DE69132814T2

DE69132814T2 - Neues insulinähnliches wachstumsfaktor bindendes protein igfbp-5

Info

Publication number: DE69132814T2
Application number: DE69132814T
Authority: DE
Inventors: Hans Born; C. Kiefer; Frank Masiarz; Johann Zapf
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-08-28
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2011-08-29
Also published as: WO1992003471A1; EP0546110A4; IE913034A1; PT98805B; JPH06503949A; PT98805A; EP0546110A1; DE69132814D1; EP0546110B1; ATE208816T1; CA2090702A1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der U.S.-Anmeldungsseriennummer 07/574,613, eingereicht am 28. August 1990 (Anwaltsaktennummer CHIR-007/00 US).

EINFÜHRUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft gereinigte, natürlicherweise vorkommende Proteine und die entsprechenden, mittels rekonribinanter gentechnischer Verfahren produzierten Proteine und spezifischer solche Proteine und genetischen Elemente, die von einem insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Protein abgeleitet sind, und Verfahren und Zusammensetzungen, die die Proteine und genetischen Elemente verwenden.

Hintergrund

Insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) sind Polypeptidhormone mit niedrigem Molekulargewicht und mit struktureller Homologie mit Proinsulin. Zwei verschiedene IGFs sind bekannt, nämlich IGF-I und IGF-II, die in vitro für eine große Vielzahl von Zellen in Gewebekultur mitogen sind. Beide IGFs stimulieren in vitro das Wachstum verschiedener Gewebe und insbesondere induzieren sie die Collagensynthese. IGF-I vermittelt den wachstumsfördernden Effekt von Wachstumshormon bei der Chondrogenese und Knochenbildung und ist deshalb essentiell für das normale Wachstum eines Individuums. Dies wird durch die Tatsache gezeigt, daß Pygmäen und Zwergpudel IGF-I fehlt, wobei sie in ihrem Serum normale Spiegel an Wachstumshormon haben. Von IGF-II nimmt man an, daß es eine entscheidende Rolle bei der fötalen Entwicklung und dem Nervenwachstum spielt.
Zusätzlich zu ihrem Primäreffekt auf das Skelettgewebe zeigen sie auch wachstumsstimulierende Funktionen bei anderen Geweben. Von Wundfibroblasten ist bekannt, daß sie IGFs produzieren, die wirksam sind bei der Stimulierung von Fibroblasten, daß sie wachsen und Collagen synthetisieren, ein Strukturprotein, das üblicherweise bei der Wundheilung erforderlich ist. Die Vaskularisierung des Wundgewebes wird ebenfalls induziert. Darüber hinaus ist auch gefunden worden, daß IGFs eine Erythropoietin-ähnliche Aktivität haben und so die Hämatopoese induzieren.
Kürzliche Untersuchungen haben auch gezeigt, daß die von gewissen Krebszellen produzierten IGFs, d. h. Brust- und Nierenkrebszellen, die Proliferation der Krebszellen und der vaskulären Gewebe und Fasergewebe auto-stimulieren, was erforderlich ist, um das Wachstum von Krebsgeweben zu unterstützen.
Zusätzlich dazu zeigen beide IGFs ein Spektrum von metabolischen Aktivitäten, die dem von Insulin ähneln, indem sie insbesondere den Transport und Metabolismus von Glucose stimulieren. Die biologischen Wirkungen der IGFs und von Insulin werden durch ihre Bindung an spezifische Rezeptoren vermittelt. Insbesondere haben die beiden IGFs die Fähigkeit, mit etwa 100fach niedrigerer Affinität an den Insulinrezeptor zu binden, als es Insulin tut.
Beide IGFs haben im Blut eine etwa 100fach höhere Konzentration als die von Insulin. Eine Hypoglycämie wird durch einen regulatorischen Mechanismus verhindert, der Trägerproteine einschließt, die im Blut anwesend und in der Lage sind, mit den IGFs Komplexe zu bilden. Somit zirkulieren die IGFs im Blut in der Form eines Komplexes, der keine Insulinähnliche Aktivität hat. Durch ihre Assoziation mit einem Trägerprotein (nachstehend als IGF-bindende Proteine oder IGFBPs bezeichnet) wird die Bindung der IGFs an Zelloberflächenrezeptoren verhindert. Es ist auch gezeigt worden, daß es eine andere Funktion der IGF-bindenden Proteine ist, die kurze Halbwertszeit der IGFs zu erhöhen, die einem raschen proteolytischen Abbau unterliegen, wenn sie in der freien Form im Blut anwesend sind.
In Übereinstimmung mit dem vorstehenden können die IGFs in vitro von Nutzen sein bei der Stimulierung von a) dem Wachstum von Tieren und Menschen mit einem Mangel an Wachstumshormon, b) der Geweberegeneration, wie der Erythropoese und Chondrogenese, c) der Wundheilung und d) der Funktionen verschiedener Organe wie Leber oder Niere. Als ein Ergebnis ihrer Chondrogenese-stimulierenden Aktivität sind die IGFs insbesondere geeignet zur Verwendung bei der Knochenbildung, d. h. bei der Behandlung der Osteoporose. Die IGFs zur Verwendung bei den vorstehend erwähnten Behandlungen werden dem Individuum vorteilhafterweise in Verbindung mit zumindest einem IGF-bindenden Protein verabreicht. Die Verabreichung dieser Kombination statt von iGF allein hat vorteilhafte Wirkungen einschließlich der Verhinderung von Hypoglycämie und möglicher mitogener Wirkungen an den Injektionsstellen und der Verlängerung der Halbwertszeit von IGF. Darüber hinaus ist gefunden worden, daß Bindungsproteine auch von Nutzen bei der Verstärkung der Erythropoietin-ähnlichen Wirkung von IGF-I sind. Die Bindungsproteine können auch von Nutzen sein bei der Zielrichtung von IGFs zu spezifischen Geweben.
Wenn sie allein verabreicht werden, d. h. ohne jedes IGF, können die Bindungsproteine auch therapeutisch von Nutzen bei der Blockierung der nachteiligen Wirkungen der IGFs, wie diejenigen, die auftreten, wenn die IGFs im Überschuß produziert werden, z. B. freie IGFs, die von gewissen Krebszellen, z. B. Hormon-produzierenden Krebszellen wie Brust- oder Nierenkrebszellen, produziert werden. Die Therapie mit IGF-bindenden Proteinen könnte auch die Blindheit als Sekundäreffekt der diabetischen proliferierenden Retinopathie verhindern. Es ist in der Tat gezeigt worden, daß die IGFs einer der Faktoren sein können, die die Endothel- und Fibroblastenproliferation bei der diabetischen Retinopathie stimulieren.
Eine andere therapeutische Verwendung der IGFBPs ist die Kontrolle des exzessiven Wachstums bei Individuen mit Mangel an IGF-bindenden Proteinen, da es sehr wahrscheinlich ist, daß hohe Spiegel an IGF, kombiniert mit abnormal niedrigen Spiegeln an Bindungsprotein für exzessives Wachstum verantwortlich sind.
In den vergangenen Jahren sind drei wichtige Arten an IGF-bindenden Proteinen, unterschiedlich in der Größe und anderen Eigenschaften, im Serum von Nagern und Menschen gefunden worden.
Das erste entdeckte Bindungsprotein, jetzt IGFBP-3 genannt, ist ein Glycoptotein von etwa 150 kd und aus mehreren Untereinheiten aufgebaut. Seine Bildung ist Wachstumshormon-abhängig, im Gegensatz zu dem zweiten, kleineren IGF-bindenden Protein.
Das zweite entdeckte Bindungsprotein, jetzt IGFBP-1 genannt, hat im Menschen und in der Ratte ein Molekulargewicht von etwa 30-40 kd. Das menschliche IGFBP-1 ist bereits aus verschiedenen Quellen gereinigt worden, einschließlich amniotischer Flüssigkeit (Povoa, G. et al., Eur. J. Biochem. (1984) 144 : 199 (daher auch als Bindungsprotein aus amniotischer Flüssigkeit bezeichnet), Placenta (Koistenen, R. et al., Endocrinology (1986) 118 : 1375) und konditioniertem Medium von G2 Hepatom-Zellen (Powell, D. R. et al., J. Chromatogr. (1987) 420 : 163). Die ersten beiden Bindungsproteine sind durch ihre Aminosäurezusammensetzungen und ihre N-terminalen Aminosäuresequenzen charakterisiert worden und wurden als identisch oder zumindest sehr ähnlich gefunden. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen des von G2 Hepatom-Zellen isolierten 1GB-bindenden Proteins (Lee, Y. L. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5): 404) und des aus einer Placenta-cDNA-Bank clonierten IGF-bindenden Proteins (Brinkman, A. et al., The EMBO Journal (1988) 7 (8): 2417) ergibt 99% Homologie. Weiterhin zeigen diese beiden Aminosäuresequenzen mit einem von einer cDNA-Bank codierten IGF-bindenden Protein eine Homologie von 94% (Brewer, M. T. et al., Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152 (3): 1289).
Zusätzlich zu den beiden wichtigsten Formen der IGF-bindenden Proteine, die im Serum vorhanden sind, wurden mehrere andere IGF-bindende Proteine in verschiedenen menschlichen Gewebeextrakten und Zellkulturmedien unter Verwendung von Western- Blotting-Verfahren und Affinitätsmarkierung mit [I¹²&sup5;]-IGF identifiziert. Ihre Molekulargewichte reichen von 15 bis 150 kd, und einige dieser Proteine scheinen durch proteolytischen Abbau der größeren IGF-bindenden Proteine gebildet worden zu sein. Insbesondere stellt ein IGF-bindendes Protein von 53 kd, das aus menschlichem Serum gereinigt wurde, eine Untereinheit des IGFBP-1 von 150 kd dar (Baxter, R. C. Biochem. Biophys. Res. Com. (1966) 139 (3): 1256).
Eine andere Form eines IGF-bindenden Proteins ist auch im konditionierten Medium von Ratten-BRL-3A-Zellen gefunden worden und hat ein Molekulargewicht von etwa 33-36 kd. Eine partielle Proteinsequenz am Amino-Ende des Ratten-BRL-3A-Bindungsproteins ist bestimmt worden (Mottolla, C. et al., J. Biol. Chem. (1986) 261 : 11180; Lyons, R. M., Smith, G. L., Mol. Cell. Endocrinol. (1986) 45 : 263). Die 33%ige Homologie, die zwischen den terminalen Sequenzen der Ratte und des Menschen gezeigt wurde, ist nicht hoch genug, um die jeweiligen Bindungsprotein als Äquivalente zu betrachten.
Ein zusätzliches IGFBP, jetzt IGFBP-2 genannt, welches mit dem BRL-3A- Bindungsprotein verwandt ist, wurde ebenfalls gefunden und seine Aminosäuresequenz voll bestimmt. Die Aminosäuresequenz von IGFBP-2 ist unterschiedlich zu der der zuvor bekannten Bindungsproteine.
Die Existenz einer Zahl verschiedener IGF-Bindungsproteine zeigt, daß diese Proteine verschiedene Funktionen haben. Da es möglich ist, unter Verwendung der gegenwärtig bekannten Bindungsproteine Krankheitszustände zu diagnostizieren und auf vielen verschiedenen Wegen die biologischen Aktivitäten der IGFs zu modifizieren, gibt es ein beträchtliches Interesse an der Entdeckung zusätzlicher IGF-Bindungsproteine, die verschiedene biologische Eigenschaften haben.

