位は、ンヤイングルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）お よび開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流にある長さ３−９のヌクレオチドの 配列を含む（’５ｈｉｎｅら、（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４］。

ＳＤ配列は、ＳＤ配列およびＥ、　ｃｏｌｉ　１６ｓ　ｒＲＮＡの３°末端との 開の塩基の対合によって、ｍＲＮＡのリポソームへの結合を促進すると考えられ ているＪＳｔｅｉｔｚら、＜１９７９）　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅ　ｕｌａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ：　Ｇｅｎｅ　ＥＸ　ｒｅｓｓｉｏ ｎ　（Ｒ，Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）の＋Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌ ｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｓｓｅｎ ｇｅｒ　ＲＮＡ”コ。弱いリポソーム結合部位て真核遺伝子および原核遺伝子を 発現すること［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｔａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌの＋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ、−ｉ。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子に直接 連結され得、この場合、Ｎ末端の第一アミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによ ってコードされるメチオニンである。所望されるなら、Ｎ末端のメチオニンは、 臭化ンアンと共にインビトロでインキュベートすることによって、またはバクテ リアメチオニンＮ末端ペプチダーゼと共にインビボもしくはインビトロでインキ ュベートすることによってタンパク質から開裂され得る（ヨーロッパ特許公開第 ２１９．２３７号）。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。通常、内因性バクテリアタン パク貫、または池の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、 異種コーディング配列の５°末端に融合される。発現されると、この構築物は、 ２つのアミノ酸配列の融合物を提供し得る。例えば、バクテリオファージλ細胞 遺伝子は、外来遺伝子の５゛末端に連結され、バクテリア内で発現され得る。得 られた融合タンパク質は、好マシくは、外来遺伝子からバクテリオファージタン パク質を開裂するためにプロセノンング酵素（因子Ｘａ）の部位を保持する［Ｎ ａｇａｉら、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０］。融合タンパク質 はまた、１ａｃＺ　［Ｊｉａら、（１９１１７）　Ｇｅｎｅ　６０：１９７］　 、ｕＩＥ　ＣＡ１１ｅｎら、　（１９８７）　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５： ９３：　Ｍａｋｏｆｆら、　（１９８９）　Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、　１３５：１１］、および匝虹［ヨーロッパ公開第３２４、６４７号］遺伝子 由来の配列を用いて形成され得る。２つのアミノ酸配列の連結部のＤＮＡ配列は 、開裂可能な部位をコードし得るか、またはコードし得ない。他の例としては、 ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）融合タンパク質が挙げられる。このような融 合タンパク質は、好適には外来タンパク質からユビキチンを開裂するために、ブ ロセ、／ング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセノンングプロテアーゼ）の 部位を保持するユピキチン領域を有する。この方法によって、天然の外来タンパ ク質が、単離され得る　［Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）　肛虹ヱ旺虹１１■７ ：６９８］。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を［することによって細胞 から分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、バクテリア中で外来タンパク質を 分泌する／グナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードする ［米国特許第４．３３６．３３６号］。／グナル配列フラグメントは、通常、細 胞からタンパク質の分泌を誘導する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコ ードする。タンパク質は、増殖培地くグラム陽性バクテリア）または細胞の内膜 と外膜との間に位置するペリプラズム空間（グラム陰性バクテリア）に分泌され る。／グナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、インビ ボまたはイノビトロで開裂され得るプロセノ／ノグ部位が存在するのが好ましい 。

適切な／グナル配列をコードするＤＮＡは、旦　ｃｏｌｉ外膜タ外膜タンパクモ 遺伝子Ｊ２Ａ）　［Ｍａｓｕｉら、（１９８３＞　ＥＸ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　 Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　ＥＸ　ｒｅｓｓｉｏｎ；　Ｇｈｒ ａｙｅｂら、　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３：２４３７］およびＥ、　ｃｏ ｌｉアルカリ性ホスファターゼシグナル配列（劇）　［Ｏｋ　ａら、（１９８５ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２ニア２１２］のよう な、分泌されたバクテリアタンパク質の遺伝子由来であり得る。さらなる例とし て、様々なりａｃｉｌｌｕｓ株からのαアミラーゼ遺伝子の／グナル配列は、旦 、　５ｕｂｔｉｌｉｓがらノ異種タンパク質を分泌するために使用され得ル［Ｐ ａ１ｖａう、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　７９：５５８２：　ヨーロッパ特許公開筒２４４．０４２号］。

通常、バクテリアによって認識される転写終止配列は、翻訳終止フドンの３゛に 位置するため、プロモーターと共にコーディング配列の側面に位置する制御領域 である。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドへ翻訳され 得るｍＲＮＡの転写を方向づける。転写終止配列は、しばしば、転写の終止を助 けるステムループ（ｓｔｅｍ　１ｏｏｐ）構造を形成し得る約５０個のヌクレオ チドのＤＮＡ配列を含む。例としては、旦　匹りにおける当遺伝子および池の生 合成遺伝子のような強力なプロモーターを有する遺伝子由来の転写終止配列が挙 げられる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望されるなら）、目的のコーディング配 列および転写終止配列を含む上記の成分は、組合されて発現構築物となる。発現 構築物は、しばしば、バクテリアのような宿主において安定して維持され得る染 色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維持され る。レプリコンは、複製系を有するため、発現またはクローニングおよび増幅の ために、原核宿主中に維持される。さらに、レプリコンは、コピー数の多いまた は少ないプラスミドであり得る。コピー数の多いプラスミドは、一般に、約５か ら約２００の範囲のコピー数を持ち、典型的には約１０から約１５０の範囲のコ ピー数を持つ。コピー数の多いプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも 約１０個、さらに好ましくは少なくとも２０個のプラスミドを含み得る。

ベクターおよび外来タンパク質の宿主に対する影響により、コピー数の多いまた はコピー数の少ないベクターが選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いてバクテリアゲノムに組込まれ 得る。組込みベクターは、通常、ベクターを組込めるバクテリア染色体に相同な 少なくとも１つの配列を含む。組込みは、ベクター中の相同なりＮＡと、バクテ リア染色体との組換えから生じるようである。例えば、様々なｈｃｉｌｌｕｓ株 からのＤＮＡで構築された組込みベクターは、ＢａｃｉｌｌｕΣ染色体に組込ま れる（ヨーロッパ特許公開筒１２７．３２８号）。

組込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾノ配列を含み得 る。

通常、染色体外および組込まれる発現構築物は、形質転換されたバクテリア株を 選択できるように、選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、バクテ リア宿主中で発現サレ、バクテリアをアンピンリン、クロラムフェニコール、エ リスロマイシン、カナマイシン（不オマインン）およびテトラサイクリンのよう な薬物に対して耐性とする遺伝子を含み得る　［Ｄａｖｌｅｓら、（１９７ｇ＞ 　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、’（ｉｃｒｏｂｉｏｌ、３２：４６９］。

選択可能マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロインン生合成 経路における遺伝子のような生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記の成分のい（つかは、形質転換ベクターニおいて組合され得る。

