EP1042476A1 - Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung - Google Patents

Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung

Info

Publication number
EP1042476A1
EP1042476A1 EP98965865A EP98965865A EP1042476A1 EP 1042476 A1 EP1042476 A1 EP 1042476A1 EP 98965865 A EP98965865 A EP 98965865A EP 98965865 A EP98965865 A EP 98965865A EP 1042476 A1 EP1042476 A1 EP 1042476A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptides
acid sequence
amino acid
peptide
igfbp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98965865A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf-Georg Forssmann
Ludger STÄNDKER
Maik Obendorf
Lothar Kling
Hans-Georg Opitz
Hossein Mostafavi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1042476A1 publication Critical patent/EP1042476A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like growth factor binding protein entspricht sowie cyclische, glycosylierte, phosphorylierten, acetylierten, amidierten und/oder sulfatierten Derivate.

Description

Insulin-like Growth Factor Binding Protein Fragmente und ihre Verwendung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften, Komplexe der Peptide mit humanem Insulin-like growth factor I und II (IGF) sowie die damit in Verbindung stehenden Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren.
Insulin-like Growth Factor Binding Proteine sind unter anderem von Shimasaki, S. und Ling, N. in Prog. Growth Factor Res. 3 (1991) 243-266 und Zapf, J. in Eur. J. Endocrinol. 132 (1995) 645-654 beschrieben worden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide, deren Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen entspricht sowie cy- clische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, a idierte und/oder sulfatierte Derivate davon. Diese erfindungsgemäßen Peptide werden als IGFBP oder IBP bezeichnet.
Bevorzugte Peptide sind solche, die natürlicherweise vorkommen und beispielsweise aus Hämo- filtrat isoliert werden können. Vorzugsweise weisen die Peptide eine Länge von 61 bis 115 Aminosäuren auf. Besonders bevorzugt sind Peptide, die Sequenzen aufweisen, die N- oder C- terminalen Sequenzen von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen entsprechen.
Bevorzugte Peptide sind Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
RrC-X,-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
worin
R, NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IGFBP.
Das Peptid weist zellproliferative und zellprotektive Eigenschaften auf.
Die erfindungsgemäßen Peptide können Disulfidbrücken aufweisen, so daß sie der allgemeinen Formel
RrC-XrPNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide an einer oder mehrerer der folgenden Positionen der Aminosäuresequenz ein Glycin auf. X2 an Position 4, X3 an Position 9, X4 an Position 4 oder 5 und/oder X4 an Position 9 oder 10.
Es ist weiter bevorzugt, daß X] an der Position 8 L oder V ist und/oder X, an der Position 11 L oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder. N ist und/oder X2 .an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform wird R, ausgewählt aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP (SEQ ID NO: 1), GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP (SEQ ID NO: 2), GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP (SEQ ID NO: 3) , GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP (SEQ ID NO : 4), KVNGAPREDARPVPQGS (SEQ ID NO: 5) ,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP (SEQ ID NO : 6), PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP (SEQ ID NO: 7) und/oder
X, ausgewählt aus
RIELYRWESLAKAQETSGEEISKFYL (SEQ ID NO: 8), QQELDQVLERIST RLPDERGPLEHLYSLHI (SEQ ID NO : 9), RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI (SEQ ID NO : 10) , QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI (SEQ ID NO: 11), RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL (SEQ ID NO: 12), RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV (SEQ ID NO: 13) und/oder
X2 ausgewählt aus
NKNGFYHSR (SEQ ID NO 14 )
DKHGLYNLK (SEQ ID NO 15 )
DKKGFYKKK (SEQ ID NO 16 )
DRNGNFHPK (SEQ ID NO 17 )
DRKGFYKRK (SEQ ID NO 18 )
DHRGFYRKR (SEQ ID NO 19 ) und/oder
X3 ausgewählt aus
ETS DGEAGL (SEQ ID NO 20) ,
KMSLNGQRGE (SEQ ID NO 21) ,
RPSKGRKRGF (SEQ ID NO 22) ,
HPALDGQRGK (SEQ ID NO 23) ,
KPSRGRKRGI (SEQ ID NO 24) ,
RSSQGQRRGP (SEQ ID NO 25) und/oder
x4 ausgewählt aus
YP NGKRIPGSPEIRGDPN (SEQ ID NO 26 ) , NPNTGKLIQGAPTIRGDPE (SEQ ID NO 27 ) , DKYGQPLPGYTTKGKEDVH (SEQ ID NO 28 ) , DRKTGVKLPGGLEPKGELD (SEQ ID NO 29) , DKYGMKLPGMEYVDGDFQ (SEQ ID NO: 30 ) , DRMGKSLPGSPDGNGSSS (SEQ ID NO: 31 ) und/oder
R2 ausgewählt aus
QIYFNVQN (SEQ ID NO: 32), HLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 33; HLFYNEQQE (SEQ ID NO: 34), YSMQSK (SEQ ID NO: 35), HQLADSFRE (SEQ ID NO: 36), HTFDSSNVE (SEQ ID NO: 37), PTGSSG (SEQ ID NO: 38) .