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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Entsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein IGF-Bindungsprotein bereitzustellen, das biologische Eigenschaften hat, die unterschiedlich sind von denen von IGFBP-1, IGFBP-2 uns IGFBP-3.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, das neue IGF-Bindungsprotein unter Verwendung rekombinanter DNA-Moleküle bereitzustellen, die in der Lage sind, das neue IGF-Bindungsprotein zu exprimieren, damit das Bindungsprotein leichter verfügbar sein wird.
Dieses und andere Ziele der vorliegenden Erfindung sind durch die Bereitstellung der rekombinanten Proteinherstellung von Anspruch 1 erreicht worden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine schematisches Diagramm, dass die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen eines Clons zeigt, der menschliches IGFBP-5 codiert.
Fig. 2 ist eine schematisches Diagramm, das die Aminosäuresequenz eines menschlichen Bindungsproteins der Erfindung, menschliches IGFBP-S. mit den bekannten Sequenzen der drei menschlichen Bindungsproteine vergleicht, die vorstehend diskutiert wurden, und mit IGFBP-4, einem anderen, neu entdeckten IGF-Bindungsprotein. Bereiche von Homologie können bei diesen Sequenzen gesehen werden. Diese Bereiche von Homologie sind von besonderem Interesse, da sie Bereiche zeigen, von denen DNA-Sonden erhalten werden können, die eine hohe Erfolgswahrscheinlichkeit beim Auffinden verwandter Moleküle haben. Zwei solche homologen Bereiche sind durch Klammern angezeigt, obwohl auch andere Bereiche von Homologie anwesend sind.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die IGFBP-5-cDNA, die verwendet wurde, um das rekombinante Protein zu produzieren, wurde ursprünglich aus einer menschlichen Osteosarkom/λZAP-cDNA-Bank unter Verwendung eines Zwei-Stufen-Verfahrens isoliert. Zunächst wurden kleine Fragmente der cDNAs, die die Aminosäuren 1 bis 15 von BP5 codierten, von der Osteosarkom-cDNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, Gel-gereinigt und sequenziert. Zweitens wurden perfekt passende Oligonucleotide, basierend auf der BP5-Nucleotidsequenz zwischen den PCR-Primern, synthetisiert uns als Sonden zur Isolierung von cDNA-Clonen verwendet. Die BP5-eDNA-Clone, die bei der Agarose-Gelelektrophorese die größte DNA- Insertionsgröße zeigten, wurden sequenziert. Die Nucleotid- und codierten Aminosäuresequenzen von BP5 werden in Fig. 1 gezeigt.
Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren werden bei diesen Figuren und sonst in dieser Beschreibung verwendet.
Eine Reihe von Ausdrücken, die auf dem Gebiet der Gentechnik und der Proteinchemie verwendet werden, werden mit der nachstehend definierten Bedeutung hier verwendet.
Zwei Nucleinsäurefragmente sind "homolog", wenn sie in der Lage sind, unter Hybridisierungsbedingungen, die bei Maniatis et al., op. cit., S. 320-323 beschrieben sind, miteinander zu hybridisieren. Unter Verwendung der folgenden Waschbedingungen jedoch - 2 · SCC, 0,1% SDS, Raumtemperatur - zweimal, jeweils 30 Minuten; dann 2 · SCC, 0,1% SDS, 50ºC - einmal, 30 Minuten; dann 2 · SCC, zweimal Raumtemperatur, jeweils 10 Minuten -- können homologe Sequenzen identifiziert werden, die höchstens etwa 25-30% Basenpaarfehlpaarungen enthalten. Mehr bevorzugt enthalten homologe Nucleinsäurestränge 15-25% Basenpaarfehlpaarungen, noch mehr bevorzugt 5-15% Basenpaarfehlpaarungen. Diese Ausmaße an Homologie können unter Verwendung von stringenteren Waschbedingungen zur Identifizierung von Clonen von Genbanken (oder anderen Quellen von genetischem Material) ausgewählt werden, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Ein DNA-Fragment ist "abgeleitet von" einer IGFBP-5 codierenden DNA-Sequenz, wenn es die selbe oder im wesentlichen die selbe Basenpaarsequenz hat wie ein Bereich der das gesamte IGFBP-5-Molekül codierenden Sequenz.
Im wesentlichen das selbe bedeutet, wenn es sich auf biologische Aktivitäten bezieht, daß die Aktivitäten vom selben Typ sind, obwohl ihr Ausmaß unterschiedlich sein kann. Wenn es sich auf Aminosäuresequenzen bezieht, bedeutet im wesentlichen das selbe, daß die fraglichen Moleküle ähnliche biologische Eigenschafien haben und bei der Aminosäuresequenz vorzugsweise mindestens 85% Homologie haben. Mehr bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen mindestens zu 90% identisch. Bei anderen Verwendungen hat im wesentlichen das selbe seine normale englischsprachige Bedeutung.
Ein Protein ist "abgeleitet von" einem IGFBP-5-Molekül, wenn es die selbe oder im wesentlichen die selbe Aminosäuresequenz wie ein Bereich des IGFBP-5-Moleküls hat.
IGFBP-5, sowohl glycosyliert als auch unglycosyliert, oder Polypeptidderivate davon, können zur Produktion von für IGFBP-5 spezifischen Antikörpern verwendet werden, sowohl monoclonal als auch polyclonal. Unter Polypeptidderivaten dieser IGFBPs sind Polypeptide gemeint, die sich in der Länge vom natürlichen IGFBP-5 unterscheiden und fünf oder mehr Aminosäuren von IGFBP-5 in der selben Primärstruktur enthalten, wie sie bei IGFBP-5 gefunden werden, das von einer natürlichen Quelle erhalten wurde. Polypeptidmoleküle, die im wesentlichen die selbe Aminosäuresequenz wie IGFBP-5 haben, aber kleinere Aminosäuresubstitutionen besitzen, die im wesentlichen nicht die Fähigkeit der IGFBP-5- Polypeptidderivate beeinträchtigen, mit IGFBP-5-spezifischen Molekülen wie Antikörper und IGF-Moleküle, insbesondere IGF-1 und speziell IGF-II, eine Wechselwirkung einzugehen, sind innerhalb der Definition von IGFBP-5. Derivate umfassen glycosylierte Formen, aggregierte Konjugate mit anderen IGF-BP5-Molekülen, und kovalente Konjugate mit nicht verwandten chemischen Gruppen. Kovalente Derivate werden durch Verknüpfung von funktionellen Gruppen mit Gruppen, die in der IGF-BP5-Aminosäurekette oder bei den N- terminalen oder C-terminalen Gruppen gefunden werden, mittels Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik bekannt sind.
Experimente mit N-Glycanase legen nahe, daß IGFBP-5 glycosyliert ist. Die Behandlung von IGFBP-5 mit N-Glycanase zeigt eine Veränderung im Molekulargewicht von 30 kd auf 24 kd für IGFBP-S. was sehr nahe legt, daß dieses Bindungsprotein glycosyliert ist. Das ist konsistent mit der codierten Sequenz.
IGFBP-5-spezifische Moleküle umfassen Polypeptide wie Antikörper, die spezifisch sind für das IGFBP-5-Polypeptid, das die natürlicherweise vorkommende IGFBP-5- Aminosäuresequenz enthält. Mit "spezifische Bindungspolypeptide" sind Polypeptide gemeint, die an IGFBP-5 und seine Derivate binden und eine meßbar höhere Bindungsaffinität zu dem Zielpolypeptid, d. h. IGFBP-5 und Polypeptidderivate von IGFBP-5, haben als zu anderen Polypeptiden, die auf Bindung getestet werden. Eine um den Faktor 10 höhere Affinität wird bevorzugt, mehr bevorzugt um den Faktor 100. Die Bindungsaffinität für Antikörper bezieht sich auf ein einzelnes Bindungsereignis (d. h. die monovalente Bindung eines Antikörpermoleküls). Die spezifische Bindung durch Antikörper bedeutet auch, daß die Bindung an der normalen Bindungsstelle des Antikörpers für das Molekül stattfindet (am Ende der Arme der variablen Region).
Wie vorstehend diskutiert werden kleinere Aminosäurevariationen von der natürlichen Aminosäuresequenz von IGFBP-5 als vom Begriff IGFBP-S umfaßt betrachtet; insbesondere wird konservativer Aminosäureersatz als vom Begriff IGFBP-5 umfaßt betrachtet. Konservativer Ersatz ist derjenige, der innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfindet, die bei ihren Seitenketten verwandt sind. Genetisch codierte Aminosäuren werden im allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) saure = Aspartat, Glutamat; (2) basische = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolare = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladene polare = Glycin, Asparagin, Glutaniln, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist zum Beispiel vernünftig zu erwarten, daß ein isolierter Ersatz eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines. Threonins durch ein Serin oder ein ähnlicher Ersatz einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keine größere Wirkung auf die Bindungseigenschaften des resultierenden Moleküls haben wird, insbesondere wenn der Ersatz keine Aminosäure an der Bindungsstelle umfaßt, die in die Wechselwirkung von IGFBP-5 oder seiner Derivate mit einem IGF-Molekül involviert ist. Ob ein Aminosäurewechsel in einem funktionellen Peptid resultiert, kann leicht durch Testung der spezifischen Bindungseigenschaften des IGFBP-5-Polypeptidderivats bestimmt werden. Ein Bindungstest wird nachstehend im Detail beschrieben.
Für IGFBP-5 spezifische Antikörper werden durch Immunisierung eines geeigneten Wirbeltierwirts, z. B. Kaninchen, mit gereinigtem IGFBP-5 oder einem Polypeptidderivat von IGFBP-5 selbst oder in Verbindung mit einem herkömmlichen Adjuvans produziert. Üblicherweise werden zwei oder mehr Immunisierungen involviert sein, und Blut oder Milz werden einige Tage nach der letzten Injektion gewonnen. Für polyclonale Antiseren können die Immunglobuline ausgefällt, isoliert und mittels einer Reihe von Standardverfahren, einschließlich Affinitätsreinigung unter Verwendung von IGFBP-5, das an eine feste Oberfläche wie einem Gel oder Kügelchen in einer Affinitätssäule gebunden ist, gereinigt werden. Für monoclonale Antikörper werden die Splenocyten üblicherweise mit immortalisierten Lymphocyten, z. B. einer myeloiden Zelllinie, unter selektiven Bedingungen für die Hybridbildung fusioniert. Die Hybridome können unter limitierenden Verdünnungsbedingungen cloniert werden und ihre Überstände auf Antikörper durchmustert werden, die die gewünschte Spezifität haben. Verfahren zur Produktion von Antikörpern sind in der Literatur wohl bekannt und werden durch die Publikation Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Hrsg. Harlow und Lane, Cold Spring Harbor Laboratories Press, und die U.S.- Patente Nrs. 4,381,292, 4,451,570 und 4,618,577 exemplarisch dargestellt.
IGFBP-5 kann leicht aus Blut und seinen Komponenten wie Serum und Plasma und von gentechnisch zur Produktion von IGFBP-5 oder Polypeptidderivaten davon modifizierten Zellen mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines für IGFBP-5 spezifischen monoclonalen Antikörpers gereinigt werden. Zusätzlich zur Verwendung von Antikörper- Affinitätschromatographie können IGFBP-5 und Polypeptidderivate davon mittels einer Vielzahl anderer, allgemein bekannter Proteinreinigungsverfahren (entweder allein oder in Kombination) einschließlich Immunpräzipitation, Gelfiltration, Ionenaustauscherchromatographie, Chromatofokussierung, isoelektrischer Fokussierung, selektiver Präzipitation, Elektrophorese und dergleichen gereinigt werden. Fraktionen, die während der Reinigungsverfahren isoliert werden, können auf die Anwesenheit von IGFBP-5 oder Polypeptidderivaten von IGFBP-5 mittels Immuntests analysiert werden, die IGFBP-5- spezifische Antikörper oder IGFBP-5-spezifische Biotests verwenden. Ausführliche Beispiele werden nachstehend ausgeführt.
Die Isolierung von Nucleotidsequenzen, die IGFBP-5 codieren, umfaßt die Schaffung von entweder genomischen Banken von Zellen, die IGFBP-5 codieren, oder die Herstellung einer eDNA-Bank aus RNA, die von Zellen, die IGFBP-5 codieren, isoliert wurde. Es wird im allgemeinen vorzuziehen sein, eine cDNA-Bank zur Isolierung der IGFBP-5 codierenden Nucleotidsequenz zu schaffen, um jegliche Probleme zu vermeiden, die sich aus den Versuchen zur Bestimmung der Intron/Exon-Grenzen ergeben. Genetische Banken können entweder in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen hergestellt werden. Allgemein verfügbare Clonierungsvektoren wie Plasmide, Cosmide, Phagen, YACs und dergleichen können verwendet werden, um genetische Banken zu erzeugen, die geeignet sind für die Isolierung von Nucleotidsequenzen, die IGFBP-5 oder Teile davon codieren.
Nützliche Verfahren zur Durchmusterung von genetischen Banken auf die Anwesenheit von IGFBP-5-Nucleotidsequenzen umfassen die Herstellung von Oligonucleotid-Sonden, die auf der N-terminalen Aminosäuresequenzinformation von gereinigtem IGFBP-5 oder gereinigten internen Fragmenten von gereinigtem IGFBP-5 beruhen. Unter Verwendung des genetischen Triplet-Standardcodes können Oligonucleotidsequenzen von etwa 17 Basenpaaren oder länger mittels herkömmlicher in vitro-Syntheseverfahren hergestellt werden, um den Teilen von IGFBP-5 zu entsprechen, für die die Aminosäuresequenz mittels der N-terminalen Analyse bestimmt wurde. Die resultierenden Nucleinsäuresequenzen können anschließend mit Radionukliden, Enzymen, Biotin, fluoreszierenden Gruppen oder dergleichen markiert werden und als Sonden zur Durchmusterung von genetischen Banken verwendet werden.
Zusätzliche Verfahren von Interesse zur Isolierung IGFBP-5-codierender Nucleinsäuresequenzen umfassen die Durchmusterung von genetischen Banken auf die Expression von IGFBP-5 oder Fragmenten davon mittels IGFBP-5-spezifischer Antikörper, entweder polyclonal oder monoclonal. Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren umfaßt die Verwendung von degenerierten Primern, die auf partiellen Aminosäuresequenzen von gereinigtem IGFBP-5 oder auf Sequenzen von bekannten, verwandten Molekülen beruhen, und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Gensegmente zwischen den Primern zu amplifizieren. Das Gen kann dann unter Verwendung einer spezifischen Hybridisierungssonde isoliert werden, die auf dem amplifizierten Gensegment beruht, und dann auf die geeignete Expression von Protein analysiert werden. Eine ausführliche Beschreibung dieses bevorzugten Verfahrens wird in den folgenden Beispielen dargelegt.
Nucleotidsequenzen, die IGFBP-5 codieren, können von rekombinanten DNA- Molekülen erhalten werden, die aus Isolaten einer genetischen IGFBP-5-Bank gewonnen wurden. Die Nucleotidsequenz, die IGFBP-5 codiert, kann mittels Sequenzierung der Nucleotidsequenzen dieser rekombinanten Moleküle, die keine Vektorsequenzen sind, erhalten werden. Die Nucleotidsequenzinformation kann unter Verwendung breit angewendeter DNA- Sequenzierungsprotokolle wie Maxim und Gilbert-Sequenzierung, Didesoxy-Nucleotid- Sequenzierung und dergleichen erhalten werden. Beispiele für geeignete Nucleotidsequenzierungsprotokolle können bei Berger und Kimmel, Methods in Enzymology Bd. 52, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987) Academic Press, gefunden werden. Nucleotidsequenzinformationen von mehreren rekombinanten DNA-Isolaten, einschließlich Isolate von sowohl cDNA als auch genomischen Banken, können kombiniert werden, um die gesamte Aminosäure-Codierungsequenz von IGFBP-5, ebenso wie die Nucleotidsequenzen von Introns innerhalb des IGFBP-5-Gens, stromaufwärts liegende Nucleotidsequenzen und stromabwärts liegende Nucleotidsequenzen bereitzustellen.
Nucleotidsequenzen, die durch die Sequenzierung von Isolaten von IGFBP-5- spezifischen genetischen Banken erhalten werden, werden einer Analyse unterzogen, um Regionen von Interesse in den IGFBP-5-Genen zu identifizieren. Diese Regionen von Interesse umfassen offene Leserahmen, Introns, Promotorsequenzen, Terminationssequenzen und dergleichen. Die Analyse der Nucleotidsequenzinformation wird vorzugsweise mittels eines Computers durchgeführt. Software, die zur Analyse von Nucleotidsequenzen auf Regionen von Interesse geeignet ist, ist kommerziell erhältlich und umfaßt zum Beispiel DNASISTM (LKB). Es ist auch von Interesse, Aminosäuresequenzinformation, die von der N- terminalen Sequenzierung von gereinigtem IGFBP-5 erhalten wurde, zu verwenden, wenn die IGFBP-5-Nucleotidsequenzinformation analysiert wird, um die Genauigkeit der Nucleotidsequenzanalyse zu verbessern.
Isolierte Nucleotidsequenzen, die IGFBP-5 codieren, können verwendet werden, um gereinigtes IGFBP-5 oder Fragmente davon zu erhalten, entweder mittels rekombinanter DNA-Verfahren oder mittels in vitro-Polypeptidsyntheseverfahren. Mit "gereinigt" und "isoliert" wird unter Bezug auf eine Polypeptid- oder Nucleotidsequenz gemeint, daß das angezeigte Molekül im wesentlichen in der Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle des selben Typs anwesend ist. Der Ausdruck "gereinigt", wie hier verwendet, bedeutet vorzugsweise mindestens 95 Gewichts-%, mehr bevorzugt mindestens 99 Gewichts-%, und am meisten bevorzugt mindestens 99,8 Gewichts-% von den anwesenden biologischen Makromolekülen des selben Typs (es können aber Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle, die ein Molekulargewicht von weniger als 1000 haben, anwesend sein).
Ein signifikanter Vorteil der Produktion von IGFBP-5 mittels rekombinanter DNA- Technik statt der Isolierung von IGFBP-5 aus natürlichen Quellen ist, daß äquivalente Mengen an IGFBP-5 unter Verwendung von weniger Ausgangsmaterial produziert werden können, als erforderlich wären, um das Bindungsprotein aus einer natürlichen Quelle zu isolieren. Die Produktion von IGFBP-5 mittels rekombinanter Technik erlaubt es auch, IGFBP-5 in der Abwesenheit einiger Moleküle zu isolieren, die üblicherweise in den Zellen anwesend sind, die natürlicherweise IGFBP-5 produzieren. Tn der Tat können IGFBP-Zusammensetzungen leicht produziert werden, die vollkommen frei sind von jeglicher Spur an menschlicher Proteinverunreinigung, da das einzige menschliche Protein, das von dem rekombinanten nichtmenschlichen Wirt produziert wird, das rekombinante IGFBP ist. Potentielle virale Mittel aus natürlichen Quellen werden auch vermieden. Es ist auch offensichtlich, dass die rekombinante DNA-Technik verwendet werden kann, um IGFBP-5-Polypeptidderivate zu produzieren, die nicht in der Natur gefunden werden, wie die vorstehend beschriebenen Variationen.
IGFBP-5 und Polypeptidderivate von IGFBP-5 können mittels rekombinanter Techniken exprimiert werden, wenn eine DNA-Sequenz, die das relevante Molekül codiert, funktionell in einen Vektor inseriert ist. Mit "funktionell inseriert" ist in geeignetem Leserahmen und in geeigneter Orientierung gemeint, wie von Durchschnittsfachleuten leicht verstanden wird. Wenn man ein genetisches Konstrukt produzieren will, das einen kompletten IGFBP-5-Leserahmen enthält, ist das bevorzugte Ausgangsmaterial eher ein cDNA-Bank- Isolat, das IGFBP-5 codiert, und nicht ein Isolat aus einer genomischen Bank. Typischerweise wird das IGFBP-5-Gen stromabwärts von einem Promotor inseriert und wird von einem Stop- Codon gefolgt, obwohl auch die Produktion eines hybriden Proteins, gefolgt von einer Spaltung, verwendet werden kann, wenn erwünscht. Im allgemeinen werden Wirtszellspezifische Sequenzen verwendet werden, die die Produktionsausbeute von IGFBP-5 und Polypeptidderivaten von IGFBP-5 verbessern und geeignete Kontrollsequenzen werden zu dem Expressionsvektor zugefügt, wie Enhancersequenzen, Polyadenylierungssequenzen und Ribosomenbindungsstellen.
Nachdem die geeignete codierende Sequenz isoliert ist, kann sie mittels einer Anzahl von verschiedenen Expressionssystemen exprimiert werden.

