EP1042476A1 - Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung - Google Patents

Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung

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Publication number
EP1042476A1
EP1042476A1 EP98965865A EP98965865A EP1042476A1 EP 1042476 A1 EP1042476 A1 EP 1042476A1 EP 98965865 A EP98965865 A EP 98965865A EP 98965865 A EP98965865 A EP 98965865A EP 1042476 A1 EP1042476 A1 EP 1042476A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptides
acid sequence
amino acid
peptide
igfbp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98965865A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf-Georg Forssmann
Ludger STÄNDKER
Maik Obendorf
Lothar Kling
Hans-Georg Opitz
Hossein Mostafavi
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Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1042476A1 publication Critical patent/EP1042476A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Insulin-like growth factor binding protein fragments and their use
  • the present invention relates to peptides with cell proliferative and cell protective properties, complexes of the peptides with human insulin-like growth factor I and II (IGF) and the associated nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and inhibitors.
  • IGF insulin-like growth factor I and II
  • Insulin-like growth factor binding proteins are described, inter alia, by Shimasaki, S. and Ling, N. in Prog. Growth Factor Res. 3 (1991) 243-266 and Zapf, J. in Eur. J. Endocrinol. 132 (1995) 645-654.
  • the present invention relates to peptides whose amino acid sequence corresponds in part to the amino acid sequence of insulin-like growth factor binding proteins, and to cyclic, glycosylated, phosphorylated, acetylated, acidated and / or sulfated derivatives thereof. These peptides according to the invention are referred to as IGFBP or IBP.
  • Preferred peptides are those that occur naturally and can be isolated, for example, from hemofiltrate.
  • the peptides preferably have a length of 61 to 115 amino acids.
  • Peptides which have sequences which correspond to N- or C-terminal sequences of insulin-like growth factor binding proteins are particularly preferred.
  • Preferred peptides are peptides with the amino acid sequence of the formula
  • R NH 2 , an amino acid or a peptide with an amino acid sequence comprising up to 41 amino acids
  • X a peptide with an amino acid sequence comprising 24 to 31 amino acids
  • X represents a peptide with an amino acid sequence comprising 9 amino acids
  • X 3 represents a peptide with an amino acid sequence comprising 10 amino acids
  • X 4 represents a peptide with an amino acid sequence comprising 18 to 24 amino acids
  • the peptide has cell proliferative and cell protective properties.
  • the peptides according to the invention can have disulfide bridges, so that they have the general formula
  • the peptides have a glycine at one or more of the following positions in the amino acid sequence.
  • X ] at position 8 is L or V and / or X, at position 11 is L or I and / or X 2 at position 1 D or.
  • N is and / or X 2 at position 9 is K or R and / or X 3 at position 3 is S or A and / or at position 8 is R or A.
  • R is selected from
  • APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP SEQ ID NO: 1
  • GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP SEQ ID NO: 2
  • GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP SEQ ID NO: 3
  • NKNGFYHSR SEQ ID NO 14
  • DHRGFYRKR (SEQ ID NO 19) and / or
  • RSSQGQRRGP (SEQ ID NO 25) and / or
  • YP NGKRIPGSPEIRGDPN (SEQ ID NO 26), NPNTGKLIQGAPTIRGDPE (SEQ ID NO 27), DKYGQPLPGYTTKGKEDVH (SEQ ID NO 28), DRKTGVKLPGGLEPKGELD (SEQ ID NO 29), DKYYGMGGGLGQD and or
  • R 2 selected from
  • Preferred peptides have the following sequences IGFBP-1
  • the peptides according to the invention can be obtained by purification from human blood filtrate or urine, by solid phase peptide synthesis or by expression in recombinant microorganisms.
  • the invention furthermore relates to the complexes of the peptides according to the invention with human insulin-like growth factor-I and / or human insulin-like growth factor-II and their physiologically active fragments and / or derivatives, in particular amidated, acetylated, sulfated, phosphorylated and / or glycosylated derivatives.
  • the invention furthermore relates to nucleic acids which code for the peptides according to the invention, antisense nucleotides which bind under stringent conditions to a nucleic acid which codes for the peptide according to the invention, antibodies which bind to the peptides according to the invention, inhibitors which inhibit the biological activity of the insulin -like growth factor binding proteins, inhibitors that inhibit the expression of insulin-like growth factor binding proteins.
  • the peptides, complexes, nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and inhibitors according to the invention are particularly suitable for the manufacture of a medicament for the treatment of over- or under-expression of insulin-like growth factor binding proteins, for the treatment of muscle loss, osteoporosis, diabetes, amyloidal lateral sclerosis, peripheral - Central and central neuropathies, inflammatory processes, disturbed inflammatory reactions, tumor disorders, inflammatory and neoplastic diseases, growth disorders, musculoskeletal disorders, diseases of the bone apparatus and / or for wound and bone healing.
  • IGFBP IGF-I or IGF-II are particularly suitable for the treatment of bone diseases.
  • the peptides according to the invention and the complexes of the peptides with insulin-like growth factor have a cell proliferative activity.
  • the peptides according to the invention regulate the release of IGF-I and IGF-II from the complexes at their site of action.
  • the co-administration of the peptides according to the invention with IGF-I or IGF-II extends the biological half-life and thus the availability of the latter.