上記のように、形質転換ベクターは、通常、レプリコンにおいて維持されるか、 または組込みベクターに形成される選択可能マーカーを含む。

染色体外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクター は、多くのバクテリアに形質転換されるために開発されている。例えば、発現ベ クターが、特に、以下のバクテリアで開発されている：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ ｕｂｔｉｌｉｓ　［Ｐａ１ｖａら、　（１９８２）　Ｐｒｏｃ、’１ａｔ１．　 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：５５８２；　ヨーロッパ特許公開東３６，２ ５９号および第６３．９５３号、Ｐ、Ｃ，Ｔ、　Ｎ０８４１０４５４１コ　、　 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｒｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）　 Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８：　Ａｍａｎｎら、　（１９８５）　Ｇｅｎｅ　 ４０：１８３；　５ｔｕｄｉｅｒら、　（１９８６）　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、　１８９：１１３；　ヨーロッパ特許公開筒３６．７７６号、第１３６．８２ ９号および第１３６．９０７号：英国特許出願第８４１８２７３号］、５ｔｒｅ 　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　［Ｐｏｗｅｌｌら、　＜１９８８）　 Ａ　１．　ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５］　；　５ｔｒｅ 　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ　［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）　Ａ 　１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｓ４：６５５］、録」担旦 団井ｓ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　Ｃ米国特許第４．７４５．０５６号１゜外因性ＤＮ Ａをバクテリア宿主に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、通常 、ＣａＣｌ２で処理したバクテリアまたは二価のカチオンおよびＤＭＳＯのよう な他の物質で処理したバクテリアの形質転換を含む。Ｄ＋ＩＡはまた、エレクト ロボレー／コンによって、バクテリア細胞に導入され得る。形質転換手法は、通 常、形質転換されるバクテリア種に応じて変化する。例えば、　１Ｍａｓｓｏｎ ら、（１９ｇ９）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、６０：２７３； 　Ｐａ１ｖａら、　（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　７９：５５８２：　ヨーロッパ特許公開筒３６．２５９号および第６３． ９５３号；ｐ、ｃＴ、Ｗｏ　１１４１０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］　、　［ Ｍｉｌｌｅｒら、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ８５：８５６；　Ｗａｎｇら、　（１９９０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１７２：９４９、（：ａｍｌ□ｂａｃｔｅｒ］、　［Ｃｏｈｅｎら、　（１９７ ３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、６９：２１１０；　Ｄｏｗｅｒ ら、　（１９Ｈ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−１６：６１２７；　 Ｋｕｓｈｎｅｒ　（１９７８）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　：　 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｉｔｏｎａｌ　Ｓ　ｍ 　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅ■■（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙ ｅｒおよびＳ、　Ｎ１ｃｏｓｉａＷ）の−Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈａ ｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ口ｏｎ　ｏｒ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　ｗｉｔｈ　ＣｏｌＥｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｌａｓｌｌｉｄｓ”；　Ｍ ａｎｄｅＬら、　（１９７０）　Ｊ、Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、５３：１５９；　Ｔａ ｋｅｔｏ（１９８Ｂ）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｅｔａ　９４９： ３１８：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］　、　［Ｃｈａｓｓｙら、　（１９８？） 　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、４４：１７３　Ｌａｃｔｏｂａｃ ｉｌｌｕｓコ　；　［Ｆｉｅｄｌｅｒら、（１９８８）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ１７０：３８、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｌ　；　口Ａｕｇｕｓｔｔｎら 、　（１９９０）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、６６：２０３． 　Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ］、　［Ｂａｒａｎｙら、　（１９８０）　Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４：５９８；　Ｉ（ａｒｌａｎｄｅｒ　（１９８？ ＞　ト工］已旦■匹ｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｊ、　Ｆｅｒｒｅｔｔｉおよ びＲ，Ｃｕｒｔｆｓｓ編１１１）の＋Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｆｏｎ　ｏｆ　５ ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｔ ｏｎ”　；　Ｐｅｒｒｙら、　（１９８１）　１ｎｆｅｃ、１ｍｍｕｎ、３２： １２９５；　Ｐｏｗｅｌｌら、　（１９８８）　Ａ　１．　Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４：６５５：　Ｓｏｍｋｕｔｉら、　（１９８吐ｆｆｉ系 酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コーディング配列（ 例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３゛）転写を開始するすべてのＤＮ Ａ配列である。プロモーターは、コーディング配列の５′末端に近接して通常位 置する転写開始領域を有し得る。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラー ゼ結合部位（ｒＴＡＴＡボックスＪ）および転写開始部位を含む。

酵母プロモーターはまた、上流アクティベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第ニ ドメインを有し、もし存在するなら、この第ニドメインは、通常、構造遺伝子か ら離れて位置する。ＵＡＳは、制御された（誘導可能な）発現を可能にする。構 成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。制限された発現は、ポジティブまたは ネガティブであり得、転写を向上または減少させる。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵微生物であるため、代謝経路における酵素 をフードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例としては 、アルコールデヒドロゲナーゼ ノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフニートイ゛ツメラーゼ、グ リセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（　ＧＡＰまたはＧＡ ＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレート ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）　（ヨー口ｙ　）＜特許公開第 ３２９２０３号）力（挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母二遺伝 子はまた、有用なプロモーター配列を提供する［　Ｍｙａｎｏｈａｒａら、（１ ９８３）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０：１ １。

さらに、天然には存在しない合成プロモーターはまた、酵母プロモーターとして も機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのｔｌＡｓ配列は、他の酵母プロ モーターの転写活性化領域と結合し得、合成ノ・イブリッドプロモーターを形成 する。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領 域に結合したＡＤＨ制御配列が挙げられる（米国特許東４、　８７６、　１９７ 号および第４．　８８０．　７３４号）。ノ＼イブリントプロモーターのその池 の例としては、什…、Ｕ貝、−、また（よ租競遺伝子のいずれかの制御配列から なり、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合 わせられたプロモーターが挙げられる（ヨーロノノ〈特許公開第１６４５５６号 ）。

さらに、酵母プロモータは、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し、転写を開始する 能力を有する非酵母起源の天然ｉこ存在するプロモーターを含み得る。このよう なプロモーターの例としては、特に、　［Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）　Ｐｒ立 虹−ロエＬ二４ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ二＋７：１０７８：　Ｈｅｎｉｋｏ ｆｆら、　（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ ｇら、（１９８１）　Ｃｕｒｒ．　Ｔｏ　ｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．　９６：１１９；　）Ｉ。

１　１ｅｎｂｅｒｇら、　（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍ−土り土 −上ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ−ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉｎ　ｏｒｔ ａｎｃｅ　（ＫＩＮ＞　ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．　Ｐｕｈｌｅｒｍ）の−Ｔｈｅ 　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　 Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−：！Ｉ！ｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌ ｏｎら、　（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１１：１６３；　Ｐａｎｔｈｉｅｒら、　 （１９１１０）　Ｃｕｒｒ。

Ｇｅｎｅｔ．　２：１０９：］を包含する。

ＤＮＡ分子は、酵母中で細胞内で発現され得る。プロモーター配列はＤＮＡ分子 に直接連結され得る。この場合、組換えタン、＜り實のＮ末瑞第−アミノ酸は、 常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望されるな ら、Ｎ末端のメチオニンは、臭化ンアンと共にインビトロでインキュベートする ことによって、タン、ｆり質から開裂され得る。

融合タンパク質は、直接発現の代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質 または池の適切なタン／くり貫のＮ末）寓部分をニードするＤＮＡ配列は、異種 コーディング配ｙ＋１の５°末ン嵩１こ融合される。発現すると、この構築物（ よ、２つのアミノ酸配り１ｊの融合物を提供し得る。例えば、酵母またはヒトス ーツくーオキシドジスムターゼ（　ＳＯＤ）遺伝子は、外来の遺伝子の５゛末端 で連結され得、酵母中で発現する。２つのアミノ酸配列の結合部の［＞ＨＡ配列 は、開裂可能な部位をコードし得るか、またはコードし得ない。例えば、ヨーロ ッパ特許公開第１９６０５６号を参照のこと。他の例としては、ユビキチン融合 タン／ｆり質が挙げられる。このような融合タンパク質は、外来タン／（り質か らユビキチンを開裂するために、好ましくはプロセッシング酵素（例えば、ユビ キチン特異的プロセノンングブロテアーゼ）の部位を保持するユビキチン領域を 用いて形成される。

従って、この方法によって、天然の外来タンｔ４り質は、単離され得る（１９８ ９年８月７日付けで提出された米国特許出願第３５９、　５９９号と同一出願人 のＰ．Ｃ．τ．　Ｎｏ　１１８１０２４０６６、この開示は、本願では参考のた めに援用している）。この系は、ＩＧＦＢＰ−４を生産するための現在好ましい 系である。

あるいは、外来タンパク質はまた、キメラＤＮＡ分子を形成することによって細 胞から増殖培地に分泌され得る。このキメラＤＮＡ分子は、酵母中で外来タンパ ク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンノ＜り質をコー ドする。