Bevorzugte Peptide weisen folgende Sequenzen auf IGFBP-1
APSEEDHSIL DAISTYDGSKALHVTNIKKWKEPCRIELYRWESLAKAQETSGEEISKFYLP NCNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLCWCWPWNGKRIPGSPEIRGDPNCQIYFNVQN (SEQ ID NO: 39)
IGFBP-2
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHG LYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 40)
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHG LYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ (SEQ ID NO: 45)
IGFBP-3
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK (SEQ ID NO: 41)
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFC CVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK (SEQ ID NO: 46)
HPLHSKIIIIKKGHAKDSQRY (SEQ ID NO: 47)
IGFBP-4
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGLRCYPPR GVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIR DRSTSGGKM (SEQ ID NO: 48)
KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPAL DGQRGKC CVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE (SEQ ID NO: 42)
IGFBP-5
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRK GFYKRKQCKPSRGRKRGIC CVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE (SEQ ID NO: 43)
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRK GFYKRKQCKPSRGRKRGIC CVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE (SEQ ID NO: 49)
HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS (SEQ ID NO: 50)
IGFBP-6
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGPCRRHLDSVLQQLQTEVYRGAQT LYVPNCDHRGFYRKRQCRSSQGQRRGPCWCVDRMGKSLPGSPDGNGSSSCPTGSSG (SEQ ID NO: 44) Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptidsynthese oder durch Expression in rekombinanten Mikroorganismen erhalten.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Komplexe der erfindungsgemäßen Peptide mit humanem Insulin-like growth factor-I und/oder humanem Insulin-like growth factor-II sowie dessen physiologisch aktiven Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierte, acety- lierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.
Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, Antisensenucleotide, die unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure binden, die für das erfindungsgemäße Peptid kodiert, Antikörper, die an die erfindungsgemäßen Peptide binden, Inhibitoren, die die biologische Aktivität der Insulin-like Growth Factor Binding Proteine hemmen, Inhibitoren, die die Expression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen hemmen.
Die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren eignen sich insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Über- oder Unterexpression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteine, zur Behandlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, periphe- ren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsre-aktionen, TumorerJ ankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.
Insbesondere Komplexe von IGFBP mit IGF-I oder IGF-II eignen sich zur Behandlung von Knochenerkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Peptide und die Komplexe der Peptide mit Insulin-like growth factor weisen eine zellproliferative Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Peptide regulieren die Freisetzung des IGF-I und IGF-Il aus den Komplexen an ihrem Wirkort. Die Coadministration der erfmdungsgemäßen Peptide mit IGF-I oder IGF-II verlängert die biologische Halbwertzeit und damit die Verfügbarkeit der letztgenannten. Die durch Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte Hypoglykämie wird durch die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide verhindert.
Die erfindungsgemäßen Peptide haben desweiteren eine wachstumsfördernde Wirkung auf Knochenzellen und führen zu einer Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstumshormonen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren in einer pharmazeutisch üblichen Darreichungsform in einem Arzneimittel enthalten. Sie eignen sich zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmo- nalen Applikation. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 μg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag.
Die erfindungsgem.äßen Nucleinsäuren und/oder Antisensenucleotide eignen sich auch zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörpern und/oder Inhibitoren.
Bevorzugterweise enthält das Diagnostikmittel poly- oder monoklonale Antiköφer gegen das erfindungsgem.äße Peptid, wobei die Antiköφer fluoreszenz- oder radioaktiv-markiert sein können, um in den bekannten ELISA oder RIA eingesetzt werden zu können. Jedoch kann das Diagnostikmittel auch Nucleinsäuren enthalten, die in modifizierter oder markierter Form in dem Fachmann bekannten Tests wie PCR oder Finger-Printing zum Einsatz kommen.