  • the hypoglycemia induced by injection of free IGF-I or IGF-II is prevented by the co-administration of the peptides according to the invention.
  • the peptides according to the invention furthermore have a growth-promoting effect on bone cells and lead to an enhancement or modulation of the action of growth hormones.
  • the peptides, complexes, nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and inhibitors according to the invention are contained in a pharmaceutical in a pharmaceutical dosage form. They are suitable for oral, intravenous, intramuscular, intracutaneous, intrathecal use or as an aerosol for transpulmonary application.
  • the amount of peptide to be administered is 1 ⁇ g to 1 g per administration unit per day.
  • nucleic acids and / or antisense nucleotides according to the invention are also suitable for the manufacture of a medicament for the treatment of somatic or non-somatic genetic diseases.
  • the diagnostic agent according to the invention contains the peptides, complexes, nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and / or inhibitors according to the invention.
  • the diagnostic agent preferably contains poly- or monoclonal antibodies to the peptide according to the invention, it being possible for the antibodies to be labeled with fluorescence or radioactive in order to be able to be used in the known ELISA or RIA.
  • the diagnostic agent can also contain nucleic acids, which are used in modified or labeled form in tests known to those skilled in the art, such as PCR or finger printing.
  • the diagnostic agents according to the invention are particularly suitable for the diagnosis of functional disorders of the bones, the muscles, the nervous system, the lymph organs, the gastric Intestinal tract, immune system, diabetes, inflammatory and neoplastic processes as well as a marker for cancer.
  • the simultaneous appearance of several fragments of BP-4 or BP-5 in the plasma, in particular the N- and C-termmal domains, is suitable as a marker for diseases of the bone metabolism.
  • the corresponding peptides can either be detected by mass spectroscopy or, preferably by an immune reaction with the corresponding antibodies.
  • FIG. 1 shows an alignment of the consensus sequences of C-terminal fragments of the insulin-like growth factor proteins.
  • FIG. 2 shows the schematic structure of the insulin-like growth factor proteins with the cysteine-rich N- and C-terminal domains.
  • FIG. 3 shows the schematic structure of the insulin-like growth factor proteins and the sequence of the biologically active fragments isolated from hemofiltrate.
  • FIG. 4 shows the isolation of the osteoanabolic factor IGFBP-4-11 from human hemofiltrate (see example 3).
  • Figure 5 shows the sequence and sulfur bridge analysis of the osteoanabolic factor IGFBP-4- 11.
  • the cysteines 153-183, 194-205 and 207-228 are bridged.
  • Figure 6 shows the biological effect of the osteoanabolic factor IGFBP-4-11. After incubation of serum-free primary rat osteoblasts for (A) 24 hours, (B) 48 hours and (C) 72 hours with IGFBP-4-11, the proliferation-promoting effect of IGFBP-4-11 can be seen. An increase in the rate of DNA synthesis is found in a dose-dependent manner, measured as the incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU).
  • Figure 7 shows the specific binding to osteoblasts and the possible receptor for the osteoanabolic factor IGFBP-4-11 (designated as IGFBP-4 136 "237 ).
  • A Radioactively labeled IGFBP-4-11 shows an unlabelled by increasing amounts IGFBP-4-11 displaceable specific binding to primary osteoblast cells
  • B Radioactively labeled IGFBP-4-11 could, after binding to osteoblasts, be chemically cross-linked with its putative receptor molecule and then by gel electrophoresis and subsequent authorization. diography can be demonstrated.
  • the ligand-receptor complex has a molecular weight of approximately 120 kDa. The formation of the complex is promoted by saponin, a membrane pore former. The complex formation is prevented by adding an excess of unlabelled IGFBP-4-11 to the incubation batch.
  • the peptides according to the invention can be obtained from a human hemofiltrate by a purification process.
  • This patented process (Forssmann, W.-G. (1988), publication DE 36 33 707 AI), which was developed for the extraction of proteins from hemofiltrate, was also used in a modified form to purify the peptide complex.
  • H. hemofiltrate accumulates in large quantities in the ultrafiltration of the blood of kidney patients. 800 to 1,000 1 hemofiltrate are adjusted to a pH of 2.1 with HCl and diluted with water to a conductivity of 5.5 mS / cm and applied to a strong cation exchanger at a flow rate of 3 1 / min.
  • Buffer A Hemofiltrate pH 2.1, conductivity 5.5 mS / cm
  • Buffer B 0.5 M ammonium acetate
  • ammonium acetate eluates of the batch extraction are combined in amounts of 5,000 to 10,000 1 hemofiltrate peptide.
  • the peptide extract is applied to the preparative cation exchanger with the addition of demineralized water with a conductivity of 5.5 mS / cm.
  • the column is rinsed with 0.01 M HCl until the conductivity is below 1 mS / cm.
  • the elution is carried out in several stages using the buffers specified below
  • Eluates 1-7 are referred to as pH pool I-VII. They are collected separately and then rinsed with demineralized water. The elution takes place until a new baseline is reached. never, with elution volumes of 10 to 25 1 being achieved for the individual pH pools I to VII.