好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて開裂され得る、リーダーフラグ メントと外来遺伝子との間でコードされるプロセッシング部位がある。リーダー 配列フラグメントは、通常、細胞からタンパク質の分泌を誘導する疎水性アミノ 酸を含むシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ヨーロ ッパ公開第１２８７３号、　Ｊ、Ｐ、Ｏ，公開第６２．０９６゜０８６号）およ びＡ因子遺伝子（米国特許第４．５８８．６８４号）のような分泌される酵母タ ンパク質の遺伝子由来であり得る。あるいは、インターフェロンリーダーのよう な、酵母中での分泌を提供する非酵母起源のリーダーが存在する（ヨーロア７で 特許公開第６００５７号）。

好ましいクラスの分泌リーダーは、「プレ”ｐｒｅ”」シグナル配列と「プロ” ｐｒｏ”」領域の両方を含む、酵母α因子遺伝子のフラグメントを用いるリーダ ーである。使用され得るα因子フラグメントのタイプには、全長プレープロα因 子リーダー（約８３個のアミノ酸残基）および一部欠けたα因子リーダー（通常 約２５から約５０個のアミノ酸残基）が含まれる（米国特許第４．５４６．０８ ３号および第４．８７０．００８号；　Ｅ　Ｏ、、ｔ＜特許公開第３２４２７４ 号）。分泌を促すアルファ因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダ ーには、第一の酵母のプレ配列、第二の酵母のプロ領域で形成される７％イブリ ッドα因子リーダーが含マレル（例えば、Ｐ、Ｃ，Ｔ、　Ｗｏ　８９１０２４６ ３を参照のこと）通常、酵母によって認識される転写終止配列は、翻訳終止コド ンの３°に位置する制御領域であり、プロモーターと共にコーディング配列の側 面に位置する。これらの配列は、ＤＮＡによってフードされるポリペプチドに翻 訳され得る＋ａＲＮＡの転写を方向づける。転写終止配列および解糖系酵素をコ ードする配列のような、他の酵母で認識される終止配列の例。

通常、プロモーター、リーダー（所望されるなら）、目的のコーディング配列お よび転写終止配列を含む上記の成分は、組合されて発現構築物となる。発現構築 物は、しばしば、酵母またはバクテリアのような宿主において安定して維持され 得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコンにおいて維 持される。レプリコンは、２つの復製系を有するため、例えば、発現のための酵 母中で、ならびにクローニングおよび増幅のための原核宿主中に維持される。こ のような酵母−バクチリアシャトルベクターの例としては、ＹＥｐ２４が含まれ る［Ｂ□ｔｓｔｅｔｎら、（１９７９）　Ｇｅｎｅ　ｉ：１７−２４コ、ｐｃｉ ／１　［Ｂｒａｋｅら、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ　ＵＳＡ　８　：４６４２−４６４６］、およびＹＲＩ３１７　［Ｓｔｉｎｃ ｈｃｏｍｂら、＜１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１５８：１５７］。さらに、レプリコンは、コピー数の多いまたは少ないプラス ミドであり得る。コピー数の多いプラスミドは、一般に、約５から約２００の範 囲のコピー数を有し、典型的には約１０から約１５０の範囲である。コピー数の 多いプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、さらに好ましく は少なくとも２０個のプラスミドを含み得る。ベクターおよび外来タンパク質の 宿主に対する影響に応じて、コピー数の多いまたはコピー数の少ないベクターが 選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、上記を参照のこと。

あるいは、発現構築物は、組込みベクターを用いて酵母ゲノムに組込まれる。組 込みベクターは、通常、ベクターを組込む酵母染色体に相同な少なくとも１つの 配列を含み、好ましくは、発現構築物の両側にある２つの相同な配列を含む。組 込みは、ベクター中の相同なりＮＡと、酵母染色体との組換えから生じるよって ある［０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｍｏｌ、　１０１：２２８−２４５］。組込みベクターは、ベクターに含まれる のに適切な相同配列を選択することによって、酵母中の特定の遺伝子座に方向つ けられ得る。０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、上記を参照のこと。１つまたはそれ以上 の発現構築物が組込み得、生産された組換えタンパク質のレベルに影響し得る［ Ｒｉｎｅら、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８０：６７５０］。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中の単 一セグメントとして存在し、ベクター全体を組込むか、または染色体中の隣接す るセグメントに相同で、ベクター中の発現構築物の両側（こ存在、する２つのセ グメントとして存在し、発現構築物のみを安定して組込み得る。

通常、染色体外構築物および組込み発現構築物は、形質転換された酵母株を選択 できるように、選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、ＡＤＨ２、 ）ＩＩ３４、ＬＥＵ２、凹およびＡｌＯ２のような、酵母宿主中で発現され得る 生合成遺伝子、および酵母細胞中に、ツニカマインンおよびＧ４１８耐性を供与 するＧ４１８耐性遺伝子をそれぞれ含み得る。さらに、適切な選択可能マーカー はまた、酵母に、金属のような毒性化合物の存在下で増殖する能力を与える。例 えば、ＣＵＰＩの存在により、酵母は、銅イオンの存在下で増殖する［Ｂｕｔｔ ら、（１９ｇ？）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｖ、Ｓｌ：３５１］。

あるいは、上記の成分のい（つかは、組合されて形質転換ベクターになり得る。

上記のように、形質転換ベクターは、通常、レプリコンに保持されるか、または 組込みベクターに組込まれる選択可能マーカーを含む。

細胞外レプリコンまたは組込みベクターである、発現および形質転換ベクターが 、多くの酵母の形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、特 に以下の酵母について開発されている：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　 ［Ｋｕｒｔｚら、（１９８６）Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：１４２］ 　、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ　［Ｋｕｎｚｅら、９１９８５）　Ｊ、　 Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２Ｓ：１４１］、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　凹 且１圧的Ｍ　［Ｇｌｅｅｓｏｎら、　（１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、１３２：３４５９；　Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、　（１９８６）　Ｍｏ １．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２＋３０２１　、ｕＩＬ但Ｌ」囮Ｄ」ＩＬ口ｓ ［Ｄａｓら、　（１９８４）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１５５］　 。

Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ　［Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ら、＜１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔチ１１Ｌ−七ハニア３７；　Ｖａｎ　Ｄｅｎ　 Ｂｅｒｇら、　（１９９０）　氾Ａムｒｅｃｈｎｏ土幻ホｉ：１３５］　、Ｐｉ ｃｈｉａ　ＬＬＬ上１ｅｒｉｍｏｎｄｉユ［Ｋｕｎｚｅら、　（１９８５）　Ｊ 、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２５：１４１］、Ｐｉｃｈｉａ　凹１臘Ｌ 」［Ｃｒｅｇｇら５（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：３ ３７６；米国特許第４．８３７．１４８号および第４．９２９．５５５号］、Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　［Ｈｉｎｎｅｎら、（１９ ７ｇ）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７５：　１９２９； 　Ｉｔｏら、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５３：１６３］、 Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　匹皇巨［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓ ｅ　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０６］、およびＹａｒｒｏｗｉａ 　Ｌｌｌは工ｉｃａ　［Ｄａｖｉｄｏｗら、（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ ｔ、１０：３８０４７１　Ｇａ１１１ａｒｄｉｎら、　（１９８５）　Ｃｕｒｒ 、Ｇｅｎｅｔ、１０：４９］。

外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当該技術分野において公知であり、 通常、スフェロプラストまたはアルカリカチオンで処理した無傷の酵母細胞の形 質転換を含む。形質転換手法は、通常、形質転換される酵母種に応じて変わる。

例えば、　［Ｋｕｒｔｚら、（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 ６：１４２；　Ｋｕｎｚｅら、９１９８５）　Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、　２５＋１４１；　Ｃａｎｄｉｄａ］　；　［Ｇｌｅｅｓ。

ｎら、９１９８６）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３２：３４５９ＨＲ ｏｇｇｅｎｋａｍｐら、（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０２ ：３０２；　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ］　；　口Ｄａｓら、（１９８４）　Ｊ、Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、１５８：１１６５；　Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、　（ １９１１３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４：１１６５；　Ｖａｎ　ｄｅｎ 　Ｂｅｒｇら、（１９９０）　ＢＵｉＬＸ虹上厄江如ヒｉ：１３５；　Ｋｌｕ　 ｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ］　；　［Ｃｒｅｇｇら、（１９８５）　Ｍ。

１、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、５：３３７６；　Ｋｕｎｚｅら、　（１９８５）　 Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒ。