Die erfindungsgemäßen Diagnostikmittel eignen sich insbesondere zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
Insbesondere das gleichzeitige Auftreten mehrerer Fragmente von BP-4 oder BP-5 im Plasma, insbesondere der N- und C-termmalen Domänen eignet sich als Marker für Erkrankungen des Knochenstoffwechsels. Die entsprechenden Peptide können entweder massenspektroskopisch nachgewiesen oder, bevorzugt durch Immunreaktion mit entsprechenden Antiköφer.
Figur 1 zeigt ein Alignment der Konsensussequenzen von C-terminalen Fragmenten der Insulin- like Growth Factor Proteine.
Figur 2 zeigt die schematische Struktur der Insulin-like Growth Factor Proteine mit den cystein- reichen N- und C-terminalen Domänen.
Figur 3 zeigt die schematische Struktur der Insulin-like Growth Factor Proteine sowie die Sequenz der aus Hämofiltrat isolierten biologisch aktiven Fragmente.
Figur 4 zeigt die Isolierung des osteoanabolen Faktors IGFBP-4-11 aus humanem Hämofiltrat (siehe Beispiel 3).
Figur 5 zeigt die Sequenz- und Schwefelbrückenanalyse des osteoanabolen Faktors IGFBP-4- 11. Die Cysteine 153-183, 194-205 und 207-228 sind verbrückt.
Figur 6 zeigt die biologische Wirkung des osteoanabolen Faktors IGFBP-4-11. Nach einer Inkubation von serumfrei gehaltenen primären Rattenosteoblasten für (A) 24 Stunden, (B) 48 Stunden und (C) 72 Stunden mit IGFBP-4-11 zeigt sich die proliferationsfordernde Wirkung des IGFBP-4-11. In dosisabhängiger Weise wird ein Anstieg der DNA-Syntheserate gefunden, gemessen als Einbau von Bromodesoxyuridin (BrdU).
Figur 7 zeigt die spezifische Bindung an Osteoblasten und den möglichen Rezeptor für den osteoanabolen Faktor IGFBP-4-11 (als IGFBP-4136"237 bezeichnet). A: Radioaktiv markiertes IGFBP-4-11 zeigt eine durch steigende Mengen an nicht-markiertem IGFBP-4-11 verdrängbare spezifische Bindung an primäre Osteoblastenzellen. B: Radioaktiv markiertes IGFBP-4-11 konnte, nachdem es an Osteo-blasten gebunden hat, chemisch mit seinem putativen Rezeptormolekül vernetzt werden und anschließend durch Gelelektrophorese und nachfolgende Autora- diographie nachgewiesen werden. Der Ligand-Rezeptor-Komplex hat ein Molekulargewicht von etwa 120 kDa. Die Bildung des Komplexes wird begünstigt durch Saponin, einen Membranporenbildner. Die Komplexbildung wird verhindert durch Zusatz eines Überschusses an nicht- markiertem IGFBP-4-11 zum Inkubationsansatz.
Die Aufreinigung des erfmdungsgemäßen Peptids bzw. seine Komplexes wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Aufreinigung und peptidchemische Analyse des IGFBP-2-13
Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch ein Reinigungsverfahren ausgehend vom humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses patentierte Verfahren (Forssmann, W.-G. (1988), Offenlegungs- schrift DE 36 33 707 AI), welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat entwickelt wurde, wurde in modifizierter Form auch zur Aufreinigung des Peptidkomplexes eingesetzt.
Hämofiltrat-Batch-Extraktion
H.ämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an. 800 bis 1.000 1 Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH- Wert von 2,1 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 1/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Wirten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Fluß: 3 1/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,1, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftragung der insgesamt 1.000 1 Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH- Wert (6,8 bis 7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 1 Eluat erreicht.
Erste präparative Auftrennung
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000 bis 10.000 1 Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2,1 wird das Peptidextrakt unter Zumi- schung von VE- Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Fluß: bis zu 3 1/min während des Auftrages,
0,5 bis 1 1 während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem,
(PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE- Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basisli- nie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 1 erreicht werden.
Zweite präparative Auftrennung:
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reverse Phase Chromatographie getrennt
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 μm 10 x 12,5 cm (FineLine 100)
Fluß : 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: lO mM HCl
Puffer B : 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0 bis 60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay getestet. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20EC gelagert.
Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die im Assay bioaktiven Fraktionen 11 und 12 aus pH-Pool V wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 21 bis 25 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm x 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C 18 15-20 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 42 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: ä 1,5 min ab Start des Gradienten
Semipräparative Reverse-Phase Cl 8-Chromatographie: Die bioaktiven Fraktionen 21 bis 25 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über die gleiche semipräparative Reverse Phase Säule aufgetrennt. Als Laufmittel wurde jedoch Methanol verwendet. Die Fraktion 24 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm x 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 μm, 300 Ä
Puffer A: 0, 1 % TFA, 20% Methanol
Puffer B : 0, 1 % TFA, 100% Methanol
Gradient: 0 bis 20% B in 6,5 min, 20 bis 80% B in 55 min,
80 bis 100% B in 13 min
Fluß: 30 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: ä 1,5 min ab Start des Gradienten
Kationenaustauschchromatographie:
Die bioaktiven Fraktionen 19 und 20 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Kationenaustauscher-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 45 bis 47 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 1 cm x 5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Pepkat, Biotek 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0
Puffer B : 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0, 1 ,5 M NaCl
Gradient: 0 bis 50% B in 50 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 3 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad Sprint
Fraktionen: a 1,5 min ab Start des Gradienten
Analytische Reverse-Phase Chromatographie:
Die bioaktiven Fraktionen 45 bis 47 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden sukzessive in mehreren identischen Läufen über eine Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 56 enthielt die erfmdungsgem.äße Substanz.
Chromato graphiebedingungen:
Säule: 1 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C 18 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: ä 1 min ab Start des Gradienten Zweite Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die bioaktive Fraktion 56 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC RP-C18, 5 μm, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 15 bis 50% B in 75 min, 75 bis 100% B in 10 min
Fluß: 0J ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Dritte Analytische Reverse-Phase C3-Chromatographie:
Ein Teil der bioaktiven Fraktion 45 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde direkt der Massen- und Sequenzanalyse unterzogen. Ein anderer Teil wurde reduziert und alkyliert (wie unter Beispiel 2 beschrieben) und dann auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,1 cm x 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Zorbax RP-C3, 5 μm, 300 Ä Analytik verwandt wird, deutlich.
Massenbestimmungen
Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten und modifizierten Peptide wurden auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer durchgeführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden als
IGF-II, 7471 Da; IGFBP-2, 12 681 Da; IGFBP-2, 12 865 Da
bestimmt.
Bestimmung von Cvsteinen/Modifizierung von Peptiden Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivatisierung, zum Beispiel nach Reduktion mit ß-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid- Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm x 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekulargewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämofiltrat sechs Cysteine enthalten, welche zudem mit drei Disulfidbrücken untereinander verbunden sind.
Sequenzbestimmung
Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die carboxamidomethylierte Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert.
Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergaben sich folgende N-terminale Sequenzen:
IGFBP-2-13, MW 12681
(reduziertes und mit Jodacet.amid modifiziertes Molekül, MW 13045)
Aminosäuren
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV...
IGFBP-2-13, MW 12865
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13223)
Aminosäuren
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV...
IGF-π, MW 7471
Aminosäuren
AYRPSETLCGGEL.... Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des MALDI-TOF-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProl und EMBL-Nucleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzt eine hundertprozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des humanen IGFBP-2 bzw. zur Aminosäuresequenz von IGF-II.
IGFBP-2 wurde bisher als ein 34 kD großes Bindungsprotein beschrieben, dessen vollständige Sequenzanalyse durch Analyse der zugehörigen cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), Seiten 2497 bis 2502) erfolgte. IGF-II und auch IGF-I, welches ebenfalls an IGFBP-2 bindet, wurden dagegen in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon umfangreich beschrieben (als Review: Rechler, M.M., & Nissley, S.P. (1990) Insulin-like growth fac- tors In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, M.B., Roberts, A.B. eds.), Seiten 263 bis 367, Springer- Verlag, Berlin).
Beispiel 2
Bestimmung der biologischen Aktivität des IGF/IGFBP-2-13
Die Isolierung des IGF/IGFBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Überlebensassay der PC- 12 (Pheochromocytom-Zellen)-Zellinie. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.
Der Assay mißt das Überleben der Zellen, nachdem sie serumfrei gehalten wurden, indem 24 Stunden nach Serumentzug die Aktivität mitochondrialer Enzyme bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 10.000 PC- 12 Zellen pro Loch in serumfreien Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 20 Stunden später wird die Überlebensrate der Zellen mittels eines Wst-1 Substrats gemessen. Dieses Substrat wird von mitochondrialen Enzymen umgesetzt Die entstehende Farbstoffintensität wird bei 405 nm im ELISA- Reader gemessen, die Referenzwellenlänge liegt dabei bei über 600 nm.