Säuger- Expressionssysteme

Ein Säuger-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säuger-RNA- Polymerase zu binden und stromabwärts die (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (d. h. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions- Initiationsregion haben, die üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz plaziert wird, und eine TATA-Box, die üblicherweise 25-30 Basenpaare (bp) stromaufwärts von der Transkriptions-Initiationsstelle liegt. Von der TATA-Box nimmt man an, dass sie die RNA-Polymerase II veranlasst, die RNA-Synthese an der richtigen Stelle zu beginnen. Ein Säuger-Promotor wird auch stromaufwärts ein Promotorelement enthalten, das typischerweise innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts von der TATA-Box lokalisiert ist. Ein sich stromaufwärts befindliches Promotorelement bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird und kann in jeder Richtung agieren [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aus].
Gene von Säuger-Viren werden oft stark exprimiert und haben einen breiten Wirtsbereich; deshalb stellen Sequenzen, die Säuger-Viren codieren, insbesondere nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen den frühen SV40-Promotor, den LTR- Promotor des Mäuse-Mamma-Tumovirus, den späten Hauptpromotor des Adenovirus (Ad MLP) und den Promotor des Herpes simplex-Virus. Zusätzlich stellen auch Sequenzen, die von nicht-viralen Genen abgeleitet sind, wie dem Maus-Metallothionein-Gen, nützliche Promotorsequenzen bereit. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, in Abhängigkeit davon, ob der Promotor in hormonreaktiven Zellen mit Glucocorticoid induziert werden kann.
Die Anwesenheit eines Enhancerelements (Enhancer), kombiniert mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen, wird typischerweise die Expressionsrate erhöhen. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bis zu 1000fach stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkriptions-Initiationsstelle entweder in der normalen oder umgekehrten Orientierung oder mehr als 1000 Nucleotide vom Promotor entfernt plaziert sind [Maniatis et al. (1987) Science 236 : 1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Ausg.]. Von Viren abgeleitete Enhancerelemente können insbesondere von Nutzen sein, weil sie üblicherweise einen breiteren Wirtsbereich haben. Beispiele umfassen den frühen Genenhancer von SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4: 761] und die abgeleiteten Enhancer/Promotoren aus der langen terminalen Wiederholungssequenz (LTR) des Rous-Sarkomvirus [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6777] und vom menschlichen Cytomegalievirus [Boshart et al. (1985) Cell 41: 521]. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in der Anwesenheit eines Induktors aktiv, wie einem Hormon oder einem Metallion [Sassone-Corsi und Borelli (1986) Trends Genet. 2 : 215; Maniatis et al. (1987) Science 236 : 1237].
Ein DNA-Molekül kann in Säugerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Wenn erwünscht kann der N-Terminus von dem Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanbromid abgespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform könne fremde Proteine auch durch Schaffung von chimären DNA-Molekülen, die ein Fusionsprotein codieren, das ein die Sezenierung des fremden Proteins in Säugerzellen bewirkendes Leader-Sequenzfragment umfasst, von der Zelle in das Wachsmedium sezerniert werden. Vorzugsweise werden Prozessierungsstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem Fremdgen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leader-Sequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sezenierung des Proteins aus der Zelle steuern. Der Adenovirus-Tripartit-Leader ist ein Beispiel einer Leader-Sequenz, die die Sezenierung eines fremdem Proteins in Säugerzellen bewirkt.
Typischerweise sind die Transkriptions-Terminationssequenzen und die Polyadenylierungssequenzen, die von Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und daher zusammen mit den Promotorelementen die codierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch ortsspezifische, post-transkriptionelle Spaltung und. Polyadenylierung gebildet [Birnstiel et al. (1985) Cell 41 : 349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and Splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14 : 105]. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid übersetzt werden kann, das von der DNA codiert wird. Beispiele für Transkriptions-Terminations-/Polyadenylierungssignale umfassen die, die von SV40 abgeleitet sind [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch intervenierende Sequenzen genannt) anwesend sind. Mehrere eDNAs jedoch wurden von Vektoren effizient exprimiert, denen Spleiß-Stellen (auch Spleiß-Donor und -Akzeptorstellen genannt) fehlen [vgl. z. B. Gothing und Sambrook (1981) Nature 293 : 620]. Introns sind intervenierende, nicht codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleiß-Donor- und - Akzeptorstellen enthalten. Diese werden mittels eines Verfahrens entfernt, das man "Spleißen" nennt, gefolgt von der Polyadenylierung des primären Transkripts [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52 : 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20 : 671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55 : 1119; Krainer und Maniatis (1988) "RNA splicing". In Transcription and splicin (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover)].
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, umfassend einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptions-Terminationssequenz, in einem Expressionskonstrukt zusammengesetzt. Enhancer, Introns mit funktionellen Spleiß- Donor- und -Akzeptorstellen und Leader-Sequenzen können, wenn erwünscht, ebenfalls in dem Expressionskonstrukt enthalten sein. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon erhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden), das in der Lage ist, sich stabil in einem Wirt wie Säugerzellen oder Bakterien zu erhalten. Säuger- Replikationssysteme umfassen diejenigen, die von Tier-Viren abgeleitet sind, die zur Replikation trans-agierende Faktoren erfordern. Zum Beispiel replizieren Plasmide, die das Replikationssystem von Papoaviren wie SV40 [Gluzman (1981) Cell 23 : 175] oder vom Polyomvirus enthalten, in der Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens zu extrem hohen Kopienzahlen. Zusätzliche Beispiele für Säuger-Replicons umfassen diejenigen, die vom Rinder-Papillomvirus und vom Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Zusätzlich kann das Replicon zwei Replikationssysteme haben und kann damit zum Beispiel in Säugerzellen für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Chlonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Shuttlevektoren umfassen pMT2 (Kaufmann et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9 : 946] und pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6 : 1074].