二２５：１４１；米国特許第４．８３７．１４８号および第４．９２９．５５５ 号；Ｐｉｃｈｉａ］　：　［Ｈｉｎｎｅｎら、　（１９７８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５；１９２９；　ｌｔｏら、（１９８３） 　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ’ｏ１．　１５３：１６３５ａｃｃｈａｒｙコ　；　［Ｂｅ ａｃｈおよびＮｕｒｓｅ　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０６；　Ｓ ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ］　；　［Ｄａｖｉｄｏｗら、　（１９ ８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ。

１０：３９：　Ｇａ１１１ａｒｄｉｎら、（１９８５）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ 、１０：４９＋　Ｙａｒｒｏｖ艮１０ を　いた珍 本発明の抗原および遺伝子物質を含む組成物は、診断ア。

セイにおいて使用され得る。得られる生物学的に有用な情報のうちの１つに、過 剰な結合タンパク質のレベルがあり、これは、膿瘍の存在による。そのため、Ｉ ＧＦまたはＩＧＦＢＰ結合タンパク質のうちの１つの産生が増加している（なぜ なら、結合タンパク質は、過剰なＩＧＦの存在下で生産されるから）。さらに、 多数の公知の疾患は、ＩＧＦの濃度と関連し得る。例えば、い（つかのタイプの オステオポローシスは、ＩＧＦレベルと関連している。さらに、結合タンパク質 は、組換えによって生産されたＩＧＦ類の同定、生産および精製に使用され得る 。［ＧＦＢＰ−４の存在を検出する方法には、血液試料、髄液、または腫瘍もし くは骨組織のような生物学試料を分析することが含まれる。

通常、本発明の結合タンパク質のような分析物を検出する方法は、免疫アッセイ に基づいている。このような技術は公知であり、ここで詳細を述べる必要はない 。例としては、異種および同種免疫アッセイ技術が含まれる。この技術は両方と も、結合タンパク質とそれに対応する特異的抗体との間に免疫複合体を形成する ことに基づいている。ＩＧＦＢＰ−４の異種アッセイでは、通常、固体表面に結 合した特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する。サンド ウィッチアッセイは、次第にポピユラーとなってきている。固相の非存在下の溶 液中で行われる同種アッセイもまた、使用され得る。これは、例えば、遊離抗体 を酵素−抗原結合体に結合することによってもたらされる酵素活性の相違を決定 することによる。多数の適切なアッセイは、米国特許第３，８１７，８３７号、 第４．００５．３６０号、および第３．９９６．３４５号に記載されている。

上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質物質を、高分子ビーズ、デ ィノブスティノク、またはフィルター物質のような固体支持体物質に付着させる 公知の技術によって調製される。これらの付着方法は、一般に、タンパク質を支 持体に非特異的に吸着させること、またはタンパク質を、通常、遊離アミン基を 解して、活性カルボキシル基、ヒドロキシル基またはアルデヒド基のような固体 支持体上の化学的に反応性の基に共有結合させることを含む。

同種アッセイとして知られている第二の診断影響において、分析物に結合する抗 体は、培地中で直接検出され得る反応培地にいくつかの変化をもたらす。これま で提案された公知の一般的なタイプの同種アッセイは、以下のものを含む：（ａ ）スピン標識されたリポータ−であって、抗原に結合する抗体が、リポートされ た可動性の変化（スピン分割ピークが広がること）によって検出される、リポー タ−；（ｂ）結合が蛍光効力の変化によって検出される、蛍光リポータ−；（Ｃ ）抗体結合が、酵素／基質相互反応に影響を与える、酵素リポータ−；および（ ｄ）結合によりリポソームが溶解し、カプセル化されたリポータ−が放出される 、リポソーム結合リポータ−６本発明のタンパク質抗原に対するこれらの方法の 適用は、同種アッセイ試薬を調製するための従来の方法に従う。

ｌ旦王グユニブを　しての袷　の「 本発明の遺伝子物質は、それ自身、天然の物質中に存在する遺伝子物質に対する プローブとして多くのアッセイに使用され得る。分析物は、（通常）少なくとも 約１６個の連続ヌクレオチド、通常は３０から２００のヌクレオチド、最高は上 記に示す配列（ｃＤＮＡ配列）の実質的に全長の配列を含むプローブにハイブリ ダイズするヌクレオチド配列であり得る。分析物はＲＮＡもしくはｃＤＮＡであ り得る。試料は、典型的には前の章に記載の通りである。陽性の結果は一般的に は、明細書に記載の配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの配列と少なく とも約７０％相同である配列、通常は、配列中の少なくとも約６０の連続ヌクレ オチドと少なくとも約８０％相同である配列を含む遺伝子物質を同定することと して特徴づけられる。そして実質的には、全長配列に相同である配列を含み得る 。分析物を検出するために、分析物がプローブにハイブリダイズする場合には、 そのプローブは検出標識を含有し得る。特に、結合タンパク質を検出するのに有 用であるプローブは、これらのタンハク質の保存領域、特に、ＢＰ４＋７）７　 ミ／酸１８１−１９１　（ＰＮＣＤ）およびアミノ酸２１２−２１５　（ＣＷＣ Ｖ）からの保存領域に基づく。これらのアミノ酸は、関連のＩＯＦ結合タンパク 質のすべてに高度に保存されている。ＩＧＦＢＰ−１のみが異なり、１９１位の ＤがＮである。

襟的核酸の増幅のための１つの方法である、ハイブリダイゼー／ｇンアノセイに よる後の分析のための方法は、ポリメラーゼチェーン　リアク／ｇンすなわちＰ ＣＲ法として知られている。ＰＣＲ法は、疑わしい試料中で本発明のＩＧＦＢＰ −４を検出するだめに適用され得る。この中で、互いに間隔を隔てた、明細書に おける前述の遺伝子配列に基づくオリゴヌクレオチドブライマーを用いる。この プライマーは、２本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれのストランドに相捕的であり、典型 的には約５０から４５０　ｎｔもしくはそれを越えて（通常は２０００　ｎｔを 越えない）離れテイル。この方法には、特定のオリゴヌクレオチドブライマーの 調製および次に標的ＤＮＡの変性の繰り返しサイクル、プライマー結合、および ＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって、プライマー間の間隔に基づく予測され る長さのＤＮＡフラグメントを得ること、が含まれる。１つのプライマーから生 成された伸長産物は、もう一方のプライマーのさらなる標的配列として作用する 。標的配列の増幅の程度は、実施されるサイクル数により制御され、簡単な式２ ｎにより理論的に算出される。

（ここで、ｎはサイクル数である。）１サイクルあたりの平均効率が、約６５％ から８５％の範囲である場合には、２５サイクルで、標的配列の０３から４．８ 　Ｘ　１，０００．０００コピーが産生される。ＰＣＲ法は、５ａｉｋｉら、５ ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２３０：１３５０−１３５４：　５ａｉｋｉら、 Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　３２４：１６３−１６６；および５ｃｈａｒｆら 、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：１０７６−１０７８を含む多くの文 献に記載されている。さらに、米国特許第４．６８３．１９４号、第４．６８３ ．１９５号および第４．６８３゜２０２号を参照のこと。

本発明は、ＩＧＦＢＰ−４をコードするＤＮＡフラグメントの選択的増幅に基づ く、ＩＧＦＢＰ−４を測定するための特異的な診断法を含む。この方法は、図１ に示す配列から選択されたＤＮＡの２本鎖フラグメントのそれぞれのストランド の非相同領域由来の一対の１本鎖プライマーを使用する。本発明の１局面をなす これらの「ブライマーフラグメント」は、上記のよにＩＧＦＢＰ−４フラグメン トから調製される。この方法では、上記に検討したように、米国特許第４．６８ ３．２０２号に開示されているとおり、選択された核酸配列を増幅するための方 法に従う。