Der IGF/IGFBP-2-13 Komplex besitzt in dosisabhängigerweise eine Überlebensförderende Wirkung auf PC- 12 Zellen. Diese Zellen entsprechen neuronalen Vorläuferzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IGF/IGFBP-2-13 ein neuroprotektiver Faktor ist.
Beispiel 3
Aufreinigung des erfindungsgem.äßen Peptids IGFBP-4-11
Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptid IGFBP-4-11 erfolgte bis zur Stufe der zweiten präparativen Auftrennung völlig analog zu der unter Beispiel 1 beschriebenen Aufreinigung des IGFBP-2-13. Die weitere Aufreinigung erfolgte durch
Analytische Reverse-Phase C18-Chromatographie:
Die im Assay bioaktive Fraktion 33 aus pH-Pool IV wurden über eine analytische Reverse- Phase-Säule aufgetrennt. Die Fraktion 34 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 1 cm x 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C45 ym, 300 Ä
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B : 0, 1 % TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0 - 80% B in 80 min, 80 - 100% B in 10 min
Fluß: 2,5 ml/min
Detektion: 230 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: ä 1 min ab Start des Gradienten
Massenbestimmungen Die Massenbestimmungen wurden auf einem Elektrospray-Massenspektrometer durchgeführt. Die Molekülmasse des Peptids wurde als
IGFBP-4-11, 11 344 Da
bestimmt.
Sequenzbestimmung
Die Aminosäuresequenz des aufgereinigten, nativen, biologisch aktiven Peptids IGFBP-4-11 wurde wie unter Beispiel 1 auf der Seite 13 beschrieben durchgeführt.
Es ergab sich die folgende N-terminale Sequenz:
IGFBP-4- 11 , MW 11344 Da
KVNGAPREDARPVPQGSXQSELIIRALERL...
Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekul.arm.asse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Messgenauigkeit des Elektrospray-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäuredatenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundertprozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des humanen IGFBP-4.
Bestimmung der Schwefelbrückenverknüpfung des IGFBP-4-11
Die Analyse der Schwefelbrückenverknüpfung erfolgte, indem das native Peptid IGFBP-4-11 parallel in zwei verschiedenen Ansätzen mit den Endoproteasen Chymotrypsin und Arg-C gespalten wurde. Die erhaltenen Spaltfragmente wurden dann mittels analytischer Reverse Phase Chromatographie voneinander getrennt und der Molekularmassen- und Sequenzanalyse unterzogen. Folgende Fragmente, welche jeweils zwei Cysteine und eine Schwefelbrücke enthalten, wurden erhalten: HPKQCHPALDGQRGKCW, MW 1960
CVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSF, MW 3112
PVPQGSCQSELHR
MW 3236
THEDLYIIPIPNCDR
Daraus ist ersichtlich, daß im nativen IGFBP-4-11 die Schwefelbrücken zwischen Cystein 1 und 2, zwischen Cystein 3 und 4 sowie zwischen Cystein 5 und 6 ausgebildet sind.
Beispiel 4
Bestimmung der biologischen Aktivität des IGFBP-4-1 1
Die Isolierung des IGFBP-4-11 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Prolife- rationsassay mit primären Knochenzellen (Osteoblasten), die zunächst aus Schädeldecken von Rattenembryonen isoliert werden
D.azu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 3 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und .anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen. Der Assay mißt die Proliferation der Zellen, indem 48 oder 72 Stunden nach Zugabe der Fraktionen der Einbau von radioaktivem Thymidin, also die DNA-Syntheserate, bestimmt wird. Als Positiv-Kontrolle wird in diesem Assay Transforming Growth Factor-beta (TGF-beta) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 5.000 Osteoblasten-Zellen pro Loch in serumhaltigem Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 48 oder 72 Stunden später wird die Proliferationsrate (DNA-Syntheserate) der Zellen mittels der Zugabe und des Einbaus von radioaktivem Thymi- dins gemessen. Das Peptid IGFBP-4-11 besitzt in dosisabhängigerweise eine proliferations- förderende Wirkung auf diese primären Osteoblasten. Diese Zellen entsprechen typischen Knochenzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IGFBP-4-11 ein osteoanaboler Faktor ist. Beispiel 5
Isolierung der C-terminalen Domäne des IGFBP-3
Durch ein ähnliches Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte aus Hämofiltrat ein Peptid isoliert werden mit einer Masse von 2.470 Dalton (MALDI:2481 Dalton) mit der Sequenz: HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS (?) wodurch sich als IGFBP-3 C-terminale Sequenz folgende Sequenz ergibt:
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNNLSPRGVHIPNC DKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK
Beispiel 6
Durch ein ähnliches Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte die N-terminale Domäne des IGFBP-4 mit der Sequenz
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGL RCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNSFSPCSAHD RRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM
Beispiel 7
Bestimmung der C-terminalen Sequenz des IPB-5 durch ein Verfahren wie in den Beispielen 1 und 3 konnte ein Peptid mit einer Masse von 13,5 kD bestimmt werden. Die Sequenzbestimmung ergab folgende Sequenz:
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCD RKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE
Die theoretische Masse beträgt 12,5 kD, daher ist davon auszugehen, daß das Peptid an Serin oder Theronin glykosyliert ist.