  • the individual pH pools are separated for fractionation and simultaneous desalination using a reverse phase chromatography
  • Pillar FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
  • Buffer B 80% acetonitrile in 10 mM HCl
  • the column is rinsed with buffer A. Fractions of 200 ml are collected during the elution. Aliquots of the fractions are tested in the bioassay. The fractions are freeze-dried and stored at -20EC.
  • the bioactive fractions 11 and 12 from pH pool V in the assay were separated using a semi-preparative reverse-phase column. Fractions 21 to 25 contained the substance according to the invention.
  • Buffer B 0.1% TFA, 80% acetonitrile
  • Buffer A 0.1% TFA, 20% methanol
  • Buffer B 0.1% TFA, 100% methanol
  • Buffer A 20 mM sodium phosphate, pH 3.0
  • Buffer B 20 mM sodium phosphate, pH 3.0, 1.5 M NaCl
  • Fraction 56 contained the substance according to the invention.
  • Buffer B 0.1% TFA, 80% acetonitrile
  • the bioactive fraction 56 from the previous separation step was further purified on an analytical reverse phase column.
  • Filling material YMC RP-C18, 5 ⁇ m, 300 ⁇
  • Buffer B 0.1% TFA, 80% acetonitrile
  • bioactive fraction 45 from the previous separation step was subjected directly to the mass and sequence analysis. Another portion was reduced and alkylated (as described in Example 2) and then further purified on an analytical reverse phase column.
  • Filling material Zorbax RP-C3, 5 ⁇ m, 300 ⁇ analytics is used, clearly.
  • IGF-II 7471 Da; IGFBP-2, 12,681 Da; IGFBP-2, 12 865 Da
  • Cysteines can be detected in peptide sequencing after prior chemical derivatization, for example after reduction with ß-mercaptoethanol and carboxamidomethylation with iodoacetamide. After derivatization, desalting is preferably followed by analytical reverse phase chromatography with a Vydac RP-C18 column (4.6 mm x 25 cm). Some of the peptides modified in this way are fed to the sequence analysis, with the other part the mass determinations give a corresponding molecular weight. From the mass difference to the native peptide, it is concluded that the peptides from hemofiltrate contain six cysteines, which are also connected to one another with three disulfide bridges.
  • IGFBP-2-13 MW 12681
  • IGFBP-2-13 MW 12865
  • the peptide sequences are 100% identical to the amino acids of human IGFBP-2 derived from the cDNA or to the amino acid sequence of IGF-II.
  • IGFBP-2 has so far been described as a 34 kD binding protein, the complete sequence analysis of which was carried out by analysis of the associated cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), pages 2497 to 2502).
  • IGF-II and IGF-I which also binds to IGFBP-2, have been extensively described in their structure at the protein and DNA sequence level (as a review: Rechler, MM, & Nissley, SP (1990) insulin-like growth factors In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, MB, Roberts, AB eds.), pages 263 to 367, Springer-Verlag, Berlin).
  • the IGF / IGFBP-2-13 was isolated on the basis of its biological activity in a survival assay of the PC-12 (pheochromocytoma cells) cell line. For this purpose, aliquots of the individual chromatography steps described in Example 1 were freeze-dried and then fed to the biological assay. The fractions, which each gave a positive signal, were subjected to further purification.
  • the assay measures cell survival after being serum-free by determining mitochondrial enzyme activity 24 hours after serum deprivation.
  • Nerve growth factor (NGF) or fetal calf serum (FCS) is used as a positive control in this assay.
  • 10,000 PC-12 cells per hole are sown in 96-well plates in serum-free medium. Aliquots (approx. 100 ml equivalent of the starting material) are added to the wells. 20 hours later, the survival rate of the cells is measured using a Wst-1 substrate. This substrate is converted by mitochondrial enzymes. The resulting dye intensity is measured at 405 nm in an ELISA reader, the reference wavelength is over 600 nm.
  • the IGF / IGFBP-2-13 complex has a dose-dependent, survival-promoting effect on PC-12 cells. These cells correspond to neuronal progenitor cells, so that it can be assumed that IGF / IGFBP-2-13 is a neuroprotective factor.
  • the bioactive fraction 33 from pH pool IV in the assay was separated on an analytical reverse phase column. Fraction 34 contained the substance according to the invention.
  • Buffer B 0.1% TFA, 80% acetonitrile
  • Mass determinations The mass determinations were carried out on an electrospray mass spectrometer. The molecular weight of the peptide was as
  • the C-terminus was determined by comparing the measured molecular mass with the mass calculated from the sequence. The agreement of these masses lies in the measuring accuracy of the electrospray mass spectrometer of 0.1% of the total mass.
  • the peptide sequence is 100% identical to the amino acids of human IGFBP-4 derived from the cDNA.
  • the sulfur bridge linkage was analyzed by cleaving the native peptide IGFBP-4-11 in parallel in two different batches with the endoproteases chymotrypsin and Arg-C. The cleavage fragments obtained were then separated from one another by means of analytical reverse phase chromatography and subjected to the molecular mass and sequence analysis. The following fragments, each containing two cysteines and a sulfur bridge, were obtained: HPKQCHPALDGQRGKCW, MW 1960
  • the IGFBP-4-11 was isolated on the basis of its biological activity in a proliferation assay with primary bone cells (osteoblasts), which are initially isolated from the skullcap of rat embryos
  • TGF-beta Transforming growth factor-beta
  • FCS fetal calf serum
  • the proliferation rate (DNA synthesis rate) of the cells is measured by adding and incorporating radioactive thymidine.