Baculovirus-Expressionssysteme

Ein Baculovirus-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und stromabwärts die (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (d. h. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiationsregion haben, die üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz plaziert ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion umfasst üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase und eine Transkriptions- Initiationsstelle. Ein Baculovirus-Promotor kann auch eine zweite Domäne haben, die Enhancer genannt wird, die, wenn anwesend, üblicherweise distal zum strukturellen Gen ist. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Sequenzen, die Gene codieren, die zu späten Zeiten im Infektionszyklus reichlich transkribiert werden, stellen insbesonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Sequenzen, die von dem Polyhedrin-Gen [Friesen et a.l. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); E. P. O. Pbl. Nr. 127,839 und 155,476] und dem p10-Gen [Vlak et al. (1988) J. Gen. Virol. 69 : 765] abgeleitet sind.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, in welchem Fall die erste Aminosäure am N- Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches von dem ATG- Startcodon codiert wird. Wenn erwünscht kann Methionin am N-Terminus durch in vitro- Inkubation mit Cyanbromid abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression bereit. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende einer heterologen codierenden Sequenz fusioniert. Bei Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Zum Beispiel kann der N-Terminus des Polyhedringens mit dem 5'-Terminus eines fremdem Gens verknüpft und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder auch nicht. Vgl. z. B. Luckow et al. (1988) Bio/technology 6 : 47.
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine auch mittels Schaffung chimärer DNA-Moleküle, die ein Fusionsprotein codieren, das ein die Sezernierung des fremden Proteins in Insekten bewirkendes Leader-Sequenzfragment umfaßt, aus der Zelle sezerniert werden. Das Leader-Sequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sezernierung des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirusproteine abgeleitet werden, wie das Baculovirus-Polyhedringen [Carbonell et al. (1988) Gene 73 : 409]. In einer anderen Ausführungsform bewirken Leader vom nicht- Baculovirus-Ursprung, wie diejenigen, die von Genen abgeleitet sind, die menschliches alpha- Interferon [Maeda et al. (1985) Nature 315 : 592], menschliches, Gastrin freisetzendes Peptid [Lebacq-Verheyden et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8 : 3129], menschliches IL-2 [Smith et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 8404], Maus-IL-3 [Miyajima et al. (1987) Gene 58: 273] und menschliche Glucocerebrosidase [Martin et al. (1988) DNA 7 : 99] codieren, auch die Sezernierung in Insekten.
Typischerweise sind die Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Insekten erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz: flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid übersetzt werden kann, das von der DNA codiert wird. Beispiele umfassen die Transkriptions-Terminationssequenzen, die vom Polyhedringen abgeleitet sind [Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42 : 177].
Vor der Insertion des fremden Gens in das Baculovirus-Genom werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, umfassend einen Promotor, einen Leader (wenn erwünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptions-Terminationssequenz, in einem intermediären Transplacementkonstrukt zusammengesetzt. Intermediäre Transplacementkonstruktionen werden oft in einem Replicon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmiden), das in der Lage ist, sich stabil in einem Wirt wie Bakterien zu erhalten. Das Replicon wird ein Replikationssystem haben, was erlaubt, dass es in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Der Promotor und die Transkriptions-Terminationssequenzen des Konstrukts werden typischerweise einen 2,5 kb-Bereich des Baculovirus-Genoms für die Integration des fremden Gens in das Baculovirus-Genom mittels eines doppelten Crossover- Rekombinationsereignisses unter Produktion eines Baculovirus-Expressionsvektors enthalten [Miller et al. (1988) Bioessays 4 : 91]. Der Baculovirus-Expressionsvektor wird typischerweise in einen infektiösen, rekombinanten Baculovirus verpackt.
Bei der Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren werden üblicherweise selektierbare Marker wie Antibiotika-Resistenzgene nicht verwendet. Die Selektion ist typischerweise mittels visueller Inspektion nach Ausschlusskörpern. Beispiele für die Verwendung von selektierbaren Markern werden in dieser Beschreibung an anderer Stelle gegeben.
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Infektion in verschiedene Insektenzellen entwickelt. Zum Beispiel wurden rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Heliothis zea, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni [P. C. T. WO 89/046699; Carbonell et al. (1985) J. Virol. 56 : 153; Smith et a.l. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; Wright (1986) Nature 321 : 718; vgl. allgemein Fraser et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25 : 22S].
Verfahren zur Einführung exogener DNA in Insektenwirte sind im Stand der Technik wohl bekannt und umfassen typischerweise die Transfektion von Wirtsinsektenzellen mit der DNA oder die Infektion von Insektenzellen oder lebenden Insekten, üblicherweise Larven, mit Virus. Transfektionsverfahren basieren auf dem Calciumphosphatverfahren, das ursprünglich für Säugerzellen entwickelt wurde [Graham et al. (1973) Virology 52 : 456]. Verfahren für die DNA-Transfektion und für die virale Infektion variieren üblicherweise mit der zu transfizierenden Insektengattung. Siehe z. B. Autograph [Carstens et al. (1980) Virology 101: 311], Heliothis (virescens) [P. C. T. Publ. Nr. WO88/02030], Spodoptera [Kang (1988) "Baculovirus Vectors für Expression of Foreign Genes," in: Advances in Virus Research, Bd. 35].

Bakterielle Expressionssysteme

Ein bakterieller Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und stromabwärts die (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (d. h. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiationsregion haben, die üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz plaziert wird. Diese Transkriptions-Initiationsregion umfasst typischerweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase und eine Transkriptions- Initiationsstelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne haben, die ein Operator genannt wird, die eine angrenzende RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt die negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Gen-Repressorprotein an den Operator binden und damit die Transkription eines spezifischen Gens inhibieren kann. Die konstitutive Expression kann bei Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen wie einem Operator stattfinden. Zusätzlich kann eine positive Regulation mittels einer Bindungssequenz für ein Gen- Aktivatorprotein erreicht werden, die, wenn anwesend, üblicherweise proximal (5') zu der RNA-Palymerase-Bindungssequenz ist. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivierungsprotein ist das Catabolit-Aktivierungsprotein (CAP), das hilft, die Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) zu initiieren [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18 : 173]. Die regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, womit die Transkription entweder erhöht oder erniedrigt wird.
Sequenzen, die Enzyme von Stoffwechselwegen codieren, stellen insbesondere nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von Zuckermetabolisierenden Enzymen wie Galactose, Lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198: 1056] und Maltose abgeleitet sind. Zusätzliche Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (4) abgeleitet sind [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8 : 4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9 : 731; U.S.-Patent Nr. 4,738,921; E. P. O.-Pbl.-Nr. 36,776 und 121,775]. Das γ-Lactamase (bla)-Promotorsystem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)], das Bakteriophage lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292 : 128]- und T5 [U.S.-Patent Nr. 4,689,406]-Promotorsystem stellen ebenfalls nützliche Promotorsequenzen bereit.
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können die Transkriptions- Aktivierungssequenzen eines bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors mit den Operon- Sequenzen eines anderen bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors unter Schaffung eines synthetischen Hybrid-Promotors [U. S. -Patent Nr. 4,551,433] verknüpft werden. Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein hybridertrp-lac-Promotor, der aus sowohl trp-Promotor- als auch lac- Operon-Sequenzen besteht und der durch den lac-Repressor reguliert wird [Amann et al. (1983) Gene 25 : 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80 : 21]. Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlicherweise vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs umfassen, die die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlicherweise vorkommender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um eine Expression einiger Gene in Prokaryonten auf hohem Niveau zu produzieren. Das Bakteriophage T7-RNA-Polymerase/Promotor-System ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotor-Systems [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189 : 113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 1074]. Zusätzlich kann ein Hybrid-Promotor auch aus einem Bakteriophagen- Promotor und einer E. coli-Operatorregion bestehen (E. P. O Pbl. Nr. 267,851).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotor-Sequenz ist auch eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle von Nutzen für die Expression fremder Gene in Prokaryonten. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz genannt und umfasst ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz von 3-9:Nucleotiden Länge, die 3-11 Nucleotide stromaufwärts vom Initiationscodon lokalisiert ist [Shine et al. (1975) Nature 254: 34]. Man nimmt an, dass die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an das Ribosom durch Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E. coli 16S-rNA fördert [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger)]. Um eukaryontische Gene und prokaryontische Gene mit schwacher Ribosomen-Bindungsstelle zu exprimieren [Sambrook et al. (1989) "Expression of clones genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, in welchem Fall die erste Aminosäure am N- Terminus immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Wenn erwünscht, kann Methionin am N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanbromid oder entweder in vivo- oder in vitro-Inkubation mit bakterieller N-terminaler Methionin- Peptidase (E. P. O. Pbl. Nr. 219,237) von dem Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression bereit. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende von heterologen, codierenden Sequenzen fusioniert. Bei Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Zum Beispiel kann das Bakteriophage lambda-Zellgen mit dem 5'-Terminus eines fremdem Gens verknüpft werden und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagenprotein von dem fremdem Gen zu spalten [Nagai et al. (1984) Nature 309 : 8I0]. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen von lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60 : 197]-, trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5 : 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135 : 11]- und Chey [E. P. O. Pbl. Nr. 324,647]-Genen gemacht werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder auch nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin- Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region, die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym behält (z. B. Ubiquitin-spezifische Prozessierungsprotease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten, hergestellt. Mit diesem Verfahren können native, fremde Proteine isoliert werden [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7 : 698].
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine auch mittels Schaffung chimärer DNA-Moleküle, die ein Fusionsprotein codieren, das ein die Sezernierung des fremden Proteins in Bakterien bewirkendes Signalpeptid-Sequenzfragment umfasst, von der Zelte sezerniert werden [U. S.-Patent Nr. 4,336,336]. Das Signal-Sequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sezernierung des Proteins von der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium sezerniert (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und der äußeren Membran der Zelle gelegen ist (Gram-negative Bakterien). Vorzugsweise werden Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können, zwischen dem Signalpeptidfragment und dem fremden Gen codiert.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine wie das äußere Membranproteingen von E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Gbrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437] und die Signalsequenz von alkalischer Phosphatase von E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 7212] abgeleitet werden. Als ein zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylasegens von verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine von B. subtilis zu sezernieren [:Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5582; E. P. O. Pbl. Nr. 244,0423.
Typischerweise sind die Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz: flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid übersetzt werden kann, das von der DNA codiert wird. Transkriptions-Terminationssequenzen umfassen häufig DNA- Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die in der Lage sind, Stamm-Schleifen-Strukturen zu bilden, die bei der Beendigung der Transkription helfen. Beispiele umfassen Transkriptions- Terminationssequenzen, die von Genen mit starken Promotoren abgeleitet sind, wie das trp- Gen in E. coli ebenso wie andere biosynthetische Gene.
Typischerweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, umfassend einen Promotor, eine Signalsequenz (wenn erwünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptions-Terminationssequenz in Expressionskonstrukten zusammengesetzt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon aufrechterhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plamide), das in der Lage ist, sich in einem Wirt wie Bakterien stabil zu erhalten. Das Replicon wird ein Replikationssystem haben, was erlaubt, dass es in einem prokaryontischen Wirt entweder zur Expression oder zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Zusätzlich kann ein Replicon ein Plasmid mit entweder hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl haben, die von etwa 5 bis etwa 200 reicht, und typischerweise von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Es kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden, in Abhängigkeit von dem Effekt des Vektors und der fremden DNA auf den Wirt.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mittels eines integrierenden Vektors in das bakterielle Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten typischerweise mindestens eine Sequenz, die homolog ist zu dem bakteriellen Chromosom, was dem Vektor die Integration erlaubt. Integrationen scheinen von Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem bakteriellen Chromosom zu resultieren. Zum Beispiel integrieren integrierende Vektoren, die aus DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert wurden, in das Bacillus-Chromosom (E. P. O. Pbl. Nr. 127,328). Integrierende Vektoren können auch aus Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen zusammengesetzt sein.
Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, die die Selektion der bakteriellen Stämme erlauben, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können in dem bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene umfassen, die eine bakterielle Resistenz gegen Wirkstoffe wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin verleihen [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32 : 469]. Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene umfassen, so wie die im Histidin-, Tryptophan- und Leucin- Biosyntheseweg.
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengesetzt werden. Transformationsvektoren umfassen typischerweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten wird oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, sind zur Transformation von vielen Bakterien entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren für unter anderem die folgenden Bakterien entwickelt worden: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5582; E. P. O. Pbl. Nr. 36,259 und 63,953; P. C. T. WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292 : 128; Amann et al. (1985) Gene 40 : 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; E. P. O. Pbl. Nr. 36,776, 136,829 und 136,907; GB-Patentanmeldung Seriennummer 8418273], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 655]; Streptomyces lividans [U.S.-Patent Nr. 4,745,056].
Verfahren zur Einbringung von exogener DNA in bakterielle Wirte sind im Stand der Technik wohl bekannt und umfassen typischerweise entweder die Transformation von Bakterien, die mit CaCl&sub2; oder anderen Mitteln wie zweiwertigen Kationen und DMSO behandelt wurden. DNA kann auch mittels Elektroporation in bakterielle Zellen eingebracht werden. Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der bakteriellen Art, die transformiert werden soll. Vgl. z. B. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60 : 273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5582; E. P. O. Pbl. Nrs. 36,259 und 63,953; P. C. T. WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172 : 949; Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69 : 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16 : 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with Co1E1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53 : 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949 : 318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44 : 173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170 : 38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66 : 203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144 : 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by eleetroporation, in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32 : 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 : 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1 : 412, Streptococcus].