モノクローナル ＩＧＦＢＰ−４に対する抗体および抗イデイオタイプ抗体のインビボ使用、なら びに診断への使用の両方には、モノクローナル抗体の使用が好ましい。モノクロ ーナル抗ウイルス粒子抗体あるいは抗イデイオタイプ抗体は、以下のように産生 され得る。免疫された動物から膵臓あるいは白血球を取り出し、当業者に公知の 方法により、不死化するかあるいは使用して、ハイブリドーマを調製する。ヒト −ヒトハイブリドーマを産生ずるために、ヒト白血球ドナーを選択する。エプス タイン・バールウィルス（ＥＢ’／）が、ヒト白血球の不死化に使用され得るか 、あるいはヒト融合パートナ−がヒト−ヒトハイブリドーマを産生ずるために使 用され得る。ペプチドによるインビトロ−次免疫もまた、ヒトモノクローナル抗 体の生成に使用され得る。不死化細胞により分泌された抗体は、所望の特異性を 有する抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーニングされる。

ＩＧＦＢＰ−４の　畳・　に文・　るアッセイイン／ニリン様成長因子に結合す る性質は、本発明のタンパク質の生物学的性質の１つである。これらのタンパク 質は、好都合にＩＧＦ−１を使用した結合アッセイ［Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ 、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（ １９７８）　２５３２７６９］あるいは、ＩＧＦ−１ｆを使用した、好ましくは 、標識化、例えばヨウ素化形態での＋０Ｆ−１１を使用した結合アッセイ［Ｒｉ ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ、　Ｅ、およびＨｕｍｂａｌ、　Ｒ，Ｅ、、　ＦＥＢＳ　 （１９７８）　８９：２８３］で試験され得る。

例えば、このようなアッセイは、都合よく、本発明のタンパク質のゲル電気泳動 （５ＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施し、後にゲルのウェスタンプｌニア／トを実施し、 次に［＋２５１コＩＧＦ−１もしくはＩＩの存在下にそのプロットをインキユベ ートして、そのプロットを洗浄して遊離のＩＧＦ−１もしくは−＋＋を除き、そ のプロットの放射活性を検出することを含み得る。

匹りヱユ亙 本発明のＩＧＦ−ＢＰ類はもとは、ヒトＩＧＦ−ＢＰ類を意味し、哺乳動物、例 えば、ネズミ、ブタ、ウマもしくはウシのＩＧＦ−ＢＰ類が、必要とされる程度 に相同性を有する限りＩＧＦ−ＢＰ類の定義内に含まれる。

本発明のＩＧＦ−ＢＰ類には、組織抽出物あるいは馴化培養培地からの精製物、 ならびに組み換え法により得られるものが含まれる。

（以下余白） ＩＧＦ叶ユ匡ソ１遁 本発明の結合タンパク質の治療上の応用には、単独治療剤としての使用、ＩＧＦ との組み合わせによる使用が含まれ、後者が好ましい。

ＩＧＦとの組み合わせによる使用の場合は、本発明の結合タンパク質は、上記の 表示のような使用、おもに、成長誘導剤、組織再生剤、もしくは傷冶癒剤として の使用に適している。

従って、本発明は以下の（１）、（１１）、（ｉｉｉ）あるいは（ｉｖ）を提供 する。

（ｉ）被験体の成長、組織あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を促進するため の、遊離あるいは固定化されたＩＧＦとの組み合わせでの、本発明の結合タンパ ク質の使用；あるいは、 （ｉｉ）被験体の成長、被験体の組織あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を促 進する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療上有効な量のＩ ＧＦとともに、本発明の結合タンパク質の治療上有効な量を投与することを包含 する、方法；あるいは （ｉｉｉ＞被験体の成長、組繊あるいは器官の再生、もしくは傷治癒を促進する 薬学的組成物であって、本発明の結合タンパク質を、ＩＧＦおよび薬学的に受容 可能なキャリアあるいは希釈剤とともに含有する、組成物；あるいは（ｉｖ）　 ａ合もしくは付随投与についての説明書とともに、本発明の結合タンパク質とＩ ＧＦとを使用まで分離した形態で含有する、パッケイジ。

１ＧＦに関連して、本発明の結合タンパク質は軟骨形成あるいは造血機能を媒介 する特に興味深いものである。このことは、以下のＡからＣの試験によって示さ れ得る。

Ａ）　ＩＧＦは、例えば、胎児ラット頭蓋冠中のコラーゲンおよび非コラーゲン タンパク質への［３旧−プロリンの取り込みの増加によって示されるように、骨 の形成を増大させる。ＩＧＦが、本発明の結合タンパク質の存在下に使用される と、相乗効果を生じる。ラット頭蓋冠の組織培養物は、２１日齢の胎児ラットか ら前頭および後頭部の骨を解剖し、来状縫合にそって分割して、Ｋｒｅａｍらの 方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　（１９８５）　Ｌｕ：２９６）に従って培 養することにより調製する。結合タンパク質あるいはＩＧＦを、培養物１ｍｌあ たり１０から２００　ｎｇの用量範囲で添加する。それらを組み合わせて添加す る場合には、モル比は１：　ｌである。培養は、２４から４８時間行われる。コ ラゲナーゼ消化タンパク質および非コラーゲンタンパク質への〔３旧プロリンの 取り込みを定量するために、骨をホモジネートしたものを、Ｄｉｅｇｅｌｍａｎ 　Ｒ，およびＰｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ　（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　（１９７２） ２８：４４３）の方法、およびｋｒｅａＩＩｌら、　（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ ｇｙ　（１９８５）１１６：２９６）の変法に従って、細菌性コラゲナーゼで消 化する。

Ｂ）　ＩＧＦは、骨からの［４５］Ｃａの放出が減少することによって示される ように、骨吸収を減少させる。ＩＧＦが本発明の結合タンパク質の存在下に使用 されると相乗効果が生じる。この試験は、Ｒａ１ｓｚの原理（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、（１９６５）　４４：１０３）に従って行われる。妊娠ラットに 、妊娠１８日回心［４５］Ｃａを皮下注射する。ＩＧＦを、単独であるいは本発 明の結合タンパク質の存在下で、１匹あたり１０　ｎｇから２００　ｎｇの投与 量で注射する。

結合タンパク質は、ＩＧＦに対するモル比が１：　１になるように加える。１９ 日回心、その動物を殺し、胎児を取り出す。とぅ骨および尺骨の鉱質強化幹を解 剖で取り出し、培養に移す。

骨移植物からの［４５］Ｃａの放出に基づいて、吸収を定量する。

Ｃ〉本発明のＩＧＦ−結合タンパク質および池のＩＧＦ−結合タンパク質は、ｌ ０Ｆ−１のエリトロポエチン様効果を増す。このことは、特に以下のものをＦａ ｇｇ、　Ｂ、　Ｒｏｉｔｓｃｈ、　Ｃ，Ａ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（ １９８６）　Ｌｕ１ｌに記載のＣＦＵ−Ｅアッセイで試験することにより確かめ られ得る。つまり、例えば、１０ｎｇ／＋ｌのＩＧＦ−［。

ＩＧＦ単独ならびに、図１の成熟［ＧＦ結合タンパク質との組み合わせ、例えば 、図１の成熟ＩＧＦ結合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株培養物由来の上清の ５０μｍとの組み合わせを調べる。ＩＧＦ結合結合タンパ単質単独られた結果は 、コントロールと有意な差はないが、一方、ＩＧＦ−１単独と比較して組み合わ せの相乗効果はみられる。