  • the peptide IGFBP-4-11 has a proliferation-promoting effect on these primary osteoblasts. These cells correspond to typical bone cells, so it can be assumed that IGFBP-4-11 is an osteoanabolic factor.
  • the theoretical mass is 12.5 kD, so it can be assumed that the peptide is glycosylated on serine or theronine.

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Abstract

Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like growth factor binding protein entspricht sowie cyclische, glycosylierte, phosphorylierten, acetylierten, amidierten und/oder sulfatierten Derivate.

Description

Insulin-like Growth Factor Binding Protein Fragmente und ihre Verwendung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften, Komplexe der Peptide mit humanem Insulin-like growth factor I und II (IGF) sowie die damit in Verbindung stehenden Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren.
Insulin-like Growth Factor Binding Proteine sind unter anderem von Shimasaki, S. und Ling, N. in Prog. Growth Factor Res. 3 (1991) 243-266 und Zapf, J. in Eur. J. Endocrinol. 132 (1995) 645-654 beschrieben worden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide, deren Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen entspricht sowie cy- clische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, a idierte und/oder sulfatierte Derivate davon. Diese erfindungsgemäßen Peptide werden als IGFBP oder IBP bezeichnet.
Bevorzugte Peptide sind solche, die natürlicherweise vorkommen und beispielsweise aus Hämo- filtrat isoliert werden können. Vorzugsweise weisen die Peptide eine Länge von 61 bis 115 Aminosäuren auf. Besonders bevorzugt sind Peptide, die Sequenzen aufweisen, die N- oder C- terminalen Sequenzen von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen entsprechen.
Bevorzugte Peptide sind Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
RrC-X,-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
worin
R, NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IGFBP.
Das Peptid weist zellproliferative und zellprotektive Eigenschaften auf.
Die erfindungsgemäßen Peptide können Disulfidbrücken aufweisen, so daß sie der allgemeinen Formel
RrC-XrPNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide an einer oder mehrerer der folgenden Positionen der Aminosäuresequenz ein Glycin auf. X2 an Position 4, X3 an Position 9, X4 an Position 4 oder 5 und/oder X4 an Position 9 oder 10.
Es ist weiter bevorzugt, daß X] an der Position 8 L oder V ist und/oder X, an der Position 11 L oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder. N ist und/oder X2 .an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform wird R, ausgewählt aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP (SEQ ID NO: 1), GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP (SEQ ID NO: 2), GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP (SEQ ID NO: 3) , GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP (SEQ ID NO : 4), KVNGAPREDARPVPQGS (SEQ ID NO: 5) ,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP (SEQ ID NO : 6), PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP (SEQ ID NO: 7) und/oder
X, ausgewählt aus
RIELYRWESLAKAQETSGEEISKFYL (SEQ ID NO: 8), QQELDQVLERIST RLPDERGPLEHLYSLHI (SEQ ID NO : 9), RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI (SEQ ID NO : 10) , QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI (SEQ ID NO: 11), RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL (SEQ ID NO: 12), RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV (SEQ ID NO: 13) und/oder
X2 ausgewählt aus
NKNGFYHSR (SEQ ID NO 14 )
DKHGLYNLK (SEQ ID NO 15 )
DKKGFYKKK (SEQ ID NO 16 )
DRNGNFHPK (SEQ ID NO 17 )
DRKGFYKRK (SEQ ID NO 18 )
DHRGFYRKR (SEQ ID NO 19 ) und/oder
X3 ausgewählt aus
ETS DGEAGL (SEQ ID NO 20) ,
KMSLNGQRGE (SEQ ID NO 21) ,
RPSKGRKRGF (SEQ ID NO 22) ,
HPALDGQRGK (SEQ ID NO 23) ,
KPSRGRKRGI (SEQ ID NO 24) ,
RSSQGQRRGP (SEQ ID NO 25) und/oder
x4 ausgewählt aus
YP NGKRIPGSPEIRGDPN (SEQ ID NO 26 ) , NPNTGKLIQGAPTIRGDPE (SEQ ID NO 27 ) , DKYGQPLPGYTTKGKEDVH (SEQ ID NO 28 ) , DRKTGVKLPGGLEPKGELD (SEQ ID NO 29) , DKYGMKLPGMEYVDGDFQ (SEQ ID NO: 30 ) , DRMGKSLPGSPDGNGSSS (SEQ ID NO: 31 ) und/oder
R2 ausgewählt aus
QIYFNVQN (SEQ ID NO: 32), HLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 33; HLFYNEQQE (SEQ ID NO: 34), YSMQSK (SEQ ID NO: 35), HQLADSFRE (SEQ ID NO: 36), HTFDSSNVE (SEQ ID NO: 37), PTGSSG (SEQ ID NO: 38) .