Beschreibung: Hefe-Expressionssysteme

Ein Hefe-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Hefe-RNA- Polymerase zu binden und stromabwärts die (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (d. h. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions- Initiationsregion haben, die üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz plaziert ist. Diese Transkriptions-Initiationsregion umfasst typischerweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein Hefe-Promotor kann auch eine zweite Domäne haben, die stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenz (UAS) genannt wird, die, wenn anwesend, üblicherweise distal zum strukturellen Gen ist. Die UAS erlaubt die regulierte (induzierbare) Expression. Die konstitutive Expression findet in der Abwesenheit einer UAS statt. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wobei die Transkription entweder erhöht oder erniedrigt ist.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Metabolismus; daher stellen Sequenzen, die Enzyme des Metabolismus codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (E. P. O. Pbl. Nr. 284044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd-3- Phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH) Hexokiriase, Phosphofructokinase, 3- Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvatkinase (PyK) (E. P. O. Pbl. Nr. 329203). Das Hefe PHO5- Gen, das saure Phosphatase codiert, stellt eine nützliche Promotorsequenz bereit [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 1].
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als Hefe-Promotoren. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen von einem Hefe- Promotor mit der Transkriptions-Aktivierungsregion eines anderen Hefe-Promotors unter Schaffung eines synthetischen hybriden Promotors verknüpft werden. Beispiele für solche hybriden Promotoren umfassen die ADH-regulatorische Sequenz, verknüpft mit der GAP- Transkriptions-Aktivierungsregion (U. S. -Patent Nr. 4,876,197 und 4,880,734). Andere Beispiele für hybride Promotoren umfassen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen von entweder ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHOS-Genen bestehen, kombiniert mit der Transkriptions-Aktivierungsregion eines Gens für ein glycolytisches Enzym wie GAP oder PyK (E. P. O. Pbl. Nr. 164556). Darüber hinaus kann ein Hefe-Promotor natürlicherweise vorkommende Promotoren von nicht-Hefe-Ursprung umfassen, die die Fähigkeit haben, die Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele solcher Promotoren umfassen unter anderem [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283 : 835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96 : 119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmi.s und A. Puhler); Mercerau- Puigalon et al. (1980) Gene 11 : 163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2 : 109].
Ein DNA-Molekül kann in Hefe intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welches durch das ATG-Startcodon codiert wird. Wenn erwünscht kann Methionin am N- Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanbromid vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression bereit. Typischerweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen Hefe-Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Zum Beispiel kann das Superoxiddismutase (SOD)-Gen der Hefe oder des Menschen mit dem 5'-Terminus eines fremdem Gens verknüpft werden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder auch nicht. Vgl. z. B. E. P. O. Pbl. Nr 196056. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin- Region gemacht, die vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym behält (z. B. Ubiquitin-spezifische Prozessierungsprotease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten. Mit diesem Verfahren können daher native, fremde Proteine isoliert werden (P. C. T. WO 88/024066; in gemeinsamem Besitz befindliche U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr 359,599, angemeldet am 7. August 1989, deren Offenbarung durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Diese System ist das gegenwärtig für die Produktion von IGFBP-5 bevorzugte System.
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine auch mittels Schaffung chimärer DNA-Moleküle, die ein Fusionsprotein codieren, das ein die Sezernierung des fremden Proteins in Hefe bewirkendes Leader-Sequenzfragment umfasst, von der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden. Vorzugsweise werden zwischen dem Leader-Fragment und dem fremden Gen Prozessierungsstellen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leader-Sequenzfragment codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sezernierung des Proteins von der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus Genen für sezernierte Hefe- Proteine wie dem Hefe-Invertase-Gen (E. P. O. Pbl. Nr. 12873; J. P. O. Pbl. Nr. 62,096,086) und dem A-Faktor-Gen (U.S.-Patent Nr. 4,588,684) abgeleitet werden. In einer anderen Ausführungsform existieren Leader von nicht-Hefe-Ursprung wie ein Interferon-Leader, die ebenfalls die Sezernierung in Hefe bereitstellen (E. P. O. Pbl. Nr. 60057).
Eine bevorzugte Klasse von Sezemierungs-Leader sind diejenigen, die ein Fragment des Hefe-alpha-Faktor-Gens umfassen, das sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch eine "pro"-Region enthält. Die Typen von alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, umfassen den prä-pro-alpha-Faktor-Leader voller Länge (etwa 83 Aminosäurereste) ebenso wie verkürzte alpha-Faktor-Leader (typischerweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (U.S.-Patente Nr. 4,546,083 und 4,870,008; E. P. O. Pbl. Nr. 324274). Zusätzliche Leader, die ein alpha-Faktor-Leaderfragment beinhalten, das die Sezernierung bewirkt, umfassen hybride alpha-Faktor-Leader, die aus einer prä-Sequenz eines ersten Hefe- alpha-Faktors, aber einer pro-Region eines zweiten Hefe-alpha-Faktors hergestellt sind (vgl. z. B. P. C. T. WO 89/02463).
Typischerweise sind die Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Hefe erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3' zum Translations-Stopcodon lokalisiert sind und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid übersetzt werden kann, das durch die DNA codiert wird. Beispiele von Transkriptions-Terminationssequenzen und anderen von Hefe erkannten Terminationssequenzen, wie diejenigen, die glycolytische Enzyme codieren. Typischerweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, umfassend einen Promotor, einen Leader (wenn erwünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptions-Terminationssequenz, in einem Expressionskonstrukt zusammengesetzt.
Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon erhalten, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das in der Lage ist, sich in einem Wirt wie Hefe oder Bakterien stabil zu erhalten. Das Replicon kann zwei Replikationssysteme haben, was erlaubt, dass es zum Beispiel in Hefe zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Beispiele für solche Hefe-Bakterien- Shuttlevektoren umfassen Yep24 [Botstein et al. (1979) Gene 8: 17-24], pC1/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4642-4646] und YRp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Zusätzlich kann ein Replicon ein Plasmid mit entweder hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl haben, die von etwa 5 bis etwa 200 reicht, und typischerweise von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Es kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden, in Abhängigkeit von dem Effekt des Vektors und der fremden DNA auf den Wirt. Vgl. z. B. Brake et al., vorstehend.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mittels eines integrierenden Vektors in das Hefe-Genom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten typischerweise mindestens eine Sequenz, die homolog ist zu dem Hefe-Chromosom, was dem Vektor die Integration erlaubt, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen von Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefe-Chromosom zu resultieren [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245]. Ein integrierender Vektor kann durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz zum Einbau in den Vektor gegen einen spezifischen Locus in Hefe gerichtet sein. Vgl. Orr-Weaver et al., vorstehend. Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, was möglicherweise die Menge an produziertem, rekombinantem Protein beeinflußt [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die im Vektor eingeschlossenen chromosomalen Sequenzen können entweder als einzelnes Segment im Vektor vorkommen, was in der Integration des gesamten Vektors resultiert, oder als zwei Segmente, die homolog zu benachbarten Segmenten im Chromosom sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was in einer stabilen Integration nur des Expressionskonstrukts resultieren kann.
Typischerweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Hefestämmen zu ermöglichen, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene enthalten, die in Hefewirten exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, und das G418-Resistenzgen, was Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin beziehungsweise G418 verleiht. Zusätzlich kann ein geeigneter selektierbarer Marker Hefe auch die Fähigkeit verleihen, in der Gegenwart von toxischen Substanzen wie einem Metall zu wachsen. Zum Beispiel erlaubt die Anwesenheit von CUP1 Hefe, in der Anwesenheit von Kupfer-Ionen zu wachsen [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51 : 351].
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in einem Transformationsvektor zusammengesetzt werden. Transformationsvektoren umfassen typischerweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten wird oder für einen integrierenden Vektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, sind zur Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Zum Beispiel sind Expressionsvektoren für unter anderem die folgenden Hefen entwickelt worden: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158 : 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8 : 135], Pichia guillerimondii [Kunze, et ah (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; U.S.-Patente Nr. 4,837,148 und 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153 : 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706] und Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 380471; Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren zur Einbringung exogener DNA in Hefewirtszellen sind im Stand der Technik wohl bekannt und umfassen typischerweise entweder die Transformation von Sphäroblasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt wurden. Die Transformationsverfahren variieren mit der zu transformierenden Hefeart. Vgl. z. B. [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142]; Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158 : 1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]; U.S.-Patente Nr. 4,837,148 und 4,929,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163; Saccharomyces]; [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].

Diagnostische Verfahren unter Verwendung von Antigenen

Die Zusammensetzungen der Erfindung, die Antigene umfassen, ebenso wie das genetische Material können in diagnostischen Tests verwendet werden. Unter der biologisch wichtigen Information, die erhalten werden kann, ist ein übermäßiger Spiegel an Bindungsprotein wegen der Anwesenheit von Tumoren, die in einer erhöhten Produktion von entweder IGF oder einem der IGFBP-Bindungsproteine resultieren (da die Bindungsproteine in der Anwesenheit eines Überschusses an IGF produziert werden). Zusätzlich kann eine Anzahl von bekannten Krankheiten mit IGF-Konzentrationen in Zusammenhang gebracht werden. Zum Beispiel stehen einige Arten von Osteoporose mit dem IGF-Spiegel in Zusammenhang. Außerdem können die Bindungsproteine für die Identifizierung, Produktion und Reinigung der rekombinant produzierten IGFs verwendet werden. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von IGFBP-5 umfassen die Analyse einer biologischen Probe wie einer Blutprobe, cerebrospinaler Flüssigkeit oder von Tumor- oder Knochengewebe.
Typischerweise beruhen die Verfahren zum Nachweis von Analyten wie den Bindungsproteinen der Erfindung auf Immuntests. Solche Verfahren sind wohl bekannt und müssen hier nicht ausführlich beschrieben werden. Beispiele umfassen sowohl heterogene als auch homogene Immuntestverfahren. Beide Verfahren beruhen auf der Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Bindungsprotein und einem entsprechenden spezifischen Antikörper. Heterogene Tests für IGFBP-5 verwenden typischerweise einen spezifischen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper, der an eine feste Oberfläche gebunden ist, Sandwich-Tests sind zunehmend populär. Homogene Tests, die in Lösung ohne die Anwesenheit einer festen Phase durchgeführt werden, können auch verwendet werden, zum Beispiel zur Bestimmung des Unterschieds bei der Enzymaktivität, der durch die Bindung von freiem Antikörper an ein Enzym-Antigen-Konjugat hervorgerufen wird. Eine Reihe von geeigneten Tests werden in den U.S.-Patenten Nr. 3,817,837, 4,006,360, 3,996,345 offenbart.
Das Reagenz an der festen Oberfläche in dem vorstehenden Test wird mittels bekannter Verfahren zur Anheftung von Proteinmaterial an festes Trägermaterial wie polymere Kügelchen, Eintauchstäbchen oder Filtermaterial hergestellt. Diese Anheftungsverfahren umfassen im allgemeinen eine unspezifische Adsorption des Proteins an den Träger oder kovalente Bindung des Proteins typischerweise durch eine freie Amingruppe an eine chemisch reaktive Gruppe auf dem festen Träger wie eine aktive Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aldehydgruppe.
In einer zweiten diagnostischen Konfiguration, die als ein homogener Test bekannt ist, erzeugt die Antikörperbindung an einen Analyten eine gewisse Veränderung in dem Reaktionsmedium, die in dem Medium direkt nachgewiesen werden kann. Bekannte allgemeine Typen von homogenen Tests, die hierzu vorgeschlagen werden, umfassen (a) Spinmarkierte Reportermoleküle, wobei die Antikörperbindung an das Antigen durch eine Veränderung in der beobachteten Beweglichkeit nachgewiesen wird (eine Verbreiterung der Spin spaltenden Peaks), (b) fluoreszierende Reportermoleküle, wobei die Bindung durch eine Veränderung bei der Fluoreszenzeffizienz nachgewiesen wird, (c) Enzym-Reportermoleküle, wobei die Antikörperbindung die Enzym/Substrat-Wechselwirkungen beeinflußt, und (d) Liposom-gebundene Reportermoleküle, wobei die Bindung zur Lyse des Liposoms und zur Freisetzung des eingekapselten Reportermoleküls führt. Die Anpassung dieser Verfahren an das Proteinantigen der vorliegenden Erfindung folgt herlkömmlichen Verfahren zur Herstellung homogener Testreagenzien.