Claims

Patentansprüche
1. Peptide, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Aminosäuresequenz Teilen der Aminosäuresequenz von Insulin-like growth factor binding protein entspricht sowie cyclische, gly- cosylierte, phosphorylierten, acetylierten, amidierten und/oder sulfatierten Derivate.
2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekemizeichnet, daß die Peptide aus Hämofiltrat isoliert werden können.
3. Peptide nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine Länge von 61 bis 115 Aminosäuren aufweisen.
4. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide Sequenzen aufweisen, die N- oder C-terminalen Sequenzen von Insulin-like growth factor binding protein entsprechen.
5. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Aminosäuresequenz der Formel
R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
worin
R, NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, Xj ein Peptid mit einer Aminosauresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phos- phorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IGFBP.
6. Peptide gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 5 mit Disulfidbrücken der Formel
RrC-X,-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2
7. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß X2 an Position 4 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X3 an der Position 9 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 4 oder 5 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 9 oder 10 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist.
8. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß X, an der Position 8 oder V ist und/oder X, an der Position 1 1 oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.
9. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß R, ausgewählt wird aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP.
10. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß X, ausgewählt wird aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV.
11. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß X2 ausgewählt wird aus
NKNGFYHSR, DKHGLYNLK, DKKGFYKKK, DRNGNFHPK, DRKGFYKRK, DHRGFYRKR.
12. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß X3 ausgewählt wird aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP.
13. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekeimzeichnet, daß X4 ausgewählt wird aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLOQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS.
14. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ausgewählt wird aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.
15. Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide ausgewählt werden aus
IBP-1
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEPCRIELYRVVESLAKAQETS
GEEISKFYLPNCNKNGFYHSRQCETSMDGEAGLCWCVYPWNGKRIPGSPEIRG
DPNCQIYFNVQN
IGFBP-2 GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYS LHIPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECH LFYNEQQEARGVHTQRMQ
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLH IPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLF YNEQQEARGVHTQRMQ
IGFBP-3
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNV LSPRGVHIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGK EDVHCYSMQSK
KVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGV HIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCY SMQSK
HPLHSKIIIIKKGHAKDSQRY
IGFBP-4
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRC GSGLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHPNNS FSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM
KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNF HPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE
IGFBP-5
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPR AVYLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQ
CHTFDSSNVE
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAV YLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCH TFDSSNVE
HTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS
IGFBP-6
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGPCRRHLDSVLQQ LQTEVYRGAQTLYVPNCDHRGFYRKRQCRSSQGQRRGPCWCVDRMGKSLPG SPDGNGSSSCPTGSSG
16. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid- synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikroorganismen.
17. Komplexe von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor-I, MW 7649) oder hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor-II, MW 7491) sowie dessen biologisch aktive Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierten, acetyherten, sulfatierten, phosphoryherten und/oder glykosylierten Derivaten.
18. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
19. Antisensenucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es unter stringenten Bedingungen eine Nucleinsäuresequenz bindet, die für ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
20. Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 bindet.
21. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die biologische Aktivität von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 hemmt.
22. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 hemmt.
23. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexen gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Unterexpression von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen.
24. Verwendung von Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Überexpression Insulin-like Growth Factor Bindmg Proteinen.
25 Arzneimittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexe gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, Antisen- senucleotiden gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 in einer pharmazeutisch üblichen Darreichungsform zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.
26. Verwendung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 25 zur Behandlung von Muskelschwund, Osteroporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Rnochenheilung.