Bevorzugte Peptide weisen folgende Sequenzen auf IGFBP-1
APSEEDHSIL DAISTYDGSKALHVTNIKKWKEPCRIELYRWESLAKAQETSGEEISKFYLP NCNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLCWCWPWNGKRIPGSPEIRGDPNCQIYFNVQN (SEQ ID NO: 39)
IGFBP-2
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHG LYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 40)
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHG LYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 45)
IGFBP-3
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK (SEQ ID NO: 41)
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFC CVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK (SEQ ID NO: 46)
HPLHSKIIIIKKGHAKDSQRY (SEQ ID NO: 47)
IGFBP-4
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGLRCYPPR GVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIR DRSTSGGKM (SEQ ID NO: 48)
KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPAL DGQRGKC CVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE (SEQ ID NO: 42)
IGFBP-5
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRK GFYKRKQCKPSRGRKRGIC CVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE (SEQ ID NO: 43)
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRK GFYKRKQCKPSRGRKRGIC CVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE (SEQ ID NO: 49)
HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS (SEQ ID NO: 50)
IGFBP-6
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGPCRRHLDSVLQQLQTEVYRGAQT LYVPNCDHRGFYRKRQCRSSQGQRRGPCWCVDRMGKSLPGSPDGNGSSSCPTGSSG (SEQ ID NO: 44) Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptidsynthese oder durch Expression in rekombinanten Mikroorganismen erhalten.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Komplexe der erfindungsgemäßen Peptide mit humanem Insulin-like growth factor-I und/oder humanem Insulin-like growth factor-II sowie dessen physiologisch aktiven Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierte, acety- lierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.
Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, Antisensenucleotide, die unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure binden, die für das erfindungsgemäße Peptid kodiert, Antikörper, die an die erfindungsgemäßen Peptide binden, Inhibitoren, die die biologische Aktivität der Insulin-like Growth Factor Binding Proteine hemmen, Inhibitoren, die die Expression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen hemmen.
Die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren eignen sich insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Über- oder Unterexpression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteine, zur Behandlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, periphe- ren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsre-aktionen, TumorerJ ankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.
Insbesondere Komplexe von IGFBP mit IGF-I oder IGF-II eignen sich zur Behandlung von Knochenerkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Peptide und die Komplexe der Peptide mit Insulin-like growth factor weisen eine zellproliferative Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Peptide regulieren die Freisetzung des IGF-I und IGF-Il aus den Komplexen an ihrem Wirkort. Die Coadministration der erfmdungsgemäßen Peptide mit IGF-I oder IGF-II verlängert die biologische Halbwertzeit und damit die Verfügbarkeit der letztgenannten. Die durch Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte Hypoglykämie wird durch die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide verhindert.
Die erfindungsgemäßen Peptide haben desweiteren eine wachstumsfördernde Wirkung auf Knochenzellen und führen zu einer Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstumshormonen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren in einer pharmazeutisch üblichen Darreichungsform in einem Arzneimittel enthalten. Sie eignen sich zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmo- nalen Applikation. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 μg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag.
Die erfindungsgem.äßen Nucleinsäuren und/oder Antisensenucleotide eignen sich auch zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörpern und/oder Inhibitoren.
Bevorzugterweise enthält das Diagnostikmittel poly- oder monoklonale Antiköφer gegen das erfindungsgem.äße Peptid, wobei die Antiköφer fluoreszenz- oder radioaktiv-markiert sein können, um in den bekannten ELISA oder RIA eingesetzt werden zu können. Jedoch kann das Diagnostikmittel auch Nucleinsäuren enthalten, die in modifizierter oder markierter Form in dem Fachmann bekannten Tests wie PCR oder Finger-Printing zum Einsatz kommen.
Die erfindungsgemäßen Diagnostikmittel eignen sich insbesondere zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
Insbesondere das gleichzeitige Auftreten mehrerer Fragmente von BP-4 oder BP-5 im Plasma, insbesondere der N- und C-termmalen Domänen eignet sich als Marker für Erkrankungen des Knochenstoffwechsels. Die entsprechenden Peptide können entweder massenspektroskopisch nachgewiesen oder, bevorzugt durch Immunreaktion mit entsprechenden Antiköφer.
Figur 1 zeigt ein Alignment der Konsensussequenzen von C-terminalen Fragmenten der Insulin- like Growth Factor Proteine.
Figur 2 zeigt die schematische Struktur der Insulin-like Growth Factor Proteine mit den cystein- reichen N- und C-terminalen Domänen.
Figur 3 zeigt die schematische Struktur der Insulin-like Growth Factor Proteine sowie die Sequenz der aus Hämofiltrat isolierten biologisch aktiven Fragmente.
Figur 4 zeigt die Isolierung des osteoanabolen Faktors IGFBP-4-11 aus humanem Hämofiltrat (siehe Beispiel 3).
Figur 5 zeigt die Sequenz- und Schwefelbrückenanalyse des osteoanabolen Faktors IGFBP-4- 11. Die Cysteine 153-183, 194-205 und 207-228 sind verbrückt.
Figur 6 zeigt die biologische Wirkung des osteoanabolen Faktors IGFBP-4-11. Nach einer Inkubation von serumfrei gehaltenen primären Rattenosteoblasten für (A) 24 Stunden, (B) 48 Stunden und (C) 72 Stunden mit IGFBP-4-11 zeigt sich die proliferationsfordernde Wirkung des IGFBP-4-11. In dosisabhängiger Weise wird ein Anstieg der DNA-Syntheserate gefunden, gemessen als Einbau von Bromodesoxyuridin (BrdU).