Diagnostische Anwendungen unter Verwendung genetischer Sonden

Das genetische Material der Erfindung kann als solches in zahlreichen Tests als Sonden für genetisches Material, das in natürlicherweise vorkommenden Materialien anwesend ist, verwendet werden. Der Analyt kann eine Nucleotidsequenz sein, die mit einer Sonde hybridisiert, die eine Sequenz von (üblicherweise) mindestens etwa 16 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, üblicherweise 30 bis 200 Nucleotiden, bis zu im wesentlichen der vollen Sequenz der vorstehenden gezeigten Sequenzen (eDNA-Sequenzen) umfaßt. Das Analyt kann RNA oder cDNA sein. Die Probe ist üblicherweise wie in den vorstehenden Abschnitten beschrieben. Ein positives Ergebnis wird im allgemeinen als Identifikation eines genetischen Materials charakterisiert, das eine Sequenz umfaßt, die mindestens zu etwa 70% homolog ist zu einer Sequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nucleotiden der hier gezeigten Sequenzen, üblicherweise mindestens zu etwa 80% homolog ist zu mindestens etwa 60 aufeinanderfolgenden Nucleotiden innerhalb der Sequenzen, und kann eine Sequenz umfassen, die im wesentlichen homolog ist zu den Sequenzen voller Länge. Um einen Analyt nachzuweisen, wenn der Analyt mit einer Sonde hybridisiert, kann die Sonde eine nachweisbare Markierung enthalten. Sonden, die zum Nachweis der Bindungsproteine besonders von Nutzen sind, beruhen auf den konservierten Regionen dieser Proteine, insbesondere von den Aminosäuren PNCD und den Aminosäuren CWCV von BP5, wie in Fig. 2 in Klammern dargestellt. Diese Aminosäuren sind in allen verwandten IGF-Bindungsproteinen in hohem Maße konserviert. Nur IGFBP-1 hat einen Unterschied, ein N für ein D an Position 191.
Ein Verfahren zur Amplifikation von Zielnucleinsäuren für die spätere Analyse mittels Hybridisierungstests ist bekannt als die Polymerase-Kettenreaktion oder das PCR-Verfahren. Das PCR-Verfahren kann zum Nachweis von IGFBP-5 der Erfindung in verdächtigen Proben unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern eingesetzt werden, die voneinander einen Abstand haben und die auf der genetischen Sequenz beruhen, die hier offenbart wird. Die Primer sind komplementär zu gegenläufigen Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls und sind typischerweise etwa 50 bis 450 nt oder mehr (üblicherweise nicht mehr als 2000 nt) voneinander getrennt. Dieses Verfahren umfaßt die Herstellung der spezifischen Oligonucleotid-Primer und dann wiederholte Zyklen der Denaturierung der Ziel-DNA, der Bindung der Primer und der Verlängerung mit DNA-Polymerase, um DNA-Fragmente der erwarteten Länge des Abstands der Primer zu erhalten. Die Verlängerungsprodukte, die von einem Primer erhalten werden, dienen als zusätzliche Zielsequenzen für den anderen Primer. Das Ausmaß der Amplifikation einer Zielsequenz wird durch die Anzahl der durchgeführten Zyklen gesteuert und wird theoretisch durch die einfache Formel 2n berechnet, wobei n die Anzahl an Zyklen ist. Unter der Vorraussetzung, daß die durchschnittliche Effizienz pro Zyklus von etwa 65% bis 85% reicht, produzieren 25 Zyklen zwischen 0,3 bis 4,8 Millionen Kopien der Zielsequenz. Das PCR-Verfahren wird in einer Anzahl von Publikationen beschrieben, einschließlich Saiki et al., Science (1985) 230: 1350-1354; Saiki et al., Nature (1986) 324: 163-166; und Scharf et al., Science (1986) 233: 1076-1078. Vgl. auch U. S. - Patente Nr. 4,683,194; 4,683,195; und 4,683,202.
Die Erfindung umfaßt ein spezifisches diagnostisches Verfahren zur Bestimmung von IGFBP-5, das auf selektiver Amplifikation von IGFBP-5-codierenden DNA-Fragmenten beruht. Dieses Verfahren verwendet ein Paar an Einzelstrang-Primern, die aus nichthomologen Bereichen gegenläufiger Stränge eines DNA-Duplexfragments abgeleitet sind, das aus den in Fig. 1 dargestellten Sequenzen ausgewählt ist. Diese "Primer-Fragmente", die einen Aspekt der Erfindung bilden, werden, wie vorstehend beschrieben, von IGFBP-5- Fragmenten hergestellt. Das Verfahren folgt dem Prozeß zur Amplifikation ausgewählter Nucleinsäuresequenzen, wie in U.S.-Patent Nr. 4,683,202 offenbart und vorstehend diskutiert.

Monoclonale Antikörper

Für die in vivo-Verwendung von Antikörpern gegen IGFBP-5 und anti-idiotypischen Antikörper und die diagnostische Verwendung kann die Verwendung von monoclonalen Antikörpern bevorzugt sein. Monoclonale Antikörper gegen Virus-Partikel oder antiidiotypische Antikörper können wie folgt produziert werden. Die Milz oder die Lymphocyten von einem immunisierten Tier werden entnommen und immortalisiert oder verwendet, um mittels im Stand der Technik bekannten Verfahren Hybridome herzustellen. Um ein menschlich-menschliches Hybridom herzustellen wird ein menschlicher Lymphocytendonor ausgewählt. Das Epstein-Barr-Virus (EBV) kann verwendet werden, um menschliche Lymphocyten zu immortalisieren, oder ein menschlicher Fusionspartner kann zur Produktion menschlich-menschlicher Hybridome verwendet werden. Eine primäre in vitro-Immunisierung mit Peptiden kann ebenfalls bei der Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper verwendet werden. Antikörper, die von den immortalisierten Zellen sezerniert werden, werden durchmustert, um die Clone zu bestimmen, die Antikörper der erwünschten Spezifität sezernieren.

Test auf die biologischen Eigenschaften von IGFBP-5

Die Eigenschaft der Bindung an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor ist eine der biologischen Aktivitäten der Proteine der Erfindung. Diese Proteine können einfach in Bindungstests unter Verwendung von IGF-I [Rinderknecht, E. und Humbel, R. E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769] oder IGF-II [Rinderknecht, E. und Humbel, R. E., FEBS (1978) 89: 283], vorzugsweise IGF-II, in einer markierten, z. B. iodierten, Form getestet werden. Zum Beispiel kann ein solcher Test einfach die Durchführung einer Gelelektrophorese (SDS- PAGE) der Proteine der Erfindung umfassen, gefolgt von einem Western-Blot des Gels, dann Inkubation des Blots in der Gegenwart von [¹²&sup5;I]IGF-I oder -II, Waschen des Blots zur Entfernung von freiem IGF-I oder -II und Bestimmung der Radioaktivität auf dem Blot.

Quellen von IGFBP-5

Während die IGF-BP5 der Erfindung ursprünglich menschliche IGF-BP5 bedeuten, sind IGF-BP5 von Säugern, d. h. murin, von dem Schwein, dem Pferd oder Rind in der Definition der IGF-BP5 mit eingeschlossen, so lange sie das erforderliche Ausmaß an Homogenität erfüllen.
Die IGF-BP5 der Erfindung umfassen diejenigen, die aus Gewebeextrakten oder aus konditioniertem Medium gereinigt sind, ebenso wie die mittels rekombinanter Mittel erhaltenen.

Verwendungen von IGFBP-5

Therapeutische Anwendungen der Bindungsproteine der Erfindung umfassen ihre Verwendung als einzelnes therapeutisches Mittel und ihre Verwendung in Kombination mit einem IGF, wobei die letztere Verwendung bevorzugt ist.
Wenn es in Kombination mit einem IGF verwendet wird, ist ein Bindungsprotein der Erfindung geeignet zur Verwendung bei den vorstehend erwähnten Indikationen, vor allem als Wachstum induzierendes, Gewebe regenerierendes oder Wunden heilendes Mittel.

Entsprechend stellt die Erfindung bereit:

i) Verwendung eines Bindungsproteins der Erfindung zusammen mit IGF in freier oder fixierter Kombination zur Stimulierung des Wachstums eines Individuums, der Gewebe- oder Organregeneration oder der Wundheilung, oder
ii) ein Verfahren zur Stimulierung des Wachstums eines Individuums, der Gewebe- oder Organregeneration oder der Wundheilung in einem Individuum, was die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Bindungsproteins der Erfindung zusammen mit einer therapeutisch wirksamen Menge an IGF an einen Patienten umfaßt, der eine solche Behandlung benötigt, oder
iii) ein Arzneimittel zur Stimulierung des Wachsbums eines Individuums, der Gewebe- oder Organregeneration oder der Wundheilung, welches ein Bindungsprotein der Erfindung zusammen mit einem IGF und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt, oder
iv) eine Packung, die getrennte Dosierungsformen eines Bindungsproteins der Erfindung und einen IGF zusammen mit Anweisungen für die Mischung oder die gleichzeitige Verabreichung enthält.
In Verbindung mit einem IGF ist ein Bindungsprotein der Erfindung von besonderem Interesse zur Vermittlung der Chondrogenese oder Hämotopoese. Dies kann in den folgenden Tests A bis C gezeigt werden.
A) Ein IGF erhöht die Knochenbildung, wie angezeigt durch z. B. einen erhöhten Einbau von [³H]-Prolin in Collagen- und nicht-Collagen-Proteine in fötalen Rattencalvaria. Ein synergistischer Effekt tritt auf, wenn ein IGF in der Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung verwendet wird. Organkulturen von Rattencalvaria werden durch Spalten der frontalen und parietalen Knochen von 21 Tage alten fötalen Ratten, Aufspaltung entlang der sagittalen Naht und Kultur entsprechend dem Verfahren von Kream et al. (Endocrinology (1985) 116: 296) hergestellt. Ein Bindungsprotein oder IGF wird in Dosen von 10 bis 200 ng/ml Kultur zugegeben. Wenn sie in Kombination miteinander zugegeben werden, beträgt das molare Verhältnis 1 : 1. Die Kultur wird 24 bis 48 Stunden durchgeführt. Um den Einbau von [³H]-Prolin in Collagenase-verdaubares Protein und nicht-Collagen-Protein zu quantifizieren, werden Knochenhomogenate entsprechend dem Verfahren von Diegelman R. und Peterkofsky (Dev. Biol. (1972) 28 : 443), modifiziert von Kream et al. (Endocrinology (1985) 116: 296), mit bakterieller Collagenase verdaut.
B) Ein IGF vermindert die Knochenresorption, angezeigt durch die verminderte Freisetzung von [45]Ca aus Knochen. Ein synergistischer Effekt tritt auf, wenn IGF in der Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung verwendet wird. Der Test wird entsprechend den Prinzipien von Raisz (J. Clin. Invest. (1965) 44: 103) durchgeführt. Trächtigen Ratten wird am 18. Tag der Schwangerschaft s.c. [45]Ca injiziert. Ein IGF, entweder allein oder in der Gegenwart eines Bindungsproteins der Erfindung, wird mit einer Dosis von 10 ng bis 200 ng pro Tier injiziert. Das Bindungsprotein wird in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zum IGF zugegeben. Am Tag 19 werden die Tiere getötet und die Föten entnommen. Die mineralisierten Schäfte der Radü und der Ulnae werden entfernt und in Kultur genommen. Die Resorption wird auf der Basis der Freisetzung von [45]Ca von den Knochenexplantaten quantifiziert.
C) Die IGF-Bindungsproteine der Erfindung ebenso wie andere IGF- Bindungsproteine verstärken den Erythropoietin-ähnlichen Effekt von IGF-I. Dies kann insbesondere gezeigt werden durch Testung von IGF-I, z. B. 10 ng/ml IGF-I, allein oder in Kombination mit dem reifen IGF-Bindungsprotein von Fig. 1 oder 2, z. B. ein 50 ul-Aliquot eines Überstandes, der von einer Kultur einer CHO-Zelllinie abgeleitet ist, die das reife IGF- Bindungsprotein von Fig. 1 exprimierte, in einem CFU-E-Test, wie er von Fagg, B. Roitsch, C. A., Cell. Physiol. (1986) 126: 1 beschrieben ist. Während das Signal, das mit dem IGF- Bindungsprotein allein erhalten wird, nicht signifikant unterschiedlich ist von der Kontrolle, wird ein synergistischer Effekt der Kombination gesehen, verglichen mit IGF-I allein.
Weiterhin kann die mitogene Aktivität eines IGF in Kombination mit einem Bindungsprotein der Erfindung wie folgt getestet werden: Der Einbau von [³H] Methylthymidin in CCL 39-Zellen (Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters) in Kultur wird gemessen, wie von Plouet et al. Cell. Biol. (1984) 30: 105 beschrieben. In diesem Test wird die Zelllinie CCI 39 auf eine Platte mit 40 000 Zellen pro Mulde in 0,5 ml MEM- Kulturmedium (Gibco) ausgesät, das 10% fötales Kälberserum, 0,1% Penicillin, 0,4% Streptomycin und 0,5% Fungizon enthält. Nach 72 Stunden Inkubation bei 37ºC in einer Atmosphäre, die 5% CO&sub2; enthält, werden die Zellen mit MEM-Medium in der Abwesenheit von fötalem Kälberserum gewaschen und dann in diesem Medium 20 Stunden kultiviert. Zu diesem Stadium ist die Zellkultur confluent, und ein IGF oder ein Bindungsprotein oder beide zusammen werden jeweils mit einer Dosis von 10 ng bis 200 ng in das Kulturmedium inokuliert. Wenn sie zusammen zugegeben werden, muß das molare Verhältnis 1 : 1 sein. Die Testprobe wird 24 Stunden bei 37ºC inkubiert, und dann wird 1 uCl [³H]-Methylthymidin in 10 ul PBS zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation wird der Einbau von Methylthymidin durch Waschen der Zellen mit PBS gestoppt. Die Zellen werden 30 min mit 0,5 ml Trichloressigsäure (5%) fixiert, mit Wasser gewaschen und letztlich mit 0,5 ml 0,1 M NaOH 2 Stunden bei 37ºC lysiert. 0,5 ml des Lysats werden in eine Szintillationsflasche übertragen und mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit zur Messung der β-Radioaktivität gemischt. Das Bindungsprotein verstärkt die mitogene Aktivität von IGF, obwohl die Menge an Radioaktivität, die bei Verwendung des Bindungsproteins allein gemessen wird, nicht wesentlich unterschiedlich ist von der der Kontrollprobe.
Insbesondere ist ein Bindungsprotein der Erfindung in Kombination mit einem IGF nützlich a) für die Behandlung der Hypopituiarismus, der Zwergwüchsigkeit vom Laron-Typ, der Osteoporose, von Anämien, insbesondere Komplikationen in Folge von chronischem Nierenversagen und Leber- oder Nierendefizienz, und b) zur Unterstützung der Heilung von Wunden wie Geschwüren und Verbrennungen oder solcher, die bei Unfällen auftreten oder von einer Operation stammen.
Zur Verwendung in Verbindung mit einem Bindungsprotein der Erfindung wird IGF vorzugsweise ausgewählt aus IGF-I, wie von Rinderknecht, E. und Humbel, R. E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769 beschrieben, IGF-II, wie beschrieben bei Rinderknecht, E. und Humbel, R. E., FEBS (1978) 89: 283, und jedem Derivat oder Fragment von IGF-I und IGF-II, das eine insulinähnliche Wachstumsfaktor-Aktivität hat. Am meisten bevorzugt ist das IGF-II.
Zur Verwendung in Verbindung mit einem IGF ist das Bindungsprotein der Erfindung vorzugsweise ein Protein, das zwischen 85% und 100% homolog mit prä-IGF-BP oder IGF- Bp ist, wie in Fig. 1 gezeigt ist.
Wenn sie nicht mit IGFs assoziiert sind, haben die Bindungsproteine der Erfindung weitere therapeutische Anwendungen in jeder physiologischen Erkrankung, die aus einer übermäßigen Produktion freier IGFs resultiert, z. B. IGF-produzierende Krebsarten wie Brust- oder Nierenkrebs, diabetische proliferierende Retinopathie oder abnormales Wachstum großer Kinder mit hohem Serumspiegel an freiem IGF.
Entsprechend stellt die Erfindung auch bereit:
(i) die Verwendung eines Bindungsproteins der Erfindung zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Produktion an freiem IGF durch einen Säuger, zum Beispiel den menschlichen Körper, resultieren, z. B. IGF-produzierende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum großer Individuen, oder
(ii) ein Verfahren zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Produktion an freiem IGF resultieren, z. B. IGh-produzierende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Bindungsproteins der Erfindung an ein Individuum umfaßt, das eine solche Behandlung benötigt, oder
(iii) ein Arzneimittel zur Behandlung physiologischer Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Produktion an freiem IGF resultieren, z. B. IGF-produzierende Krebsarten, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, welches ein Bindungsprotein der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt, oder
(iv) ein Verfahren zur Freisetzung der IGFs an spezifische Organe oder Gewebe, das auf den verschiedenen Bindungseigenschaften von IGFBP-5 beruht, wie durch biologische Testung gezeigt wird.
Fragmente von mutierten Formen von prä-IGF-BP oder IGF-BP, wie in Fig. 1 gezeigt, sind von besonderem Wert bei der Behandlung von physiologischen Erkrankungen, die aus einer übermäßigen Produktion an freiem IGF im menschlichen Körper resultieren.
Ein Bindungsprotein der Erfindung, allein oder in Kombination mit einem IGF, kann mittels jedes für Peptide geeigneten, herkömmlichen Weges verabreicht werden, insbesondere enteral, z. B. in der Form von Tabletten oder Kapseln, bevorzugt parenteral, z. B. subkutan oder intravenös in der Form von Injektionen oder Infusionen. Darüber hinaus kann es auch topisch, z. B. in der Form von Salben oder Suspensionen verwendet werden, wenn es z. B. als Mittel zur Wundheilung verwendet wird.
Für alle vorstehenden Indikationen wird die geeignete Dosierung variieren in Abhängigkeit von z. B. der Natur oder Ernsthaftigkeit der zu belhandelnden Erkrankung und dem Verabreichungsweg. Zum Beispiel können bei der Behandlung von Osteoporose oder Anämie mit täglichen Dosen von etwa 0,1 ug/kg bis 40 ug/kg Körpergewicht, vorzugsweise von etwa 0,5 ug/kg bis etwa 20 ug/kg Körpergewicht eines Bindungsproteins der Erfindung zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden. In größeren Säugern, zum Beispiel Menschen, ist eine angezeigte tägliche Dosis von etwa 5 ug, der Einfachheit halber parenteral verabreicht, zum Beispiel einmal täglich. Für die Wundheilung ist eine tägliche Dosis von 0,1 bis 10 ug eines Proteins der Erfindung pro cm² Wundfläche bei größeren Säugern als geeignet angezeigt, zum Beispiel Menschen. Diese wird der Einfachheit halber einmal täglich verabreicht. Wenn es in Kombination mit einem IGF verwendet wird, ist das molare Verhältnis von Bindungsprotein zu IGF vorzugsweise zwischen 0,1 : 1 und 5 : 1, mehr bevorzugt zwischen 0,5 : 1 und 2 : 1, am meisten bevorzugt 1 : 1.
Arzneimittel der Erfindung können auf herkömmliche Weise hergestellt werden.
Andere Verwendungen für die Bindungsproteine der Erfindung umfassen verschiedene Verwendungen bei der Produktion von IGF-Molekülen mittels rekombinanter Verfahren. Die Bindungsproteine der Erfindung können verwendet werden, um Hefe produziertes IGF in nativer (aktiver) Konformation (im Gegensatz zu inaktivierten Formen) nachzuweisen. Zusätzlich können die Proteine der Erfindung als Träger (möglicherweise in der Form von coexprimierten Proteinen) bei der Produktion von IGF verwendet werden. Da das Bindungsprotein IGF in vivo stabilisiert, wird erwartet, daß es in vitro das selbe tut. Die Bindungsproteine können durch Anheftung an eine feste Oberfläche (wie bei der Affinitätschromatographie) auch verwendet werden, um in Hefe produziertes IGF zu reinigen.
Während die Erfindung mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen, Verfahren, Konstruktionen und Verwendungen beschrieben wurde, wird es für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne das Gebiet der Erfindung zu verlassen.

Beispiel 1

Sepharose-IGF-1-Affinitätssäule

60 mg rekombinantei menschlicher IGF I (Ciba-Geigy AG, Basel, Schweiz) wurden in 20 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, pH-Wert 8,3, das 0,5 M NaCl enthielt, gelöst und gemäß dem Protokoll des Lieferanten (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) an CNBr-aktivierte Sepharose 48 (4 g trockenes Gel) gekoppelt. Das Gel wurde mit 500 ml 0,05 M Natriumphosphatpuffer/0,5 M NaCl, pH-Wert 6,5, in einer 1,5 · 15 cm Glassäule (Gelbettvolumen 15 ml) äquilibriert.

Reinigung von Serum-IGFBPs

Dieses Verfahren wurde gemäß einer Modifikation des Verfahrens von Martin und Baxter (18, 19) durchgeführt. Es sollte beachtet werden, daß die in den Beispielen in Klammern gezeigten Referenzen sich auf die Referenzen beziehen, die nummernweise im Abschnitt Relevante Literatur in dieser Beschreibung aufgelistet sind. Ein Liter altes menschliches Citrat-Plasma wurde mit 50 U (1 ml) Thrombin-Calcium zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, durch ein Käsetuch filtriert und angesäuert. Dissoziierter IGF wurde mit SP-Sephadex C-25 entfernt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und der Niederschlag durch eine 30-minütige Zentrifugation bei 20 000 UpM entfernt. Der Überstand wurde mit 34 ml/min durch die vorstehend beschriebene Sepharose-IGE- 1 -Affinitätssäule gepumpt und die Säule mit 500 ml 0,05 M Natriumphosphatpuffer/0,5 M NaCl, pH-Wert 6,5, gewaschen. Das Bindungsprotein (d. h. IGFBP) wurde mit 40 ml 0,5 M Essigsäure eluiert, dreimal gegen zwei Liter 0,1 M Ammoniumacetat dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Material (40 mg) wurde in 4 ml 0,1 M Heptafluorbuttersäure, die 20% (Vol./Vol.) Acetonitril enthielt, aufgelöst und das unlösliche Material wurde durch eine 10- minütige Zentrifugation bei 10 000 entfernt. Der klare Überstand wurde einer HPLC auf einer Nucleosil Cjg-Säule (Macherey-Nagel, D ren, BRD) (19) unterzogen (2 Läufe mit jeweils 2 ml). Die ausfließenden Fraktionen wurden in einer Speed-Vac (Savant Instruments, Hicksville, NY) getrocknet, in 1 ml 0,01 M Essigsäure aufgenommen und erneut getrocknet. Das resultierende Material wurde für die Liganden-Blot-Analyse (vgl. nachstehend) und die Silberfärbung (20) in 250 ul H&sub2;O gelöst.

¹²&sup5;I-IGF-Liganden-Blot-Analyse

Das Verfahren von Hossenlopp et al. (21) wurde mit leichten Modifikationen verwendet (6, 19). Fünf-pd-Aliquots der aus der HPLC ausfließenden Fraktionen wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese auf 15% SDS-Polyacrylamid- Plattengelen unterzogen. Der ¹&sup4;C-markierte Molekulargewichtsmarker (Rainbow Marker, Amersham, GB) wurde reduziert. Die Gele wurden einem Blotverfahren auf Nitrocellulose- Membranen unterworfen und wie beschrieben (21) weiterverarbeitet. Die Membranen wurden 6 h bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Plastiksack mit 3 · 10&sup6; CpM ¹²&sup5;I-markiertem IGF II inkubiert (22). Nach mehrfachem Waschen wurden die luftgetrockneten Membranen 12-48 h bei -70ºC in einer Kodak X-OMATIC-Kassette (Eastmen, Rochester, NY) einem Röntgenfilm ausgesetzt (Kodak, X-OMAT, AR).
¹²&sup5;I-IGF-II wurde als Markierung für die Durchmusterung genommen, weil nicht alle Banden mit ¹²&sup5;I-IGF-I nachgewiesen werden.