27. Verwendung der Nucleinsäure gemäß Anspruch 18 und/oder der Antisensenucleotide gemäß Anspruch 19 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.
28. Diagnostikmittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, Komplexe gemäß Anspruch 17, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 18, Antisensenucleotide gemäß Anspruch 19, Antiköφern gemäß Anspruch 20, Inhibitoren gemäß Anspruch 21 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 22 sowie weitere Hilfsmittel.
29. Verwendung der Diagnostikmittel gemäß Anspruch 28 zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen-Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.
EP98965865A 1997-12-22 1998-12-22 Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung Withdrawn EP1042476A1 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19757250A DE19757250A1 (de) 1997-12-22 1997-12-22 Insulin-like growth factor binding protein und seine Verwendung
DE19757250 1997-12-22
PCT/EP1998/008405 WO1999032620A1 (de) 1997-12-22 1998-12-22 Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1042476A1 true EP1042476A1 (de) 2000-10-11

Family

ID=7853008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98965865A Withdrawn EP1042476A1 (de) 1997-12-22 1998-12-22 Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1042476A1 (de)
JP (1) JP2002508931A (de)
CA (1) CA2315974A1 (de)
DE (1) DE19757250A1 (de)
WO (1) WO1999032620A1 (de)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1141015T3 (da) 1999-01-06 2010-01-25 Genentech Inc Insulin-lignende vækstfaktor (IGF) I-mutantvarianter
DK1141014T3 (da) 1999-01-06 2005-04-11 Genentech Inc Insulinlignende vækstfaktor (IGF) i mutantvariant
US7115382B1 (en) 1999-03-15 2006-10-03 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method for detecting IGFBP-4 protease without detecting IGFBP-4 protease/proMBP Complex
DE60034779T2 (de) * 1999-03-15 2008-01-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research, Rochester Insulinartiger-wachstumsfaktorbindungsprotein-4-protease
CN1320629A (zh) * 2000-04-27 2001-11-07 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人胰岛素样生长因子结合蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
EP1282437B1 (de) 2000-05-16 2008-03-19 Genentech, Inc. Behandlung von knorpelerkrankungen
CN1328055A (zh) * 2000-06-14 2001-12-26 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——胰岛素类似生长因子结合蛋白16.17和编码这种多肽的多核苷酸
CN1328049A (zh) * 2000-06-14 2001-12-26 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——胰岛素类似生长因子结合蛋白11.88和编码这种多肽的多核苷酸
US6500630B2 (en) 2001-01-12 2002-12-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Marker for inflammatory conditions
AU2002302640A1 (en) * 2001-06-07 2002-12-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Mutants of igf binding proteins and methods of production of antagonists thereof
ATE382364T1 (de) * 2001-09-18 2008-01-15 Bioexpertise Llc Von igf-bindungsprotein stammendes peptid
EP1560933A4 (de) * 2002-11-14 2007-11-21 Wyeth Corp Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung neurologischer erkrankungen
AU2004278311A1 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Genentech, Inc. IGF binding proteins
US7968679B2 (en) 2004-12-24 2011-06-28 Insmed Incorporated Purified rhIGF-I/rhIGFBP-3 complexes and their method of manufacture
DK1760088T3 (da) * 2005-09-05 2008-06-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor associerede peptider, der bindes promiskuöst til human leuko-cyt-antigen (HLA) klasse II-molekyler
GB0521276D0 (en) * 2005-10-19 2005-11-30 Lewitt Moira S Medical uses and therapies based upon the action of azurocidin on IGFBP-1
EP1957061B1 (de) * 2005-11-30 2011-05-11 Nestec S.A. Kombination umfassend mindestens eine aminosäure und einen pkr-inhibitor zur verwendung in der behandlung von muskelschwund
WO2008086813A2 (en) * 2007-01-19 2008-07-24 Kobenhavns Universitet Peptides derived from proteins of the insulin super-family
US20120189641A1 (en) 2009-02-25 2012-07-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
EP2437768B1 (de) * 2009-06-04 2016-08-10 The University of North Carolina At Chapel Hill Verbindungen und verfahren zur behandlung von knochenerkrankungen und zur gewichtskontrolle
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