Figur 7 zeigt die spezifische Bindung an Osteoblasten und den möglichen Rezeptor für den osteoanabolen Faktor IGFBP-4-11 (als IGFBP-4136"237 bezeichnet). A: Radioaktiv markiertes IGFBP-4-11 zeigt eine durch steigende Mengen an nicht-markiertem IGFBP-4-11 verdrängbare spezifische Bindung an primäre Osteoblastenzellen. B: Radioaktiv markiertes IGFBP-4-11 konnte, nachdem es an Osteo-blasten gebunden hat, chemisch mit seinem putativen Rezeptormolekül vernetzt werden und anschließend durch Gelelektrophorese und nachfolgende Autora- diographie nachgewiesen werden. Der Ligand-Rezeptor-Komplex hat ein Molekulargewicht von etwa 120 kDa. Die Bildung des Komplexes wird begünstigt durch Saponin, einen Membranporenbildner. Die Komplexbildung wird verhindert durch Zusatz eines Überschusses an nicht- markiertem IGFBP-4-11 zum Inkubationsansatz.
Die Aufreinigung des erfmdungsgemäßen Peptids bzw. seine Komplexes wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Aufreinigung und peptidchemische Analyse des IGFBP-2-13
Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch ein Reinigungsverfahren ausgehend vom humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses patentierte Verfahren (Forssmann, W.-G. (1988), Offenlegungs- schrift DE 36 33 707 AI), welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat entwickelt wurde, wurde in modifizierter Form auch zur Aufreinigung des Peptidkomplexes eingesetzt.
Hämofiltrat-Batch-Extraktion
H.ämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an. 800 bis 1.000 1 Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH- Wert von 2,1 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 1/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Wirten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Fluß: 3 1/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,1, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftragung der insgesamt 1.000 1 Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH- Wert (6,8 bis 7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 1 Eluat erreicht.
Erste präparative Auftrennung
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000 bis 10.000 1 Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2,1 wird das Peptidextrakt unter Zumi- schung von VE- Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Fluß: bis zu 3 1/min während des Auftrages,
0,5 bis 1 1 während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem,
(PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE- Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basisli- nie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 1 erreicht werden.
Zweite präparative Auftrennung:
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reverse Phase Chromatographie getrennt
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 μm 10 x 12,5 cm (FineLine 100)
Fluß : 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: lO mM HCl
Puffer B : 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0 bis 60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20EC gelagert.
Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die im Assay bioaktiven Fraktionen 11 und 12 aus pH-Pool V wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 21 bis 25 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm x 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C 18 15-20 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 42 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: ä 1,5 min ab Start des Gradienten
Semipräparative Reverse-Phase Cl 8-Chromatographie: Die bioaktiven Fraktionen 21 bis 25 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über die gleiche semipräparative Reverse Phase Säule aufgetrennt. Als Laufmittel wurde jedoch Methanol verwendet. Die Fraktion 24 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm x 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 μm, 300 Ä
Puffer A: 0, 1 % TFA, 20% Methanol
Puffer B : 0, 1 % TFA, 100% Methanol
Gradient: 0 bis 20% B in 6,5 min, 20 bis 80% B in 55 min,
80 bis 100% B in 13 min
Fluß: 30 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: ä 1,5 min ab Start des Gradienten
Kationenaustauschchromatographie:
Die bioaktiven Fraktionen 19 und 20 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Kationenaustauscher-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 45 bis 47 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 1 cm x 5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Pepkat, Biotek 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0
Puffer B : 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0, 1 ,5 M NaCl
Gradient: 0 bis 50% B in 50 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 3 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad Sprint
Fraktionen: a 1,5 min ab Start des Gradienten
Analytische Reverse-Phase Chromatographie:
Die bioaktiven Fraktionen 45 bis 47 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden sukzessive in mehreren identischen Läufen über eine Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 56 enthielt die erfmdungsgem.äße Substanz.
Chromato graphiebedingungen:
Säule: 1 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C 18 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: ä 1 min ab Start des Gradienten Zweite Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die bioaktive Fraktion 56 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC RP-C18, 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 15 bis 50% B in 75 min, 75 bis 100% B in 10 min
Fluß: 0J ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Dritte Analytische Reverse-Phase C3-Chromatographie:
Ein Teil der bioaktiven Fraktion 45 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde direkt der Massen- und Sequenzanalyse unterzogen. Ein anderer Teil wurde reduziert und alkyliert (wie unter Beispiel 2 beschrieben) und dann auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,1 cm x 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Zorbax RP-C3, 5 μm, 300 Ä Analytik verwandt wird, deutlich.
Massenbestimmungen
Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten und modifizierten Peptide wurden auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer durchgeführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden als
IGF-II, 7471 Da; IGFBP-2, 12 681 Da; IGFBP-2, 12 865 Da
bestimmt.
Bestimmung von Cvsteinen/Modifizierung von Peptiden Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivatisierung, zum Beispiel nach Reduktion mit ß-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid- Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm x 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekulargewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämofiltrat sechs Cysteine enthalten, welche zudem mit drei Disulfidbrücken untereinander verbunden sind.
Sequenzbestimmung
Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die carboxamidomethylierte Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert.
Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergaben sich folgende N-terminale Sequenzen:
IGFBP-2-13, MW 12681
(reduziertes und mit Jodacet.amid modifiziertes Molekül, MW 13045)
Aminosäuren
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV...