Elektroblotting auf einer Polyvinylidendifluorid (Immobilion)-Membran

10 bis 30 ug von HPLC-gereinigtem IGFBP wurde wie vorstehend beschrieben (Polyacrylamid-Plattengel, 15 · 15 · 0,15 cm) unter reduzierenden Bedingungen einer Elektrophorese und einem Elektoblotting (2 h bei 0,8 A) auf eine Immobilion-Membran (Millipore Corp., Bedford, MA) unterzogen, wie von Matswdaira (23) beschrieben. Die Membran wurde 5 sec mit 0,1% Coomassie-Blau R-250 in 50% Methanol gefärbt, 5 min bei Raumtemperatur in 50% Methanol/10% Essigsäure entfärbt und dann sorgfältig mit H&sub2;O gespült. Die Membran wurde luftgetrocknet, und die Proteinbanden wurden ausgeschnitten und bei -20ºC aufbewahrt.
Die Aminosäureanalyse wurde mittels automatisiertem Edman-Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 470A-Proteinsequenzierungsgeräts (Foster City, CA) (25) durchgeführt.

Gewebe- und RNA-Isolierung

Menschliches Osteosarcom-Gewebe wurde von Dr. Marshall Urist, UCLA, erhalten. Die gesamte RNA wurde unter Verwendung des Guanidinium-Thiocyanat-Verfahrens (27) isoliert. Ein Osterizer wurde zur Homogenisierung des Gewebes verwendet. Poly (A)&spplus; RNA wurde mittels einer einzigen Fraktionierung über Oligo (dT)-CellüLose gereinigt (29).

Oligonucleotidsynthese

Oligonucleotid-Adaptoren, -Sonden und -Sequenzierungs- und PCR-Primer wurden mittels des Phosphoramiditverfahrens mit einem Applied Biosystems (Foster City, CA)- Modell 380A-Synthesegeräts synthetisiert, mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und mit SEP-PAK C&sub1;&sub8;-Kartuschen (Waters; Milford, MA) entsalzt.
Ein 14-mer Oligonucleotid (5' CCTGTAGATCTCCG 3') und ein 18-mer Oligonucleotid (5' AATTCGGAGATCTACAGG 3') wurden synthetisiert und als EcoRl- Adaptoren für die menschliche Osteocarcinom-cDNA-Bank verwendet, die in λZAP konstruiert worden war. Das 14-mer wurde phosphoryliert (30) und dann unmittelbar 15 min auf 95ºC erhitzt, um die Polynucleotidkinase zu inaktivieren. Die Adaptoren enthalten auch eine interne Bgl II-Stelle und werden im folgenden Abschnitt vollständiger beschrieben, der die Konstruktion der cDNA-Bank beschreibt.
Die beiden PCR-Primer für BP5 waren: (I) ein "Sense"-Primer, der aus einem Gemisch von 48 26-meren [5' AGATCTGAATTCGA(CIT)GA(A/G)GCXAT(A/T/C)CA 3'] bestand, und (2) ein "Antisense"-Primer, der aus einem Gemisch von 64 26-meren [5 AGATCTGAATTCGC(T/C)A(G/A)(T/C)TTXGC(T/C)TC 3'] bestand, wobei X für alle 4 Desoxynucleotide steht. Die Eco RI-Stellen wurden in die Primer eingeführt, um eine Subclonierung in M13-Sequenzierungsvektoren zu erlauben. Die BP5-Sonde bestand aus einem 20-mer (5' TCGGAGCAGGGCGGGCAGTG 3') und einem 7-mer Primer (5' CACTGCC 3').

PCR-Amplifikation von BP5-Sequenzen

Die PCR-Reaktionen wurden entsprechend dem Lieferanten des PCR-Kits (Perkin/Elmer/Cetus) unter Verwendung der beschriebenen PCR-Primer (vgl. den Abschnitt Oligonucleotidsynthese) mit einer Endkonzentration von 8 uM durchgeführt. Die MatrizencDNA wurde aus 2,5 ug menschlicher Osteosarcom (Ost2)-poly(A)&spplus;-RNA synthetisiert. Die Bedingungen der cDNA-Synthese waren identisch zu denen; die nachstehend für die Synthese für den ersten cDNA-Strang beschrieben sind (vgl. Konstruktion der cDNA-Bank). Die cDNA wurde auf Biogel A-15 m fraktioniert, durch Ethanolausfällung gewonnen und in 100 ul sterilem Wasser resuspendiert. Zwischen 2,5 bis 5 ul an cDNA-Matrize wurden für jede PCR- Reaktion verwendet. 35 PCR-Zyklen wurden in einem Perkin/Elmer/Cetus DNA-Thermal- Cycler durchgeführt. Die ersten 10 Zyklen bestanden aus einem Denaturierungsschritt von I min bei 94ºC; einem Anlagerungsschritt von 1 min bei 40ºC; und einem Verlängerungsschritt von 1 min bei 40ºC. Die nächsten 25 Zyklen bestanden aus einem Denaturierungsschritt von 1 min bei 94ºC; einem Anlagerungsschritt von 1 min bei 55ºC; und einem Verlängerungsschritt von 1 min bei 72ºC. Der letzte Verlängerungsschritt beim letzten Zyklus war 7 min. Die Proben wurden einmal mit Phenol/Chloroform/IAA (1 : 1 : 0,04), einmal mit Chloroform/IAA (24 : 1) extrahiert, durch Ethanolausfällung gewonnen, mit EcoRI verdaut und mittels Elektrophorese auf einem 7% Acrylarnid, 1 · TBE-Gel (30) fraktioniert. Die DNA, die mit 40- 70 bp wanderte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, über eine Elutip-d-Säule gereinigt, mit Eco-RI-geschnittenem M13mp18 ligiert und zur DNA-Sequenzierung in DH5αF' eingebracht.

Konstruktion der cDNA-Bank

Erststrang-cDNA wurde aus menschlicher Osteosarcom (Ost3)-poly(A)&spplus;-RNA synthetisiert, wie beschrieben (33), aber mit den folgenden Modifikationen: 10 ug poly(A)&spplus;- RNA wurden in 20 ul 5 mIvl Tris-Salzsäure (pH-Wert 7,5) 3 min auf 65ºC erhitzt, unmittelbar danach 1 min auf Eis gestellt und dann (bei Raumtemperatur) so eingestellt, daß 50 mM Tris- Salzsäure (pH-Wert 8,3 bei 42ºC), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 10 mM Dithiothreit, je 2 mM dATP, dGTP, dTTP und [α-³²P] dCTP (300 CpM/pMol), 60 U RNasin und 2,5 ug Oligo (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; enthalten waren. 60 U clonierte reverse Transkriptase vom Moloney-Leukämievirus der Maus wurden zugegeben, um die cDNA-Synthese zu initiieren (gesamtes Reaktionsvolumen 40 l), und die Reaktion wurde bei 42ºC 60 min fortgesetzt. Der zweite cDNA-Strang wurde synthetisiert und mit den EcoRl-Adaptoren ligiert (vgl. Abschnitt Oligonucleotidsynthese), wie beschrieben (34). Die dscDNA wurde phosphoryliert (30) und dann auf 0,5 M NaCl/25 mM EDTA eingestellt und 15 min auf 75ºC erhitzt, um die Polynucleotidkinase zu inaktivieren. Die dscDNA wurde mittels Chromatographie auf Biogel A-15m von nicht ligierten Adaptoren getrennt und durch Ethanolausfällung gewonnen. Die dscDNA wurde mit EcoR1-geschnittenem λZAP (Stratagene) ligiert, wie vom Lieferanten beschrieben, aber unter Einschluß von 15% Polyethylenglycol (PEG) 8000 (Sigma) in das Reaktionsmedium, einer zuvor beschriebenen Modifikation (35). Die ligierte DNA wurde mittels Zentrifugation (12000 · g) gewonnen, mit Chloroform gewaschen, getrocknet, in 4 ul H&sub2;O resuspendiert und mit einem in vitro-Verpackungsextrakt (Stratagene) gemäß dem Lieferanten inkubiert. Eine Bank mit 2,3 · 10&sup7; unabhängigen, rekombinanten Clonen wurde erhalten. Rekombinante Phagen wurden in E. coli BB4 (Stratagene) vermehrt.

Durchmusterung der cDNA-Bank

Ungefähr 300 000 rekombinante Phagen von der Ost3-cDNA-Bank wurden in E. coli BB4 ausplattiert (50 000 Phagen/Platte mit 137 mm Durchmesser) und 5-6 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen. Die Phagen wurden auf Nitrocellulosefilter (Millipore, HATF 137) übertragen, verarbeitet (36) und mit den BP4- und BP5-Sonden durchmustert. Die BP4-Sonde wurde mit T4-Polynucleotidkinase und [γ³²P) ATP (28) mit einer spezifischen Aktivität von 1- 2 · 108 CpM/ug markiert. Die BP5-Sonde wurde gemäß Feinberg und Vogelstein (42) markiert. Die Filter wurden 1-2 h bei 37ºC in 5 · SSC (1 SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7), 40% Formamid, 5 · Denhardt's Lösung (1 · Denhardt's Lösung = 0,02% Polyvinylpyrrolidonlo,02% Ficoll/0,02% Rinderserumalbumin), 10% Dextransulfat, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, 1 mlvi Natriumpyrophosphat, 0,1% NaDodSO&sub4; und 50 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA prä-hybridisiert. Die markierte Sonde wurde mit einer Konzentration von 106 CpM/ml zugegeben, und die Hybridisierung wurde bei 37ºC über Nacht unter leichtem Schütteln fortgesetzt. Die Filter wurden mit 2 · SSC/0,1% NaDodSO&sub4; bei 65ºC gewaschen und Kodak XAR-2-Filmen mit einem DuPont Lighting Plus- Verstärkerschirm über Nacht bei -80ºC ausgesetzt. Flächen mit Plaques, die ein doppeltes Signal gaben, wurden gesammelt, wieder ausplattiert und wieder durchmustert, bis reine Plaques erhalten wurden.

Plasmid-Isolierung, Subclonierung und Sequenzierung

Bluescript SK(-)-enthaltende BP5-cDNA-Insertionen wurden von λZAP mittels des M13 Gewinnungs-/Auschneideprotokolls freigesetzt, das vom Lieferanten (Stratagene) beschrieben wird. Plasmid-DNA wurde mittels des alkalischen Lyse-Verfahrens (30) isoliert. Die Insertionen wurden aus dem Bluescript SK(-)-Vektor mittels Bgl II-Verdau ausgeschnitten und durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Insertionen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und 12 h unter leichtem Schütteln in 10 mM Tris-Salzsäure pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA (TE) passiv eluiert, mittels Elutip-D gereinigt, wie vom Lieferanten (Schleicher und Schuell) beschrieben und in einen M13-Sequenzierungsvektor subcloniert (37). Die DNA- Sequenzierung wurde mittels des Didesoxy-Kettenbeendigungsverfahrens (38) unter Verwendung von M13-Primern ebenso wie spezifischen internen Primern durchgeführt.
Zweideutige Bereiche wurden unter Verwendung von 7-Desaza-2-desoxyguanidintriphosphat (39) und Sequanase (US Biochemicals) aufgelöst.

Hinterlegung der genetischen Information

Die in Fig. 1 dargestellten genetischen Sequenzen sind hinterlegt bei der American Type Culture Collection, wo sie wie folgt identifiziert sind:

Claims

1. Rekombinantes menschliches Proteinpräparat, umfassend ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in den Positionen 1 bis 258, inklusive, von Fig. 1 oder 22 bis 258, inklusive, von Fig. 1 gezeigt ist, oder eine Variante davon mit dem Ersatz einer einzigen Aminosäure, wobei das Proteinpräparat in einer nichtmenschlichen Zelle produziert wird, so daß das Proteinpräparat frei ist von Verunreinigungen anderer menschlicher Proteine, und wobei das Polypeptid einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor binden kann.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das rekombinante Proteinpräparat nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Zusammensetzung ferner einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) umfasst.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der IGF IGF-1 ist.

5. Rekombinantes menschliches Proteinpräparat nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als Medikament.

6. Verwendung eines rekombinanten menschlichen Proteinpräparates nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung physiologischer Störungen in einem Säugerindividuum, die von einer übermäßigen Produktion von freiem insulinähnlichem Wachstumsfaktor in dem Individuum herrühren.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 3 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Wachstums eines Säugerinindividuums, zur Gewebe- und oder zur Organregeneration in einem Säugerindividuum oder zur Wundheilung in einem Säugerindividuum.