さらに、本発明の結合タンパク質と組み合わせたＩＧＦの分裂促進活性は、以下 のように試験され得る。ＣＣＬ　３９細胞（チャイニースハムスター肺線維芽細 胞）への［３Ｈ］メチルチミジンの取り込みを、Ｐｌｏｕｅ’ｔら、Ｃｅ１１． 　Ｍｉｏｌ、（１９８４）　３０：１０５の記載に従って測定する。このアッセ イでは、細胞株ＣＣＩ　３９を、１０％胎児ウンｍ清、０．１％ベニ／リン、０ ．４％ストレプチマイ／ンおよび０６５％ファンギゾンを含有するＭＥＭ培養培 地（Ｇｉｂｃｏ）　０．５ｍＩ中に、ウェルあたり４０．０００細抱を播種する 。５％ＣＯ２雰囲気下で、３７℃でのインキュベーションを７２時間を行った後 、細胞を、胎児ウソ自涜を含まないＭＥＭ培地で洗浄し、２０時間この培地中で 培養した。この段階で、細胞培養を集密的にし、ＩＧＦあるいは結合タンパク質 、もしくはその両方ともを、培養培地に１０　ｎｇから２００　ｎｇの用量範囲 で各々を混入させる。両方ともを加える場合のモル比は、１：　１であるべきで ある。この試験試料を３７°Ｃで２４時間インキュベートし、次に１０μｌ　Ｐ ＢＳ中の１μＣｉ［３旧メチルチミジンとともに加える。４時間インキ二ヘート した後、メチルチミジンの取り込みを、細胞をＰＢＳで洗浄して停止する。細胞 を０．５ｍｌト’Ｊクロロ酢酸（５％）で３０分間固定し、水で洗浄して、最後 に０．５ｍｌ　ＮａＯＨ０，１Ｍで、２時間３７°Ｃに保って溶解し、溶解物の ０．５ｍｌを／ンチレーションフラスコに移し、そしてβ−放射活性を測定する ために３ｍｌのシンチレーション液と混合する。結合タンパク質は、ＩＧＦのマ イトジェン活性を高める。しかし、結合タンパク質が単独で使用された場合に測 定される放射活性レベルは、実質的にコントロール試料のレベルと相違がない。

さらに詳細には、本発明の結合タンパク質は、ＩＣＦとの組み合わせによって以 下のことに有用である。ａ）下垂体機能減退症、Ｌａｒｏｎタイプ小人症、骨粗 しよう症、貧血、特に合併症をともなう慢性腎不全症、および肝不全あるいは腎 不全を治療するために、ならびにｂ＞ｍ瘍および火傷のような傷、あるいは事故 により生じた傷もしくは手術の結果による傷の治癒を促進するために、有用であ る。

本発明の結合タンパク質に関連する使用のために、ＩＧＦは、Ｒｉｎｄｅｒｋｎ ｅｃｈｔ、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、（１９７８）　２５３：２７６９に記載のＩＧＦ−１、Ｒｉｎｄｅｒｋｎ ｅｃｈｔ、　Ｅ、およびＨｕｍｂｅｌ、　Ｒ，Ｅ、、　ＦＥＢＳ　（１９７８） 　８９：２８３に記載のＩＣＦ−１１、およびインシュリン様成長因子活性を有 する、ＩＧＦ−１ならびにＩＧＦ−１１の誘導体およびフラグメントから選択さ れるのが好ましい。ＩＧＦ−１１が最も好ましい。

ＩＧＦに関連する使用のために、本発明の結合タンパク質は、図１に示すプレＩ ＧＦ−ＢＰもしくはＩＧＦ−ＢＰと、８５％から１００％相同性があるタンパク 質が好ましい。

ＩＧＦに関連しない場合は、本発明の結合タンパク質は、遊離ＩＧＦｓａの過剰 産生による任意の生理学的異常、例えば、乳癌もしくは腎臓癌のようなＩＧＦ産 生癌、糖尿病性増殖網膜症、もしくは、遊離ＩＧＦの直情レベルが高い異常成長 の高身長光に、さらに治療上の応用を有する。

従って、本発明はさらに、以下の（ｉ）、（ｉ　ｉ）、（ｉｉｉ）あるいは（ｉ ｖ）を提供する。

（１）人体などの哺乳動物による、遊離ＩＧＦの過剰産生の結果による生理学的 異常、例えば、ＩＧＦ産生癌、糖尿病性網膜症もしくは高身長被験体の異常成長 を治療するための、本発明の結合タンパク質の使用；あるいは（ｉ　ｉ）遊離Ｉ ＧＦの過剰産生の結果による生理学的異常、例えば、ＩＧＦ産生産生菌尿病性網 膜症もしくは被験体の異常成長を冶療するための方法であって、本発明の結合タ ンパク質の治療上有効な量を、このような治療を必要とする被験体に投与するこ とを包含する、方法；あるいは（ｉｉｉ）ａ離ＩＧＦの過剰産生の結果による生 理学的異常、例えば、ＩＧＦ産生産生菌尿病性網膜症もしくは被験体の異常成長 を冶療するための方法であって、本発明の結合タンパク質を薬学的に受容可能な キャリアあるいは希釈剤とともに含有する、組成物；あるいは （ｊｖ）生物学的試験を行うことにより示されるような、ＩＧＦＢＰ−４の異な る結合能に基づく、特定の器官あるいは組織にＩＧＦを送達する方法。

図１に示すプレー＋ＧＦ−ＢＰもしくはＩＧＦ−ＢＰの変異形態のフラグメント は、人体における遊離ＩＧＦの過剰産生の結果による生理学的異常を冶療するた めに、特に価値のあるものである。

本発明の結合タンパク質は、単独もしくはＩＧＦと組み合わせて、ペプチドに適 した任意の都合のよい経路で、すなわち、特に腸の経路には、例えば、錠剤ある いはカプセルの形態で、そして、皮下あるいは静脈内経路では、例えば、注入用 注射剤の形態で投与され得る。さらに、それは局所に使用され得て、例えば、傷 治癒Ｈのような使用には、軟膏あるいは懸濁液の形態で使用され得る。

上記に示されだすへての適切な投与量は、例えば、冶療されるべき障害の性質な らびに重篤さ、および投与形態に依存して変化する。例えば、骨粗しよう症ある いは貧血の治療では、本発明の結合タンパク質の毎日の投与量は、約０．１μｇ ／ｋｇ体重から４０μｇ　／ｋｇ体重、好ましくは、約０．５　μｇ／ｋｇ体重 から約２０μｇ／ｋｇ体重の範囲で、満足な結果が得られ得る。例えばヒトのよ うな比較的大きな哺乳動物では、示されたように毎日の投与量は、例えば１日に 一度とすると、約５μｇが好都合に腸に投与される。傷冶癒には、傷面積ｃｍ２ あたりに対して、本発明のタンパク質の０．１から１０μｇが毎日の投与量とし て、例えばヒトのような比較的大きな哺乳動物において、適切に示される。これ は１日に一度、好都合に投与される。ＩＧＦと組み合わせて使用される場合には 、結合タンパク質とＩＧＦのモル比は、好ましくは０．１＋１から５；１であり 、より好ましくは０．５：１から２＝１であり、最も好ましくは１：１である。

本発明の薬学的組成物は、従来の手法で生産され得る。

本発明の結合タンパク質の他の使用には、組み換え技術によるＩＧＦ分子の生産 においての種々の使用が含まれる。本発明の結合タンパク質は、天然（活性）フ ンホメーション（この反対は不活性型）である酵母産生ＩＧＦを検出するために 使用さし得る。さらに、本発明のタンパク質は、ＩＧＦの生産においてのキャリ ア（おそらくは同時発現されたタンパク質の形態）として使用され得る。結合タ ンパク質がインビボにおいてＩＧＦを固定化するので、インビトロにおいても同 様に固定化することが予測される。結合タンパク質はまた、固相表面に結合させ て（アフィニティークロマトグラフィーなど）酵母で産生されたＩＧＦを精製す るために使用され得る。

本発明は、特定の実施態様、方法、構成、および使用を蓼考として記載している が、本発明から逸脱することなく、種々の変形ならびに改変がなされ得ることは 、当業者にとって明白である。

実１」ロー セファロース−ＩＧＦ−１アフィニティーカラム６０ｍｇの組み換えヒトＩＧＦ 　ｌ　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ　ＡＧ、　Ｂａ５ｅ１．　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎ ｄ）を、０．５　Ｍ　ＮａＣｌを含有する２０ｍ１の０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ ３、ｐＨ８，３に溶解し、ＣＮＢｒ活性化セファロース　４ｇ　（４ｇの乾燥ゲ ル）にＮ販売元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐ ｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）のプロトコルに従ってカップリングした。そのゲ ルを、１．５Ｘ　１５　ｃｍのガラスカラム（ゲルベト容積は１５ｍ１）中で、 ５００　ｒｒｒｌの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１０．５　Ｍ　ＮａＣ１ 、ｐＨ６，５で平衡化した。