IGFBP-2-13, MW 12865
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13223)
Aminosäuren
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV...
IGF-π, MW 7471
Aminosäuren
AYRPSETLCGGEL.... Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des MALDI-TOF-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProl und EMBL-Nucleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzt eine hundertprozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des humanen IGFBP-2 bzw. zur Aminosäuresequenz von IGF-II.
IGFBP-2 wurde bisher als ein 34 kD großes Bindungsprotein beschrieben, dessen vollständige Sequenzanalyse durch Analyse der zugehörigen cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), Seiten 2497 bis 2502) erfolgte. IGF-II und auch IGF-I, welches ebenfalls an IGFBP-2 bindet, wurden dagegen in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon umfangreich beschrieben (als Review: Rechler, M.M., & Nissley, S.P. (1990) Insulin-like growth fac- tors In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, M.B., Roberts, A.B. eds.), Seiten 263 bis 367, Springer- Verlag, Berlin).
Beispiel 2
Bestimmung der biologischen Aktivität des IGF/IGFBP-2-13
Die Isolierung des IGF/IGFBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Überlebensassay der PC- 12 (Pheochromocytom-Zellen)-Zellinie. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.
Der Assay mißt das Überleben der Zellen, nachdem sie serumfrei gehalten wurden, indem 24 Stunden nach Serumentzug die Aktivität mitochondrialer Enzyme bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 10.000 PC- 12 Zellen pro Loch in serumfreien Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 20 Stunden später wird die Überlebensrate der Zellen mittels eines Wst-1 Substrats gemessen. Dieses Substrat wird von mitochondrialen Enzymen umgesetzt Die entstehende Farbstoffintensität wird bei 405 nm im ELISA- Reader gemessen, die Referenzwellenlänge liegt dabei bei über 600 nm.
Der IGF/IGFBP-2-13 Komplex besitzt in dosisabhängigerweise eine Überlebensförderende Wirkung auf PC- 12 Zellen. Diese Zellen entsprechen neuronalen Vorläuferzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IGF/IGFBP-2-13 ein neuroprotektiver Faktor ist.
Beispiel 3
Aufreinigung des erfindungsgem.äßen Peptids IGFBP-4-11
Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptid IGFBP-4-11 erfolgte bis zur Stufe der zweiten präparativen Auftrennung völlig analog zu der unter Beispiel 1 beschriebenen Aufreinigung des IGFBP-2-13. Die weitere Aufreinigung erfolgte durch
Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die im Assay bioaktive Fraktion 33 aus pH-Pool IV wurden über eine analytische Reverse- Phase-Säule aufgetrennt. Die Fraktion 34 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 1 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C45 ym, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0 - 80% B in 80 min, 80 - 100% B in 10 min
Fluß: 2,5 ml/min
Detektion: 230 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: ä 1 min ab Start des Gradienten
Massenbestimmungen Die Massenbestimmungen wurden auf einem Elektrospray-Massenspektrometer durchgeführt. Die Molekülmasse des Peptids wurde als
IGFBP-4-11, 11 344 Da
bestimmt.
Sequenzbestimmung
Die Aminosäuresequenz des aufgereinigten, nativen, biologisch aktiven Peptids IGFBP-4-11 wurde wie unter Beispiel 1 auf der Seite 13 beschrieben durchgeführt.
Es ergab sich die folgende N-terminale Sequenz:
IGFBP-4- 11 , MW 11344 Da
KVNGAPREDARPVPQGSXQSELIIRALERL...
Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekul.arm.asse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Messgenauigkeit des Elektrospray-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäuredatenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundertprozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des humanen IGFBP-4.
Bestimmung der Schwefelbrückenverknüpfung des IGFBP-4-11
Die Analyse der Schwefelbrückenverknüpfung erfolgte, indem das native Peptid IGFBP-4-11 parallel in zwei verschiedenen Ansätzen mit den Endoproteasen Chymotrypsin und Arg-C gespalten wurde. Die erhaltenen Spaltfragmente wurden dann mittels analytischer Reverse Phase Chromatographie voneinander getrennt und der Molekularmassen- und Sequenzanalyse unterzogen. Folgende Fragmente, welche jeweils zwei Cysteine und eine Schwefelbrücke enthalten, wurden erhalten: HPKQCHPALDGQRGKCW, MW 1960
CVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSF, MW 3112
PVPQGSCQSELHR
MW 3236
THEDLYIIPIPNCDR
Daraus ist ersichtlich, daß im nativen IGFBP-4-11 die Schwefelbrücken zwischen Cystein 1 und 2, zwischen Cystein 3 und 4 sowie zwischen Cystein 5 und 6 ausgebildet sind.