KR101482708B1 (ko) * 2012-10-09 2015-01-14 성균관대학교산학협력단 헤파린 결합 도메인을 포함하는 ｉｇｆｂｐ-5의 ｃ-말단 도메인의 신생 혈관 생성 억제제로서의 신규한 용도
EP2970387A4 (de) * 2013-03-12 2016-07-27 Univ North Carolina Verbindungen und verfahren zur behandlung von adipositas und gewichtssteuerung
US11192932B2 (en) * 2018-05-24 2021-12-07 Amolyt Pharma Heparin-binding domain of IGFBP-2 in the treatment of metabolic disorders
WO2021016667A1 (en) * 2019-07-30 2021-02-04 The University Of Sydney Inhibitors and use thereof in cancer treatment

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69233155T2 (de) * 1991-01-08 2004-06-03 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Insulinartigen wachstumsfaktor bindendes protein
DE69333063T2 (de) * 1992-11-04 2004-05-13 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Vekürztes insulinähnlichen wachstumsfaktor-bindendes protein mit mitogener aktivität
US6046033A (en) * 1994-06-27 2000-04-04 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Basic osteoblast growth factor II (bOGF-II)
AUPM672594A0 (en) * 1994-07-08 1994-08-04 Royal Children's Hospital Research Foundation A method for the prophylaxis and/or treatment of proliferative and/or inflammatory skin disorders
JPH10512235A (ja) * 1994-07-20 1998-11-24 セルトリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 骨形成の促進および骨再造形の調節のためのｉｇｆ／ｉｇｆｂｐ複合体
US5712381A (en) * 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9932620A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2315974A1 (en) 1999-07-01
JP2002508931A (ja) 2002-03-26
DE19757250A1 (de) 1999-07-01
WO1999032620A9 (de) 1999-09-23
WO1999032620A1 (de) 1999-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1042476A1 (de) Insulin-like growth factor binding protein fragmente und ihre verwendung
EP1027440B2 (de) Inhibitor-protein des wnt-signalwegs
Yates et al. Effects of a synthetic peptide of a parathyroid hormone-related protein on calcium homeostasis, renal tubular calcium reabsorption, and bone metabolism in vivo and in vitro in rodents.
EP0167575B1 (de) Cardiodilatin, ein neues peptidhormon und verfahren zu seiner herstellung
EP0885904B1 (de) Peptide als Agonisten und/oder Inhibitoren der Amyloidbildung und/oder Zytotoxizität sowie der Verwendung bei der Alzheimer'schen Krankheit, beim Typ II Diabetes mellitus und bei spongiformen Encephalopathien
DE69734157T2 (de) Parathyroidhormon-verwandthe peptidanaloge
DE102007030904A1 (de) Humanes zirkulierendes antivirales Albumin-Fragment (ALB-408) und seine Verwendung
EP0892811B1 (de) Peptide mit antiproliferativen eigenschaften
EP0736095B1 (de) Humanes zirkulierendes cytokin cc-1
EP1959013B1 (de) Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung
DE60318749T2 (de) Paralytisches peptid von der spitzmaus sowie dessen nutzung in der therapie von neuromuskulären krankheiten
EP1023445B1 (de) Cadherin derived growth factor und seine verwendung
DE69737986T2 (de) Epimorphin antagonist und herstellungsverfahren dafür
DE60036638T2 (de) Verwendung von colostrinin, dessen peptidbestandteile und deren analoga zur förderung der neuronalen zelldifferenzierung
WO1997020049A1 (de) Humanes, im blut zirkulierendes peptid mit insulinotroper wirkung
DE19951824A1 (de) Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung
EP0896584A2 (de) BIOLOGISCH AKTIVER EIWEISSSTOFF - KOLLAGENFRAGMENT HF-COLL-18/514cf - ZUR HEMMUNG DES WACHSTUMS VON TUMOREN UND VON GEFÄSSWUCHERUNGEN
EP1056857A2 (de) Transporterprotein für saccharid-gekoppelte arzneimittel
DE4344397A1 (de) Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1
DE4427395A1 (de) Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1
DE19919148A1 (de) Von Interleukin 12 abgeleitete Peptid-Homodimere und Peptid-Heterodimere
EP1123392A1 (de) Das gen prv-1 und dessen verwendung
DE19906921A1 (de) Neuronal-cell-survival-factor (NCSF) und seine Verwendung
DE4445630A1 (de) Humane zirkulierende Peptidfragmente 20-92 und 23-74 des Precursor des Osteoinduktiven Faktors kurz: OIF-20-92 und OIF 23-74
DE19953732A1 (de) Humanes zirkulierendes Virus inhibierendes Peptid (VIRIP) und seine Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20000616

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IE IT LI LU NL SE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20040630