゛　ＩＧＦＢＰ　の　１ この方法は、ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒ（１８，１９）の変法に従って行 った。実施例中の括弧内の参考文献は、本明細書の関連文献の章に番号をつけて 挙げている参考文献をさす。過日採取した、クエン酸塩添加ヒト血漿のＩＬを、 トロンビン−カルシウム５０　Ｕ（Ｉ　ｌｌ１ｌ）と室温で２時間攪拌し、チー ズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）で濾過し、酸性化した。解離させたＩＧＦ をＳＰ−セフアゾ！クス　Ｃ−２５で取り出した。次にｐＨを６５に調整し、沈 澱を２０．０００　ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。上清を、上記のよ うに３４ｍ１／分の流速でセファロース−ＩＧＦアフィニティーカラムにポンプ で送り、そのカラムを、５００　ｍｌの０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ ０．５　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ６，５で洗浄した。結合タンパク質（すなわち、Ｉ ＧＦＢＰ）を０．５Ｍ酢酸４０ｍ１で溶出し、２Ｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム を外液として３回透析し、そして凍結乾燥した。ａ結乾燥物（４０ｍｇ）を２０ ％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する、４　ｍｌの０゜ＩＭへブタフルオロブ チリック酸に溶解し、不溶物を１０．　ｏｏｏで１０分間遠心分離して除去した 。透明の上清をＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ＋８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇ ｅｌ、　Ｄ　ｒｅｎ。

ＦＲＧ）のＩ（ＰＬＣ（各２ｍｌで２回）にかけた（１９）。溶出画分を５ｐｅ ｅｄ−Ｖａｅ　（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉ（ｉｃｋｓｖｉ ｌｌｅ、ＩＪＹ）で乾燥し、１　ｍｌの０．０１Ｍ酢酸中に取り出し、再度乾燥 した。得られた物質を、リガンドプロット分析（下記を参照のこと）および銀染 色用に、２５０μｌ　Ｈ２Ｏに溶解した（２０）。

＋２５１−ＩＧＦリガンドプロット Ｈｏ５ｓｅｎ　Ｉｏｐｐら（２１）の方法を少し改変して使用した（６．１９） 。

ＨＰＬＣ溶出画分の５μｌを、非還元条件下で１５％ＳＤＳポリアクリルアミド スラブゲルで電気泳動にかけた。ｌ　’Ｃ−１識の分子量マーカー（Ｒａｉｎｂ ｏｗ　Ｍａｒｋｅｒ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を還元した。ゲルをニトロセ ルロース膜にトランスプロットし、記載のように処理した（２１）。膜を、ンー ルされたブラステイノクバノグ内で、室温で６時間、３　ｘ　１０６ｃｐ１１” ５Ｉ−ｖＡ識ＩＧＦＩ＋とインキュベートした（２２）。数回洗浄の後、空気乾 燥した膜を〜７０’Ｃで１２−４８時間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴＩＣカセッ ト　（Ｅａｓｔｍａｎ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）中でＸ線フィルム（Ｋｏ ｄａｋ、　Ｘ−ＯＭＡＴ、　ＡＲ）に曝した。

全てのバンドが１２Ｊ−ＩＧＦ　＋で検出されるわけではないので、”Ｉ−ＩＧ Ｆ　Ｉ＋をスクリーソング用のトレーサーとして選択した（下記を参照のこと） 。

ポリビニリデンジフルオライド　［ｍｍｏｂｉ　ｌ　ｉｏｎ　でのエレクトロプ ロ、ティング １０から３０μｇのＨＰＬＣ精製ＩＧＦＢＰを、上記のように（ポリアクリルア ミドスラブゲル　１５　ｘ　１５　Ｋ　Ｏ，１５ａｍ）還元条件下で電気泳動に かけ、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　（２３）の記載のように、Ｉｍｍｏｂｉｌ。

ｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）にエレク トロブロノティンクシた（　０．８Ａで２時間）。膜を０．１％クマシー　ブル ーＲ−２５０ノ５０％メタノール溶液で５秒間染色し、５０％メタノール／１０ ％酢酸中で、室温で５分間脱色し、そして十分に）１２０ですすいだ。

膜を空気乾燥し、タンパク質のバンドを切り出し、−２０″Ｃで保存した。

アミノ酸分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０ Ａタンパク質シークエンサー（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を使用して、 自動エドマン分解（２５）により実施した。

、　およびＲＮＡの ヒト骨肉腫組繊を、Ｄｒ、　Ｍａｒｓｈａｌｌ　Ｕｒｉｓｔ、　ＵＣＬＡから得 た。

全ＲＮＡをグアニノウムチオシア不−ト法（２７）により単離した。

０ｓｔｅｒｉｚｅｒを使用して組織をホモジナイズした。ポリ　（Ａ）　”ＲＮ Ａをオリゴ（ｄＴ）セルロースによる単分画（２９）により精製した。

オリゴヌクレオチドム オリゴヌクレオチドアダプター、プローブ、ならびに配列決定用およびＰＣＲ用 ブラプライマーＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ ｔｙ、　ＣＡ）モデル３８０Ａ合成機を用いて、ホスホルアミダイト法により合 成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして５ＥＰ−ＰＡＫ　 Ｃｐｓカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ；　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）で脱塩した。

１４−ｍａｒオリゴヌクレオチド（５°ＣＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＣＧ　３°） および１８−ｍａｒオリゴヌクレオチド（Ｓ’　ＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＴＣＴＡ ＣＡＧＧ　３°）を合成し、λＺＡＰに構築されたヒト骨肉腫ｃＤＮＡライブラ リーに対するＥｃｏＲ１アダプターとして使用した。この１４−ｍａｒをリン酸 化（３０）　Ｌ、直ちに、９５°Ｃで１５分間加熱して、ポリヌクレオチドキナ ーゼを不活性化した。アダプターは、さらに内部ＢｇＩＩＩを含有し、ｃＤＮＡ ライブラリーの構築について記載されている下記の章でさらに詳細に記載する。

ＢＦ２に対する２つのＰＣＲプライマーは：　（１）６４種の２７−ｍａｒの混 合物［５°ＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧＸＧＴＸＣＡ（Ａ／ Ｇ）ＧＣ３°］からなる「センス」プライマー、および（２）６４ｐ１の２８− ｍａｒ混合物［５°ＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ （Ｃ／Ｔ）ＴＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＸＡＣ３°］からなる「アンチセンス」プライマ ーであり、ここでＸは４種の全部のデオキシヌクレオチドである。Ｅｃｏ　Ｒ１ 部位は、プライマー中に含まれていて、Ｍ１３ンークエノスヘクターにサブクロ ーニングされる。ＢＰ４プローブは、２３−ｍａｒ　［５’　ＧＣＧＧＧＴＴＧ ＴＣＣＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴ　３°コ　である。

旺Ｉこす■皿１皿 ＰＣＲ反応をＰＣＲキットの販売元（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ） の指示に従って、上記のＰＣＲプライマー（オリゴヌクレオチド合成の章を参照 のこと）を使用して、最終ａ度８μＭで行った。鋳型ｃＤＮＡを、２．５μｇの ヒト骨肉腫（Ｏｓｔ２）ポリ（Ａ）　＋　ＲＮＡから合成した。・ｃＤＮＡの合 成条件は、第一ストランドｃＤＮＡ合成（ｃＤＮＡライブラリーの構築を参照の こと）について下記に示す条件と同じであった。ｃＤＮＡをＢｉｏｇｅｌ　Ａ− １５ｍで分画し、エタノール沈降により回収し、そして１００μｌの滅菌水に再 度懸濁させた。２５から５μｍのｃＤＮＡ鋳型を各ＰＣＲ反応に使用した。Ｐｅ ｒｋｉｎ／Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーモサイクラ−で、ＰＣＲを３５ サイクル実施した。最初の１０サイクルは、９４℃、１分間の変性工程；４５’ Ｃ，１分間のア二一リング工程；および４５℃、１分間の伸長工程からなる。次 の２５サイクルは、９４℃、１分間の変性工程；５５℃、１分間のア二一リング 工程；および７２℃、１分間の伸長工程からなる。最終サイクルでの最後の伸長 工程は、７分間であった。試料を、フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ（１・１ ００４）で１回抽出し、クロロホルム／ＩＡＡ（２４・１）で１回抽出し、エタ ノール沈降で回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、そして７％アクリルアミド、Ｉ　Ｘ 　ＴＢＥゲルでの電気泳動（３ｏ）により分画した。４Ｏ−７０ｂ、　９間のＤ ＮＡの移動部分をゲルから切り出し、Ｅｌｕｔｉ　ｐ−ｄカラムに通過させて精 製し、Ｅｃｏ−Ｒ１切断したｍ１３　ｍｏｌｇに連結し、そしてＤ）！５αＦ° にＤＮＡ配列分析のために導入した。