Beispiel 4
Bestimmung der biologischen Aktivität des IGFBP-4-1 1
Die Isolierung des IGFBP-4-11 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Prolife- rationsassay mit primären Knochenzellen (Osteoblasten), die zunächst aus Schädeldecken von Rattenembryonen isoliert werden
D.azu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 3 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und .anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen. Der Assay mißt die Proliferation der Zellen, indem 48 oder 72 Stunden nach Zugabe der Fraktionen der Einbau von radioaktivem Thymidin, also die DNA-Syntheserate, bestimmt wird. Als Positiv-Kontrolle wird in diesem Assay Transforming Growth Factor-beta (TGF-beta) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 5.000 Osteoblasten-Zellen pro Loch in serumhaltigem Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 48 oder 72 Stunden später wird die Proliferationsrate (DNA-Syntheserate) der Zellen mittels der Zugabe und des Einbaus von radioaktivem Thymi- dins gemessen. Das Peptid IGFBP-4-11 besitzt in dosisabhängigerweise eine proliferations- förderende Wirkung auf diese primären Osteoblasten. Diese Zellen entsprechen typischen Knochenzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IGFBP-4-11 ein osteoanaboler Faktor ist. Beispiel 5
Isolierung der C-terminalen Domäne des IGFBP-3
Durch ein ähnliches Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte aus Hämofiltrat ein Peptid isoliert werden mit einer Masse von 2.470 Dalton (MALDI:2481 Dalton) mit der Sequenz: HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS (?) wodurch sich als IGFBP-3 C-terminale Sequenz folgende Sequenz ergibt:
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNNLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK
Beispiel 6
Durch ein ähnliches Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte die N-terminale Domäne des IGFBP-4 mit der Sequenz
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGL RCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNSFSPCSAHD RRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM
Beispiel 7
Bestimmung der C-terminalen Sequenz des IPB-5 durch ein Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte ein Peptid mit einer Masse von 13,5 kD bestimmt werden. Die Sequenzbestimmung ergab folgende Sequenz:
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCD RKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE
Die theoretische Masse beträgt 12,5 kD, daher ist davon auszugehen, daß das Peptid an Serin oder Theronin glykosyliert ist.

Claims

Patentansprüche
1. Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like growth factor binding protein entspricht sowie cyclische, gly- cosylierte, phosphorylierten, acetylierten, amidierten und/oder sulfatierten Derivate.
2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekemizeichnet, daß die Peptide aus Hämofiltrat isoliert werden können.
3. Peptide nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine Länge von 61 bis 115 Aminosäuren aufweisen.
4. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide Sequenzen aufweisen, die N- oder C-terminalen Sequenzen von Insulin-like growth factor binding protein entsprechen.
5. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Aminosäuresequenz der Formel
R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
worin
R, NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, Xj ein Peptid mit einer Aminosauresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phos- phorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IGFBP.
6. Peptide gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 5 mit Disulfidbrücken der Formel
RrC-X,-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
7. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß X2 an Position 4 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X3 an der Position 9 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 4 oder 5 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 9 oder 10 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist.
8. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß X, an der Position 8 oder V ist und/oder X, an der Position 1 1 oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
9. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß R, ausgewählt wird aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP.
10. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß X, ausgewählt wird aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV.
11. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß X2 ausgewählt wird aus
NKNGFYHSR, DKHGLYNLK, DKKGFYKKK, DRNGNFHPK, DRKGFYKRK, DHRGFYRKR.
12. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß X3 ausgewählt wird aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP.
13. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekeimzeichnet, daß X4 ausgewählt wird aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLOQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS.
14. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ausgewählt wird aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.
15. Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide ausgewählt werden aus
IBP-1
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEPCRIELYRVVESLAKAQETS
GEEISKFYLPNCNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLCWCVYPWNGKRIPGSPEIRG
DPNCQIYFNVQN
IGFBP-2 GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYS LHIPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECH LFYNEQQEARGVHTQRMQ
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLH IPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLF YNEQQEARGVHTQRMQ
IGFBP-3
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNV LSPRGVHIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGK EDVHCYSMQSK
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGV HIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCY SMQSK
HPLHSKIIIIKKGHAKDSQRY
IGFBP-4
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRC GSGLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNS FSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM
KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNF HPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE
IGFBP-5
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPR AVYLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQ
CHTFDSSNVE
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAV YLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCH TFDSSNVE
HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS
IGFBP-6
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGPCRRHLDSVLQQ LQTEVYRGAQTLYVPNCDHRGFYRKRQCRSSQGQRRGPCWCVDRMGKSLPG SPDGNGSSSCPTGSSG
16. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid- synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikroorganismen.
17. Komplexe von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor-I, MW 7649) oder hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor-II, MW 7491) sowie dessen biologisch aktive Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierten, acetyherten, sulfatierten, phosphoryherten und/oder glykosylierten Derivaten.
18. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
19. Antisensenucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es unter stringenten Bedingungen eine Nucleinsäuresequenz bindet, die für ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
20. Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 bindet.
21. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die biologische Aktivität von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 hemmt.
22. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 hemmt.
23. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexen gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Unterexpression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen.
24. Verwendung von Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Überexpression Insulin-like Growth Factor Bindmg Proteinen.
25 Arzneimittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexe gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, Antisen- senucleotiden gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 in einer pharmazeutisch üblichen Darreichungsform zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
26. Verwendung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 25 zur Behandlung von Muskelschwund, Osteroporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Rnochenheilung.
27. Verwendung der Nucleinsäure gemäß Anspruch 18 und/oder der Antisensenucleotide gemäß Anspruch 19 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.
28. Diagnostikmittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexe gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, Antisensenucleotide gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 sowie weitere Hilfsmittel.
29. Verwendung der Diagnostikmittel gemäß Anspruch 28 zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen-Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
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