ｃＤＮＡライブラリーの　２ 第一ストランドｃＤＮＡを、記載（３３）のように、ヒト骨肉腫（Ｏｓｔ３）ポ リ（Ａ）　”　ＲＮＡから合成したが、しかし、下記の改変を行って実施した＝ １０μｇのポリ（Ａ）　’　ＲＮＡを２０μｌの５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７， ５）中で、６５°Ｃで３分間加熱し、直ちに、氷上に１分間置き、次に、５０ｍ Ｍトリス−塩酸（４２°ＣでｐＨ８，３）、８　ｍＭ　ＭｇＣｌ＋：、３０　ｍ Ｍ　ＫＣＩ、１０　ｍＭジチオトレイトール、各２１１１ＭのｄＡＴＰ、　ｄＧ ＴＰ、　ｄＴＴＰおよび［α−３；）コｄＣＴＰ　（３００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ） 、６０　Ｕ　ＲＮａｓｉｎ、ならびに２．５μｇオリゴ（ｄＴ）　＋２−Ｉｌｌ を含有するヨウに（室温で）調整した。６０μＵのクローン化モロニー不ズミ白 血病ウィルス逆転写酵素を、ｃＤＮＡ合成を開始させるために加え（合計反応体 積は４０μｍ）、そして反応を４２℃で６０分間続けた。第二ｃＤＮＡストラン ドを合成し、記載（３４）のようにＥｃｏＲ１アダプター（オリゴヌクレオチド 合成の章を参照のこと）に連結した。ｄｓｃＤＮＡをリン酸化（３０）　Ｌ、次 に、Ｏ，５ＭＮａＣｌ／２５　ｍＭ　ＥＤＴＡに調整して、７５℃で１５分間加 熱してポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。ｄｓｃＤＮＡを、Ｂｉｏｇｅ ｌ　Ａ−１５ｍでのクロマトグラフィーにより、連結されていないアダプターか ら分離して、エタノール沈降により回収した。ｄｓｃＤＮＡを、販売元の記載に 従って、ＥｃｏＲｌ−切断した　λＺＡＰ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し たが、反応媒質中に１５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　８０００　（Ｓ ｉｇｍａ）を含むように前述（３５）を改変して実施した。連結されたＤＮＡを 遠心分１ｔｉ　（１２，０００ｘ　ｇ）により回収し、クロロホルムで洗浄し、 乾燥させて、４μｌのＨ２Ｏに再懸濁させ、販売元の指示に従って、インビトロ パッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とインキュベートした。２．３ 　Ｘ　１０７の個別の組み換えクローンのライブラリーを得た。組み換えファー ジをＥ、　ｃｏｌｉ　ＢＨ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で増殖させた。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング０ｓｔ３　ｃＤＮＡライブラリー由来の 約３００，０００個の組み換えファージをＬｉＱＬＬＢＢ４に植え＜　ｓｏ、　 ｏｏｏファージ／直径１３７　＋ｉｍプレート）、３７°Ｃで５−６時間増殖さ せた。ファージをニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　ＨＡＴ Ｆ　１３７）に移し、処理（３６）し、そしてＢＰ４プローブでスクリーニング した。ＢＰ４プローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−３２１） ］ＡＴＰで標議しく２８）、比活性を１−２　Ｘ　１０９ｃｐｓ／μｇとした。

フィルターを、５　Ｘ　ＳＳＣ（Ｉ　ＳＳＣＩＩｏ、１５　Ｍ塩化ナトリウム１ ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）　４０％ホルムアミド％５Ｘデンハ ート溶液（ｌｘデンハート溶液＝　０．０２駕ポリビニルピロリドン／Ｑ、０２ ％フィコール１０．０２％ウシ血清アルブミン）、１０％デキストラン硫酸、５ ０ａ＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，１ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．１ ％ＮａＤｏｄＳＯａ、および５０　μｇ／ａｌ変性サケ精子すＮＡ中で、３７° Ｃで１−２時間、プレハイブリダイズさせた。１ｍプローブを濃度が１０６ｃｐ Ｉｌ／Ｉｌｌになるように加え、ノ蔦イブリダイゼーションを、おだやかに振盪 させながら３７℃で一夜続けた。フィルターを、６０℃、２　ｘ　５ＣＣ１０， １％ＮａＤｏｄＳＯ４中で洗浄し、ＤｕＰａｎｔ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕ ｓ増感スクリーンを用いて、−８０℃　で−夜、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−２フイル ムに曝した。二重のシグナルを与えるプラーク部分を取り出し、再度植え付け、 再度スクリーニングし、純粋なプラークが得られるまで繰り返した。

プラスミドの　サブクローニングおよび　ｌ８Ｐ４　ｃＤＮＡ挿入断片を含有す るＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（−）を、販売元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が記 載しているＭ１３レスキュー／切り出しのプロトコルにより、λＺＡＰから放出 させた。プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（３０）で単離した。挿入断片を 、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ベクターからＢｇｌ　Ｉ＋消化により切り出 し、アガロースゲル電気泳動により分画した。挿入断片をゲルから切り出し、１ ０ｍＭ）リス−塩酸ｐｌ’ｌ　７．５．１■Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）中でおだやか に振盪しながら１２時間にわたっておだやかに抽出し、販売元（Ｓｃｈｌｅｉｃ ｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）の記載のようにｅｌｕｔｉｐ−Ｄにより精製 して、Ｍ１３シークエンスベクター（３７）にサブクローニングした。ＤＮＡ配 列決定を、Ｍ１３プライマーおよび特異的な内部プライマーを用いて、チェイン ターミネーシコン法−（３８）により行った。不明瞭な領域は、７−ジアザ−２ −ブオキシグアニジンートリホスフエート（３９）およびンークエナーゼ（ＵＳ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｔｅａｌｓ）を使用して分析した。

ｌｉ玉１五葛！丘 図１に示す遺伝子配列は、アメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　ｌこ寄託され ている。これらは、以下のように同定されている。

Ｉｍ　Ｌ 鴫コツ　人り賀ＭＬ 不才１１躬私ｔ）７シー凶２く１稲ｈ）ＴＩＧχ　二 １象η−ＩじトＬＣｚＦ已Ｐ了ミ１り蜜作Ｍ’ｌ　”　＊ｔｌ’＜ＦＩＧ、　２ Ｂ 国際調査報告 □、□−４Ｋゴ／ＵＳ９１／％１３８ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＣＡ 、ＪＰ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．インシュリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ−４）をコードする 核酸配列、または少なくとも１０個のヌクレオチドを含むそのサブ配列、を有す る組換えＤＮＡ分子。
2. ２．前記配列が図１のＩＧＦＢＰ−４に示すものである、請求項１に記載の組換 えＤＮＡ分子。
3. ３．ヒトＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. ４．前記配列がゲノム配列である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. ５．前記配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
6. ６．前記分子がｐＢｓＢＰ４．１に含有される、請求項１に記載の組換えＤＮＡ 分子。
7. ７．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含有する組換え微生物または細胞株。
8. ８．前記微生物が酵母である、請求項７に記載の微生物。
9. ９．前記細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項７に記載の微生物。
10. １０．ＩＧＦＢＰ−４またはその断片を産生する方法であって、請求項１に記載 のＤＮＡ分子を含有する組換え宿主を、該ＩＧＦＢＰ−４または断片が該宿主に より発現される条件下で増殖させる工程、および次に発現させたＩＧＦＢＰ−４ または断片を単離する工程を含む方法。
11. １１．前記宿主が微生物である、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記宿主が真核細胞である、請求項１０に記載の方法。
13. １３．前記宿主が非ヒトトランスジェニック動物である、請求項１０に記載の方 法。